DE69434119T3

DE69434119T3 - Stabilisierte mikrogasbläschen-zusammensetzungen für echographie

Info

Publication number: DE69434119T3
Application number: DE69434119T
Authority: DE
Inventors: G. Ernest SCHUTT; P. David EVITTS; Alta Rene KINNER; G. Jeffry WEERS; David Charles ANDERSON
Original assignee: Imcor Pharmaceutical Co
Current assignee: Imcor Pharmaceutical Co
Priority date: 1993-07-30
Filing date: 1994-08-01
Publication date: 2011-05-05
Anticipated expiration: 2014-08-02
Also published as: HK1013403A1; US20050281747A1; US6953569B2; EP1550464A1; US5720938A; US6706253B2; US5639443A; AU7478294A; US20020054854A1; US20020051750A1; US6372195B1; AU694135B2; JP3559849B2; ES2231775T3; US20020028179A1; WO1995003835A1; DE69434119D1; US20050244338A1; US5605673A; DK0711179T3

Description

Hintergrund der Erfindung
Gebiet der Erfindung
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Zubereitung von stabilen langlebigen Mikrogasbläschen zur Ultraschallkontrastverbesserung und zu anderen Zwecken und Zusammensetzungen der derartig zubereiteten Bläschen.
Hintergrund der Erfindung
Die Ultraschalltechnologie stellt eine wichtige und wirtschaftlichere Alternative zu solchen Bilderzeugungstechniken dar, die ionisierende Strahlung verwenden. Es sind zwar zahlreiche herkömmliche Bilderzeugungstechnologien verfügbar, z. B. Magnetresonanztomographie (MRI), Computertomographie (CT) und Positronenemissionstomographie (PET), aber jede dieser Techniken benötigt extrem teure Geräte. Außerdem nutzen CT und PET ionisierende Strahlung. Im Gegensatz zu diesen Techniken ist die Ultraschallbilderzeugungsgerätetechnik relativ billig. Außerdem nutzt die Ultraschallbilderzeugung nicht die ionisierende Strahlung.
Ultraschallbilderzeugung nutzt Differenzen der Gewebedichte und der Zusammensetzung, die die Reflektion von Schallwellen durch diese Gewebe beeinflussen. Die Bilder sind besonders scharf, wenn deutlich unterscheidbare Änderungen der Gewebedichte oder der Komprimierbarkeit vorhanden sind, z. B. in Gewebegrenzbereichen. Grenzbereiche zwischen festen Geweben, dem Skelettsystem und verschiedenen Organen und/oder Tumoren sind ohne weiteres durch Ultraschall bildlich darstellbar.
Demzufolge funktioniert in vielen Bilderzeugungsanwendungen Ultraschall gut ohne Verwendung von Kontrastverbesserungsmitteln; aber bei anderen Anwendungen, z. B. bei der Visualisierung des strömenden Blutes, gibt es anhaltende Bemühungen, solche Mittel zu entwickeln, um eine Kontrastverbesserung zu erreichen. Eine besonders wichtige Anwendung für solche Kontrastmittel besteht auf dem Gebiet der Perfusionsszintigramme. Solche Ultraschallkontrastmittel könnten die Bilderzeugung von strömendem Blut im Herzmuskel, in den Nieren, der Leber und anderen Geweben verbessern. Dies wiederum würde Untersuchung, Diagnose, Chirurgie und Therapie bei dem bildlich dargestellten Gewebe erleichtern. Ein Blut-Pool-Kontrastmittel würde auch eine Bilderzeugung auf der Grundlage des Blutgehalts (z. B. von Tumoren und entzündeten Geweben) ermöglichen und würde zur Visualisierung der Plazenta oder des Fötus durch Verbesserung lediglich des mütterlichen Kreislaufs beitragen.
Eine Vielzahl verschiedener Ultraschallkontrastverbesserungsmittel ist bisher vorgeschlagen worden. Die erfolgreichsten Mittel haben bisher im allgemeinen aus Mikrogasbläschen bestanden, die intravenös injiziert werden können. In ihrer einfachsten Ausführungsform sind Mikrobläschen kleinste Bläschen, die ein Gas, z. B. Luft, enthalten, und diese entstehen unter Verwendung von Schäumungsmitteln, Surfactants bzw. oberflächenaktiven Stoffen oder Kapselungsmitteln. Die Mikrobläschen stellen ein physisches Objekt im strömenden Blut dar, das eine andere Dichte und eine viel höhere Komprimierbarkeit hat als das umgebende Fluidgewebe und das Blut. Infolgedessen können diese Mikrobläschen ohne weiteres durch Ultraschall bildlich dargestellt werden.
Die Zusammensetzungen der meisten Mikrobläschen haben bisher jedoch keine Kontrastverbesserung, die auch nur wenige Sekunden, geschweige denn Minuten Kontrastverbesserung erbracht hätte. Dies schränkt ihren Nutzen stark ein. Mikrobläschen sind daher verschieden ”aufgebaut”, um ihre effektive Kontrastverbesserungslebensdauer zu erhöhen. Verschiedene Wege sind bisher beschritten worden: die Verwendung verschiedener Surfactants oder Schäumungsmittel; die Verwendung von Gelatinen oder Albuminmikrokugeln, die anfänglich in einer Flüssigsuspension entstehen und die während der Erstarrung Gas einschließen; und Liposombildung. Jeder dieser Versuche müßte theoretisch festere Bläschenstrukturen erzeugen. Die eingeschlossenen Gase (normalerweise Luft, CO₂ oder dgl.) stehen infolge der Oberflächenspannung des umgebenden Surfactants unter erhöhtem Druck im Bläschen, wie durch die Laplacesche Gleichung (ΔP = 2γ/r) beschrieben.
Dieser erhöhte Druck wiederum führt zu einer schnellen Schrumpfung und Auflösung des Bläschens, wenn das Gas aus einem hohen Druckbereich (im Bläschen) in eine Umgebung mit niedrigerem Druckbereich (entweder in der umgebenden Flüssigkeit, die bei diesem erhöhten Druck nicht mit Gas gesättigt ist, oder in einem Bläschen mit größerem Durchmesser und niedrigerem Druck) übergeht.
Festphase-Hüllen, die Gase einkapseln, haben sich im allgemeinen als zu fragil oder zu durchlässig erwiesen, als daß das Gas eine ausreichende Lebensdauer im lebenden Organismus haben könnte. Ferner reduzieren dicke Hüllen (z. B. Albumin, Zucker oder andere viskose Materialien) die Komprimierbarkeit der Bläschen, so daß ihre Echotauglichkeit während der kurzen Zeit, in der sie bestehen, reduziert wird. Feststoff-Partikel oder flüssige Emulsionströpfchen, die Gas oder Blasen entwickeln, wenn sie injiziert werden, stellen eine Gefahr der Übersättigung des Blutes mit Gas oder Dampf dar. Dies führt zu einer kleinen Anzahl von großen embolisierenden Bläschen, die sich an den wenigen verfügbaren Bläschenkeimstellen bilden, und nicht zu der beabsichtigten großen Anzahl von kleinen Bläschen.
Ein Vorschlag zur Lösung solcher Probleme ist ausgeführt in Quay, PCT/US 92/07250 . Bei Quay werden Bläschen unter Verwendung von Gasen gebildet, die danach ausgewählt sind, daß sie bei Körpertemperatur (37°C) ein Gas sind und eine reduzierte Wasserlöslichkeit, eine höhere Dichte und eine reduzierte Gasdiffusionsfähigkeit in Lösungen im Vergleich zu Luft haben. Obwohl eine reduzierte Wasserlöslichkeit und Diffusionsfähigkeit die Geschwindigkeit, mit der das Gas das Bläschen verläßt, beeinflussen kann, bleiben zahlreiche Probleme bei den Bläschen von Quay offen. Die Ausbildung von Bläschen mit einem hinreichend kleinen Durchmesser (z. B. 3 bis 5 μm) erfordert einen hohen Energieaufwand. Dies ist insofern ein Nachteil, als hochentwickelte Bläschenzubereitungssysteme am Verwendungsort vorhanden sein müssen. Außerdem sind die Gasauswahlkriterien von Quay insofern fehlerhaft, als sie bestimmte Hauptursachen für die Bläschenschrumpfung nicht berücksichtigen, nämlich die Auswirkungen der Bläschenoberflächenspannung, der Surfactant- und der Osmosegaswirkungen, und diese Fehler führen zum Einschluß bestimmter ungeeigneter Gase und zum Ausschluß bestimmter optimal geeigneter Gase.
Demzufolge besteht in der Fachwelt Bedarf an Zusammensetzungen und an einem Verfahren zur Zubereitung solcher Zusammensetzungen, die ein langlebiges Kontrastverbesserungsmittel darstellen oder ausnutzen, das biokompatibel, leicht zubereitbar ist und eine starke Kontrastverbesserung bei der Ultraschallbilderzeugung bietet.
Zusammenfassung der Erfindung
Erfindungsgemäß wird ein Ultraschallkontrastverbesserungsmittel bereitgestellt, das eine verlängerte Lebensdauer im lebenden Organismus hat, und das aus einer praktisch beliebigen herkömmlichen Mikrobläschenformulierung in Verbindung mit einem eingeschlossenen Gas oder Gasgemisch besteht, das unter Berücksichtigung von Partialdrücken von Gasen sowohl innerhalb als auch außerhalb des Bläschens gewählt wird, und von den resultierenden Differenzen im Osmosegasdruck, der der Bläschenschrumpfung entgegenwirkt. Gase mit einem niedrigen Dampfdruck und begrenzter Löslichkeit im Blut oder Serum (d. h. relativ hydrophobe Gase) können vorteilhafterweise in Kombination mit einem anderen Gas bereitgestellt werden, das schneller mit Gasen ausgetauscht wird, die im normalen Blut oder Serum enthalten sind. Es werden Surfactant-Familien, die die Verwendung höher molukularer Osmosegasmittel ermöglichen, und verbesserte Verfahren zur Bläschenerzeugung offenbart.
Ein Aspekt der Erfindung ist ein stabilisiertes gasgefülltes Mikrobläschenpräparat, mit einem Gemisch aus einem ersten Gas oder Gasen und einem zweiten Gas oder Gasen (Osmosegasmittel) innerhalb von im allgemeinen kugelförmigen Membranen, um Mikrobläschen zu bilden, wobei das erste Gas und das zweite Gas jeweils in einem Molverhältnis von etwa 1:100 bis etwa 1000:1 vorhanden sind und wobei das erste Gas einen Dampfdruck von mindestens etwa (760 – x) mm Hg bei 37°C hat, wobei x der Dampfdruck des zweiten Gases bei 37°C ist und wobei der Dampfdruck des ersten und des zweiten Gases bei 37°C größer ist als etwa 75 mm Hg unter der Bedingung, daß das erste Gas und das zweite Gas kein Wasserdampf sind. Im erfindungsgemäßen Zusammenhang weist das zweite Gas einen Fluorkohlenwasserstoff auf, ausgewählt aus der Gruppe Perfluorpropane C₃F₈, Perfluorbutane C₄F₁₀, Perfluorpentane C₅F₁₂, Perfluorcyclopentane C₅F₁₀, Perfluormethylcyclobutane C₅F₁₀, Perfluorhexane C₆F₁₄, Perfluorcyclohexane C₆F₁₂, Perfluormethylcyclopentane C₆F₁₂, Perfluordimethylcyclobutane C₆F₁₂ _, und das erste Gas ist ein Nichtfluorkohlenwasserstoff, ausgewählt aus der Gruppe Stickstoff, Sauerstoff, Kohlendioxid oder Gemischen daraus.
Die Mikrobläschen können vorteilhaft in einem flüssigen Medium bereitgestellt werden, z. B. in einem wäßrigen Medium, wobei sie einen ersten mittleren Durchmesser haben, das Verhältnis zwischen dem ersten Gas und dem zweiten Gas im Mikrobläschen mindestens 1:1 ist und die Mikrobläschen geeignet sind, infolge des Verlustes des ersten Gases durch die Membran auf einen zweiten mittleren Durchmesser von weniger als etwa 75% des ersten Durchmessers in dem Medium zu schrumpfen und dann infolge einer Osmosegasdruckdifferenz durch die Membran bei oder etwa bei dem zweiten Durchmesser für mindestens etwa 1 min stabilisiert zu bleiben. Vorteilhafterweise ist das Medium in einem Behälter, und die Mikrobläschen sind tatsächlich in dem Behälter entstanden. Als Alternative ist das Medium Blut im lebenden Organismus. In einer Ausführungsform enthält das flüssige Medium darin gelöstes Gas oder Gase mit einer Spannung von mindestens etwa 700 mm Hg, wobei der erste Durchmesser mindestens etwa 5 µm beträgt und wobei die Spannung des in dem Medium gelösten Gases oder der Gase kleiner ist als der Partialdruck des gleichen Gases oder der gleichen Gase innerhalb der Mikrobläschen.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform enthält das Bläschen anfangs mindestens drei Gase: ein erstes Gas mit einem Partialdruck, der viel größer ist als die Gasspannung des gleichen Gases in der umgebenden Flüssigkeit (z. B. 1,5; 2; 4; 5; 10; 20; 50 oder 100 mal oder noch größer als in der umgebenden Flüssigkeit); ein zweites Gas, das aufgrund der relativ geringen Permeabilität der Bläschenmembran für das Gas oder einer relativ niedrigen Löslichkeit des Gases im umgebenden Medium im Bläschen festgehalten wird (wie an anderer Stelle hierin beschrieben); und ein drittes Gas, für das die Membran relativ durchlässig ist und das auch in dem umgebenden Medium vorhanden ist. Beispielsweise kann in einem wäßrigen System, das der Luft ausgesetzt ist oder zumindest teilweise ein ausgeglichenes Verhältnis mit ihr hat (z. B. Blut), das erste Gas vorteilhafterweise Kohlendioxid oder ein anderes Gas sein, das nicht in großen Mengen in der Luft oder im Blut vorhanden ist; das zweite Gas kann Fluorkohlenwasserstoffgas sein, z. B. Perfluorhexan; und das dritte Gas kann Luft sein oder ein Hauptbestandteil von Luft, z. B. Stickstoff oder Sauerstoff.
Vorzugsweise ist der erste Durchmesser vor der Schrumpfung mindestens etwa 10 µm, und der zweite Durchmesser, wenn der Durchmesser stabilisiert ist, liegt zwischen etwa 1 µm und 6 µm.
Für alle Mikrobläschenpräparate oder -verfahren, die hier beschrieben sind, hat das zweite Gas in einer bevorzugten Ausführungsform ein mittleres Molekulargewicht von mindestens etwa dem 4-fachen des ersten Gases. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform hat das zweite Gas einen Dampfdruck, der bei 37°C kleiner ist als etwa 750 oder 760 mm Hg. Außerdem wird bevorzugt, daß das Molverhältnis zwischen dem ersten Gas und dem zweiten Gas etwa 1:10 bis etwa 500:1, 200:1 oder 100:1 ist. In weiteren bevorzugten Ausführungsformen weist das zweite Gas einen Fluorkohlenwasserstoff oder ein Gemisch aus mindestens zwei oder drei Fluorkohlenwasserstoffen auf, und das erste Gas ist ein Nichtfluorkohlenwasserstoff. Bei bestimmten vorteilhaften Präparaten weist das zweite Gas ein oder mehrere Perfluorkohlenwasserstoffe auf. Bei noch weiteren enthalten die Mikrobläschen als zweites Gas gasförmiges Perfluorbutan und Perfluorhexan in einem Verhältnis von etwa 1:10 bis etwa 10:1. Als Alternative enthalten die Mikrobläschen als zweites Gas gasförmiges Perfluorbutan und Perfluorpentan in einem Verhältnis von etwa 1:10 bis etwa 10:1. Es ist vorteilhaft, daß das zweite Gas das Mikrobläschen viel langsamer verläßt als das erste Gas; somit wird bevorzugt, daß das zweite Gas eine Wasserlöslichkeit hat, die nicht größer ist als etwa 0,5 mM bei 25°C und eine Atmosphäre hat, und das erste Gas hat eine Wasserlöslichkeit, die von mindestens etwa 10 mal und vorzugsweise mindestens 20, 50, 100 oder 200 mal größer ist als die des zweiten Gases. Ebenso wird bevorzugt, daß die Permeabilität der Membran des ersten Gases mindestens etwa 5 mal, vorzugsweise 10, 20, 50 oder 100 mal größer ist als die Permeabilität der Membran für das zweite Gas.
Das Mikrobläschenpräparat kann vorteilhafterweise in einem Behälter enthalten sein, wobei eine Flüssigkeit in dem Behälter als Beimischung zu den Mikrobläschen enthalten ist, wobei der Behälter ferner Einrichtungen zum Durchlassen einer ausreichenden Ultraschallenergie an die Flüssigkeit aufweist, um die Ausbildung der Mikrobläschen durch Beschallung zu ermöglichen. Auf diese Weise können die Mikrobläschen vom Arzt (oder von einem anderen Spezialisten) unmittelbar vor Verwendung durch Anwendung von Ultraschallenergie von einer äußeren Quelle auf das sterile Präparat im Behälter ausgebildet werden. Diese Einrichtung zum Durchlassen können beispielsweise ein flexibles Polymermaterial mit einer Dicke sein, die kleiner ist als etwa 0,5 mm (die ein leichtes Durchlassen der Ultraschallenergie ohne Überhitzung der Membran ermöglicht). Solche Membranen können aus solchen Polymeren wie etwa natürlicher oder synthetischer Kautschuk oder einem anderen Elastomer, Polytetrafluorethylen, Polyethylenterephthalat und dgl. hergestellt werden.
Bei den erfindungsgemäßen Mikrobläschenpräparaten ist die Membran, die das Gas einschließt, vorzugsweise ein Surfactant. Ein bevorzugter Surfactant-Typ ist u. a. ein nicht-newtonsches, viskoelastisches Surfactant, allein oder in Kombination mit einem anderen Surfactant. Weitere bevorzugte allgemeine und spezifische Surfactant-Kategorien sind u. a. Kohlehydrate, z. B. Polysaccharide, derivatisierte Kohlehydrate, z. B. Fettsäureester von Zuckerarten, z. B. Saccharose (vorzugsweise Saccharosestearat) und Protein-Surfactants, einschließlich Albumin. Als Alternative muß die Membran des Mikrobläschens kein Fluid sein (z. B. ein Surfactant), sondern kann statt dessen ein fester oder halbfester Stoff sein, z. B. ein gehärtetes, eingedicktes oder denaturiertes Proteinmaterial (z. B. Albumin), Kohlehydrate oder dgl.
Eine vorteilhafte Form der Erfindung ist ein Kit bzw. eine Ausstattung zur Verwendung bei der Zubereitung von Mikrobläschen, vorzugsweise am Ort der Verwendung. Diese Ausstattung kann einen verschlossener Behälter (z. B. eine Ampulle mit einem Trennwandverschluß zur einfachen Entnahme der Mikrobläschen unter Verwendung einer Injektionsspritze), eine Flüssigkeit im Behälter (z. B. Wasser oder ein gepuffertes, isotonisches, steriles wäßriges Medium), ein Surfactant im Behälter und ein Fluorkohlenwasserstoffgas (einschließlich eines Fluorkohlenwasserstoffdampfs) im Behälter umfassen, wobei die Flüssigkeit, das Surfactant und das Kohlenwasserstoffgas oder der Kohlenwasserstoffdampf zusammen geeignet sind, bei Zuführung von Energie Mikrobläschen auszubilden. Die Energie kann vorteilhafterweise einfach Schüttelbewegungsenergie, entweder manuell oder mechanisch, Rühren oder Schlagen oder Ultraschallenergie sein. Die Ausstattung bzw. das Kit weist vorzugsweise eine Einrichtung im Behälter auf, die das Durchlassen einer ausreichenden äußeren Ultraschallenergie zu der Flüssigkeit ermöglicht, um Mikrobläschen im Behälter auszubilden. Wie oben ausgeführt, kann die Einrichtung zum Durchlassen in einer Ausführungsform eine flexible Polymermembran mit einer Dicke von weniger als etwa 0,5 mm aufweisen. In einer Ausführungsform weist die Ausstattung ferner ein Nichtfluorkohlenwasserstoffgas im Behälter auf, wobei das Molverhältnis zwischen dem Nichtfluorkohlenwasserstoffgas und dem Fluorkohlenwasserstoffgas etwa 1:10 bis etwa 1000:1 beträgt, unter der Bedingung, daß das Nichtfluorkohlenwasserstoffgas kein Wasserdampf ist. Bei allen erfindungsgemäßen Ausstattungen können das Surfactant, das Gas oder die Gase und die anderen Elemente der Ausstattung in bestimmten Ausführungsformen die gleichen sein, wie oben für das Mikrobläschenpräparat an sich ausgeführt.
