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Hintergrund der Erfindung
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Gebiet der Erfindung
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Die
Erfindung betrifft ein Verfahren zur Zubereitung von stabilen langlebigen
Mikrogasbläschen
zur Ultraschallkontrastverbesserung und zu anderen Zwecken und Zusammensetzungen
der derartig zubereiteten Bläschen.
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Hintergrund der Erfindung
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Die
Ultraschalltechnologie stellt eine wichtige und wirtschaftlichere
Alternative zu solchen Bilderzeugungstechniken dar, die ionisierende
Strahlung verwenden. Es sind zwar zahlreiche herkömmliche
Bilderzeugungstechnologien verfügbar,
z. B. Magnetresonanztomographie (MRI), Computertomographie (CT)
und Positronenemissionstomographie (PET), aber jede dieser Techniken
benötigt
extrem teure Geräte.
Außerdem nutzen
CT und PET ionisierende Strahlung. Im Gegensatz zu diesen Techniken
ist die Ultraschallbilderzeugungsgerätetechnik relativ billig. Außerdem nutzt
die Ultraschallbilderzeugung nicht die ionisierende Strahlung.
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Ultraschallbilderzeugung
nutzt Differenzen der Gewebedichte und der Zusammensetzung, die
die Reflektion von Schallwellen durch diese Gewebe beeinflussen.
Die Bilder sind besonders scharf, wenn deutlich unterscheidbare Änderungen
der Gewebedichte oder der Komprimierbarkeit vorhanden sind, z. B.
in Gewebegrenzbereichen. Grenzbereiche zwischen festen Geweben,
dem Skelettsystem und verschiedenen Organen und/oder Tumoren sind
ohne weiteres durch Ultraschall bildlich darstellbar.
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Demzufolge
funktioniert in vielen Bilderzeugungsanwendungen Ultraschall gut
ohne Verwendung von Kontrastverbesserungsmitteln; aber bei anderen
Anwendungen, z. B. bei der Vi sualisierung des strömenden Blutes,
gibt es anhaltende Bemühungen,
solche Mittel zu entwickeln, um eine Kontrastverbesserung zu erreichen.
Eine besonders wichtige Anwendung für solche Kontrastmittel besteht
auf dem Gebiet der Perfusionsszintigramme. Solche Ultraschallkontrastmittel
könnten
die Bilderzeugung von strömendem
Blut im Herzmuskel, in den Nieren, der Leber und anderen Geweben
verbessern. Dies wiederum würde
Untersuchung, Diagnose, Chirurgie und Therapie bei dem bildlich
dargestellten Gewebe erleichtern. Ein Blut-Pool-Kontrastmittel würde auch
eine Bilderzeugung auf der Grundlage des Blutgehalts (z. B. von
Tumoren und entzündeten
Geweben) ermöglichen
und würde
zur Visualisierung der Plazenta oder des Fötus durch Verbesserung lediglich des
mütterlichen
Kreislaufs beitragen.
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Eine
Vielzahl verschiedener Ultraschallkontrastverbesserungsmittel ist
bisher vorgeschlagen worden. Die erfolgreichsten Mittel haben bisher
im allgemeinen aus Mikrogasbläschen
bestanden, die intravenös
injiziert werden können.
In ihrer einfachsten Ausführungsform
sind Mikrobläschen
kleinste Bläschen,
die ein Gas, z. B. Luft, enthalten, und diese entstehen unter Verwendung
von Schäumungsmitteln,
Surfactants bzw. oberflächenaktiven
Stoffen oder Kapselungsmitteln. Die Mikrobläschen stellen ein physisches
Objekt im strömenden
Blut dar, das eine andere Dichte und eine viel höhere Komprimierbarkeit hat
als das umgebende Fluidgewebe und das Blut. Infolgedessen können diese
Mikrobläschen
ohne weiteres durch Ultraschall bildlich dargestellt werden.
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Die
Zusammensetzungen der meisten Mikrobläschen haben bisher jedoch keine
Kontrastverbesserung, die auch nur wenige Sekunden, geschweige denn
Minuten Kontrastverbesserung erbracht hätte. Dies schränkt ihren
Nutzen stark ein. Mikrobläschen
sind daher verschieden "aufgebaut", um ihre effektive
Kontrastverbesserungslebensdauer zu erhöhen. Verschiedene Wege sind
bisher beschritten worden: die Verwendung verschiedener Surfactants
oder Schäumungsmittel;
die Verwendung von Gelatinen oder Albuminmikrokugeln, die anfänglich in
einer Flüssigsuspension
entstehen und die während
der Erstarrung Gas einschließen;
und Liposombildung. Jeder dieser Versuche müßte theoretisch festere Bläschenstrukturen
erzeugen. Die einge schlossenen Gase (normalerweise Luft, CO2 oder dgl.) stehen infolge der Oberflächenspannung
des umgebenden Surfactants unter erhöhtem Druck im Bläschen, wie
durch die Laplacesche Gleichung (ΔP
= 2γ/r)
beschrieben.
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Dieser
erhöhte
Druck wiederum führt
zu einer schnellen Schrumpfung und Auflösung des Bläschens, wenn das Gas aus einem
hohen Druckbereich (im Bläschen)
in eine Umgebung mit niedrigerem Druckbereich (entweder in der umgebenden
Flüssigkeit,
die bei diesem erhöhten
Druck nicht mit Gas gesättigt
ist, oder in einem Bläschen
mit größerem Durchmesser
und niedrigerem Druck) übergeht.
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Festphase-Hüllen, die
Gase einkapseln, haben sich im allgemeinen als zu fragil oder zu
durchlässig erwiesen,
als daß das
Gas eine ausreichende Lebensdauer im lebenden Organismus haben könnte. Ferner reduzieren
dicke Hüllen
(z. B. Albumin, Zucker oder andere viskose Materialien) die Komprimierbarkeit
der Bläschen,
so daß ihre
Echotauglichkeit während
der kurzen Zeit, in der sie bestehen, reduziert wird. Feststoffpartikel
oder flüssige
Emulsionströpfchen,
die Gas oder Blasen entwickeln, wenn sie injiziert werden, stellen eine
Gefahr der Übersättigung
des Blutes mit Gas oder Dampf dar. Dies führt zu einer kleinen Anzahl
von großen
embolisierenden Bläschen,
die sich an den wenigen verfügbaren
Bläschenkeimstellen
bilden, und nicht zu der beabsichtigten großen Anzahl von kleinen Bläschen.
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Ein
Vorschlag zur Lösung
solcher Probleme ist ausgeführt
in Quay, PCT/US92/07250. Bei Quay werden Bläschen unter Verwendung von
Gasen gebildet, die danach ausgewählt sind, daß sie bei
Körpertemperatur
(37°C) ein
Gas sind und eine reduzierte Wasserlöslichkeit, eine höhere Dichte
und eine reduzierte Gasdiffusionsfähigkeit in Lösungen im
Vergleich zu Luft haben. Obwohl eine reduzierte Wasserlöslichkeit
und Diffusionsfähigkeit
die Geschwindigkeit, mit der das Gas das Bläschen verläßt, beeinflussen kann, bleiben
zahlreiche Probleme bei den Bläschen
von Quay offen. Die Ausbildung von Bläschen mit einem hinreichend
kleinen Durchmesser (z. B. 3 bis 5 μm) erfordert einen hohen Energieaufwand.
Dies ist insofern ein Nachteil, als hochentwickelte Bläschenzubereitungssysteme
am Verwendungsort vorhanden sein müssen. Außerdem sind die Gasauswahlkriterien
von Quay insofern fehlerhaft, als sie bestimmte Hauptursachen für die Bläschenschrumpfung
nicht berücksichtigen,
nämlich
die Auswirkungen der Bläschenoberflächenspannung,
der Surfactant- und der Osmosegaswirkungen, und diese Fehler führen zum
Einschluß bestimmter
ungeeigneter Gase und zum Ausschluß bestimmter optimal geeigneter
Gase.
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Demzufolge
besteht in der Fachwelt Bedarf an Zusammensetzungen und an einem
Verfahren zur Zubereitung solcher Zusammensetzungen, die ein langlebiges
Kontrastverbesserungsmittel darstellen oder ausnutzen, das biokompatibel,
leicht zubereitbar ist und eine starke Kontrastverbesserung bei
der Ultraschallbilderzeugung bietet.
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Zusammenfassung der Erfindung
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Erfindungsgemäß wird ein
Ultraschallkontrastverbesserungsmittel bereitgestellt, das eine
verlängerte Lebensdauer
im lebenden Organismus hat, und das aus einer praktisch beliebigen
herkömmlichen
Mikrobläschenformulierung
in Verbindung mit einem eingeschlossenen Gas oder Gasgemisch besteht,
das unter Berücksichtigung
von Partialdrücken
von Gasen sowohl innerhalb als auch außerhalb des Bläschens gewählt wird,
und von den resultierenden Differenzen im Osmosegasdruck, der der
Bläschenschrumpfung
entgegenwirkt. Gase mit einem niedrigen Dampfdruck und begrenzter
Löslichkeit
im Blut oder Serum (d. h. relativ hydrophobe Gase) können vorteilhafterweise
in Kombination mit einem anderen Gas bereitgestellt werden, das schneller
mit Gasen ausgetauscht wird, die im normalen Blut oder Serum enthalten
sind. Es werden Surfactant-Familien, die die Verwendung höher molukularer
Osmosegasmittel ermöglichen,
und verbesserte Verfahren zur Bläschenerzeugung
offenbart.
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Ein
Aspekt der Erfindung ist ein stabilisiertes gasgefülltes Mikrobläschenpräparat, mit
einem Gemisch aus einem ersten Gas oder Gasen und einem zweiten
Gas oder Gasen (Osmosegasmittel) innerhalb von im allgemeinen kugelförmigen Membranen,
um Mikrobläschen
zu bilden, wobei das erste Gas und das zweite Gas jeweils in einem
Molverhältnis
von etwa 1 : 100 bis etwa 1000 : 1 vorhanden sind und wobei das
erste Gas einen Dampfdruck von mindestens etwa (760 – x) mm
Hg bei 37°C
hat, wobei x der Dampfdruck des zweiten Gases bei 37°C ist und
wobei der Dampfdruck des ersten und des zweiten Gases bei 37°C größer ist
als etwa 75 mm Hg unter der Bedingung, daß das erste Gas und das zweite
Gas kein Wasserdampf sind. In einer Ausführungsform weist das zweite
Gas einen Fluorkohlenwasserstoff auf, und das erste Gas ist ein
Nichtfluorkohlenwasserstoff, z. B. Stickstoff, Sauerstoff, Kohlendioxid
oder Gemische daraus.
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Die
Mikrobläschen
können
vorteilhaft in einem flüssigen
Medium bereitgestellt werden, z. B. in einem wäßrigen Medium, wobei sie einen
ersten mittleren Durchmesser haben, das Verhältnis zwischen dem ersten Gas
und dem zweiten Gas im Mikrobläschen
mindestens 1 : 1 ist und die Mikrobläschen geeignet sind, infolge des
Verlustes des ersten Gases durch die Membran auf einen zweiten mittleren
Durchmesser von weniger als etwa 75% des ersten Durchmessers in
dem Medium zu schrumpfen und dann infolge einer Osmosegasdruckdifferenz
durch die Membran bei oder etwa bei dem zweiten Durchmesser für mindestens
etwa 1 min stabilisiert zu bleiben. Vorteilhafterweise ist das Medium
in einem Behälter,
und die Mikrobläschen
sind tatsächlich in
dem Behälter
entstanden. Als Alternative ist das Medium Blut im lebenden Organismus.
In einer Ausführungsform
enthält
das flüssige
Medium darin gelöstes
Gas oder Gase mit einer Spannung von mindestens etwa 700 mm Hg,
wobei der erste Durchmesser mindestens etwa 5 μm beträgt und wobei die Spannung des in
dem Medium gelösten
Gases oder der Gase kleiner ist als der Partialdruck des gleichen
Gases oder der gleichen Gase innerhalb der Mikrobläschen.
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In
einer besonders bevorzugten Ausführungsform
enthält
das Bläschen
anfangs mindestens drei Gase: ein erstes Gas mit einem Partialdruck,
der viel größer ist
als die Gasspannung des gleichen Gases in der umgebenden Flüssigkeit
(z. B. 1,5; 2; 4; 5; 10; 20; 50 oder 100 mal oder noch größer als
in der umgebenden Flüssigkeit);
ein zweites Gas, das aufgrund der relativ geringen Permeabilität der Bläschenmembran
für das Gas
oder einer relativ niedrigen Löslichkeit
des Gases im umgebenden Medium im Bläschen festgehalten wird (wie
an anderer Stel le hierin beschrieben); und ein drittes Gas, für das die
Membran relativ durchlässig
ist und das auch in dem umgebenden Medium vorhanden ist. Beispielsweise
kann in einem wäßrigen System,
das der Luft ausgesetzt ist oder zumindest teilweise ein ausgeglichenes
Verhältnis
mit ihr hat (z. B. Blut), das erste Gas vorteilhafterweise Kohlendioxid
oder ein anderes Gas sein, das nicht in großen Mengen in der Luft oder
im Blut vorhanden ist; das zweite Gas kann Fluorkohlenwasserstoffgas
sein, z. B. Perfluorhexan; und das dritte Gas kann Luft sein oder
ein Hauptbestandteil von Luft, z. B. Stickstoff oder Sauerstoff.
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Vorzugsweise
ist der erste Durchmesser vor der Schrumpfung mindestens etwa 10 μm, und der
zweite Durchmesser, wenn der Durchmesser stabilisiert ist, liegt
zwischen etwa 1 μm
und 6 μm.
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Für alle Mikrobläschenpräparate oder
-verfahren, die hier beschrieben sind, hat das zweite Gas in einer
bevorzugten Ausführungsform
ein mittleres Molekulargewicht von mindestens etwa dem 4-fachen
des ersten Gases. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform
hat das zweite Gas einen Dampfdruck, der bei 37°C kleiner ist als etwa 750 oder
760 mm Hg. Außerdem
wird bevorzugt, daß das
Molverhältnis
zwischen dem ersten Gas und dem zweiten Gas etwa 1 : 10 bis etwa
500 : 1, 200 : 1 oder 100 : 1 ist. In weiteren bevorzugten Ausführungsformen
weist das zweite Gas einen Fluorkohlenwasserstoff oder ein Gemisch
aus mindestens zwei oder drei Fluorkohlenwasserstoffen auf, und
das erste Gas ist ein Nichtfluorkohlenwasserstoff. Bei bestimmten
vorteilhaften Präparaten
weist das zweite Gas ein oder mehrere Perfluorkohlenwasserstoffe
auf. Bei anderen weisen sowohl das erste Gas als auch das zweite
Gas Fluorkohlenwasserstoffe auf. Bei noch weiteren enthalten die
Mikrobläschen
als erstes Gas oder als zweites Gas bzw. als erstes und zweites
Gas gasförmiges
Perfluorbutan und Perfluorhexan in einem Verhältnis von etwa 1 : 10 bis etwa
10 : 1. Als Alternative enthalten die Mikrobläschen als erstes Gas oder als
zweites Gas bzw. als erstes und zweites Gas gasförmiges Perfluorbutan und Perfluorpentan
in einem Verhältnis
von etwa 1 : 10 bis etwa 10 : 1. Es ist vorteilhaft, daß das zweite
Gas das Mikrobläschen
viel langsamer verläßt als das
erste Gas; somit wird bevor zugt, daß das zweite Gas eine Wasserlöslichkeit
hat, die nicht größer ist
als etwa 0,5 mM bei 25°C
und eine Atmosphäre
hat, und das erste Gas hat eine Wasserlöslichkeit, die von mindestens
etwa 10 mal und vorzugsweise mindestens 20, 50, 100 oder 200 mal
größer ist
als die des zweiten Gases. Ebenso wird bevorzugt, daß die Permeabilität der Membran
des ersten Gases mindestens etwa 5 mal, vorzugsweise 10, 20, 50
oder 100 mal größer ist
als die Permeabilität
der Membran für
das zweite Gas.
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Das
Mikrobläschenpräparat kann
vorteilhafterweise in einem Behälter
enthalten sein, wobei eine Flüssigkeit
in dem Behälter
als Beimischung zu den Mikrobläschen
enthalten ist, wobei der Behälter
ferner Einrichtungen zum Durchlassen einer ausreichenden Ultraschallenergie
an die Flüssigkeit
aufweist, um die Ausbildung der Mikrobläschen durch Beschallung zu
ermöglichen.
Auf diese Weise können
die Mikrobläschen
vom Arzt (oder von einem anderen Spezialisten) unmittelbar vor Verwendung
durch Anwendung von Ultraschallenergie von einer äußeren Quelle
auf das sterile Präparat
im Behälter
ausgebildet werden. Diese Einrichtung zum Durchlassen können beispielsweise
ein flexibles Polymermaterial mit einer Dicke sein, die kleiner
ist als etwa 0,5 mm (die ein leichtes Durchlassen der Ultraschallenergie
ohne Überhitzung
der Membran ermöglicht). Solche
Membranen können
aus solchen Polymeren wie etwa natürlicher oder synthetischer
Kautschuk oder einem anderen Elastomer, Polytetrafluorethylen, Polyethylenterephthalat
und dgl. hergestellt werden.
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Bei
den erfindungsgemäßen Mikrobläschenpräparaten
ist die Membran, die das Gas einschließt, vorzugsweise ein Surfactant.
Ein bevorzugter Surfactant-Typ ist u. a. ein nicht-newtonsches, viskoelastisches Surfactant,
allein oder in Kombination mit einem anderen Surfactant. Weitere
bevorzugte allgemeine und spezifische Surfactant-Kategorien sind
u. a. Kohlehydrate, z. B. Polysaccharide, derivatisierte Kohlehydrate,
z. B. Fettsäureester
von Zuckerarten, z. B. Saccharose (vorzugsweise Saccharosestearat)
und Protein-Surfactants, einschließlich Albumin. Als Alternative
muß die
Membran des Mikrobläschens
kein Fluid sein (z. B. ein Surfactant), sondern kann statt dessen
ein fester oder halbfester Stoff sein, z. B. ein gehärtetes,
eingedicktes oder denaturiertes Proteinmaterial (z. B. Albumin),
Kohlehydrate oder dgl.
