DE69434086T2 - Herstellung und Verwendung von Immunkonjugaten die eine VL-Kette enthalten welche am Asn in Position 18 glykosyliert ist - Google Patents

Herstellung und Verwendung von Immunkonjugaten die eine VL-Kette enthalten welche am Asn in Position 18 glykosyliert ist Download PDF

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Description

  • Hintergrund der Erfindung
  • 1. Technisches Gebiet
  • Die vorliegende Erfindung betrifft neue Immunkonjugate, die nützlich für Diagnose und Therapie sind. Insbesondere betrifft die Erfindung Immunkonjugate, die ein Antikörperfragment aufweisen, das über einen Kohlenhydratanteil in der variablen Region der leichten Kette des Antikörperfragments kovalent an ein diagnostisches oder therapeutisches Prinzip gebunden ist. Die Erfindung betrifft außerdem Immunkonjugate, die einen Antikörperteil aufweisen, der ein intakter Antikörper mit einer Glykosylierungsstelle in der variablen Domäne der leichten Kette ist, die durch Mutation der die leichte Kette kodierenden Nukleotidsequenz in den Antikörper eingebracht wurde. Die Erfindung betrifft weiterhin Verfahren zur Herstellung solcher Immunkonjugate. Die vorliegende Erfindung betrifft auch Verfahren der Diagnose und Therapie, bei denen solche Immunkonjugate verwendet werden.
  • 2. Naher Stand der Technik
  • Monoklonale Antikörper können an eine Vielzahl von Agenzien konjugiert werden, um Immunkonjugate zur Verwendung in Diagnose und Therapie zu bilden. Diese Agenzien umfassen Chelate, die es den Immunkonjugaten erlauben, stabile Bindungen mit Radiosisotopen einzugehen, und zytotoxische Agenzien wie Toxine und Arzneimittel für die Chemotherapie. Beispielsweise können zytotoxische Agenzien, die normalerweise zu toxisch für Patienten wären, wenn sie in systemischer Weise verabreicht werden, in einer Weise an Antikrebs-Antikörper gekoppelt werden, dass sich ihre toxischen Effekte nur gegen die Tumorzellen, die das Zielantigen tragen, richten. Die diagnostische oder therapeutische Effizienz von Immunkonjugaten hängt von mehreren Faktoren ab. Unter diesen Faktoren sind das molare Verhältnis des diagnostischen oder therapeutischen Prinzips zum Antikörper und die Antikörperbindungsaktivität des Immunkonjugats von größter Bedeutung.
  • Forscher haben herausgefunden, dass die maximale Anzahl diagnostischer oder therapeutischer Prinzipien, die direkt an einen Antikörper gebunden werden können, durch die Anzahl der modifizierbaren Stellen am Antikörpermolekül und den Verlust der Immunreaktivität des Antikörpers begrenzt ist. Zum Beispiel haben Kulkarni et al., Cancer Research 41: 2700–2706 (1981) berichtet, dass es für die Anzahl von Arzneimittelmolekülen, die in einen Antikörper eingebaut werden können, ohne die Antigen-Bindungs-Aktivität deutlich herabzusetzen, eine Grenze gibt. Kulkarni et al. fanden heraus, dass die höchste Einbaurate, die für Methotrexat festgestellt werden konnte, ungefähr bei zehn Methotrexat-Molekülen pro Antikörpermolekül lag, und dass Versuche, das molare Verhältnis von Arzneimittel zu Antikörper auf über ungefähr zehn zu erhöhen, die Ausbeute an Immunkonjugat herabsetzte und die Antikörperaktivität beschädigte. Kanellos et al., JNCI 75: 319–329 (1985) haben von ähnlichen Ergebnissen berichtet.
  • Um einen hohen Substitutionsgrad von Immunkonjugat zu erreichen, ohne die Antigen-Bindungs-Aktivität deutlich zu verschlechtern, haben Forscher die Verwendung von wasserlöslichen polymeren Molekülen als Zwischenstufe für eine indirekte Konjugation des Arzneimittels untersucht. Derartige Polymere umfassen oxidiertes Dextran (Arnon et al., Immunol. Rev. 62: 5–27 (1982)), Poly-Glutaminsäure (Greenfield et al., Antibody Immunoconjugates and Radiopharmaceuticals 2: 201–216 (1989)), humanes Serumalbumin (Baldwin et al., NCI Monographs 3: 95–99 (1987)) und Carboxymethyldextran (Schechter et al., Cancer Immunol. Immunother. 25: 225–230 (1987)).
  • Shih et al., Int. J. Cancer 41: 832–839 (1988) haben eine ortsspezifische Verbindungsmethode beschrieben, bei der Methotrexat über ein Aminodextran an den Kohlenhydratanteil in der konstanten oder „Fc-" Region eines Antikörpers gebunden wurde, was ein Immunkonjugat mit hohem Substitutionsverhältnis und Beibehaltung der Immunreaktivität zur Folge hatte. Vor kürzerer Zeit haben Shih et al., Int. J. Cancer 46: 1101–1106 (1990) die Wirksamkeit eines Immunkonjugats nachgewie sen, das über ein Aminodextran an den Kohlenhydratanteil in der Fc Region eines monoklonalen Antikörpers konjugiertes 5-Fluorouridin aufwies. In beiden Studien haben Shih et al. beobachtet, dass das Immunkonjugat ungefähr 30 bis 50 Arzneimittelmoleküle pro Immunglobulinmolekül enthielt. Somit bietet die indirekte Konjugation eines diagnostischen oder therapeutischen Prinzips an den Kohlenhydratanteil in der Fc Region eines Antikörpers ein Mittel, Immunkonjugate mit funktioneller Antigen-Bindungs-Aktivität und einem hohen Substitutionsgrad zu erhalten.
  • Ein Vorteil der Verwendung des Kohlenhydratanteils in der Fc Region als ortsspezifische Bindungsstelle liegt darin, dass Antikörper aller Untertypen charakteristischerweise eine glykosylierte Fc Region enthalten. Im allgemeinen sind Antikörpermoleküle in ihren Fc Regionen je nach ihrem Isotyp an charakteristischen Positionen glykosyliert. Beispielsweise befindet sich typischerweise ein Kohlenhydrat an Aminosäure 297 in der CH2 Domäne in der Fc Region von IgG Molekülen. Die Konjugation eines diagnostischen oder therapeutischen Prinzips an die Kohlenhydratgruppe an dieser Position, die weit von der Antigen-Bindungsstelle entfernt liegt, sollte eine minimale Auswirkung auf die Immunreaktivität des resultierenden Immunkonjugats erzeugen, wie von Shih et al. nachgewiesen wurde.
  • Es ist jedoch ein Nachteil der Verwendung des Kohlenhydratanteils in der Fc Region als Bindungsstelle, dass der gesamte Antikörper für das Immunkonjugat benötigt wird. Die Verwendung von Antikörperfragmenten, insbesondere Fab, Fab' und F(ab')2 bieten einen Vorteil gegenüber der Verwendung eines gesamten Antikörpers, weil solche Fragmente besser aus Kapillaren heraus und in Zielgewebe hinein diffundieren können. Siehe zum Beispiel Brown, „Clinical Use of Monoclonal Antibodies," in BIOTECHNOLOGY AND PHARMACY, Pezzuto et al., eds. Chapman & Hall, pp. 227–249 (1993). Darüber hinaus lassen sich Antikörperfragmente leichter aus Blut und normalen Geweben klären als ein gesamter Antikörper. Beispielsweise hat intaktes Maus IgG eine Halbwertszeit im Blut von ungefähr 30 Stunden, während F(ab')2 und Fab/Fab' Halbwertszeiten von ungefähr 20 Stunden bzw. 2 Stunden haben. Id. Daher ist es von Vorteil, Antikörperfragmente zur Bildung von Immunkonjugaten zu verwenden. Antikörperfragmente sind besonders vorteilhaft in Radioimmuntherapie- und Radioimmmundiagnose-Anwendungen, in denen die Radioisotop-Exposition gesunden Gewebes minimiert werden muss.
  • Variable Regionen von Antikörpern enthalten gelegentlich Kohlenhydratgruppen, die potentielle Bindungsstellen für die Herstellung von Immunkonjugaten aus Antikörperfragmenten bieten. Zum Beispiel wurden in ungefähr 15–25% von aus Maus stammenden variablen Regionen Asparagin-gebundene Kohlenhydrat-Akzeptorsequenzen identifiziert. Kabat et al. SEQUENCES OF PROTEINS OF IMMUNOLOGICAL INTEREST, 5th ed. U.S. Department of Health and Human Services (1990). Im Falle von Antikörpern der Antidextran-Familie sind Glykosylierungsstellen in den komplementaritäts-bestimmenden Regionen (CDRs), insbesondere CDR2, der variablen Regionen des schweren Kette vorhanden. Id. Die Anwesenheit von Asn-gebundenen Kohlenhydraten in den CDRs dieser Antikörper schien deren Antigen-Bindung zu verstärken. Wallick et al., J. Exp. Med. 168: 1099–1109 (1988); Wright et al., EMBO J. 10: 2717–2723 (1991). Die Einführung von zusätzlichen Kohlenhydratbindungsstellen in CDR2 durch gerichtete Mutagenese resultierte jedoch entweder in der Verstärkung oder in der Verminderung der Affinität für das Antigen, je nachdem, an welcher Position die Glykosylierungsstelle eingeführt wurde. Wright et al., supra. Daher ist die Durchführbarkeit einer Bindung eines diagnostischen oder therapeutischen Prinzips an einen Kohlenhydratanteil in der VH CDR Region unsicher.
  • Die Europäische Patentanmeldung EP-A-0338151 beschreibt modifizierte Antikörper mit einer veränderten Anzahl von Glykosylierungsstellen, offenbart jedoch nicht einen Antikörper, der eine Glykosylierungsstelle ungefähr an Position 18 der leichten Kette aufweist. Die Internationale Anmeldung WO 87/05031 offenbart Antikörperkonjugate, offenbart aber nicht den Gegenstand der vorliegenden Erfindung.
  • Studien der Erfinder zur Kohlenhydratkonjugation zeigten eine hohe Konjugationseffizienz mit dem IgG Antikörper LL2, einem monoklonalem Antikörper aus der Maus beschrieben von Pawlak-Byczkowska et al. (Cancer Res. 49: 4568–4577 (1989)) und Goldenberg et al. (J. Clin. Oncol. 9: 548 (1991)). Analysen von LL2 Konjugaten mittels Natriumdodecylsulfat Polyacrylamidgel Elektrophorese (SDS-PAGE) unter reduzierenden Bedingungen wiesen auf die Existenz einer Glykosylierungsstelle in der variablen (VL) Region der leichten Kette des LL2 Antikörpers hin. Nach Klonierung der VL Region von LL2 wurde eine Asn-gebundene Glykosylierungssignalsequenz an Position 18–20 der Framework-1 (FR1) Sequenz der VL Region gefunden.
  • Diese Studien deuteten auf eine mögliche bevorzugte Konjugation an einem Kohlenhydratanteil innerhalb der VL Region hin. Dieses unerwartete Ergebnis könnte durch eine erhöhte Zugänglichkeit in der VL Region erklärt werden. Wir verwendeten ortsgerichtete Mutagenese, um die Asn-gebundene Glykosylierungssignalsequenz zu entfernen und fanden heraus, dass das resultierende Protein eine im Vergleich zum ursprünglichen Antikörper ähnliche Immunreaktivität zeigte. Dieses Ergebnis ist in Übereinstimmung mit den Computer-Modelling-Studien der Erfinder, die eine vernachlässigbare oder minimale Wechselwirkung zwischen dem Kohlenhydratanteil der FR1 Region der leichten Kette und der Antigen-Bindungsstelle vorhersagten. Dem gemäß weisen diese Studien darauf hin, dass die Konjugation eines diagnostischen oder therapeutischen Prinzips an einen Kohlenhydratanteil in der FR1 Sequenz der VL Region ein Mittel bietet, um Immunkonjugate von Antikörperfragmenten mit funktionsfähigen Antigen-Bindungsstellen zu erhalten.
  • Die vorliegende Erfindung bietet ein Verfahren zur Herstellung neuartiger Immunkonjugate, die ein diagnostisches oder therapeutisches Prinzip aufweisen, das über einen Kohlenhydratanteil der variablen Region der leichten Kette an einen intakten Antikörper oder ein Antigen bindendes Fragment davon gebunden ist.
  • Zusammenfassung der Erfindung
  • Die vorliegende Erfindung betrifft einen mutierten rekombinanten Antikörper oder ein Antigen bindendes Antikörperfragment mit einer nicht-natürlichen Asn-Glykosylierungssignalsequenz an Position 18–20 der leichten Kette des Antikörpers oder des Antigen-bindenden Antikörperfragments.
  • Die vorliegende Erfindung betrifft außerdem ein Verfahren zur Herstellung eines glykosylierten mutierten rekombinanten Antikörpers oder eines Antigen-bindenden Antikörperfragments, umfassend die Schritte:
    • (a) Kultivieren transformierter Wirtszellen, die einen mutierten Antikörper oder ein Antikörperfragment exprimieren und glykosylieren, der bzw. das eine mutierte leichte Kette und eine schwere Kette umfasst, wobei die Wirtszellen mit einem Expressionsvektor transformiert sind, in den ein mutiertes DNA-Molekül kloniert ist, das eine mutierte leichte Kette kodiert, die an der Aminosäureposition 18 bis 20 eine nicht-natürliche Asn-Glykosylierungssignalsequenz enthält; und
    • (b) Gewinnen des exprimierten und glykosylierten mutierten Antikörpers oder des Antigen-bindenden Antikörperfragments aus den kultivierten Wirtszellen.
  • Die vorliegende Erfindung betrifft weiterhin ein lösliches Immunkonjugat, umfassend
    • (a) ein glykosyliertes Antikörperfragment, wobei das Antikörperfragment ausgewählt ist aus: Fab, Fab', F(ab)2 und F(ab')2, und wobei das Antikörperfragment eine variable Region der leichten Kette und einen Kohlenhydratanteil, der an die Aminosäureposition 18 der variablen Region der leichten Kette gebunden ist, aufweist; und
    • (b) ein Zwischenstufenkonjugat, umfassend einen polymeren Träger mit zumindest einer freien Aminogruppe und eine Mehrzahl von Arzneimittel, Toxin, Chelatbildner, Bor-Addend oder nachweisbaren Markermolekülen, die kovalent an den polymeren Träger gebunden sind, wobei das Zwischenstufenkonjugat durch mindestens eine freie Aminogruppe des polymeren Trägers kovalent an den Kohlenhydratanteil des Antikörperfragments gebunden ist, und wobei das Immunkonjugat die Immunreaktivität des Antikörperfragments beibehält.
  • Darüber hinaus betrifft die vorliegende Erfindung ein lösliches Immunkonjugat, umfassend
    • (a) ein glykosyliertes Antikörperfragment, wobei das Antikörperfragment ausgewählt ist aus: Fab, Fab', F(ab)2 und F(ab')2, und wobei das Antikörperfragment eine variable Region der leichten Kette und einen Kohlenhydratanteil, der an die Aminosäureposition 18 der variablen Region der leichten Kette gebunden ist, aufweist; und
    • (b) einen Nicht-Antikörper-Anteil ausgewählt aus: einem Arzneimittel, einem Toxin, einem Chelatbildner, einem Polyethylenglykol, einem Bor-Addend und einem nachweisbaren Markermolekül, wobei der Nicht-Antikörper-Anteil kovalent an den Kohlenhydratanteil des Antikörperfragments gebunden ist und wobei das Immunkonjugat die Immunreaktivität des Antikörperfragments beibehält.
  • Die vorliegende Erfindung betrifft weiterhin ein lösliches Immunkonjugat, umfassend
    • (a) einen mutierten Antikörper, wobei der mutierte Antikörper eine variable Region der leichten Kette und einen Kohlenhydratanteil, der an die Aminosäureposition 18 der variablen Region der leichten Kette gebunden ist, aufweist; und
    • (b) einen Nicht-Antikörper-Anteil ausgewählt aus: einem Arzneimittel, einem Toxin, einem Chelatbildner, einem Polyethylenglykol, einem Bor-Addend und einem nachweisbaren Markermolekül,
    wobei der Nicht-Antikörper-Anteil kovalent an den Kohlenhydratanteil des mutierten Antikörpers gebunden ist, und wobei das Immunkonjugat die Immunreaktivität des mutierten Antikörpers beibehält.
  • Die vorliegende Erfindung betrifft ebenso ein lösliches Immunkonjugat, umfassend
    • (a) eine Antikörperkomponente, wobei die Antikörperkomponente ausgewählt ist aus: einem Fv und einem einkettigen Antikörper, und wobei die Antikörperkomponente eine variable Region der leichten Kette und einen Kohlenhydratanteil, der an die Aminosäureposition 18 der variablen Region der leichten Kette gebunden ist, aufweist; und
    • (b) ein Zwischenstufenkonjugat, umfassend einen polymeren Träger mit zumindest einer freien Aminogruppe und eine Mehrzahl von Arzneimittel, Toxin, Chelatbildner, Bor-Addend oder nachweisbaren Markermolekülen, die kovalent an den polymeren Träger gebunden sind,
    wobei das Zwischenstufenkonjugat durch mindestens eine freie Aminogruppe des polymeren Trägers kovalent an den Kohlenhydratanteil der Antikörperkomponente gebunden ist,
    und wobei das Immunkonjugat die Immunreaktivität der Antikörperkomponente beibehält.
  • Die vorliegende Erfindung betrifft weiterhin ein lösliches Immunkonjugat, umfassend
    • (a) eine Antikörperkomponente, wobei die Antikörperkomponente ausgewählt ist aus: einem Fv und einem einkettigen Antikörper, und wobei die Antikörperkomponente eine variable Region der leichten Kette und einen Kohlenhydratanteil, der an die Aminosäureposition 18 der variablen Region der leichten Kette gebunden ist, aufweist; und
    • (b) eine Nicht-Antikörperkomponente ausgewählt aus: einem Arzneimittel, einem Toxin, einem Chelatbildner, einem Polyethylenglykol, einem Bor-Addend und einem nachweisbaren Markermolekül,
    wobei die Nicht-Antikörperkomponente kovalent an den Kohlenhydratanteil der Antikörperkomponente gebunden ist,
    und wobei das Immunkonjugat die Immunreaktivität der Antikörperkomponente beibehält.
  • Die vorliegende Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Herstellung eines Immunkonjugats, umfassend die Schritte
    • (a) Einführen einer Asn-Glykosylierungssignalsequenz an Position 18 bis 20 der leichten Kette eines Antikörpers durch Mutieren der Nukleotidsequenz eines DNA-Moleküls, das die leichte Kette kodiert;
    • (b) Klonieren des mutierten DNA-Moleküls in einen Expressionsvektor;
    • (c) Transformieren von Wirtszellen mit dem Expressionsvektor und Gewinnen von transformierten Wirtszellen, die einen mutierten Antikörper exprimieren, der eine mutierte leichte Kette und eine schwere Kette umfasst;
    • (d) Kultivieren der transformierten Wirtszellen und Gewinnen des mutierten Antikörpers aus den kultivierten Wirtszellen;
    • (e) Herstellen eines Antikörperfragments aus dem gewonnenen Antikörper, wobei das Antiköperfragment ausgewählt ist aus: Fab, Fab', F(ab)2 und F(ab')2, und wobei das Antikörperfragment einen Kohlenhydratanteil in der mutierten leichten Kette des Antikörperfragments enthält; und
    • (f) Kovalentes Binden eines Zwischenstufenkonjugats an den Kohlenhydratanteil des Antikörperfragments, wobei das Zwischenstufenkonjugat einen polymeren Träger mit mindestens einer freien Aminogruppe und eine Mehrzahl von Arzneimittel, Toxin, Chelatbildner, Bor-Addend oder nachweisbaren Markermolekülen, die kovalent an den polymeren Träger gebunden sind, umfasst, wobei das Zwischenstufenkonjugat durch mindestens eine freie Aminogruppe des polymeren Trägers kovalent an den Kohlenhydratanteil des Antikörperfragments gebunden ist, und wobei das Immunkonjugat die Immunreaktivität des Antikörperfragments beibehält.
  • Die vorliegende Erfindung betrifft ebenso ein Verfahren zur Diagnose des Vorliegens einer Krankheit in einem Säuger, umfassend die Schritte:
    • (a) Herstellung eines Immunkonjugats, umfassend einen nachweisbaren Marker und ein Antikörperfragment mit einem Kohlenhydratanteil, der an Position 18 der leichten Kette des Antikörperfragments gebunden ist, wobei der nachweisbare Marker an den Kohlenhydratanteil des Antikörperfragments konjugiert ist, und wobei das Antikörperfragment fähig ist, an ein Antigen zu binden, das mit der Krankheit zusammenhängt;
    • (b) Verabreichen einer Zusammensetzung umfassend das Immunkonjugat und einen pharmazeutisch verträglichen Träger an einen Säuger; und
    • (c) Verwendung von in vivo bildgebenden Verfahren zur Detektion der Anwesenheit des Immunkonjugats an Krankheitsorten.
  • Die vorliegende Erfindung betrifft weiterhin ein Verfahren zur Behandlung einer Krankheit in einem Säuger, umfassend die Schritte:
    • (a) Herstellung eines Immunkonjugats, umfassend ein Antikörperfragment mit einem Kohlenhydratanteil, der an Position 18 der leichten Kette des Antikörperfragments gebunden ist, und einen Nicht-Antikörper-Anteil ausgewählt aus: einem Arzneimittel, einem Toxin, einem Chelatbildner, einem Bor-Addend und einem Radioisotop, wobei die Nicht-Antikörper-Anteil kovalent an den Kohlenhydratanteil des Antikörperfragments gebunden ist und wobei das Antikörperfragment an ein Antigen binden kann, das mit der Krankheit zusammenhängt; und
    • (b) Verabreichen einer Zusammensetzung umfassend das Immunkonjugat und einen pharmazeutisch verträglichen Träger an einen Säuger.
  • Ebenso schließt die vorliegende Erfindung weiterentwickelte Verfahren des in vitro Immuntests und des in situ Nachweises von Antigen in Gewebeproben unter Verwendung der Immunkonjugate der vorliegenden Erfindung ein.
  • Es werden außerdem geeignete polymere Träger, Chelate, nachweisbare Markermoleküle und Verbindungsstücke, die für die Verwendung bei der Herstellung der Immunkonjugate der vorliegenden Erfindung geeignet sind, zur Verfügung gestellt.
  • Ausführliche Beschreibung
  • 1. Überblick
  • Die vorliegende Erfindung betrifft Immunkonjugate, die einen intakten Antikörper oder ein Antigen bindendes Fragment davon umfassen, der bzw. das über einen Kohlenhydratanteil in der variablen Region der leichten Kette des Antikörperanteils kovalent an ein diagnostisches oder therapeutisches Prinzip gebunden ist. Die Erfindung betrifft weiterhin Verfahren zur Herstellung derartiger Immunkonjugate. Die Erfindung beabsichtigt auch die Verwendung solcher Immunkonjugate in der Diagnose und Immuntherapie.
  • 2. Definitionen
  • In der folgenden Beschreibung wird eine Reihe von Begriffen eingehend verwendet. An dieser Stelle werden Definitionen gegeben, um das Verständnis der Erfindung zu erleichtern.
  • Antikörper. Im vorliegenden Zusammenhang umfasst der Begriff „Antikörper" sowohl monoklonale Antikörper, wie aus der Maus stammende, chimäre oder humanisierte Antikörper, als auch Antigen bindende Fragmente davon. Derartige Fragmente umfassen Fab, Fab', F(ab)2 und F(ab')2, denen das Fc Fragment eines intakten Antikörpers fehlt. Derartige Fragmente umfassen auch isolierte Fragmente bestehend aus der variablen Region der leichten Kette, „Fv" Fragmente bestehend aus den variablen Regionen der leichten und der schweren Ketten und rekombinante einkettige Polypeptidmoleküle, in denen die leichten und die schweren variablen Regionen über einen Peptidlinker verbunden sind.
  • Mutierte Antikörper. Im vorliegenden Zusammenhang ist ein mutierter Antikörper ein intakter Antikörper oder ein Antigen bindendes Fragment davon, der eine Asn-gebundene Glykosylierungsstelle an Aminosäureposition 18 in der leichten Kette aufweist, die durch Veränderung der zugehörigen Nukleotidsequenz in die leichte Kette eingeführt wurde. Die Methoden zur Mutation der Nukleotidsequenz, welche die leichte Kette kodiert, umfassen die Polymerasekettenreaktion, ortsgerichtete Mutagenese und Gensynthese mittels Polymerasekettenreaktion mit synthetischen DNA Oligomeren.
  • Diagnostisches oder therapeutisches Prinzip. Im vorliegenden Zusammenhang ist ein diagnostisches oder therapeutisches Prinzip ein Molekül oder Atom, das an einen Antikörper konjugiert ist, um ein Immunkonjugat zu bilden, das für Diagnose- und Therapiezwecke nützlich ist. Beispiele für diagnostische oder therapeutische Prinzipien umfassen Arzneimittel, Toxine, Chelatbildner, Borverbindungen und nachweisbare Marker.
  • Immunkonjugate. Im vorliegenden Zusammenhang ist ein Immunkonjugat ein Molekül, das einen Antikörper und ein diagnostisches oder therapeutisches Prinzip aufweist. Ein Immunkonjugat behält die Immunreaktivität des Antikörpers bei, das heißt, der Antikörperanteil hat nach der Konjugation ungefähr die selbe oder nur leicht reduzierte Fähigkeit, das Antigen zu binden, wie vor der Konjugation.
  • Strukturgen. Eine DNA Sequenz, die in messenger RNA (mRNA) transkribiert wird, welche dann in eine Sequenz von Aminosäuren translatiert wird, die für ein spezifisches Polypeptid charakteristisch ist.
  • Promotor. Eine DNA Sequenz, die die Transkription eines Strukturgens zur Herstellung von mRNA steuert. Üblicherweise befindet sich ein Promotor in der 5' Region eines Gens, nahe am Startcodon eines Strukturgens. Ist ein Promotor ein induzierbarer Promotor, so steigt die Transkriptionsrate als Antwort auf ein induzierendes Agens. Im Gegensatz dazu wird die Transkriptionsrate nicht durch ein induzierendes Agens reguliert, wenn der Promotor ein konstitutiver Promotor ist.
  • Enhancer. Ein Promotorelement. Ein Enhancer kann die Effizienz, mit der ein bestimmtes Gen in mRNA transkribiert wird, erhöhen, ungeachtet des Abstandes oder der Orientierung des Enhancers bezüglich zur Startstelle der Transkription.
  • Komplementäre DNA (cDNA). Komplementäre DNA ist ein einzelsträngiges DNA Molekül, das durch das Enzym Reverse Transkriptase aus einer mRNA Vorlage gebildet wurde. Üblicherweise wird ein Primer, der komplementär zu Teilen der mRNA ist, für die Initiation der reversen Transkription gebraucht. Der Fachmann verwendet den Begriff „cDNA" auch in Bezug auf ein doppelsträngiges DNA Molekül, das aus einem derartigen einzelsträngigen DNA Molekül und seinem Gegenstrang besteht.
  • Expression. Expression ist der Vorgang, durch den ein Polypeptid aus einem Strukturgen hergestellt wird. Der Vorgang umfasst die Transkription des Gens in mRNA und die Translation dieser mRNA in Polypeptid(e).
  • Klonierungsvektor. Ein DNA Molekül wie bspw. ein Plasmid, Cosmid oder Bakteriophage, das die Fähigkeit, besitzt, sich in einer Wirtszelle autonom zu replizieren, und das dazu verwendet wird, Zellen zur Genmanipulation zu transformieren. Klonierungsvektoren enthalten üblicherweise sowohl eine oder eine geringe Anzahl von Restriktionsendonuklease-Erkennungsstellen, an denen fremde DNA Sequenzen in einer vorbestimmbaren Weise eingefügt werden können, ohne eine essentielle biologische Funktion des Vektors zu verlieren, als auch ein Markergen, das zur Verwendung bei der Identifizierung und Selektion von Zellen, die mit dem Klonierungsvektor transformiert sind, geeignet ist. Markergene umfassen üblicherweise Gene, die eine Tetrazyklinresistenz oder eine Ampizillinresistenz vermitteln.
  • Expressionsvektor. Ein DNA Molekül, umfassend ein kloniertes Strukturgen, das ein Fremdprotein kodiert und die Expression des Fremdproteins in einem rekombinanten Wirt ermöglicht. Üblicherweise ist die Expression des klonierten Gens unter die Kontrolle bestimmter regulatorischer Sequenzen wie Promotor- und Enhancer-Sequenzen gestellt (das heißt, funktionsfähig an diese Sequenzen gebunden). Promotor-Sequenzen können entweder konstitutiv oder induzierbar sein.
