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Gebiet der
Erfindung
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Diese Erfindung betrifft Materialien
und Verwendungen solcher Materialien zur Reparatur und Regeneration
vieler verschiedener Gewebe an einer einzigen Defektstelle in einem
Säugetier.
Die Erfindung betrifft insbesondere Materialien und Verwendungen
solcher Materialien zur Herstellung autogener bzw. autologer Ersatzkörperteile
in vivo, einschließlich
von Skelettgelenken, die viele unterschiedliche Gewebe umfassen,
wie beispielsweise Bänder,
Gelenkknorpel und Knochengewebe.
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Hintergrund
der Erfindung
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Skelettgelenke stellen eine bewegliche
Einheit von zwei oder mehr Knochen dar. Synovial-Gelenke bzw. echte Gelenke sind hochentwickelte
Gelenke, die eine freie Bewegung ermöglichen. Weil die unteren Gliedmaßen der
Säugetiere
mit der Bewegung befasst sind und die oberen Gliedmaßen eine
Vielfalt von Bewegungen bereitstellen, sind die meisten der Gelenke
in den Extremitäten
vom Synovial-Typ. Es existieren verschiedene Typen von Synovial-Gelenken
bzw. echten Gelenken bzw. Junctura synovialis. Ihre Klassifikation beruht
auf dem Typ der tatsächlichen
Bewegung, die sie ermöglichen
(uniaxial, biaxial und polyaxial). Sie werden gemäß ihren
morphologischen Hauptmerkmalen unterschieden (Gelenk, Achse, condylär). Im Gegensatz zu
fibrösen
und knorpelartigen Gelenken, bei denen die Enden der Knochen in
Durchgängigkeit
mit dazwischenliegendem Gewebe zu finden sind, werden die Enden
der Knochen in einem echten Gelenk zwar in Berührung gebracht, sind jedoch
getrennt. Weil die Knochen innen nicht gebunden sind, ergibt sich
die Integrität bzw.
Vollständigkeit
eines echten Gelenkes aus seinen Bändern und der Kapsel (die das
Gelenk extern bindet) und in gewissem Ausmaß aus den umgebenden Muskeln.
Bei echten Gelenken sind die benachbarten Knochenoberflächen mit
einem Gelenk- oder Hyalin-Knorpel bedeckt und die Gelenkhöhle wird
von einer Bindegewebskapsel umgeben, die das Gelenk von der es umgebenden
vaskularisierten Umgebung abtrennt. Die Innenoberfläche der
Kapsel ist von einer Synovial-Schicht oder „Membran" ausgekleidet, die Zellen enthält, die in
die Sekretion der viskosen, gleitfähig machenden Synovial-Flüssigkeit
bzw. Gelenkflüssigkeit
involviert sind. Gray, Anatomy of the Human Body, Seiten 312; 333–336 (13.
Ausgabe; C. C. Clemente, Hsg. (1985)).
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Bei bestimmten echten Gelenken kann
die Gelenk- oder Synovial-Höhle
durch einen Meniskus aus einem Faserknorpel unterteilt sein. Die
echten Gelenke, die zwei Knochen einschliessen und die eine einzige Gelenkhöhle enthalten,
werden als einfache Gelenke bezeichnet. Gelenke, die einen Meniskus
enthalten, der zwei Höhlen
ausbildet, werden als zusammengesetzte Gelenke bezeichnet. Der Begriff „zusammengesetzte Verbindung" wird für solche
Gelenke verwendet, bei denen mehr als ein einzelnes Paar an Gelenkoberflächen vorliegt.
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Der Gelenkersatz, insbesondere der
echte Gelenkersatz, ist ein üblich
durchgeführtes
Verfahren in der orthopädischen
Chirurgie. Jedoch ist das ideale Material zum Ersatz von Gelenken
nach wie vor schwer fassbar. Typischerweise erfordert die Gelenkrekonstruktion
die Heilung des Knochendefektes, des Gelenkknorpels und zusätzlich einer
oder mehrerer der verbindenden Bänder.
Bis jetzt existiert kein zufriedenstellendes klinisches Mittel zur
einfachen Reparatur sowohl des Skelettknorpels als auch von Knochendefekten
innerhalb eines Gelenkes, das zuverlässig lebensfähige, voll
funktionsfähige
und Gewicht tragende Gelenke zur Folge hat. Prothesen-Gelenke, die
alle endogenen Gelenk-Gewebe ersetzen, umgehen diese Probleme. Jedoch
weisen Prothesen-Gelenke zahlreiche, wohl dokumentierte Beschränkungen
auf, insbesondere bei jüngeren
und hoch aktiven Patienten. Zusätzlich
ist unter einigen Umständen
ein prothetischer Gelenkersatz nicht möglich und die Reparaturoptionen
sind auf Osteochondro-Allotransplantatmaterialien beschränkt.
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Der Gelenk- oder Hyalin-Knorpel,
der am Ende der Gelenk-Knochen zu finden ist, ist ein spezialisiertes,
histologisch ausgeprägtes
Gewebe und ist für
die Verteilung der Belastungsbeständigkeit gegenüber Druckkräften verantwortlich,
und für
das glatte Gleiten, das Teil der Gelenkfunktion ist. Der Gelenk-Knorpel weist
geringe oder keine selbstregenerierenden Eigenschaften auf. Somit
wird, wenn der Gelenk-Knorpel zerrissen oder in seiner Dicke abgenutzt
oder in anderer Weise als Funktion der Zeit, einer Erkrankung oder
einer Verletzung geschädigt
wird, seine Fähigkeit,
die darunterliegende Knochenoberfläche zu schützen, beeinträchtigt.
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Andere Knorpeltypen in Skelett-Gelenken
schließen
Faserknorpel und elastischen Knorpel ein. Sekundäre knorpelartige Gelenke werden
durch Scheiben eines Faserknorpels gebildet, die die Wirbel in der
Wirbelsäule
verbinden. Im Faserknorpel ist das Mucopolysaccharid-Netzwerk mit hervortretenden
Kollagen-Bündeln
durchflochten und die Chondrozyten bzw. Knorpelzellen sind breiter
verstreut als im Hyalin-Knorpel. Elastischer Knorpel enthält Kollagenfasern,
die histologisch Elastin-Fasern ähnlich
sind. Wie bei anderen Bindegeweben ist die Bildung von knorpelartigem
Gewebe ein komplexes biologisches Verfahren, das die Interaktion von
Zellen und Kollagenfasern in einem einzigartigen biochemischen Milieu
einschließt.
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Knorpelgewebe, einschließlich Gelenkknorpel,
fehlt anders als Bindegeweben Blutgefäße, Nerven, Lymphgefäße und Basalmembran.
Der Knorpel ist aus Knorpelzellen zusammengesetzt, die ein reichliches
extrazelluläres
Milieu synthetisieren, zusammengesetzt aus Wasser, Kollagenen, Proteoglycanen
und nicht-kollagenösen
Proteinen und Lipiden. Kollagen dient dazu, Proteoglycane einzufangen
und um dem Gewebe eine Zugfestigkeit zu verleihen. Typ-II-Kollagen
ist im Knorpelgewebe das vorherrschende Kollagen. Die Proteoglycane
sind aus einer variablen Anzahl von Glycosaminoglycan-Ketten, Keratinsulfat,
Chrondroitinsulfat und/oder Dermatansulfat und N-gebundenen und
O-gebundenen Oligosacchariden zusammengesetzt, die kovalent an einem
Proteinkern gebunden sind. Die sulfatierten Glycosaminoglycane sind
negativ geladen, was einen osmotischen Quelldruck zur Folge hat,
der Wasser einzieht.
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Im Gegensatz hierzu sind bestimmte
Kollagene, wie beispielsweise die fibrotischen knorpelartigen Gewebe,
die beispielsweise in Narbengewebe auftreten, Keloid- und typischerweise
Narbentypgewebe, d. h. aus Kapillarien und reichlichen, irregulären dysorganisierten
Bündeln
aus Typ-I- und Typ-II-Kollagen zusammengesetzt.
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Histologisch gesehen können Gelenk-
oder Hyalin-Knorpel von anderen Formen von Knorpel unterschieden
werden, sowohl durch ihre Morphologie als auch durch ihre Biochemie.
Morphologisch gesehen ist Gelenkknorpel durch Oberflächen- gegen
Mittel- gegen Tiefe- „Zonen" gekennzeichnet,
die eine charakteristische Abstufung von Merkmalen von der Oberfläche des
Gewebes zur Basis des Gewebes, das an den Knochen angrenzt, zeigen.
In der oberflächlichen
Zone beispielsweise sind die Knorpelzellen abgeflacht und liegen zur
Oberfläche
parallel eingebettet in einem extrazellulären Netzwerk, das tangential angeordnetes
Kollagen und wenige Proteoglycane enthält. In der mittleren Zone sind
die Chondrozyten kugelförmig
und sind von einem extrazellulären
Netzwerk umgeben, das reich an Proteoglycanen und abgestuft organisierten
Kollagenfasern ist. In der tiefen Zone, nahe dem Knochen, sind die
Kollagenfasern vertikal orientiert. Die Konzentration der Keratinsulfat-reichen
Proteoglycane erhöht
sich mit zunehmendem Abstand von der Knorpeloberfläche. Für eine ausführliche
Beschreibung einer Gelenk-Knorpel-Mikrostruktur, siehe beispielsweise
(Aydelotte und Kuettner (1988), Conn. Tiss. Res. 18: 205; Zanetti
et al. (1985), J. Cell Biol. 101: 53; und Poole et al., (1984), J.
Anat. 138: 13.
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Biochemisch gesehen kann Gelenk-Kollagen
durch das Vorhandensein von Typ-II- und Typ-IX-Kollagen ebenso wie durch das Vorliegen
von wohl charakterisierten Proteoglycanen und durch die Abwesenheit von
Typ-X-Kollagen identifiziert werden, die mit einer Ersatzknochenbildung
assoziiert ist.
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Bei dem normalen Gelenkknorpel existiert
ein Gleichgewicht zwischen Synthese und Zerstörung des oben beschriebenen
extrazellulären
Netzwerks. Jedoch tritt bei Gewebe, das einer wiederholten Verletzung unterworfen
wird, beispielsweise einer, die auf eine Reibung zwischen schlecht
aneinander ausgerichteten Knochen zurückzuführen ist, die miteinander in
Berührung
stehen, oder bei Gelenk-Erkrankungen, die durch einen Netto-Verlust
von Gelenk-Knorpel
gekennzeichnet sind, beispielsweise Osteoarthritis, ein Ungleichgewicht
zwischen Synthese und Abbau auf.
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Zwei Typen von Defekten werden in
Gelenk-Oberflächen
erkannt, d. h. Defekte mit volle-Dicke-
und Oberflächendefekten.
Diese Defekte unterscheiden sich nicht nur im Ausmaß der physischen
bzw. physikalischen Schädigung
des Knorpels sondern auch in der Natur der Heilungs-Reaktion, die
jede Verletzungsart zeigen kann.
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Defekte der Gelenkoberfläche in voller
Dicke schließen
eine Schädigung
des Hyalin-Knorpels,
der kalzifizierten Knorpel-Schicht und des subchondralen Knochen-Gewebes
mit seinen Blutgefäßen und
Knochenmark ein. Voll-Dicke-Defekte können ernsthaften Schmerz verursachen,
weil die Knochenplatte sensorische Nervenenden enthält. Solche
Defekte entstehen im Allgemeinen aus schweren Verletzungen und/oder
während
der späten
Stadien einer degenerativen Gelenkerkrankung wie beispielsweise
einer Osteoarthritis. Voll-Dicke-Defekte
können
gelegentlich zu einer Blutung führen
und zur Induktion einer Heilungsreaktion aus dem subchondralen Knochen.
In einigen Fällen
jedoch ist das gebildete Reparaturgewebe bzw. Ersatzgewebe ein vaskularisierter
faseriger bzw. fibröser
Knorpeltyp mit nicht ausreichenden biomechanischen Eigenschaften
und persistiert nicht auf einer Langzeitbasis.
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Im Gegensatz hierzu sind Oberflächendefekte
im Gelenkknorpel-Gewebe auf das Knorpelgewebe selbst beschränkt. Solche
Defekte sind berüchtigt,
weil sie nicht abheilen und keine Neigung zu Heilungsreaktionen
zeigen. Oberflächliche
Defekte können
als Fissuren, Soden oder Spalten in der Oberfläche des Knorpels auftreten
oder sie können
ein „Krebsfleisch"-Aussehen im betroffenen
Gewebe aufweisen. Sie enthalten keine Blutgefäße (Blut-Spots), wie sie beispielsweise
in Defekten mit voller Dicke ersichtlich sind. Oberflächliche
Defekte mögen
keine bekannte Ursache aufweisen, sie sind jedoch oftmals Ergebnis
mechanischer Fehlanordnungen, die zur Abnutzung des Knorpelgewebes
führen.
Solche mechanischen Fehlanordnungen können durch eine Verletzung
des Gelenkes, beispielsweise durch eine Ablösung von Tomo-Meniskus-Gewebe
in das Gelenk, Meniskektomie, eine Laxation des Gelenkes durch ein
gerissenes Band, eine Fehlausrichtung von Gelenken, Knochenfraktur
oder Erbkrankheiten verursacht sein. Oberflächliche Defekte sind ebenfalls
durch frühe
Stadien von degenerativen Gelenk-Erkrankungen, wie beispielsweise
einer Osteoarthritis, gekennzeichnet. Weil das Knorpelgewebe nicht
innerviert oder vaskularisiert ist, heilen oberflächliche
Defekte nicht und degenerieren oftmals zu Defekten mit voller Dicke.
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Ein Ersatz mit Prothesen-Gelenken
ist üblicherweise
die bevorzugte Option für
eine ernsthafte Degeneration einer Gelenk-Funktion, die den Verlust
an Gelenk-Knorpel mit einschließt.
Es wird angenommen, dass ein Mittel zur funktionellen Rekonstruktion
von Gelenk-Komplexen, einschließlich
der Regeneration und Heilung von Gelenkknorpel, einen tiefgreifenden
Effekt auf die alloplastische Gelenks-Ersatzchirurgie und die Behandlung
degenerativer Gelenk-Erkrankungen haben würde.
