DE69434423T2 - Herstellung von menschlichem rekombinantem kollagen in der milch eines transgen-tieres - Google Patents

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Description

  • Technisches Gebiet
  • Die Erfindung bezieht sich auf die Herstellung von rekombinanten Proteinen, speziell von Kollagen, in der Milch eines transgenen Säugetieres. Insbesondere betrifft die Erfindung ein Verfahren, aufgereinigte Formen von brauchbarem menschlichen Kollagen herzustellen, indem man die Sekretion des Kollagens (oder Prokollagens) in die Milch eines transgenen Säugetieres bewirkt.
  • Technischer Hintergrund
  • Kollagen ist ein Hauptstrukturprotein, das in rekonstruktiven therapeutischen Verfahren in Menschen nützlich ist. Kollagene, die für diese Zwecke benutzt werden, werden generell durch Isolierung des Materials aus Gewebe von Nutztieren wie Kühen oder Schweinen hergestellt. Obwohl Kollagene, die nach diesem Verfahren hergestellt wurden, mit einigem Erfolg eingesetzt wurden, ist Kollagen im wesentlichen doch ein für den behandelten Menschen fremdes Protein, und Immunantworten können problematisch sein.
  • Durch Behandlung des tierischen Kollagens mit proteolytischen Enzymen wurde die Immunogenizität herabgesetzt und das Problem damit verringert.
  • Es wäre daher vorteilhaft, wenn man menschliches statt Schweine- oder Rinder-Kollagen für therapeutische Zwecke bereitstellen könnte. Die Quellen für menschliches Kollagen sind limitiert und die einzige verlässliche Quelle ist menschliche Plazenta. Die US Patentanmeldung US 07/921,810 (Collagen Corporation) beschreibt die Aufreinigung von humanem Kollagen aus menschlicher Plazenta. Die Plazenta enthält verschiedene Typen von Kollagenen, in besonderem Maße Typ I, III, IV und V. Der Prozess zu Trennung und Aufreinigung der einzelnen Typen ist mangelhaft und resultiert in einen überwiegenden Typ mit geringen Mengen der anderen Typen. Die Herstellung von aufgereinigtem Kollagen aus Plazenten erfordert weitere Prozessschritte, um sicherzustellen, dass das resultierende Kollagen-Produkt frei ist von menschlichen Viren wie Hepatitis und HIV. Unter diesem Gesichtspunkt gab es Versuche, menschliches Kollagen durch rekombinante Techniken herzustellen.
  • Die Expression des menschlichem Knorpel-Prokollagen Gens (Col2A1) in Maus 3T3 Zellen wurde beschrieben (Ala-Kokko, L. et al., J. Biol. Chem (1991)266: 14175–14178). Olsen A. S. et al., beschreiben die Expression einer Minigen-Version des menschlichen pro α1(I) Kollagen Gens in Maus Fibroblasten (Olsen A. S. et al., J. Biol. Chem. (1991)266: 1117–1121). Die Expression von humaner proα2 (V) Kollagen cDNA in proα2 defizienten Hamster-Zellen wurde von Greenspan, D. S.: et al. beschrieben (J. Biol. Chem. (1989)264: 20683–20687). Auch Maus-Fibroblasten wurden für die Expression der proα1 (I) Kette eingesetzt, wobei das resultierende exprimierte Protein mit Mäuse proα2 (I) Ketten in einer Kollagen Triple-Helix komplexiert wird (Schnieke et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1987) 84: 8869–8873). Nach einer Studie von Stacey et al. waren transgene Mäuse, die so modifiziert wurden, dass sie eine mutierte Form des proα1(I) Gens enthielten, nach der Geburt nicht lebensfähig (Stacey A. et al. Nature (1988) 322: 131–136). Des weiteren erhielt man transgene Mäuse, die eine Minigen-Version des menschlichen Gens für Typ I Prokollagen systemisch exprimieren (Khillan, J. S. et al., J. Biol. Chem. (1991)266: 23373–23379; PCT-Anmeldung WO 92/22333). Diese Mäuse sind geeignet als Modellsysteme zur Untersuchung von Knochenkrankheiten, die durch das produzierte modifizierte Kollagen charakterisiert sind.
  • Die Herstellung von rekombinantem, menschlichem Kollagen ist beschwerlich durch die Notwendigkeit einer Vielzahl von posttranslationalen Enzymen, von denen man annimmt, dass sie nur in Zellen vorhanden sind, die nativ Kollagen herstellen. Man vermutet, dass mindestens 8 solcher posttranslationeller Enzyme notwendig sind (Prockop et al., New England J Med (1984) 311: 376–386). Dies hat die Versuche zur rekombinanten Produktion auf Zellen eingeschränkt, die nativ dieses Protein herstellen; das führt zwangsläufig zu chimären Formen des Proteins.
  • Um die Bildung von chimären Kollagenen zu vermeiden, die teilweise menschliche Ketten und teilweise Ketten des Säuger-Wirts in der Triple-Helix enthalten, kann es möglich sein, menschliche Zellen für die Herstellung zu nutzen. Sogar in diesem Fall ist es dennoch nicht möglich, einen bestimmten Typ eines Kollagen-Produktes zu erhalten, der frei ist von anderen Kollagen-Typen. Wie weiter untenstehend beschrieben wird, macht die Vielfalt der hergestellten Kollagene und die ihr eigenen Ähnlichkeit eine homogene Präparation entweder von der nativen oder von rekombinanten Quellen, die ihre eigenen Kollagene herstellen, unmöglich.
  • Die vorliegende Erfindung löst diese Probleme durch Synthese von menschlichem Prokollagen oder Kollagen in Zellen, die dieses Protein nativ nicht herstellen durch Bereitstellung von Techniken, die für die Produktion von Fremdproteinen in Säuger-Milch eingesetzt werden und in den hierin zitierten Veröffentlichungen beschrieben werden. Das Kollagen des ausgewählten Typs wird in die Milch entweder als Prokollagen oder als Kollagen sezerniert, abhängig von der Konstruktion des Expressionssystems und der begleitenden rekombinanten Enzym-Produktion.
