DE69531617T2

DE69531617T2 - Polymere mikrokugen und herstellungsverfahren

Info

Publication number: DE69531617T2
Application number: DE69531617T
Authority: DE
Inventors: Nai-Hong Li; R. James BENSON; Naotaka Kitagawa
Original assignee: SUNSTORM RESEARCH CORP LOS GATOS; Sunstorm Res Corp
Current assignee: Sunstorm Research Corp Los Gatos Calif Us
Priority date: 1994-06-06
Filing date: 1995-06-06
Publication date: 2004-08-12
Anticipated expiration: 2015-06-07
Also published as: AU2693795A; CA2190731A1; US5583162A; DE69531617D1; AU702241B2; JP2009057578A; EP0764047B2; US5863957A; US5653922A; DE69531617T3; EP0764047A4; WO1995033553A1; EP0764047B1; JPH10501173A; US5760097A; EP0764047A1; CN1150764A; US6100306A

Description

Hintergrund der Erfindung
Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft Mikrokügelchen aus einem vernetzten porösen Polymermaterial und betrifft Verfahren zur Herstellung solcher Mikrokügelchen. Diese Erfindung betrifft insbesondere ein Polymer-Mikrokügelchen mit außergewöhnlich großer Porosität.
Beschreibung des Stands der Technik
Vernetzte, homogene, poröse Polymermaterialien sind im US-Patent Nr. 4 522 953 offenbart (Barby et al., erteilt am 01.06.1985). Die offenbarten Polymermaterialien werden durch Polymerisation von Wasser-in-Öl-Emulsionen mit einem relativ hohen Verhältnis von Wasser zu Öl erzeugt. Diese Emulsionen werden als „Emulsionen mit einer großen inneren Phase" bzw. als „high internal phase emulsions" bezeichnet und sind in der Technik als „HIPEs" bekannt. HIPEs umfassen eine kontinuierliche Öl-Phase, die ein Monomer und ein Vernetzungsmittel einschließt und umfasst eine wäßrige diskontinuierliche Phase. Solche Emulsionen werden durch Unterwerfen bzw. Unterziehen der kombinierten Öl- und Wasser-Phasen gegenüber einem Rühren in Gegenwart eines Emulgators hergestellt. Polymere werden aus der sich ergebenden Emulsion durch Erhitzen erzeugt. Die Polymere werden dann gewaschen, um jegliches unpolymerisiertes Monomer/Vernetzer zu entfernen.
Die offenbarten porösen Polymere weisen starre Strukturen auf, die durch Poren in den Hohlraumwänden verbundene Hohlräume enthalten. Durch Auswählen geeigneter Bestandteile und Verfahrensbedingungen können HIPE-Polymere mit Leervolumina von 80% oder mehr erreicht werden. Diese Materialien weisen somit eine sehr hohe Kapazität zum Absorbieren und Zurückhalten von Flüssigkeiten auf.
Verschiedene Modifikationen von HIPE-Polymeren wurden beschrieben. Beispielsweise offenbart US-Patent Nr. 4,536,521 (Haq, erteilt am 20.08.1985), dass HIPE-Polymere zur Erzeugung von sulfoniertem Polymermaterial sulfoniert werden können, das eine hohe Kapazität zur Absorption ionischer Lösungen zeigt. Weitere funktionalisierte HIPE-Polymere, die durch ein ähnliches Verfahren hergestellt werden, wurden im US-Patent Nr. 4,611,014 (Jomes et al., erteilt am 09.09.1986) und 4,612,334 (Jones et al., 16.09.1986) offenbart.
Obwohl die Existenz polymerisierbarer HIPEs bekannt ist, ist die Herstellung nützlicher HIPE-Polymere nicht ohne Schwierigkeiten. Weil die zur Herstellung dieser Polymere verwendeten Emulsionen ein hohes Verhältnis von Wasser zu Öl aufweisen, neigen die Emulsionen dazu, instabil zu sein. Eine Auswahl der geeigneten Monomer/Vernetzer-Konzentration, Emulgators und Emulgator-Konzentration, Temperatur, Rührbedingungen sind alle zur Bildung einer stabilen Emulsion von Bedeutung. Leichte Veränderungen bei jeder dieser Variablen kann verursachen, dass die Emulsion „bricht" oder sich in eine getrennte Öl- und Wasserphase auftrennt. Darüber hinaus können Emulsionsbestandteile unter Verfahrensbedingungen, die eine stabile Emulsion erzeugen, nicht immer HIPE-Polymere ergeben, die für ihren beabsichtigten Verwendungszweck nützlich sind.
Zusätzlich zu diesen Problemen haben die mit der Maßstabsvergrößerung der Herstellung von HIPE-Polymeren verbundenen Kosten eine kommerzielle Entwicklung von Produkten auf HIPE-Polymerbasis verhindert. Verfahren zur Herstellung von HIPE-Polymeren im großen Maßstab sind bekannt. Beispielsweise offenbart US-Patent Nr. 5,149,720 (DesMarais et al., erteilt am 22.09.1992) eine kontinuierliche Phase zur Herstellung von HIPEs, die zur Polymerisierung zu absorbierenden Polymeren geeignet sind. Zusätzlich ist ein Verfahren, das solche kontinuierliche Verfahren durch Reduzieren der Aushärtezeit von Monomeren in einem HIPE erleichtert, im US-Patent Nr. 5,252,619 offenbart (Brownscombe et al., erteilt am 12.10.1993). Die Herstellung von HIPE-Polymeren in großem Maßstab durch solche bekannten Verfahren wurde jedoch durch das Fehlen kosteneffizienter Mittel zur Entfernung der nicht polymerisierten Emulsions-Bestandteile aus den Polymeren erschwert.
Alle Verfahren nach dem Stand der Technik zur Herstellung von HIPE-Polymeren erzeugen einen Block aus Polymermaterial mit der Größe und Form des zur Polymerisierung verwen deten Gefäßes. Das Problem bei der Herstellung von HIPE-Polymeren in Blockform besteht darin, dass es sehr schwierig ist, nicht polymerisierte Emulsions-Bestandteile aus einem Block aus einem Material mit niedriger Dichte, das stark absorbierend ist, auszuwaschen. Die versuchte Lösung dieses Problems bestand darin, die Blöcke zu Teilchen zu vermahlen, jedoch ist dieser Ansatz deswegen nicht zufriedenstellend, weil sowohl das Trocknen als auch die Vermahlverfahren kostenintensiv sind und eine Begrenzung der Größe der durch das Vermahlen erzeugten Teilchen besteht. Für viele Anwendungen ist die Entfernung übriger Emulsionsbestandteile essentiell. Bis heute jedoch wurde kein kosteneffizientes Verfahren zur Durchführung dieses Waschschrittes entwickelt.
Ein zusätzliches Problem bei HIPE-Polymerblöcken gemäß des Stands der Technik besteht darin, dass die Blöcke eine Haut aufweisen, die die Grenzfläche zwischen dem HIPE und dem zur Polymerisierung verwendeten Behälter bildet. (US-Patent Nr. 4,522,953, Barby et al., erteilt am 11.06.1985, Spalte 4, Zeilen 1–6). Um einen permeablen Block zu bilden und daher ein nützliches Produkt zu erzeugen, muß die Haut entfernt werden. Idealerweise wäre man dazu in der Lage, ein Polymermaterial herzustellen, das die erwünschten Eigenschaften von HIPE-Polymeren aufweist, dem jedoch eine Haut fehlt.
Zusammenfassung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung schließt ein wie in Anspruch 1 definiertes Material ein. Optionale bzw. wahlweise Merkmale der beanspruchten Produkte sind in den abhängigen Ansprüchen 2, 46, 51, 52 und 53 offenbart.
Diese Mikrokügelchen bzw. Microbeads weisen eine poröse, vernetzte Polymerstruktur auf, die durch Hohlräume charakterisiert ist, die durch miteinander verbundene Poren verbunden sind. Zumindest einige der Hohlräume bzw. Kavitäten im Inneren jedes Mikrokügelchens steht mit der Oberfläche des Mikrokügelchens in Verbindung.
Die vorliegende Erfindung schließt ebenfalls ein wie in Anspruch 3 beschriebenes Verfahren ein. Wahlweise Merkmale des beanspruchten Verfahrens sind in den abhängigen Ansprüchen 4 bis 45 und 49 offenbart. Der erste Schritt dieses Verfahrens besteht darin, eine kontinuierli che Öl-Phase (hierin nachstehend als „Öl-Phase" bezeichnet) mit einer diskontinuierlichen wäßrigen Phase zur Bildung einer Emulsion zu vereinigen bzw. zu verbinden. Die Öl-Phase der Emulsion schließt ein im wesentlichen wasserunlösliches, multifunktionelles Monomer, ein im wesentlichen wasserunlösliches, polyfunktionelles vernetztes Mittel und einen Emulgator ein, der zur Ausbildung einer stabilen Wasser-in-Öl-Emulsion geeignet ist. Der zweite Schritt des Verfahrens besteht darin, die Emulsion einem wäßrigen Suspensionsmedium zur Bildung einer Öl-in-Wasser-Suspension dispergierter Emulsions-Tröpfchen zuzusetzen. Der Endschritt dieses Verfahrens besteht im Polymerisieren der Emulsions-Tröpfchen zur Bildung von Mikrokügelchen.
In einer Ausführungsform liegt der Polymerisationsstarter bzw. -initiator sowohl in der wäßrigen diskontinuierlichen Phase des HIPE als auch im wäßrigen Suspensionsmedium vor. Ein Polymerisationsstarter kann wahlweise ebenso in die Öl-Phase eingeschlossen werden. Bei einer Variation dieser Ausführungsform schließt die Öl-Phase Styrol als das Monomer, Divinylbenzol als Vernetzungsmittel und Sorbitanmonooleat als Emulgator ein. Zusätzlich enthält die Öl-Phase den Öl-löslichen Polymerisationsstarter Azoisobisbutyronitril ebenso wie Dodecan, das die Bildung von miteinander in Verbindung stehenden Poren fördert. Die wäßrige diskontinuierliche Phase schließt den wasserlöslichen Polymerisationsstarter Kaliumpersulfat ein. Das wäßrige Suspensionsmedium schließt ein Suspensionsmittel ein, das modifiziertes Siliziumdioxid und Gelatine ebenso wie Kaliumpersulfat umfasst. Bei einer weiteren Ausführungsform liegt der Polymerisationsstarter lediglich in der Öl-Phase vor.
Die vorliegende Erfindung umfasst ebenfalls Mikrokügelchen, die zur Verwendung in speziellen Anwendungen modifiziert wurden. Die vorliegende Erfindung schließt insbesondere Mikrokügelchen, die zur Absorption von Flüssigkeiten funktionalisiert wurden; Kohlenstoffhaltige Strukturen, die aus den Mikrokügelchen hergestellt wurden und ein Verfahren, solche Strukturen herzustellen; und Mikrokügelchen, die ein Gel oder Prä-Gel bzw. Vorgel innerhalb der Mikrokügelchen-Hohlräume aufweisen, ebenso wie ein Verfahren ein, solche Mikrokügelchen herzustellen.
Zusätzlich schließt die vorliegende Erfindung die Verwendung von Mikrokügelchen in einer Vielzahl von Anwendungen ein, einschließlich der Verwendung von Mikrokügelchen als Substrat bei Trenn- und Syntheseverfahren; der Verwendung von Mikrokügelchen als Substrat zum Immobilisieren eines Moleküls wie beispielsweise eines Polypeptids oder eines Oligonukleotids; und der Verwendung von Mikrokügelchen in Zellkultur-Verfahren, wie in den Ansprüchen 47, 48 und 50 beschrieben ist.
Ausführliche Beschreibung der Erfindung
Die Mikrokügelchen
Die vorliegende Erfindung schließt ein vernetztes poröses Polymermaterial ein, das als „Mikrokügelchen" bezeichnet wird, wobei zumindest ungefähr 10% der Mikrokügelchen im wesentlichen sphärisch bzw. kugelförmig und/oder im wesentlichen ellipsoid sind. Die vorliegende Erfindung schließt ebenfalls ein Verfahren zur Herstellung eines solchen Materials ein. Ein Mikrokügelchen wird typischerweise durch Suspensionspolymerisierung einer Emulsion mit großer inneren Phase, als „HIPE" bezeichnet, erzeugt. Das Mikrokügelchen der vorliegenden Erfindung weist somit die erwünschten physikalischen Eigenschaften der HIPE-Polymere des Stands der Technik auf (wie beispielsweise solche, die im US-Patent Nr. 4 522 953, Barby et al., erteilt am 01.06.1985, offenbart wurden). Insbesondere weist das Mikrokügelchen aufgrund des Vorhandenseins von Hohlräumen, die durch miteinander in Verbindung stehenden Poren verbunden sind, eine sehr geringe Dichte auf. Die Schüttdichte einer Charge von Mikrokügelchen gemäß der vorliegenden Erfindung beträgt typischerweise weniger als ungefähr 0,2 g/ml. Das Leervolumen des Mikrokügelchens ist hoch, zumindest 70% und vorzugsweise zumindest 90%. Diese hohe Porosität verleiht dem Mikrokügelchen ein außergewöhnliches Absorptionsvermögen. Darüber hinaus stellt das Mikrokügelchen, weil die zwischen den Hohlräumen bestehende Verbindung im Mikrokügelchen es Flüssigkeiten ermöglicht, durch das Mikrokügelchen zu strömen, ein ausgezeichnetes Substrat zur Verwendung in Biotechnologie-Anwendungen bereit, wie beispielsweise in der chromatographischen Auftrennung von Proteinen und in der Peptid-Synthese.
Der durchschnittliche Durchmesser des Mikrokügelchens bewegt sich typischerweise von 5 μm bis 5 mm. Bevorzugte Durchschnittsdurchmesser bewegen sich von 50 μm bis 500 μm. Die kleine Größe erleichtert ein effizientes Waschen des Mikrokügelchens zur Entfernung restlicher nicht polymerisierter Emulsions-Bestandteile. Weiterhin kann das Verfahren der vorliegenden Erfindung zur Herstellung von Mikrokügelchen einer relativ gleichförmigen Größe und Form verwendet werden, was es ermöglicht, die Waschbedingungen so zu optimalisieren, dass sichergestellt wird, dass jedes Mikrokügelchen in einer Charge sorgfältig gewaschen wurde. Somit kann das Mikrokügelchen anders als die HIPE-Blöcke des Stands der Technik relativ einfach gewaschen werden. Dieses Merkmal der vorliegenden Erfindung erleichtert eine kosteneffiziente Vergrößerung der HIPE-Polymererzeugung.
Ein zusätzliches Merkmal des Mikrokügelchens besteht darin, dass das Mikrokügelchen „hautlos" ist, so dass einige Innen-Hohlräume und Poren mit der Oberfläche des Mikrokügelchens in Verbindung stehen. Somit bietet das Mikrokügelchen gegenüber HIPE-Polymeren des Stands der Technik den Vorteil, dass ein poröses Polymermaterial direkt nach Polymerisierung erzeugt werden kann, und der Bedarf nach einem Haut-Entfernungsschritt vermieden wird.
Die hohe Porosität des Mikrokügelchens macht es als Absorptionsmaterial nützlich und ebenfalls als festen Träger in einer Vielzahl von Biotechnologie-Anwendungen, einschließlich von chromatographischen Auftrennungen, Festphasensynthesen, Immobilisierung von Antikörpern oder Enzymen, und Zellkultur. Darüber hinaus sind viele der physikalischen bzw. physischen Eigenschaften des Mikrokügelchens wie beispielsweise Leervolumen und Hohlraumgröße kontrollier- bzw. steuerbar. Deswegen können unterschiedliche Typen von Mikrokügelchen, die für unterschiedliche Verwendungen spezialisiert sind, erzeugt werden. Eine Beschreibung des allgemeinen Verfahrens zur Herstellung des Mikrokügelchens ist nachstehend präsentiert, gefolgt von einer Diskussion von Modifikationen zur Herstellung spezialisierter Mikrokügelchen.
Definitionen
Der Begriff „Mikrokügelchen" betrifft ein vernetztes Polymermaterial, bei dem zumindest 10% dieses Materials aus im wesentlichen kugelförmigen und/oder im wesentlichen ellipsoiden Kügelchen besteht. Vorzugsweise besteht zumindest 20% und besonders bevorzugt zu mindest 50% dieses Materials aus im wesentlichen kugelförmigen und/oder im wesentlichen elipsoiden Kügelchen.
Wie auf die Bestandteile einer HIPE angewendet zeigt der Satz „im wesentlichen wasserunlöslich" an, dass jeder in der wäßrigen Phase vorliegende Bestandteil in einer solch niedrigen Konzentration vorliegt, dass die Polymerisation des wäßrigen Monomers weniger als 5 Gew.-% des polymerisierbaren Monomers beträgt.
Wie hierin verwendet bedeutet der Begriff „Schüttdichte" den Wert, der durch Teilen des Gewichtes eines bekannten Volumens von Mikrokügelchen durch dessen Volumen erzielt wird.
Wie hierin verwendet betrifft der Begriff „Leervolumen" das Volumen eines Mikrokügelchens, das kein Polymermaterial umfasst. Mit anderen Worten umfasst das Leervolumen eines Mikrokügelchens das Gesamtvolumen der Hohlräume. Leervolumen wird entweder als Prozentsatz des gesamten Mikrokügelchen-Volumens oder als Volumen pro Gramm Mikrokügelchen-Material (ccm/g) ausgedrückt.
Wie hierin verwendet betrifft der Begriff „Hohlraumgröße" den durchschnittlichen Durchmesser der in einem Mikrokügelchen vorliegenden Hohlräume.
Wie hierin verwendet betrifft der Begriff „Porogen" eine organische Verbindung, die, wenn sie in die Öl-Phase einer HIPE eingeschlossen ist, die Bildung von Poren fördert, die die Hohlräume in einem Mikrokügelchen verbinden.
Die Abkürzung „DVB" betrifft „Divinylbenzol"; wobei die Abkürzung „AIBN" „Azoisobisbutyronitril" betrifft; und die Abkürzung „PVA" „Poly(vinylalkohol)" betrifft, der durch Hydrolyse von Poly(vinylacetat) erzeugt wird.
Herstellung von Mikrokügelchen
Die Mikrokügelchen der vorliegenden Erfindung werden bequemerweise aus einem HIPE hergestellt, das eine Emulsion aus einer diskontinuierlichen wäßrigen Phase in einer Öl-Phase umfasst. Einmal gebildet wird die HIPE einem wäßrigen Suspensionsmedium zur Bildung einer Suspension aus HIPE-Mikrotröpfchen im Suspensionsmedium zugesetzt. Die Polymerisierung wandelt dann die flüssigen HIPE-Mikrotröpfchen zu festen Mikrokügelchen um.
Bei einer Ausführungsform liegt der Polymerisationsstarter sowohl in der wäßrigen diskontinuierlichen Phase der HIPE als auch im wäßrigen Suspensionsmedium vor. Ein Polymerisationsstarter kann wahlweise ebenso in die Öl-Phase eingeschlossen werden. In einer weiteren Ausführungsform liegt der Polymerisationsstarter lediglich in der Öl-Phase vor.
Mikrokügelchen-Produktion unter Verwendung eines Polymerisationsstarters in der wäßrigen Phase.
Bestandteile der Emulsion mit großer innerer Phase
Die relativen Mengen der beiden HIPE-Phasen sind, neben anderen Parametern, bedeutende Determinanten der physikalischen Eigenschaften des Mikrokügelchens. Insbesondere beeinflußt der Prozentsatz der wäßrigen diskontinuierlichen Phase Leervolumen, Dichte, Hohlraumgröße und Oberfläche. Für die Emulsionen, die zur Herstellung bevorzugter Mikrokügelchen verwendet werden, ist der Prozentsatz der wäßrigen diskontinuierlichen Phase im allgemeinen im Bereich von 70% bis 98% besonders bevorzugt 75% bis 95% und am meisten bevorzugt 80% bis 90%.
Die Öl-Phase der Emulsion umfasst ein Monomer, ein Vernetzungsmittel und einen Emulgator, der zur Bildung einer stabilen Wasser-in-Öl-Emulsion geeignet ist. Der Monomerbestandteil unterscheidet sich von demjenigen von HIPE-Polymeren des Stands der Technik nicht und kann irgendein im wesentlichen wasserunlösliches, monofunktionelles Monomer sein. In einer Ausführungsform ist der Monomertyp ein Styrol-basiertes Monomer, wie beispielsweise Styrol, 4-Methylstyrol, 4-Ethylstyrol, Chlormethylstyrol, 4-t-BOC-hydroxystyrol.
Der Monomer-Bestandteil kann ein einzelner Monomer-Typ oder ein Gemisch von Typen sein. Der Monomerbestandteil liegt typischerweise in einer Konzentration von 5 bis 90 Gew.-% der Öl-Phase vor. Die Konzentration des Monomer-Bestandteils ist vorzugsweise 15% bis 50% der Öl-Phase besonders bevorzugt 16% bis 38%.
Das Vernetzungsmittel kann aus einer breiten Vielzahl im wesentlichen wasserunlöslicher, polyfunktioneller Monomere ausgewählt sein. Vorzugsweise ist das Vernetzungsmittel bifunktionell. Geeignete Vernetzungsmittel unterscheiden sich von denjenigen des Stands der Technik nicht und schließen aromatische Divinyl-Verbindungen, wie beispielsweise Divinylbenzol (DVB) ein. Andere Arten von Vernetzungsmitteln, wie beispielsweise Di- oder Triacryl-Verbindungen und Triallylisocyanurat können ebenfalls verwendet werden. Das Vernetzungsmittel kann ein einziger Typ eines Vernetzungsmittels oder ein Gemisch von Typen sein. Das Vernetzungsmittel liegt im allgemeinen in einer Konzentration von 1 bis 90 Gew.-% der Öl-Phase vor. Vorzugsweise ist die Konzentration des Vernetzungsmittel 15% bis 50% der Öl-Phase. Besonders bevorzugt ist die Konzentration 16% bis 38%.