In einer weiteren Ausführungsform weist die Ausstattung auf: einen Behälter, getrocknete flüssigkeitslösliche hohlraumhaltige Strukturen im Behälter, wobei die flüssigkeitshaltigen Strukturen mehrere Hohlräume mit einem mittleren Durchmesser bilden, der kleiner ist als etwa 100 µm, ein Gas in den Hohlräumen und ein Surfactant, wobei die hohlraumhaltigen Strukturen, das Gas und der Surfactant zusammen geeignet sind, bei Zuführung einer Flüssigkeit in den Behälter, in der hohlraumhaltige Strukturen löslich sind, Mikrobläschen auszubilden. Die hohlraumhaltigen Strukturen können zumindest teilweise aus dem Surfactant hergestellt werden, z. B. durch Gefriertrocknung des hohlraumbildenden Materials oder durch Sprühtrocknung, oder können aus einem beliebigen anderen flüssigkeitslöslichen (vorzugsweise wasserlöslichen) filmbildenden Material, z. B. Albumin, Enzyme oder andere Proteine, einfache oder komplexe Kohlehydrate oder Polysaccharide und dgl. ausgebildet werden. Die Surfactants, die in der Ausstattung verwendet werden, können vorteilhaft diejenigen sein, die oben in Verbindung mit den Mikrobläschenpräparaten an sich beschrieben worden sind.
Die Erfindung weist auch ein Verfahren zur Ausbildung von Mikrobläschen auf, mit den folgenden Schritten: Bereitstellen eines ersten Gases, eines zweiten Gases, eines membranbildenden Materials und einer Flüssigkeit, wobei das erste Gas und das zweite Gas in einem Molverhältnis von etwa 1:100 bis etwa 1000:1 vorhanden sind und wobei das erste Gas bei 37°C einen Dampfdruck von mindestens etwa (760 – x) mm Hg hat, wobei x der Dampfdruck des zweiten Gases bei 37°C ist und wobei der Dampfdruck des ersten und zweiten Gases bei 37°C größer ist als 75 mm Hg unter der Bedingung, daß das erste Gas und das zweite Gas kein Wasserdampf sind und das erste und das zweite Gas mit dem membranbildenden Material umgeben sind, um Mikrobläschen in der Flüssigkeit zu bilden. Die membranbildenden Materialien und Gase können die sein, die oben beschrieben sind. Das Verfahren weist vorzugsweise ferner die folgenden Schritte auf: anfängliches Ausbilden von Mikrobläschen mit einem ersten mittleren Durchmesser, wobei das anfängliche Verhältnis zwischen dem ersten Gas und dem zweiten Gas in den Mikrobläschen mindestens etwa 1:1 ist, Kontaktieren der Mikrobläschen mit einem ersten mittleren Durchmesser mit einem flüssigen Medium, Schrumpfen der Mikrobläschen im Medium infolge des Verlustes des ersten Gases durch die Membran und anschließendes Stabilisieren der Mikrobläschen bei einem zweiten mittleren Durchmesser von weniger als etwa 75% des ersten Durchmessers für eine Zeitspanne von mindestens einer Minute. Vorzugsweise werden die Mikrobläschen bei dem zweiten Durchmesser durch Bereitstellen einer Osmosegasdifferenz durch die Membran stabilisiert, so daß die Spannung des im Medium gelösten Gases oder der Gase größer oder gleich dem Druck des gleichen Gases oder der Gase in den Mikrobläschen ist. In einer Ausführungsform ist der erste Durchmesser mindestens etwa 5 µm.
Die Erfindung weist auch ein Verfahren zur Ausbildung von Mikrobläschen mit den folgenden Schritten auf: Bereitstellen von getrockneten, flüssigkeitslöslichen, hohlraumhaltigen Strukturen, wobei die hohlraumhaltigen Strukturen eine Vielzahl von Hohlräumen mit einem Durchmesser bilden, der kleiner ist als etwa 100 µm, Bereitstellen eines Gases in den Hohlräumen, Bereitstellen eines Surfactants, Kombinieren der hohlraumhaltigen Strukturen, des Gases, des Surfactants und einer Flüssigkeit miteinander, in der die hohlraumhaltigen Strukturen löslich sind, und Lösen der hohlraumhaltigen Strukturen in der Flüssigkeit, so daß das Gas in den eingeschlossenen Räumen Mikrobläschen bildet, die vom Surfactant umgeben sind. Wie bei der Ausstattung werden bevorzugte hohlraumhaltige Strukturen aus Protein, Surfactant, Kohlehydrat oder einem beliebigen anderen der oben beschrieben Materialien ausgebildet.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung von Mikrobläschen mit einer erhöhten Lagerungsstabilität mit den folgenden Schritten: Sprühtrocknen einer flüssigen Formulierung eines biokompatiblen Materials, um daraus hohle Mikrokugeln zu erzeugen, Durchdringen der Mikrokugeln mit einem Osmosegasmittel (dem zweiten Gas), das mit dem ersten Gas gemischt ist, und Speichern der Mikrokugeln in einem Behälter mit dem Gasgemisch und anschließendes Hinzusetzen einer wäßrigen Phase zu dem Pulver, wobei das Pulver die wäßrige Phase löst, um das Gasgemisch in einer flüssigen Surfactant-Membran einzuschließen, um Mikrobläschen zu bilden. In einer Ausführungsform weist die Mikrokugel eine Stärke oder ein Stärkederivat mit einem Molekulargewicht von mehr als etwa 500 000 oder einem Dextrose-Äquivalenzwert von weniger als etwa 12 auf. Ein bevorzugtes Stärkederivat ist Hydroxyethylstärke. Das Osmosegasmittel weist einen Perfluorkohlenwasserstoff auf, ausgewählt aus der Gruppe Perfluorpropane C₃F₈, Perfluorbutane C₄F₁₀, Perfluorpentane C₅F₁₂, Perfluorcyclopentane C₅F₁₀, Perfluormethylcyclobutane C₅F₁₀, Perfluorhexane C₆F₁₄, Perfluorcyclohexane C₆F₁₂, Perfluormethylcyclopentane C₆F₁₂, Perfluordimethylcyclobutane C₆F₁₂. In einer weiteren Ausführungsform weist das Mikrokügelchen ein Zuckerester mit einer Komponente mit einem hydrophil-lipophilen Gleichgewicht von weniger als etwa 8 auf. Vorzugsweise ist der Zuckerester Saccharosetristearat.
Die Erfindung weist auch ein Verfahren zur Ausbildung von Mikrobläschen mit den folgenden Schritten auf: Bereitstellung eines mit einem Osmosegasmittel durchsetzten Surfactant-Pulvers und Kombinieren des Pulvers mit einer wäßrigen Phase.
Noch ein weiterer Aspekt der Erfindung ist ein Verfahren zur Erhöhung der Halbwertzeit der Mikrobläschen im lebenden Organismus, mit den folgenden Schritten: Bereitstellen einer sprühgetrockneten Formulierung in Kombination mit einem Osmosegasmittel, das die Formulierung durchdringt, und Kombinieren der Formulierung mit einer wäßrigen Phase, um Mikrobläschen mit einer Halbwertzeit im lebenden Organismus von mindestens etwa 20 s zu bilden. In bevorzugten Ausführungen weist die sprühgetrocknete Formulierung eine Stärke oder ein Stärkederivat auf, und das Zuckerester ist Saccharosetristearat.
Die Erfindung weist auch die Verwendung eines stabilisierten, flüssigen Mikrobläschenpräparats zur Herstellung eines Diagnosemittels zur bildlichen Darstellung eines Objekts oder Körpers mit den folgenden Schritten auf: Einführen irgendeines der oben erwähnten Mikrobläschenpräparate in das Objekt oder den Körper und anschließende Ultraschallbildgewinnung zumindest eines Teils des Objekts oder Körpers. Vorzugsweise ist der Körper ein Wirbeltier, und das Präparat wird in die Gefäße des Wirbeltiers eingeleitet. Das Verfahren kann ferner die Schritte aufweisen: Herstellen der Mikrobläschen auf eine der oben erwähnten Weise vor Einleitung in das Lebewesen.
Eine weitere Ausführungsform der Erfindung ist ein mit einem stabilisierten Gas gefülltes Mikrobläschenpräparat mit:
einem Behälter; und
einem im Behälter befindlichen Gemisch aus einem ersten Gas oder Gasen und einem zweiten Gas oder Gasen innerhalb von im allgemeinen kugelförmigen Membranen, um Mikrobläschen zu bilden, wobei das erste Gas und das zweite Gas jeweils in einem Molverhältnis von etwa 1:100 bis etwa 1000:1 vorhanden sind und wobei das erste Gas einen Dampfdruck von mindestens etwa (760 – x) mm Hg bei 37°C hat, wobei x der Dampfdruck des zweiten Gases bei 37°C ist und wobei der Dampfdruck des ersten und zweiten Gases bei 37°C größer ist als etwa 75 mm Hg unter der Bedingung, daß das erste Gas und das zweite Gas kein Wasserdampf sind.
Das erste Gas weist einen Fluorkohlenwasserstoff auf, ausgewählt aus der Gruppe Perfluorpropane C₃F₈, Perfluorbutane C₄F₁₀, Perfluorpentane C₅F₁₂, Perfluorcyclopentane C₅F₁₀, Perfluormethylcyclobutane C₅F₁₀, Perfluorhexane C₆F₁₄, Perfluorcyclohexane C₆F₁₂, Perfluormethylcyclopentane C₆F₁₂, Perfluordimethylcyclobutane C₆F₁₂, und das erste Gas ist ein Nichtfluorkohlenwasserstoff, ausgewählt aus der Gruppe Stickstoff, Sauerstoff, Kohlendioxid und Gemischen daraus. Vorzugsweise weist das erste Gas Stickstoff, Sauerstoff, Kohlendioxid oder Gemische daraus auf. Die Erfindung weist ferner das oben erwähnte Präparat auf, wobei:
die Mikrobläschen in einem flüssigen Medium sind und einen ersten mittleren Durchmesser haben;
das Verhältnis zwischen dem ersten Gas und dem zweiten Gas in den Mikrobläschen mindestens 1:1 ist; und
die Mikrobläschen geeignet sind, infolge des Verlustes des ersten Gases durch die Membran auf einen zweiten mittleren Durchmesser von weniger als etwa 75% des ersten Durchmessers im Medium zu schrumpfen und dann infolge der Osmosegasdruckdifferenz durch die Membran bei oder etwa bei dem zweiten Durchmesser für mindestens etwa 1 min stabilisiert zu bleiben. Vorteilhafterweise ist das Medium wäßrig. In einer alternativen Ausführungsform ist das Medium in einem Behälter, und die Mikrobläschen sind in dem Behälter ausgebildet worden. Vorzugsweise ist das Medium Blut im lebenden Organismus. Unter einem weiteren Aspekt dieser bevorzugten Ausführungsform enthält das flüssige Medium in ihm gelöstes Gas oder Gase mit einer Gasspannung von mindestens etwa 700 mm Hg, wobei der erste Durchmesser mindestens etwa 5 µm ist und wobei die Spannung des im Medium gelösten Gases oder der Gase kleiner ist als der Druck des gleichen Gases oder der Gase im Mikrobläschen. Vorzugsweise ist der erste Durchmesser mindestens etwa 10 µm, und der zweite Durchmesser ist zwischen etwa 1 und 6 µm. Unter einem weiteren Aspekt der Erfindung hat das zweite Gas ein mittleres Molekulargewicht von mindestens etwa dem 4-fachen des Molekulargewichts des ersten Gases. Vorteilhafterweise hat das zweite Gas bei 37°C einen Dampfdruck von weniger als etwa 750 mm Hg, und das Verhältnis zwischen dem ersten Gas und dem zweiten Gas ist etwa 1:10 bis etwa 500:1. Das zweite Gas weist Fluorkohlenwasserstoff auf, ausgewählt aus der Gruppe Perfluorpropane C₃F₈, Perfluorbutane C₄F₁₀, Perfluorpentane C₅F₁₂, Perfluorcyclopentane C₅F₁₀, Perfluormethylcyclobutane C₅F₁₀, Perfluorhexane C₆F₁₄, Perfluorcyclohexane C₆F₁₂, Perfluormethylcyclopentane C₆F₁₂, Perfluordimethylcyclobutane C₆F₁₂, und das erste Gas ist ein Nichtfluorkohlenwasserstoff, ausgewählt aus der Gruppe Stickstoff, Sauerstoff, Kohlendioxid und Gemischen daraus. Als Alternative kann das zweite Gas mindestens zwei Fluorkohlenwasserstoffe oder einen Perfluorkohlenwasserstoff aufweisen, ausgewählt aus der Gruppe Perfluorpropane C3F8, Perfluorbutane C4F10, Perfluorpentane C5F12, Perfluorcyclopentane C5F10, Perfluormethylcyclobutane C5F10, Perfluorhexane C6F14, Perfluorcyclohexane C6F12, Perfluormethylcyclopentane C6F12, Perfluordimethylcyclobutane C6F12. Unter einem weiteren Aspekt der Erfindung enthalten die Mikrobläschen als das zweite Gas gasförmiges Perfluorbutan und Perfluorhexan in einem Verhältnis von etwa 1:10 bis etwa 10:1. Unter einem weiteren Aspekt der Erfindung enthalten die Mikrobläschen als das zweite Gas gasförmiges Perfluorbutan und Perfluorpentan in einem Verhältnis von etwa 1:10 bis etwa 10:1. Gemäß einem weiteren Aspekt der Erfindung hat das zweite Gas bei 25°C und einer Atmosphäre eine Wasserlöslichkeit von nicht mehr als etwa 0,5 mM, und das erste Gas hat eine Wasserlöslichkeit, die mindestens 10-mal größer ist als die des zweiten Gases. Vorzugsweise ist die Permeabilität der Membran für das erste Gas mindestens etwa 5-mal größer als die Permeabilität der Membran für das zweite Gas. Gemäß einem weiteren Aspekt der Erfindung weist das Präparat ferner eine Flüssigkeit im Behälter als Beimischung zu den Mikrobläschen auf, wobei der Behälter ferner eine Einrichtung zum Durchlassen einer ausreichenden Ultraschallenergie auf die Flüssigkeit aufweist, damit die Formulierung der Mikrobläschen durch Beschallung möglich wird. Vorteilhafterweise weist die Einrichtung zum Durchlassen ein flexibles Polymermaterial mit einer Dicke von weniger als etwa 0,5 mm auf. Vorzugsweise ist die Membran ein Surfactant; besonders bevorzugt weist das Surfactant ein nicht-newtonsches, viskoelastisches oder Kohlehydrat-Surfactant auf. Das Kohlehydrat ist vorzugsweise ein Polysaccharid. In alternativen Ausführungsformen ist das Surfactant ein Fettsäureester eines Zuckers; vorzugsweise ist es Saccharosestearat. In einer alternativen Ausführungsform ist das Surfactant proteinhaltig. Gemäß einem weiteren Aspekt der Erfindung ist die Membran fest oder halbfest; vorteilhafterweise ist sie ein proteinhaltiges Material. Das proteinhaltige Material ist vorzugsweise Albumin.
Kurzbeschreibung der Zeichnungen
1 ist eine perspektivische Ansicht einer Zweikammer-Ampulle, die ein mikrobläschenbildendes Präparat enthält, mit einer wäßrigen Lösung in einer oberen Kammer und festen und gasförmigen Bestandteilen in einer unteren Kammer.
2 stellt die Ampulle aus 1 dar, wobei die wäßrige Lösung mit den festen Bestandteilen gemischt worden ist, um die Mikrobläschen zur Verabreichung an einen Patienten zu bilden.
3 ist eine perspektivische Ansicht einer umgekehrten Zweikammer-Ampulle, die ein mikrobläschenbildendes Präparat enthält, mit einer wäßrigen Lösung in der unteren Kammer und festen und gasförmigen Bestandteilen in der oberen Kammer.
4 stellt die Ampulle aus 3 dar, wobei die wäßrige Lösung mit den festen Bestandteilen gemischt worden ist, um Mikrobläschen zur Verabreichung an einen Patienten zu bilden.
Ausführliche Beschreibung der Erfindung
Die Begriffe ”Dampf” und ”Gas”, wie sie in der Beschreibung und in den Ansprüchen verwendet werden, sind austauschbar. Ebenso ist, wenn auf die Spannung des gelösten Gases in einer Flüssigkeit Bezug genommen wird, der gebräuchlichere Begriff ”Druck” mit ”Spannung” austauschbar. ”Osmosegasdruck” ist nachstehend ausführlicher definiert, aber in einer einfachen Annäherung kann man davon ausgehen, daß es sich um die Differenz zwischen dem Partialdruck eines Gases in einem Mikrobläschen und dem Druck oder der Spannung dieses Gases (entweder in einer Gasphase oder gelöst in einer Flüssigphase) außerhalb des Mikrobläschens handelt, wenn die Mikrobläschenmembran für das Gas durchlässig ist. Im einzelnen handelt es sich um Differenzen der Gastdiffusionsgeschwindigkeiten durch die Membran. Der Begriff ”Membran” bedeutet Material, das ein Mikrobläschen umgibt oder bildet, ganz gleich, ob es ein Surfactant, eine andere filmbildende Flüssigkeit oder ein filmbildender Feststoff oder halbfester Stoff ist. Als ”Mikrobläschen” gelten Bläschen mit einem Durchmesser zwischen etwa 0,5 und 300 µm, bevorzugt mit einem Durchmesser von nicht mehr als etwa 200, 100 oder 50 µm und zur intravaskulären Verwendung vorzugsweise nicht mehr als etwa 10, 8, 7, 6 oder 5 µm (gemessen als anzahlmittelgewichteter Durchmesser des Mikrobläschenaufbaus). Wenn von ”Gas” die Rede ist, versteht es sich, daß Gemische von Gasen, die die entsprechende Eigenschaft haben, unter die Definition fallen, außer wenn der Kontext etwas anderes erfordert. Luft kann also normalerweise hier als ”Gas” angesehen werden.
Die Erfindung stellt Mikrobläschen bereit, die eine verlängerte Lebensdauer im lebenden Organismus haben, die zur Verwendung als Ultraschall- oder Magnetresonanzbildgewinnungs-(MRI-)Kontrastverbesserungsmittel geeignet sind. Typische Ultraschallkontrastverbesserungsmittel weisen ein Kontrastverbesserungspotential für nur etwa einen Durchlauf durch das Arteriensystem oder für wenige Sekunden bis zu einer Minute auf und existieren also nach einer intravenösen Injektion bei einem Patienten nicht mehr nach der Aorta. Im Vergleich dazu bieten Kontrastmittel, die erfindungsgemäß zubereitet sind, weiterhin Lebensdauern mit Kontrastverbesserungen, die nach intravenöser Injektion in mehreren Durchgängen durch den gesamten Kreislauf eines Patienten gemessen werden können. Die Lebensdauern der Bläschen von mehreren Minuten lassen sich ohne weiteres nachweisen. Eine solche Verlängerung des Kontrastverbesserungspotentials bei Ultraschall ist sehr vorteilhaft. Zusätzlich ermöglichen die erfindungsgemäßen Kontrastverbesserungsmittel eine bessere Bildgewinnung, z. B. werden deutlichere, lebendigere und unterscheidbare Bilder des Blutes, das durch das Herz, die Leber und die Nieren strömt, erreicht. Es können also kleine nichttoxische Dosen in eine periphere Vene verabreicht werden und verwendet werden, um Bilder des gesamten Körpers zu verbessern.
Wie im US-Patent 5 315 997 offenbart, haben Gase und Perfluorkohlenwasserstoffdämpfe magnetische Ansprechbarkeit, die sich wesentlich von Gewebe und Blut unterscheidet. Deshalb bewirken die erfindungsgemäßen Mikrobläschen während einer MRI Änderungen der in Geweben und im Blut vorhandenen lokalen Magnetfelder. Diese Änderungen können auf einem MRI-Bild wahrgenommen und verwendet werden, um das Vorhandensein eines Kontrastmittels zu erkennen. Das erfindungsgemäße Mittel ist im Blutpool länger stabil und ermöglicht daher längere, empfindlichere Abtastungen größerer Abschnitte des Körpers.
