DE69435038T2

DE69435038T2 - Aktivin rezeptor-ähnliche kinase (alk), gehörend zur tgf rezeptorfamilie und/oder zur bmp rezeptorfamilie

Info

Publication number: DE69435038T2
Application number: DE69435038T
Authority: DE
Inventors: John M. Hudson Wozney; Anthony J. Hudson CELESTE; R. Scott Andover THIES; Noboru Tsukuba-City YAMAJI
Original assignee: Genetics Institute LLC
Current assignee: Genetics Institute LLC
Priority date: 1993-09-17
Filing date: 1994-09-07
Publication date: 2008-08-07
Anticipated expiration: 2014-09-08
Also published as: JPH09502611A; EP1903112A3; KR960705041A; WO1995007982A1; AU686232B2; US7091007B2; FI961196A0; CA2170405A1; OA10359A; US6291206B1; DK0723588T3; AU7722494A; US20040142417A1; US20020137133A1; US6610513B2; FI961196A; KR100406299B1; EP0723588A1; ATE376590T1; NO961009D0

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft neuartige Serin-/Threoninkinaserezeptorproteine, einschließlich einer neuartigen Familie von Rezeptorproteinen zu morphogenetischen Knochenproteinen (bone morphogenetic Proteins, BMPs). Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung Rezeptorproteine, die an BMPs, einschließlich BMP-2 und BMP-4, binden können. Die vorliegende Erfindung betrifft weiterhin Verfahren zum Isolieren neuartiger BMP-Rezeptorproteine unter Verwendung neu identifizierter DNA-Fragmente als Sonden zum Isolieren solcher Proteine.
ALLGEMEINER STAND DER TECHNIK
Bei morphogenetischen Knochenproteinen (BMPs) handelt es sich um eine Familie von Proteinen, die dahingehend identifiziert wurden, dass sie die Fähigkeit haben, die Bildung von Knochen und Knorpel in Gewebeextrakten zu induzieren. BMPs sind eine Unterfamilie in der TGF-β-Superfamilie. BMPs haben mehrere therapeutische Verwendungszwecke, einschließlich einer großen Vielfalt an Situationen, in denen Knochen aufgrund physiologischer oder traumatischer Vorgänge verloren gegangen ist.
Von der TGF-β-Superfamilie von Proteinen wurde gezeigt, dass sie an Serin-/Threoninkinaserezeptoren bindet. Massague, Cell, 69:1067–1070 (1992); Attisano et al., Cell 68:97–108 (1992); Lin et al., Cell, 68:775–785 (1992); Wang et al., Cell 67:797–805 (1991). In ähnlicher Weise wurden Aktivinrezeptoren isoliert und als eine vorhergesagte Transmembran-Serinkinase charakterisiert. Mathews et al., Cell 65:973–982 (1991); Nakamura et al., J. Biol. Chem. 267:18924–18928 (1992). Ebner et al., Science, 260:1344–1348 (1993), beschreiben die Existenz von Typ-I- und Typ-II-TGF-β-Rezeptoren und die Wirkungen des Typ-I-Rezeptors auf die Bindung von TGF-β an den Typ-II-Rezeptor.
Von Typ-I-Rezeptorproteinen wurde berichtet, dass sie nicht unabhängig an ihre Ligandenmoleküle binden, sondern von ihnen beobachtet wird, dass sie, in Zusammenarbeit mit Typ-II-Rezeptoren, zur gesteigerten Bindung an den Liganden beitragen. Siehe Matsuzaki et al., J. Biol. Chem., 268:12719–12723 (1993); Ebner et al., Science, 260:1344–1348 (1993).
Paralkar et al., PNAS USA 88:3397–3401 (1991), beschreiben das Vorliegen von Stellen zur Bindung mit hoher Affinität für BMP-4 auf MC3T3E1- und NIH3T3-Zellen. Es wurde keine Kompetition für die BMP-4-Bindeproteine durch TGF-β vorgefunden, noch lag Kompetition für TGF-β-Rezeptoren durch BMP-4 vor, wie in Attisano et al., Cell 68:97–108 (1992), beobachtet.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
In einer Ausführungsform umfasst die vorliegende Erfindung ein gereinigtes und isoliertes DNA-Molekül, das ein BMP-Rezeptorprotein kodiert, wie in Anspruch 1 definiert.
Neben anderen Verwendungszwecken sind diese DNA-Moleküle gegenwärtig als Sonden zum Isolieren und Reinigen weiterer neuartiger BMP-Rezeptoren von Nutzen.
Die vorliegende Erfindung umfasst außerdem neuartige DNA-Sequenzen, die Rezeptorproteine kodieren, wobei die neuartigen DNA-Sequenzen mittels eines Verfahrens unter Verwendung einer DNA-Sequenz, die alle oder einen Bruchteil der Rezeptorproteine der vorliegenden Erfindung kodiert, identifiziert werden. In bevorzugten Ausführungsformen werden die neuartigen DNA-Sequenzen unter Verwendung einer DNA-Sequenz aus der Serin-/Threoninkinasedomäne eines Rezeptors identifiziert, die in der Familie von BMP-Rezeptoren stark konserviert ist. Alternativ könnte eine DNA-Sequenz, die die Ligandenbindungsdomäne kodiert, zum Identifizieren weiterer neuartiger, BMP-Rezeptoren kodierender Sequenzen verwendet werden.
Die vorliegende Erfindung umfasst weiterhin DNA-Moleküle, die lösliche, verkürzte Rezeptorproteine und die löslichen Proteine selbst kodieren. Die verkürzten Rezeptorproteine umfassen vorzugsweise die Ligandenbindungsdomäne, jedoch nicht die Serin-/Threoninkinase- und Transmembrandomänen des Rezeptorproteins. Die verkürzten Rezeptorproteine sind löslich und werden von Säugetierzellen in Überstand sekretiert. Folglich wird bei Expression in Säugetierzellen unter Verwendung eines DNA-Moleküls, das ein verkürztes Rezeptorprotein kodiert, das verkürzte Rezeptorprotein sekretiert anstelle auf der Oberfläche der Wirtszelle exprimiert. Das dadurch exprimierte verkürzte Rezeptorprotein bindet noch immer spezifisch an BMPs und kann dazu verwendet werden, Rezeptoren daran zu hindern, die zellulären Vorgänge zu vermitteln, an denen sie normalerweise als Signalisierungsmechanismen durch Kompetition für denselben Liganden teilnehmen. Das verkürzte Rezeptorprotein könnte mit Rezeptorproteinen konkurrieren, die normalerweise auf der Oberfläche von auf funktionellen Liganden reagierenden Zellen exprimiert werden, und die Bildung eines funktionellen Rezeptor/Ligand-Komplexes inhibieren, wodurch der normale Signalisierungsmechanismus des Komplexes und die zellulären Vorgänge, die normalerweise von funktionellen Rezeptor/Ligand-Interaktionen beeinflusst werden, blockiert werden.
In einem Gesichtspunkt stellt die Erfindung ein Verfahren zum Produzieren von Zellen, die mehr als ein Rezeptorprotein exprimieren, bereit, das das Kultivieren einer ausgewählten Wirtszelle umfasst, die eine Polynukleotidsequenz, die ein erstes ausgewähltes Rezeptorprotein, verkürztes Rezeptorprotein oder ein aktives Fragment davon kodiert, und eine Polynukleotidsequenz, die ein zweites ausgewähltes Rezeptorprotein, verkürztes Rezeptorprotein oder ein aktives Fragment davon kodiert, enthält. Die resultierenden Zellen, die mehrere koexprimierte, biologisch aktive Rezeptoren exprimieren werden, können isoliert und in einer therapeutischen Zusammensetzung verwendet werden.
Ein anderer Gesichtspunkt der gegenwärtigen Erfindung umfasst Liganden für die BMP-Rezeptoren und ein verkürztes BMP-Rezeptorprotein, wobei die Liganden durch die Fähigkeit, an die Rezeptoren zu binden, gekennzeichnet sind. Solche Liganden können das Wachstum von Knochen und/oder Knorpel stimulieren oder können am Beeinflussen anderer Entwicklungsvorgänge beteiligt sein. Die Liganden können monoklonale Antikörper, kleine Peptid-BMP-Analoga oder kleine organische Molekül-BMP-Analoga, wie hierin weiter charakterisiert, sein. In einer bevorzugten Ausführungsform umfassen die Liganden Antikörper gegen das verkürzte, lösliche Rezeptorprotein und die Rezeptorproteine der Erfindung. Diese Antikörper können in einer Vielfalt diagnostischer und therapeutischer Anwendungen eingesetzt werden. Solche Antikörper können zum Identifizieren von Zellarten, die Rezeptoren der Erfindung von Natur aus exprimieren, verwendet werden und können daher die Fähigkeit haben, bei Exposition gegenüber dem entsprechenden Liganden eine biologische Reaktion auszulösen. Diese Antikörper können weiterhin bei der Identifizierung weiterer Rezeptorproteine, die an andere individuelle BMPs und/oder BMP-Heterodimere binden können, von Nutzen sein. Des Weiteren sind solche Antikörper beim Blockieren der Bildung funktioneller Rezeptor/Ligand-Komplexe von Nutzen sein und somit die Zellreaktionen zu inhibieren, die normalerweise von diesen Komplexen vermittelt würden. Alternativ können solche Antikörper die Wirkung von BMP durch Interagieren mit dem Rezeptor in einer Art und Weise nachzuahmen, die die Zellreaktionen stimulieren würde, die normalerweise von einem funktionellen Rezeptor/Ligand-Komplex vermittelt werden würden.
In noch einer anderen Ausführungsform umfasst die Erfindung pharmazeutische Zusammensetzungen, die eine Verbindung umfasst, die zuerst für eine solche Verwendung als ein Ligand für den verkürzten BMP-Rezeptor identifiziert wurde, und therapeutische Verfahren zur Behandlung von Knochen- und/oder Knorpelerkrankungen, die das Verabreichen eines Liganden für den verkürzten BMP-Rezeptor umfasst.
Andere Gesichtspunkte und Vorteile der vorliegenden Erfindung werden bei Betrachtung der folgenden ausführlichen Beschreibung und bevorzugten Ausführungsformen dieser offenbar werden.
Kurzbeschreibung der Sequenzen
SEQ ID NO: 1 umfasst die DNA- und die Aminosäuresequenz des BMP-Rezeptorproteins CFK1-23a, das aus der Rattenzelllinie CFK1 isoliert wurde. Diese DNA, die im Plasmid CFK1-23a enthalten ist, wurde hinterlegt und ihr wurde ATCC Nr. 69378 zugeteilt, wie im Folgenden weiter beschrieben.
SEQ ID NO: 2 umfasst die Aminosäuresequenz, die von der CFK1-23a-DNA-Sequenz kodiert wird.
SEQ ID NO: 3 umfasst die DNA- und die Aminosäuresequenz des BMP-Rezeptorproteins CFK1-43a, das aus der Rattenzelllinie CFK1 isoliert wurde. Diese DNA, die im Plasmid CFK1-43a enthalten ist, wurde hinterlegt und ihr wurde ATCC Nr. 69381 zugeteilt, wie im Folgenden weiter beschrieben.
SEQ ID NO: 4 umfasst die Aminosäuresequenz, die von der CFK1-43a-DNA-Sequenz kodiert wird.
SEQ ID NO: 5 umfasst die DNA- und die Aminosäuresequenz des Serin-/Threoninkinaserezeptorproteins CFK1-10a, das aus der Rattenzelllinie CFK1 isoliert wurde. Diese DNA, die im Plasmid CFK1-10a enthalten ist, wurde hinterlegt und ihr wurde ATCC Nr. 69380 zugeteilt, wie im Folgenden weiter beschrieben.
SEQ ID NO: 6 umfasst die Aminosäuresequenz, die von der CFK1-10a-DNA-Sequenz kodiert wird.
SEQ ID NO: 7 umfasst die DNA- und die Aminosäuresequenz des Serin-/Kinaserezeptorproteins W101, das aus der Mauszelllinie W-20-17 isoliert wurde. Diese DNA, die im Plasmid pMT101 enthalten ist, wurde hinterlegt und ihr wurde ATCC Nr. 69379 zugeteilt, wie im Folgenden weiter beschrieben.
SEQ ID NO: 8 umfasst die Aminosäuresequenz, die von der W101-DNA-Sequenz kodiert wird.
SEQ ID NO: 9 umfasst die DNA- und die Aminosäuresequenz des Serin-/Kinaserezeptorproteins W120, das aus der Mauszelllinie W-20-17 isoliert wurde. Diese DNA, die im Plasmid pMT120E enthalten ist, wurde hinterlegt und ihr wurde ATCC Nr. 69377 zugeteilt, wie im Folgenden weiter beschrieben.
SEQ ID NO: 10 umfasst die Aminosäuresequenz, die von der W120-DNA-Sequenz kodiert wird.
SEQ ID NO: 11 umfasst die DNA- und die Aminosäuresequenz des Serin-/Kinaserezeptorproteins KDA-B5. Diese DNA wurde als eine Sonde zum Identifizieren neuartiger Serin-/Kinaserezeptoren der vorliegenden Erfindung verwendet.
SEQ ID NO: 12 umfasst die Aminosäuresequenz, die von der KDA-B5-DNA-Sequenz kodiert wird.
SEQ ID NO: 13 umfasst die DNA-Sequenz von Oligonukleotidprimer A.
SEQ ID NO: 14 umfasst die DNA-Sequenz von Oligonukleotidprimer B.
SEQ ID NO: 15 umfasst die DNA-Sequenz von Oligonukleotidprimer C.
SEQ ID NO: 16 umfasst die DNA-Sequenz von Oligonukleotidprimer D.
SEQ ID NO: 17 umfasst die DNA-Sequenz von Oligonukleotidprimer E.
SEQ ID NO: 18 umfasst die Aminosäuresequenz eines Abschnitts von KDA-B5, der zum Entwerfen des Oligonukleotidprimers A verwendet wird.
SEQ ID NO: 19 umfasst die Aminosäuresequenz eines Abschnitts von KDA-B5, der zum Entwerfen der Oligonukleotidprimer B bis E verwendet wird.
Ausführliche Beschreibung der Erfindung
Morphogenetische Knochenproteine sind durch ihre Fähigkeit, die Bildung von Knorpel und/oder Knochen zu fördern, zu stimulieren oder anderweitig zu induzieren, gekennzeichnet. Die Fähigkeit dieser Proteine, Knorpel- und/oder Knochenbildungsaktivität zu zeigen, ist in dem Rattenknochenbildungsassay im Folgenden beschrieben. Diese Proteine können in Zusammensetzungen verwendet werden, die zum Induzieren von Knochen- und/oder Knorpelbildung verwendet werden können. Diese BMP-Zusammensetzungen können auch zur Wundheilung und Gewebereparatur verwendet werden. Weitere Verwendungszwecke für solche Zusammensetzungen beinhalten die Behandlung von Knochen- und/oder Knorpeldefekten, Parodontitis und anderen Zahnreparaturvorgängen, die Behandlung von Osteoporose und die Steigerung des neuronalen Überlebens.
Die BMP-Rezeptoren und verkürzten Rezeptoren der vorliegenden Erfindung sind neben anderen Verwendungszwecken zu der Identifizierung von BMPs, der Identifizierung weiterer BMP-Rezeptoren und der Identifizierung von Liganden oder Molekülen, einschließlich Antikörpern, die die Bindungseigenschaften von BMPs nachahmen können, von Nutzen. Diese Liganden können je nach dem individuellen Liganden als Agonist oder Antagonisten fungieren. Die Aktivität der Liganden kann in einem Assay auf BMP-Aktivität, wie dem Assay auf Induktion alkalischer Phosphatase von W-20-17 und dem Assay auf ektopische Knochenbildung in Ratten, die in den Beispielen XII und XIII im Folgenden beschrieben sind, charakterisiert werden. Die BMP-Rezeptoren sind außerdem beim Inhibieren der Wirkungen von BMPs von Nutzen, wo eine solche Inhibition gewünscht wird.
BMP-Rezeptorproteine der vorliegenden Erfindung können durch eine Aminosäuresequenz charakterisiert werden, die die Aminosäuren Nr. 1–532 von SEQ ID NO: 2 oder die Aminosäuren Nr. 1–502 von SEQ ID NO: 4 umfasst.
Die gereinigten menschlichen BMP-Rezeptorproteine der vorliegenden Erfindung können produziert werden, indem eine Wirtszelle, die mit einer DNA-Sequenz transformiert wurde, die die DNA kodierende Sequenz von SEQ ID NO: 1 von Nukleotid Nr. 61 bis Nukleotid Nr. 1656 (oder bis 1659 mit dem Stoppcodon) umfasst, kultiviert wird und aus der transformierten Zellmembran ein Protein gewonnen und gereinigt wird, das die abgeleitete Aminosäuresequenz oder eine im Wesentlichen homologe Sequenz, wie durch die Aminosäuren Nr. 24 bis Nr. 532 von SEQ ID NO: 2 oder die Aminosäuren Nr. 8 bis Nr. 502 von SEQ ID NO: 4 dargestellt, enthält. Da von den in dieser Art und Weise exprimierten BMP-Rezeptorproteinen erwartet wird, dass sie mit der Zellmembran der transformierten Zelle assoziiert bleiben, können rekombinante Rezeptorproteine der Erfindung von der transformierten Zellmembran dissoziiert werden, und sie werden dann gereinigt, indem sie von anderen proteinhaltigen Materialien, mit denen sie gemeinsam produziert werden, und von anderen vorliegenden Kontaminanten isoliert werden.
Verkürzte BMP-Rezeptorproteine der vorliegenden Erfindung können durch eine Aminosäuresequenz charakterisiert werden, die die Aminosäuren Nr. 1–149 von SEQ ID NO: 2 oder die Aminosäuren Nr. 1–124 von SEQ ID NO: 4 umfasst.