Zusätzlich zu einem Monomer- und Vernetzungsmittel umfasst die Öl-Phase einen Emulgator, der die Bildung einer stabilen Emulsion fördert. Der Emulgator kann irgendeiner von nicht ionischen, kationischen, anionischen oder amphoteren Emulgatoren oder einer Kombination von Emulgatoren sein, die die Bildung einer stabilen Emulsion fördern. Geeignete Emulgatoren unterscheiden sich von denjenigen des Stands der Technik nicht und schließen Sorbitanfettsäureester, Polyglycerolfettsäureester und Polyoxyethylenfettsäuren und -ester ein. In einer Ausführungsform ist der Emulgator Sorbitanmonooleat (vertrieben als SPAN 80). Der Emulgator liegt im allgemeinen in einer Konzentration von 4 bis 50 Gew.-% der Öl-Phase vor. Vorzugsweise ist die Konzentration des Emulgators 10% bis 25% der Öl-Phase. Besonders bevorzugt ist die Konzentration 15% bis 20%.
In einer Variation der ersten Ausführungsform enthält die Öl-Phase ebenfalls einen Öl-löslichen Polymerisationsstarter und ein Porogen. Der Starter kann irgendein Öl-löslicher Starter sein, der die Bildung einer stabilen Emulsion ermöglicht, wie beispielsweise ein Azo-Starter. Ein bevorzugter Starter ist Azoisobisbutyronitril (AIBN). Der Initiator kann in einer Konzentration von bis zu ungefähr 5 Gew.-% des gesamten polymerisierbaren Monomers (Monomerbestandteil plus Vernetzungsmittel) in der Öl-Phase vorliegen. Die Konzentration des Starters ist vorzugsweise 0,5 bis 1,5 Gew.-% des gesamten polymerisierbaren Monomers, besonders bevorzugt 1,2 Gew.-%.
Das Porogen der vorliegenden Erfindung kann irgendeine nicht polymerisierende organische Verbindung oder Kombination von Verbindungen sein, die die Bildung einer stabilen Emulsion ermöglicht, vorausgesetzt, dass die Verbindung ein für die verwendeten Monomere gutes Lösungsmittel ist, jedoch für das erzeugte Polymer ein schlechtes Lösungsmittel ist. Geeignete Porogene schließen Dodecan, Toluol, Cyclohexanol, n-Heptan, Isooctan und Petroleumether ein. Ein bevorzugtes Porogen ist Dodecan. Das Porogen liegt im allgemeinen in einer Konzentration von 10 bis 60 Gew.-% der Öl-Phase vor. Die Porogen-Konzentration beeinflußt die Größe und Anzahl der Poren, die die Hohlräume in dem Mikrokügelchen miteinander verbinden. Insbesondere erhöht eine Zunahme der Porogen-Konzentration die Größe und Anzahl der diese verbindenden Poren; während eine Abnahme der Porogen-Konzentration die Größe und Anzahl der Poren senkt. Die Porogen-Konzentration ist vorzugsweise 25 bis 40 Gew.-% der Öl-Phase. Die Konzentration ist besonders bevorzugt 30 bis 35 Gew.-%.
In der ersten Ausführungsform umfasst die wäßrige diskontinuierliche Phase einer HIPE im allgemeinen einen wasserlöslichen Polymerisationsstarter. Der Starter kann irgendein geeigneter Wasser-löslicher Starter sein. Solche Initiatoren bzw. Starter sind wohl bekannt und schließen Peroxid-Verbindungen wie beispielsweise Natrium-, Kalium- und Ammoniumpersulfate; Natriumperacetat; Natriumperkarbonat und dergleichen ein. Ein bevorzugter Starter ist Kaliumpersulfat. Der Starter kann in einer Konzentration von bis zu 5 Gew.-% der wäßrigen diskontinuierlichen Phase betragen. Vorzugsweise ist die Konzentration des Starters 0,5 bis 2 Gew.-% der wäßrigen diskontinuierlichen Phase.
Bestandteile des wäßrigen Suspensionsmediums
Nach Bildung einer HIPE durch das ausführlich unten beschriebene Verfahren wird die HIPE einem wäßrigen Suspensionsmedium zur Bildung einer Öl-in-Wasser-Suspension zugesetzt. Das wäßrige Suspensionsmedium umfasst ein Suspensionsmittel und in der ersten Ausfüh rungsform einen wasserlöslichen Polymerisationsstarter. Das Suspensionsmittel kann irgendein Mittel oder eine Kombination von Mitteln sein, die die Bildung einer stabilen Suspension von HIPE-Mikrotröpfchen fördert. Typische Tröpfchenstabilisatoren für Öl-in-Wasser-Suspensionen schließen Wasser-lösliche Polymere wie beispielsweise Gelatine, natürliche Gummis, Zellulose und Zellulosederivate (beispielsweise Hydroxyethylzellulose), Polyvinylpyrrolidon und Poly(vinylalkohol) (PVA) ein. PVA, das zur Verwendung als Suspensionsmittel geeignet ist, wird durch Teil-(85% bis 92%)hydrolyse von Polyvinylacetat erzeugt. Ebenfalls verwendet werden fein verteilte, wasserunlösliche anorganische Feststoffe wie beispielsweise Tonerde, Siliziumdioxid, Aluminiumoxid und Zirkoniumdioxid. Zwei oder mehr unterschiedliche Suspensionsmittel können kombiniert werden. In einer Ausführungsform ist das Suspensionsmittel tatsächlich eine Kombination aus Gelatine oder PVA (88% Hydrolyse) und modifizierter Tonerde und Siliziumdioxid-Teilchen.
Modifizierte anorganische Feststoff-Teilchen werden durch Behandlung der Teilchen mit einem Mittel erzeugt, das die Hydrophobie der Teilchen erhöht, und dadurch das Vermögen der Teilchen, die Suspension zu stabilisieren, verbessert. Bei einer Ausführungsform sind die anorganischen Feststoff-Teilchen durch Behandlung mit einem oberflächenaktiven Stoff bzw. Tensid modifiziert, wie beispielsweise Asphalten, in Gegenwart eines geeigneten organischen Lösungsmittels. Geeignete organische Lösungsmittel schließen Toluol, Heptan und ein Gemisch der beiden ein. Die relativen Konzentrationen des anorganischen Feststoffs und von Asphalten können zur Erzeugung modifizierter anorganischer Feststoffe variierender Hydrophobien variiert werden. Ein Maß der Teilchenhydrophobie ist der „Kontaktwinkel", der widerspiegelt, wie weit ein Teilchen in eine Wasserphase an einer Öl-Wasser-Grenzfläche eindringt. Ein Kontaktwinkel von 90° zeigt, dass das Teilchen zur Hälfte in der Öl-Phase und zur Hälfte in der Wasser-Phase vorliegt. Ein Kontaktwinkel von weniger als 90° zeigt, dass das Teilchen weiter in die Wasser-Phase penetriert, d. h. hydrophiler ist. In der vorliegenden Erfindung wird die Hydrophobie der anorganischen festen Teilchen so eingestellt, dass die Teilchen die Bildung einer stabilen Suspension fördern. In einer geeigneten Variation dieser Ausführungsform ist der Kontaktwinkel der modifizierten anorganischen festen Teilchen ungefähr 65°. Das Suspensionsmittel kann im wäßrigen Suspensionsmittel in irgendeiner Konzentration vorliegen, die die Bildung einer stabilen Suspension fördert, typischerweise ungefähr 0,1 bis ungefähr 10 Gew.-% des wäßrigen Suspensionsmediums. Für eine bevorzugte Kombination aus Suspensionsmitteln wird eine stabile Suspension mit einer PVA-Konzentration von 0,5% bis 5% und einer anorganischen Feststoff-Konzentration von 0,05 bis 0,3 Gew.-% des wäßrigen Suspensionsmediums gewonnen.
Zusätzlich zum Suspensionsmittel enthält das wäßrige Suspensionsmedium einen wasserlöslichen Polymerisationsstarter in der ersten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung. Das Vorliegen eines Starters im Suspensionsmedium, ebenso wie in den HIPE-Mikrotröpfchen beschleunigt die Polymerisationsreaktion. Es ist im allgemeinen eine rasche Polymerisation wegen der Neigung der Suspension, über die Zeit hinweg zu brechen, wünschenswert.
Der Starter kann irgendein geeigneter Wasser-löslicher Starter sein, wie beispielsweise solche, die oben für die wäßrige diskontinuierliche Phase der HIPE beschrieben sind. In einer bevorzugten Variation dieser Ausführungsform ist der Starter Kaliumpersulfat, vorliegend im Suspensionsmedium in einer Konzentration von bis zu 5 Gew.-%. Besonders bevorzugt ist die Konzentration des Starters 0,5 bis 2 Gew.-% des wäßrigen Suspensionsmediums.
Herstellung einer Emulsion mit großer innerer Phase
Der erste Schritt bei der Herstellung eines HIPE-basierten Mikrokügelchens ist die Bildung einer Emulsion mit großer innerer Phase. Eine HIPE kann durch irgendeines der Verfahren des Stands der Technik hergestellt werden, wie beispielsweise diejenigen, die im US-Patent Nr. 4,522,953 offenbart sind (Barby et al., erteilt am 11.06.1985). Kurz gesagt wird eine HIPE durch Vereinigen der Öl- und wäßrigen diskontinuierlichen Phasen gebildet, während die Kombination einer Scher-Bewegung unterworfen werden. Im allgemeinen wird eine Misch- oder Rühr- bzw. Bewegungsvorrichtung wie beispielsweise eine Stiftschneidmühle verwendet.
Der Umfang und die Dauer der Scher-Bewegung muss so ausreichend sein, um eine stabile Emulsion zu bilden. Weil die Scher-Bewegung zur Hohlraumgröße umgekehrt in Beziehung steht, kann die Bewegung erhöht oder gesenkt werden, um jeweils ein Mikrokügelchen mit kleineren oder größeren Hohlräumen zu gewinnen. In einer Ausführungsform wird eine HIPE unter Verwendung eines Gifford-Wood Homogenizer-Mixers (Model 1-LV), eingestellt auf 1.400 UpM, hergestellt. Bei dieser Mischgeschwindigkeit wird die HIPE in ungefähr 5 Minuten erzeugt. Bei einer anderen Ausführungsform wird eine HIPE unter Verwendung einer Luft-betriebenen Version des obigen Mixers (Modell 1-LAV) hergestellt, wobei der Luftdruck für ungefähr 5–10 Minuten bei 5–10 psi eingestellt wird. Die HIPE kann in einem chargenweisen oder in einem kontinuierlichen Verfahren gebildet werden, beispielsweise das, das im US-Patent Nr. 5,149,720 offenbart ist (DesMarais et al., erteilt am 22.09.1992).
Herstellung einer HIPE-Mikrotröpfchen-Suspension
Wenn sie einmal gebildet wird, wird die HIPE dem wäßrigen Suspensionsmedium zugesetzt. Die HIPE muss dem Suspensionsmedium in einer Menge und in einer Geschwindigkeit zugesetzt werden, die zur Bildung einer Suspension aus HIPE-Mikrotröpfchen geeignet ist.
Wenn die HIPE zugesetzt wird, wird die Suspension einer ausreichenden Scher-Bewegung unterworfen, um eine stabile Suspension zu bilden. Um sicherzustellen, dass die erzeugten Mikrokügelchen eine relativ gleichförmige Größe aufweisen, sollte die Mischvorrichtung die verwendet wird, eine relativ gleichförmige Verteilung an Bewegungs- bzw. Rührkraft durch die ganze Suspension hindurch bereitstellen. Weil die Scher-Bewegung zur Mikrotröpfchen-Größe umgekehrt in Beziehung steht, kann die Bewegung zur Erzielung kleinerer oder größerer HIPE-Mikrotröpfchen jeweils erhöht oder gesenkt werden. Auf diese Weise kann man die Größe des nach Polymerisation erzeugten Mikrokügelchens steuern.
Um eine stabile Mikrotröpfchen-Suspension in einem kugelförmigen 22 l-Reaktor mit Scheide- bzw. Trennwänden oder Vertiefungen herzustellen wird beispielsweise die HIPE dem Suspensionsmedium tropfenweise in einer Strömungsgeschwindigkeit von bis zu ungefähr 500 ml/min zugesetzt, bis die Suspension bis zu ungefähr 50% HIPE umfasst. Das Rühren kann sich von ungefähr 50 bis ungefähr 500 UpM bewegen, wenn ein propeller- oder schaufelartiges Flügelrad mit einem Durchmesser von ungefähr 1,5 bis 3 Inch bzw. Zoll verwendet wird. In einer Ausführungsform wird die HIPE dem Suspensionsmedium im 22 Liter-Reaktor in einer Durchflußgeschwindigkeit von 20 ml/min zugesetzt, bis die Suspension ungefähr 10% HIPE umfasst.
Das Rühren dieses Gemisches bei ungefähr 250 UpM gefolgt von Polymerisation ergibt Mikrokügelchen mit einem durchschnittlichen Durchmesser im Bereich von 100 bis 160 μm.
Polymerisation von HIPE-Mikrotröpfchen
Wenn einmal eine stabile Suspension von HIPE-Mikrotröpfchen erzielt wird, wird die Temperatur des wäßrigen Suspensionsmediums auf über Umgebungstemperatur angehoben und die Polymerisation wird gestartet. Die Polymerisationsbedingungen variieren abhängig von der Zusammensetzung der HIPE. Beispielsweise sind das Monomer- oder Monomergemisch und der Polymerisationsstarter (die Polymerisationsstarter) besonders bedeutende Determinanten der Polymerisationstemperatur. Darüber hinaus müssen die Bedingungen so gewählt werden, dass eine stabile Suspension für eine Zeitspanne aufrecht erhalten werden kann, die für die Polymerisation von Nutzen ist. Die Bestimmung einer geeigneten Polymerisationstemperatur für eine gegebene HIPE liegt innerhalb des Fachwissens auf dem Gebiet. Im allgemeinen sollte die Temperatur der HIPE-Suspension nicht über 85°C angehoben werden, weil hohe Temperaturen ein Brechen der Suspension verursachen können. Vorzugsweise werden, wenn AIBN der Öl-lösliche Starter und Kaliumpersulfat der Wasser-lösliche Starter ist, Styrolmonomere durch Halten der Suspension bei 60°C über Nacht polymerisiert (ungefähr 18 Stunden).
Waschen der Mikrokügelchen
Der Polymerisationsschritt wandelt ein HIPE-Mikrotröpfchen zu einem festen Mikrokügelchen um. Wie oben diskutiert wird dieses Mikrokügelchen im allgemeinen zur Entfernung irgendwelcher restlichen nicht polymerisierten Bestandteile der HIPE oder des Suspensionsmediums gewaschen. Das Mikrokügelchen kann mit irgendeiner Flüssigkeit gewaschen werden, die die übrigen Bestandteile solubilisiert bzw. löslich macht, ohne die Stabilität des Mikrokügelchens zu beeinflussen. Mehr als ein Waschzyklus kann erforderlich sein. Vorzugsweise wird das Mikrokügelchen fünf Mal mit Wasser gefolgt von einer Aceton-Extraktion für ungefähr einen Tag in einem Soxhlet-Extraktor, gewaschen. Das Mikrokügelchen kann dann in konventioneller Weise getrocknet werden. Vorzugsweise wird das Mikrokügelchen für zwei Tage luftgetrocknet oder wird unter Vakuum bei 50°C über Nacht getrocknet. Die sich ergebenden Mikrokügelchen weisen typischerweise eine Schüttdichte von weniger als 0,1 g/ml auf.
Mikrokügelchen-Herstellung unter Verwendung eines Öl-Phasen-Starters
Mikrokügelchen-Bestandteile
In einer zweiten Ausführungsform kann ein Polymer-Mikrokügelchen durch ein Verfahren hergestellt werden, bei dem der Polymerisationsstarter in der Öl-Phase anstelle der wäßrigen Phase vorliegt. Geeignete Starter für diese Ausführungsform schließen Öl-lösliche Starter beispielsweise AIBN, Benzoylperoxid, Lauroylperoxid, VAZO-Typ Initiatoren bzw. Starter (wie beispielsweise 1,1'-Azobis(cyclohexancarbonitril), das als VAZO-Katalysator 88 von Aldrich, Milwaukee, WI, vertrieben wird) und dergleichen ein.
In dieser Ausführungsform wird ein ausreichender Starter der Öl-Phase zugesetzt, um eine freie Radikalreaktion zu starten. Geeignete Starter-Konzentrationen für eine gegebene Mikrokügelchen-Präparation können in einfacher Weise durch den Fachmann auf dem Gebiet bestimmt werden. Typischerweise liegt der Starter in einer Konzentration von bis zu 5 Gew.-% am gesamten polymerisierbaren Monomer (Monomer-Bestandteil plus Vernetzungsmittel) in der Öl-Phase vor. Die Konzentration des Starters ist vorzugsweise 0,5 bis 3,0 Gew.-% am gesamten polymerisierbaren Monomer, besonders bevorzugt ungefähr 2,2 Gew.-%.
Zusätzlich macht die zweite Ausführungsform die Verwendung eines Stabilisators erforderlich, der dazu in der Lage ist, eine Grenzfläche zwischen der wäßrigen diskontinuierlichen Phase der HIPE und dem wäßrigen Suspensionsmedium zu bilden, wobei diese beiden wäßrigen Medien in der Mikrotröpfchen-Suspension aneinander grenzen. Dieses Phänomen ist der Situation in Seifenblasen analog, in denen eine Grenzfläche, die durch Detergenz-Moleküle gebildet wird, Luft auf der Innenseite der Blase von Luft auf der Außenseite abtrennt. Der Stabilisator reduziert einen Wasserverlust aus den HIPE-Mikrotröpfchen und hilft dabei, eine Koaleszenz der Mikrotröpfchen zu vermeiden.
Im allgemeinen sollte der Stabilisator eine filmbildende Verbindung sein, die in organischen Lösungsmitteln löslich ist und die ausreichend hydrophil ist, um die Grenzfläche zwischen der wäßrigen diskontinuierlichen Phase der HIPE und des wäßrigen Suspensionsmediums zu stabilisieren. Diese Eigenschaften sind in einer Vielzahl natürlicher und synthetischer Polymere zu finden, die als Stabilisatoren in dieser Ausführungsform dienen können, einschließlich von Zellulosederivaten, wie beispielsweise Methylzellulose und Ethylzellulose, und PVA (weniger als 70% Hydrolyse). Weitere geeignete Stabilisatoren können empirisch durch den Fachmann auf dem Gebiet gemäß der hierin offenbarten Lehren bestimmt werden. Vorzugsweise umfasst der Stabilisator Ethylzellulose.
Die Stabilisatorkonzentration muss ausreichend sein, um den Wasserverlust aus den HIPE-Mikrotröpfchen zu reduzieren und um eine Mikrotröpfchen-Koaleszenz zu reduzieren. Optimale Konzentrationen variieren mit der HIPE-Zusammensetzung und werden empirisch bestimmt. Geeignete Stabilisator-Konzentrationen bewegen sich typischerweise von 0,01 bis ungefähr 15 Gew.-% der Öl-Phase. Höhere Stabilisator-Konzentrationen können verwendet werden; jedoch ist es bei Konzentrationen oberhalb 15% schwierig, den Stabilisator aus den polymerisierten Mikrokügelchen auszuwaschen. Vorzugsweise ist die Stabilisator-Konzentration 0,1% bis 1% der Öl-Phase, besonders bevorzugt 0,2% bis 0,6%.
Wenn der Stabilisator in der Öl-Phase nicht löslich ist, wird der Stabilisator typischerweise in einem inerten Lösungsmittel gelöst und die sich ergebende Lösung der Öl-Phase der HIPE zugesetzt. Zusätzlich zum Solubilisieren des Stabilisators dient das inerte Lösungsmittel als ein Porogen. Das inerte Lösungsmittel kann irgendein Lösungsmittel sein, das dazu in der Lage ist, den Stabilisator zu solubilisieren und das in der Öl-Phase der HIPE mischbar ist. Beispiele für inerte Lösungsmittel, die in der zweiten Ausführungsform von Nutzen sind, schließen Trichlorethan, Toluol, Chloroform und andere halogenierte Lösungsmittel und dergleichen ein.
Ausreichend inertes Lösungsmittel wird dem Stabilisator zugesetzt, um die Löslichkeit des Stabilisators zu erhöhen, um ein Mischen des Stabilisators mit der Öl-Phase zu ermöglichen. Die inerte Lösungsmittel-Konzentration variiert mit der verwendeten Stabilisator- und Öl-Phase und die Bestimmung des geeigneten Typs und der Konzentration eines inerten Lö sungsmittels zur Erleichterung des Mischens eines speziellen Stabilisators mit einer vorgegebenen Öl-Phase liegt innerhalb der Fähigkeiten des Fachmanns. Typischerweise bewegt sich die Konzentration des inerten Lösungsmittels von 3 bis 60 Gew.-% der Öl-Phase und insbesondere von 10 bis 40%.
Geeignete Konzentrationen an Monomer, Vernetzungsmittel und Emulgator sind im wesentlichen wie oben beschrieben, außer dass die Konzentrationen irgendeiner dieser Verbindungen so reduziert werden können, dass sie den Einschluß des Öl-löslichen Polymerisations-Starters, Stabilisators und des inerten Lösungsmittels in der Öl-Phase in Einklang bringen. Somit sind typische Konzentrationsbereiche für diese Bestandteile in der zweiten Ausführungsform wie folgt:
Bevorzugte Konzentrationen für jeden dieser Bestandteile sind dieselben wie oben für die erste Ausführungsform diskutiert. Zusätzlich kann ein Porogen wahlweise in die Öl-Phase mit eingeschlossen werden, wie oben für die erste Ausführungsform beschrieben. Wenn ein Porogen eingeschlossen wird, können die Konzentrationen an Monomer, Vernetzungsmittel und/oder Emulgator reduziert werden.