  • Rekombinanter Wirt. Ein rekombinanter Wirt kann jede prokaryontische oder eukaryontische Zelle sein, die entweder einen Klonierungsvektor oder einen Expressionsvektor enthält. Der Begriff will auch solche prokaryontischen oder eukaryontischen Zellen beinhalten, die gentechnisch so hergestellt wurden, dass sie das klonierte Gen/die klonierten Gene im Chromosom oder Genom der Wirtszelle enthalten. Beispiele für geeignete Wirte finden sich bei Sambrook et al., MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York (1989).
  • 3. Verfahren zur Einführung einer Asn-Glykosylierungssignalsequenz in eine leichte Kette eines Antikörpers durch Mutation der DNA Sequenz, die das Protein kodiert
  • A. Antikörperstruktur und Asn-gebundene Glykosylierung
  • Antikörpermoleküle sind zusammengesetzt aus zwei identischen Kopien von schweren und leichten Ketten, die durch Disulfidbindungen kovalent miteinander verbunden sind. Für eine allgemeine Erörterung siehe Schultz et al., „Proteins II: Stucture-Function Relationship of Protein Families," in TEXTBOOK OF BIOCHEMISTRY WITZ CLINICAL CORRELETIONS, 3rd Ed., T. M. Devlin (ed.), Wiley & Sons, pp. 92–134 (1992); Turner et al., „Antigen Receptor Molecules," in IMMUNOLOGY, 3rd Ed., Roitt et al., (eds.), Mosby, pp. 4.1–4.20 (1993). In der meist verbreiteten Antikörperart, IgG, haben die zwei schweren Ketten jeweils etwa 440 Aminosäuren, während die zwei leichten Ketten jeweils etwa 220 Aminosäuren haben. Die Aminosäuresequenzen der carboxyterminalen Hälfte der leichten Kette und der carboxyterminalen Drei-Viertel der schweren Kette sind unter den Antikörpern mit unterschiedlichen Antigenspezifitäten hoch konserviert. Diese konservierten Bereiche in den leichten und schweren Ketten werden „konstante Bereiche" („constant regions)" bezeichnet und mit CL bzw. CH benannt. Die CH Bereiche bestimmen, ob ein bestimmter Antikörper zur Antikörperklasse IgG, IgA, IgD, IgE oder IgM gehört. Die CH Bereiche sind innerhalb einer Antikörperklasse homolog zueinander, unterscheiden sich jedoch signifikant von der Aminosäuresequenz der CH Regionen anderer Antikörperklassen.
  • Im Gegensatz dazu sind die Aminosäuresequenzen der aminoterminalen Hälfte der leichten Kette und des aminoterminalen Viertels der schweren Kette unter den Antikörpern mit unterschiedlichen Antigenspezifitäten hoch variabel. Bestimmte Bereiche innerhalb dieser variablen Abschnitte sind „hypervariabel" und wurden als „komplementaritätsbestimmende Bereiche" („complementary determining regions", CDRs) bezeichnet, weil diese Bereiche die Antigen-Bindungsstelle (ABS) bilden, die komplementär zur Topologie der Antigenstruktur ist.
  • Jede schwere Kette ist mit einer leichten Kette verbunden, so dass die aminoterminalen Enden der beiden Ketten nahe aneinander liegen und eine Antigen-Bindungsstelle darstellen. Durch proteolytische Spaltung kann ein Antikörper in kleine, funktionelle Einheiten fragmentiert werden. Beispielsweise ergibt die proteolytische Spaltung eines IgG Moleküls mit Papain die Spaltung des Antikörpers im Scharnierpeptid einer jeden schweren Kette. Ein Produkt des Papainverdaus ist die carboxyterminale Hälfte der schweren Ketten, die kovalent zu einem „kristallisierbaren Fragment" (Fc) verbunden sind. Das Fc Fragment bindet kein Antigen. Die anderen Spaltungsprodukte sind identisch und bestehen aus einem aminoterminalen Segment der schweren Kette, das mit der gesamten leichten Kette verbunden ist. Diese aminoterminalen oder „Antigen bindenden Fragmente" (Fab) können Antigen mit einer Affinität binden, die derjenigen des intakten Antikörpermoleküls ähnlich ist. Der Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist die kovalente Anbindung eines diagnostischen oder therapeutischen Prinzips an einen Asn-gebundenen Kohlenhydratanteil der variablen Region der leichten Kette eines intakten Antikörpers oder eines Antigen bindenden Fragmentes davon. Asn-gebundene Glykosylierung, auch als „N-gebundene Glykosylierung" bezeichnet, ist eine Art der Glykosylierung, bei der Zuckerreste über den Amidstickstoff von Asparaginresten gebunden sind. Die intrazelluläre Biosynthese von Asn-gebundenen Oligosacchariden findet sowohl im Lumen des Endoplasmatischen Retikulums als auch beim nachfolgenden Transport des Proteins zum Golgiapparat statt. Asn-gebundene Glykosylierung erfolgt an der Glykosylierungssequenz: Asn-X-Thr/Ser, wobei X jede Aminosäure außer Prolin und Asparaginsäure sein kann. Somit gibt es 36 mögliche Sequenzen von 3 Aminosäuren, die eine Asn-gebundene Glykosylierung kodieren. Berücksichtigt man die Degeneriertheit des genetischen Codes, gibt es über tausend mögliche Nukleotidsequenzen, die die Glykosylierungssignalsequenzen kodieren.
  • B. Mutagenese
  • Die spezielle Nukleotidsequenz, die zur Einführung einer Asn-gebundenen Glykosylierungssequenz in Position 18–20 verwendet wird, ist abhängig von der natürlich vorkommenden Nukleotidsequenz. Wie weiter unten beschrieben ist, kann die Einführung einer Asn-gebundenen Glykosylierungsstelle in das PKAPPA(11)24 Protein durch eine Veränderung des Codons 18 von AGG zu AAC erreicht werden. Eine derartige Mutation der Nukleotidsequenz kann durch dem Fachmann wohlbekannte Verfahren erreicht werden.
  • Zum Beispiel kann eine Asn-gebundene Glykosylierungsstelle an Position 18 eingeführt werden, indem Oligonukleotid-gerichtete Mutagenese und eine klonierte leichte Kette eines Antikörpers verwendet werden. In diesem Verfahren wird eine einzelsträngige DNA-Vorlage, die die Sequenz der leichten Antikörperkette enthält, aus einem dut– ung– Stamm von E. coli gereinigt, um ein DNA-Molekül herzustellen, das eine geringe Anzahl von Uracilresten anstelle von Thymidin enthält. Eine derartige DNA-Vorlage kann durch M13 Klonierung oder durch in vitro Transkription unter Verwendung eines SP6 Promotors erhalten werden. Siehe zum Beispiel Ausubel et al. (eds.), CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, John Wiley & Sons (1987). Ein Oligonukleotid, das die mutierte Sequenz enthält, wird durch wohlbekannte Verfahren synthetisiert. Id. Das Oligonukleotid wird in einem annealing-Vorgang an die einzelsträngige DNA-Vorlage assoziiert, und es werden T4 DNA Polymerase und T4 DNA Ligase verwendet, um ein doppelsträngiges DNA-Molekül zu erzeugen. Transformation von wildtypischen (dut+ ung+) E. coli Zellen mit den doppelsträngigen DNA-Molekülen liefert eine gute Ausbeute von mutierter DNA.
  • Genaue Protokolle für die Oligonukleotid-gerichtete Mutagenese und verwandte Techniken zur Mutagenese klonierter DNA sind wohlbekannt. Siehe beispielsweise Ausubel et al., supra; Sambrook et al., supra.
  • Alternativ kann eine Asn-gebundene Glykosylierungsstelle in eine leichte Kette eines Antikörpers eingeführt werden, indem eine Oligonukleotid, das die gewünschte Mutation enthält, als Primer und ein DNA Klon der variablen Regionen für die leichten Antikörperketten verwendet werden, oder durch Verwendung von RNA aus Zellen, die den Antikörper von Interesse als Vorlage produzieren. Derartige Techniken schließen bspw. die Polymerasekettenreaktion wie in Beispiel 1 dargestellt ein. Siehe auch Huse, „Combinatorial Antibody Expression Libraries in Filamentous Phage," in ANTIBODY ENGINEERING: A PRACTICAL GUIDE, C. Borrebaeck (ed.), W. H. Freeman and Company, pp. 103–120 (1992). Ortsgerichtete Mutagenese kann bspw. unter Verwendung des TRANSFORMERTM Site-directed Mutagenesis Kit (Clontech; Palo Alto, CA) nach Herstellerangaben durchgeführt werden.
  • Alternativ kann eine Glykosylierungsstelle in eine leichte Kette eines Immunglobulins eingeführt werden, indem ein Leichte-Kette-Gen mit sich gegenseitig primenden Oligonukleotiden synthetisiert wird, wobei eines der Oligonukleotide die gewünschte Mutation enthält. Techniken für die Konstruktion großer, synthetischer Gene sind dem Fachmann wohlbekannt. Siehe bspw. Uhlmann, Gene 71: 29–40 (1988); Wosnick et al., Gene 60: 115–127 (1988); Ausubel et al., supra.
  • Zusammengefasst kann eine Asn-gebundene Glykosylierungsstelle an Aminosäureposition 18 in der leichten Kette eines jeden Antikörpers eingeführt werden, wenn zwei Voraussetzungen erfüllt sind. Erstens muss die Nukleotidsequenz, die die Codons für die Aminosäurepositionen 18–20 der leichten Kette des betroffenen Antikörpers umgibt und beinhaltet, zugänglich sein, um ein komplementäres Oligonukleotid, das die gewünschte Mutation enthält, entwerfen zu können. Zweitens muss Zugang entweder zu klonierter Antikörper DNA oder zu Zellen, die den Antikörper von Interesse produzieren, bestehen. Sind diese beiden Voraussetzungen erfüllt, umfasst die vorliegende Erfindung Immunkonjugate, umfassend aus Maus stammende, humanisierte oder chimäre Antikörper, bei denen ein diagnostisches oder therapeutisches Prinzip über einen ungefähr an Aminosäureposition 18 der variablen Region der leichten Kette liegenden Kohlenhydratanteil an den Antikörperanteil gebunden ist. Derartige Antikörper schließen intakte Antikörper und die Antigen bindenden Fragmente Fab, Fab', F(ab)2 und F(ab')2 ein.
  • Darüber hinaus beabsichtigt die vorliegende Erfindung die Herstellung von Immunkonjugaten, die Fv Fragmente oder einkettige Antikörper umfassen. Wie oben erörtert, beinhalten Fv Fragmente eine nicht-kovalente Verbindung der variablen Regionen der schweren und leichten Ketten. Im Gegensatz dazu umfassen einkettige Antikörper schwere und leichte Polypeptidketten aus der variablen Region eines gegebenen Antikörpers, die über einen Peptidlinker verbunden sind. Siehe zum Beispiel Bird et al., Science 242: 423–426 (1988); Ladner et al., U.S. Patent No. 4 946 778; und Pack et al., Bio/Technology 11: 1271–1277 (1993).
  • Im allgemeinen fehlen Fv Fragmenten und einkettigen Antikörpern eine Stelle zur Anbringung bestimmter diagnostischer oder therapeutischer Prinzipien wie Radiometalle. Die Einführung einer Asn-gebundenen Glykosylierungsstelle in eine variable Region der leichten Kette eines Fv Fragments oder eines einkettigen Antikörpers bietet jedoch einen Kohlenhydratanteil für die Anbindung einer Vielzahl von diagnostischen und therapeutischen Prinzipien, wie unten beschrieben wird. Obwohl Fv Fragmente und einkettige Antikörper üblicherweise von prokaryontischen Wirtszellen erzeugt werden, sind eukaryontische Wirtszellen die bevorzugten Wirtszellen. Insbesondere Insektenzellen, Hefezellen und Säugerzellen sind bevorzugte eukaryontische Wirte. Säugerzellen sind die am meisten bevorzugten Wirtszellen.
  • Immunkonjugate der vorliegenden Erfindung können so lange unter Verwendung von intakten Antikörpern, Antikörperfragmenten oder einkettigen Antikörpern, die einen Kohlenhydratanteil enthalten, der an einer alternierenden Glykosylierungsstelle angebracht ist, hergestellt werden, wie der mutierte Antikörper oder die Fragmente ihre Antigen-Bindungsaktivität beibehalten. Geeignete alternative Glykosylierungsstellen können mittels Molecular-Modelling-Techniken identifiziert werden, die dem Fachmann wohlbekannt sind. Siehe zum Beispiel Lesk et al., „Antibody Structure and Structural Predictions Useful in Guiding Antibody Engineering," in ANTIBODY ENGINEERING: A PRACTICAL GUIDE, C. Borrebaeck (ed.), W. H. Freeman and Company, pp. 1–38 (1992); Cheetham, "Engineering Antibody Affinity" Id. at pp. 39–67.
  • 4. Verfahren zur Expression und Isolierung des Proteinprodukts aus einer mutierten DNA Sequenz
  • A. Verfahren zur Expression eines mutierten Antikörpers
  • Nach der Mutation der Nukleotidsequenz wird die mutierte DNA zur weiteren Analyse, wie die Bestimmung der Nukleotidsequenz, in einen Klonierungsvektor eingebracht, wie in Beispiel 1 dargestellt ist. Um das Polypeptid, das von der mutierten DNA Sequenz kodiert wird, zu exprimieren, muss die DNA Sequenz funktionsfähig mit regulatorischen Sequenzen verbunden werden, die die transkriptionelle Expression in einem Expressionsvektor kontrollieren, und anschließend entweder in prokaryontische oder eukaryontische Wirtszellen eingeführt werden. Zusätzlich zu Transkriptionsregulationssequenzen wie Promotoren und Enhancer, beinhalten Expressionsvektoren Translationsregulationssequenzen und ein Markergen, das geeignet ist, die Zellen, die den Expressionsvektor tragen, zu selektieren.
  • Geeignete Promotoren für die Expression in einem prokaryontischen Wirt können unterdrückbar, konstitutiv oder induzierbar sein. Geeignete Promotor sind dem Fachmann wohlbekannt und umfassen Promotoren zur Erkennung der T4, T3, Sp6 und T7 Polymerasen, die PR und PL Promotoren des Bakteriophagen lambda, die trp, recA, heat shock und lacZ Promotoren von E. coli, den α-Amylase und die σ28-spezifischen Promotoren von B. subtilis, die Promotoren der Bakteriophagen von Bacillus, Streptomyces-Promotoren, den int Promotor des Bakteriophagen lambda, den bla Promotor des β-Lactamase-Gens von pBR322 und den CAT Promotor des Chloramphenicol-Acetyltransferase-Gens. Einen Überblick über prokaryontische Promotoren gibt Glick, J. Ind. Microbiol. 1: 277–282 (1987); Watson et al., MOLECULAR BIOLOGY OF THE GENE, 4th Ed., Benjamin Cummins (1987); Ausubel et al., supra und Sambrook et al., supra.
  • Ein besonders bevorzugter prokaryontischer Wirt ist E. coli. Bevorzugte Stämme von E. coli umfassen Y1088, Y1089, CSH18, ER1451 und ER1647 (siehe zum Beispiel Brown (Ed.), MOLECULAR BIOLOGY LABFAX, Academic Press (1991)). Ein alternativer bevorzugter Wirt ist Bacillus subtilis, umfassend solche Stämme wie BR151, YB886, MI119, MI120 und B170 (siehe zum Beispiel Hardy, „Bacillus Cloning Methods," in DNA CLONING: A PRACTICAL APPROACH, Glover (Ed.), IRL Press (1985)).
  • Verfahren zur Herstellung von Antikörperfragmenten in E. coli sind dem Fachmann wohlbekannt. Siehe zum Beispiel Huse, „Combinatorial Antibody Expression Libraries in Filamentous Phage," in ANTIBODY ENGINEERING: A PRACTICAL GUIDE, C. Borrebaeck (ed.), W. H. Freeman and Company, pp. 103–120 (1992); Ward, "Ex pression and Purification of Antibody Fragments Using Escherichia coli as a Host," Id. at pp. 121–138 (1992). Dem Fachmann sind auch Verfahren zur Herstellung von Fv Fragmenten, die sich aus variablen Bereichen der schweren und leichten Ketten zusammensetzen, in E. coli bekannt. Id. Siehe auch Whitlow et al., „Single-Chain Fv Proteins and their Fusion Proteins," in NEW TECHNIQUES IN ANTIBODY GENERATION, Methods 2(2) (1991).
  • Darüber hinaus sind Expressionssysteme zur Klonierung von Antikörpern in prokaryontischen Zellen kommerziell erhältlich. Beispielsweise bietet das IMMUNO ZAPTM Klonierungs- und Expressionssystem (Stratagene Cloning Systems; La Jolla, CA) Vektoren zur Expression von leichten und schweren Antikörperketten in E. coli.
  • Da die Expression einer mutierten DNA Sequenz in prokaryontischen Zellen eine nachfolgende in vitro Glykosylierung erfordert, umfasst die vorliegende Erfindung bevorzugt die Expression einer mutierten DNA Sequenz in eukaryontischen Zellen, und besonders in Säuger-Insekten- und Hefe-Zellen. Besonders bevorzugte eukaryontische Wirte sind Säugerzellen. Säugerzellen versehen das klonierte Polypeptid mit post-translationalen Modifikationen, einschließlich der richtigen Faltung und Glykosylierung. Zum Beispiel umfassen derartige Säugerzellen COS-7 Zellen (ATCC CRL 1651), nicht-sekretierende Myelomzellen (SP2/0-AG14; ATCC CRL 1581), chinesische Hamster Ovarzellen (CHO-K1; ATCC CCL 61), Ratten-Schleimzellen (GH1; ATCC CCL 82), HeLa S3 Zellen (ATCC CCL 2.2) und Ratten-Leberzellen (H-4-II-E; ATCC CRL 1548).
  • Für einen Säugerwirt können die Transkriptions- und Translationsregulationssequenzen aus viralen Quellen wie Adenovirus, Rinderpapillomavirus und Simian Virus abgeleitet sein. Zusätzlich können Promotor aus Säugerexpressionsprodukten wie Actin, Kollagen oder Myosin verwendet werden. Alternativ kann ein prokaryontischer Promotor (wie der Bacteriophage T3 RNA Polymerase Promotor) verwendet werden, wobei der prokaryontische Promotor durch einen eukaryontischen Promotor reguliert wird (siehe zum Beispiel Zhou et al., Mol. Cell. Biol. 10: 4529–4537 (1990); Kaufman et al., Nucl. Acids Res. 19: 4485–4490 (1991)). Es können Transkriptionsinitiations-Regulationssignale gewählt werden, die eine Repression oder Aktivierung ermöglichen, so dass die Expression von Genen moduliert werden kann.
  • Im allgemeinen beinhalten eukaryontische Regulationsbereiche eine Promotorregion, die die Initiation der RNA Synthese steuern können. Derartige eukaryontische Promotoren umfassen die Promotoren des Maus Metallothionin I Gens (Hamer et al., J. Mol. Appl. Gen. 1: 273–288 (1982)); den TK Promotor des Herpes Virus (McKnight, Cell 31: 355–365 (1982)); den SV40 early Promotor (Benoist et al., Nature (London) 290: 304–310 (1981)); den Rous Sarcoma Virus Promotor (Gorman et al., supra); den Cytomegalovirus Promotor (Foecking et al., Gene 45: 101 (1980)); den Hefe gal4-Gen Promotor (Johnston et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 79: 6971–6975 (1982); Silver et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 81: 5951–5955 (1984)); und den IgG Promotor (Orlandi et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 86: 3833–3837 (1989)).
  • Starke regulatorische Sequenzen sind die am meisten bevorzugten regulatorischen Sequenzen der vorliegenden Erfindung. Beispiele solcher bevorzugter regulatorischer Sequenzen umfassen den SV40 Promotor-Enhancer (Gorman, „High Efficiency Gene Transfer into Mammalian Cells," in DNA CLONING: A PRACTICAL APPROACH, Volume II, Glover (Ed.), IRL Press pp. 143–190 (1985)), den hCMV-MIE Promotor-Enhancer (Bebbington et al., Bio/Technology 10: 169–175 (1992)) und den schwere Antikörperkette-Promotor (Orlandi et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 86: 3833–3837 (1989)). Ebenfalls bevorzugt sind die Kappa-Ketten Enhancer für die Expression der leichten Kette und der IgH Enhancer (Gillies, „Design of Expression Vectors and Mammalian Cell Systems Suitable for Engineering Antibodies," in ANTIBODY ENGINEERING: A PRACTICAL GUIDE, C. Borrebaeck (Ed.), W. H. Freeman and Company, pp. 139–157 (1992); Orlandi et al., supra).
  • Die den mutierten Antikörper kodierende Sequenz und ein funktionsfähig verbundener Promotor können als nicht-replizierendes DNA Molekül in eukaryontische Zellen eingeführt werden, das entweder ein lineares Molekül oder, mehr bevorzugt, ein geschlossenes, kovalent zirkuläres Molekül sein kann. Da derartige Moleküle unfähig zur autonomen Replikation sind, kann die Expression des Proteins durch die vorübergehende Expression der eingeführten Sequenz erfolgen. Bevorzugt erfolgt eine permanente Expression durch die Integration der eingeführten Sequenz in das Wirtschromosom.
  • Bevorzugt wird die eingeführte Sequenz in ein Plasmid oder einen viralen Vektor eingebaut, der im Empfängerwirt zur autonomen Replikation fähig ist. Für diese Anwendung sind mehrere mögliche Vektorsysteme verfügbar. Eine Klasse von Vektoren verwenden DNA Elemente mit autonom replizierenden extra-chromosomalen Plasmiden, die aus tierischen Viren wie Rinderpapillomavirus, Polyomavirus, Adenovirus oder SV40 Virus gewonnen wurden. Eine zweite Klasse von Vektoren be ruht auf der Integration der gewünschten genomischen oder cDNA Sequenzen in das Wirtschromosom. Zusätzliche Elemente können zur optimalen Synthese von mRNA benötigt werden. Diese Elemente können sowohl Splice-Signale als auch Transkriptionspromotoren, -enhancer und -terminationssignale beinhalten. Die cDNA Expressionsvektoren, die derartige Elemente enthalten, umfassen diejenigen, die von Okayama, Mol. Cell. Biol. 3: 280 (1983), Sambrook et al., supra, Ausubel et al., supra, Bebbington et al., supra, Orlandi et al., supra und Fouser et al., Bio/Technology 10: 1121–1127 (1992), Gillies, supra, beschrieben sind. Genomische DNA Expressionsvektoren, die Intronsequenzen beinhalten, sind beschrieben von Orlandi et al., supra. Siehe allgemein auch Lerner et al. (Eds.), NEW TECHNIQUES IN ANTIBODY GENERATION, Methods 2(2) (1991).
  • Um Säugerzellen zu erhalten, die intakte Antikörper exprimieren, kann der Expressionsvektor, der die mutierte leichte Antikörperkette aufweist, mit einem Schwere-Antikörperkette-Expressionsvektor in Säugerzellen kotransfektiert werden. Siehe zum Beispiel Orlandi et al., supra. Alternativ können Säugerzellen, die einen Expressionsvektor für die schwere Kette enthalten, mit einem Expressionsvektor, der die mutierte leichte Antikörperkette aufweist, transfektiert werden, und Säugerzellen, die einen Expressionsvektor enthalten, der die mutierte leichte Antikörperkette aufweist, können mit einem Expressionsvektor für die schwere Kette transfektiert werden. Darüber hinaus können Säugerzellen mit einem einzigen Expressionsvektor transfektiert werden, der sowohl DNA Fragmente aufweist, die die mutierte leichte Antikörperkette kodieren, als auch DNA-Fragmente, die die schwere Antikörperkette kodieren. Siehe zum Beispiel Gillies et al., supra; Bebbington et al., supra. Jeder dieser Ansätze führt zur Produktion transfektierter Zellen, die ganze Antikörpermoleküle exprimieren, die die mutierte leichte Antikörperkette aufweisen. Standard-Transfektionstechniken sind im Stand der Technik wohlbekannt. Siehe bspw. Sambrook et al., supra; Ausubel et al., supra.
  • B. Verfahren zur Isolierung eines mutierten Antikörpers aus transfektierten Zellen
  • Transfektierte Zellen, die den Expressionsvektor tragen, werden selektiert, indem das passende Mittel verwendet wird. Bspw. kann G418 verwendet werden, um transfektierte Zellen zu selektieren, die einen Expressionsvektor mit dem Aminoglykosidphosphotransferasegen tragen. Southern et al., J. Mol. Appl. Gen. 1: 327–341 (1982). Alternativ kann Hygromycin-B verwendet werden, um transfektierte Zellen zu selektieren, die einen Expressionsvektor mit dem Hygromycin-B-Phosphotransferasegen tragen. Palmer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 1055–1059 (1987). Alternativ können Aminopterin und Mycophenolsäure verwendet werden, um transfektierte Zellen zu selektieren, die einen Expressionsvektor mit dem Xanthin-Guanin-Phosphoribosyltransferasegen tragen. Mulligan et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA 78: 2072–2076 (1981).
  • Transfektierte Zellen, die den mutierten Antikörper produzieren, können mittels einer Vielzahl von Methoden identifiziert werden. Bspw. kann jeder Immundetektionstest verwendet werden, um derartige „Transfectoma-Zellen" zu identifizieren. Beispiel 1 bietet eine Darstellung der Verwendung eines enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) für diese Anwendung.
  • Nachdem die Transfektoma-Zellen identifiziert wurden, werden die Zellen kultiviert und Antikörper aus den Zellüberständen isoliert. Isolierungstechniken umfassen Affinitätschromatographie mit Protein-A Sepharose (für intakte Antikörper), Größenausschluss-Chromatographie und Ionenaustausch-Chromatographie. Siehe zum Beispiel Coligan et al. (eds.), CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY, John Wiley & Sons (1991) für ausführliche Protokolle.
  • 5. Verfahren zur Herstellung von Immunkonjugaten
  • A. Herstellung von Antikörper Fragmenten
  • Die vorliegende Erfindung beabsichtigt die Herstellung von Immunkonjugaten aus intakten mutierten Antikörpern oder aus Antigen bindenden Antikörperfragmenten. Antikörperfragmente können aus Transfektoma-Zellen erhalten werden, indem intakte mutierte Antikörper, die von Transfektoma-Zellen produziert wurden, proteolytisch gespalten werden oder indem intakte Antikörper, die natürlich vorkommende Asn-gebundene Glykosylierungssignalsequenzen an Position 18–20 der leichten Kette aufweisen, proteolytisch gespalten werden.
  • Antikörperfragmente können direkt aus Transfektoma-Zellen gewonnen werden, indem Zellen mit einem Strukturgen für eine schwere Kette transfektiert werden, das mutiert wurde. Zum Beispiel sollten Transfektoma-Zellen Fab Fragmente produzieren, wenn ein Stoppcodon im Anschluss an die Sequenz der CH1 Domäne eingefügt wurde. Alternativ sollten Transfektoma-Zellen Fab' oder F(ab')2 Fragmente pro duzieren, wenn ein Stoppcodon nach der Sequenz, die den Scharnierbereich der schweren Kette kodiert, eingefügt wurde.
  • Alternativ können Antikörperfragmente mittels wohlbekannter proteolytischer Techniken aus intakten Antikörpern hergestellt werden. Siehe zum Beispiel Coligan et al., supra. Zur Veranschaulichung bietet Beispiel 2 ein Verfahren zur Gewinnung von Fab Fragmenten mittels Papain. Darüber hinaus können F(ab')2 Fragmente durch einen Pepsin-Verdau intakter Antikörper erhalten werden. Divalente Fragmente können mittels gewöhnlicher Disulfidbindungen reduzierender Agenzien, bspw. Cystein, Dithiothreitol (DTT) und ähnliche, in monovalente Fragmente gespalten werden.
  • B. Konjugationsverfahren
  • (i) Indirekte Konjugation
  • Immunkonjugate können durch indirekte Konjugation eines diagnostischen oder therapeutischen Prinzips an einen intakten Antikörper oder an ein Antigen bindendes Fragment davon hergestellt werden. Derartige Techniken sind beschrieben in: Shih et al., Int. J. Cancer 41: 832–839 (1988); Shih et al., Int. J. Cancer 46: 1101–1106 (1990); und Shih et al., U.S. Patent No. 5 057 313. Das allgemeine Verfahren beinhaltet, eine Antikörperkomponente, die einen oxidierten Kohlenhydratanteil aufweist, mit einem Trägerpolymer, das mindestens eine freie Aminfunktion aufweist und das mit einer Mehrzahl von Arzneimittel, Toxin, Chelatbildner oder Bor-Addend, oder mit nachweisbaren Markern beladen ist, zur Reaktion zu bringen. Diese Reaktion ergibt eine initiale Schiffsche Base (Imin) Bindung, die durch Reduktion zu einem sekundären Amin stabilisiert werden kann, um das endgültige Konjugat zu bilden.