Die gereinigten menschlichen verkürzten BMP-Rezeptorproteine der vorliegenden Erfindung können produziert werden, indem eine Wirtszelle, die mit einer DNA-Sequenz transformiert wurde, die die DNA kodierende Sequenz von SEQ ID NO: 1 von Nukleotid Nr. 61 bis Nukleotid Nr. 507 oder SEQ ID NO: 3 von Nukleotid Nr. 247 bis Nukleotid 618 umfasst, kultiviert wird und aus dem Kulturmedium ein Protein gewonnen und gereinigt wird, das die abgeleitete Aminosäuresequenz oder eine im Wesentlichen homologe Sequenz, wie durch die Aminosäuren Nr. 24 bis Nr. 149 von SEQ ID NO: 2 oder die Aminosäuren Nr. 8 bis Nr. 124 von SEQ ID NO: 4 dargestellt, enthält. In den obigen Aminosäuresequenzen wird die sekretorische Leader-Sequenz (z. B. die Aminosäuren 1 bis 23 von SEQ ID NO: 2) nicht vorliegen, da diese in der Regel von sekretierten Proteinen abgespalten werden. Die für SEQ ID NO: 4 von Standardcomputerprogrammen vorhergesagte Leader-Sequenz besteht aus den Aminosäuren 1 bis 7; es wird jedoch in Erwägung gezogen, dass die tatsächliche Leader-Sequenz länger sein kann, da sieben Aminosäuren für eine Leader-Sequenz ungewöhnlich kurz sind. Folglich kann das Protein, das aus dem Kultivieren von Wirtszellen gereinigt wurde, die mit einem DNA-Molekül transformiert wurden, das die DNA-Sequenz von SEQ ID NO: 3 von Nukleotid Nr. 247 bis Nukleotid 618 umfasst, kürzer als die Aminosäuren Nr. 8 bis Nr. 124 von SEQ ID NO: 4 sein.
Die aus dem Kulturmedium gewonnenen verkürzten BMP-Rezeptorproteine werden gereinigt, indem sie von anderen proteinhaltigen Materialien, mit denen sie gemeinsam produziert werden, und von anderen vorliegenden Kontaminanten isoliert werden.
Weitere Serin-/Threoninkinaserezeptorproteine der vorliegenden Erfindung können durch eine Aminosäuresequenz charakterisiert werden, die die Aminosäuren Nr. 1–509 von SEQ ID NO: 6 umfasst.
Die gereinigten Serin-/Threoninkinaserezeptorproteine der vorliegenden Erfindung können produziert werden, indem eine Wirtszelle, die mit einer DNA-Sequenz transformiert wurde, die die DNA kodierende Sequenz von SEQ ID NO: 5 von Nukleotid Nr. 474 bis Nukleotid 2000 (oder bis 2003, Stoppcodon) umfasst, kultiviert wird und aus der transformierten Zellmembran ein Protein gewonnen und gereinigt wird, das die abgeleitete Aminosäuresequenz oder eine im Wesentlichen homologe Sequenz, wie durch die Aminosäuren Nr. 18 bis Nr. 509 von SEQ ID NO: 6 dargestellt, enthält. Da von den in dieser Art und Weise exprimierten Serin-/Threoninkinaserezeptorproteinen erwartet wird, dass sie mit der Zellmembran der transformierten Zelle assoziiert bleiben, können rekombinante Rezeptorproteine der Erfindung von der transformierten Zellmembran dissoziiert werden, und sie werden dann gereinigt, indem sie von anderen proteinhaltigen Materialien, mit denen sie gemeinsam produziert werden, und von anderen vorliegenden Kontaminanten isoliert werden.
Verkürzte Serin-/Threoninkinaserezeptorproteine der vorliegenden Erfindung können durch eine Aminosäuresequenz charakterisiert werden, die die Aminosäuren Nr. 1–121 von SEQ ID NO: 6 umfasst.
Die gereinigten menschlichen verkürzten Serin-/Threoninkinaserezeptorproteine der vorliegenden Erfindung können produziert werden, indem eine Wirtszelle, die mit einer DNA-Sequenz transformiert wurde, die die DNA kodierende Sequenz von SEQ ID NO: 5 von Nukleotid Nr. 474 bis Nukleotid 836 umfasst, kultiviert wird und aus dem Kulturmedium ein Protein gewonnen und gereinigt wird, das die abgeleitete Aminosäuresequenz oder eine im Wesentlichen homologe Sequenz, wie durch die Aminosäuren Nr. 18 bis Nr. 121 von SEQ ID NO: 6 dargestellt, enthält. Die aus dem Kulturmedium gewonnenen verkürzten Serin-/Threoninkinaserezeptorproteine werden gereinigt, indem sie von anderen proteinhaltigen Materialien, mit denen sie gemeinsam produziert werden, und von anderen vorliegenden Kontaminanten isoliert werden.
Serin-/Kinaserezeptorproteine der vorliegenden Erfindung können durch eine Aminosäuresequenz charakterisiert werden, die die Aminosäuren Nr. 1–505 von SEQ ID NO: 8 oder die Aminosäuren Nr. 1–503 von SEQ ID NO: 10 umfasst.
Die gereinigten Serin-/Kinaserezeptorproteine der vorliegenden Erfindung können produziert werden, indem eine Wirtszelle, die mit einer DNA-Sequenz transformiert wurde, die die DNA kodierende Sequenz von SEQ ID NO: 7 von Nukleotid Nr. 80 bis Nukleotid 1594 (oder bis 1597, Stoppcodon) oder SEQ ID NO: 9 von Nukleotid Nr. 83 bis Nukleotid 1591 (oder bis 1594, Stoppcodon) umfasst, kultiviert wird und aus der transformierten Zellmembran ein Protein gewonnen und gereinigt wird, das die abgeleitete Aminosäuresequenz oder eine im Wesentlichen homologe Sequenz, wie durch die Aminosäuren Nr. 24 bis Nr. 505 von SEQ ID NO: 8 oder die Aminosäuren Nr. 30 bis Nr. 503 von SEQ ID NO: 10 dargestellt, enthält. Da von den in dieser Art und Weise exprimierten Serin-/Kinaserezeptorproteinen erwartet wird, dass sie mit der Zellmembran der transformierten Zelle assoziiert bleiben, können rekombinante Rezeptorproteine der Erfindung von der transformierten Zellmembran dissoziiert werden, und sie werden dann gereinigt, indem sie von anderen proteinhaltigen Materialien, mit denen sie gemeinsam produziert werden, und von anderen vorliegenden Kontaminanten isoliert werden.
Verkürzte Serin-/Threoninkinaserezeptorproteine der vorliegenden Erfindung können durch eine Aminosäuresequenz charakterisiert werden, die die Aminosäuren Nr. 1–122 von SEQ ID NO: 8 oder die Aminosäuren Nr. 1–121 von SEQ ID NO: 10 umfasst.
Die gereinigten menschlichen verkürzten Serin-/Threoninkinaserezeptorproteine der vorliegenden Erfindung können produziert werden, indem eine Wirtszelle, die mit einer DNA-Sequenz transformiert wurde, die die DNA kodierende Sequenz von SEQ ID NO: 7 von Nukleotid Nr. 80 bis Nukleotid 445 oder SEQ ID NO: 9 von Nukleotid Nr. 83 bis Nukleotid 445 umfasst, kultiviert wird und aus dem Kulturmedium ein Protein gewonnen und gereinigt wird, das die abgeleitete Aminosäuresequenz oder eine im Wesentlichen homologe Sequenz, wie durch die Aminosäuren Nr. 24 bis Nr. 122 von SEQ ID NO: 8 oder die Aminosäuren Nr. 30 bis Nr. 121 von SEQ ID NO: 10 dargestellt, enthält. Die aus dem Kulturmedium gewonnenen verkürzten Serin-/Threoninkinaserezeptorproteine werden gereinigt, indem sie von anderen proteinhaltigen Materialien, mit denen sie gemeinsam produziert werden, und von anderen vorliegenden Kontaminanten isoliert werden.
Die vorliegende Erfindung umfasst außerdem DNA-Moleküle, die die neuartigen DNA-Sequenzen umfassen, die frei einer Assoziation mit DNA-Sequenzen sind, die andere proteinhaltige Materialien kodieren, und für die Expression der obigen Rezeptorproteine kodieren. Diese DNA-Sequenzen beinhalten die in den SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7 und 9 in einer 5'-zu-3'-Richtung dargestellten und jene Sequenzen, die unter stringenten Hybridisierungsbedingungen [siehe T. Maniatis et al., Molecular Cloning (A Laboratory Manual), Cold Spring Harbor Laboratory (1982), Seiten 387 bis 389] an die DNA-Sequenzen von SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7 und 9 hybridisieren und ein Protein mit der Fähigkeit, an BMP zu binden, kodieren oder die zum Isolieren neuartiger BMP-Rezeptoren von Nutzen sind.
In ähnlicher Weise kodieren DNA-Sequenzen, die für die obigen Rezeptorpolypeptide kodieren, für die durch die Aminosäuresequenzen von SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8 und 10 kodiert wird, die sich jedoch aufgrund von Degenerationen des genetischen Kodes (natürlich vorkommende Basenänderungen in der Speziespopulation, die in einer Aminosäurenänderung resultieren können oder auch nicht) hinsichtlich der Codonsequenz unterscheiden, ebenfalls die hierin beschriebenen neuartigen Rezeptorproteine. Variationen in den DNA-Sequenzen von SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7 und 9, die von Punktmutationen oder von induzierten Modifikationen (einschließlich Insertion, Deletion und Substitution), um die Aktivität, die Halbwertzeit oder die Produktion von dadurch kodierten Polypeptiden zu fördern, sind ebenfalls von der Erfindung umfasst.
Ein anderer Gesichtspunkt der vorliegenden Erfindung stellt ein neuartiges Verfahren zum Produzieren von Rezeptorproteinen bereit. Das Verfahren der vorliegenden Erfindung schließt das Kultivieren einer geeigneten Zelllinie ein, die mit einem DNA-Molekül transformiert wurde, das eine DNA-Sequenz umfasst, die bei Expression unter der Kontrolle bekannter Regulationssequenzen für ein Rezeptorprotein kodiert. Die transformierten Wirtszellen werden kultiviert und die Rezeptorproteine aus der transformierten Zellmembran gewonnen und gereinigt. Die gereinigten Proteine sind im Wesentlichen frei von anderen Proteinen, mit denen sie gemeinsam produziert werden, sowie von anderen Kontaminanten.
Ein anderer Gesichtspunkt der vorliegenden Erfindung stellt ein neuartiges Verfahren zum Produzieren verkürzter Rezeptorproteine bereit. Das Verfahren der vorliegenden Erfindung schließt das Kultivieren einer geeigneten Zelllinie ein, die mit einem DNA-Molekül transformiert wurde, das eine DNA-Sequenz umfasst, die bei Expression unter der Kontrolle bekannter Regulationssequenzen für ein verkürztes Rezeptorprotein kodiert. Die transformierten Wirtszellen werden kultiviert und die verkürzten Rezeptorproteine aus dem Kulturmedium gewonnen und gereinigt. Die gereinigten Proteine sind im Wesentlichen frei von anderen Proteinen, mit denen sie gemeinsam produziert werden, sowie von anderen Kontaminanten.
Geeignete Zellen oder Zelllinien zur Produktion der Rezeptorproteine oder verkürzten Rezeptorproteine können Säugetierzellen sein, wie Zellen der Ovarien des chinesischen Hamsters (Chinese hamster ovary cells, CHO) oder BHK-Zellen. Die Auswahl geeigneter Säugetierwirtszellen und Verfahren zur Transformation, zur Kultivierung, zur Amplifikation, zum Screenen und zur Produktproduktion und -reinigung sind in der Technik bekannt. Siehe z. B. Gething und Sambrook, Nature, 293:620–625 (1981), oder alternativ Kaufman et al., Mol. Cell. Biol., 5(7):1750–1759 (1985), oder Howley et al., US-Patentschrift 4,419,446 . Eine weitere geeignete Säugetierzelllinie, die in den begleitenden Beispielen beschrieben ist, ist die COS-1-Zelllinie des Affen. Die Säugetierzelllinie CV-1 kann ebenfalls geeignet sein.
Bakterienzellen können gleichfalls geeignete Wirte sein. Zum Beispiel sind die verschiedenen Stämme von E. coli (z. B. HB101, MC1061) im Gebiet der Biotechnologie als Wirtszellen wohl bekannt. Verschiedene Stämme von B. subtilis, Pseudomonas, anderen Bazillen und dergleichen können ebenfalls in diesem Verfahren eingesetzt werden.
Viele Fachmännern bekannte Stämme von Hefezellen können ebenfalls als Wirtszellen zur Expression der Polypeptide der vorliegenden Erfindung zur Verfügung stehen. Des Weiteren können, falls gewünscht, Insektenzellen in dem Verfahren der vorliegenden Erfindung als Wirtszellen genutzt werden. Siehe z. B. Miller et al., Genetic Engineering, 8:277–298 (Plenum Press 1986), und darin zitierte Literaturhinweise.
Ein anderer Gesichtspunkt der vorliegenden Erfindung stellt Vektoren zur Verwendung bei der Expression dieser neuartigen Rezeptorpolypeptide bereit. Vorzugsweise enthalten die Vektoren die oben beschriebenen vollständigen neuartigen DNA-Sequenzen, die die neuartigen Rezeptorproteine der Erfindung kodieren. Des Weiteren enthalten die Vektoren entsprechende Expressionskontrollsequenzen, die die Expression der Rezeptorproteinsequenzen ermöglichen.
Alternativ sind Vektoren, die modifizierte DNA-Sequenzen, wie oben beschrieben, einbinden, ebenfalls Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung und bei der Produktion der Rezeptorproteine von Nutzen. Die Vektoren können in dem Verfahren zum Transformieren von Zelllinien eingesetzt werden und enthalten ausgewählte Regulationssequenzen in operativer Assoziation mit den DNA kodierenden Sequenzen der Erfindung, die die Replikation und Expression dieser in ausgewählten Wirtszellen steuern können. Geeignete Regulationssequenzen für solche Vektoren sind dem Fachmann bekannt und können in Abhängigkeit von den ausgewählten Wirtszellen ausgewählt werden. Eine solche Auswahl ist Routine und bildet nicht Teil der vorliegenden Erfindung.
Von den BMP-Rezeptorproteinen der vorliegenden Erfindung, wie CFK1-23a und CFK1-43a, wurde festgestellt, dass sie an Mitglieder der BMP-Familie, vorzugsweise BMP-2 und BMP-4, jedoch nicht an TGF-β binden. Somit werden die BMP-Rezeptorproteine der vorliegenden Erfindung von TGF-β-Rezeptoren unterschieden, die an TGF-β binden.
Die vorliegende Erfindung kann die Kotransfektion von Zeilen mit DNA-Molekülen beinhalten, die DNA-Sequenzen umfassen, die mehrere Rezeptorproteine kodieren, um eine Bindung an ein Ligandenmolekül, wie ein BMP, zu erzielen. Somit kann beispielsweise ein DNA-Molekül, das eine DNA-Sequenz umfasst, die das Rezeptorprotein CFK1-10a kodiert, zusammen mit einem DNA-Molekül, das eine DNA-Sequenz umfasst, die das Rezeptorprotein CFK1-23a oder CFK1-43a kodiert, in Zellen kotransfiziert werden.
Die DNA-Moleküle, die DNA-Sequenzen umfassen, die die Rezeptorproteine der vorliegenden Erfindung kodieren, sind zur Produktion von Zellen, die Rezeptorproteine kodieren, von Nutzen. Diese Zellen werden bei Transformation mit den DNA-Molekülen der vorliegenden Erfindung Rezeptorproteine auf deren Oberfläche exprimieren. Diese Zellen werden wiederum leichter an den Liganden binden und können eine gesteigerte Reaktionsfreudigkeit gegenüber dem Liganden demonstrieren. Zum Beispiel zeigen Zellen, die die BMP-Rezeptorproteine der vorliegende Erfindung exprimieren, eine erhöhte Bindung an BMP-2 und BMP-4 aufzeigen und werden eine gesteigerte Reaktionsfreudigkeit gegenüber BMPs, wie BMP-2 und BMP-4, aufzeigen. Die gesteigerte BMP-Reaktion ist zum Beschleunigen der Wirkungen von BMPs wünschenswert, die die osteoinduktive Förderung von Knochenwachstum und Knorpelregeneration beinhalten.
Die BMP-Rezeptorproteine der vorliegenden Erfindung sind zum Isolieren von BMP von Nutzen. Darüber hinaus sind BMP-Rezeptorproteine der Erfindung bei der Identifizierung neuartiger Moleküle, die mit BMPs zusammenhängen und möglicherweise dazu im Stande sind, die Bildung von Knochen oder Knorpel zu induzieren, oder am Beeinflussen anderer Entwicklungsvorgänge beteiligt sein können, von Nutzen. Des Weiteren sind die BMP-Rezeptorproteine zum Identifizieren und/oder Quantifizieren von BMP-2 und/oder BMP-4 in einer Probe sowie zum Inhibieren der Wirkungen von BMP-2 oder BMP-4 auf Zellen von Nutzen. Die BMP-Rezeptoren der vorliegenden Erfindung können weiterhin beim Identifizieren synthetischer und natürlich vorkommender chemischer Einheiten, die die Bindungseffekte von BMP-2 und/oder BMP-4 nachahmen können, von Nutzen sein. Die BMP-Rezeptorproteine der Erfindung können auch beim Identifizieren synthetischer und natürlich vorkommender chemischer Einheiten, die den Bindungseffekten von BMP-2 und/oder BMP-4 entgegenwirken und/oder diese inhibieren können, von Nutzen sein. Die BMP-Rezeptorproteine können außerdem beim Identifizieren von Verbindungen, die beim Regulieren der Expression der BMP-Rezeptorproteine eine Rolle spielen, von Nutzen sein. Diese Verbindungen könnten dazu verwendet werden, die BMP-Reaktionsfähigkeit, beispielsweise Knochenwachstum, insbesondere Gewebe oder Zellen von Interesse, zu stimulieren.