Die wäßrige diskontinuierliche Phase und das wäßrige Suspensionsmedium der zweiten Ausführungsform unterscheiden sich von solchen der ersten Ausführungsform dahingehend, dass die wäßrige diskontinuierliche Phase und das wäßrige Suspensionsmedium der zweiten Ausführungsform keinen Polymerisationsstarter einschließen. Bei einer Variation der zweiten Ausführungsform besteht die wäßrige diskontinuierliche Phase im wesentlichen aus Wasser. Das wäßrige Suspensionsmedium dieser Ausführungsform umfasst ein Suspendierungsmittel, das jedes Mittel oder Kombination von Mitteln sein kann, die die Bildung einer stabilen Suspension von HIPE-Mikrotröpfchen fördert. Beispiele für geeignete Suspensionsmittel werden oben diskutiert. Natürliche Gummis, wie beispielsweise Akazien-Gummi (im Handel erhältlich von Aldrich Chemical Co., Milwaukee, WI) werden bevorzugt. Das Suspendierungsmittel kann in jeder Konzentration vorliegen, das die Bildung einer stabilen Suspension fördert, typischerweise 1 bis 30 Gew.-% des wäßrigen Suspensionsmediums. Vorzugsweise ist die Suspendierungsmittelkonzentration zwischen 2% bis 15%.
Herstellung der Mikrokügelchen
Um Mikrokügelchen gemäß der zweiten Ausführungsform herzustellen wird eine Öl-Phase hergestellt, indem der Öl-lösliche Polymerisationsstarter, der Stabilisator und ein inertes Lösungsmittel mit einem Monomer, einem Vernetzungsmittel und einem Emulgator vereinigt wird. Eine HIPE wird durch Kombinieren der Öl- und wäßrigen diskontinuierlichen Phasen gebildet, während die Kombination einer ausreichenden Scher-Bewegung unterzogen wird, um eine stabile Emulsion wie oben beschrieben zu bilden. Wenn sie einmal geformt ist wird die HIPE in einer Menge und in einer Geschwindigkeit dem wäßrigen Suspensionsmedium zugesetzt, die zur Ausbildung einer Suspension aus HIPE-Mikrotröpfchen geeignet ist. Wenn das HIPE zugesetzt wird, wird die Suspension wie oben beschrieben einem Scher-Rühren bzw. einer Scher-Bewegung unterworfen.
Nach Gewinnung einer stabilen Suspension wird die Polymerisation durch Erhöhen der Temperatur gestartet. Wie oben beschrieben variieren die Polymerisationsbedingungen abhängig von der Zusammensetzung der HIPE und die Bestimmung geeigneter Bedingungen für eine gegebene HIPE liegt innerhalb des Wissens des Fachmanns auf dem Gebiet. Wenn Lauroylperoxid der Starter ist, wird die Polymerisation üblicherweise für 20 Stunden bei 50°C durchgeführt.
Modifikationen der Mikrokügelchen
Das Mikrokügelchen ist für eine Vielzahl von Anwendungen von Nutzen, und bemerkenswerter Weise als Absorptionsmaterial und ebenfalls als fester Träger in Biotechnologie-Anwendungen. Ein Mikrokügelchen-basiertes Absorbenz kann beispielsweise zum Transport von Lösungsmitteln, zum Absorbieren von Körperflüssigkeiten und als adhäsiver Mikroträger verwendet werden. Biotechnologie-Anwendungen schließen chromatographische Auftrennungen, Festphasensynthese, Immobilisierung von Antikörpern oder Enzymen und mikrobielle oder Säugetierzellkultur ein. Das basische bzw. grundlegende Mikrokügelchen kann auf einer Vielzahl von Wegen modifiziert werden, um Mikrokügelchen zu erzeugen, die für spezielle Anwendungen spezialisiert sind.
Funktionalisierung des Mikrokügelchens zur Absorption von Säuren
Eine breite Vielzahl ionischer und polarer funktioneller Gruppen kann dem Mikrokügelchen zugesetzt werden, um ein polymeres Mikrokügelchen zu erzeugen, das große Mengen an sauren Flüssigkeiten absorbieren kann. Solche Mikrokügelchen weisen im allgemeinen eine größere Kapazität zum Absorbieren wäßriger und/organischer Säuren auf im Vergleich zu deren Kapazität für das Neutralöl Methyloleat. Insbesondere ist das Verhältnis von wäßriger und/oder organischer Säure- zur Methyloleat Absorption im allgemeinen größer als 1,2. Ein bevorzugtes Ausgangsmaterial zur Herstellung eines solchen Mikrokügelchens ist ein Mikrokügelchen, das von 1% bis 50% vernetzt ist und ein Leervolumen von mehr als 70% in seinem durch Lösungsmittel aufgequollenen Zustand aufweist.
Das funktionalisierte Mikrokügelchen umfasst die folgende strukturelle Einheit:
wobei A eine vernetzte Kohlenstoff-Kette repräsentiert, wobei Y eine optionale Spacer-Gruppe ist und Z eine ionische oder polare funktionelle Gruppe ist. Z ist aus einer Amino- oder substituierten Amino-Gruppe und einer kationischen Alkyl-Ammoniumgruppe mit 8 oder mehr Kohlenstoffatomen ausgewählt (hierin nachstehend „ein höheres Alkyl") oder aus einer kationischen quartären Alkylammonium-Gruppe von 8 Kohlenstoffatomen oder weniger in Gegenwart eines organischen Gegenions mit 8 oder mehr Kohlenstoffatomen. Das funktionalisierte Mikrokügelchen kann einen einzigen Typ einer solchen strukturellen Einheit oder eine Kombination unterschiedlicher Typen umfassen.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist Z aus ionischen oder polaren funktionellen Gruppen der Strukturen 1–3 ausgewählt:
wobei R₂, R₃, R₄, R₅ und R₆ gleich oder unterschiedlich sein können und aus Alkyl, Cycloalkyl, Aryl und Hydroxyalkyl ausgewählt sein können. Alternativ können R₂ und R₃ den Teil eines Ringsystems bilden. Wenn Z eine kationische quartäre Ammonium-Gruppe (3) ist, sind R₄, R₅, R₆ vorzugsweise so ausgewählt, dass die Anzahl von Kohlenstoffatomen, die in R₄ + R₅ + R₆ vorliegen, 10 oder mehr ist. Wenn Z eine Amino-Salzgruppe (2) ist, sind R₄ und R₅ vorzugsweise so ausgewählt, dass die Anzahl von Kohlenstoffatomen, die in R₄ + R₅ vorliegen, 8 oder mehr beträgt.
Das Gegenion X^– für die kationische quartäre Ammonium-Gruppe (3) oder die Amino-Salzgruppe (2) ist ein organisches oder anorganisches Ion. Das Gegenion für die höhere kationische Alkyl-Gruppe ist eine anorganische Spezies wie beispielsweise Chlorid, Sulfat oder Nitrat. Alternativ ist das Gegenion eine lang- oder kurzkettige organische Spezies wie beispielsweise Acetat oder Oleat.
In einer weiteren Ausführungsform sind R₄, R₅ und R₆ niedere Alkyl-Gruppen, so dass die Anzahl von Kohlenstoffatomen, die in R₄ + R₅ + R₆ vorliegt, weniger als 10 für eine kationische quartäre Ammonium-Gruppe (3) beträgt und die Anzahl von Kohlenstoffatomen in R₄ + R₅ für ein Aminosalz (2) weniger als 8 beträgt. In dieser Ausführungsform ist das Gegenion X^– vorzugsweise eine organische Gruppe mit 8 oder mehr Kohlenstoffatomen, wie beispielsweise Oleat. Für eine kationische quartäre Ammonium-Gruppe (3) kann X^– ebenfalls OH^– sein.
Die Menge an Lösungsmittel, die von dem funktionalisierten Mikrokügelchen absorbiert wird, nimmt mit der Anzahl ionischer oder polarer funktioneller Gruppen, die vorliegen, zu, vorausgesetzt, das Niveau des Vernetzens überschreitet nicht ungefähr 15–20%. Oberhalb dieses Niveaus der Vernetzung ist die Menge der Flüssigkeit, die absorbiert wird, viel weniger gegenüber dem Ausmaß der Substitution empfindlich, weil die Flüssigkeitsaufnahme dann von der Mobilität solvatisierter Polymer-Ketten abhängig ist. Das Niveau des Vernetzens wird durch Verändern der relativen Konzentrationen von Monomer und Vernetzer kontrolliert. Vorzugsweise ist das Niveau der Vernetzung im Bereich von 2–10%. Der Umfang der Funktionalisierung ist im allgemeinen größer als 30%, vorzugsweise größer als 50% und am meisten bevorzugt größer als 70%.
Funktionalisierte Mikrokügelchen werden durch dieselben Verfahren erzeugt, die auch zur Herstellung funktionalisierter HIPE-Polymere verwendet werden. Geeignete Verfahren sind wohl bekannt und sind beispielsweise im US-Patent Nr. 4,611,014 offenbart (Jomes et al., erteilt am 09.09.1986). Kurz gesagt wird das funktionalisierte Mikrokügelchen im allgemeinen indirekt durch chemische Modifikation eines vorgeformten Mikrokügelchens hergestellt, das eine reaktive Gruppe wie beispielsweise Brom oder Chlormethyl trägt.
Ein für eine anschließende chemische Modifikation geeignetes Mikrokügelchen kann durch Polymerisation von Monomeren wie beispielsweise Chlormethylstyrol oder 4-t-BOC-hydroxystyrol hergestellt werden. Weitere geeignete Monomere sind Styrol, α-Methylstyrol oder ein anderes substituiertes Styrol oder aromatische Vinylmonomere, die nach Polymerisation, zur Erzeugung eines reaktiven Mikrokügelchen-Zwischenproduktes, das anschließend zu einem funktionalisierten Mikrokügelchen umgewandelt werden kann, chlormethyliert werden kann.
Monomere, die keine reaktiven Gruppen tragen (einschließlich des Vernetzungsmittels) können in das Mikrokügelchen in Konzentrationen von bis zu 20% oder mehr eingebaut werden. Um HIPE-basierte Mikrokügelchen zu erzeugen müssen jedoch solche Monomere die Bildung einer stabilen HIPE erlauben. Die Konzentration des reaktiven Monomers sollte im allgemeinen ausreichend hoch sein, um sicherzustellen, dass das funktionalisierte Mikrokügel chen, das nach chemischer Modifikation erzeugt wird, ionische öder polare funktionelle Gruppen auf minimal 30% der Monomer-Reste trägt.
Eine chemische Modifikation des reaktiven Mikrokügelchen-Zwischenproduktes wird durch eine Vielzahl herkömmlicher Verfahren durchgeführt. Bevorzugte beispielhafte Verfahren zur Herstellung von durch Amino-, Aminosalz- und kationischen quartären Ammoniumfunktionalisierten Mikrokügelchen sind ausführlich in den Beispielen 2 bzw. 4 dargestellt.
In einer weiteren Ausführungsform können Mikrokügelchen, die ionische oder polare Gruppen tragen, direkt durch Emulgieren und Polymerisation eines geeigneten im wesentlichen Wasser-unlöslichen Monomers hergestellt werden.
Funktionalisierung des Mikrokügelchens zur Absorption wäßriger Lösungen
Durch Auswählen unterschiedlicher polarer oder ionischer funktioneller Gruppen kann das Mikrokügelchen so funktionalisiert werden, dass ein Mikrokügelchen produziert wird, das große Mengen wäßriger Lösungen absorbiert, und das ebenfalls als Ionenaustauscherharz dient. Die Kapazität dieser Mikrokügelchen zum Absorbieren einer 10% Natriumchloridlösung ist derartig, dass das Verhältnis von 10% Natriumchlorid zu Wasser-Absorption im allgemeinen größer als 0,1, vorzugsweise größer als 0,5 und am meisten bevorzugt größer als 0,7 ist.
Das für die wäßrige Absorption funktionalisierte Mikrokügelchen umfasst die folgende strukturelle Einheit:
bei der A eine vernetzte Kohlenstoff-Kette ist, bei der Y eine optionale Spacer-Gruppe ist und Z eine ionische oder polare funktionelle Gruppe ist. Z ist aus einer kationischen Alkyl-Ammoniumgruppe mit 10 Kohlenstoffatomen oder weniger, einem Alkyl-Amino-Salz mit 8 Kohlenstoffatomen oder weniger, einem Alkoxylat, einem Metall- oder Ammonium- oder substituiertem Ammonium-Salz einer Schwefelsäure-, Karbonsäure-, Phosphorsäure-, oder Sulfonsäure-Gruppe ausgewählt, vorausgesetzt, dass, wenn Z eine Sulfonsäure ist, Y nicht die folgende Struktur aufweist:
wenn m = 0
Das funktionalisierte Mikrokügelchen kann einen einzigen Typ einer von solchen strukturellen Einheiten oder eine Kombination unterschiedlicher Typen umfassen.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist Z aus ionischen oder polaren funktionellen Gruppen der Strukturen 1–2 ausgewählt:
wobei R₂, R₃ und R₄ gleich oder unterschiedlich sein können und aus einem Alkyl, Cycloalkyl, Aryl und Hydroxyaryl ausgewählt sind. Alternativ bilden R₂ und R₃ Teil eines Ringsystems. Wenn Z eine kationische quartäre Ammonium-Gruppe (1) ist, sind R₂, R₃, R₄ vorzugsweise so ausgewählt, dass die Anzahl der Kohlenstoffatome, die in R₂ + R₃ + R₄ vorliegt, weniger als 10 beträgt. Wenn Z eine Amino-Salzgruppe (2) ist, sind R₂ und R₃ vorzugsweise derart ausgewählt, dass die Anzahl von Kohlenstoffatomen, die in R₂ + R₃ vorliegen, weniger als 8 beträgt.
Das Gegenion X^– für die kationische quartäre Ammonium-Gruppe (1) oder die Amino-Salzgruppe (2) ist eine anorganische Spezies wie beispielsweise Chlorid, Sulfat oder Nitrat.
Alternativ kann das Gegenion eine Carboxylat-Spezies mit weniger als 8 Kohlenstoffatomen sein, beispielsweise Acetat oder Lactat. Für eine kationische quartäre Ammonium-Gruppe (1) kann X^– ebenfalls OH^– sein.
In einer Ausführungsform ist Z eine alkoxylierte Kette des folgenden Typs:
wobei p 1 bis 680 ist und
und wobei R₅ eine Wasserstoff- oder eine Alkyl-Gruppe ist und M ein Metall-, ein Ammonium-, oder ein substituiertes Ammoniumkation ist. Besonders bevorzugt ist R₅ = Wasserstoff, B = CH₂OH und p < 20.
Verfahren zum Zusetzen der oben beschriebenen funktionellen Gruppen zu HIPE-Polymeren sind im US-Patent Nr. 4,612,334 offenbart (Jones et al., 16.09.1986). Mikrokügelchen, die zur wäßrigen Absorption funktionalisiert werden, werden durch dieselben Verfahren hergestellt, die zur Herstellung der entsprechenden funktionalisierten HIPE-Polymere verwendet werden. Geeignete Verfahren sind dieselben wie die oben beschriebenen Verfahren zur Herstellung von Mikrokügelchen, die zur Säureabsorption für funktionelle Gruppen desselben basischen Typs funktionalisiert wurden (beispielsweise Aminosalze).
Insbesondere schließen geeignete Monomere zur Herstellung eines reaktiven Mikrokügelchen-Zwischenproduktes, das zur Absorption wäßriger Lösungen funktionalisiert werden kann, Chlormethylstyrol, n-Butylmethacrylat, t-Butylacrylat, 2-Ethylhexylacrylat oder andere geeignete Acrylat- oder Methacrylat-Ester ein. Zusätzlich können Monomere wie beispielsweise Styrol, α-Methylstyrol oder andere substituierte Styrole oder aromatische Vinylmonomere polymerisiert und darauf zur Herstellung eines reaktiven Mikrokügelchen-Zwischenproduktes chlormethyliert, sulfoniert, nitriert oder in anderer Weise aktiviert werden, das anschließend zu einem funktionalisierten Mikrokügelchen umgewandelt werden kann. Bevorzugte beispielhafte Verfahren zur Herstellung von Aminosalz-, kationischem quartärem Ammonium-, Alkoxylat- und Sulfonat-Salz funktionalisierten Mikrokügelchen sind ausführlich in den Beispielen 5 bzw. 8 beschrieben.
Herstellung einer stabilen Kohlenstoff-Struktur aus dem Mikrokügelchen
Ein Mikrokügelchen kann in ein poröses kohlenstoffhaltiges Material umgewandelt werden, das die Orginalstruktur von Mikrokügelchen-Hohlräumen und diese verbindenden Poren beibehält. Dieses Material ist beispielsweise als Sorptions- oder Filtrationsmedium und als fester Träger in einer Vielzahl biotechnologischer Anwendungen von Nutzen (weiter im nächsten Abschnitt beschrieben). Zusätzlich kann das kohlenstoffhaltige Mikrokügelchen als Elektroden-Material in Batterien und Super-Kondensatoren verwendet werden. Batterieelektrodenmaterialien weisen vorzugsweise einen großen Gitterabstand auf, wie beispielsweise derjenige des Mikrokügelchens. Ein großer Gitterabstand reduziert oder eliminiert eine Gitterausdehnung und Kontraktion während des Batteriebetriebs und verlängert dadurch die Batteriezykluslebenszeiten. Superkondensatoren erfordern hochleitende Elektroden. Das Mikrokügelchen ist ideal für diese Anwendung geeignet, weil die miteinander-Verbundenheit des Mikrokügelchens dieses hochleitend macht.
Um ein kohlenstoffhaltiges Mikrokügelchen zu erzeugen wird ein stabiles Mikrokügelchen in einer Inertatmosphäre wie für die HIPE-Polymere im US-Patent Nr. 4,775,655 beschrieben (Edwards et al., erteilt am 04.10.1988) erhitzt. Die Fähigkeit des Mikrokügelchens, dieser Hitzebehandlung zu widerstehen variiert abhängig vom verwendeten Monomer oder den Monomeren. Einige Monomere, wie beispielsweise Styrol-basierte Monomere ergeben Mikrokügelchen, die gegen eine Depolymerisierung während des Erhitzens stabilisiert werden müssen.
Die zur Stabilisierung solcher Mikrokügelchen erforderliche Modifikation kann viele Formen annehmen. Mikrokügelchen-Bestandteile und Verfahrensbedingungen können so ausgewählt werden, dass ein hoher Vernetzungsgrad erreicht wird oder um chemische Einheiten einzuschließen, die eine Depolymerisierung unter den verwendeten Erhitzungsbedingungen reduzieren oder diesen vorbeugen. Geeignete stabilisierende chemische Einheiten schließen die Halogene; Sulfonate und Chlormethyl, Methoxy, Nitro- und Cyano-Gruppen ein. Zur maximalen thermischen Stabilität ist der Grad des Vernetzens vorzugsweise größer als 20% und der Grad irgendeiner anderen chemischen Modifikation ist zumindest 50%. Die stabilisierenden Einheiten können in das Mikrokügelchen nach dessen Bildung oder durch Selektion von in geeigneter Weise modifizierten Monomeren eingebracht werden.
Wenn es einmal stabilisiert ist, wird das Mikrokügelchen in einer Inertatmosphäre auf eine Temperatur von zumindest 500°C erhitzt. Um den Stabilisator-Gehalt der endgültigen Kohlenstoff enthaltenden Struktur zu reduzieren, sollte die Temperatur im allgemeinen auf zumindest ungefähr 1.200°C erhöht werden. Ein bevorzugtes beispielhaftes Verfahren zur Herstellung einer stabilen Kohlenstoffstruktur aus dem Mikrokügelchen ist ausführlich in Beispiel 9 beschrieben.
Herstellung eines Mikrokügelchens zur Verwendung als Substrat
Viele Chromatographie- und chemischen Synthesetechniken verwenden ein Substrat. Bei chromatographischen Auftrennungen werden Bestandteile einer Lösung auf Grundlage des Vermögens solcher Bestandteile aufgetrennt, mit chemischen Gruppen, die an die Substratoberfläche gebunden sind, wechselzuwirken. Bei einer Festphasensynthese dient das Substrat als Plattform, an die ein wachsendes Molekül wie beispielsweise ein Polypeptid, verankert wird.
Beide Verfahren können in einer chargenweise oder kontinuierlichen Weise durchgeführt werden. In einem chargenweisen Verfahren ist das Substrat in einem Gefäß enthalten und Lösungen, die die zu trennenden Bestandteile oder die Reaktanten enthalten, werden aufeinanderfolgend zugesetzt und durch Filtration und Waschen entfernt. Alternativ ist in kontinu ierlichen oder halbkontinuierlichen Verfahren das Substrat in einer Säule enthalten und Lösungen werden anschließend durch die Säule hindurch geleitet.
Das Mikrokügelchen ist in einzigartiger Weise zur Anwendung in solchen Systemen geeignet, weil das Mikrokügelchen ein starres Gerüst bereitstellt, das offene Kanäle für die Flüssigkeitsströmung sicherstellt und ermöglicht, dass Lösungs-Bestandteile oder Reaktanten in oder aus dem Mikrokügelchen diffundieren. Wenn dies für eine spezielle Anwendung erwünscht ist, kann das Mikrokügelchen durch Bereitstellen chemischer Gruppen an der Mikro-Kugel-Oberfläche funktionalisiert werden, direkt mit den Bestandteilen oder Reaktanten in einer Lösung interagieren. Alternativ können die chemischen Gruppen an der Mikrokügelchen-Oberfläche als Anker für andere reaktive Spezies dienen, wie beispielsweise für Katalysatoren, Enzyme oder Antikörper.
