DE69533942T2

DE69533942T2 - Behandlung von lösungen roter blutkörperchen mit antiviralen wirkstoffen

Info

Publication number: DE69533942T2
Application number: DE69533942T
Authority: DE
Inventors: David Cook; Susan Wollowitz; Aileen Niero
Original assignee: Cerus Corp
Current assignee: Cerus Corp
Priority date: 1994-11-14
Filing date: 1995-11-08
Publication date: 2005-12-29
Anticipated expiration: 2015-11-09
Also published as: JPH10507367A; EP0804074B1; US5559250A; AU4151396A; JP3145124B2; ATE287210T1; US5691132A; CA2203885A1; WO1996014737A1; CA2203885C; US20020182581A1; EP0804074A4; US6171777B1; US6410219B1; EP0804074A1; US6143490A; AU712034B2; DE69533942D1

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Die Erfindung betrifft im allgemeinen neue Verbindungen und Verfahren zur in-vitro-Inaktivierung von Pathogenen in biologischem Material, das zur in-vitro- oder in-vivo-Verwendung vorgesehen ist, und insbesondere zur Inaktivierung von Pathogenen in Lösungen, die rote Blutkörperchen enthalten, vor der klinischen Untersuchung oder Transfusion.
HINTERGRUND
Das Vorhandensein von Pathogenen in Blutprodukten sowie anderen biologischen Materialien wird sowohl für das Gesundheitspersonal als auch für die Empfänger der Materialien als signifikantes Gesundheitsproblem angesehen.
Das Gesundheitspersonal geht täglich mit einem großen Volumen an Humanflüssigkeiten als Teil der Routine-Überwachung von Krankenhaus-Patienten durch Gewinnung und Untersuchen von Humanflüssigkeiten (Blut, Urin, Spinalflüssigkeit, usw.) um. Gewöhnlich wird bei jedem eingelieferten Patient mindestens ein Röhrchen Blut vom Phlebotomist entnommen. Während des Überführungs-, Portionierungs- und Untersuchungs-Verfahrens wird jedes Probenröhrchen von einem Krankenhaus-Mitarbeiter verarbeitet, während der Inhalt offenliegt. Dieser ausgiebige Umgang mit potentiell infektiösen Humanflüssigkeiten ist nicht ohne Gesundheitsgefahren. Die Occupational Safety and Health Administration (OSHA) schätzt, dass jährlich mehr als 5 Millionen Gesundheitspersonal, wie u. a. die Laboranten im Krankenhauslabor, Pathogen-Infektionen am Arbeitsplatz ausgesetzt sind, die vom Blut ausgehen. Das Pathogen, das für die überwältigende Mehrheit von Infektionen verantwortlich ist, ist das Hepatitis B-Virus (HBV). Die US-Gesundheitsbehörde (Center for Disease Control (CDC)) schätzt, dass bei Gesundheitspersonal jedes Jahr zwölftausend Fälle von HBV-Infektion auftreten. Von diesen Fällen müssen mehr als 500 ins Krankenhaus überführt werden und etwa 250 dieser Patienten sterben (beispielsweise an fulminant verlaufender Hepatitis, Zirrhose oder Leberkrebs). Siehe Guidelines for Prevention of Transmission of HIV and HBV to Health-Care and Public Safety Workers, CDC (Februar 1989). Die meisten Vollzeit-Labormitarbeiter ziehen sich während ihrer beruflichen Laufbahn mindestens einmal Hepatitis zu. Tatsächlich zeigen bis zu einem Drittel des gesamten Gesundheitspersonals einen serologischen Beweis für eine vorhergehende HBV-Infektion. Id.
Nach der Erkennung des erworbenen Immunschwäche-Syndroms (AIDS) haben klinische Labors zusätzliche Vorsichtsmaßnahmen getroffen. Statt der Verwendung manuell positionierter Kunststoff-Einsätze zur Aufrechterhaltung der Trennung von Zellen aus dem Serum nach dem Zentrifugieren der Proben, steht nun ein 'Gel' zur Verfügung, das sich in dem leeren Röhrchen zum Zeitpunkt der Blutabnahme befindet. Beim Zentrifugieren des Röhrchens wandern die Zellen unter das Gel, wohingegen das Serum oberhalb bleibt. Während die Trennung auf diese Weise ohne großartige Probenhandhabung aufrechterhalten wird, verringert diese nicht die Handhabung des Technikers zum Zeitpunkt der Analyse. Leider kann infektiöses Virus für längere Zeit in einer Flüssigkeit oder einem getrockneten Zustand überdauern, möglicherweise sogar bei erhöhten Temperaturen. Resnick et al., JAMA 255: 1887 (1986).
Vorsichtsmaßnahmen, wie Handschuhe und Augenschutz lösen das Problem nicht ganz. Unfälle im Labor oder im Krankenhaus beinhalten gewöhnlich das Aussetzen gegenüber einem größeren Körperabschnitt, und die Erkrankung kann durch die Haut und Schleimhäute übertragen werden. Morbidity and Mortality Weekly Report 36: 285 (1987).
Es bedarf eindeutig weiterhin einer adäquateren Lösung für aus dem Blut hervorgehende Pathogen- Infektionen am Arbeitsplatz. Solch eine Lösung sollte als Schutz gegen einen breiten Bereich von Pathogenen dienen. Die Mechanistiken der Lösung sollten die Arbeitsschritte bei einer Labor- oder Blutbank nicht unnötig stören.
Ein weiteres signifikantes Problem ist die Kontamination der Blutversorgung für eine in-vivo-Verwendung. Die Sicherheit der Blutversorgung wird weiter durch die Übertragung von Pathogenen durch Transfusion bedroht. Die Bedrohung durch das Human-Immunschwächevirus (HIV) und das erworbene Immunschwächesyndrom (AIDS) ist zwar mittlerweile weithin veröffentlicht, jedoch ist die Kontamination von Blutprodukten mit einer Reihe anderer infektiöser Viruserreger, die aus dem Blut stammen, noch bedeutsamer. Siehe R. Y. Dodd, In: Transfusion Medicine in the 1990's (American Assoc. Blood Banks 1990) (S. J. Nance, Hrsg.). In den Vereinigten Staaten entwickeln z. B. schätzungsweise bis zu zehn (10) Prozent von mehrfach transfundierten Empfängern eine Hepatitis, die für viele Tausende Fälle jährlich verantwortlich ist.
Vollblut, das freiwilligen Spendern für Transfusionsempfänger entnommen wurde, wird gewöhnlich in seine Komponenten aufgetrennt: rote Blutkörperchen, Blutplättchen und Plasma. Jede dieser Fraktionen wird einzeln gelagert und zur Behandlung einer Vielzahl spezifischer Zustände und Krankheitsstadien verwendet.
Der Bestandteil der roten Blutkörperchen wird vorwiegend zur Behandlung von Trauma, chronischer Anämie und Blutverlust während der Operation (insbesondere Herz- und Leber-Operation) einschließlich postoperativem Bluten verwendet. D. M. Surgenor et al., Transfusion 32: 458 (1992). Etwa zwölf (12) Millionen Einheiten roter Blutkörperchen werden jährlich in etwa vier (4) Millionen Empfänger allein in den Vereinigten Staaten übertragen. E. L. Wallace et al., 33: 139 (1993).
Die Sicherheit der Blutversorgung kann nicht durch bloßes Untersuchen des Blutes auf Pathogene vor der Transfusion erfolgen. Ein Großteil der Untersuchung beruht auf der Erfassung von Antikörpern gegen das Pathogen in dem potentiellen Blutspender. Es ist mittlerweile gut dokumentiert, dass Erreger durch "seronegative" Blutspender übertragen werden können, d. h. Spender, die keine nachweisbaren Antikörper gegen das Pathogen aufweisen. Den US-Gesundheitsbehörden (CDC) wurden beispielsweise 13 auf eine Transfusion zurückführbare AIDS-Fälle bei Empfängern von Blut berichtet, das vorher getestet und in Bezug auf Antikörper gegen das HIV-1-Virus als negativ eingestuft wurde.
Schreibfehler und andere Fehler setzen die Patienten weiterhin kontaminiertem, falsch untersuchtem oder falsch beschriftetem Blut aus. Das Problem wird kompliziert, wenn eine schlechte Einheit mehrere Opfer erzeugt, da das Vollblut routinemäßig in Bestandteile aufgeteilt wird. Fehler in Blutbanken sind nicht selten. Seit Anfang 1990 wurden der FDA 29.586 Blutbankfehler und Unfälle berichtet. "How safe is Our Blood," U.S. News and World Report, 27. Juni 1994, 68–78. Rückrufe von Blut, das von Blutzentren versehentlich abgegeben wurde, sind gewöhnlich ineffizient, da sie Monate oder Jahre nach der Transfusion der Blutprodukte erfolgen.
Ein alternativer Ansatz zur Eliminierung der Übertragung von Krankheiten durch Blutprodukte ist die Entwicklung einer Maßnahme zur Inaktivierung der Pathogene in Transfusionsprodukten. Einige dieser Techniken, wie Wärme [J. Hilfenhous et al., J. Biol. Std. 70: 589 (1987)], Lösungsmittel/Detergenz-Behandlung [B. Horowitz et al., Transfusion 25: 516 (1985)], Gamma-Bestrahlung [G. Moroff et al. Transfusion 26: 453 (1986)] oder UV allein [K. N. Proudouz et al., Blood 70: 589 (1987)] sind mit der Erhaltung der Funktion der roten Blutkörperchen vollständig inkompatibel.
Eine weitere Maßnahme zur Inaktivierung der Pathogene ist die Verwendung von Methylen-Blau. S. J. Wagner et al. untersuchten Methylen-Blau als Virozid für Lösungen roter Blutkörperchen. S. J. Wagner et al., Transfusion 33: 30 (1993). Die Lichtbehandlung roter Blutkörperchen mit Methylen-Blau verursachte Befunden zufolge einen Verlust von ATP, verstärkte Ionen-Permeabilität und die Bindung von autologem Immunglobulin (IgG) an die Oberfläche der roten Blutkörperchen. Es wurde spekuliert, dass eine gewisse allgemeine (und ungewünschte) Modifikation der Membran der roten Blutkörperchen als Folge der Behandlung stattfindet.
H. J. Creech et al. [Journal of Medicinal Chemistry, Bd. 15, Nr. 7, 739–746 (1972)] erörtert Antitumor- und Mutagen-Eigenschaften einer Reihe von heterocyclischen Stickstoff- und Schwefel-Senf-Verbindungen. V. Rytir et al., [Folia Microbiologica, Bd. 20, Nr. 1, 17–23 (1975)] untersucht die Wirkung bestimmter Verbindungen (einschließlich ICR-170) während der Eliminierung der Plasmide in E. coli. Weder H. J. Creech et al. noch V. Rytir et al. behandeln die Dekontamination von Blutprodukten oder klinischen Proben.
Ein weiterer Ansatz ist die Abreicherung des Erythrozytenproduktes von kontaminierenden Lymphozyten, die virale Pathogene bergen können. Es wurden sowohl die Leukodepletion mit Filtern und Gefrier-Tau-Arbeitsschritte untersucht. S. M. Bruisten et al., Transfusion 30: 833 (1990). Die vollständige Entfernung der Lymphozyten kann jedoch nicht mit diesen Verfahren erzielt werden. Die Leukodepletion richtet sich jedoch nicht an zellfreies Virus. Somit reicht dieser Ansatz nicht aus, damit das Blut vollständig sicher ist.
Schließlich gibt es den Ansatz der Vermeidung von Blut und der Verwendung von Blutsubstituenten. Hämoglobin-Lösungen, Perfluorkohlenstoff-Emulsionen, und in Vesikel eingeschlossenes Hämoglobin sind ebenfalls als Kandidaten vorgeschlagen. Leider haben sich diese als allgemeiner Ersatz jeweils als inadäquat erwiesen. Siehe R. M. Winslow In: Blood Safety: Current Challenges (S. J. Nance hrsg.) (AABB 1992) (S. 151–167).
Zusammengefasst besteht ein Bedarf an einer Maßnahme zur Inaktivierung von Virus-Pathogenen in Lösungen roter Blutkörperchen. Dieser Ansatz muss effektiv sein, ohne dass dem Blutprodukt oder dem Transfusions-Empfänger ein Schaden zugefügt wird.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung ist in den Patentansprüchen definiert und betrifft im Allgemeinen neue Verbindungen und Verfahren zur in-vitro-Aktivierung der Pathogene in biologischem Material, das zur in-vitro- oder in-vivo-Verwendung vorgesehen ist, und insbesondere zur Inaktivierung von Pathogenen in Lösungen, die rote Blutkörperchen enthalten, vor der klinischen Untersuchung oder Transfusion. Erfindungsgemäß wird eine Verbindung mit einem nukleinsäurebindenden Ligand und einer Senfgruppe selektiv zur Behandlung der Kontamination durch nukleinsäureenthaltende Mikroorganismen, einschließlich pathogener Viren, eingesetzt. Ohne die Absicht, einen Mechanismus für die vorliegende Erfindung vorzuschlagen, sind diese Verbindungen Alkylierungsmittel.
Die vorliegende Erfindung schlägt ein in-vitro-Verfahren zur Inaktivierung eines Pathogens aus Viren, Bakterien oder Protozoen in Säugerblut oder einem Produkt aus Blutbestandteilen vor, wobei das Verfahren umfasst:

(a) das Zusammenbringen in vitro von Säugerblut oder einem Blutbestandteile-Produkt, das unter dem Verdacht steht, dass es ein Pathogen enthält, mit einer das Pathogen inaktivierenden Menge einer ersten Verbindung, die einen nicht-kovalenten nukleinsäurebindenden Liganden und eine daran gebundene Gruppe aufweist, welche aus der aus Senfgruppen und Senfzwischenprodukten bestehenden Gruppe ausgewählt ist, und die beim Inkubieren mit dem Blut oder Blutprodukt zur Inaktivierung von mindestens 1 log Pathogen, welches im Blut oder Blutprodukt, wenn überhaupt, vorhanden ist, führt; und
(b) Gewinnen des pathogeninaktivierten Säugerbluts oder Blutbestandteile-Produkts, wobei das gewonnene Produkt im Wesentlichen seine biologische Aktivität beibehalten hat, wobei die erste Verbindung in einem R17-Bakteriophagen-Test eine größere Inaktivierungseffizienz gegenüber R17 als eine zweite Verbindung hat, welche eine Senfgruppe aufweist, jedoch keinen nicht-kovalenten nukleinsäurebindenden Ligand.

Bei einer Ausführungsform wird die erste Verbindung zu dem Säugerblut oder dem Blutbestandteile-Produkt in einer Endkonzentration der Verbindung von 4 bis 320 μM gegeben. Das Gemisch kann 1 min bis 48 Std. inkubiert werden. Die Verbindung kann zu dem Säugetier-Blut oder dem Blutbestandteile-Produkt in einem Gemisch zugegeben werden, das Dextrose, Natriumchlorid, Mannit, Adenin und H₂O enthält.
Das Blutprodukt kann in ein Säugetier übertragen werden. Bei einer Ausführungsform umfasst das Blutprodukt rote Blutkörperchen, Blutplättchen und Plasma. Konzentrate roter Blutkörperchen werden auch in Erwägung gezogen.
Die vorliegende Erfindung schlägt die Inaktivierung viraler als auch bakterieller Pathogene vor. Eine Verbindung, die erfindungsgemäß für dieses Verfahren vorgeschlagen wird, ist N1,N1-Bis(2-chlorethyl)-N6-(6-chlormethoxy-9-acridinyl)-1,4-pentandiamin. Man kann auch mehr als eine der Verbindungen zu dem Blut oder Blutbestandteile-Produkt zugeben. Die Erfindung umfasst auch einen Schritt nach der Inkubation des Gemischs, nämlich das Entfernen der Verbindung aus der biologischen Zusammensetzung mit einem Absorptionsmittelmaterial.
Die Verbindung kann zu dem Blutprodukt in einer Endkonzentration einer Verbindung mit einem nukleinsäurebindenden Ligand und einer Senfgruppe zwischen 1 μg/ml und 250 μg/ml zugegeben werden. Als weiteren Bestandteil schlägt die Erfindung vor, dass bei der Zugabe der Verbindung mit einem nukleinsäurebindenden Liganden und einer Senfgruppe zu dem Blutprodukt, die Verbindung in einem Gemisch vorliegt, das Dextrose, Natriumchlorid, Mannit, Adenin und H₂O umfasst. Das Blutprodukt kann auch in ein Säugetier transfundiert werden. Durch dieses Verfahren können virale und bakterielle Pathogene inaktiviert werden. Zudem wird ein Blutprodukt vorgeschlagen, das durch dieses Verfahren dekontaminiert wird. In diesem Verfahren eignen sich verschiedene Verbindungen, wie u. a.: N1,N1-Bis(2-chlorethyl)-N4-(6-chlor-2-methoxy-9-acridinyl)-1,4-pentandiamin. Außerdem kann mehr als eine der Verbindungen zu dem Blutprodukt zugegeben werden. Nach dem Inkubieren des Gemischs wird die Verbindung aus der biologischen Zusammensetzung mit einem adsorbierenden Material entfernt.
Bei einer weiteren Ausführungsform schlägt die Erfindung ein Verfahren zur Inaktivierung von Pathogenen in einer klinischen Probe vor, die zur klinischen Untersuchung aus Säugetieren entnommen wurde, umfassend in der folgenden Reihenfolge:

(a) Bereitstellen in einer beliebigen Reihenfolge:
– einer Verbindung mit einem nicht-kovalenten nukleinsäurebindenden Liganden und einer Gruppe, die einen kovalenten Komplex mit der Nukleinsäure des Pathogens bildet, und die aus der aus Senf und Senfzwischenprodukten bestehenden Gruppe ausgewählt ist;
– einer klinischen Probe, die unter dem Verdacht steht, dass sie mit Pathogenen kontaminiert ist;
(b) Zugeben der Verbindung zu der klinischen Probe, so dass man ein Gemisch erhält;
(c) Inkubieren des Gemischs für 1 min bis 48 Std.; und
(d) Messen des Spiegels eines klinischen chemischen Analyten in der klinischen Probe.

Eine Verbindung, die bei diesem Verfahren vorgeschlagen ist, ist N1,N1-Bis(2-chlorethyl)-N4-(6-chlor-2-methoxy-9-acridinyl)-1,4-pentandiamin, das vorzugsweise zur Erzielung einer N1,N1-Bis(2-chlorethyl)-N4-(6-chlor-2-methoxy-9-acridinyl)-1,4-pentandiamin-Konzentration hinzugegeben wird, die ausreicht, dass im Wesentlichen sämtliche Pathogene ohne signifikanten Schaden der klinischen Probe inaktiviert werden. Zudem, wenn N1,N1-Bis(2-chlorethyl)-N4-(6-chlor-2-methoxy-9-acridinyl)-1,4-pentandiamin zu der klinischen Probe gegeben wird, kann N1,N1-Bis-(2-chlorethyl)-N4-(6-chlor-2-methoxy-9-acridinyl)-1,4-pentandiamin in einem Gemisch vorliegen, das Dextrose, Natriumchlorid, Mannit, Adenin und H₂O umfasst.