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Wie auch Gelenkknorpel, weisen Gelenk-Bänder, die
zur Verbindung interagierender Knochen im Gelenk dienen, nur geringe
oder keine selbst regenerativen Eigenschaften auf. Bänder sind
typischerweise aus im wesentlichen parallelen Bündeln von weißem fibrösem Bindegewebe
zusammengesetzt. Sie sind biegsam und flexibel und ermöglichen
eine im Wesentlichen vollständige
Bewegungsfreiheit, sind jedoch undehnbar, um eine Überdehnung der
interagierenden Knochen im Gelenk zu vermeiden. Wie Knorpel fehlen
dem Bändergewebe
im Wesentlichen Blutgefäße und es
weist nur geringe oder nicht vorhandene selbstregenerative Eigenschaften
auf. Die chirurgische Heilung von Tomo- oder geschädigtem Band-Gewebe
ist bis heute auf die Verwendung autogener bzw. autologer Transplantate
oder synthetischer Materialien beschränkt, die chirurgisch an den
Gelenkextremitäten
des Knochens befestigt werden. Allogene Ligamente versagen typischerweise
mechanisch, was vermutlich auf die Behandlungen zurückzuführen ist,
die dazu erforderlich sind, um diese Materialien biokompatibel zu
machen. In ähnlicher
Weise sind Sehnen Seil- bzw. Tau-artige Strukturen, die Muskelfasern
an Knochen oder Knorpel binden und die aus im wesentlichen parallelen
Fibroiden aus weißem Bindegewebe
gebildet sind. Die Synovialkapsel bzw. Gelenkkapsel ist aus einer
dünnen
Schicht aus bandartigem Gewebe zusammengesetzt, das das Gelenk einschließt und es
dem Gelenk ermöglicht,
in der gleitfähig machenden
Gelenkflüssigkeit
gebadet zu werden. Das Innere der Gelenkkapsel ist mit einer dünnen Membrane
aus Bindegewebe ausgekleidet, die verzweigte Bindegewebskörperchen
aufweist, die die Synovialmembran definieren, und die in erster
Linie zur Absonderung bzw. Sezernierung von Synovialflüssigkeit
in den Hohlraum bzw. die Höhle
verantwortlich ist. Die Integrität
dieser Membran ist deswegen zur Gewährleistung einer Quelle für die gleitfähig machenden
Synovialflüssigkeit
von Bedeutung. Eine Heilung dieser Gewebe im orthopädischen
Kontext ist typischerweise auf die erneute Vernähung von existierendem Gewebe
beschränkt.
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Knochengewebe unterscheidet sich
von den anderen hierin vorstehend beschriebenen Geweben signifikant,
einschließlich
von Knorpelgewebe. Insbesondere ist Knochengewebe vaskularisiertes
Gewebe, zusammengesetzt aus Zellen und einem zweiphasigen Medium,
das aus einem mineralisierten, anorganischen Bestandteil (in erster
Linie Hydroxidapatit-Kristalle)
und einem organischen Bestandteil zusammengesetzt ist, der in erster
Linie Typ-I-Kollagen
umfasst. Glycosaminoglycane bilden weniger als 2% dieses organischen
Bestandteils und weniger als 1% des zweiphasigen Mediums selbst
oder von Knochengewebe per se. Überdies liegt,
bezüglich
Knorpelgewebe, das Kollagen, das im Knochengewebe vorliegt, in einer
hoch organisierten parallelen Anordnung vor.
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Knochendefekte, gleichgültig, ob
mit degenerativer, traumatischer oder kanzeröser Äthiologie, stellen eine beachtliche
Herausforderung für
den rekonstruktiven Chirurgen dar.
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Insbesondere ist die Rekonstruktion
oder Reparatur von Skelettteilen schwierig, die Teil eines Multigewebs-Komplexes
sind, wie es beispielsweise bei Säugetiergelenken der Fall ist.
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Säugetier-Knochengewebe
enthält
bekanntermaßen
ein oder mehrere proteinartige Materialien, die vermutlich während Wachstum
und natürlicher
Knochenheilung aktiv sind, und die eine Entwicklungskaskade zellulärer Ereignisse
induzieren können,
die eine Ersatzknochenbildung zur Folge haben. Die Entwicklungskaskade,
die in die Ersatzknochendifferenzierung involviert ist, besteht
aus einer Chemotaxis mesenchymaler Zellen, der Proliferation von
Vorläuferzellen
zu Knorpelzellen und Osteoblasten, einer Differenzierung von Knorpel,
einer vaskulären
Invasion, Knochenbildung, Umformung und letztendlich einer Marksdifferentiation.
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Echte osteogene bzw. osteogenetische
Faktoren, die zum Induzieren der oben beschriebenen Kaskade von
Ereignissen in der Lage sind, die eine Ersatzknochenbildung zur
Folge haben, wurden nunmehr identifiziert, isoliert und kloniert.
Diese Proteine, die in der Natur als Disufid-verbrückte dimere
Proteine auftreten, werden in der Technik als „osteogene" Proteine, „osteoinduktive" Proteine und „Knochen-morphogenetische" Proteine bezeichnet.
Gleichgültig,
ob natürlich
vorkommend oder synthetisch hergestellt, sind diese osteogenen Proteine,
wenn sie in ein Säugetier
typischerweise in Verbindung mit einem Substrat implantiert werden, das
die Bindung, Proliferation und Differentiation von migratorischen
Vorläuferzellen
ermöglicht,
zum Induzieren einer Rekrutierung empfänglicher Vorläuferzellen
und zu einer Stimulierung deren Proliferation, zur Induktion der
Differenzierung zu Knorpelzellen und Osteoblasten und weiter zu
einer Induzierung der Differentiation von intermediärem Knorpel,
einer Vaskularisierung, Knochenbildung, Umformung und zuletzt zu
einer Marks-Differentiation in der Lage. Diese Proteine werden als
Mitglieder der Vgr-1/0P1-Proteinunterfamilie der TGPß-Supergen-Familie
strukturell verwandter Proteine bezeichnet. Mitglieder schließen die
Proteine ein, die in der Technik als OP1(BMP-7), OP2(BMP-8), BMP2,
BMP3, BMP4, BMP5, BMP6, 60A, DPP, Vgr-1 und Vgl beschrieben werden.
Siehe beispielsweise
US 5 011
691 ;
US 5 266 683 ,
Ozkaynak et al. (1990) EMBO J. 9: 2085–2093, Wharton et al. (1991)
PNAS 88: 9214–9218);
(Ozkaynak (1992) J. Biol. Chem. 267: 25220–25227 und
US 5 266 683 ); (Celeste et al. (1990)
PNAS 87: 9843–9847);
(Lyons et al. (1989) PNAS 86: 4554–4558). Diese Offenbarungen
beschreiben die Aminosäure-
und DNA-Sequenzen, ebenso wie die chemischen und physikalischen
Eigenschaften dieser Proteine. Siehe ebenfalls (Wozney et al. (1988)
Science 242: 1528– 1533);
BMP 9(WO93/00432, veröffentlicht
am 7. Januar 1993); DPP (Padgett et al. (1987) Nature 325: 81–84; und
Vg-1(Weeks(1987) Cell 51: 861–867).
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Es ist eine Aufgabe der vorliegenden
Erfindung, eine bioresorbierbare Matrix und Vorrichtung bereitzustellen,
die zum Regenerieren von Körperteilen
geeignet ist, die zwei oder mehr funktionell und strukturell verbundene,
jedoch verschiedene Ersatzgewebe in einem Säugetier umfassen. Es ist eine
weitere Aufgabe, Zusammensetzungen und Verwendungen solcher Zusammensetzungen
zur Heilung oder vollständigen
Wiederherstellung eines mechanisch und funktionell lebensfähigen Skelett-Gelenkes
in einem Säugetier,
insbesondere eines Gelenks oder Synovial-Gelenkes, ebenso wie anderer
Körperteile
bereitzustellen, die Knochen und bona fide Hyalin-Knorpel umfassen,
ohne auf Prothesen-Vorrichtungen angewiesen zu sein. Es ist eine weitere
Aufgabe, Materialien und Verwendungen solcher Materialien zur Heilung
von Gewebsdefekten in einem Säugetiergelenk
bereitzustellen, um ein mechanisch und funktionell lebensfähiges Gelenk
zu bilden, das Knochen- und Gelenkknorpel, Band, Sehne, Synovialmembran
und synoviales Kapselgewebe umfasst. Es ist eine weitere Aufgabe
der vorliegenden Erfindung, ein Mittel zur Wiederherstellung von
funktionellem nicht-mineralisiertem Gewebe in einem Skelett-Gelenk bereitzustellen,
einschließlich
des darin vorliegenden avaskulären
Gewebes.
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Zusammenfassung
der Erfindung
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Gemäß der vorliegenden Erfindung
werden Vorrichtungen zur Herstellung eines lebenden autogenen Ersatzteiles
bereitgestellt, das vielfache getrennte bzw. verschiedene Gewebe
umfasst. Bei einem Aspekt schließt der Ersatzkörperteil
ein gesamtes Säugetierskelett-Gelenk
oder einen Teil hiervon ein, einschließlich ein echtes oder Synovial-Gelenk.
Wie hierin nachstehend beschrieben, sind die Zusammensetzungen der
Erfindung ausreichend, um die mechanische und funktionelle Lebensfähigkeit
der Gewebe, die mit einem Skelett-Gelenk assoziiert sind, einschließlich Knochen
(und Knochenmark), Gelenkknorpel, Band, Sehne, Synovialkapsel und
Synovialmembran-Gewebe, wieder herzustellen. Somit stellt die Erfindung
Zusammensetzungen und Verwendungen solcher Zusammensetzungen zum
Ersatz einer oder mehrerer der vielen verschiedenen Gewebe bereit,
die ein Säugetierskelett-Gelenk definieren.
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Die Erfindung stellt in einem anderen
Aspekt deswegen eine Vorrichtung bereit, wie sie in Anspruch 1 beansprucht
wird. Die Matrix umfasst intakte Reste, die für zumindest zwei verschiedene
Gewebe des Ersatzkörperteils
spezifisch oder charakteristisch für diese sind und/oder von diesen
abstammen. Es wird aus der hierin nachstehend bereitgestellten Beschreibung
klar werden, dass die Matrix Reste einschließen kann, die für vier oder
mehr unterschiedliche Gewebe spezifisch sind. Die Matrix ist biokompatibel
und bioresorbierbar. Sie ist insbesondere ausreichend frei von pathogenen
und antigenen Reizen, die eine Transplantat-Abstoßung zur
Folge haben können.
Vorzugsweise wird die Matrix aus einem allogenen oder xenogenen
Körperteil
gewonnen. Sie wird vorzugsweise von einem Säugetier-Spender, beispielsweise einem Kadaver,
gewonnen. Der Körperteil
kann durch Dehydratation inert oder „devitalisiert" gemacht werden,
wie beispielsweise durch Ethanol-Extraktion und Lyophilisation,
so dass kein restlicher zellulärer
Metabolismus zurückbleibt,
so dass jedoch die Funktion endogener Wachstumsfaktoren und dergleichen
nach In-situ-Rekonstitution durch endogene Körperflüssigkeiten wiederhergestellt
werden kann. Der behandelte Körperteil,
der nunmehr im Wesentlichen bezüglich
antigener und pathogener Bestandteile abgereichert ist und nunmehr
kompatibel ist, hält
die Reste aufrecht, die für
vielfache verschiedene Gewebe spezifisch sind, die den zu ersetzenden
Körperteil
bilden. Diese Reste schließen
solche vielfachen verschiedenen Gewebe mit Dimensionen und strukturellen
Beziehungen zueinander auf, die solche in dem zu ersetzenden Körperteil
nachahmen. Der so behandelten Matrix, die eine Nützlichkeit in den Vorrichtungen
der Erfindung aufweist, fehlt eine signifikante mechanische Integrität im Vergleich
mit nativem Gewebe und ist von selbst aus nicht ausreichend, um
die Regeneration eines Ersatzkörperteils
oder Gewebes, wenn es implantiert wird, zu induzieren. Jedoch wird
durch Imprägnieren
oder in anderer Weise Infundieren der Zwischenräume der Matrix mit osteogenem
Protein, so dass das Protein auf den Oberflächen der Matrix abgelagert
oder auf diesem absorbiert wird, die Vorrichtung der vorliegenden
Erfindung gebildet, und ist ausreichend, um die Bildung von neuem
Gewebe in vivo zu induzieren, so dass die Regeneration eines mechanisch
und funktionell lebensfähigen
Ersatzkörperteils
in situ auftritt.
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Bei einer bevorzugten Ausführungsform
umfasst die Vorrichtung ein vollständiges Skelett-Gelenk oder einen
Teil hiervon, das aus einem Säugetier-Spender
ausgeschnitten wird, der gegenüber
dem Empfänger
allogen oder xenogen ist. Wie hierin beschrieben behandelt, ist
die Vorrichtung, die das allogene oder xenogene Skelett-Gelenk (1)
enthält,
biokompatibel, nämlich
ist nicht pathogen und ausreichend nicht-antigen, um eine Transplantat-Abstoßung in vivo
zu vermeiden und (2) ist ausreichend, um die Bildung eines funktionell
lebensfähigen
autogenen Ersatzgelenkes in vivo zu induzieren, einschließlich der
Erzeugung von funktionellem Knochen, Gelenkknorpel, Bändern und
Kapselgewebe in der korrekten Beziehung zueinander, so dass sich
ein strukturell und mechanisch funktionelles Ersatzgelenk ergibt.
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In einer weiteren Ausführungsform
stellt die Erfindung eine Vorrichtung bereit, die als Matrix bzw.
Matrize zur Ausbildung eines gesamten echten Skelett-Gelenkes oder
eines Teils hiervon dient, das vielfache verschiedene Gewebe umfasst,
und das in Reaktion auf morphogenetische Signale eine neue Gewebsbildung
induziert, einschließlich
neuen Knorpelgewebes aus entsprechenden Zellen, die in der synovialen
Umgebung vorliegen. Die neu geformten Gewebe nehmen die Form und
Funktion der Originalgewebe im Skelett-Gelenk an.