Die anschließenden Abschnitte beschreiben die Verwendung des Mikrokügelchens in der Chromatographie und Festphasensynthese und diskutieren als Beispiel die Funktionalisierung des Mikrokügelchens zur Verwendung in einer Ionenaustauscher-Chromatographie und in der Peptidsynthese. Die Diskussionen dieser beiden Anwendungen sollen lediglich veranschaulichend sein und die Erfindung keinesfalls einschränken. Variationen dieser Anwendung werden für den Fachmann auf dem Gebiet offensichtlich sein und sind in den Umfang der Erfindung mit eingeschlossen.
Funktionalisierung des Mikrokügelchens zur Verwendung in der Chromatographie
Das Mikrokügelchen ist als Substrat in einer Vielzahl von chromatographischen Techniken von Nutzen, einschließlich der Ionen-Austausch-, Gelfiltrations-, Adsorptions- und Affinitätschromatographie.
In der Ionenaustausch-Chromatographie werden die Bestandteile eines Gemisches auf Grundlage von Unterschieden der Netto-Ladung aufgetrennt. Substrate, die Kationen auftrennen, werden als „Kationenaustauscherharze" bezeichnet und sind durch das Vorliegen negativ geladener Gruppen charakterisiert. Umgekehrt sind Substrate, die Anionen auftrennen „Anionenaustauscherharze" durch das Vorhandensein von positiv geladenen Gruppen charakteri siert. Ein Bestandteil, der an ein Anionenaustauscherharz bindet, wird typischerweise aus dem Harz durch Erhöhen des pH des Säulenpuffers oder durch Zusetzen von Anionen, die mit dem Bestandteil um die Bindung an die Säule konkurrieren, freigesetzt. Ein solcher Bestandteil eluiert aus der Säule vor den Bestandteilen, die eine höhere negative Netto-Ladung aufweisen und hinter den Bestandteilen, die eine niedrigere Netto-Ladung aufweisen.
Kationenaustauscherharze können aus Mikrokügelchen durch Bereitstellen von sauren Gruppen auf den Mikrokügelchen-Oberflächen erzeugt werden. Geeignete Gruppen schließen die stark sauren Sulfonat-Gruppen ebenso wie die schwach sauren Carboxylat-, Carboxymethyl-, Phosphat-, Sulfomethyl-, Sulfoethyl- und Sulfopropylgruppen ein. Anionenaustauscherharze können aus Mikrokügelchen durch Funktionalisieren der Mikrokügelchen mit basischen Gruppen hergestellt werden, die sich von den stark basischem quartären Ammonium-Gruppen bis zu den schwach basischen Gruppen wie beispielsweise Aminoethyl-, Diethylaminoethyl-, Guanidoethyl- und Epichlorhydrin-triethanolamin-Gruppen bewegen.
Saure und basische Gruppen können einem vorgeformten Mikrokügelchen wie oben zur Funktionalisierung des Mikrokügelchens zur Absorption saurer und wäßriger Lösungen beschrieben oder durch irgendein anderes herkömmliches Verfahren zugesetzt werden. Alternativ kann ein Mikrokügelchen, das solche Gruppen trägt, direkt durch Polymerisation eines geeigneten Monomers hergestellt werden.
Unabhängig vom Herstellungsverfahren weist das zur Chromatographie funktionalisierte Mikrokügelchen im allgemeinen ein Leervolumen von zumindest 70% und eine Hohlraumgröße von bis zu 50 μm auf. Vorzugsweise weist ein Mikrokügelchen ein Leervolumen von 70% bis 80% auf. Diese Kombination an Merkmalen stellt eine rasche Aufnahme von Flüssigkeiten mit einer relativ unbeeinträchtigten Strömung durch das Mikrokügelchen sicher.
Die Kapazität des Mikrokügelchen-Substrats kann durch Zusetzen eines Gels zum Mikrokügelchen gemäß der im US-Patent Nr. 4,965,289 offenbarten Verfahren (Sherrington, erteilt am 23.10.1990) erhöht werden. Wie weiterhin im nächsten Abschnitt diskutiert wird, wird das Gel in den Mikrokügelchen-Hohlräumen gebildet oder diesen zugesetzt und wird an die Mikrokügelchen-Oberfläche gebunden. Das Gel trägt entweder saure oder basische Gruppen, ab hängig davon, ob das Mikrokügelchen-Substrat als Anionenaustauscherharz oder Kationenaustauscherharz dienen soll.
Funktionalisierung des Mikrokügelchens zur Verwendung in der Festphasensynthese
Das Mikrokügelchen wird zur Verwendung in der Festphasensynthese funktionalisiert, indem chemische Gruppen bereitgestellt werden, die an die Mikrokügelchen-Oberflächen gebunden werden. Die chemischen Gruppen werden so ausgewählt, dass sie mit einem der in die Synthese involvierten Reaktanten bzw. Reaktionspartner interagieren. Auf Grundlage der ausgewählten chemischen Gruppe können Mikrokügelchen-Substrate für chemische Synthesen von so unterschiedlichen Spezies wie Peptiden, Oligonukleotiden und Oligosacchariden spezialisiert sein. Verfahren zum Zusetzen geeigneter chemischer Gruppen zum Funktionalisieren des Mikrokügelchens zur Verwendung in solchen Synthesen unterscheiden sich nicht von den früher für HIPEs nach dem Stand der Technik und für andere Polymere beschriebenen Verfahren.
Ein Mikrokügelchen kann für die Peptidsynthese beispielsweise wie im US-Patent Nr. 4,965,289 (Sherrington, erteilt am 23.10.1990) funktionalisiert werden. Kurz gesagt wird ein Mikrokügelchen derart hergestellt, dass das Hohlvolumen zumindest 70% beträgt und die Hohlraumgröße bis zu 50 μm beträgt. Das Mikrokügelchen ist vorzugsweise so ausreichend vernetzt, dass das Mikrokügelchen auf nicht mehr als das zweifache seines Trockenvolumens während der Anwendung aufquillt.
Die chemische Gruppe, die an die Mikrokügelchen-Oberfläche gebunden ist, kann irgendeine Gruppe sein, die an den ersten Reaktionspartner in der Synthese bindet. In der Peptidsynthese ist die chemische Gruppe beispielsweise irgendeine Gruppe, die an die erste Aminosäure des Peptids, das hergestellt werden soll, bindet. Die chemische Gruppe sollte so gewählt werden, dass die chemische Gruppe an einer Position an die Aminosäure bindet, die von der Amino-Gruppe verschieden ist. Typischerweise umfasst die chemische Gruppe ein Amin, das mit der Carboxyl-Gruppe der ersten Aminosäure reagiert.
Chemische Gruppen können einem vorgeformten Mikrokügelchen zugesetzt werden oder alternativ kann ein Mikrokügelchen, das chemische Gruppen trägt, direkt durch Emulsifikation bzw. Emulsionsbildung und Polymerisation eines geeigneten im wesentlichen Wasserunlöslichen Monomers hergestellt werden. Falls es erwünscht ist, können die chemischen Gruppen weiter modifiziert werden, um Spacer-Gruppen bereitzustellen, die mit der ersten Aminosäure des Peptids interagieren.
Die Peptidsynthese wird durch Binden der ersten Aminosäure an geeignete chemische Gruppen auf der Mikroperlen-Oberfläche begonnen. Die Amino-Gruppen der Aminosäure-Reaktionspartner sind im allgemeinen geschützt und somit tritt eine Kettenverlängerung durch alternierende Runden der Entschützung und Bindung von Aminosäuren auf. Das Verfahren wird durch Abspaltung des Peptids vom Substrat beendet, wonach das Peptid typischerweise gereinigt wird.
Die Kapazität des Mikrokügelchen-Substrats kann durch Zusetzen eines Gels zum Mikrokügelchen gemäß der im US-Patent Nr. 4,965,289 offenbarten Verfahren erhöht werden (Sherrington, erteilt am 23.10.1990). Kurz gesagt wird ein geeignetes Mikrokügelchen wie oben beschrieben hergestellt und ein Gel oder ein Vor-Gel wird in den Hohlräumen des Mikrokügelchens abgelagert und in diesen gehalten. Das Gel ist im allgemeinen in einem hohen Maße durch Lösungsmittel gequollenes, vernetztes Gel und kann beispielsweise ein weiches deformierbares bzw. verformbares Polyamidgel sein. Für Syntheseanwendungen wird das Gel im allgemeinen so angepaßt, dass es mit einem Reaktionspartner in der Synthese wechselwirkt. Das Verhältnis von gequollenem Gel zu porösem Material kann sich von 60 : 40 bis 95 : 5 (Gewicht : Gewicht) bewegen und ist besonders bevorzugt von 75 : 25 bis 95 : 5. Das am meisten bevorzugte Verhältnis ist ungefähr 80 : 20.
Das Gel kann in dem vorgeformten Mikrokügelchen durch irgendeines der Verfahren des Stands der Technik zur Herstellung von Gel-befüllter HIPE-Polymere wie beispielsweise solche, die im US-Patent Nr. 4,965,289 offenbart sind (Sherrington, erteilt am 23.10.1990), abgelagert und in diesem gehalten werden. In einer Ausführungsform wird das Gel aus Vor-Gelmaterialien innerhalb der Mikrokügelchen-Hohlräume gebildet. Am meisten bevorzugt wird das Gel in den Mikrokügelchen-Hohlräumen während der Gelbildung gehalten oder ver ankert. Das Gel kann durch die Kettenverlängerung und/oder Interpenetration zwischen dem Gel und den Mikrokügelchen-Oberflächen gehalten werden. Zusätzlich kann das Gel durch ein Verfahren zurückgehalten werden, von dem angenommen wird, dass es die chemische Bindung zwischen dem Gel und den Oberflächen des Mikrokügelchens mit einschließt. Kombinationen der obigen Mechanismen sind ebenfalls möglich.
In einer Ausführungsform wird das Mikrokügelchen mit einer Lösung in Berührung gebracht, die Vor-Gel-Bestandteile und ein quellendes Lösungsmittel für das Mikrokügelchen umfaßt. Wenn die Prä- bzw. Vor-Gel-Bestandteile in das Mikrokügelchen eindringen und beginnen, ein Gel zu bilden, quillt das Mikrokügelchen auf und fängt Anteile des sich bildenden Gels durch Polymer-Ketteninterpenetration zwischen dem gequollenen Polymermaterial des Mikrokügelchens und dem sich bildenden Gel ein. Geeignete quellende Lösungsmittel hängen von der Natur des Mikrokügelchen-Polymers ab und können in einfacher Weise durch den Fachmann auf dem Gebiet bestimmt werden. Die Details eines bevorzugten beispielhaften Verfahrens zur Herstellung eines Gel-befüllten Mikrokügelchens für die Polymer-Kettenverlängerung ist in Beispiel 10 dargelegt.
In einer weiteren Ausführungsform kann die Zurückhaltung durch chemische Bindung durch Umsetzen der Gel- oder Prä-Gel-Bestandteile mit Ankergruppen auf dem Mikrokügelchen erreicht werden. Geeignete Gel-Ankergruppen unterscheiden sich von solchen, die in der Technik bekannt sind nicht, einschließlich Gruppen, die Doppelbindungen aufweisen, die für eine Interaktion mit Gel oder Prä-Gel-Bestandteilen verfügbar sind. Solche Ankergruppen können in das Mikrokügelchen durch Modifikation nach Mikrokügelchen-Bildung oder durch Selektion von in geeigneter Weise modifizierten Monomeren eingebracht werden.
Beispielsweise kann ein Gel-befülltes Mikrokügelchen durch Umsetzen eines Aminomethylfunktionalisierten Mikrokügelchens mit Acryloylchlorid hergestellt werden, um ein acryliertes Mikrokügelchen herzustellen. Nach Erhitzen in Gegenwart von Prä-Gel-Bestandteilen zum Starten der Gel-Polymerisation wird angenommen, dass die Doppelbindungen der Acrylat-Gruppe mit dem sich bildenden Gel wechselwirken, was eine kovalente Bindung des Gels an das Mikrokügelchen zur Folge hat. Wenn ein acryliertes Mikrokügelchen verwendet wird, schließen geeignete Prä-Gel-Monomere beispielsweise Acryloyltyramin-Acetat und Acryloyl sarcosin-Methylester ein. Wie oben diskutiert können Ankergruppen in das Mikrokügelchen durch Modifikation nach Mikrokügelchen-Bildung oder durch Selektion von geeignet modifizierten Monomeren eingebracht werden.
Verwendung des Mikrokügelchens zur Immobilisierung von Molekülen
Das Mikrokügelchen kann als Substrat für eine breite Vielzahl von Molekülen verwendet werden, einschließlich von Polypeptiden und Oligonukleotiden. Das Mikrokügelchen ist insbesondere zum Immobilisieren von Antikörpern, Lectinen, Enzymen und Haptenen von Nutzen. Verfahren zur Bindung solcher Moleküle an Polymersubstraten sind wohl bekannt (siehe beispielsweise Tijssen, P. Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology: Practice and Theories of Enzyme Immunoassays New York: Elsevier (1985) auf den Seiten 298–314). Mehrere solcher Verfahren werden unten kurz beschrieben. Die Verfahren sind als Beispiele beschrieben und sollen nicht als einschränkend aufgefaßt werden, weil der Fachmann auf dem Gebiet in einfacher Weise bestimmen kann, wie diese Verfahren nach dem Stand der Technik zu verwenden oder zu modifizieren sind, um ein interessierendes Molekül an das Mikrokügelchen zu binden.
Ein Polypeptid kann an das Mikrokügelchen über eine nicht-kovalente Adsorption oder durch kovalente Bindung befestigt werden. Eine nicht-kovalente Adsorption wird im allgemeinen nicht spezifischen hydrophoben Wechselwirkungen zugeschrieben und ist von der Netto-Ladung des Polypeptids unabhängig. Ein Polypeptid wird an das Mikrokügelchen durch Behandlung des Mikrokügelchens mit einer Pufferlösung, die das Polypeptid enthält, befestigt. Geeignete Puffer schließen 50 mM Karbonat, pH 9,6; 10 mM Tris-HCl, pH 8,5, das 100 mM Natriumchlorid enthält; und Phosphat-gepufferte Salzlösung ein. Die Polypeptidkonzentration ist im allgemeinen zwischen 1 und 10 μg/ml. Das Mikrokügelchen wird typischerweise in dieser Lösung über Nacht bei 4°C in einer Feuchtkammer inkubiert. Die Polypeptidadsorptionsniveaus können durch teilweise Denaturierung des Polypeptids beispielsweise durch Exponieren des Polypeptids gegenüber einer hohen Temperatur, niedrigem pH (beispielsweise 2,5) oder denaturierenden Mitteln (beispielsweise Urea) erhöht werden.
Mehrere unterschiedliche Verfahren sind für die kovalente Bindung von Polypeptiden an das Mikrokügelchen verfügbar. Bequemerweise kann ein Polypeptid mit einer freien Amino-Gruppe an ein Mikrokügelchen auf Styrol-Basis beispielsweise durch Behandlung des Mikrokügelchens mit Glutaraldehyd bei einem niedrigen pH gebunden werden. Das Polypeptid wird dann zugesetzt und der pH der Lösung wird auf zwischen 8,0 und 9,5 mit 100 mM Karbonat erhöht. Die Erhöhung des pHs erhöht die Reaktivität des Glutaraldehyds, das das Polypeptid an die Mikrokügelchen-Oberfläche bindet. Ethylchlorformiat kann für Glutaraldehyd substituiert werden oder in Kombination mit diesem im obigen Verfahren verwendet werden.
Alternativ können die Mikrokügelchen für eine kovalente Bindung der Polypeptide funktionalisiert werden. Ein solches Mikrokügelchen stellt Ankergruppen bereit, die an das interessierende Polypeptid binden. Geeignete Anker-Gruppen zur Bindung von Polypeptiden an Polymere sind wohl bekannt und schließen Hydrazid-Gruppen, Alkylamin-Gruppen und Sanger's Reagenz ein. Anker-Gruppen können in das Mikrokügelchen durch Modifikation nach Mikrokügelchen-Bildung oder durch Selektion von in geeigneter Weise modifizierten Monomeren eingebracht werden.
Zusätzlich kann ein Polypeptid an das Mikrokügelchen über ein Brückenmolekül gebunden werden. Dieses Verfahren der Bindung ist für Polypeptide von Nutzen, die schlecht an das Mikrokügelchen binden. Solche Polypeptide werden an ein Brückenmolekül gebunden, das eine hohe Affinität für Kunststoff aufweist, wie beispielsweise Rinderserumalbumin (BSA). Um ein Polypeptid an ein Mikrokügelchen über eine BSA-Brücke zu binden, wird BSA dem Mikrokügelchen zugesetzt und darauf wird das Polypeptid an das immobilisierte BSA unter Verwendung eines herkömmlichen Vernetzers wie beispielsweise Carbodiimid gebunden.
In einer weiteren Ausführungsform dient das Mikrokügelchen als Substrat für ein Oligonukleotid. Das Oligonukleotid kann bequemerweise an ein Mikrokügelchen durch Behandlung des Mikrokügelchens mit einer polykationischen Substanz wie beispielsweise methyliertem BAS, poly-L-Lysin oder Protaminsulfat adsorbiert werden. Wenn das Letztere verwendet wird, wird das Mikrokügelchen typischerweise für ungefähr 90 Minuten mit einer 1% wäßrigen Lösung von Protaminsulfat gefolgt von mehreren Waschungen mit destilliertem Wasser behandelt. Das Mikrokügelchen wird dann trocknen gelassen. Ein Oligonukleotid wird an das behandelte Mikrokügelchen durch Zusetzen des Oligonukleotids zum Mikrokügelchen in einer Konzentration von ungefähr 10 μg/ml in einem Puffer wie beispielsweise 50 mM Tris-HCl, pH 7,5, adsorbiert, der 10 mM Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) und 10 mM Ethylenglykol-bis(β-aminoethylether)N,N,N',N'-tetraessigsäure (EGTA) enthält. Im allgemeinen ergibt eine Behandlungszeit von 60 Minuten geeignete Ergebnisse.
Verwendung des Mikrokügelchens in einer hochdichten Zellkultur
Zusätzlich zu den obigen Anwendungen ist das Mikrokügelchen ebenfalls in einer Zellkultur von Nutzen. Eine hochdichte Zellkultur erfordert im allgemeinen, dass Zellen durch kontinuierliche Perfusion mit Wachstumsmedium genährt werden. Suspensionskulturen erfüllen diese Anforderung, jedoch begrenzen Scher-Effekte die Belüftung bei einer hohen Zellkonzentration. Das Mikrokügelchen schützt die Zellen vor diesen Scher-Wirkungen und kann in konventionellen Rühr- oder Airlift-Bioreaktoren verwendet werden.
Um ein Mikrokügelchen zur Verwendung beim Kultivieren eukaryontischer oder prokaryontischer Zellen herzustellen wird das Mikrokügelchen im allgemeinen durch irgendeines der vielen wohl bekannten Sterilisationsverfahren sterilisiert. Geeignete Verfahren schließen Bestrahlung, Ethylenoxid-Behandlung und vorzugsweise Autoklavieren ein. Sterile Mikrokügelchen werden dann in einem Kulturgefäß mit dem für die zu kultivierenden Zellen geeigneten Wachstumsmedium angeordnet. Geeignete Wachstumsmedien sind wohl bekannt und unterscheiden sich von den Wachstumsmedien des Stands der Technik für Suspensionskulturen nicht. Ein Inoculum der Zellen wird zugesetzt und die Kultur wird unter Bedingungen gehalten, die für die Zellanlagerung an die Mikrokügelchen geeignet sind. Das Kulturvolumen wird dann im allgemeinen erhöht und die Kultur wird in derselben Weise wie in Suspensionskulturen nach dem Stand der Technik aufrecht erhalten.
Mikrokügelchen können in einer Zellkultur ohne Modifikation verwendet werden, jedoch können die Mikrokügelchen ebenfalls zur Verbesserung der Zell-Bindung bzw. Anlagerung, Wachstum und der Herstellung spezifischer Proteine modifiziert werden. Beispielsweise kann eine Vielzahl von Brückenmolekülen verwendet werden, um die Zellen an die Mikrokügelchen anzulagern. Geeignete Brücken-Moleküle schließen Antikörper, Lectine, Glutaraldehyd und Poly-L-lysin ein. Zusätzlich erhöht die Sulfonierung von Mikrokügelchen wie oben beschrieben die Zell-Anlagerungsraten. Beispiel 11 veranschaulicht die Verwendung sulfonierter Mikrokügelchen in einer beispielhaften Säugetierzellkultur.
Diese Erfindung wird weiter durch die nachfolgenden speziellen, jedoch nicht einschränkenden Beispiele, veranschaulicht. Verfahren, die konstruktiv auf die Praxis reduziert sind werden in der Gegenwartsform beschrieben und Verfahren, die im Labor durchgeführt wurden, werden in der Vergangenheitsform dargelegt.
Beispiel 1
A. Mikrokügelchen-Produktion unter Verwendung wäßriger und Öl-Phasen-Starter
Beispielhafte bevorzugte Mikrokügelchen werden gemäß der folgenden Vorschrift hergestellt. Die Endkonzentration jedes Bestandteils der HIPE und des wäßrigen Suspensionsmediums ist in Tabelle 1, Studie 4 dargestellt. Tabelle 1 zeigt weiterhin Studien, bei denen die vorliegende Vorschrift wie gezeigt variiert wurde. Die Ergebnisse dieser Studien sind in Tabelle 2 dargelegt.