  • Beschreibung der Erfindung
  • Die Erfindung sieht die rekombinante Herstellung von humanem Kollagen in einer Form vor, die die Isolierung eines homogenen Kollagen-Typs erlaubt und kann so konzipiert werden, dass die Produktion von kommerziell relevanten Mengen dieser Proteine zu angemessenen Kosten erreicht wird. Die Erfindung nutzt dabei Systeme, die für die Herstellung von rekombinanten Proteinen in Säugermilch entwickelt wurden. Sie erfordert den Einsatz dieser Techniken nicht nur, um die Expression der für die gewünschten Kollagene kodierende Gene zu bewirken, sondern auch, falls notwendig, für die Expression des Gens für jedes benötigte posttranslationale Enzym.
  • Ein Aspekt der Erfindung richtet sich auf ein Verfahren zur Herstellung eines einzelnen Typs eines trimerischen humanen Kollagens, das die pro-α1-Kette des Typ I Kollagens umfasst, eines einzelnen Typs eines trimerischen humanen Prokollagens, das die pro-α1-Kette des Typ I Kollagens umfasst oder eine Mischung aus diesem Kollagen und diesem Prokollagen. Dieses Verfahren beinhaltet die Gewinnung der Milch aus der Milchdrüse eines nicht-menschlichen Säugetiers, wobei das Säugetier modifiziert wurde, damit es ein Expressionssystem enthält, welches eine kodierende Nukleotidsequenz aufweist, welche wenigstens das menschliche Prokollagen kodiert, nutzbar verbunden, um Nukleotidsequenzen zu kontrollieren, die die Expression besonders in Milcheinweiß absondernde Epithelzellen der Milchdrüse ausführen unter Konditionen, wo die kodierende Nukleotidsequenz mit Expression versehen ist, um menschliches Prokollagen, menschliches Kollagen oder eine Mischung derselben in die Milch des Säugetieres abzusondern. Das nicht-menschliche Säugetier kann auch, falls erforderlich, so modifiziert sein, dass es in den Milch absondernden Zellen der Milchdrüse ein Expressionssystem für die Produktion eines jeden erforderlichen posttranslationalen Enzyms enthält.
  • In Abhängigkeit von der Anwesenheit oder Abwesenheit geeigneter Proteasen in der Zelle kann entweder Kollagen oder Prokollagen sezerniert werden.
  • Dem Prokollagen, das durch die im Expressionssystem enthaltene Nukleotidsequenz kodiert wird, geht eine Nukleotidsequenz voraus, die ein entsprechendes Signal kodiert. Dies ist entweder eine Signalsequenz, die natürlicherweise mit dem Prokollagen verbunden ist oder eine alternative Signalsequenz, die in den Zielzellen funktionell ist. Somit wird das Prokollagen als Resultat der rekombinanten Expression in die Milch sezerniert. Wenn die Wirtszellen Enzyme enthalten, die für gewöhnlich die Spaltung der Prosequenzen vom Kollagen bewirken, d.h. Prokollagen-Protease und/oder Prokollagen-C-Protease, wird die Prosequenz vom Prokollagen in den Zellen abgespalten und Kollagen wird in das Medium sezerniert. Falls jedoch diese Enzyme in den produzierenden Zellen nicht vorhanden sind, wird das Prokollagen sezerniert. Geringe Mengen an Proteasen führen zu einer Mischung von Kollagen und Prokollagen.
  • Scheinbar variieren die Mengen an diesen Enzymen in den Zellen, die natürlicherweise Kollagen produzieren. In Abhängigkeit von dem Gewebe und der Entwicklungsphase in der sich das Subjekt befindet, von dem das Gewebe stammt, werden größere oder geringere Anteile an Kollagen oder Prokollagen in dem sezernierten Material enthalten sein. Somit wird die Milch, die Kollagen enthält, dieses Kollagen in einer Form des menschlichen Kollagen per se, des menschlichen Prokollagen per se oder einer Mischung der beiden enthalten.
  • Obwohl es möglich wäre, von den nativen Prokollagen-Genen die kodierenden Sequenzen für die Prosequenzen zu deletieren, ist dies dennoch nicht wünschenswert, da die Pro-Region, insbesondere die C-terminale Pro-Region, die Bildung der Triple-Helix durch die Kollagen-Anteile des Moleküls ermöglicht. Folglich würden nach einer Deletion der Prosequenzen von dem Expressionsvektor die resultierenden, einzelnen Kollagen-Ketten nicht in der Lage sei, eine Triple-Helix zu formen, die aber charakteristisch für das Kollagen-Molekül ist.
  • Setzt man die entsprechenden geeigneten proteolytischen Enzyme jedoch dem in die Milch sezernierten Prokollagen zu, erhält man natürlich Kollagen.
  • In einem weiteren Aspekt stellt die Erfindung einen Expressionsvektor zur Verfügung für die Herstellung eines einzelnen Typs eines trimerischen humanen Prokollagens, das die pro-α1 Kette des Typ I Kollagens aufweist, für die Herstellung eines einzelnen Typ eines trimerischen humanen Kollagens, das die pro-α1 Kette des Typ I Kollagens aufweist oder eine Mischung aus diesem Kollagen und Prokollagen in Milch. Dieses Expressionssystem enthält eine Nukleotidsequenz, die dieses humane Prokollagen kodiert und mit einem Promotor operabel verbunden ist. Dieser Promotor bewirkt insbesondere die Expression in Milch-Protein sezernierende Zellen von Milchdrüsen. Falls erforderlich, können auch Expressionssysteme benutzt werden, die für die Herstellung von posttranslationalen Enzymen geeignet sind. Die Erfindung richtet sich auch auf nicht-humane embryonale Stammzellen (ES) und auf nicht-humane Eier – einschließlich der befruchteten Form – die so modifiziert wurden, dass sie das Expressionssystem enthalten. Die Erfindung richtet sich ebenso auf nicht-menschliche Säugetiere, denen das befruchtete Ei oder eine Blastula einschließlich der ES Zellen implantiert wurde.
