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Technisches
Gebiet
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Das
Gebiet dieser Erfindung sind chemisch modifizierte, wasserlösliche Proteinpolymere.
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Hintergrund
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Proteinpolymere
wurden bisher mit wiederkehrenden Domänen mit unterschiedlicher Blockgröße und unterschiedlichem
Massenverhältnis
synthetisiert. Je nach Art der wiederkehrenden Domäne können Polymere
dieser Art eine stark geordnete Struktur aus β-Faltblättern bilden. Im Allgemeinen
nimmt die Löslichkeit
des Polymers in Wasser mit steigender Gesamtanzahl solcher Blöcke in einem
Polymer ab. Außerdem
ist die Regelmäßigkeit
dieser Proteine aus synthetisierten Grundeinheiten viel stärker als
die von Proteinen aus natürlich vorkommenden
Grundeinheiten, aus denen die synthetisierten Proteinpolymere hergestellt
werden. In den extremsten Fällen
sind Proteine aus fast 100 % seideähnlichen Blöcken vollkommen unlöslich in
Wasser.
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Die
meisten Kunststoffe weisen hydrophobe Oberflächen auf. Bei vielen Anwendungen,
z.B. bei Zellkulturen und Immundiagnosen, ist es entscheidend, eine
hydrophile Oberfläche
zu erhalten, die durch wässrige
Flüssigkeiten
benetzt wird. Derzeitige Behandlungen, die im Handel angewendet
werden, umfassen Plasmabehandlungen, um die Bildung von ionisierbaren
chemischen Gruppen auf der Oberfläche auszulösen, Oxidation unter Bestrahlungsbedingungen
oder die Ablagerung von Tensiden auf der Oberfläche.
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Bei
vielen solchen Anwendungen ist es wünschenswert, die Tensid- und
Adhäsionseigenschaften
solcher stark geordneten Proteinpolymere zu nutzen, indem diese
Proteine auf hydrophoben Oberflächen
von wässrigen
Lösungen
abgeschieden wer den. Aufgrund ihrer Unlöslichkeit in Wasser müssen solche
Proteinpolymere jedoch unter Verwendung von Lösungsmitteln mit starker Wasserstoffbindung,
wie z.B. > 85 % Ameisensäure, oder
unter Verwendung von konzentrierten wässrigen Lösungen von Salzen weit oben
in der Hofmeisterschen Reihe, wie z.B. 4,5 M Lithiumperchlorat oder
Lithiumbromid, löslich
gemacht werden.
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Solche
Lösungsmittel
bringen im täglichen
Gebrauch jedoch Nachteile mit sich. > 85 % Ameisensäure ist zwar ein gutes Lösungsmittel
und vollkommen flüchtig,
ist aber korrosiv, und seine Dämpfe
sind schädlich. Wenn
die wässrigen
Salzlösungen
verwendet werden, sind die Salzrückstände korrosiv
und schädlich.
Es kann zwar ein Beschichtungsverfahren verwendet werden, das damit
beginnt, eine relativ konzentrierte Stammlösung eines Proteinpolymers
in einem Lösungsmittel,
wie es oben beschrieben ist, herzustellen, wonach mithilfe von Wasser
als Verdünner
die geeigneten Arbeitskonzentrationen hergestellt werden, aber dieser Ansatz
löst die
oben genannten Probleme nicht. Außerdem sind diese verdünnten Arbeitslösungen häufig metastabil
und ändern
ihre Abscheidungseigenschaften im Laufe der Zeit.
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Die
schädlichen
und korrosiven Komponenten der existierenden Lösungsmittelsysteme komplizieren die
Entwicklung von Beschichtungsverfahren, die Proteinpolymere mit
stark geordneten Strukturen umfassen. Deshalb wären Verfahren zur Modifikation
solcher Proteinpolymere, um ihre Löslichkeit in Wasser zu verbessern,
von großem
Wert.
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Relevante
Literatur
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Verfahren
zur Herstellung von rekombinanten Proteinen aus wiederkehrenden
Blöcken
sind im US-Patent Nr. 5.243.038, das am 7.9.1993 erteilt wurde;
und in der internationalen Anmeldung PCT/US89/05016, veröffentlicht
als WO90/05177, beschrieben.
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Die
DE 19 04 108 offenbart Verfahren
zur Hydroxyalkylierung von bestimmten Proteinen, insbesondere Albumin,
Weizengluten, Sojahydrolysat und Casein.
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Die
FR 2.063.335 offenbart ein Verfahren zur Veresterung von Gelatine
zur Verwendung in Kosmetika.
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Die
US 4.224.219 offenbart ein
Verfahren zur Behandlung von Maisproteinen, insbesondere Zein oder Maisgluten,
mit einem Alkylenoxid, um ein Derivat zu erhalten, das in einem
mäßig alkalischen
wässrigen
Medium löslich
ist.
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Canella
et al., Lebensmittel-Wiss. Technol. 12(2), 95–101 (1979), offenbaren Verfahren
zur Succinylierung und Acetylierung von Sonnenblumenproteinen, um
ihre physikochemischen Eigenschaften als Nahrungsmittelzusatz zu
verbessern.
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ZUSAMMENFASSUNG
DER ERFINDUNG
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Bereitgestellt
werden Verfahren und Zusammensetzungen zur Herstellung und Verwendung
von wasserlöslichen,
Grundeinheiten umfassenden Proteinen durch chemische Modifikation
von wasserunlöslichen, Grundeinheiten
umfassenden Proteinen aus wiederkehrenden Blöcken mit der in den beiliegenden
Ansprüchen
definierten Aminosäuresequenz.
Die Löslichkeit
des Proteins in Wasser wird durch die Umsetzung eines polaren Reaktanten
mit geringem Molekulargewicht mit verfügbaren Funktionalitäten auf
dem Protein erhöht. Das
resultierende Produkt ist wasserlöslich, kann auf Kunststoff
aufgetragen werden und haftet fest daran und behält aktive funktionelle Sequenzen
bei, insbesondere biologische funktionelle Sequenzen, die in der
Ausgangsverbindung vorhanden waren.