Bläschen sind zwar nachweislich die effektivsten Ultraschall-Strahlungsstreuer zur Verwendung bei intravenösen Ultraschallkontrastmitteln, ihr praktischer Hauptnachteil ist jedoch die extrem kurze Lebensdauer der kleinen Bläschen (mit Durchmesser von normalerweise weniger als 5 µm), die erforderlich sind, um in einer Suspension durch die Kapillaren zu strömen. Diese kurze Lebensdauer wird durch den erhöhten Gasdruck in den Bläschen bewirkt, der durch die Oberflächenspannungskräfte, die auf das Bläschen wirken, bedingt ist. Dieser erhöhte innere Druck erhöht sich, wenn sich der Durchmesser des Bläschens reduziert. Der erhöhte innere Gasdruck zwingt das Gas im Bläschen, sich zu lösen, was zu einer Zerstörung des Bläschens führt, wenn das Gas in eine Lösung gezwungen wird. Die Laplacesche Gleichung ΔP = 2γ/r (wobei ΔP der erhöhte Gasdruck im Bläschen, γ die Oberflächenspannung des Bläschenfilms und r der Radius des Bläschens ist) beschreibt den Druck, der durch die umgebende Bläschenoberfläche oder den Film auf ein Gasbläschen ausgeübt wird. Der Laplacesche Druck ist umgekehrt proportional zum Bläschenradius; wenn also das Bläschen schrumpft, erhöht sich der Laplacesche Druck, wobei die Diffusionsgeschwindigkeit des Gases aus dem Bläschen heraus und die Bläschenschrumpfgeschwindigkeit erhöht werden.
Es wurde überraschend festgestellt, daß Gase und Gasdampfgemische, die einen Osmosegasdruck gegen den Laplaceschen Druck ausüben können, das Kollabieren dieser Bläschen mit kleinem Durchmesser stark verlangsamen können. Im allgemeinen verwendet die Erfindung ein Primärmodifikationsgas oder Gasgemisch, das ein Osmosegasmittel zu einem Partialdruck abschwächt, der kleiner ist als der Dampfdruck des Osmosegasmittels, bis sich das Modifikationsgas mit den Gasen austauscht, die normalerweise in dem äußeren Medium vorhanden sind. Das/die Osmosegasmittel sind im allgemeinen relativ hydrophob und relativ bläschenmembranundurchdringlich und besitzen ferner die Fähigkeit, bei einem relativ niedrigen Dampfdruck einen Osmosegasdruck von mehr als 75 oder 100 Torr zu entwickeln.
Das erfindungsgemäße Verfahren betrifft den bekannten Osmoseeffekt, der in einem Dialysebeutel beobachtet wird, der einen gelösten Stoff enthält, der im wesentlichen membranundurchdringlich ist (z. B. PEG, Albumin, Polysaccharid, Stärke) und der in einer wäßrigen Lösung gelöst ist und einer äußeren Phase von reinem Wasser ausgesetzt wird. Der gelöste Stoff im Beutel verdünnt das Wasser im Beutel und reduziert so die Wasserdiffusionsgeschwindigkeit aus dem Beutel heraus relativ zur Diffusionsgeschwindigkeit des reinen Wassers (volle Konzentration) in den Beutel hinein. Das Volumen des Beutels dehnt sich aus, bis das Gleichgewicht bei einem erhöhten inneren Druck im Beutel hergestellt ist, der die nach außen gerichtete Wasserdiffusionsgeschwindigkeit erhöht, um die nach innen gerichtete Diffusionsgeschwindigkeit des reinen Wassers auszugleichen. Diese Druckdifferenz ist der Osmosedruck zwischen den Lösungen.
In dem oben beschriebenen System fällt der innere Druck langsam ab, während der gelöste Stoff langsam aus dem Beutel diffundiert, wobei sich die Konzentration des inneren gelösten Stoffs verringert. Weitere Materialien, die in der Lösung gelöst sind, die den Beutel umgibt, reduzieren diesen Druck weiter, und wenn sie effektiver sind oder eine höhere Konzentration haben, schrumpft der Beutel.
Es wurde beobachtet, daß Luftbläschen, die mit ausgewählten Perfluorkohlenwasserstoffen gesättigt sind, größer werden, statt zu schrumpfen, wenn sie der einer Flüssigkeit gelösten Luft ausgesetzt werden, infolge des Osmosegasdrucks, der durch den Perfluorkohlenwasserstoffdampf ausgeübt wird. Der Perfluorkohlenwasserstoffdampf ist relativ undurchlässig durch den Bläschenfilm und verbleibt somit im Bläschen. Die Luft im Bläschen wird durch den Perfluorkohlenwasserstoff verdünnt, was den Luftdiffusionsstrom aus dem Bläschen verlangsamt. Dieser Osmosegasdruck ist proportional zum Konzentrationsgradienten des Perfluorkohlenwasserstoffdampfes durch den Bläschenfilm, zur Konzentration der Luft, die das Bläschen umgibt, und zum Verhältnis zwischen der Bläschenfilm-Permeabilität von Luft und Perfluorkohlenwasserstoff.
Wie oben beschrieben, ist der Laplacesche Druck umgekehrt proportional zum Bläschenradius; wenn also das Bläschen schrumpft, erhöht sich der Laplacesche Druck, wobei sich die Diffusionsgeschwindigkeit des Gases aus dem Bläschen heraus und die Geschwindigkeit der Bläschenschrumpfung erhöht, und dies führt in bestimmten Fällen zur Kondensation und praktischem Verschwinden eines Gases im Bläschen, wenn der kombinierte Laplacesche und äußere Druck das Osmosemittel konzentrieren, bis sein Partialdruck den Dampfdruck des flüssigen Osmosemittels erreicht.
Wir haben festgestellt, daß herkömmliche Mikrobläschen, die ein einzelnes Gas enthalten, im Blut für eine Zeitspanne weiterbestehen, die in erster Linie abhängt vom arteriellen Druck, vom Bläschendurchmesser, von der Membranpermeabilität des Gases durch die Oberfläche des Bläschens, von der mechanischen Stärke der Oberfläche des Bläschens, dem Vorhandensein, dem Nichtvorhandensein und der Konzentration der Gase, die normalerweise im Blut oder Serum vorhanden sind, und von der Oberflächenspannung, die an der Oberfläche des Bläschens vorhanden ist (die in erster Linie vom Durchmesser des Bläschens und in zweiter Linie von der Identität und Konzentration der Surfactants abhängt, die die Oberfläche des Bläschens bilden). Jeder dieser Parameter steht mit jedem in Wechselbeziehung, und sie wirken im Bläschen zusammen, um die Zeitspanne zu bestimmen, die das Bläschen im Blut überdauert.
Die Erfindung weist die Feststellung auf, daß ein einzelnes Gas oder eine Kombination von Gasen gemeinsam die Struktur der Mikrobläschen, die diese mitreißen oder einschließen, stabilisieren kann. Im einzelnen benutzt die Erfindung ein erstes Gas oder Gase (ein ”Primärmodifikationsgas”), ausgewählt aus der Gruppe Stickstoff, Sauerstoff, Kohlendioxid und Gemischen daraus, das als Wahlmöglichkeit normalerweise im normalen Blut oder Serum in Kombination mit einem oder mehreren zusätzlichen zweiten Gasen (einem ”Osmosegasmittel oder -mitteln” oder einem ”Sekundärgas”), ausgewählt aus der Gruppe Perfluorpropane C3F8, Perfluorbutane C4F10, Perfluorpentane C5F12, Perfluorcyclopentane C5F10, Perfluormethylcyclobutane C5F10, Perfluorhexane C6F14, Perfluorcyclohexane C6F12, Perfluormethylcyclopentane C6F12, Perfluordimethylcyclobutane C6F12, vorhanden ist, die den Osmosedruck im Bläschen regulieren. Durch Regulierung des Osmosedrucks im Bläschen übt das Osmosegasmittel (hier definiert als einzelnes chemisches Objekt oder als Gemisch aus solchen) einen Druck im Bläschen aus, der zur Verhinderung des Druckverlusts beiträgt. Als Wahlmöglichkeit kann der Modifikator ein Gas sein, das normalerweise nicht im Blut oder Serum vorhanden ist. Das Modifikationsgas muß jedoch in der Lage sein, das/die Osmosegasmittel bei einem Partialdruck unter dem Dampfdruck des/der Osmosegasmittel(s) zu verdünnen oder beizubehalten, während die Gase im Blut oder einer anderen umgebenden Flüssigkeit in das Bläschen diffundieren. In einem wäßrigen Medium gilt Wasserdampf nicht als eines der in Frage kommenden ”Gase”. Wenn Mikrobläschen in einem nichtwäßrigen flüssigen Medium sind, gilt der Dampf dieses Mediums ebenfalls nicht als eines der ”Gase”.
Wir haben festgestellt, daß durch Zusatz eines Osmosegasmittels, das beispielsweise eine reduzierte Membranpermeabilität durch die Oberfläche des Bläschens oder eine reduzierte Löslichkeit in der äußeren Dispersionsphase-Flüssigphase hat, die Lebensdauer des dadurch entstehenden Bläschens radikal erhöht wird. Dieser stabilisierende Einfluß wird anhand einer Beschreibung bestimmter theoretischer Bläschen noch besser verständlich. Zunächst betrachten wir die Auswirkungen des arteriellen Drucks und der Oberflächenspannung auf ein hypothetisches Mikrobläschen, das nur Luft enthält.
Zunächst wird ein hypothetisches Bläschen, das nur Luft enthält, zubereitet. Zu Beschreibungszwecken wird zunächst davon ausgegangen, daß dieses Bläschen keinen Laplaceschen Druck hat. Im Gleichgewichtszustand bei Standardtemperatur und Standarddruck (STP) hat es im allgemeinen einen inneren Luftdruck von 760 Torr, und die Luftkonzentration des umgebenden Fluids ist ausgeglichen bei 760 Torr (d. h. das Fluid hat eine Luftspannung von 760 Torr). Ein solches Bläschen schrumpft nicht und wächst nicht.
Wenn als nächstes das oben beschriebene hypothetische Bläschen in das künstliche System eingeführt wird, ist der Partialdruck der Luft (oder die Luftspannung) im Blut (der Luftdruck, bei dem das Blut mit Luft gesättigt war) auch annähernd 760 Torr, und es besteht ein arterieller Druck (zum Zwecke der vorliegenden Beschreibung bei 100 Torr). Diese Gesamtsumme ergibt einen äußeren Druck auf dem Bläschen von 860 Torr und bewirkt, daß die Gase im Bläschen komprimiert werden, bis der innere Druck auf 860 Torr ansteigt. Dann entsteht eine Differenz von 100 Torr zwischen dem Luftdruck im Bläschen und der Luftspannung des Fluids, das das Bläschen umgibt. Diese Druckdifferenz bewirkt, daß Luft durch seine luftdurchlässige Oberflächenmembran aus dem Bläschen herausdiffundiert, was bewirkt, daß das Bläschen schrumpft (d. h. Luft verliert), wenn es das Gleichgewicht zu erreichen versucht. Das Bläschen schrumpft, bis es verschwindet.
Als nächstes betrachten wir die zusätzliche und realistischere Auswirkung auf das hypothetische Bläschen, wenn die Oberflächenspannung des Bläschens dazukommt. Die Oberflächenspannung des Bläschens führt zu einem Laplaceschen Druck, der auf das Gas im Bläschen ausgeübt wird. Der Gesamtdruck, der auf das Gas im Bläschen ausgeübt wird, wird dadurch berechnet, daß die Summe aus atmosphärischem Druck, arteriellem Druck und Laplaceschem Druck gebildet wird. In einem 3 µm großen Bläschen ist mit wohl ausgewählten Surfactants eine Oberflächenspannung von 10 Dyn/cm erreichbar. Der Laplacesche Druck, der auf das hypothetische 3 µm große Bläschen ausgeübt wird, ist also annähernd 100 Torr, und außerdem wird der arterielle Druck von 100 Torr ebenfalls auf das Bläschen ausgeübt. Daher ist der äußere Gesamtdruck, der auf das Gas im Bläschen wirkt, 960 Torr.
Das Bläschen wird komprimiert, bis der Druck der Luft im Bläschen auf 960 Torr steigt. Demzufolge entsteht eine Konzentrationsdifferenz von 200 Torr zwischen der Luft im Bläschen und der Luft, die im Blut gelöst ist. Deshalb schrumpft das Bläschen schnell und verschwindet sogar noch schneller, als es dies im vorherigen Falle tat, während es versucht, das Gleichgewicht zu erreichen.
Die erfindungsgemäße Feststellung wird dadurch veranschaulicht, daß ein drittes hypothetisches Mikrobläschen betrachtet wird, das Luft und ein Osmosegasmittel oder ein zweites Gas enthält. Es wird angenommen, daß ein theoretisches Bläschen, das anfangs keinen arteriellen Druck und keinen Laplaceschen Druck hat, zubereitet wird, das einen Gesamtdruck von 760 Torr hat, der durch Luft bei einem Partialdruck von 684 Torr und ein Perfluorkohlenwasserstoff (”PFC”) als Osmosegasmittel bei einem Partialdruck von 76 Torr gegeben ist. Ferner wird angenommen, daß der Perfluorkohlenwasserstoff so gewählt ist, daß er eine oder mehrere Eigenschaften hat, die ihn in die Lage versetzen, als geeignetes Osmosegasmittel zu wirken, z. B. eine begrenzte Bläschenmembranpermeabilität oder eine begrenzte Löslichkeit in der äußeren Flüssigphase. Es besteht eine anfängliche Osmosegasdruckdifferenz zwischen den 684 Torr Luft im Bläschen und den 760 Torr Luftspannung von 76 Torr außerhalb des Bläschens (wenn wir von STP ausgehen). Diese 76 Torr anfängliche Druckdifferenz ist der anfängliche Osmosegasdruck und bewirkt, daß sich das Bläschen ausdehnt. Luft von außerhalb des Bläschens diffundiert in das Bläschen und bläst es auf, angetrieben von der Osmosedruckdifferenz, wie wenn Wasser in einen Dialysebeutel diffundiert, der eine Stärkelösung enthält und den Beutel auffüllt.
Der maximale Osmosegasdruck, den dieses Gasgemisch entwickeln kann, hängt mit dem Partialdruck des PFC und dem Verhältnis zwischen der Permeabilität des PFC und der Permeabilität der Luft im umgebenden Fluid zusammen. Theoretisch und wie experimentell beobachtet, wird das Bläschen unendlich groß, wenn das System versucht, osmotisches Gleichgewicht zwischen der Konzentration der Luft (die dem Partialdruck der Luft äquivalent ist) im Bläschen und der Konzentration der Luft, die das Bläschen umgibt (die Luftspannung), zu erreichen.
Wenn das hypothetische Mischgasbläschen einem arteriellen Druck von 100 Torr ausgesetzt ist, wo das Blut eine gelöste Luftspannung von 760 Torr hat, ist der äußere Gesamtdruck gleich 860 Torr (760 Torr atmosphärischer Druck und 100 Torr arterieller Druck). Das Bläschen wird unter dem arteriellen Druck komprimiert, was bewirkt, daß der innere Druck des Bläschens 860 Torr erreicht. Der Partialdruck der Luft steigt auf 774 Torr, und der Partialdruck des PFC (des zweiten Gases) steigt auf 86 Torr. Die Luft diffundiert aus dem Bläschen heraus, bis sie das osmotische Gleichgewicht mit der Luft erreicht, die im Blut gelöst ist (d. h. 760 Torr), und der Partialdruck des PFC steigt auf 100 Torr. Der Partialdruck des PFC gleicht den Druck aus, der durch arteriellen Druck ausgeübt wird, stoppt die Schrumpfung des Bläschens in jedem Fall, wobei angenommen wird, daß die Permeabilität des Bläschens für den PFC vernachlässigbar ist.
Wenn die Oberflächenspannung oder die Laplacesche Druckkomponente von 100 Torr hinzukommt (wie oben bei dem Luftbläschen beschrieben), wird insgesamt ein zusätzlicher Druck von 200 Torr auf das Gas im Bläschen ausgeübt. Wiederum wird das Bläschen komprimiert, bis der Druck im Bläschen auf 960 Torr (Partialdruck der Luft 864 und Partialdruck des PFC 96) steigt. Die Luft diffundiert aus dem Bläschen, bis sie 760 Torr erreicht (im Gleichgewicht mit der Konzentration der Luft, die im Blut gelöst ist), und der Partialdruck des PFC steigt auf 200 Torr, wobei wiederum der Osmosegasdruck, der durch den PFC ausgelöst wird, den Druck ausgleicht, der durch den Laplaceschen Druck und den arteriellen Druck ausgeübt wird, wobei wiederum angenommen wird, daß die Permeabilität der Membran des Bläschens für den PFC vernachlässigbar ist.
Wenn der Partialdruck der Luft im Bläschen kleiner ist als die Luftspannung der umgebenden Flüssigkeit, wird das Bläschen tatsächlich ebenfalls größer, bis der PFC ausreichend durch eintreffende Luft verdünnt wird, so daß der Luftdruck im Bläschen und die Luftspannung außerhalb des Bläschens identisch sind.
Die Bläschen können also durch die Verwendung von Kombinationen von Gasen effektiv stabilisiert werden, da die richtige Kombination der Gase zu einer Osmosegasdruckdifferenz führt, die genutzt werden kann, um diese Auswirkungen des Laplaceschen Drucks und des arteriellen Drucks auszugleichen, der auf das Gas im Bläschen im zirkulierenden Blut ausgeübt wird.
Beispiele für bestimmte Anwendungen der erfindungsgemäßen Mikrobläschen sind u. a. Bildgewinnung der Perfusion des Herzens, des Myokardgewebes und die Bestimmung von Perfusionscharakteristiken des Herzens und seines Gewebes bei Belastungs- oder köperlichen Betätigungsversuchen oder Perfusionsdefekten oder Veränderungen infolge von Myokardinfarkt. Ebenso kann Myokardgewebe nach oraler oder venösen Verabreichung von Medikamenten, die dazu bestimmt sind, den Blutstrom in einem Gewebe zu erhöhen, sichtbar gemacht werden. Ebenso kann die Visualisierung von Änderungen des Myokardgewebes nach oder während verschiedener Eingriffe verbessert werden, z. B. bei Koronargewebe-Venentransplantation, Koronarangioplastik oder bei Verwendung von thrombozytischen Mitteln (TPA oder Streptokinase). Da diese Kontrastmittel bequem über eine periphere Vene verabreicht werden können, um die Visualisierung des gesamten Kreislaufsystems zu verbessern, tragen sie auch zur Diagnose allgemeiner Gefäßerkrankungen und zur Überwachung der Lebensfähigkeit von Plazentagewebe durch Ultraschall bei.
Es muß jedoch betont werden, daß diese Prinzipien über die Ultraschallbildgewinnung hinaus Anwendungsmöglichkeiten haben. Tatsächlich ist die Erfindung so breit angelegt, daß sie die Verwendung des Osmosegasdrucks zur Stabilisierung von Bläschen zur Verwendung in beliebigen Systemen, einschließlich nichtbiologischer Anwendungen, einschließt.