  • In anderer Hinsicht führt die Erfindung zu Milch, die von einem nicht-menschlichen Säugetier wie obenstehend beschrieben produziert wird. Diese Milch enthält einen einzelnen Typ eines trimerischen humanen Kollagens, das die pro-α1 Kette des Typ I Kollagens aufweist, einen einzelnen Typ eines trimerischen humanen Prokollagens, das die pro-α1 Kette des Typ I Kollagens aufweist oder eine Mischung aus diesem Kollagen und Prokollagen. Die Erfindung stellt auch eine Zusammensetzung bereit aus einem einzelnen Typ eines trimerischen humanen Kollagens, das die pro-α1 Kette des Typ I Kollagens aufweist, einem einzelnen Typ eines trimerischen humanen Prokollagens, das die pro-α1 Kette des Typ I Kollagens aufweist oder eine Mischung aus diesem Kollagen und Prokollagen, wobei das Prokollagen oder Kollagen von dem vorstehend definierten nicht-humanen Säugetier hergestellt wird. Diese Zusammensetzungen werden erhältlich durch die Ausführung des erfindungsgemäßen Verfahrens, das die Herstellung von nur einem gewünschten rekombinanten Kollagentyp erlaubt ohne einen Hintergrund von entweder ähnlichen nicht-menschlichen Kollagenmolekülen oder Kollagenen verschiedener Typen.
  • Ausführungsformen der Erfindung
  • Kollagen ist ein gut charakterisiertes Protein; die Expression der Kollagen kodierenden Gene wurde auch kürzlich von Adams et al. in einem Übersichtsartikel beschrieben (Adams, S. L., Amer J Respir Cell and Molec Biol (1989)1: 161–168). Dieser Review fasst die bekannten existierenden Kollagentypen zusammen und beschreibt die ihnen gemeinsamen Eigenschaften. Die mRNAS, die die verschiedenen Typen von Kollagen kodieren, werden im Zytoplasma von Kollagen-produzierenden Zellen in Prokollagen Untereinheiten translatiert, die dann in Triple Helices zusammengefügt werden. Diese zusammengesetzten Prokollagene enthalten Propeptid-Extensionen an den N- und C-Termini, die helfen, die Untereinheiten zusammenzusetzen. Die Extensionen sind aber nicht Bestandteil der Dreifachhelix. Die Prosequenzen werden dann abgespalten, sodass während der Sekretion des Prokollagens eine Kollagen-Triplehelix erhalten wird. Die Kollagen-Helix selber enthält nichthelikale Extensionen, die als Telopeptide bezeichnet werden. Die triple-helikale Region beinhaltet sich wiederholende Aminosäuresequenzen mit einem Glycin in jeder dritten Position und Prolin (P) oder Hydroxyproline (HP) häufig in den anderen Positionen, sodass eine Sequenz von „triplets" der Form -(GXY)n enthalten ist, wobei X oder Y beide P oder HP sind. Einer der essentiellen posttranslationellen Schritte ist die Konversion einiger Prolin-Reste zu Hydroxyprolinen um die Stabilität der Triple-Helix bei Köpertemperatur zu sichern. Andere wichtige posttranslationale Modifikationen sind der Austausch von Disulfiden, Hydroxylierung von Lysyl-Resten, Hinzufügung von Kohlehydraten und der Aufbau und die Vernetzung der triple-helikalen Kollagenmoleküle.
  • Gemäß dem Übersichtsartikel von Adams wurden dreizehn genetisch verschiedene Kollagen-Typen beschrieben, die die Produkte von mindestens 23 Genen sind. Die häufigsten Typen in den interstitiellen Geweben sind die Typen I, III, V und VI; in Knorpel werden die Typen II, IX, X und XI gefunden. Einige dieser Typen existieren natürlicherweise als Homotriplexes andere als Heterotriplexes.
  • Die Nomenklatur der verschiedenen Kollagen-Typen ist so angelegt, dass der Ursprung des fraglichen Kollagens bestimmt wird. Beispielsweise ist die Triple-Helix vom Typ I eine Heterotriplex, die die Produkte von zwei verschiedenen Kollagen-kodierenden Genen enthält. Dieser Typ von Kollagen wird als [α1(I)]2 α2(I) bezeichnet; folglich enthält Typ I Kollagen zwei Ketten kodiert vom Col1A1 Gen und eine Proteinkette kodiert vom Col1A2 Gen. Typ III Kollagen wird bezeichnet mir [α1(III)]3 und ist folglich zusammengesetzt aus 3 identischen Ketten translatiert vom Col3A1 Gen. Typ II Kollagen ist ebenfalls ein Homopolymer bezeichnet mit [α1(II)]3 das aus Translationsprodukten des Col2A1 Gens zusammengesetzt ist.
  • Da Kollagen-produzierende Zellen, wie obenstehend beschrieben, verschiedene Arten von Kollagen produzieren, war es in der Vergangenheit unmöglich, beispielsweise homogene Typ I Kollagene zu bekommen, die frei waren von Typ III Kollagenen. Das erfindungsgemäße Verfahren ermöglicht durch die Produktion von Kollagen in nicht Kollagen-produzierenden Zellen solche homogenen Präparationen.
  • Das genetische Material, das die gewünschten Kollagene kodiert ist zum Einsatz in dem erfindungsgemäßen Verfahren erhältlich. Die Gene, die die humanen Typ I, II, III, IV und V Kollagene kodieren sind gegenwärtig verfügbar.
  • Prockop, DJ et al (supra) listen die folgenden kotranslationalen und posttranslationalen Modifikationen auf, die bei der Produktion von Kollagen in Fibroblasten vorkommen: Spaltung der Signalpeptide an den N-Termini der Ketten, Hydroxylierung an der Y-Position von Prolin- und Lysin-Resten, Hinzufügen von Galaktose oder Galaktose und dann Glukose an einige der Hydroxylysine, Addition eines Mannose-reichen Oligosaccharids an die C Propeptide, Assoziation der C-terminalen Propeptide durch einen Prozess, der durch die Struktur dieser Domänen bestimmt wird und schließlich die Bildung von intrachenaren und interchenaren Disulfidbrücken in den Propeptiden. Nach der Sekretion der Prokollagene werden die N-Propeptide durch eine Prokollagen-N-Proteinase und die C-Propeptide durch eine separate Prokollagen-C-Proteinase abgespalten. Das Kollagen ordnet sich von selbst in Fibrillen und Lysyl-Oxidase konvertiert einige Lysin- und einige Hydroxylysin-Reste in Aldehyd-Derivate, um Quervernetzungen mit ähnlichen Resten in den angrenzenden Molekülen zu bilden.