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BESCHREIBUNG
SPEZIFISCHER AUSFÜHRUNGSFORMEN
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Bereitgestellt
werden Verfahren und Zusammensetzungen, wodurch Proteine, die einen
Block aus Grundeinheiten aus 3–30
Aminosäuren
umfassen und geringe Wasserlöslichkeit
aufweisen, durch das Hinzufügen
von organischen Gruppen mit geringem Molekulargewicht zu verfügbaren Funktionalitäten chemisch modifiziert
werden, um Produkte zu erhalten, die wasserlöslich sind, aber fest an einer
Kunststoffoberfläche haften,
auch in Gegenwart eines wässrigen
Mediums über
einen längeren Zeitraum.
Von besonderem Interesse sind Proteine mit hohem Molekulargewicht,
worin große
Bereiche aus kleinen Grundeinheiten einen Hauptteil des Proteins
ausmachen.
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Die
Proteine weisen typischerweise ein relativ hohes Molekulargewicht über etwa
6 kD, üblicherweise über etwa
10 kD, vorzugsweise über
20 kD, und im Allgemeinen unter etwa 250 kD, üblicherweise unter etwa 150
kD, meist unter etwa 125 kD, auf. Das Protein ist normalerweise
repetitiv, d.h. es besteht aus wiederkehrenden Grundeinheiten, worin
eine einzelne Einheit aus 3–30
Aminosäuren
(9–90
Nucleotiden), häufiger
3–25 Aminosäuren (9–75 Nucleotiden),
vorzugsweise 4–15
Aminosäuren
(12–45
Nucleotiden), noch bevorzugter 4–12 Aminosäuren (12–36 Nucleotiden), besteht,
wobei üblicherweise
die gleiche Aminosäure
zumindest zweimal in der gleichen Einheit vorkommt, im Allgemeinen
durch zumindest eine Aminosäure
getrennt. Großteils
bestehen die natürlich
vorkommenden Grundeinheiten aus etwa 4 bis 8 Aminosäure-Grundeinheiten, insbesondere
4 bis 6 Aminosäureeinheiten.
Unterschiedliche Kombinationen aus Aminosäure-Grundeinheiten können zusammengesetzt
werden, um ein Blockcopolymer oder alternierendes Blockcopolymer
zu bilden.
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Ein
wesentlicher Teil der gesamten Aminosäuren eines Proteins weist eine
reaktive Funktionalität
auf, einschließlich
Hydroxy-, Sulfhydryl-, Carboxy- und Amino-, insbesondere Hydroxy-
oder Sulfhydrylgruppen, z.B. Serin, Threonin, Tyrosin, Cystein,
Lysin, Histidin, Asparaginsäure
und Glutaminsäure. Üblicherweise
bei zumindest 2 der Anzahl an Aminosäuren, häufiger zumindest etwa 5 % der
Anzahl, vorzugsweise zumindest etwa 10 % der Anzahl, aber üblicherweise
nicht mehr als etwa 30 %, häufiger
nicht mehr als etwa 20 %, sind die reaktiven Funktionalitäten an der
Funktionalisierung des Proteins beteiligt. Wünschenswerterweise ist die reaktive
Gruppe Hydroxy, worin die an der Funktionalisierung beteiligte Hydroxygruppe
je nach funktionalisierender Gruppe variieren kann, z.B. reagiert
Tyrosin mit einem Oxiran und Serin mit einem Sulton.
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Für die Modifikation
geeignete Proteine weisen eine stark geordnete, üblicherweise halbkristalline Struktur
mit einem hohen Anteil an verlängerten β-Konformationen
und β-Schleifenkonformationen
auf.
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Die
Proteinlöslichkeit
in entionisiertem Wasser bei Umgebungsbedingungen beträgt üblicherweise
weniger als etwa 1,0 mg/ml, häufiger
weniger als etwa 0,1 mg/ml. Nach der genannten chemischen Modifikation beträgt die Löslichkeit
bei Umgebungsbedingungen zumindest etwa 10 mg/ml, häufiger zumindest
etwa 100 mg/ml.
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Das
Protein wird durch Umsetzung mit einem funktionalisierenden Reagens,
z.B. einem Alkylierungsmittel oder einem Acylierungsmittel, modifiziert,
wobei ein einzelnes Reagens oder eine Kombination von Reagenzien,
die üblicherweise
aus nicht mehr als etwa 3 Reagenzien, häufiger nicht mehr als etwa
2 Reagenzien, besteht, verwendet werden kann. Geeignete Reagenzien
weisen etwa 2 bis 8, häufig
2 bis 6, Kohlenstoffatome, üblicherweise
2 bis 4 Kohlenstoffatome, wenn es sich nicht um Ammonio handelt,
und üblicherweise
5 bis 8 Kohlenstoffatome bei Ammonio auf, und umfassen 1 bis 4 Heteroatome,
die Chalkogene (Sauerstoff und Schwefel) und Stickstoff sind, vor
allem als Amino mit 1 bis 4 Substituenten. Funktionalitäten umfassen
Epoxide mit 2 bis 4; üblicherweise
2 bis 3, Kohlenstoffatomen, Acylgruppen mit 2 bis 8, üblicherweise
2 bis 6, Kohlenstoffatomen, worin die Acylgruppe 0 bis 2 Oxygruppen
mit 0 bis 2 Kohlenstoffatomen aufweisen kann, oder Aminogruppen
mit 0 bis 4 Kohlenstoffatomen, insbesondere Ammonio, Lactone mit
3 bis 5 Kohlenstoffatomen, insbesondere Sulfonatlacton (Sulton)
mit etwa 3 bis 8 Kohlenstoffatomen, und substituiertes aktives Olefin oder
aktives Halogen mit etwa 2 bis 8 Kohlenstoffatomen, üblicherweise
2 bis 6 Kohlenstoffatomen und vorzugsweise 2 bis 3 Kohlenstoffatomen,
wenn es sich nicht um wie oben beschrieben substituiertes Ammonio mit üblicherweise
1 bis 3 Heteroatomen handelt. Die resultierenden Substituenten umfassen
Hydroxyethyl, Hydroxypropyl, Dihydroxypropyl, Dihydroxybutyl, Carboxymethyl,
Carboxyethyl, Cyanoethyl, Trimethylammonioethyl, 2-Hydroxy-4-dimethylammoniobutyl,
Sulfonatopropyl, Trimethylammonioacetyl, Methoxyacetyl und dergleichen.