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Eine
vorteilhafte Form der Erfindung ist ein Kit bzw. eine Ausstattung
zur Verwendung bei der Zubereitung von Mikrobläschen, vorzugsweise am Ort
der Verwendung. Diese Ausstattung kann einen verschlossener Behälter (z.
B. eine Ampulle mit einem Trennwandverschluß zur einfachen Entnahme der
Mikrobläschen unter
Verwendung einer Injektionsspritze), eine Flüssigkeit im Behälter (z.
B. Wasser oder ein gepuffertes, isotonisches, steriles wäßriges Medium),
ein Surfactant im Behälter
und ein Fluorkohlenwasserstoffgas (einschließlich eines Fluorkohlenwasserstoffdampfs)
im Behälter
umfassen, wobei die Flüssigkeit,
das Surfactant und das Kohlenwasserstoffgas oder der Kohlenwasserstoffdampf
zusammen geeignet sind, bei Zuführung
von Energie Mikrobläschen
auszubilden. Die Energie kann vorteilhafterweise einfach Schüttelbewegungsenergie, entweder
manuell oder mechanisch, Rühren
oder Schlagen oder Ultraschallenergie sein. Die Ausstattung bzw. das
Kit weist vorzugsweise eine Einrichtung im Behälter auf, die das Durchlassen
einer ausreichenden äußeren Ultraschallenergie
zu der Flüssigkeit
ermöglicht,
um Mikrobläschen
im Behälter
auszubilden. Wie oben ausgeführt,
kann die Einrichtung zum Durchlassen in einer Ausführungsform
eine flexible Polymermembran mit einer Dicke von weniger als etwa
0,5 mm aufweisen. In einer Ausführungsform
weist die Ausstattung ferner ein Nichtfluorkohlenwasserstoffgas
im Behälter
auf, wobei das Molverhältnis
zwischen dem Nichtfluorkohlenwasserstoffgas und dem Fluorkohlenwasserstoffgas
etwa 1 : 10 bis etwa 1000 : 1 beträgt, unter der Bedingung, daß das Nichtfluorkohlenwasserstoffgas
kein Wasserdampf ist. Bei allen erfindungsgemäßen Ausstattungen können das
Surfactant, das Gas oder die Gase und die anderen Elemente der Ausstattung
in bestimmten Ausführungsformen
die gleichen sein, wie oben für
das Mikrobläschenpräparat an
sich ausgeführt.
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In
einer weiteren Ausführungsform
weist die Ausstattung auf: einen Behälter, getrocknete flüssigkeitslösliche hohlraumhaltige
Strukturen im Behälter,
wobei die flüssigkeitshal tigen
Strukturen mehrere Hohlräume mit
einem mittleren Durchmesser bilden, der kleiner ist als etwa 100 μm, ein Gas
in den Hohlräumen
und ein Surfactant, wobei die hohlraumhaltigen Strukturen, das Gas
und der Surfactant zusammen geeignet sind, bei Zuführung einer
Flüssigkeit
in den Behälter,
in der hohlraumhaltige Strukturen löslich sind, Mikrobläschen auszubilden.
Die hohlraumhaltigen Strukturen können zumindest teilweise aus
dem Surfactant hergestellt werden, z. B. durch Gefriertrocknung
des hohlraumbildenden Materials oder durch Sprühtrocknung, oder können aus einem
beliebigen anderen flüssigkeitslöslichen
(vorzugsweise wasserlöslichen)
filmbildenden Material, z. B. Albumin, Enzyme oder andere Proteine,
einfache oder komplexe Kohlehydrate oder Polysaccharide und dgl. ausgebildet
werden. Die Surfactants, die in der Ausstattung verwendet werden,
können
vorteilhaft diejenigen sein, die oben in Verbindung mit den Mikrobläschenpräparaten
an sich beschrieben worden sind.
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Die
Erfindung weist auch ein Verfahren zur Ausbildung von Mikrobläschen auf,
mit den folgenden Schritten: Bereitstellen eines ersten Gases, eines
zweiten Gases, eines membranbildenden Materials und einer Flüssigkeit,
wobei das erste Gas und das zweite Gas in einem Molverhältnis von
etwa 1 : 100 bis etwa 1000 : 1 vorhanden sind und wobei das erste
Gas bei 37°C
einen Dampfdruck von mindestens etwa (760 – x) mm Hg hat, wobei x der
Dampfdruck des zweiten Gases bei 37°C ist und wobei der Dampfdruck
des ersten und zweiten Gases bei 37°C größer ist als 75 mm Hg unter
der Bedingung, daß das
erste Gas und das zweite Gas kein Wasserdampf sind und das erste
und das zweite Gas mit dem membranbildenden Material umgeben sind, um
Mikrobläschen
in der Flüssigkeit
zu bilden. Die membranbildenden Materialien und Gase können die
sein, die oben beschrieben sind. Das Verfahren weist vorzugsweise
ferner die folgenden Schritte auf: anfängliches Ausbilden von Mikrobläschen mit
einem ersten mittleren Durchmesser, wobei das anfängliche
Verhältnis
zwischen dem ersten Gas und dem zweiten Gas in den Mikrobläschen mindestens
etwa 1 : 1 ist, Kontaktieren der Mikrobläschen mit einem ersten mittleren
Durchmesser mit einem flüssigen
Medium, Schrumpfen der Mikrobläschen
im Medium in folge des Verlustes des ersten Gases durch die Membran
und anschließendes
Stabilisieren der Mikrobläschen
bei einem zweiten mittleren Durchmesser von weniger als etwa 75%
des ersten Durchmessers für
eine Zeitspanne von mindestens einer Minute. Vorzugsweise werden
die Mikrobläschen
bei dem zweiten Durchmesser durch Bereitstellen einer Osmosegasdifferenz
durch die Membran stabilisiert, so daß die Spannung des im Medium
gelösten
Gases oder der Gase größer oder
gleich dem Druck des gleichen Gases oder der Gase in den Mikrobläschen ist.
In einer Ausführungsform
ist der erste Durchmesser mindestens etwa 5 μm.
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Die
Erfindung weist auch ein Verfahren zur Ausbildung von Mikrobläschen mit
den folgenden Schritten auf: Bereitstellen von getrockneten, flüssigkeitslöslichen,
hohlraumhaltigen Strukturen, wobei die hohlraumhaltigen Strukturen
eine Vielzahl von Hohlräumen
mit einem Durchmesser bilden, der kleiner ist als etwa 100 μm, Bereitstellen
eines Gases in den Hohlräumen,
Bereitstellen eines Surfactants, Kombinieren der hohlraumhaltigen
Strukturen, des Gases, des Surfactants und einer Flüssigkeit
miteinander, in der die hohlraumhaltigen Strukturen löslich sind,
und Lösen
der hohlraumhaltigen Strukturen in der Flüssigkeit, so daß das Gas
in den eingeschlossenen Räumen
Mikrobläschen
bildet, die vom Surfactant umgeben sind. Wie bei der Ausstattung werden
bevorzugte hohlraumhaltige Strukturen aus Protein, Surfactant, Kohlehydrat
oder einem beliebigen anderen der oben beschrieben Materialien ausgebildet.
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Ein
weiterer Aspekt der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung
von Mikrobläschen
mit einer erhöhten
Lagerungsstabilität
mit den folgenden Schritten: Sprühtrocknen
einer flüssigen
Formulierung eines biokompatiblen Materials, um daraus hohle Mikrokugeln
zu erzeugen, Durchdringen der Mikrokugeln mit einem Osmosegasmittel
(dem zweiten Gas), das mit dem ersten Gas gemischt ist, und Speichern
der Mikrokugeln in einem Behälter
mit dem Gasgemisch und anschließendes
Hinzusetzen einer wäßrigen Phase
zu dem Pulver, wobei das Pulver die wäßrige Phase löst, um das
Gasgemisch in einer flüssigen
Surfactant-Membran
einzuschließen,
um Mikrobläschen
zu bilden. In einer Ausführungsform
weist die Mikrokugel eine Stärke
oder ein Stärkederivat
mit einem Molekulargewicht von mehr als etwa 500 000 oder einem
Dextrose-Äquivalenzwert von
weniger als etwa 12 auf. Ein bevorzugtes Stärkederivat ist Hydroxyethylstärke. Vorzugsweise
weist das Osmosegasmittel einen Perfluorkohlenwasserstoff auf. In
einer weiteren Ausführungsform
weist das Mikrokügelchen
ein Zuckerester mit einer Komponente mit einem hydrophil-lipophilen
Gleichgewicht von weniger als etwa 8 auf. Vorzugsweise ist der Zuckerester
Saccharosetristearat.
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Die
Erfindung weist auch ein Verfahren zur Ausbildung von Mikrobläschen mit
den folgenden Schritten auf: Bereitstellung eines mit einem Osmosegasmittel
durchsetzten Surfactant-Pulvers
und Kombinieren des Pulvers mit einer wäßrigen Phase.
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Noch
ein weiterer Aspekt der Erfindung ist ein Verfahren zur Erhöhung der
Halbwertzeit der Mikrobläschen
im lebenden Organismus, mit den folgenden Schritten: Bereitstellen
einer sprühgetrockneten
Formulierung in Kombination mit einem Osmosegasmittel, das die Formulierung
durchdringt, und Kombinieren der Formulierung mit einer wäßrigen Phase,
um Mikrobläschen
mit einer Halbwertzeit im lebenden Organismus von mindestens etwa
20 s zu bilden. In bevorzugten Ausführungen weist die sprühgetrocknete
Formulierung eine Stärke
oder ein Stärkederivat
auf, und das Zuckerester ist Saccharosetristearat.
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Die
Erfindung weist auch die Verwendung eines stabilisierten, flüssigen Mikrobläschenpräparats zur Herstellung
eines Diagnosemittels zur bildlichen Darstellung eines Objekts oder
Körpers
mit den folgenden Schritten auf: Einführen irgendeines der oben erwähnten Mikrobläschenpräparate in
das Objekt oder den Körper
und anschließende
Ultraschallbildgewinnung zumindest eines Teils des Objekts oder
Körpers.
Vorzugsweise ist der Körper
ein Wirbeltier, und das Präparat
wird in die Gefäße des Wirbeltiers
eingeleitet. Das Verfahren kann ferner die Schritte aufweisen: Herstellen
der Mikrobläschen
auf eine der oben erwähnten
Weise vor Einleitung in das Lebewesen.
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Eine
weitere Ausführungsform
der Erfindung ist ein mit einem stabilisierten Gas gefülltes Mikrobläschenpräparat mit:
einem
Behälter;
und
einem im Behälter
befindlichen Gemisch aus einem ersten Gas oder Gasen und einem zweiten
Gas oder Gasen innerhalb von im allgemeinen kugelförmigen Membranen,
um Mikrobläschen
zu bilden, wobei das erste Gas und das zweite Gas jeweils in einem
Molverhältnis
von etwa 1 : 100 bis etwa 1000 : 1 vorhanden sind und wobei das
erste Gas einen Dampfdruck von mindesten: etwa (760 – x) mm
Hg bei 37°C
hat, wobei x der Dampfdruck des zweiten Gases bei 37°C ist und
wobei der Dampfdruck des ersten und zweiten Gases bei 37°C größer ist
als etwa 75 mm Hg unter der Bedingung, daß das erste Gas und das zweite
Gas kein Wasserdampf sind.
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In
einer bevorzugten Ausführungsform
weist das zweite Gas einen Fluorkohlenwasserstoff auf, und das erste
Gas ist ein Nichtfluorkohlenwasserstoff. Vorzugsweise weist das
erste Gas Stickstoff, Sauerstoff, Kohlendioxid oder Gemische daraus
auf. Die Erfindung weist ferner das oben erwähnte Präparat auf, wobei:
die
Mikrobläschen
in einem flüssigen
Medium sind und einen ersten mittleren Durchmesser haben;
das
Verhältnis
zwischen dem ersten Gas und dem zweiten Gas in den Mikrobläschen mindestens
1 : 1 ist; und
die Mikrobläschen
geeignet sind, infolge des Verlustes des ersten Gases durch die
Membran auf einen zweiten mittleren Durchmesser von weniger als
etwa 75% des ersten Durchmessers im Medium zu schrumpfen und dann
infolge der Osmosegasdruckdifferenz durch die Membran bei oder etwa
bei dem zweiten Durchmesser für
mindestens etwa 1 min stabilisiert zu bleiben.
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Vorteilhafterweise
ist das Medium wäßrig. In
einer alternativen Ausführungsform
ist das Medium in einem Behälter,
und die Mikrobläschen
sind in dem Behälter
ausgebildet worden. Vorzugsweise ist das Medium Blut im lebenden
Organismus. Unter einem weiteren Aspekt dieser bevorzugten Ausführungsform
enthält
das flüssige
Medium in ihm gelöstes
Gas oder Gase mit einer Gasspannung von mindestens etwa 700 mm Hg, wobei
der erste Durchmesser mindestens etwa 5 μm ist und wobei die Spannung
des im Medium gelösten
Gases oder der Gase kleiner ist als der Druck des gleichen Gases
oder der Gase im Mikrobläschen.
Vorzugsweise ist der erste Durchmesser mindestens etwa 10 μm, und der
zweite Durchmesser ist zwischen etwa 1 und 6 μm. Unter einem weiteren Aspekt
der Erfindung hat das zweite Gas ein mittleres Molekulargewicht
von mindestens etwa dem 4-fachen des Molekulargewichts des ersten
Gases. Vorteilhafterweise hat das zweite Gas bei 37°C einen Dampfdruck
von weniger als etwa 750 mm Hg, und das Verhältnis zwischen dem ersten Gas und
dem zweiten Gas ist etwa 1 : 10 bis etwa 500 : 1. Das zweite Gas
weist vorzugsweise Fluorkohlenwasserstoff auf, und das erste Gas
ist ein Nichtfluorkohlenwasserstoff. Als Alternative kann das zweite
Gas mindestens zwei Fluorkohlenwasserstoffe oder einen Perfluorkohlenwasserstoff
aufweisen. In einer weiteren alternativen Ausführungsform weisen das erste
Gas und das zweite Gas Fluorkohlenwasserstoffe auf. Unter einem weiteren
Aspekt der Erfindung enthalten die Mikrobläschen als das erste Gas oder
das zweite Gas bzw. als das erste und das zweite Gas gasförmiges Perfluorbutan
und Perfluorhexan in einem Verhältnis
von etwa 1 : 10 bis etwa 10 : 1. Unter einem weiteren Aspekt der
Erfindung enthalten die Mikrobläschen
als das erste Gas oder das zweite Gas bzw. als das erste und das
zweite Gas gasförmiges
Perfluorbutan und Perfluorpentan in einem Verhältnis von etwa 1 : 10 bis etwa
10 : 1. Gemäß einem
weiteren Aspekt der Erfindung hat das zweite Gas bei 25°C und einer
Atmosphäre
eine Wasserlöslichkeit
von nicht mehr als etwa 0,5 mM, und das erste Gas hat eine Wasserlöslichkeit,
die mindestens 10-mal größer ist
als die des zweiten Gases. Vorzugsweise ist die Permeabilität der Membran
für das
erste Gas mindestens etwa 5-mal größer als die Permeabilität der Membran
für das
zweite Gas. Gemäß einem
weiteren Aspekt der Erfindung weist das Präparat ferner eine Flüssigkeit
im Behälter
als Beimischung zu den Mikrobläschen
auf, wobei der Behälter
ferner eine Einrichtung zum Durchlassen einer ausreichenden Ultraschallenergie
auf die Flüssigkeit
aufweist, damit die Formulierung der Mikrobläschen durch Beschallung möglich wird.
Vorteilhafterweise weist die Einrichtung zum Durchlassen ein flexibles
Polymermaterial mit einer Dicke von weniger als etwa 0,5 mm auf.
Vorzugsweise ist die Membran ein Surfactant; besonders bevorzugt
weist das Surfactant ein nicht-newtonsches, viskoelastisches oder
Kohlehydrat-Surfactant auf. Das Kohlehydrat ist vorzugsweise ein
Poly saccharid. In alternativen Ausführungsformen ist das Surfactant
ein Fettsäureester
eines Zuckers; vorzugsweise ist es Saccharosestearat. In einer alternativen
Ausführungsform
ist das Surfactant proteinhaltig. Gemäß einem weiteren Aspekt der
Erfindung ist die Membran fest oder halbfest; vorteilhafterweise
ist sie ein proteinhaltiges Material. Das proteinhaltige Material ist
vorzugsweise Albumin.
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Gemäß einem
weiteren Aspekt der Erfindung ist ein Kit bzw. eine Ausstattung
zur Verwendung bei der Zubereitung von Mikrobläschen vorhanden, mit:
einem
Behälter;
getrockneten,
flüssigkeitslöslichen,
hohlraumhaltigen Strukturen im Behälter, wobei die hohlraumhaltigen Strukturen
mehrere Hohlräume
mit einem mittleren Durchmesser von weniger als etwa 100 μm bilden;
einem
Gas in den Hohlräumen;
und
einem Surfactant, wobei die hohlraumhaltigen Strukturen,
das Gas und das Surfactant zusammen geeignet sind, bei Zugabe einer
Flüssigkeit
in den Behälter,
in der die flüssigkeitshaltigen
Strukturen löslich
sind, Mikrobläschen
zu bilden.
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Vorzugsweise
weisen die hohlraumhaltigen Strukturen mindestens teilweise das
Surfactant auf. Vorteilhafterweise ist das Surfactant ein nicht-newtonsches,
viskoelastisches Surfactant. Vorzugweise ist das Surfactant ein
Fettsäureester
eines Zuckers; besonders bevorzugt ist es Saccharosestearat. Als
Alternative sind die hohlraumhaltigen Strukturen proteinhaltig oder
bestehen aus einem Kohlehydrat.