Die neuartigen Serin-/Threoninkinaserezeptorproteine der vorliegenden Erfindung beinhalten auch W101 und W120, die aus der Mauszelllinie W-20-17 isoliert wurden, eine Zelllinie, von der bekannt ist, dass sie auf BMP reagiert. Die DNA, die eines dieser neuartigen Rezeptorproteine kodiert, wurde als eine Sonde verwendet, um andere Klone zu isolieren, die potentiell Mitglieder der Klasse von BMP-Rezeptorproteinen sind, einschließlich der CFK1-23a- und CFK1-43a-Klone, von denen bestätigt wurde, dass sie Proteine kodieren, die Mitglieder der BMP-Rezeptorfamilie sind. Folglich sind die DNA-Moleküle, die eine DNA-Sequenz umfassen, die die Serin-/Kinaserezeptorproteine der vorliegenden Erfindung kodiert, zur Isolierung von DNA, die BMP-Rezeptorproteine kodiert, von Nutzen und die vorliegende Erfindung beinhaltet ein solches Verfahren zum Verwenden der DNA-Moleküle, die eine DNA-Sequenz umfassen, die Serin-/Threoninkinaserezeptorproteine sowie die neuartigen BMP-Rezeptorproteine kodiert, die dadurch isoliert werden.
In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung werden neuartige DNA-Sequenzen, die BMP-Rezeptorproteine kodieren, mittels eines Verfahrens unter Verwendung einer DNA-Sequenz, die alle oder ein Fragment der Serin-/Kinaserezeptorproteine der vorliegende Erfindung kodiert, identifiziert. In bevorzugten Ausführungsformen werden die neuartigen DNA-Sequenzen unter Verwendung einer DNA-Sequenz, die die Serin-/Threoninkinasedomäne eines Rezeptors kodiert, identifiziert. Alternativ könnte eine DNA-Sequenz, die die Ligandenbindungsdomäne kodiert, zum Identifizieren weiterer neuartiger, BMP-Rezeptoren kodierender Sequenzen verwendet werden.
Folglich umfasst die vorliegende Erfindung weiterhin Verfahren zum Identifizieren neuer BMP-Rezeptorproteine und DNA-Moleküle, die jene Proteine kodieren, und die so identifizierten Proteine und DNA-Moleküle. Das Verfahren umfasst das Herstellen eines DNA-Fragments, das eine ausgewählte Domäne eines BMP-Rezeptorproteins, vorzugsweise die Kinasedomäne eines BMP-Rezeptorproteins, kodiert, oder alternativ eines DNA-Fragments, das die Ligandenbindungsdomäne kodiert, und das Verwenden dieses Fragments als einer Sonde, um entweder eine genomische oder cDNA-Bibliothek zu screenen. Die cDNA-Bibliothek wird vorzugsweise aus einer Zelllinie hergestellt, von der bekannt ist, dass sie BMP-Rezeptoren exprimiert. Diese beinhalten die Mauszelllinie W-20-17 und die Rattenzelllinie CFK1. Die DNA-Sequenzen, die so identifiziert werden, teilen mit dem bekannten BMP-Rezeptorprotein Homologie und von ihnen wird folglich erwartet, dass sie ein Protein kodieren, das an ein oder mehrere BMPs binden wird. Unter Anwendung von in der Technik bekannten Verfahren kann die gesamte DNA-Sequenz kloniert werden, die dadurch identifiziert wird, und dazu verwendet werden, das neu identifizierte BMP-Rezeptorprotein zu exprimieren. Die Identifizierung des neuen Proteins als ein BMP-Rezeptorprotein wird unter Anwendung des in Beispiel VI beschriebenen Bindungsassays bestätigt.
Eine andere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung umfasst DNA-Moleküle, die DNA-Sequenzen umfassen, die verkürzte Rezeptorproteine kodieren, und die verkürzten Proteine selbst. Die verkürzten Rezeptorproteine umfassen vorzugsweise die Ligandenbindungsdomäne, jedoch nicht die Serin-/Threoninkinase- und Transmembrandomänen des Rezeptorproteins. Die verkürzten Rezeptorproteine sind löslich und werden von Säugetierzellen in Überstand sekretiert. Folglich wird bei Expression in Säugetierzellen unter Verwendung eines DNA-Moleküls, das ein verkürztes Rezeptorprotein kodiert, das verkürzte Rezeptorprotein sekretiert anstelle auf der Oberfläche der Wirtszelle exprimiert. Das dadurch exprimierte verkürzte Rezeptorprotein bindet noch immer spezifisch an seinen Liganden. Folglich können die verkürzten BMP-Rezeptorproteine dazu verwendet werden, BMP-Rezeptoren der Erfindung daran zu hindern, die zellulären Vorgänge zu vermitteln, an denen sie normalerweise als Signalisierungsmechanismen teilnehmen. Das verkürzte Rezeptorprotein könnte mit Rezeptorproteinen konkurrieren, die normalerweise auf der Oberfläche von auf funktionellen Liganden reagierenden Zellen exprimiert werden, und die Bildung eines funktionellen Rezeptor/Ligand-Komplexes inhibieren, wodurch der normale Signalisierungsmechanismus des Komplexes und die zellulären Vorgänge, die normalerweise von funktionellen Rezeptor/Ligand-Interaktionen beeinflusst werden, blockiert werden.
Zusammensetzungen, die die verkürzten BMP-Rezeptorproteine der vorliegende Erfindung enthalten, können zur Inhibition der Wirkungen von BMPs, wie BMP-2 und/oder BMP-4, auf Zellen verwendet werden. Die vorliegende Erfindung beinhaltet therapeutische Verfahren, die das Verabreichen einer solchen Zusammensetzung topisch, systematisch oder lokal als ein Implantat oder eine Vorrichtung umfasst. Bei Verabreichung ist die therapeutische Zusammensetzung zur Verwendung in dieser Erfindung selbstverständlich in einer pyrogenfreien, physiologisch unbedenklichen Form. Des Weiteren kann die Zusammensetzung in wünschenswerter Weise eingekapselt oder zur Abgabe an die gewünschte Stelle in einer viskosen Form injiziert werden. Therapeutisch geeignete Agentien, wie Wachstumsfaktoren (z. B. BMPs, TGF-β, FGF, IGF), Cytokine (z. B. Interleukine und CSFs) und Antibiotika, können auch gegebenenfalls in den Verfahren der Erfindung in die Rezeptorzusammensetzung eingebunden oder gleichzeitig oder sequentiell mit dieser verabreicht werden.
Eine andere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung umfasst Zellen, die mit den DNA-Molekülen transformiert wurden, die DNA-Sequenzen umfassen, die die BMP-Rezeptorproteine der vorliegenden. Erfindung kodieren. Diese Zellen werden BMP-Rezeptoren auf deren Oberfläche exprimieren, die die Reaktionsfreudigkeit der Zellen gegenüber BMP erhöhen werden. Folglich können Zellen, die mit den DNA-Molekülen transformiert wurden, die die BMP-Rezeptorproteine kodieren, therapeutisch verabreicht werden, um die Reaktion gegenüber BMP zu fördern, beispielsweise Knochen- und/oder Knorpelregeneration an einer gewünschten Stelle.
Es gibt eine große Auswahl an Verfahren, die zum Abgeben der Zellen, die BMP-Rezeptorproteine exprimieren, an eine Stelle zur Verwendung beim Fördern einer BMP-Reaktion, wie Knochen- und/oder Knorpelregeneration, verwendet werden können. In einer Ausführungsform der Erfindung können die Zellen, die BMP-Rezeptorprotein exprimieren, mittels direkter Applikation, beispielsweise direkter Injektion einer Probe solcher Zellen in die Stelle des Knochen- oder Knorpelschadens, abgegeben werden. In einer bestimmten Ausführungsform können diese Zellen gereinigt sein. In einer bevorzugten Ausführungsform können die Zellen, die BMP-Rezeptorprotein exprimieren, in ein Medium oder eine Matrix abgegeben werden, die deren Beweglichkeit zum Teil behindert, um die Zellen zu einer Stelle einer Knochen- oder Knorpelverletzung zu führen. Ein solches Medium oder eine solche Matrix könnte halbfest sein, wie eine Paste oder ein Gel, einschließlich eines gelartigen Polymers. Alternativ könnte das Medium oder die Matrix in der Form eines Feststoffs, vorzugsweise eines porösen Feststoffs sein, der die Migration von Zellen in die feste Matrix ermöglichen und sie dort festhalten wird, während er die Proliferation der Zellen ermöglicht.
In einem Verfahren der vorliegenden Erfindung werden die Zellen, die BMP-Rezeptoren exprimieren, in der gewünschten Stelle angewendet, wie oben beschrieben, und BMP wird angewendet. Das BMP kann gleichzeitig oder nach Anwendung der Zellen, die BMP-Rezeptoren exprimieren, angewendet werden. BMPs sind bekannt und wurden wie folgt beschrieben: BMP-2 (manchmal als BMP-2A bezeichnet) und BMP-4 (manchmal als BMP-2B bezeichnet): US-Patentschrift Nr. 5,013,649 ; BMP-3: US-Patentschrift Nr. 5,116,738 ; BMP-5: US-Patentschrift Nr. 5,106,748 ; BMP-6: US-Patentschrift Nr. 5,187,076 : BMP-7: US-Patentschrift Nr. 5,141,905 ; BMP-8: PCT-Veröffentlichung Nr. WO 93/00432 ; BMP-9: Aktenzeichen 07/720,590 , am 25. Juni 1991 eingereicht; BMP-10: Aktenzeichen______, am 12. Mai 1993 eingereicht. Heterodimere sind in der US-Patentanmeldung mit dem Aktenzeichen 07/787,496 , am 7. April 1992 eingereicht, beschrieben. Das BMP kann auf in der Technik bekannte Art und Weisen angewendet werden, wie in den obigen Patentschriften sowie in der US-Patentschrift 5,171,579 beschrieben.
Expression von Rezeptorprotein
Um Rezeptorprotein zu produzieren, wird die DNA, die das gewünschte Protein kodiert, in einen entsprechenden Expressionsvektor überführt und mittels herkömmlicher Gentechniken in Säugetierzellen oder andere bevorzugte eukaryontische oder prokaryontische Wirte eingeführt. Das gegenwärtig bevorzugte Expressionssystem für biologisch aktives rekombinantes Rezeptorprotein sind stabil transformierte Säugetierzellen.
Ein Fachmann kann Säugetier-Expressionsvektoren konstruieren, indem er die Sequenz von SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7 oder 9 oder andere DNA-Sequenzen, die die kodierenden Sequenzen von SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7 oder 9 enthalten, oder andere modifizierte Sequenzen und bekannte Vektoren, wie pCD [Okayama et al., Mol. Cell. Biol., 2:161–170 (1982)] und pJL3, pJL4 [Gough et al., EMBO J., 4:645–653 (1985)], einsetzen. Die Rezeptorprotein-cDNA-Sequenzen können modifiziert werden, indem die nichtkodierenden Nukleotide neben den 5'- und 3'-Enden der kodierenden Region entfernt werden. Die deletierten nichtkodierenden Nukleotide können durch andere Sequenzen, von denen bekannt ist, dass sie für die Expression förderlich sind, ersetzt werden oder auch nicht. Die Transformation dieser Vektoren in geeignete Wirtszellen kann in der Expression von Rezeptorproteinen resultieren.
Ein Fachmann kann die Sequenzen von SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7 oder 9 manipulieren, indem die Säugetier-Regulationssequenzen, die die kodierende Sequenz flankieren, eliminiert oder mit bakteriellen Sequenzen ersetzt werden, um bakterielle Vektoren zur intrazellulären oder extrazellulären Expression durch Bakterienzellen zu erzeugen. Zum Beispiel können die kodierenden Sequenzen weiter manipuliert werden (z. B. an andere bekannte Linker ligiert oder durch Deletieren nichtkodierender Sequenzen daraus oder Verändern von Nukleotiden darin mittels anderer bekannter Techniken modifiziert werden). Die modifizierte kodierende Sequenz des Rezeptorproteins kann dann unter Anwendung von Vorgehensweisen, wie in T. Taniguchi et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:5230–5233 (1980), beschrieben, in einen bekannten bakteriellen Vektor inseriert werden. Dieser beispielhafte bakterielle Vektor kann dann in bakterielle Wirtszellen transformiert und Rezeptorprotein dadurch exprimiert werden. Zwecks einer Strategie zum Hervorbringen extrazellulärer Expression von Rezeptorproteinen in Bakterienzellen siehe z. B. die europäische Patentanmeldung EP A 177,343 .
Ähnliche Manipulationen können zur Konstruktion eines Insektenvektors [siehe z. B. die in der veröffentlichen europäischen Patentanmeldung 155,476 beschriebenen Vorgehensweisen] zur Expression in Hefezellen durchgeführt werden. Ein Hefevektor kann auch konstruiert werden, indem Hefe-Regulationssequenzen zur intrazellulären oder extrazellulären Expression der Rezeptorproteine durch Hefezellen eingesetzt werden. [Siehe z. B. die in der veröffentlichen PCT-Anmeldung WO 86/00639 und der europäischen Patentanmeldung EP A 123,289 beschriebenen Vorgehensweisen].
Ein Verfahren zum Produzieren hoher Spiegel eines Rezeptorproteins der Erfindung in Säugetierzellen schließt die Konstruktion von Zellen ein, die mehrere Kopien eines oder mehrerer der heterologen Rezeptorgene enthalten. Das heterologe Gen wird mit einem amplifizierbaren Marker, z. B. dem DHFR-Gen (DHFR = Dihydrofolatreduktase), verknüpft, für den Zellen, die vermehrte Genkopien enthalten, zur Propagierung in zunehmenden Konzentrationen von Methotrexat (MTX) gemäß der Vorgehensweisen von Kaufman und Sharp, J. Mol. Biol., 159:601–629 (1982), ausgewählt werden können. Diese Vorgehensweise kann mit einer Reihe unterschiedlicher Zellarten eingesetzt werden.
Zum Beispiel kann ein Plasmid, das eine DNA-Sequenz für ein BMP-Rezeptorprotein der Erfindung enthält, in operativer Assoziation mit anderen Plasmidsequenzen, die die Expression dieser ermöglichen, und dem DHFR-Expresssionsplasmid pAdA26SV(A)3 [Kaufman und Sharp, Mol. Cell. Biol., 2:1304 (1982)] zusammen mittels Kalziumphosphat-Kopräzipitation und Transfektion, Elektroporation, Protoplastenfusion oder Lipofektion in DHFR-defiziente CHO-Zellen, DUKX-BII, eingeführt werden. DHFR exprimierende Transformanten werden hinsichtlich ihres Wachstums in Alphamedien mit dialysiertem fötalem Kälberserum ausgewählt und anschließend hinsichtlich ihrer Amplifikation durch Wachstum in zunehmenden Konzentrationen von MTX (z. B. aufeinander folgende Schritte in 0,02, 0,2, 1,0 und 5 μM MTX) ausgewählt, wie in Kaufman et al., Mol. Cell. Biol., 5:1750 (1983), beschrieben.
Transformanten werden kloniert und die Bindung an BMP-2 oder BMP-4 wird mittels des in Beispiel VI oben beschriebenen Bindungsassays gemessen. Die BMP-2- und BMP-4-Bindung sollte mit zunehmenden Niveaus an MTX-Widerstand zunehmen. Ähnliche Vorgehensweisen können zum Produzieren anderer verwandter BMP-Rezeptorproteine befolgt werden.
Koexpression mehrerer Rezeptorproteine
Gemäß einer Ausführungsform dieser Erfindung kann die Wirtszelle mit einem oder mehreren Vektoren, die kodierende Sequenzen für ein oder mehrere Rezeptorproteine, verkürzte Rezeptorproteine oder aktive Fragmente davon enthalten, kotransfiziert werden. Jede Rezeptor-Polynukleotidsequenz kann auf demselben Vektor oder auf individuellen Vektoren, die in die Zelle kotransfiziert werden, vorliegen. Alternativ können die Polynukleotide, die Rezeptoren, verkürzte Rezeptoren oder deren Fragmente in ein Chromosom der Wirtszelle eingebunden werden. Des Weiteren kann eine einzige Transkriptionseinheit eine einzige Kopie von zwei Genen, die unterschiedliche Rezeptorproteine kodieren, kodieren.
Gemäß einer anderen Ausführungsform dieser Erfindung ist die ausgewählte Wirtszelle, die die zwei Polypeptide kodierenden Sequenzen enthält, eine Hybridzelllinie, die durch Fusionieren von zwei ausgewählten, stabilen Wirtszellen erhalten wird, wobei jede Wirtszelle mit einer Polynukleotidsequenz transfiziert wird und diese stabil exprimieren kann, wobei die Polynukleotidsequenz ein ausgewähltes erstes oder zweites Rezeptorprotein, verkürztes Rezeptorprotein oder aktives Fragment davon kodiert.
In einem anderen Gesichtspunkt der vorliegenden Erfindung werden folglich Zusammensetzungen von Zellen bereitgestellt, die mehr als ein rekombinantes Rezeptorprotein, verkürztes Rezeptorprotein oder aktive Fragmente davon exprimieren, die die Bindungseigenschaften des Rezeptors oder verkürzten Rezeptors beibehalten. Ebenfalls bereitgestellt werden Zusammensetzungen verkürzter Rezeptorproteine, die von Wirtszellen sekretiert wurden. Die Zellen, Proteine und Zusammensetzungen von Rezeptorproteinen, verkürzten Rezeptorproteinen oder aktiven Fragmenten davon können durch ihre Fähigkeit, in einem Bindungsassay selektiv an BMPs mit einer größeren Bindungsaffinität als an andere Proteine in der TGF-β-Superfamilie zu binden, gekennzeichnet werden.
Die Zellen und Zusammensetzungen können ein oder mehrere BMP-Rezeptorproteine, verkürzte BMP-Rezeptorproteine oder aktive Fragmente davon oder ein oder mehrere Serin-/Threoninkinaserezeptorproteine oder aktive Fragmente davon, wie W-101, W-120 oder CFK1-10a, in Kombination mit einem oder mehreren BMP-Rezeptorproteinen, verkürzten BMP-Rezeptorproteinen oder aktiven Fragmenten davon, wie CFK1-23a oder CFK1-43a, umfassen. Diese Zellen oder Zusammensetzungen können produziert werden, indem jedes Protein in einer ausgewählten Wirtszelle koexprimiert wird und die Zellen in einer Zusammensetzung isoliert werden oder in dem Fall, in dem verkürzte Rezeptorproteine produziert werden, die verkürzten Rezeptorproteine aus dem Kulturmedium isoliert werden.