Spezielle Reaktanten umfassen Ethylenoxid, Propylenoxid, Hydro xypropylenoxid,
Epichlorhydrin, Chloressigsäure,
Trimethylammonioethylchlorid, Trimethylammoniopropylenoxid, Acrylnitril,
Methacrylamid, Dimethylaminoethylchloridhydrochlorid usw. Die Reaktion
wird üblicherweise
durch eine nucleophile Substitution am Kohlenstoff des Reagens stattfinden,
mit Retention des Aminosäureheteroatoms,
insbesondere durch eine basenkatalysierte nucleophile Substitution.
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In
einem ersten Schritt wird das Protein in einer geeigneten Lösung, in
der die Reaktion stattfinden kann, löslich gemacht, üblicherweise
unter Verwendung von konzentrierten wässrigen Lösungen von Salzen, die in der
Hofmeisterschen Reihe weit oben sind und deren Anionen gegenüber dem/den
funktionalisierenden Reagens/Reagenzien im Wesentlichen inert sind,
wobei ihre Konzentration zumindest etwa 2 M, üblicherweise zumindest etwa
4,5 M, beträgt.
Beispiele für
geeignete Hofmeister-Salze sind Lithiumperchlorat und Kaliumsulfat.
Bei basenkatalysierten Reaktionen kann der pH der Lösung dann
auf zumindest etwa 9, häufiger
zumindest etwa 11, oder zumindest etwa 10 erhöht werden, je nach Art des
organischen Reagens. Das funktionalisierende Reagens wird üblicherweise
in einem zumindest 2fachen molaren Überschuss, üblicherweise zumindest etwa
10fachen Überschuss,
zugesetzt, je nach den für
eine bestimmte Reaktion verfügbaren
reaktiven Gruppen in der Proteinzusammensetzung. Die Reaktion findet
solange statt, bis etwa 1 % der reaktiven Aminosäurereste modifiziert wurde,
häufiger
zumindest etwa 10 % der reaktiven Reste modifiziert wurden, und üblicherweise
nicht mehr als etwa 80 %, häufiger
nicht mehr als etwa 60 %, der reaktiven Reste modifiziert wurden.
Bei Raumtemperatur ist die Reaktion üblicherweise nach etwa 6 Stunden,
häufiger
etwa 3 Stunden, abgeschlossen. Die Reaktion wird gestoppt, indem
der pH auf etwa 7,0 bis 7,5 gesenkt wird. Das modifizierte Protein
kann durch herkömmliche
Verfahren gereinigt werden.
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Je
nach den gewählten
Bedingungen kann ein gewisser Abbau des Proteins stattfinden. Werden
stark basische Bedingungen über
einen längeren
Zeitraum gewählt,
z.B. > 2 M für > 1 h, kann, vor allem
bei hoher Ionenstärke,
z.B. > 2 M LiClO4, das Molekulargewicht des Proteins um etwa
die Hälfte
verringert werden. Deshalb kann durch die Wahl der Reaktionsbedingungen
ein Produkt erhalten werden, das ein ge ringeres oder etwa das gleiche
Molekulargewicht aufweist wie das Protein, plus dem zusätzlichen
Gewicht des Reagens.
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Proteine
von Interesse umfassen Strukturproteine, wie z.B. elastin-, collagen-,
keratin- und seideähnliche
Proteine, vorzugsweise synthetische Proteinpolymere, insbesondere
Proteine, die aus seideähnlichen Proteingrundeinheiten
bestehen, worin Blöcke
aus Grundeinheiten, im Allgemeinen Blöcke aus 2 bis 50 Grundeinheiten,
durch Sequenzen aus etwa 3 bis 50, häufiger 3 bis 35, Aminosäuren getrennt
sind, die eine Sequenz mit chemischer oder physiologischer Aktivität, z.B.
Zellrezeptorbindung, umfassen, wie etwa in Basalmembranproteinen,
Liganden für
Rezeptoren, homing-Proteinen usw. Diese Proteine enthalten die RGDS-Sequenz
(Fibronectin), die IKVAV-Sequenz (Laminin), Cystein, Lysin, Asparaginsäure, Histidin
usw. und andere Gruppen, wie in den US-Patentanmeldungen Nr. 609.716
und 114.618 (zusammen den US-Patenten Nr. 6.184.348; 6.140.072;
6.018.030; 5.830.713; 5.773.249; 5.770.697; 5.723.588; 5.641.648;
5.606.019; 5.514.581; 5.496.712 und 5.243.038 entsprechend) und
in der PCT/US87/02822 (veröffentlicht
als WO88/03533) und in der PCT/US89/05016 (veröffentlicht als WO90/05177)
beschrieben ist, worin zahlreiche wiederkehrende Grundeinheiten
sowie unterschiedliche dazwischenliegende Sequenzen beschrieben
sind. Die Polypeptide können
natürliche,
chemisch synthetisierte oder rekombinante Proteine sein, einschließlich modifizierter
Formen, wie z.B. Mutanten und Fusionsprodukte.
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Seideähnliche
Proteine weisen als Grundeinheit GAGAGS auf (G = Glycin; A = Alanin;
S = Serin). Diese Grundeinheit ist in einem natürlich vorkommenden Seidefibroinprotein
enthalten. Der N-Terminus und der C-Terminus können unterschiedliche Sequenzen
sein, im Allgemeinen aus etwa 1 bis 125 Aminosäuren, üblicherweise etwa 1 bis 60
Aminosäuren,
die üblicherweise
weniger als 20 %, häufiger
weniger als etwa 10 % der gesamten Aminosäuren des Proteins ausmachen.