  • Es ist nicht völlig geklärt, ob Milchdrüsenzellen, die endogen kein Kollagen produzieren, die Enzyme enthalten, die für die posttranslationalen Ereignisse notwendig sind. Da die Anordnung in Dreifachhelices durch die Sequenzen der C-terminalen Extensionen vermittelt werden, nimmt man an, dass bei Fehlen der benötigten Proteasen in den epithelialen Zellen der Milchdrüsenzellen, der Aufbau der Dreifachhelices extrazellulär durch Bereitstellen der geeigneten Sekretions-Signale zu dem Prokollagen-Molekül und der Zugabe geeigneter Proteasen wie oben festgestellt bewirkt werden kann. Alternativ können die Proteasen rekombinant in den epithelialen Milchdrüsenzellen produziert werden. Die Enzyme, die höchstwahrscheinlich von den Milchdrüsenzellen für die notwendigen posttranslationalen Modifikationen benötigt werden, sind die Proteindisulfidisomerase und die α-Untereinheit der Prolyl-Hydroxylase Falls diese Enzyme nicht endogen produziert werden und rekombinant bereitgestellt werden müssen, können die Expressionssysteme für ihre Produktion gemeinsam mit den Expressionssystemen für das Kollagen und das Prokollagen verabreicht werden. Das Gen für die α-Untereinheit der Prolyl-Hydroxylase wurde noch nicht vollständig beschrieben, aber das Gen, das die Proteindisulfidisomerase kodiert, wurde partiell isoliert wie von Tasanen K. et al. beschrieben (J Biol Chem (1988), 263: 16218–16224 und J Biol Chem (1992) 267: 11513–11519). Gene, die beide Proteine kodieren, sind durch Standardtechniken erhältlich. Diese beiden Enzyme funktionieren gemeinsam als ein tetrameres Protein, das zwei Untereinheiten der Prolyl-Hydroxylase und zwei α Untereinheiten der Proteindisulfidisomerase in nicht kovalenter Bindung enthält. Obwohl die beiden Untereinheiten der Proteindisulfidisomerase als Dimer funktionell sind, müssen die beiden α-Untereinheiten der Prolyl-Hydroxylase mit der Proteindisulfidisomerase assoziiert sein um aktiv zu sein (Vuari, et al., 1992).
  • Ein gut entwickeltes System für den Gebrauch des erfindungsgemäßen Verfahrens ist die Milchproduktion in Kühen. Dieses System wird von Krimpenfort, P. et al. in Biotechnology (1991) 9: 844–847 zusammengefasst. Der Artikel beschreibt die Mikroinjektion von fertilisierten Rinder-Oozyten mit Genen, die humane Proteine kodieren und die Entwicklung der resultierenden Embryonen in den Ersatzmüttern. Die humanen Gene wurden an die bovinen αS1-Casein-Regulatorelemente fusioniert. Diese allgemeine Technologie wurde auch in der PCT Anmeldung WO91/08216 beschrieben und am 13. Juni 1991 publiziert (GenPharm).
  • Zusätzliche Beschreibungen der Produktion von rekombinanten Proteinen durch Entwicklung von transgenen Tieren, die die Proteine in die Milch sezernieren, sind in der Europäischen Anmeldung 264166 zu finden (veröffentlicht 20. April 1988, Integrated Genetics). Diese Offenbarung betont die Benutzung des whey acid protein Kontrollsystems für die Proteinsekretion und zitiert den Gebrauch dieses Systems für die Produktion von tPA und Hepatitis B Oberflächenantigen in Ziegenmilch. Analoge Systeme für die Herstellung von Fremdproteinen werden in der PCT Anmeldung WO88/00239 beschrieben (veröffentlicht 14. Januar 1988, Pharmaceutical Proteins Limited). Diese Anmeldung beschreibt Verfahren zum Erhalt von geeigneten regulatorischen DNA-Sequenzen für Produkte aus der Milchdrüse von Schafen, einschließlich beta-Lactoglobulin und die Konstruktion von transgenen Schafen, die so modifiziert wurden, dass sie Fremdproteine in die Milch absondern. Eine weitere Anmeldung PCT WO88/01648 (veröffentlicht 10. März 1988, Immunex Corporation), beschreibt allgemein die Konstruktion transgener Tiere, die Fremdproteine unter der Kontrolle der regulatorischen Sequenzen des bovinen alpha Lactalbumin-Gens in die Milch sezernieren. Schließlich beschreibt PCT WO88/10118 (veröffentlicht 29. Dezember 1988, Biogen) die Konstruktion transgener Mäuse und größerer Säugetiere für die Herstellung verschiedener rekombinanter humaner Proteine in Milch. Andere Veröffentlichungen, die die Herstellung verschiedener Proteine in Milch beschreiben schließen Archibold, A. L. et al. (Proc Natl Acad Sci USA (1990) 87: 5178–5182) ein, die die Produktion von humanem α-Antitripsin in der Milch transgener Mäuse beschreiben. Diese Herstellung benutzt ein hybrides Genkonstrukt, wobei das β-Lactoglobulin-Gen an das α1-Antitripsin-Minigen fusioniert wurde. Pittius C. W. et al., Proc Natl Acad Sci USA (1988)85, 5874–5878 beschreibt die Herstellung von Tissue Plasminogen Aktivator (tPA) in den Milchdrüsen von transgenen Mäusen durch Benutzung des murinen whey acid protein Promotors. Henninghaus L. et al., Protein Expression and Purification (1990) 1: 3–8 gibt eine Übersicht über den Gebrauch der Milchdrüse als Bioreaktor und die Herstellung verschiedener Fremdproteine in Milch. Der Artikel beschreibt die Faktoren, die die Produktionsrate beeinflussen und zeigt empfehlenswerte Formen für die Konstruktionen von Expressionssystemen auf.
  • Folglich sind Techniken zur Konstruktion von geeigneten Wirts-Vektoren, die regulatorische Elemente enthalten, um die Herstellung von Fremdproteinen in Milchdrüsen zu bewirken und diese Proteine in die Milch zu sezernieren aus dem Stand der Technik bekannt. Zusätzlich sind auch Techniken zur Konstruktion transgener Säugetiere, die diese Systeme beinhalten, einschließlich Mäuse sowie größere Säugetierarten wie Kühe, Schafe und Ziegen gut bekannt.