  • Das Trägerpolymer ist bevorzugt ein Aminodextran oder Polypeptid von mindestens 50 Aminosäureresten, obwohl andere grundsätzlich äquivalente Trägerpolymere ebenso verwendet werden können. Bevorzugt ist das endgültige Immunkonjugat in wässriger Lösung wie Säugerserum löslich, um die Verabreichung zu vereinfachen und ein erfolgreiches Targeting bei der Verwendung in der Diagnose oder Therapie zu erreichen. Somit verbessern löslich-machende Funktionen am Trägerpolymer die Serumlöslichkeit des endgültigen Immunkonjugats. Löslich-machende Funktionen sind auch bei der Verwendung von Immunkonjugaten in in vitro Immuntests und bei der in situ Detektion wichtig, wie weiter unten beschrieben wird. Insbesondere ist ein Aminodextran bevorzugt.
  • Der Vorgang zur Herstellung eines Immunkonjugats mit einem Aminodextranträger beginnt üblicherweise mit einem Dextranpolymer, vorteilhafterweise einem Dextran mit einem durchschnittlichen Molekulargewicht von 10000–100000. Das Dextran wird mit einem oxidierenden Agens zur Reaktion gebracht, um eine kontrollierte Oxidation eines Teils seiner Kohlenhydratringe zur Bildung von Aldehydgruppen zu bewirken. Die Oxidation wird passenderweise mit glykolytischen chemischen Reagenzien wie NaIO4 nach Standardverfahren durchgeführt.
  • Das oxidierte Dextran wird dann mit einem Polyamin zur Reaktion gebracht, bevorzugt mit einem Diamin und besonders bevorzugt mit einem Mono- oder Poly-Hydroxy-Diamin. Geeignete Amine umfassen Ethylendiamin, Propylendiamin oder andere ähnliche Polymethylendiamine, Diethylentriamin oder ähnliche Polyamine, 1,3-Diamino-2-hydroxypropan oder andere ähnliche hydroxylierte Diamine oder Polyamine und ähnliche. Es wird ein Überschuss des Amins relativ zur Aldehydgruppe des Dextrans verwendet, um sicher zu stellen, dass eine im Wesentlichen vollständige Umwandlung der Aldehydgruppen in Schiffsche Basen erfolgt.
  • Ein reduzierendes Agens wie NaBH4, NaBH3CN oder ähnliches wird dazu verwendet, die reduktive Stabilisierung des resultierenden Schiffsche Base Intermediats durchzuführen. Das resultierende Addukt kann durch einen Durchgang durch eine gewöhnliche Größenausschlusssäule gereinigt werden, um quervernetzte Dextrane zu entfernen.
  • Andere gewöhnliche Verfahren der Derivatisierung eines Dextrans zur Einführung von Aminfunktionen können ebenso verwendet werden, bspw. Reaktion mit Cyanogenbromid gefolgt von einer Reaktion mit einem Diamin.
  • Das Aminodextran wird anschließend zur Bildung eines Zwischenstufenaddukts mit einem Derivat des bestimmten Arzneimittels, Toxins, Chelatbildners, Bor-Addenden oder Markers, das aufgeladen werden soll, zur Reaktion gebracht, das in einer aktivierten Form vorliegt, bevorzugt als Carboxyl-aktiviertes Derivat, das auf gewöhnliche Weise hergestellt wurde, bspw. durch Verwendung von Dicyclohexylcarbodiimid (DCC) oder einer wasserlöslichen Variante davon.
  • Alternativ können Polypeptid-Toxine wie das Pokeweed Antivirale Protein oder die Ricin A-Kette und ähnliche über Glutaraldehydkondensation oder durch Reaktion von aktivierten Carboxylgruppen am Protein mit Aminen am Aminodextran an das Aminodextran gekoppelt werden.
  • Chelatbildner für Radiometalle oder magnetische Resonanzverstärker sind im Stand der Technik wohlbekannt. Typisch sind Derivate von 1,4,7,10-Tetraazacyclododecantetraessigsäure (DOTA), Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) und Diethylentriaminpentaessigsäure (DTPA). Diese Chelatbildner haben charakteristischerweise Gruppen an den Seitenketten, durch die der Chelatbildner an dem Träger befestigt werden kann. Derartige Gruppen umfassen bspw. Benzylisothiocyanat, durch das das DOTA, DTPA oder EDTA an die Amingruppe eines Trägers gekoppelt werden kann. Alternativ können Carboxylgruppen oder Amingruppen an einem Chelatbildner durch Aktivierung oder vorangehende Derivatisierung und anschließender Kopplung, an einen Träger gekoppelt werden, wobei dies alles wohlbekannte Vorgehensweisen sind.
  • Marker wie Enzyme, Fluoreszenzkomponenten, Elektronentransferagenzien und ähnliche können durch übliche, im Stand der Technik wohlbekannte Verfahren an einen Träger gekoppelt werden. Die mit einem Marker versehenen Träger und die Immunkonjugate, die aus diesen hergestellt werden, können für in vitro Immuntests und zur in vivo Detektion wie weiter unten beschrieben verwendet werden.
  • Bor-Addenden wie Carborane können durch übliche Verfahren an Antikörperkomponenten gebunden werden. Zum Beispiel können Carborane mit Carboxylfunktionen an angehängten Seitenketten hergestellt werden, was im Stand der Technik wohlbekannt ist. Die Anbringung solcher Carborane an einem Träger, bspw. Aminodextran, zur Herstellung eines Zwischenstufenkonjugats kann durch Aktivierung der Carboxylgruppen der Carborane und Kondensation mit Aminen am Träger erreicht werden. Derartige Zwischenstufenkonjugate werden anschließend an Antikörperkomponenten gebunden, um therapeutisch nützliche Immunkonjugate wie weiter unten beschrieben herzustellen.
  • Als Alternative zu Aminodextran kann ein Polyamidoamindendrimer als Trägerpolymer verwendet werden. Dendrimer-Moleküle von geeignetem Typ können bspw. nach dem Verfahren von Tomalia et al., Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 29: 138–175 (1990) hergestellt werden. Dendrimere, die nach diesem Verfahren hergestellt sind, weisen eine einheitliche Größe, Form und Ladung auf und tragen eine bekannte Anzahl primärer Aminogruppen an der Moleküloberfläche, von denen alle für Konjugationszwecke verwendet werden können. Polyamidoamindendrimere tragen au ßerdem tertiäre Aminogruppen, die in wässriger Lösung bei physiologischem ph-Wert protoniert sind und dem Trägermolekül Wasserlöslichkeit verleihen.
  • Auch ein Polypeptidträger kann anstatt eines Aminodextrans oder eines Polyamidoamindendrimers verwendet werden, aber der Polypeptidträger muss mindestens 50 Aminosäurereste in der Kette haben, bevorzugt 100–5000 Aminosäurereste. Zumindest einige der Aminosäuren sollten Lysinreste oder Glutamat- oder Aspartatreste sein. Die angehängten Amine der Lysinreste und die angehängten Carboxylate von Glutamat und Aspartat sind geeignet, ein Arzneimittel, Toxin, einen Chelatbildner oder Bor-Addend daran zu binden. Beispiele für geeignete Polypeptidträger umfassen Polylysin, Polyglutaminsäure, Polyasparaginsäure, Kopolymere davon, und gemischte Polymere dieser Aminosäuren und anderer, bspw. Serine, um die nötigen Löslichkeitseigenschaften auf den resultierenden, beladenen Träger und das Immunkonjugat zu übertragen.
  • Die Konjugation des Zwischenstufenkonjugats mit der Antikörperkomponente wird durch Oxidation des Kohlenhydratanteils der Antikörperkomponente und Reaktion des resultierenden Aldehyd- (und Keton-) Carbonyls mit Aminogruppen, die nach der Beladung mit einem Arzneimittel, Toxin, Chelatbildner, Bor-Addend oder Marker am Träger verbleiben, durchgeführt.
  • Alternativ kann ein Zwischenstufenkonjugat über Aminogruppen, die nach der Beladung mit dem diagnostischen oder therapeutischen Prinzip in das Zwischenstufenkonjugat eingeführt wurden, an eine oxidierte Antikörperkomponente gebunden werden. Die Oxidation wird zweckdienlicherweise entweder chemisch durchgeführt, bspw. mit NaIO4 oder anderen glykolytischen Reagenzien, oder enzymatisch, bspw. mit Neuraminidase oder Galaktoseoxidase. Im Falle eines Aminodextranträgers werden üblicherweise nicht alle Amine des Aminodextrans zur Beladung mit einem diagnostischen oder therapeutischen Prinzip verwendet. Die verbleibenden Amine des Aminodextrans kondensieren mit der oxidierten Antikörperkomponente unter Bildung von Schiffsche Base Addukten, die anschließend reduktiv stabilisiert werden, normalerweise mit einem Borhydrid Reduktionsmittel.
  • Analoge Verfahren werden zur Herstellung anderer Immunkonjugate gemäß der Erfindung verwendet. Die Stöchiometrie zwischen den Trägermolekülen und dem diagnostischen oder therapeutischen Prinzip wird so eingestellt, dass beladenes Dendrimer und Polypeptidträger bevorzugt freie Aminoreste zur Kondensation mit dem oxidierten Kohlenhydratanteil einer Antikörperkomponente übrig haben. Carbo xyle am Polypeptidträger können, wenn nötig, in Amine umgewandelt werden durch bspw. Aktivierung mit DCC und Reaktion mit einem Überschuss eines Diamins.
  • Das endgültige Immunkonjugat wird mittels üblicher Techniken gereinigt, wie Größenausschlußchromatographie an Sephacryl S-300 oder ähnlichen Matrices.
  • Die indirekte Konjugation an ein Antikörperfragment ist in Beispiel 4 dargestellt.
  • (ii) Direkte Konjugation
  • Alternativ können Immunkonjugate durch direkte Konjugation einer Antikörperkomponente mit einem diagnostischen oder therapeutischen Prinzip hergestellt werden. Die allgemeine Vorgehensweise ist analog zum indirekten Verfahren der Konjugation, außer, dass ein diagnostisches oder therapeutisches Prinzip direkt an eine oxidierte Antikörperkomponente gebunden wird. Die direkte Konjugation von Chelatbildnern an ein Antikörperfragment ist in Beispiel 3 erläutert. Ein besonderer Vorteil der Herstellung von Immunkonjugaten durch Kopplung an das oxidierte Kohlenhydrat der leichten Kette ist, dass die Oxidationsreaktion multiple Stellen zur Anbindung von diagnostischen oder therapeutischen Prinzipien liefert. Da der Kohlenhydratanteil der leichten Kette die Antigenbindungsstelle nicht beeinflusst, bietet dieses Verfahren daher ein Mittel, direkt eine Vielzahl diagnostischer oder therapeutischer Prinzipien an ein Antikörperfragment zu binden, ohne einen polymeren Träger zu verwenden, um die Beladungskapazität des Antikörpers zu erhöhen. Dies ist unter solchen Umständen von Vorteil, unter denen die Anwesenheit eines geladenen Zwischenstufenträgermoleküls mit einer unvorteilhaften Pharmakokinetik des Immunkonjugats einhergeht.
  • Es ist klar erkennbar, dass andere diagnostische oder therapeutische Prinzipien die unten beschriebenen Chelatbildner ersetzen können. Dem Fachmann wird es möglich sein, ohne übermäßiges Experimentieren Konjugationsschemen zu erarbeiten. Zusätzlich wird der Fachmann auf zahlreiche mögliche Variationen der Konjugationsmethoden stoßen. In einem Beispiel kann der Kohlenhydratanteil zur Anbringung von Polyethylenglykol (PEG) verwendet werden, um die pharmakokinetischen Eigenschaften eines intakten Antikörpers oder eines Antigen bindenden Fragments davon im Blut, Lymphe oder anderen extrazellulären Flüssigkeiten zu verändern. Dies ist besonders vorteilhaft für die Verwendung von Antikörperfragmenten, die mit Radiometallen und insbesondere mit 99mTc markiert sind, in der Radioimmundiagnose (RAID).
  • 99mTc ist ein besonders attraktives Radioisotop für therapeutische und diagnostische Anwendungen, weil es für alle nuklearmedizinische Abteilungen leicht erhältlich ist, kostengünstig ist, dem Patienten minimale Strahlungsdosen gibt und ideale Nuklearbildgebungseigenschaften aufweist. Es hat eine Halbwertszeit von sechs Stunden, was bedeutet, dass eine schnelle Zielfindung eines Technetium-markierten Antikörpers erwünscht ist. Folglich sind Antikörperfragmente wie F(ab')2 und F(ab)2 und insbesondere Fab und Fab', die eine schnellere Zielfindungskinetik zeigen als ganze Immunglobuline, für RAID Anwendungen mit Tc-99m Markierung bevorzugt. Ein großer Nachteil der Verwendung von Tc-99m-markierten Fragmenten für bildgebende Verfahren ist die relativ hohe Aufnahme und Verbleib der Radioaktivität in der Niere, was zu Darstellungsschwierigkeiten im Bereich dieses Organs führt. Es wurde herausgefunden, dass Konjugation von PEG an Tc-99m-markierten Antikörper eine bedeutende Abnahme der Menge der Nierenaufnahme und -retention des Fragments verursacht. Siehe U.S. Patentanmeldung No. 08/309 319, die durch Verweis in ihrer Gesamtheit in der vorliegenden Erfindung enthalten ist.
  • Um PEG an ein Kohlenhydrat der leichten Kette zu koppeln, kann der Kohlenhydratanteil durch Periodat oxidiert werden und durch im Stand der Technik wohlbekannte Verfahren mit einem PEG Derivat, das einen nukleophilen Anteil trägt, gekoppelt werden. Zum Beispiel wird PEG Hydrazid (Shearwater Polymers, Inc., Huntsville, AL) zur Bildung eines Hydrazons mit dem Antikörperfragment gemischt. Alternativ kann ein PEG-Amin mit dem oxidierten Kohlenhydrat zur Reaktion gebracht werden, um eine Schiffsche Base zu bilden, die anschließend durch Behandlung mit Natriumcyanoborhydrid zur Bildung einer stabilen sekundären Aminbindung reduziert wird. Die Konjugation von PEG mit einem Fab Antikörperfragment wird in Beispiel 8 erläutert.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform kann das Antikörperfragment, wenn es einmal an PEG konjugiert ist, unter kontrollierten Bedingungen mit einem reduzierenden Agens behandelt werden, um freie Thiolgruppen zu erzeugen, die eine direkte Markierung des Fragments mit Tc-99m ermöglichen. Verfahren zur kontrollierten Reduktion von Antikörperfragmenten sind dem durchschnittlichen Fachmann wohlbekannt. Siehe zum Beispiel U.S. Patent 5 128 119, das durch Verweis in seiner Gesamtheit in der vorliegenden Erfindung enthalten ist. In einer anderen bevorzugten Ausführungsform können freie Thiolgruppen an dem PEG-konjugierten Antikörperfragment in nicht-ortsspezifischer Weise durch Reaktion mit einem thiolierenden Agens wie Traut's Reagens oder in der Art, wie in der U.S. Patentanmeldung No. 08/253 772 beschrieben, erzeugt werden, worauf direkte Markierung mit Tc-99m folgen kann.
  • In einer weiteren Ausführungsform werden Amin-terminierende bifunktionelle chelatbildende Reagenzien (BFC) an die oxidierten Kohlenhydrate der leichten Kette eines Antikörpers oder Antikörperfragments gebunden. Diese bifunktionalen Reagenzien enthalten angehängte Thiol- und Amingruppen, die in geeigneter Weise zugänglich sind um radioaktive Metalle wie 186Re, 188Re, 111Ag und 67Cu fest zu binden. Die Konjugation des BFC an den Antikörper wird über Amin- oder Hydrazinfunktionen an dem BFC erreicht, die Imin- bzw. Hydrazonbindungen zu den Aldehydfunktionen am oxidierten Kohlenhydrat bilden können. Iminbindungen können durch Reduktion mit einem reduzierenden Agens wie Natriumcyanoborhydrid stabilisiert werden. Während des Konjugationsschrittes wird die Thiolgruppe des chelatbildenden Teils als Thioester oder Disulfid maskiert und nach der Herstellung des Konjugats entschützt.
  • Die BFCs können durch die allgemeinen Strukturen Ia, Ib und Ic beschrieben werden:
  • Figure 00280001
  • In der allgemeinen Struktur Ia ist X gleich CH, oder X und Z können zusammengenommen gleich CO sein; Y ist gleich CR4R5, CH2CR4R5, oder (CH2)2CR4R5 wobei C4 und C5 gleich oder unterschiedlich sein können und ausgewählt sind aus: Hydrogen und Alkyl, substituiertes Alkyl, Aryl oder substituierte Arylgruppen; Z kann jede Gruppe sein, die zur Reaktion und/oder Komplexbildung mit den oxidierten Kohlenhydratgruppen am Protein befähigt ist, oder Z kann gleich N sein; R1 ist eine Thiol Schutzgruppe, die unter Bedingungen entfernt werden kann, die die Immunreaktivität des Proteins nicht signifikant verringern; R2 und R3 können gleich oder unterschiedlich sein und repräsentieren jeweils eine Acylgruppe oder eine substituierte Acylgruppe oder Hydrogen, Alkyl, Aryl, substituiertes Alkyl oder substituiertes Aryl, wobei die Substituenten an den Alkyl- oder Arylgruppen Metall-ligierende Gruppen sind, die ausgewählt sind aus: Sulfhydryl, Amin und Carboxysäure oder deren geschützte Derivate; R2 und R3 können auch jede andere Gruppe sein, die zur Reaktion und/oder Komplexbildung mit den oxidierten Kohlenhydratgruppen am Protein befähigt ist.
  • In Formel (II) ist D gleich H oder CH2SR1; E kann jede Gruppe sein, die zur Reaktion und/oder Komplexbildung mit den oxidierten Kohlenhydratgruppen am Protein befähigt ist; R1 ist eine Thiol Schutzgruppe, die unter Bedingungen entfernt werden kann, die die Immunreaktivität des Proteins nicht signifikant verringern, und m ist gleich 0, 1, 2 oder 3.
  • In Formel (III) kann Q jede Gruppe sein, die zur Reaktion und/oder Komplexbildung mit den oxidierten Kohlenhydratgruppen am Protein befähigt ist; R1 ist eine Thiol Schutzgruppe, die unter Bedingungen entfernt werden kann, die die Immunreaktivität des Proteins nicht signifikant verringern; und jedes n ist unabhängig gleich 2 oder 3.
  • Repräsentative Beispiele für Ia, Ib und Ic sind unten dargestellt. In einigen davon ist die Antikörper-bindende Gruppe als Hydrazid gezeigt, aber nicht darauf beschränkt. Es sind nur die Thiol-geschützten Versionen der Strukturen (mit 'R' gleich Acyl, Benzoyl oder 2-Thiopyridyl) gezeigt, obwohl die Metallkomplexbildung thiolentschützte Konjugate einschließt. Die Synthese der BFCs kann durch im Stand der Technik wohlbekannte Verfahren erreicht werden. Repräsentative Synthesen einiger BFCs und Verfahren der Konjugation sind in den Beispielen 9–14 dargestellt.
  • Figure 00290001
  • Figure 00300001
  • Die in dem BFC verwendete Thiol Schutzgruppe kann jede organische oder anorganische Gruppe sein, die unter milden Bedingungen einfach entfernt werden kann, um in Anwesenheit des Proteins das freie Sulfhydryl wiederherzustellen, ohne die Aktivität des Proteins grundlegend zu verändern. Beispiele für geeignete Schutzgruppen umfassen Thioester, Thiocarbamate und Disulfide. In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Thiol Schutzgruppe ein Benzoesäurethioester. Der Fachmann ist mit den Verfahrensweisen zum Schützen und Entschützen von Thiolgruppen vertraut. Zum Beispiel können Benzoesäurethioester unter milden und selektiven Bedingungen durch Hydroxylamin entschützt werden. Wenn das Amin jedoch ein Hydrazid ist, wird die Thiolgruppe bevorzugt als Disulfid geschützt, bspw. mit der 'R' Funktion als 2-Pyridylthiogruppe.
  • In einer anderen Ausführungsform der Erfindung kann das oxidierte Kohlenhydrat zur Konjugation von Gruppen für ein Pretargeting des Antikörpers verwendet werden. Das Pretargeting von monoklonalen Antikörpern ist zur „Entkopplung" des Antikörper Targeting Schrittes und des Schrittes der Zuführung eines Radiodiagnostikums/Radiotherapeutikums in Antikörper-basierten Agenzien von Nutzen. Durch die Reduzierung der Menge von Radioisotop in der Zirkulation bei gleichzeitigem Beibehalten einer hohen Aufnahme des Antikörpers an seinem Ziel, sind eine Reduzierung der Strahlungsdosis auf Blut und blut-bildende Gewebe und höhere Ziel : Nicht-Ziel-Verhältnisse des Radioisotops möglich. Typische Beispiele von Pretargeting-Ansätzen sind: die Verwendung von Antikörper-Avidin- (oder Antikörper-Streptavidin-) Konjugaten in einem Vorlokalisationsschritt, gefolgt durch Zuführung eines Isotops, das an einen Biotin-Anteil konjugiert ist; die Verwendung von Antikörper-Biotin-Konjugaten in einem Vorlokalisierungsschritt gefolgt durch die Zuführung eines Isotops, das an einen Avidin- (oder Streptavidin-) Anteil konjugiert ist; oder die Verwendung von Antikörper-Biotin-Konjugaten in einem Vorlokalisierungsschritt gefolgt durch die Zuführung eines Avidin- (oder Streptavidin-) Anteils und nachfol gende Zuführung eines Isotops, das an einen Biotinanteil konjugiert ist. Andere Paare von Agenzien, die auf ähnliche Weise als sekundäre Targeting Vektoren verwendet werden können, sind bspw.: zwei komplementäre Sequenzen von einzelsträngigen Nukleinsäuren; ein Enzym zusammen mit seinem spezifischen Substrat; oder ein Protein zusammen mit seinem spezifischen Liganden, so wie intrinsischer Faktor und Vitamin B12.
  • Zusätzliche Targeting Schritte sind ebenso durchführbar und auch die Verwendung von mehr als einer radiomarkierten Species ist möglich, wie in der U.S. Patentanmeldung Nr. 08/051 144 beschrieben ist, die durch Verweis in ihrer Gesamtheit in der vorliegenden Erfindung enthalten ist. Andere Ansätze zum Erreichen einer höheren Menge an Therapeutikum am Antikörper-Zielort umfassen die Aufnahme bspw. eines Antikörper-Biotin(Avidin)-Radioisotop-Konjugats als Vehikel für eine Isotopzuführung in einem späteren Schritt, das auf ein Target gerichtet ist, das zuvor mit Antikörper-Avidin(Biotin) als Target ausgestattet wurde. In diesem Beispiel hat das Antikörper-Biotin(Avidin)-Radioisotop-Konjugat zwei Stellen, nämlich Antigen und Avidin (Biotin), die als Targets dienen können. Siehe zum Beispiel U.S. Patentanmeldung Nr. 08/062 662, die durch Verweis in ihrer Gesamtheit in der vorliegenden Erfindung enthalten ist.
  • Die Anwesenheit von Kohlenhydrat in der leichten Kette von Antikörperfragmenten ermöglicht eine Ortsspezifität der Konjugation von geeigneten Pretargeting Reagenzien an Antikörperfragmente wie F(ab')2. Im Falle von Fab' Fragmenten, die freie Thiolgruppen tragen, ermöglicht die Anwesenheit von sowohl Kohlenhydrat- als auch Thiol-Funktionen zusätzlich die ortsspezifische Konjugation von zwei unterschiedlichen Teilen, die jeweils unterschiedliche chemische Eigenschaften aufweisen können.
  • Beispiele für Systeme zur Herstellung von Pretargeting Konjugaten (unterstrichen) sind unten gezeigt:
    (Avidin-Thiol) plus (Maleimid-L-hydrazid) bildet (Avidin-L-hydrazid)
    2 (Avidin-L-hydrazid) plus (CHO-Fab'-S-S-Fab'-CHO) bildet (Avidin)2-F(ab')2
    (Avidin)2-F(ab')2 reduziert mit 2-Mercaptoethanol bildet 2 × Avidin-Fab'-SH
    Avidin plus (Succinimid-L-maleimid) bildet (Avidin-L-maleimid)
    (Avidin-L-maleimid) plus Avidin-Fab'-SH bildet (Avidin)2-Fab'
    (Avidin-CHO) plus (Hydrazid-L-hydrazid) bildet (Avidin-L-hydrazid)
    2 (Avidin-L-hydrazid) plus (CHO-Fab'-S-S-Fab'-CHO) bildet (Avidin)2-F(ab')2
    (Avidin)2-F(ab')2 reduziert mit 2-Mercaptoethanol bildet 2 (Avidin-Fab'-SH)
    Avidin-Fab'-SH plus (Avidin-Maleimid) bildet (Avidin)2-Fab'
    n(Biotin-L-hydrazid) plus (CHO-Fab'-S-S-Fab'-CHO) bildet (Biotin)n-F(ab')2
    wobei n eine ganze Zahl ist, üblicherweise von 1 bis ungefähr 30; L bezeichnet einen Linker, Hydrocarbon, Alkyl, Acyl oder eine Verbindung, die zwei unterschiedliche reaktive Funktionalitäten voneinander trennt und die kommerziell erhältliche Proteinquervernetzungsagenzien einschließt. In den oben beschriebenen Beispielen kann Streptavidin anstelle von Avidin verwendet werden. Wenn angegeben, können unter Verwendung von Standardreagenzien wie Natriumperiodat bzw. 2-Mercaptoethanol Kohlenhydratanteile oxidiert werden, um Aldehyde herzustellen, und Disulfidbindungen können zur Erzeugung freier Thiole reduziert werden. Thiolgruppen können durch die Verwendung bekannter thiolierender Agenzien wie 2-Iminothiolan in Avidin eingeführt werden. Freie Thiol-Gruppen an den Avidin (Streptavidin)-Fab' Konjugaten können vor ihrer Verwendung optional blockiert werden, bspw. mit Iodacetamid. Alternativ kann die freie Thiol-Gruppe als reaktive Gruppe für eine weitere Modifikation verwendet werden, bspw. durch Radiomarkierung mit Tc-99m oder durch Konjugation mit einem Agens wie einem poly(Ethylenglykol) (PEG) Derivat, das über eine Maleimid-Reaktion für die nachfolgende Kopplung an freie Thiolgruppen aktiviert ist.
  • Die F(ab')2-basierten Streptavidin/Avidin-Konjugate erhalten zwei nicht-sterisch beeinträchtigte Antigenbindungsstellen und alle acht Biotin-Bindungsstellen, und monovalente Fab'-Einheiten tragen eine oder zwei Streptavidin/Avidin-Einheiten pro Fab' bei vollem Erhalt der Biotin-Bindungsfähigkeit. Die Verwendung des Kohlenhydrats bedeutet, dass mehrere Biotin Einheiten über das oxidierte Kohlenhydrat an jedes Fragmentmolekül gekoppelt sein können, ohne in die Antigen-Bindungsfähigkeit des Fragments einzugreifen.
  • In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung stellt die Konjugation an Kohlenhydratreste der leichten Kette, die von der Antigenbindungsstelle entfernt liegen, sicher, dass die Bindung eines nachfolgend verabreichten klärenden zweiten Anti körpers nicht gestört wird, wenn der zweite Antikörper ein antiidiotypischer Antikörper ist. In diesem Fall wird der zweite Antikörper an den zirkulierenden Antikörper über seine Antigen-Bindungsstelle binden, und der Targeting Antikörper wird über die Leber entfernt werden. Die Verwendung dieses Systems hat den Vorteil, das keine der sekundären Stellen des Targeting Antikörpers (bspw. Avidine oder Biotine) während des Klärschrittes blockiert sind.