Die vorliegende Erfindung schlägt spezifisch vor, dass die klinische Probe rote Blutkörperchen umfasst, und dass die inaktivierten Pathogene entweder bakterielle Pathogene oder virale Pathogene umfassen. Bei einer Ausführungsform erfolgt die Messung des Spiegels des klinischen Chemie-Analyten in der klinischen Probe ohne signifikante Schädigung der klinischen Probe.
Bei einer weiteren Ausführungsform schlägt die vorliegende Erfindung eine Stoffzusammensetzung vor, umfassend 5-[N,N-Bis(2-chlorethyl)amino]methyl-8-methoxypsoralen.
BESCHREIBUNG DER FIGUREN
1 ist ein Schaubild, das die Verringerung des Titers von R17 zeigt, das mit verschiedenen Chinakrin- Senf-Konzentrationen in entweder Adsol^TM oder Dimethylsulfoxid (DMSO) behandelt wurde. Die horizontale gepunktete Linie stellt die Nachweisgrenze des verwendeten Tests dar.
2 ist ein Schaubild, das die Inaktivierung von R17 durch Chinikrin-Senf als Funktion des Hämatokrits zeigt.
3 ist ein Schaubild, das die Inaktivierungskinetiken von Chinikrin-Senf zeigt.
4 ist ein Schaubild, das die Verringerung des Titers von R17 als Funktion der Inkubationszeit von Chinikrin-Senf in Adsol zeigt.
5 ist ein Schaubild, das die Reduktion der R17-Inaktivierungsaktivität als Funktion der Zeit bei Inkubation in Gegenwart von Adsol, roten Blutkörperchen oder Amberlite XAD-16^TM zeigt.
6 ist ein Schaubild, das die Wirkungen von Chinikrin-Senf bei verschiedenen Konzentrationen auf extrazelluläre Kalium-Spiegel zeigt.
7 ist ein Schaubild, das die Reduktion des Titers von R17 zeigt, das mit verschiedenen Chinikrin-Senf-Konzentrationen behandelt wurde; die horizontal gepunktete Linie veranschaulicht die Nachweisgrenze des verwendeten Tests.
8 ist ein Schaubild, das die Aktivität des Chinikrin-Senfs nach der Inkubation in roten Blutkörperchen mit oder ohne vorhandenes Amberlite XAD-16^TM in einem Ames-Test mit dem Stamm TA 1537 zeigt.
9 ist ein Schaubild, das die Inaktivierung eines Bakterienstamms, Staphylococcus epidermis, mit Chinikrin-Senf bei verschiedenen Konzentrationen zeigt.
BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft im allgemeinen eine neue Verbindung und Verfahren zur in-vitro-Inaktivierung von Pathogenen in biologischem Material, das für eine in-vitro- oder in-vivo-Verwendung vorgesehen ist, und insbesondere die Inaktivierung von Pathogenen in Lösungen, die rote Blutkörperchen enthalten, vor der klinischen Untersuchung oder Transfusion. Erfindungsgemäß wird eine Verbindung mit einem nukleinsäurebindenden Liganden und einer Senfgruppe selektiv zur Behandlung von Kontamination durch nukleinsäurehaltige Mikroorganismen, wie u. a. pathogenen Viren und Bakterien, eingesetzt.
I. ERFINDUNGSGEMÄß EINGESETZTE VERBINDUNGEN
Verfahren zur Dekontamination der roten Blutkörperchen mit lichtaktivierten Verbindungen haben in der Vergangenheit aufgrund der Absorptionsfähigkeit durch Hämoglobin von Licht bei Wellenlängen, die zur Aktivierung der Verbindungen nötig sind, ein Problem erfahren. Obwohl die bisherigen Verfahren Pathogene in anderen Medien inaktivieren würden, sind sie somit in Anwesenheit von roten Blutkörperchen ineffizient. Die vorliegende Erfindung schlägt dagegen ein Verfahren zur Sterilisation vor, das die Pathogene sogar in Konzentraten roter Blutkörperchen effizient inaktivieren kann [Hämatokrit-Werte von 1% bis 60% oder mehr].
Die vorliegende Erfindung schlägt die Behandlung von Lösungen roter Blutkörperchen mit einer Verbindung vor, die Pathogene inaktiviert, ohne dass ein Aussetzen gegenüber Licht notwendig ist. Der erfindungsgemäße Vorteil zur Inaktivierung in Flüssigkeiten zur Transfusion ist zweifach. Erstens ist kein Licht erforderlich, was eine weniger komplexe Technologie zur Inaktivierung ermöglicht. Zweitens wird die Dekontaminationsverbindung vollständig nach einer kurzen Zeitdauer umgesetzt. Die Behandlung ist je nach der verwendeten Verbindung in mehreren Minuten oder Stunden beendet. Das Material, das nicht mit den Nukleinsäuren reagiert oder ein anderes Biomolekül hydrolysiert, lässt keine Verbindung zur Transfusion zurück.
Man möchte zwar nicht auf einen bestimmten erfindungsgemäßen Wirkmechanismus eingeschränkt werden, jedoch haben die erfindungsgemäßen Verbindungen zwei Eigenschaften gemeinsam. Die erste Eigenschaft ist, dass sie die Nukleinsäure nicht-kovalent binden. Die zweite ist, dass sie mindestens eine Senfgruppe haben.
A. Nicht-kovalente nukleinsäurebindende Gruppe
Eine Verbindung, die die Nukleinsäure bindet, hat einen "nukleinsäurebindenden Liganden", der hier als Gruppe definiert ist, die eine Affinität für Nukleinsäuren hat und diese nicht-kovalent binden kann. Es gibt mehrere Arten der Bindung an Nukleinsäuren. Verbindungen, die durch eine der folgenden Arten, Kombinationen davon oder andere Arten binden, werden als nukleinsäurebindende Liganden angesehen. Die Erfindung ist zwar nicht auf die folgenden Verbindungen eingeschränkt, jedoch sind einige Beispiele für nukleinsäurebindende Liganden: a) Interkalationsverbindungen, wie Acridine, Acridone, Proflavin, Acriflavin, Actinomycine, Anthracyclinone, Beta-Rhodomycin A, Daunamycin, Thiaxanthenone, Miracil D, Anthramycin, Mitomycin, Echinomycin, Chinomycin, Triostin, Diacridine, Ellipticene (einschließlich Dimeren, Trimeren und Analoga), Norphilin A, Fluorene und Fluorenone, Fluorenodiamine, Chinakrin, Benzacridine, Phenazine, Phenanthradine, Phenothiazine, Chlorpromazin, Phenoxazine, Benzothiazole, Xanthene und Thioxanthene, Anthrachinone, Anthrapyrazole, Benzothiopyranoindole, 3,4-Benzpyren, Benzopyrendiolepoxidie, 1-Pyrenyloxiran, Benzanthracen-5,6-oxid, Benzodipyrone, Benzothiazole, Chinolone, Chloroquin, Chinin, Phenylchinolincarboxamide, Furocumarine, wie Psoralene und Isopsoralene, Ethidiumsalze, Propidium, Coralyne, Ellipticin-Kation und -Derivate, polycyclische Kohlenwasserstoffe und ihre Oxiran-Derivate, und Echinimycin; b) Mittel, die an die kleine Furche binden, wie Distamycin, Mitomycin, Netropsin, andere Lexitropsine, Hoechst 33258 und andere Hoechst-Farbstoffe, DAPI (4',6'-Diamidin-2-phenylindol), Berenil, und Triarylmethan-Farbstoffe; c) Mittel, die an die große Furche binden, wie Aflatoxine; d) Moleküle, die durch Elektrostatik binden (Mittel, die an das Phosphat-Rückgrat binden), wie Spermin, Spermidin, und andere Polyamine; e) Nukleinsäuren oder Analoga, die durch sequenzspezifische Wechselwirkungen, wie Tripelhelix-Bildung, D-Loop-Bildung und direkte Basenpaarung an einzelsträngige Ziele binden.
Man möchte nicht auf einen bestimmten Mechanismus eingeschränkt sein, jedoch nimmt man an, dass der nukleinsäurebindende Ligand als Träger (oder Anker) wirkt, der das Molekül zur Nukleinsäure weist (oder hinführt) und damit nicht-kovalent wechselwirkt.
B. Senfgruppe
Die zweite Eigenschaft, die die erfindungsgemäß verwendeten Verbindungen gemeinsam haben, ist, dass sie mindestens eine Senfgruppe enthalten. Eine "Senfgruppe" hat hier definitionsgemäß Mono- oder Bis-Halogenethylamingruppen und Monohalogenethylsulfid-Gruppen.
Die vorliegende Erfindung ist nicht strikt auf Senfverbindungen eingeschränkt. Man nimmt an, dass die Senfverbindungen reaktive Zwischenprodukte bilden können, wie Aziridinium- oder Aziridin-Komplexe und Schwefel-Analoga dieser Komplexe.
Man möchte zwar nicht auf einen bestimmten Mechanismus eingeschränkt sein, jedoch reagieren Verbindungen mit Senfgruppen bekanntlich mit Nukleinsäuren und bilden kovalente Komplexe, die die Nukleinsäure-Replikation hemmen. Sie sind gewöhnlich Feststoffe, die beim Auflösen in einem Medium, das Nukleophile enthält, vollständig innerhalb von Minuten oder Stunden reagieren. Einige Beispiele sind nachstehend aufgeführt.
Stickstoff-Senfverbindungen sind Mitglieder der Klasse von Verbindungen mit einem nukleinsäurebindenden Liganden und einer Senfgruppe, die eingehend in der Literatur beschrieben sind. Siehe beispielsweise Gravatt, G. L. et al., "DNA-Directed Alkylating Agents. 4,4-Anilinoquinoline-Based Minor Groove Directed Aniline Mustards", J. Med. Chem. 34: 1552 (1991) Cummings, J. et al., "Determination of Reactive Nitrogen Mustard Anticancer Drugs in Plasma by High-Performance Liquid Chromatography Using Derivatization," Anal. Chem. 63: 1514 (1991). Sie sind bekanntlich leistungsstarke Nukleinsäure-Alkylierungsmittel, und aufgrund dieser Wirkungsweise wurden sie weithin als Antitumormittel untersucht. Einige werden in der Klinik praktisch angewendet (beispielsweise Anilin-Senf, Chlorambucil, Melphalan).
Eine Klasse der Stickstoff-Senfverbindungen sind die Anilin-Senfverbindungen. Auf diesen Verbindungen befindet sich mindestens eine Halogenethylaminoanilin-Gruppe, wobei das Halogenethyl Mono- oder Bis- sein kann. Ein Beispiel für eine Bis(halogenethyl)aminoanilin-Gruppe erscheint nachfolgend (wobei R der Verbindungspunkt zu anderen Gruppen ist):
Eine spezifische Anilin-Senfgruppe ist die Gruppe der Anilin-Senfverbindungen auf Acridin-Träger (beschrieben von Gravatt et al., J. Med. Chem. 34: 1552), wobei R eine Verbindungsgruppe umfasst (beispielsweise O, CH₂, S, COHN oder CO, jedoch werden andere Verbindungsgruppen in Betracht gezogen), welche die Senfgruppe an einen zweiten Bestandteil, eine Acridingruppe, bindet. Ein Beispiel für die Bestandteile einer Anilin-Senfverbindung mit 9-Aminoacridin-Träger erscheint nachstehend (wobei X die Verbindungsgruppe ist):
Die vorliegende Erfindung zeigt, dass eine spezifische Verbindung mit einem nukleinsäurebindenden Ligand und einer Senfgruppe, N1,N1-Bis(2-chlorethyl)-N4-(6-chlor-2-methoxy-9-acridinyl)-1,4-pentandiamin-dihydrochlorid ("Chinikrin-Senf") als Antivirusmittel für rote Blutkörperchen geeignet ist. Chinikrin-Senf ist kommerziell erhältlich (von Aldrich, Milwaukee, WI, als Chinikrin-Senf-Dihydrochloridhydrat, dessen Struktur nachstehend gezeigt ist).
II. MATERIALIEN ZUR DEKONTAMINATION
Die vorliegende Erfindung schlägt eine neue Verbindung und eine neue Verwendung für Verbindungen mit. einem nukleinsäurebindenden Liganden und einer Senfgruppe vor: die Inaktivierung von Viren und Bakterien in Blut, Blutprodukten und anderen biologischen Zusammensetzungen. Die folgenden biologischen Zusammensetzungen sind zwar keine ausschließliche Liste, jedoch werden sie in Betracht gezogen und im Allgemeinen als "Proben" bezeichnet. Von den erwogenen Blut und Blutbestandteilen umfassen beispielhafte Zusammensetzungen Vollblut, gepackte rote Blutkörperchen, Blutplättchen, Plasma (frisches oder frisches gefrorenes Plasma) und Proteine, die von Blut oder Blutbestandteilen hergeleitet sind. Blutbestandteile umfassen auch Plasmaprotein-Anteil, Antihämophilie-Faktor (AHF, Faktor VIII); Faktor IX und Faktor IX-Komplex (Faktoren II, VII, IX und X); Fibrinogene, Faktor XTII, Prothrombin und Thrombin (Faktor II und IIa); Immunglobuline (beispielsweise IgA, IgD, IgE, IgG und IgM und deren Fragmente, beispielsweise Fab, F(ab')₂ und Fc); Hyperimmunglobuline, wie sie gegen Tetanus und Hepatitis B verwendet werden; Cryopräzipitat; Albumin; Interferone; Lymphokine; und Transfer-Faktoren. Die vorliegende Erfindung erwägt auch als Teil von Blut und Blutprodukten, eine synthetische Version von Blut oder Blutprodukt.
Die erfindungsgemäßen Verfahren und die erfindungsgemäße Verbindung eignen sich ebenfalls zur Inaktivierung von Pathogenen in biologischen Zusammensetzungen, umfassend Impfstoffe, aus rekombinanter DNA erzeugte Proteine, Oligopeptid-Liganden, usw. Biologische Zusammensetzungen umfassen auch andere klinische Proben als Blut und Blutbestandteile, wie Urin, Speichel, Fezes, Spinalflüssigkeit und andere Materialien, die zur klinischen Untersuchung aus Säugetieren entnommen werden.
III. INAKTIVIERUNG VON PATHOGENEN
Die vorliegende Erfindung schlägt die Behandlung eines Blutproduktes mit einer Verbindung mit einem nukleinsäurebindenden Ligand und einer Senfgruppe zur Inaktivierung kontaminierender Pathogen-Nukleinsäuresequenzen vor der Verwendung des Blutproduktes vor.
A. Inaktivierung im Allgemeinen
Der Begriff "Inaktivierung" ist hier definiert als eine derartige Veränderung der Nukleinsäure einer Pathogeneinheit, dass sich die Pathogeneinheit nicht replizieren kann. Dies unterscheidet sich von einer "vollständigen Inaktivierung", wobei sich alle in einer gegebenen Probe vorhandenen Pathogeneinheiten nicht replizieren können oder "wesentliche Inaktivierung", wobei sich die meisten vorhandenen Pathogeneinheiten nicht replizieren können. "Inaktivierungseffizienz" einer Verbindung ist definiert als das Ausmaß der Inaktivierung, die die Verbindung bei einer bestimmten Konzentration der Verbindung oder Strahlungsdosis erzielen kann. Würden beispielsweise 100 μM einer hypothetischen Verbindung X 5 log HIV-Virus inaktivieren, wohingegen unter den gleichen Versuchsbedingungen die gleiche Konzentration von Verbindung Y nur 1 log Virus inaktiviert, dann hat die Verbindung X eine bessere "Inaktivierungseffizienz" als Verbindung Y.
Zur Abschätzung, dass ein "Inaktivierungs"-Verfahren eine "vollständige Inaktivierung" erzielen kann oder nicht, betrachtet man am besten ein spezifisches Beispiel. Eine Bakterienkultur wird als inaktiviert angesehen, wenn ein Aliquot der Kultur, wenn sie auf eine frische Kulturplatte überführt wird und sie dort wachsen gelassen wird, nach einem bestimmten Zeitraum nicht nachweisbar ist. Eine minimale Anzahl lebensfähiger Bakterien muss auf die Platte aufgetragen werden, damit ein Signal nachweisbar wird. Mit dem optimalen Nachweisverfahren ist die minimale Anzahl 1 Bakterienzelle. Mit einem suboptimalen Nachweisverfahren kann die minimale Anzahl an so aufgebrachten Bakterienzellen, dass ein Signal beobachtet wird, viel größer als 1 sein. Das Nachweisverfahren bestimmt eine "Schwelle", unterhalb der das "Inaktivierungsverfahren" vollständig effektiv zu sein scheint (und oberhalb der die "Inaktivierung" tatsächlich nur partiell effektiv ist).
B. Inaktivierung potentieller Pathogene
Die gleichen Überlegungen hinsichtlich des Nachweisverfahrens und der Schwelle existieren bei der Bestimmung der Empfindlichkeitsgrenze eines Inaktivierungsverfahrens für Nukleinsäure. Wiederum bedeutet "Inaktivierung", dass eine Pathogeneinheit sich nicht replizieren kann.
Im Falle der Inaktivierungsverfahren für Material, das von Menschen in vivo oder in vitro verwendet wird, kann das Nachweisverfahren theoretisch herangezogen werden, um das Ausmaß der Infektion mit einer Krankheit als Folge der Einwirkung des Materials zu messen. Die Schwelle, unter der das Inaktivierungsverfahren beendet ist, wird dann als Ausmaß der Inaktivierung verwendet, das zur Verhinderung des Krankheitsausbruchs aufgrund von Kontakt mit dem Material ausreicht. Man erkennt, dass es in diesem Praxis-Szenario nicht entscheidend ist, dass die erfindungsgemäßen Verfahren zu einer "vollständigen Inaktivierung" führen. D. h. eine "wesentliche Inaktivierung" ist angemessen, so lange der überlebende Anteil keine Krankheit verursachen kann. Somit werden "im Wesentlichen sämtliche" Pathogene inaktiviert, wenn jeglicher überlebende Anteil des verbleibenden Pathogens keine Krankheit verursachen kann. Das erfindungsgemäße Inaktivierungsverfahren inaktiviert im Wesentlichen die Nukleinsäure in Pathogenen. Bei einer Ausführungsform inaktiviert im Wesentlichen das Inaktivierungsverfahren die Nukleinsäure des Pathogens in Blutpräparaten.
Man möchte zwar nicht auf irgendein Verfahren eingeschränkt sein, durch das die erfindungsgemäßen Verbindungen die Pathogene inaktivieren, jedoch nimmt man an, dass die Inaktivierung auf der Alkylierung von Anteilen der Pathogen-Nukleinsäure beruht. Es ist zwar nicht beabsichtigt, dass das erfindungsgemäße Inaktivierungsverfahren durch die Beschaffenheit der Nukleinsäure eingeschränkt ist; jedoch nimmt man an, dass das Inaktivierungsverfahren sämtliche Formen der Nukleinsäure (unabhängig davon, ob es sich um DNA, mRNA usw. handelt) im Wesentlichen inaktiviert.
Wenn eine Verbindung mit einem nukleinsäurebindenden Liganden und einer Senfgruppe zur Modifikation der Nukleinsäure verwendet wird, verhindert die Wechselwirkung der Pathogen-Nukleinsäure (unabhängig davon, ob es sich um DNA, mRNA usw. handelt) mit der Verbindung vorzugsweise die Replikation des Pathogens, so dass es, wenn ein Mensch dem behandelten Pathogen ausgesetzt wird, zu keiner Infektion kommt.