  • Systeme für die Expression von Prokollagen-Genen in Milchproduzierenden Zellen können unter Anwendung von Methoden konstruiert werden, die analog der kürzlich beschriebenen Herstellung von humaner Kollagenase in der Lunge transgener Mäuse sind (D'Armiento et al., Cell (1992), 71: 955–961).
  • Gene für eine Anzahl von Prokollagen-Typen sind erhältlich und Gene für weitere Typen sind ebenso zu erhalten. Die Präparation und die Klonierung des menschlichen Col1A1 Gens wurde beschrieben (Barsh et al., J Biol Chem (1984) 259: 14906–14913). Kurz zusammengefasst wird eine humane Cosmid Genbank verpackt und in E. coli transduziert. Die Zellen werden platiert, inkubiert und mit einer Nukleinsäuresequenz, die spezifisch für das Col1A1 Gen ist, überprüft. Positive Kolonien werden isoliert, in Kulturmedium inkubiert und die DNA isoliert. Restriktionsendonukleasen werden benutzt, um die DNA an ausgewählten Stellen zu schneiden. Die verdaute DNA wird durch Gelelektrophorese und DNA-Sequenzierung überprüft. Für den aus der humanen genomischen Genbank isolierten Cosmid-Klon CG103 wurde nachgewiesen, dass er das gesamte menschliche Col1A1 Gen enthält.
  • Fragmente von Kollagen-Genen wurden aus Cosmid-Banken (Barsh et al., supra) und aus Bakteriphagen-Banken ausgewählt (Chu et al., J Biol Chem (1985)260: 4537–4363 für Typ III Kollagen; Chu et al., Nature (1984) 310: 337–340 für Typ I Kollagen). Unter Benutzung des Charon 4A Bakteriophagen-Vektors wurde das Col1A1 Gen aus 3 überlappenden genomischen Klonen isoliert. Das Col1A2 Gen erhielt man ebenso von 5 überlappenden Klonen in Charon 4A Genbanken (de Wet et al., J Biol Chem (1987) 262: 16032–16036). Es wurde nachgewiesen, dass das erste Intron wichtig ist für die Regulierung der α1(1) gewebespezifische Genexpression in transgenen Mäusen (Slack J. L., et al., Mol Cell Biol (1991) 11: 2066–2074).
  • Alternativ zur Benutzung des gesamten Gens können auch cDNAs in voller Länge benutzt werden; allerdings wurde gezeigt, dass die Benutzung des gesamten Gens in Experimenten mit transgenen Tieren wirksamer ist (Palmiter et al., Proc Natl Acad Sci USA (1991) 88: 478–482). Solche cDNAs voller Länge können aus cDNA Banken isoliert werden. Dies wurde für den cDNA Klon für die alpha-2 Kette des Typ I Kollagen gemacht, der aus einer lambda Phagenbank isoliert wurde (Lee et al., J Biol Chem (1988) 263: 13414–13418).
  • Um ein Expressionssystem zu konstruieren, dass kompatibel ist mit den Epithelzellen der Milchdrüsen, wird das Col1A1 Gen oder das Prokollagen-Gen als DNA-Fragment mit einem ähnlich vorbereiteten DNA-Fragment ligiert, das den Promotor und alle zusätzlich benötigten regulatorischen Sequenzen für eine Milch-spezifische Proteinexpression enthält. Wie von D'Armiento et al., beschrieben wird, ist es bei der Ligation des Promotors mit einem Gen notwendig, die Startstelle für die Translation zu bewahren. Dies kann erreicht werden durch Einführung einer spezifischen Restriktionsstelle unmittelbar vor der Startseite der Translation, die auch einmalig ist für das 5'Ende des ausgewählten Promotors. Wenn diese Fragmente unter Benutzung einer solchen Restriktionsschnittstelle vorbereitet werden, sind die 3'Enden des Promotors kompatibel mit den 5'Enden des Col1A1 Gens. Bei der Ligation wird der Promotor an die korrekte Stelle des Gens ligiert und kodiert eine mRNA, die die Translation von der Translations-Startseite des Prokollagen-Gens erlaubt. Dies ist analog zur Ligation des Heptoglobin Promotors mit dem humanen Kollagenase-Gen wie von D'Armiento et al., beschrieben (supra). Das Promotor-Gen-Konstrukt wird in ein Bacteriophagen-Vektor-Klonierungssystem ligiert, indem die Phagen-DNA mit einem Restriktionsenzym behandelt wird. Beide Enden der Fremd-DNA werden dann in das Vektor-Konstrukt ligiert, um die DNA zu klonieren.
  • Die cDNA, die die Translations-Startseite für die exprimierte mRNA enthält, kann auch mit einem Promotor ligiert werden, um so ein funktionelles Konstrukt für die Einführung in ein transgenes Tier vorzubereiten. Diese Methode wurde für die humane Lactoferrin cDNA benutzt, die mit den 5' und 3' nicht-translatierten Bereichen des bovinen alpha-S1-Casein fusioniert wurde (Krimpenfort).
  • Es wird auch verstanden, dass die Regionen stromaufwärts des Promotors in die Regulation der Genexpression einbezogen sind. Insbesondere wurde gezeigt, dass die extrazelluläre Matrix und Hormone die Expression des bovinen β-Casein durch ihre Beeinflussung der stromaufwärts gelegenen Sequenzen in den relevanten Genen regulieren (Schmidhauser C., et al., Proc Natl Acad Sci USA (1990)87: 9118–9122). Weiterhin sind Signale für die Termination der Transkription und der Translation hilfreich für die Erhöhung der Expressionsrate.
  • Um die Größe des Prokollagen-Gens so zu reduzieren, dass es in Bakteriophagen kloniert werden kann, kann das Gen selber durch Reduktion der Anzahl an Introns verkürzt werden. Dies kann für Prokollagen-Gene ausgeführt werden, die als überlappende Fragmente kloniert wurden. Die Introns an den Verbindungsstellen können identifiziert werden und mit spezifischen Endonukleasen verkürzt werden unter Beibehaltung der Restriktionsschnittstellen, die für die Ligation kompatibel sind. Die Restriktionsstellen können auch durch Seiten-spezifische Mutagenese so verändert werden (D'Armineta et al., supra), dass Restriktionsstellen für die Klonierung des Prokollagen-Gens in ein einziges Konstrukt entstehen. Eine alternative Methode zur Entfernung von Introns ist die Fusion von Genen, die cDNAs enthalten um zwei oder mehr Exons im Gen zu ersetzen.