In einer bevorzugten Ausführungsform haben die erfindungsgemäßen Mikrobläschen eine auf Surfactants beruhende Bläschenmembran. Die Prinzipien der Erfindung können jedoch auch angewendet werden, um Mikrobläschen praktisch jedes Typs zu stabilisieren. Mischgase oder -dämpfe des oben beschriebenen Typs können also albuminbasierte Bläschen, polysaccharidbasierte Mikrobläschen, von sprühgetrockneten Mikrokügelchen abgeleitete Bläschen und dgl. stabilisieren. Dieses Ergebnis wird durch den Einschluß einer Kombination von Gasen in dem gewählten Mikrobläschen erreicht, vorzugsweise eines Primärmodifikationsgases oder Gasgemischs, das ein Osmosegasmittel zu einem Partialdruck verdünnt, der kleiner ist als der Dampfdruck des Osmosegasmittels, bis sich das Modifikationsgas mit Gasen, die normalerweise in dem äußeren Medium vorhanden sind, austauscht. Das/die Osmosegasmittel sind im allgemeinen relativ hydrophob und relativ bläschenmembranundurchdringlich und besitzen auch ferner die Fähigkeit, Osmosegasdrücke zu entwickeln, die größer sind als 50, 75 oder 100 Torr. In einer bevorzugten Ausführungsform ist der Gasdruck des Osmosegasmittels bei 37°C vorzugsweise kleiner als etwa 760 Torr, besonders bevorzugt kleiner als etwa 750, 740, 730, 720, 710 oder 700 Torr und in bestimmten Ausführungen kleiner als etwa 650, 600, 500 oder 400 Torr. In bevorzugten Ausführungsformen ist der Dampfdruck des Primärmodifikationsgases bei 37°C mindestens 660 Torr, und der Dampfdruck des Osmosegasmittels ist bei 37°C mindestens 100 Torr. Bei der Bildgewinnung im lebenden Organismus sind mittlere Bläschendurchmesser zwischen 1 und 10 µm bevorzugt, 3 bis 5 µm besonders bevorzugt sind. Die Erfindung kann in einer Ausführungsform auch als Gemisch aus einem ersten Gas oder Gasen und einem zweiten Gas oder Gasen innerhalb von im allgemeinen kugelförmigen Membranen beschrieben werden, um Mikrobläschen zu bilden, wobei das erste Gas und das zweite Gas jeweils in einem Molverhältnis von etwa 1:100, 1:75, 1:50, 1:30, 1:20 oder 1:10 bis etwa 1000:1, 500:1, 250:1, 100:1, 75:1 oder 50:1 vorhanden sind und wobei das erste Gas bei 37°C einen Dampfdruck von mindestens etwa (760 – x) mm Hg hat, wobei x der Dampfdruck des zweiten Gases bei 37°C ist und wobei der Dampfdruck des ersten und des zweiten Gases bei 37°C größer ist als etwa 75 oder 100 mm Hg.
Mikrobläschen, die gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung zubereitet sind, können auch eine zusätzliche vorteilhafte Eigenschaft aufweisen. In einer solchen Ausführungsform werden Gemische von nichtosmotischen Gasen mit stabilisierenden Osmosegasen (oder Osmosegasmitteln) verwendet, um die resultierende Bläschengrößenverteilung während und unmittelbar nach der Herstellung zu stabilisieren. Bei der Erzeugung der Bläschen bewirkt der höhere Laplacesche Druck in kleineren Bläschen eine Diffusion durch die Flüssigphase in die größeren Bläschen mit niedrigerem Laplaceschen Druck. Dies bewirkt, daß die mittlere Größenverteilung mit der Zeit über die Kapillargrößengrenze von 5 µm steigt. Dies wird als Disproportionierung bezeichnet. Wenn ein Gemisch eines nichtosmotischen Gases (z. B. Luft) mit einem osmotischen Dampf (z. B. C₆F₁₄) verwendet wird, wird durch eine geringfügige Reduktion des Volumens der kleineren Bläschen dadurch, daß Luft das Bläschen verläßt, das osmotische Gas konzentriert und sein osmotischer Druck erhöht, wobei eine weitere Schrumpfung verzögert wird, während das Volumen der größeren Bläschen geringfügig zunimmt, wobei das Osmosegas verdünnt und das weitere Wachstum verzögert wird.
Ein zusätzlicher Vorteil der Verwendung eines Gemischs aus extrem blutlöslichen Gasen (z. B. 87,5 Vol.-% CO₂) und einem Osmosegasgemisch (z. B. 28% C₆F₁₄-Dampf + 72% Luft) ist gegeben, wenn diese Bläschen nach Injektion infolge der Abgabe von CO₂ an das Blut schnell schrumpfen. Die Bläschen erfahren nach der Injektion infolge des Verlustes an CO₂ eine Verringerung des Volumens um 87,5%. Dieser Verlust an CO₂ entspricht einer Halbierung des Bläschendurchmessers. Demzufolge kann man Bläschen mit größerem Durchmesser (z. B. 9 µm) unter Verwendung einfacher mechanischer Mittel zubereiten, die die Bläschen nach Injektion auf unter 5 µm schrumpfen lassen. Im allgemeinen werden solche Bläschen anfänglich zubereitet, wenn das erste Gas in einem Verhältnis von mindestens 1:1 in bezug auf das zweite Gas vorhanden ist, vorzugsweise mindestens 3:2, 2:1, 3:1, 4:1, 5:1 oder 10:1. Wenn die Mikrobläschenmembran durchlässiger ist für das erste Gas als für das zweite Gas (z. B. wenn die Membran entsprechende Permeabilitäten für die Gase in einem Verhältnis von mindestens etwa 2:1, 3:1, 4:1, 5:1 oder 10:1 hat, vorzugsweise noch höher, z. B. 20:1, 40:1 oder 100:1) hat, schrumpfen die Bläschen vorteilhafterweise von ihrem ursprünglichen ersten Durchmesser sehr schnell (z. B. innerhalb von 1, 2, 4 oder 5 min) auf einen mittleren zweiten Durchmesser, der 75% oder weniger ihres ursprünglichen Durchmessers beträgt. Wenn mindestens ein relativ membrandurchlässiges Gas im wäßrigen Medium vorhanden ist, das das Mikrobläschen umgibt, wird das Bläschen vorzugsweise für mindestens etwa 1 min, vorzugsweise 2, 3, 4 oder 5 min bei oder etwa bei dem zweiten Durchmesser stabilisiert. In einer bevorzugten Ausführungsform behalten die Bläschen für mindestens 1, 2, 3, 4 oder 5 min eine Größe zwischen etwa 5 oder 6 µm und 1 µm, stabilisiert durch eine Osmosegasdruckdifferenz. Die Gasspannung in der äußeren Flüssigkeit ist vorzugsweise mindestens etwa 700 mm Hg. Außerdem ist ein relativ membranundurchdringliches Gas auch im Mikrobläschen vorhanden, um eine solche Osmosedruckdifferenz zu erzeugen.
I. Aufbau der Mikrobläschen
A. Die membranbildende Flüssigphase
Die äußere, kontinuierliche Flüssigphase, in der sich das Bläschen befindet, weist normalerweise ein Surfactant oder Schäumungsmittel auf. Surfactants, die zur erfindungsgemäßen Verwendung geeignet sind, sind u. a. eine beliebige Verbindung oder Zusammensetzung, die zur Ausbildung und Beibehaltung der Bläschenmembran durch Ausbildung einer Schicht an der Grenzfläche zwischen den Phasen beiträgt. Das Schäumungsmittel oder der Surfactant kann eine einzelne Verbindung oder eine Kombination aus Verbindungen aufweisen, beispielsweise im Falle von Co-Surfactants.
Beispiele für geeignete Surfactants oder Schäumungsmittel sind u. a.: Blockcopolymere des Polyoxypropylen, Polyexyethylen, Zuckerester, Fettalkohole, aliphatische Aminoxide, aliphatische Ester der Hyaluronsäure, aliphatische Estersalze der Hyaluronsäure, Dodecyl-Poly(ethylenoxy)ethanol, Nonylphenoxy-Poly(ethylenoxy)ethanol, derivatisierte Stärken, Hydroxyethylstärke-Fettsäureester, handelsübliche Speisepflanzenstärken, Dextrane, Dextran-Fettsäureester, Sorbitol, Sorbit-Fettsäureester, Gelatine, Serumalbumine und Kombinationen daraus. Besonders bevorzugte Zuckerester sind solche mit einer Komponente mit einem hydrophil-lipophilen Gleichgewicht (HLB) von weniger als 8, einschließlich Mono-, Di-, Tri- oder Polyester-Saccharose, Trehalose, Dextrose und Fructose, um Stearat, Behenat, Palminat, Myristat, Laurat und Caproat (z. B. Saccharose-Tristearat) zu erzeugen, da diese Zuckerster die Stabilität der Mikrobläschen verlängern. Andere Zuckerester, die zur erfindungsgemäßen Verwendung in Frage kommen, sind u. a. solche, die mit ungesättigten Fettsäuren verestert sind, um Oleat, Ricinoleat, Linoleat, Arachidat, Plamitoleat und Myristoleat zu bilden. Das HLB ist eine Zahl zwischen 0 und 40, die Emulgatoren und Substanzen zugewiesen werden, die emulgiert werden. Das HLB zeigt das Emulsionsverhalten an und bezieht sich auf das Gleichgewicht zwischen dem hydrophilen und lipophilen Teil des Moleküls (Rosen, M., (1989), Surfactants and Interfacial Phenomena, 2. Auflage, John Wiley & Sons, New York, S. 326–329).
Erfindungsgemäß werden bevorzugte Surfactants oder Schäumungsmittel aus der Gruppe gewählt, die aus Phospholipiden, nichtionischen Surfactants, neutralen oder anionischen Surfactants, Fluor-Surfactants bestehen, die neutral oder anionisch sein können, und Kombinationen aus solchen Emulgatoren oder Schaumbildungsmittels.
Die nichtionischen Surfactants, die zur erfindungsgemäßen Verwendung geeignet sind, sind u. a. Polyoxyethylen-Polyoxypropylen-Copolymere. Ein Beispiel für diese Klasse von Verbindungen ist Pluronic, z. B. Pluronic F-68. Außerdem kommen Polyoxyethylen-Fettsäureester, z. B. Polyoxyethylenstearate, Polyoxyethylen-Fettalkoholester, polyoxyethylierte Sorbitan-Fettsäurester, Glycerolpolyethylenglycoloxystearat, Glycerolpolyethylenglycolricinoleat, ethoxylierte Sojabohnensterole, ethoxylierte Castoröle und deren hydrierte Derivate und Cholesterin in Frage. Zusätzlich sind nichtionische Alkylglucoside, z. B. Tweens^®, Spans^® und Brijs^® mit einer Komponente mit einem HLB, der kleiner ist als 8, auch im Schutzbereich der Erfindung. Die Spans sind u. a. Sorbitantetraoleat, Sorbitantetratearat, Sorbitantristearat, Sorbitantripalmitat, Sorbitantrioleat und Sorbitandistearat. Tweens sind u. a. Polyoxyethylensorbitantristearat, Polyoxyethylensorbitantripalmitat, Polyoxyethylensorbitantrioleat. Die Brij-Familie ist eine weitere geeignete Kategorie von Materialien, die Polyoxyethylen-10-Stearylether aufweist. Anionische Surfactants, insbesondere Fettsäuren (oder deren Salze) mit 12 bis 24 Kohlenstoffatomen, können auch verwendet werden. Ein Beispiel für ein geeignetes anionisches Surfactant ist Ölsäure oder ihr Salz, Natriumoleat.
Man wird anerkennen, daß eine große Auswahl von Surfactants verwendet werden kann. Tatsächlich kann praktisch jeder Surfactant oder jedes Schäumungsmittel (einschließlich solche, die noch zu entwickeln sind), die in der Lage sind, die Bildung von Mikrobläschen zu erleichtern, erfindungsgemäß verwendet werden. Das optimale Surfactant oder das optimale Schäumungsmittel oder Kombinationen daraus können durch empirische Untersuchungen, die keine übermäßigen Experimente erfordern, für eine gegebene Anwendung bestimmt werden. Folglich sollte ein Fachmann auf dem Fachgebiet der Erfindung das Surfactant oder Schäumungsmittel oder Kombinationen daraus auf der Grundlage solcher Eigenschaften wie Biokompatibilität oder ihr nicht-newtonsches Verhalten wählen.
Die Beständigkeit eines Kontrastmittels im Blut ist umgekehrt proportional zum Laplaceschen Druck, der proportional zur Oberflächenspannung des Bläschens ist. Eine reduzierte Oberflächenspannung erhöht somit die Beständigkeit im Blut. Surfactants, die geordnete Strukturen (multilaminare Schichten oder Stäbchen) in einer Lösung bilden und nicht-newtonsche, viskoelastische Oberflächenspannungen erzeugen, sind ebenfalls geeignet. Solche Surfactants sind u. a. viele der zuckerbasierten Surfactants und Protein- oder Glycoprotein-Surfactants (einschließlich Rinder-, Menschen- oder andere Lungen-Surfactants). Ein bevorzugter Typ eines solchen Surfactants hat eine Zucker- oder andere Kohlehydrat-Kopfgruppe und eine Kohlenwasserstoff- oder Fluorkohlenwasserstoff-Schwanzgruppe. Eine große Anzahl von Zuckerarten ist bekannt, die als Kopfgruppen fungieren können, einschließlich Glucose, Saccharose, Mannose, Lactose, Fructose, Dextrose, Aldose und dgl. Die Schwanzgruppe hat vorzugsweise etwa 2 oder 4 bis 20 oder 24 Kohlenstoffatome und kann beispielsweise eine Fettsäuregruppe (verzweigt oder unverzweigt, gesättigt oder ungesättigt) sein, die über eine Esterbindung mit dem Zucker kovalent verbunden ist. Die Oberflächenspannung von Bläschen, die mit diesen Surfactants erzeugt wird, verringert sich stark, wenn die Oberfläche durch Schrumpfung des Bläschens komprimiert wird (z. B. wenn das Bläschen schrumpft), und sie erhöht sich, wenn sich die Oberfläche des Bläschens vergrößert (z. B. wenn das Bläschen gößer wird). Diese Wirkung verzögert die Disproportionierung, die zu einer engeren Größenverteilung und zu langlebigeren Bläschen in der Ampulle und im lebenden Organismus führt. Ein bevorzugtes Surfactant-Gemisch, das die Eigenschaften hat, die der nicht-newtonschen Viskoelastizität zugeordnet werden, ist u. a. ein nichtionisches Surfactant oder ein anderes schaumbildendes Surfactant in Kombination mit einem der nicht-newtonschen, viskoelastischen Surfactants, z. B. einem der Zuckerester (z. B. 2% Pluronic F-68 plus 1% Saccharosestearat). Häufig ist das Verhältnis zwischen dem nichtionischen Surfactant und dem nicht-newtonschen Surfactant etwa 5:1 bis etwa 1:5, wobei die Surfactants gemeinsam (ganz gleich, ob nicht-newtonsche oder konventionelle) 0,5 bis 8% besonders bevorzugt etwa 1 bis 5% (Gew./Vol.) des mikrobläschenbildenden Flüssigkeitsgemischs aufweisen.
Die Verringerung der Oberflächenspannung bei kleinen Bläschen gegen den typischen Laplaceschen Druck ermöglicht die Verwendung effizienterer Osmosegasmittel, z. B. Perfluorkohlenwasserstoffe mit höherem Molekulargewicht als das Osmosegasmittel. Bei herkömmlichen Surfactants kondensieren die PFCs mit höherem Molekulargewicht bei den hohen Bläschendrücken. Ohne diese effizienteren Surfactants wären höher siedende, weniger membrandurchlässige PFCs, z. B. C₆F₁₄, extrem schwierig.
Man kann auch andere Mittel in die wäßrige Phase einbeziehen. Solche Mittel können vorteilhafterweise u. a. sein: herkömmliche Viskositätsmodifikatoren, Puffer, z. B. Phosphatpuffer oder andere herkömmliche biokompatible Puffer oder pH-regulierende Mittel, z. B. Säuren oder Basen, Osmosemittel (um Isotonie, Hyperosmolarität oder Hyposmolarität zu erreichen). Bevorzugte Lösungen haben einen pH von etwa 7 und sind isotonisch. Wenn jedoch CO₂ als erstes Gas in einem Bläschen verwendet wird, das geeignet ist, schnell auf eine erste Größe zu schrumpfen, kann ein basischer pH eine schnelle Schrumpfung durch Entzug von CO₂ erleichtern, da es das Bläschen verläßt, wodurch ein Aufbau von gelöstem CO₂ in der wäßrigen Phase verhindert wird.
B. Die Gasphase
Ein Hauptaspekt der Erfindung besteht in der Auswahl der Gasphase. Wie oben beschrieben, beruht die Erfindung auf die Verwendung von Kombinationen von Gasen, um die Differenzen der Partialdrücke auszunutzen oder zu verursachen und um Osmosegasdrücke zu erzeugen, die die Bläschen stabilisieren. Das primäre Modifikationsgas ist ausgewählt aus der Gruppe Stickstoff, Sauerstoff, Kohlendioxid und Gemischen daraus. Luft und/oder Bruchteile davon sind auch im normalen Blut und Serum enthalten. Wenn die Mikrobläschen in einer Umgebung zu verwenden sind, die sich von Blut unterscheidet, wird vorzugsweise das Primärmodifikationsgas aus den Gasen ausgewählt, die normalerweise im äußeren Medium vorhanden sind. Weitere Kriterien sind die Einfachheit, mit der das Primärmodifikationsgas in die Bläschen hinein- oder aus ihnen herausdiffundiert. Normalerweise können Luft und/oder Bruchteile davon ebenso ohne weiteres durch herkömmliche flexible oder feste Bläschenoberflächen hindurchdringen. Diese Kriterien in Kombination ermöglichen nach Bedarf die schnelle Diffusion des Primärmodifikationsgases in die Bläschen hinein oder aus ihnen heraus.
Modifikationsgase, die nicht im äußeren Medium enthalten sind, können auch verwendet werden. In diesem Fall werden die Bläschen anfänglich größer oder schrumpfen (je nach der relativen Permeabilität und den Konzentrationen der äußeren Gase für den Modifikator), wenn die äußeren Gase das ursprüngliche Modifikationsgas ersetzen. Wenn das Osmosegasmittel während dieses Prozesses nicht kondensiert ist, bleibt das Bläschen stabil.
Das Osmosegasmittel ist vorzugsweise ein Gas, das durch die Oberfläche des Bläschens weniger durchdringend ist als der Modifikator. Es wird auch bevorzugt, daß das Osmosegasmittel im Blut oder Serum weniger löslich ist. Daher ist es nunmehr verständlich, daß das Osmosegasmittel bei Raum- oder Körpertemperatur ein Gas sein kann, oder es kann bei Körpertemperatur normalerweise eine Flüssigkeit sein, solange es bei der Verwendungstemperatur einen ausreichenden Partial- oder Dampfdruck hat, um die gewünschte Osmosewirkung zu erreichen.
Demzufolge können Fluorkohlenwasserstoffe und andere Verbindungen, die bei Raum- oder Körpertemperatur keine Gase sind, verwendet werden, vorausgesetzt, daß sie einen ausreichenden Dampfdruck haben, vorzugsweise mindestens etwa 50 oder 100 Torr bei Körpertemperatur oder besonders bevorzugt mindestens etwa 150 oder 200 Torr. Es versteht sich, daß, wenn das Osmosegasmittel ein Gemisch aus Gasen ist, das relevante Maß für den Dampfdruck der Dampfdruck des Gemischs ist, nicht unbedingt der Dampfdruck der einzelnen Komponenten des Osmosemischgasmittels.
Es ist auch wichtig, daß, wenn ein Perfluorkohlenwasserstoff als das Osmosemittel in einem Bläschen verwendet wird, der bestimmte Perfluorkohlenwasserstoff nicht bei dem Partialdruck kondensiert, der im Bläschen und bei Raumtemperatur herrscht. Je nach den relativen Konzentrationen des Primärmodifikationsgases und des Osmosegasmittels kann das Primärmodifikationsgas schnell das Bläschen verlassen, wodurch es schrumpfen und das zweite Osmosegasmittel konzentrieren kann. Ein solches Schrumpfen kann auftreten, bis der Osmosegasdruck dem äußeren Druck am Bläschen (maximaler absoluter arterieller Druck) plus dem Laplaceschen Druck des Bläschens minus dem Luftdruck oder der Luftsättigungsspannung des Blutes (im wesentlichen eine Atmosphäre) gleicht. Der Kondensationspartialdruck des resultierenden Gasgemischs bei 37°C muß also über dem oben beschriebenen Gleichgewichtspartialdruck des Osmosemittels sein.
Repräsentative Fluorkohlenwasserstoffe, die diese Kriterien erfüllen Mikrobläschen besser stabilisieren können, sind die folgenden:
C₄F₁₀ < C₅F₁₂ < C₆F₁₄
Demzufolge versteht es sich, daß PFCs mit 8 Kohlenstoffatomen oder weniger (bei 37°C Dampfdrücke von über 80 mm Hg) bevorzugt werden. Wie außerdem verständlich ist, ist es jedoch möglich, durch Hinzufügung von Heteroatomen und dgl. größere Moleküle mit erhöhter Flüchtigkeit zu erzeugen. Daher ist die Bestimmung des optimalen sekundären Osmosegasmittels oder der Gase nicht größenbegrenzt, sondern beruht vielmehr auf der Fähigkeit, ihre Dampfphase bei Körpertemperatur beizubehalten, während ein Osmosegasdruck herrscht, der mindestens der Summe des arteriellen und des Laplaceschen Drucks gleicht.
Eine Auflistung bestimmter Verbindungen, die geeignete Löslichkeits- und Dampfdruckkriterien erfüllen, ist in Tabelle I gegeben:
Tabelle 1