Der Begriff "synthetische Medien" ist hier definiert als wässriges synthetisches Speichermedium für Blut oder ein Blutprodukt. Bei einer Ausführungsform schlägt die vorliegende Erfindung das Inaktivieren von Blutprodukten in synthetischen Medien, die eine gepufferte Salzlösung enthalten, vor.
Die vorliegende Erfindung inaktiviert Pathogene auf der Basis von Nukleinsäuren in Blut durch ein einzelnes Verfahren. Somit hat dies das Potential zur Eliminierung von Bakterien, Protozoen sowie Viren. Die vorliegende Erfindung soll nicht durch die Zahl oder die Beschaffenheit der inaktivierten Pathogene eingeschränkt sein. Die erfindungsgemäße Behandlung blockiert bedeutenderweise jedoch die Replikation des HIV-Virus. Hätte ein effizientes Dekontaminationsverfahren vor der Lösung der AIDS-Pandemie zur Verfügung gestanden, wäre keine HIV-Übertragung durch Transfusion aufgetreten. Eine Dekontamination auf der Basis von Verbindungen mit einem nukleinsäurebindenden Liganden und einer Senfgruppe hat das Potential zur Eliminierung sämtlicher infektiöser Mittel aus der Blutversorgung, ungeachtet des beteiligten Pathogens.
C. Auswahl von Verbindungen zur Inaktivierung von Pathogenen
Zur Bewertung einer Verbindung zur Entscheidung, ob diese sich bei den erfindungsgemäßen Dekontaminationsverfahren eignet, wurden zwei wichtige Eigenschaften in Erwägung gezogen: 1) Die Fähigkeit der Verbindung zur Inaktivierung der Pathogene und 2) ihre Mutagenität nach der Behandlung. Die Fähigkeit einer Verbindung zur Inaktivierung der Pathogene kann durch verschiedene Verfahren bestimmt werden. Eine Technik ist die Durchführung eines Bakteriophagen-Screenings; ein Test, der die Nukleinsäurebindung der Testverbindungen bestimmt. Ein derartiges Screening, ein R17-Screening, wird eingehend in einem nachstehenden Beispiel beschrieben. Zeigt das R17-Screening eine Inaktivierungs-Aktivität, eignet es sich zur direkten Untersuchung der Fähigkeit der Verbindung zur Inaktivirung eines Virus. Ein Verfahren zur Durchführung eines direkten Virus-Inaktivierungs-Screenings ist eingehend in einem nachstehenden Beispiel für zellfreies HIV beschrieben.
Das R17-Bakteriophagen-Screening sagt wahrscheinlich die HIV-Inaktivierungs-Effizienz sowie die Effizienz von Verbindungen gegen viele andere Viren voraus. R17 wurde deshalb ausgewählt, weil man erwartete, dass es ein sehr schwierig zu inaktivierendes Pathogen ist. Es ist auch ein kleiner einzelsträngiger RNA-Phage. Man möchte nicht auf eine beliebige Maßnahme eingeschränkt sein, mit der die vorliegende Erfindung arbeitet, jedoch erwartet man, dass sich kürzere Nukleinsäure-Fragmente schwieriger inaktivieren lassen, weil sie ein kleineres Ziel für die Verbindung darstellen. Somit wird erwartet, dass man unter Bedingungen, die die Inaktivierung von R17 herbeiführen, auch viele Viren und Bakterien inaktivieren kann.
Das zellfreie HIV-Screening komplementiert das R17-Screening durch Bestätigung, dass eine bestimmte Verbindung, die sich im R17 als positiv erwiesen hat, tatsächlich Viren effizient inaktiviert. Zeigt eine Verbindung im R17-Screening Aktivität, wird sie somit anschließend im Virus-Inaktivierungs-Screening untersucht.
Die zweite Eigenschaft, die bei der Untersuchung einer Verbindung zur Verwendung bei den erfindungsgemäßen Verfahren wichtig ist, ist die Mutagenität nach der Behandlung. Der am häufigsten verwendete Mutagen-Karzinogen-Screening-Test ist der Ames-Test. Dieser Test ist beschrieben in D. M. Maron und B. N. Ames in Mutation Research 113: 173 (1983) und ein spezifisches Screening ist eingehend in einem Beispiel unten beschrieben. Der Ames-Test nutzt mehrere einzigartige Salmonella typhimurium-Stämme, deren Wachstum histidinabhängig ist und denen das übliche DNA-Reparatur-Enzym fehlt. Die Häufigkeit der normalen Mutationen, die die Bakterien histidinunabhängig machen (d. h. die Häufigkeit spontaner Revertanten), ist niedrig. Der Test ermöglicht einem die Bewertung des Einflusses jeglicher chemischer Rest-Einheiten, die nach der Behandlung dieser Revertanten-Häufigkeit verbleiben.
Da einige Substanzen nicht selbst mutagen sind, aber durch Stoffwechselwirkung in ein Mutagen umgewandelt werden können, wird die zu untersuchende Verbindung mit den Bakterien auf Agarplatten zusammen mit dem Leberextrakt gemischt. Der Leberextrakt täuscht die Stoffwechselwirkung in einem Tier vor. Kontrollplatten enthalten nur die Bakterien und den Extrakt.
Die Gemische werden dann inkubiert. Das Wachstum der Bakterien (sofern überhaupt) wird durch Zählen der Kolonien überprüft. Bei einem positiven Ames-Test liegt die Anzahl der Kolonien auf den Platten mit Gemischen, die die Verbindung enthalten, signifikant höher als die Zahl auf den entsprechenden Kontrollplatten.
Werden die bekannten Karzinogene auf diese Weise mit dem Ames-Test untersucht, sind etwa 90 Prozent positiv. Werden bekannte Nichtkarzinogene entsprechend untersucht, sind etwa 90 Prozent negativ.
Eine Verbindung (X) kann als potentielle Dekontaminationsverbindung zur erfindungsgemäßen Verwendung, wie in der nachstehenden Tabelle 1 gezeigt, bewertet werden. X wird zu Beginn in Schritt I bewertet. X wird in dem R17-Test in Gegenwart roter Blutkörperchen bei mehreren verschiedenen Konzentrationen zwischen 4 und 320 μM, wie im nachstehenden Beispiel erläutert, untersucht. Zeigt die Verbindung bei jeder Konzentration eine größere Inaktivierungsaktivität als 1 log Inaktivierung von R17 (log Abtötung) im R17-Screening, wird die Verbindung dann in dem zellfreien HIV-Test, Schritt II, wie in einem nachstehenden Beispiel erläutert, untersucht. Zeigt die Verbindung eine Inaktivierungsaktivität größer als 1 log Inaktivierung von HIV (log Abtötung) in dem zellfreien HIV-Test, ist die Verbindung ein geeignetes Mittel zur Inaktivierung von Pathogenen in klinischen Testproben. Wird die Verbindung auf Dekontamination der biologischen Materialien, die in vivo verwendet werden sollen, untersucht, durchlaufen sie Schritt III. Ein durch das erfindungsgemäße Verfahren dekontaminiertes biologisches Material wird im Ames-Test untersucht und es wird bestimmt, ob jegliche nach der Dekontamination verbleibende Verbindung mutagen ist. Zeigt schließlich das restliche Material keine signifikante Mutagenität im Ames-Test, wird die Verbindung als geeignetes Mittel zur Inaktivierung der Pathogene in Produkten identifiziert, die auch in vivo verwendet werden sollen.
TABELLE 1
Anhand dieser Anweisungen kann eine Person bestimmen, welche Verbindungen sich zur Verwendung in den erfindungsgemäßen Verfahren eignen.
D. Abgabe und Entfernung der Verbindungen zur Inaktivierung
Die vorliegende Erfindung schlägt mehrere verschiedene Formulierungen und Wege vor, durch die die hier beschriebenen Verbindungen in einem Inaktivierungsverfahren abgegeben und wenn gewünscht entfernt werden können. Dieser Abschnitt ist lediglich veranschaulichend und soll die Erfindung keineswegs auf irgendeine Behandlungsform oder irgendein Behandlungsverfahren mit den Verbindungen einschränken.
Die Verbindungen können in einem Inaktivierungsverfahren in verschiedenen Formen und zu verschiedenen Zeiten eingebracht werden, die von dem Zweck abhängen können, für den das Blutpräparat dekontaminiert wird. Die Verbindungen können beispielsweise als wässrige Lösung in Wasser, Salzlösung, synthetischen Medien oder einer Vielzahl anderer Medien eingebracht werden. Die Verbindungen können alternativ als trockene Formulierungen mit oder ohne Hilfsstoffe bereitgestellt werden. Die Verbindungen können darüber hinaus allein oder in einem "Cocktail" oder Gemisch von mehreren verschiedenen Verbindungen eingebracht werden. Bei einer bevorzugten Ausführungsform wird eine Verbindung mit einem nukleinsäurebindenden Liganden und einer Senfgruppe bei einer Konzentration von weniger als 250 μM eingesetzt.
Die Verbindungen können direkt mit dem Blut oder Blutprodukt gemischt werden oder als Lösung oder Suspension in einer biologisch kompatiblen Flüssigkeit [wie Adsol (dessen Inhalt im nachstehenden Experimente-Abschnitt beschrieben ist) oder einem organischen Lösungsmittel (beispielsweise Dimethylsulfoxid (DMSO), Ethanol, Glycerin, Polyethylenglykol (PEG) oder Polypropylenglykol)] hergestellt werden und dann mit dem Blut gemischt werden. Die neuen Verbindungen können ebenfalls an verschiedenen Stellen in dem Inaktivierungs-Verfahren bereitgestellt werden. Die Verbindung kann beispielsweise in das Reaktionsgefäß, wie einen Blutbeutel, zum Zeitpunkt der Herstellung eingebracht werden. Alternativ kann die Verbindung zu dem zu sterilisierenden Material gegeben werden, nachdem es in dem Reaktionsgefäß untergebracht wurde.
1. Dekontamination der klinischen Proben
Eine klinische Probe ist definiert als beliebiges Material, das aus Säugetieren zur klinischen Untersuchung entfernt werden soll, einschließlich, aber nicht eingeschränkt auf Blut und Blutbestandteile, Urin, Speichel, Fezes, Knochenmark und Spinalflüssigkeit. Ein Serum-Analyt ist hier definiert als Bestandteil, der sich in klinischen Proben findet, und der in klinischen Chemie-Untersuchungen gemessen wird. Beispiele für Serumanalyten umfassen, sind aber nicht eingeschränkt auf Glucose, Blutharnstoff-Stickstoff, Kreatinin, Blutharnstoff- Stickstoff/Kreatinin-Verhältnis, Natrium, Kalium, Chlorid, Magnesium, Calcium, anorganischen Phosphor, Gesamt-Protein, Albumin, Gesamt-Globulin, Albumin/Globulin-Verhältnis, Billirubin, alkalische Phosphatase, Lactatdehydrogenase, Glutamattransferase, Aspartattransaminase, Alaninaminotransferase, Harnsäure, Eisen, Triglyceride und Cholesterin.
Bei der Dekontamination klinischer Proben ist das Ziel die Dekontamination der Probe, damit die Erreger nicht auf die Mitarbeiter des Kliniklabors übertragen werden können. Weil die Proben nicht in einen Empfänger übertragen werden, ist es weniger bedeutend, dass die restliche Verbindung aus der Probe entfernt wird. Daher können Reinigungstechniken nicht gewünscht sein. Die vorliegende Erfindung schlägt vor, dass die Verbindung in dem klinischen Testprobenröhrchen zugegen ist, bevor die Probe dem Patient entnommen wird, oder sie kann nach der Entnahme zugegeben werden. Sobald die Verbindung die Probe kontaktiert hat, wird die Probe vorzugsweise sorgfältig gemischt und dann inkubiert. Die Probe kann dann in der gewünschten Gruppe der klinischen Chemie-Untersuchungen untersucht werden, ohne dass die Gefahr besteht, dass infektiöse Krankheiten verbreitet werden.
2. Dekontamination von Blutprodukten zur Transfusion.
Die Verbindung zur Dekontamination kann zum Vollblut vor der Fraktionierung zugegeben werden, indem sie vor oder nach der Entnahme des Blutes in den Blutbeutel gefügt wird. Alternativ kann die Verbindung nach der Fraktionierung des Blutes zugegeben werden, wobei die einzelnen Fraktionen dekontaminiert werden.
Bei Produkten zur Transfusion kann es in einigen Fällen wünschenswert sein, die restliche Verbindung oder die chemischen Reaktionsprodukte nach der Behandlung des Produktes, aber vor der Transfusion, zu entfernen. Die vorliegende Erfindung schlägt die Entfernung oder das "Reinigen" der Verbindung aus dem Blutprodukt nach der Belichtung und vor der Transfusion vor. Bei einer Ausführungsform kann eine restliche Verbindung oder ein chemisches Produkt mit einem Adsorptionsmaterial entfernt werden. Beispiele für adsorbierende Materialien, die sich erfindungsgemäß verwenden lassen, sind u. a., aber nicht eingeschränkt auf: Aktivkohle (und zwar unbeschichtet oder mit einem Polymer beschichtet), Kieselgel, Umkehrphasen-Kieselgel, Polymeradsorptionsmittel und modifizierte Polymeradsorptionsmittel. Die vorliegende Erfindung schlägt mehrere Wege zur Einbringung des Adsorptionsmaterials zu den Blutprodukten für die Transfusion vor. Das Adsorptionsmittel kann direkt mit den Blutprodukten gemischt werden und anschließend ausfiltriert werden. Alternativ können die Blutprodukte durch einen Filter geleitet werden, der das Adsorptionsmaterial enthält.
3. Dekontamination von Impfstoffen und anderen biologischen Zusammensetzungen
Impfstoffe und andere biologische Zusammensetzungen, die nicht von Blut hergeleitet sind, wie aus rekombinanter DNA hergestellte Proteine und Oligopeptid-Liganden, können ebenfalls mit den erfindungsgemäßen Verfahren dekontaminiert werden. Durch rekombinante DNA erzeugte Proteine werden oft in großen Mengen in Wirts-Organismen hergestellt. Das Einbringen der Dekontaminationsverbindung kann vor der Amplifikation erfolgen, so dass die Verbindung beim Wachsen der Wirtsorganismen in den Organismus eingebracht wird. Alternativ kann die Verbindung nach der Herstellung der Verbindung, aber vor dem Einbringen in ein Säugetier, zugegeben werden.
Die Entfernung der Verbindung vor dem Gebrauch kann hier genauso wie bei Blutprodukten für die Transfusion gewünscht sein. Diese vorstehend genannten Verfahren finden ebenfalls gute Anwendung bei Impfstoffen und anderen biologischen Zusammensetzungen.
V. ERHALTUNG DER BIOCHEMISCHEN EIGENSCHAFTEN VON BEHANDELTEM MATERIAL
Bei der Behandlung von Blutprodukten, die in vivo verwendet werden sollen, muss man sich fragen, ob das Verfahren oder die verwendeten Verbindungen die in-vivo-Aktivität des behandelten Materials verändern. Eine Transfusion roter Blutkörperchen ist beispielsweise eine gut etablierte wirksame Behandlung für Patienten, die an starkem Blutverlust leiden. Wenn jedoch die verwendete Inaktivierungsbehandlung die in-vivo-Überlebensdauer der roten Blutkörperchen stark reduziert, dann hat die Behandlung keinen praktischen Wert. Die erfindungsgemäßen Verbindungen eignen sich bei Inaktivierungsverfahren, weil die Reaktion bei Temperaturen durchgeführt werden kann, die mit der Erhaltung der biochemischen Eigenschaften von Blut und Blutprodukten kompatibel sind. Jedoch nicht alle Verfahren der Pathogen-Inaktivierung inaktivieren, ohne dass die biologische Aktivität des dekontaminierten Materials signifikant gesenkt wird. Vorher bekannte Verbindungen und Protokolle zur Inaktivierung benötigten sowohl ein Aussetzen gegenüber Licht und die darauffolgende Entfernung von molekularem Sauerstoff aus der Reaktion vor und während der Belichtung, damit ein Schaden der Blutprodukte durch die Sauerstoffradikale, die während der Bestrahlung entstehen, verhindert wird. Siehe L. Lin et al., Blood 74: 517 (1989); US-Patent Nr. 4,727,027 von Wiesehahn. Die vorliegende Erfindung kann zur Dekontamination von Blutprodukten ohne Licht und in Gegenwart von Sauerstoff verwendet werden, ohne dass die Aktivität, für die die Produkte hergestellt werden, zerstört wird. Mit den Verfahren der vorliegenden Erfindung besteht darüber hinaus kein Bedarf zur Verringerung der Konzentration an molekularem Sauerstoff.
Die vorliegende Erfindung schlägt vor, dass die in-vivo-Aktivität eines Blutproduktes nicht zerstört oder signifikant gesenkt wird, wenn sich das Blutprodukt, das durch die erfindungsgemäßen Verfahren dekontaminiert wird, in bekannten Tests auf die Funktion des jeweiligen Blutproduktes so verhält, als wäre es ein normal funktionierendes Blutprodukt. Die Aktivität einer klinischen Probe wird nicht zerstört oder signifikant gesenkt, wenn sich die klinische Probe, die durch die erfindungsgemäßen Verfahren dekontaminiert wird, in üblichen klinischen Chemie-Tests wie eine unbehandelte Probe verhält. Ein Blutprodukt oder eine klinische Probe hat einen "wesentlichen Schaden" erlitten, wenn das Blutprodukt nicht länger den Zweck erfüllt, für den es hergestellt wurde. Sind beispielsweise rote Blutkörperchen betroffen, wird die in-vivo-Aktivität nicht zerstört oder signifikant gesenkt, wenn die AMP-Spiegel, die IgG-Bindung und die extrazellulären Kaliumspiegel der roten Blutkörperchen, die durch die erfindungsgemäßen Verfahren behandelt wurden und 9 Tage aufbewahrt wurden, genauso wie bei unbehandelten Proben sind, die 9 Tage aufbewahrt wurden. Entsprechend erleidet eine klinische Probe keinen signifikanten Schaden, wenn sich eine behandelte Probe in einem oder mehreren üblichen klinischen Chemie-Tests im wesentlichen genauso wie eine unbehandelte Probe verhält. "Im Wesentlichen genauso" bedeutet, dass die Werte für die behandelten Proben keine Änderung aufweisen, die um 10% größer ist als die Änderung der Werte bei einer nicht-behandelten Kontrolle. Im Falle der roten Blutkörperchen erfolgt dieser Vergleich nach einer 9 Tage dauernden Lagerung nach der Behandlung.
EXPERIMENTE
Die folgenden Beispiele veranschaulichen bestimmte bevorzugte Ausführungsformen und Aspekte der vorliegenden Erfindung und sollen deren Schutzbereich nicht einschränken.