  • Eines der posttranslationalen Modifikationsenzyme, das für die Herstellung von Kollagen gebraucht wird, ist die Proteindisulfidisomerase. Diese bildet in Kombination mit der alpha-Untereinheit der Prolylhydroxylase ein Tetramer, das als Prolylhydroxylase isoliert wird. Das Gen für die Proteindisulfidisomerase wurde aus einer humanen genomischen Genbank, die in einem Cosmid_Vektor pcos2EMBL hergestellt wurde, isoliert (Proustka et al., Proc Natl Acad Sci USA (1984) 81: 4129–4133). Die Genbank wurde mit cDNA Fragmenten überprüft, die spezifisch für humane Proteindisulfidisomerase sind. Man erhielt verschiedene Klone von denen mindestens zwei das gesamte Gen enthielten (Tasanen et al., J Biol Chem (1988)263: 16128–16224).
  • Dieses Gen kann für den Gebrauch in Expressionssystemen gemäß dieser Erfindung von der Cosmid DNA mit Restriktionsendonukleasen herausgeschnitten und mit einem Milch-spezifischen Promotor ligiert werden unter Nutzung einer Strategie, die ähnlich der ist, die zur Konstruktion der Heptoglobin-Kollagenase DNA eingesetzt wurde.
  • Falls die Milchdrüsenzellen nicht die für die posttranslationale Modifikation von Prokollagen geeigneten Enzyme aufweist, muss das transgene Tier mit einem Expressionssystem für diese Enzyme modifiziert werden. Die Konstruktion dieser Expressionssysteme ist analog zu der hier beschriebenen Konstruktion von Expressionssystemen für Pokollagen-Gene. Die Expressionssysteme für die posttranslationellen Enzyme werden gleichzeitig mit den Expressionssystemen für das gewünschte Kollagen-Produkt bereitgestellt.
  • Die Wahl des Promotors für die Expression in Milch fällt vorzugsweise auf den Promotor eines Milch-spezifischen Proteins, wie z.B. die 5' und 3' regulierenden Sequenzen des alpha S1-Caseins. Diese wurden an humane Lactoferrin cDNA fusioniert, sodass das Konstrukt den alpha S1-Casein Promotor und die Signalsequenz für das humanen Lactoferrin-Gen nutzte. Ein anderes Konstrukt, das für die Expression von Fremdprotein in Schafsmilch genutzt wurde, bestand aus dem beta-Lactoglobin-Promotor vom Schaf fusioniert an menschliche Antitrypsin Genfragmente (Wright et al., Biotechnology (1991)9: 830–833). Ein dritter Promotor, der genutzt wurde, ist der vom sauren Molkeprotein (whey acid protein), der mit der cDNA der modifizierten Version des humanen Tissue Plasminogen Aktivators (tPA) fusioniert wurde (Ebert et al., Biotechnology (1991)9: 835–838). Es wurden so transgene Ziegen hergestellt, in deren Milch der Tissue Plasminogen Aktivator exprimiert wurde. Die Sequenz des Gens wird auf einmalige Restriktionsendonuklease-Schnittstellen durchsucht, die dann ausgewählt werden, um die exakte Translationsstartseite in der mRNA des funktionellen Gens zu erhalten.
  • Falls es wünschenswert ist, die posttranslationellen Enzyme in den Milchdrüsenzellen bereitzustellen, so nimmt man an, dass die wichtigsten Kandidaten die Prolyl-Hydroxylase und die Proteindisulfidisomerase sind. Das Gen für die alpha-Untereinheit der Prolyl-Hydroxylase vom Huhn wurde noch nicht vollständig isoliert; es ist jedoch bekannt, dass dieses 50 Kb groß ist (R. Berg, nicht-veröffentlichte Information). Es wird erwartet, dass man das gesamte Gen aus einer menschlichen Cosmid-Genbank isolieren kann, so wie dies auch für das Col1A1 Gen und für die Gene der Proteindisulfidisomerase durchgeführt wurde. Die cDNA für die Huhn- alpha-Untereinheit (Bassuk et al., Proc Nat Acad Sci USA (1989)86: 7382–7386) und die humane alpha-Untereinheit (Helaakoski, T., Proc Natl Acad Sci USA (1989)86: 4392–4396) wurden beschrieben. Da das Gen bis jetzt nicht erhältlich ist, kann die cDNA für die menschliche alpha-Untereinheit an den Promotor eines Milch-spezifischen Proteins fusioniert werden, um so ein DNA-Konstrukt für die Einführung in ein transgenes Tier herzustellen.
  • Bei Nutzung dieser Systeme erhält man Tiere, die humanes Kollagen oder Prokollagen in die Milch absondern. Das Gen, das die gewünschte Prokollagen-Kette kodiert, wird mit geeigneten Kontrollsequenzen verbunden, die in den Milchdrüsenzellen der Säugetierspezies funktionieren. Dies sind z.B. die regulatorischen Sequenzen von dem αS1-Casein-Gen, vom β-Lactalbumin- oder α-Lactalbumin-Gen, β-Lactoglobin- oder Lactoferrin-Gen. Die 5' und die 3' regulatorischen Sequenzen können genutzt werden. Die Gene, die die benötigten posttranslationalen Enzyme kodieren, werden auf ähnliche Art in Expressionssysteme konstruiert unter Nutzung Säugerzell-spezifischer regulatorischer Sequenzen.
  • Die resultierenden Expressionssysteme werden mikroinjiziert mit Techniken wie beispielsweise in Patent US 4,873,191 beschrieben. Die Expressionssystem-Konstrukte werden durch PCR oder Klonierung vervielfältigt und durch Agarosegelelektrophorese aufgereinigt. Nach der Elektroelution wird die Konzentration auf 1–10 μg/ml eingestellt und in Oozyten mikroinjiziert. Diese werden frisch den Eierstöcken von Kühen oder anderen Tieren entnommen. Die Oozyten werden aus den Follikeln angesaugt und können sich vor der Befruchtung mit aufgetautem gefrorenem Sperma absetzen. Das Sperma wurde mit Heparin und vorfraktioniertem Percoll Gradienten behandelt, um die bewegliche Fraktion zu isolieren.