Perfluorpropane C₃F₈
Perfluorbutane C₄F₁₀
Perfluorpentane C₅F₁₂
Perfluorcyclopentane C₅F₁₀
Perfluormethylcyclobutane C₅F₁₀
Perfluorhexane C₆F₁₄
Perfluorcyclohexane C₆F₁₂
Perfluormethylcyclopentane C₆F₁₂
Perfluordimethylcyclobutane C₆F₁₂

Man wird anerkennen, daß ein Fachmann auf diesem Gebiet ohne weiteres andere Verbindungen bestimmen kann, die erfindungsgemäß zweckmäßig funktionieren würden, die die oben beschriebenen Löslichkeits- und Dampfdruckkriterien erfüllen. Ferner ist verständlich, daß bestimmte Verbindungen außerhalb des bevorzugten Löslichkeits- oder Dampfdruckbereichs erwogen werden, wenn solche Verbindungen die Abweichung in anderen Kategorien kompensieren und eine höhere Unlöslichkeit oder einen niedrigeren Dampfdruck aufweisen.
Man beachte auch, daß für medizinische Zwecke die Gase, sowohl das Modifikationsgas als auch das Osmosegasmittel, biokompatibel sein sollten und nicht physiologisch schädlich. Schließlich verflüchtigen sich die Mikrobläschen, die die Gasphase erhalten, und die Gasphase löst sich im Blut auf, entweder als gelöstes Gas oder als Tröpfchen unterhalb der Mikrometergrenze der kondensierten Flüssigkeit. Es versteht sich, daß Gase in erster Linie aus dem Körper entfernt werden durch Lungenatmung oder durch eine Kombination von Atmung und anderen Stoffwechselwegen im retikuloendothelialen System.
Geeignete Gaskombinationen aus dem Primärmodifikator und den Sekundärgasen können ohne übermäßige Experimente empirisch festgelegt werden. Solche empirischen Bestimmungen sind in den Beispielen beschrieben.
Wenn ein effizientes Surfactant, z. B. ein Rinderlungen-Surfactant, verwendet wird, um ein Bläschen mit großem Durchmesser mit einer niedrigen Oberflächenspannung zu erzeugen, ist der Laplacesche Druck sehr niedrig. Wenn mit Perfluoroctylbromid (PFOB) gesättigte Luft im Bläschen ist und das Bläschen der Luft oder einer Flüssigkeit ausgesetzt wird, die nahezu mit Luft gesättigt ist (z. B. im Gleichgewicht mit Luft), ist der Osmosegasdruck größer als der Laplacesche Druck und daher wird das Bläschen größer. Bei Bläschen mit kleinerem Durchmesser ist der Laplacesche Druck höher, und daher schrumpft das Bläschen oder fällt zusammen. Diese Schrumpfung erfolgt mit einer verringerten Geschwindigkeit, was durch die Differenz zwischen dem Laplaceschen Druck und dem Osmosegasdruck bewirkt wird. Wenn Bläschen mit kleinem Durchmesser durch Beschallung von Gas oder Gasdampfgemischen in einer Lösung mit Surfactants mit niedriger Oberflächenspannung erzeugt werden, z. B. 2% Pluronic F-68 plus 1% Saccharosestearat, korreliert die Zeit, in der die Bläschen im Reagenzglas, wie durch Mikroskop zu beobachten, und im lebenden Organismus, wie durch Dopplerultraschallbildgewinnung einer Kaninchenniere nach intravenöser Injektion zu beobachten, stabil sind, mit dem oben erwähnten Osmosegasdruckvergleich.
Bei dem Dopplerultraschall-Experiment mit Kaninchennieren (Beispiel III) wurde eine Kontrastverbesserung von bis zu 10 min mit Perfluorhexan/Luftgemischen in den Bläschen beobachtet, verglichen mit dem sofortigen Verschwinden des Kontrasts bei reinen Luftbläschen. Diese Perfluorchemikalien sind in der Lage, Osmosegasdrücke auszuüben, die nahezu das Gegengewicht zum Laplaceschen Druck darstellen und funktionelle Ultraschallmikrobläschenkontrastmittel erzeugen.
Eine überraschende Feststellung war, daß Gemische aus PFC, z. B. C₄F₁₀ (als Kombinationsmodifikationsgas oder als Osmosegasmittel), die mit C₆F₁₄-Dampf (als Hauptosmosegasmittel) gesättigt sind, das Bläschen für längere Zeiten als eine der beiden Komponenten allein stabilisieren können. Die Ursache dafür ist, daß C₄F₁₀ bei Körpertemperatur ein Gas ist (und daher sowohl als Modifikationsgas wie auch als Osmosegasmittel wirken kann), eine etwas verringerte Membranpermeabilität hat und es in C₆F₁₄ bei Körpertemperatur nur geringfügig löslich ist. In dieser Situation werden die Osmosegasdrücke beider Mittel zusammen addiert, was zu einer erhöhten Bläschenbeständigkeit gegenüber der von reinen Luft/C₆F₁₄-Gemischen führt. Es ist möglich, daß der Kondensationspunkt der länger beständigen C₆F₁₄-Komponente mit höherem Molekulargewicht erhöht wird, was dazu führt, daß ein größerer Osmosegasdruck ausgeübt wird. Weitere Gemische aus PFC funktionieren ähnlich. Bevorzugte Gemische aus PFC haben Verhältnisse von 1:10 bis 10:1 und weisen solche Gemische auf wie etwa Perfluorbutan/Perfluorhexan und Perfluorbutan/Perfluorpentan. Diese bevorzugten Fluorchemikalien können verzweigte oder gerade Ketten haben.
Wie oben beschrieben, haben wir auch festgestellt, daß Gemische aus nichtosmotischen Gasen in Kombination mit dem Osmosegasmittel die Größenverteilung der Bläschen vor und nach der Injektion stabilisieren. Nach Erzeugung der Bläschen bewirken die höheren Laplaceschen Drücke in kleineren Bläschen eine Diffusion durch die Flüssigphase zu den größeren Bläschen mit niedrigerem Laplaceschen Druck. Die bewirkt, daß die mittlere Größenverteilung mit der Zeit über die Kapillargrößengrenze von 5 µm steigt. Dies wird als Disproportionierung bezeichnet.
Wenn jedoch ein Gemisch aus Modifikationsgasen (z. B. Luft oder Kohlendioxid) mit einem Osmosemittel (z. B. C₆F₁₄) verwendet wird, wird durch eine geringfügige Reduzierung des Volumens der kleineren Bläschen infolge eines der Modifikationsgase, die das Bläschen verläßt, das Osmosegas konzentriert, und sein osmotischer Druck erhöht sich, wodurch eine weitere Schrumpfung verzögert wird. Andererseits vergrößert sich das Volumen der größeren Bläschen geringfügig, wodurch das Osmosegas verdünnt und weiteres Wachstum verzögert wird.
Ein zusätzlicher Vorteil der Verwendung eines Gemischs aus einem extrem blutlöslichen Gas (z. B. 75% durch 87,5 Vol.-% CO₂) und einem Osmosegasgemisch (z. B. 28% C₆F₁₄-Dampf und 72% Luft) besteht darin, daß, wenn diese Bläschen injiziert werden, sie infolge der Abgabe von CO₂ an das Blut schnell schrumpfen. Kohlendioxid verschwindet infolge eines spezifischen Plasmaenzyms, das seine Auflösung katalysiert, besonders schnell. Eine Verringerung von 87,5 Vol.-% infolge des Verlustes an CO₂ entspricht einer Halbierung des Bläschendurchmessers. Demzufolge können Bläschen mit größerem Durchmesser erzeugt werden, die nach Injektion oder nach Einwirkung einer Lösung mit einem basischen oder alkalischen pH auf eine entsprechende Größe schrumpfen (nämlich 5 µm).
Demzufolge haben wir festgestellt, daß durch die Verwendung eines Gases, das relativ hydrophob ist und das eine relativ niedrige Membranpermeabilität hat, die Geschwindigkeit, mit der die Kontrastpartikel zerfallen, reduziert werden kann. Durch Reduzierung der Partikelzerfallsgeschwindigkeit werden also die Halbwertzeiten der Mikrobläschen erhöht und das Kontrastverbesserungspotential erweitert.
II. Weitere Komponenten
Es versteht sich, daß weitere Komponenten in die erfindungsgemäßen Mikrobläschenformulierungen aufgenommen werden können. Beispielsweise können Osmosemittel, Stabilisatoren, Gelatoren, Puffer, Viskosemodulatoren, Luftlöslichkeitsmodifikatoren, Salze und Zucker zugesetzt werden, um die Mikrobläschensuspension auf maximale Lebensdauer und Kontrastverbesserungseffektivität abzustimmen. Solche Überlegungen wie Sterilität, Isotonie und Biokompatibilität können die Verwendung solcher herkömmlicher Zusätze zu den injizierbaren Zusammensetzungen bestimmen. Die Verwendung solcher Mittel wird dem Fachmann verständlich sein, und die spezifischen Mengen, Verhältnisse und Typen der Mittel können ohne übermäßige Experimente empirisch bestimmt werden.
III. Formulierung der erfindungsgemäßen Mikrobläschen
Es gibt viele verschiedene Verfahren, Mikrobläschen erfindungsgemäß herzustellen. Die Beschallung wird bei der Ausbildung der Mikrobläschen bevorzugt, d. h. durch eine ultraschalldurchlässige Trennwand oder indem die Trennwand mit einer Ultraschallsonde, einschließlich einer mit Ultraschall schwingenden Injektionsnadel, durchstoßen wird. Man wird jedoch anerkennen, daß viele verschiedene andere Techniken zur Bläschenbildung bestehen. Beispielsweise können Gasinjektionstechniken verwendet werden, wie etwa Venturigasinjektion.
Weitere Verfahren zur Ausbildung von Mikrobläschen sind u. a. die Ausbildung von Partikelmikrokügelchen durch Ultrabeschallung von Albumin oder anderem Eiweiß, wie in der europäischen Patentanmeldung 0 359 246 von Molecular Biosystems, Inc. beschrieben; die Verwendung von Tensiden und viskositätserhöhenden Mitteln, wie im US-Patent 4 446 442 beschrieben; lipidbeschichtete, Nichtliposom-Mikrobläschen, wie im US-Patent 4 684 479 beschrieben; Liposomen mit eingeschlossenen Gasen, wie im US-Patent 5 088 499 und 5 123 414 beschrieben; und die Verwendung von denaturierten Albuminpartikel-Mikrokügelchen, wie im US-Patent 4 718 433 beschrieben.
Jedes der oben beschriebenen Verfahren kann mit ähnlichem Erfolg verwendet werden, um Modifikationsgas und Osmosegasmittel erfindungsgemäß einzuschließen. Außerdem wird erwartet, daß ähnliche Verbesserungen der Langlebigkeit der erzeugten Bläschen durch die erfindungsgemäße Verwendung beobachtet werden.
Die Beschallung kann auf verschiedene Weise erfolgen. Beispielsweise kann eine Ampulle mit einer Surfactant-Lösung und Gas im Kopfraum der Ampulle durch eine dünne Membran hindurch beschallt werden. Vorzugsweise ist die Membran weniger als etwa 0,5 oder 0,4 mm dick und besonders bevorzugt weniger als etwa 0,3 oder sogar 0,2 mm dick, d. h. dünner als die Wellenlänge des Ultraschalls im Material, um einen akzeptablen Durchtritt zu ermöglichen und die Membranerwärmung zu minimieren. Die Membran kann aus Materialien wie etwa Gummi, Teflon, Mylar, Urethan, aluminiertem Film oder irgendeinem anderen schalldurchlässigen synthetischen oder natürlichen Polymerfilm oder filmbildendem Material bestehen. Die Beschallung kann durch Berührung oder sogar durch Drücken auf die Membran mit einer Ultraschallsonde oder mit einem fokussierten ”Ultraschallstrahl” erfolgen. Die Ultraschallsonde kann eine Einwegsonde sein. In beiden Fällen kann die Sonde an die Membran angelegt oder durch sie hindurch in die Flüssigkeit eingeführt werden. Wenn die Beschallung erfolgt ist, kann die Mikrobläschenlösung der Ampulle entnommen und an den Patienten verabreicht werden.
Die Beschallung kann auch innerhalb einer Spritze mit einer leistungsschwachen ultraschallschwingenden Ansauganordnung an der Spritze erfolgen, wie bei einem Tintenstrahldrucker. Außerdem kann die Spritze oder die Ampulle in einem leistungsschwachen Ultraschallbad, das seine Energie an einem Punkt in dem Behälter fokussiert, angeordnet sein und in diesem beschallt werden.
Weitere Arten der mechanischen Ausbildung von Mikrobläschen werden ebenfalls erwogen. Beispielsweise können Bläschen mit einer mechanischen Röhre mit hoher Scherkraft (oder einer Doppelspritzennadel) und zwei Spritzen oder einer Ansauganordnung an der Spritze ausgebildet werden. Selbst einfaches Schütteln ist eine Möglichkeit. Die hier beschriebenen Schrumpfbläschentechniken sind besonders geeignet für mechanisch ausgebildete Bläschen, wobei sie einen geringeren Energiebedarf haben als beschallte Bläschen. Solche Bläschen haben normalerweise einen Durchmesser, der viel größer ist als die letztlich gewünschten biokompatiblen Bilderzeugungsmittel, und können erfindungsgemäß auf eine entsprechende Größe geschrumpft werden.
In einem weiteren Verfahren können Mikrobläschen unter Verwendung einer Flüssigosmosemittelemulsion ausgebildet werden, die mit einem Modifikationsgas bei erhöhtem Druck übersättigt wird und in eine Surfactant-Lösung eingebracht wird. Dieses Zubereitungsverfahren wirkt wie die Öffnung einer Brauselimonade, wo das Gas bei Druckentlastung schäumt und dabei Bläschen bildet.
In einem weiteren Verfahren können die Bläschen ausgebildet werden wie bei der Schaumerzeugung mit Rasiercreme, wo Perfluorbutan, Freon oder andere ähnliche Materialien sieden, wenn der Druck abgelassen wird. In diesem Verfahren ist es jedoch unbedingt notwendig, daß die emulgierte Flüssigkeit bei ausreichend niedrigen Temperaturen siedet oder daß sie zahlreiche Bläschenkeimstellen enthält, um eine Überhitzung und Übersättigung der wäßrigen Phase zu verhindern. Diese Übersättigung führt zur Erzeugung einer kleinen Anzahl großer Bläschen in einer begrenzten Anzahl von Bläschenkeimstellen und nicht zu der gewünschten großen Anzahl von kleinen Bläschen (eines für jedes Tröpfchen).
In noch einem weiteren Verfahren können trockene hohlraumhaltige Partikel oder andere Strukturen (z. B. hohle Kügelchen oder Honigwaben), die sich schnell lösen oder Wasser anlagern, vorzugsweise in einer wäßrigen Lösung, z. B. Albumin, mikrofeine Zuckerkristalle, hohler sprühgetrockneter Zucker, Salze, hohle Surfactant-Kügelchen, getrocknete poröse Polymerkügelchen, getrocknete poröse Hyaluronsäure oder Kügelchen mit substituierter Hyaluronsäure oder sogar handelsübliche getrocknete Lactosemikrokügelchen, mit einem Osmosegasmittel stabilisiert werden.
Beispielsweise kann eine sprühgetrocknete Surfactant-Lösung formuliert werden durch Einstäubung einer Surfactant-Lösung in ein erwärmtes Gas, z. B. Luft, Kohlendioxid, Stickstoff oder dgl., um getrocknete Kügelchen von 1 bis 10 µm oder größere hohle oder poröse Kügelchen zu erhalten, die in einer Ampulle verpackt werden, das mit einem Osmosegas oder einem gewünschten Gasgemisch gefüllt ist, wie hierin beschrieben. Das Gas diffundiert in die Hohlräume der Kügelchen. Die Diffusion kann durch Druck- oder Vakuumzyklen unterstützt werden. Wenn die Kügelchen mit einer sterilen Lösung rehydratisiert werden, lösen sie sich schnell und lassen osmosegasstabilisierte Bläschen in der Ampulle zurück. Außerdem führt der Einschluß von Stärke oder Dextrinen, Zuckerpolyester und/oder einem Aufblasmittel, z. B. Methylenchlorid, 1,1,2-Trichlortrifluorethan (Freon 113, EM Science, Gibbstown, NJ) oder Perfluorhexan zu Mikrobläschen mit einer erhöhten Halbwertzeit im lebenden Organismus. Besonders bevorzugte Stärken zur Verwendung bei der Ausbildung von Mikrobläschen sind u. a. solche mit einem Molekulargewicht von mehr als etwa 500 000 Dalton oder einem Dextroseäquivalenz-(DE-)Wert von weniger als etwa 12. Der DE-Wert ist ein quantitatives Maß für den Grad der Stärkepolymerhydrolyse. Er ist ein Maß für die Reduzierung der Leistung im Vergleich zum Dextrosenormalwert von 100. Je höher der DE-Wert ist, um so größer ist der Grad der Stärkehydrolyse. Solche bevorzugten Stärken sind u. a. Nahrungsmittelqualität aufweisende Pflanzenstärken, wie sie handelsüblich in der Nahrungsmittelindustrie verfügbar sind, einschließlich solche, die unter dem Handelsnamen N-LOK und CAPSULE von National Starch and Chemical Co. vertrieben werden (Bridgewater, NJ); derivatisierte Stärken, z. B. Hydroxyethylstärke (vertrieben unter dem Handelsnamen HETASTARCH und HESPAN von du Pont Pharmaceuticals) (M-Hydroxyethylstärke, Ajinimoto, Tokyo, Japan). (Man beachte, daß sich kurzkettige Stärken gut trocken versprühen lassen und verwendet werden können, um Mikrobläschen zu erzeugen, aber nicht bevorzugt sind, da sie mit einem Molekulargewicht von weniger als etwa 500 000 die Mikrobläschen nicht stabilisieren. Sie können jedoch erfindungsgemäß in Anwendungen verwendet werden, bei denen eine zusätzliche Stabilisierung nicht erforderlich ist.) Als Alternative kann ein gefriergetrockneter Kuchen aus Surfactant und Auflockerungsmitteln, die mit feinen Porenstrukturen hergestellt sind, in einer Ampulle mit einer sterilen Lösung und einem Kopfraum mit einem Osmosegasgemisch eingebracht werden. Die Lösung kann schnell eingefroren werden, um eine feine Eiskristallstruktur zu erzeugen, und nach der Gefriertrocknung entstehen daher feine Poren (Hohlräume, wo Eiskristalle entfernt wurden).
Als Alternative können lösliche oder dispergierbare hohlraumbildende Strukturen verwendet werden. In dieser Ausführungsform, wo das hohlraumbildende Material weder aus einem Surfactant besteht noch ein solches enthält, werden sowohl das Surfactant als auch die Flüssigkeit in den Behälter mit den Strukturen und dem gewünschten Gas oder Gasen eingebracht. Bei Rehydratisierung schließen diese Hohlräume das Osmosegas ein und bilden bei der Lösung des festen Kuchens Mikrobläschen mit dem Gas oder Gasen darin.
Man wird anerkennen, daß Kits bzw. Ausstattungen zur Verwendung bei der Herstellung der erfindungsgemäßen Mikrobläschenpräparate zubereitet werden können. Diese Ausstattungen können einen Behälter mit dem oben beschriebenen Gas oder Gasen zur Ausbildung der Mikrobläschen, der Flüssigkeit und des Surfactants aufweisen. Der Behälter kann alle sterilen trockenen Komponenten und das Gas in einer Kammer enthalten, während die sterile wäßrige Flüssigkeit in einer zweiten Kammer des gleichen Behälters enthalten ist. Geeignete Zweikammer-Ampullen sind beispielsweise unter dem Handelsnamen WHEATON RS177FLW oder S-1702FL von Wheaton Glass Co. (Milville, NJ) erhältlich. Ein solcher Behälter ist in 1 bis 4 dargestellt. Mit Bezug auf 1 und 2 hat der dargestellte Wheaton-Behälter 5 eine obere Kammer 20, die eine wäßrige Lösung 25 enthalten kann, und eine untere Kammer 30, die die getrockneten Bestandteile 35 und ein gewünschtes Gas enthalten kann. Ein Stopfen 10 ist vorgesehen, der die obere Kammer von der Umgebung trennt, und ein Verschluß 15 trennt die obere Kammer 20 von der unteren Kammer 30, die sprühgetrocknete (pulverisierte) hohle Mikrokügelchen 35 und das Osmosegasmittel enthält. Durch Niederdrücken des Stopfens 10 wird die relativ nichtkomprimierbare Flüssigkeit unter Druck gesetzt, die den Verschluß 15 nach unten in die untere Kammer 30 drückt. Dadurch wird die wäßrige Lösung 25 in die untere Kammer 30 eingelassen, was zur Lösung des Pulvers 35 führt, um stabilisierte Mikrobläschen 45 zu bilden, die das eingeschlossene Osmosegasmittel enthalten. Überschüssiges Osmosegasmittel 40 wird von der unteren Kammer 30 in die obere Kammer 20 eingelassen. Diese Anordnung ist bequem für den Anwender und hat den zusätzlichen unerwarteten Vorteil, daß die kleine Menge von wasserundurchdringlichem Osmosegasmittel in der unteren Kammer durch Abdeckung des Zwischenkammerverschlusses mit einer dicken (0,5 bis 1,25 Zoll) Schicht einer wäßrigen Lösung verschlossen wird, und den Vorteil, daß die wäßrige Lösung in die untere Kammer eingeführt werden kann, ohne den Druck in der oberen Kammer um mehr als etwa 10% zu erhöhen. Es besteht deshalb keine Notwendigkeit für einen Druckausgleichsöffnung. (Im Gegensatz dazu kann die herkömmliche Rehydratation eines gelösten Stoffs in einer Ampulle mit nur einer Kammer mit einer Nadel und einer Spritze ohne eine Lüftungsöffnung zum Aufbau eines beträchtlichen Innenkammerdrucks führen, der die Mikrobläschen kollabieren lassen könnte.) Die Bildung der Mikrobläschen nach diesem Verfahren ist in Beispiel XI beschrieben.
Als Alternative kann eine umgekehrte Zweikammer-Ampulle für die Mikrobläschenzubereitung verwendet werden. Mit Bezug auf 3 und 4 kann die gleiche Ampulle verwendet werden, wie oben beschrieben, außer daß der Stopfen 50 so verlängert ist, daß er den innere Verschluß 15 verschiebt, wenn darauf gedrückt wird. Bei diesem Mikrobläschenzubereitungsverfahren sind die sprühgetrockneten hohlen Mikrokügelchen 35 und das Osmosegasmittel 40 in der oberen Kammer 20 enthalten. Die wäßrige Lösung 25 und das Osmosegasmittel 40 sind in der unteren Kammer 30 enthalten. Wenn auf den Stopfen 50 gedrückt wird, verschiebt er den Verschluß 15, so daß sich die sprühgetrockneten hohlen Mikrokügelchen mit der wäßrigen Lösung 25 in Gegenwart des Osmosegasmittels 40 vermischen können. Ein Vorteil, der mit diesem Verfahren der Mikrobläschenbildung verbunden ist, besteht darin, daß die wäßrige Phase zuerst eingeträufelt und dann durch Autoklavierung oder andere Mittel sterilisiert werden kann, gefolgt von einer Einträufelung der sprühgetrockneten Mikrokügelchen. Dadurch wird ein potentielles Mikrobenwachstum in der wäßrigen Phase vor der Sterilisierung verhindert.
Obwohl ein bestimmter Zweikammer-Behälter dargestellt ist, sind andere geeignete Vorrichtungen bekannt und handels üblich erhältlich. Beispielsweise eine Zweikammer-Glasspritze, z. B. B-D HYPAK Liquid/Dry 5 + 5 ml Doppelkammer, vorgefülltes Spritzensystem (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ; beschrieben im US-Patent 4 613 326 ), kann vorteilhaft verwendet werden, um das sprühgetrocknete Pulver zu rehydratisieren. Die Vorteile dieses Systems sind u. a.:

1. Bequeme Anwendung;
2. Das wasserunlösliche Osmosegasmittel ist eingeschlossen in einer Kammer mit einer wäßrigen Lösung auf einer Seite und einer extrem kleinen Elastomerfläche, die die Nadel auf der anderen Seite verschließt; und
3. Eine Filtrationsnadel, z. B. Monojet Nr. 305 (Sherwood Medical, St. Louis, MO) kann zur Zeit der Zubereitung an der Spritze angebracht werden, um sicherzustellen, daß keine ungelösten Feststoffe injiziert werden.

Die Verwendung der Zweikammer-Spritze zur Ausbildung von Mikrobläschen ist in Beispiel XII beschrieben.
Ein Fachmann kann erkennen, daß andere Zweikammer-Rehydratisationssysteme, die in der Lage sind, sprühgetrocknetes Pulver mit der wäßrigen Lösung steril zu kombinieren, auch in den Schutzbereich der Erfindung fallen. Bei solchen Systemen ist es besonders vorteilhaft, wenn die wäßrige Phase zwischen dem wasserunlöslichen Osmosegas und der Umgebung angeordnet werden kann, um die Lagerungslebensdauer des Erzeugnisses zu erhöhen.
Als Alternative kann der Behälter das hohlraumbildende Material und das Gas oder die Gase enthalten, und das Surfactant und die Flüssigkeit können hinzugesetzt werden, um Mikrobläschen zu bilden. In einer Ausführungsform kann das Surfactant mit den anderen Materialien im Behälter vorhanden sein, so daß nur die Flüssigkeit hinzugesetzt werden muß, um die Mikrobläschen zu bilden. Wenn ein Material, das zur Bildung der Mikrobläschen nötig ist, nicht schon im Behälter vorhanden ist, kann es mit den anderen Komponenten der Ausstattung verpackt sein, vorzugsweise in einer Form oder einem Behälter, die bzw. der geeignet ist, eine einsatzbereite Kombination mit den anderen Komponenten der Ausstattung zu bilden.
Der Behälter, der in der Ausstattung verwendet wird, kann ein Behälter sein, der hierin anderswo beschrieben ist. In einer Ausführungsform ist der Behälter eine herkömmliche durch eine Trennwand verschlossene Ampulle. In einer weiteren Ausführungsform hat er eine Einrichtung zum Lenken oder Einlassen einer ausreichenden bläschenbildenden Energie in den Inhalt des Behälters. Diese Einrichtung kann beispielsweise die bereits beschriebene dünne Schicht oder Folie aufweisen.
Verschiedene Ausführungsformen der Erfindung weisen überraschende Vorteile auf. Die sprühgetrockneten Stärkeformulierungen ergeben eine verlängerte Stabilität der Mikrobläschen im Reagenzglas, besonders wenn das Molekulargewicht der Stärke über etwa 500 000 liegt. Die Verwendung von Fettsäureestern des Zuckers, die eine Komponente mit einem HLB von weniger als 8 enthalten, ermöglicht eine stark erhöhte Stabilität im lebenden Organismus und in der Ampulle. Fettsäureester des Zuckers, z. B. Succharosemonosterat, sowie Blockcopolymere, z. B. Pluronic F-68 (mit einem HLB über 12), ermöglichen, daß das Pulver in dem Moment Bläschen bildet, wo sie rehydratisiert werden. Sprühgetrocknete Formulierungen mit einem Strukturmittel, z. B. Stärke, Stärkederivat oder Dextrin, ergeben eine deutlich niedrigere Gesamtdosis des Surfactants als vergleichbare beschallte Formulierungen. Die Verwendung der Zweikammer-Ampullen mit Wasser, die einen zusätzlichen Verschluß für das Fluorkohlenwasserstoffgas bieten, haben eine längere Lagerlebensdauer und bieten eine bequemere Anwendung. Sprühgetrocknete Formulierungen mit einem Strukturmittel (z. B. Stärke oder Dextrin) und einem Zuckerpolyester liefern Mikrobläschen mit einer stark erhöhten Halbwertzeiten im lebenden Organismus.
Die Einbeziehung eines Aufblasmittels in die sprühzutrocknend Lösung führt durch Ausbildung einer größeren Anzahl von hohlen Mikrokügelchen zu einem stärkeren Ultraschallsignal pro Gramm des sprühgetrockneten Pulvers. Das Aufblasmittel löst die Dampfbläschenformulierung in den zerstäubten Tröpfchen der Lösung aus, die in den Sprühtrockner eintreten, da sich diese Tröpfchen mit dem heißen Luftstrom im Trockner mischen. Geeignete Aufblasmittel sind solche, die die Lösung in den zerstäubten Tröpfchen mit Gas oder Dampf übersättigen, bei der erhöhten Temperatur der trocknenden Tröpfchen (annähernd 100°C). Geeignete Mittel sind u. a.:

1. Gelöste, niedrigsiedende (unter 100°C) Lösemittel mit begrenzter Mischbarkeit mit wäßrigen Lösungen, z. B. Methylenchlorid, Aceton und Kohlenstoffdisulfid, die verwendet werden, um die Lösung bei Raumtemperatur zu sättigen.
2. Ein Gas, z. B. CO₂ oder N₂, das verwendet wird, um die Lösung bei Raumtemperatur und erhöhtem Druck (z. B. 3 Bar) zu sättigen. Die Tröpfchen werden dann mit dem Gas bei 1 Atmosphäre und 100°C übersättigt.
3. Emulsionen von nichtmischbaren, niedrigsiedenden (unter 100°C) Flüssigkeiten, z. B. Freon 113, Perfluorpentan, Perfluorhexan, Perfluorbutan, Pentan, Butan, FC-11, FC-11B1, FC-11B2, FC-12B2, FC-21, FC-21B1, FC-21B2, FC-31B1, FC-113A, FC-122, FC-123, FC-132, FC-133, FC-141, FC-141B, FC-142, FC-151, FC-152, FC-1112, FC-1121 und FC-1131.

Das Aufblasmittel wird im wesentlichen während des Sprühtrocknungsprozesses verdampft und ist daher in nicht mehr als kleinsten Mengen in dem endgültigen sprühgetrockneten Pulver vorhanden.
Die Einbeziehung der Surfactants und Benetzungsmittel in die Hülle des Mikrokügelchens erlaubt die Verwendung einer niedrigeren Surfactant-Konzentration. Wenn sich die Mikrokügelchenhülle löst, umgibt sie vorübergehend das in ihrem Inneren gebildete Mikrobläschen, mit einer Schicht einer wäßrigen Phase, die mit den Surfactants gesättigt ist, wobei ihre Anlagerung auf der Oberfläche des Mikrobläschens verbessert wird. Die gefriergetrockneten, surfactanthaltigen Mikrokügelchen erfordern also nur örtlich begrenzt hohe Konzentrationen des Surfactants und machen eine hohe Surfactant-Konzentration in der gesamten wäßrigen Phase unnötig.
Jedes der erfindungsgemäßen Mikrobläschenpräparate kann an ein Wirbeltier, z. B. an einen Vogel oder einen Säuger, als Kontrastmittel zur Ultraschallbildgewinnung von Abschnitten des Wirbeltiers verabreicht werden. Vorzugsweise ist das Wirbeltier ein Mensch, und der Abschnitt, der bildlich dargestellt wird, ist das Gefäßsystem des Wirbeltiers. In dieser Ausführungsform wird eine kleine Menge von Mikrobläschen (z. B. 0,1 ml/kg [2 mg/kg sprühgetrocknetes Pulver] auf der Grundlage des Körpergewichts des Wirbeltiers) intravaskulär in das Säugetier eingeführt. Andere Mengen von Mikrobläschen, z. B. etwa 0,005 ml/kg bis etwa 1,0 ml/kg, können auch verwendet werden. Eine bildliche Darstellung des Herzens, der Arterien, Venen und Organe, die reich an Blut sind, z. B. die Leber, die Lunge und die Nieren, kann mit dieser Technik durch Ultraschall erfolgen.
Die vorstehende Beschreibung ist noch besser verständlich mit Bezug auf die nachfolgenden Beispiele. Solche Beispiele sind jedoch nur Beispiele für bevorzugte Verfahren zur Umsetzung der Erfindung und schränken den Schutzbereich der Erfindung und der beigefügten Ansprüche nicht ein.
Beispiel I
Zubereitung von Mikrobläschen durch Beschallung
Mikrobläschen mit einer anzahlmittelgewichteten Größe von 5 µm wurden durch Beschallung einer isotonischen wäßrigen Phase zubereitet, die 2% Pluronic F-68 und 1% Saccharosestearat als Surfactant, Luft als Modifikationsgas und Perfluorhexan als das Osmosegasmittel enthält.
Bei diesem Experiment wurde 1,3 ml sterile Wasserlösung, die 0,9% NaCl, 2% Pluronic F-68 und 1% Saccharosestearat enthielt, einer Ampulle von 2,0 ml hinzugesetzt. Die Ampulle hatte einen verbleibenden Kopfraum von 0,7 ml, der anfänglich Luft enthielt. Luft, die mit Perfluorhexandampf (220 Torr Perfluorhexan mit 540 Torr Luft) bei 25°C gesättigt war, wurde verwendet, um den Kopfraum der Ampulle zu spülen. Die Ampulle wurde mit einer 0,22 mm dünnen Polytetrafluorethylen-(PTFE-)Trennwand verschlossen. Die Ampulle wurde horizontal gedreht, und eine Beschallungssonde von 1/8 Zoll (3 mm), die an ein von Sonics & Materials vertriebenes Beschallungsgerät Modell VC50 von 50 W angeschlossen war, wurde sanft gegen die Trennwand gedrückt. In dieser Position trennte die Trennwand die Sonde von der Lösung. Der Sonde wurde dann Leistung zugeführt, und die Lösung wurde für 15 s beschallt, wobei eine weiße Lösung aus feinverteilten Mikrobläschen entstand, die eine anzahlmittelgewichtete Größe von 5 μm hatten, gemessen mit einem Laserlichtzerstreuungs-Partikelanalysegerät Horiba LA-700.
Beispiel II
Messung der In-vitro-Größe der Mikrobläschen im Reagenzglas
Die In-vitro-Größe (Größe im Reagenzglas) der Mikrobläschen, die in Beispiel I zubereitet wurden, wurden durch Laserlichtstreuung gemessen. Untersuchungen der Bläschen wurden durchgeführt, wobei die Mikrobläschen zu einer Dextrosewasserlösung von 4% (1:50) verdünnt wurden, die durch ein Laserlichtstreuungs-Analysegerät Horiba LA-700 umgewälzt wurden. Die mittlere Mikrobläschengröße war 5 μm, und die Größe verdoppelte sich in 25 min.
Interessanterweise hatten Mikrobläschen, die nach demselben Verfahren wie in Beispiel I ohne Verwendung eines Osmosegasmittels hergestellt wurden (wo das Perfluorhexan/Luftgemisch durch Luft ersetzt war), eine mittlere Größe von 11 μm und ergaben bei 10 s nur Hintergrundwerte auf dem Partikelanalysegerät.
Beispiel III
Messung der Lebensdauer der Mikrobläschen im lebenden Organismus