Größtenteils
weisen die Aminosäuren
kein bestimmtes Muster in den terminalen Sequenzen auf. Von besonderem
Interesse sind Proteine, welche die Zusammensetzung und die physikalischen
Eigenschaften von Seide des Bombyx mori nachahmen. Im Allgemeinen
sind unterschiedliche Termini das Ergebnis der Insertion des Gens
in einen Vektor auf eine Weise, die zur Expression eines Fusionsproteins
führt.
Jedes beliebige Protein, das die gewünschten Eigenschaften des Produkts
nicht beeinträchtigt,
kann den einen oder anderen Terminus bereitstellen. Insbesondere
endogene Wirtsproteine, z.B. bakterielle Proteine, können eingesetzt
werden. Die Termini sind in der vorliegenden Erfindung nicht entscheidend,
sondern dienen hauptsächlich
der einfacheren Handhabung, sollten aber die gewünschten Eigenschaften des Proteins
nicht beeinträchtigen,
und außerdem
können
sie auf eine proteolytische Spaltung ausgerichtet sein.
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Von
besonderem Interesse ist ein Motiv mit einer Basensequenz aus etwa
2 bis 10, vorzugsweise 8 bis 9, einzelnen Grundeinheiten, üblicherweise
durch eine Sequenz aus etwa 5 bis 160 Aminosäuren, üblicherweise 8 bis 50 Aminosäuren, getrennt,
die eine innere Wiederholung aufweisen können, die sich von der einzelnen
Grundeinheit aus 3 bis 30 Aminosäuren
unterscheidet, was normalerweise zur Modifikation der physikalischen
Eigenschaften und der Struktur des Proteins führt. Durch die Einführung von
Elastinwiederholungen in einem fibroinähnlichen Polymer kann beispielsweise
größere Elastizität und Flexibilität im Vergleich
zum fobroinähnlichen
Polymer erreicht werden. Somit können
Blockcopolymere bereitgestellt werden, worin die Eigenschaften je
nach Art der Homopolymere der einzelnen Grundeinheiten variieren.
Die Gesamtanzahl an Basisgrundeinheiten liegt im Allgemeinen im
Bereich von etwa 50 bis 300, üblicherweise
75 bis 250.
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Physikalische
Messungen an gereinigten seideähnlichen
Proteinen, die durch Rekombinationsverfahren hergestellt und danach
beschrieben wurden, bestätigen
das Modell der Faltblattkonformationen mit antiparallelen Ketten
für die
kristallinen Regionen von Bombyx-mori-Seidefibroin. Zirkulardichroismus-(CD-)
und Fourier-Transformations-Infrarotspektroskopie-(FTIR-)
Analysen bestätigen
einen hohen Grad an großen β- und β-Schleifenkonformationen.
Vergleiche zwischen dem Spektrum eines seideähnlichen Proteins (SlpIII,
in den oben genannten Patenten beschrieben) und dem eines natürlich vorkommenden
Seidefibroins in verschiedenen Lösungsmitteln
zeigen, dass SlpIII in Lösung
aus einem Gemisch aus den ungeordneten und stark geordneten Strukturen
besteht, die in Seidefibroinen vorkommen.
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Ein
seideähnliches
Protein mit dazwischenliegenden RGDS-Sequenzen (in den oben genannten
Patenten als SLPF- oder FCB-SLP-Protein bezeichnet und als ProNectin®-F
von Protein Polymer Technologies, Inc., San Diego, CA, erhältlich)
ist dadurch charakterisiert, dass es starkes Adhäsionsvermögen aufweist. Beim Beschichten
einer Kunststoff- oder Glasoberfläche, z.B. Polystyrol, Bioglas,
Polyacrylate usw., vor allem beim Wärmeformen und Extrudieren von
Kunststoffen, wird eine Beschichtung mit starker Adhäsion erhalten,
die in einer Zellkultur über
einen längeren
Zeitraum, z.B. 30 Tage oder länger,
stabil ist. Nach der Modifikation wurde keine wesentliche Veränderung
der oben definierten Adhäsionseigenschaften
nachgewiesen.
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Die
Proteinverbindungen können
als wässrige
Lösungen
bereitgestellt werden, worin der Salzgehalt nicht mehr als 1 M,
normalerweise weniger als etwa 0,5 M, beträgt und können entionisiertes Wasser
sein. Üblicherweise
ist die Proteinverbindung in der wässrigen Lösung in einer Menge von zumindest
etwa 0,001 Gew.-% vorhanden, kann aber auch 0,01 Gew.-% oder mehr
betragen, liegt aber üblicherweise
nicht über
90 Gew.-%, und das Ganze kann als Lösung zur direkten Verwendung
zum Beschichten oder für
andere Zwecke, als Konzentrat aus zumindest etwa 10 Gew.-% oder
als Zusammensetzung mit anderen Komponenten, die für den gewünschten
Zweck geeignet sind, bereitgestellt werden. Die jeweilige Konzentration
des Proteins in der Lösung
hängt von
der Art des Proteins, von seiner Löslichkeit, von der beabsichtigten
Anwendung, von anderen Komponenten in der Lösung und dergleichen ab. Das
Auftragen von biologisch funktionellen Proteinen auf Kunststoffsubstrate
kann bei extrem geringen Konzentrationen stattfinden, während Lösungen zum
Spinnen von Fasern eine hohe Konzentration aufweisen.
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Die
modifizierten Proteine sind vor allem zum Beschichten von Kunststoffoberflächen geeignet.
Die erhöhte
Wasserlöslichkeit
ermöglicht
Beschichtungsverfahren in nichttoxischen Lösungsmittelsystemen, wobei verschiedene
Auftrageverfahren eingesetzt werden können, ohne sich um die Gefahren
der früher
verwendeten Lösungsmittel Gedanken
machen zu müssen.
Da viele Anwendungen den Kontakt mit lebensfähigen biologischen Zellen oder
solchen Geweben umfassen, sind biokompatible Kunststoffe insbesondere
bevorzugt. Biokompatibel Kunststoffe sind typischerweise nicht toxisch
und biochemisch inert. Beispiele für biokompatible Kunststoffe
umfassen Polycaprolacton, Polycarbonat, Polydimethylsiloxan (Siliconkautschuk),
Polydioxanon, Polyetherurethan, Polyethylen und Polyethylenterephthalat,
Polyglykolsäure
und Polymilchsäure
und PLGA-Copolymere, Polystyrol, Polyhydroxyethylmethacrylat (HEMA),
Polymethylmethacrylat (Acryl), Polyvinylchlorid (PVC) usw.