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Bei einem weiteren Aspekt stellt
die Erfindung wie in Ansprüchen
3 bis 5 und 7 beanspruchte Verwendungen der Matrix und des osteogenen
Proteins von Anspruch 1 zur Herstellung der oben beschriebenen Vorrichtung
bereit. In einer Ausführungsform
umfasst eine solche Verwendung die Bereitstellung einer Zufuhr von mesenchymalen
Zellen zur implantierten Vorrichtung, wie durch Durchfädeln oder
in anderer Weise Bereitstellen eines Muskellappens, der mit einer
Blutzufuhr im hohlen Anteil der Vorrichtung perfundiert wird. In
einer weiteren Ausführung
wird die Vorrichtung an einem Ort im Körper des Individuums implantiert,
die von der Defektstelle beabstandet ist bzw. verschieden ist, der
jedoch die Erzeugung des Ersatzkörperteiles
erlaubt. Der somit gebildete autogene Körperteil kann dann an der Defektstelle
implantiert werden.
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Wie aus der hierin bereitgestellten
Beschreibung klar sein wird, stellt die Erfindung in einem weiteren Aspekt
Vorrichtungen und Verwendungen solcher Vorrichtungen zur funktionellen
mechanischen Wiederherstellung eines oder mehrerer individueller
Gewebe in einem Säugetierskelett-Gelenk,
einschließlich
des nicht-mineralisierten und avaskulären Gewebs in diesem, bereit.
Somit stellt die Erfindung in einer Ausführungsform Vorrichtungen bereit,
die zur Wiederherstellung, ohne Einschränkung, funktionellen Gelenkknorpels,
von Bändern,
Synovialmembran und Synovialkapsel-Gewebe in der Lage sind. Die
hierin beschriebenen Vorrichtungen können beispielsweise dazu verwendet
werden, oberflächliche
Gelenkknorpel- Defekte
in einem Gelenk zu korrigieren, zerrissene oder beeinträchtigte
Bänder
und/oder Sehnen zu ersetzen, und Defekte der Synovial-Kapsel oder
des Membrangewebes zu heilen.
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Die Vorrichtungen zur Heilung von
individuellem Skelettgelenk-Gewebe umfassen osteogenes Protein,
abgelagert auf einer Matrix, die Reste enthält, die für Skelettgelenk-Gewebe des zu ersetzenden
Typs spezifisch sind oder von diesen abgeleitet sind, einschließlich, ohne
Beschränkung,
Knorpel, Band, Sehne, Synovialkapsel oder Synovialmembran-Gewebe.
Die Vorrichtung kann die Form eines Feststoffes einnehmen oder sie
kann die physikalischen Eigenschaften einer Paste oder eines Gels
aufweisen. Die Matrix ist vorzugsweise aus allogenem oder xenogenem
Gewebe abgeleitet und wird wie hierin beschrieben behandelt, um
eine biokompatible, devitalisierte Matrix zu bilden.
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In einer weiteren Ausführungsform
kann die Matrix de novo aus synthetischen und/oder natürlich abgeleiteten
Bestandteilen formuliert werden. Die Matrix schließt sowohl
(a) Reste ein, die für
das gegebene Gewebe spezifisch oder für dieses charakteristisch sind
und (b) Materialien, die ausreichend sind, um ein temporäres Gerüst zum Infiltrieren
von Zellen und zum Definieren einer dreidimensionalen Struktur zu
erzeugen, das die Dimensionen des erwünschten Ersatz-Gewebes nachahmt.
Solche nützlichen
Materialien sind hierin unten beschrieben. Geeignete gewebsspezifische
Reste können
aus devitalisiertem allogenem oder xenogenem Gewebe gewonnen und
mit den strukturellen Materialien wie hierin beschrieben kombiniert
werden, um die synthetische Matrix zu erzeugen. In einer weiteren
Ausführungsform
umfasst die Matrix devitalisiertes nicht-mineralisiertes Gewebe.
In einigen Fällen,
wie bei der Bildung von Gelenk-Knorpel auf Ersatzknochen, kann ein nichtmineralisiertes
Matrixmaterial, das eine dreidimensionale Struktur definiert, die
die Anlagerung von infiltrierenden Zellen ermöglicht, in Kombination mit
osteogenem Protein ausreichend sein, um eine neue Gewebsbildung
zu induzieren.
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Während
wie oben beschrieben in einer bevorzugten Ausführungsform die Erfindung eine
Vorrichtung betrachtet, die als Matrize zur Ausbildung eines Ersatzskelett-Gelenkes
in vivo geeignet ist, wird von dem Fachmann auf dem Gebiet erkannt
werden, dass die Erfindung eine Vorrichtung betrachtet und die Offenbarung
diese ermöglicht,
die als eine Matrize zur Ausbildung von anderen in vivo funktionellen
Ersatzkörperteilen als
Skelett-Gelenken geeignet sind und die viele verschiedene Gewebe
umfassen.
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Wenn sie gemäß der Verwendung in der vorliegenden
Erfindung verwendet werden, erfüllen
die Vorrichtungen der Erfindung und/oder die Gewebe, die sich aus
ihrer Anwendung ergeben, im Wesentlichen die folgenden Kriterien
eines bevorzugten Transplantat-Materials:
- 1.
Sie haben die Bildung von mechanisch und funktionell lebensfähigen Geweben
zur Folge, die normalerweise an der Stelle bzw. dem Ort vorliegen.
Diese Gewebe weisen eine geeignete Größe und korrekte Strukturbeziehungen
auf, so dass sie einen funktionellen Körperteil zur Folge haben. Insbesondere
wird das Multi-Gewebsersatzteil, gleichgültig ob es in situ an der Stelle
der beabsichtigten Verwendung produziert wird oder davon entfernt
produziert wird, eingebaut, mit benachbarten Geweben integriert,
wobei es im Wesentlichen seine Form beibehält, und indem er eine abnormale
Resorption vermeidet, unabhängig von
den Konditionen, die an der Empfängerstelle
vorliegen. Weiland et al. (1983) Clin. Orthop. 174: 81(1983).
- 2. Die Vorrichtungen sind dazu in der Lage, präzise ausgeformt
und gebildet zu werden, um sich exakt an jeden Defekt anzupassen,
wie auch immer komplex die Skelett- oder Organform, die ersetzt
werden soll, ist.
- 3. Die Vorrichtungen weisen praktisch unbegrenzten Vorrat auf
und sind relativ leicht zu gewinnen.
- 4. Die Vorrichtungen weisen eine minimale Morbidität auf der
Spender-Seite auf.
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Weiterhin versieht die vorliegende
Erfindung den praktizierenden Fachmann mit Materialien und Verwendungen
solcher Materialien für
die Skelettgelenk-Reparatur bzw. -Heilung, einschließlich der
Reparatur von Knochen- und Gelenkknorpel, der darin vorliegt, und
die Probleme lösen,
die unter Verwendung der Verfahren und Vorrichtungen nach dem Stand
der Technik auftreten. Beispielsweise kann die vorliegende Erfindung
die Bildung von bona fade Hyalin-Knorpel eher als Faserknorpel an
einer Defektstelle induzieren. Unter Verwendung der hierin offenbarten
Materialien und Verfahren bildet sich funktioneller Hyalin-Knorpel
auf der Gelenkoberfläche
des Knochens an einer Defektstelle und degeneriert über die
Zeit nicht zu Faser-Knorpel. Im Gegensatz hierzu resultieren die
Verfahren nach dem Stand der Technik zur Heilung von Knorpeldefekten im
Allgemeinen letztendlich in der Entwicklung von Faser-Knorpel an der Defektstelle.
Anders als Hyalin-Knorpel fehlt dem Faser-Knorpel die physiologische
Fähigkeit,
Gelenke wieder auf ihre volle Kapazität zu bringen. Somit, wenn die
vorliegenden Materialien gemäß der vorliegenden
Verfahren verwendet werden, kann der praktizierende Fachmann im
Wesentlichen einen Knorpeldefekt in einem Gelenk funktionell wiederherstellen, insbesondere
einen oberflächlichen
Gelenkknorpel-Defekt, und kann im Wesentlichen die unerwünschte Bildung
von Faser-Knorpel, die für
die Verfahren nach dem Stand der Technik typisch sind oder eine
Degeneration zu „Volle-Dicke-Defekten" vermeiden. Die Erfindung
stellt ebenfalls Mittel zur Reparatur von individuellem Gewebe eines
Gelenkes bereit, das nicht leicht reparierbar ist, individuell unter
Verwendung der Verfahren des Stands der Technik und das in einigen
Fällen
früher
einen Ersatz des gesamten Gelenkes durch eine Prothesen-Vorrichtung
erforderte. Die Erfindung ermöglicht
weiterhin die Verwendung allogener Ersatzmaterialien zur Reparatur
des avaskulären
Gewebes in einem Skelett-Gelenk und hat die Bildung von mechanisch
und funktionell lebensfähigen
Ersatzgeweben am Gelenkort zur Folge.
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Kurze Beschreibung
der Zeichnungen
-
Während
die Beschreibung mit Ansprüchen
schließt,
die den Gegenstand, der als die vorliegende Erfindung angesehen
wird, speziell darlegt und besonders beansprucht, wird angenommen,
dass die Erfindung durch die nachfolgende ausführliche Beschreibung bevorzugter
Ausführungsformen
besser verständlich
ist, wenn diese in Verbindung mit den begleitenden Zeichnungen zur
Hand genommen wird, bei denen:
-
1 eine
fragmentarische Vorderansicht eines Säugetier-Kniegelenkes ist, wobei
ausreichend Gewebe entfernt wird, um den Knorpel auf den Kondylen
des Oberschenkelknochens, die Bänder,
die Synovial-Membran, die Gelenkkapsel zu zeigen und weiterhin ein
geschädigtes
Areal im Gelenkknorpel zu zeigen, das einer Heilung bedarf;
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2A bis 2D schematische Darstellungen
der Elemente sind, die zur Erzeugung eines lebensfähigen, funktionellen
glenohumeralen Halb-Gelenkes in einer Ausführungsform der Erfindung verwendet
werden. 2A zeigt ein
lyophilisiertes Allotransplantat; 2B zeigt
osteogenetisches Protein zur Aufbringung auf das lyophilisierte
Allotransplantat von 2A;
-
2C zeigt
eine Muskelklappe aus kutanem Maximus-Muskel, der in den Schaft
des lyophilisierten Allotransplantates eingefädelt werden muss; und 2D zeigt ein lebensfähiges, funktionelles
Halb-Gelenk, das sich aus der Kombination der Elemente in den
2A, 2B und 2C ergibt. D repräsentiert
eine Ausführungsform
der Vorrichtung der vorliegenden Erfindung;
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3A bis 3D schematische Darstellungen
der vier Allotransplantate sind, die im Halbgelenk von Beispiel
2 (5 Wochen) getestet wurden und
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4A bis 4D schematische Darstellungen
der vier Allotransplantate sind, die im Halb-Gelenk von Beispiel 3 getestet wurden
(6 Monate).
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Ausführliche
Beschreibung
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Gemäß der vorliegenden Erfindung
werden neuartige Materialien und Verwendungen zur Heilung und Regeneration
vielfacher verschiedener Gewebe bereitgestellt, einschließlich der
Herstellung eines lebenden autogenen Ersatzteils, das vielfache
verschiedene Gewebe umfasst. In einer Ausführungsform ist der Ersatzkörperteil
ein Skelettgelenk, insbesondere ein echtes Gelenk, und schließt ohne
Einschränkung
Reste ein, die für
Knochen, Knorpel, Band, Sehne, Synovial-Kapsel und Synovialmembran-Gewebe
spezifisch sind oder von diesen abgeleitet sind.
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Insbesondere stellt die vorliegende
Erfindung bei einem Aspekt eine Vorrichtung bereit, die ein auf
den Oberflächen
einer Matrix oder Substrats abgelagertes osteogenetisches Protein
umfasst, zur Ausbildung eines funktionellen Säugetier-Ersatzkörperteils,
das viele verschiedene Gewebe umfasst. Wie hierin verwendet, bedeutet
der Begriff „Matrix" eine Struktur mit
Zwischenräumen
zur Anlagerung bzw. Bindung, Proliferation und Differentiation infiltrierender
Zellen. Sie umfasst Reste, die für
das zu ersetzende Gewebe spezifisch sind und/oder vom selben Gewebstyp
abgeleitet sind und weist eine Form und Dimension auf, die wenn
sie implantiert ist, im Wesentlichen diejenige des erwünschten
Ersatzgewebes nachahmt.
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Wie hierin verwendet soll der Begriff „Rest" einen Bestandteil
eines gegebenen Gewebes bedeuten, der eine Spezifität für das gegebene
Gewebe aufweist oder dafür
charakteristisch ist, und der aus den nicht-lebensfähigen Bestandteilen
des gegebenen Gewebes ableitbar ist. Eine Matrix, die diesen Rest
(Reste) umfasst, wenn sie mit osteogenem Protein kombiniert wird,
und die in ein Säugetier
in einer Umgebung implantiert wird, die die lokale Umgebung des
Gewebes unter physiologischen Bedingungen nachahmt und ausreichend zur
Bildung eines spezifischen, mechanisch und funktionell lebensfähigen Ersatzgewebes
ist.
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Der Begriff „vielfache verschiedene Gewebe" soll physiologisch
unterscheidbare Gewebe bedeuten, wie beispielsweise biochemisch
oder ultrastrukturell unterscheidbare Gewebe, die an einem anatomisch ähnlichen
Ort vorliegen. In einer Gelenk-Ersatzvorrichtung kann die Matrix
beispielsweise Reste umfassen, die für Knochen, Knorpel, Bänder, Sehnen
und Synovialmembran-Gewebe spezifisch ist oder von diesen abgeleitet ist.
Somit ist ein signifikanter Aspekt der Matrix der Erfindung eine
einzelne Struktur, die Reste aus vielfachen, getrennten Geweben
umfasst und die, wenn sie mit einem osteogenetischen Protein, wie
hierin definiert, kombiniert wird, zum Induzieren der Heilung oder
Regeneration eines Körperteils
geeignet ist, der über
eine Zeitspanne hinweg in vivo mechanisch und funktionell lebensfähig ist.