Bei der nachfolgenden Offenbarung der Experimente gelten die folgenden Abkürzungen: Äq. (Äquivalente); M (Molar); μM (Mikromolar); N (Normal); mol (Mol); mmol (Millimol); μmol (Mikromol); nmol (Nanomol); g (Gramm); mg (Milligramm); μg (Mikrogramm); 1 (Liter); ml (Milliliter); μl (Mikroliter); cm (Zentimeter); mm (Millimeter); μm (Mikrometer); nm (Nanometer); °C (Grad Celsius); HPLC (Hochdruckflüssigkeitschromatographie); Q (Chinakrin); QM (Chinakrin-Senf); DMSO (Dimethylsulfoxid); Htc (Hämatokrit); RBC (rote Blutkörperchen); LB (Luria-Brühe); N-Acetylcystein (NAC); BUN (Blut-Harnstoff-Stickstoff); Kreat. (Kreatinin); Phos.-Säure (Phosphorsäure); alk (alkalische Phosphatase); ALT (Alanin-Aminotransferase); AST (Aspartat-Transaminase); LDH (Lactatdehydrogenase); GGT (Glutamat-Transferase); cfu (kulturbildende Einheiten); pfu (plaquebildende Einheiten); DMEM (Delbecco's modifiziertes Eagles Medium); FBS (fötales Rinderserum); PRBC (gepackte rote Blutkörperchen); PCR (Polymerasekettenreaktion); U/min (Umdrehungen pro Minute); TC (Gewebekultur); NHSP (Normal-Humanserum-Pool); LSM (Lymphocyten-Trennmedium); NCS (Serum neugeborener Kälber); PBS (phosphatgepufferte Salzlösung).
Adsol ist zwar kommerziell von Baxter Healthcare Corp., Deerfield, IL, erhältlich, jedoch wurde es bei Verwendung in den folgenden Experimenten durch Sterilfiltration in dem folgenden Gemisch hergestellt: 22 g Glucose, 9 g NaCl, 7,5 g Mannit und 0,27 g Adenin in 1 l destilliertem H₂O.
Die Polymerasekettenreaktion (PCR) wird in einigen der nachstehenden Beispiele verwendet. PCR ist ein Verfahren zur Steigerung der Konzentration eines Segmentes einer Zielsequenz in einem Gemisch aus genomischer DNA ohne Klonierung oder Aufreinigung. Siehe K. B. Mullis et al., US-Patent Nr. 4,683,195 und 4,683,202. Dieses Verfahren zur Amplifikation der Zielsequenz besteht aus der Einbringung eines großen Überschusses von zwei Oligonukleotid-Primern in das DNA-Gemisch, das die gewünschte Zielsequenz enthält, gefolgt von einer genauen Abfolge thermischer Zyklen in der Gegenwart einer DNA-Polymerase. Die beiden Primer sind zu ihren jeweiligen Strängen der doppelsträngigen Zielsequenz komplementär. Zur Amplifikation wird das Gemisch denaturiert, und die Primer werden dann an ihre komplementären Sequenzen innerhalb des Zielmoleküls hybridisiert. Nach der Hybridisierung werden die Primer mit einer Polymerase verlängert, so dass ein neues Paar komplementärer Stränge erhalten wird. Die Schritte Denaturierung, Primer-Hybridisierung, und Polymerase-Verlängerung kann viele Male wiederholt werden (d. h. Denaturierung, Hybridisierung und Verlängerung machen einen "Zyklus" aus; es können zahlreiche "Zyklen" durchgeführt werden), so dass man eine hohe Konzentration eines amplifizierten Segmentes der gewünschten Zielsequenz erhält. Die Länge des amplifizierten Segmentes der gewünschten Zielsequenz wird durch die relativen Positionen der Primer zueinander bestimmt, und daher ist diese Länge ein kontrollierbarer Parameter. Aufgrund des Wiederholungsaspektes des Verfahrens wird das Verfahren von den Erfindern als "Polymerasekettenreaktion" bezeichnet.
BEISPIEL 1
Dieses Beispiel misst die R17-Inaktivierungsaktivität von Chinikrin-Senf(QM)-Lösungen, die entweder in Adsol oder DMSO hergestellt wurden. Der Bakteriophage R17 hat ein einzelsträngiges RNA-Genom von etwa 1,2 × 10⁶ Dalton und lässt sich verglichen mit vielen anderen Zielen schwierig inaktivieren. Siehe im Allgemeinen L. Lin et al., Blood 74: 517 (1989). Der Vorteil des R17-Systems ist, dass die Inaktivierung leicht im Labor untersucht werden kann.
Der zur Bestimmung der Inaktivierung verwendete Test misst die Fähigkeit des Phagen, zur anschließenden Infektion von Bakterien und zur Hemmung von deren Wachstum. Der Phage wurde in Hrf 3000 Bakterien gezüchtet. (R17 und Hrf 3000 wurden von der American Tissue Culture Collection (ATCC), Washington D. C. erhalten). Zuerst wurde das R17-Stammvirus verdünnt (10,9 log/ml in LB-Brühe) 1 : 20 in Adsol (R17-Adsol). Dann wurde ein 30% Hämatokrit (Htc)-Konzentrat von roten Blutkörperchen in einem R17-Adsol-Gemisch hergestellt durch Abzentrifugieren der roten Blutkörperchen (RBC) aus Vollblut und Resuspendieren von 3,5 ml RBC-Pellet in 7,0 ml R17-Adsol. In diesem und in den folgenden Experimenten wurde der Htc auf einem Model F800 Sysmex-Zellzählgerät (Toa Medical Electronics, Kobe, Japan) gemessen. Zehn 1 ml-Aliquots der Proben wurden dann in sterile Röhrchen überführt.
Etwa 2 mg QM, das kommerziell erhältlich ist von Aldrich, Inc., Milwaukee, WI, wurde in jeweils zwei Röhrchen eingewogen. Die Proben wurden dann in DMSO oder Adsol in einer Endkonzentration von 0,4 mg/ml gelöst. QM in Adsol ist bei dieser Konzentration eine Suspension und keine Lösung.
Anschließend wurde die QM-Suspension zu den R17-Adsol-Proben gegeben, so dass die folgenden QM-Endkonzentrationen in den Probenröhrchen erhalten wurden: 2,5, 5,0, 10 oder 20 μg/ml. Das QM wurde bei diesen Konzentrationen vollständig löslich gemacht. Positive Kontrollproben wurden ebenfalls hergestellt, wobei 50 μl Adsol oder DMSO zu R17-Adsol-Proben gegeben wurden. Die Proben ließ man für mindestens 1 Std. bei Raumtemperatur stehen. Dann wurden die Proben durch einen R17 Phagen-Assay titriert. Sterile 13 ml-Verdünnungsröhrchen wurden mit LB-Brühe hergestellt. Zur Herstellung der Verdünnungen wurde ein 0,1 ml-Aliquot der Phagenlösung zu dem ersten Verdünnungsröhrchen mit 0,4 ml Medium gegeben. Dann wurden 0,02 ml dieser Lösung in das zweite Röhrchen mit 0,5 ml Medium (1 : 25) gegeben. Die zweite Lösung wurde dann in den verbleibenden Röhrchen seriell verdünnt (1 : 25). Zu jeder verdünnten Probe wurden 0,05 ml Hrf 3000-Bakterien, die über Nacht gezüchtet wurden, und 3 ml geschmolzener LB-Deckagar gegeben. Die gemischten Materialien wurden auf Platten mit LB-Brühe gegeben. Nach dem Härten des Deckagars wurden die Platten bei 37°C über Nacht inkubiert. Die Plaques wurden am nächsten Morgen gezählt und der nach der Behandlung verbleibende Phagentiter wurde auf der Basis der Verdünnungsfaktoren berechnet.
Die Ergebnisse sind in der nachstehenden Tabelle 2 und in 1 gezeigt. Aus den Daten geht hervor, dass QM sogar bei Konzentrationen von nur 2,5 μg/ml effizient R17 inaktivieren kann. Bei Konzentrationen über 10 μg/ml wird eine vollständige Inaktivierung bis zur Nachweisgrenze dieses Tests erzielt.
TABELLE 2
BEISPIEL 2
Mit Hilfe dieses Beispiels soll gezeigt werden, dass das Vorhandensein von RBC die R17-Inaktivierung durch die erfindungsgemäßen Verbindungen und Verfahren nicht signifikant beeinflusst. Es wurden zwei verschiedene Verbindungen, QM und Verbindung 1, untersucht, deren Synthese im nachstehenden Beispiel 17 beschrieben ist. Für QM war das Verfahren folgendermaßen: zuerst wurde etwa 60% Htc-RBC-Konzentrat durch Verdünnung in Adsol hergestellt. Die Probe wurde erneut in sterilen Röhrchen mit Adsol verdünnt, so dass das RBC-Konzentrat mit einem endgültigen Htc-Wert von 2%, 6%, 20% oder 60% (0,5 ml Endvolumen in jedem Röhrchen) erhalten wurde.
Anschließend wurde eine R17-Stammkultur (11,3 log/ml in LB) 1 : 10 in Adsol (R17-Adsol) verdünnt. Diese Stammkultur (0,5 ml) wurde in jedes Röhrchen gegeben, so dass ein End-Htc von etwa 1%, 3%, 10% oder 30% in 1 ml erhalten wurde. Eine positive Kontrollprobe wurde hergestellt ohne RBC durch Vereinigen von 0,5 ml R17-Adsol mit 0,5 ml Adsol. QM (3,4 mg) wurde in H₂O gelöst, so dass eine Endkonzentration von 0,1 mg/ml erzielt wurde. Dann wurde ein 10 μl-Aliquot der QM-Lösung in jede R17-Probe gegeben, und die Proben wurden etwa 2 Std. inkubiert. Eine negative Kontrolle wurde nicht mit QM behandelt. Die Proben wurden dann in einem R17-Phagen-Assay wie in Beispiel 1 oben beschrieben titriert.
Die Ergebnisse sind in der Tabelle 3 und in 2 gezeigt. Aus den Daten geht hervor, dass QM R17 bei allen untersuchten Htc hemmt.
TABELLE 3
Ein weiteres Experiment wurde zur Untersuchung der Inaktivierungsfähigkeit einer neuen Verbindung, Verbindung 1, durchgeführt. Eine 1 : 1000-Verdünnung von R17 (Titer der Stammkultur betrug 11,9 Log) wurde in 25 ml gepackten roten Blutkörperchen hergestellt. Zu den 5 Röhrchen wurden jeweils 5 ml dieser Lösung von R17-gepackten roten Blutkörperchen gegeben. Die Verbindung 1 wurde dann in Salzlösung bis zu einer Endkonzentration von 3 mg/ml gelöst. Die Verbindung in Lösung wurde wie folgt zu den 4 Röhrchen gegeben: das erste Röhrchen, das Kontrollröhrchen, erhielt nur Salzlösung; das zweite Röhrchen erhielt 10 μg/ml Verbindung 1 in Salzlösung; das dritte Röhrchen erhielt 30 μg/ml Verbindung 1 in Salzlösung; das vierte Röhrchen erhielt 100 μg/ml Verbindung 1 in Salzlösung und das letzte Röhrchen erhielt 300 μg/ml Verbindung 1 in Salzlösung. Die Röhrchen wurden gemischt und dann bei 4°C über Nacht inkubiert. Die Ergebnisse zeigten R17-Inaktivierungsaktivität. Konzentrationen oberhalb von 30 μg/ml inaktivierten etwa 4 log R17 mit einem Ausgangs-Titer von 10 log R17.
BEISPIEL 3
Dieses Beispiel offenbart die Kinetiken der R17-Inaktivierung durch QM. Zur Messung der Inaktivierugskinetiken muss das reaktive QM gequencht werden, so dass die Zwischenzeitpunkte ein verlässliches Maß für die R17-Inaktivierung zu einer bestimmten Zeit liefern. Zwei Verfahren wurden hier in Kombination zum Quenchen der Reaktion verwendet. Zuerst wurde NAC zu den Proben gegeben, so dass dieses mit überschüssigem QM reagierte. Zweitens wurden die Proben rasch in LB-Medium verdünnt, so dass die effektive QM-Konzentration in der Probe reduziert wurde. Die nachstehend beschriebenen Kontrollexperimente zeigen, dass dieser doppelte Ansatz restliches QM effizient quencht, was eine gültige Messung der Reaktionskinetiken ermöglicht.
Die Proben wurden auf die folgende Weise hergestellt. Eine Verdünnung von R17 (1 : 20) in Adsol wurde hergestellt: 0,15 ml Phage (11,3 log/ml) + 2,85 ml Adsol. Ein Aliquot von steril filtriertem 0,1 M NAC wurde zum Quenchen der QM-Reaktion mit R17 aufgetaut.
Die Röhrchen wurden dann zur Standard-Verdünnung von Phage hergestellt, und sie enthielten geeignete LB-Volumina.
TABELLE 4
Es wurde eine Reihe von Röhrchen hergestellt, die hier als Quench-Röhrchen bezeichnet werden und die Quench-Faktoren (NAC und/oder eine Verdünnung mit LB) enthalten, so dass sie die Proben an geeigneten Zeitpunkten aufnehmen. Cystein (44 μl-Aliquots) wurde zu den Quench-Röhrchen Nr. 1 bis 12 gegeben.
QM (1,5 mg) wurde in Adsol (25,0 ml) zu einer Endkonzentration von 0,1 mg/ml gelöst. Dann wurde die QM-Lösung in Adsol 100fach verdünnt: 50 μl QM-Lösung + 4,95 ml Adsol; 1 μg/ml Endkonzentration.
Die Tabelle 4 offenbart, wie jede Kontroll- und Versuchs-Probe behandelt wurde. Die Kontrollen wurden zuerst behandelt, indem Aliquots (100 μl) Phage in Quench-Röhrchen 9 bis 13 untergebracht wurden, dann sofort 100 μl von 1 μg/ml QM in die Quench-Röhrchen 9 und 10 und 200 μl Adsol in die Quench-Röhrchen 11 und 12 gegeben wurde. Adsol (250 μl) wurde in das Quench-Röhrchen 13 gegeben. Dann wurden die Proben 9 und 11 für den Phagen-Test in LB-Brühe verdünnt.
Die Versuchsproben wurden anschließend behandelt. Phage (1,0 ml) wurde in ein steriles 15 ml-Röhrchen überführt. QM (1,0 ml, 1,0 μg/ml) wurde zugegeben. Dieses Gemisch wurde (in 200 μl Aliquots) in die Quench-Röhrchen 1 bis 8 zu den folgenden Zeiten überführt: 0, 2, 4, 8, 16, 32, 64 und 128 min. Die Proben wurden gemischt und für den Phagen-Test sofort in LB-Brühe verdünnt. Schließlich wurden die Proben 10, 12 und 13 für den Phagentest in LB-Brühe verdünnt.
Die Ergebnisse sind in der Tabelle 5 und in 3 gezeigt. NAC allein tötet zwar R17 nicht (vergleiche die Proben #11 und #12 mit Probe #13), bei der Zugabe vor QM lieferte NAC einen wesentlichen, aber keinen vollständigen Schutz gegen die QM-Inaktivierung (vergleiche Proben #7 und #10). Die Kombination von NAC und Verdünnung führte zu einem fast vollständigen Quenchen der QM-Aktivität (vergleiche Proben #1 und #13). Die QM-Inaktivierung von R17 war innerhalb von 2 Std. beendet.
TABELLE 5
BEISPIEL 4
Dieses Experiment misst den Verlust der QM-Aktivität bei der Vorinkubation von Medikament in Adsol. Man nimmt an, dass Senf-Verbindungen durch thermisch erlaubte Wege reagieren. Sie können in wässriger Lösung hydrolysiert werden. Dieses Experiment war dazu ausgelegt, den Verlust der QM-Antivirus-Aktivität in einer bestimmten wässrigen Lösung, d. h. Adsol, zu messen. Vorhergehende Ergebnisse haben ergeben, dass die QM-Antivirus-Aktivität nicht rasch bei der Vorinkubation des Medikamentes in Adsol sank (Ergebnisse nicht gezeigt). Ein Belang in solchen Experimenten war die Möglichkeit der lichtabhängigen Inaktivierung, weil Proben in LB verdünnt wurden, ohne dass übermäßige Versuche zur Abschirmung des Umgebungslichtes unternommen wurden und weil die Acridine bekanntlich durch photodynamische Wirkungen inaktivieren. Dieses Experiment wurde unter Bedingungen wiederholt, bei denen die Mengen an Umgebungslicht sorgfältig während des Experimentes überwacht wurden, damit die Möglichkeit ausgeschlossen wurde, dass die R17-Inaktivierung aufgrund der lichtvermittelten Wirkungen geschah. Zusätzliche Kontrollen wurden auch durchgeführt, um die Wirkungen von Licht in Proben zu bestimmen, die absichtlich gegenüber Raumbeleuchtungen ausgesetzt wurden und um die Inaktivierung durch die Stammverbindung, Chinikrin, zu bestimmen, dessen Struktur folgt:
Das folgende Verfahren erfolgte auf einer sterilen Werkbank ohne Beleuchtung. R17-Phage (10,9 log/ml) wurde 10fach in Adsol verdünnt: 1,0 ml R17 Stamm + 9,0 ml Adsol. Ein (1) ml des verdünnten Phagen wurde in zehn sterile 1,5 ml Röhrchen überführt. Eine 0,1 mg/ml QM-Lösung wurde hergestellt durch Lösen von 3,4 mg QM (auf der sterilen Werkbank gewogen) mit 34 ml H₂O. Die resultierende Lösung wurde in Folie eingewickelt, um sie vor Licht zu schützen. Dann wurden 10 μl QM nach 0, 10, 40, 60, 120 oder 240 min Vorinkubation in die Röhrchen gegeben. Die Proben wurden wieder in Folie eingewickelt, um eine Einwirkung von Licht zu verhindern. Für eine Licht-Kontrolle wurden zum Zeitpunkt 0 10 μl QM zu 1,0 ml Phage gegeben, und die Probe wurde nicht in Folie eingewickelt. Eine 1 mg/ml Lösung Chinikrin in DMSO wurde als weitere Kontrolle hergestellt. Ein (1) μl davon wurde jeweils zu den beiden Proben gegeben. Dann wurde eine Probe in Folie (Probe Q) inkubiert und eine ohne Folie (Probe Q + Licht). Sämtliche Proben wurden 2 Std. 15 min über eine endgültige Zugabe von QM hinaus inkubiert. Die Gesamt-Inkubation für die Probe vom Zeitpunkt Null betrug 6 Std. 15 min.
Die folgende Arbeit erfolgte mit sehr wenig Umgebungslicht (die Quelle war eine geschlossene Türöffnung): die Bakterien wurden im Dunkeln verdünnt und plattiert. Für die positiven Lichtkontrollen, wurden die Proben während der Verdünnungen Umgebungslicht ausgesetzt, und dann während der Plattierung zu schwachen Lichtbedingungen überführt.
Die Ergebnisse sind in der 4 und in Tabelle 6 gezeigt. Aus diesen Ergebnissen geht hervor, dass es keine lichtabhängige Abtötung durch QM oder Chinikrin unter den Bedingungen dieses Experimentes gab. Zudem war die QM-Aktivität nach einer 4 Std. Vorinkubation in Adsol nicht verringert.
TABELLE 6
BEISPIEL 5
Die QM-Aktivität war nicht verringert nach einer 4 Std. Vorinkubation in Adsol, wie es in dem vorstehenden Beispiel 4 gezeigt ist. Ein Ziel dieses Beispiels ist die Bestimmung, ob QM durch Vorinkubation in Gegenwart roter Blutkörperchen schneller inaktiviert wird. Dieses Beispiel untersucht auch die Kinetiken der Entfernung von QM aus Lösungen roter Blutkörperchen durch ein Adsorptionsmaterial, um die Wirksamkeit einer Reinigungstechnik bei der Entfernung von Verbindungen, die eine Senfgruppe enthalten, zu etablieren.