Die Lebensdauern der Mikrobläschen, die nach Beispiel I hergestellt worden sind, wurden bei Kaninchen gemessen mittels Injektion von 0,2 ml frisch erzeugter Mikrobläschen in eine marginale Ohrvene eines Kaninchens, das mit einem Ultraschallbildgewinnungsinstrument Accuson 128XP/5 mit einem Wandler von 5 MHz beobachtet wurde. Mehrere Versuche wurden durchgeführt, bei denen Bilder des Herzens, der Vena cava inferior/Aorta und der Niere gemacht wurden, während die Zeit und der Umfang der beobachtbaren Kontrastverbesserung gemessen wurden. Die Ergebnisse sind in der nachstehenden Tabelle II dargestellt: Tabelle II

Organ	Dosis	Zeit bis zur maximale Intensität	Zeit bis zur minimal verwendbaren Intensität	Zeit, bis keine Verbesserung auftrat
Herz	0,1 ml/kg	7–10 s	8–10 min	25 min
IVC/Aorta	0,1 ml/kg	7–10 s	8–10 min	25 min
Niere	0,1 ml/kg	7–10 s	8–10 min	25 min

In Tabelle III ist ein Vergleich von Mikrobläschen dargestellt, die auf eine identische Weise ohne Verwendung eines Osmosegases zubereitet worden sind (es wurde nur Luft verwendet). Man beachte, daß sporadische Reflektionen nur in der rechten Herzkammer während der Injektion beobachtet wurden, die jedoch unmittelbar nach der Dosierung verschwanden. Tabelle III

Organ	Dosis	Zeit bis zur maximalen Intensität	Zeit bis zur minimal verwendbaren Intensität	Zeit, bis keine Verbesserung auftrat
Herz	0,1 ml/kg	0	0	0
IVC/Aorta	0,1 ml/kg	0	0	0
Niere	0,1 ml/kg	0	0	0

Die Verwendung eines Osmosemittels erhöhte die Zeitdauer, in der Mikrobläschen sichtbar waren, dramatisch.
Beispiel IV
Zubereitung von gemischten osmotisch stabilisierten Mikrobläschen
Mikrobläschen mit einer anzahlmittelgewichteten Größe von 5 µm wurden durch Beschallung einer isotonischen wäßrigen Phase zubereitet, die 2% Pluronic F-68 und 1% Saccharosestearat als Surfactant und Gemische aus Perfluorhexan und Perfluorbutan als die Osmosemittel enthielt.
Bei diesem Experiment wurde 1,3 ml sterile Wasserlösung, die 0,9% NaCl und 2% Pluronic F-68 enthielt, einer Ampulle von 2,0 ml zugesetzt. Die Ampulle hatte einen verbleibenden Kopfraum von 0,7 ml, der anfänglich Luft enthielt. Ein Osmosegasgemisch aus Perfluorhexan mit 540 Torr und Perfluorbutan mit 220 Torr wurde verwendet, um den Kopfraum vor dem Verschließen mit einer 0,22 mm dünnen PTFE-Trennwand zu spülen. Die Ampulle wurde beschallt wie in Beispiel I, wobei eine weiße Lösung aus feinverteilten Mikrobläschen entstand, die eine mittlere Partikelgröße von 5 µm hatten, gemessen mit einem Laserlichtzerstreuungs-Partikelanalysegerät Horiba LA-700. Dieser Vorgang wurde noch zweimal wiederholt, einmal mit reinem Perfluorbutan und dann mit einem Gemisch von 540 Torr Luft plus 220 Torr Perfluorhexan. Die Beständigkeit aller drei Präparate im Gefäßsystem wurde durch Ultraschallbildgewinnung bei einem Kaninchen nach intravenöser Injektion bestimmt und ist nachstehend aufgeführt:

1,5 min Perfluorbutan

2 min Perfluorhexan + Luft

3 min Perfluorbutan + Perfluorhexan
Das Gemisch aus Perfluorkohlenwasserstoffen bestand länger als eines der beiden Mittel allein.
Beispiel V
Zubereitung von osmosegasstabilisierten Mikrobläschen aus löslichen sprühgetrockneten Kügelchen
Osmosegasstabilisierte Mikrobläschen wurden durch Lösung hohler sprühgetrockneter Lactosekügelchen, die mit einem Luft-Perfluorhexandampfgemisch gefüllt waren, in einer Surfactant-Lösung zubereitet.
Sprühgetrocknete Laktose-Kügelchen mit einem mittleren Durchmesser von annähernd 100 µm und mit zahlreichen 10 bis 50 μm große Hohlräumen wurden von DMV International unter dem Handelsnamen PHARMATOSE DCL-11 bezogen. 90 mg Lactosekügelchen wurden in eine Ampulle von 2,0 ml eingebracht. Die porösen Kügelchen wurden mit einem Gemisch von 220 Torr Perfluorhexan und 540 Torr Luft gefüllt durch zyklische Veränderung des Gasdrucks in der Ampulle zwischen 1 Atmosphäre und 1/2 Atmosphäre bei insgesamt 12 Wiederholungen in 5 min. Eine Surfactant-Lösung, die 0,9% Natriumchlorid, 2% Pluronic-F68 und 1% Saccharosestearat enthielt, wurde auf annähernd 45°C erwärmt, um die Lösung der Lactose zu beschleunigen, bevor 1,5 ml der gewärmten Lösung in die Ampulle eingeleitet wurde. Die Ampulle wurde dann durch Umkehrung für annähernd 30 s sanft geschüttelt, um die Lactose vor der Einleitung der derartig zubereiteten Mikrobläschen in das Partikelanalysegerät Horiba LA-700 zu lösen. Ein volumengewichteter mittlerer Durchmesser von 7,7 µm wurde annähernd 1 min nach Auflösung gemessen. Der Durchmesser dieser Mikrobläschen blieb nahezu konstant, wobei er sich in 10 min zu einem mittleren Durchmesser von 7,1 µm änderte. Wenn das Experiment mit luftgefüllter Lactose wiederholt wurde, ergab das Partikelanalysegerät 1 min nach der Auflösung nur Hintergrundwerte, wobei demonstriert wurde, daß gasosmosestabilisierte Mikrobläschen durch Auflösung von gasgefüllten hohlraumhaltigen Strukturen hergestellt werden können.
Beispiel VI
Zubereitung großer Bläschen, die auf eine gewünschte Größe schrumpfen
Mikrobläschen mit einer volumenmittelgewichteten Größe von 20 µm, auf 2 µm schrumpfend, wurden durch Beschallung einer isotonischen wäßrigen Phase zubereitet, die 2% Pluronic F-68 als Surfactant, CO₂ als Verdünnungsgas und Perfluorhexan als das Osmosegasmittel enthielt.
Bei diesem Experiment wurde 1,3 ml sterile Wasserlösung, die 0,9% NaCl, 2% Pluronic F-68 und 1% Saccharosestearat enthielt, in eine Ampulle von 2,0 ml eingebracht. Die Ampulle hatte einen verbleibenden Kopfraum von 0,7 ml, der anfänglich Luft enthielt. Ein Gemisch aus Luft, das mit Perfluorhexan bei 25°C gesättigt war, verdünnt um einen Faktor 10 mit CO₂ (684 Torr CO₂ + 54 Torr Luft + 22 Torr Perfluorhexan), wurde verwendet, um den Kopfraum zu spülen. Die Ampulle wurde mit einer 0,22 mm dünnen PTFE-Trennwand verschlossen. Die Ampulle wurde beschallt wie in Beispiel I, wobei eine weiße Lösung aus feinverteilten Mikrobläschen mit einer mittleren Partikelgröße von 28 µm entstand, gemessen mit einem Laserlichtstreuungs-Analysegerät Horiba LA-700. In der Lösung aus 4% Dextrose plus 0,25 mM NaOH des Horiba-Gerätes schrumpfte der mittlere Bläschendurchmesser schnell in 2 bis 4 min von 28 µm auf 5 bis 7 µm und blieb dann relativ konstant, wobei nach 27 min 2,6 µm erreicht wurden. Die Ursache dafür ist, daß das CO₂ die Mikrobläschen verläßt, indem es sich in der Wasserphase löst.
Beispiel VII
Wirkung des nicht-newtonschen viskoelastischen Surfactant-Saccharosestearat
Mikrobläschen wurden wie in Beispiel I oben unter Verwendung von 0,9% NaCl, 2% Pluronic F-68 und 2% Saccharosestearat als Surfactant und mit perfluorpropangesättigter Luft und perfluorhexangesättigter Luft im Kopfraum zubereitet. Diese beiden Zubereitungen wurden mit der gleichen Surfactant-Lösung minus Saccharosestearat wiederholt. Alle vier Mikrobläschenpräparate wurden bewertet wie in Beispiel III oben. Die nutzbare Beständigkeit dieser Mikrobläschen im Gefäßsystem ist nachstehend aufgeführt:
Beständigkeit bei 2% Pluronic F-68 + 2% Saccharosestearat
Perfluorpropan 2 min
Perfluorhexan 4 min
Beständigkeit bei nur 2% Pluronic F-68
Perfluorpropan 2 min
Perfluorhexan 1 min
Wie oben zu sehen ist, verhinderte die durch die nicht-newtonschen elastischen Eigenschaften des Saccharosestearats ermöglichte, reduziete Oberflächenspannung, daß das weniger flüchtige Perfluorhexan kondensierte, so daß Perfluorhexanmikrobläschen mit langer Beständigkeit hergestellt werden konnten.
Beispiel VIII
Sprühtrocknen von stärkehaltiger Emulsion
Ein Liter jeder der folgenden Lösungen wurde mit Wasser für eine Injektion zubereitet: Lösung A, die 4,0% Gew./Vol. N-Lok-Pflanzenstärke (National Starch and Chemical Co., Bridgewater, NJ) und 1,9% Gew./Vol. Natriumchlorid (Mallinckrodt, St. Louis, MO) enthielt, und Lösung B, die 2% Supersonic F-68 (Serva Heidelberg, Deutschland) und 2,0% Gew./Vol. Ryotosaccharosestearat S-1670 (Mitsubishi-Kasei Food Corp., Tokyo, Japan) enthielt. Die Lösung B wurde in einen Mischer mit hoher Scherkraft eingebracht und in einem Eisbad gekühlt. Eine grobe Suspension von 40 ml 1,1,2-Trichlortrifluorethan (Freon 113; EM Science, Gibbstown, NJ) wurde in 1 Liter Lösung B hergestellt. Diese Suspension wurde unter Verwendung eines Mikroverflüssigers (Micorofluidics Corporation, Newton, MA; Modell M-110F) bei 10 000 psi und 5°C in 5 Durchläufen emulgiert. Die resultierende Emulsion wurde einer Lösung A zugesetzt, um die folgende Formel zum Sprühtrocknen zu erzeugen:
2,0% Gew./Vol. N-Lok
1,0% Gew./Vol. Superonic F-68
1,0% Gew./Vol. Saccharosestearat S-1670
0,95% Gew./Vol. Natriumchlorid
2,0% Gew./Vol. 1,1,2-Trichlortrifluorethan
Diese Emulsion wurde dann in einem tragbaren Sprühtrockner von Niro Atomizer sprühgetrocknet, der mit 2 Fluidzerstäubern ausgerüstet ist (Niro Atomizer, Kopenhagen, Dänemark) und der die folgenden Einstellungen verwendet:
Warmluftdurchflußrate = 39,5 Kubikfuß/min
Einlaßlufttemperatur = 235°C
Auslaßlufttemperatur = 10°C
Zerstäuberluftmenge = 110 l/h
Emulsionszuführmenge = 1 l/h
Das trockene, hohle kugelförmige Erzeugnis hatte einen Durchmesser zwischen etwa 1 µm und etwa 15 µm und wurde in einem Zyklonabscheider gesammelt, wie es für diesen Trockner üblich ist. Aliquoten des Pulvers (250 mg) wurden in Röhrchenampullen von 10 ml eingewogen, mit perfluorhexangesättigtem Stickstoff bei 13°C besprengt und verschlossen. Der Stickstoff wurde mit Perfluorhexan gesättigt, indem er durch drei perfluorhexangefüllte Gaswaschflaschen geführt wurde, die in einem Wasserbad von 13°C eingetaucht waren.
Die Ampullen wurden mit 5 ml Wasser für Injektionszwecke rehydratisiert, nach dem Einfügen einer Nadel der Größe 18 als Lüftungsöffnung zur Druckentlastung, als das Wasser injiziert wurde. 1 ml der resultierenden Mikrobläschensuspension wurde intravenös in ein Kaninchen von annähernd 3 kg injiziert, das an die Instrumente angeschlossen war, um das Dopplerultraschallsignal seiner Halsschlagader zu beobachten. Eine 10-MHz-Durchflußmanschette (Triton Technology Inc., San Diego, CA; Modell ES-10-20), die mit einem Dopplerdurchflußmodul System 6 (Triton Technology Inc.) verbunden war, lieferte das RF-Dopplersignal an ein Oszilloskop LeCroy 9410 (LeCroy, Chestnut Ridge, NY). Die vom Oszilloskop berechnete Effektiv-(RMS-)Spannung des Signals wurde an einen Computer übertragen und die resultierende Kurve angepaßt, um die Spitzen-Echosignalintensität und die Halbwertszeit der Mikrobläschen im Blut zu ermitteln. Signale vor Kontrastverbesserung waren kleiner als 0,1 V Effektivspannung. Ein Spitzensignal von effektiv 1,6 V wurde bei einer Halbwertszeit von 52,4 s festgestellt, womit erwiesen war, daß man mit sprühgetrockneten Pulvern intravaskuläre echofähige Mikrobläschen erzeugen kann, die eine verlängerte Halbwertszeit im lebenden Organismus haben.
Beispiel IX
Herstellung von Mikrobläschen, die Hydroxyethylstärke enthalten
Eine Emulsion zum Sprühtrocknen wurde wie in Beispiel VIII zubereitet, um folgende entgültige Zusammensetzung zu ergeben:
2,0% Gew./Vol. m-HES-Hydroxyethylstärke (Ajinimoto, Tokyo, Japan)
2,0% Gew./Vol. Natriumchlorid (Mallinckrodt)
1,74% Natriumphosphat, zweibasisch (Mallinckrodt)
0,26% Gew./Vol. Natriumphosphat, einbasisch (Mallinckrodt)
1,7% Gew./Vol. Superonic F-68 (Serva)
0,2% Gew./Vol. Ryotosaccharosestereat S-1670 (Mitsubishi-Kasei Food Corp.)
0,1% Gew./Vol. Ryotosaccharosestereat S-570 (Mitsubishi-Kasei Food Corp.)
4,0% Gew./Vol. 1,1,2-Trichlortrifluorethan (Freon 113; EM Science, Gibbstown, NJ)
Diese Emulsion wurde sprühgetrocknet wie in Beispiel VIII unter Verwendung der folgenden Parameter:
Warmluftdurchflußmenge = 39,5 Kubikfuß/min
Einlaßlufttemperatur = 220°C
Auslaßlufttemperatur = 105°C
Zerstäuberluftmenge = 110 l/h
Emulsionszuführmenge = 1 l/h
Es wurden Probeampullen zubereitet mit 400 mg sprühgetrocknetem Pulver und wie in Beispiel VIII besprengt. Nach der Rehydratation mit 5 ml Wasser zur Injektion und intravenöser Verabreichung von 1,0 ml an ein Kaninchen wie in Beispiel VIII wurde ein Spitzensignal von effektiv 2,4 V bei einer Halbwertzeit von 70,9 s beobachtet. Dies zeigt, daß man mit derivatisierten, injizierbaren Stärken mit höherem Molekulargewicht und mit Zuckerpolyestern höhere Signale vom lebenden Organismus erzeugen kann, die länger anhalten im Vergleich zu normaler Pflanzenstärke (Beispiel VIII). Dies zeigt auch die geringere Surfactant-Konzentration, die von einer optimale sprühgetrocknete Formulierung gefordert wird, und die Verwendung eines Sprühtrockungs-Aufblasmittels, z. B. Freon 113.
Beispiel X
Stabilität von stärkehaltigen Mikrobläschen
Das in Beispiel VIII beschriebene sprühgetrocknete Pulver wurde rehydratisiert, wie beschrieben. Zum Vergleich wurden die beschallten Mikrobläschen aus Beispiel I zubereitet, und beide wurden mit Lichtmikroskopie innerhalb von 2 min bei der Zubereitung und wiederum 10 min nach Zubereitung geprüft. Es wurde festgestellt, daß das beschallte Erzeugnis eine breitere anfänglichere Bläschendurchmesserverteilung hat (zwischen etwa 1 und etwa 30 µm) als das rehydratisierte sprühgetrocknete Pulver (zwischen etwa 3 und etwa 15 µm). Nach 10 min wurden die Ampullen geschüttelt, neue Proben genommen und wiederum mit Lichtmikroskopie beobachtet. Das rehydratisierte sprühgetrocknete Erzeugnis war im wesentlichen unverändert, obwohl die beschallten Mikrobläschen durch Disproportionierung größer geworden waren, bis nahezu alle beobachtbaren Mikrobläschen einen Durchmesser von mehr als 10 µm hatten. Dieses Experiment demonstrierte die verlängerte Stabilität von durch Sprühtrocknung erzeugten Mikrobläschen im lebenden Organismus und daß Stärken die In-vitro-Stabilität erhöhen können.
Beispiel XI
Mikrobläschenbildung unter Verwendung einer Zweikammer-Ampulle
800 mg sprühgetrocknetes Pulver aus Beispiel X wurde in die untere Kammer einer Zweikammer-Ampulle Wheaton RS-177FLW von 20 ml eingewogen (1). Die Ampulle wurde vor Einfügung des Zwischenkammerverschlusses mit perfluorhexangesättigtem Stickstoff bei 13°C gespült. Die obere Kammer wurde zur Injektion mit 10 ml sterilem Wasser gefüllt. Der Stopfen der oberen Kammer wurde eingesetzt, um alle Luftbläschen in der oberen Kammer zu beseitigen. Beim Drücken auf den oberen Stopfen wurde der Zwischenkammerverschluß in die untere Kammer gedrückt, wodurch das Wasser in die untere Kammer fließen und das Pulver rehydratisieren konnte (2). Es entstanden zahlreiche stabile Mikrobläschen, wie durch Lichtmikroskopie demonstriert wurde. Dieser Vorgang demonstrierte die Zweckmäßigkeit dieser Verpackungsform und daß es nicht mehr notwendig ist, eine Lüftungsöffnung vorzusehen, um einen Druckaufbau zu beseitigen, wenn die wäßrige Phase dem Pulver hinzugesetzt wird.
Beispiel XII
Mikrobläschenbildung unter Verwendung einer Zweikammer-Spritze
100 mg sprühgetrocknetes Pulver aus Beispiel IX wurde in eine HYPAK-Flüssig/Trocken-Zweikammer-Spritze für 5 ml plus 5 ml (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ) eingewogen und in der Pulver-Kammer (am Nadelende) geschüttelt. Der Zwischenkammerverschluß wurde dann direkt über dem Umgehungskanal positioniert. Eine 5-μm-Filternadel wurde dann an der Spritze angebracht. Die pulverhaltige Kammer wurde dann mit dem Osmosegasmittel gefüllt, indem die Anordnung in einer Vakuumkammer plaziert wurde, evakuiert wurde und die Kammer erneut mit Osmosegasmittel, perfluorhexangesättigtem Stickstoff, bei 13°C gefüllt wurde. Die Filternadel ermöglicht die Evakuierung und erneute Füllung mit Atmosphäre in der pulverhaltigen Kammer. Eine dichtende Nadelabdeckung wurde dann auf der Nadel plaziert. Die Flüssigkeitskammer wurde dann mit 4 ml Wasser zur Injektion gefüllt, und der Kolben wurde unter Verwendung einer zeitweiligen Lüftungsöffnung aufgesetzt (Draht zwischen Glasspritzenzylinder und dem Kolben eingefügt, um alle Luftblasen zu beseitigen).
Zur Rehydratisierung wurde die dichtende Nadelabdeckung entfernt, um den Druckaufbau in der Pulverkammer zu beseitigen. Der Kolben wurde dann niedergedrückt, wobei der Zwischenkammerverschluß zur Umgehungsposition geschoben wurde, in der das Wasser um die Zwischenkammerdichtung herum in die pulverhaltige Kammer fließen kann. Die Kolbenbewegung wurde unterbrochen, als das gesamte Wasser in der Pulverkammer war. Die Spritze wurde geschüttelt, um das Pulver zu lösen. Überschüssiges Gas und große Blasen wurden ausgestoßen, indem die Spritze mit dem Nadelende nach oben gehalten und auf den Kolben gedrückt wurde. Die Lösung, die zahlreiche stabilisierte Mikrobläschen enthielt (wie durch Lichtmikroskopie beobachtet) wurde dann durch Drücken des Kolbens bis zum Anschlag aus der Spritze ausgestoßen.