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Das
Kunststoffsubstrat kann unterschiedliche Formen aufweisen, wobei
das Kunststoffsubstrat Laborware, z.B. eine Petrischale, ein Kulturkolben,
ein Erlenmeyerkolben, ein Objektträger, eine Rollflasche, eine Mikrotiterplatte
oder dergleichen, auf die eine festhaftende Beschichtung aufgetragen
werden soll, um beispielsweise Zellen darin zu züchten; eine Vorrichtung, auf
der eine festhaftende Proteinbeschichtung aufgetragen werden soll,
wie z.B. eine Vorrichtung, die in vivo eingeführt wird, worin die unbeschichtete
Kunststoffoberfläche
der Vorrichtung zu einer nachteiligen physiologischen Reaktion führen kann;
und Fasern oder Filme, wobei die Oberflächeneigenschaften des Materials
modifiziert werden sollen; und dergleichen sein kann. Die Lösung kann
durch Anstreichen, Aufsprühen,
Eintauchen oder Einweichen auf die Oberfläche aufgetragen werden.
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Die
Lösungen
können
auch Additive, wie z.B. Stabilisatoren, Puffer, Detergenzien, Verteilungsmittel oder
dergleichen, enthalten, die im Allgemeinen insgesamt weniger als
etwa 5 Gew.-% der Lösung,
häufig
weniger als etwa 1 Gew.-% der Lösung,
ausmachen.
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Die
nachstehenden Beispiele dienen der Veranschaulichung und nicht der
Einschränkung.
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EXPERIMENTELLER
TEIL
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Die
Namen der Polymere und ihre Herstellung sind im US-Patent Nr. 5.243.038
und in der Anmeldung mit der Seriennummer 07/609.716, eingereicht
am 6. November 1990, sowie in den entsprechenden US-Patenten Nr.
6.184.348; 6.140.072; 5.830.713; 5.773.249; 5.723.588; 5.641.648;
5.606.019; 5.514.581 und 5.496.712 zu finden.
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SLPF
(ProNectin©-F,
Protein Polymer Technologies, Inc., San Diego, CA, USA) (100 mg)
wurde in 5,0 ml 4,5 M Lithiumperchlorat in Wasser gelöst. Festes
NaOH (19 mg) wurde unter Rühren
bei Raumtemperatur in dem Gemisch gelöst. Propylenoxid (600 μl) wurde
in zwei Portionen von jeweils 300 μl zugesetzt, wobei nach jedem
Zusatz 2 h bei Raumtemperatur gerührt wurde. Das Reaktionsgemisch
wurde in 45 ml Wasser gegossen und unter Verwendung von verdünnter wässriger
Salzsäure
auf einen pH von 7,0–7,5
neutralisiert. Das Gemisch wurde unter Verwendung einer Cellulosemembran
mit einem Cutoff-Wert von 13 kDA (Spectrum Medical Devices) 24 h
lang gegen entionisiertes Wasser dialysiert. Ein leichter Niederschlag
(4,8 mg) wurde durch ein gewogenes Filterpapier abfiltriert. Die
verbleibende sehr geringe Trübung
wurde durch ein Kissen aus Celite 545 abfiltriert, um eine klare
Lösung
mit einem pH von 6,5 zu erhalten. Diese Lösung wurde auf dem Rotationsverdampfer
auf etwa 10 ml eingeengt, bevor sie 24 h lang unter Verwendung einer
Cellulosemembran mit einem Cutoff-Wert von 13 kDA gegen entionisiertes
Wasser dialysiert wurde. Der Gehalt des Dialyseschlauchs wurde in
einem 100 ml fassenden, birnenförmigen
Kolben außen
eingefroren (Shell-Freezing) und auf einen Enddruck von 75 mTorr
bei 25 °C
gefriergetrocknet. Ein weißer,
flockiger Faserfeststoff (42,8 mg) wurde gewonnen. Dieses Material
wurde als HP-PnF bezeichnet und erwies sich als leicht löslich in
entionisiertem Wasser.
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Eine
Gelelektrophorese dieses Materials zeigt eine Reihe von Banden,
die bei etwa der Hälfte
des Molekulargewichts des Ausgangsmaterials wandern, was auf etwa
eine hydrolytische Kettenspaltung pro Molekül während der Reaktionschemie hinweist.
Die Reaktivität
des Seidefibroinantikörpers
gegenüber
HP-PnF erwies sich als weni ger intensiv als die gegenüber nativem
SLPF, wie durch die Intensität
der auf dem Gel entstehenden Banden und die bekannte Masse der auf
das Gel aufgetragenen Proteinprobe bestimmt wurde.
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Hydroxypropyliertes SLP3.0
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Rohes
SLP3.0 (100 mg) wurde in 4,5 ml 4,5 M Lihtiumperchlorat aufgeschlämmt und
24 h lang bei Raumtemperatur gerührt,
um eine braune partikuläre
Suspension in einer viskosen Lösung
zu erhalten. Celite 454 (50 mg) wurde zugesetzt und das Ganze gerührt und
zentrifugiert, um ein braunes Pellet (ca. 0,3 ml Volumen) zu erhalten
und eine klare Überstandslösung bereitzustellen.
Der Überstand
wurde abdekantiert. Zum Überstand
wurde NaOH (20 mg), gelöst
in 0,50 ml einer 4,5-molaren Lithiumperchloratlösung, zugesetzt. Propylenoxid
(300 μl)
wurde auf ein Mal zugesetzt, und das Gemisch wurde 6 h lang bei
35 °C gerührt. Eine
zweite Portion Propylenoxid (300 μl)
wurde zugesetzt und das Gemisch 2 h lang gerührt. Wasser (5,0 ml) wurde
zugesetzt, und das Reaktionsgemisch wurde mit verdünnter wässriger
Salzsäure
auf einen pH von 7,0 neutralisiert. Die Lösung wurde 48 h lang gegen
entionisiertes Wasser durch eine Cellulosemembran mit einem Cutoff-Wert
von 13 kDA dialysiert. Die leichte Trübung der Produktlösung wurde
durch Zentrifugation entfernt, um einen klaren Überstand und ein Pellet (ca.