  • In einer anderen Ausführungsform der Erfindung können Chelate, die radioaktive Nuklide tragen, über verstoffwechselbare Bindungen an das oxidierte Kohlenhydrat der leichten Kette gebunden sein. Ein Problem, das häufig mit der Verwendung von Antikörperfragmenten in radiotherapeutischen und radiodiagnostischen Anwendungen einhergeht, ist eine potentiell gefährliche Anhäufung der radiomarkierten Antikörperfragmente in der Niere. Wenn das Konjugat unter Verwendung eines Säure- oder Base-labilen Linkers hergestellt wurde, kann nützlicherweise eine Abspaltung des radioaktiven Chelats vom Antikörper erfolgen. Wenn das Chelat ein relativ geringes Molekulargewicht aufweist, wird es nicht in der Niere zurückgehalten und in den Urin abgesondert, wodurch die radioaktive Exposition der Niere reduziert wird. Chelate mit geringem Molekulargewicht, die für diese Anwendung geeignet sind, umfassen bspw. die oben beschriebenen bifunktionalen Chelate und DOTA oder DTPA-ähnliche Chelate. Jedes dieser Moleküle kann durch im Stand der Technik bekannte Standardmethoden verändert werden, um reaktive funktionelle Gruppen zu liefern, die säurelabile Bindungen mit Carbonylgruppen am oxidierten Kohlenhydrat des Antikörperfragments bilden können. Beispiele für geeignete säurelabile Bindungen umfassen Hydrazon- und Thiosemicarbazon-Funktionen. Diese werden durch Reaktion des oxidierten Kohlenhydrats mit Chelaten, die Hydrazid-, Thiosemicarbazid- bzw. Thiocarbazid-Funktionen tragen, gebildet. Die Herstellung und Konjugation eines Thiocarbazid-Derivates von DTPA wird in Beispiel 15 dargestellt.
  • Alternativ können basen-spaltbare Linker verwendet werden, die für eine verstärkte Klärung von bifunktionalen Chelat-99Tc-markierten Fragmenten aus den Nieren verwendet wurden. Siehe zum Beispiel Weber et al., Bioconjug. Chem. 1: 431 (1990). Die Kopplung eines bifunktionalen Chelats an Kohlenhydrat der leichten Kette über eine Hydrazid-Bindung kann basen-sensitive Esteranteile in einem Verbindungs-Abstandhalter-Arm einbringen. Ein Beispiel für eine derartige Ester-enthaltene Verbindungseinheit ist Ethylenglykolbis(succinimidylsuccinat) (EGS, zu beziehen von Pierce Chemical Co., Rockford, IL), das zwei terminale N-Hydroxysuccinimid (NHS) -Esterderivate von zwei 1,4-Dibuttersäureeinheiten aufweist, von denen jede durch zwei Alkylester an einen einzigen Ethylenglykolteil gebunden ist. Ein NHS Ester kann durch einen geeigneten Amin-enthaltenden BFC (bspw. 2-Aminobenzyl DTPA) ersetzt sein, während der andere NHS Ester mit einer limitierenden Menge Hydrazin zur Reaktion gebracht wird. Das resultierende Hydrazid wird zur Kopplung an das Kohlenhydrat der leichten Kette eines Antikörpers oder Antikörperfragments verwendet, wobei eine Antikörper-BFC Bindung, die zwei Alkylesterfunktionen enthält, gebildet wird. Ein derartiges Konjugat ist bei physiologischem pH stabil, wird jedoch bei basischem pH leicht gespalten.
  • In einer anderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist es möglich, durch Anbringung eines diagnostischen oder therapeutischen Prinzips an einen Kohlenhydratanteil und an eine freie Sulfhydrylgruppe ein „divalentes Immunkonjugat" aufzubauen. Eine derartige freie Sulfhydrylgruppe kann sich in dem Scharnierbereich der Antikörperkomponente befinden.
  • 6. Verwendung von Immunkonjugaten für Diagnose und Therapie
  • A. Verwendung von Immunkonjugaten für die Diagnose
  • Das bildgebende diagnostische Verfahren mit radiomarkierten monoklonalen Antikörpern ist wohlbekannt. Siehe zum Beispiel Srivastava (ed.), RADIOLABELED MONOCLONAL ANTIBODIES FOR IMAGING AND THERAPY; Plenum Press (1988); Chase, „Medical Applications of Radioisotopes," in REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES, 18th Edition, Gennaro et al. (eds.) Mack Publishing Co., pp. 624–652 (1990); und Brown, "Clinical Use of Monoclonal Antibodies," in BIOTECHNOLOGY AND PHARMACY, Pezzuto et al. (eds.), Chapman & Hall, pp. 227–249 (1993). Dieses Verfahren, auch als Immunoszintigraphie bezeichnet, verwendet eine Gamma-Kamera, um den Aufenthaltsort von Gamma-emitierenden Radioisotopen, die an monoklonale Antikörper konjugiert sind, zu ermitteln. Diagnostische bildgebende Verfahren können zur Diagnose von kardiovaskulären Krankheiten und von Infektionskrankheiten verwendet werden. Brown, supra.
  • Die vorliegende Erfindung beabsichtigt die Verwendung von Immunkonjugaten zur Diagnose kardiovaskulärer Krankheiten. Zum Beispiel können Immunkonjugate, die Antimyosinfragmente enthalten, zur bildlichen Darstellung von myokardialer Nekrose in Verbindung mit einem akuten myokardialen Infarkt verwendet werden. Immunkonjugate, die Antikörperfragmente aufweisen, die Blutplättchen und Fibrin binden, können zur bildlichen Darstellung von Thrombosen in tief liegenden Venen verwen det werden. Darüber hinaus können Immunkonjugate, die Antikörperfragmente aufweisen, die aktivierte Blutplättchen binden, zur bildlichen Darstellung von artheriosklerotischen Plaques verwendet werden.
  • Immunkonjugate der vorliegenden Erfindung können auch in der Diagnose von Infektionskrankheiten verwendet werden. Zum Beispiel können Immunkonjugate, die Antikörperfragmente aufweisen, die spezifisch bakterielle Antigene binden, zur Lokalisierung von Abszessen verwendet werden. Zusätzlich können Immunkonjugate, die Antikörperfragmente aufweisen, die Granulozyten und Entzündungsleukozyten binden, zur Lokalisierung von Stellen einer bakteriellen Infektion verwendet werden. Zahlreiche Studien haben die Verwendung monoklonaler Antikörper für die szintigraphische Erkennung von Krebs bewertet. Siehe zum Beispiel Brown, supra, und die dort gegebenen Verweise. Die Untersuchungen haben die Haupttypen von festen Tumoren wie Melanom, kolorektales Karzinom, Ovarkarzinom, Brustkarzinom, Sarkom und Lungenkarzinom abgedeckt. Daher beabsichtigt die vorliegende Erfindung die Erkennung von Krebs unter Verwendung von Immunkonjugaten, welche Antikörperfragmente aufweisen, die Tumormarker binden, um Krebs zu erkennen. Beispiele derartiger Tumormarker umfassen karzinoembryonales Antigen, Alpha-Fetoprotein, onkogene Produkte, Tumor-assoziierte Zelloberflächenantigene und Nekrose-assoziierte intrazelluläre Antigene.
  • Zusätzlich zur Diagnose können bildgebende Verfahren mit monoklonalen Antikörpern verwendet werden, um therapeutische Antworten zu überwachen, ein Wiederauftreten einer Krankheit zu erkennen und die nachfolgenden klinischen Entscheidungen zu steuern.
  • Für die diagnostische Bildgebung können Radioisotope entweder direkt oder indirekt durch die Verwendung einer intermediären funktionalen Gruppe an Antikörperfragmente gebunden werden. Derartige intermediäre funktionale Gruppen umfassen DOTA, DTPA und EDTA. Die Strahlungsdosis, welcher der Patient ausgeliefert wird, wird so niedrig wie möglich gehalten. Dies wird erreicht, indem die Isotope so ausgewählt werden, dass die beste Kombination aus minimaler Halbwertszeit, minimaler Rückhaltung im Körper und minimaler Menge an Isotop, die einen Nachweis und genaue Messung erlaubt, erreicht wird. Beispiele für Radioisotope, die an Antikörper gebunden werden können und zur diagnostischen Bildgebung geeignet sind, umfassen 99mTc und 111In.
  • Studien legen nahe, dass Antikörperfragmente, insbesondere Fab und Fab', vorteilhafte Tumor/Hintergrund Verhältnisse bieten. Brown, supra. Daher ist die Verwendung von Fab und Fab' Antikörperfragmenten zur Herstellung von Immunkonjugaten eine bevorzugte Ausführungsform der Erfindung. Die Beibehaltung der Divalez bei Verwendung eines F(ab)2 oder eines F(ab')2 Targeting Vektors führt jedoch zu höheren absoluten Mengen von Antikörper am Ziel im Vergleich zu monovalenten Fragmenten und kann in manchen Geweben zu besseren Ziel : Nicht-Ziel Verhältnissen führen.
  • Die Immunkonjugate, die im Zusammenhang mit vorliegender Erfindung nützlich sind, können zur Verwendung in der in vitro Diagnose auch mit paramagnetischen Ionen markiert werden. Elemente, die zur magnetischen Resonanz Bildgebung besonders nützlich sind, umfassen GdIII, Mn, Dy und Fe Ionen.
  • In einer Ausführungsform der Erfindung sind multiple Chelatmoleküle wie DTPA direkt an das oxidierte Kohlenhydrat der leichten Kette des Antikörperfragments konjugiert, was die Chelatbildung einer großen Zahl von paramagnetischen Ionen ohne die Notwendigkeit eines Zwischenstufenträgers ermöglicht. Für die Verwendung mancher Typen von Zwischenstufenträgern wurde herausgefunden, dass sie zerstörerische Auswirkungen auf die mit Metallchelaten erzeugten Ergebnisse der Bildgebung mittels magnetischer Resonanz haben. Siehe zum Beispiel Wiener et al., Magnetic Resonance in Medicine 31: 1–8 (1994). Die direkte Konjugation von Chelaten auf diese Weise beseitigt daher derartige Probleme.
  • In einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung benutzt das Immunkonjugat ein Polyamidoamindendrimer als Zwischenstufenträger zur Anbringung eines chelatbildenden Teils wie DTPA. Für derartige Dendrimere wurde gezeigt, dass sie verschiedene Vorteile gegenüber anderen Molekülen für die Verwendung als Träger von paramagnetischen Ionen für die Bildgebung mittels magnetischer Resonanz besitzen. Siehe zum Beispiel Wiener et al., supra.
  • Die vorliegende Erfindung beabsichtigt auch die Verwendung von Immunkonjugaten, um die Anwesenheit bestimmter Antigene in vitro zu erkennen. In derartigen Immuntests können die Immunkonjugate in flüssiger Phase oder an einen Festphasenträger gebunden verwendet werden. Zum Beispiel kann ein intakter Antikörper oder ein Antigen bindendes Fragment davon an ein Polymer wie Aminodextran gebunden sein, um die Antikörperkomponente an einen unlöslichen Träger wie polymerummantelte Kügelchen, Platten oder Röhren zu binden.
  • Alternativ können die Immunkonjugate der vorliegenden Erfindung dazu verwendet werden, die Anwesenheit bestimmter Antigene in Gewebeschnitten, die aus einer Gewebeprobe hergestellt wurden, zu ermitteln. Diese in situ Erkennung kann durch Aufbringung eines nachweisbar markierten Immunkonjugats auf den Gewebeschnitt erfolgen. In situ Erkennung kann dazu verwendet werden, die Anwesenheit eines bestimmten Antigens zu bestimmen und die Verteilung des bestimmten Antigens in dem untersuchten Gewebe zu bestimmen. Allgemeine Techniken der in situ Erkennung sind dem durchschnittlichen Fachmann wohlbekannt. Siehe zum Beispiel Ponder, „Cell Marking Techniques and Their Application," in MAMMALIAN DEVELOPMENT: A PRACTICAL APPROACH, Monk (ed.); IRL Press, pp. 115–138 (1987); Coligan et al., supra.
  • Nachweisbare Marker wie Enzyme, fluoreszierende Komponenten, Elektonentransferagenzien und ähnliche können durch übliche, im Stand der Technik wohlbekannte Verfahren an einen Träger gebunden werden. Diese markierten Träger und die daraus hergestellten Immunkonjugate können ungefähr so wie ein Antikörperkonjugat, das durch direkte Anbringung des Markers an dem Antikörper hergestellt wurde, für in vitro Immuntests und zur in situ Erkennung verwendet werden. Die Beladung des Immunkonjugats gemäß vorliegender Erfindung mit einer Vielzahl von Markern kann jedoch die Sensitivität des Immuntests oder des histologischen Verfahrens erhöhen, wo nur ein geringer Grad an Bindung des Antikörpers oder Antikörperfragments ans Zielantigen erreicht wird.
  • B. Verwendung von Immunkonjugaten in der Therapie
  • Immunkonjugate können zur Behandlung viraler und bakterieller Infektionskrankheiten, kardiovaskulärer Krankheiten, Autoimmunkrankheiten und Krebs verwendet werden. Brown, supra. Das Ziel solcher Therapie ist es, zytotoxische Dosen von Radioaktivität, Toxin oder Arzneimittel an Zielzellen heran zu bringen, während die entsprechenden Dosen für Nicht-Zielgewebe minimiert werden.
  • Wie oben erläutert kann ein Radioisotop an einen intakten Antikörper oder ein Antigen bindendes Fragment davon direkt oder indirekt über ein chelatbildendes Agens gebunden werden. Bspw. kann 67Cu, das aufgrund seiner 61,5 Stunden Halbwertszeit und der reichlichen Abgabe von beta-Teilchen und gamma-Strahlen für eines der vielversprechendsten Radioisotope für die Radioimmuntherapie gehalten wird, an eine Antikörperkomponente konjugiert werden, indem das chelatbildende Agens p-Bromacetamidobenzyltetraethylamintetraessigsäure (TETA) verwendet wird. Cha se, supra. Alternativ kann 90Y, das ein energiereiches beta-Teilchen emittiert, unter Verwendung von Diethylentriaminpentaessigsäure (DTPA) oder bevorzugt Tetraazazyklododecantetraessigsäure (DOTA) an einen intakten Antikörper oder ein Antigen bindendes Fragment davon gekoppelt werden, wie hierin beschrieben.
  • Die Verwendung des Kohlenhydratanteils der leichten Kette eines Antikörperfragments für die direkte Konjugation von vielfältigen Molekülen eines Chelatbildners bietet eine attraktive mögliche Lösung für das Problem, das mit der Verwendung von DOTA als Chelatbildner für 90Y einhergeht. Es wurde gezeigt, dass DOTA aufgrund seiner hohen Bindungskonstante und der niedrigen Dissoziationsgeschwindigkeit des 90Y-DOTA Komplexes das bevorzugte chelatbildende Agens für 90Y ist. Siehe zum Beispiel Camera et al., J. Nucl. Med. 35: 882–888 (1994). Aufgrund der sehr langsamen Kinetik der Metallbindung ist es dennoch schwierig, hohe Einbauraten bei der 90Y Markierung von DOTA Immunkonjugaten zu erreichen. Siehe zum Beispiel Wu et al., Bioorg. Med. Chem. Lett. 4: 449–454 (1994). Wu et al., supra, haben kürzlich die Verwendung eines Polyamidoamindendrimer-Intermediats zur Konjugation von 10–11 DOTA Molekülen über nicht ortsspezifische Verfahren an intakte Antikörper beschrieben und gezeigt, dass dies die 90Y Koordinationsrate erhöhte, um die spezifische Aktivität des Konjugats auf akzeptierbare Niveaus zu erhöhen. In der vorliegenden Erfindung können ähnlich hohe Zahlen von DOTA Molekülen direkt an Kohlenhydrate der leichten Kette eines Antikörperfragments konjugiert werden, was die 90Y Koordinationsrate erhöht und die Herstellung von Konjugaten mit hohen Einbauraten ohne die Verwendung eines Zwischenstufenkonjugats erlaubt. Zusätzlich kann bei einem IgG, das beide Arten von Kohlenhydraten trägt, das Kohlenhydrat an der leichten Kette zusammen mit dem Kohlenhydrat der schweren Kette als Stelle zur Beladung mit Haptenen verwendet werden und damit eine erhöhte Hapten-Beladungskapazität des Immunkonjugats ermöglichen.
  • Alternativ können Dendrimere ähnlich zu denen, die von Wu et al. verwendet wurden, als Zwischenstufenträger verwendet werden, was die Konjugation von sogar noch größeren Zahlen von DOTA Molekülen und das Erreichen noch höherer Einbauraten von 90Y in Immunkonjugate ermöglicht. Wu et al. erreichten durch die Verwendung von nicht ortsspezifischen Konjugationsverfahren nur ein 1 : 1 Verhältnis von Dendrimer zu Antikörper. In der vorliegenden Erfindung ermöglicht die Anwesenheit einer großen Anzahl von Zuckerresten am Kohlenhydrat der leichten Kette, die alle potentielle Konjugationsstellen sind, Träger : Antikörper Verhältnisse von über eins. Darüber hinaus wird die Immunreaktivität des Immunkonjugats, da das Kohlenhydrat die Antigenbindungsstelle nicht beeinflusst, nicht bemerkenswert verringert.
  • Alternativ können Bor-Addenden wie Carborane an intakte Antikörper oder Antigen bindende Fragment davon gebunden werden. Carborane können mit Carboxylfunktionen an angehängten Seitenketten dargestellt werden, wie im Stand der Technik wohlbekannt ist. Die Anbringung von Carboranen an einen Träger wie Aminodextran kann durch Aktivierung der Carboxylgruppe des Carborans und Kondensation mit Aminen am Träger erreicht werden. Das Zwischenstufenkonjugat wird dann an die Antikörperkomponente konjugiert. Nach der Verabreichung des Immunkonjugats wird ein Bor-Addend durch thermische Neutronenbestrahlung aktiviert und in radioaktive Atome umgewandelt, die unter Erzeugung hoch toxischer, kurzreichender Effekte durch α-Emission zerfallen.
  • Darüber hinaus können Immunkonjugate hergestellt werden, bei denen das therapeutische Prinzip ein Toxin oder ein Arzneimittel ist. Nützliche Toxine für die Herstellung derartiger Immunkonjugate umfassen Ricin, Abrin, Pokeweed Antivirales Protein, Gelonin, Diphtherietoxin und Pseudomonas Endotoxin. Nützliche chemotherapeutische Arzneimittel für die Herstellung von Immunkonjugaten umfassen Doxorubicin, Daunorubicin, Methotrexat, Melphalin, Chlorambucil, Vinca Alkaloide, 5-Fluoruridin und Mitomycin-C.
  • C. Verabreichung von Immunkonjugaten
  • Im allgemeinen wird die Dosierung der verabreichten Immunkonjugate abhängig von solchen Faktoren wie Alter, Gewicht, Größe, Geschlecht, allgemeiner medizinischer Zustand und medizinische Vorgeschichte des Patienten variieren. Typischerweise ist es erstrebenswert, dem Empfänger eine Immunkonjugatdosis im Bereich von ungefähr 1 pg/kg bis 10 mg/kg (Menge Agens/Körpergewicht des Patienten) zuzuführen, obwohl auch eine niedrigere oder höhere Dosis verabreicht werden kann. Bspw. haben viele Studien eine erfolgreiche diagnostische Bildgebung mit Dosen von 0,1 bis 1,0 mg gezeigt, während andere Studien eine verbesserte Lokalisierung mit Dosen über 10 mg gezeigt haben. Brown, supra.
  • Für therapeutische Anwendungen werden ungefähr 10–200 Milligramm Immunkonjugat verabreicht werden, normalerweise über mehrere Tage hinweg täglich. Um die Empfindlichkeit des Patienten zu vermindern kann es notwendig sein, die Dosis zu vermindern und/oder Antikörper einer anderen Art zu verwenden und/oder hypoal lergene Antikörper, bspw. hybride menschliche oder Primaten-Antikörper, zu verwenden.
  • Die Verabreichung von Immunkonjugaten an einen Patienten kann intravenös, intraarteriell, intraperitoneal, intramuskulär, subkutan, intrapleural, intrathekal, durch Perfusion durch einen regionalen Katheter oder durch direkte intraläsionale Injektion erfolgen. Bei der Verabreichung der Immunkonjugats durch Injektion kann die Verabreichung durch kontinuierliche Infusion oder durch einzelne oder mehrfache Bolus erfolgen.
  • Immunkonjugate von Bor-Addend-beladenen Trägern zur thermischen Neutronenaktivierungstherapie werden normalerweise in ähnlicher Weise verwendet. Jedoch wird es von Vorteil sein, abzuwarten, bis nicht an Zielmoleküle gebundene Immunkonjugate geklärt sind, bevor die Neutrionenbestrahlung durchgeführt wird. Eine solche Klärung kann durch Verwendung eines zweiten Antikörpers beschleunigt werden, wie bspw. aus U.S. Patent Nr. 4 624 846 bekannt ist.
  • Die Immunkonjugate der vorliegenden Erfindung können gemäß bekannter Verfahren formuliert sein, um pharmazeutisch wirksame Verbindungen herzustellen, wobei Immunkonjugate in einer Mischung mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger kombiniert werden. Eine Verbindung wird als „pharmazeutisch verträglicher Träger" bezeichnet, wenn seine Verabreichung durch einen Empfängerpatienten toleriert werden kann. Sterile phosphat-gepufferte Salzlösung ist ein Beispiel für einen pharmazeutisch verträglichen Träger. Andere geeignete Träger sind dem Fachmann wohlbekannt. Siehe zum Beispiel REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES, 18th Ed. (1990).
  • Zum Zweck der Immuntherapie werden einem Patienten ein Immunkonjugat und ein pharmazeutisch verträglicher Träger in therapeutisch wirksamer Menge verabreicht. Eine Kombination eines Immunkonjugats und eines pharmazeutisch verträglichen Trägers wird als „in therapeutisch wirksamer Menge verabreicht" bezeichnet, wenn die verabreichte Menge physiologisch bedeutsam ist. Ein Agens ist physiologisch bedeutsam, wenn seine Anwesenheit eine nachweisbare Änderung der Physiologie eines Empfängerpatienten zur Folge hat.
  • Zusätzliche pharmazeutische Verfahren können angewendet werden, um die Dauer der Wirkung eines Immunkonjugats in einer therapeutischen Anwendung zu kontrollieren. Präparate zur kontrollierten Freisetzung können durch die Verwendung von Polymeren zur Komplexierung oder Adsorption eines Immunkonjugats hergestellt werden. Zum Beispiel beinhalten biokompatible Polymere Grundsubstanzen aus Poly(Ethylen-co-Vinylacetat) und Grundsubstanzen aus einem Polyanhydrid-Copolymer eines Stearinsäuredimers und Sebacinsäure. Sherwood et al., Bio/Technology 10: 1446–1449 (1992). Die Geschwindigkeit der Freisetzung eines Immunkonjugats von einem derartigen Grundmaterial ist abhängig vom Molekulargewicht des Immunkonjugats, von der Menge an Immunkonjugat in der Grundsubstanz und von der Größe gelöster Teilchen. Saltzman et al., Biophysical. J. 55: 163–171 (1989); und Sherwood et al., supra. Andere feste Dosierungsformen sind beschrieben in REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES, 18th Ed. (1990). Nachdem nun die Erfindung allgemein beschrieben wurde, wird diese leichter zu verstehen sein, wenn die folgenden Beispiele berücksichtigt werden, welche zum Zwecke der Erklärung gegeben sind und nicht beabsichtigen, die vorliegende Erfindung einzuschränken, sofern dies nicht angemerkt ist.
  • Beispiel 1
  • Darstellung von Immunkonjugaten unter Verwendung monoklonaler Antikörper, denen eine natürlich vorkommende Asn-Glykosylierungssignalsequenz im FR1 Bereich der variablen Domäne der leichten Kette fehlt
  • (a) Einführung einer Asn-Glykosylierungssignalsequenz durch Mutagenese
  • Eine Asn-Glykosylierungssignalsequenz wird durch Veränderung der Nukleotidsequenz, die die Aminosäurereste 18–20 kodiert, an Aminosäureposition 18–20 des FR1 Bereiches der variablen Domäne der leichten Kette eines monoklonalen Antikörpers eingeführt. Im Beispiel wurde die Aminosäuresequenz Arg18Val19Ser20 in der Framework-1 Sequenz der variablen Region der leichten Kette des Maus monoklonalen Antikörpers PKAPPA(11)24 gefunden, der von MPC-11 Zellen produziert wird. Rabbitts et al., Can. J. Biochem. 58: 176–187 (1980); Kabat et al., SEQUENCES OF PROTEINS OF IMMUNOLOGICAL INTEREST, U.S. Department of Health and Human Sevices (1983). Der Arg Rest an Position 18 wird durch die Sequenz AGG kodiert. Id. Daher ist das Ziel der Mutagenesetechnik, die Nukleotidsequenz von AGG zu AAC zu verändern, wodurch Asn kodiert wird.
  • Die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) Technik wird angewendet, um die Asn-Glykosylierungsstelle entsprechend dem Verfahren von Orlandi et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 3833–3837 (1989) einzuführen. In diesem Verfahren wird die gesamte zelluläre RNA aus ungefähr 5 × 108 MPC-11 Zellen (ATCC CCL 167) gerei nigt und mRNA wird durch Standardverfahren über Oligo-(dT)-Zellulose aus der Gesamt-RNA abgetrennt. Die cDNA Synthese des ersten Stranges wird unter Verwendung des VK1FOR Primers durchgeführt, der ein von Orlandi et al. beschriebener VK Region 3' Primer ist. Eine 50 μl Reaktionsmischung, die enthält: 10 μg mRNA, 20 pmol VK1FOR Primer, 250 μM eines jeden dNTP, 10 mM Dithiothreitol, 100 mM Tris-HCl (pH 8,3), 10 mM MgCl2 und 140 mM KCl, werden 10 Minuten bei 70°C inkubiert und anschließend abgekühlt. Reverse Transkriptase (46 Units) wird zugegeben und die Mischung wird eine Stunde bei 42°C inkubiert. Die Reaktion wird durch Erhitzen der Reaktionsmischung für 5 Minuten auf 90°C beendet.
  • Alternativ kann der erste Strang cDNA aus gesamter zellulärer RNA aus MPC-11 Zellen synthetisiert werden, indem das SUPERSCRIPTTM Preamplification System (Gibco/BRL; Gaithersburg, MD) mit dem VK1FOR Primer verwendet wird.
  • Die VK Sequenzen werden mittels eines 5' Primers amplifiziert, der die ersten 20 Aminosäuren der VK Domäne kodiert, mit der Ausnahme, dass Aminosäuren 18–20 eine Asn-Glykosylierungsstelle kodieren. In diesem Beispiel wird der Aminosäurerest an Position 18 wie oben erläutert durch AAC kodiert. PCR Reaktionsmischungen enthalten 10 μl des Erststrang cDNA Produktes, 9 μl 10 × Puffer (500 mM KCl, 100 mM Tris-HCl (pH 8,3), 15 mM MgCl2 und 0,01% (w/v) Gelatine), 5 μl VK1FOR und 5' Primer und 5 Units AMPLITAQTM DNA Polymerase (Perkin Elmer Cetus; Norwalk, CA). Die Mischungen werden mit Paraffinöl überschichtet und 30 Runden von Temperaturzyklen in einem programmierbaren Heizblock ausgesetzt. Ein typischer Zyklus besteht aus: Denaturierung für eine Minute bei 94°C, Annealing für 1,5 Minuten bei 50°C und Polymerisierung für 1,5 Minuten bei 72°C.
  • Die DNA Probe wird zwei Mal mit Ether extrahiert, ein Mal mit Phenol, ein Mal mit Phenol/Chloroform und anschließend mit Ethanol gefällt. Alternativ kann die DNA Probe nach Elektrophorese durch ein Agarosegel gereinigt werden.
  • Amplifizierte VK Fragmente werden auf einem 2%igen Agarosegel gemäß Standardtechniken gereinigt. Die ungefähr 300 Basenpaar VK Fragmente werden dann mit den Restriktionsenzymen PvuII und BglII verdaut und in die komplementären Restriktionsschnittstellen eines Klonierungsvektors ligiert. Verschiedene Klonierungsvektoren sind kommerziell erhältlich. Zum Beispiel sind die pGEMTM Vektoren (Promega; Madison, WI) und ZAP EXPRESSTM Vektoren (Stratagene Cloning Systems; La Jolla, CA) zur Klonierung des VK Fragments verwendbar. Alternativ kann ein Vektor verwendet werden, der einen geeigneten Immunglobulinpromotor- und -leadersequenz enthält. Siehe zum Beispiel Orlandi et al., supra. Die ligierte DNA wird mittels eines Standard Calciumchlorid-Verfahrens in kompetente E. coli DH5α Zellen transformiert.