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Kurzbeschreibung der Zeichnungen
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1 ist
eine perspektivische Ansicht einer Zweikammer-Ampulle, die ein mikrobläschenbildendes Präparat enthält, mit
einer wäßrigen Lösung in
einer oberen Kammer und festen und gasförmigen Bestandteilen in einer
unteren Kammer.
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2 stellt
die Ampulle aus 1 dar, wobei die wäßrige Lösung mit
den festen Bestandteilen gemischt worden ist, um die Mikrobläschen zur
Verabreichung an einen Patienten zu bilden.
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3 ist
eine perspektivische Ansicht einer umgekehrten Zweikammer-Ampulle,
die ein mikrobläschenbildendes
Präparat
enthält,
mit einer wäßrigen Lösung in
der unteren Kammer und festen und gasförmigen Bestandteilen in der
oberen Kammer.
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4 stellt
die Ampulle aus 3 dar, wobei die wäßrige Lösung mit
den festen Bestandteilen gemischt worden ist, um Mikrobläschen zur
Verabreichung an einen Patienten zu bilden.
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Ausführliche Beschreibung der Erfindung
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Die
Begriffe "Dampf" und "Gas", wie sie in der
Beschreibung und in den Ansprüchen
verwendet werden, sind austauschbar. Ebenso ist, wenn auf die Spannung
des gelösten
Gases in einer Flüssigkeit
Bezug genommen wird, der gebräuchlichere
Begriff "Druck" mit "Spannung" austauschbar. "Osmosegasdruck" ist nachstehend
ausführlicher
definiert, aber in einer einfachen Annäherung kann man davon ausgehen,
daß es sich
um die Differenz zwischen dem Partialdruck eines Gases in einem
Mikrobläschen
und dem Druck oder der Spannung dieses Gases (entweder in einer
Gasphase oder gelöst
in einer Flüssigphase)
außerhalb
des Mikrobläschens
handelt, wenn die Mikrobläschenmembran
für das
Gas durchlässig
ist. Im einzelnen handelt es sich um Differenzen der Gastdiffusionsgeschwindigkeiten
durch die Membran. Der Begriff "Membran" bedeutet Material,
das ein Mikrobläschen
umgibt oder bildet, ganz gleich, ob es ein Surfactant, eine andere
filmbildende Flüssigkeit
oder ein filmbildender Feststoff oder halbfester Stoff ist. Als "Mikrobläschen" gelten Bläschen mit
einem Durchmesser zwischen etwa 0,5 und 300 μm, bevorzugt mit einem Durchmesser
von nicht mehr als etwa 200, 100 oder 50 μm und zur intravaskulären Verwendung
vorzugsweise nicht mehr als etwa 10, 8, 7, 6 oder 5 μm (gemessen
als anzahlmittelgewichteter Durchmesser des Mikrobläschenaufbaus).
Wenn von "Gas" die Rede ist, versteht
es sich, daß Gemische
von Gasen, die die entsprechende Eigenschaft haben, unter die Definition
fallen, außer
wenn der Kontext etwas anderes erfordert. Luft kann also normalerweise
hier als "Gas" angesehen werden.
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Die
Erfindung stellt Mikrobläschen
bereit, die eine verlängerte
Lebensdauer im lebenden Organismus haben, die zur Verwendung als
Ultraschall- oder Magnetresonanzbildgewinnungs(MRI-)Kontrastverbesserungsmittel
geeignet sind. Typische Ultraschallkontrastverbesserungsmittel weisen
ein Kontrastverbesserungspotential für nur etwa einen Durchlauf
durch das Arteriensystem oder für
wenige Sekunden bis zu einer Minute auf und existieren also nach
einer intravenösen
Injektion bei einem Patienten nicht mehr nach der Aorta. Im Vergleich
dazu bieten Kontrastmittel, die erfindungsgemäß zubereitet sind, weiterhin
Lebensdauern mit Kontrastverbesserungen, die nach intravenöser Injektion
in mehreren Durchgängen
durch den gesamten Kreislauf eines Patienten gemessen werden können. Die
Lebensdauern der Bläschen
von mehreren Minuten lassen sich ohne weiteres nachweisen. Eine
solche Verlängerung
des Kontrastverbesserungspotentials bei Ultraschall ist sehr vorteilhaft.
Zusätzlich
ermöglichen
die erfindungsgemäßen Kontrastverbesserungsmittel
eine bessere Bildgewinnung, z. B. werden deutlichere, lebendigere
und unterscheidbare Bilder des Blutes, das durch das Herz, die Leber
und die Nieren strömt,
erreicht. Es können
also kleine nichttoxische Dosen in eine periphere Vene verabreicht
werden und verwendet werden, um Bilder des gesamten Körpers zu
verbessern.
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Wie
im US-Patent 5 315 997 offenbart, haben Gase und Perfluorkohlenwasserstoffdämpfe magnetische
Ansprechbarkeit, die sich wesentlich von Gewebe und Blut unterscheidet.
Deshalb bewirken die erfindungsgemäßen Mikrobläschen während einer MRI Änderungen
der in Geweben und im Blut vorhandenen lokalen Magnetfelder. Diese Änderungen
können
auf einem MRI-Bild wahrgenommen und verwendet werden, um das Vorhandensein
eines Kontrastmittels zu erkennen. Das erfindungsgemäße Mittel
ist im Blutpool länger stabil
und ermöglicht
daher längere,
empfindlichere Abtastungen größerer Abschnitte
des Körpers.
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Bläschen sind
zwar nachweislich die effektivsten Ultraschall-Strahlungsstreuer
zur Verwendung bei intravenösen
Ultraschallkontrastmitteln, ihr praktischer Hauptnachteil ist jedoch
die extrem kurze Lebensdauer der kleinen Bläschen (mit Durchmesser von
normalerweise weniger als 5 μm),
die erforder lich sind, um in einer Suspension durch die Kapillaren
zu strömen.
Diese kurze Lebensdauer wird durch den erhöhten Gasdruck in den Bläschen bewirkt,
der durch die Oberflächenspannungskräfte, die
auf das Bläschen
wirken, bedingt ist. Dieser erhöhte
innere Druck erhöht
sich, wenn sich der Durchmesser des Bläschens reduziert. Der erhöhte innere
Gasdruck zwingt das Gas im Bläschen,
sich zu lösen,
was zu einer Zerstörung
des Bläschens
führt, wenn
das Gas in eine Lösung
gezwungen wird. Die Laplacesche Gleichung ΔP = 2γ/r (wobei ΔP der erhöhte Gasdruck im Bläschen, γ die Oberflächenspannung
des Bläschenfilms
und r der Radius des Bläschens
ist) beschreibt den Druck, der durch die umgebende Bläschenoberfläche oder
den Film auf ein Gasbläschen
ausgeübt
wird. Der Laplacesche Druck ist umgekehrt proportional zum Bläschenradius;
wenn also das Bläschen schrumpft,
erhöht
sich der Laplacesche Druck, wobei die Diffusionsgeschwindigkeit
des Gases aus dem Bläschen
heraus und die Bläschenschrumpfgeschwindigkeit
erhöht
werden.
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Es
wurde überraschend
festgestellt, daß Gase
und Gasdampfgemische, die einen Osmosegasdruck gegen den Laplaceschen
Druck ausüben
können,
das Kollabieren dieser Bläschen
mit kleinem Durchmesser stark verlangsamen können. Im allgemeinen verwendet
die Erfindung ein Primärmodifikationsgas
oder Gasgemisch, das ein Osmosegasmittel zu einem Partialdruck abschwächt, der
kleiner ist als der Dampfdruck des Osmosegasmittels, bis sich das
Modifikationsgas mit den Gasen austauscht, die normalerweise in
dem äußeren Medium
vorhanden sind. Das/die Osmosegasmittel sind im allgemeinen relativ
hydrophob und relativ bläschenmembranundurchdringlich
und besitzen ferner die Fähigkeit,
bei einem relativ niedrigen Dampfdruck einen Osmosegasdruck von
mehr als 75 oder 100 Torr zu entwickeln.
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Das
erfindungsgemäße Verfahren
betrifft den bekannten Osmoseeffekt, der in einem Dialysebeutel beobachtet
wird, der einen gelösten
Stoff enthält,
der im wesentlichen membranundurchdringlich ist (z. B. PEG, Albumin,
Polysaccharid, Stärke)
und der in einer wäßrigen Lösung gelöst ist und
einer äußeren Phase von
reinem Wasser ausgesetzt wird. Der gelöste Stoff im Beutel verdünnt das
Wasser im Beutel und reduziert so die Was serdiffusionsgeschwindigkeit
aus dem Beutel heraus relativ zur Diffusionsgeschwindigkeit des
reinen Wassers (volle Konzentration) in den Beutel hinein. Das Volumen
des Beutels dehnt sich aus, bis das Gleichgewicht bei einem erhöhten inneren
Druck im Beutel hergestellt ist, der die nach außen gerichtete Wasserdiffusionsgeschwindigkeit
erhöht,
um die nach innen gerichtete Diffusionsgeschwindigkeit des reinen
Wassers auszugleichen. Diese Druckdifferenz ist der Osmosedruck
zwischen den Lösungen.
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In
dem oben beschriebenen System fällt
der innere Druck langsam ab, während
der gelöste
Stoff langsam aus dem Beutel diffundiert, wobei sich die Konzentration
des inneren gelösten
Stoffs verringert. Weitere Materialien, die in der Lösung gelöst sind,
die den Beutel umgibt, reduzieren diesen Druck weiter, und wenn sie
effektiver sind oder eine höhere
Konzentration haben, schrumpft der Beutel.
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Es
wurde beobachtet, daß Luftbläschen, die
mit ausgewählten
Perfluorkohlenwasserstoffen gesättigt sind,
größer werden,
statt zu schrumpfen, wenn sie der einer Flüssigkeit gelösten Luft
ausgesetzt werden, infolge des Osmosegasdrucks, der durch den Perfluorkohlenwasserstoffdampf
ausgeübt
wird. Der Perfluorkohlenwasserstoffdampf ist relativ undurchlässig durch
den Bläschenfilm
und verbleibt somit im Bläschen.
Die Luft im Bläschen
wird durch den Perfluorkohlenwasserstoff verdünnt, was den Luftdiffusionsstrom
aus dem Bläschen
verlangsamt. Dieser Osmosegasdruck ist proportional zum Konzentrationsgradienten
des Perfluorkohlenwasserstoffdampfes durch den Bläschenfilm,
zur Konzentration der Luft, die das Bläschen umgibt, und zum Verhältnis zwischen
der Bläschenfilm-
Permeabilität
von Luft und Perfluorkohlenwasserstoff.
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Wie
oben beschrieben, ist der Laplacesche Druck umgekehrt proportional
zum Bläschenradius;
wenn also das Bläschen
schrumpft, erhöht
sich der Laplacesche Druck, wobei sich die Diffusionsgeschwindigkeit des
Gases aus dem Bläschen
heraus und die Geschwindigkeit der Bläschenschrumpfung erhöht, und
dies führt
in bestimmten Fällen
zur Kondensation und praktischem Verschwinden eines Gases im Bläschen, wenn der
kombinierte Laplacesche und äußere Druck
das Osmosemittel konzent rieren, bis sein Partialdruck den Dampfdruck
des flüssigen
Osmosemittels erreicht.
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Wir
haben festgestellt, daß herkömmliche
Mikrobläschen,
die ein einzelnes Gas enthalten, im Blut für eine Zeitspanne weiterbestehen,
die in erster Linie abhängt
vom arteriellen Druck, vom Bläschendurchmesser, von
der Membranpermeabilität
des Gases durch die Oberfläche
des Bläschens,
von der mechanischen Stärke der
Oberfläche
des Bläschens,
dem Vorhandensein, dem Nichtvorhandensein und der Konzentration
der Gase, die normalerweise im Blut oder Serum vorhanden sind, und
von der Oberflächenspannung,
die an der Oberfläche
des Bläschens
vorhanden ist (die in erster Linie vom Durchmesser des Bläschens und
in zweiter Linie von der Identität
und Konzentration der Surfactants abhängt, die die Oberfläche des
Bläschens
bilden). Jeder dieser Parameter steht mit jedem in Wechselbeziehung,
und sie wirken im Bläschen
zusammen, um die Zeitspanne zu bestimmen, die das Bläschen im
Blut überdauert.
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Die
Erfindung weist die Feststellung auf, daß ein einzelnes Gas oder eine
Kombination von Gasen gemeinsam die Struktur der Mikrobläschen, die
diese mitreißen
oder einschließen,
stabilisieren kann. Im einzelnen benutzt die Erfindung ein erstes
Gas oder Gase (ein "Primärmodifikationsgas"), das als Wahlmöglichkeit normalerweise
im normalen Blut oder Serum in Kombination mit einem oder mehreren
zusätzlichen
zweiten Gasen (einem "Osmosegasmittel
oder -mitteln" oder
einem "Sekundärgas") vorhanden ist,
die den Osmosedruck im Bläschen
regulieren. Durch Regulierung des Osmosedrucks im Bläschen übt das Osmosegasmittel (hier
definiert als einzelnes chemisches Objekt oder als Gemisch aus solchen)
einen Druck im Bläschen
aus, der zur Verhinderung des Druckverlusts beiträgt. Als
Wahlmöglichkeit
kann der Modifikator ein Gas sein, das normalerweise nicht im Blut
oder Serum vorhanden ist. Das Modifikationsgas muß jedoch
in der Lage sein, das/die Osmosegasmittel bei einem Partialdruck
unter dem Dampfdruck des/der Osmosegasmittel(s) zu verdünnen oder
beizubehalten, während
die Gase im Blut oder einer anderen umgebenden Flüssigkeit
in das Bläschen
diffundieren. In einem wäßrigen Medium
gilt Wasserdampf nicht als eines der in Frage kommenden "Gase". Wenn Mik robläschen in
einem nichtwäßrigen flüssigen Medium
sind, gilt der Dampf dieses Mediums ebenfalls nicht als eines der "Gase".
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Wir
haben festgestellt, daß durch
Zusatz eines Osmosegasmittels, das beispielsweise eine reduzierte Membranpermeabilität durch
die Oberfläche
des Bläschens
oder eine reduzierte Löslichkeit
in der äußeren Dispersionsphase-Flüssigphase
hat, die Lebensdauer des dadurch entstehenden Bläschens radikal erhöht wird.
Dieser stabilisierende Einfluß wird
anhand einer Beschreibung bestimmter theoretischer Bläschen noch besser
verständlich.
Zunächst
betrachten wir die Auswirkungen des arteriellen Drucks und der Oberflächenspannung
auf ein hypothetisches Mikrobläschen,
das nur Luft enthält.
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Zunächst wird
ein hypothetisches Bläschen,
das nur Luft enthält,
zubereitet. Zu Beschreibungszwecken wird zunächst davon ausgegangen, daß dieses
Bläschen
keinen Laplaceschen Druck hat. Im Gleichgewichtszustand bei Standardtemperatur
und Standarddruck (STP) hat es im allgemeinen einen inneren Luftdruck
von 760 Torr, und die Luftkonzentration des umgebenden Fluids ist
ausgeglichen bei 760 Torr (d. h. das Fluid hat eine Luftspannung
von 760 Torr). Ein solches Bläschen
schrumpft nicht und wächst
nicht.
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Wenn
als nächstes
das oben beschriebene hypothetische Bläschen in das künstliche
System eingeführt
wird, ist der Partialdruck der Luft (oder die Luftspannung) im Blut
(der Luftdruck, bei dem das Blut mit Luft gesättigt war) auch annähernd 760
Torr, und es besteht ein arterieller Druck (zum Zwecke der vorliegenden Beschreibung
bei 100 Torr). Diese Gesamtsumme ergibt einen äußeren Druck auf dem Bläschen von
860 Torr und bewirkt, daß die
Gase im Bläschen
komprimiert werden, bis der innere Druck auf 860 Torr ansteigt.
Dann entsteht eine Differenz von 100 Torr zwischen dem Luftdruck
im Bläschen
und der Luftspannung des Fluids, das das Bläschen umgibt. Diese Druckdifferenz
bewirkt, daß Luft
durch seine luftdurchlässige
Oberflächenmembran
aus dem Bläschen
herausdiffundiert, was bewirkt, daß das Bläschen schrumpft (d. h. Luft
verliert), wenn es das Gleichgewicht zu erreichen versucht. Das
Bläschen
schrumpft, bis es verschwindet.
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Als
nächstes
betrachten wir die zusätzliche
und realistischere Auswirkung auf das hypothetische Bläschen, wenn
die Oberflächenspannung
des Bläschens
dazukommt. Die Oberflächenspannung
des Bläschens führt zu einem
Laplaceschen Druck, der auf das Gas im Bläschen ausgeübt wird. Der Gesamtdruck, der
auf das Gas im Bläschen
ausgeübt
wird, wird dadurch berechnet, daß die Summe aus atmosphärischem
Druck, arteriellem Druck und Laplaceschem Druck gebildet wird. In
einem 3 μm
großen
Bläschen
ist mit wohl ausgewählten
Surfactants eine Oberflächenspannung
von 10 Dyn/cm erreichbar. Der Laplacesche Druck, der auf das hypothetische
3 μm große Bläschen ausgeübt wird,
ist also annähernd
100 Torr, und außerdem
wird der arterielle Druck von 100 Torr ebenfalls auf das Bläschen ausgeübt. Daher
ist der äußere Gesamtdruck,
der auf das Gas im Bläschen
wirkt, 960 Torr.
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Das
Bläschen
wird komprimiert, bis der Druck der Luft im Bläschen auf 960 Torr steigt.
Demzufolge entsteht eine Konzentrationsdifferenz von 200 Torr zwischen
der Luft im Bläschen
und der Luft, die im Blut gelöst
ist. Deshalb schrumpft das Bläschen
schnell und verschwindet sogar noch schneller, als es dies im vorherigen
Falle tat, während
es versucht, das Gleichgewicht zu erreichen.