Claims

Verfahren zur Bildung stabilisierter Mikrogasbläschen in einer Flüssigkeit, wobei das Verfahren die folgenden Schritte aufweist: Bereitstellen eines ersten Gases, eines zweiten Gases, eines membranbildenden Materials und einer Flüssigkeit, wobei das erste Gas und das zweite Gas in einem molaren Verhältnis von etwa 1:100 bis etwa 1000:1 vorhanden sind und wobei das erste Gas bei 37°C einen Dampfdruck von mindestens etwa (760 – x) mm Hg hat, wobei x der Dampfdruck des zweiten Gases bei 37°C ist, wobei der Dampfdruck des ersten und zweiten Gases bei 37°C größer als etwa 75 mm Hg ist, mit der Maßgabe, daß das erste Gas und das zweite Gas kein Wasserdampf sind, wobei das erste Gas ein Nichtfluorkohlenwasserstoff ist, ausgewählt aus der Gruppe Stickstoff, Sauerstoff, Kohlendioxid und Gemischen daraus, und das zweite Gas einen Fluorkohlenwasserstoff aufweist, ausgewählt aus der Gruppe Perfluorpropane C₃F₈, Perfluorbutane C₄F₁₀, Perfluorpentane C₅F₁₂, Perfluorcyclopentane C₅F₁₀, Perfluormethylcyclobutane C₅F₁₀, Perfluorhexane C₆F₁₄, Perfluorcyclohexane C₆F₁₂, Perfluormethylcyclopentane C₆F₁₂, Perfluordimethylcyclobutane C₆F₁₂; und Umgeben der ersten und zweiten Gase mit dem membranbildenden Material, um Mikrogasbläschen in der Flüssigkeit zu bilden.
Verfahren nach Anspruch 1, das ferner die folgenden Schritte aufweist: anfängliches Bilden von Mikrogasbläschen mit einem ersten mittleren Durchmesser, wobei das anfängliche Verhältnis des ersten Gases zu dem zweiten Gas in den Mikrogasbläschen mindestens etwa 1:1 ist, Kontaktieren der Mikrogasbläschen mit einem ersten mittleren Durchmesser mit einem flüssigen Medium; Schrumpfen der Mikrogasbläschen in dem Medium als Folge eines Verlusts des ersten Gases durch die Membran; und dann Stabilisieren der Mikrogasbläschen bei einem zweiten mittleren Durchmesser, der geringer als etwa 75% des ersten Durchmessers ist für eine Zeitspanne von mindestens einer Minute.
Verfahren nach Anspruch 2, wobei die Mikrogasbläschen bei dem zweiten Durchmesser stabilisiert werden, indem ein Gas bei einem osmotischen Druckdifferential durch die Membran bereitgestellt wird, so daß die Spannung eines Gases oder von Gasen, die in dem Medium gelöst sind, gleich oder größer als der Partialdruck des gleichen Gases oder der Gase innerhalb der Mikrogasbläschen ist.
Verfahren nach Anspruch 2, wobei der erste Durchmesser mindestens etwa 5 µm ist.
Sprühgetrocknete hohle Mikrokügelchen-Zusammensetzung zum Bilden stabilisierter Mikrogasbläschen nach Zusetzen in eine Flüssigkeit, wobei ein erstes und ein zweites Gas in dem Mikrogasbläschen vorhanden sind; und die hohlen Mikrokügelchen einen mittleren Durchmesser von weniger als etwa 100 µm haben und einen oberflächenaktiven Stoff in Verbindung mit einem oder mehreren Kohlenhydraten aufweisen, welche aus der Gruppe ausgewählt werden, die besteht aus: Stärken, Stärkederivaten, Dextrin und Verbindungen daraus, und wobei das erste Gas und das zweite Gas jeweils in einem molaren Verhältnis von etwa 1:100 bis etwa 1000:1 vorhanden sind und wobei das erste Gas ein Nichtfluorkohlenwasserstoff ist, ausgewählt aus der Gruppe Stickstoff, Sauerstoff, Kohlendioxid und Gemischen daraus, und das zweite Gas einen Fluorkohlenwasserstoff aufweist, ausgewählt aus der Gruppe Perfluorpropane C₃F₈, Perfluorbutane C₄F₁₀, Perfluorpentane C₅F₁₂, Perfluorcyclopentane C₅F₁₀, Perfluormethylcyclobutane C₅F₁₀, Perfluorhexane C₆F₁₄, Perfluorcyclohexane C₆F₁₂, Perfluormethylcyclopentane C₆F₁₂, Perfluordimethylcyclobutane C₆F₁₂.
Mikrokügelchen-Zusammensetzung nach Anspruch 5, wobei der oberflächenaktive Stoff einen Bestandteil mit einem hydrophil-lipophilen Gleichgewicht von weniger als etwa 8 hat.
Mikrokügelchen-Zusammensetzung nach Anspruch 5, wobei das erste Gas und das zweite Gas jeweils in einem molaren Verhältnis von etwa 1:30 bis etwa 100:1 vorhanden sind und wobei das erste Gas bei 37°C einen Dampfdruck von mindestens etwa (760 – x) mm Hg hat, wobei x der Dampfdruck des zweiten Gases bei 37°C ist und wobei der Dampfdruck des ersten und zweiten Gases bei 37°C größer als etwa 75 mm Hg ist.
Stabilisierte gasgefüllte Mikrogasbläschen-Zubereitung, die aufweist: eine Mischung aus einem ersten Gas oder Gasen und einem zweiten Gas oder Gasen innerhalb von im allgemeinen kugelförmigen Membranen, um Mikrogasbläschen zu bilden, wobei das erste Gas und das zweite Gas jeweils in einem molaren Verhältnis von etwa 1:100 bis etwa 1000:1 vorhanden sind und wobei das erste Gas bei 37°C einen Dampfdruck von mindestens etwa (760 – x) mm Hg hat, wobei x der Dampfdruck des zweiten Gases bei 37°C ist und wobei das erste Gas ein Nichtfluorkohlenwasserstoff ist, ausgewählt aus der Gruppe Stickstoff, Sauerstoff, Kohlendioxid und Gemischen daraus, und das zweite Gas einen Fluorkohlenwasserstoff aufweist, ausgewählt aus der Gruppe Perfluorpropane C₃F₈, Perfluorbutane C₄F₁₀, Perfluorpentane C₅F₁₂, Perfluorcyclopentane C₅F₁₀, Perfluormethylcyclobutane C₅F₁₀, Perfluorhexane C₆F₁₄, Perfluorcyclohexane C₆F₁₂, Perfluormethylcyclopentane C₆F₁₂, Perfluordimethylcyclobutane C₆F₁₂.
Stabilisierte gasgefüllte Mikrogasbläschen-Zubereitung nach Anspruch 8, die ferner aufweist: einen Behälter, in den die stabilisierten Mikrogasbläschen, die eine Mischung aus dem ersten Gas oder den Gasen und dem zweiten Gas oder den Gasen aufweisen, eingeschlossen sind.
Zubereitung nach Anspruch 8, wobei: die stabilisierten Mikrogasbläschen in einem flüssigen Medium sind und einen ersten mittleren Durchmesser haben; das Verhältnis des ersten Gases zu dem zweiten Gas in den stabilisierten Mikrogasbläschen mindestens 1:1 ist und die stabilisierten Mikrogasbläschen geeignet sind, als Folge eines Verlustes des ersten Gases durch die Membran in dem Medium auf einen zweiten mittleren Durchmesser von weniger als etwa 75% des ersten Durchmessers zu schrumpfen und dann als Folge eines osmotischen Gasdruckdifferentials durch die Membran bei oder etwa bei dem zweiten Durchmesser mindestens etwa 1 Minute stabilisiert zu bleiben.
Zubereitung nach Anspruch 10, wobei das Medium wäßrig ist.
Zubereitung nach Anspruch 10, wobei das Medium in einem Behälter ist und die Mikrogasbläschen in dem Behälter gebildet wurden.
Zubereitung nach Anspruch 10, wobei das Medium Blut im lebenden Organismus ist.
Zubereitung nach Anspruch 10, wobei das flüssige Medium darin gelöstes Gas oder Gase mit einer Gasspannung von mindestens etwa 700 mm Hg enthält, wobei der erste Durchmesser mindestens etwa 5 µm ist und wobei die Spannung des in dem Medium gelösten Gases oder der Gase geringer als der Druck des gleichen Gases oder der Gase innerhalb des Mikrogasbläschens ist.
Zubereitung nach Anspruch 10, wobei der erste Durchmesser mindestens etwa 10 μm ist und der zweite Durchmesser zwischen etwa 1 μm und 6 μm ist.
Zubereitung nach Anspruch 8, wobei das zweite Gas ein mittleres Molekulargewicht von mindestens 4 mal dem des ersten Gases hat.
Zubereitung nach Anspruch 8, wobei das zweite Gas bei 37°C einen Dampfdruck von weniger als etwa 750 mm Hg hat.
Zubereitung nach Anspruch 17, wobei das molare Verhältnis des ersten Gases zu dem zweiten Gas von etwa 1:10 bis etwa 500:1 ist.
Zubereitung nach Anspruch 8 oder 17, wobei das zweite Gas mindestens zwei Fluorkohlenwasserstoffe aufweist oder wobei das zweite Gas Perfluorhexan aufweist.
Zubereitung nach Anspruch 9, die ferner eine Flüssigkeit in dem Behälter als Beimischung zu den Mikrogasbläschen aufweist, wobei der Behälter ferner Einrichtungen zum Übertragen von ausreichend Ultraschallenergie an die Flüssigkeit aufweist, um die Bildung der Mikrogasbläschen durch Ultraschallbehandlung zu ermöglichen.
Zubereitung nach Anspruch 20, wobei die Übertragungseinrichtung ein flexibles Polymermaterial mit einer Dicke von weniger als etwa 0,5 mm aufweist.
Zubereitung nach Anspruch 8, wobei die im allgemeinen kugelförmige Membran ein oberflächenaktiver Stoff ist.
Zubereitung nach Anspruch 22, wobei der oberflächenaktive Stoff ein Kohlenhydrat, bevorzugt ein Polysaccharid ist.
Zubereitung nach Anspruch 22, wobei der oberflächenaktive Stoff proteinös bzw. eiweißartig ist.
Zubereitung nach Anspruch 8, wobei die Membran fest oder halbfest ist.
Zubereitung nach Anspruch 8, wobei die Membran ein proteinöses bzw. eiweißartiges Material, bevorzugt Albumin, ist.
Ausstattung zum Bilden stabilisierter Mikrogasbläschen aus einem festen Vorläufer, wobei die Ausstattung aufweist: eine Flasche, die eine gasförmige Phase und feste oder halbfeste im wesentlichen wasserlösliche hohlraumenthaltende Strukturen enthält, welche mehrere Hohlräume mit einem mittleren Durchmesser von weniger als etwa 100 μm definieren; einen oberflächenaktiven Stoff in der Flasche, wobei die gasförmige Phase aus einem Fluorkohlenwasserstoff ausgewählt aus der Gruppe Perfluorpropane C₃F₈, Perfluorbutane C₄F₁₀, Perfluorpentane C₅F₁₂, Perfluorcyclopentane C₅F₁₀, Perfluormethylcyclobutane C₅F₁₀, Perfluorhexane C₆F₁₄, Perfluorcyclohexane C₆F₁₂, Perfluormethylcyclopentane C₆F₁₂, Perfluordimethylcyclobutane C₆F₁₂, und einem Gas besteht, das aus der Gruppe ausgewählt wird, die aus Sauerstoff, Kohlendioxid, Stickstoff oder Mischungen daraus besteht.
Ausstattung nach Anspruch 27, wobei die gasförmige Phase ein osmotisches Gasmittel mit einer Wasserlöslichkeit von nicht mehr als 0,5 mM bei 25°C und einer Atmosphäre aufweist.
Ausstattung nach Anspruch 27, wobei die Mikrogasbläschen durch die Anwendung von Energie gebildet werden.
Ausstattung nach Anspruch 29, wobei die Anwendung von Energie mechanisches Schütteln, einfaches Schütteln, Beschallung oder Ultraschall-Schwingungen ist.
Ausstattung nach Anspruch 27, wobei das zweite Gas, nachdem die stabilisierten Mikrogasbläschen gebildet und injiziert wurden, von dem externen Medium in und aus dem Mikrogasbläschen diffundiert.
Ausstattung nach Anspruch 27, wobei die hohlraumenthaltende Struktur eine sprühgetrocknete Stärke oder sprühgetrocknetes Stärkederivat aufweist.
Ausstattung nach Anspruch 27, wobei die hohlraumenthaltende Struktur einen oberflächenaktiven Stoff aufweist.
Ausstattung nach Anspruch 33, wobei der oberflächenaktive Stoff ein nicht-newtonscher oberflächenaktiver Stoff ist.
Ausstattung nach Anspruch 33, wobei ein Bestandteil des oberflächenaktiven Stoffes ein hydrophil-lipophiles Gleichgewicht von mindestens 12 hat.
Ausstattung nach Anspruch 27, wobei die Flasche eine Menge an Zuckerester mit einem HLB-Wert von weniger als 8 hat, um die Halbwertszeit von daraus gebildeten Mikrogasbläschen im lebenden Organismus zu vergrößern.
Ausstattung nach Anspruch 27, wobei die hohlraumenthaltende Struktur sprühgetrocknete Mikrokügelchen aufweist.
Ausstattung nach Anspruch 37, wobei die Mikrokügelchen einen oberflächenaktiven Stoff und entweder (a) eine Stärke oder ein Stärkederivat oder ein Dextrin oder (b) einen Zuckerester aufweisen.
Ausstattung für die Verwendung bei der Herstellung stabilisierter Mikrogasbläschen direkt in einer Flüssigkeit, wobei die Ausstattung aufweist: einen verschlossenen Behälter; eine Flüssigkeit in dem Behälter; einen oberflächenaktiven Stoff in dem Behälter; und ein Fluorkohlenwasserstoffgas oder -dampf ausgewählt aus der Gruppe Perfluorpropane C₃F₈, Perfluorbutane C₄F₁₀, Perfluorpentane C₅F₁₂, Perfluorcyclopentane C₅F₁₀, Perfluormethylcyclobutane C₅F₁₀, Perfluorhexane C₆F₁₄, Perfluorcyclohexane C₆F₁₂, Perfluormethylcyclopentane C₆F₁₂, Perfluordimethylcyclobutane C₆F₁₂, und ein Nichtfluorkohlenwasserstoffgas ausgewählt aus der Gruppe Stickstoff, Sauerstoff, Kohlendioxid oder Gemischen daraus, in dem Behälter, wobei die Flüssigkeit, der oberflächenaktive Stoff und das Fluorkohlenwasserstoffgas oder der -dampf und das Nichtfluorkohlenwasserstoffgas gemeinsam geeignet sind, nach der Anwendung von Energie Mikrogasbläschen zu bilden.
Ausstattung nach Anspruch 39, die ferner eine Einrichtung in dem Behälter aufweist, um die Übertragung von ausreichend externer Energie an die Flüssigkeit zu ermöglichen, um Mikrogasbläschen in dem Behälter zu bilden.
Ausstattung nach Anspruch 39, wobei die Anwendung von Energie mechanisches Schütteln, einfaches Schütteln, Beschallung oder Ultraschall-Schwingungen ist.
Ausstattung nach Anspruch 39, die ferner ein Nichtfluorkohlenwasserstoffgas in dem Behälter aufweist, wobei das molare Verhältnis des Nichtfluorkohlenwasserstoffgases zu dem Fluorkohlenwasserstoffgas von etwa 1:100 bis etwa 1000:1 ist, mit der Maßgabe, daß das Nichtfluorkohlenwasserstoffgas kein Wasserdampf ist.
Zusammensetzung, Zubereitung oder Ausstattung nach Anspruch 5, 22 oder 33, wobei der oberflächenaktive Stoff ein oder mehrere Phospholipide aufweist.
Zubereitung nach Anspruch 22, wobei der oberflächenaktive Stoff ein nicht-newtonscher viskoelastischer oberflächenaktiver Stoff ist.
Zubereitung nach Anspruch 22, wobei der oberflächenaktive Stoff ein Fettsäureester eines Zuckers ist.
Zubereitung nach Anspruch 22, wobei der oberflächenaktive Stoff ein Sucrose-Stearat ist.
Zubereitung oder Ausstattung nach den Ansprüchen 8, 27 oder 39, wobei das Mikrogasbläschen ein lipidbeschichtetes Mikrogasbläschen ist.