Als ein weiterer Gesichtspunkt dieser Erfindung wird eine Zelllinie bereitgestellt, die eine erste Polynukleotidsequenz, die ein erstes Rezeptorprotein, verkürztes Rezeptorprotein oder aktives Fragment davon kodiert, und eine zweite Polynukleotidsequenz, die ein zweites Rezeptorprotein, verkürztes Rezeptorprotein oder aktives Fragment davon kodiert, umfasst, wobei die Sequenzen unter der Kontrolle eines oder mehrerer geeigneter Expressionsregulationssysteme steht, die die Rezeptorproteine koexprimieren können. Die Zelllinie kann mit einem oder mehr als einem Polynukleotidmolekül transfiziert werden. Alternativ kann die Zelllinie eine Hybridzelllinie sein, die wie oben beschrieben mittels Zellfusion erzeugt werden kann.
Ein anderer Gesichtspunkt der Erfindung ist ein Polynukleotidmolekül oder Plasmidvektor, das bzw. der eine Polynukleotidsequenz, die ein erstes ausgewähltes Rezeptorprotein, verkürztes Rezeptorprotein oder aktives Fragment davon kodiert, und eine Polynukleotidsequenz, die ein zweites ausgewähltes Rezeptorprotein, verkürztes Rezeptorprotein oder aktives Fragment davon kodiert, umfasst. Die Sequenzen stehen unter der Kontrolle mindestens einer geeigneten Regulationssequenz, die die Koexpression jedes Proteins oder aktiven Fragments steuern kann. Das Molekül kann eine einzige Transkriptionseinheit, die eine Kopie beider Gene enthält, oder mehr als eine Transkriptionseinheit, von denen jede eine Kopie eines einzigen Gens enthält, enthalten.
Eine Ausführungsform des Verfahrens der vorliegenden Erfindung zum Produzieren von Zusammensetzungen von Zellen oder rekombinanten Rezeptorproteinen beinhaltet das Kultivieren einer geeigneten Zelllinie. die mit einer DNA-Sequenz, die zur Expression eines ersten Rezeptorproteins, verkürzten Rezeptorproteins oder aktiven Fragments davon kodiert, und einer DNA-Sequenz, die zur Expression eines zweiten Rezeptorproteins, verkürzten Rezeptorproteins oder aktiven Fragments davon kodiert, unter der Kontrolle bekannter Regulationssequenzen kotransfiziert wurde. Die transformierten Wirtszellen werden kultiviert und die Zellen werden isoliert und gereinigt, um Zusammensetzungen transformierter Zellen zu bilden. In der Ausführungsform, in der verkürzte Rezeptorproteine produziert werden, wird das verkürzte Rezeptorprotein aus dem Kulturmedium gewonnen und gereinigt und kann zum Bilden von Zusammensetzungen von verkürztem Rezeptorprotein verwendet werden.
In einer anderen Ausführungsform dieses Verfahrens, bei dem es sich um das gegenwärtig bevorzugte Verfahren zur Expression der rekombinanten Rezeptorproteine dieser Erfindung handelt, wird eine einzige Wirtszelle, z. B. eine CHO-DUKX-Zelle, mit einem ersten DNA-Molekül, das eine DNA-Sequenz enthält, die ein Rezeptorprotein, wie das Rezeptorprotein CFK1-10a, kodiert, und einem zweiten DNA-Molekül, das eine DNA-Sequenz enthält, die ein zweites ausgewähltes Rezeptorprotein, wie das BMP-Rezeptorprotein CFK1-23a oder CFK1-43a, kodiert, kotransfiziert. Ein oder beide Plasmide enthalten einen selektierbaren Marker, der zum Herstellen stabiler Zelllinien, die die Rezeptorproteine exprimieren, verwendet werden kann. Diese separaten Plasmide, die verschiedene Rezeptorgene an separaten Transkriptionseinheiten enthalten, werden gemischt und unter Anwendung herkömmlicher Protokolle in die CHO-Zellen kotransfiziert. Ein Verhältnis von Plasmiden, das eine maximale Expression von Aktivität in dem Bindungsassay ergibt, kann ermittelt werden.
Zum Beispiel können gleiche Anteile eines Plasmids, das das erste Rezeptorproteingen und ein DHFR-Markergen (DHFR = Dihydrofolatreduktase) enthält, und eines anderen Plasmids, das ein zweites Rezeptorproteingen und ein DHFR-Markergen enthält, zusammen mittels Kalziumphosphat-Kopräzipitation und Transfektion, Elektroporation, Mikroinjektion, Protoplastenfusion oder Lipofektion in DHFR-defiziente CHO-Zellen, DUKX-BII, eingeführt werden. Individuelle DHFR exprimierende Transformanten werden mittels herkömmlicher Mittel hinsichtlich ihres Wachstums in Alphamedien mit dialysiertem fötalem Kälberserum ausgewählt. DHFR+-Zellen, die zunehmende Genkopien enthalten, können hinsichtlich ihrer Propagierung in zunehmenden Konzentrationen von MTX (z. B. aufeinander folgende Schritte in 0,02, 0,1, 0,5 und 2,0 μM MTX) gemäß den Vorgehensweisen von Kaufman und Sharp, J. Mol. Biol., 159:601–629 (1982), und Kaufman et al., Mol. Cell. Biol., 5:1750 (1983), ausgewählt werden. Die Expression von mindestens einem Rezeptorprotein, das mit DHFR verknüpft ist, sollte mit zunehmenden Niveaus an MTX-Widerstand zunehmen. Zellen, die eines oder beide des Rezeptorprotein- und des DHFR-Gens stabil exprimieren, werden überleben. Bei einer hohen Frequenz binden Zelllinien jedoch beide Plasmide, die bei der anfänglichen Transfektion vorlagen, stabil ein und exprimieren diese. Das konditionierte Medium wird danach geerntet und das Rezeptorprotein mittels herkömmlicher Verfahren isoliert und auf Aktivität geprüft. Diese Vorgehensweise kann mit DHFR-defizienten Zellen eingesetzt werden.
Als eine alternative Ausführungsform dieses Verfahrens kann eine DNA-Molekül, die ein ausgewähltes Rezeptorgen enthalten, kann in eine stabile Zelllinie transfiziert werden, die bereits ein anderes ausgewähltes Rezeptorgen exprimiert. Zum Beispiel kann eine stabile CHO-Zelllinie, die das Gen für den Rezeptor CFK1-10a mit dem DHFR-Marker exprimiert, mit einem Plasmid, das das Gen für das Rezeptorgen für CFK1-23a enthält, und einem zweiten selektierbaren Markergen, z. B. Neomycinresistenz (Neo), transfiziert. Nach der Transfektion wird die Zelle kultiviert und geeignete Zellen werden mittels Behandlung mit MTX und dem Antibiotikum, G-418, ausgewählt. Überlebende Zellen werden dann auf die Expression beider Rezeptorproteine gescreent. Dieses Expressionssystem hat den Vorteil, dass es eine Auswahl in einem einzigen Schritt ermöglicht.
Alternative Doppelauswahlstrategien unter Verwendung unterschiedlicher Zelllinien oder unterschiedlicher Marker können ebenfalls angewendet werden. Zum Beispiel kann die Verwendung eines ADA-Markers (ADA = Adenosindeaminase) zum Amplifizieren des zweiten Rezeptorgens in einer stabilen CHO-Zelllinie, die einen anderen Rezeptor mit dem DHFR-Marker exprimiert, bevorzugt sein, da das Expressionsniveau unter Verwendung von DCF-vermittelter (DCF = Desoxycoformycin) Genamplifikation gesteigert werden kann. Alternativ kann dann eine beliebige Zelllinie, die einen Rezeptor exprimiert, der hergestellt wurde, indem zunächst dieser Marker verwendet wurde, der Empfänger eines zweiten Rezeptorexpressionsvektors sein, der einen unterschiedlichen Marker enthält und hinsichtlich der Doppelresistenz und der Rezeptorkoexpression ausgewählt wurde.
Noch eine andere Ausführungsform eines Verfahrens zum Exprimieren der Rezeptoren dieser Erfindung beinhaltet das Transfizieren der Wirtszelle mit einem einzigen DNA-Molekül, das mehrere Gene zur Expression entweder an einer einzigen Transkriptionseinheit oder an separaten Transkriptionseinheiten kodiert. Multicistron-Expression beinhaltet mehrere Polypeptide, die in einem einzigen Transkript kodiert werden das unter Verwendung einer Leader-Sequenz, z. B. aus dem EMC-Virus, aus Poliovirus oder aus anderen herkömmlichen Quellen von Leader-Sequenzen, effizient aus Vektoren translatiert werden kann. Zwei Rezeptorgene (Rx bzw. Ry) und ein selektierbarer Marker können in einer einzigen Transkriptionseinheit exprimiert werden. Zum Beispiel können Vektoren, die die Konfiguration Rx-EMC-Ry-DHFR oder Rx-EMC-Ry-EMC-DHFR enthalten, in CHO-Zellen transfiziert und ausgewählt und unter Verwendung des DHFR-Markers amplifiziert werden. Es kann ein Plasmid konstruiert werden, das DNA-Sequenzen, die zwei verschiedene Rezeptoren kodieren, ein oder mehrere Markergene und eine geeignete Leader- oder Regulationssequenz an einer einzigen Transkriptionseinheit enthält.
In ähnlicher Weise können Wirtszellen mit einem einzigen Plasmid transfiziert werden, das separate Transkriptionseinheiten für jeden Rezeptor enthält. Ein selektierbarer Marker, z. B. DHFR, kann an einer anderen Transkriptionseinheit oder alternativ als das zweite Cistron an einem oder beiden der Rezeptorgene enthalten sein. Diese Plasmide können in eine ausgewählte Wirtszelle zur Expression der Rezeptoren transfiziert werden.
Eine andere Ausführungsform dieses Expressionsverfahrens beinhaltet eine Zellfusion. Zwei stabile Zelllinien, die ausgewählte Rezeptoren exprimieren, wie eine Zelllinie, die mit einem Vektor für CFK1-23a (z. b. pMV23a) transformiert wurde, und eine Zelllinie, die mit einem Vektor für CFK1-43a (z. b. pMV43a) stabil transformiert wurde, entwickelt unter Verwendung des DHFR/MTX-Genamplifikationssystems und Expression von Rezeptoren in hohen Niveaus, können mit einem von mehreren dominanten Markergenen (z. B. Neo^r, Hygromycin^r, GPT) transfiziert werden. Nach ausreichender Zeit in Kokultur (ungefähr einen Tag) können eine resultierende Zelllinie, die einen Rezeptor und einen dominanten Marker exprimiert, mit einer Zelllinie, die einen anderen Rezeptor und vorzugsweise einen anderen Marker exprimiert, unter Verwendung eines Fusigenreagens, wie Polyethylenglykol, Sendaivirus oder ein anderes bekanntes Agens, fusioniert werden.
Die resultierenden Zellhybride, die sowohl dominante Marker als auch DHFR exprimieren, können unter Anwendung der geeigneten Kulturbedingungen ausgewählt und auf Koexpression der Rezeptoren, verkürzten Rezeptoren oder von deren Fragmenten gescreent werden. Die ausgewählte Hybridzelle enthält Sequenzen, die beide ausgewählte Rezeptoren kodieren, und beide Rezeptoren werden in der Membran der Zelle zurückbehalten. Zusammensetzungen der Zeilen, die mehrere Rezeptoren exprimieren, können in den Verfahren der vorliegenden Erfindung zum Interagieren mit BMP verwendet werden. In dem Fall, in dem Gene, die verkürzte Rezeptoren kodieren, verwendet werden, wird der verkürzte Rezeptor in der Zelle gebildet und dann sekretiert. Das verkürzte Rezeptorprotein wird aus dem konditionierten Medium erhalten und daraus mittels herkömmlicher Verfahren isoliert und gereinigt. Die resultierende Rezeptorproteinzusammensetzung kann mittels hierin beschriebenen Verfahren charakterisiert und in den Verfahren der vorliegenden Erfindung verwendet werden, beispielsweise um mit Rezeptoren, die in Zellen vorliegen, um die Ligandenbindung zu konkurrieren und somit die Aktivität von BMP zu inhibieren.
Zelllinien, die aus den oben beschriebenen Vorgehensweisen erzeugt wurden, können zum Produzieren koexprimierter Rezeptorpolypeptide verwendet werden. Die Rezeptorproteine werden in der Membran der Zellen zurückbehalten. Zusammensetzungen der Zellen können dazu verwendet werden, die Reaktion gegenüber BMP zu steigern, beispielsweise die Knorpel- und/oder Knochenbildung zu steigern. Zusammensetzungen der Zellen können in Verbindung mit BMP angewendet werden.
Wenn verkürzte Rezeptorpolypeptide produziert werden, werden die Rezeptorproteine aus dem Zellmedium in einer Form, die im Wesentlichen frei von anderen Proteinen, mit denen sie gemeinsam produziert werden, sowie von anderen Kontaminanten, die in den Wirtszellen vorgefunden werden, mittels herkömmlicher Reinigungstechniken isoliert. Das gegenwärtig bevorzugte Verfahren zur Produktion ist Kotransfektion unterschiedlicher Vektoren in CHO-Zellen und von Methotrexat vermittelte Genamplifikation. Stabile Zelllinien können zum Erzeugen konditionierter Medien verwendet werden, die verkürzten Rezeptor enthalten, der gereinigt und auf In-vitro- und In-vivo-Aktivitäten geprüft werden kann. Zum Beispiel können die resultierenden, verkürzten Rezeptor produzierenden Zelllinien, die mittels eines beliebigen der hierin beschriebenen Verfahren erhalten wurden, mittels der in Beispiel VI beschriebenen Bindungsassays auf Aktivität und mittels SDS-PAGE (sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis, Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese) auf Proteinexpression gescreent werden.
Die oben beschriebenen Verfahren zur Koexpression der Rezeptoren dieser Erfindung nutzen geeignete Wirtszellen oder -zelllinien. Zu geeigneten Zellen zählen vorzugsweise Säugetierzellen, wie Zellen der Ovarien des chinesischen Hamsters (Chinese hamster ovary cells, CHO). Die Auswahl geeigneter Säugetierwirtszellen und Verfahren zur Transformation, zur Kultivierung, zur Amplifikation, zum Screenen und zur Produktproduktion und -reinigung sind in der Technik bekannt. Siehe z. B. Gething und Sambrook, Nature, 293:620–625 (1981), oder alternativ Kaufman et al., Mol. Cell. Biol., 5(7):1750–1759 (1985), oder Howley et al., US-Patentschrift 4,419,446 . Weitere geeignete Säugetierzelllinien sind die CV-1-Zelllinie, die BHK-Zelllinien und die 293-Zelllinie.
Ein anderer Gesichtspunkt der vorliegenden Erfindung stellt DNA-Moleküle oder Plasmidvektoren zur Verwendung bei der Expression dieser rekombinanten Rezeptorproteine bereit. Diese Plasmidvektoren können durch Zurückgreifen auf bekannte Verfahren und verfügbare Bestandteile, die Fachmännern bekannt sind, konstruiert werden. Im Allgemeinen wird zum Erzeugen eines Vektors, der in den Verfahren dieser Erfindung von Nutzen ist, die DNA, die das gewünschte Rezeptorprotein, verkürzte Rezeptorprotein oder aktive Fragment davon kodiert, in einen oder mehrere adäquate Expressionsvektoren überführt, die für die ausgewählte Wirtszelle geeignet sind.
Es wird gegenwärtig in Erwägung gezogen, dass ein beliebiger Expressionsvektor, der zur effizienten Expression in Säugetierzellen geeignet ist, zum Produzieren der rekombinanten Rezeptorproteine dieser Erfindung in Säugetierwirtszellen eingesetzt werden kann. Vorzugsweise enthalten die Vektoren die oben und im Sequenzprotokoll beschriebenen ausgewählten Rezeptor-DNA-Sequenzen, die ausgewählte Rezeptorproteine oder verkürzte Rezeptorproteine kodieren. Alternativ sind Vektoren, die modifizierte Sequenzen einbinden, ebenfalls Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung und bei der Produktion der Vektoren von Nutzen.
Neben den oben beschriebenen spezifischen Vektoren kann ein Fachmann Säugetier-Expressionsvektoren konstruieren, indem die Sequenz von SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7 oder 9 oder andere DNA-Sequenzen, die für Rezeptorproteine, verkürzte Rezeptorproteine oder aktive Fragmente davon kodieren, und bekannte Vektoren, wie pCD [Okayama et al., Mol. Cell Biol., 2:161–170 (1982)] und pJL3, pJL4 [Gough et al., EMBO J., 4:645–653 (1985)], eingesetzt werden. Die Rezeptor-DNA-Sequenzen können modifiziert werden, indem die nichtkodierenden Nukleotide an den 5'- und 3'-Enden der kodierenden Region entfernt werden. Die deletierten nichtkodierenden Nukleotide können durch andere Sequenzen, von denen bekannt ist, dass sie für die Expression förderlich sind, ersetzt werden oder auch nicht. Die Transformation dieser Vektoren in geeignete Wirtszellen, wie oben beschrieben, kann gewünschte Rezeptorproteine produzieren.
Ein Fachmann könnte die Sequenzen von SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7 oder 9 manipulieren, indem die Säugetier-Regulationssequenzen, die die kodierende Sequenz flankieren, eliminiert oder mit z. B. Hefe- oder Insekten-Regulationssequenzen ersetzt werden, um Vektoren zur intrazellulären oder extrazellulären Expression durch Hefe- oder Insektenzellen zu erzeugen. [Siehe z. B. die in der veröffentlichten europäischen Patentanmeldung 155,476 beschriebenen Vorgehensweisen zur Expression in Insektenzellen und die in der veröffentlichten PCT-Anmeldung WO 86/00639 und der europäischen Patentanmeldung EP A 123,289 beschriebenen Vorgehensweisen zur Expression in Hefezellen.]