1. Herstellen einer Öl-Phase durch Vereinigen von 11,37 g Styrol-basiertem Monomer, 11,25 g DVB, 8,00 g Span 80, 0,27 g AIBN; und 15,00 g Dodecan unter Rühren bei Raumtemperatur.
2. Herstellen einer wäßrigen diskontinuierlichen Phase durch Zusetzen von 0,78 g Kaliumpersulfat zu 94,3 ml destilliertem Wasser.
3. Rühren der Öl-Phase bei ungefähr 1.400 UpM und darauf Zusetzen der wäßrigen diskontinuierlichen Phase zur Öl-Phase in einer Strömungsgeschwindigkeit von 20 ml/Minute. Rühren der vereinigen Phasen bei 1.400 UpM für ungefähr 5–10 Minuten zur Bildung einer stabilen HIPE.
4. Herstellen eines wäßrigen Suspensionsmediums durch Kombinieren von 2 g Kaliumpersulfat und 3 g Kaolinit-Tonerde (Georgia Kaolin Co., Inc.) mit 1 Liter destilliertem Wasser. Rühren des Gemisches bei 700 UpM für ungefähr 15 Minuten und darauf Einstellen der Rührgeschwindigkeit auf 250 UpM.
5. Zusetzen der HIPE tropfenweise zum wäßrigen Suspensionsmedium in einer Strömungsgeschwindigkeit von 15 ml/Minute in einen 22 l Lurexreaktor (Modell Nr. LX62141008), bis die Suspension ungefähr 20% HIPE erreicht.
6. Zur Bildung von Mikrokügelchen Polymerisieren der Suspension durch Erhöhen der Temperatur auf 60°C über Nacht (ungefähr 18 Stunden) unter Rühren bei 250 UpM.
7. Waschen der sich ergebenden Mikrokügelchen fünf Mal mit Wasser und darauf Durchführen einer Aceton-Extraktion in einem Soxhlet-Extraktor für ungefähr einen Tag. Lufttrocknen lassen der Mikrokügelchen über Nacht. Die Schüttdichte des sich ergebenden Materials beträgt 0,055 g/ml getrockneter Mikrokügelchen.