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Wie hierin verwendet, sollen die
Begriffe „Knochen" und „Gelenkknorpel" das Folgende bedeuten: Knochen
bedeutet ein kalzifiziertes (mineralisiertes) Bindegewebe, das in
erster Linie einen Verbundstoff aus abgelagertem Kalzium und Phosphat
in Form von Hydroxyapatit, Kollagen (in erster Linie Typ-I-Kollagen)
und Knochenzellen, wie beispielsweise Osteoblasten, Osteozyten und
Osteoklasten ebenso wie das Knochenmarksgewebe umfasst, das sich
im Inneren des echten Ersatzknochens bildet. Knorpel betrifft einen
Typ an Bindegewebe, der Knorpelzellen in einem extrazellulären Netzwerk
eingebettet enthält,
das Kollagenfibrillen (vorherrschend Typ-II-Kollagen zusammen mit
anderen untergeordneten Typen, beispielsweise Typen IX und XI),
verschiedene Proteoglycane (beispielsweise Chondroitinsulfat-, Keratansulfat-
und Dermatansulfat-Proteoglycane), andere Proteine und Wasser umfasst.
Gelenkknorpel bedeutet Hyalin- oder Gelenk-Knorpel, ein avaskuläres, nicht-mineralisiertes
Gewebe, das die Gelenkoberflächen
des Anteils der Knochen in Gelenken bedeckt und die Bewegung in
den Gelenken ermöglicht,
ohne einen direkten Knochen-zu-Knochen-Kontakt und dadurch eine
Abnutzung und eine Beschädigung
der gegenüberliegenden
Knochenoberflächen
verhindert. Der größte Teil
normalen gesunden Gelenk-Knorpels wird als „Hyalin" bezeichnet, d. h. er weist eine charakteristische
Milchglas-Erscheinung auf. Unter physiologischen Bedingungen ruht
Gelenkknorpelgewebe auf der darunterliegenden, mineralisierten Knochenoberfläche; der
Ersatzknochen, der hoch vaskularisierte Ossikeln enthält. Diese
in hohem Maße vaskularisierten
Ossikeln können
diffusionsfähige
Nährstoffe
an den darüberliegenden
Knorpel bereitstellen, jedoch nicht mesenchymale Stammzellen.
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„Band" soll sowohl die Tau-artigen Strukturen
von weißem
fibrösem
Bindegewebe, die die Vorderextremitäten von interagierenden Knochen
befestigen, ebenso wie das Gewebe bedeuten, das eine Synovial-Kapsel
bzw. Gelenk-Kapsel definiert. „Synovial-Membran" soll die Bindegewebsmembran
definieren, die die Innenseite der Gelenkhöhle auskleidet und die in die
Absonderung von Synovial-Flüssigkeit
involviert ist. „Sehne" soll die Bindegewebsstruktur
definieren, die den Muskel am Knochen befestigt.
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Ersatzknochenteile
-
Wie hierin offenbart, stellt die
vorliegende Erfindung Verwendungen und Zusammensetzungen zum Ersetzen
und Heilen defekter Knochenteile bereit. Die Anwendungen schließen ein
chirurgisches Ausschneiden des defekten Körperteiles, ein Implantieren
einer Vorrichtung, die eine Matrix des Typs, der oben beschrieben
ist, umfasst an der Stelle des Ausschnittes und, falls notwendig,
eine chirurgische Heilung von Geweben ein, die der Stelle des Ausschnittes,
wie hierin nachstehend beschrieben wird, benachbart sind. Es ist
beispielsweise für
den synovialen Gelenk-Ersatz wünschenswert,
die Gelenkkapsel zu heilen, einschließlich der Synovial-Membran
und der Bänder,
um chirurgisch die Gelenkstruktur physiologischen Bedingungen anzupassen,
wodurch eine avaskuläre
Umgebung erzeugt wird, die die Synovial-Höhle ist, und die in Synovial-Flüssigkeit
gebadet ist. Es ist ebenfalls bevorzugt, die implantierte Vorrichtung
an das umgebende Gewebe zu vernähen
oder in anderer Weise mechanisch mit diesem temporär zu verbinden.
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In einer Ausführungsform ist die Vorrichtung
so konstruiert, dass sie die Pfanne oder die gesamte Säugetier-Skelettgelenkstruktur
ersetzt und eine Matrix mit Resten für vielfache, verschiedene Gewebe
einschließt,
einschließlich
zwei oder mehr von Knochen, Knorpel, Band, Sehne, Synovial-Kapsel
und/oder Synovialmembran-Gewebe.
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In einer weiteren Ausführungsform
ist die Vorrichtung so konstruiert, dass sie ein individuelles Gewebe eines
Säugetier-Skelettgelenkes
ersetzt, einschließlich
eines individuellen avaskulären
und/oder nicht-mineralisierten Gewebes. Wie hierin demonstriert, ist
die Vorrichtung dazu in der Lage, eine funktionelle Ersatzgewebsbildung
zu induzieren, einschließlich
von Gelenk-Knorpel, aus reagierenden Zellen, die in der lokalen
Umgebung vorliegen, einschließlich
einer synovialen Umgebung, und ohne eine zelluläre Infiltration mesenchymaler
Zellen aus einer vaskularisierten Muskel-Klappe zu erfordern. Die
Matrix in dieser Ausführungsform
umfasst Reste, die für
Gewebe desselben Typs wie das zu ersetzende individuelle Gewebe
spezifisch sind oder für
dieses charakteristisch sind und/oder davon abgeleitet sind. In
einer anderen Ausführungsform
umfasst die Matrix devitalisiertes nichtmineralisiertes Gewebe.
In einer bevorzugten Ausführungsform
kann das Ersatzgewebe Gelenkknorpel, Band, Knochen, Sehne oder Synovialkapsel-Gewebe
einschließen.
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Bei einem teil- oder vollständigen Gelenkersatz
wird bevorzugt, ist es jedoch nicht erforderlich, in der Ausübung des
Verfahrens den zusätzlichen
Schritt einzuschließen,
eine Muskelklappe bzw. Muskellappen in einen hohlen Anteil der implantierten
Vorrichtung einzufädeln.
Beispielsweise kann unter Verwendung des in Khouri,
US 5 067 963 beschriebenen Verfahrens,
dessen Offenbarung durch diese Bezugnahme hierin mit aufgenommen
und hierin nachstehend beschrieben ist, eine Muskelklappe, die selbst
mit einem osteogenetischen Protein vorbehandelt sein kann, chirurgisch
in eine Kavität
in der implantierten Matrix eingebracht werden, wie beispielsweise
in die Mark-Kavität
des devitalisierten Knochens, um eine Blutzufuhr bereitzustellen,
um die Morphogenese von vaskularisiertem Gewebe zu beschleunigen
und um eine fertige Versorgung für
mesenchymale Stammzellen bereitzustellen.
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Die Matrix der vorliegenden Erfindung
weist eine Nützlichkeit
als implantierbare Vorrichtung auf, wenn das osteogenetische Protein
auf den Oberflächen
der Matrix angeordnet ist, vorliegend in einer Menge, die ausreicht,
um die Bildung jedes der Ersatzgewebe zu induzieren. Dies ermöglicht die
Regeneration des Körperteils
innerhalb des Säugetiers,
einschließlich
vielfacher Gewebe der geeigneten Größe, Beziehung und Funktion.
Osteogene Proteine, die in der vorliegenden Erfindung als nützlich betrachtet
werden, werden nachstehend beschrieben und wurden früher beispielsweise
in US-Patent Nr. 4 968 590, 5 258 499 und 5 266 683 beschrieben,
deren Offenbarungen durch Bezugnahme hierin mit aufgenommen sind.
Das osteogene Protein kann beispielsweise irgendeines der bekannten
knochenmorphogenetischen Proteine und/oder Äquivalenten hiervon sein, die
hierin beschrieben und/oder in der Technik beschrieben sind, und
schließt
Material aus natürlicher Quelle,
rekombinantes Material und irgendein Material ein, das in anderer
Weise produziert wird und das zum Induzieren einer Gewebsmorphogene
in der Lage ist.
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Die Verwendungen und Materialien
der vorliegenden Erfindung sind inbesondere zur Heilung und/oder zum
teilweisen oder vollständigen
Ersatz von Säugetierkörper-Gelenken,
einschließlich,
ohne Beschränkung, Gelenken,
insbesondere Gelenken, die eine bandartige Kapsel einschließen und
in Synovial-Flüssigkeit
gebadet sind, nützlich.
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Bei einigen echten Gelenken ist die
Bewegung uniaxial, d. h. alle Bewegungen finden um eine Achse herum
statt: Zu diesen zählt
der Ginglymus oder Scharniergelenk, bei dem die Bewegungsachse quer
zu den Achsen der Knochen verläuft
und das Trochoid- oder Zapfengelenk, bei dem die Achse in Längsrichtung
verläuft.
Im Falle von biaxialen Synovial-Gelenken
erfolgen die Bewegungen um zwei Achsen in einem rechten Winkel herum
oder in irgendeinem anderen Winkel zueinander: Diese schließen die
Chondyloid-, die Ellipsoid- und die Sattel-Gelenke ein. Es existiert
eine dritte Art von Synovial-Gelenk, das spheroidale oder das Kugel- und
Sockel-Gelenk, bei dem die Bewegungen polyaxial sind, d. h. es werden
Bewegungen in einer unbegrenzten Anzahl von Achsen ermöglicht.
Zuletzt existieren die ebenen oder Gleittyp-Synovial-Gelenke.
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Bei den Scharnier-Gelenken sind die
Gelenkoberflächen
aneinander in einer solchen Weise geformt, so dass eine Bewegung
in nur einer Ebene um die Querachse ermöglicht wird. Eine Biegung des
Ellenbogengelenkes ist ein Beispiel hierfür; weitere Beispiele schließen die
interphalangialen Gelenke sowohl der Finger als auch der Zehen ein.
Bei Zapfengelenken tritt die Bewegung eines Zapfengelenkes um eine
einzige Achse auf, es ist jedoch die Längsachse. Es existieren mehrere
Zapfengelenke im menschlichen Körper,
wie beispielsweise das proximale radioulnare Gelenk. In Kondylar-Gelenken
tritt eine Bewegung in erster Linie in einer Ebene auf. Das tibiofemorale
Gelenk des Kniegelenkes ist ein Beispiel hierfür. Beim Ellipsoid-Gelenk erfolgt
die Bewegung um zwei Hauptachsen herum, die im rechten Winkel zueinander
stehen. Beispiele für
diese Gelenke schließen
die radiokarpalen und metakarpophalangialen Gelenke ein. In einem
Sattelgelenk ist das Gelenkende des proximalen Knochens in einer
Achse konkav und in einer dazu senkrecht stehenden Achse konvex.
Diese Oberflächen
passen wechselseitig in konvexe und konkave Oberflächen des
distalen Knochens. Das beste Beispiel eines Sattelgelenkes ist das
karpometakarpale Gelenk des Daumens. Ein Kugel- und Sockel-Gelenk
ist ein solches, bei dem der distale Knochen zu einer Bewegung um
eine unbegrenzte Anzahl von Achsen mit einem gemeinsamen Zentrum
herum in der Lage ist. Beispiele dieser Form eines Gelenkes sind
in den Hüft-
und Schultergelenken zu finden. Ein Ebene- oder Gleittyp-Gelenk
ermöglicht
ein Gleiten oder Abrutschen eines Knochen über den anderen. Anders als
die oben beschriebenen Gelenke ist der Bewegungsumfang zwischen
den Oberflächen
durch die Bänder-
oder Knochen-artige Fortsätze
eingeschränkt,
die das Gelenk umgeben. Dies ist die Form, die in den Gelenken zwischen
den Gelenkfortsätzen
bestimmter Wirbel vorliegen, die Karpal-Gelenke und die intermetatarsalen
Gelenke.
-
Obwohl es in Betracht gezogen wird,
dass die vorliegende Erfindung zur Reparatur von Defekten, einschließlich Knochen-
und Gelenk-Knorpel an anderer Stelle in einem Säugetierkörper verwendbar ist, werden die
Aspekte bzw. Grundgedanken der Erfindung hierin in Verbindung mit
den Gelenkoberflächen
auf dem Oberschenkelknochen in einem Kniegelenk 10 dargestellt,
illustriert in 1.
-
1 illustriert
ein Kniegelenk 10 zwischen dem Oberteil eines Oberschenkelknochens 11 und
dem Oberteil eines Schienbeins 12. Zur Klarheit der Darstellung
sind nur die Anteile 13 und 14 der medialen und lateralen
kollateralen Bänder,
die den Oberschenkelknochen 11 beweglich an das darunterliegende
Schienbein 12 und das Wadenbein 15 befestigen,
in 1 dargestellt. In ähnlicher
Weise ist die Gelenkkapsel durch die äußere dunkle Auskleidung 25 und
die Synovial-Membran dargestellt, die die Synovial-Höhle auskleidet und
die gleitfähig
machende Synovial-Flüssigkeit
sezerniert, ist durch die innere dunkle Auskleidung 26 repräsentiert.
Normalerweise zwischen den gegenüberliegenden
Flächen
des Oberschenkelknochens 11 und des Schienbeins 12 dazwischen
gelegen sind laterale und mediale Meniskusknorpel 16 und 17 und
vordere und hintere Kreuzbänder
(nicht dargestellt). Konvex gekrümmte
Kondylen 20 und 21 am unteren Ende des Schienbeins 11 werden
normalerweise durch die Meniskusknorpel 16 bzw. 17 am
oberen Ende des Schienbeins 12 gelagert. Normalerweise
wird das untere Ende des Schienbeins 11, einschließlich der
Kondylen 20 und 21, von einer Schicht 22 aus
einem Hyalin-Knorpelmaterial bedeckt, der als Gelenk-Knorpel 22 bezeichnet
wird. Der Gelenk-Knorpel 22 bildet im Allgemeinen ein elastisches
Polster, das auf der Oberfläche
des unteren Endes des Oberschenkelhalsknochens 11 fixiert
ist, um das Letztere von einer Abnutzung und einer mechanischen Erschütterung
zu schützen.