In ähnlicher Weise können bakterielle Sequenzen und bevorzugte Codons Sequenzen in den beschriebenen und beispielhaft dargestellten Säugetier-Vektoren ersetzen, um geeignete Expressionssysteme zur Verwendung bei der Produktion von Rezeptorproteinen in dem oben beschriebenen Verfahren zu erzeugen. Zum Beispiel könnten die kodierenden Sequenzen weiter manipuliert werden (z. B. an andere bekannte Linker ligiert oder durch Deletieren nichtkodierender Sequenzen daraus oder Verändern von Nukleotiden darin mittels anderer bekannter Techniken modifiziert werden). Die modifizierte kodierende Sequenz des Rezeptors könnte dann unter Anwendung von Vorgehensweisen, wie in T. Taniguchi et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:5230–5233 (1980), beschrieben, in einen bekannten bakteriellen Vektor inseriert werden. Der beispielhafte bakterielle Vektor könnte dann in bakterielle Wirtszellen transformiert und Rezeptorproteine dadurch exprimiert werden.
Andere Vektoren, die in den Verfahren dieser Erfindung von Nutzen sind, können mehrere Gene in einer einzigen Transkriptionseinheit enthalten. Zum Beispiel enthält ein vorgeschlagenes Plasmid das CFK1-10a-Rezeptorgen, gefolgt von der EMC-Leader-Sequenz, gefolgt von dem CFK1-23a-BMP-Rezeptorgen, gefolgt von dem DHFR-Markergen. Ein anderes Beispiel enthält das CFK1-23a-BMP-Rezeptorgen, den EMC-Leader, das W101-Serin-/Threoninkinaserezeptorgen, eine weitere EMC-Leader-Sequenz und das DHFR-Markergen. Alternativ kann der Vektor mehr als eine Transkriptionseinheit enthalten. Als ein Beispiel kann das Plasmid eine Transkriptionseinheit für das CFK1-23a-BMP-Rezeptorgen und eine separate Transkriptionseinheit für das CFK1-43a-Rezeptorgen enthalten, d. h. CFK1-23a-EMC-DHFR und CFK1-43a-EMC-DHFR. Alternativ kann jede Transkriptionseinheit an dem Plasmid ein anderes Markergen enthalten. Zum Beispiel kann das Plasmid CFK1-10a-EMC-Neo und CFK1-43a-EMC-Neo enthalten. Selbstverständlich sind die obigen Beispiele nicht einschränkend. Andere Kombinationen (d. h. Koexpression) der Rezeptoren der vorliegenden Erfindung liegen ebenfalls innerhalb der Erfindung.
Darüber hinaus enthalten die Vektoren außerdem adäquate Expressionskontrollsequenzen, die die Replikation und Expression des Rezeptors in den ausgewählten Wirtszellen steuern können. Geeignete Regulationssequenzen für solche Vektoren sind dem Fachmann bekannt und können in Abhängigkeit von den ausgewählten Wirtszellen ausgewählt werden. Eine solche Auswahl ist Routine und bildet nicht Teil der vorliegenden Erfindung. In ähnlicher Weise können die Vektoren einen oder mehrere Selektionsmarker, wie das Antibiotikaresistenzgen, Neo, oder selektierbare Marker, wie DHFR und ADA, enthalten. Das gegenwärtig bevorzugte Markergen ist DHFR. Diese Markergene können auch von einem Fachmann ausgewählt werden.
Die folgenden Beispiele veranschaulichen die Ausübung der vorliegenden Erfindung beim Gewinnen und Charakterisieren der Rezeptorproteine der vorliegenden Erfindung und Einsetzen dieser zum Gewinnen der entsprechenden menschlichen Rezeptorproteine der vorliegenden Erfindung und beim Exprimieren der Proteine mittels rekombinanter Techniken.
Antikörper
Wie hierin verwendet, wird von einem Molekül gesagt, dass es „BMP-ähnlich" ist, wenn es mindestens eine BMP-ähnliche Aktivität aufzeigt. Für die Zwecke der Erfindung beinhaltet BMP-ähnliche Aktivität die Fähigkeit, an einen verkürzten BMP-Rezeptor zu binden und das Wachstum BMP-abhängiger Zelllinien, wie der in Beispiel VIII beschriebenen W-20-17-Zelllinie, zu stimulieren. Wie hierin verwendet, beinhaltet der Ausdruck „BMP-ähnlicher monoklonaler Antikörper" nichtmenschliche BMP-ähnliche monoklonale Antikörper, Komplementarität bestimmende Regionen (complementarity determining regions, CDRs) der nichtmenschlichen BMP-ähnlichen monoklonalen Antikörper, BMP-Erkennungsstellen der nichtmenschlichen BMP-ähnlichen monoklonalen Antikörper, alle aufgepfropften Formen der BMP-Erkennungsstellen der nichtmenschlichen BMP-ähnlichen monoklonalen Antikörper und kleine Peptid-BMP-Analoga.
Gemäß der vorliegenden Erfindung umfasst der Ausdruck „BMP-Analogon" monoklonale Antikörper, kleine Peptide und kleine Moleküle, die über eine BMP-ähnliche Aktivität verfügen. Für die Zwecke der Erfindung ist BMP-ähnliche Aktivität als die Fähigkeit, an den verkürzten BMP-Rezeptor zu binden und das Wachstum BMP-abhängiger Zelllinien, wie der in Beispiel VIII beschriebenen W-20-17-Zelllinie, zu stimulieren, definiert.
Die BMP-ähnlichen monoklonalen Antikörper der Erfindung können auf molekularer Ebene verändert werden, um ihre Eignung als Pharmazeutika für Menschen zu fördern. Zum Beispiel umfassen die CDRs der BMP-ähnlichen monoklonalen Antikörper spezifische BMP-Rezeptor-Erkennungsstellen, die von der vorliegenden Erfindung umfasst sind. Diese CDRs können auf menschliche Immunglobulin-Gerüstregionen gepfropft werden, um die Antigenität zu minimieren, die vom Vorliegen nichtmenschlicher Immunglobulin-Regionen verursacht wird, beispielsweise mittels der in WO 91/09967 offenbarten Techniken. Die BMP-Rezeptor-Erkennungsstellen der vorliegenden Erfindung können auch auf andere Proteingerüste gepfropft werden, um die therapeutische Effizienz der daraus entwickelten BMP-Analoga zu maximieren. Die CDRs der BMP-ähnlichen monoklonalen Antikörper können auch auf molekularer Ebene verändert werden, um einkettige Antikörper zu bilden.
Die CDRs der BMP-ähnlichen monoklonalen Antikörper können auch dazu verwendet werden, kleine Peptid-BMP-Analoga herzustellen. Die gesamte CDR kann in den kleinen Peptid-BMP-Analoga der Erfindung vorliegen oder ein BMP-ähnlicher Abschnitt der CDR kann solche kleinen Peptid-BMP-Analoga umfassen. Zwei oder mehr CDRs können in einer „Kopf-an-Kopf"-, „Kopf-an- Schwanz"- oder „Schwanz-an-Schwanz"-Ausrichtung verbunden werden, um dimere oder multimere kleine Peptid-BMP-Analoga zu bilden. Da jeder BMP-ähnliche monoklonale Antikörper mehrere CDRs enthalten kann, kann eine einzige CDR in dem kleinen Peptid-BMP-Analogon vorliegen oder verschiedene BMP-ähnliche CDRs aus einem oder mehreren BMP-ähnlichen monoklonalen Antikörpern können vorliegen. Nicht natürlich vorkommende, synthetische und D-Aminosäuren können durch spezifische Aminosäuren der BMP-ähnlichen CDRs ersetzt werden.
Die Erfindung umfasst weiterhin Peptide, die den verkürzten Rezeptor spezifisch binden und eine BMP-ähnliche Aktivität aufweisen. Diese Peptide können auf der Sequenz der CDRs von BMP-ähnlichen Antikörpern basieren, sind jedoch nicht ausschließlich solche. Die Peptide können mit anderen Peptiden in multimeren Strukturen von zwei Peptiden oder mehr „verbrückt" oder „verbunden" sein, um die BMP-ähnliche Aktivität auszulösen. Die Aminosäuren der Peptide können „unnatürliche" Aminosäuren mit z. B. D-Stereospezifität oder Analoge von Aminosäuren mit anderen chemischen Gruppen, die an die Peptidhauptkette angefügt sind, sein, sind jedoch nicht ausschließlich diese. Die Peptide können auch eine cyclische Struktur aufweisen. Ein Peptid, wie hierin verwendet, ist ein Molekül, das mindestens zwei Aminosäuren und bis zu dreißig Aminosäuren umfasst.
Die Erfindung umfasst weiterhin kleine organische Moleküle, die aminosäurenartige Moleküle beinhalten können, die spezifische Bindung an den verkürzten menschlichen BMP-Rezeptor aufzeigen und die über eine BMP-ähnliche Aktivität verfügen. „Kleine organische Moleküle" sind gemäß der vorliegenden Erfindung als kohlenstoffhaltige Moleküle, bei denen es sich nicht um Proteine handelt, mit einem Molekulargewicht von weniger als 3000 definiert, die zunächst unter Verwendung des verkürzten Rezeptors der Erfindung zur Verwendung als BMP-Analoga identifiziert wurden. Die kleinen organischen Moleküle der Erfindung können in Pharmazeutika zur oralen Verabreichung zur Behandlung von Knochen- und/oder Knorpelerkrankungen eingebunden werden.
Pharmazeutische Zusammensetzungen, die die BMP-ähnlichen monoklonalen Antikörper, kleinen Peptid-BMP-Analoga oder kleinen organischen Moleküle der vorliegende Erfindung enthalten, sind beim Behandeln einer Vielfalt von Knochen- und/oder Knorpelerkrankungen unterschiedlicher Ätiologien von Nutzen. Solche pharmazeutischen Zusammensetzungen können außerdem pharmazeutisch unbedenkliche Trägerstoffe, Verdünnungsmittel, Füllstoffe, Salze, Puffer, Stabilisierungsmittel und/oder andere in der Technik wohl bekannte Materialien enthalten. Der Ausdruck „pharmazeutisch unbedenklich" steht für ein nicht toxisches Material, das die Wirksamkeit der biologischen Aktivität des Wirkstoffs bzw. der Wirkstoffe nicht beeinträchtigt. Die Eigenschaften des Trägerstoffs oder anderen Materials wird vom Verabreichungsweg abhängen.
Die Verabreichung der BMP-ähnlichen monoklonalen Antikörper, kleinen Peptid-BMP-Analoga oder kleinen organischen Moleküle der Erfindung kann in einer Vielfalt herkömmlicher Wege durchgeführt werden, einschließlich über Matrizes und/oder Trägerstoffe, wie in der US-Patentschrift 5,171,579 offenbart sind. Für die BMP-ähnlichen monoklonalen Antikörper ist eine intravenöse Verabreichung an den Patienten bevorzugt. Kutane oder subkutane Injektion kann ebenfalls zur Verabreichung des monoklonalen Antikörpers der Ausführungsform der Erfindung eingesetzt werden. Orale Verabreichung ist zur Verabreichung des kleinen Peptids und kleinen organischen Moleküls der Ausführungsform der Erfindung bevorzugt.
Die Menge an BMP-ähnlichem monoklonalem Antikörper, kleinem Peptid-Analagon oder kleinem organischem Molekül in der pharmazeutischen Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung wird von der Art und Schwere des behandelten Leidens und von der Art vorheriger Behandlungen, denen der Patient unterzogen wurde, abhängen. Schließlich wird der behandelnde Arzt die Menge an BMP-Analogon bestimmen, mit der jeder individuelle Patient behandelt wird. Es wird in Erwägung gezogen, dass die verschiedenen pharmazeutischen Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung etwa 0,1 μg bis etwa 100 μg BMP-Analogon-Molekül pro kg Körpergewicht enthalten sollten.
BEISPIELE
Beispiel I. Identifizierung der murinen KDA-B5-Sequenz.
Zwei Peptidsequenzen wurden von der Aminosäuresequenz des Aktivinrezeptors in der als die Kinasedomäne des Moleküls beschriebenen Region abgeleitet (Mathews et al., Cell, 65:973–982 (1991)). Diese bestimmten Sequenzen wurden auf Basis eines Vergleichs zwischen der Aminosäuresequenz des Daf-1-Genprodukts und des Aktivinrezeptors ausgewählt und von ihnen wird vorausgesagt, dass sie in anderen Serin-/Threoninkinaserezeptormolekülen konserviert sind. Die zwei ausgewählten Peptidsequenzen waren:

1. Asn-Glu-Tyr-Val-Ala-Val-Lys
2. His-Arg-Asp-Ile-Lys-Ser

Der folgende Oligonukleotidprimer wurde auf Basis der Aminosäuresequenz Nr. 1 entworfen und auf einem DNA-Syntheseautomat synthetisiert.
Die ersten 8 Nukleotide dieses Primers (unterstrichen) umfassen eine Erkennungssequenz für die Restriktionsendonuklease BamHI, um anschließende Manipulationen amplifizierter DNA-Produkte zu erleichtern, und sind nicht von der Aminosäuresequenz Nr. 1 abgeleitet.
Die folgenden Oligonukleotidprimer wurden auf Basis der Aminosäuresequenz Nr. 2 entworfen und auf einem DNA-Syntheseautomat synthetisiert.
Die ersten 9 Nukleotide der Primer B bis E (unterstrichen) umfassen eine Erkennungssequenz für die Restriktionsendonuklease XbaI, um anschließende Manipulationen amplifizierter DNA-Produkte zu erleichtern, und sind nicht von der Aminosäuresequenz Nr. 2 abgeleitet.
Die Standardnukleotidsymbole in den oben identifizierten Primer sind wie folgt: A = Adenosin, C = Cytosin, G = Guanin, T = Thymin, R = Adenosin oder Guanin, Y = Cytosin oder Thymin und D = Guanin, Adenosin oder Thymin.
Diese Oligonukleotide wurden hinsichtlich ihrer vorhergesagten Fähigkeit, Serin-/Threoninkinasedomaflen kodierende Sequenzen, die den in der Aktivinrezeptorsequenz vorgefundenen ähnlich sind, spezifisch zu amplifizieren, ausgewählt. Da Aktivin und die BMP-Moleküle Mitglieder der großen TGF-β-Superfamilie von Wachstums- und Differenzierungsfaktoren sind, prognostizieren wir, dass deren entsprechende Rezeptoren im Hinblick auf Struktur und primäre Aminosäuresequenz auch miteinander verwandt sein können. Die TGF-β-Typ-II-Rezeptorsequenz (Lin et al., Cell, 68:775–785 (1992)) deutet darauf hin, dass sie wie der Aktivinrezeptor auch eine Serin-/Threoninkinase ist. Auf Basis der oben beschriebenen Beziehungen prognostizierten wir, dass diese degenerierten Oligonukleotide Sequenzen, die Fragmente anderer Serin-/Threoninkinaserezeptormoleküle, einschließlich Aktivinrezeptoren, TGF-β-Rezeptoren und BMP-Rezeptoren, kodieren, spezifisch amplifizieren werden.
Die auf BMP-2 reagierende Mauszeillinie W-20-17 wurde als eine Quelle von mRNA ausgewählt, von der wir vorhersagen würden, dass sie Moleküle enthält, die BMP-Rezeptoren kodieren können. Die gesamte RNA wurde unter Anwendung von Fachmännern bekannten etablierten Vorgehensweisen aus W-20-17-Zellen extrahiert und mRNA wurde anschließend mittels Oligo-(dT)-Cellulose-Chromatographie ausgewählt. 10 ng der W-20-17-mRNA wurden als eine Matrize genutzt, um eine Erststrang-cDNA in einem Reaktionsgemisch (20 μl Gesamtvolumen), das 1 mM jedes Desoxynukleotidtriphosphats (dATP, dGTP, dCTP, dTTP), 10 mM Tris-HCl (pH 8,3), 50 mM KCl, 5 mM MgCl₂, 1 E/μl RNase-Inhibitor, 2,5 E/μl Umkehrtranskriptase, 2,5 μM statistische Hexamere und 20 ng der oben beschriebenen W-20-17-mRNA enthält, zu synthetisieren. Dieses Reaktionsgemisch wurde 10 Minuten bei Raumtemperatur, gefolgt von 15 Minuten bei 42°C und dann 5 Minuten bei 99°C inkubiert. Das fertige Erststrang-cDNA-Reaktionsgemisch wurde dann bei 4°C gelagert.
Oligonukleotidkombinationen, die aus Oligonukleotidprimer A, gepaart mit entweder Oligonukleotidprimer B, C, D oder E bestanden, wurden als Primer genutzt, um die Amplifikation spezifischer Nukleotidsequenzen aus der oben beschriebenen Erststrang-W-20-17-cDNA-Matrize zu ermöglichen. Die Amplifikationsreaktion wurde durchgeführt, indem das oben beschriebene Erststrang-cDNA-Reaktionsgemisch (20 μl) auf ein Volumen von 100 μl eingestellt wurde, um die Bestandteile des Reaktionspuffers auf die folgenden Endkonzentrationen zu bringen: 2 mM MgCl₂, 10 mM Tris-HCl (pH 8,3), 50 mM KCl, 2,5 E/100 μl Taq-DNA-Polymerase, 1 pM/μl Oligonukleotidprimer A und 1 pM/μl von entweder Oligonukleotidprimer B, C, D oder E. Das gesamte Reaktionsgemisch wurde dann zwei Minuten bei 95°C inkubiert und dann in der folgenden Art und Weise thermischer Zyklisierung unterzogen: 1 Minute bei 95°C, 1 Minute bei 40°C und 1 Minute bei 72°C für vierzig Zyklen; gefolgt von einer 7 Minuten währenden Inkubation bei 72°C, wonach das fertige Reaktionsgemisch bei 4°C gelagert wurde.
Die DNA, die mittels dieser Reaktion spezifisch amplifiziert wurde, wurde mit Ethanol präzipitiert, mit den Restriktionsendonukleasen BamHI und XbaI verdaut und einer Agarose-Gelelektrophorese unterzogen. Regionen des Gels, in denen DNA-Banden offensichtlich waren, wurden exzisiert und die darin enthaltene DNA wurde mit einem QIAEX-Gelextraktionskit (Qiagen, Katalognr.: 20020) gemäß den vom Hersteller bereitgestellten Anweisungen eluiert. Die mit Gel extrahierten DNA-Fragmente wurden in den Plasmidvektor pGEM-3 zwischen den BamHI- und XbaI-Stellen des Polylinkers subkloniert. Eine DNA-Sequenzanalyse eines der resultierende Subklone, der mit KDA-B5 bezeichnet wurde, zeigte, dass das spezifisch amplifizierte DNA-Sequenz-Insert eine Aminosäuresequenz kodiert, die zu der entsprechenden Region des Aktivinrezeptors und der Daf-1-Genprodukt-Kinasedomänen in der Region dazwischen, in der die Oligonukleotidprimer A, B, C, D und E entworfen wurden (wie am Anfang dieses Abschnitts beschrieben) homolog ist. Die Aminosäuresequenz, die von dieser Region der spezifisch amplifizierten KDA-B5-Sequenz kodiert wird, ist zu 41% und 47% mit den entsprechenden Regionen des Aktivinrezeptors bzw. der Daf-1-Genprodukt-Kinasedomänen identisch.