B. Mikrokügelchen-Produktion unter Verwendung eines Öl-Phasen-Starters
Beispielhafte bevorzugte Mikrokügelchen werden gemäß der folgenden alternativen Vorschrift hergestellt. Die Endkonzentration jedes Bestandteils der HIPE und des wäßrigen Suspensionsmediums ist in Tabelle 3, Studie 7 dargestellt. Tabelle 3 zeigt ebenfalls Studien, bei denen die anschließende Vorschrift wie angezeigt variiert wurde. Die Ergebnisse dieser Studien sind in Tabelle 4 dargelegt.

1. In einem 1 Liter Becherglas Herstellen einer Öl-Phase durch Lösen von 0,4 g Ethylzellulose in 30 g Trichlorethan und Zusetzen von 20 g Styrol-basiertem Monomer, 19,5 g DVB, 22 g Span 80 und 0,9 g Lauroylperoxid. Vermischen der Bestandteile durch Rühren bei Raumtemperatur.
2. Anordnen des Becherglases unter einen Gifford-Wood-Homogenisiermischer (Modell 1-LV, im Handel erhältlich von Greerco, Hudson, NH) und Rühren bei 1.800 bis 4.800 UpM unter langsamem Zusetzen von 850 g entionisiertem Wasser zur Bildung einer HIPE.
3. In einem 2 Liter Glas Zylinderreaktor (von Ace Glass, Vineland, NJ) Herstellen eines wäßrigen Suspensionsmediums durch Kombinieren von 120 g Akazien-Gummi mit 800 g entionisiertem Wasser. Unter Rühren bei 100 UpM Erhitzen des Gemischs auf 60–70°C für ungefähr 15 Minuten und darauf Abkühlen des Gemisches auf ungefähr 40°C.
4. Zusetzen der HIPE zum wäßrigen Suspensionsmedium tropfenweise in einer Strömungsgeschwindigkeit von ungefähr 200 ml/Minute.
5. Einstellen der Mischgeschwindigkeit auf zwischen 10 UpM und 300 UpM, abhängig von der erwünschten Kügelchen-Größe.
6. Zur Bildung von Mikrokügelchen Polymerisieren der Suspension durch Anheben der Temperatur auf 45°C für ungefähr 20 Stunden unter konstantem Rühren.
7. Waschen der sich ergebenden Mikrokügelchen fünf Mal mit Wasser und darauf Durchführen einer Aceton-Extraktion gefolgt von einer Methanol-Extraktion in einem Soxhlet-Extraktor für jeweils ungefähr 18 Stunden. An der Luft trocknen lassen der Mikrokügelchen über Nacht.