  • Zur Analyse der klonierten DNA werden Transformanten über Nacht bei 37°C in SOC (2% Bacto-Trypton, 0,5% Bacto-Hefeextrakt, 10 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 10 mM MgCl2, 10 mM MgSO4 und 20 mM Glukose) angezogen. Das SOC Medium enthält das passende Antibiotikum, um auf das Wachstum von Bakterien, die den Vektor enthalten, zu selektieren. Zum Beispiel enthält das SOC Medium 50 μg/ml Ampicillin zur Selektion auf das Wachstum von Bakterien, die einen pGEMTM Vektor tragen. Mini-Plasmid-DNA-Präparationen der Kolonien werden gemäß Standardverfahren hergestellt und der Restriktionsverdau-Analyse unterzogen. DNA von positiven Kolonien wird mittels der Didesoxymethode von Sanger et al., Proc. Natl. Sci. USA 75: 5463–5467 (1977) sequenziert. Die Ergebnisse der DNA Sequenzbestimmung werden dazu verwendet, sicher zu stellen, dass keine unerwünschten Mutationen durch die PCR Reaktion eingeführt wurden und dass die Mutationen) in der 18–20 Region eingeführt wurde(n).
  • (b) Transfektion von Säugerzellen
  • Restriktionsenzyme werden dazu verwendet, das DNA Fragment aus dem Aufbewahrungsvektor herauszuschneiden, das die VK-Sequenz mit der Asn-Glykosylierungssignalsequenz an Position 18 enthält. Das DNA Fragment wird dann in einen passenden Säuger-Expressionsvektor kloniert. Ein derartiger Vektor sollte die kodierende Sequenz der konstanten Region, einen Immunglobulin-Enhancer, einen Kappa-Enhancer und einen Arzneimittelselektionsmarker (bspw. das Hygromycinresistenzgen) enthalten. Als Beispiel siehe Orlandi et al., supra.
  • Ungefähr 10 μg des linearisierten, die leichte Kette tragenden Expressionsvektors, der den mutierten VK Bereich enthält, und 20–30 μg des linearisierten, die schwere Kette tragenden Expressionsvektors werden durch Elektroporation mittels Standardverfahren in Säugerzellen kotransfektiert. Zum Beispiel werden ungefähr 106 SP2/0-AG14 nicht-sekretierende Myelomzellen (ATCC CRL 1581) gemäß der Technik von Co et al., J. Immunol. 148: 1149–1154 (1992) oder gemäß ähnlicher Techniken, die entweder in Sambrook et al., supra, oder in CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, Ausubel et al., eds., John Wiley & Sons (1989) beschrieben sind, transfektiert. Nach der Transfektion werden die Zellen in 96-Loch Mikrotiterplatten in vollständig Hybridomaserum-freiem Medium (GIBCO/BRL) bei 37°C in 5% Kohlendioxid angezogen. Zwei Tage später wird der Selektionsprozess durch Zugabe von Medium, das das passende Selektionsmittel (zum Beispiel Hygromycin) enthält, initiiert. Üblicherweise zeigen sich zwei bis drei Wochen nach der Elektroporation Kolonien. Zur Expansion werden die Kolonien in 24-Loch Schalen überführt.
  • (c) Assay für Antikörper-sekretierende Transfektoma-Klone
  • Ein ELISA Test wird verwendet, um Antikörper-sekretierende Transfektoma-Klone zu selektieren. Kurz gesagt werden Überstände von konfluenten Vertiefungen verdünnt und 100 μl einer jeden Verdünnung werden dreifach in ELISA Mikrotiterplatten zugegeben, die zuvor mit Schaf anti-Maus IgG spezifischem Antikörper beschichtet wurden (The Binding Site Ltd.; San Diego, CA). Nach Inkubation der Mikrotiterplatten für eine Stunde bei Raumtemperatur werden ungebundene Proteine entfernt, indem die Platten drei Mal mit Waschpuffer (PBS mit 0,05% Polysorbat-20) gewaschen werden. Gebundene Antikörper lässt man mit Peroxidase-konjugiertem Ziegen anti-Maus IgG-spezifischem Antikörper (HyClone Laboratories; Logan, Utah) reagieren. Nach dreimaligem Waschen der Platte mit Waschpuffer werden in jede Vertiefung 100 μl Substratlösung (3,3 mg/ml ortho-Phenylendiamin und 0,12% Wasserstoffperoxid in 0,02 M Citratpuffer (pH 5,0)) zugegeben. Die Farbentwicklung erfolgt 30 Minuten lang im Dunklen, und die Reaktion wird durch die Zugabe von 50 μl 4 M HCl pro Vertiefung gestoppt. Ein automatisierter ELISA-Plattenleser (Bio-Tek Instrument; Winooski, VT) wird zur Absorptionsmessung bei 490 nm verwendet.
  • Alternativ können chimäre oder humanisierte mutierte Antikörper nachgewiesen werden, indem ELISA Mikrotiterplatten mit Ziegen anti-Mensch Fab oder Kappa-spezifischem Antikörper (Jackson ImmunoResearch; West Grove, PA) beschichtet werden und gebundener Antikörper mit Peroxidase-konjugiertem Ziegen anti-Mensch Fc-spezifischem Antikörper (Jackson ImmunoResearch; West Grove, PA) nachgewiesen wird.
  • (d) Reinigung und Analyse der Antikörper
  • Transfektoma-Zellen werden als 500 ml Kulturen in serum-freiem Medium angezogen bis sie konfluent sind. Die Kulturen werden zentrifugiert, um die Zellen zu pelletieren, und die Überstände werden durch eine 0,2 Micron Membran gefiltert. Antikörper werden isoliert, indem die Überstände mittels Schwerkraft mit einer Geschwindigkeit von 0,5–1 ml/min durch eine drei Milliliter Protein-A Säule geschickt werden. Die Säule wird anschließend mit 20 ml PBS gewaschen und gebundene Antikörper werden mit 10 ml einer Lösung, die 0,1 M Glycin und 10 mM EDTA (pH 3,5) enthält, eluiert. Ein Milliliter Elutionsfraktionen werden in Anwesenheit von 10 μl 3 M Tris (pH 8,6) gesammelt. Das Vorhandensein von Antikörpern wird durch Absorptionsmessung bei 280 nm erkannt und Elutionsfraktionen, die eine Absorption über dem Hintergrund aufweisen, werden vereinigt, gefiltert, gegen PBS dialysiert und mit einer Centricon 30® (Amicon; Beverly, MA) konzentriert. Die Antikörper Endkonzentrationen werden durch ELISA bestimmt und Antikörperkonzentrationen werden auf 1 mg/ml in PBS mit 0,01% (w/v) Natriumazid eingestellt.
  • Glykosylierung der leichten Kette wird durch Elektrophorese der gereinigten Antikörper oder Antikörperfragmente auf einem 4–20% SDS-Polyacrylamid-Gradientengel unter reduzierenden Bedingungen gemäß Standardverfahren durchgeführt. Siehe zum Beispiel CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY, Coligan et al., eds., John Wiley & Sons (1991). Das Vorhandensein der Glykosylierung der leichten Kette wird durch ein höheres apparentes Molekulargewicht und die Anwesenheit mehrerer Banden der leichten Kette angezeigt.
  • (e) Herstellung von Konjugaten
  • Die direkten oder indirekten Verfahren können an dieser Stelle angewendet werden, um Immunkonjugate zu erhalten, wie unten beschrieben ist.
  • Beispiel 2
  • Herstellung von Antikörperfragmenten
  • Fab, Fab', F(ab)2 oder F(ab')2 Fragmente können aus Transfectoma-Zellen erhalten werden, indem das Strukturgen für die schwere Kette im Expressionsvektor für die schwere Kette mutiert wird. Die Fab Expression wird erreicht, indem ein Stopp-Codon auf die Sequenz der CH1 Domäne folgend eingeführt wird. Im Gegensatz dazu werden die Fab' und F(ab')2 Expression erreicht, indem ein Stopp-Codon nach der Sequenz, die den Scharnierbereich der schweren Kette kodiert, eingeführt wird. Antikörperfragmente werden aus Transfektoma-Kulturüberständen durch Größenausschluss-Chromatographie, Ionenaustausch-Chromatographie oder Affinitäts-Chromatographie gereinigt, wie in Coligan et al., supra, beschrieben. Alternativ kann ein kommerziell erhältliches Reinigungssystem wie eine Quick MAB Säule (Sterogen; Santa Clara, CA) zur Reinigung der Fragmente verwendet werden.
  • Alternativ können Antikörperfragmente aus intakten Antikörpern durch Proteolyse erzeugt werden. Diese Techniken sind dem Fachmann wohlbekannt. Siehe zum Beispiel Coligan et al., supra, auf Seiten 2.8.1–2.8.10. Siehe auch Stanworth et al. „Immunochemical Analysis of Human and Rabbit Immunoglobulins and Their Subunits," in HANDBOOK OF EXPERIMENTAL IMMUNOLOGY, Vol. 1, D. M. Weir, ed., Blackwell Scientific pp. 12.1–12.46 (1986) und Parham "Preparation and Purification of Active Fragments from Mouse Monoclonal Antibodies," Id. auf Seiten 14.1–14.23. Als Beispiel kann preaktiviertes Papain folgendermaßen zur Herstellung von F(ab)2 Fragmenten aus IgG1 oder Fab Fragmenten von IgG2a oder IgG2b verwendet werden. Die Papainaktivierung erfolgt durch Inkubation von 2 mg/ml Papain (2 × rekristallisierte Suspension, Sigma #P3125) und 0,05 M Cystein (freie Base, kristallin; Sigma #C7755) für 30 Minuten in einem 37°C Wasserbad. Um Cystein zu entfernen wird die Papain/Cystein Mischung auf eine PD-10 Säule (Pharmacia #G-25) aufgetragen, die mit 20 ml Acetat/EDTA Puffer (0,1 M Acetat mit 3 mM EDTA, pH 5,5) äquilibriert wurde. Fraktionen werden durch Absorptionsmessung bei 280 nm untersucht und die zwei oder drei Fraktionen, die Protein enthalten, werden vereinigt. Die Konzentration des preaktivierten Papains wird durch folgende Formel bestimmt: (Absorption bei 280 nm)/2,5 = mg preaktiviertes Papain/ml.
  • Zur Bereitstellung von Antikörper für den Verdau werden 10 mg Antikörper in 2 bis 5 ml PBS gegen Acetat/EDTA Puffer dialysiert. Fünfhundert Mikrogramm preaktiviertes Papain wird der dialysierten Antikörperlösung zugegeben und die Mischung wird mittels „Vortex" gemischt. Nach 6–12 Stunden Inkubation in einem 37°C Wasserbad wird Papain durch Zugabe von kristallinem Iodacetamid (Sigma #16125) auf eine Endkonzentration von 0,03 M inaktiviert. Die Mischung wird dann bei 4°C 6–12 Stunden lang gegen 1 Liter PBS (pH 8,0) dialysiert.
  • Um unverdauten Antikörper und Fc Fragmente zu entfernen, wird die Mischung auf eine Protein-A-Sepharose-Säule aufgetragen, die mit PBS (pH 8,0) äquilibriert wurde. Ungebundene Fraktionen werden in 2 ml Aliquots gesammelt und vereinigt. Nach der Konzentrierung der Vereinigung auf 5 ml oder weniger wird das Protein durch Größenausschluss-Chromatographie fraktioniert und die Ergebnisse werden durch SDS-PAGE analysiert.
  • Beispiel 3
  • Direkte Konjugation an dem Kohlenhydratanteil der FR1 Region der variablen Domäne der leichten Kette von F(ab')2 Fragmenten
  • (a) Konjugation des Maus LL2 F(ab')2 Fragments mit Chelatbildner
  • LL2 ist ein Maus monoklonaler Antikörper, von dem bekannt ist, dass er wirksam für die Diagnose und Behandlung von Nicht-Hodgkins B-Zell-Lymphom eingesetzt werden kann. Goldenberg et al., J. Clin. Oncol. 9: 548–564 (1991); Murthy et al., Eur. J. Nucl. Med. 19: 394–401 (1992); Das LL2 F(ab')2 Fragment wurde entweder mit Aminobenzyl-DTPA (DTPA) oder einem Derivat von DTPA, das den langkettigen Linker -CSNH(CH2)10NH2 enthält (LC-DTPA), konjugiert. Kurz gefasst, wurde LL2 F(ab')2 Fragment (2,5 mg) in ungefähr 1 ml einer 50 mM Acetat-gepufferten 0,9% Salzlösung (ABS; pH 5,3) im Dunklen durch Behandlung mit Natriummetaperiodat (210 μl einer 5,68 mg/ml Lösung) eine Stunde lang bei 0°C oxidiert. Die Reaktionsmischung wurde mit Ethylenglykol (20 μl) behandelt, um das unreagierte Periodat zu zersetzen, und das oxidierte Antikörperfragment wurde unter Verwendung einer Sephadex® G-50/80 Säule (Pharmacia; Piscataway, NJ), äquilibriert mit PBS (pH 6,1), gereinigt. Das oxidierte Fragment wurde dann mit einem Überschuss DTPA oder LC-DTPA reagiert. Nach 40 Stunden bei Raumtemperatur wurde die Schiffsche Base mit NaBH3CN reduziert. Konjugierte Antikörper wurden mittels einer Zentrifugations-Größenausschluss-Säule (Sephadex® G-50/80), die mit 0,1 M Acetat (pH 6,5) äquilibriert war, gereinigt. Die Konzentrationen der Antikörperkonjugate wurden durch Absorptionsmessung bei 280 nm bestimmt.
  • Das Verhältnis von Chelatbildner-Molekül pro Molekül Antikörperfragment wurde durch einen Metallbindungstest bestimmt. Der Test wurde durchgeführt, indem ein Aliquot von LL2 F(ab')2-Chelatbildner-Konjugat mit 0,1 M Ammoniumacetat (pH 7) und 2 M Triethanolamin gemischt wurde, und die Mischung bei Raumtemperatur mit einem bekannten Überschuss an Kobaltacetat, dotiert mit 57Kobaltacetat, inkubiert wurde. Nach 30 Minuten wurde EDTA (pH 7) auf eine Endkonzentration von 10 mM zugegeben. Nach weiteren 10 Minuten Inkubation wurde die Mischung durch unmittelbare Dünnschicht-Chromatographie (instant thin layer chromatography, ITLC) analysiert, wobei 10 mM EDTA zur Entwicklung verwendet wurde. Der Bruchteil der Radioaktivität, der an den Antikörper gebunden war, wurde durch Auszählen von Ausschnitten von ITLC Streifen an einem gamma-Zähler bestimmt. Die Ergebnisse zeigten, dass ungefähr 6 Moleküle DTPA pro Antikörperfragment und ungefähr 5 Moleküle LC-DTPA pro Antikörperfragment vorhanden waren.
  • (b) Bestimmung der Immunreaktivität von LL2 F(ab')2-Chelatbildner-Konjugaten
  • Die Immunreaktivitäten der LL2 F(ab')2-DTPA- und LL2 F(ab')2-LC-DTPA-Konjugate wurden mittels eines ELISA Tests bestimmt. Die Ergebnisse zeigten, dass LL2 F(ab')2 und die DTPA- und LC-DTPA-Konjugate ähnliche Bindungsaktivitäten gegenüber einem LL2 antiidiotypischen Antikörper zeigen.
  • Zusätzlich wurden die Immunreaktivitäten der LL2 F(ab')2-DTPA- und LL2 F(ab')2-LC-DTPA-Konjugate in einem Bindungskonkurrenztest untersucht. In diesen Experimenten wurde ein menschlicher chimärer LL2 (IgG/Kappa) Antikörper verwendet, um mit LL2 F(ab')2 oder einem seiner Konjugate bei der Bindung an Raji Lymphomzellen (ATCC CCL 86) zu konkurrieren. Raji Zellen wurden in DMEM Medium kultiviert, das mit 10% fetalem Kälberserum und 2 mM L-Glutamin ergänzt wurde. Zellen wurden bei 37°C in 5% Kohlendioxid erhalten. Zellmedium und Komponenten wurden von Gibco/BRL (Gaithersburg, MD) bezogen.
  • In diesen Studien wurde 1 μg des chimären LL2 (IgG/Kappa) mit 5 × 105 Raji Zellen in Anwesenheit unterschiedlicher Konzentrationen von LL2 F(ab')2 oder seiner Konjugate in einem Endvolumen von 100 μl PBS, ergänzt mit 1% fetalem Kälberserum und 0,01% (w/v) Natriumazid (PBS-FA), inkubiert. Die Gemische wurden 30 Minuten lang bei 4°C inkubiert und anschließend drei Mal mit PBS gewaschen, um ungebundene Antikörper zu entfernen. Das Ausmaß an verbleibender Bindung durch chimären LL2 nach Konkurrenz wurde bestimmt durch Zugabe von 100 μl einer Lösung eines Ziegen anti-Mensch Fc-spezifischen Antikörpers, der mit Fluoresceinisothiocyanat (20 × verdünnte Stammlösung in PBS-FA) markiert wurde, und Inkubation für 30 Minuten bei 4°C. Nach dreimaligem Waschen der Mischung mit PBS wurde die Fluorszenzintensität mittels eines FACSCAN Zellsorters für fluoreszenzaktivierte Zellen gemessen. Die Ergebnisse dieser Studien zeigten, dass LL2 F(ab')2 und seine Konjugate eine ähnliche Bindung zu Raji Zellen aufwiesen.
  • Somit zeigen diese Studien, dass beide Konjugate immunreaktiv waren und Bindungsaktivitäten ähnlich zu denen der unkonjugierten LL2 F(ab')2 Fragmente aufwiesen.
  • (c) Markierung mit 111Indium
  • Die LL2 F(ab')2-Chelatbildner-Konjugate wurden folgendermaßen mit 111Indium markiert. 111Indiumchlorid wurde mittels Ammoniumacetat bei pH 5,5 gepuffert, so dass die Endkonzentration an Acetat ungefähr 0,2 M war. 111Indiumacetat wurde zu einer Lösung von LL2 F(ab')2-Konjugat in 0,1 M Acetat (pH 6,5) gegeben und die Mischung wurde ungefähr eine Stunde lang inkubiert. Die Reaktionsgemische enthielten entweder 9,7 μg LL2 F(ab')2-DTPA und 72,6 μCi 111Indium oder 10 μg LL2 F(ab')2-LC-DTPA und 126,7 μCi 111Indium.
  • Das Ausmaß des 111Indium-Einbaus wurde durch Inkubation des Markierungsgemisches mit 10 mM EDTA für 10 Minuten und nachfolgende ITLC Untersuchung unter Verwendung von 10 mM EDTA zur Entwicklung untersucht. In diesem Test bewegt sich 111Indium an die Lösungsfront, während Antikörper-gebundenes 111Indium am Ursprung verbleibt. Das Vorhandensein von kolloidalem 111Indium wurde durch ITLC (koaufgetragen mit humanem Serumalbumin) getestet, wobei eine Wasser : Ethanol : Ammoniak (5 : 2 : 1) Lösung zur Entwicklung verwendet wurde. In diesem System repräsentiert der am Ursprung verbleibende radioaktive Anteil kolloidales 111Indium. Zusätzlich wurden alle Markierungsgemische mittels Radio-Hochdruck-Flüssigkeits-Chromatographie (radio-high pressure liquid chromatography, Radio-HPLC) analysiert. Die Ergebnisse dieser Studien zeigten, dass 111Indium-markiertes LL2 F(ab')2-DTPA eine spezifische Aktivität von 7,47 μCi/μg Protein aufweist und dass 111Indium zu 97,4% (bestimmt durch ITLC) oder 92,5% (bestimmt durch Radio-HPLC) eingebaut wurde. Darüber hinaus hat 111Indium-markiertes LL2 F(ab')2-LC-DTPA eine spezifische Aktivität von 12,67 μCi/μg Protein und 111Indium wurde zu 95,6% (bestimmt durch ITLC) oder 94% (bestimmt durch Radio-HPLC) eingebaut. Die Menge an kolloidalem 111Indium ist üblicherweise etwa 1 bis 3%.
  • (d) Markierung mit 90Yttrium
  • LL2 F(ab')2-Chelatbildner-Konjugate wurden wie oben beschrieben hergestellt. Die Konjugate wurden folgendermaßen mit 90Yttrium markiert. Kurz beschrieben wurde kommerziell erhältliches 90Yttriumchlorid (DuPont NEN; 17,68 μl; 5,63 mCi) mit 35,4 μl 0,5 M Acetat (pH 6,0) gepuffert. Die Lösung wurde 5–10 Minuten bei Raumtemperatur stehen gelassen und dann zur Radiomarkierung verwendet.
  • 90Yttrium markiertes LL2 F(ab')2-DTPA wurde erzeugt durch Mischen von 90Yttriumacetat (128,7 μCi) mit LL2 F(ab')2-DTPA (30 μg; 8,3 μl), Inkubation bei Raumtemperatur für 1 Stunde und Verdünnen mit 90 μl 0,1 M Acetat (pH 6,5). 90Yttrium markiertes LL2 F(ab')2-LC-DTPA wurde erzeugt durch Mischen von 90Yttriumacetat (109,5 μCi) mit LL2 F(ab')2-LC-DTPA (30 μg; 7,6 μl), Inkubation bei Raumtemperatur für 1 Stunde und Verdünnen mit 90 μl 0,1 M Acetat (pH 6,5). Das Ergebnis des Markierungsvorgangs wurde durch ITLC in zwei Lösungsmittelsystemen und durch HPLC wie oben beschrieben getestet.
  • 90Yttrium markiertes LL2 F(ab')2-DTPA hatte eine spezifische Aktivität von 4,29 μCi/μg Protein, während 90Yttrium markiertes LL2 F(ab')2-LC-DTPA eine spezifische Aktivität von 3,65 μCi/μg Protein hatte. Radio-HPLC-Analyse zeigte, dass 90Yttrium in LL2 F(ab')2-DTPA zu 96% eingebaut wurde, während 90Yttrium in LL2 F(ab')2-LC-DTPA zu 90% eingebaut wurde.
  • Beispiel 4
  • Indirekte Konjugation an dem Kohlenhydratanteil des FR1 Bereiches der variablen Domäne der leichten Kette von F(ab')2 Fragmenten
  • (a) Herstellung des Zwischenstufenkonjugats
  • Das Maus F(ab')2 Fragment wurde gemäß dem Verfahren von Shih et al., Int. J. Cancer 41: 832–839 (1988) über Dextran mit Dexorubicin konjugiert. Kurz gesagt wurde Aminodextran durch Lösung von einem Gramm Dextran (Molekulargewicht 18 kD; Sigma Chemical Co.; St. Louis, MO) in 70 ml Wasser hergestellt. Das Dextran wurde durch Zugabe von 0,5 Gramm Natriummetaperiodat und Rühren der Lösung über Nacht bei Raumtemperatur teilweise oxidiert, um Polyaldehyddextran zu erzeugen. Nach der Konzentrierung des Gemisches mit einer Amicon Zelle (YM10 Membran; MWCO = 10000) wurde das Polyaldehyddextran durch Sephadex G-25 Chromatographie gereinigt und lyophilisiert, um ungefähr 900 Gramm weißes Pulver zu erhalten. Polyaldehyddextran wurde anschließend 24 Stunden lang bei Raumtemperatur mit zwei Äquivalenten 1,3-Diamino-2-hydroxypropan in wässriger Phase behandelt. Die resultierende Schiffsche Base wurde durch Zugabe von Natriumborhydrid (0,311 mmol pro 2,15 mmol 1,3-Diamino-2-hydroxypropan) zur Mischung stabilisiert. Das Gemisch wurde sechs Stunden lang bei Raumtemperatur inkubiert. Aminodextran wurde mittels einer Sephadex® G-25 Säule gereinigt.
  • Doxorubicin (Sigma Chemical Co.; St. Louis, MO) wurde aktiviert durch Zugabe von einem Milliliter wasserfreiem DMF zu 0,1 mmol Doxorubicin in einem ausgetrocknetem Reacti-Reaktionsgefäß gefolgt durch eine Lösung von N-Hydroxysuccinimid (23 mg, 0,2 mmol; Sigma) in 750 μl wasserfreiem DMF und einer Lösung aus 1,3- Dicyclohexylcarbodiimid (41,5 mg, 0,2 mmol; Sigma) in 750 μl wasserfreiem DMF. Das Reaktionsgemisch wurde 16 Stunden lang im Dunklen bei Raumtemperatur unter wasserfreien Bedingungen gerührt. Das Nebenprodukt, das heißt das Harnstoffderivat, präzipitierte in diesem Lösungsmittelsystem schlecht. Das Präzipitat wurde zentrifugiert und die Lösung wurde in einer versiegelten Flasche bei –20°C aufbewahrt.
  • Doxorubicin-Dextran Zwischenstufenkonjugat wurde hergestellt durch Verdünnen von Aminodextran (18 kD; 10 mg) in zwei Milliliter PBS (pH 7,2) und allmählicher Zugabe von 0,7 ml der obigen N-Hydroxysuccinimid-aktivierten Doxorubicin Lösung. Somit waren 50 Mol Doxorubicin pro Mol Aminodextran vorhanden. Die Lösung wurde fünf Stunden lang bei Raumtemperatur gerührt und nach Entfernung von sämtlichem Präzipitat wurde das Konjugat mittels einer Sephadex G-25 Säule gereinigt. Das Doxorubicin-Dextran Konjugat war durch ein Doxorubicin/Dextran Verhältnis von 14 gekennzeichnet.
  • Alternativ wurde das Doxorubicin-Dextran Konjugat hergestellt durch Reaktion von Doxorubicin mit 1-Ethyl-3(3-Dimethylaminopropyl)-carbodiimid wie beschrieben von Shih et al., Int. J. Cancer 41: 832–839 (1988). Siehe auch Shih et al., Cancer Research 51: 4192–4198 (1991).
  • (b) Ortsspezifische Bindung des Zwischenstufenkonjugats an LL2 F(ab')2
  • LL2 F(ab')2 Fragment (25 mg) in 5 ml PBS (pH 5,5) wurde im Dunklen durch Behandlung mit Natriummetaperiodat (800 μl einer 21,5 mg/ml Lösung) bei Raumtemperatur für 60 Minuten oxidiert. Das Reaktionsgemisch wurde mit Ethylenglykol (50 μl) behandelt, um das unreagierte Periodat zu zersetzen, und das oxidierte Antikörperfragment wurde mittels einer Sephadex G-25 Säule, die mit 0,05 M HEPES (pH 7,4) äquilibriert war, gereinigt. Das oxidierte Fragment wurde dann auf 5 mg/ml in 0,05 M HEPES (pH 7,4) konzentriert und mit dem Doxorubicin-Dextran Konjugat (22 mg) zur Reaktion gebracht. Nach 24 Stunden bei Raumtemperatur wurde die Schiffsche Base mit NaBH3CN reduziert. Konjugierter Antikörper wurde unter Verwendung einer Sepharose CL-6B Säule gereinigt.
  • Mit diesem Verfahren können an jedes LL2 F(ab')2 Fragment durchschnittlich neun Doxorubicinmoleküle an die Kohlenhydratstelle der FR1 Region der variablen Domäne der leichten Kette gekoppelt werden. Dieses Verhältnis wurde durch Messung der Konzentrationen von Doxorubicin (A482) und Protein (A280) bestimmt. Das Konjugat behält 80% der Immunreaktivität des unkonjugierten LL2 F(ab')2 Fragments bei, wie durch das oben beschriebene durchflusszytometrische Verfahren bestimmt wurde.
  • Beispiel 5
  • Einführung einer Asn-gebundenen Glykosylierungsstelle in die VK FR1 Region von humanisiertem MN14
  • Eine Asn-Glykosylierungsstelle wurde in die VK FR1 Region von humanisiertem MN14, einem Antikörper, der karzinoembryonales Antigen bindet, eingeführt. Kurz gesagt wurde die Nukleotidsequenz, die Arg18 kodiert, zu einer Nukleotidsequenz, die Asn18 kodiert, mutiert, wozu die in Beispiel 1 beschriebene PCR-Methode verwendet wurde. In diesem Fall wurde DNA aus dem die leichte Kette für humanisierten MN14 exprimierenden Vektors als Vorlage für die PCR verwendet. Der VKFOR1 Primer von Orlandi et al. wurde als 3' Primer benutzt. Der 5' Primer bestand aus einem 57-mer, das die ersten 20 Aminosäuren der MN14 VK Domäne kodierte, mit der Ausnahme, dass das Codon an Position 18 Asn kodierte. Das ungefähr 300 Basenpaar große PCR Produkt wurde mit PvuII und BglII verdaut und in komplementäre Stellen eines Aufbewahrungs- oder Klonierungsvektors ligiert. Kompetente DH5α Zellen wurden gemäß Standard Calciumchloridmethode mit dem Aufbewahrungs- oder Klonierungsvektor transformiert. Siehe zum Beispiel Ausubel et al., supra.