Die DNA-Sequenz und die abgeleitete Aminosäuresequenz des spezifisch amplifizierten KDA-B5-DNA-Fragments sind in SEQ ID NO: 11 bzw. SEQ ID NO: 12 aufgeführt.
Die Nukleotide 1–24 der in SEQ ID NO: 11 aufgeführten Sequenz umfassen einen Abschnitt des Oligonukleotidprimers A und die Nukleotide 319–341 umfassen einen Abschnitt des reversen Komplements des Oligonukleotidprimers B, der zum Durchführen der spezifischen Amplifikationsreaktion genutzt wird. Aufgrund der Funktion der Oligonukleotide A und B beim Initiieren der Amplifikationsreaktion können sie nicht genau der tatsächlichen Sequenz, die das Maus-KDA-B5-Protein kodiert, entsprechen und werden daher nicht in der obigen Aminosäureableitung translatiert.
Beispiel II. Isolierung von W101- und W120-Klonen aus einer W-20-17-cDNA-Bibliothek.
Die in SEQ ID NO: 11 aufgeführte 341 bp lange Sequenz des KDA-B5-Inserts wurde als eine Sonde zum Screenen einer W-20-17-cDNA-Bibliothek unter Bedingungen verringerter Stringenz (4× SSC, 0,1% SDS bei 60°C) in einem Versuch, andere Maus-Sequenzen, die mit KDA-B5 verwandt sind, in der folgenden Art und Weise zu isolieren, genutzt.
1.000.000 Rekombinanten einer W-20-17-cDNA-Bibliothek (Thies et al., Endocrinology, 130:1318–1324 (1992)), die in dem Vektor λZAPII konstruiert wurde, wurden in einer Dichte von 20.000 rekombinanten Bakteriophagen-Plaques pro Platte auf 100 Platten plattiert. Duplikat-Nitrocellulose-Repliken der Platten wurden hergestellt. Ein DNA-Fragment, das der in SEQ ID NO: 11 aufgeführten 341 bp langen Sequenz des in KDA-65-Inserts entsprach, wurde mittels der Oligolabelling-Methode von Feinberg et al., Anal. Biochem., 132:6–13 (1983), mit ³²P markiert und an einen Satz von Filtern in Standard-Hybridisierungspuffer (SHB: 5× SSC, 0,1% SDS, 5× Denhardt-Lösung, 100 μg/ml Lachssperma-DNA) 2 Tage bei 60°C hybridisiert. Der andere Satz von Filtern wurde an eine DNA-Sonde, die den Nukleotiden Nr. 710 bis 1044 der veröffentlichten Sequenz des Aktivinrezeptors (Mathews et al., Cell, 65:973–982 (1991)) entsprach, unter denselben Bedingungen wie für den ersten Satz beschrieben hybridisiert. Diese Region der Aktivinrezeptorkinasedomäne entspricht der DNA-Sequenz des KDA-B5-Inserts. Die Filter wurden unter Bedingungen verringerter Stringenz (4× SSC, 0,1% SDS bei 60°C) gewaschen. 13 positiv hybridisierende rekombinante Bakteriophagen-Plaques wurden ausgewählt und für Zweitversuche erneut plattiert. Es wurden Duplikat-Nitrocellulose-Repliken der rekombinanten Plaques von diesen Platten hergestellt. Wiederum wurde ein Satz von Filtern an die KDA-B5-Sonde und der andere Satz an die Aktivinrezeptorsone hybridisiert, wie oben im primären Screening beschrieben (2 Tage bei 60°C in SHB). Beide Sätze von Filtern wurden unter den oben beschriebenen Bedingungen verringerter Stringenz (4× SSC, 0,1% SDS bei 60°C) gewaschen. Zwei Rekombinanten, die stakr an die KDA-B5-Sonde, jedoch nicht an die entsprechende Aktivinrezeptorsonde hybridisierten, wurden zur weiteren Analyse ausgewählt. Diese zwei cDNA-Klone, als W-101 und W-120 bezeichnet, wurden von Plaques gereinigt und ihre Inserts wurden auf das Plasmid Bluescript SK (+/–) gemäß dem vom Hersteller (Stratagene) beschriebenen In-vivo-Exzisionsprotokoll überführt. Eine DNA-Sequenzanalyse dieser Rekombinanten zeigte, dass sie Proteine kodieren, die zu dem Aktivinrezeptor und dem Daf-1-Genprodukt homolog sind. Die DNA-Sequenz und die abgeleitete Aminosäuresequenz eines Abschnitts von pMT101 (ATCC 69379) sind in SEQ ID NO: 7 bzw. SEQ ID NO: 8 aufgeführt.
Die Nukleotidsequenz des Klons W-101 deutet darauf hin, dass sie ein partielles Polypeptid von 467 Aminosäuren kodiert, das den carboxyterminalen Abschnitt des murinen Rezeptormoleküls W-101 umfasst. Eine mittels Oligolabelling bearbeitete cDNA-Bibliothek wurde unter Verwendung eines statistischen Hexamers, pd(N)₆ (Pharmacia/LKB, Katalognr. 27-2166-01) aus W-20-17-mRNA hergestellt, um eine Synthese von Erststrang-cDNA aus der W-20-17-mRNA-Matrize zu primen. Die Bibliothek wurde mit einem Oligonukleotid aus 30 Basen gescreent, das den Nukleotiden Nr. 245 bis 274 von SEQ ID NO: 7 entsprach. Die zum Entwerfen dieser Oligonukleotidsonde genutzte DNA-Sequenz wurde von der kodierenden Sequenz des Klons W-101 abgeleitet. Die Hybridisierung wurde in SHB bei 65°C durchgeführt und stringente Waschbedingungen von 0,2× SSC, 0,1% SDS bei 65°C wurden zum Entfernen unspezifisch gebundener Sonde eingesetzt. Das DNA-Insert eines dieser Klone, WR9, wurde mittels DNA-Sequenzanalyse charakterisiert und es wurde davon bestimmt, dass es zusätzliche 5'-kodierende Sequenzen des murinen W-101-Rezeptors enthält, die in dem oben beschriebenen ursprünglichen cDNA-Klon nicht vorliegen. Dem 0,7 kb langen insert des W9-Klons fehlen jedoch Sequenzen, die die C-terminale Region des murinen W-101-Rezeptorproteins kodieren. Um eine cDNA-Sequenz zu konstruieren, die das komplette W-101-Rezeptorprotein kodieren würde, wurden DNA-Sequenzen aus sowohl dem ursprünglichen Oligo (dT) als auch dem mittels Oligolabelling bearbeiteten Klon W9 an einer gemeinsamen BstEII-Restriktionsendonukleasestelle verbunden. Die in SEQ ID NO: 7 aufgeführte Sequenz enthält ein offenes Leseraster von 1515 Basenpaaren, das das komplette murine W-101-Rezeptorprotein aus 505 Aminosäuren kodiert. Die Nukleotide 1–660 der in SEQ ID NO: 7 aufgeführten Sequenz sind vom W9-cDNA-Klon abgeleitet, während die verbleibende Sequenz (Nukleotide 661–1648) von dem mit Oligo (dT) geprimten cDNA-Klon W-101 abgeleitet ist. Die BstEII-Restriktionsendonukleasenerkennungssequenz GGTNACC (die sich an Position 660–666 befindet) erleichterte die Konstruktion dieser chimären cDNA-Sequenz. Diese Konstruktion wurde durch Verdauen des Klons W-101 und des Klons W9 mit der Restriktionsendonuklease BstEII erzielt, was in der Linearisierung jedes Plasmids an der gemeinsamen BstEII-Stelle ihrer jeweiligen Inserts resultierte. Die zwei linearisierten Plasmide wurden mit Gel isoliert, dann an dieser Stelle zusammen ligiert und mit der Restriktionsendonuklease SaII verdaut, um die in SEQ ID NO: 7 aufgeführte Sequenz von den Plasmidvektorsequenzen (pBluescript) zu trennen. Die DNA-Fragmente, die aus dieser Sequenzligation und dem SaII-Verdau resultierten, wurden auf einem Agarosegel mittels Elektrophorese verarbeitet. Eine Region, die ein DNA-Fragment von ungefähr 2,3 kb enthielt, das 660 bp des 5'-Endes der W9-cDNA und ungefähr 1,64 kb des 3'-Endes der ursprünglichen W-101-cDNA umfasste, wurde von dem Gel exzisiert und die darin enthaltene DNA wurde mit einem QIAEX-Gelextraktionskit (Qiagen, Katalognr.: 20020) gemäß den vom Hersteller bereitgestellten Anweisungen eluiert. Das resultierende DNA-Fragment, das die in SEQ ID NO: 7 aufgeführte Sequenz (die das komplette murine W-101-Rezeptorprotein kodiert) umfasst, wurde in den Säugetier-Zellexpressionsvektor pMT3 an der SaII-Stelle der Polylinkerregion subkloniert. Dieses Plasmid wird mit pMT101 bezeichnet.
Die Nukleotidsequenz eines Abschnitts des Inserts des cDNA-Klons W-120 ist in SEQ ID NO: 9 aufgeführt. Der vermuteten, den Initiator Methionin kodierenden Sequenz gehen 68 bp 5'-untranslatierter Sequenz voraus und sie kodiert ein offenes Leseraster von 1509 bp, das das komplette murine W-120- Rezeptorprotein aus 503 Aminosäuren kodiert. Dem Stoppcodon folgen mindestens 203 bp 3'-untranslatierter Sequenz. Das Insert des Klons W-120, das die in SEQ ID NO: 9 aufgeführte Sequenz umfasst, wird von dem pBluescript-Plasmid mit der Restriktionsendonuklease EcoRI exzisiert und an den Säugetierzellenexpressionsvektor pMT3 an der EcoRI-Stelle der Polylinkerregion überführt. Dieses Plasmid wird als pMT120E bezeichnet und wurde bei der American Type Culture Collection hinterlegt (ATCC Nr. 69377).
Beispiel III. Isolierung von CFK1-10a, CFK1-23a und CFK1-43a aus einer CFK1-cDNA-Bibliothek.
Eine andere auf BMP-2 reagierende Zelllinie, CFK1 [Bernier und Goltzman, J. Cell. Physiol., 152:317 (1992)] wurde als eine Quelle von mRNA ausgewählt, von der vorhersagt werden würde, dass sie Moleküle, die BMP-Rezeptoren kodieren können, und zusätzliche Serin-/Threoninkinase kodierende Sequenzen, die mit dem TGF-β-Rezeptor, dem Aktivinrezeptor, daf-1, W-101 und W-120 verwandt ist, enthält.
1 × 10⁶ Rekombinanten einer CFK1-cDNA-Bibliothek, die in dem Vektor λZAPII konstruiert wurde, wurden in einer Dichte von 20.000 rekombinanten Bakteriophagen-Plaques pro Platte auf 50 Platten plattiert. Duplikat-Nitrocellulose-Repliken der Platten wurden hergestellt. Ein DNA-Fragment des W-101-cDNA-Inserts aus 645 Basenpaaren, das den Nukleotiden Nr. 828–Nr. 1472 von SEQ ID NO: 7 entspricht, wurde mittels der Oligolabelling-Methode von Feinberg et al., Anal. Biochem., 132:6–13 (1983), mit ³²P markiert und an beide Sätze von Filtern in SHB zwei Tage bei 60°C hybridisiert. Die Filter wurden unter Bedingungen verringerter Stringenz (4× SSC, 0,1% SDS bei 60°C) gewaschen. Viele Duplikate hybridisierende Rekombinanten mit verschiedenen Intensitäten (ungefähr 200) wurden bemerkt. 27 Bakteriophagen-Plaques, die für den weiten Hybridisierungsintensitätsbereich repräsentativ waren, wurden von Plaques gereinigt und ihre Inserts wurden auf das Plasmid Bluescript SK (+/–) gemäß dem vom Hersteller (Stratagene) beschriebenen In- vivo-Exzisionsprotokoll überführt. Eine DNA-Sequenzanalyse von mehreren Rekombinanten zeigte, dass sie Proteine kodieren, die zu dem Aktivinrezeptor, Daf-1 und anderen Rezeptorproteinen der Serin-/Threoninkinaserezeptor-Familie homolog sind.
Die Nukleotidsequenz des Klons CFK1-10a umfasst ein offenes Leseraster von 1527 bp, das ein CFK1-10a-Rezeptorprotein aus 509 Aminosäuren kodiert. Von dem kodierten CFK1-10a-Rezeptorprotein aus 509 Aminosäuren wird in Erwägung gezogen, dass es das primäre Translationsprodukt ist, da der kodierenden Sequenz 458 bp 5'-untranslatierter Sequenz mit Stoppcodons in allen drei Leserastern vorausgehen. Die DNA und die abgeleitete Aminosäuresequenz des Großteils des Inserts von CFK1-10a (ATCC Nr. 69380) ist in SEQ ID NO: 5 aufgeführt.
Auf Grundlage der Kenntnis anderer Serin-/Threoninkinaserezeptorproteine weist das kodierte CFK1-10a aus 509 Aminosäuren die charakteristischen Merkmale von Serin-/Threoninkinaserezeptoren auf, insbesondere jener, die Liganden der TGF-β/BMP-Superfamilie von Wachstums- und Differenzierungsfaktoren erkennen können. Dieses Molekül kodiert ein vollständiges Rezeptormolekül mit einer charakteristischen hydrophoben Leader-Sequenz, die die Ligandenbindungsdomäne des Proteins zum extrazellulären Raum richtet, einer Transmembranregion, die das komplette Rezeptormolekül in der Zellmembran verankert, was das Positionieren der Serin-/Threoninkinasedomäne in dem intrazellulären Raum ermöglicht. Die Ligandenbindungsdomäne des CFK1-10a-Rezeptormoleküls der Erfindung zeigt ein Muster von Cystein-Konservierung auf, die bei anderen Rezeptoren bemerkt wird, die Liganden der TGF-β/BMP-Superfamilie von Wachstums- und Differenzierungsfaktoren erkennen können. Die Region des CFK1-10a-Rezeptorproteins, das der intrazellulären Serin-/Threoninkinasedomäne entspricht, zeigt einen beträchtlichen Grad an Aminosäuresequenzidentität zu der entsprechenden Domäne anderer Rezeptoren dieser Familie auf, wie folgt: TGF-β-Typ-II-Rezeptor (Genbank-Zugriffsnr. M85079): 35%; Aktivin-Typ-II-Rezeptor (Genbank-Zugriffsnr. M65287): 40%; Aktivin-Typ-IIB-Rezeptor (Genbank-Zugriffsnr. M84120): 38% und Daf-1 (Genbank-Zugriffsnr. A35103): 39%. Das 3,2 kb lange Insert des CFK1-10a-cDNA-Klons wird mit der Restriktionsendonuklease NotI exzisiert und an den Säugetierzellenexpressionsvektor pMV2 an der NotI-Stelle des Polylinkers überführt. Dieses Plasmid wird als CFK1-10a/Not-4 bezeichnet.
Der CFK1-10a-Rezeptor der vorliegenden Erfindung ist zu einer menschlichen Serin-/Threoninkinaserezeptor-mRNA homolog, die in die Genbank eingegeben wurde, Zugriffsnummer L02911, für die kein Ligand identifiziert wurde. Dieses Rezeptorprotein ist auch zu dem gemeldeten murinen Typ-I-TGF-β-Rezeptor homolog, Ebner et al., Science, 260:1344–1348 (1993) (Genbank-Zugriffsnr. L15436).
Die Nukleotidsequenz des Klons CFK1-23a (ATCC Nr. 69378) umfasst ein offenes Leseraster von 1596 bp, das ein CFK1-23a-Rezeptorprotein aus 532 Aminosäuren kodiert. Von dem kodierten CFK1-23a-Rezeptorprotein aus 532 Aminosäuren wird in Erwägung gezogen, dass es das primäre Translationsprodukt ist. Der kodierenden Sequenz gehen 60 bp 5'-untranslatierter Sequenz voraus. Die DNA und die abgeleitete Aminosäuresequenz des Großteils des Inserts von CFK1-23a ist in SEQ ID NO: 1 aufgeführt.
Auf Grundlage der Kenntnis anderer Serin-/Threoninkinaserezeptorproteine weist das kodierte CFK1-23a aus 532 Aminosäuren die charakteristischen Merkmale von Serin-/Threoninkinaserezeptoren auf, insbesondere jener, die Liganden der TGF-β/BMP-Superfamilie von Wachstums- und Differenzierungsfaktoren erkennen können. Die Region des CFK1-23a-Rezeptorproteins, das der intrazellulären Serin-/Threoninkinasedomäne entspricht, zeigt einen beträchtlichen Grad an Aminosäuresequenzidentität zu der entsprechenden Domäne anderer Rezeptoren dieser Familie auf, wie folgt: TGF-β-Typ-II-Rezeptor (Genbank-Zugriffsnr. M85079): 35%; Aktivin-Typ-II-Rezeptor (Genbank-Zugriffsnr. M65287): 41%; Aktivin-Typ-IIB-Rezeptor (Genbank-Zugriffsnr. M84120): 39% und Daf-1 (Genbank-Zugriffsnr. A35103): 39%. Das 2,8 kb lange Insert des CFK1-23a-cDNA-Klons wird mit der Restriktionsendonuklease EcoRI exzisiert und an den Säugetierzellenexpressionsvektor pMV2 an der EcoRI-Stelle des Polylinkers überführt. Dieses Plasmid wird als pMV23a bezeichnet.