0,2 ml) zu erhalten. Der Überstand
wurde Hüllegefroren ("Shell-Freezing") und auf einen Enddruck
von 75 mTorr bei 25 °C
gefriergetrocknet, um ein weißes,
flockiges Material (39 mg) zu erhalten. Dieses Material wurde als
HP-SLP3.0 bezeichnet und erwies sich als leicht löslich in
entionisiertem Wasser.
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Eine
Gelelektrophorese dieses Materials zeigt eine Reihe von Banden,
die bei etwa der Hälfte
des Molekulargewichts des Ausgangsmaterials wandern, was auf etwa
eine hydrolytische Kettenspaltung pro Molekül hinweist. Die Reaktivität des Seidefibroinantikörpers gegenüber HP-SLP3.0
erwies sich als weniger intensiv als die gegenüber nativem SLP3.0, wie durch
die Intensität
der auf dem Gel entstehenden Banden und die bekannte Masse der auf
das Gel aufgetragenen Proteinprobe bestimmt wurde.
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Dimethylaminoethyliertes
SLP3
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Rohes
SLP3.0 (1,0 g) wurde 16 h lang mit 25 ml 4,5 M LiClO4 gerührt. Ungelöste suspendierte
Feststoffe wurden durch Zentrifugation unter Verwendung eines S534-Rotors bei 15.000
U/min über
einen Zeitraum von 20 min entfernt. Ein hellgelber klarer Überstand
(23,5 ml) wurde gewonnen und in den nächsten Schritten verwendet.
Vier Portionen Dimethylaminoethylchlorid·HCl (0,72 g, 5 mmol) und
Natriumhydroxid (0,40 g, 10 mmol) wurden zugesetzt, wobei nach jedem
Zusatz 30 min gerührt
wurde. Essigsäure
(1140 μl) wurde
zugesetzt, um den pH auf 6,5 einzustellen. Die neutralisierte Lösung wurde
in einen Dialyseschlauch mit einem Cutoff-Wert von 13 kDa gegeben
und 24 h lang gegen entionisiertes Wasser dialysiert. Der Rückstand
wurde durch ein Kissen aus Celite 545 auf einem Büchner-Trichter
filtriert, auf dem Rotationsverdampfer eingeengt und 24 h lang durch
einen Dialyseschlauch mit einem Cutoff-Wert von 13 kDa gegen entionisiertes Wasser
dialysiert. Der Rückstand
wurde Hülle-gefroren
("Shell-Freezing") und gefriergetrocknet,
um 39,5 mg eines weißen
Produkts zu erhalten. Dieses Material wurde als DMA-SLP3.0 bezeichnet
und erwies sich als leicht löslich
in entionisiertem Wasser.
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Sulfopropyliertes SLP3
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Rohes
SLP3.0 (1,0 g) wurde 16 h lang mit 25 ml 4,5 M LiClO4 gerührt. Ungelöste suspendierte
Feststoffe wurden durch Zentrifugation unter Verwendung eines S534-Rotors bei 15.000
U/min über
einen Zeitraum von 20 min entfernt. Ein hellgelber klarer Überstand
(23,5 ml) wurde gewonnen und in den nächsten Schritten verwendet.
Vier Portionen Propansulton (1,22 g, 876 μl, 10 mmol) und Natriumhydroxid
(0,40 g, 10 mmol) wurden zugesetzt, wobei nach jedem Zusatz 30 min
lang gerührt
wurde. Essigsäure
(600 μl)
wurde zugesetzt, um den pH auf 6,5 einzustellen. Die neutralisierte
Lösung
wurde in einen Dialyseschlauch mit einem Cutoff-Wert von 13 kDa
ge geben und 24 h lang gegen entionisiertes Wasser dialysiert. Der
Rückstand
wurde durch ein Kissen aus Celite 545 auf einem Büchner-Trichter
filtriert, auf dem Rotationsverdampfer eingeengt und 24 h lang durch
einen Dialyseschlauch mit einem Cutoff-Wert von 13 kDa gegen entionisiertes
Wasser dialysiert. Der Rückstand
wurde Hülle-gefroren
("Shell-Freezing") und gefriergetrocknet,
um 160 mg eines weißen
Produkts zu erhalten. Dieses Material wurde als SP-SLP3.0 bezeichnet
und erwies sich als leicht löslich in
entionisiertem Wasser.
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Sulfopropyliertes
SLPF
-
SLPF
(103 mg) und 3,0 ml 4,5-molares wässriges Lithiumperchlorat wurden
zu einem 10 ml fassenden Erlenmeyerkolben zugesetzt, der mit einem
Gummiseptumverschluss ausgestattet war und mithilfe eines Magnetrührers gerührt wurde.
Der Kopfraum wurde mit Stickstoff gespült, wonach bei Raumtemperatur
zu rühren begonnen
wurde. Propansulton, gelöst
in 2,0 ml Tetrahydrofuran, wurde auf ein Mal zugesetzt, um ein homogenes
Gemisch zu erhalten. Eine Lösung
(1,0 ml) von Natriumhydroxid (40 mg) in 4,5-molarem wässrigem
Lithiumperchlorat wurde dann mithilfe einer Spritzenpumpe mit einer
Geschwindigkeit von 0,019 ml/min zugesetzt. Nach weiteren 30 min
Rühren
wurde eine Lösung
von Essigsäure
(60 mg) in Wasser (1,0 ml) auf ein Mal zugesetzt, und das Reaktionsgemisch
wurde in einen Dialyseschlauch mit einem Cutoff-Wert von 13 kDa
gegeben und 24 h lang gegen 15 l entionisiertes Wasser dialysiert.