Darüber
hinaus stellt der Gelenk-Knorpel 22, wenn er von der Synovial-Flüssigkeit im
Kniegelenk 10 gleitfähig
gemacht wird, eine Oberfläche
bereit, die einfach auf den darunterliegenden Oberflächen der
Meniskusknorpel 16 und 17 während der Biegung des Kniegelenkes 10 gleitbar
ist (oder auf der oberen Oberfläche
des Schienbeins 12 sollte ein oder beide der Meniskusknorpel 16 und 17 teilweise
oder vollständig
abwesend sein).
-
Ein Teil des Gelenkes kann durch
eine Verletzung oder Erkrankung geschädigt werden oder exzessiv abgenutzt
werden. 1 illustriert
ein Beispiel eines geschädigten
Areals 23.
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Matrix-Erwägungen
-
Wie es durch den Fachmann erkennbar
sein wird, ist die präzise
Natur des Substrates per se, das für die hierin offenbarten Matrices
verwendet wird, nicht für
die ultimative Fähigkeit
der Matrix, Ersatzgewebe zu heilen oder zu regenerieren, nicht bestimmend,
vorausgesetzt, dass die Matrix eine dreidimensionale Struktur aufweist,
die ausreichend ist, um als Gerüst
für infiltrierende
Zellen zu dienen und die Reste einschließt, die für denselben Gewebstyp wie das
zu heilende Gewebe spezifisch sind oder für diese charakteristisch sind und/oder
die von diesen abgeleitet sind.
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In der vorliegenden Erfindung dient
das Substrat als Gerüst,
auf dem bestimmte zelluläre
Ereignisse, vermittelt durch ein osteogenetisches Protein, notwendigerweise
eintreten werden. Die spezifischen Reaktionen auf das osteogenetische
Protein werden ultimativ durch die endogene Mikroumgebung an der
Implantatstelle und durch das Entwicklungspotential der reagierenden
Zellen vorgeschrieben. Wie es ebenfalls durch den Fachmann auf dem
Gebiet erkannt werden wird, hängt
die präzise
Auswahl eines Substrats, das für
die hierin offenbarten Matrices verwendet wird, teilweise vom zu
heilenden Defekttyp, anatomischen Erwägungen, wie beispielsweise
dem Umfang der Vaskularisierung an der Defektstelle und dergleichen
ab.
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Die Matrix der Erfindung kann wie
folgt gewonnen werden. Ein Ersatzgewebe oder Körperteil, das als Ersatz-Körperteil
verwendet werden soll und das zumindest zwei verschiedene Gewebe
in Verbindung umfasst, um den Körperteil
zu bilden, wird bereitgestellt, beispielsweise von einem Kadaver
bzw. einem Leichnam oder von einer Knochenbank, und wird durch Ethanol-Behandlung
behandelt und durch Lyophilisation dehydriert, so dass das verbleibende
Material nicht pathogen ist und ausreichend nicht-antigen ist, um
eine Transplantat-Abstoßung
zu vermeiden. Wie oben beschrieben, umfasst das so behandelte Material,
das in den Vorrichtungen der Erfindung eine Nützlichkeit aufweist, weiterhin
die Reste des extrahierten Gewebes oder von Geweben, aus dem es
abgleitet bzw. gewonnen ist. Eine Ersatzkörperteilmatrix, die so behandelt
wird, ist weiterhin so dimensioniert, dass die Reste eine strukturelle
Beziehung zueinander aufweisen, die diejenige des zu ersetzenden
Körperteils
nachahmt.
-
Matrices aus
natürlicher
Quelle
-
Geeignete allogene oder xenogene
Matrices können
wie hierin nachstehend beschrieben erzeugt werden, unter Verwendung
von Verfahren, die in der Technik wohl bekannt sind. Vorzugsweise
wird der Ersatzkörperteil
oder das -gewebe frisch gewonnen, und zwar aus einem Kadaver oder
einer Gewebsbank, die ihre Gewebe nach Gewinnung einfriert. In allen
Fällen
und wie es für
den praktizierenden Fachmann auf dem Gebiet offensichtlich ist,
ist es bevorzugt, jedes Gewebe nach Gewinnung einzufrieren, insofern
das Gewebe nicht zur sofortigen Anwendung entnommen wird. Vor Verwendung
wird das Gewebe mit einem geeigneten Mittel behandelt, um zelluläre nicht-strukturelle
Bestandteile des Gewebes zu extrahieren, um das Gewebe zu devitalisieren.
Das Mittel sollte dazu in der Lage sein, irgendwelche wachstumshemmenden
Bestandteile zu extrahieren, die mit dem Gewebe verbunden sind,
ebenso wie irgendwelche Pathogene zu extrahieren oder in anderer
Weise zu zerstören.
Das sich ergebende Material ist eine Art zelluläre Matrix, die Zwischenräume definiert,
die von Zellen infiltriert werden können, und ist im Wesentlichen
bezüglich
nicht strukturell-assoziierter Bestandteile abgereichert.
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Bei einem gegenwärtig bevorzugten Verfahren
wird das Gewebe einer Methodik folgend devitalisiert, wie beispielsweise
diejenige, die in der Technik zum Fixieren von Gewebe verwendet
wird. Das Gewebe wird einem nicht-polaren Lösungsmittel ausgesetzt, wie
beispielsweise 100% (200 Proof) Ethanol für eine Zeitspanne, die ausreichend
ist, um den Wassergehalt des Gewebes im Wesentlichen durch Ethanol
zu ersetzen und um die zelluläre
Struktur des Gewebes zu zerstören.
Typischerweise wird das Gewebe gegenüber 200 Proof Ethanol für mehrere
Tage exponiert, bei einer Temperatur im Bereich von ungefähr 4 bis
40° C, und
es wird Sorge getragen, die Lösung
durch frischen Ethanol alle 6–12
Stunden zu ersetzen, bis zu einem solchen Zeitpunkt, wenn der Flüssigkeitsgehalt
des Gewebes 70–90
Ethanol umfasst. Typischerweise ist eine Behandlung für 3–4 Tage
geeignet. Das Volumen an Flüssigkeit,
das zugesetzt wird, sollte mehr als ausreichend sein, um das Gewebe
einzutauchen. Das behandelte Gewebe wird dann lyophilisiert bzw.
gefriergetrocknet. Die sich ergebende, trockene bzw. wasserfreie
Matrix ist im Wesentlichen bezüglich
nichtstruktureller Bestandteile abgereichert, behält jedoch
sowohl intrazelluläre
als auch extrazelluläre
Matrixbestandteile, die von dem Gewebe abgeleitet sind.
-
Zahlreiche weitere Verfahren sind
in der Technik zum Extrahieren von Geweben beschrieben, einschließlich von
mineralisiertem Gewebe, wie beispielsweise Knochen, und um diese
Gewebe für
allogene oder xenogene Implantate biokompatibel zu machen. Siehe
beispielsweise Sampath et al. (1983) PNAS 80: 6591–6595,
US 5 011 691 und US-Patent
Nr. 4 975 526 und 5 171 574. Diese Veröffentlichungen beschreiben die
Extraktion mit 4 M Guanidin-HCl, 50 mM Tris-HCl, pH 7,0 für 16 Stunden
bei 4°C
und verschiedene Deglycosylierungs- und Kollagenfibrill-modifizierende
Mittel, einschließlich
Flusssäure,
Trifluoressigsäure,
Trichlormethan, Acetonitril, Isopropanol, erhitzte saure wässrige Lösungen und
verschiedene Kombinationen dieser Reagenzien. Die Offenbarungen
der Patente ist hierin durch Bezugnahme mit aufgenommen. Wie hierin
und nachstehend beschrieben kann, wenn die Matrix mit einem Fibrillen-modifizierenden
Mittel behandelt wird, die behandelte Matrix zur Entfernung irgendwelcher
extrahierten Bestandteile gewaschen werden, und zwar folgend einer
Form des hierin nachstehend beschriebenen Verfahrens:
- 1. Suspendieren einer Matrixzubereitung in TBS (Tris-gepufferte
Salzlösung)
1 g/200 ml und Rühren
bei 4°C
für 2 Stunden;
oder in 6 M Urea, 50 mM Tris-HCl, 500 mM NaCl, pH 7,0 (UTBS) oder
Wasser und Rühren
bei Raumtemperatur (RT) für
30 Minuten (ausreichend Zeit, um den pH zu neutralisieren);
- 2. Zentrifugieren und Wiederholen des Waschschrittes; und
- 3. Zentrifugieren; Verwerfen des Überstandes; Waschen des Rückstands
mit Wasser; und darauf lyophilisieren.
-
Behandelte allogene oder xenogene
Matrices weisen zur Erzeugung von Vorrichtungen zur Ausbildung von
Ersatzkörperteilen,
die vielfache verschiedene Gewebe umfassen, ebenso wie zur Erzeugung
von Vorrichtungen zum Ersetzen individueller Gelenk-Gewebe, wie
beispielsweise Bänder
und Gelenkknorpel-Gewebe besondere Nützlichkeit auf. Beispielsweise
kann eine Ersatzband-Vorrichtung aus einer allogenen Band-Matrix
und osteogenetischem Protein formuliert und in einen Skelettgelenk-Ort
unter Befolgung von chirurgischen Standardverfahren für den autogenen
Band-Ersatz implantiert werden. In ähnlicher Weise kann eine allogene
Gelenkknorpel-Vorrichtung aus devitalisiertem Knorpelgewebe oder
anderem inerten, nicht-mineralisiertem Matrix-Material und osteogenetischem
Protein gebildet werden und die Vorrichtung kann auf der subchondralen
Knochenoberfläche
als eine Schicht abgelagert werden. Alternativ kann eine formulierte
Vorrichtung pulverisiert oder in anderer Weise mechanisch abgeschliffen
bzw. abgeschabt werden, um Teilchen zu erzeugen, die zu einer Paste
oder einem Gel, wie hierin beschrieben, zur Aufbringung auf die
Knochenoberfläche
formuliert werden können.
-
Synthetische
Matrices
-
Als Alternative zu einer Matrix aus
natürlicher
Quelle oder als Ergänzung,
die in Kombination mit einer Matrix aus natürlicher Quelle verwendet werden
soll, kann eine geeignete Matrix ebenfalls de novo formuliert werden,
unter Verwendung (1) von Resten, die von demselben Gewebstyp wie
dem zu heilenden Gewebstyp abgleitet sind und/oder für diesen
charakteristisch oder spezifisch sind, und (2) ein oder mehrerer
Materialien, die zur Erzeugung einer dreidimensionalen Gerüststruktur
dienen, die ausgebildet oder gegossen oder gepresst werden kann,
um die Dimensionen des erwünschten
Ersatzgewebes anzunehmen. In einigen Umständen, wie bei der Bildung von
Gelenkknorpel auf subchondrale Knochen-Oberflächen, kann osteogenes. Protein
in Kombination mit einer Matrix, die eine dreidimensionale Gerüststruktur
bildet, die ausreichend ist, um die Anlagerung infiltrierender Zellen
zu ermöglichen
und die aus einem nicht-mineralisiertem Material zusammengesetzt
ist, ausreichend sein. Irgendeines oder eine Kombination aus Materialien
kann in vorteilhafter Weise verwendet werden, einschließlich, ohne
Beschränkung,
Kollagen; Homopolymere oder Copolymere der Glycolsäure, Milchsäure und
Buttersäure,
einschließlich
Derivaten hiervon; und Keramik, wie beispielsweise Hydroxyapatit,
Trikalziumphosphat und anderer Kaliziumphosphate und Kombinationen
hiervon.
-
Der gewebsspezifische Bestandteil
einer synthetischen Matrix kann in einfacher Weise durch Devitalisieren
eines allogenen oder xenogenen Gewebes, wie oben beschrieben, und
darauf Pulverisieren oder in anderer Weise mechanisch Zerbrechen
der unlöslichen
Matrix, die zurückbleibt,
gewonnen werden. Dieses teilchenförmige Material kann dann mit
einem oder mehreren strukturellen Materialien kombiniert werden,
einschließlich
solcher, die hierin beschrieben sind. Alternativ können gewebsspezifische
Bestandteile weiter aus der behandelten Matrix unter Verwendung
von Standardextraktionsverfahren aufgereinigt werden, die in der Technik
wohl charakterisiert sind und unter Verwendung von Standardanalyseverfahren
kann das extrahierte Material in jedem Reinigungsschritt auf seine
Gewebsspezifität-Möglichkeit
bzw. -Vermögen
getestet werden. Siehe beispielsweise Sampath et al. (1987) PNAS
72: 7599–7603
und
US 4 968 590 für beispielhafte
Gewebsextraktions-Vorschriften.
-
Eine synthetische Matrix kann wünschenswert
sein, wenn beispielsweise Ersatz-Gelenkknorpel
in einem existierenden Gelenk erwünscht ist, um einen Riss oder
einen begrenzten oberflächlichen
Defekt des Gewebes zu korrigieren oder um die Höhe der Gelenkknorpel-Oberfläche, die
nun aufgrund des Alters, einer Erkrankung oder einer Verletzung
abgenutzt ist, zu erhöhen.
Ein solches „Wiederbeschichten" der Gelenkknorpel-Schicht kann unter
Verwendung der Verfahren und Zusammensetzungen der Erfindung erreicht
werden, indem in einer Ausführungsform
eine Schicht aus einem allogenen oder xenogenen Gelenkknorpelgewebe, wie
hierin beschrieben, behandelt wird, indem die sich ergebende Matrix
mit osteogenem Protein beschichtet wird, indem die formulierte Vorrichtung
so aufgerollt wird, dass sie in das Gelenk unter Verwendung von
orthoskopischen Standard-Chirurgietechniken eingebracht werden kann,
und, einmal an der Stelle bereitgestellt, indem die Vorrichtung
als eine Schicht auf der Gelenkknochen-Oberfläche entrollt wird. In einer
weiteren Ausführungsform
wird die Vorrichtung als Paste oder injizierbare gelartige Substanz
formuliert, die auf die Gelenkknochen-Oberfläche im Gelenk ebenfalls unter
Verwendung von orthosknpischen Standard-Chirurgietechniken injiziert
werden kann. In dieser Ausführungsform
kann die Formulierung eine pulverisierte oder in anderer Weise mechanisch
abgebaute Vorrichtung umfassen, die sowohl Matrix- als auch osteogenes
Protein und zusätzlich
ein oder mehrere Bestandteile umfasst, die dazu dienen, die Teilchen
in eine pastenartige oder gelartige Substanz zu binden. Bindungsmaterialien,
die in der Technik wohl charakterisiert sind, schließen beispielsweise
Carboxymethylzellulose, Glycerol, Polyethylenglycol und dergleichen
ein. Alternativ kann die Vorrichtung osteogenes Protein, dispergiert
in einer synthetischen Matrix, umfassen, die die erwünschten
physikalischen Eigenschaften bereitstellt. Als Beispiel wird in
der WO91/18558, veröffentlicht
am 21. Dezember 1991 und hierin nachstehend beschrieben, eine synthetische
Matrix mit einer Gewebsspezifität
für Knorpel
und Knochen beschrieben. Kurz gesagt umfasst die Matrix ein poröses vernetztes
Struktur-Polymer aus biokompatiblem, biologisch abbaubaren Kollagen
und geeignete gewebsspezifische Glycosaminoglycane als gewebsspezifische
Zellanlagerungsfaktoren. Kollagen, das aus mehreren Quellen gewonnen
wird, kann verwendet werden, einschließlich unlösliches Kollagen, Säure-lösliches
Kollagen, Kollagen, das in neutralen oder basischen wässrigen
Lösungen
löslich
ist, ebenso wie solche Kollagene, die im Handel erhältlich sind.