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Die
erfindungsgemäße Feststellung
wird dadurch veranschaulicht, daß ein drittes hypothetisches
Mikrobläschen
betrachtet wird, das Luft und ein Osmosegasmittel oder ein zweites
Gas enthält.
Es wird angenommen, daß ein
theoretisches Bläschen,
das anfangs keinen arteriellen Druck und keinen Laplaceschen Druck
hat, zubereitet wird, das einen Gesamtdruck von 760 Torr hat, der
durch Luft bei einem Partialdruck von 684 Torr und ein Perfluorkohlenwasserstoff
("PFC") als Osmosegasmittel
bei einem Partialdruck von 76 Torr gegeben ist. Ferner wird angenommen,
daß der
Perfluorkohlenwasserstoff so gewählt
ist, daß er
eine oder mehrere Eigenschaften hat, die ihn in die Lage versetzen,
als geeignetes Osmosegasmittel zu wirken, z. B. eine begrenzte Bläschenmembranpermeabilität oder eine
begrenzte Löslichkeit
in der äußeren Flüssigphase. Es
besteht eine anfängliche
Osmosegasdruckdifferenz zwischen den 684 Torr Luft im Bläschen und
den 760 Torr Luftspannung von 76 Torr außerhalb des Bläschens (wenn
wir von STP ausgehen). Diese 76 Torr anfängliche Druckdifferenz ist
der anfängliche
Osmosegasdruck und bewirkt, daß sich
das Bläschen
ausdehnt. Luft von außerhalb
des Bläschens
diffundiert in das Bläschen
und bläst
es auf, angetrieben von der Osmosedruckdifferenz, wie wenn Wasser
in einen Dialysebeutel diffundiert, der eine Stärkelösung enthält und den Beutel auffüllt.
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Der
maximale Osmosegasdruck, den dieses Gasgemisch entwickeln kann,
hängt mit
dem Partialdruck des PFC und dem Verhältnis zwischen der Permeabilität des PFC
und der Permeabilität
der Luft im umgebenden Fluid zusammen. Theoretisch und wie experimentell
beobachtet, wird das Bläschen
unendlich groß,
wenn das System versucht, osmotisches Gleichgewicht zwischen der
Konzentration der Luft (die dem Partialdruck der Luft äquivalent
ist) im Bläschen
und der Konzentration der Luft, die das Bläschen umgibt (die Luftspannung),
zu erreichen.
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Wenn
das hypothetische Mischgasbläschen
einem arteriellen Druck von 100 Torr ausgesetzt ist, wo das Blut
eine gelöste
Luftspannung von 760 Torr hat, ist der äußere Gesamtdruck gleich 860
Torr (760 Torr atmosphärischer
Druck und 100 Torr arterieller Druck). Das Bläschen wird unter dem arteriellen
Druck komprimiert, was bewirkt, daß der innere Druck des Bläschens 860
Torr erreicht. Der Partialdruck der Luft steigt auf 774 Torr, und
der Partialdruck des PFC (des zweiten Gases) steigt auf 86 Torr.
Die Luft diffundiert aus dem Bläschen
heraus, bis sie das osmotische Gleichgewicht mit der Luft erreicht,
die im Blut gelöst
ist (d. h. 760 Torr), und der Partialdruck des PFC steigt auf 100
Torr. Der Partialdruck des PFC gleicht den Druck aus, der durch
arteriellen Druck ausgeübt
wird, stoppt die Schrumpfung des Bläschens in jedem Fall, wobei
angenommen wird, daß die
Permeabilität
des Bläschens
für den
PFC vernachlässigbar
ist.
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Wenn
die Oberflächenspannung
oder die Laplacesche Druckkomponente von 100 Torr hinzukommt (wie
oben bei dem Luftbläschen
beschrieben), wird insgesamt ein zusätzlicher Druck von 200 Torr
auf das Gas im Bläschen
ausgeübt.
Wiederum wird das Bläschen
komprimiert, bis der Druck im Bläschen
auf 960 Torr (Partialdruck der Luft 864 und Partialdruck des PFC 96)
steigt. Die Luft diffundiert aus dem Bläschen, bis sie 760 Torr erreicht
(im Gleichgewicht mit der Konzentration der Luft, die im Blut gelöst ist),
und der Partialdruck des PFC steigt auf 200 Torr, wobei wiederum
der Osmosegasdruck, der durch den PFC ausgelöst wird, den Druck ausgleicht,
der durch den Laplaceschen Druck und den arteriellen Druck ausgeübt wird,
wobei wiederum angenommen wird, daß die Permeabilität der Membran
des Bläschens
für den
PFC vernachlässigbar
ist.
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Wenn
der Partialdruck der Luft im Bläschen
kleiner ist als die Luftspannung der umgebenden Flüssigkeit,
wird das Bläschen
tatsächlich
ebenfalls größer, bis
der PFC ausreichend durch eintreffende Luft verdünnt wird, so daß der Luftdruck
im Bläschen
und die Luftspannung außerhalb
des Bläschens
identisch sind.
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Die
Bläschen
können
also durch die Verwendung von Kombinationen von Gasen effektiv stabilisiert werden,
da die richtige Kombination der Gase zu einer Osmosegasdruckdifferenz
führt,
die genutzt werden kann, um diese Auswirkungen des Laplaceschen
Drucks und des arteriellen Drucks auszugleichen, der auf das Gas
im Bläschen
im zirkulierenden Blut ausgeübt
wird.
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Beispiele
für bestimmte
Anwendungen der erfindungsgemäßen Mikrobläschen sind
u. a. Bildgewinnung der Perfusion des Herzens, des Myokardgewebes
und die Bestimmung von Perfusionscharakteristiken des Herzens und
seines Gewebes bei Belastungs- oder köperlichen Betätigungsversuchen
oder Perfusionsdefekten oder Veränderungen
infolge von Myokardinfarkt. Ebenso kann Myokardgewebe nach oraler
oder venösen
Verabreichung von Medikamenten, die dazu bestimmt sind, den Blutstrom
in einem Gewebe zu erhöhen,
sichtbar gemacht werden. Ebenso kann die Visualisierung von Änderungen
des Myokardgewebes nach oder während
verschiedener Eingriffe verbessert werden, z. B. bei Koronargewebe-Venentransplantation,
Koronarangioplastik oder bei Verwendung von thrombozytischen Mitteln
(TPA oder Streptokinase). Da diese Kontrastmittel bequem über eine
periphere Vene verabreicht werden können, um die Visualisierung
des gesamten Kreislaufsystems zu verbessern, tragen sie auch zur
Diagnose allgemeiner Gefäßerkrankungen
und zur Überwachung
der Lebensfähigkeit
von Plazentagewebe durch Ultraschall bei.
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Es
muß jedoch
betont werden, daß diese
Prinzipien über
die Ultraschallbildgewinnung hinaus Anwendungsmöglichkeiten haben. Tatsächlich ist
die Erfindung so breit angelegt, daß sie die Verwendung des Osmosegasdrucks
zur Stabilisierung von Bläschen
zur Verwendung in beliebigen Systemen, einschließlich nichtbiologischer Anwendungen,
einschließt.
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In
einer bevorzugten Ausführungsform
haben die erfindungsgemäßen Mikrobläschen eine
auf Surfactants beruhende Bläschenmembran.
Die Prinzipien der Erfindung können
jedoch auch angewendet werden, um Mikrobläschen praktisch jedes Typs
zu stabilisieren. Mischgase oder -dämpfe des oben beschriebenen Typs
können
also albuminbasierte Bläschen,
polysaccharidbasierte Mikrobläschen,
von sprühgetrockneten Mikrokügelchen
abgeleitete Bläschen
und dgl. stabilisieren. Dieses Ergebnis wird durch den Einschluß einer Kombination
von Gasen in dem gewählten
Mikrobläschen
erreicht, vorzugsweise eines Primärmodifikationsgases oder Gasgemischs,
das ein Osmosegasmittel zu einem Partialdruck verdünnt, der
kleiner ist als der Dampfdruck des Osmosegasmittels, bis sich das
Modifikationsgas mit Gasen, die normalerweise in dem äußeren Medium
vorhanden sind, austauscht. Das/die Osmosegasmittel sind im allgemeinen
relativ hydrophob und relativ bläschenmembranundurchdringlich
und besitzen auch ferner die Fähigkeit,
Osmosegasdrücke
zu entwickeln, die größer sind
als 50, 75 oder 100 Torr. In einer bevorzugten Ausführungsform
ist der Gasdruck des Osmosegasmittels bei 37°C vorzugsweise kleiner als etwa
760 Torr, besonders bevorzugt kleiner als etwa 750, 740, 730, 720,
710 oder 700 Torr und in bestimmten Ausführungen kleiner als etwa 650,
600, 500 oder 400 Torr. In bevorzugten Ausführungsformen ist der Dampfdruck
des Primärmodifikationsgases
bei 37°C
mindestens 660 Torr, und der Dampfdruck des Osmosegasmittels ist
bei 37°C
mindestens 100 Torr. Bei der Bildgewinnung im lebenden Organismus
sind mittlere Bläschendurchmesser
zwischen 1 und 10 μm
bevorzugt, wobei 3 bis 5 μm
besonders bevorzugt sind. Die Erfindung kann in einer Ausführungsform
auch als Gemisch aus einem ersten Gas oder Gasen und einem zweiten
Gas oder Gasen innerhalb von im allgemeinen kugelförmigen Membranen
beschrieben werden, um Mikrobläschen
zu bilden, wobei das erste Gas und das zweite Gas jeweils in einem
Molverhältnis
von etwa 1 : 100, 1 : 75, 1 : 50, 1 : 30, 1 : 20 oder 1 : 10 bis
etwa 1000 : 1, 500 : 1, 250 : 1, 100 : 1, 75 : 1 oder 50 : 1 vorhanden
sind und wobei das erste Gas bei 37°C einen Dampfdruck von mindestens
etwa (760 – x)
mm Hg hat, wobei x der Dampfdruck des zweiten Gases bei 37°C ist und
wobei der Dampfdruck des ersten und des zweiten Gases bei 37°C größer ist
als etwa 75 oder 100 mm Hg.
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Mikrobläschen, die
gemäß einer
bevorzugten Ausführungsform
der Erfindung zubereitet sind, können auch
eine zusätzliche
vorteilhafte Eigenschaft aufweisen. In einer solchen Ausführungsform
werden Gemische von nichtosmotischen Gasen mit stabilisierenden
Osmosegasen (oder Osmosegasmitteln) verwendet, um die resultierende
Bläschengrößenverteilung
während
und unmittelbar nach der Herstellung zu stabilisieren. Bei der Erzeugung
der Bläschen
bewirkt der höhere
Laplacesche Druck in kleineren Bläschen eine Diffusion durch die
Flüssigphase
in die größeren Bläschen mit
niedrigerem Laplaceschen Druck. Dies bewirkt, daß die mittlere Größenverteilung
mit der Zeit über
die Kapillargrößengrenze
von 5 μm
steigt. Dies wird als Disproportionierung bezeichnet. Wenn ein Gemisch
eines nichtosmotischen Gases (z. B. Luft) mit einem osmotischen
Dampf (z. B. C6F14)
verwendet wird, wird durch eine geringfügige Reduktion des Volumens
der kleineren Bläschen
dadurch, daß Luft
das Bläschen
verläßt, das
osmotische Gas konzentriert und sein osmotischer Druck erhöht, wobei
eine weitere Schrumpfung verzögert
wird, während
das Volumen der größeren Bläschen geringfügig zunimmt,
wobei das Osmosegas verdünnt
und das weitere Wachstum verzögert
wird.
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Ein
zusätzlicher
Vorteil der Verwendung eines Gemischs aus extrem blutlöslichen
Gasen (z. B. 87,5 Vol.-% CO2) und einem
Osmosegasgemisch (z. B. 28% C6F14-Dampf
+ 72% Luft) ist gegeben, wenn diese Bläschen nach Injektion infolge
der Abgabe von CO2 an das Blut schnell schrumpfen.
Die Bläschen
erfahren nach der Injektion infolge des Verlustes an CO2 eine
Verringerung des Volumens um 87,5%. Dieser Verlust an CO2 entspricht einer Halbierung des Bläschendurchmessers.
Demzufolge kann man Bläschen
mit größerem Durchmesser
(z. B. 9 μm)
unter Verwendung einfacher mechanischer Mittel zubereiten, die die
Blä schen
nach Injektion auf unter 5 μm
schrumpfen lassen. Im allgemeinen werden solche Bläschen anfänglich zubereitet, wenn
das erste Gas in einem Verhältnis
von mindestens 1 : 1 in bezug auf das zweite Gas vorhanden ist,
vorzugsweise mindestens 3 : 2, 2 : 1, 3 : 1, 4 : 1, 5 : 1 oder 10
: 1. Wenn die Mikrobläschenmembran
durchlässiger ist
für das
erste Gas als für
das zweite Gas (z. B. wenn die Membran entsprechende Permeabilitäten für die Gase
in einem Verhältnis
von mindestens etwa 2 : 1, 3 : 1, 4 : 1, 5 : 1 oder 10 : 1 hat,
vorzugsweise noch höher, z.
B. 20 : 1, 40 : 1 oder 100 : 1) hat, schrumpfen die Bläschen vorteilhafterweise
von ihrem ursprünglichen
ersten Durchmesser sehr schnell (z. B. innerhalb von 1, 2, 4 oder
5 min) auf einen mittleren zweiten Durchmesser, der 75% oder weniger
ihres ursprünglichen
Durchmessers beträgt.
Wenn mindestens ein relativ membrandurchlässiges Gas im wäßrigen Medium
vorhanden ist, das das Mikrobläschen
umgibt, wird das Bläschen
vorzugsweise für
mindestens etwa 1 min, vorzugsweise 2, 3, 4 oder 5 min bei oder
etwa bei dem zweiten Durchmesser stabilisiert. In einer bevorzugten
Ausführungsform
behalten die Bläschen
für mindestens
1, 2, 3, 4 oder 5 min eine Größe zwischen
etwa 5 oder 6 μm
und 1 μm,
stabilisiert durch eine Osmosegasdruckdifferenz. Die Gasspannung
in der äußeren Flüssigkeit
ist vorzugsweise mindestens etwa 700 mm Hg. Außerdem ist ein relativ membranundurchdringliches
Gas auch im Mikrobläschen
vorhanden, um eine solche Osmosedruckdifferenz zu erzeugen.
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I. Aufbau der Mikrobläschen
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A. Die membranbildende
Flüssigphase
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Die äußere, kontinuierliche
Flüssigphase,
in der sich das Bläschen
befindet, weist normalerweise ein Surfactant oder Schäumungsmittel
auf. Surfactants, die zur erfindungsgemäßen Verwendung geeignet sind, sind
u. a. eine beliebige Verbindung oder Zusammensetzung, die zur Ausbildung
und Beibehaltung der Bläschenmembran
durch Ausbildung einer Schicht an der Grenzfläche zwischen den Phasen beiträgt. Das
Schäumungsmittel
oder der Surfactant kann eine einzelne Verbindung oder eine Kombination
aus Verbindungen aufweisen, beispielsweise im Falle von Co-Surfactants.
-
Beispiele
für geeignete
Surfactants oder Schäumungsmittel
sind u. a.: Blockcopolymere des Polyoxypropylen, Polyexyethylen,
Zuckerester, Fettalkohole, aliphatische Aminoxide, aliphatische
Ester der Hyaluronsäure,
aliphatische Estersalze der Hyaluronsäure, Dodecyl-Poly(ethylenoxy)ethanol,
Nonylphenoxy-Poly(ethylenoxy)ethanol, derivatisierte Stärken, Hydroxyethylstärke-Fettsäureester,
handelsübliche
Speisepflanzenstärken,
Dextrane, Dextran-Fettsäureester,
Sorbitol, Sorbit-Fettsäureester,
Gelatine, Serumalbumine und Kombinationen daraus. Besonders bevorzugte
Zuckerester sind solche mit einer Komponente mit einem hydrophil-lipophilen
Gleichgewicht (HLB) von weniger als 8, einschließlich Mono-, Di-, Tri- oder
Polyester-Saccharose, Trehalose, Dextrose und Fructose, um Stearat,
Behenat, Palminat, Myristat, Laurat und Caproat (z. B. Saccharose-Tristearat)
zu erzeugen, da diese Zuckerster die Stabilität der Mikrobläschen verlängern. Andere
Zuckerester, die zur erfindungsgemäßen Verwendung in Frage kommen,
sind u. a. solche, die mit ungesättigten
Fettsäuren
verestert sind, um Oleat, Ricinoleat, Linoleat, Arachidat, Plamitoleat
und Myristoleat zu bilden. Das HLB ist eine Zahl zwischen 0 und
40, die Emulgatoren und Substanzen zugewiesen werden, die emulgiert
werden. Das HLB zeigt das Emulsionsverhalten an und bezieht sich
auf das Gleichgewicht zwischen dem hydrophilen und lipophilen Teil
des Moleküls
(Rosen, M., (1989), Surfactants and Interfacial Phenomena, 2. Auflage,
John Wiley & Sons,
New York, S. 326–329).
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Erfindungsgemäß werden
bevorzugte Surfactants oder Schäumungsmittel
aus der Gruppe gewählt, die
aus Phospholipiden, nichtionischen Surfactants, neutralen oder anionischen
Surfactants, Fluor-Surfactants bestehen, die neutral oder anionisch
sein können,
und Kombinationen aus solchen Emulgatoren oder Schaumbildungsmittels.