  • Die befruchteten Oozyten werden zentrifugiert, z.B. bei 15.000 × g für 8 Minuten, um die Pronuclei für die Injektion sichtbar zu machen. Sie werden dann von der Zygote zur Morula oder bis zum Blastozyten-Stadium in Eileitergewebe-konditioniertem Medium kultiviert. Dieses Medium wird hergestellt durch Abschaben von luminalem Gewebe vom Eileiter und Verdünnung in Kulturmedium. Die Zygote muss innerhalb von 2 Stunden nach der Mikroinjektion in das Kulturmedium überführt werden.
  • In dem vorgesehenen Empfänger-Säugetier wie z.B. der Kuh wird der Östrus dann durch Verabreichung von Coprostanol synchronisiert. Der Östrus tritt innerhalb von 2 Tagen ein und die Embryonen werden 5–7 Tage danach in den Rezipienten übertragen.
  • In den Nachkommen kann der erfolgreiche Transfer durch Southern Blot überprüft werden. Bei Nutzung dieses Systems zur Expression des Col1A1 Gens kann beispielsweise in den Nachkommen das Col1A1 Gen nachgewiesen werden, wenn bei der Southern Hybridisierung eine Col1A1 genspezifische Sonde eingesetzt wird.
  • Alternativ können die gewünschten Konstrukte in ES Zellen eingeführt werden und in die kultivierten Zellen zur Sicherstellung der Modifikation durch das transgene Tier. Die modifizierten Zellen werden dann in die embryonale Blastula-Phase injiziert und die Blastulas in pseudo-schwangere Wirte eingesetzt. Die resultierenden Nachkommen sind bezüglich. der ES und der Wirtszellen chimär. Nicht-chimäre Stämme, die ausschließlich ES-Nachfahren umfassen, erhält man durch herkömmliche Kreuzung.
  • Für die Herstellung des gewünschten Prokollagens oder Kollagens in der Milch müssen beide Expressionssysteme – für das Prokollagen-Gen und für die Gene, die die posttranslationellen Enzyme kodieren – in dem transgenen Tier vorhanden sein. Es gibt verschiedene Wege, dies zu erreichen.
  • Erstens kann der Säugetier-Wirt bereits die benötigten Mengen an posttranslationellen Enzymen in den Epithelzellen der Milchdrüsen produzieren. Alternativ können die Konstrukte, die in Eier mikroinjiziert werden oder in ES Zellen transfiziert werden, einen Cocktail aus den gewünschten Prokollagen-Gen-Expressionssystemen mit z.B. den ähnlich konstruierten Expressionssystemen für die Proly-Hydroxylase und die Proteindisulfidisomerase, enthalten. Die erfolgreiche Produktion von Kollagen in der Milch kann dann durch Anti-Prokollagen Antikörper nachgewiesen werden oder durch Analyse der Milch bzgl. des Gehalts an Hydroxyprolin, einer Aminosäure, die unique ist und die in Kollagen als Resultat der Prolylhydroxylase-Aktivität gefunden wird.
  • Alternativ können die Expressionssysteme für das Prokollagen-Gen und die Expressionssysteme für jegliche benötigte posttranslationellen Enzyme kodierenden Gene in verschiedenen Chargen in die befruchteten Eier injiziert oder in verschiedene Chargen von ES Zellen injiziert werden. Es werden somit transgene Tiere entwickelt, die entweder Prokollagen- oder Kollagen-Gene exprimieren oder Tiere, die die Gene für die posttranslationellen Enzyme kodieren. Diese Tiere können dann gekreuzt und die Nachkommenschaft auf die Expression durch beide Systeme überprüft werden. Zumindest einige Nachkommen einer solchen Kreuzung werden in der Lage sein, sowohl das Kollagen als auch die posttranslationellen Enzyme herzustellen.
  • Bei einer weiteren Vorgehensweise werden die befruchteten Eier oder die ES Zellen von transgenen Tieren präpariert, die bereits so modifiziert wurden, dass sie entweder die Prokollagen-Gene oder die Gene für die posttranslationellen Enzyme exprimieren. Diese Eier werden dann mit dem jeweils in dem transgenen Tier fehlenden Expressionssystem mikroinjiziert oder die ES-Zellen transfiziert, sodass dann ein transgenes Tier entwickelt wird, das Expressionssysteme für alle benötigten Komponenten enthält.
  • Es muss angemerkt werden, dass die Expressionssysteme für die vorgehend beschriebenen speziellen posttranslationellen Enzyme, falls notwendig, unbedingt gleichzeitig bereitgestellt werden müssen, da die Enzyme gemeinsam als tetrameres Protein funktionieren: wie oben beschrieben, müssen die beiden α-Untereinheiten der Prolyl-Hydroxylase mit der Proteindisulfidisomerase assoziieren, um aktiv zu sein.
  • Wenn mit einer der vorstehend genannten Methoden geeigneten transgene Tiere erhalten wurden, wird Prokollagen oder Kollagen in die Milch abgesondert. Das Prokollagen- oder Kollagen-Produkt, das von dem transgenen Tier hergestellt wird, wird bestimmt durch das Prokollagen-Gen, das in dem Expressionssystem eingesetzt wurde. Für eine homogene Dreifachhelix (Homotriplex) wird nur ein Gen eingeführt. Für die Herstellung einer heterogenen Dreifachhelix (Heterotriplex), wie z.B. typischerweise für Typ I Kollagen werden entweder beide Gene – Col1A1 und Col1A2- in der originellen Mikroinjektion eingesetzt oder es werden Tiere, die transgen für Col1A1 sind mit Tieren, die transgen für Col1A2 sind, gekreuzt. Das Typ III Collagen kodierende Col3A1 Gen kann zur Herstellung transgener Tiere benutzt werden. Dies ist einfacher, da nur eine Kollagen-Polypeptidkette benötigt wird.
  • Falls Proteasen für die Konversion von Kollagen nicht anwesend sind, wird das durch die Expressionssysteme bereitgestellte Prokollagen in die Milch sezerniert.