  • Das DNA Fragment, das die humanisierte MN14 VK Sequenz mit einer Asn-Glykosylierungssignalsequenz an Aminosäureposition 18 enthält, wurde in einen pSVhyg-basierten Expressionsvektor für die leichte Kette subkloniert. SP2/0-AG14 nicht-sekretierende Myelomzellen wurden durch Elektroporation mit dem linearisierten Expressionsvektor für die leichte Kette und mit einem linearisierten Expressionsvektor für die schwere Kette kotransfektiert. Transfektoma-Zellen wurden unter Verwendung von Hygromycin-B selektiert und zur Erzeugung von Antikörper kultiviert.
  • Antikörper wurde gereinigt und auf einem reduzierenden SDS-PAGE Gel analysiert. Die leichte Kette des glykosylierten humanisierten MN14 wanderte als multiple Banden und lief bei einem höheren Molekulargewicht als die nicht-glykosylierte leichte Kette des MN14. Dieses Ergebnis zeigt, dass die neue Asn-gebundene Glykosylierungsstelle zur Kohlenhydrataddition verwendet wurde.
  • Bedeutenderweise waren die MN14 Blockierungsaktivitäten des glykosylierten Antikörpers und des nicht-glykosylierten MN14 Antikörpers praktisch gleich. Somit beeinflusst die Glykosylierung in der VK FR1 Region des humanisierten MN14 nicht seine Immunreaktivität.
  • Beispiel 6
  • Direkte Konjugation von DOTA an den Kohlenhydratanteil der FR1 Region der variablen Domäne der leichten Kette von F(ab')2 Fragmenten
  • (a) Konjugation des Maus RS7 F(ab')2 Fragments mit DOTA
  • Mab RS7 ist ein sich rasch international verbreitender Antikörper, der Reaktivität gegenüber Lungen-, Bauch-, Blasen-, Brust-, Ovar-, Uterus- und Prostatakarzinomen zeigt (Stein et al., 1990, Cancer Res. 50, 1330–1336). Durch Anwendung der oben beschriebenen Verfahren wird eine Glykosylierungsstelle NVT an Position 18–20 der VK Domäne von RS7 eingeführt. Der glykosylierte RS7 wird in SP2/0-AG14 Myelomzellen exprimiert und das F(ab')2 Fragment wird wie oben beschrieben erhalten.
  • Zu 2 mg F(ab')2 Fragment von RS7 in 1 ml 0,1 M Phosphat-gepufferter 0,9%iger Natriumchloridlösung pH 7,2 (PBS) werden 400 μl 2,84 mg/ml Natriummetaperiodat gegeben. Das Reaktionsgemisch wird im Dunklen bei Raumtemperatur 90 Minuten lang gerührt und es werden 20 μl Ethylenglykol zugegeben, um die Oxidationsreaktion zu stoppen. Das oxidierte Antikörperfragment wird über eine Sephadex® G-25 Größenausschlusssäule (Pharmacia; Piscataway, NJ), die mit PBS (pH 6,1) äquilibriert wurde, gereinigt. Der Antikörper wird mit einer Centricon 30® (Amicon; Beverly, MA) auf 2 mg/ml rekonzentriert und mit einem Überschuss 2-p-Aminobenzyl-1,4,7,10-tertraazacyclododecantetraessigsäure (NH2-Bz-DOTA) behandelt. Das Gemisch lässt man 48 Stunden lang bei 4°C reagieren. Die Schiffsche Base wird in situ durch Zugabe eines 10-fachen molaren Überschusses (gegenüber dem Antikörper) von Natriumcyanoborhydrid und nachfolgendem Rühren für 30 Minuten reduziert. Das DOTA-F(ab')2-Konjugat wird unter Verwendung einer Zentrifugations-Größenausschluss-Säule (Sephadex® G-50/80), die mit 0,1 M Acetat-gepufferter 0,9%iger Natriumchloridlösung (ABS, pH 6,5), die mit säuregewasche nen Komponenten und mit metallfreien Medien hergestellt wurde, äquilibriert ist, gereinigt. Die Konzentration des Antikörperkonjugats wird durch seine Absorption bei 280 nm bestimmt und das Verhältnis von Chelat pro Mol Antikörper wird durch den Kobalt-57 Bindungstest wie in Beispiel 3 bestimmt.
  • Kommerziell erhältliches Yttrium-90 Chlorid (8,9 mCi, 27 μl) wird mit 81 μl 0,5 M ABS, pH 6, behandelt und die Lösung durch „Vortex" gemischt. Sie wird 15 Minuten stehen gelassen und dann bei der unten beschriebenen Markierung verwendet.
  • Dem DOTA-markierten RS7 F(ab')2 Konjugat (1 mg, 73 μl) in einem säuregewaschenen Kunststoffreaktionsgefäß wird Yttrium-90 Acetat (4,94 mCi, 60 μl) in ABS zugegeben. Die Gefäßinhalte werden mittels „Vortex" gut gemischt und 1 Stunde bei Raumtemperatur stehen gelassen. Dann wurden dem Markierungsgefäß 850 μl 0,1 M ABS zugegeben und gemischt. Das Markierungsergebnis wird durch unmittelbare Dünnschicht-Chromatographie in zwei Lösungsmittelsystemen wie in Beispiel 3 beschrieben getestet.
  • Beispiel 7
  • Indirekte Konjugation unter Verwendung eines Polyamidoamindendrimers als Zwischenstufenträger an dem Kohlenhydratanteil der FR1 Region der variablen Domäne der leichten Kette von F(ab')2, Fragmenten
  • (a) Herstellung des Zwischenstufenkonjugats
  • Das wie oben beschrieben oxidierte Maus RS7 F(ab')2' Fragment wurde über ein Polyamidoamindendrimer der zweiten Generation mit DOTA konjugiert. Das Dendrimer wurde gemäß dem Verfahren von Tomalia et al., Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 29: 138–175 (1990) hergestellt. Das Dendrimer (10 μM in 8 ml Wasser) wurde 24 Stunden lang mit 150 μM 2-(p-Isothiocyanatobenzyl)-1,4,7,10-tetraazacyclododecyltetraessigsäure bei 40°C, pH 9 reagiert, wobei periodisch 0,2 M NaOH zugegeben wurde, um den pH der Lösung bei 9,0 zu halten. Unreagierter Ligand wurde durch Ultrazentrifugation in einer gerührten Zelle (Amicon, MA), die mit einem 3000 MW cut-off Filter ausgestattet war, entfernt. Nach Lyophili sierung wurde das Dendrimer-Chelatbildner-Konjugat in ABS resuspendiert und wie in Beispiel 6 beschrieben an das RS7 F(ab')2 Fragment konjugiert.
  • Beispiel 8
  • Konjugation von Hz-PEG (Methoxypolyethylenglykolhydrazid) an das Kohlenhydrat der leichten Kette von F(ab')2
  • Konjugationsprotokoll (a)
  • IMMU-LL2-F(ab')2 Kohlenhydratanteil wurde 90 Minuten lang bei 0°C mit Natriumperiodat (20 mM Endkonzentration) bei pH 6 oxidiert. Das oxidierte Fragment wurde durch Zentrifugationssäulentechnik (Sephadex® G-50-80) in PBS pH 6,0 vom überschüssigen Periodat abgetrennt. Die Hydrazonbindung wurde erhalten, indem Methoxy-PEG-hydrazid (MW 5000, Shearwater Polymers, Inc., Huntsville, AL) im molaren Überschuss zur gereinigten oxidierten Zwischenstufe gegeben wurde. Die Reaktion erfolgte zwei Stunden lang bei Raumtemperatur. Die Produkte wurden mit einer Zentrifugationssäule mit Sephadex® G-50-80, 0,1 M Natriumphosphat pH 7 gereinigt und durch Größenausschluss-HPLC unter Verwendung einer BioSil SEC-400 Säule und Elution mit 0,2 M Natriumphosphat, 0,02% Natriumazid, pH 6,8 analysiert.
  • Die Ergebnisse zeigten 16% unmodifizierte F(ab')2 bei der Reaktion mit 50 × molarem Überschuss und nur 2,3% unmodifizierte F(ab')2 bei der Reaktion mit 300 × molarem Überschuss an Hz-PEG.
  • Konjugationsprotokoll (b)
  • IMMU-LL2-F(ab')2, 200 μl (2,1 mg, 2,1 × 10–8 mol) wurde mit 29,4 μl 0,5 M NaIO4 (700 × 2,1 × 10–8 mol) für 45 Minuten bei 26°C oxidiert. Das oxidierte Fragment wurde durch zwei aufeinanderfolgende 2,4 ml Zentrifugationssäulen (Sephadex® G-50-80) in 0,1 M Natriumphosphat pH 7 vom überschüssigen NaIO4 abgetrennt.
  • Konjugation von Methoxy-Hz-PEG an das oxidierte Fragment wurde erreicht durch Inkubation von 205 μl (1,52 mg, 1,52 × 10–8 mol) oxidiertem IMMU-LL2-F(ab')2 mit 22,8 mg (300 × 1,52 × 10–8 mol) Methoxy-Hz-PEG (MW 5000) bei 25°C für eine Sunde. Das Konjugat wurde über (vier aufeinanderfolgende 2,4 ml) Zentrifugationssäulen aus Sephadex® G-50-80 mit Elution mit 0,1 M Natriumphosphat pH 7 gereinigt. HPLC-Analyse auf einer Größenausschlusssäule aus BioSil 400® mit Elution mit 0,2 M Natriumphosphat, 0,15 M Natriumchlorid, 0,02% Natriumazid, pH 6,8 zeigte zwei neue Peaks bei 7,4 (16,9%) und 8,3 min (83,1%).
  • Beispiel 9
  • Herstellung des bifunktionalen chelatbildenden Agens (5)
  • Das folgende Beispiel verdeutlicht ein Verfahren zur Herstellung eines besonders bevorzugten bifunktionalen chelatbildenden Agens zur Verwendung im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung. Das Radiomarkieren von Proteinen oder Antikörpern, die endständige Sulfhydrylgruppen aufweisen, unter Verwendung der bifunktionalen chelatbildenden Agenzien, die in diesem Beispiel hergestellt werden, und die Verwendung der radiomarkierten Proteine oder Antikörper in bildgebenden Radioimmunverfahren oder in Radioimmuntherapieverfahren liegt im Kenntnisbereich des Fachmanns. Die Reaktionsfolge ist unten gezeigt.
    • (a). Zu einer gerührten Lösung von N-ε-(t-Butoxycarbonyl)lysin in Tetrahydrofuran (THF), die unter Argon auf 4°C gekühlt ist, wird tropfenweise Bor-Tetrahydrofurankomplex (1 Äquivalent) zugegeben. Nach 2 Stunden wird überschüssiges Bor durch vorsichtige Zugabe von wässrigem THF zersetzt. Das Reaktionsgemisch wurde anschließend 10 bis 18 Stunden lang mit 5 M Natriumhydroxid refluxiert, um die Borsäureester abzubauen. Die wässrige Lösung wurde gründlich mit Chloroform extrahiert, mit Salzlösung gewaschen, über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und in einem Rotationsverdampfer zur Trockenheit konzentriert, wodurch 2-Amino-6-N(t-butoxycarbonyl)amino-1-hexanol erhalten wurde (1).
    • (b). Die Verbindung (1) wird bei 4°C in Ethanol gelöst und 10 Minuten lang wird Formaldehydgas (erzeugt durch Aufheizen von Paraformaldehyd in einem Argonstrom) in die Lösung eingeleitet. Anschließend wird langsam Natriumborhydrid (10 Äquivalente) zugegeben, wobei die Temperatur auf 4°C gehalten wird. Die Mischung wird bis zur Trockene eingedampft und in schneller Folge werden dem Rest tropfenweise 0,1 M HCl und eine gesättigte Natriumbicarbonat Lösung zugegeben. Die Lösung wird mit Ethylacetat extrahiert, mit Salzlösung gewaschen und die organische Schicht über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und zur Trockenheit konzentriert. Das Produkt wird nochmals wie oben beschrieben mit Formaldehyd und Natriumborhydrid behandelt, um 2-(N,N-Dimethylamino)-6-[N-(t-butoxycarbonyl)amino]-1-hexanol zu liefern (2).
    • (c). Zu einer Lösung von (2) in Dichlormethan bei 4°C wird wasserfreies Kaliumcarbonat (20 Äqu.) gegeben und die Suspension wird kräftig gerührt, während tropfenweise ein Überschuss Thionylchlorid zugegeben wird. Nach einer Stunde wird das Lösungsmittel und überschüssiges Thionylchlorid in einem Rotationsverdampfer entfernt und der Rest mit Ethylacetat extrahiert. Eindampfen bis zur Trockene ergibt 1-(N,N-Dimethylamino)-5-(t-butoxycarbonyl)amino-1-chlormethylpentan (3), das wenn nötig durch Chromatographie über ein Silicagel weiter gereinigt werden kann.
    • (d). Zu einer Lösung von (3) in Toluen wird 1,8-Diazabicyclo[5.4.0]undec-7-en (2,2 Äqu.) gefolgt von Thiobenzoesäure (1,1 Äqu.) gegeben und die Lösung wird unter Rückfluss erhitzt. Der Fortgang der Reaktion wird durch Dünnschicht-Chromatographie (TLC) auf Silicagel-Platten verfolgt, wobei die Sichtbarmachung mittels 5% Phosphomolybdänsäure in Ethanol erfolgt. Wenn die Reaktion vollständig ist, wird der organische Auszug bis zur Trockene eingedampft und der Rest in Chloroform wiedergelöst, ein Mal mit Wasser gewaschen, über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und eingedampft, um rohes S-Benzoyl-2-(N,N-dimethylamino)-5-(t-butoxycarbonyl)aminomercaptan (4) zu erhalten. Diese Verbindung wird durch Blitzchromatographie weiter gereinigt.
    • (e). Zu einer bei Raumtemperatur gerührten Lösung von (4) in Dichlormethan wird Trifluoressigsäure (10 Äqu.) gegeben. Nach zwei Stunden wird das Lösungsmittel bis zur Trockene eingedampft, um (5) zu ergeben, was direkt zur Konjugation an das oxidierte Kohlenhydrat des Antikörperfragments verwendet wird.
  • Beispiel 10
  • Kopplung des bifunktionalen chelatbildenden Agens (5) an einen oxidierten Antikörper
  • LL2 F(ab')2 Fragment (2,5 mg) in ungefähr 1 ml 50 mM Acetat-gepufferter 0,9%iger Salzlösung (ABS; pH 5,3) wird im Dunklen durch Behandlung mit Natriummetaperiodat (210 μl einer 5,68 mg/ml Lösung) bei 0°C für eine Stunde oxidiert. Das Reaktionsgemisch wird mit Ethylenglykol (20 μl) behandelt), um das unreagierte Periodat zu zersetzen, und das oxidierte Antikörperfragment wird über eine mit PBS (pH 6,1) äquilibrierte Sephadex G-50-80 Säule (Pharmacia; Piscataway, NJ) gereinigt. Das oxidierte Fragment wird dann mit einem Überschuss an chelatbildendem Agens (5) zur Reaktion gebracht. Nach 40 Stunden bei Raumtemperatur wird die Schiffsche Base mit NaBH3CN reduziert. Konjugierter Antikörper wird über eine Zentrifugations-Größenausschluss-Säule (Sephadex® G-50-80), äquilibriert mit 0,1 M Acetat (pH 6,5), gereinigt. Die Antikörperkonjugat-Konzentrationen werden durch Absorptionsmessung bei 280 nm bestimmt.
  • Beispiel 11 Herstellung eines bifunktionalen chelatbildenden Agens (10)
    Figure 00580001
    • (a). Zu einer gerührten Lösung von 2-Amino-6-N(t-butoxycarbonyl)amino-1-hexanol (1) in wasserfreiem Acetonitril wurde wasserfreies Natriumcarbonat gefolgt von t-Butylbromacetat (2,2 Äqu.) gegeben. Das Gemisch wurde 6–10 Stunden lang unter Rückfluss gerührt und anschließend mit Ethylacetat extrahiert. Diese Lösung wurde bis zur Trockene eingedampft und durch Chromatographie über ein Silicagel gereinigt, um (6) mit 68–75% Ausbeute zu liefern.
    • (b). Zu einer bei Raumtemperatur gerührten Lösung von (6) in Dichlormethan wurde Trifluoressigsäure (10 Äqu.) gegeben. Nach 1 Stunde wurde das Lösungsmittel in vacuo entfernt und der Rest in trockenem THF gelöst. Die Lösung wurde auf 4°C gekühlt und Bor-THF Komplex (3 Äqu.) wurde tropfenweise über 15 Minuten hinweg zugegeben. Nach zweistündigem Rühren wurde überschüssiges Bor mit wässrigem THF zersetzt und der Borsäureester wurde durch 10–18 Stunden Refluxierung mit 5 M wässrigem Natriumhydroxid abgebaut. Das Gemisch wurde mit Ethylacetat extrahiert und die organische Lösung wurde mit Salz gewaschen, über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und in vacuo bis zur Trockene eingedampft. Der Rest wurde in THF : Wasser (1 : 1) aufgenommen und der pH mit 0,1 M NaOH auf 10 eingestellt. Di-t-butyldicarbonat (2,2 Äqu.) wurde portionsweise zugegeben, wobei der pH durch die jeweils notwendige Zugabe von 0,1 M NaOH auf 9–10 gehalten wurde. Eine Stunde nach Beendigung der Zugabe wurde die Lösung mit Ethylacetat extrahiert und die organische Schicht in vacuo getrocknet und eingedampft. Der Rest wurde über Silicagel chromatographiert, um (7) zu ergeben.
    • (c). Zu einer auf 4°C abgekühlten Lösung von (7) in Chloroform wurde wasserfreies Kaliumcarbonat (20 Äqu.) gegeben und die Suspension wurde kräftig gerührt, während tropfenweise ein Überschuss Thionylchlorid zugegeben wurde. Nach einer Stunde wurde das Lösungsmittel und überschüssiges Thionylchlorid in einem Rotationsverdampfer entfernt und der Rest mit Ethylacetat extrahiert. Eindampfen bis zur Trockene ergab (8).
    • (d). Zu einer Lösung von (8) in Toluen wurde 1,8-Diazabicyclo[5.4.0]undec-7-en (1,8 Äqu./Chloridgruppe) gefolgt von Thiobenzoesäure (1,4 Äqu./Chloridgruppe) gegeben und die Lösung unter Rückfluss erhitzt. Der Fortgang der Reaktion wurde durch Dünnschicht-Chromatographie (TLC) auf Silicagel-Platten verfolgt, wobei die Sichtbarmachung mittels 5% Phosphomolybdänsäure in Ethanol erfolgte. Als die Reaktion beendet war, wurde der organische Auszug bis zur Trockene eingedampft und der Rest in Chloroform gelöst, ein Mal mit Wasser gewaschen, über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und in vacuo eingedampft, um rohes (9) zu erhalten, das durch Blitzchromatographie weiter gereinigt wurde. Das 1H NMR Spektrum (400 MHz) von (9) zeigte Signale bei: 7,95 (m, 6H), 7,55 (t, 3H, J = 8), 7,42 (m, 6H), 3,25–2,75 (m, 13H), 1,6–1,2 (m, 6H), 1,44 (s, 9H).
    • (e). Zu einer bei Raumtemperatur gerührten Lösung von (9) in Dichlormethan wurde Trifluoressigsäure (10 Äqu.) gegeben. Nach zwei Stunden wurde das Lösungsmittel bis zur Trockene eingedampft, um (10) zu ergeben, was direkt zur Konjugation verwendet wird, wie im obigen Beispiel 10 beschrieben ist.
  • Beispiel 12 Herstellung eines bifunktionalen chelatbildenden Agens (14)
    Figure 00600001
    • (a). Zu einer Lösung von Diethylentriaminpentaessigsäure (DTPA) in DMF wird Triethylamin (1 Äqu.) gefolgt von 4-Nitrophenethylamin (0,25 Äqu.) gegeben. Nach zweistündigem Rühren wird 0,1 M NaOH (Überschuss) zugegeben. Nach 1 Stunde wird die Lösung mit 0,1 M HCl angesäuert und die Lösung in vacuo eingedampft. Der organische Rest wird in wasserfreiem THF aufgenommen, über Magnesiumsulfat getrocknet, gefiltert und auf 4°C abgekühlt. Bor-THF Komplex (6 Äqu.) wird tropfenweise über 15 Minuten hinweg zugegeben. Nach zweistündigem Rühren wird 0,1 M HCl zugegeben, um Borsäureester abzubauen. Ein Überschuss an gesättigter Natriumbicarbonat-Lösung wird zugegeben, und das Gemisch mit Ethylacetat extrahiert. Die organische Lösung wird mit Salz gewaschen, über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und in vacuo bis zur Trockene eingedampft, um (11) zu ergeben.
    • (b). Zu einer bei Raumtemperatur gerührten Lösung von (11) in Methanol wird Palladium an einem Kohlekatalysator (0,1 Äqu.) gegeben. Die Suspension wird unter Wasserstoffatmosphäre gestellt und die Reduktion wird so lange zugelassen, bis TLC die Abwesenheit von (11) anzeigt. Das Reaktionsgemisch wird drei Mal mit Argon gespült, zur Entfernung des Katalysators gefiltert, und bis zur Trockene eingedampft. Der Rest wird in THF : Wasser (1 : 1) aufgenommen und der pH mit 0,1 M NaOH auf 10 eingestellt. Di-t-butyldicarbonat (2,2 Äqu.) wird portionsweise zugegeben, wobei der pH durch die jeweils notwendige Zugabe von 0,1 M NaOH auf 9–10 gehalten wird. Eine Stunde nach Beendigung der Zugabe wird die Lösung mit Ethylacetat extrahiert und die organische Schicht getrocknet und in vacuo eingedampft. Der Rest wird über Silicagel chromatographiert, um (12) zu ergeben.
    • (c). Zu einer Lösung von (12) in Chloroform bei 4°C wird wasserfreies Kaliumcarbonat (20 Äqu.) gegeben und die Suspension kräftig gerührt, während tropfenweise ein Überschuss Thionylchlorid zugegeben wird. Nach einer Stunde wird das Lö sungsmittel und überschüssiges Thionylchlorid in einem Rotationsverdampfer entfernt und der Rest mit Ethylacetat extrahiert. Das Lösungsmittel wird in vacuo bis zur Trockene eingedampft und der Rest wird in Toluen aufgenommen. 1,8-Diazabicyclo[5.4.0]undec-7-en (2,2 Äqu.) wird gefolgt von Thiobenzoesäure (1,1 Äqu.) zugegeben und die Lösung unter Rückfluss erhitzt. Nach 5 Stunden wurde der organische Auszug bis zur Trockene eingedampft und der Rest in Chloroform wiedergelöst, ein Mal mit Wasser gewaschen, über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und in vacuo eingedampft, um rohes (13) zu erhalten, das durch Blitzchromatographie weiter gereinigt wird.
    • (d). Zu einer bei Raumtemperatur gerührten Lösung von (13) in Dichlormethan wird Trifluoressigsäure (10 Äqu.) gegeben. Nach zwei Stunden wird das Lösungsmittel bis zur Trockene eingedampft, und der Rest wird direkt zur Konjugation, wie im obigen Beispiel 10 beschrieben ist, verwendet.
  • Beispiel 13 Herstellung eines bifunktionalen chelatbildenden Agens (19)
    Figure 00610001
    • (a). Zu einer Lösung von 1,4,8,11-Tetraazacyclotetradecan in wasserfreiem Acetonitril wird wasserfreies Natriumcarbonat gefolgt von t-Butylbromacetat (6 Äqu.) gegeben. Das Gemisch wird 6–10 Stunden lang unter Rückfluss erhitzt und anschlie ßend mit Ethylacetat extrahiert. Diese Lösung wird bis zur Trockene eingedampft und durch Chromatographie über ein Silicagel gereinigt, um (15) zu liefern.
    • (b). Zu einer Lösung von (15) in Dichlormethan bei Raumtemperatur wird Trifluoressigsäure (10 Äqu.) gegeben. Nach 2 Stunden wird das Lösungsmittel bis zur Trockene eingedampft und der Rest in einem minimalen Volumen DMF gelöst. Die Lösung wird auf 4°C gekühlt und Thionylchlorid (Überschuss) wird zugegeben. Nach zwei Stunden wird die Lösung in vacuo bis zur Trockene eingedampft, um überschüssiges Thionylchlorid zu entfernen, und Triethylamin (10 Äqu.) wird gefolgt von 4-Nitrophenethylamin (0,25 Äqu.) zugegeben. Pulverförmiges Natriumborhydrid wird portionsweise zugegeben, um die verbleibenden Säurechloridgruppen zu reduzieren, gefolgt durch Zugabe von 0,1 M HCl. Die Lösung wird mit Ethylacetat extrahiert und die organische Lösung wird mit Salz gewaschen und in vacuo eingedampft. Der Rest wird über Silicagel chromatographiert, um reines (16) zu ergeben.
    • (c). Zu einer gerührten Lösung von (16) in Methanol wird Palladium an einem Kohlekatalysator (0,1 Äqu.) gegeben. Die Suspension wird unter Wasserstoffatmosphäre gestellt und die Reduktion wird so lange zugelassen, bis TLC die Abwesenheit von (16) anzeigt. Das Reaktionsgemisch wird drei Mal mit Argon gespült, zur Entfernung des Katalysators gefiltert, und bis zur Trockene eingedampft. Der Rest wird in THF : Wasser (1 : 1) aufgenommen und der pH mit 0,1 M NaOH auf 10 eingestellt. Di-t-butyldicarbonat (2,2 Äqu.) wird portionsweise zugegeben, wobei der pH durch die jeweils notwendige Zugabe von 0,1 M NaOH auf 9–10 gehalten wird. Eine Stunde nach Beendigung der Zugabe wird die Lösung mit Ethylacetat extrahiert und die organische Schicht getrocknet und in vacuo eingedampft. Der Rest wird über Silicagel chromatographiert, um (17) zu ergeben.
    • (d). Zu einer Lösung von (17) in Chloroform bei 4°C wird wasserfreies Kaliumcarbonat (20 Äqu.) gegeben und die Suspension kräftig gerührt, während tropfenweise ein Überschuss Thionylchlorid zugegeben wird. Nach einer Stunde wird das Lösungsmittel und überschüssiges Thionylchlorid in einem Rotationsverdampfer entfernt und der Rest mit Ethylacetat extrahiert. Das Lösungsmittel wird in vacuo bis zur Trockene eingedampft und der Rest wird in Toluen aufgenommen. 1,8-Diazabicyclo[5.4.0]undec-7-en (1,8 Äqu./Chloridgruppe) wird gefolgt von Thiobenzoesäure (1,4 Äqu./Chloridgruppe) zugegeben und die Lösung unter Rückfluss erhitzt. Nach 5 Stunden wird der organische Auszug bis zur Trockene eingedampft und der Rest in Chloroform wiedergelöst, ein Mal mit Wasser gewaschen, über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und in vacuo eingedampft, um rohes (18) zu erhalten, das durch Blitzchromatographie weiter gereinigt wird.
    • (e). Zu einer Lösung von (18) in Dichlormethan bei Raumtemperatur wird Trifluoressigsäure (10 Äqu.) gegeben. Nach zwei Stunden wird das Lösungsmittel bis zur Trockene eingedampft, um (19) zu ergeben, was direkt zur Konjugation verwendet wird, wie im obigen Beispiel 10 beschrieben ist.
  • Beispiel 14 Herstellung eines bifunktionalen chelatbildenden Agens (21)
    Figure 00630001
    • (a). Zu einer auf 4°C gekühlten Lösung von N-Boc N'-Methylethylendiamin in Dichlormethan wird Triethylamin (10 Äqu.) gefolgt von Chloracetylchlorid (1,1 Äqu.) gegeben. Nach 30-minütigem Rühren wird Wasser zugegeben und die organische Phase abgetrennt, getrocknet und in vacuo zur Trockenheit konzentriert. Der Rest wird in Toluen aufgenommen und 1,8-Diazabicyclo[5.4.0]undec-7-en (2,2 Äqu.) wird gefolgt von Thiobenzoesäure (1,1 Äqu.) zugegeben und die Lösung unter Rückfluss erhitzt. Nach 5 Stunden wird der organische Auszug bis zur Trockene eingedampft und der Rest in Chloroform wiedergelöst, ein Mal mit Wasser gewaschen, über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und in vacuo eingedampft, um rohes (20) zu erhalten, das durch Blitzchromatographie weiter gereinigt wird.