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Die
nichtionischen Surfactants, die zur erfindungsgemäßen Verwendung
geeignet sind, sind u. a. Polyoxyethylen-Polyoxypropylen-Copolymere. Ein Beispiel
für diese
Klasse von Verbindungen ist Pluronic, z. B. Pluronic F-68. Außerdem kommen
Polyoxyethylen-Fettsäureester,
z. B. Polyoxyethylenstearate, Polyoxyethylen-Fettalkoholester, polyoxyethylierte
Sorbi tan-Fettsäurester,
Glycerolpolyethylenglycoloxystearat, Glycerolpolyethylenglycolricinoleat,
ethoxylierte Sojabohnensterole, ethoxylierte Castoröle und deren
hydrierte Derivate und Cholesterin in Frage. Zusätzlich sind nichtionische Alkylglucoside,
z. B. Tweens®,
Spans® und
Brijs® mit einer
Komponente mit einem HLB, der kleiner ist als 8, auch im Schutzbereich
der Erfindung. Die Spans sind u. a. Sorbitantetraoleat, Sorbitantetratearat,
Sorbitantristearat, Sorbitantripalmitat, Sorbitantrioleat und Sorbitandistearat.
Tweens sind u. a. Polyoxyethylensorbitantristearat, Polyoxyethylensorbitantripalmitat,
Polyoxyethylensorbitantrioleat. Die Brij-Familie ist eine weitere
geeignete Kategorie von Materialien, die Polyoxyethylen-10-Stearylether
aufweist. Anionische Surfactants, insbesondere Fettsäuren (oder
deren Salze) mit 12 bis 24 Kohlenstoffatomen, können auch verwendet werden.
Ein Beispiel für
ein geeignetes anionisches Surfactant ist Ölsäure oder ihr Salz, Natriumoleat.
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Man
wird anerkennen, daß eine
große
Auswahl von Surfactants verwendet werden kann. Tatsächlich kann
praktisch jeder Surfactant oder jedes Schäumungsmittel (einschließlich solche,
die noch zu entwickeln sind), die in der Lage sind, die Bildung
von Mikrobläschen
zu erleichtern, erfindungsgemäß verwendet
werden. Das optimale Surfactant oder das optimale Schäumungsmittel
oder Kombinationen daraus können
durch empirische Untersuchungen, die keine übermäßigen Experimente erfordern,
für eine
gegebene Anwendung bestimmt werden. Folglich sollte ein Fachmann
auf dem Fachgebiet der Erfindung das Surfactant oder Schäumungsmittel
oder Kombinationen daraus auf der Grundlage solcher Eigenschaften
wie Biokompatibilität
oder ihr nicht-newtonsches Verhalten wählen.
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Die
Beständigkeit
eines Kontrastmittels im Blut ist umgekehrt proportional zum Laplaceschen
Druck, der proportional zur Oberflächenspannung des Bläschens ist.
Eine reduzierte Oberflächenspannung
erhöht somit
die Beständigkeit
im Blut. Surfactants, die geordnete Strukturen (multilaminare Schichten
oder Stäbchen)
in einer Lösung
bilden und nicht-newtonsche, viskoelastische Oberflächenspannungen
erzeugen, sind ebenfalls geeignet. Solche Surfactants sind u. a.
viele der zuckerba sierten Surfactants und Protein- oder Glycoprotein-Surfactants
(einschließlich
Rinder-, Menschen- oder andere Lungen-Surfactants). Ein bevorzugter Typ eines
solchen Surfactants hat eine Zucker- oder andere Kohlehydrat-Kopfgruppe
und eine Kohlenwasserstoff- oder Fluorkohlenwasserstoff-Schwanzgruppe.
Eine große
Anzahl von Zuckerarten ist bekannt, die als Kopfgruppen fungieren
können,
einschließlich
Glucose, Saccharose, Mannose, Lactose, Fructose, Dextrose, Aldose
und dgl. Die Schwanzgruppe hat vorzugsweise etwa 2 oder 4 bis 20
oder 24 Kohlenstoffatome und kann beispielsweise eine Fettsäuregruppe
(verzweigt oder unverzweigt, gesättigt
oder ungesättigt)
sein, die über
eine Esterbindung mit dem Zucker kovalent verbunden ist. Die Oberflächenspannung
von Bläschen,
die mit diesen Surfactants erzeugt wird, verringert sich stark,
wenn die Oberfläche
durch Schrumpfung des Bläschens
komprimiert wird (z. B. wenn das Bläschen schrumpft), und sie erhöht sich,
wenn sich die Oberfläche des
Bläschens
vergrößert (z.
B. wenn das Bläschen
gößer wird).
Diese Wirkung verzögert
die Disproportionierung, die zu einer engeren Größenverteilung und zu langlebigeren
Bläschen
in der Ampulle und im lebenden Organismus führt. Ein bevorzugtes Surfactant-Gemisch,
das die Eigenschaften hat, die der nicht-newtonschen Viskoelastizität zugeordnet
werden, ist u. a. ein nichtionisches Surfactant oder ein anderes
schaumbildendes Surfactant in Kombination mit einem der nicht-newtonschen,
viskoelastischen Surfactants, z. B. einem der Zuckerester (z. B.
2% Pluronic F-68 plus 1% Saccharosestearat). Häufig ist das Verhältnis zwischen
dem nichtionischen Surfactant und dem nicht-newtonschen Surfactant
etwa 5 : 1 bis etwa 1 : 5, wobei die Surfactants gemeinsam (ganz
gleich, ob nicht-newtonsche oder konventionelle) 0,5 bis 8%, besonders
bevorzugt etwa 1 bis 5% (Gew./Vol.) des mikrobläschenbildenden Flüssigkeitsgemischs
aufweisen.
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Die
Verringerung der Oberflächenspannung
bei kleinen Bläschen
gegen den typischen Laplaceschen Druck ermöglicht die Verwendung effizienterer
Osmosegasmittel, z. B. Perfluorkohlenwasserstoffe mit höherem Molekulargewicht
als das Osmosegasmittel. Bei herkömmlichen Surfactants kondensieren
die PFCs mit höherem
Molekulargewicht bei den hohen Bläschendrücken.
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Ohne
diese effizienteren Surfactants wären höher siedende, weniger membrandurchlässige PFCs,
z. B. C6F14, extrem
schwierig.
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Man
kann auch andere Mittel in die wäßrige Phase
einbeziehen. Solche Mittel können
vorteilhafterweise u. a. sein: herkömmliche Viskositätsmodifikatoren,
Puffer, z. B. Phosphatpuffer oder andere herkömmliche biokompatible Puffer
oder pH-regulierende
Mittel, z. B. Säuren
oder Basen, Osmosemittel (um Isotonie, Hyperosmolarität oder Hyposmolarität zu erreichen).
Bevorzugte Lösungen
haben einen pH von etwa 7 und sind isotonisch. Wenn jedoch CO2 als erstes Gas in einem Bläschen verwendet
wird, das geeignet ist, schnell auf eine erste Größe zu schrumpfen,
kann ein basischer pH eine schnelle Schrumpfung durch Entzug von
CO2 erleichtern, da es das Bläschen verläßt, wodurch
ein Aufbau von gelöstem
CO2 in der wäßrigen Phase verhindert wird.
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B. Die Gasphase
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Ein
Hauptaspekt der Erfindung besteht in der Auswahl der Gasphase. Wie
oben beschrieben, beruht die Erfindung auf die Verwendung von Kombinationen
von Gasen, um die Differenzen der Partialdrücke auszunutzen oder zu verursachen
und um Osmosegasdrücke
zu erzeugen, die die Bläschen
stabilisieren. Das primäre
Modifikationsgas ist vorzugsweise Luft oder ein in der Luft vorhandenes
Gas. Luft und/oder Bruchteile davon sind auch im normalen Blut und
Serum enthalten. Wenn die Mikrobläschen in einer Umgebung zu
verwenden sind, die sich von Blut unterscheidet, wird vorzugsweise
das Primärmodifikationsgas
aus den Gasen ausgewählt,
die normalerweise im äußeren Medium
vorhanden sind. Weitere Kriterien sind die Einfachheit, mit der
das Primärmodifikationsgas
in die Bläschen
hinein- oder aus ihnen herausdiffundiert. Normalerweise können Luft
und/oder Bruchteile davon ebenso ohne weiteres durch herkömmliche
flexible oder feste Bläschenoberflächen hindurchdringen.
Diese Kriterien in Kombination ermöglichen nach Bedarf die schnelle
Diffusion des Primärmodifikationsgases
in die Bläschen
hinein oder aus ihnen heraus.
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Modifikationsgase,
die nicht im äußeren Medium
enthalten sind, können
auch verwendet werden. In diesem Fall werden die Bläschen anfänglich größer oder
schrumpfen (je nach der relativen Permeabilität und den Konzentrationen der äußeren Gase
für den
Modifikator), wenn die äußeren Gase
das ursprüngliche
Modifikationsgas ersetzen. Wenn das Osmosegasmittel während dieses
Prozesses nicht kondensiert ist, bleibt das Bläschen stabil.
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Das
Osmosegasmittel ist vorzugsweise ein Gas, das durch die Oberfläche des
Bläschens
weniger durchdringend ist als der Modifikator. Es wird auch bevorzugt,
daß das
Osmosegasmittel im Blut oder Serum weniger löslich ist. Daher ist es nunmehr
verständlich,
daß das
Osmosegasmittel bei Raum- oder Körpertemperatur
ein Gas sein kann, oder es kann bei Körpertemperatur normalerweise
eine Flüssigkeit
sein, solange es bei der Verwendungstemperatur einen ausreichenden
Partial- oder Dampfdruck hat, um die gewünschte Osmosewirkung zu erreichen.
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Demzufolge
können
Fluorkohlenwasserstoffe und andere Verbindungen, die bei Raum- oder
Körpertemperatur
keine Gase sind, verwendet werden, vorausgesetzt, daß sie einen
ausreichenden Dampfdruck haben, vorzugsweise mindestens etwa 50
oder 100 Torr bei Körpertemperatur
oder besonders bevorzugt mindestens etwa 150 oder 200 Torr. Es versteht
sich, daß,
wenn das Osmosegasmittel ein Gemisch aus Gasen ist, das relevante
Maß für den Dampfdruck
der Dampfdruck des Gemischs ist, nicht unbedingt der Dampfdruck der
einzelnen Komponenten des Osmosemischgasmittels.
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Es
ist auch wichtig, daß,
wenn ein Perfluorkohlenwasserstoff als das Osmosemittel in einem
Bläschen verwendet
wird, der bestimmte Perfluorkohlenwasserstoff nicht bei dem Partialdruck
kondensiert, der im Bläschen
und bei Raumtemperatur herrscht. Je nach den relativen Konzentrationen
des Primärmodifikationsgases und
des Osmosegasmittels kann das Primärmodifikationsgas schnell das
Bläschen
verlassen, wodurch es schrumpfen und das zweite Osmosegasmittel
konzentrieren kann. Ein solches Schrumpfen kann auftreten, bis der
Osmosegasdruck dem äußeren Druck
am Bläschen
(maximaler absoluter arterieller Druck) plus dem Laplaceschen Druck
des Bläschens
minus dem Luftdruck oder der Luftsättigungsspannung des Blutes
(im wesentlichen eine Atmosphäre)
gleicht. Der Kondensationspartial druck des resultierenden Gasgemischs
bei 37°C
muß also über dem
oben beschriebenen Gleichgewichtspartialdruck des Osmosemittels
sein.
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Repräsentative
Fluorkohlenwasserstoffe, die diese Kriterien erfüllen Mikrobläschen besser
stabilisieren können,
sind die folgenden:
CCl2F2 < CF4,
CHClF2 < C4F10, N(C2F5)3 < C5F12 < C6F14
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Demzufolge
versteht es sich, daß PFCs
mit 8 Kohlenstoffatomen oder weniger (bei 37°C Dampfdrücke von über 80 mm Hg) bevorzugt werden.
Wie außerdem
verständlich
ist, ist es jedoch möglich,
durch Hinzufügung
von Heteroatomen und dgl. größere Moleküle mit erhöhter Flüchtigkeit
zu erzeugen. Daher ist die Bestimmung des optimalen sekundären Osmosegasmittels
oder der Gase nicht größenbegrenzt,
sondern beruht vielmehr auf der Fähigkeit, ihre Dampfphase bei
Körpertemperatur
beizubehalten, während
ein Osmosegasdruck herrscht, der mindestens der Summe des arteriellen
und des Laplaceschen Drucks gleicht.
-
Eine
Auflistung bestimmter Verbindungen, die geeignete Löslichkeits-
und Dampfdruckkriterien erfüllen,
ist in Tabelle I gegeben:
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Tabelle 1
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- Perfluorpropane C3F8
- Perfluorbutane C4F10
- Perfluorcyclobutane C4F8
- Perfluorpentane C5F12
- Perfluorcyclopentane C5F10
- Perfluormethylcyclobutane C5F10
- Perfluorhexane C6F14
- Perfluorcyclohexane C6F12
- Perfluormethylcyclopentane C6F12
- Perfluordimethylcyclobutane C6F12
- Perfluorheptane C7F16
- Perfluorcycloheptane C7F14
- Perfluormethylcyclohexane C7F14
- Perfluordimethylcyclopentane C7F14
- Perfluortrimethylcyclobutane C7F14
- Perfluortriethylamine N(C2F5)3
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Man
wird anerkennen, daß ein
Fachmann auf diesem Gebiet ohne weiteres andere Verbindungen bestimmen
kann, die erfindungsgemäß zweckmäßig funktionieren
würden,
die die oben beschriebenen Löslichkeits-
und Dampfdruckkriterien erfüllen.
Ferner ist verständlich,
daß bestimmte
Verbindungen außerhalb
des bevorzugten Löslichkeits-
oder Dampfdruckbereichs erwogen werden, wenn solche Verbindungen
die Abweichung in anderen Kategorien kompensieren und eine höhere Unlöslichkeit
oder einen niedrigeren Dampfdruck aufweisen.
-
Man
beachte auch, daß für medizinische
Zwecke die Gase, sowohl das Modifikationsgas als auch das Osmosegasmittel,
biokompatibel sein sollten und nicht physiologisch schädlich. Schließlich verflüchtigen
sich die Mikrobläschen,
die die Gasphase erhalten, und die Gasphase löst sich im Blut auf, entweder
als gelöstes Gas
oder als Tröpfchen
unterhalb der Mikrometergrenze der kondensierten Flüssigkeit.
Es versteht sich, daß Gase
in erster Linie aus dem Körper
entfernt werden durch Lungenatmung oder durch eine Kombination von Atmung
und anderen Stoffwechselwegen im retikuloendothelialen System.
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Geeignete
Gaskombinationen aus dem Primärmodifikator
und den Sekundärgasen
können
ohne übermäßige Experimente
empirisch festgelegt werden. Solche empirischen Bestimmungen sind
in den Beispielen beschrieben.
-
Wenn
ein effizientes Surfactant, z. B. ein Rinderlungen-Surfactant, verwendet
wird, um ein Bläschen mit
großem
Durchmesser mit einer niedrigen Oberflächenspannung zu erzeugen, ist
der Laplacesche Druck sehr niedrig. Wenn mit Perfluoroctylbromid
(PFOB) gesättigte
Luft im Bläschen
ist und das Bläschen
der Luft oder einer Flüssigkeit
ausgesetzt wird, die nahezu mit Luft gesättigt ist (z. B. im Gleichgewicht
mit Luft), ist der Osmosegasdruck größer als der Laplacesche Druck
und daher wird das Bläschen
größer. Bei
Bläschen
mit kleinerem Durchmesser ist der Laplacesche Druck höher, und
daher schrumpft das Bläschen
oder fällt
zusammen. Diese Schrumpfung erfolgt mit einer verringerten Geschwindigkeit,
was durch die Differenz zwischen dem Laplaceschen Druck und dem
Osmosegasdruck bewirkt wird. Wenn Bläschen mit kleinem Durchmesser durch
Beschallung von Gas oder Gasdampfgemischen in einer Lösung mit
Surfactants mit niedriger Oberflächenspannung
erzeugt werden, z. B. 2% Pluronic F-68 plus 1% Saccharosestearat,
korreliert die Zeit, in der die Bläschen im Reagenzglas, wie durch
Mikroskop zu beobachten, und im lebenden Organismus, wie durch Dopplerultraschallbildgewinnung
einer Kaninchenniere nach intravenöser Injektion zu beobachten,
stabil sind, mit dem oben erwähnten
Osmosegasdruckvergleich.
-
Bei
dem Dopplerultraschall-Experiment mit Kaninchennieren (Beispiel
III) wurde eine Kontrastverbesserung von bis zu 10 min mit Perfluorhexan/Luftgemischen
in den Bläschen
beobachtet, verglichen mit dem sofortigen Verschwinden des Kontrasts
bei reinen Luftbläschen.
Diese Perfluorchemikalien sind in der Lage, Osmosegasdrücke auszuüben, die
nahezu das Gegengewicht zum Laplaceschen Druck darstellen und funktionelle
Ultraschallmikrobläschenkontrastmittel
erzeugen.
-
Eine überraschende
Feststellung war, daß Gemische
aus PFC, z. B. C4F10 (als
Kombinationsmodifikationsgas oder als Osmosegasmittel), die mit
C6F14-Dampf (als
Hauptosmosegasmittel) gesättigt
sind, das Bläschen
für längere Zeiten
als eine der beiden Komponenten allein stabilisieren können. Die
Ursache dafür
ist, daß C4F10 bei Körpertemperatur
ein Gas ist (und daher sowohl als Modifikationsgas wie auch als
Osmosegasmittel wirken kann), eine etwas verringerte Membranpermeabilität hat und
es in C6F14 bei
Körpertemperatur
nur geringfügig
löslich
ist. In dieser Situation werden die Osmosegasdrücke beider Mittel zusammen
addiert, was zu einer erhöhten
Bläschenbeständigkeit
gegenüber
der von reinen Luft/C6F14-Gemischen
führt.
Es ist möglich, daß der Kondensationspunkt
der länger
beständigen
C6F14-Komponente
mit höherem
Molekulargewicht erhöht wird,
was dazu führt,
daß ein
größerer Osmosegasdruck
ausgeübt
wird. Weitere Gemische aus PFC funktionieren ähnlich. Bevorzugte Gemische
aus PFC haben Verhältnisse
von 1 : 10 bis 10 : 1 und weisen solche Gemische auf wie etwa Perfluorbutan/Perfluorhexan
und Perfluorbutan/Perfluorpentan. Diese bevorzugten Fluorchemikalien
können
verzweigte oder gerade Ketten haben.