Das Wasser wurde gewechselt und die Dialyse weitere 24 h fortgesetzt.
Der Rückstand
wurde Hülle-gefroren
("Shell-Freezing") und gefriergetrocknet,
um 90 mg eines weißen
Produkts zu erhalten. Dieses Material wurde als SP-SLPF bezeichnet
und erwies sich als leicht löslich
in entionisiertem Wasser.
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Dimethylaminoethyliertes
SLPF
-
SLPF
(103 mg), Dimethylaminoethylchloridhydrochlorid (360 mg) und 3,0
ml 4,5-molares wässriges Lithiumperchlorat
wurden zu einem 10 ml fassenden Erlenmeyerkolben zugesetzt, der
mit einem Gummiseptumverschluss ausgestattet war und mit hilfe eines
Magnetrührers
gerührt
wurde. Der Kopfraum wurde mit Stickstoff gespült, und Rühren wurde bei Raumtemperatur
durchgeführt.
Eine Lösung
von Natriumhydroxid (200 mg) in 4,5-molarem wässrigem Lithiumperchlorat (2,65
ml) wurde dann mithilfe einer Spritzenpumpe mit einer Geschwindigkeit
von 0,174 ml/min zugesetzt. Nach weiteren 60 min Rühren wurde
Essigsäure
verwendet, um den pH auf 6,0–6,5
einzustellen, und das Reaktionsgemisch wurde in einen Dialyseschlauch
mit einem Cutoff-Wert von 13 kDa gegeben und 24 h lang gegen 15
l entionisiertes Wasser dialysiert. Der Rückstand wurde Hülle-gefroren
("Shell-Freezing") und gefriergetrocknet,
um 63 mg eines weißen
Produkts zu erhalten. Dieses Material wurde als DMA-SLPF bezeichnet
und erwies sich als leicht löslich
in entionisiertem Wasser.
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Aminosäurezusammensetzungen
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Die
Aminosäurezusammensetzung
der derivatisierten Proteinpolymere wurde durch das PTC-Derivatisierungsverfahren
gemäß Henrickson
und Meredith (1984) bestimmt. Proteinproben wurden bei 108 °C 24 h lang
im Vakuum mit 5,7 N konstant siedender Salzsäure hydrolysiert. Nach der
Umsetzung mit PITC wurden Aminosäurederivate
bei 254 nm durch HPLC-Umkehrphasenchromatographie unter Verwendung
des Systems Hewlett Packard 1090 und einer C18-Säule von Supelco (4,6 mm × 25 cm)
mit einem linearen Gradienten von 0–50 % Acetonitril in 0,1 M
Ammoniumacetat pH 6,78 als mobile Phase detektiert. Henrickson,
R.L., und Meredith, S.C., Amino Analysis by Reverse High Performance
Liquid Chromatography, Anal. Biochem. 137, 64–74 (1984). Die normalisierten
Ergebnisse dieser Analysen von HP-PnF, HP-SLP3.0, DMA-SLP3.0, SP-SLP3.0
bzw. SP-PnF sind in den Tabellen 1 bis 5 zusammengefasst.
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Tabelle
1 Normalisierte
Aminosäurezusammensetzungen
von HP-PnF
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Tabelle
2 Normalisierte
Aminosäurezusammensetzungen
von HP-SLP3.0
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Tabelle
3 Normalisierte
Aminosäurezusammensetzungen
von DMA-SLP3.0
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Tabelle
4 Normalisierte
Aminosäurezusammensetzungen
von SP-SLP3.0
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Tabelle
5 Normalisierte
Aminosäurezusammensetzungen
von SP-PnF
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In
den Fällen
von SP-SLP3.0 und SP-PnF können
die Defizite mittels mikrochemischer Analysen der Elementarzusammensetzung
der Proteine und Berechnung des Molverhältnisses zwischen Schwefel
und Stickstoff verifiziert werden. Sowohl die SLP3.0- als auch die
SLPF-Moleküle
sind anfangs frei von Schwefel, und jeder Funktionalisierungsvorgang
führt eine
einzelne 3-Sulfopropylgruppierung ein. Somit ist das Molverhältnis zwischen
Schwefel und Stickstoff ein Maß für das Ausmaß der Funktionalisierungsreaktion.
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Aufgrund
der beobachteten Defizite von Aminosäuren in SP-SLP3.0 ist das vorhergesagte
Verhältnis S:N
= 0,120. Eine Mikroanalyse der Elementarzusammensetzung dieses funktionalisierten
Proteins ergab ein gemessenes Verhältnis S:N von 0,119. Aufgrund
der beobachteten Defizite von Aminosäuren in SP-PnF ist das vorherge sagte
Verhältnis
S:N = 0,042. Eine Mikroanalyse der Elementarzusammensetzung dieses
funktionalisierten Proteins ergab ein gemessenes Verhältnis S:N
von 0,034. Somit stimmen die Daten der Elementarzusammensetzungen
und Aminosäurezusammensetzungen überein.
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Die
Daten in den Tabellen 1 bis 5 konzentrieren sich auf die Aminosäuren, welche
die Seidefibroinregion (GAGAGS) dieser Proteinpolymere ausmachen,
die seideähnliche
Regionen umfassen. In allen Fällen weisen
die normalisierten Verhältnisse
auf eine Abreicherung von L-Serin hin. Solche Ergebnisse lassen
vermuten, dass die L-Serinreste
durch die Reaktion auf den Seitenkettenhydroxylen die primären Stellen
für die verschiedenen
Veresterungsreaktionen sind.
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Von
einem O-alkylierten Rest von L-Serin im modifizierten Proteinpolymer
wird erwartet, dass er zurück
zu einer Aminosäure
hydrolysiert, nicht aber, das er unter den Bedingungen des sauren
Hydrolyseschritts der Aminosäurezusammensetzungsanalyse
zu nativem L-Serin zurück
spaltet. Somit scheint der Absolutgehalt an L-Serin in den modifizierten
Proteinpolymeren verringert, wie beobachtet wurde. Basierend auf
diesen Zusammensetzungsdaten findet die Funktionalisierung auf 9
% bis 58 % der L-Serinreste statt.