Tabelle 4
Beispiel 2
Funktionalisierung von Mikrokügelchen zur Absorption von Säuren unter Verwendung von Amino-Gruppen
Diethylamin-funktionalisierte Mikrokügelchen werden aus Clormethylstyrol-Mikrokügelchen hergestellt, wie in Beispiel 1 beschrieben. Die Mikrokügelchen werden über Nacht luftgetrocknet und im Soxhlet für 15 Stunden mit 200 ml Hexan extrahiert, um übrige nicht polymerisierte Bestandteile zu entfernen. 5 g Mikrokügelchen werden dann unter Rückflußkühlung mit 150 ml wäßrigem Diethylamin für 20 Stunden erhitzt. Die sich ergebenden Diethy lamin-funktionalisierten Mikrokügelchen sind zu 85% substituiert und weisen eine Kapazität von 1,5 mM/g auf. Ein g dieses Materials absorbiert 20 ml 1 N Schwefelsäure.
Beispiel 3
Funktionalisierung von Mikrokügelchen zur Absorption von Säuren unter Verwendung von Aminosalzen
Um ein Dihexylammoniumsalz herzustellen werden Dihexylamin-funktionalisierte Mikrokügelchen wie oben in Beispiel 3 für Diethylamin-funktionalisierte Mikrokügelchen beschrieben hergestellt. 1 g Dimethylhexamin-funktionalisierte Mikrokügelchen werden darauf zu 100 ml methanolischer HCl zugesetzt und für 30 Minuten gerührt. Das Gegenion des sich ergebenden Salzes ist Chlorid. Die Dihexylammoniumchlorid-funktionalisierten Mikrokügelchen werden durch Filtration gesammelt, 3 mal mit 50 ml Methanol gewaschen und über Nacht luftgetrocknet. Die sich ergebenden Mikrokügelchen sind zu 70% substituiert.
Beispiel 4
Funktionalisierung von Mikrokügelchen zur Absorption von Säuren unter Verwendung quartärer Ammonium-Gruppen
Um ein Dimethyldecylammonium-Salz herzustellen werden Chlormethylstyrol-Mikrokügelchen wie in Beispiel 1 beschrieben hergestellt. Die Mikrokügelchen werden über Nacht luftgetrocknet und mit Hexan Soxhlet extrahiert um restliche nicht polymerisierte Bestandteile zu entfernen. 1 g Mikrokügelchen werden dann unter Vakuum mit einem 10-fach molarem Überschuß an ethanolischem Amin befällt und für 7 Stunden unter Rückflußkühlung erhitzt. Das Gegenion des sich ergebenden Salzes ist Chlorid. Die Dimethyldecylammoniumchlorid-funktionalisierten Mikrokügelchen werden durch Filtration gesammelt, 2 mal mit 50 ml Ethanol und 2 mal mit 50 ml Methanol gewaschen und darauf über Nacht luftgetrocknet. Die sich ergebenden Mikrokügelchen sind zu 70% substituiert.
Beispiel 5
Funktionalisierung von Mikrokügelchen zur Absorption wäßriger Lösungen unter Verwendung von Aminosalzen
Um ein Dimethylammonium-Salz herzustellen werden Diethylamino-funktionalisierte Mikrokügelchen wie in Beispiel 3 beschrieben hergestellt. Die Mikrokügelchen werden über Nacht luftgetrocknet und mit Hexan Soxhlet extrahiert, um restliche nicht polymerisierte Bestandteile zu entfernen. 1 g Mikrokügelchen werden dann zu 100 ml methanolischer HCl zugesetzt und für 30 Minuten gerührt. Das Gegenion des sich ergebenden Salzes ist Chlorid. Die Diethylaminchlorid-funktionalisierten Mikrokügelchen sind zu 85% substituiert.
Beispiel 6
Funktionalisierung von Mikrokügelchen zur Absorption wäßriger Lösungen unter Verwendung quartärer Ammonium-Gruppen
Um ein Dimethyldecylammonium-Salz herzustellen werden Chlormethylstyrol-Mikrokügelchen wie in Beispiel 1 beschrieben hergestellt. Die Mikrokügelchen werden über Nacht luftgetrocknet und mit Hexan Soxhlet extrahiert, um übrige nicht polymerisierte Bestandteile zu entfernen. 1 g Mikrokügelchen werden dann mit 100 ml wäßrigem Amin für 30 Minuten behandelt. Die sich ergebenden Dimethyldecylammoniumchlorid-funktionalisierten Mikrokügelchen sind zu 85% substituiert.
Beispiel 7
Funktionalisierung von Mikrokügelchen zur Absorption wäßriger Lösungen unter Verwendung von Alkoxylat-Gruppen
Ethoxylierte Mikrokügelchen werden aus Chlormethylstyrol-Mikrokügelchen wie in Beispiel 1 beschrieben hergestellt. Die Mikrokügelchen werden über Nacht luftgetrocknet und mit Hexan Soxhlet-extrahiert, um restliche nicht polymerisierte Bestandteile zu entfernen. 1 g Mikrokügelchen werden mit 100 ml der anionischen Form eines Polyethylenglykol (PEG) enthaltenden 8–9 Ethylenglykolmonomers in überschüssigem PEG als Lösungsmittel behandelt. Die Reaktionspartner werden für 2 Stunden auf 95°C erhitzt. Die sich ergebenden ethoxylierten Mikrokügelchen sind zu 90% substituiert.
Beispiel 8
Funktionalisierung von Mikrokügelchen zur Absorption wäßriger Lösungen unter Verwendung von Sulfonat-Gruppen
Sulfonat-funktionalisierte Mikrokügelchen werden aus Styrol-Mikrokügelchen hergestellt, die wie in Beispiel 1 beschrieben hergestellt wurden. Die Mikrokügelchen werden unter Vakuum bei 50°C für 2 Tage getrocknet. 10 g Mikrokügelchen werden dann einem 500 ml Kolben zugesetzt, der ein Gemisch aus 200 ml Chloroform und 50 ml Chlorsulfonsäure enthält. Der Kolben wird bei Raumtemperatur für 2 Tage geschüttelt. Die Sulfonat-funktionalisierten Mikrokügelchen werden durch Filtration gesammelt und nacheinander mit 250 ml jeweils von Chloroform, Methylenchlorid, Aceton und Methanol gewaschen. Die Mikrokügelchen werden in 300 ml 10% wäßrigem Natriumhydroxid über Nacht eingeweicht und darauf mit Wasser gewaschen, bis das Eluat einen neutralen pH erreicht. Die Schüttdichte des sich ergebenden Materials beträgt 0,067 g/ml getrockneter Mikrokügelchen und die Kapazität beträgt 2,5 mM/g. 1 g dieses Materials absorbiert 23,5 g Wasser.
Beispiel 9
Herstellung stabiler Kohlenstoff-Strukturen aus Chlormethylstyrol-Mikrokügelchen
3-Chlormethylstyrol Mikrokügelchen werden wie in Beispiel 1 beschrieben hergestellt, so dass die Konzentration des Vernetzungsmittels zwischen 20–40% und das Hohlvolumen 90% beträgt. 1 g Mikrokügelchen werden dann in einem elektrisch beheizten Rohrofen angeordnet und die Temperatur wird in einer sauerstofffreien Stickstoffatmosphäre auf 600°C erhitzt. Die Geschwindigkeit des Erhitzens wird im allgemeinen unter 5°C pro Minute gehalten und im Bereich von 180–380°C, wobei die Erhitzungsgeschwindigkeit 2°C pro Minute nicht über schreitet. Nach dem Erhitzungsprozeß werden die Mikrokügelchen auf Umgebungstemperatur in einer inerten Atmosphäre abgekühlt um eine Oxidation durch Luft zu vermeiden.
Beispiel 10
Herstellung von Gel-befüllten Mikrokügelchen zur Verwendung als Substrat für die Proteinsynthese
Mikrokügelchen mit einem Leervolumen von 90%, einer Schüttdichte von 0,047 g/ml, einem durchschnittlichen Hohlraumdurchmesser im Bereich von 1–50 μm und die zu 10% vernetzt sind, werden wie in Beispiel 1 beschrieben hergestellt. Das verwendete Gel ist Poly(N-(2-(4-acetoxyphenyl)ethylacrylamid). Um eine Lösung aus Gel-Vorläufern herzustellen, werden 2,5 g Monomer, 0,075 g des Vernetzungsmittels Ethylenbis(acrylamid) und 0,1 g des Starters AIBN zu 10 ml des Quellmittels Dichlorethan zugesetzt. Die Gel-Vorläuferlösung wird dann durch Durchspülen mit Stickstoff desoxygeniert.
0,7 g Mikrokügelchen werden der Gel-Vorläuferlösung zugesetzt und die Polymerisation wird durch Erhitzen des Gemisches auf 60°C gestartet, während die Probe auf einem Rotationsverdampfer, der für die Rückflußkühlung modifiziert wurde, rotiert wird. Das Dichlorethan quillt die Mikrokügelchen auf und ermöglicht es den Gel-Vorläufern, in das Mikrokügelchen einzudringen und ein Polyamid zu bilden, das zwischen die Polymer-Ketten des Mikrokügelchens eindringt. Nach einer Stunde werden die Gel-befüllten Mikrokügelchen (hierin nachstehend als „Gemisch") bezeichnet, mit 50 ml Dimethylformamid (DMF) und 50 ml Diethylether gewaschen und darauf vakuumgetrocknet. Die Ausbeute an Gemisch beträgt 2,7 g.
Um chemische Gruppen innerhalb des Gemisches zu erzeugen werden 0,25 g Gemisch mit 50 ml 5% Lösung Hydrazinhydrat in DMF für 5 Minuten behandelt. Diese Behandlung ergibt freie Phenol-Funktionalitäten innerhalb der Gel-Matrix, die als chemische Gruppen für die Peptidsynthese dienen können.
Beispiel 11
Verwendung von Mikrokügelchen in hochdichten Zellkulturen
Um Mikrokügelchen herzustellen, die für eine Säugetierzellkultur geeignet sind, werden sulfonierte Mikrokügelchen wie in Beispiel 8 beschrieben hergestellt und werden in einer 70% Ethanollösung befeuchtet und bei 121°C für 15 Minuten autoclaviert. Die Mikrokügelchen werden dann zwei Mal mit steriler Phosphat-gepufferter Salzlösung und einmal mit vollständigem Wachstumsmedium gewaschen. 500 mg der sterilen Mikrokügelchen werden in einer 500 ml Rollflasche angeordnet, die silikonisiert wurde, um eine Anlagerung der Zellen an der Flasche zu verhindern.
Ein Inoculum von 5 × 10⁷ Baby-Hamster-Nierenzellen in 50 ml Wachstumsmedium (das 10% fötales Kalbsserum enthält) wird der Rollflasche zugesetzt. Das Inoculum wird mit den Mikrokügelchen für 8 Stunden bei 37°C unter periodischem Schütteln inkubiert, um eine Anlagerung der Zellen an die Mikrokügelchen zu ermöglichen. Das Kulturvolumen wird dann auf 100 ml erhöht und die Rollflasche wird mit Luft-CO₂ (95 : 5) Gemisch begast und in einer Rollvorrichtung angeordnet. Das Wachstumsmedium wird ersetzt, wenn die Glukosekonzentration unter 1 g/l abfällt.
Die nachfolgenden bevorzugten Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung sind unten beschrieben:
Poröse vernetzte Polymer-Mikrokügelchen werden mit Hohlräumen ausgestattet, die durch miteinander in Verbindung stehende Poren verbunden sind, wobei zumindest einige der Hohlräume im Inneren jedes Mikrokügelchens mit der Oberfläche des Mikrokügelchens in Verbindung stehen, und wobei ungefähr 10% der Mikrokügelchen im wesentlichen kugelförmig oder im wesentlichen ellipsoidförmig oder eine Kombination hiervon sind, wobei die Mikrokügelchen derart funktionalisiert wurden, dass die funktionalisierten Mikrokügelchen wäßrige und/oder organische saure Flüssigkeiten absorbieren, wobei die funktionalisierten Mikrokügelchen die folgende Struktureinheit umfassen:
bei der
A eine vernetzte Kohlenstoff-Kette ist;
Y eine wahlweise Spacer-Gruppe ist; und
Z eine ionische oder polare funktionelle Gruppe ist;
(Ausführungsform 1).
In den funktionalisierten Mikrokügelchen von Ausführungsform 1 ist das Verhältnis der wäßrigen und/oder organischen Säure-Absorption durch die funktionalisierten Mikrokügelchen zur Methyloleat-Absorption größer als ungefähr 1,2.
In den funktionalisierten Mikrokügelchen von Ausführungsform 1 ist Z aus der Gruppe ausgewählt, die aus einer Amino- oder substituierten Amino-Gruppe, einer kationischen quartären Alkyl-Ammonium-Gruppe mit 8 oder mehr Kohlenstoffatomen, und einer kationischen quartären Ammonium-Alkylgruppe von 8 Kohlenstoffatomen oder weniger in Gegenwart eines Gegenions, d. h. einer organischen Gruppe, die 8 oder mehr Kohlenstoffatome enthält, besteht.
In den funktionalisierten Mikrokügelchen der Ausführungsform 1 umfaßt Z eine ionische oder polare funktionelle Gruppe, ausgewählt aus der Gruppe, die aus den Spezies 1–3 besteht:
wobei R₂, R₃, R₄, R₅ und R₆ gleich oder verschieden sein können und aus der Gruppe ausgewählt sind, die aus Alkyl, Cycloalkyl, Aryl, Hydroxyalkyl besteht; oder R₂ und R₃ den Teil eines Ringsystems bilden; und die Anzahl von Kohlenstoffatomen, die in R₄ + R₅ + R₆ vorliegt 10 oder mehr für ein kationisches quartäres Ammonium ist (3);
die Anzahl der Kohlenstoffatome, die in R₄ + R₅ vorliegen 8 oder mehr für ein Aminosalz (2) ist; und
das Gegenion X^– ein organisches oder anorganisches Ion ist.
In den funktionalisierten Mikrokügelchen von oben beträgt die Anzahl der Kohlenstoffatome, die in R₄ + R₅ + R₆ vorliegt weniger als 10 für ein kationisches quartäres Ammonium (3); die Anzahl der Kohlenstoffatome, die in R₄ + R₅ vorliegt weniger als 8 für ein Aminosalz (2) und ist das Gegenion eine organischen Gruppe mit 8 oder mehr Kohlenstoffatomen.
In den funktionalisierten Mikrokügelchen von Ausführungsform 1 ist der Vernetzungsgrad von 1 bis 20%.
In den funktionalisierten Mikrokügelchen von Ausführungsform 1 ist der Vernetzungsgrad von 2 bis 10%.
In den funktionalisierten Mikrokügelchen von Ausführungsform 1 ist das Hohlvolumen der Mikrokügelchen größer als 95%.
In den funktionalisierten Mikrokügelchen von Ausführungsform 1 ist Funktionalisierungsgrad größer als 50%.
Ausführungsform 2:
Poröse vernetzte Polymer-Mikrokügelchen werden mit Hohlräumen versehen, die durch miteinander in Verbindungen stehenden Poren verbunden sind, wobei zumindest einige der Hohlräume im Inneren jedes Mikrokügelchens mit der Oberfläche des Mikrokügelchen in Verbindung stehen, und wobei ungefähr 10% der Mikrokügelchen im wesentlichen kugelförmig oder im wesentlichen elipsoidförmig oder eine Kombination hiervon sind, wobei die Mikrokügelchen so funktionalisiert wurden, dass die funktionalisierten Mikrokügelchen wäßrige Flüssig keiten absorbieren, wobei die funktionalisierten Mikrokügelchen die folgende Struktureinheit umfassen:
bei der A eine vernetzte Kohlenstoff-Kette ist;
Y eine wahlweise Spacer-Gruppe ist; und
Z eine ionische oder polare funktionelle Gruppe ist;
In den funktionalisierten Mikrokügelchen von Ausführungsform 2 ist das Verhältnis von 10% Natriumchlorid-Absorption durch die funktionalisierten Mikrokügelchen zur Wasserabsorption größer als 0,1.
In den funktionalisierten Mikrokügelchen von oben ist das Verhältnis von 10% Natriumchlorid-Absorption zur Wasserabsorption größer als 0,5.
In den funktionalisierten Mikrokügelchen von oben ist das Verhältnis von 10% Natriumchlorid-Absorption zur Wasserabsorption größer als 0,7.
In den funktionalisierten Mikrokügelchen von Ausführungsform 2 ist Z aus der Gruppe ausgewählt, die aus einer kationischen quartären Alkyl-Ammoniumgruppe mit 10 Kohlenstoffatomen oder weniger, einer Aminosalz-Alkylgruppe mit 8 Kohlenstoffatomen oder weniger; einer Alkoxylat-Gruppe;
einem Metall-, Ammonium- oder substituiertem Ammonium-Salz einer Schwefelsäure-, Karbonsäure-, Phosphorsäure- oder Sulfonsäure-Gruppe besteht, außer dass, wenn Z eine Sulfonsäure ist, Y nicht die folgende Struktur aufweist:
wenn m = 0.
In den funktionalisierten Mikrokügelchen von Ausführungsform 2 umfasst Z eine ionische oder polare funktionelle Gruppe, ausgewählt aus der Gruppe, die aus den Strukturen 1–2 besteht:
bei denen R₂, R₃ und R₄ gleich oder verschieden sein können und aus der Gruppe ausgewählt sind, die aus einem Alkyl, Cycloalkyl, Aryl und Hydroxyalkyl besteht; oder R₂ und R₃ den Teil eines Ringsystems bilden; und die Anzahl von Kohlenstoffatomen, die in R₂ + R₃ + R₄ vorliegt weniger als 10 für ein kationisches quartäres Ammonium (1) beträgt;
die Anzahl von Kohlenstoffatomen, die in R₂ + R₃ vorliegt, weniger als 8 für ein Aminosalz (2) beträgt; und
das Gegenion X^– ein anorganisches Ion oder eine Carboxylat-Gruppe mit weniger als 8 Kohlenstoffatomen ist.
In den funktionalisierten Mikrokügelchen von Ausführungsform 2 ist Z eine Alkoxylat-Gruppe mit der Struktur
wobei p 1 bis 680 ist, und
und wobei R₅ eine Wasserstoff- oder eine Alkyl-Gruppe ist und M ein Metall, ein Ammonium- oder ein substituiertes Ammoniumkation ist.
In den funktionalisierten Mikrokügelchen von Ausführungsform 2 ist der Vernetzungsgrad von 1 bis 20%.
In den funktionalisierten Mikrokügelchen von Ausführungsform 2 ist der Vernetzungsgrad von 2 bis 10%.
In den funktionalisierten Mikrokügelchen von Ausführungsform 2 ist das Leervolumen bzw. Hohlraumvolumen der Mikrokügelchen größer als 95%.
In den funktionalisierten Mikrokügelchen von Ausführungsform 2 ist der Funktionalisierungsgrad größer als 50%.
Ausführungsform 3
Poröse vernetzte Polymer-Mikrokügelchen werden mit Hohlräumen versehen, die durch miteinander in Verbindung stehenden Poren verbunden sind, wobei zumindest einige der Hohlräume im Inneren jedes Mikrokügelchens mit der Oberfläche des Mikrokügelchens in Verbindung stehen, und wobei ungefähr 10% der Mikrokügelchen im wesentlichen kugelförmig oder im wesentlichen ellipsoid oder eine Kombination hiervon sind, wobei die Mikrokügelchen eine Kohlenstoff-haltige Struktur aufweisen.
In den Kohlenstoff-haltigen Mikrokügelchen von Ausführungsform 3 weisen die Mikrokügelchen ein Hohlraumvolumen von zumindest 90% und eine Trockendichte von weniger als 0,25 g/ccm auf.
Ausführungsform 4
Ist ein Trennverfahren, das folgendes umfasst:

(i) das Passieren einer Lösung, die zumindest zwei Bestandteile aufweist, durch poröse, vernetzte Polymer-Mikrokügelchen mit Hohlräumen, die durch miteinander in Verbindung stehenden Poren verbunden sind, wobei eine chemische Gruppe, die vorzugsweise mit einem der beiden Bestandteile interagiert, mit der Oberfläche der Mikrokügelchen verbunden ist; und
(ii) Trennen der beiden Bestandteile voneinander.