Zuerst wurden Phagen-Verdünnungen hergestellt. R17 (11,3 log/ml Stammkultur) wurde 1 : 10 in Adsol verdünnt: 0,7 ml Phage + 6,3 ml Adsol. Verdünnter Phage (0,5 ml) wurde in 15 sterilen 1,5 ml-Röhrchen untergebracht, die mit 1 bis 15 beschriftet wurden. Die Behandlung für jedes Röhrchen ist in der Tabelle 7 gezeigt.
TABELLE 7
Anschließend wurden die QM-Lösungen hergestellt. Etwa 20 ml gepackte rote Blutkörperchen (PRBC) wurden in einem konischen 50 ml-Röhrchen 9 min bei 1600 U/min abzentrifugiert. Das Volumen des Pellets nach dem Zentrifugieren betrug 17 ml. Etwa 3 mg QM wurden auf einem Wiegepapier in einem Biosicherheitsraum eingewogen (tatsächliches Gewicht betrug 4,5 mg). Die Probe wurde dann in ein konisches 50 ml-Röhrchen überführt. Die Probe wurde dann bis zu einer Konzentration von 0,1 mg/ml in Adsol gelöst (tatsächliches Adsolvolumen war 45 ml). Anschließend wurde das Pellet mit den roten Blutkörperchen 1 : 1 mit 17 ml QM-Lösung verdünnt. Der Inhalt der Röhrchen wurde vorsichtig durch mehrmaliges Umschwenken gemischt. Dies wird anschließend die QM-ABC-Lösung genannt.
Amberlite XAD-16^TM (ein kommerziell erhältliches Adsorptionsmittel von Sigma, St. Louis, MO) wurde eingewogen (0,452 g) und in ein konisches 15 ml-Röhrchen überführt. Ein Aliquot der QM-ABC-Lösung (9 ml) wurde in das 15 ml-Röhrchen mit 0,5 g XAD-16 überführt und vorsichtig durch Umschwenken gemischt. Dies wird anschließend als QM-XAD-Lösung bezeichnet. Die QM-Lösung wurde mit einem gleichen Volumen Adsol (1 ml jeweils) verdünnt. Dies wird anschließend als die QM-Adsol-Lösung bezeichnet.
Zu jedem Zeitpunkt wurden 0,1 ml aus QM-ABC, QM-XAD und QM-Adsol in ein 1,5 ml-Eppendorf-Röhrchen überführt. Der Inhalt des Röhrchens wurde 10 sec bei voller Geschwindigkeit in einer Mikrofuge abzentrifugiert, so dass die Zellen und das Harz pelletiert wurden. Dann wurden 5 μl wässrige Phase mit QM in das geeignete Röhrchen, das den Phagen enthielt, überführt. Das phagenhaltige QM wurde dann für die in der vorstehenden Tabelle 7 angegebenen Zeiten im Dunkeln inkubiert. Die 240 min. Probe wurde mindestens 2 Std. nach der Zugabe von QM inkubiert. Anschließend wurden Verdünnungen erstellt, und die Phagen wurden plattiert.
Die Ergebnisse erscheinen in der nachstehenden Tabelle 8 und in 5. Die QM-Antivirus-Aktivität wurde bei einer 4 Std. Vorinkubation mit roten Blutkörperchen entfernt. Das adsorbierende Reinigungsmaterial, Amberlite XAD-16^TM, entfernte ebenfalls QM aus dem Blut innerhalb von 1 Std. Diese Ergebnisse legen nahe, dass entweder eine Inkubation in Gegenwart von roten Blutkörperchen oder die Behandlung mit einem Adsorptionsmittelharz oder die beiden Behandlungen kombiniert zur raschen Entfernung von restlichem QM nach der Inaktivierung ausreichen.
TABELLE 8
BEISPIEL 6
Dieses Beispiel bezweckt die Messung der Inaktivierung von Enten-Hepatitis-B-Virus (DHBV) durch ein erfindungsgemäßes Verfahren. DHBV wurde wegen der Ähnlichkeiten des Aufbaus zwischen den beiden Viren als Modell für Human-Hepatitis B-Virus gewählt. Siehe Ganem, D. und Varmus, H. "The Molecular Biology of the Hepatitis B Viruses", Ann. Rev. Biochem. 56: 651 (1987).
Infizierte Enten-Hepatozyten wurden folgendermaßen hergestellt. Enten-Hepatocyten wurden aus den Lebern von etwa 1 Woche alten Entenküken isoliert. Die Entenküken wurden vorher gescreent und als DHBV-negativ eingestuft. Jedes der Küken wurde anästethisiert, dann wurden 0,5 ml Natrium-Heparin über die Portader infundiert. Anschließend wurde jedes Entenküken mit 75 ml einer Lösung mit 200 ml 1 × MEM/Earle's BSS + 2 ml Hepes-Puffer + 2 ml 1% EGTA (in 1 × MEM) perfundiert. Dann wurden die Entenküken 20 min lang mit einer steril filtrierten Lösung mit 30 mg Collagenase A (kommerziell erhältlich von Boehringer Mannheim Biochem., Indianapolis, IN) + 200 ml Ham's F-12/DMEM-Medium perfundiert.
Zu diesem Zeitpunkt wurde die Leber entnommen, zu einem feinen Brei aufgeschnitten und in einer 125 ml-Flasche mit 50 ml Ham's F-12/DMEM untergebracht. Etwa 10 ml einer Lösung mit 5 mg Dnase I und 25 ml Ham's F-12/DMEM wurden zu der Lebersuspension gegeben. Die Suspension wurde 10 min bei 200 U/min. zentrifugiert.
Die Suspension wurde dann durch Gaze-Kissen filtriert, die 125 ml-Flasche wurde mit den restlichen 15 ml der DNase-I-Lösung gespült, und die Spülflüssigkeit wurde ebenfalls in die Lebersuspension filtriert. Die Zellsuspension wurde gleichmäßig in 2 × 50 ml Zentrifugenröhrchen unterteilt und 2 min bei 50 × g pelletiert. Die Pellets wurden in 10 ml einer Lösung mit Medium 199/Earle's BSS, 5% Kälberserum, resuspendiert und pelletiert. Dieses Verfahren wurde zwei weitere Male wiederholt. Das dritte Pelletieren wurde in 10 ml Plattierungsmedium resuspendiert. Weitere 10 ml Plattierungsmedium wurden jeweils in die Röhrchen gegeben.
Die Leberzellsuspension wurde durch einen 70 Mikron-Zellfiltrierer in ein 50 ml-Zentrifugenröhrchen filtriert. Aliquots der Zellsuspension (etwa 0,5 ml) wurden in Petrischalen mit 2 ml Plattierungsmedium überführt, so dass ein Ausmaß an Konfluenz von etwa 6 bis 8 × 10⁶ lebenden Zellen pro Petrischale erhalten wurde. Nach einer 2 Std. Inkubation bei 37°C wurde das Medium zu L-15-Medium (kommerziell erhältlich von Gibco, Grand Island, NY) (mit 0,9 g/l Galactose, 0,55 g/l Na-Pyruvat)/DMSO gewechselt. Das Medium wurde wiederum nach 24 Std. und alle 48 Std. danach gewechselt. Die Zellen wurden für 5 bis 7 Tage in Kultur gezüchtet.
Anschließend erfolgte die Virus-Inaktivierung. DHBV-Stamm-Virus wurde für 15 min in einem Ofen bei 37°C aufgetaut. Das Virus wurde dann für 5 min bei 14.000 U/min in einer Mikrofuge bei Raumtemperatur abzentrifugiert, und der Überstand wurde in ein frisches Röhrchen überführt, wobei das Material am Boden des Röhrchens vermieden wurde. Zentrifugation und Überführung wurden wiederholt und die Proben wurden auf Eis untergebracht.
Etwa 7 ml Vollblut wurden in ein Röhrchen mit saurem Citrat-Dextrose-Antikoagulanz entnommen. Die Zellen wurden für 9 min bei 1600 U/min abzentrifugiert, um die roten Blutkörperchen zu packen. Das Plasma wurde entzogen und durch das gleiche Volumen Adsol (2,9 ml) ersetzt.
Das Virus wurde verdünnt, und zwar 0,25 ml in 2,25 ml roten Blutkörperchen, und das Gemisch wurde im Vortexer aufgewirbelt, so dass eine 10^–1 Verdünnung erhalten wurde. Das verdünnte Virus wurde dann in sterilen Röhrchen wie folgt aliquotiert: 50 μl als unbehandelte Probe; 1,8 μl, zu behandeln mit 40 μg/ml QM; und 0,5 ml, zu behandeln mit 10 μg/ml QM. Anschließend wurde eine 1 mg/ml QM-Lösung hergestellt durch Auflösen von 3,2 mg QM in 3,2 ml sterilem ddH₂O. Aliquots der QM-Lösung wurden zu den Röhrchen mit dem Virus wie folgt gegeben: 72 μl QM wurden zu der 1,8 ml Probe gegeben, so dass eine QM-Endkonzentration von 40 μg/ml erhalten wurde, und 5 μl QM wurden zu der 0,5 ml Probe gegeben, so dass eine QM-Endkonzentration von 10 μg/ml erhalten wurde. Die Proben wurden 4 Std. bei Raumtemperatur inkubiert.
Nach der Inkubation wurden die roten Blutkörperchen in einer Mikrofuge abzentrifugiert. Plasma/Adsol-Überstand wurde entfernt. Verdünnungen jeder Probe wurden durch serielle Verdünnung von 100 μl Virus in 0,9 ml PBS/10% NCS (PBS betrug 10 mM, pH-Wert 7,4) hergestellt. Die unbehandelte Kontrolle (Probe #1) wurde auf 10^–7 verdünnt. Die behandelten Proben (#2 und #3) wurden auf 10^–4 verdünnt.
Platten mit der Lebersuspension wurden dann gemäß dem in der Tabelle 9 offenbarten Schema angeimpft. Die Platten wurden mit etwa 100 μl Virus im Doppelansatz (siehe unten) beimpft und 1, 10 oder 15 Tage gezüchtet.
Die Proben wurden dann durch PCR und durch Slot-Blot-Hybridisierung analysiert, um das Vorhandensein von Virus-DNA zu bestätigen.
Die Slot-Blot-Hybridisierung erfolgte für sämtliche Proben nach der Ernte der DNA aus den Gewebekulturproben. Die PCR-Analyse erfolgte mit ausgewählten Proben. Die Proben wurden mit 3 M NaOH denaturiert, genauso wie die Plasmid pD1.5G-DNA-Proben zur Markierung. Die Proben wurden dann mit NH₄OAc neutralisiert. 400 μl 1 M NH₄OAc wurden zu jeder Vertiefung einer Mini-Fold-II-Slot-Blot-Vorrichtung, die kommerziell erhältlich ist von VWR Scientific, Greenbelt, MO, ausgerüstet mit einem Filter, gegeben, genauso wie die Aliquots jeder Probe. Die Vorrichtung wurde evakuiert, bis sämtliche Proben durch den Filter getreten waren. Der Filter wurde dann bis zur Trockne gebacken. Anschließend wurde der Filter in einem Gemisch aus 250 ml 20 × SSC (175,3 g NaCl, 88,2 g Na-Citrat in 800 ml H₂O), 50 ml 50 × Denhardt's Lösung (5 g Ficoll, erhältlich von Sigma, St. Louis, MO, 5 g Polyvinylpyrrolidon und 5 g Rinderserumalbumin mit 500 ml H₂O), 20 ml h mg/ml denaturierter Lachssperma-DNA, 180 ml H₂O, 500 ml Formamid und 10 ml einer 10%igen Lösung von Natriumdodecylsulfat in H₂O vorhybridisiert. Die Probe wurde folgendermaßen hergestellt: 3 μl pD1.5G (67 ng/μl) und 5 ml 15 ng/μl statistische Hexamer-Oligonukleotide wurden erwärmt und erneut gekühlt, dann wurden 4 μl 5 × Markierungspuffer, 2 μl dGAT-Gemisch (jeweils 5 mM dGTP, dATP, dTTP in TE), 1 μl Klenow und 5 μl [α³²P]dCTP zugegeben und inkubiert. Die Reaktion wurde durch Zugabe von 25 mM EDTA gestoppt. Dann wurden 5 × 10⁵ Zählimpulse pro min Probe pro ml Hybridisierungslösung zu dem Filter gegeben und über Nacht hybridisieren gelassen. Der Filter wurde entfernt, und es wurde eine niedrig stringente Waschlösung (50 ml 20 × SSC, 940 ml H₂O und 10 ml 10% SDS) zugegeben, so dass der Filter zum Waschen unter gleichzeitigem Schütteln bedeckt war, was zweimal wiederholt wurde, wobei beim letzten Mal stattdessen hoch stringente Waschlösung (5 ml 20 × SSC, 990 ml H₂O und 10 ml 10% SDS) hinzugegeben wurde. Der Filter wurde dann einem Film exponiert, so dass eine geeignete Exposition erhalten wurde, und der Film wurde dann auf positive Hybridisierung untersucht. Eine negative Kontrollprobe mit Kalbsthymus-DNA wurde ebenfalls mit untersucht.
TABELLE 9
Die Tabelle 10 fasst die PCR- und Slot-Blot-Hybridisierungsdaten zusammen. (NP bedeutet, dass die PCR für diese Probe "nicht durchgeführt" wurde. Ein Pluszeichen gibt an, dass die DHBV-Nukleinsäure in der PCR amplifiziert wurde. Ein Minuszeichen gibt an, dass sie nicht amplifiziert wurde).
TABELLE 10
Der Tabelle 10 zufolge war der Virustiter 6 log pro ml auf der Basis des positiven PCR-Signals für Platte #9. Eine Dosis von 10 μg/ml QM inaktivierte 4 log pro ml auf der Basis des positiven PCR-Signals für die Platten #60 und #61. Eine Dosis von 40 μg/ml QM inaktivierte > 6 log DHBV pro ml auf der Basis des Fehlens eines PCR-Signals und der Slot-Blot-Signale in sämtlichen untersuchten Proben.
BEISPIEL 7
Dieses Beispiel bezweckt die Messung der Inaktivierung von zellfreiem HIV durch QM. Wie bei dem R17-Test wurden kleine Aliquots von QM zu Stamm-HIV-1 gegeben. Die Stamm-QM-Lösung wurde hergestellt durch Lösen von 3,4 mg der Verbindung in Gewebekulturmedien (DMEM/15% FBS), so dass eine Endkonzentration von 0,6 mg/ml QM erhalten wurde. Das QM war bei dieser Konzentration eine kolloidale Suspension statt einer Lösung, die bei dem Experiment verwendet wurde. Stamm-HIV (10^4,2 plaquebildende Einheiten/ml) war in DMEM/15% FBS. Die QM-Lösung wurde zu Aliquots von Stamm-HIV-1 gegeben, so dass ein Gesamtproben-Endvolumen von 0,5 ml mit den folgenden QM-Endkonzentrationen erhalten wurde: 3 μg/ml, 10 μg/ml oder 30 μg/ml. Die 0,5 ml Test-Aliquots wurden in Polystyrol-Gewebekulturplatten mit 24 Vertiefungen untergebracht. Zwei Kontrollen wurden hergestellt, die eine enthielt nur Stamm-HIV-1 und die andere enthielt QM ohne Stamm-HIV-1. Sämtliche Proben wurden für 1 Std. bei Raumtemperatur inkubiert, dann bis zum Test auf Infektiosität durch einen Mikrotiter-Plaquetest bei –70°C aufbewahrt. Aliquots zur Messung der restlichen HIV-Infektiosität in den mit einer erfindungsgemäßen Verbindung behandelten Probe wurden entnommen und gezüchtet.
Restliche HIV-Infektiosität wurde mit einem MT-2-Infektiositäts-Test getestet. (Zuvor beschrieben in Hanson, C. V., Crowford-Miksza, L. und Sheppard, H. W., J. Clin. Micro 28: 2030 (1990)). Das Testmedium war 85% DMEM (mit einer hohen Glucosekonzentration) mit 200 μg. Streptomycin, 200 U Penicillin, 50 μg Gentamicin und 1 μg Amphotericin B pro ml, 15% FBS und 2 μg Polybren (Sigma Chemical Co., St. Louis, Mo.) pro ml. Die Test- und Kontroll-Proben aus dem Inaktivierungsverfahren wurden in 50% Testmedium und 50% normalem gepooltem Humanplasma verdünnt. Die Proben wurden in Platten mit 96 Vertiefungen (Corning Glass Works, Corning, N.Y.) seriell verdünnt. Die Platten wurden bei 37°C in einer 5% CO₂-Atmosphäre für 1 bis 18 Std. inkubiert. MT-2-Zellen (0,025 ml) [Klon alpha-4, erhältlich (Katalog-Nr. 237) von den National Institutes of Health AIDS Research and Reference Reagent Program, Rockville, Md.] wurden jeweils in die Vertiefungen gegeben, so dass eine Konzentration von 80.000 Zellen pro Vertiefung erhalten wurde. Nach einer weiteren Std. Inkubation bei 37°C in 5% CO₂ wurden 0,075 ml Testmedium mit 1,6% SeaPlaque-Agarose (FMC Bioproducts, Rockland, Maine), vorgewärmt auf 38,5°C, in jede Vertiefung gegeben. Die Platten wurden für einige min bei 37°C gehalten, bis mehrere Platten sich angereichert hatten, und wurden dann in Plattenträgern bei 600 × g für 20 min zentrifugiert. In der Zentrifuge bildeten sich Zell-Einfachschichten, bevor die Agaroseschicht gelierte. Die Platten wurden 6 Tage bei 37°C in 5% CO₂ inkubiert und durch Zugabe von 0,05 ml 50 μg/ml Propidiumiodid (Sigma Chemical Co.) in phosphatgepufferter Salzlösung (pH-Wert 7,4) in jede Vertiefung gefärbt. Nach 24 bis 48 Std. wurden rosa/orange fluoreszenzgefärbte Mikroplaques durch Unterbringen der Platten auf einem 8000 μW/cm² 304 nm UV-Lichtkasten (Fotodyne, Inc., New Berlin, Wis.) sichtbar gemacht. Die Plaques wurden bei 20- bis 25facher Vergrößerung in einem Stereomikroskop gezählt.
TABELLE 11
Die Ergebnisse erscheinen in der vorstehenden Tabelle 11. Bei einer Konzentration von 30 μg/ml konnte das QM zellfreies HIV vollständig bis zur Nachweisgrenze des verwendeten Plaquetests inaktivieren.
BEISPIEL 8
Das letzte Beispiel zeigte, dass QM zellfreies HIV inaktivieren konnte. HIV findet sich ebenfalls in bestimmten Zelltypen. Dieses Beispiel untersucht die Fähigkeit von QM bei verschiedenen Konzentrationen die zellassoziierte Form von HIV zu inaktivieren.