-
Wie
oben beschrieben, haben wir auch festgestellt, daß Gemische
aus nichtosmotischen Gasen in Kombination mit dem Osmosegasmittel
die Größenverteilung
der Bläschen
vor und nach der Injektion stabilisieren. Nach Erzeugung der Bläschen bewirken
die höheren
Laplaceschen Drücke
in kleineren Bläschen
eine Diffusion durch die Flüssigphase
zu den größeren Bläschen mit
niedrigerem Laplaceschen Druck. Die bewirkt, daß die mittlere Größenverteilung
mit der Zeit über
die Kapillargrößengrenze
von 5 μm
steigt. Dies wird als Disproportionierung bezeichnet.
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Wenn
jedoch ein Gemisch aus Modifikationsgasen (z. B. Luft oder Kohlendioxid)
mit einem Osmosemittel (z. B. C6F14) verwendet wird, wird durch eine geringfügige Reduzierung
des Volumens der kleineren Bläschen
infolge eines der Modifikationsgase, die das Bläschen verläßt, das Osmosegas konzentriert,
und sein osmotischer Druck erhöht
sich, wodurch eine weitere Schrumpfung verzögert wird. Andererseits vergrößert sich das
Volumen der größeren Bläschen geringfügig, wodurch
das Osmosegas verdünnt
und weiteres Wachstum verzögert
wird.
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Ein
zusätzlicher
Vorteil der Verwendung eines Gemischs aus einem extrem blutlöslichen
Gas (z. B. 75% durch 87,5 Vol.-% CO2) und
einem Osmosegasgemisch (z. B. 28% C6F14-Dampf und 72% Luft) besteht darin, daß, wenn
diese Bläschen
injiziert werden, sie infolge der Abgabe von CO2 an
das Blut schnell schrumpfen. Kohlendioxid verschwindet infolge eines
spezifischen Plasmaenzyms, das seine Auflösung katalysiert, besonders
schnell. Eine Verringerung von 87,5 Vol.-% infolge des Verlustes
an CO2 entspricht einer Halbierung des Bläschendurchmessers.
Demzufolge können
Bläschen
mit größerem Durchmesser
erzeugt werden, die nach Injektion oder nach Einwirkung einer Lösung mit
einem basischen oder alkalischen pH auf eine entsprechende Größe schrumpfen
(nämlich
5 μm).
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Demzufolge
haben wir festgestellt, daß durch
die Verwendung eines Gases, das relativ hydrophob ist und das eine
relativ niedrige Membranpermeabilität hat, die Geschwindigkeit,
mit der die Kontrastpartikel zerfallen, reduziert werden kann. Durch
Reduzierung der Partikelzerfallsgeschwindigkeit werden also die
Halbwertzeiten der Mikrobläschen
erhöht
und das Kontrastverbesserungspotential erweitert.
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II. Weitere Komponenten
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Es
versteht sich, daß weitere
Komponenten in die erfindungsgemäßen Mikrobläschenformulierungen aufgenommen
werden können.
Beispielsweise können
Osmosemittel, Stabilisatoren, Gelatoren, Puffer, Viskosemodulatoren,
Luftlöslichkeitsmodifikatoren,
Salze und Zucker zugesetzt werden, um die Mikrobläschensuspension
auf maximale Lebensdauer und Kontrastverbesserungseffektivität abzustimmen.
Solche Überlegungen
wie Sterilität,
Isotonie und Biokompatibilität
können
die Verwendung solcher herkömmlicher
Zusätze
zu den injizierbaren Zusammensetzungen bestimmen. Die Verwendung
solcher Mittel wird dem Fachmann verständlich sein, und die spezifischen
Mengen, Verhältnisse
und Typen der Mittel können
ohne übermäßige Experimente
empirisch bestimmt werden.
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III. Formulierung der
erfindungsgemäßen Mikrobläschen
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Es
gibt viele verschiedene Verfahren, Mikrobläschen erfindungsgemäß herzustellen.
Die Beschallung wird bei der Ausbildung der Mikrobläschen bevorzugt,
d. h. durch eine ultraschalldurchlässige Trennwand oder indem
die Trennwand mit einer Ultraschallsonde, einschließlich einer
mit Ultraschall schwingenden Injektionsnadel, durchstoßen wird.
Man wird jedoch anerkennen, daß viele
verschiedene andere Techniken zur Bläschenbildung bestehen. Beispielsweise
können
Gasinjektionstechniken verwendet werden, wie etwa Venturigasinjektion.
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Weitere
Verfahren zur Ausbildung von Mikrobläschen sind u. a. die Ausbildung
von Partikelmikrokügelchen
durch Ultrabeschallung von Albumin oder anderem Eiweiß, wie in
der europäischen
Patentanmeldung 0 359 246 von Molecular Biosystems, Inc. beschrieben;
die Verwendung von Tensiden und viskositätserhöhenden Mitteln, wie im US-Patent
4 446 442 beschrieben; lipidbeschichtete, Nichtliposom-Mikrobläschen, wie
im US-Patent 4 684 479 beschrieben; Liposomen mit eingeschlossenen
Gasen, wie im US-Patent 5 088 499 und 5 123 414 beschrieben; und
die Verwendung von denaturierten Albuminpartikel-Mikrokügelchen,
wie im US-Patent 4 718 433 beschrieben.
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Jedes
der oben beschriebenen Verfahren kann mit ähnli chem Erfolg verwendet
werden, um Modifikationsgas und Osmosegasmittel erfindungsgemäß einzuschließen. Außerdem wird
erwartet, daß ähnliche
Verbesserungen der Langlebigkeit der erzeugten Bläschen durch
die erfindungsgemäße Verwendung
beobachtet werden.
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Die
Beschallung kann auf verschiedene Weise erfolgen. Beispielsweise
kann eine Ampulle mit einer Surfactant-Lösung und Gas im Kopfraum der
Ampulle durch eine dünne
Membran hindurch beschallt werden. Vorzugsweise ist die Membran
weniger als etwa 0,5 oder 0,4 mm dick und besonders bevorzugt weniger
als etwa 0,3 oder sogar 0,2 mm dick, d. h. dünner als die Wellenlänge des
Ultraschalls im Material, um einen akzeptablen Durchtritt zu ermöglichen
und die Membranerwärmung
zu minimieren. Die Membran kann aus Materialien wie etwa Gummi,
Teflon, Mylar, Urethan, aluminiertem Film oder irgendeinem anderen
schalldurchlässigen
synthetischen oder natürlichen
Polymerfilm oder filmbildendem Material bestehen. Die Beschallung
kann durch Berührung
oder sogar durch Drücken
auf die Membran mit einer Ultraschallsonde oder mit einem fokussierten "Ultraschallstrahl" erfolgen. Die Ultraschallsonde
kann eine Einwegsonde sein. In beiden Fällen kann die Sonde an die
Membran angelegt oder durch sie hindurch in die Flüssigkeit
eingeführt
werden. Wenn die Beschallung erfolgt ist, kann die Mikrobläschenlösung der
Ampulle entnommen und an den Patienten verabreicht werden.
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Die
Beschallung kann auch innerhalb einer Spritze mit einer leistungsschwachen
ultraschallschwingenden Ansauganordnung an der Spritze erfolgen,
wie bei einem Tintenstrahldrucker. Außerdem kann die Spritze oder
die Ampulle in einem leistungsschwachen Ultraschallbad, das seine
Energie an einem Punkt in dem Behälter fokussiert, angeordnet
sein und in diesem beschallt werden.
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Weitere
Arten der mechanischen Ausbildung von Mikrobläschen werden ebenfalls erwogen.
Beispielsweise können
Bläschen
mit einer mechanischen Röhre
mit hoher Scherkraft (oder einer Doppelspritzennadel) und zwei Spritzen
oder einer Ansauganordnung an der Spritze ausgebildet werden. Selbst
einfaches Schütteln ist
eine Möglichkeit.
Die hier beschriebenen Schrumpfbläschentechniken sind besonders
geeignet für
mechanisch ausgebildete Bläschen,
wobei sie einen geringeren Energiebedarf haben als beschallte Bläschen. Solche
Bläschen
haben normalerweise einen Durchmesser, der viel größer ist
als die letztlich gewünschten
biokompatiblen Bilderzeugungsmittel, und können erfindungsgemäß auf eine
entsprechende Größe geschrumpft werden.
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In
einem weiteren Verfahren können
Mikrobläschen
unter Verwendung einer Flüssigosmosemittelemulsion
ausgebildet werden, die mit einem Modifikationsgas bei erhöhtem Druck übersättigt wird
und in eine Surfactant-Lösung
eingebracht wird. Dieses Zubereitungsverfahren wirkt wie die Öffnung einer
Brauselimonade, wo das Gas bei Druckentlastung schäumt und
dabei Bläschen
bildet.
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In
einem weiteren Verfahren können
die Bläschen
ausgebildet werden wie bei der Schaumerzeugung mit Rasiercreme,
wo Perfluorbutan, Freon oder andere ähnliche Materialien sieden,
wenn der Druck abgelassen wird. In diesem Verfahren ist es jedoch
unbedingt notwendig, daß die
emulgierte Flüssigkeit
bei ausreichend niedrigen Temperaturen siedet oder daß sie zahlreiche
Bläschenkeimstellen
enthält,
um eine Überhitzung
und Übersättigung
der wäßrigen Phase
zu verhindern. Diese Übersättigung
führt zur
Erzeugung einer kleinen Anzahl großer Bläschen in einer begrenzten Anzahl
von Bläschenkeimstellen
und nicht zu der gewünschten
großen
Anzahl von kleinen Bläschen
(eines für
jedes Tröpfchen).
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In
noch einem weiteren Verfahren können
trockene hohlraumhaltige Partikel oder andere Strukturen (z. B.
hohle Kügelchen
oder Honigwaben), die sich schnell lösen oder Wasser anlagern, vorzugsweise
in einer wäßrigen Lösung, z.
B. Albumin, mikrofeine Zuckerkristalle, hohler sprühgetrockneter
Zucker, Salze, hohle Surfactant-Kügelchen, getrocknete poröse Polymerkügelchen,
getrocknete poröse
Hyaluronsäure
oder Kügelchen
mit substituierter Hyaluronsäure
oder sogar handelsübliche
getrocknete Lactosemikrokügelchen,
mit einem Osmosegasmittel stabilisiert werden.
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Beispielsweise
kann eine sprühgetrocknete
Surfactant-Lösung formuliert
werden durch Einstäubung einer
Surfactant-Lösung in
ein erwärmtes
Gas, z. B. Luft, Kohlendioxid, Stickstoff oder dgl., um getrocknete Kügelchen
von 1 bis 10 μm
oder größere hohle
oder poröse.
Kügelchen
zu erhalten, die in einer Ampulle verpackt werden, das mit einem
Osmosegas oder einem gewünschten
Gasgemisch gefüllt
ist, wie hierin beschrieben. Das Gas diffundiert in die Hohlräume der
Kügelchen.
Die Diffusion kann durch Druck- oder Vakuumzyklen unterstützt werden.
Wenn die Kügelchen
mit einer sterilen Lösung
rehydratisiert werden, lösen
sie sich schnell und lassen osmosegasstabilisierte Bläschen in
der Ampulle zurück.
Außerdem
führt der
Einschluß von
Stärke oder
Dextrinen, Zuckerpolyester und/oder einem Aufblasmittel, z. B. Methylenchlorid,
1,1,2-Trichlortrifluorethan
(Freon 113, EM Science, Gibbstown, NJ) oder Perfluorhexan zu Mikrobläschen mit
einer erhöhten
Halbwertzeit im lebenden Organismus. Besonders bevorzugte Stärken zur
Verwendung bei der Ausbildung von Mikrobläschen sind u. a. solche mit
einem Molekulargewicht von mehr als etwa 500 000 Dalton oder einem
Dextroseäquivalenz-(DE-)Wert
von weniger als etwa 12. Der DE-Wert ist ein quantitatives Maß für den Grad
der Stärkepolymerhydrolyse.
Er ist ein Maß für die Reduzierung
der Leistung im Vergleich zum Dextrosenormalwert von 100. Je höher der
DE-Wert ist, um so größer ist
der Grad der Stärkehydrolyse.
Solche bevorzugten Stärken
sind u. a. Nahrungsmittelqualität
aufweisende Pflanzenstärken,
wie sie handelsüblich
in der Nahrungsmittelindustrie verfügbar sind, einschließlich solche,
die unter dem Handelsnamen N-LOK und CAPSULE von National Starch
and Chemical Co. vertrieben werden (Bridgewater, NJ); derivatisierte
Stärken,
z. B. Hydroxyethylstärke
(vertrieben unter dem Handelsnamen HETASTARCH und HESPAN von du
Pont Pharmaceuticals) (M-Hydroxyethylstärke, Ajinimoto, Tokyo, Japan).
(Man beachte, daß sich
kurzkettige Stärken
gut trocken versprühen
lassen und verwendet werden können,
um Mikrobläschen
zu erzeugen, aber nicht bevorzugt sind, da sie mit einem Molekulargewicht
von weniger als etwa 500 000 die Mikrobläschen nicht stabilisieren. Sie
können
jedoch erfindungsgemäß in Anwendungen
verwendet werden, bei denen eine zusätzliche Stabilisierung nicht
erforderlich ist.) Als Alternative kann ein gefriergetrockneter
Kuchen aus Surfactant und Auflockerungsmitteln, die mit feinen Porenstrukturen
hergestellt sind, in einer Ampulle mit einer sterilen Lösung und einem
Kopfraum mit einem Osmosegasgemisch eingebracht werden. Die Lösung kann
schnell eingefroren werden, um eine feine Eiskristallstruktur zu
erzeugen, und nach der Gefriertrocknung entstehen daher feine Poren
(Hohlräume,
wo Eiskristalle entfernt wurden).
-
Als
Alternative können
lösliche
oder dispergierbare hohlraumbildende Strukturen verwendet werden. In
dieser Ausführungsform,
wo das hohlraumbildende Material weder aus einem Surfactant besteht
noch ein solches enthält,
werden sowohl das Surfactant als auch die Flüssigkeit in den Behälter mit
den Strukturen und dem gewünschten
Gas oder Gasen eingebracht. Bei Rehydratisierung schließen diese
Hohlräume
das Osmosegas ein und bilden bei der Lösung des festen Kuchens Mikrobläschen mit
dem Gas oder Gasen darin.
-
Man
wird anerkennen, daß Kits
bzw. Ausstattungen zur Verwendung bei der Herstellung der erfindungsgemäßen Mikrobläschenpräparate zubereitet
werden können.
Diese Ausstattungen können
einen Behälter
mit dem oben beschriebenen Gas oder Gasen zur Ausbildung der Mikrobläschen, der
Flüssigkeit
und des Surfactants aufweisen. Der Behälter kann alle sterilen trockenen
Komponenten und das Gas in einer Kammer enthalten, während die
sterile wäßrige Flüssigkeit
in einer zweiten Kammer des gleichen Behälters enthalten ist. Geeignete
Zweikammer-Ampullen
sind beispielsweise unter dem Handelsnamen WHEATON RS177FLW oder
5-1702FL von Wheaton Glass Co. (Milville, NJ) erhältlich.
Ein solcher Behälter
ist in 1 bis 4 dargestellt. Mit Bezug auf 1 und 2 hat
der dargestellte Wheaton-Behälter 5 eine
obere Kammer 20, die eine wäßrige Lösung 25 enthalten
kann, und eine untere Kammer 30, die die getrockneten Bestandteile 35 und
ein gewünschtes
Gas enthalten kann. Ein Stopfen 10 ist vorgesehen, der
die obere Kammer von der Umgebung trennt, und ein Verschluß 15 trennt
die obere Kammer 20 von der unteren Kammer 30,
die sprühgetrocknete
(pulverisierte) hohle Mikrokügelchen 35 und
das Osmosegasmittel enthält.
Durch Niederdrücken
des Stopfens 10 wird die relativ nichtkomprimierbare Flüssigkeit
unter Druck gesetzt, die den Verschluß 15 nach unten in
die untere Kammer 30 drückt.
Dadurch wird die wäßrige Lösung 25 in
die untere Kammer 30 eingelassen, was zur Lösung des
Pulvers 35 führt,
um stabilisierte Mikrobläschen 45 zu
bilden, die das eingeschlossene Osmosegasmittel enthalten. Überschüssiges Osmosegasmittel 40 wird
von der unteren Kammer 30 in die obere Kammer 20 eingelassen.
Diese Anordnung ist bequem für
den Anwender und hat den zusätzlichen
unerwarteten Vorteil, daß die
kleine Menge von wasserundurchdringlichem Osmosegasmittel in der
unteren Kammer durch Abdeckung des Zwischenkammerverschlusses mit
einer dicken (0,5 bis 1,25 Zoll) Schicht einer wäßrigen Lösung verschlossen wird, und
den Vorteil, daß die
wäßrige Lösung in
die untere Kammer eingeführt
werden kann, ohne den Druck in der oberen Kammer um mehr als etwa
10% zu erhöhen.
Es besteht deshalb keine Notwendigkeit für einen Druckausgleichsöffnung.
(Im Gegensatz dazu kann die herkömmliche Rehydratation
eines gelösten
Stoffs in einer Ampulle mit nur einer Kammer mit einer Nadel und
einer Spritze ohne eine Lüftungsöffnung zum
Aufbau eines beträchtlichen
Innenkammerdrucks führen,
der die Mikrobläschen
kollabieren lassen könnte.)
Die Bildung der Mikrobläschen
nach diesem Verfahren ist in Beispiel XIII beschrieben.