    • (b). Zu einer Lösung von (20) in Dichlormethan bei Raumtemperatur wird Trifluoressigsäure (10 Äqu.) gegeben. Nach zwei Stunden wird das Lösungsmittel bis zur Trockene eingedampft, um (21) zu ergeben, was direkt zur Konjugation verwendet wird, wie im obigen Beispiel 10 beschrieben ist.
  • Beispiel 15 Herstellung eines bifunktionalen chelatbildenden Agens (23)
    Figure 00640001
    • (a). Zu einer auf 4°C gekühlten Lösung von N-Boc-Hydrazin in Dichlormethan wird Triethylamin (10 Äqu.) gefolgt von Dimethylacryloylchlorid (1,1 Äqu.) gegeben. Nach 30-minütigem Rühren wird Wasser zugegeben und die organische Phase abgetrennt, getrocknet und in vacuo zur Trockenheit konzentriert. Der Rest wird in Toluen aufgenommen und 1,8-Diazabicyclo[5.4.0]undec-7-en (2,2 Äqu.) wird gefolgt von Thiobenzoesäure (1,1 Äqu.) zugegeben und die Lösung unter Rückfluss erhitzt. Nach 5 Stunden wird der organische Auszug bis zur Trockene eingedampft und der Rest in Chloroform wiedergelöst, ein Mal mit Wasser gewaschen, über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und in vacuo eingedampft, um rohes (22) zu erhalten, das durch Blitzchromatographie weiter gereinigt wird. Die Thiolgruppe wurde mit Natriummethoxid in Methanol entschützt und das Thiol wurde als eine 2-Pyridylthioleinheit wiedergeschützt.
    • (b). Zu einer Lösung von (22) in Dichlormethan bei Raumtemperatur wird Trifluoressigsäure (10 Äqu.) gegeben. Nach zwei Stunden wird das Lösungsmittel bis zur Trockene eingedampft, um (23) zu ergeben, was direkt zur Konjugation verwendet wird, wie im obigen Beispiel 10 beschrieben ist, wobei jedoch der Reduktionsschritt unterbleibt.
  • Beispiel 16
  • Herstellung eines Semicarbazid-Derivates von DTPA und Konjugation und Radiomarkierung zur Erzeugung eines Immunkonjugats mit einer säurelabilen Bindung
  • (a) Herstellung von p-(Thiosemicarbazidyl)benzyl-DTPA
  • p-(Isothiocyanato)benzyl-DTPA (19,7 μmol) in 0,5 ml Wasser wurde mit 6,6 μl einer 55% wässrigen Lösung von Hydrazinhydrat (6 Äquiv.) gemischt und der pH der Lösung wurde mittels festem Natriumcarbonat auf 9,13 eingestellt. Das klare Reaktionsgemisch wurde 4 Stunden lang bei 37°C inkubiert. Der pH wurde dann auf 12,8 erhöht und Wasser wurde mittels einer Vakuumpumpe entfernt. Der Rest wurde zwei Mal mit Isopropanol extrahiert, um restliches Hydrazin zu entfernen, und in 0,3 ml Wasser gelöst. Der pH wurde auf 6,5 eingestellt, um eine wässrige Lösung des erforderlichen Produkts mit einer Konzentration von 60 μmol/ml zu ergeben.
  • (b) Kopplung von p-(Thiosemicarbazidyl)benzyl-DTPA an den oxidierten Kohlenhydrananteil von Antikörperfragment LL2-F(ab')2
  • Das LL2 F(ab')2 Fragment (0,8 ml; 1,95 mg/ml) in 50 mM Acetat-gepufferter Salzlösung, pH 5,3, wurde mit Natriummetaperiodat in einer Endkonzentration von 14,3 mM behandelt und bei 0°C (Eisbad) 1 Stunde lang inkubiert. Überschüssiges Periodat wurde durch Glycerol (20 μl) abgebaut und der oxidierte Antikörper wurde über eine Zentrifugations-Größenausschluss-Säule in 0,1 M Phosphatpuffer, pH 7 gereinigt.
  • Die Lösung des oxidierten Antikörpers wurde hinsichtlich Natriumchlorid 150 mM gemacht, der pH wurde auf 6,2 eingestellt (unter Verwendung von festem Natriumphosphat, monobasisch) und anschließend mit einem 300-fach molaren Überschuss an p-(Thiosemicarbazidyl)benzyl-DTPA behandelt. Das Reaktionsgemisch wurde „gevortext" und im Dunklen bei Raumtemperatur 18 Stunden lang inkubiert. Das Konjugat wurde über eine Zentrifugations-Größenausschluss-Säule in 0,1 M Acetat, pH 6,5, gereinigt und in einem Centricon 30 Konzentrator konzentriert.
  • HPLC Analyse des Konjugats ergab einen einzigen Peak bei einer mit der Retentionszeit des unmodifizierten Antikörpers identischen Retentionszeit.
  • (c) Bestimmung der Anzahl von Chelaten pro LL2-F(ab')2
  • 40 μg des obigen Konjugats wurden mit einem Überschuss Kobaltacetat, das mit 50–200000 cpm Kobalt-57 Radioisotop dotiert war, markiert. Nach 30 Minuten wurde das Markierungsgemisch auf 10 mM in EDTA gebracht und auf den Einbau von Kobalt in den Antikörper untersucht (mittels ITLC auf Silicagel-imprägnierten Glasfaserstreifen und 10 mM EDTA zur Chromatogrammentwicklung). Von dem Anteil der Radioaktivität, die an den Antikörper gebunden hat, und der relativen molaren Menge der verwendeten Konjugat- und Co/57Co-Lösungen wurde die Anzahl der Chelate pro Antikörperfragment auf 1,25 bestimmt.
  • (d) Radiomarkierung des Konjugats mit Y-90
  • 5 μl (50 μg) der Lösung des p-(Thiosemicarbazonyl)benzyl-DTPA-F(ab')2 Konjugats in 0,1 M Natriumacetat (pH 6,5) wurde mit 4 μl Y-90 Acetat (95,5 μCi) gemischt und 1 Stunde inkubiert. Die Lösung wurde dann mit 9 μl 0,1 M Natriumacetat verdünnt und hinsichtlich des Einbaus analysiert. Ein Aliquot des Markierungsgemisches wurde nach 10-minütiger Inkubation mit 10 mM EDTA einer unmittelbaren dünnschicht-chromatographischen Untersuchung unterzogen. Der Y-90 Einbau lag bei 77,3%, wobei 1,2% der Radioaktivität in Form von Kolloiden vorlag. Radio-HPLC zeigte einen Einbau von 64%.
  • (e) Radiomarkierung des Konjugats mit In-111
  • 60 μg der Lösung des p-(Thiosemicarbazonyl)benzyl-DTPA-F(ab')2 Konjugats wurde mit 124 μCi In-111-acetat (In-11-chlorid gepuffert mit 0,22 M Ammoniumacetat) vermischt und 45 Minuten bei Raumtemperatur gelassen. Die Analyse eines Aliquots des Markierungsgemisches nach Inkubation mit 10 mM EDTA zeigte einen In-111 Einbau ins Konjugat von 86%. Die Probe wurde mit 0,1 M Acetat auf 90 μl verdünnt und 10 Minuten mit 10 μl einer 0,1 M DTPA Lösung (pH 7) inkubiert. Zwei aufeinander folgende Reinigungsschritte durch Zentrifugations-Größenausschluss-Chromatographie ergab das In-111 markierte Konjugat.

Claims (17)

  1. Mutierter rekombinanter Antikörper oder Antigen bindendes Antikörperfragment mit einer nicht natürlichen Asn-Glycosylierungssignalsequenz an Position 18 bis 20 der leichten Kette des Antikörpers oder des Antigen bindenden Antikörperfragments.
  2. Antigen bindendes Antikörperfragment nach Anspruch 1, wobei das Antigen bindende Antikörperfragment an Position 18 glycosyliert ist.
  3. Antigen bindendes Antikörperfragment nach einem der vorherigen Ansprüche, wobei das Fragment aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus Fab, Fab', F(ab)2, F(ab')2, Fv und einkettigem Fv.
  4. Verfahren zur Herstellung eines glycosylierten mutierten rekombinanten Antikörpers oder eines Antigen bindenden Antikörperfragments, umfassend die Schritte: (a) Kultivieren transformierter Wirtszellen, die einen mutierten Antikörper oder ein Antikörperfragment exprimieren und glycosylieren, das eine mutierte leichte Kette und eine schwere Kette umfasst, wobei die Wirtszellen mit einem Expressionsvektor transformiert sind, in den ein mutiertes DNA-Molekül kloniert ist, das eine mutierte leichte Kette codiert, die an der Aminosäureposition 18 bis 20 eine nicht natürliche Asn-Glycosylierungssignalsequenz enthält; und (b) Gewinnen des exprimierten und glycosylierten mutierten Antikörpers oder des Antigen bindenden Antikörperfragments aus den kultivierten Wirtszellen.
  5. Lösliches Immunkonjugat, umfassend (a) ein glycosyliertes Antikörperfragment, das aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus Fab, Fab', F(ab)2, F(ab')2, Fv und einkettigem Fv, das eine leichtkettige variable Region mit einer Kohlehydratgruppierung umfasst, die an die Aminosäure Asn in Position 18 der leichtkettigen variablen Region gebunden ist; und (b) ein Diagnose- oder Therapieprinzip, das aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus einem Arzneimittel, einem Toxin, einem Chelatbildner, einem Polyethylenglycol, einem Bor-Addenden und einem nachweisbaren Markermolekül, das entweder direkt oder indirekt an die Kohlehydratgruppierung gebunden ist, und wobei das Immunkonjugat die Immunreaktivität des Antikörperfragments beibehält.
  6. Lösliches Immunkonjugat nach Anspruch 5, wobei (b) über eine kovalente Bindung direkt an die Kohlehydratgruppierung gebunden ist.
  7. Lösliches Immunkonjugat nach Anspruch 5, wobei (b) an einen beladenen Polymerträger gebunden ist, wobei der Träger mindestens eine freie Aminosäuregruppe aufweist, über die er kovalent an die Kohlehydratgruppierung bindet.
  8. Lösliches Immunkonjugat nach einem der Ansprüche 5 bis 7, wobei das Antikörperfragment ein mutiertes Antikörperfragment ist, umfassend eine nicht natürliche Asn-Glycosylierungssignalsequenz an der Aminosäureposition 18 bis 20 der leichten Kette des Antikörperfragments.
  9. Lösliches Immunkonjugat nach Anspruch 7, wobei der polymere Träger aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus einem Aminodextran, einem Polypeptid einer Länge von mindestens 50 Aminosäuren und einem Polyamidoamin-Dendrimer.
  10. Lösliches Immunkonjugat nach einem der Ansprüche 5 bis 7, wobei das nachweisbare Markermolekül aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus 90Y, 186Re und GdIII, Avidin, Streptavidin und Biotin.
  11. Lösliches Immunkonjugat nach einem der Ansprüche 5 bis 7, wobei der Chelatbildner aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus 1,4,7,10- Tetraazacyclododecantetraessigsäure und Verbindungen, die dargestellt sind durch Formel (I)
    Figure 00690001
    wobei X CH ist oder X und Z zusammengenommen CO sein können; Y CR4R5, Ch2CR4R5 oder (CH2)2CR4R5 ist, wobei R4 und R5 gleich oder verschieden sind und aus der Gruppe ausgewählt sind, bestehend aus Wasserstoff und Alkyl-, substituierten Alkyl-, Aryl- oder substituierten Arylgruppen; Z jede Gruppe sein kann, die mit der Kohlehydratgruppierung des Antikörperfragments reagieren kann, oder Z H sein kann; R1 eine Thiol-Schutzgruppe ist, die unter Bedingungen entfernt werden kann, die die Immunreaktivität des Proteins nicht wesentlich herabsetzen; R2 und R3 gleich oder verschieden sein können und jeweils eine Acylgruppe oder eine substituierte Acylgruppe oder Wasserstoff, Alkyl, Aryl, substituiertes Alkyl oder substituiertes Aryl darstellen, wobei die Substituenen an der Alkyl- oder Arylgruppe Metall-Ligandengruppen sind, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Sulfhydryl, Amin und Carbonsäure oder ihren geschützten Derivaten; R2 und R3 auch jede Gruppe sein können, die mit der Kohlehydratgruppierung des Antikörperfragments reagieren kann, oder Formel (II)
    Figure 00690002
    wobei D H oder CH2SR1 ist; E jede Gruppe sein kann, die mit der Kohlehydratgruppierung des Antikörperfragments reagieren kann; R1 eine Thiolschutzgruppe ist, die unter Bedingungen entfernt werden kann, die die Immunreaktivität des Proteins nicht wesentlich herabsetzen; und m 0, 1, 2 oder 3 ist, oder Formel (III)
    Figure 00700001
    wobei Q jede Gruppe sein kann, die mit der Kohlehydratgruppierung des Antikörperfragments zur reagieren vermag; R1 eine Thiolschutzgruppe ist, die unter Bedingungen entfernt werden kann, die die Immunreaktivität des Proteins nicht wesentlich herabsetzen; und n jeweils unabhängig 2 oder 3 ist.
  12. Lösliches Immunkonjugat nach Anspruch 7, wobei der Chelatbildner über einen säurelabilen Linker, ausgewählt aus Verbindungen, bestehend aus einem Thiosemicarbazid und einem Hydrazid, kovalent an den polymeren Träger gebunden ist.
  13. Verfahren zur Herstellung eines Immunkonjugats, umfassend das kovalente Binden eines Diagnose- oder Therapieprinzips an die Kohlehydratgruppierung eines Antikörperfragments, wobei das Antikörperfragment aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus Fab, Fab', F(ab)2, F(ab')s, Fv und einkettigem Fv, wobei das Antikörperfragment in der leichten Kette an der Aminosäureposition 18 eine Kohlehydratgruppierung enthält, wobei das Diagnose- oder Therapieprinzip aus einer Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus einem Arzneimittel, einem Toxin, einem Chelatbildner, einem Polyethylenglycol, einem Bor-Addenden und einem nachweisbaren Markermolekül, wobei das Diagnose- oder Therapieprinzip entweder direkt oder indirekt an die Kohlehydratgruppierung gebunden ist, und das Immunkonjugat die Immunreaktivität des Antikörperfragments beibehält.
  14. Verfahren nach Anspruch 13, wobei das Diagnose- oder Therapieprinzip über eine kovalente Bindung direkt an die Kohlehydratgruppierung gebunden ist.
  15. Verfahren nach Anspruch 13, wobei das Diagnose- oder Therapieprinzip an einen beladenen polymeren Träger gebunden ist, wobei der Träger mindestens eine freie Aminosäuregruppe aufweist über die er kovalent an die Kohlehydratgruppierung bindet.
  16. Zusammensetzung zur Verwendung bei der Diagnose des Vorliegens einer Krankheit in einem Säuger, umfassend ein Immunkonjugat und einen pharmazeutisch verträglichen Träger, wobei das Immunkonjugat einen nachweisbaren Marker und ein Antigen bindendes Antikörperfragment umfasst, bei dem eine Kohlehydratgruppierung an die Aminosäureposition 18 der leichten Kette des Antigen bindenden Antikörperfragments gebunden ist, wobei der nachweisbare Marker zu der Kohlehydratgruppierung des Antigen bindenden Antikörperfragments in Konjugation ist und wobei das Antigen bindende Antikörperfragment spezifisch an ein Antigen bindet, das mit der Krankheit zusammenhängt.
  17. Zusammensetzung zur Behandlung einer Krankheit in einem Säuger, umfassend ein Immunkonjugat und einen pharmazeutisch verträglichen Träger, wobei das Immunkonjugat ein Antigen bindendes Antikörperfragment, bei dem eine Kohlehydratgruppierung an die Aminosäureposition 18 der leichten Kette des Antikörperfragments gebunden ist, und eine Nichtantikörpergruppierung, die aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus einem Arzneimittel, einem Toxin, einem Chelatbildner, einem Polyethylenglycol, einem Bor- Addenden und einem therapeutischen Radioisotop, umfasst, wobei die Nichtantikörpergruppierung kovalent an die Kohlehydratgruppierung des Antigen bindenden Antikörperfragments gebunden ist und wobei das Antigen bindende Antikörperfragment spezifisch an ein Antigen bindet, das mit der Krankheit zusammenhängt.
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Families Citing this family (243)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5776093A (en) * 1985-07-05 1998-07-07 Immunomedics, Inc. Method for imaging and treating organs and tissues
CA2097617A1 (en) * 1990-11-23 1992-05-23 Brian Seed Inhibition of cell adhesion protein-carbohydrate interactions
US5401489A (en) * 1991-05-01 1995-03-28 University Of New Mexico Biomodulators as universal imaging agents
US5364612A (en) * 1991-05-06 1994-11-15 Immunomedics, Inc. Detection of cardiovascular lesions
US5919455A (en) * 1993-10-27 1999-07-06 Enzon, Inc. Non-antigenic branched polymer conjugates
US5888773A (en) * 1994-08-17 1999-03-30 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Method of producing single-chain Fv molecules
US5559099A (en) * 1994-09-08 1996-09-24 Genvec, Inc. Penton base protein and methods of using same
US6465253B1 (en) 1994-09-08 2002-10-15 Genvec, Inc. Vectors and methods for gene transfer to cells
US5846782A (en) * 1995-11-28 1998-12-08 Genvec, Inc. Targeting adenovirus with use of constrained peptide motifs
US5545553A (en) * 1994-09-26 1996-08-13 The Rockefeller University Glycosyltransferases for biosynthesis of oligosaccharides, and genes encoding them
US5874540A (en) * 1994-10-05 1999-02-23 Immunomedics, Inc. CDR-grafted type III anti-CEA humanized mouse monoclonal antibodies
SE503711C2 (sv) * 1994-12-14 1996-08-12 Medicarb Ab Flerstegsförfarande för beläggning av en intraokulär lins
US6127525A (en) * 1995-02-21 2000-10-03 Cornell Research Foundation, Inc. Chimeric adenoviral coat protein and methods of using same
US5770442A (en) 1995-02-21 1998-06-23 Cornell Research Foundation, Inc. Chimeric adenoviral fiber protein and methods of using same
US6017496A (en) 1995-06-07 2000-01-25 Irori Matrices with memories and uses thereof
US5751629A (en) 1995-04-25 1998-05-12 Irori Remotely programmable matrices with memories
US6331273B1 (en) 1995-04-25 2001-12-18 Discovery Partners International Remotely programmable matrices with memories
US6416714B1 (en) * 1995-04-25 2002-07-09 Discovery Partners International, Inc. Remotely programmable matrices with memories
US5874214A (en) 1995-04-25 1999-02-23 Irori Remotely programmable matrices with memories
US6329139B1 (en) 1995-04-25 2001-12-11 Discovery Partners International Automated sorting system for matrices with memory
US6783980B2 (en) * 1995-06-15 2004-08-31 Crucell Holland B.V. Packaging systems for human recombinant adenovirus to be used in gene therapy
CA2222140C (en) * 1995-06-15 2010-11-23 Introgene B.V. Packaging systems for human recombinant adenovirus to be used in gene therapy
AU702975B2 (en) * 1995-09-22 1999-03-11 Immunomedics Inc. Recombinant proteins having multiple disulfide bonds and thiol-substituted conjugates thereof
CA2240834C (en) 1995-12-22 2013-12-03 Immunomedics, Inc. Use of immunoconjugates to enhance the efficacy of multi-stage cascade boosting vaccines
US6441025B2 (en) * 1996-03-12 2002-08-27 Pg-Txl Company, L.P. Water soluble paclitaxel derivatives
US6730300B2 (en) 1996-03-20 2004-05-04 Immunomedics, Inc. Humanization of an anti-carcinoembryonic antigen anti-idiotype antibody and use as a tumor vaccine and for targeting applications
WO1997034632A1 (en) * 1996-03-20 1997-09-25 Immunomedics, Inc. Glycosylated humanized b-cell specific antibodies
US5891506A (en) * 1996-08-09 1999-04-06 Medtronic, Inc. Oxidative method for attachment of glycoproteins or glycopeptides to surfaces of medical devices
DE69724428T3 (de) * 1996-06-07 2009-07-23 Poniard Pharmaceuticals, Inc., Seattle Humanisierte antikörper die an das gleiche antigen wie antikörper nr-lu-13 binden und deren verwendung in "pretargeting" verfahren
US5861308A (en) * 1996-08-21 1999-01-19 Ludwig Institute For Cancer Research Isolated nucleic acids associated with T cell activation and uses thereof
US6136274A (en) * 1996-10-07 2000-10-24 Irori Matrices with memories in automated drug discovery and units therefor
US6759509B1 (en) 1996-11-05 2004-07-06 Bristol-Myers Squibb Company Branched peptide linkers
CA2264610A1 (en) * 1996-11-05 1998-05-14 Bristol-Myers Squibb Company Branched peptide linkers
US5816259A (en) * 1997-01-13 1998-10-06 Rose; Samuel Method for the diagnosis and treatment of cancer by the accumulation of radioactive precipitates in targeted cells
EP1007569B1 (de) * 1997-02-11 2009-04-08 Immunomedics, Inc. Stimulation einer immunantwort durch antikörper, welche mit dem alpha-galaktosylepitop markiert sind
US7122636B1 (en) 1997-02-21 2006-10-17 Genentech, Inc. Antibody fragment-polymer conjugates and uses of same
NZ336839A (en) 1997-02-21 2001-08-31 Genentech Inc Antibody fragment-polymer conjugates and humanized anti-IL-8 monoclonal antibodies
US6306393B1 (en) * 1997-03-24 2001-10-23 Immunomedics, Inc. Immunotherapy of B-cell malignancies using anti-CD22 antibodies
US6183744B1 (en) 1997-03-24 2001-02-06 Immunomedics, Inc. Immunotherapy of B-cell malignancies using anti-CD22 antibodies
US6004529A (en) * 1997-04-11 1999-12-21 Nycomed Imaging As Chelating agents
US20040009166A1 (en) * 1997-04-30 2004-01-15 Filpula David R. Single chain antigen-binding polypeptides for polymer conjugation
US6323322B1 (en) * 1997-04-30 2001-11-27 Enzon, Inc. Single-chain antigen-binding proteins capable of glycosylation, production and uses thereof
US6673538B1 (en) 1997-07-25 2004-01-06 The Trustees Of Boston University Methods and compositions for designing vaccines
WO1999005325A1 (en) 1997-07-25 1999-02-04 The Trustees Of Boston University Methods and compositions for determining species of bacteria and fungi
US6953675B2 (en) * 1997-11-06 2005-10-11 Immunomedics, Inc. Landscaped antibodies and antibody fragments for clinical use
US6458355B1 (en) 1998-01-22 2002-10-01 Genentech, Inc. Methods of treating inflammatory disease with anti-IL-8 antibody fragment-polymer conjugates
US7005504B2 (en) 1998-01-22 2006-02-28 Genentech, Inc. Antibody fragment-peg conjugates
US6468532B1 (en) 1998-01-22 2002-10-22 Genentech, Inc. Methods of treating inflammatory diseases with anti-IL-8 antibody fragment-polymer conjugates
AU4070499A (en) 1998-04-30 1999-11-16 Cornell Research Foundation Inc. Adenoviral vectors with tandem fiber proteins
US6962702B2 (en) 1998-06-22 2005-11-08 Immunomedics Inc. Production and use of novel peptide-based agents for use with bi-specific antibodies
CA2331783C (en) * 1998-07-02 2009-12-29 Genencor International, Inc. Chemically modified proteins with a carbohydrate moiety
US20040043489A1 (en) * 1998-07-08 2004-03-04 Menzo Havenga Gene delivery vectors provided with a tissue tropism for dendritic cells and methods of use
US20030017138A1 (en) * 1998-07-08 2003-01-23 Menzo Havenga Chimeric adenoviruses
US6248057B1 (en) 1998-07-28 2001-06-19 Innerdyne, Inc. Absorbable brachytherapy and chemotherapy delivery devices and methods
EP1112372A1 (de) 1998-09-11 2001-07-04 Genvec, Inc. Adenovirus mit veränderter zielzellenspezifität
US6333396B1 (en) 1998-10-20 2001-12-25 Enzon, Inc. Method for targeted delivery of nucleic acids
US6929946B1 (en) 1998-11-20 2005-08-16 Crucell Holland B.V. Gene delivery vectors provided with a tissue tropism for smooth muscle cells, and/or endothelial cells
US20030099629A1 (en) * 1999-03-11 2003-05-29 Immunomedics, Inc. Recombinant onconase and chemical conjugates and fusion proteins of recombinant onconase
US8383081B2 (en) 1999-05-10 2013-02-26 Immunomedics, Inc. Anti-CD74 immunoconjugates and methods of use
US7829064B2 (en) 1999-05-10 2010-11-09 Immunomedics, Inc. Anti-CD74 immunoconjugates and methods
US8119101B2 (en) 1999-05-10 2012-02-21 The Ohio State University Anti-CD74 immunoconjugates and methods of use
US6913922B1 (en) * 1999-05-18 2005-07-05 Crucell Holland B.V. Serotype of adenovirus and uses thereof
US20050232900A1 (en) * 1999-05-18 2005-10-20 Crucell Holland B.V. Serotype of adenovirus and uses thereof
US6492169B1 (en) * 1999-05-18 2002-12-10 Crucell Holland, B.V. Complementing cell lines
US7297478B1 (en) 2000-09-22 2007-11-20 Large Scale Biology Corporation Creation of variable length and sequence linker regions for dual-domain or multi-domain molecules
US7067111B1 (en) * 1999-10-25 2006-06-27 Board Of Regents, University Of Texas System Ethylenedicysteine (EC)-drug conjugates, compositions and methods for tissue specific disease imaging
US20020028178A1 (en) * 2000-07-12 2002-03-07 Nabil Hanna Treatment of B cell malignancies using combination of B cell depleting antibody and immune modulating antibody related applications
US7018810B1 (en) * 1999-12-07 2006-03-28 Amgen Inc. Chordin-like molecules and uses thereof
US20030023043A1 (en) * 2000-03-02 2003-01-30 Kazuhisa Uchida Method of separating and purifying protein
US6800728B2 (en) * 2000-03-22 2004-10-05 Solulink Biosciences, Inc. Hydrazine-based and carbonyl-based bifunctional crosslinking reagents
EP1157999A1 (de) * 2000-05-24 2001-11-28 Introgene B.V. Verfahren und Mitteln zur Verbesserung der Haut-Transplantation mittels Genabgabe-Vehikel mit Tropismus für primären Fibroblasten, sowie andere Verwendungsmöglichkeiten für diesen
JP2003534806A (ja) * 2000-05-31 2003-11-25 ジェンベク、インコーポレイティッド アデノウイルスベクターのターゲティングの方法および組成物
PL212211B1 (pl) * 2000-06-02 2012-08-31 Regents Board Of Kompozycja do wytwarzania scyntygraficznego środka obrazującego, kompozycja do obrazowania scyntograficznego, sposób syntezy znakowanego radionuklidem koniugatu etylenodicysteiny z ligandem naprowadzającym do obrazowania, zastosowanie kompozycji zawierającej znakowany radionklidem konigat etylenodiscysteiny z ligandem naprowadzającym do wytwarzania środków farmaceutycznych do obrazowania nowotworu albo miejsca infekcji oraz zestaw do wytwarzania preparatów radiofarmaceutycznych
AU6836301A (en) 2000-06-20 2002-01-02 Idec Pharma Corp Treatment of b-cell associated diseases such as malignancies and autoimmune diseases using a cold anti-cd20 antibody/radiolabeled anti-cd22 antibody combination
MXPA03002262A (es) * 2000-09-18 2003-10-15 Idec Pharma Corp Terapia de combinacion para tratamiento de enfermedades autoinmunes usando una combinacion de anticuerpos inmunorreguladores/supresores de celulas b.