Es wurden H9-Zellen, die chronisch mit HIV_IIIB infiziert waren, verwendet. (H9/HTLV-III-B NIH 1983 Kat.#400). Kulturen dieser Zellen wurden in Dulbeccomodifiziertem Eagle-Medium mit hohem Glucose-Gehalt, angereichert mit 2 mM L-Glutamin, 200 Einheiten/ml Penicillin, 200 μg/ml Streptomycin, und 9% fötalem Rinderserum (Intergen Company, Purchase, N.Y.) gehalten. Zur Erhaltung wurde die Kultur einmal je Woche geteilt, und zwar bis zu einer Dichte von 3 × 10⁵ bis 4 × 10⁵ Zellen/ml. Etwa vier Tage nach der Teilung wurde bei Bedarf 8,8% Natriumhydrogencarbonat zugegeben. Für das Inaktivierungsverfahren wurden die Zellen drei Tage nach dem Aufteilen verwendet. Sie wurden bei 400 g für 10 min aus ihrem Kulturmedium zentrifugiert, der Überstand wurde verworfen, und die Zellen wurden in etwa 8 ml 85% DMEM + 15% FBS auf eine Konzentration von 2 × 10⁶ Zellen/ml resuspendiert. Aliquots (1 ml) der infizierten Zellsuspension wurden in 15 ml-Röhrchen für QM-freie Kontrollen und für die QM-Versuchsprobe untergebracht. Eine Stammlösung von QM (1 mg/ml in sterilem ddH₂O) wurde in 15 ml Röhrchen in den. geeigneten Aliquots verdünnt, so dass eine Endkonzentration von 0, 3, 10, 30, 100 oder 150 μg/ml erhalten wurde. Die Proben wurden für 2 Std. unter periodischem sorgfältigem Mischen inkubiert, dann bei –80°C bis zur Analyse durch den Mikrotiter-Plaque-Test aufbewahrt.
Die aufbewahrten Proben wurden bei 37°C aufgetaut, dann in einem HIV-Mikrotiter-Plaque-Test wie beschrieben in Hanson, C. V., Crawford-Miksza, L. und Sheppard, H. W., J. Clin. Micro 28: 2030 (1990) und wie in Beispiel 7 oben mit den folgenden Abwandlungen titriert. Die Proben wurden direkt in Platten mit 96 Vertiefungen (Corning Glass Works, Corning, N.Y.) seriell verdünnt. Die Platten wurden in einer 5% CO₂-Atmosphäre für 1 bis 18 Std. bei 37°C inkubiert. MT-2-Zellen (0,025 ml) [Klon alpha-4, erhältlich (Katalog Nummer 237) von National Institutes of Health AIDS Research and Reference Reagent Program, Rockville, Md.] wurden in jede Vertiefung gegeben, so dass eine Konzentration von 80.000 Zellen pro Vertiefung erhalten wurde. Nach einer weiteren Std. Inkubation bei 37°C in 5% CO₂, wurde 0,075 ml Test-Medium mit 1,6% SeaPlaque-Agarose (FMC Bioproducts, Rockland, Maine), vorgewärmt auf 38,5°C in jede Vertiefung gegeben. Die Platten wurden für einige Minuten bei 37°C gehalten, bis sich mehrere Platten angereichert hatten, und wurden dann in Plattenträgern bei 600 × g für 20 min zentrifugiert. In der Zentrifuge bildeten sich Zell-Einfachschichten, bevor die Agaroseschicht gelierte. Die Platten wurden 6 Tage bei 37°C in 5% CO₂ inkubiert und durch Zugabe von 0,05 ml 50 μg/ml Propidiumiodid (Sigma Chemical Co.) in phosphatgepufferter Salzlösung (pH-Wert 7,4) in jede Vertiefung gefärbt. Nach 24 bis 48 Std. wurden rosa/orange fluoreszenzgefärbte Mikroplaques durch Unterbringen der Platten auf einem 8000 μW/cm² 304 nm UV-Lichtkasten (Fotodyne, Inc., New Berlin, Wis.) sichtbar gemacht. Die Plaques wurden bei 20- bis 25facher Vergrößerung in einem Stereomikroskop gezählt. Die Ergebnisse erscheinen in Tabelle 12.
TABELLE 12
Aus diesem Beispiel ist ersichtlich, dass QM zellassoziiertes HIV selbst bei sehr niedrigen Konzentrationen, wie 10 μg/ml und weniger, inaktiviert.
BEISPIEL 9
Dieses Beispiel offenbart die Fähigkeit der beiden Verbindungen mit einem nukleinsäurebindenden Liganden und einer Senfgruppe, QM, und N-(2-Chlorethyl)-N-ethyl-N'-(6-chlor-2-methoxy-9-acridinyl)-1,3-propandiamin-dihydrochlorid ("ICR-170") (kommerziell erhältlich von Polysciences Inc., Warrington, PA) zur Inaktivierung sowohl von zellfreiem als auch zellassoziiertem HIV in der Gegenwart roter Blutkörperchen. Die Struktur von ICR-170 ist nachstehend gezeigt.
Für die Inaktivierung von zellfreiem HIV wurden 15 ml PRBC mit 5 ml Adsol in einem Endvolumen von 20 ml gemischt. Dann wurden zehn 2 ml-Aliquots in konische 15 ml-Röhrchen gegeben. Verschiedene Dosen der beiden Verbindungen wurden anschließend in die Röhrchen gegeben. Die Stamm-Verbindungslösungen waren beide 1 mg/ml in Salzlösung, aufbewahrt bei 4°C. ICR-170 war bei dieser Konzentration in Lösung. Die folgenden Volumina der beiden Testverbindungen wurden in die PRBC-Röhrchen gegeben: 20, 40, 80 oder 160 μl; zur Erzeugung von Endkonzentrationen der Testverbindung von 10, 20, 40 oder 80 μg/ml.
Nach der Zugabe der Verbindungen wurden die Proben 100 min bei Raumtemperatur im Dunkeln unter Mischen alle 30 min inkubiert. Anschließend wurden die roten Blutkörperchen durch Zentrifugation für 5 min bei 2500 U/min pelletiert. Der Überstand wurde entfernt, und NHSP wurde zugegeben, so dass die Probe 15% NHSP enthielt. Die Proben wurden bei –80°C aufbewahrt.
Die Inaktivierung von zellassoziiertem HIV wurde auf ähnliche Weise mit folgenden Ausnahmen durchgeführt. Es wurden H9-Zellen, die chronisch mit HIV_IIIB infiziert waren, verwendet. (H9/HTLV-III-B NIH 1983 Kat.#400). Kulturen dieser Zellen wurden in DMEM mit hohem Glucose-Gehalt, angereichert mit 2 mM L-Glutamin, 200 Einheiten/ml Penicillin, 200 μg/ml Streptomycin, und 9% fötalem Rinderserum (Intergen Company, Purchase, N.Y.) gehalten. Zur Erhaltung wurde die Kultur einmal die Woche geteilt, und zwar bis zu einer Dichte von 3 × 10⁵ bis 4 × 10⁵ Zellen/ml, und etwa vier Tage nach der Teilung wurde bei Bedarf 3,3% Natriumhydrogencarbonat zugegeben. Für das Inaktivierungsverfahren wurden die Zellen drei Tage nach dem Aufteilen verwendet. Die Zellen in einer Probe dieser Stammlösung wurden in einem Hämacytometer vom Neubauer-Typ (kommerziell erhältlich von VWR Scientific, Greenbelt, MO) gezählt, die Zahl betrug 1,07 × 10⁶ Zellen/ml. Ein Aliquot (18,7 ml, 20 × 10⁶ Zellen) wurde pelletiert und in 5 ml Adsol resuspendiert. Diese 5 ml Zellsuspension wurde dann zu 15 ml PRBC gegeben. Die Probe wurde dann geteilt und Verbindung wurde wie oben für zellfreie Proben beschrieben zugegeben. Die Proben wurden 100 min inkubiert, gefolgt von der Zugabe von 3 ml eines 1 : 1-Gemischs von NHSP und RPMI-1640 (kommerziell erhältlich von Irvine Scientific, Santa Ana, CA). Anschließend wurde jede Probe in einem 15 ml-Röhrchen mit 6 ml Lymphoyten-Trennmedium (LSM) (kommerziell erhältlich von Organon Teknika Corp., Durham, NC) untergebracht, und die Röhrchen wurden 30 min bei 1500 U/min zentrifugiert. Die H9-Zellen, die sich zu einer bestimmten Schicht trennten, wurden in ein anderes Röhrchen überführt, mit 10 ml DMEM gemischt und für 5 min bei 2000 U/min zentrifugiert. Das Pellet wurde in 1 ml 85% DMEM + 15% FBS resuspendiert, und dann in ein 2 ml Sarstedt-Röhrchen überführt. Die Proben wurden ebenfalls bei –80°C aufbewahrt.
Die Proben wurden mit einem Mikrotiter-Plaquetest, wie in Beispiel 8 für zellfreies HIV und in Beispiel 9 für zellassoziiertes HIV beschrieben, titriert. Die Ergebnisse erscheinen in Tabelle 13A (zellfrei) und 13B (zellassoziiert) unten.
TABELLE 13A
TABELLE 13B
BEISPIEL 10
Die vorstehenden Beispiele ergaben, dass QM außergewöhnliche Pathogen-Inaktivierungsaktivität besitzt. Bei der Auswahl eines Mittels zur Dekontamination von Blutprodukten für klinische Untersuchung oder Transfusion ist es ebenfalls wichtig, die Wirkungen des Verfahrens und der Verbindung, die auf die Blutproduktfunktion verwendet wurden, zu berücksichtigen. Dieses Beispiel erforscht die Kurzzeit-Wirkungen der beiden Verbindungen mit einem nukleinsäurebindenden Liganden und einer Senfgruppe, QM und Chlorambucil, auf die Funktion der roten Blutkörperchen, wie es durch Kalium-Austritt und IgG-Bindung an die Oberflächen der roten Blutkörperchen gemessen wurde. Die Struktur von Chlorambucil erscheint nachstehend.
Dieses Beispiel vergleicht zusätzlich die R17-Inaktivierungs-Aktivität in roten Blutkörperchen einer Verbindung mit einem nukleinsäurebindenden Liganden und einer Senfgruppe (QM), mit einer Verbindung, die nur eine Senfgruppe und keinen nukleinsäurebindenden Liganden hat (Chlorambucil).
Vollblut (20 ml) wurde in ein konisches 50 ml-Röhrchen überführt und für 9 min bei 1600 U/min bei Raumtemperatur abzentrifugiert. Das Plasma wurde entfernt (9 ml). Anschließend wurden 10,9 log/ml Stammkultur R17-Phage 1 : 20 mit Adsol verdünnt (24,4 ml Adsol + 1,28 ml R17). Die pelletierten roten Blutkörperchen wurden dann auf 30% Htc mit 25,6 ml Adsol/R17-Gemisch resuspendiert. Aliquots (3 ml jeweils) wurden in 9 Röhrchen auf Eis überführt.
Jede Senfverbindung wurde zu Adsol gegeben. Chlorambucil, kommerziell erhältlich von Aldrich Inc., Milwaukee, WI, (5,8 mg) wurde zu 1,93 ml Adsol plus 5,85 μl 3 M NaOH (ungelöstes Material blieb zurück) gegeben, und die Suspension wurde im Experiment durch Aufwirbeln vor der Zugabe verwendet. QM (2,9 mg) wurde zu 0,967 ml Adsol (wiederum blieb das Material in Suspension) gegeben. Die Senfverbindungen wurden sofort in den in der nachstehenden Tabelle 14 angegebenen Volumina zum Blut zugefügt und durch Umschwenken gemischt.
TABELLE 14
Die Mengen an extrazellulärem Kalium wurden etwa 1 Std. nach der Behandlung mit einem Ciba Corning 614 K⁺/Na⁺-Analysegerät (kommerziell erhältlich von Ciba Corning Diagnostics Corp., Medfield, Massachussetts) gemessen. Die verbleibenden Proben wurden über Nacht bei 4°C inkubiert. Nach der Inkubation wurden 0,2 ml jeder Probe für den R17-Test entfernt und in einer Mikrozentrifuge 1 min zentrifugiert. Der Überstand wurde dann für den Phagen-Test entfernt.
Kalium-Spiegel in den restlichen Proben wurden gemessen, und die Proben wurden bei 4°C aufbewahrt. Die Kalium-Messungen wurden täglich für eine Woche wiederholt oder bis signifikante. Unterschiede beobachtet wurden. Die extrazellulären Kaliumdaten erscheinen in Tabelle 15 und 6. Die IgG-Bindung in den Proben wurden mit Baxter Unival Anti-Humanglobulin Anti-IgG für direkten Antiglobulin-Test und Baxter Coombs Kontroll-Zellen für Qualitätskontrolle von Anti-Human Globulin-Test (beide erhältlich von Baxter Healthcare Corporation, Deerfield, IL) gemessen. Die Ergebnisse der IgG-Bindung wie sie durch FACScan^TM (Becton Dickinson, Mountain View, CA) gemessen wurden, erscheinen in den Tabellen 15 und 16:
R17 wurde bei sämtlichen QM-Konzentrationen (≥ 8,4 log/ml) inaktiviert. Bis zu einer Konzentration von 300 μg/ml wurde jedoch nur wenig oder keine Inaktivierung (≤ 0,4 log) für Chlorambucil beobachtet.
TABELLE 15
TABELLE 16
Chlorambucil veränderte den Kalium-Austritt oder die IgG-Bindung der roten Blutkörperchen nicht. QM zeigte signifikante Antivirus-Aktivität und induzierte nur leichte Änderungen der Funktion der roten Blutkörperchen unter den Versuchsbedingungen. Eine signifikante Schädigung der roten Blutkörperchen wurde nur bei weitaus höheren Mengen erfasst als zur Inaktivierung von R17 erforderlich ist.
BEISPIEL 11
Das Beispiel 10 zeigte, dass QM R17 in roten Blutkörperchen unter Bedingungen, bei denen der Kaliumaustritt und die Oberflächen-IgG-Bindung vernachlässigbar waren, inaktivieren konnte. Dieses Beispiel ist dazu ausgelegt, diese Beobachtungen weiter zu untermauern, indem die Funktion der roten Blutkörperchen nach der Behandlung mit verschiedenen QM-Mengen genauer untersucht wurde. Dieses Beispiel untersucht spezifisch die Wirkungen der QM-Behandlung auf die Funktion der roten Blutkörperchen nach der Aufbewahrung unter Bedingungen, die diejenigen in einer Blutbank genau nachahmen.
Eine etwa 1 Tag alte gepackte Einheit roter Blutkörperchen wurde vom Sacramento Blood Center erhalten. Die Zellen wurden resuspendiert, und etwa 200 ml wurden in einen sterilen Behälter überführt. R17 (0,2 ml) in LB wurde zugegeben, und die Probe wurde gemischt. Anschließend wurde die Einheit in 6–30 ml Aliquots in sterilen konischen Zentrifugenröhrchen auf Eis unterteilt. Die verbleibenden gepackten roten Blutkörperchen wurden in dem Beutel bei 4°C aufbewahrt.
QM (3,2 mg) wurden mit eiskaltem Adsol (1,6 ml) gemischt, so dass eine 2,0 mg/ml Suspension hergestellt wurde. Aliquots der QM-Suspension wurden wie in Tabelle 17 offenbart zu den Zellen gegeben. Die Proben wurden sorgfältig durch vorsichtiges Umschwenken gemischt und in Fenwal Transfer-Packs (Baxter/Fenwal, Ill) zur Aufbewahrung bei 4°C überführt.
TABELLE 17
Die folgenden Messungen der Zellfunktion wurden genommen. 1) Die Kaliumspiegel wurden täglich für eine Woche und wöchentlich danach mit dem Ciba Corning 614 K⁺/Na⁺-Analysegerät (kommerziell erhältlich von Ciba Corning, MA) bestimmt. 2) Adenosin-5'-triphosphat (ATP) und 2,3-Diphosphoglycerinsäure (2,3-DPG) wurde am ersten Tag nach der Behandlung und wöchentlich danach gemessen. ATP wurde MO gemessen, wobei das Sigma-Verfahren Nr. 366-UV verwendet wurde. 2,3-DPG wurde mit dem 2,3-DPG-Kit, kommerziell erhältlich von Sigma, St. Louis, MO, gemessen. 3) Die IgG-Bindung an die Oberfläche der roten Blutkörperchen wurde nach Tag 1 und Woche 1 gemessen, wobei Baxter Unival Anti-Humanglobulin Anti-IgG für den direkten Antiglobulin-Test und Baxter Coombs-Kontrollzellen für die Qualitätskontrolle von Anti-Humanglobulin-Test, kommerziell erhältlich von Baxter Healthcare Inc., Deerfield, IL verwendet wurden.
Die Ergebnisse für die R17-Inaktivierung erscheinen in 7. Die Ergebnisse für die Funktion der roten Blutkörperchen erscheinen in den Tabellen 18A bis 18D.
TABELLE 18A
TABELLE 18B
TABELLE 18C
TABELLE 18D
Unter den Bedingungen der effizienten R17-Inaktivierung in gepackten roten Blutkörperchen gibt es keine signifikanten Wirkungen auf den Kalium-Austritt, den ATP-Gehalt oder 2,3-DPG-Gehalt, und nur mäßige Wirkungen auf die IgG-Bindung an RBC.
BEISPIEL 12
Dieses Beispiel bewertet QM zur Bestimmung, ob dies im Ames-Test, einem gut bekannten Test auf Mutagenität, mutagen ist. Senf-Verbindungen erweisen sich zwar als wirksame Verbindungen zur Pathogen-Inaktivierung, jedoch werden sie als potentielle Mutagene angesehen. Dieses Beispiel zeigt, dass mit QM behandeltes Blut, insbesondere nach einem Inkubationszeitraum, keine signifikante Mutagenwirkung aufweist. Somit haben die erfindungsgemäßen Verbindungen eine außergewöhnliche Pathogen-Inaktivierungseffizienz, während eine nur minimale Mutagenität gezeigt wird.
In diesem Beispiel wurde QM mit einem Ames-Test auf seine Mutagenität untersucht. Die Mutagenität wurde unter vier Bedingungen getestet. QM, inkubiert über Nacht in Wasser, QM, zugefügt zu roten Blutkörperchen und sofort ausplattiert; QM, zugefügt zu roten Blutkörperchen, inkubiert über Nacht bei 4°C und dann plattiert; und QM, zugegeben zu roten Blutkörperchen, 4 Std. inkubiert bei 4°C, dann gemischt mit Amberlite XAD-16^TM und über Nacht inkubiert vor dem Plattieren.
Zuerst wurde die Löslichkeit von QM in roten Blutkörperchen bestimmt. 10 mg/ml QM wurde 10fach und 100fach in roten Blutkörperchen verdünnt, und die Löslichkeit wurde beobachtet. Zur Gewinnung einer 1,0 mg/ml Lösung, wurden 20 μl der 10 mg/ml QM-Lösung mit 180 μl der roten Blutkörperchen mit 50% Htc vereinigt. Dieses Stammmaterial enthielt bestimmte Teilchen. Anschließend wurde eine 0,3 mg/ml Konzentration untersucht durch Vereinigen von 20 μl 3,0 mg/ml QM und 180 μl roten Blutkörperchen mit 50% Htc. Es gab einen Beweis für ein Ausfallen mit der 3 mg/ml Stammlösung. Schließlich wurden 20 μl der 1,0 mg/ml Stammlösung mit 180 μl der gepackten roten Blutkörperchen gemischt. Die 1,0 mg/ml Stammlösung erschien klar. Die 3 mg/ml Stammlösung wurde als die höchste Konzentration angesehen, somit sind 0,3 mg/ml bei den roten Blutkörperchen und 30 μg/Platte die oberen Konzentrationsgrenzen in diesem Experiment.