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Als
Alternative kann eine umgekehrte Zweikammer-Ampulle für die Mikrobläschenzubereitung
verwendet werden. Mit Bezug auf 3 und 4 kann
die gleiche Ampulle verwendet werden, wie oben beschrieben, außer daß der Stopfen 50 so
verlängert
ist, daß er
den innere Verschluß 15 verschiebt,
wenn darauf gedrückt
wird. Bei diesem Mikrobläschenzubereitungsverfahren
sind die sprühgetrockneten
hohlen Mikrokügelchen 35 und
das Osmosegasmittel 40 in der oberen Kammer 20 enthalten.
Die wäßrige Lösung 25 und
das Osmosegasmittel 40 sind in der unteren Kammer 30 enthalten.
Wenn auf den Stopfen 50 gedrückt wird, verschiebt er den
Verschluß 15,
so daß sich
die sprühgetrockneten
hohlen Mikrokügelchen
mit der wäßrigen Lösung 25 in
Gegenwart des Osmosegasmittels 40 vermischen können. Ein
Vorteil, der mit diesem Verfahren der Mikrobläschenbildung verbunden ist,
besteht darin, daß die
wäßrige Phase
zuerst einge träufelt
und dann durch Autoklavierung oder andere Mittel sterilisiert werden
kann, gefolgt von einer Einträufelung
der sprühgetrockneten
Mikrokügelchen.
Dadurch wird ein potentielles Mikrobenwachstum in der wäßrigen Phase
vor der Sterilisierung verhindert.
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Obwohl
ein bestimmter Zweikammer-Behälter
dargestellt ist, sind andere geeignete Vorrichtungen bekannt und
handelsüblich
erhältlich.
Beispielsweise eine Zweikammer-Glasspritze, z. B. B-D HYPAK Liquid/Dry 5
+ 5 ml Doppelkammer, vorgefülltes
Spritzensystem (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ; beschrieben
im US-Patent 4 613 326), kann vorteilhaft verwendet werden, um das
sprühgetrocknete
Pulver zu rehydratisieren. Die Vorteile dieses Systems sind u. a.:
- 1. Bequeme Anwendung;
- 2. Das wasserunlösliche
Osmosegasmittel ist eingeschlossen in einer Kammer mit einer wäßrigen Lösung auf
einer Seite und einer extrem kleinen Elastomerfläche, die die Nadel auf der
anderen Seite verschließt; und
- 3. Eine Filtrationsnadel, z. B. Monojet Nr. 305 (Sherwood Medical,
St. Louis, MO) kann zur Zeit der Zubereitung an der Spritze angebracht
werden, um sicherzustellen, daß keine
ungelösten
Feststoffe injiziert werden.
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Die
Verwendung der Zweikammer-Spritze zur Ausbildung von Mikrobläschen ist
in Beispiel XIV beschrieben.
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Ein
Fachmann kann erkennen, daß andere
Zweikammer-Rehydratisationssysteme,
die in der Lage sind, sprühgetrocknetes
Pulver mit der wäßrigen Lösung steril
zu kombinieren, auch in den Schutzbereich der Erfindung fallen.
Bei solchen Systemen ist es besonders vorteilhaft, wenn die wäßrige Phase
zwischen dem wasserunlöslichen
Osmosegas und der Umgebung angeordnet werden kann, um die Lagerungslebensdauer des
Erzeugnisses zu erhöhen.
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Als
Alternative kann der Behälter
das hohlraumbildende Material und das Gas oder die Gase enthalten,
und das Surfactant und die Flüssigkeit
können
hinzugesetzt werden, um Mikrobläschen
zu bilden. In einer Ausführungsform
kann das Surfactant mit den anderen Materialien im Behälter vorhanden
sein, so daß nur
die Flüssigkeit
hinzugesetzt werden muß,
um die Mi krobläschen
zu bilden. Wenn ein Material, das zur Bildung der Mikrobläschen nötig ist,
nicht schon im Behälter
vorhanden ist, kann es mit den anderen Komponenten der Ausstattung
verpackt sein, vorzugsweise in einer Form oder einem Behälter, die
bzw. der geeignet ist, eine einsatzbereite Kombination mit den anderen
Komponenten der Ausstattung zu bilden.
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Der
Behälter,
der in der Ausstattung verwendet wird, kann ein Behälter sein,
der hierin anderswo beschrieben ist. In einer Ausführungsform
ist der Behälter
eine herkömmliche
durch eine Trennwand verschlossene Ampulle. In einer weiteren Ausführungsform
hat er eine Einrichtung zum Lenken oder Einlassen einer ausreichenden
bläschenbildenden
Energie in den Inhalt des Behälters.
Diese Einrichtung kann beispielsweise die bereits beschriebene dünne Schicht
oder Folie aufweisen.
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Verschiedene
Ausführungsformen
der Erfindung weisen überraschende
Vorteile auf. Die sprühgetrockneten
Stärkeformulierungen
ergeben eine verlängerte
Stabilität
der Mikrobläschen
im Reagenzglas, besonders wenn das Molekulargewicht der Stärke über etwa
500 000 liegt. Die Verwendung von Fettsäureestern des Zuckers, die
eine Komponente mit einem HLB von weniger als 8 enthalten, ermöglicht eine
stark erhöhte Stabilität im lebenden
Organismus und in der Ampulle. Fettsäureester des Zuckers, z. B.
Succharosemonosterat, sowie Blockcopolymere, z. B. Pluronic F-68
(mit einem HLB über
12), ermöglichen,
daß das
Pulver in dem Moment Bläschen
bildet, wo sie rehydratisiert werden. Sprühgetrocknete Formulierungen
mit einem Strukturmittel, z. B. Stärke, Stärkederivat oder Dextrin, ergeben
eine deutlich niedrigere Gesamtdosis des Surfactants als vergleichbare
beschallte Formulierungen. Die Verwendung der Zweikammer-Ampullen
mit Wasser, die einen zusätzlichen
Verschluß für das Fluorkohlenwasserstoffgas
bieten, haben eine längere
Lagerlebensdauer und bieten eine bequemere Anwendung. Sprühgetrocknete
Formulierungen mit einem Strukturmittel (z. B. Stärke oder
Dextrin) und einem Zuckerpolyester liefern Mikrobläschen mit
einer stark erhöhten
Halbwertzeiten im lebenden Organismus.
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Die
Einbeziehung eines Aufblasmittels in die sprühzutrocknend Lösung führt durch
Ausbildung einer größeren Anzahl von
hohlen Mikrokügelchen
zu einem stärkeren
Ultraschallsignal pro Gramm des sprühgetrockneten Pulvers. Das
Aufblasmittel löst
die Dampfbläschenformulierung
in den zerstäubten
Tröpfchen
der Lösung
aus, die in den Sprühtrockner
eintreten, da sich diese Tröpfchen
mit dem heißen
Luftstrom im Trockner mischen. Geeignete Aufblasmittel sind solche,
die die Lösung
in den zerstäubten
Tröpfchen
mit Gas oder Dampf übersättigen,
bei der erhöhten
Temperatur der trocknenden Tröpfchen
(annähernd
100°C).
Geeignete Mittel sind u. a.:
- 1. Gelöste, niedrigsiedende
(unter 100°C)
Lösemittel
mit begrenzter Mischbarkeit mit wäßrigen Lösungen, z. B. Methylenchlorid,
Aceton und Kohlenstoffdisulfid, die verwendet werden, um die Lösung bei
Raumtemperatur zu sättigen.
- 2. Ein Gas, z. B. CO2 oder N2, das verwendet wird, um die Lösung bei
Raumtemperatur und erhöhtem
Druck (z. B. 3 Bar) zu sättigen.
Die Tröpfchen
werden dann mit dem Gas bei 1 Atmosphäre und 100°C übersättigt.
- 3. Emulsionen von nichtmischbaren, niedrigsiedenden (unter 100°C) Flüssigkeiten,
z. B. Freon 113, Perfluorpentan, Perfluorhexan, Perfluorbutan, Pentan,
Butan, FC-11, FC-11B1, FC-11B2, FC-12B2, FC-21, FC-21B1, FC-21B2,
FC-31B1, FC-113A, FC-122, FC-123, FC-132, FC-133, FC-141, FC-141B,
FC-142, FC-151,
FC-152, FC-1112, FC-1121 und FC-1131.
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Das
Aufblasmittel wird im wesentlichen während des Sprühtrocknungsprozesses
verdampft und ist daher in nicht mehr als kleinsten Mengen in dem
endgültigen
sprühgetrockneten
Pulver vorhanden.
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Die
Einbeziehung der Surfactants und Benetzungsmittel in die Hülle des
Mikrokügelchens
erlaubt die Verwendung einer niedrigeren Surfactant-Konzentration.
Wenn sich die Mikrokügelchenhülle löst, umgibt
sie vorübergehend
das in ihrem Inneren gebildete Mikrobläschen, mit einer Schicht einer
wäßrigen Phase,
die mit den Surfactants gesättigt
ist, wobei ihre Anlagerung auf der Oberfläche des Mikrobläschens verbessert
wird. Die gefriergetrockneten, surfactanthaltigen Mikrokügelchen
erfordern also nur örtlich
begrenzt hohe Konzentrationen des Surfactants und machen eine hohe
Surfactant-Konzentration in der gesamten wäßrigen Phase unnötig.
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Jedes
der erfindungsgemäßen Mikrobläschenpräparate kann
an ein Wirbeltier, z. B. an einen Vogel oder einen Säuger, als
Kontrastmittel zur Ultraschallbildgewinnung von Abschnitten des
Wirbeltiers verabreicht werden. Vorzugsweise ist das Wirbeltier
ein Mensch, und der Abschnitt, der bildlich dargestellt wird, ist
das Gefäßsystem
des Wirbeltiers. In dieser Ausführungsform
wird eine kleine Menge von Mikrobläschen (z. B. 0,1 ml/kg [2 mg/kg
sprühgetrocknetes
Pulver] auf der Grundlage des Körpergewichts
des Wirbeltiers) intravaskulär in
das Säugetier
eingeführt.
Andere Mengen von Mikrobläschen,
z. B. etwa 0,005 ml/kg bis etwa 1,0 ml/kg, können auch verwendet werden.
Eine bildliche Darstellung des Herzens, der Arterien, Venen und
Organe, die reich an Blut sind, z. B. die Leber, die Lunge und die
Nieren, kann mit dieser Technik durch Ultraschall erfolgen.
-
Die
vorstehende Beschreibung ist noch besser verständlich mit Bezug auf die nachfolgenden
Beispiele. Solche Beispiele sind jedoch nur Beispiele für bevorzugte
Verfahren zur Umsetzung der Erfindung und schränken den Schutzbereich der
Erfindung und der beigefügten
Ansprüche
nicht ein.
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Beispiel I
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Zubereitung von Mikrobläschen durch
Beschallung
-
Mikrobläschen mit
einer anzahlmittelgewichteten Größe von 5 μm wurden
durch Beschallung einer isotonischen wäßrigen Phase zubereitet, die
2% Pluronic F-68 und 1% Saccharosestearat als Surfactant, Luft als
Modifikationsgas und Perfluorhexan als das Osmosegasmittel enthält.
-
Bei
diesem Experiment wurde 1,3 ml sterile Wasserlösung, die 0,9% NaCl, 2% Pluronic
F-68 und 1% Saccharosestearat enthielt, einer Ampulle von 2,0 ml
hinzugesetzt. Die Ampulle hatte einen verbleibenden Kopfraum von
0,7 ml, der anfänglich
Luft enthielt. Luft, die mit Perfluorhexandampf (220 Torr Perfluorhexan
mit 540 Torr Luft) bei 25°C
gesättigt
war, wurde verwendet, um den Kopfraum der Ampulle zu spülen. Die
Ampulle wurde mit einer 0,22 mm dünnen Polytetrafluorethylen(PTFE-)Trennwand
verschlossen. Die Ampulle wurde horizontal gedreht, und eine Beschallungssonde
von 1/8 Zoll (3 mm), die an ein von Sonics & Materials vertriebenes Beschallungsgerät Modell
VC50 von 50 W angeschlossen war, wurde sanft gegen die Trennwand gedrückt. In
dieser Position trennte die Trennwand die Sonde von der Lösung. Der
Sonde wurde dann Leistung zugeführt,
und die Lösung
wurde für
15% beschallt, wobei eine weiße
Lösung
aus feinverteilten Mikrobläschen entstand,
die eine anzahlmittelgewichtete Größe von 5 μm hatten, gemessen mit einem
Laserlichtzerstreuungs-Partikelanalysegerät Horiba LA-700.
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Beispiel II
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Messung der In-vitro-Größe der Mikrobläschen im
Reagenzglas
-
Die
In-vitro-Größe (Größe im Reagenzglas)
der Mikrobläschen,
die in Beispiel I zubereitet wurden, wurden durch Laserlichtstreuung
gemessen. Untersuchungen der Bläschen
wurden durchgeführt,
wobei die Mikrobläschen
zu einer Dextrosewasserlösung
von 4% (1 : 50) verdünnt
wurden, die durch ein Laserlichtstreuungs-Analysegerät Horiba
LA-700 umgewälzt
wurden. Die mittlere Mikrobläschengröße war 5 μm, und die Größe verdoppelte
sich in 25 min.
-
Interessanterweise
hatten Mikrobläschen,
die nach demselben Verfahren wie in Beispiel I ohne Verwendung eines
Osmosegasmittels hergestellt wurden (wo das Perfluorhexan/Luftgemisch
durch Luft ersetzt war), eine mittlere Größe von 11 μm und ergaben bei 10 s nur Hintergrundwerte
auf dem Partikelanalysegerät.
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Beispiel III
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Messung der Lebensdauer
der Mikrobläschen
im lebenden Organismus
-
Die
Lebensdauern der Mikrobläschen,
die nach Beispiel I hergestellt worden sind, wurden bei Kaninchen
gemessen mittels Injektion von 0,2 ml frisch erzeugter Mikrobläschen in
eine marginale Ohrvene eines Kaninchens, das mit einem Ultraschallbildgewinnungsinstrument
Accuson 128XP/5 mit einem Wandler von 5 MHz beobachtet wurde. Mehrere
Versuche wurden durchgeführt,
bei denen Bilder des Herzens, der Vena cava inferior/Aorta und der
Niere gemacht wurden, während
die Zeit und der Umfang der beobachtbaren Kontrastverbesserung gemessen
wurden. Die Ergebnisse sind in der nachstehenden Tabelle II dargestellt:
-
-
In
Tabelle III ist ein Vergleich von Mikrobläschen dargestellt, die auf
eine identische Weise ohne Verwendung eines Osmosegases zubereitet
worden sind (es wurde nur Luft verwendet). Man beachte, daß sporadische
Reflektionen nur in der rechten Herzkammer während der Injektion beobachtet
wurden, die jedoch unmittelbar nach der Dosierung verschwanden.
-
-
Die
Verwendung eines Osmosemittels erhöhte die Zeitdauer, in der Mikrobläschen sichtbar
waren, dramatisch.
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Beispiel IV
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Zubereitung
von gemischten osmotisch stabilisierten Mikrobläschen
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Mikrobläschen mit
einer anzahlmittelgewichteten Größe von 5 μm wurden
durch Beschallung einer isotonischen wäßrigen Phase zubereitet, die
2% Pluronic F-68 und 1% Saccharosestearat als Surfactant und Gemische
aus Perfluorhexan und Perfluorbutan als die Osmosemittel enthielt.
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Bei
diesem Experiment wurde 1,3 ml sterile Wasserlösung, die 0,9% NaCl und 2%
Pluronic F-68 enthielt, einer Ampulle von 2,0 ml zugesetzt. Die
Ampulle hatte einen verbleibenden Kopfraum von 0,7 ml, der anfänglich Luft
enthielt. Ein Osmosegasgemisch aus Perfluorhexan mit 540 Torr und
Perfluorbutan mit 220 Torr wurde verwendet, um den Kopfraum vor
dem Verschließen
mit einer 0,22 mm dünnen
PTFE-Trennwand zu spülen.
Die Ampulle wurde beschallt wie in Beispiel I, wobei eine weiße Lösung aus
feinverteilten Mikrobläschen
entstand, die eine mittlere Partikelgröße von 5 μm hatten, gemessen mit einem
Laserlichtzerstreuungs-Partikelanalysegerät Horiba LA-700.
-
Dieser
Vorgang wurde noch zweimal wiederholt, einmal mit reinem Perfluorbutan
und dann mit einem Gemisch von 540 Torr Luft plus 220 Torr Perfluorhexan.
Die Beständigkeit
aller drei Präparate
im Gefäßsystem wurde
durch Ultraschallbildgewinnung bei einem Kaninchen nach intravenöser Injektion
bestimmt und ist nachstehend aufgeführt:
1,5
min | Perfluorbutan |
2 min | Perfluorhexan
+ Luft |
3 min | Perfluorbutan
+ Perfluorhexan |
-
Das
Gemisch aus Perfluorkohlenwasserstoffen bestand länger als
eines der beiden Mittel allein.
-
Beispiel V
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Zubereitung
von osmosegasstabilisierten Mikrobläschen aus löslichen sprühgetrockneten Kügelchen
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Osmosegasstabilisierte
Mikrobläschen
wurden durch Lösung
hohler sprühgetrockneter
Lactosekügelchen,
die mit einem Luft-Perfluorhexandampfgemisch gefüllt waren, in einer Surfactant-Lösung zubereitet.
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Sprühgetrocknete
Laktose-Kügelchen
mit einem mittleren Durchmesser von annähernd 100 μm und mit zahlreichen 10 bis
50 μm große Hohlräumen wurden
von DMV International unter dem Handelsnamen PHARMATOSE DCL-11 bezogen.