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Glycosaminoglycane (GAGs) oder Mucopolysaccharide
sind Hexosamin-enthaltende Polysaccharide tierischen Ursprungs,
die eine gewebsspezifische Verteilung aufweisen und deswegen dazu
verwendet werden können,
die Gewebsspezifität
der Morphogen-stimulierten differenzierenden Zellen zu bestimmen.
Eine Reaktion mit den GAGs stellt ebenfalls Kollagen mit anderen
wertvollen Eigenschaften bereit, d. h. einem Unvermögen, eine
Immunreaktion (Fremdkörperreaktion)
von einem Tier-Wirt hervorzurufen.
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Chemisch gesehen sind GAGS aus Resten
von Hexosaminen hergestellt, die glycosidisch gebunden sind, und
die in einer mehr oder weniger regulären Art und Weise entweder
mit Hexouronsäuren
oder Hexose-Komponenten alternieren (siehe beispielsweise Dodgson
et al. in Carbohydrate Metabolism and its Disorders (Dickens et
al., Hsg.), Bd. 1, Academic Press (1968)). Nützliche GAGs schließen Hyaluronsäure, Heparin, Heparinsulfat,
Chondroitin-6-Sulfat,
Chondroitin-4-Sulfat, Dermatansulfat und Keratinsulfat ein. Weitere
GAGs können
ebenfalls zur Ausbildung der hierin beschriebenen Matrix verwendet
werden und der Fachmann auf dem Gebiet wird andere geeignete GAGs
kennen oder unter Verwendung von nicht mehr als Routineexperimenten
dazu in der Lage sein, diese zu erkennen. Für eine ausführlichere Beschreibung von
Mucopolysacchariden siehe Aspinall, Polysaccharides, Pergamon Press,
Oxford (1970).
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Kollagen kann mit einem GAG in wässrigen
sauren Lösungen,
vorzugsweise in verdünnten
Essigsäurelösungen umgesetzt
werden. Durch Zusatz des GAG tropfenweise in eine wässrige Kollagendispersion
ergeben sich Kopräzipitate
aus verwickelten Kollagenfibrillen, die mit GAG beschichtet sind.
Die verwickelte Masse an Fasern kann dann zur Bildung einer homogenen
Dispersion von feinen Fasern homogenisiert und darauf filtriert
und getrocknet werden.
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Die Unlöslichkeit der Kollagen-GAG-Produkte
kann bis zum erwünschten
Grad durch kovalentes Vernetzen dieser Materialien erhöht werden,
was ebenfalls dazu dient, die Beständigkeit gegenüber einer
Resorption dieser Materialien zu erhöhen. Im Allgemeinen ist jedes
kovalente Vernetzungsverfahren, das zum Vernetzen von Kollagen geeignet
ist, auch zum Vernetzen dieser Verbundmaterialien geeignet, obwohl
ein Vernetzen durch ein dehydrothermisches Verfahren bevorzugt wird.
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Erwägungen bezüglich der
Formulierungen
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Die Vorrichtungen der Erfindung können unter
Verwendung irgendwelcher Verfahren formuliert werden, die in der
Technik zur Formulierung osteogener Vorrichtungen beschrieben sind.
Siehe beispielsweise US-Patent Nr. 5 266 683, dessen Offenbarung
hierin durch Bezugnahme mit aufgenommen ist. Kurz gesagt wird das
osteogene Protein typischerweise in einem geeigneten Lösungsmittel
gelöst
und mit der Matrix kombiniert. Man lässt die Bestandteile sich verbinden.
Typischerweise wird das kombinierte Material darauf lyophilisiert,
mit dem Ergebnis, dass das osteogene Protein auf den Oberflächen der
Matrix abgelagert oder adsorbiert wird. Nützliche solubilisierende Lösungsmittel
schließen
ohne Beschränkung
Ethanoltrifluoressigsäure-Lösung, beispielsweise
47,5% EtOH/0,01% TFA; und eine Acetonitril/TFA-Lösung, Ethanol oder Ethanol
in Wasser und physiologisch gepufferte Salzlösungen ein. Formulierungen
in einem sauren Puffer können
die Absorption an OP-1 auf der Matrixoberfläche erleichtern. Für Ersatzkörperteil-Vorrichtungen
der Erfindung ist die gegenwärtig
bevorzugte Formulierungs-Vorschrift eine Inkubation der Matrix und
des osteogenen Proteins in einer Ethanol/TFA-Lösung (beispielsweise 30–40 EtOH/0,01
bis 0,1% TFA) für
24 Stunden, gefolgt von Lyophilisation. Dieses Verfahren ist ausreichend,
um 70–90%
des Proteins auf der Matrixoberfläche zu adsorbieren oder zu
präzipitieren.
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Die Menge an osteogenem Protein,
die verwendet wird, hängt
von der Größe der Ersatzvorrichtung, die
verwendet werden soll, und von der spezifischen Aktivität des osteogenen
Proteins ab. Typischerweise können
0,5 mg bis 100 mg/10 g Matrix Trockengewicht vorteilhafterweise
verwendet werden.
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Zusätzlich zu osteogenen Proteinen
können
verschiedene Wachstumsfaktoren, Hormone, Enzyme, therapeutische
Zusammensetzungen, Antibiotika oder andere bioaktive Mittel ebenfalls
an ein Substrat adsorbiert oder mit diesem imprägniert werden und über die
Zeit hinweg freigesetzt werden, wenn sie implantiert werden und
die Matrix langsam adsorbiert wird. Somit können verschiedene bekannte
Wachstumsfaktoren, wie beispielsweise EGF, PDGF, IGF, FGF, TGF-a
und TGF-b in vivo freigesetzt werden. Die Matrix kann ebenfalls
dazu verwendet werden, chemotherapeutische Mittel, Insulin, Enzyme,
Enzyminhibitoren oder chemotaktische Chemoattraktanz-Faktoren freizusetzen.
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Erwägungen bezüglich des
Proteins
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Wie hierin definiert, schließen die
osteogenen Proteine, die in der Zusammensetzung und den Anwendungen
der Erfindung von Nutzen sind, die Familie von dimeren Proteinen
mit einer Ersatzknochen-Aktivität ein,
wenn sie einem Säugetier
in Verbindung mit einer Matrix implantiert werden, und die eine
Subklasse der „Superfamilie" von „TGF-β-artigen" Proteinen umfassen.
Das osteogene Protein aus natürlicher
Quelle in seiner reifen, nativen Form ist ein glycosyliertes Dimer,
das typischerweise ein apparentes Molekulargewicht von ungefähr 30–36 kDa
aufweist, wie durch SDS-PAGE bestimmt wurde. Wenn es reduziert wird,
lässt das
30 kDa Protein zwei glycosylierte Peptid-Untereinheiten mit apparenten
Molekülgewichten
bzw. Molekülmassen
von ungefähr
16 kDa und 18 kDa entstehen. Im reduzierten Zustand weist das Protein
keine nachweisbare osteogenetische Aktivität auf. Das unglycosylierte
Protein, das ebenfalls osteogene Aktivität aufweist, weist ein apparentes
bzw. scheinbares Molekulargewicht von ungefähr 27 kDa auf. Wenn es reduziert
ist, lässt
das 27 kDa Protein zwei unglycosylierte Polypeptide mit Molekulargewichten
von ungefähr
14 kDa bis 16 kDa entstehen, die zum Induzieren einer Ersatzknochenbildung
in einem Säugetier
in der Lage sind. Nützliche
Sequenzen schließen
solche ein, die die C-terminalen 102 Aminosäuresequenzen von DPP(von Drosophila),
Vgl(von Xenopus), Vgr-1(von der Maus), das OP1 und dergleichen Proteine,
Proteine (siehe US-Patent Nr. 5 011 691 und Oppermann et al., ebenso
wie die als BMB2, BMP3, BMP4 bezeichneten Proteine (siehe WO88/00205, US-Patent
Nr. 5 013 649 und WO91/18098), BMP5 und BMP6 (siehe WO90/11366,
PCT/US 90/01630 und BMP8 und 9 umfassen.
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Die Mitglieder dieser Familie von
Proteinen teilen ein konserviertes 6- oder 7-Cystein-Skelett im
C-terminalen Bereich. Siehe beispielsweise 335–431 von SEQ ID NO: 1, dessen
Sequenz die 6-Cystein-Skelett-Reste definiert, die hierin als „OPS" oder Reste 330–431 von
SEQ ID NO. 1 bezeichnet werden, die 102 Aminosäuren umfassen und deren Sequenz
das 7-Cystein-Skelett
definiert.
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Diese Familie von Proteinen schließt längere Formen
eines gegebenen Proteins ebenso wie phylogenetische Spezies und
Allel-Varianten und biosynthetische Mutanten ein, einschließlich Additions-
und Deletions-Mutanten und -Varianten, wie beispielsweise solche,
die das konservierte C-terminale Cystein-Skelett verändern können, vorausgesetzt,
dass die Veränderung
nach wie vor ermöglicht,
dass das Protein eine dimere Spezies mit einer Konformation bildet,
die zum Induzieren einer Knochenbildung in einem Säugetier
in der Lage ist, wenn es dem Säugetier
in Verbindung mit einer Matrix implantiert wird. Zusätzlich können die
osteogenen Proteine, die in den Vorrichtungen dieser Erfindung von
Nutzen sind, Formen einschließen,
die variierende Glycosylierungsmuster und variierende N-Termini
einschließen,
können
natürlich
vorkommend oder biosynthetisch gewonnen sein und können durch
Expression rekombinanter DNA in prokaryontischen oder eukaryontischen
Wirtszellen erzeugt werden. Die Proteine sind als einzelne Spezies
(beispielsweise als Homodimere) aktiv oder kombiniert als gemischte
Spezies, einschließlich
von Heterodimeren.
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In einer Ausführungsform umfasst das osteogenetische
Protein, das hierin betrachtet wird, OP1 oder OP1-verwandte Sequenzen.
Nützliche
OP1-Sequenzen werden in US-Patent Nr. 5 011 691; 5 108 753 und 5 266
683 erwähnt;
in Ozkaynak et al. (1990) EMBOJ 9: 2085–2093; und Sampath et al. (1993)
PNAS 90: 6004–6008.
OP1-verwandte Sequenzen schließen
xenogene Homologe, beispielsweise 60A von Drosophila, Wharton et
al. (1991) PNAS 88: 9214–9218
und Proteine ein, die mehr als 60% Identität mit OP-1 in der C-terminalen
7-Cystein-Domäne teilen,
vorzugsweise zumindest eine 65%-ige Identität. Beispiele von OP1-verwandten Sequenzen
schließen
BMP5, BMP6 (und deren Spezies-Homolog Vgr-1, Lyons et al. (1989)
PNAS 86: 4554–4558),
Celeste et al. (1990) PNAS 87: 9843–9847 und die internationale
PCT-Anmeldung VO93/00432 ein; OP-2 (Sampath et al. (1990) J. Biol.
Chem. 267: 13198–13205).
Wie dem Fachmann auf dem Gebiet klar sein wird, können chimäre Konstrukte
in einfacher Weise unter Verwendung von molekularbiologischen Standardverfahren
und Mutagenese-Techniken erzeugt werden, die verschiedene Anteile
unterschiedlicher Morphogene bzw. morphogenetischer Proteinsequenzen
zur Erzeugung einer neuen Sequenz kombinieren und diese Formen des
Proteins werden hierin ebenfalls betrachtet.
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In einem bevorzugten Aspekt betrachtet
die Erfindung osteogene Proteine, die Spezies von Polypeptid-Ketten
mit der generischen Aminosäuresequenz
umfassen, die hierin als „OPX" bezeichnet wird,
die die Homologien zwischen den verschiedenen identifizierten Spezies
der osteogenen OP1- und OP2-Proteine aufnimmt und die durch die
nachstehend und in SEQ ID NO. 3 präsentierte Aminosäuresequenz
beschrieben ist.
und wobei Xaa bei Res. 2
= (Lys oder Arg); Xaa bei Res. 3 = (Lys oder Arg); Xaa bei Res.
11 = (Arg oder Gln); Xaa bei Res. 16 = (Gln oder Leu); Xaa bei Res.
19 = (Ile oder Val); Xaa bei Res. 23 = (Glu oder Gln); Xaa bei Res.
26 = (Ala oder Ser); Xaa bei Res. 35 = (Ala oder Ser); Xaa bei Res.
39 = (Asn oder Asp); Xaa bei Res. 41 = (Tyr oder Cys); Xaa bei Res.
50 = (Val oder Leu); Xaa bei Res. 52 = (Ser oder Thr); Xaa bei Res.
56 = (Phe oder Leu); Xaa bei Res. 57 = (Ile oder Met); Xaa bei :Res.