Die Präparation dieser drei Probengemische war wie folgt. Eine 10 mg/ml-Lösung QM in DMSO wurde auf 1,0 mg/ml (60 μl QM-Lösung, zugefügt zu 0,54 ml DMSO) verdünnt. Eine Lösung von roten Blutkörperchen mit einem 50% Htc-Wert wurde hergestellt durch Abzentrifugieren von 10 ml der Einheit von gepackten roten Blutkörperchen für 9 min bei 1600 U/min. Der Überstand wurde entfernt, und das Zellpellet wurde in einem gleichen Volumen Adsol resuspendiert. Der Htc wurde dann auf einem Model F800 Sysmex Zellzählgerät (Toa Medical Electronics, Kobe, Japan) bestätigt. Dreizehn 0,9 ml-Aliquots einer RBC-Lösung wurde dann in Teströhrchen untergebracht. Vier unterschiedliche QM-Stammlösungen wurden hergestellt, weil die Verbindung bei Konzentrationen von nur 3 mg/ml aus der Lösung ausfallen kann. Stammlösungen bei verschiedenen Konzentrationen wurden hergestellt durch Herstellen der folgenden Verdünnungen einer 1,0 mg/ml-Lösung: 150 μl einer 1,0 mg/ml QM-Lösung + 350 μl DMSO, so dass eine 0,3 mg/ml-Lösung erhalten wurde; 40 μl einer 1,0 mg/ml QM-Lösung + 360 μl DMSO, so dass eine 0,1 mg/ml-Lösung erhalten wurde; 15 μl einer 1,0 mg/ml QM-Lösung + 485 μl DMSO, so dass eine 0,03 mg/ml-Lösung erhalten wurde. Zum ersten Röhrchen wurden 100 μl DMSO gegeben, und das Röhrchen wurde in. einem 4°C-Schüttler (25 U/min, Orbital-Schüttler, kommerziell erhältlich von VWR Scientific, Greenbelt, MO) für die Inkubation über Nacht untergebracht. Die Röhrchen 2 bis 5 würden genauso über Nacht geschüttelt, dann wurden 100 μl-Aliquots jeder QM-Lösung in die Röhrchen direkt vor der Zugabe der Ames-Stämme verdünnt. Zu den Röhrchen 6–9 wurden 100 μl jeder QM-Lösung gegeben. Die Röhrchen wurden dann über Nacht bei 4°C auf dem Schüttler inkubiert. Anschließend wurden 100 μl jeder QM-Lösung ebenfalls zu den Röhrchen 10 bis 13 gegeben, die dann 4 Std. im Schüttler inkubiert wurden. Anschließend wurden 0,1 g eines polymeren Adsorptionsmaterials, Amberlite XAD 16^TM (kommerziell erhältlich von Sigma, Saint Louis, MO) zu jedem der Röhrchen 10 bis 13 gegeben, und die Inkubation wurde über Nacht fortgesetzt. Der Endgehalt jedes Röhrchens und der verwendeten QM-Stammlösungen sind in der nachstehenden Tabelle 19 aufgeführt.
TABELLE 19
In einem gesonderten Experiment wurden die Proben von QM in Wasser folgendermaßen hergestellt. Die Probenröhrchen wurden markiert, und 0,5 ml Phosphatpuffer wurde jeweils dazu gegeben. Dann wurden verschiedene Verdünnungen einer QM-Stammlösung (1 mg/ml) zu fünf der Röhrchen zugegeben. Für 100 μg/Platte – 1,4 ml Stammlösung; für 30 μg/Platte – 0,42 ml Stammlösung + 0,98 ml H₂O; für 10 μg/Platte – 0,14 ml Stammlösung + 1,26 ml H₂O; für 3 μg/Platte – 0,042 ml Stammlösung + 1,358 ml H₂O; für 1 μg/Platte – 0,014 ml Stammlösung + 1,386 ml H₂O. Eine Kontrolle wurde ebenfalls nur mit H₂O hergestellt.
Die Verfahren, die für den Salmonella-Mutagenitäts-Test wie von Maron und Ames eingehend beschrieben, verwendet wurden, wurden genau befolgt. Maron, D. M. und B. N. Ames, Mutation Research 113: 173 (1983). Eine kurze Beschreibung für jedes Verfahren ist hier angegeben. Die Testerstämme TA97a, TA98, TA100, TA102, TA1537 und TA1538 wurden von Dr. Ames erhalten. TA97a, TA98, TA1537 und TA1538 sind Rasterverschiebungs-Testerstämme. TA100 und TA102 sind Basensubstitutions-Testerstämme. Nach Erhalt wurde jeder Stamm unter einer Vielzahl von Bedingungen gezüchtet, um die für die Stämme spezifischen Genotypen zu bestätigen.
Die in dieser Untersuchung verwendeten Standard-Salmonella-Testerstämme erfordern Histidin für das Wachstum, da jeder Testerstamm einen anderen Mutationstyp im Histidin-Operon enthält. Neben der Histidin-Mutation enthalten diese Testerstämme andere Mutationen, die nachstehend beschrieben sind, und die ihre Fähigkeit zur Erfassung des Mutagens stark vergrößern.
Histidin-Abhängigkeit: Der Histidin-Bedarf wurde durch Ausstreichen jedes Stammes zuerst auf einer Minimal-Glucose-Platte, die nur mit Biotin angereichert war, und dann auf einer Minimal-Glucose-Platte, die mit Biotin und Histidin angereichert war, untersucht. Sämtliche Stämme wuchsen nur auf den Histidin/Biotinangereicherten Platten, was einen Histidin-Bedarf bestätigt.
rfa-Mutation: Eine Mutation, die einen partiellen Verlust der Lipopolysaccharid-Schranke verursacht, welche die Oberfläche der Bakterien überzieht, so dass die Permeabilität für große Moleküle durch Exposition einer ausgestrichenen Nähragar-Platte, die mit dem Testerstamm beschichtet worden war, gegenüber Kristallviolett, bestätigt wurde. Zuerst wurden 100 μl jeder Kultur zu 2 ml geschmolzenem Minimal-Deckagar gefügt und auf eine Nähr-Agarplatte gegossen. Dann wurde eine mit Kristallviolett gesättigte sterile Filterpapierscheibe in der Mitte jeder Platte untergebracht. Nach 16 Std. Inkubation bei 37°C wurden die Platten bewertet, und eine klare Zone ohne Bakterienwachstum wurde rings um die Scheibe herum gefunden, was die rfa-Mutation bestätigt.
uvrB-Mutation: Drei in dieser Untersuchung verwendete Stämme enthalten ein defizientes UV-Reparatursystem (TA97a, TA98, TA100, TA1537 und TA1538). Auf dieses Merkmal wurde untersucht durch Ausstreichen der Stämme auf einer Nähragar-Platte, die die Hälfte der Platte bedeckte, und Bestrahlen der freiliegenden Seite der Platte mit keimtötenden Lampen. Nach der Inkubation wurde ein Wachstum nur auf der Seite der Platte beobachtet, die vor der UV-Bestrahlung geschützt war.
R-Faktor: Die Testerstämme (TA97a, TA98, TA100 und TA102) enthalten das pKM101-Plasmid, das ihre Empfindlichkeit gegenüber Mutagenen steigert. Das Plasmid verleiht den Bakterien auch Resistenz gegenüber Ampicillin. Dies wurde bestätigt durch Anzucht der Stämme in Gegenwart von Ampicillin.
pAQ1: Der Stamm TA102 enthält auch das pAQ1-Plasmid, das seine Empfindlichkeit gegenüber Mutagenen weiter steigert. Dieses Plasmid codiert auch die Tetracyclin-Resistenz. Zur Untersuchung auf die Anwesenheit dieses Plasmids wurde TA102 auf einer Minimal-Glucoseplatte ausgestrichen, die Histidin, Biotin und Tetracyclin enthielt. Die Platte wurde 16 Std. bei 37°C inkubiert. Der Stamm zeigte normales Wachstum, was die Anwesenheit von pAQ1-Plasmid anzeigt.
Die gleichen Kulturen, die zur Untersuchung des Genotyps verwendet wurden, wurden ebenfalls gezüchtet, und Aliquots wurden unter kontrollierten Bedingungen eingefroren. Die Kulturen wurden wiederum auf den Genotyp untersucht, um die Übereinstimmung des Genotyps bei der Handhabung bei der Herstellung der gefrorenen Dauerkulturen zu bestätigen.
Die ersten mit den Stämmen erfolgten Tests sollten den Bereich der spontanen Reversion jedes dieser Stämme bestimmen. Mit jedem Mutagenitäts-Experiment wurde die spontane Reversion der Testerstämme gegenüber Histidin-Unabhängigkeit gemessen und ausgedrückt als die Anzahl der spontanen Revertanten pro Platte. Dies diente als Hintergrund-Kontrollen. Eine positive Mutagenese-Kontrolle wurde für jeden Testerstamm aufgenommen, indem ein Diagnosemutagen verwendet wurde, das sich für diesen Stamm eignete (2-Aminofluoren bei 5 mg/Platte für TA98; Natriumazid bei 1,5 mg/Platte für TA100; 9-Aminoakridin für TA1537).
Für sämtliche Experimente wurde das Vorinkubationsverfahren verwendet. Bei diesem Verfahren wurde ein Gefäß für jeden Testerstamm aufgetaut, und die Röhrchen wurden für jeden Stamm hergestellt, welche 20 μl der Kultur und 6 ml Oxoid-Nährbrühe #2 enthielten. Diese Lösung wurde 10 Std. bei 37°C geschüttelt. Bei dem Vorinkubationsverfahren für jeden zur Bewertung der Testlösung verwendeten Testerstamm wurden jeweils 0,1 ml der Übernachtkultur zu den 13 sterilen Teströhrchen gegeben. Zu jedem der Röhrchen wurden 0,1 ml Testlösung von den Röhrchen 1 bis 13 gefügt. Dies wurde ebenfalls mit den Proben durchgeführt, die nur QM in Wasser enthielten. Dann wurde 0,5 ml 0,2 M Natriumphosphatpuffer, pH-Wert 7,4, zugefügt. Dann wurde das 0,7 ml-Gemisch im Vortex-Gerät aufgewirbelt und dann unter Schütteln für 20 min bei 37°C vorinkubiert. Nach dem Schütteln wurden 2 ml geschmolzener Deckagar, angereichert mit Histidin und Biotin, zu dem 0,7 ml-Gemisch zugefügt und sofort auf eine Minimal-Glucose-Agarplatte gegossen (Volumen des Basis-Agars betrug 20 ml). Der Deckagar konnte 30 min härten, und dann wurden die Platten umgedreht und 44 Std. bei 37°C inkubiert. Nach der Inkubation wurde die Anzahl der Revertanten-Kolonien auf jeder Platte gezählt.
Die Ergebnisse erscheinen in der 8. Obwohl das QM eine positive Reaktion im Ames-Test ohne Inkubation in roten Blutkörperchen und in Wasser verzeichnete, reduzierte eine Inkubation über Nacht bei den roten Blutkörperchen signifikant den Spiegel der Revertanten, wie bei der Inkubation mit Adsorptionsmaterial. Ein Parallelexperiment erfolgte mit einem Aktivkohle-Adsorptionsmaterial, Hemosorba (kommerziell erhältlich von Asahi Medical Corp., Tokyo, Japan). Die Ergebnisse, die nicht gezeigt sind, ähnelten den Ergebnissen mit Amberlite XAD 16^TM.
BEISPIEL 13
Wie vorstehend erwähnt, ist ein Verfahren zur Dekontamination der klinischen Proben am geeignetsten, wenn es bei der Dekontamination der Proben die Ergebnisse der klinischen Tests selbst nicht signifikant beeinflusste. Dieses Beispiel vergleicht die Ergebnisse einer gemeinsamen Blutchemie-Gruppe für Proben, die mit den erfindungsgemäßen Verfahren behandelt wurden, mit unbehandelten Proben.
Lösungen von QM und ICR-170 (2 mg/ml) wurden in Salzlösung hergestellt. Das QM war fast vollständig gelöst, und das ICR-170 blieb in Suspension. Anschließend wurde Human-Vollblut entnommen, und 10 ml-Aliquots wurden in acht Röhrchen untergebracht. QM oder ICR-170 wurde zu sechs der Röhrchen in Aliquots von 100, 200 oder 400 μl zugegeben, um eine Endkonzentration der Verbindungen von entweder 20, 40 oder 80 μg/ml zu erzielen. Salzlösung wurde zu den verbleibenden beiden Röhrchen in Aliquots von 100 oder 400 μl zugegeben, um Kontrollproben herzustellen. Die Proben konnten dann 30 min gerinnen, gefolgt von 20 min in einer Zentrifuge bei 1000 U/min. Das getrennte Serum wurde dann in beschriftete Plastikröhrchen überführt und wurde in einer Gruppe von 24 üblichen klinischen Chemie-Tests untersucht.
Die Ergebnisse erscheinen nachstehend in der Tabelle 20. Weder QM noch ICR-170 hatte eine signifikante Auswirkung auf die Ergebnisse von einer der Gruppen von 24 klinischen Chemie-Tests. Lactat- Dehydrogenase und GGT zeigten einen geringfügigen Abfall der Probe mit der höchsten ICR-170-Konzentration. Die erfindungsgemäßen Verfahren stören eindeutig nicht die klinische Untersuchung der Blutproben.
TABELLE 20
BEISPIEL 14
Dieses Beispiel beschreibt die Inaktivierung der bakteriellen Pathogene biologischer Zusammensetzungen mit den erfindungsgemäßen Verfahren. Das folgende Experiment wurde durchgeführt, um zu stützen, dass die erfindungsgemäßen Verfahren zur Inaktivierung bakterieller Pathogene verwendet werden können. Bei diesem Beispiel wurden die erfindungsgemäßen Dekontaminationsverfahren zur Inaktivierung von Staphylococcus epidermis eingesetzt.
Eine Übernachtkultur des Organismus wurde hergestellt durch Animpfen von 3 ml LB-Brühe aus einer Beweglichkeits-Stichkultur. Diese wurde bei 35°C gehalten, und 1,0 ml davon wurde zum Animpfen von 9 ml LB-Brühe in einem konischen 15 ml-Röhrchen verwendet. Eine Probe (1 ml) wurde zum Ablesen einer OD₆₀₀ verwendet. Zu einem Röhrchen wurden 5 ml LB-Brühe gefügt. Dann wurde 50 μl 10⁸ cfu/ml S. epidermis zugegeben. Aliquots der Probe (jeweils 1 ml) wurden in 5 Röhrchen überführt. Diese wurden entweder mit 0, 3, 10, 30 oder 100 μg/ml QM behandelt. Eine 2 mg/ml Stammlösung von QM in ddH₂O wurde in den folgenden Mengen zugegeben, um die gewünschten Konzentrationen zu erzeugen: 0 μl, 1,5 μl, 5 μl, 15 μl und 50 μl. Die Proben wurden 3 Std. auf Eis inkubiert.
Nach der Inkubation wurden die Bakterien durch Plattieren von 0,1 ml 10fach-Verdünnungsreihen in LB-Brühe auf 100 mm Petrischalen mit Agar quantifiziert. Nach 24 Std. Inkubation bei 35°C wurden die Kolonien gezählt, und die Bakterienkonzentration wurde auf der Basis pro ml berechnet. Die in der 9 gezeigten Ergebnisse zeigen, dass QM bei > 10 μg/ml S. epidermis bis zur Nachweisgrenze dieses Tests inaktiviert.
BEISPIEL 15
Soll sich ein dekontaminiertes Blutprodukt zur in-vivo-Therapie eignen, muss das Blutprodukt nach dem Dekontaminationsverfahren eine gewisse Effizienz behalten. Ein Weg zur Bestätigung der Effizienz einer bestimmten Probe roter Blutkörperchen ist die Gewährleistung, dass sie bei der Übertragung in ein Säugetier durch den Körper des Empfängers nicht erheblich eher als die normalen roten Blutkörperchen geklärt werden. Bei diesem Beispiel werden die gepackten roten Blutkörperchen mit Verbindungen mit einem nukleinsäurebindenden Liganden und einer Senfgruppe gemäß den erfindungsgemäßen Verfahren behandelt, in Mäuse übertragen und auf ein Überleben nach der Transfusion untersucht.
Blut wurde aus 8 Balb/c-Mäusen mit einem Antikoagulationsmittel (mit Citrat, Ethylendiamin-Tetraessigsäure, Prostaglandin E1 und Theophyllin) für insgesamt 12 ml (8 ml Blut und 4 ml Antikoagulationsmittel) entnommen. Ein äquivalentes Volumen Adsol wurde hinzugegeben, und die Probe wurde 5 min bei 2000 U/min zentrifugiert. Der Überstand wurde entfernt und als "gewaschene Lösung" aufbewahrt. Das Pellet mit den roten Blutkörperchen wurde in Adsol resuspendiert, so dass eine Lösung mit 50% Htc erhalten wurde. Drei 1,5 ml Aliquots wurden in 14 ml Rundboden-Polypropylenröhrchen überführt.
Anschließend wurden 1 mg/ml Lösungen von 2 Verbindungen QM und ICR-170 in Kochsalzlösung hergestellt. Die Verbindungen wurden zu den drei Polypropylen-Röhrchen wie folgt gegeben: Röhrchen 1 erhielt keine Behandlung (120 μl Salzlösung wurde zugegeben); Röhrchen 2 erhielt 120 μl der 1 mg/ml-QM-Lösung für eine Endkonzentration von 80 μg/ml; Röhrchen 3 erhielt 120 μl der 1 mg/ml ICR-170-Lösung für eine Endkonzentration von 80 μg/ml.
Die Proben wurden dann 2 Std. bei 4°C inkubiert. Die Zellen wurden dreimal gewaschen, jedes Mal durch Zugabe von 6 ml Adsol in jedes Röhrchen und Zentrifugieren der Proben bei 1800 U/min für 5 min. Nach der letzten Wäsche wurde das Pellet in Adsol-Puffer bei einer Konzentration von 4 × 10⁶ Zellen/μl resuspendiert. 50 μl jeder Probe wurden für eine ungefärbte Kontrolle entfernt.
Die verbliebenen Zellen wurden dann mit PKH26-Farbstoff gefärbt. Aus einer 1 mM PKH26-Stammlösung wurden 120 μl entnommen und mit 8 ml Verdünnungsmittel A verdünnt, so dass eine Arbeitslösung von 15,7 μM PKH26 erhalten wurde. Diese Lösung wurde bis zum Gebrauch im Dunkeln aufbewahrt. Zu jeweils 2 ml Zellen wurde 2 ml PKH26-Farbstoff zugefügt. Die Proben wurden vorsichtig gemischt und 5 min im Dunkeln bei Raumtemperatur inkubiert. Die Zellen wurden nach 2,5 min wieder gemischt. Nach einer weiteren 5 min Inkubation wurden 2 Volumina der aufbewahrten "gewaschenen Lösung" zugegeben, um die Färbungsreaktion zu beenden. Die Zellen wurden zur Pelletierung 5 min bei 1800 U/min zentrifugiert, und der Überstand wurde entfernt. Die Zellen wurden dann dreimal mit Adsol-Puffer wie zuvor gewaschen. Nach der letzten Wäsche wurde das Probenvolumen mit Adsol auf 1 ml eingestellt. Ein Aliquot jeder Probe wurde zu diesem Zeitpunkt für eine positiv gefärbte Kontrollprobe entnommen und in der Sysmex-Maschine gezählt.