Die Nukleotidsequenz des Klons CFK1-43a umfasst ein offenes Leseraster von 1506 bp, das ein CFK1-43a-Rezeptorprotein aus 502 Aminosäuren kodiert. Von dem kodierten CFK1-43a-Rezeptorprotein aus 502 Aminosäuren wird in Erwägung gezogen, dass es das primäre Translationsprodukt ist, da der kodierenden Sequenz 239 bp 5'-untranslatierter Sequenz mit Stoppcodons in allen drei Leserastern vorausgehen. Die DNA und die abgeleitete Aminosäuresequenz des Inserts von CFK1-43a (ATCC Nr. 69381) ist in SEQ ID NO: 3 aufgeführt.
Auf Grundlage der Kenntnis anderer Serin-/Threoninkinaserezeptorproteine weist das kodierte CFK1-43a aus 502 Aminosäuren die charakteristischen Merkmale von Serin-/Threoninkinaserezeptoren auf, insbesondere jener, die Liganden der TGF-β/BMP-Superfamilie von Wachstums- und Differenzierungsfaktoren erkennen können. Die Region des CFK1-43a-Rezeptorproteins, das der intrazellulären Serin-/Threoninkinasedomäne entspricht, zeigt einen beträchtlichen Grad an Aminosäuresequenzidentität zu der entsprechenden Domäne anderer Rezeptoren dieser Familie auf, wie folgt: TGF-β-Typ-II-Rezeptor (Genbank-Zugriffsnr. M85079): 35%; Aktivin-Typ-II-Rezeptor (Genbank-Zugriffsnr. M65287): 41%; Aktivin-Typ-IIB-Rezeptor (Genbank-Zugriffsnr. M84120): 40% und Daf-1 (Genbank-Zugriffsnr. A35103): 38%. Das 2,1 kb lange Insert des CFK1-43a-cDNA-Klons wird mit der Restriktionsendonuklease EcoRI exzisiert und an den Säugetierzellenexpressionsvektor pMV2 an der EcoRI-Stelle des Polylinkers überführt. Dieses Plasmid wird als pMV43a bezeichnet.
Der CFK1-43a-Rezeptor der Erfindung ist zu einer Huhn-Serin-/Threoninkinaserezeptor-mRNA homolog, die in die Genbank eingegeben wurde, Zugriffsnummer D 13432, für die kein Ligand identifiziert wurde.
Beispiel IV. Screenen auf menschliche BMP-Rezeptoren.
Von Maus- und/oder Ratten-BMP-Rezeptorgenen wird angenommen, dass sie signifikant homolog sind. Folglich können die kodierenden Sequenzen von Maus-W-101 oder -W-120 oder Abschnitte davon zum Screenen einer menschlichen genomischen oder menschlichen cDNA-Bibliothek oder als Sonden zum Identifizieren einer menschlichen Zelllinie oder eines menschlichen Gewebes, die bzw. das die analogen menschlichen BMP-Rezeptorproteine synthetisiert, verwendet werden. In einer ähnlichen Weise können die kodierenden Sequenzen von Ratten-CFK1-10a, -CFK1-23a oder – CFK1-43a oder Abschnitte davon zum Screenen menschlicher Bibliotheken oder als Sonden zum Identifizieren einer menschlichen Zelllinie oder eines menschlichen Gewebes, die bzw. das die analogen menschlichen BMP-Rezeptorproteine synthetisiert, verwendet werden. Eine menschliche genomische Bibliothek kann mit solchen Sonden gescreent und vermutlich positiv hybridisierende rekombinante Klone isoliert und eine DNA-Sequenz erhalten werden. Belege, dass solche Rekombinanten Abschnitte der entsprechenden menschlichen BMP-Rezeptorproteine kodieren, basieren auf den Homologien von muriner oder Ratten-DNA, murinem oder Ratten-Protein und muriner und Ratten-Genstruktur zu menschlicher DNA, menschlichen Protein und menschlicher Genstruktur.
Sobald ein rekombinanter Bakteriophage oder ein rekombinantes Plasmid, der bzw. das DNA enthält, die einen Abschnitt eines menschlichen BMP-Rezeptormoleküls kodiert, erhalten wurde, kann die menschliche kodierende Sequenz zum Identifizieren einer menschlichen Zelllinie oder eines menschlichen Gewebes, die bzw. das die entsprechende menschliche BMP-Rezeptor-mRNA synthetisiert, verwendet werden. Alternativ kann die Maus- oder Ratten-BMP-Rezeptor kodierende Sequenz kann als eine Sonde zum Identifizieren einer solchen menschlichen Zelllinie oder eines solchen menschlichen Gewebes genutzt werden. Kurz gesagt, RNA wird aus einer ausgewählten Zell- oder Gewebequelle extrahiert und entweder mittels Elektrophorese auf einem Formaldehyd-Agarosegel verarbeitet und an Nitrocellulose überführt oder mit Formaldehyd umgesetzt und direkt auf Nitrocellulose gesprenkelt. Die Nitrocellulose wird dann an eine Sonde hybridisiert, die von einer kodierenden Sequenz von dem Maus-, Ratten- oder menschlichem BMP-Rezeptor abgeleitet ist. Alternativ wird die kodierende Sequenz des Maus- oder Ratten-BMP-Rezeptors zum Entwerfen von Oligonukleotidprimern verwendet, die einen Abschnitt der kodierenden Sequenz des BMP-Rezeptors spezifisch amplifizieren wird, der sich in der Region zwischen den Primern befindet, die zum Durchführen der spezifischen Amplifikationsreaktion genutzt werden. Es wird in Erwägung gezogen, dass kodierende Sequenzen des Maus-, Ratten- und menschlichem BMP-Rezeptors ausreichend homolog wäre, um ein spezifisches Amplifizieren kodierender Sequenzen des menschlichen BMP-Rezeptors aus mRNA-, cDNA- oder genomischen DNA-Matrizen zu ermöglichen. Sobald eine positive Quelle mittels eines dieser oben beschriebenen Verfahrens identifiziert wurde, wird mRNA mittels Oligo-(dT)-Cellulose-Chromatographie ausgewählt und cDNA wird synthetisiert und mittels etablierter Techniken in einen geeigneten Vektor (d. h. λgt10, λZAPII oder andere Fachmännern bekannte Vektoren) kloniert. Es ist auch möglich, die Oligonukleotidprimer-gerichtete Amplifikationsreaktion, oben beschrieben, direkt an einer zuvor hergestellten menschlichen cDNA- oder genomischen Bibliothek durchzuführen, die in einen λ-Bakteriophagen- oder Plasmidvektor kloniert wurde. In solchen Fällen könnte eine Bibliothek, die ein spezifisch amplifiziertes DNA-Produkt ergibt, das einen Abschnitt des menschlichen BMP-Rezeptorproteins kodiert, direkt unter Verwendung des Fragments von amplifizierter, BMP-Rezeptor kodierender DNA als einer Sonde gescreent werden.
Beispiel V. Expression von BMP-Rezeptoren.
Um BMP-Rezeptorproteine der Maus, der Ratte, des Menschen oder eines anderen Säugetiers zu produzieren, wird die DNA, die diese kodiert, in einen adäquaten Expressionsvektor (wie oben für W-101, W-120, CFK1-10a, CFK1-23a und CFK1-43a) überführt und mittels herkömmlicher Gentechniken in Säugetierzellen oder andere bevorzugte eukaryontische oder prokaryontische Wirte eingeführt. Die DNA-Sequenzen, die BMP-Rezeptorprotein kodieren, können in einen für eine bestimmte Wirtszelle geeigneten Vektor eingeführt werden, wie oben beschrieben. Als bevorzugtes Expressionssystem für rekombinantes menschliches BMP-Rezeptorprotein werden stabil transformierte Säugetierzellen betrachtet.
A. COS-Zellen-Expression
Als ein spezifisches Beispiel des Exprimierens eines Serin-/Threoninkinaserezeptorproteins der Erfindung wird das Insert von CFK1-23a (das die vollständige BMP-Rezeptor-cDNA für CFK1-23a enthält) aus den Vektorarmen mittels Verdau mit EcoRI gelöst und in die EcoRI-Stelle des Säugetier-Expressionsvektors, pMV2, einem Derivat von pMT2, subkloniert, das bei der ATCC unter der Zugriffsnummer ATCC 61722 hinterlegt wurde, obwohl andere Derivate davon, wie pMT3, ebenfalls geeignet sein können. Plasmid-DNA aus diesem Subklon wird mittels der DEAE-Dextran-Vorgehensweise [Sompayrac und Danna, PNAS 78:7575–7578 (1981); Luthman und Magnusson, Nucl. Acids Res. 11: 1295–1308 (1983)] in COS-Zellen transfiziert und die Zellen werden kultiviert. Serumfreies, 24 h konditioniertes Medium wird aus den Zellen 40–70 h nach der Transfektion gesammelt.
B. CHO-Zellen-Expression
(1) Serin-/Threoninkinaserezeptor-Expression in CHO-Zellen
Um hohe Niveaus von Serin-/Threoninkinaserezeptorprotein-Expression zu erzielen, wird jede der DNA-Sequenzen von SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7 oder SEQ ID NO: 9 in einen eukaryontischen Expressionsvektor, d. h. pMV2 oder pMT3, inseriert, stabil in CHO-Zellen eingeführt und mittels Methotrexat-Auswahl von DFHR [Kaufman et al., EMBO J. 6:189 (1987)] auf eine hohe Kopienanzahl amplifiziert. Die transformierten Zellen werden kultiviert und die exprimierten Rezeptorproteine bleiben mit der Zellmembran der transformierten Zelle verbunden. Rekombinante Rezeptorproteine der vorliegenden Erfindung können aus der transformierten Zellmembran dissoziiert werden und werden dann gewonnen und von anderen vorliegenden Kontaminanten gereinigt.
Ein Serin-/Threoninkinaserezeptorprotein der Erfindung wird in CHO-Zellen durch Ablösen des Inserts des oben beschriebenen klonierten CHF1-43a mit EcoRI exprimiert. Das Insert wird in die EcoRI-Klonierungsstelle des Säugetier-Expressionsvektors, der oben beschriebene pMV2, subkloniert, obwohl Derivate davon, d. h. pMT3, ebenfalls geeignet sein können.
Verfahren zum Produzieren von heterologem Protein aus CHO-Zellen sind in der Technik bekannt und sind oben beschrieben, auf den Seiten 21 bis 26.
Beispiel VI. Bindungsassays zum Bestimmen der Affinität von klonierten Rezeptoren für verschiedene TGF-β/BMP-Superfamilie-Liganden.
Ein BMP-Rezeptor der Erfindung kann mit einem Protein definiert werden, das über die Fähigkeit verfügt, ein bestimmtes BMP mit einer höheren Bindungsaffinität als an TGF-β, Aktivin, Inhibin oder andere Mitglieder der TGF-β-Familie von Wachstums- und Differenzierungsfaktoren zu binden. Die BMP-Rezeptoren der vorliegenden Erfindung binden spezifisch an ein bestimmtes BMP, so dass ungefähr ein 100-facher Überschuss eines kompetitiven Liganden, wie TGF-β oder Aktivin, das BMP nicht signifikant verdrängen wird. Die spezifische Bindung von BMPs an einen bestimmten BMP-Rezeptor der Erfindung kann demonstriert werden, indem ein Expressionsplasmid, das DNA-Sequenzen enthält, die das bestimmte BMP-Rezeptorprotein von Interesse kodieren, in COS-Zellen transfiziert und die transiente Expression des BMP- Rezeptorproteins auf der Zelloberfläche zugelassen wird. Individuelle BMPs, heterodimere BMPs oder andere Proteine der TGF-β-Superfamilie werden an BMP-Rezeptor gebunden, der COS-Zellen exprimiert, und die Zellen werden auf ihre Fähigkeit analysiert, spezifisch an ein BMP-Molekül oder einen bestimmten Satz von BMP-Proteinen mit höherer Affinität als an TGF-β oder andere Mitglieder der TGF-β-Superfamilie zu binden. Solche Bindungsassays können in der folgenden Art und Weise durchgeführt werden:
COS-Zellen, die mit einem Expressionsvektor transfiziert worden waren, der die bestimmte BMP-Rezeptor kodierende Sequenz von Interesse enthielt (z. B. pMT101, pMT120, CFK1-10a/Not-4, pMV23a oder pMV43a), werden auf mit Gel versehenen 6-Well-Platten plattiert und 60 Minuten bei 37°C in Bindungspuffer (128 mM NaCl, 5 mM KCl, 5 mM MgSO₄, 1,2 mM CaCl₂, 50 mM HEPES und 5 mg/ml RSA, pH 7,5) vorinkubiert. Die vorinkubierten COS-Zellen werden gewaschen und 10 Minuten vor der Zugabe von BMP-4 und/oder [¹²⁵I]-BMP-4 in Bindungspuffer, der mit 10 mM KCN und 2 mM NaF supplementiert war, inkubiert. Die BMP-4-Bindung wird 60 Minuten bei 37°C äquilibrieren gelassen. Nach der Bindung werden die Zellen zweimal mit eiskaltem Bindungspuffer gewaschen und mit 1% Triton X-100, 10% Glycerin, 25 mM HEPES und 1 mg/ml RSA, pH 7,5, löslich gemacht, wie von Massague [Meth. Enzymol. 146: 174–195 (1987)] beschrieben. Die Radioaktivität wird dann in einem Gammazähler gezählt.
BEISPIEL VII. Produktion von verkürzten Rezeptorproteinen zur Produktion von verkürztem Protein.
Verkürzte Rezeptorproteine der Erfindung umfassen vorzugsweise die Ligandenbindungsdomäne, jedoch nicht die Transmembran- und Serin-/Threoninkinasedomänen der Rezeptorproteine. Solche verkürzten Rezeptorproteine können in Säugetierzellen in einer Art und Weise exprimiert werden, dass die verkürzten Rezeptorproteine in den Überstand sekretiert anstelle auf der Oberfläche der Wirtszelle exprimiert werden. DNA-Sequenzen, die die Ligandenbindungsdomäne jedes Rezeptorproteins der Erfindung kodieren, können aus DNA-Sequenzen, die die Transmembran- und Serin-/Threoninkinasedomänen jedes entsprechenden Rezeptorproteins der Erfindung kodieren, isoliert und in Vektoren inseriert werden, die die Produktion verkürzter Rezeptorproteine in Säugetierzellen ermöglichen. Alternativ können die DNA-Sequenzen, die die verkürzten Rezeptorproteine kodieren, isoliert und in geeignete Vektoren zur Expression in Bakterien-, Insekten-, Virus- und Hefezellen inseriert werden. Solche Vektoren sind Fachmännern bekannt und werden an anderer Stelle in dieser Anwendung beschrieben.
In einer bevorzugten Ausführungsform können DNA-Sequenzen, die die Nukleotide Nr. 61 bis Nr. 507 von SEQ ID NO: 1 umfassen, die die Aminosäuren Nr. 1 bis 149 des CFK1-23a-Rezeptorproteins der Erfindung (SEQ ID NO: 2) kodieren, spezifisch amplifiziert werden und die resultierende DNA-Sequenz kann in einen Standard-Säugetierzellenexpressionsvektor (d. h. pMV2 oder pMT3) inseriert werden. Diese spezifische Amplifikation kann in der folgenden Art und Weise durchgeführt werden:
Oligonukleotidprimer, die die Nukleotidsequenzen Nr. 1 bis Nr. 20 von SEQ ID NO: 1 umfassen, und ein separater Primer, der den komplementären Strang der Nukleotidsequenz Nr. 488 bis 507 von SEQ ID NO: 1 umfasst, werden auf einem DNA-Syntheseautomat synthetisiert. Darüber hinaus könnten diese Oligonukleotide so entworfen werden, dass sie Erkennungsstellen von Restriktionsendonukleasen enthalten, die Fachmänner kennen (d. h. BamHI, EcoRI, XbaI usw.), um bei der Manipulation amplifizierter DNA-Produkte und der Erleichterung ihrer Insertion in Plasmidvektoren von Nutzen zu sein. Des Weiteren könnte der Primer, der die Nukleotide Nr. 488 bis 507 umfasst, auch anstelle der Nukleotide Nr. 583 bis 585 von SEQ ID NO: 1 eine Trinukleotidsequenz enthalten, die einem Translationsstoppcodon (d. h. TAA, TAG oder TGA) entspricht. Das Oligonukleotid, das die Nukleotide Nr. 488 bis 507 umfasst, würde auf der Basis des Antisense-Strangs (komplementären Strangs) dieser Region von SEQ ID NO: 1 entworfen werden und könnte in Kombination mit einem Oligonukleotid, das die Nukleotide Nr. 1 bis 20 des Sense-Strangs (kodierenden Strangs) von SEQ ID NO: 1 umfasst, zum spezifischen Amplifizieren eines DNA-Fragments, das die Nukleotide Nr. 1 bis Nr. 507 von SEQ ID NO: 1 umfasst, verwendet werden. Dieses DNA-Fragment wird ein verkürztes Rezeptorprotein der Erfindung kodieren. Das DNA-Fragment, das das verkürzte Rezeptorprotein der Erfindung kodiert, kann durch spezifisches Amplifizieren der Sequenz, die die Nukleotide Nr. 1 bis Nr. 507 von SEQ ID NO: 1 umfasst, durch die Verwendung eines Klons, der den kompletten Rezeptor der Erfindung kodiert, wie pMV23a, als einer Matrize produziert werden. Diese spezifische DNA-Amplifikationsreaktion kann wie folgt durchgeführt werden: Ungefähr 1 ng Matrizen-DNA, wie pMV23a, wird mit 100 pM eines Oligonukleotids, das die Nukleotide Nr. 1 bis 20 umfasst, und 100 pM eines Oligonukleotids, das den komplementären Strang der Nukleotide Nr. 488 bis 507 umfasst, in einem 100-μl-Reaktionsgemisch, das aus 10 mM Tris-HCl (pH 8,3), 50 mM KCl, 1,5 mM MgCl₂, 200 μM jedes Desoxynukleotidtriphosphats und 2,5 Einheiten Taq-DNA-Polymerase besteht, vereint. Das gesamte Reaktionsgemisch wurde dann zwei Minuten bei 95°C inkubiert und dann in der folgenden Art und Weise thermischer Zyklisierung unterzogen: 1 Minute bei 95°C, 1 Minute bei 40°C und 1 Minute bei 72°C für fünfundzwanzig bis vierzig Zyklen; gefolgt von einer 7 Minuten währenden Inkubation bei 72°C, wonach das fertige Reaktionsgemisch bei 4°C gelagert wurde.