58 = (Asn oder Lys); Xaa bei Res. 60 = (Glu, Asp oder Asn); Xaa
bei Res. 61 = (Thr, Ala oder Val); Xaa bei Res. 65 = (Pro oder Ala);
Xaa bei Res. 71 = (Gln oder Lys); Xaa bei Res. 73 = (Asn oder Ser);
Xaa bei Res. 75 = (Ile oder Thr); Xaa bei Res. 80 = (Phe oder Tyr);
Xaa bei Res. 82 = (Asp oder Ser); Xaa bei Res. 84 = (Ser oder Asn);
Xaa bei Res. 89 = (Lys oder Arg); Xaa bei Res. 91 = (Tyr oder His);
und Xaa bei Res. 97 = (Arg oder Lys).
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Bei einem noch weiter bevorzugten
Grundgedanken wird eine oder beide der Polypeptidketten-Untereinheiten
des osteogen aktiven Dimers von Nucleinsäuren kodiert, die an DNA- oder
RNA-Sequenzen hybridisieren, die die aktive Region von OP-1 unter
stringenten Hybridisierungsbedingungen kodieren. Wie hierin verwendet,
sind stringente Hybridisierungsbedingungen als Hybridisierung in
40% Formamid, 5 X SSPE, 5 X Denhardt's Lösung
und 0,1% SDS bei 37°C über Nacht
und Waschen in 0,1 X SSPE, 0,1% SDS bei 50°C definiert.
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Unter Vorgabe der vorhergehenden
Aminosäure-
und DNA-Sequenzinformation, des Ausmaßes der Fähigkeiten auf dem Fachgebiet
und der Offenbarungen zahlreicher Veröffentlichungen bezüglich osteogener Proteine,
einschließlich
Patent-Nr. 5 011 691 und der offengelegten PCT-Anmeldung US 89/01469,
veröffentlicht
am 19. Oktober 1989, können
zahlreiche DNAs konstruiert werden, die zumindest die aktive Domäne eines
osteogenen Proteins kodieren, das in den Vorrichtungen dieser Erfindung
von Nutzen ist, und verschiedene Analoge hiervon (einschließlich Spezies-
und Allel-Varianten und solcher, die gentechnische Mutationen enthalten),
ebenso wie Fusionsproteine, trunkierte Formen der reifen Proteine,
Deletions- und Additionsmutanten und ähnliche Konstrukte, die in
den Vorrichtungen und Verfahren der Erfindung verwendet werden können. Darüber hinaus
können
DNA-Hybridisierungssonden aus Fragmenten irgendwelcher dieser Proteine
konstruiert oder de novo aus den generischen bzw. Gattungsequenzen
entwickelt werden. Diese Sonden können dann zum Screenen unterschiedlicher
genomischer und cDNA-Banken bzw. -Bibliotheken zum Identifizieren zusätzlicher
osteogener Proteine verwendet werden, die in den Prothesen-Vorrichtungen
dieser Erfindung von Nutzen sind.
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Die DNAs können vom Fachmann auf dem Gebiet
unter Verwendung wohl bekannter DNA-Manipulationstechniken hergestellt werden,
die eine genomische und cDNA-Isolierung, Konstruktion synthetischer
DNA aus synthetisierten Oligonucleotiden und Kassetten-Mutagenesetechniken
einschließen.
15–100
mer Oligonucleotide können
auf einem DNA-Synthetisiergerät synthetisiert
und durch Polyacrylamid-Gelelektrophorese (PAGE) in Tris-Borat-EDTA-Puffer
aufgereinigt werden. Die DNA kann dann aus dem Gel elektroeluiert
werden. Überlappende
Oligomere können
durch T4 Polynucleotidkinase phosphoryliert und in größeren Blocks
ligiert werden, die ebenfalls durch PAGE gereinigt werden können.
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Die DNA aus in geeigneter Weise identifizierten
Klonen kann dann isoliert, subkloniert (vorzugsweise in einen Expressionsvektor)
und sequenziert werden. Plasmide, die interessierende Sequenzen
enthalten, können
dann zu einer geeigneten Wirtszelle zur Proteinexpression transfiziert
und weiter charakterisiert werden. Der Wirt kann eine prokaryontische
oder eukaryontische Zelle sein, weil das Unvermögen der Letzteren, ein Protein
zu glycosylieren, die morphogenetische Aktivität des Proteins nicht zerstören wird.
Nützliche
Wirtszellen schließen
E. coli, Saccharomyces, das Insekten-Baculovirus-Zellsystem, Myelomazellen, CHO-Zellen und
verschiedene andere Säugetierzellen
ein. Die Vektoren können
zusätzlich
verschiedene Sequenzen kodieren, um die korrekte Expression des
rekombinanten Proteins zu fördern,
einschließlich
Transkriptionspromotor- und Terminationssequenzen, Enhancer-Sequenzen,
bevorzugter Ribosomen-Bindungsstell-Sequenzen, bevorzugten mRNA-Leader-Sequenzen,
bevorzugten Signalsequenzen zur Proteinsekretion und dergleichen.
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Die DNA-Sequenz, die das interessierende
Gen kodiert, kann ebenfalls manipuliert werden, so dass potentiell
hemmende Sequenzen entfernt oder eine unerwünschte Sekundärstruktur-Bildung minimiert
wird. Das rekombinante osteogene Protein kann ebenfalls als ein
Fusionsprotein exprimiert werden. Nachdem es translatiert ist, kann
das Protein aus den Zellen selbst aufgereinigt und aus dem Kulturmedium
gewonnen werden. Alle biologisch aktiven Proteinformen umfassen
dimere Spezies, die durch Disulfid-Brücken verbunden oder in anderer
Weise assoziiert sind, erzeugt durch Falten und Oxidieren einer
oder mehrerer der verschiedenen rekombinanten Polypeptid-Ketten
innerhalb einer geeigneten eukaryontischen Wirtszelle oder in vitro nach
Expression individueller Untereinheiten. Eine ausführliche
Beschreibung osteogener Proteine, die aus rekombinanten DNA in E.
coli exprimiert werden und in zahlreichen unterschiedlichen Säugetierzellen
exprimiert werden, ist im US-Patent Nr. 5 266 963 offenbart, dessen
Offenbarung durch Bezugnahme hierin mit aufgenommen ist.
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Alternativ können osteogene Polypeptid-Ketten
chemisch unter Verwendung konventioneller Peptid-Synthesetechniken
chemisch synthetisiert werden, die dem Durchschnittsfachmann auf
dem Gebiet wohl vertraut sind. Beispielsweise können die Proteine intakt oder
in Teilen auf einem Festphasen-Peptidsynthesegerät unter Verwendung von Standardbetriebsverfahren
synthetisiert werden. Vollständige
Ketten werden dann entschützt
und durch HPLC aufgereinigt (Hochdruckflüssigchromatographie). Wenn
das Protein in Teilen synthetisiert wird, können die Teile unter Verwendung
einer Standardmethodik zur Bildung des intakten Proteins Peptid-gebunden
werden. Im Allgemeinen kann die Art und Weise, in der das osteogene
Protein hergestellt wird, konventionell sein und bildet keinen Teil
dieser Erfindung.
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Beispiele
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Die Mittel zum Herstellen und zur
Verwendung der Matrices und Vorrichtungen der Erfindung ebenso wie
andere Materialaspekte, die die Art und Nützlichkeit dieser Zusammensetzungen
betreffen, einschließlich, wie
der Gegenstand, der beansprucht wird, herzustellen und zu verwenden
ist, wird aus dem Nachfolgenden weiter verstanden werden, das die
beste Art und Weise darstellt, die gegenwärtig ins Auge gefasst wird,
um die Erfindung auszuüben.
Es wird klar sein, dass die Erfindung nicht auf eine so beispielhafte
Arbeit oder auf die speziellen Details, die hierin in diesen Beispielen
dargelegt sind, beschränkt
ist.
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Im Beispiel wird eine Halb-Gelenkrekonstruktion
eines echten Synovial-Gelenkes in einem existierenden Gelenk-Ort
aufgeschnitten. Wie der Durchschnittsfachmann auf dem Gebiet erkennen
wird, können
die Verfahren und Zusammensetzungen der Erfindung in gleicher Weise
auf die Bildung von Ersatzkörperteilen, die
nicht Skelett-Gelenke sind, ebenso wie auf andere Skelett-Gelenke
als Gelenk- oder Synovial-Gelenke angewendet werden. Darüber hinaus
kann, falls erwünscht,
das autogene Ersatz-Gelenk zuerst im Empfänger konstruiert werden, indem
die Vorrichtung der Erfindung an einem anderen geeigneten Ort entfernt
von der Defektstelle angeordnet wird, für eine Zeitspanne, die ausreichend
ist, um die Bildung des Ersatzkörperteils
zu induzieren, und der somit geformte autogene Körperteil wird dann im Gelenkort
zur Verwendung vernäht.
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Beispiel 1: Rekonstruktion
eines Säugetier-Hemi-Gelenkes
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Weiße Neuseeland-Kaninchen wurden
als experimentelles Modell verwendet. Orthopädische Standard-Chirurgieausrüstung und
-verfahren wurden verwendet.
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Wie in 2A dargestellt,
wurden Gelenkdefekte in einem Empfänger durch chirurgisches Ausschneiden
des gesamten glenohumeralen Hemiartikularkomplexes mit den proximalen
zwei Dritteln des Humerus erzeugt. Allotransplantate zur Implantation
wurden aus Hemi-Gelenken
hergestellt, die aus einem Spendertier mit der Gelenk-Oberfläche des
glenohumeralen Gelenkes ausgeschnitten wurden. Alle Allotransplantate
wurden in Ethanol extrahiert und unter Verwendung von Standardverfahren
und wie hierin oben beschrieben lyophilisiert, um die Pathogenität und Antigenität des Materials
zu zerstören.
Insbesondere wurden intakte Gelenkkomplexe ausgeschnitten, entmarkt
und durch Exposition gegenüber
200 ml bis 500 ml 200 Proof Ethanol für 72 Stunden bei 40°C Ethanol-behandelt.
Frischer Ethanol wurde alle 6–8
Stunden bereitgestellt. Im Anschluss an die Ethanol-Behandlung wurde
die Matrix lyophilisiert und in Ethanol/TFA mit oder ohne osteogenem
Protein rehydriert. Die behandelten Halb-Gelenke umfassten devitalisierten
Knochen, Gelenkknorpel, Band, Sehne, Synovial- bzw. Gelenkkapsel
und Synovial-Membrangewebe.
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Wie in
2B dargestellt
wurden alle lyophilisierten, osteogenen Protein-behandelten Allotransplantate
mit OP-1 wie in
US 5 011 691 beschrieben
beschichtet. Insbesondere wurde reifes, dimeres rekombinantes OP-1(ThOPI)
in einer Acetonitril-Trifluoressigsäure-Lösung solubilisiert, mit dem
lyophilisierten Allotransplant kombiniert und implantiert. 15–20 mg Protein/8–10 g Matrix
Trockengewicht wurden verwendet. Die distalen Knochenanteile aller
Allotransplantate wurden am Ort mit einer 4-Loch-Titan-Miniplatte
befestigt. Eine peinlich genaue chirurgische Rekonstruktion der
Gelenkkapsel wurde durch Vernähen
der lyophilisierten Kapselenden an die endogene Kapsel unter Verwendung
chirurgischer Standardverfahren durchgeführt, die in der Technik wohl
bekannt sind, unter Verwendung von chirurgischen Standardverfahren,
die in der Technik wohl etabliert sind. Dies erzeugte erneut eine
intakte Kapsel und Synovial- bzw. Gelenk-Auskleidung, wodurch das Gelenk-Milieu der transplantierten
Gelenk-Oberfläche
wiederhergestellt wurde. Eine Bewegung war fast unmittelbar nach
dem chirurgischen Eingriff möglich,
so dass erneut normale Gelenk-Bedingungen
hergestellt wurden.
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Bei einigen Tieren wurden lokale
Muskellappen (kutaner Maximus-Muskel, 2C)
in den Bereich des Defektes durch Einfädeln des Muskels in die Markhöhle des
Allotransplantates eingebaut, wie in 2D beschrieben
ist, unter Verwendung des Verfahrens von Khouri, wie beschrieben
in US-Patent Nr. 5 067 963, dessen Offenbarung hierin durch Bezugnahme
mit aufgenommen ist. Kurz gesagt wurden vaskularisierte und herkömmliche
Muskellappen unter Verwendung von Standardverfahren, die dem praktizierenden
Fachmann in der Rekonstruktionschirurgie wohl bekannt sind, geschnitten,
um eine perfundierende Blutzufuhr aufrechtzuerhalten und wurden
in die Knochenmarkshöhlen
der Allotransplantate eingefädelt.
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Vorläufige Auswertungen der rekonstruierten
Halbgelenke wurden durch serielle wöchentliche Radiographien unter
Verwendung von Röntgenstrahlung
und/oder Magnetresonanz-Bildgebung (MRI) erzielt. Histologische
und mechanische konfirmatorische Auswertungen wurden nach Töten bei
5 Wochen und 6 Monaten nach dem chirurgischen Eingriff durchgeführt.
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Mechanische Evaluationen involvierten
den Standardbereich der Bewegung (ROM)-Messungen, die seriell bis zur Tötung erzielt
wurden. Histologische Auswertungen involvierten die Färbung von
Sagittalschnitten durch die gewonnenen Allotransplantate unter Verwendung
von Standardtechniken.
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Kurz gesagt kann die Identifizierung
eines bona fide Gelenk-Knorpels unter Verwendung ultrastruktureller
und/oder biochemischer Parameter erreicht werden. Beispielsweise
bildet der Gelenk-Knorpel eine kontinuierliche Schicht aus Knorpelgewebe,
der identifizierbare Zonen besitzt. Die oberflächliche Zone ist durch Knorpelzellen
charakterisiert, die eine abgeflachte Morphologie und ein extrazelluläres Netzwerk
aufweisen, das sich mit Toluidinblau nicht anfärben lässt oder schlecht anfärben lässt, was
auf die relative Abwesenheit sulfatierter Proteoglycane hinweist.