Swiss Webster-Mäuse wurden mit 0,2 ml markierten Zellen aus jeder der Proben 1 bis 3 über eine Schwanzvenen-Injektion transfundiert. Die Mäuse wurden dann gewogen, um das Blutvolumen zu berechnen. Das Blutvolumen wird berechnet als Tiergewicht in g × 0,06. Dann wurde das Blut aus den Mäusen durch retroorbitale Venenpunktur mit Heparin-EDTA-beschichteten Kapillarröhrchen nach 1 Std., 24 Std., 2 weitere Male während der ersten Woche, und einmal wöchentlich für 3 Wochen entnommen. Die Augenblutungs-Proben wurden vor der Analyse in isotonische Lösung getropft.
Die Proben wurden auf einem FACScan^TM am FL2 (Rotfluoreszenzkanal) unter Gating auf der Population der roten Blutkörperchen mittels Vorwärts- und Seitenstreuungs-Linearmodus-Gates analysiert. Der Anteil der markierten Zellen in 100.000 Gesamt-Gating-Ereignissen roter Blutkörperchen wurde bestimmt.
TABELLE 21
Die Ergebnisse erscheinen in Tabelle 21. Gemäß den Ergebnissen überlebten behandelte Zellen unabhängig von der Behandlung in vivo wie die unbehandelten Kontrollzellen.
Etwas Hämolyse von RBC wurde nach dem Markieren mit PKH26 erfasst. Somit können die Gewinne durch die Markierungstechnik bewerkstelligt werden. Eine alternative Markierungstechnik wurde ebenfalls wie beschrieben verwendet. Ein aktivierter Biotinester wurde über die Schwanzvene der Balb/c-Mäuse injiziert, um die roten Blutkörperchen in vivo zu markieren (jede Maus erhielt entweder eine "Niederdosis-Behandlung" – 0,1 mg Injektion an zwei aufeinanderfolgenden Tagen oder eine "Hochdosis-Behandlung" – 0,3 mg Biotin an drei aufeinanderfolgenden Tagen). Nach der Behandlung waren Nieder- und Hochdosis-Behandlungs-Zellen mit fluoreszierend markiertem Streptavidin bei den Messungen durch FACScan-Analyse klar unterscheidbar. Nieder- und Hochdosis-Behandlungszellen wurden unabhängig mit 80 μg/ml QM oder ICR-170 wie vorstehend beschrieben behandelt. Nach der Behandlung wurden die Zellen gewaschen und mit unbehandelten Zellen, die differentiell markiert wurden, gemischt. Dann wurden drei Mäuse transfundiert. Eine erhielt unbehandelte Nieder- und unbehandelte Hochdosis-RBC, eine erhielt QM-behandelte Nieder- und unbehandelte Hochdosis-RBC, und eine erhielt ICR-170-behandelte Nieder- und unbehandelte Hochdosis-RBC. Das Bluten erfolgte wie vorstehend beschrieben. Die Ergebnisse erscheinen in Tabelle 22 unten. Die Gewinnung der behandelten Zellen ähnelt eindeutig sehr stark den unbehandelten Zellen.
TABELLE 22
BEISPIEL 16
Dieses Beispiel beschreibt die Synthese einer erfindungsgemäßen Verbindung, 5-[N,N-Bis(2-chlorethyl)amino]methyl-8-methoxypsoralen-hydrochlorid (im Text durchgehend als "Verbindung 1" bezeichnet).
Schritt 1: Synthese von 5-Brommethyl-8-methoxypsoralen
Zu einer Lösung von 2,69 g (12,3 mmol) 8-Methoxypsoralen (kommerziell erhältlich von Aldrich, Milwaukee, WI) in 135 ml Eisessig wurden 11 ml Brommethylmethylether gegeben. Die Lösung wurde aufgewirbelt, dann drei Tage bei Raumtemperatur stehen gelassen, während ein weißer Feststoff ausfiel. Das Gemisch wurde in einem Eisbad gekühlt und filtriert. Zu dem Filtrat wurden weitere 2,75 g (12,7 mmol) 8-Methoxypsoralen und 5 ml BrCH₂OCH₃ gefügt. Nach dem neuerlichen Absetzenlassen für 3 Tage wurde die Produkt-Isolation wiederholt. Die Filterkuchen wurden mit kaltem Eisessig gewaschen, an der Luft getrocknet und schließlich im Vakuum getrocknet, so dass eine Gesamtausbeute von 6,3 g (81%) 5-Brommethyl-8-methoxypsoralen als blassgelber Feststoff erhalten wurde. NMR (CDCl₃): 4,33 (s, 3H), 4,88 (s, 2H), 6,52 (d, J = 10 Hz, 1H), 6,95 (d, J = 2 Hz, 1H), 7,77 (d, J = 2 Hz, 1H), 8,11 (d, J = 10 Hz, 1H).
Schritt 2: Synthese von 5-[N,N-Bis(2-hydroxyethyl)amino]methyl-8-methoxypsoralen
5-Brommethyl-8-methoxypsoralen (0,50 g, 1,6 mmol aus Schritt 1, oben) und Diethanolamin (2,56 ml, 27 mmol) wurden in 23 ml absolutem Ethanol vereinigt und für 10 Std. unter Rückfluss erwärmt. Die Lösung wurde eingeengt, dann wurde CHCl₃ (65 ml) zu dem Rest gegeben. Die organische Schicht wurde mit 30, 30 und 10 ml Wasser nacheinander gewaschen und die vereinigten wässrigen Lösungen wurden mit CHCl₃ rückextrahiert. Die vereinigten organischen Lösungen wurden dann dreimal extrahiert, und zwar jedes Mal mit 7 ml 1,2 N HCl. Die vereinigte Säurelösung wurde mit 10% wässrigem NaOH auf pH-Wert 5 bis 6 eingestellt, und die entstandene trübe Lösung wurde viermal gewaschen, und zwar jedes Mal mit 20 ml CHCl₃. Diese letzte organische Lösung wurde mit 2 × 20 ml Salzlösung gespült, getrocknet (Na₂SO₄) und eingeengt, so dass 0,43 g (79%) des Amindiols, 5-[N,N- Bis(2-hydroxyethyl)amino]methyl-8-methoxypsoralen, Schmelzpunkt 121 bis 122°C, erhalten wurde; NMR (CDCl₃): 2,71 (t, J = 5 Hz, 4H), 3,61 (t, J = 5 Hz, 4H), 4,09 (s, 2H), 4,29 (s, 3H), 6,41 (d, J = 10 Hz, 1H), 7,00 (d, J = 2 Hz, 1H), 7,70 (d, J = 2 Hz, 1H), 8,38 (d, J = 10 Hz, 1H).
Schritt 3: 5-[N,N-Bis(2-chlorethyl)amino]methyl-8-methoxypsoralen-hydrochlorid
5-[N,N-Bis(2-hydroxyethyl)amino]methyl-8-methoxypsoralen (0,030 g, 0,090 mmol) wurde in 1 ml Thionylchlorid gelöst. Es wurde mit einem Serum-Deckel mit einer kleinen Nadel-Entlüftung bedeckt und konnte 3 Tage rühren. Das Reaktionsgemisch wurde abgestrippt, und der rohe Feststoff wurde in Isopropanol umkristallisiert, so dass 5-[N,N-Bis(2-chlorethyl)amino]methyl-8-methoxypsoralen-hydrochlorid (0,012 g, 32,4) als schmutzigweißer Feststoff, Schmp. 158–162°C, erhalten wurde. ¹H-NMR (CD₃OD): 3,40 (t, J = 6 Hz, 4H), 3,86 (t, J = 6 Hz, 4H), 4,33 (s, 3H), 4,70 (s, 2H), 6,52 (d, J = 10 Hz, 1H), 7,28 (d, J = 2 Hz, 1H), 8,03 (d, J = 2 Hz, 1H), 8,48 (d, J = 10 Hz, 1H). Die chemische Verschiebung schien gegenüber Spuren an vorhandener Säure empfindlich zu sein.
Eine Portion des vorstehend genannten Salzes wurde zwischen Methylenchlorid und wässriger NaHCO₃ aufgeteilt. Die organische Schicht wurde wiederum mit wässrigem Hydrogencarbonat gewaschen, mit Salzlösung getrocknet und mit wasserfreiem Na₂SO₄ getrocknet und eingedampft, so dass das neutrale Amin erhalten wurde; Massenspektrum (EI, m/e): 371 (3), 369 (4), 230 (16), 229 (100), 214 (5), 201 (5), 186 (10) (erhalten mit einem Shimadzu QP5000 GC/MS, mit Rtx-5, 15m-Säule, kommerziell erhältlich von Shimadzu Corporation, Kyoto, Japan).
BEISPIEL 17
Dieses Beispiel beschreibt eine vorgeschlagene Ausführungsform, wobei rote Blutkörperchen durch ein erfindungsgemäßes Verfahren behandelt wurden. Der derzeit in Blutbanken verwendete Standard-Blutprodukt-Trennungsansatz ist wie folgt: drei Beutel werden durch biegsame Röhrchen ergänzt, so dass ein Blutübertragungs-Set erhalten wird (beispielsweise kommerziell erhältlich von Baxter, Deerfield, Ill.) Nach der Entnahme des Blutes in den ersten Beutel, wird das gesamte Set durch Zentrifugation verarbeitet (beispielsweise Sorvall^TM Swing-Bucket-Zentrifuge, Dupont), was zu gepackten roten Blutkörperchen und blutplättchenreichem Plasma im ersten Beutel führt. Das Plasma wird aus dem ersten Beutel gedrückt (beispielsweise mit einer Fenwall^TM-Vorrichtung zum Ausdrücken von Plasma), durch die Röhre in den zweiten Beutel. Der erste Beutel, der die gepackten roten Blutkörperchen enthält, wird dann abgenommen.
Bei einer Ausführungsform des erfindungsgemäßen Dekontaminationsansatzes, der speziell bei roten Blutkörperchen angewendet wird, wird eine Verbindung mit einem nukleinsäurebindenden Liganden und einer Senfgruppe in die roten Blutkörperchen eingebracht (beispielsweise kann die Verbindung im ersten Beutel zugegen sein, bevor das Blut abgenommen wird, oder nach der Zentrifugation in den ersten Beutel überführt werden) und inkubiert. Nach der Inkubation kann die Verbindung mit einem Adsorptionsmaterial entfernt werden (beispielsweise mit einem kommerziell erhältlichen Material, wie Aktivkohle oder Amberlite-Harz). Das Adsorptionsmittel kann direkt in den Beutel mit den roten Blutkörperchen eingebracht werden, oder die roten Blutkörperchen können durch eine Reinigungsvorrichtung geleitet werden, die das Adsorptionsmittel enthält. Die Inkubation, Reinigung, und anschließende Aufbewahrung kann in einem kommerziell erhältlichen Aufbewahrungsbeutel stattfinden.
Aus dem vorstehenden geht hervor, dass die vorliegende Erfindung Verfahren zur Dekontamination der Blutpräparate bereitstellt, die zur Aufbewahrung und zur in-vivo-Verwendung vorgesehen sind.

Claims

In-vitro-Verfahren zur Inaktivierung eines Pathogens aus Viren, Bakterien oder Protozoen in Säugerblut oder einem Produkt aus Blutbestandteilen, wobei das Verfahren umfasst: (a) das Zusammenbringen in vitro von Säugerblut oder einem Blutbestandteile-Produkt, das unter dem Verdacht steht, dass es ein Pathogen enthält, mit einer das Pathogen inaktivierenden Menge einer ersten Verbindung, die einen nicht-kovalenten nukleinsäurebindenden Ligand und eine daran gebundene Gruppe aufweist, welche aus der aus Senfgruppen und Senfzwischenprodukten bestehenden Gruppe ausgewählt ist, und die beim Inkubieren mit dem Blut oder Blutprodukt zur Inaktivierung von mindestens 1 log Pathogen, welches im Blut oder Blutprodukt gegebenenfalls vorhanden ist, führt; und (b) Gewinnen des pathogeninaktivierten Säugerbluts oder Blutbestandteile-Produkts, wobei das gewonnene Produkt im Wesentlichen seine biologische Aktivität beibehalten hat, wobei die erste Verbindung in einem R17-Bakteriophagen-Test eine größere Inaktivierungseffizienz gegenüber R17 als eine zweite Verbindung hat, welche zwar eine Senfgruppe, jedoch keinen nicht-kovalenten nukleinsäurebindenden Ligand aufweist.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei der nicht-kovalente nukleinsäurebindende Ligand aus der aus einer Interkalationsverbindung, einem Furchenbindemittel, einem Polyamin, einem Phosphatgerüst-Bindemittel, und einem sequenzspezifischen Bindemittel bestehenden Gruppe ausgewählt ist.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei der nicht-kovalente nukleinsäurebindende Ligand eine Interkalationsverbindung ist.
Verfahren nach Anspruch 3, wobei die Interkalationsverbindung aus der aus Acridinen bestehenden Gruppe ausgewählt ist.
Verfahren nach Anspruch 4, wobei die erste Verbindung N1,N1-Bis(2-chlorethyl)-N4-(6-chlor-2-methoxy-9-acridinyl)-1,4-pentandiamin ist.
Verfahren nach Anspruch 3, wobei die Interkalationsverbindung aus der aus Furocoumarinen, Psoralenen und Isopsoralenen bestehenden Gruppe ausgewählt ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei das Blutprodukt aus der aus roten Blutzellen, Plättchen und Plasma bestehenden Gruppe ausgewählt ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei die Konzentration der ersten Verbindung zwischen 4 und 320 μm ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, wobei das Säugerblut menschliches Blut ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, wobei das Pathogen ein Virus ist.
Verfahren nach Anspruch 10, wobei das Virus-Pathogen HIV ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 11, zudem umfassend das Entfernen der ersten Verbindung aus dem pathogeninaktivierten Säugerblut oder Blutprodukt mit einem Adsorptionsmittelmaterial.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 12, wobei die Gruppe, die aus der aus Senf und Senfzwischenprodukten bestehenden Gruppe ausgewählt ist, eine Senfgruppe ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 12, wobei die Gruppe, die aus der aus Senf und Senfzwischenprodukten bestehenden Gruppe ausgewählt ist, ein Senfzwischenprodukt ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 12, wobei die Gruppe, die aus der aus Senf und Senfzwischenprodukten bestehenden Gruppe ausgewählt ist, ein Aziridin oder eine Aziridiniumgruppe ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 12, wobei der nicht-kovalente nukleinsäurebindende Ligand ein Polyamin ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 12, wobei der nicht-kovalente nukleinsäurebindende Ligand ein Polyamin ist, und die Gruppe, die aus der aus Senf und Senfzwischenprodukten bestehenden Gruppe ausgewählt ist, ein Aziridin oder eine Aziridiniumgruppe ist.
Verfahren zur Inaktivierung von Pathogenen in einer klinischen Probe, die zur klinischen Untersuchung aus Säugern entnommen wurde, umfassend in der folgenen Reihenfolge: (a) Bereitstellen in einer beliebigen Reihenfolge: – einer Verbindung mit einem nicht-kovalenten nukleinsäurebindenden Ligand und einer Gruppe, die einen kovalenten Komplex mit der Nukleinsäure des Pathogens bildet und die aus der aus Senf und Senfzwischenprodukten bestehenden Gruppe ausgewählt ist; – einer klinischen Probe, die unter dem Verdacht steht, dass sie mit Pathogenen kontaminiert ist; (b) Zugeben der Verbindung zu der klinischen Probe, so dass man ein Gemisch erhält; (c) Inkubieren des Gemischs für 1 min bis 48 Std. und (d) Messen des Spiegels eines klinischen chemischen Analyten in der klinischen Probe.
Verfahren nach Anspruch 18, wobei die Verbindung N1,N1-Bis(2-chlorethyl)-N4-(6-chlor-2-methoxy-9-acridinyl)-1,4-pentandiamin ist.
Verfahren nach Anspruch 19, wobei N1,N1-Bis(2-chlorethyl)-N4-(6-chlor-2-methoxy-9-acridinyl)-1,4-pentandiamin zugegeben wird, damit eine Konzentration von N1,N1-Bis(2-chlorethyl)-N4-(6-chlor-2-methoxy-9-acridinyl)-1,4-pentandiamin erzielt wird, die hinreicht, dass im Wesentlichen sämtliche Pathogene ohne besondere Schädigung der klinischen Probe inaktiviert werden.
Verfahren nach Anspruch 18, wobei das N1,N1-Bis(2-chlorethyl)-N4-(6-chlor-2-methoxy-9-acridinyl)-1,4-pentandiamin bei der Zugabe zur klinischen Probe N1,N1-Bis(2-chlorethyl)-N4-(6-chlor-2-methoxy-9-acridinyl)-1,4-pentandiamin im Gemisch mit Dextrose, Natriumchlorid, Mannit, Adenin und H₂O ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 18 bis 21, wobei die klinische Probe rote Blutzellen umfasst.
Verfahren nach einem der Ansprüche 18 bis 22, wobei das unter Verdacht stehende Pathogen Viren umfasst.
Verfahren nach einem der Ansprüche 18 bis 22, wobei das unter Verdacht stehende Pathogen Bakterien umfasst.
Verfahren nach einem der Ansprüche 18 bis 24, wobei der Schritt d) ohne besondere Schädigung der klinischen Probe durchgeführt wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 18 bis 25, wobei der nicht-kovalente nukleinsäurebindende Ligand eine Interkalationsverbindung ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 18 bis 25, wobei die Gruppe, die aus der aus Senf und Senfzwischenprodukten bestehenden Gruppe ausgewählt ist, ein Senfzwischenprodukt ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 18 bis 25, wobei die Gruppe, die aus der aus Senf und Senfzwischenprodukten bestehenden Gruppe ausgewählt ist, ein Aziridin oder eine Aziridiniumgruppe ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 18 bis 25, wobei der nicht-kovalente nukleinsäurebindende Ligand ein Polyamin ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 18 bis 25, wobei der nicht-kovalente nukleinsäurebindende Ligand ein Polyamin ist und die Gruppe, die aus der aus Senf und Senfzwischenprodukten bestehenden Gruppe ausgewählt ist, ein Aziridin oder eine Aziridiniumgruppe ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 18 bis 25, wobei die Gruppe, die aus der aus Senf und Senfzwischenprodukten bestehenden Gruppe ausgewählt ist, eine Senfgruppe ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 18 bis 25, wobei der nicht-kovalente nukleinsäurebindende Ligand eine Interkalationsverbindung ist, und die Gruppe, die aus der aus Senf und Senfzwischenprodukten bestehenden Gruppe ausgewählt ist, eine Senfgruppe ist.
5-[N,N-Bis(2-chlorethyl)amino]methyl-8-methoxypsoralen.