  • In dem Masse wie die Protease-Enzyme nicht in den sezernierenden Epithelzellen vorhanden sind und auch nicht durch die rekombinanten Systeme bereitgestellt werden, wird das Prokollagen in die Milch abgesondert und kann aus dieser in ähnlicher Weise wiedergewonnen werden wie Kollagen per se. Wie aus dem Stand der Technik bekannt kann das Prokollagen auch vor oder nach der Aufreinigung durch spezifische Proteasen konvertiert werden um die Prosequenzen abzuspalten. Andererseits wird Kollagen direkt sezerniert, wenn die Proteasen natürlicherweise intrazellulär vorhanden sind oder durch rekombinante Systeme bereitgestellt werden. In Abhängigkeit von der Menge dieser Enzyme erhält man Mischungen aus Prokollagen und Kollagen in der Milch. Diese kann – falls gewünscht – mit Proteasen behandelt werden, sodass alle relevanten Moleküle zu Kollagen per se konvertiert werden.
  • Wie vorstehend beschrieben, waren bisherige Präparationen von Kollagen eines Typs immer mit einem alternativen Kollagentyp kontaminiert – zum einen aufgrund der Ähnlichkeit der Kollagene und auch im Hinblick auf die Fähigkeit der nativen oder der rekombinanten Zellen, die bisher für die Kollagenproduktion benutzt wurden und die eigene Kollagene in ihrem Genom kodieren. Durch den Einsatz des erfindungsgemäßen Verfahrens können Kollagene oder Prokollagene eines vorgegebenen Typs erhalten werden, der frei ist von koexprimierten Kollagenen oder Prokollagenen eines alternativen Typs.
  • Die Aufreinigung von Kollagen oder Prokollagen aus der Milch wird durch ihre charakteristische Löslichkeit und chemischen Eigenschaften bestimmt. Beispielsweise wird die Milch angesäuert, sodass Milch-spezifische Proteine wie Casein ausfallen und Kollagen und Prokollagen in Lösung bleiben. Kollagen und Prokollagen können dann aus der sauren Lösung durch die Zugaben von Salz, Alkohol oder Propylenglykol ausgefällt werden (Miller E. J. and Rhodes, R. K., Methods in Enzymology (1982) 82: 33–64); Sage, H. and Bernstein P., ibid 96–127) In der gesamten Beschreibung und den Ansprüchen dieser Patentschrift ist der Ausdruck „beinhalten" oder Varianten wie „beinhaltend", „umfassend" im Sinne von „inbegriffen, aber nicht beschränkt auf" zu verstehen. Es ist nicht beabsichtigt, andere Zusätze, Komponenten, Ganzzahlen oder Schritte auszuschließen.

Claims (8)

  1. Verfahren zum Herstellen eines einzelnen Typs eines trimerischen menschlichen Kollagens, welcher die pro-α1 Kette des Typ I Kollagens aufweist, eines einzelnen Typs eines trimerischen menschlichen Prokollagens, welcher die pro-α1 Kette des Typ I Kollagens aufweist, oder einer Mischung des Kollagens und des Prokollagens, wobei das Verfahren aufweist: Gewinnen von Milch aus der Milchdrüse eines nicht-menschlichen Säugetiers, wobei das Säugetier modifiziert wurde, damit es ein Expressionssystem enthält, welches eine kodierende Nukleotidsequenz aufweist, welche wenigstens das menschliche Prokollagen kodiert, nutzbar verbunden, um Nukleotidsequenzen zu kontrollieren, die Expression besonders in Milcheiweiß absondernde Epithelzellen der Milchdrüsen ausführen unter Konditionen, wo die kodierende Nukleotidsequenz mit Expression versehen ist, um menschliches Prokollagen, menschliches Kollagen oder in eine Mischung derselben in die Milch des Säugetiers abzusondern; und Gewinnen des menschlichen Prokollagens, menschlichen Kollagens oder einer Mischung derselben aus Milch.
  2. Expressionsvektor zur Herstellung eines einzelnen Typs von menschlichem Prokollagen, welcher die pro-α1 Kette des Typ I Kollagens aufweist, eines einzelnen Typs eines menschlichen Kollagens, welcher die pro-α1 Kette des Typ I Kollagens aufweist oder einer Mischung des Kollagens und des Prokollagens in Milch, wobei das Expressionssystem eine kodierende Nukleotidsequenz aufweist, die das menschliche Prokollagen kodiert, nutzbar verbunden mit einem Promotor, der in der Lage ist, insbesondere Expression in Milcheiweiß absondernde Zellen von Milchdrüsen zu bewirken.
  3. Befruchtetes, nicht-menschliches Ei eines Säugetiers, welches das Expressionssystem gemäß Anspruch 2 enthält.
  4. Nicht-menschliche Stammzelle eines Embryos eines Säugetiers, welche modifiziert ist, sodass sie das Expressionssystem gemäß Anspruch 2 enthält.
  5. Transgenes, nicht-menschliches Säugetier, welches das Expressionssystem gemäß Anspruch 2 aufweist.
  6. Nicht-menschliches Säugetier gemäß Anspruch 5, welches weiter modifiziert wurde, um wenigstens ein Expressionssystem zu enthalten, das die Produktion von posttranslationalen Modifikationsenzymen für Prokollagen bewirkt.
  7. Milch, welche von einem nicht-menschlichen Säugetier wie in Anspruch 1 definiert produziert wurde, welche einen einzelnen Typ eines trimerischen menschlichen Kollagens, der die pro-α1 Kette des Typ I Kollagens aufweist, einen einzelnen Typ eines trimerischen menschlichen Prokollagens, der die pro-α1 Kette des Typ 1 Kollagens aufweist, oder eine Mischung des Kollagens und des Prokollagens enthält.
  8. Zusammensetzung eines einzelnen Typs eines trimerischen menschlichen Prokollagens, der die pro-α1 Kette des Typ I Kollagens aufweist, eines einzelnen Typs eines trimerischen menschlichen Kollagens, der die pro-α1 Kette des Typ 1 Kollagens aufweist, oder eine Mischung derselben, wobei das Prokollagen oder das Kollagen von einem nicht-menschlichen Säugetier wie in Anspruch 1 definiert produziert wird.
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