CA2421864A1 (en) * 2000-09-20 2002-03-28 Crucell Holland B.V. Transduction of dendritic cells using adenoviral vectors
DE60138403D1 (de) * 2000-09-26 2009-05-28 Crucell Holland Bv Adenovirale vektoren für die übertragung von genen in zellen der skelettmuskulatur oder myoblasten
JP3975167B2 (ja) * 2001-01-08 2007-09-12 アプレーラ コーポレイション 樹状化学発光基質
US20030211107A1 (en) * 2002-01-31 2003-11-13 Kandasamy Hariharan Use of CD23 antagonists for the treatment of neoplastic disorders
US20020159996A1 (en) * 2001-01-31 2002-10-31 Kandasamy Hariharan Use of CD23 antagonists for the treatment of neoplastic disorders
US20030103971A1 (en) * 2001-11-09 2003-06-05 Kandasamy Hariharan Immunoregulatory antibodies and uses thereof
US20070065436A1 (en) * 2001-01-31 2007-03-22 Biogen Idec Inc. Anti-cd80 antibody having adcc activity for adcc mediated killing of b cell lymphoma cells alone or in combination with other therapies
US20030012783A1 (en) 2001-02-20 2003-01-16 Wayne Kindsvogel Antibodies that bind both BCMA and TACI
DE60237810D1 (de) * 2001-04-03 2010-11-11 Thermo Finnigan Llc Zur vereinfachung komplexer peptidgemische geeignete verfahren und kits
WO2002087497A2 (en) * 2001-04-26 2002-11-07 Board Of Regents, The University Of Texas System Therapeutic agent/ligand conjugate compositions, their methods of synthesis and use
EP1389090A2 (de) * 2001-04-26 2004-02-18 Board of Regents, The University of Texas System Diagnostische bildgebende zusammensetzungen, ihre syntheseverfahren und ihre verwendung
PT1392359E (pt) 2001-05-11 2010-01-27 Ludwig Inst For Cancer Res Ltd Proteínas de ligação específica e suas utilizações
US20100056762A1 (en) 2001-05-11 2010-03-04 Old Lloyd J Specific binding proteins and uses thereof
GB0112844D0 (en) * 2001-05-25 2001-07-18 Psimei Pharmaceuticals Plc Neutron capture therapy
US7795210B2 (en) * 2001-10-10 2010-09-14 Novo Nordisk A/S Protein remodeling methods and proteins/peptides produced by the methods
US7696163B2 (en) * 2001-10-10 2010-04-13 Novo Nordisk A/S Erythropoietin: remodeling and glycoconjugation of erythropoietin
US7157277B2 (en) 2001-11-28 2007-01-02 Neose Technologies, Inc. Factor VIII remodeling and glycoconjugation of Factor VIII
US7214660B2 (en) 2001-10-10 2007-05-08 Neose Technologies, Inc. Erythropoietin: remodeling and glycoconjugation of erythropoietin
US7173003B2 (en) 2001-10-10 2007-02-06 Neose Technologies, Inc. Granulocyte colony stimulating factor: remodeling and glycoconjugation of G-CSF
US7179617B2 (en) * 2001-10-10 2007-02-20 Neose Technologies, Inc. Factor IX: remolding and glycoconjugation of Factor IX
US8008252B2 (en) * 2001-10-10 2011-08-30 Novo Nordisk A/S Factor VII: remodeling and glycoconjugation of Factor VII
US8323903B2 (en) * 2001-10-12 2012-12-04 Life Technologies Corporation Antibody complexes and methods for immunolabeling
US20050069962A1 (en) * 2001-10-12 2005-03-31 Archer Robert M Antibody complexes and methods for immunolabeling
US7261875B2 (en) * 2001-12-21 2007-08-28 Board Of Regents, The University Of Texas System Dendritic poly (amino acid) carriers and methods of use
US20030135195A1 (en) * 2002-01-16 2003-07-17 Oscar Jimenez Highly lubricious hydrophilic coating utilizing dendrimers
RU2004127458A (ru) 2002-02-14 2005-10-27 Иммуномедикс, Инк. (Us) Анти-cd20 антитела, их гибридные белки и способы их использования
US8287864B2 (en) * 2002-02-14 2012-10-16 Immunomedics, Inc. Structural variants of antibodies for improved therapeutic characteristics
ES2350477T5 (es) 2002-03-01 2020-05-06 Immunomedics Inc Internalización de anticuerpos anti-CD74 y métodos de uso
US9770517B2 (en) 2002-03-01 2017-09-26 Immunomedics, Inc. Anti-Trop-2 antibody-drug conjugates and uses thereof
EP2287201B1 (de) 2002-03-01 2018-12-12 Immunomedics, Inc. RS7-Antikörper
US20030180292A1 (en) * 2002-03-14 2003-09-25 Idec Pharmaceuticals Treatment of B cell malignancies using anti-CD40L antibodies in combination with anti-CD20 antibodies and/or chemotherapeutics and radiotherapy
US20050107310A1 (en) * 2002-03-19 2005-05-19 Holick Michael F. Carboxylic acid glycuronides, glycosamides and glycosides of quinolones, penicillins, analogs, and uses thereof
BR0309401A (pt) 2002-04-19 2007-02-21 Zymogenetics Inc polinucleotìdeo isolado, vetor de expressão, célula cultivada, método para produzir polipeptìdeos, e um anticorpo para um polipeptìdeo, e, anticorpo
DE60329835D1 (de) * 2002-04-25 2009-12-10 Crucell Holland Bv Mittel und verfahren zur herstellung von adenovirusvektoren
CN1675245B (zh) 2002-06-14 2011-01-12 免疫医疗公司 人源化单克隆抗体hPAM4
MXPA04012496A (es) 2002-06-21 2005-09-12 Novo Nordisk Healthcare Ag Glicoformos del factor vii pegilados.
CA2489712C (en) * 2002-06-21 2016-07-12 University Of Utah Research Foundation Crosslinked compounds and methods of making and using thereof
JP5138867B2 (ja) * 2002-08-01 2013-02-06 イミューノメディクス、インコーポレイテッド α−フェトタンパク質Ｉｍｍｕ３１抗体および融合タンパク質ならびにその使用方法
US7541440B2 (en) 2002-09-30 2009-06-02 Immunomedics, Inc. Chimeric, human and humanized anti-granulocyte antibodies and methods of use
US7939304B2 (en) * 2002-10-02 2011-05-10 Catalyst Biosciences, Inc. Mutant MT-SP1 proteases with altered substrate specificity or activity
US20060024289A1 (en) * 2002-10-02 2006-02-02 Ruggles Sandra W Cleavage of VEGF and VEGF receptor by wild-type and mutant proteases
WO2004032857A2 (en) 2002-10-08 2004-04-22 Immunomedics, Inc. Antibody therapy
WO2004044227A2 (en) * 2002-11-07 2004-05-27 Board Of Regents, The University Of Texas System Ethylenedicysteine (ec)-drug conjugates, compositions and methods for tissue specific disease imaging
PT1572106E (pt) 2002-11-15 2010-06-17 Novartis Vaccines & Diagnostic Métodos para prevenção e tratamento de metástase de cancro e perda óssea associada a metástase de cancro
US8420086B2 (en) 2002-12-13 2013-04-16 Immunomedics, Inc. Camptothecin conjugates of anti-CD22 antibodies for treatment of B cell diseases
US7534427B2 (en) 2002-12-31 2009-05-19 Immunomedics, Inc. Immunotherapy of B cell malignancies and autoimmune diseases using unconjugated antibodies and conjugated antibodies and antibody combinations and fusion proteins
US7803777B2 (en) * 2003-03-14 2010-09-28 Biogenerix Ag Branched water-soluble polymers and their conjugates
US8791070B2 (en) 2003-04-09 2014-07-29 Novo Nordisk A/S Glycopegylated factor IX
SG155777A1 (en) 2003-04-09 2009-10-29 Neose Technologies Inc Glycopegylation methods and proteins/peptides produced by the methods
AU2004240553A1 (en) 2003-05-09 2004-12-02 Neose Technologies, Inc. Compositions and methods for the preparation of human growth hormone glycosylation mutants
SI1639011T1 (sl) * 2003-06-30 2009-04-30 Domantis Ltd Pegilirana protitelesa z enojno domeno (dAb)
US9005625B2 (en) * 2003-07-25 2015-04-14 Novo Nordisk A/S Antibody toxin conjugates
CA2533878A1 (en) * 2003-07-29 2005-09-22 Immunomedics, Inc. Fluorinated carbohydrate conjugates
WO2005012493A2 (en) 2003-07-31 2005-02-10 Immunomedics, Inc. Anti-cd19 antibodies
US7083936B2 (en) * 2003-08-01 2006-08-01 Beckman Coulter, Inc. Aminodextran compositions and conjugates and method of making and using them
US20080305992A1 (en) 2003-11-24 2008-12-11 Neose Technologies, Inc. Glycopegylated erythropoietin
US8633157B2 (en) 2003-11-24 2014-01-21 Novo Nordisk A/S Glycopegylated erythropoietin
US20060040856A1 (en) * 2003-12-03 2006-02-23 Neose Technologies, Inc. Glycopegylated factor IX
US7956032B2 (en) * 2003-12-03 2011-06-07 Novo Nordisk A/S Glycopegylated granulocyte colony stimulating factor
US20080318850A1 (en) * 2003-12-03 2008-12-25 Neose Technologies, Inc. Glycopegylated Factor Ix
US9050378B2 (en) * 2003-12-10 2015-06-09 Board Of Regents, The University Of Texas System N2S2 chelate-targeting ligand conjugates
TR201815885T4 (tr) 2004-01-07 2018-11-21 Novartis Vaccines & Diagnostics Inc M-csf spesifik monoklonal antikorlar ve bunların kullanımı.
WO2005070138A2 (en) 2004-01-08 2005-08-04 Neose Technologies, Inc. O-linked glycosylation of peptides
US8883160B2 (en) * 2004-02-13 2014-11-11 Ibc Pharmaceuticals, Inc. Dock-and-lock (DNL) complexes for therapeutic and diagnostic use
US9550838B2 (en) 2004-02-13 2017-01-24 Ibc Pharmaceuticals, Inc. Dock-and-lock (DNL) complexes for therapeutic and diagnostic use
ES2741574T3 (es) 2004-03-31 2020-02-11 Massachusetts Gen Hospital Método para determinar la respuesta del cáncer a tratamientos dirigidos al receptor del factor de crecimiento epidérmico
SE0400886D0 (sv) * 2004-04-02 2004-04-02 Amersham Biosciences Ab Process of purification
JP5629423B2 (ja) * 2004-04-12 2014-11-19 カタリスト バイオサイエンシーズ， インコーポレイテッド 野生型及び変異型ｍｔ−ｓｐ１による、ｖｅｇｆ及びｖｅｇｆ受容体の切断
CN1296711C (zh) * 2004-05-14 2007-01-24 沈阳迈迪生物医学技术有限公司 乳腺癌的Her－2免疫组织化学诊断试剂盒
EP1771066A2 (de) 2004-07-13 2007-04-11 Neose Technologies, Inc. Remodellierung von verzweigtem peg und klykolysierung von glucagonähnlichem peptide-1 glp-1
EP1799249A2 (de) 2004-09-10 2007-06-27 Neose Technologies, Inc. Glycopegyliertes interferon alpha
CA2585758C (en) 2004-10-29 2017-08-01 Neose Technologies, Inc. Remodeling and glycopegylation of fibroblast growth factor (fgf)
US20100009902A1 (en) * 2005-01-06 2010-01-14 Neose Technologies, Inc. Glycoconjugation Using Saccharyl Fragments
ES2449195T3 (es) 2005-01-10 2014-03-18 Ratiopharm Gmbh Factor estimulante de colonias de granulocitos glicopegilado
AU2006218454B2 (en) 2005-03-03 2011-11-17 Immunomedics, Inc. Humanized L243 antibodies
US9707302B2 (en) 2013-07-23 2017-07-18 Immunomedics, Inc. Combining anti-HLA-DR or anti-Trop-2 antibodies with microtubule inhibitors, PARP inhibitors, bruton kinase inhibitors or phosphoinositide 3-kinase inhibitors significantly improves therapeutic outcome in cancer
US10058621B2 (en) 2015-06-25 2018-08-28 Immunomedics, Inc. Combination therapy with anti-HLA-DR antibodies and kinase inhibitors in hematopoietic cancers
EP1866427A4 (de) * 2005-03-30 2010-09-01 Novo Nordisk As Herstellungsverfahren zur produktion von in insektenzelllinien entstandenen peptiden
US8067006B2 (en) 2005-04-06 2011-11-29 Immunomedics, Inc. Polymeric carriers of therapeutic agents and recognition moieties for antibody-based targeting of disease sites
US8475794B2 (en) 2005-04-06 2013-07-02 Ibc Pharmaceuticals, Inc. Combination therapy with anti-CD74 antibodies provides enhanced toxicity to malignancies, Autoimmune disease and other diseases
US8349332B2 (en) 2005-04-06 2013-01-08 Ibc Pharmaceuticals, Inc. Multiple signaling pathways induced by hexavalent, monospecific and bispecific antibodies for enhanced toxicity to B-cell lymphomas and other diseases
US20070154992A1 (en) * 2005-04-08 2007-07-05 Neose Technologies, Inc. Compositions and methods for the preparation of protease resistant human growth hormone glycosylation mutants
US20080255026A1 (en) * 2005-05-25 2008-10-16 Glycopegylated Factor 1X Glycopegylated Factor Ix
US20110003744A1 (en) * 2005-05-25 2011-01-06 Novo Nordisk A/S Glycopegylated Erythropoietin Formulations
WO2006127910A2 (en) * 2005-05-25 2006-11-30 Neose Technologies, Inc. Glycopegylated erythropoietin formulations
WO2007016285A2 (en) * 2005-07-28 2007-02-08 Novartis Ag M-csf specific monoclonal antibody and uses thereof
US20070105755A1 (en) * 2005-10-26 2007-05-10 Neose Technologies, Inc. One pot desialylation and glycopegylation of therapeutic peptides
US8097237B2 (en) 2005-08-23 2012-01-17 Stc.Unm Non-invasive diagnostic agents of cancer and methods of diagnosing cancer, especially leukemia and lymphoma
JP4808453B2 (ja) * 2005-08-26 2011-11-02 株式会社荏原製作所 研磨方法及び研磨装置
US20090130776A1 (en) * 2005-09-01 2009-05-21 Canon Kabushiki Kaisha Binding protein molecule
US20090048440A1 (en) 2005-11-03 2009-02-19 Neose Technologies, Inc. Nucleotide Sugar Purification Using Membranes
TWI382990B (zh) * 2005-12-12 2013-01-21 Hoffmann La Roche 可變區域抗體之糖化
EP2674440B1 (de) 2005-12-16 2019-07-03 IBC Pharmaceuticals, Inc. Polyvalente bioaktive anordnungen auf immunglobulinbasis
US8758723B2 (en) 2006-04-19 2014-06-24 The Board Of Regents Of The University Of Texas System Compositions and methods for cellular imaging and therapy
KR20170014023A (ko) 2006-07-05 2017-02-07 카탈리스트 바이오사이언시즈, 인코포레이티드 프로테아제 스크리닝 방법 및 이에 의해 확인된 프로테아제
WO2008011633A2 (en) * 2006-07-21 2008-01-24 Neose Technologies, Inc. Glycosylation of peptides via o-linked glycosylation sequences
JP5406027B2 (ja) 2006-08-04 2014-02-05 ノバルティス アーゲー ＥｐｈＢ３特異的抗体およびその使用
KR101433544B1 (ko) 2006-08-18 2014-08-27 노바르티스 아게 Ｐｒｌｒ 특이적 항체 및 그 용도
US20080095414A1 (en) * 2006-09-12 2008-04-24 Vladimir Desh Correction of functional nuclear imaging data for motion artifacts using anatomical data
WO2008057683A2 (en) * 2006-10-03 2008-05-15 Novo Nordisk A/S Methods for the purification of polypeptide conjugates
US10925977B2 (en) 2006-10-05 2021-02-23 Ceil>Point, LLC Efficient synthesis of chelators for nuclear imaging and radiotherapy: compositions and applications
EA200900767A1 (ru) 2006-12-07 2009-12-30 Новартис Аг Антагонистические антитела против ephb3
MX338185B (es) 2007-01-25 2016-04-05 Dana Farber Cancer Inst Inc Uso de anticuerpos anti-egfr en el tratamiento de enfermedad mediada por egfr mutante.
JP5618549B2 (ja) 2007-03-15 2014-11-05 ルードヴィッヒ インスティテュート フォー キャンサーリサーチ リミテッド Ｅｇｆｒ抗体及びｓｒｃ阻害剤を用いる治療方法及び関連製剤
PL2144923T3 (pl) 2007-04-03 2013-12-31 Biogenerix Ag Sposoby leczenia z użyciem glikopegilowanego G-CSF
AU2014208212B2 (en) * 2007-05-22 2016-07-28 Wyeth Improved processes for making hydrazides
DK2155258T3 (en) * 2007-05-22 2017-09-18 Wyeth Llc Improved Methods for Preparing Hydrazides
ES2551123T3 (es) 2007-06-12 2015-11-16 Ratiopharm Gmbh Proceso mejorado para la producción de azúcares de nucleótido
CA2696360C (en) 2007-08-14 2018-11-20 Ludwig Institute For Cancer Research Monoclonal antibody targeting the egfr receptor and uses thereof
US8207112B2 (en) 2007-08-29 2012-06-26 Biogenerix Ag Liquid formulation of G-CSF conjugate
JP5302340B2 (ja) * 2008-01-30 2013-10-02 カンザス大学 リンパ管内化学療法薬物担体
AU2009219232B2 (en) 2008-02-27 2014-02-27 Novo Nordisk A/S Conjugated Factor VIII molecules
UA108735C2 (uk) * 2008-07-21 2015-06-10 Структурні варіанти антитіл для покращення терапевтичних характеристик
DK3903829T3 (da) 2009-02-13 2023-06-26 Immunomedics Inc Immunkonjugater med en intracellulær spaltelig binding
US8614185B2 (en) * 2009-05-04 2013-12-24 Centocor Ortho Biotech Inc. Fusion proteins of alpha-MSH derivatives and Fc
IN2012DN01663A (de) 2009-09-16 2015-06-05 Immunomedics Inc
TW201120210A (en) 2009-11-05 2011-06-16 Hoffmann La Roche Glycosylated repeat-motif-molecule conjugates
CA2782194C (en) 2009-12-02 2018-01-16 Immunomedics, Inc. Combination of radiolabelled antibodies (rait) and antibody-drug conjugates (adc) for treatment of pancreatic cancer
EP2523680A4 (de) * 2010-01-11 2013-06-19 Ct Molecular Med & Immunology Verstärkte zytotoxizität von antikörpern gegen cd74 und hla-dr mit interferon-gamma
PL2603528T3 (pl) 2010-08-10 2017-07-31 Glycotope Gmbh Przeciwciała Fab-glikozylowane
US8956859B1 (en) 2010-08-13 2015-02-17 Aviex Technologies Llc Compositions and methods for determining successful immunization by one or more vaccines
CA2831572C (en) 2011-05-02 2019-11-26 Immunomedics, Inc. Ultrafiltration concentration of allotype selected antibodies for small-volume administration
US10865383B2 (en) 2011-07-12 2020-12-15 Lineage Cell Therapeutics, Inc. Methods and formulations for orthopedic cell therapy
US9757458B2 (en) 2011-12-05 2017-09-12 Immunomedics, Inc. Crosslinking of CD22 by epratuzumab triggers BCR signaling and caspase-dependent apoptosis in hematopoietic cancer cells
WO2013085893A1 (en) 2011-12-05 2013-06-13 Immunomedics, Inc. Therapeutic use of anti-cd22 antibodies for inducing trogocytosis
WO2013096455A1 (en) 2011-12-20 2013-06-27 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Methods for diagnosing and treating oncogenic kras-associated cancer
US10138479B2 (en) 2012-05-24 2018-11-27 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Targeting the glutamine to pyruvate pathway for treatment of oncogenic Kras-associated cancer
WO2014014518A1 (en) 2012-07-18 2014-01-23 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Methods for treating, preventing and predicting risk of developing breast cancer
CA2874864C (en) 2012-08-14 2023-02-21 Ibc Pharmaceuticals, Inc. T-cell redirecting bispecific antibodies for treatment of disease
WO2017004144A1 (en) 2015-07-01 2017-01-05 Immunomedics, Inc. Antibody-sn-38 immunoconjugates with a cl2a linker
US10744129B2 (en) 2012-12-13 2020-08-18 Immunomedics, Inc. Therapy of small-cell lung cancer (SCLC) with a topoisomerase-I inhibiting antibody-drug conjugate (ADC) targeting Trop-2
US9492566B2 (en) 2012-12-13 2016-11-15 Immunomedics, Inc. Antibody-drug conjugates and uses thereof
US10413539B2 (en) 2012-12-13 2019-09-17 Immunomedics, Inc. Therapy for metastatic urothelial cancer with the antibody-drug conjugate, sacituzumab govitecan (IMMU-132)
US10137196B2 (en) 2012-12-13 2018-11-27 Immunomedics, Inc. Dosages of immunoconjugates of antibodies and SN-38 for improved efficacy and decreased toxicity
US10206918B2 (en) 2012-12-13 2019-02-19 Immunomedics, Inc. Efficacy of anti-HLA-DR antiboddy drug conjugate IMMU-140 (hL243-CL2A-SN-38) in HLA-DR positive cancers
HUE057977T2 (hu) 2012-12-13 2022-06-28 Immunomedics Inc Ellenanyagok és SN-38 immunkonjugátumainak dózisai javított hatásossággal és csökkentett toxicitással
US9931417B2 (en) 2012-12-13 2018-04-03 Immunomedics, Inc. Antibody-SN-38 immunoconjugates with a CL2A linker
WO2015012904A2 (en) 2012-12-13 2015-01-29 Immunomedics, Inc. Antibody-sn-38 immunoconjugates with a cl2a linker
ES2759503T3 (es) 2013-05-02 2020-05-11 Glykos Finland Oy Conjugados de una glicoproteína o un glicano con una carga útil tóxica
US11253606B2 (en) 2013-07-23 2022-02-22 Immunomedics, Inc. Combining anti-HLA-DR or anti-Trop-2 antibodies with microtubule inhibitors, PARP inhibitors, Bruton kinase inhibitors or phosphoinositide 3-kinase inhibitors significantly improves therapeutic outcome in cancer
LT3041507T (lt) 2013-08-26 2021-08-25 Biontech Research And Development, Inc. Nukleorūgštys, koduojančios antikūnus prieš sialil-lewis a
WO2015050844A1 (en) 2013-10-01 2015-04-09 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Methods of treating cancer with atovaquone-related compounds
MX2016010683A (es) 2014-02-21 2017-05-11 Ibc Pharmaceuticals Inc Terapia para tratar enfermedades mediante la induccion de respuesta inmune de las células que expresan trop-2.
US9139649B2 (en) 2014-02-25 2015-09-22 Immunomedics, Inc. Humanized anti-CD22 antibody
WO2015149006A2 (en) 2014-03-27 2015-10-01 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Compositions and methods for modulating ncoa4-mediated autophagic targeting of ferritin
AU2015271685B2 (en) 2014-06-04 2021-02-18 Biontech Research And Development, Inc. Human monoclonal antibodies to ganglioside GD2
WO2015200260A1 (en) 2014-06-24 2015-12-30 Immunomedics, Inc. Anti-histone therapy for vascular necrosis in severe glomerulonephritis
WO2015197919A1 (en) 2014-06-25 2015-12-30 Glykos Finland Oy Antibody drug conjugates binding to high-mannose n-glycan
AU2015282627B2 (en) 2014-06-30 2020-04-02 Glykos Finland Oy Saccharide derivative of a toxic payload and antibody conjugates thereof
PL3204018T3 (pl) 2014-10-07 2022-01-03 Immunomedics, Inc. Neoadiuwantowe zastosowanie koniugatów przeciwciało-lek
CA2981543A1 (en) 2015-04-22 2016-10-27 Immunomedics, Inc. Isolation, detection, diagnosis and/or characterization of circulating trop-2-positive cancer cells
KR20180020169A (ko) 2015-06-24 2018-02-27 에프. 호프만-라 로슈 아게 조정된 친화도를 갖는 항-트랜스페린 수용체 항체
US10195175B2 (en) 2015-06-25 2019-02-05 Immunomedics, Inc. Synergistic effect of anti-Trop-2 antibody-drug conjugate in combination therapy for triple-negative breast cancer when used with microtubule inhibitors or PARP inhibitors
ES2953441T3 (es) 2015-06-25 2023-11-13 Immunomedics Inc Combinación de anticuerpos anti-hla-dr o anti-Trop-2 con inhibidores de microtúbulos, inhibidores de parp, inhibidores de la cinasa de bruton o inhibidores de la fosfoinositida 3-cinasa mejora significativamente el resultado terapéutico en el cáncer
AR106189A1 (es) 2015-10-02 2017-12-20 Hoffmann La Roche ANTICUERPOS BIESPECÍFICOS CONTRA EL A-b HUMANO Y EL RECEPTOR DE TRANSFERRINA HUMANO Y MÉTODOS DE USO
CN114057885A (zh) 2015-10-02 2022-02-18 豪夫迈·罗氏有限公司 双特异性抗人cd20/人转铁蛋白受体抗体及使用方法
US20170224837A1 (en) 2016-02-10 2017-08-10 Immunomedics, Inc. Combination of abcg2 inhibitors with sacituzumab govitecan (immu-132) overcomes resistance to sn-38 in trop-2 expressing cancers
RU2725292C2 (ru) 2016-04-27 2020-06-30 Иммьюномедикс, Инк. Эффективность конъюгатов антитела против trop-2 с лекарственным средством sn-38 для терапии рецидивирующих/рефрактерных к ингибиторам контрольной точки опухолей
WO2017214186A1 (en) 2016-06-09 2017-12-14 University Of Leicester Monoclonal antibodies, compositions and methods for detecting mucin -like protein (mlp) as a biomarker for ovarian and pancreatic cancer
JP2020512314A (ja) 2017-03-27 2020-04-23 イミューノメディクス、インコーポレイテッドＩｍｍｕｎｏｍｅｄｉｃｓ， Ｉｎｃ． サシツズマブゴビテカンとＲＡＤ５１阻害剤を用いたＴｒｏｐ−２発現トリプルネガティブ乳癌の治療
EP3606964A4 (de) 2017-04-03 2020-12-09 Immunomedics, Inc. Subkutane verabreichung von antikörper-arzneimittelkonjugaten zur krebstherapie
JP2020519261A (ja) * 2017-05-11 2020-07-02 ブイアイビー ブイゼットダブリュＶｉｂ Ｖｚｗ 可変免疫グロブリンドメインのグリコシル化
WO2019073069A1 (en) 2017-10-13 2019-04-18 Boehringer Ingelheim International Gmbh HUMAN ANTIBODIES AGAINST THOMSEN-NEW ANTIGEN (TN)
US20210221910A1 (en) 2018-05-18 2021-07-22 Glycotope Gmbh Anti-muc1 antibody
CN109270064B (zh) * 2018-11-12 2020-12-01 新乡医学院 一种基于葡聚糖微球的免疫沉淀试剂及其制备方法与应用
EP3947441A1 (de) 2019-03-27 2022-02-09 UMC Utrecht Holding B.V. Manipulierte iga-antikörper und verfahren zur verwendung
JP2024514683A (ja) * 2021-04-23 2024-04-02 ユニバーシティ オブ メリーランド， カレッジ パーク 部位特異的抗体コンジュゲーションのためのＦｃグリカンリモデリングプラットフォーム法及びその適用
JPWO2022239720A1 (de) 2021-05-10 2022-11-17

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4867973A (en) * 1984-08-31 1989-09-19 Cytogen Corporation Antibody-therapeutic agent conjugates
US4699784A (en) * 1986-02-25 1987-10-13 Center For Molecular Medicine & Immunology Tumoricidal methotrexate-antibody conjugate
US5057313A (en) * 1986-02-25 1991-10-15 The Center For Molecular Medicine And Immunology Diagnostic and therapeutic antibody conjugates
US5541297A (en) * 1988-04-01 1996-07-30 Immunomedics, Inc. Therapeutic conjugates of toxins and drugs
GB8905669D0 (en) * 1989-03-13 1989-04-26 Celltech Ltd Modified antibodies
IT1261894B (it) * 1993-01-20 1996-06-03 Htm Sport Spa Pinna per nuoto.

Also Published As

Publication number Publication date
CA2177616C (en) 2004-10-26
EP0732939B1 (de) 2004-10-20
AU1331995A (en) 1995-06-27
WO1995015769A1 (en) 1995-06-15
US5635603A (en) 1997-06-03
DE69434086D1 (de) 2004-11-25
CA2177616A1 (en) 1995-06-15
JP3095415B2 (ja) 2000-10-03
AU687145B2 (en) 1998-02-19
ATE279946T1 (de) 2004-11-15
CN1142775A (zh) 1997-02-12
EP0732939A4 (de) 1997-03-19
US5443953A (en) 1995-08-22
EP0732939A1 (de) 1996-09-25
IL111914A0 (en) 1995-03-15
IL111914A (en) 2000-06-29
JPH09509309A (ja) 1997-09-22

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