Das DNA-Fragment, das mittels dieser Reaktion spezifisch amplifiziert wird, wird mit Ethanol präzipitiert, mit den adäquaten Restriktionsendonukleasen in den Fällen, in denen Restriktionsendonukleaseerkennungssequenzen den Oligonukleotiden zugesetzt wurden, die zum Primen der Synthese des amplifizierenden DNA-Fragments (oben beschrieben) genutzt wurden, verdaut und einer Agarose-Elektrophorese unterzogen. Eine Region des Gels, in der eine DNA-Bande der erwarteten Größe offensichtlich ist, wird exzisiert und in einen Plasmidvektor subkloniert. Alternativ könnte dieses spezifisch amplifizierte DNA-Fragment, das ein verkürztes Rezeptorprotein der Erfindung kodiert, direkt in einen Standard-Säugetierzellenexpressionsvektor, wie pMT3 oder anderen derartigen, Fachmännern bekannten Vektoren, subkloniert werden.
Ähnliche Manipulationen könnten wie oben durchgeführt werden, um andere verkürzte Rezeptorproteine der Erfindung zu isolieren und zu exprimieren.
Zum Beispiel können DNA-Sequenzen, die die Nukleotide Nr. 247 bis 618 von SEQ ID NO: 3 umfassen, die die Aminosäuren Nr. 1 bis 124 des CFK1-43a-BMP-Rezeptors der Erfindung (SEQ ID NO: 4) kodieren, spezifisch amplifiziert werden, um ein DNA-Fragment zu produzieren, das die Nukleotide Nr. 247 bis 618 von SEQ ID NO: 3 umfasst, die ein anderes verkürztes BMP-Rezeptorprotein kodiert. Diese Sequenzen werden die Ligandenbindungsdomäne des CFK1-43a-BMP-Rezeptors kodieren, jedoch nicht die Transmembran- und Serin-/Threoninkinasedomänen des entsprechenden Rezeptorproteins kodieren. Bei Insertion in einen adäquaten Expressionsvektor und Transfektion in die adäquate Wirtszelle wird dieses Konstrukt die Produktion eines verkürzten BMP-Rezeptorproteins ermöglichen, das in das Medium sekretiert anstelle auf der Oberfläche der Wirtszelle exprimiert wird. Diese spezifische Amplifikationsreaktion kann in einer zu der oben in Bezug auf das verkürzte CFK1-23a-BMP-Rezeptorprotein beschriebenen Art und Weise durchgeführt werden. In diesem Fall werden Oligonukleotide, die die Nukleotidsequenzen Nr. 247 bis 266 von SEQ ID NO: 3 umfassen, und ein separater Oligonukleotidprimer, der den komplementären Strang der Nukleotidsequenz Nr. 599 bis 618 von SEQ ID NO: 3 umfasst, zum spezifischen Amplifizieren eines DNA-Fragments, das die Nukleotide Nr. 247 bis 618 von SEQ ID NO: 3 umfasst, genutzt. Diese Oligonukleotide und eine Matrizen-DNA, das das entsprechende BMP-Rezeptorprotein der Erfindung kodiert, wie pMV43a, werden in dem zuvor beschriebenen spezifischen DNA-Amplifikationsreaktionsgemisch substituiert.
Darüber hinaus können andere Serin-/Threoninkinaserezeptoren der Erfindung, wie W-101, W-120 oder CFK1-10a, in einer verkürzten Form produziert werden. Die verkürzten Formen dieser Rezeptormoleküle können in Säugetierzellen in einer Art und Weise exprimiert werden, dass die entsprechenden verkürzten Proteine in das Kulturmedium sekretiert anstelle auf der Oberfläche der Wirtszelle exprimiert wird. Die Expression dieser löslichen Rezeptorproteine kann durch die Amplifikation von DNA-Fragmenten erzielt werden, die die Ligandenbindungsdomäne, jedoch nicht die Transmembran- und Serin-/Threoninkinasedomänen jedes jeweiligen, wie oben beschriebenen Serin-/Threoninkinaserezeptormoleküls für die verkürzten BMP-Rezeptorproteine kodiert.
Beispiel VIII. W-20-17-Bioassays
A. Beschreibung von W-20-17-Zellen
Die Verwendung der W-20-17-Knochenmarkstromazellen als einer Indikator-Zelllinie basiert auf der Umwandlung dieser Zellen in osteoblastenähnliche Zellen nach der Behandlung mit einem BMP-Protein [Thies et al., Journal of Bone and Mineral Research, 5:305 (1990); und Thies et al., Endocrinology, 130:1318 (1992)]. Insbesondere sind W-20-17-Zellen eine klonale Knochenmarkstromazelllinie, die von Forschern im Labor von Dr. D. Nathan, Children's Hospital, Boston, MA, USA, von adulten Mäusen abgeleitet wurde. Die Behandlung von W-20-17-Zellen mit bestimmten BMP-Proteinen resultiert in (1) einer gesteigerten Produktion alkalischer Phosphatase, (2) einer Induktion von mit PTH stimuliertem cAMP und (3) einer Induktion von Osteocalcin-Synthese durch die Zellen. Während (1) und (2) Eigenschaften darstellen, die mit dem Osteoblasten-Phänotyp assoziiert sind, ist die Fähigkeit, Osteocalcin zu synthetisieren, eine phänotypische Eigenschaft, die nur von reifen Osteoblasten aufgezeigt wird. Des Weiteren haben wir bis heute eine Umwandlung von W-20-17-Stromazellen in osteoblastenähnliche Zellen nur bei Behandlung mit BMPs beobachtet. In dieser Art und Weise korrelieren die von mit BMP behandelten W-20-17-Zellen aufgezeigten In-vitro-Aktivitäten mit der für BMPs bekannten In-vivo-Knochenbildungsaktivität.
Im Folgenden werden zwei In-vitro-Assays, die beim Vergleich von BMP-Aktivitäten von Formulierungen von BMPs mit der Aktivität bekannter BMPs von Nutzen sind, beschrieben.
B. Protokoll von Assay auf alkalische Phosphatase von W-20-17
W-20-17-Zellen werden in 96-Well-Gewebekulturplatten in einer Dichte von 10.000 Zellen pro Well in 200 μl Medium (DME mit 10% hitzeinaktiviertem fötalem Kälberserum, 2 mM Glutamin und 100 Einheiten/ml Penicillin + 100 μg/ml Streptomycin) plattiert. Die Zellen werden über Nacht in einem Inkubator mit 95% Luft, 5% CO₂ bei 37°C anheften gelassen.
Die 200 μl Medium werden aus jedem Well mit einem Multikanal-Pipettierer entfernt und durch ein gleiches Volumen einer Versuchsprobe, die in DME mit 10% hitzeinaktiviertem fötalem Kälberserum, 2 mM Glutamin und 1% Penicillin/Streptomycin abgegeben wurde, ersetzt. Die Versuchssubstanzen werden in dreifacher Ausfertigung geprüft.
Die Versuchsproben und Eichsubstanzen werden einen Zeitraum von 24 Stunden mit den W-20-17-Indikator-Zellen inkubieren gelassen. Nach den 24 Stunden werden die Platten aus dem 37-°C-Inkubator genommen und die Versuchsmedien werden aus den Zellen entfernt.
Die W-20-17-Zellschichten werden 3 Mal mit 200 μl pro Well kalzium-/magnesiumfreier phosphatgepufferter Kochsalzlösung gewaschen und diese Waschlösungen wurden verworfen.
50 μl glasdestilliertes Wasser werden jedem Well zugesetzt und die Assayplatten werden dann zur Schnellgefrierung in ein Trockeneis/Ethanol-Bad gegeben. Direkt nach dem Einfrieren werden die Assayplatten aus dem Trockeneis/Ethanol-Bad genommen und bei 37°C aufgetaut. Dieser Schritt wird 2 weitere Male für insgesamt 3 Gefrier-/Auftauvorgänge wiederholt. Direkt nach Abschluss des Vorgangs steht die membrangebundene alkalische Phosphatase zur Messung zur Verfügung.
50 μl Assaygemisch (50 mM Glycin, 0,05% Triton X-100, 4 mM MgCl₂, 5 mM p-Nitrophenolphosphat, pH = 10,3) werden jedem Assay-Well zugesetzt und die Assayplatten werden dann 30 Minuten bei 37°C in einem gerüttelten Wasserbad bei 60 Schwingungen pro Minute inkubiert.
Zum Ende der 30 Minuten währenden Inkubation wird die Reaktion angehalten, indem 100 μl 0,2 N NaOH jedem Well zugesetzt und die Assayplatten auf Eis gegeben werden.
Die spektrophotometrische Extinktion für jedes Well wird bei einer Wellenlänge von 405 Nanometer gemessen. Diese Werte werden dann mit bekanten Eichsubstanzen verglichen, um einen Schätzwert der Aktivität alkalischer Phosphatase in jeder Probe zu erhalten. Zum Beispiel werden unter Verwendung bekannter Mengen p-Nitrophenolphosphat Extinktionswerte erstellt. Dies ist in Tabelle 2 gezeigt.
Tabelle 2

Extinktionswerte für bekannte Mengen von BMPs können bestimmt und wie in Tabelle 3 gezeigt in μmol p-Nitrophenolphosphat, aufgeteilt pro Zeiteinheit, umgewandelt werden. Tabelle 3 Extinktionswerte für bekannte Eichsubstanzen für p-Nitrophenolphosphat

p-Nitrophenolphosphat in μmol	Durchschnittliche Extinktion (405 nm)
0,000	0
0,006	0,261 +/– 0,024
0,012	0,521 +/– 0,031
0,018	0,797 +/– 0,063
0,024	1,074 +/– 0,061
0,030	1,305 +/– 0,083

Werte alkalischer Phosphatase für W-20-Zellen Behandlung mit BMP-2

BMP-2-Konzentration		Extinktionsablesung		μmol Substrat
ng/ml		405 nmeter		pro Stunde
0		0,645		0,024
1,56		0,696		0,026
3,12		0,765		0,029
6,25		0,923		0,036
12,50	1,121		0,044
25,0		1,457		0,058
50,0		1,662		0,067
100,0	1,977		0,080

Diese Werte werden dann zum Vergleichen der Aktivitäten bekannter Mengen neuer BMP-Formulierungen mit bekannten aktiven BMP-Formulierungen verwendet.
C. Osteocalcin-RIA-Protokoll
W-20-17-Zellen werden zu 10⁶ Zellen pro Well in 24-Well-Multiwell-Gewebekulturschalen in 2 ml DME, das 10% hitzeinaktiviertes fötales Kälberserum, 2 mM Glutamin enthält, plattiert. Die Zellen werden über Nacht in einer Atmosphäre von 95% Luft, 5% CO₂ bei 37°C anheften gelassen.
Am nächsten Tag wird das Medium durch DME, das 10% fötales Kälberserum, 2 mM Glutamin und die Versuchssubstanz in einem Gesamtvolumen von 2 ml enthält, ersetzt. Jede Versuchssubstanz wird in dreifache Wells gegeben. Die Versuchssubstanzen werden insgesamt 96 Stunden mit den W-20-17-Zellen inkubiert, wobei die Medien nach 48 Stunden durch die gleichen Versuchsmedien ersetzt wird.
Zum Ende der 96 Stunden werden 50 μl der Versuchsmedien aus jedem Well entfernt und unter Anwendung eines Radioimmunassays auf Maus-Osteocalcin auf Osteocalcinproduktion geprüft. Die Einzelheiten des Assays sind in dem von Biomedical Technologies Inc., 378 Page Street, Stoughton, MA 02072, USA, hergestellten Kit beschrieben. Reagenzien für den Assay lassen sich als Produktnummern BT-431 (Maus-Osteocalcin-Eichsubstanz), BT-432 (Ziege-Anti-Maus-Osteocalcin), BT-431R (iodiertes Maus-Osteocalcin), BT-415 (normales Ziegenserum) und BT-414 (Esel-Anti-Ziege-IgG) finden. Der RIA auf Osteocalcin, das von W-20-17-Zellen als Reaktion auf BMP-Behandlung synthetisiert wurde, wird wie im vom Hersteller bereitgestellten Protokoll beschrieben durchgeführt.
Beispiel IX. Ratten-Ektopie-Studie
Vierundzwanzig männliche Long-Evans-Ratten werden in 6 Versuchsgruppen aufgeteilt. Jede empfängt ein subkutanes Implantat, 200 μl groß, mit entweder einer Dosis von 0 oder 20 μg/100 μl einer bestimmten BMP/Matrix-Probe, beispielsweise BMP/poröse PLGA-Partikel/Blutgerinnsel, wie in der US-Patentschrift 5,171,579 offenbart. Nach 14 Tagen werden die Ratten geopfert und jedes Tier wird auf Knochenbildung bewertet.
Beispiel X. Polyklonale Antikörper gegen den verkürzten BMP-Rezeptor
Drei Kaninchen wird gereinigtes verkürztes BMP-Rezeptorprotein injiziert. Polyklonale Antikörper aus Seren dieser Kaninchen werden mittels Chromatographie auf einer Protein-A-Säule gereinigt. Die Antikörper werden auf die Fähigkeit, BMP-Rezeptoren zu binden, geprüft.
Beispiel XI. Monoklonale Antikörper gegen den verkürzten menschlichen BMP-Rezeptor
Drei Sätze von Mäusen werden mit gereinigtem verkürztem BMP-Rezeptorprotein immunisiert. Die Milzen der Mäuse werden zum Erzeugen mehrerer Hybridomzelllinien verwendet. Die konditionierten Medien aus nichtklonalen Maus-Hybridomlinien werden auf die Fähigkeit, BMP-Rezeptoren zu binden, geprüft. Klonale Linien können aus diesen mittels sequentieller Serien- und einschränkender Verdünnungsklonierung entwickelt werden. Da nichtklonale Linien klonal werden, werden diese Linien, die im nichtklonalen Stadium positiv für Aktivität sind, die Fähigkeit bewahren, einen Antikörper zu produzieren, der BMP-Rezeptor bindet. Umgekehrt werden Linien, die negativ sind, während des gesamten Klonierungsvorgangs negativ bleiben. Monoklonale Antikörper können aus Aszites gereinigt werden, die von sowohl positiven als auch negativen Hybridomklonen abgeleitet sind. SEQUENZPROTOKOLL

Claims

DNA-Molekül, das eine DNA-Sequenz umfasst, die ein Serin-/Threoninkinase-BMP-Rezeptorprotein (BMP = morphogenetisches Knochenprotein) oder eine verkürzte Form davon mit der Fähigkeit, ein BMP in einem Bindungsassay zu binden, kodiert, wobei die DNA-Sequenz aus folgenden ausgewählt ist: (a) der DNA-Sequenz von CFK1-43a, die in SEQ ID Nr. 3 gezeigt ist; (b) den Nukleotiden 247 bis 1752 von SEQ ID Nr. 3; (c) einer DNA-Sequenz, die die Aminosäuren 8 bis 502 von SEQ ID Nr. 4 kodiert; (d) den Nukleotiden 247 bis 618 von SEQ ID Nr. 3; (e) einer DNA-Sequenz, die die Aminosäuren 8 bis 124 von SEQ ID Nr. 4 kodiert; und (f) einer DNA-Sequenz, die die Ligandenbindungsdomäne einer natürlich vorkommenden allelischen Variante eines beliebigen von (a) bis (e) kodiert.
Vektor, der das DNA-Molekül nach Anspruch 1 umfasst.
Vektor nach Anspruch 2 in operativer Assoziation mit einer Expressionskontrollsequenz dafür.
Wirtszelle, die mit dem Vektor nach Anspruch 2 oder 3 transformiert wurde.
Verfahren zum Produzieren eines Serin-/Threoninkinase-BMP-Rezeptorproteins oder einer verkürzten Form davon mit der Fähigkeit, ein BMP in einem Bindungsassay zu binden, das die folgenden Schritte umfasst: (a) Kultivieren der Wirtszelle nach Anspruch 4 in einem Kulturmedium und (b) Gewinnen des Proteins oder der verkürzten Form davon aus dem Kulturmedium.
Serin-/Threoninkinase-BMP-Rezeptorprotein oder verkürzte Form davon mit der Fähigkeit, ein BMP in einem Bindungsassay zu binden, wobei das Protein von dem DNA-Molekül nach Anspruch 1 kodiert wird.
Monoklonaler Antikörper mit der Fähigkeit, die verkürzte Form des Serin-/Threoninkinase-BMP-Rezeptorproteins nach Anspruch 6 zu binden.
Verwendung eines BMP-Rezeptorproteins oder einer verkürzten Form davon nach Anspruch 6 in einem Bindungsassay zum Identifizieren eines Liganden, der daran bindet, wobei der Ligand ein BMP-ähnlicher monoklonaler Antikörper, ein kleines Peptid-BMP-Analogon oder ein kleines organisches Molekül-BMP-Analogon ist.
Zusammensetzung, die Zellen umfasst, die mit einem oder mehreren DNA-Molekülen nach Anspruch 1 transformiert wurden.
Zusammensetzung, die das verkürzte BMP-Rezeptorprotein nach Anspruch 6 umfasst.
Verkürztes BMP-Rezeptorprotein nach Anspruch 6 zur Verwendung als ein Arzneimittel.
Verwendung einer Zusammensetzung nach Anspruch 9 zur Herstellung eines Arzneimittels zum Stimulieren des Wachstums von Knochen und/oder Knorpel.
Verwendung einer Zusammensetzung nach Anspruch 10 zur Herstellung eines Arzneimittels zum Inhibieren der Auswirkungen von BMP.
Protein, das von einem DNA-Molekül kodiert wird und das unter stringenten Hybridisierungsbedingungen mit einem DNA-Molekül nach Anspruch 1 hybridisiert, wobei das Protein durch die Fähigkeit, selektiv an BMP2 und BMP4, jedoch nicht an TGF-β zu binden, gekennzeichnet ist.