90 mg Lactosekügelchen
wurden in eine Ampulle von 2,0 ml eingebracht. Die porösen Kügelchen
wurden mit einem Gemisch von 220 Torr Perfluorhexan und 540 Torr
Luft gefüllt
durch zyklische Veränderung
des Gasdrucks in der Ampulle zwischen 1 Atmosphäre und 1/2 Atmosphäre bei insgesamt
12 Wiederholungen in 5 min. Eine Surfactant-Lösung,
die 0,9% Natriumchlorid, 2% Pluronic-F68 und 1% Saccharosestearat
enthielt, wurde auf annähernd
45°C erwärmt, um
die Lösung
der Lactose zu beschleunigen, bevor 1,5 ml der gewärmten Lösung in
die Ampulle eingeleitet wurde. Die Ampulle wurde dann durch Umkehrung
für annähernd 30
s sanft geschüttelt,
um die Lactose vor der Einleitung der derartig zubereiteten Mikrobläschen in
das Partikelanalysegerät
Horiba LA-700 zu lösen.
Ein volumengewichteter mittlerer Durchmesser von 7,7 μm wurde annähernd 1
min nach Auflösung
gemessen. Der Durchmesser dieser Mikrobläschen blieb nahezu konstant,
wobei er sich in 10 min zu einem mittleren Durchmesser von 7,1 μm änderte.
Wenn das Experiment mit luftgefüllter
Lactose wiederholt wurde, ergab das Partikelanalysegerät 1 min
nach der Auflösung
nur Hintergrundwerte, wobei demonstriert wurde, daß gasosmosestabilisierte
Mikrobläschen
durch Auflösung
von gasgefüllten
hohlraumhaltigen Strukturen hergestellt werden können.
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Beispiel VI
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Zubereitung großer Bläschen, die
auf eine gewünschte
Größe schrumpfen
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Mikrobläschen mit
einer volumenmittelgewichteten Größe von 20 μm, auf 2 μm schrumpfend, wurden durch
Beschallung einer isotonischen wäßrigen Phase
zubereitet, die 2% Pluronic F-68
als Surfactant, CO2 als Verdünnungsgas
und Perfluorhexan als das Osmosegasmittel enthielt.
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Bei
diesem Experiment wurde 1,3 ml sterile Wasserlösung, die 0,9% NaCl, 2% Pluronic
F-68 und 1% Saccharosestearat enthielt, in eine Ampulle von 2,0
ml eingebracht. Die Ampulle hatte einen verbleibenden Kopfraum von
0,7 ml, der anfänglich
Luft enthielt. Ein Gemisch aus Luft, das mit Perfluorhexan bei 25°C gesättigt war,
verdünnt
um einen Faktor 10 mit CO2 (684 Torr CO2 + 54 Torr Luft + 22 Torr Perfluorhexan),
wurde verwendet, um den Kopfraum zu spülen. Die Ampulle wurde mit
einer 0,22 mm dünnen
PTFE-Trennwand verschlossen. Die Ampulle wurde beschallt wie in
Beispiel I, wobei eine weiße
Lösung
aus feinverteilten Mikrobläschen
mit einer mittleren Partikelgröße von 28 μm entstand,
gemessen mit einem Laserlichtstreuungs-Analysegerät Horiba
LA-700. In der Lösung
aus 4% Dextrose plus 0,25 mM NaOH des Horiba-Gerätes schrumpfte der mittlere
Bläschendurchmesser
schnell in 2 bis 4 min von 28 μm
auf 5 bis 7 μm
und blieb dann relativ konstant, wobei nach 27 min 2,6 μm erreicht
wurden. Die Ursache dafür
ist, daß das
CO2 die Mikrobläschen verläßt, indem es sich in der Wasserphase
löst.
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Beispiel VII
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Perfluorheptanstabilisiertes
Mikrobläschen
in einem In-vitro-Experiment
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Mikrobläschen wurden
zubereitet wie oben in Beispiel I, wobei perfluorheptangesättigte Luft
(75 Torr + 685 Torr Luft) verwendet wurde, und wurden gemessen wie
oben in Beispiel II. Der anzahlmittelgewichtete Durchmesser dieser
Mikrobläschen
war nach 1 min Zirkulation 7,6 μm
und nach 8 min Zirkulation 2,2 μm.
Diese Beständigkeit
im Vergleich zu dem nahezu unmittelbaren Verschwinden der Mikrobläschen, die
nur Luft enthielten, demonstrierte die Perfluorheptan-Osmosegasstabilisierung.
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Beispiel VIII
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Perfluortripropylaminstabilisiertes
Mikrobläschen
in einem Experiment im lebenden Organismus
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Mikrobläschen wurden
wie oben in Beispiel I unter Verwendung von perfluortripropylamingesättigter Luft
zubereitet und bewertet, wie oben in Beispiel III. Es wurde festgestellt,
daß die
nutzbare Beständigkeit
dieser Mikrobläschen
im Gefäßsystem
2,5 min betrug, wobei die Perfluortripropylamin-Osmosegasstabilisierung demonstriert
wurde.
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Beispiel IX
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Wirkung des nicht-newtonschen
viskoelastischen Surfactant-Saccharosestearat
-
Mikrobläschen wurden
wie in Beispiel I oben unter Verwendung von 0,9% NaCl, 2% Pluronic
F-68 und 2% Saccharosestearat als Surfactant und mit perfluorpropangesättigter
Luft und perfluorhexangesättigter
Luft im Kopfraum zubereitet. Diese beiden Zubereitungen wurden mit
der gleichen Surfactant-Lösung minus
Saccharosestearat wiederholt. Alle vier Mikrobläschenpräparate wurden bewertet wie
in Beispiel III oben. Die nutzbare Beständigkeit dieser Mikrobläschen im
Gefäßsystem
ist nachstehend aufgeführt:
Beständigkeit
bei 2% Pluronic F-68 + 2% Saccharosestearat
Perfluorpropan
2 min
Perfluorhexan 4 min
Beständigkeit bei nur 2% Pluronic
F-68
Perfluorpropan 2 min
Perfluorhexan 1 min
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Wie
oben zu sehen ist, verhinderte die durch die nicht-newtonschen elastischen
Eigenschaften des Saccharosestearats ermöglichte, reduziete Oberflächenspannung,
daß das
weniger flüchtige
Perfluorhexan kondensierte, so daß Perfluorhexanmikrobläschen mit
langer Beständigkeit
hergestellt werden konnten.
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Beispiel X
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Sprühtrocknen von stärkehaltiger
Emulsion
-
Ein
Liter jeder der folgenden Lösungen
wurde mit Wasser für
eine Injektion zubereitet: Lösung
A, die 4,0% Gew./Vol. N-Lok-Pflanzenstärke (National Starch and Chemical
Co., Bridgewater, NJ) und 1,9% Gew./Vol. Natriumchlorid (Mal linckrodt,
St. Louis, MO) enthielt, und Lösung
B, die 2% Supersonic F-68 (Serva Heidelberg, Deutschland) und 2,0%
Gew./Vol. Ryotosaccharosestearat 5-1670 (Mitsubishi-Kasei Food Corp., Tokyo,
Japan) enthielt. Die Lösung
B wurde in einen Mischer mit hoher Scherkraft eingebracht und in
einem Eisbad gekühlt.
Eine grobe Suspension von 40 ml 1,1,2-Trichlortrifluorethan (Freon 113; EM
Science, Gibbstown, NJ) wurde in 1 Liter Lösung B hergestellt. Diese Suspension
wurde unter Verwendung eines Mikroverflüssigers (Micorofluidics Corporation,
Newton, MA; Modell M-110F) bei 10 000 psi und 5°C in 5 Durchläufen emulgiert.
Die resultierende Emulsion wurde einer Lösung A zugesetzt, um die folgende
Formel zum Sprühtrocknen
zu erzeugen:
2,0% Gew./Vol. N-Lok
1,0% Gew./Vol. Superonic
F-68
1,0% Gew./Vol. Saccharosestearat S-1670
0,95% Gew./Vol.
Natriumchlorid
2,0% Gew./Vol. 1,1,2-Trichlortrifluorethan
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Diese
Emulsion wurde dann in einem tragbaren Sprühtrockner von Niro Atomizer
sprühgetrocknet,
der mit 2 Fluidzerstäubern
ausgerüstet
ist (Niro Atomizer, Kopenhagen, Dänemark) und der die folgenden
Einstellungen verwendet:
Warmluftdurchflußrate = 39,5 Kubikfuß/min
Einlaßlufttemperatur
= 235°C
Auslaßlufttemperatur
= 10°C
Zerstäuberluftmenge
= 110 l/h
Emulsionszuführmenge
= 1 l/h
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Das
trockene, hohle kugelförmige
Erzeugnis hatte einen Durchmesser zwischen etwa 1 μm und etwa 15 μm und wurde
in einem Zyklonabscheider gesammelt, wie es für diesen Trockner üblich ist.
Aliquoten des Pulvers (250 mg) wurden in Röhrchenampullen von 10 ml eingewogen,
mit perfluorhexangesättigtem
Stickstoff bei 13°C
besprengt und verschlossen. Der Stickstoff wurde mit Perfluorhexan
gesättigt,
indem er durch drei perfluorhexangefüllte Gaswaschflaschen geführt wurde,
die in einem Wasserbad von 13°C
eingetaucht waren.
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Die
Ampullen wurden mit 5 ml Wasser für Injektionszwecke rehydratisiert,
nach dem Einfügen
einer Nadel der Größe 18 als
Lüftungsöffnung zur
Druckentlastung, als das Wasser injiziert wurde. 1 ml der resultierenden
Mikrobläschensuspension
wurde intravenös
in ein Kaninchen von annähernd
3 kg injiziert, das an die Instrumente angeschlossen war, um das
Dopplerultraschallsignal seiner Halsschlagader zu beobachten. Eine 10-MHz-Durchflußmanschette
(Triton Technology Inc., San Diego, CA; Modell ES-10-20), die mit
einem Dopplerdurchflußmodul
System 6 (Triton Technology Inc.) verbunden war, lieferte das RF-Dopplersignal an
ein Oszilloskop LeCroy 9410 (LeCroy, Chestnut Ridge, NY). Die vom
Oszilloskop berechnete Effektiv(RMS-)Spannung des Signals wurde
an einen Computer übertragen
und die resultierende Kurve angepaßt, um die Spitzen-Echosignalintensität und die
Halbwertszeit der Mikrobläschen
im Blut zu ermitteln. Signale vor Kontrastverbesserung waren kleiner
als 0,1 V Effektivspannung. Ein Spitzensignal von effektiv 1,6 V
wurde bei einer Halbwertszeit von 52,4 s festgestellt, womit erwiesen
war, daß man
mit sprühgetrockneten
Pulvern intravaskuläre
echofähige
Mikrobläschen
erzeugen kann, die eine verlängerte
Halbwertszeit im lebenden Organismus haben.
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Beispiel XI
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Herstellung von Mikrobläschen, die
Hydroxyethylstärke
enthalten
-
Eine
Emulsion zum Sprühtrocknen
wurde wie in Beispiel X zubereitet, um folgende entgültige Zusammensetzung
zu ergeben:
2,0% Gew./Vol. m-HES-Hydroxyethylstärke (Ajinimoto,
Tokyo, Japan)
2,0% Gew./Vol. Natriumchlorid (Mallinckrodt)
1,74%
Natriumphosphat, zweibasisch (Mallinckrodt)
0,26% Gew./Vol.
Natriumphosphat, einbasisch (Mallinckrodt)
1,7% Gew./Vol. Superonic
F-68 (Serva)
0,2% Gew./Vol. Ryotosaccharosestereat S-1670 (Mitsubishi-Kasei Food Corp.)
0,1%
Gew./Vol. Ryotosaccharosestereat S-570 (Mitsubishi-Kasei Food Corp.)
4,0%
Gew./Vol. 1,1,2-Trichlortrifluorethan (Freon 113; EM Science, Gibbstown,
NJ)
-
Diese
Emulsion wurde sprühgetrocknet
wie in Beispiel X unter Verwendung der folgenden Parameter:
Warmluftdurchflußmenge =
39,5 Kubikfuß/min
Einlaßlufttemperatur
= 220°C
Auslaßlufttemperatur
= 105°C
Zerstäuberluftmenge
= 110 l/h
Emulsionszuführmenge
= 1 l/h
-
Es
wurden Probeampullen zubereitet mit 400 mg sprühgetrocknetem Pulver und wie
in Beispiel X besprengt. Nach der Rehydratation mit 5 ml Wasser
zur Injektion und intravenöser
Verabreichung von 1,0 ml an ein Kaninchen wie in Beispiel X wurde
ein Spitzensignal von effektiv 2,4 V bei einer Halbwertzeit von
70,9% beobachtet. Dies zeigt, daß man mit derivatisierten,
injizierbaren Stärken
mit höherem
Molekulargewicht und mit Zuckerpolyestern höhere Signale vom lebenden Organismus
erzeugen kann, die länger
anhalten im Vergleich zu normaler Pflanzenstärke (Beispiel X). Dies zeigt
auch die geringere Surfactant-Konzentration, die von einer optimale
sprühgetrocknete
Formulierung gefordert wird, und die Verwendung eines Sprühtrockungs-Aufblasmittels,
z. B. Freon 113.
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Beispiel XII
-
Stabilität von stärkehaltigen
Mikrobläschen
-
Das
in Beispiel X beschriebene sprühgetrocknete
Pulver wurde rehydratisiert, wie beschrieben. Zum Vergleich wurden
die beschallten Mikrobläschen
aus Beispiel I zubereitet, und beide wurden mit Lichtmikroskopie
innerhalb von 2 min bei der Zubereitung und wiederum 10 min nach
Zubereitung geprüft.
Es wurde festgestellt, daß das
beschallte Erzeugnis eine breitere anfänglichere Bläschendurchmesserverteilung
hat (zwischen etwa 1 und etwa 30 μm)
als das rehydratisierte sprühgetrocknete
Pulver (zwischen etwa 3 und etwa 15 μm). Nach 10 min wurden die Ampullen
geschüttelt,
neue Proben genommen und wiederum mit Lichtmikroskopie beobachtet.
Das rehydratisierte sprühgetrocknete
Erzeugnis war im wesentlichen unverändert, obwohl die beschallten
Mikrobläschen
durch Disproportionierung größer geworden
waren, bis nahezu alle beobachtbaren Mikrobläschen einen Durchmesser von
mehr als 10 μm
hatten. Dieses Experiment demonstrierte die verlängerte Stabilität von durch
Sprühtrocknung
erzeugten Mikrobläschen
im lebenden Organismus und daß Stärken die
In-vitro-Stabilität
erhöhen
können.
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Beispiel XIII
-
Mikrobläschenbildung
unter Verwendung einer Zweikammer-Ampulle
-
800
mg sprühgetrocknetes
Pulver aus Beispiel XII wurde in die untere Kammer einer Zweikammer-Ampulle
Wheaton RS-177FLW
von 20 ml eingewogen (1). Die Ampulle wurde vor Einfügung des
Zwischenkammerverschlusses mit perfluorhexangesättigtem Stickstoff bei 13°C gespült. Die
obere Kammer wurde zur Injektion mit 10 ml sterilem Wasser gefüllt. Der
Stopfen der oberen Kammer wurde eingesetzt, um alle Luftbläschen in
der oberen Kammer zu beseitigen. Beim Drücken auf den oberen Stopfen
wurde der Zwischenkammerverschluß in die untere Kammer gedrückt, wodurch
das Wasser in die untere Kammer fließen und das Pulver rehydratisieren
konnte (2). Es entstanden zahlreiche
stabile Mikrobläschen,
wie durch Lichtmikroskopie demonstriert wurde. Dieser Vorgang demonstrierte
die Zweckmäßigkeit
dieser Verpackungsform und daß es
nicht mehr notwendig ist, eine Lüftungsöffnung vorzusehen,
um einen Druckaufbau zu beseitigen, wenn die wäßrige Phase dem Pulver hinzugesetzt
wird.
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Beispiel XIV
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Mikrobläschenbildung
unter Verwendung einer Zweikammer-Spritze
-
100
mg sprühgetrocknetes
Pulver aus Beispiel XI wurde in eine HYPAK-Flüssig/Trocken-Zweikammer-Spritze
für 5 ml
plus 5 ml (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ) eingewogen und
in der Pulver-Kammer (am Nadelende) geschüttelt. Der Zwischenkammerverschluß wurde
dann direkt über
dem Umgehungskanal positioniert. Eine 5-μm-Filternadel wurde dann an
der Spritze ange bracht. Die pulverhaltige Kammer wurde dann mit
dem Osmosegasmittel gefüllt,
indem die Anordnung in einer Vakuumkammer plaziert wurde, evakuiert
wurde und die Kammer erneut mit Osmosegasmittel, perfluorhexangesättigtem
Stickstoff, bei 13°C
gefüllt wurde.
Die Filternadel ermöglicht
die Evakuierung und erneute Füllung
mit Atmosphäre
in der pulverhaltigen Kammer. Eine dichtende Nadelabdeckung wurde
dann auf der Nadel plaziert. Die Flüssigkeitskammer wurde dann
mit 4 ml Wasser zur Injektion gefüllt, und der Kolben wurde unter
Verwendung einer zeitweiligen Lüftungsöffnung aufgesetzt
(Draht zwischen Glasspritzenzylinder und dem Kolben eingefügt, um alle
Luftblasen zu beseitigen).
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Zur
Rehydratisierung wurde die dichtende Nadelabdeckung entfernt, um
den Druckaufbau in der Pulverkammer zu beseitigen. Der Kolben wurde
dann niedergedrückt,
wobei der Zwischenkammerverschluß zur Umgehungsposition geschoben
wurde, in der das Wasser um die Zwischenkammerdichtung herum in
die pulverhaltige Kammer fließen
kann. Die Kolbenbewegung wurde unterbrochen, als das gesamte Wasser
in der Pulverkammer war. Die Spritze wurde geschüttelt, um das Pulver zu lösen. Überschüssiges Gas
und große Blasen
wurden ausgestoßen,
indem die Spritze mit dem Nadelende nach oben gehalten und auf den
Kolben gedrückt
wurde. Die Lösung,
die zahlreiche stabilisierte Mikrobläschen enthielt (wie durch Lichtmikroskopie
beobachtet) wurde dann durch Drücken
des Kolbens bis zum Anschlag aus der Spritze ausgestoßen.