Im Verfahren nach Ausführungsform 4 ist das Trennverfahren eine Ionen-Austauschchromatographie.
Im Verfahren von Ausführungsform 4 ist die chemische Gruppe an die Oberfläche der Mikrokügelchen gebunden.
Im Verfahren nach Ausführungsform 4 ist die chemische Gruppe an ein Gel oder Prä-Gel innerhalb der Hohlräume der Mikrokügelchen gebunden.
Ausführungsform 5
Ist ein Verfahren, das das Durchleiten einer Lösung, die einen Reaktionspartner einschließt, durch poröse; vernetzte Polymer-Mikrokügelchen mit durch miteinander in Verbindung stehenden Poren verbundenen Hohlräumen umfasst, wobei eine chemische Gruppe, die mit dem Reaktionspartner interagiert, an die Oberfläche der Mikrokügelchen gebunden ist, und wobei die chemische Gruppe an die Oberfläche der Mikrokügelchen gebunden ist.
Im obigen Verfahren ist die chemische Gruppe an ein Gel oder Prä-Gel innerhalb der Hohlräume der Mikrokügelchen gebunden.
Ausführungsform 6
Poröse vernetzte Polymer-Mikrokügelchen werden mit Hohlräumen bereitgestellt, die durch miteinander in Verbindung stehenden Poren verbunden sind, wobei zumindest einige der Hohlräume im Inneren jedes Mikrokügelchens mit der Oberfläche des Mikrokügelchens in Verbindung stehen und wobei ungefähr 10% der Mikrokügelchen im wesentlichen kugelförmig oder im wesentlichen ellipsoid oder eine Kombination hiervon sind, wobei die Mikrokügelchen zusätzlich ein Gel oder Prä-Gel innerhalb der Hohlräume der Mikrokügelchen umfassen, wobei das Gel oder Prä-Gel eine chemische Gruppe umfasst, die mit einer chemischen Einheit interagiert, ausgewählt aus der Gruppe, die aus einem Bestandteil einer Lösung und einem Reaktionspartner in einer chemischen Synthese besteht.
Bei den Mikrokügelchen von Ausführungsform 6 bewegt sich die Hohlraum-Größe im Bereich von 1 bis 100 μm Durchmesser.
Bei den Mikrokügelchen von Ausführungsform 6 sind die Mikrokügelchen derart vernetzt, dass die Gegenwart einer Flüssigkeit das Aufquellen eines Mikrokügelchens das Trockenvolumen des Mikrokügelchens um nicht mehr als ungefähr zwei Mal überschreitet.
Bei den Mikrokügelchen von Ausführungsform 6 liegt das Gewichtsverhältnis von aufgequollenem Gel zum Mikrokügelchen im Bereich von 60 : 40 bis 95 : 5.
Ausführungsform 7
Ist ein Verfahren zur Herstellung von Mikrokügelchen, die ein Gel oder Prä-Gel aufweisen, das folgendes umfasst:

(a) Herstellen poröser, vernetzter Polymer-Mikrokügelchen mit Hohlräumen, die durch miteinander in Verbindung stehenden Poren verbunden sind und
(b) Ablagern und/oder Zurückhalten eines Gels oder Prä-Gels in den Mikrokügelchen-Hohlräumen;

Ausführungsform 8
Poröse vernetzte Polymer-Mikrokügelchen werden mit Hohlräumen versehen, die durch miteinander in Verbindung stehenden Poren verbunden sind, wobei zumindest einige der Hohlräume im Inneren jedes Mikrokügelchens mit der Oberfläche des Mikrokügelchens in Verbindung stehen, und wobei ungefähr 10% der Mikrokügelchen im wesentlichen kugelförmig oder im wesentlichen ellipsoid oder eine Kombination hiervon sind, wobei ein Molekül, ausgewählt aus der Gruppe, die aus einem Polypeptid und einem Oligonukleotid besteht, an die Oberfläche der Mikrokügelchen gebunden ist.
In den Mikrokügelchen von Ausführungsform 8 ist das Molekül ein Polypeptid, ausgewählt aus der Gruppe, die aus einem Antikörper, einem Lectin, einem Enzym und einem Hapten besteht.
In den Mikrokügelchen von Ausführungsform 8 ist das Molekül an die Oberfläche der Mikrokügelchen durch eine Art einer Bindung gebunden, ausgewählt aus der Gruppe, die aus einer nicht kovalenten Absorption, kovalenten Bindung und Bindung über ein Brückenmolekül besteht.

Claims

Poröse vernetzte polymere Mikrokügelchen mit durch Verbindungsporen verbundenen Hohlräumen, wobei mindestens einige der Hohlräume im Inneren jedes Mikrokügelchens mit der Oberfläche des Mikrokügelchens in Verbindung stehen, wobei die Mikrokügelchen ein Hohlraumvolumen von mindestens 70% aufweisen, und wobei mindestens 10% der Mikrokügelchen im Wesentlichen sphärisch oder im Wesentlichen ellipsoidförmig oder eine Kombination davon sind.
Mikrokügelchen nach Anspruch 1, wobei die Mikrokügelchen einen mittleren Durchmesser in dem Bereich von 5 μm bis 5 mm aufweisen.
Verfahren zur Herstellung poröser, vernetzter polymerer Mikrokügelchen, mit den Schritten: (a) Vereinigen (i) einer kontinuierlichen Ölphase, umfassend (1) ein im wesentlichen Wasser-unlösliches, monofunktionelles Monomer; (2) ein im wesentlichen Wasser-unlösliches, polyfunktionales Vernetzungsmittel; und (3) einen Emulgator, der zur Bildung einer stabilen Wasser-in-Öl-Emulsion geeignet ist; und (ii) einer wässrigen diskontinuierlichen Phase zur Bildung einer Emulsion, wobei die Emulsion mindestens 70% wässrige diskontinuierliche Phase aufweist; (b) Zugabe der Emulsion zu einem wässrigen Suspensionsmedium zur Bildung einer Öl-in-Wasser-Suspension dispergierter Emulsionströpfchen; (c) wobei (i) das wässrige Suspensionsmedium ein Suspensionsmittel und einen wasserlöslichen Polymerisationsinitiator aufweist, oder wobei (ii) die Ölphase einen öllöslichen Polymerisationsinitiator und einen Stabilisator aufweist, wobei der Stabilisator eine Film-bildende Verbindung zur Stabilisierung der Grenzfläche zwischen der wässrigen diskontinuierlichen Phase und dem wässrigen Suspensionsmedium ist, um die Emulsionströpfchen zu polymerisieren, um poröse vernetzte polymere Mikrokügelchen zu erzeugen, welche Hohlräume aufweisen, die durch Verbindungsporen verbunden sind, wobei mindestens einige der Hohlräume im Inneren jedes Mikrokügelchens mit der Oberfläche des Mikrokügelchens in Verbindung stehen, wobei die Mikrokügelchen ein Hohlraumvolumen von mindestens 70% aufweisen, und wobei mindestens 10% der Mikrokügelchen im wesentlichen sphärisch oder im wesentlichen ellipsoidförmig oder eine Kombination davon sind.
Verfahren nach Anspruch 3, wobei die Suspension gerührt wird, während die Emulsionströpfchen polymerisieren.
Verfahren nach Anspruch 3 oder 4, wobei die Ölphase zusätzlich einen Porenbildner aufweist.
Verfahren nach Anspruch 4 oder 5, wobei das wässrige Suspensionsmedium ein Suspensionsmittel aufweist, und wobei das wässrige Suspensionsmedium weiterhin einen wasserläslichen Polymerisationsinitiator aufweist, um die Emulsionströpfchen zu polymerisieren.
Verfahren nach Anspruch 4 oder 5, wobei die Ölphase einen öllöslichen Polymerisationsinitiator und einen Stabilisator aufweist, wobei der Stabilisator eine Film-bildende Verbindung zur Stabilisierung der Grenzfläche zwischen der wässrigen diskontinuierlichen Phase und dem wässrigen Suspensionsmittel ist, um die Emulsionströpfchen zu polymerisieren.
Verfahren nach Anspruch 6, umfassend einen wasserlöslichen Polymerisationsinitiator in dem wässrigen Suspensionsmedium.
Verfahren nach Anspruch 6 oder 8, umfassend einen Wasserlöslichen Polymerisationsinitiator in der wässrigen diskontinuierlichen Phase.
Verfahren nach Anspruch 6, 8 oder 9, umfassend einen Öllöslichen Potymerisationsinitiator in der Ölphase.
Verfahren nach einem der Ansprüche 3–10, wobei die Ölphase ein Monomer auf Styrolbasis aufweist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 3–10, wobei das Monomer in der Ölphase mit einer Konzentration in dem Bereich von 5 bis 90 Gew.-% vorliegt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 3–10, wobei die Ölphase ein Gemisch monofunktionaler Monomere aufweist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 3–10, wobei die Ölphase ein Vernetzungsmittel aufweist, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus einer Divinylbenzol-Verbindung, einer Di- oder Triacryl-Verbindung und einem Triallylisocyanurat.
Verfahren nach einem der Ansprüche 3–10, wobei das Vernetzungsmittel in der Ölphase in einer Konzentration in dem Bereich von 1 bis 90 Gew.-% vorliegt.
Verfahren nach Anspruch 15, wobei das Vernetzungsmittel in der Ölphase in einer Konzentration in dem Bereich von 15 bis 50 Gew.-% vorliegt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 3–10, wobei die Ölphase ein Gemisch polyfunktionaler Vernetzungsmittel aufweist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 3–10, wobei der Emulgator ein Mittel aufweist, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus einem Sorbitan-Fettsäureester, einem Polyglycerol-Fettsäureester und einer Polyoxyethylen-Fettsäure oder -ester.
Verfahren nach einem der Ansprüche 3–10, wobei der Emulgator in der Ölphase in einer Konzentration in dem Bereich von 3 bis 50 Gew.-% vorliegt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 3–6 und 8–10, wobei der wasserlösliche Polymerisationsinitiator ein Peroxid-Initiator ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 3–6 und 8–10, wobei der wasserlösliche Polymerisationsinitiator in einer Konzentration von bis zu 5 Gew.-% vorliegt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 3–5, 7 und 10, wobei der öllösliche Polymerisationsinitiator aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus einem Azo-Initiator und einem Peroxid-Initiator.
Verfahren nach Anspruch 22, wobei der öllösliche Initiator aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus AIBN, Benzoyl-peroxid, Lauroylperoxid und einem VAZO-Initiator.
Verfahren nach einem der Ansprüche 3–5, 7 oder 10, wobei der öllösliche Polymerisationsinitiator in der Ölphase in einer Konzentration von bis zu 5 Gew.-% des gesamten polymerisierbaren Monomers vorliegt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 5–10, wobei der Porenbildner eine Verbindung umfasst, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Dodecan, Toluol, Cyclohexanol, n-Heptan, Isooctan und Petrolether.
Verfahren nach einem der Ansprüche 5–10, wobei der Porenbildner in der Ölphase in einer Konzentration in dem Bereich von 10 bis 60 Gew.-% vorliegt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 3–10, wobei die Öl-in-Wasser-Suspension einen zur Erzeugung einer stabilen Suspension geeigneten Anteil einer Emulsion mit großer innerer Phase umfasst.
Verfahren nach einem der Ansprüche 3–6 und 8–10, wobei das Suspensionsmittel ein Mittel umfasst, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus einem wasserlöslichen Polymer und einem wasserunlöslichen anorganischen Feststoff.
Verfahren nach Anspruch 28, wobei das Suspensionsmittel ein Mittel aufweist, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Gelatine, einem natürlichen Gummi und Cellulose.
Verfahren nach Anspruch 29, wobei das Suspensionsmittel ein Akaziengummi ist.
Verfahren nach Anspruch 28, wobei das Suspensionsmittel einen fein verteilten, wasserunlöslichen anorganischen Feststoff aufweist, der zur Erhöhung seiner Hydrophobizität modifiziert wurde.
Verfahren nach Anspruch 28, wobei das Suspensionsmittel in dem wässrigen Suspensionsmedium in einer Konzentration von 0,1 bis 30 Gew.-% vorliegt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 3–10, wobei die Suspension gebildet wird durch Zugabe einer Emulsion zu dem wässrigen Suspensionsmedium, während eine ausreichende Scherbewegung ausgeübt wird, um eine stabile Suspension zu erzeugen.
Verfahren nach einem der Ansprüche 3–5 und 7, wobei der Stabilisator einen natürlichen oder synthetischen polymeren Stabilisator umfasst.
Verfahren nach Anspruch 34, wobei der polymere Stabilisator ein Cellulosederivat umfasst.
Verfahren nach Anspruch 34, wobei der polymere Stabilisator ein Mittel umfasst, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Methylcellulose, Ethylcellulose und teilweise hydrolysiertem Poly(vinylalkohol).
Verfahren nach einem der Ansprüche 3–5 und 7, wobei der polymere Stabilisator in der Ölphase in einer Konzentration in dem Bereich von 0,01 bis 15 Gew.-% vorliegt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 3–5 und 7, wobei der Stabilisator in einem inerten Lösungsmittel gelöst ist, bevor er zu der Ölphase gegeben wird.
Verfahren nach Anspruch 38, wobei das inerte Lösungsmittel aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus Trichlorethan, Toluol und Chloroform.
Verfahren nach einem der Ansprüche 3–10, wobei die Emulsion 70% bis 98% wässrige diskontinuierlicher Phase umfasst.
Verfahren nach Anspruch 40, wobei die Emulsion 75% bis 95% wässrige diskontinuierliche Phase umfasst.
Verfahren nach Anspruch 41, wobei die Emulsion 80% bis 90% wässrige diskontinuierliche Phase umfasst.
Verfahren nach Anspruch 10, wobei die Ölphase umfasst: (a) Styrol als das Monomer; (b) Divinylbenzol als das Vernetzungsmittel; (c) Sorbitanmonooleat als den Emulgator; (d) Dodecan als den Porenbildner; (e) Azoisobisbutyronitril als den öllöslicher Initiator; die wässrige diskontinuierliche Phase umfasst: (f) Kaliumpersulfat; das wässrige Suspensionsmedium umfasst: (g) Kaliumpersulfat als den wasserlöslichen Polymerisationsinitiator; und (f) das Suspensionsmittel ein Mittel umfasst, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Gelatine, einem natürlichen Gummi und Cellulose.
Verfahren nach Anspruch 39, wobei die Ölphase umfasst: (a) Styrol als das Monomer; (b) Divinylbenzol als das Vernetzungsmittel; (c) Lauroylperoxid als den öllöslichen Initiator; (d) Trichlorethan als das inerte Lösungsmittel; (e) Sorbitanmonooleat als den Emulgator; und (f) Ethylcellulose als den polymeren Stabilisator; und (g) die wässrige diskontinuierliche Phase einen Polymerisationsinitiator nicht enthält; und (h) das Suspensionsmedium Akaziengummi umfasst und einen Polymerisationsinitiator nicht enthält.
Verfahren nach Anspruch 3, weiterhin umfassend das Erwärmen der Mikrokügelchen in einer inerten Atmosphäre auf eine Temperatur von mindestens 500°C, um Kohlenstoffhaltige Mikrokügelchen zu erzeugen.
Mikrokügelchen nach Anspruch 1, weiterhin umfassend eine an die Oberfläche der Mikrokügelchen gebundene chemische Gruppe.
Verwendung von Mikrokügelchen nach Anspruch 46 zur Trennung von Komponenten durch: (i) Passieren einer Lösung mit mindestens zwei Komponenten durch die Mikrokügelchen von Anspruch 46, wobei eine der zwei Komponenten vorzugsweise mit der an die Oberfläche der Mikrokügelchen gebundenen chemischen Gruppe wechselwirkt; und (ii) Trennen der zwei Komponenten voneinander.
Verwendung von Mikrokügelchen gemäß Anspruch 46, umfassend Passieren einer Lösung, die einen Reaktant enthält, durch die Mikrokügelchen von Anspruch 46, wobei die an die Oberfläche der Mikrokügelchen gebundene chemische Gruppe mit dem Reaktant wechselwirkt.
Verfahren nach Anspruch 3, weiterhin umfassend das Ablagern und Festhalten eines Gels oder Pre-Gels in den Hohlräumen der Mikrokügelchen.
Verwendung von Mikrokügelchen nach Anspruch 1, umfassend (a) Inkontaktbringen der Mikrokügelchen von Anspruch 1 mit Zellen, und (b) Bewegen der Mikrokügelchen.
Mikrokügelchen nach Anspruch 1, wobei die Schüttdichte der Mikrokügelchen in dem Bereich von weniger als 0,2 g/ml liegt.
Mikrokügelchen nach Anspruch 1, wobei die Schüttdichte der Mikrokügelchen in dem Bereich von weniger als 0,10 g/ml liegt.
Mikrokügelchen nach Anspruch 1, wobei die Mikrokügelchen ein Hohlraumvolumen von mindestens 90% aufweisen.