Knorpelzellen in den Mittel- und Tiefenzonen weisen eine kugelförmige Erscheinung
auf und die Matrix enthält
reichliche sulfatierte Proteoglycane, wie es durch Färbung mit
Toluidinblau bewiesen wird. Kollagenfasern sind gegenwärtig diffus
in der ganzen Matrix verteilt. Die Knorpelzellen besitzen reichliches
rohes endoplasmatisches Retikulum und sind von extrazellulärem Netzwerk
umgeben. Das perizelluläre
Netzwerk enthält
zahlreiche dünne
nicht zusammengebundene Kollagenfasern. Das Kollagen in interterritorialen
Netzwerk ist weniger kompaktiert und in ein Elektronen durchlässiges amorphes
Material eingebettet, ähnlich
dem Gelenkknorpel. Kollagenfasern im interterritorialen Bereich
des Netzwerkes zeigen die periodische Bandenbildung, die für Kollagenfasern
in der interterritorialen Zone von Knorpelgewebe charakteristisch
ist.
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Biochemisch gesehen weist das Vorhandensein
von Typ-I- und Typ-IX-Kollagen in Knorpelgewebe auf den differenzierten
Phänotyp
von Knorpelzellen hin. Das Vorliegen von Typ-II- und/oder Typ-IX-Kollagen
kann durch Standard-Gelelektrophorese, Western-Blot-Analyse und/oder
immunhistochemische Färbung
bestimmt werden unter Verwendung beispielsweise kommerziell erhältlicher
Antikörper.
Weitere biochemische Marker schließen Hämatoxilin, Eosin, Goldners
Trichrom und Safranin-O ein.
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Die Gelenknorpel-Regeneration wurde
histologisch in den hierin beschriebenen Beispielen unter Verwendung
von Glycosaminoglycan-spezifischen Färbungen und Techniken, die
in der Technik wohl bekannt sind, histologisch ausgewertet. Für die initiale
histologische Auswertung wurden die Defektstellen durch das Zentrum
des Defektes längsweise
zweifach geschnitten. Die sich ergebenden Hälften und das umgebende Gewebe
wurde in Paraffin eingebettet und durch das Zentrum des Defektes
hindurch geschnitten. Eine Hälfte jedes
Defektes wurde zur histologischen Färbung mit Toluidinblau und/oder
Hämatoxilin
und Eosin, Goldners Trichrom und Safranin-O verwendet. Die andere
Hälfte
wurde bei der Herstellung von Schnitten zur Immunfärbung verwendet.
Histologische Auswertungen involvierten die Bestimmung von: Glycosaminoglycan-Gehalt
im Reparatorknorpel; Knorpelund Knorpelzell-Morphologie; und strukturelle
Integrität
und Morphologie an der Defektgrenzfläche. Die Morphologie des Reparaturknorpels
wurde für
den gebildeten Knorpeltyp dargestellt: Gelenk – gegen fibrotisch durch Auswertung
des Glycosaminoglycan-Gehaltes,
des Ausmaßes
der Knorpelablagerung und dergleichen.
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Histologische Auswertungen unter
Verwendung von Standardmethodologien, die in der Technik wohl charakterisiert
sind, ermöglichen
ebenfalls die Bestimmung von neuem Knochen und der Knochenmarksbildung.
Siehe beispielsweise US-Patent Nr. 5 266 683, dessen Offenbarung
durch Bezugnahme hierin mit aufgenommen ist. In ähnlicher Weise kann die Band-
und Gelenkkapsel-Integrität
durch MRI, ebenso wie durch Histologie nach Tötung überwacht werden.
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Beispiel 2: 5-wöchige Dauer
(Kurzzeit)
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Für
die 5-Wochen-Studie wurde 4 Gruppen mit 10 Kaninchen pro
Gruppe lyophilisiertes Allotransplantat implantiert. Siehe 3A, 3B, 3C und 3D. In Gruppe 1 wurde ein
lyophilisiertes Kontroll-Allotransplantat 30, das frei
von osteogenem Protein war, implantiert (3A). In Gruppe 2 wurde experimentelles
lyophilisiertes Allotransplantat 31 mit OP-1 vor der Implantation
(3B) imprägniert.
In Gruppe 3 wurde lyophilisiertes Kontroll-Allotransplantat 30, das frei
von osteogenem Protein war, mit Muskellappen 32 implantiert,
die in die Markhöhle 33 (3C) eingefädelt waren.
In Gruppe 4 wurde ein experimentelles lyophilisiertes Allotransplantat 31 mit
OP-1 vor der Implantation imprägnier
und Muskellappen 32 wurden in die Markhöhle 33 (3D) eingefädelt.
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Wie oben festgestellt folgten der
Transplantatheilung nicht-invasive serielle Röntgenbestrahlungen und Standard-MRI
(Magnetresonanz-Bildgebung). Durch Röntgenbestimmung wiesen Allotransplantate,
die mit osteogenem Protein behandelt wurden, eine bemerkenswert
verdickte Rinde postoperativ bei Woche 1 auf, im Vergleich zu Kontroll-Allotransplantaten
(Gruppen 1, 3), die eine nur dünne,
Eierschalen-artige Rinde zeigten. Zum Zeitpunkt 4 Wochen war die
Großzahl
der Kontroll-Allotransplantate gebrochen und instabil. Im Gegensatz
hierzu verblieben OP-1-behandelte Allotransplantate (Gruppen 2,
4) stabil.
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Eine MRI wurde als nicht-invasives
Mittel zur anschließenden
Reformation von Gelenkknorpel in den Allotransplantaten verwendet.
Ein dunkles Signal, das durch MRI produziert wurde, repräsentiert
die Abwesenheit oder nicht-lebensfähigen Knorpel, wohingegen ein
helles Signal lebensfähigen,
lebendigen Knorpel anzeigt. Kontroll-Allotransplantate erzeugten lediglich
ein dunkles Signal, wenn sie bei 1, 3 und 5 Wochen postoperativ
getestet wurden. Diese MRI-Erkenntnisse wurden durch histologische
Analyse bestätigt,
die bei 5 Wochen postoperativ durchgeführt wurden. Ein Sagittalschnitt
durch Kontroll-Allotransplantate zeigte eine degenerierte Gelenk-Oberfläche ohne
lebende Zellen.
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Im Kontrast hierzu zeigten die MRI-Erkenntnisse
der Gelenk-Kappe bzw. -Kapsel von OP-1-behandelten Allotransplantaten ein helles
Signal bei Woche 3 postoperativ, was auf die Regeneration von lebensfähigem Gelenk-Knorpel
hinweist. Eine histologische Analyse der OP-1-behandelten Allotransplantate
zeigte bei Woche 5 eine Schicht aus neu erzeugtem Gelenk-Knorpel
oben auf der Allotransplantat-Matrix. Die Allotransplantate von
Gruppe 4 zeigten ein wenig dickere Knorpelschichten als solche von
Gruppe 2, was nahelegt, dass der Zusatz des Muskellappens die Geschwindigkeit
der Gelenk-Regeneration weiter erhöhen kann.
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Zusätzlich erhielten Gelenke, die
mit den OP-1-behandelten Allotransplantaten regeneriert wurden,
einen nahezu normalen Bewegungsbereich zu dem Zeitpunkt zurück, zu dem
sie 5 Wochen nach der Rekonstruktion gewonnen wurden. Der nahezu
normale Bereich der Bewegung weist ebenfalls auf das Vorhandensein einer
gleitfähig
machenden Gelenkflüssigkeit
hin. Im Gegensatz hierzu waren die gewonnenen Kontroll-Allotransplantate
steif und bei Gewinnung kontrahiert. Somit waren die Hemi-Gelenk-Ersatzvorrichtungen
der Erfindung bei der Ausbildung mechanisch und funktionell lebensfähiger Ersatzgelenke
erfolgreich, mit einer intakten Kapsel und Synovium und funktionierendem
Band, Knochen und Gelenkknorpel-Gewebe. Bei Fehlen von osteogenem
Protein sind die Allotransplantate von sich aus nicht ausreichend,
während
sie vom Spender nicht abgestoßen
werden, um ein funktionelles, Gewicht tragendes Gelenk zu erzeugen.
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Beispiel 3: 6-monatige
Dauer (Langzeit)
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Für
die 6-Monats-Studie wurde die Variable des Abschabens bzw. des Abschälens der
alten Knorpel-Kappe in den lyophilisierten Allotransplantaten mit
eingebracht. Kurz gesagt wurde dies durch mechanisches Abtrennen
der Gelenkknorpel-Kappe der Gelenk-Oberfläche erreicht.
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Die folgenden Gruppen wurden mit
4 Kaninchen pro Gruppe verwendet: In Gruppe 5 wurden lyophilisiertes
Allotransplantat 34 mit einer abgeschälten Gelenkoberfläche und
Muskellappen 32 implantiert (siehe 4A); in Gruppe 6 wurden lyophilisiertes
Kontroll-Allotransplantat 30 mit
nicht-abgeschälter
Gelenk-Oberfläche
und Muskellappen 32 implantiert (siehe 4B); in Gruppe 7 wurden lyophilisiertes
Allotransplantat 35 mit einer abgeschälten Gelenkoberfläche und
OP-1 und einem Muskellappen 36, behandelt mit OP-1, implantiert
(siehe 4C); und in Gruppe
8 wurde ein lyophilisiertes Allotransplantat 37 mit einer
nicht-abgeschälten Gelenk-Oberfläche und
OP-1 und Muskellappen 36, der mit OP-1 behandelt wurde,
implantier (siehe 4D). Transplantate
in den Gruppen 5–8
wurden nach 6 Wochen nach dem chirurgischen Eingriff gewonnen.
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Basierend auf den Bildgebungsstudien
vor der Gewinnung sind die zum Zeitpunkt 3 Monate nach der Operation
gesammelten Ergebnisse mit den oben beschriebenen Ergebnissen konsistent,
die bei 5 Wochen gesammelt wurden. Intakte Allotransplantate, die
mit OP-1 (Gruppe 8) behandelt wurden, regenerierten eine lebende
Knorpel-Gelenkoberfläche
zum Zeitpunkt 3 Wochen, wenn dies unter Verwendung von MRI evaluiert wurde.
Diese Gelenkkappe liegt zum Zeitpunkt 3 Monate noch vor und ist
sogar besser entwickelt. Ohne OP-1-Behandlung des Allotransplantates
(Gruppe 6) existierte eine vernachlässigbare Knorpelregeneration bezüglich der
OP-1-behandelten Gruppen.
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In ähnlicher Weise erhielten Gruppe-8-Kaninchen
(Allotransplantat + OP-1, nicht-abgeschält) einen nahezu normalen Bewegungsbereich
(mehr als 80%) im rekonstruierten Gelenk zurück. Gruppe-7-Kaninchen (Allotransplantat
+ OP-1, abgeschält)
erreicht nur 50% Bewegungsbereich und Gruppe 5 und 6 (kein OP-1) erreichten
weniger als 30%.
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Wie durch Histologie bestimmt wurde,
waren die Vorrichtungen der Erfindung dazu in der Lage, sowohl die
Knochen- als auch Gelenkknorpel-Bildung im geeigneten Kontext zueinander
in einer Langzeitstudie (mehr als 6 Monate) zu induzieren und aufrechtzuerhalten.
Insbesondere demonstrierten die Kaninchen von Gruppe 8 eine Gelenkknorpel-Bildung
auf der Oberfläche
des Knochens, wie es morphologisch durch das Vorliegen von ruhenden,
zentralen und tieferen Zonen-Knorpelzellen unter Beweis gestellt
wurde. Im Gegensatz hierzu wurde in Gruppen, die lediglich mit Muskellappen
(Gruppe 5 und 6) behandelt wurden, der Muskel durch Narbengewebe
ersetzt. In den Gruppen, die mit abgeschälten Knochen-Matrices behandelt
wurden, wurde keine signifikante Knorpel-Regeneration identifiziert,
was das Erfordernis von Knorpel-spezifischen Resten in der Gelenkknorpel-Bildung
in einem nicht-vaskularisierten Milieu demonstriert.
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Sowohl in der Kurzzeit- als auch
in der Langzeitstudie ergaben sich mechanisch und funktionell lebensfähige Synovial-Gelenke
aus den rekonstruierten Halb-Gelenken, die mit osteogenem Protein
behandelt wurden, wie es durch Morphologie und Biochemie unter Beweis
gestellt wurde. Zusätzlich
bildete sich neues Gewebe, einschließlich Gelenk-Knorpel, entsprechend
Form, Art und strukturellem Verhältnis
zu dem Rest im devitalisierten Gewebe, das die Matrix der Vorrichtung
bildete. Zusammen genommen demonstrieren diese Beispiele, dass eine
Vorrichtung, die osteogenes Protein und abgeschälte, nicht-lebensfähige lyophilisierte
devitalisierte Matrix enthalten, zu einer lebensfähigen, mechanisch
und strukturellen Ersatzkörperteil-Struktur transformiert
werden kann, die viele verschiedene neu gebildete Gewebe umfasst,
die die Form und Funktion eines Originalgewebes annehmen. Die Vorrichtung
kann die normale Funktion eines zerstörten Körperteils wiederherstellen,
einschließlich
eines zerstörten
Skelettgelenkes, der Wiederherstellung mechanisch und funktionell
lebensfähiger
vielfacher verschiedener Gewebe, einschließlich Knochen- und Knochenmark,
Gelenk-Knorpel, Band, Sehne, Synovial-Kapsel und synovialer Membrangewebe. Überdies
werden die Gewebe unter im Wesentlichen physiologischen Bedingungen
wiederhergestellt, einschließlich,
beispielsweise aus reagierenden Zellen, die in einer Gelenkumgebung
vorliegen und ohne Exposition gegenüber avaskularisierten Muskellappen.
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Eine Vorrichtung, die osteogene Protein-behandelte
Matrices umfasst, einschließlich
lyophilisierte Allotransplantate oder Xenotransplantate, wie hierin
offenbart, können
zur Bildung eines neuen, mechanisch, strukturell und funktionell
lebensfähigen
Ersatzgewebes führen
und zu Ersatzkörperteilen,
die vielfache verschiedene Gewebe umfassen, die durch Wirtszellen
besiedelt werden und dies ohne irgendeiner der Einschränkungen
von Prothesenmaterialien.
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Der Fachmann wird wissen oder dazu
in der Lage sein sicherzustellen, ohne nicht mehr als Routineexperimente
zu verwenden, dass viele Äquivalente
für die
speziellen Ausführungsformen
der hierin beschriebenen Erfindung existieren. Diese und alle anderen Äquivalente
sollen durch die nachfolgenden Ansprüche mit umfasst werden.
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