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Die
Reaktivität
des Antikörpers
gegenüber
Seidefibroin hängt
von der Erkennung des GAGAGS-Epitops ab. Wenn eine chemische Modifikation
in der markantesten chemischen Gruppe in diesem Epitop, in der Hydroxyseitenkette
auf dem L-Serinrest, stattfindet, dann würde man eine verringerte Reaktivität gegenüber dem
Antikörper
erwarten. Qualitativ wurde eine solche verringerte Reaktivität gegenüber dem
Antikörper
in den Fällen
des HP-PnF und des HP-SLP3.0 beobachtet.
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Bindung von
VERO-Zellen an mit HP-PnF beschichtetem Polystyrol
-
Um
die Fähigkeit
von HP-PnF in Bezug auf Oberflächenaktivität und Zellbindungsaktivität zu beurteilen,
wurde ein Zellbindungstest auf einer Polystyrolkulturplatte mit
96 Wells durchgeführt.
In diesem Test wurde 1,0 mg/ml ProNectin F (PnF) zu 4,5 M Lithiumperchlorat
zugesetzt und mit phosphatgepufferter Salzlösung zu den endgültigen Beschichtungskonzentrationen
reihenverdünnt.
Das HP-PnF wurde zu entionisiertem Wasser zugesetzt und mit entionisiertem
Wasser reihenverdünnt.
Auf jede Bahn aus 8 Wells auf der Platte wurde eine Verdünnung aufgetragen.
Das Blockieren, Inokulieren mit Zellen, Inkubieren, Fixieren und
Färben
mit blauschwarzem Amidofarbstoff wurden alle laut Standardprotokollen
durchgeführt.
Die relativen Zellenanzahlen wurden bei 495 nm spektralphotometrisch
geschätzt.
Die Ergebnisse dieses Zellbindungstests sind in Tabelle 6 zusammengefasst.
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Tabelle
6 VERO-Zellbindung
an reihenverdünntem
ProNectin
®F
und reihenverdünntem
HP-PnF
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Bindung von VERO-Zellen
an mit SP-PnF beschichtetem Polystyrol
-
Um
die Fähigkeit
von SP-PnF in Bezug auf Oberflächenaktivität und Zellbindungsaktivität zu beurteilen,
wurde ein Zellbindungstest auf einer Polystyrolkulturplatte mit
96 Wells durchgeführt.
In diesem Test wurde 1,0 mg/ml ProNectin F zu 4,5 M Lithiumperchlorat
zugesetzt und mit phosphatgepufferter Salzlösung zur Endkonzentration von
1,0 μg/ml
reihenverdünnt
und dann auf die erste Bahn aus 8 Wells aufgetragen. Das SP-PnF wurde
in einer Konzentration von 1 mg/ml in entionisiertem Wasser ge löst und zu
den endgültigen
Beschichtungskonzentrationen von 10 μg/ml, 1,0 μg/ml, 0,10 μg/ml verdünnt. Auf jeweils zwei Bahnen
aus 8 Wells auf der Platte wurde eine Verdünnung aufgetragen. Das Blockieren,
Inokulieren mit Zellen, Inkubieren, Fixieren und Färben mit
blauschwarzem Amidofarbstoff wurden alle laut Standardprotokollen
durchgeführt.
Die relativen Zellenanzahlen wurden bei 495 nm spektralphotometrisch
geschätzt.
Die Ergebnisse dieses Tests sind in Tabelle 7 zusammengefasst.
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Tabelle
7 VERO-Zellbindung
an reihenverdünntem
ProNectin
©F
und reihenverdünntem
SP-PnF
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Haftung von VERO-Zellen
an mit DMA-PnF beschichtetem Polystyrol
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Um
die Fähigkeit
von DMA-PnF in Bezug auf Oberflächenaktivität und Zellbindungsaktivität zu beurteilen,
wurde ein Zellbindungstest auf einer Polystyrolkulturplatte mit
96 Wells durchgeführt.
In diesem Test wurde 1,0 mg/ml ProNectin F zu 4,5 M Lithiumperchlorat
zugesetzt und mit phosphatgepufferter Salzlösung zur Endkonzentration von
10 μg/ml
reihenverdünnt
und dann auf die erste Bahn aus 8 Wells aufgetragen. Das DMA-PnF
wurde in einer Konzentration von 1 mg/ml in entionisiertem Wasser
gelöst
und zu den endgültigen Beschichtungskonzentrationen
von 10 μg/ml,
1,0 μg/ml,
0,10 μg/ml
verdünnt.
Auf jede Bahn aus 8 Wells auf der Platte wurde eine Verdünnung aufgetragen.
Das Blockieren, Inokulieren mit Zellen, Inkubieren, Fixieren und
Färben
mit blauschwarzem Amidofarbstoff wurden alle laut Standardproto kollen
durchgeführt.
Die relativen Zellenanzahlen wurden bei 495 nm spektralphotometrisch
geschätzt.
Die Ergebnisse dieses Tests sind in Tabelle 8 zusammengefasst.
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Tabelle
8 VERO-Zellbindung
an reihenverdünntem
ProNectin
®F
und reihenverdünntem
DMA-PnF
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Die
Daten zeigen, dass PH-PnF sowohl seine Aktivität als Tensid als auch als Zellbindungsoberflächenmodifikator
beibehält.
Außerdem
führt die
Hydroxypropylierung zu keiner akuten Zytotoxizität. Das hydroxypropylierte Polymer
ist zur Beschichtung von Polystyrol nützlich, das für Säugetierzellkulturen
bestimmt ist. Durch die Modifikation ist es auch für andere
Zwecke geeignet, wie beispielsweise die Ablagerung auf Polypropylenfasern.
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Aus
den dargelegten Daten ist ersichtlich, dass die vorliegenden Verfahren
die Wasserlöslichkeit
von hochrepetitiven, geordneten Proteinen erhöht, ohne die Adhäsionseigenschaften
des Proteins zu verringern. Nach der Modifikation können die
Proteine in Wasser löslich
gemacht und zur Beschichtung von Kunststoffoberflächen für biologische
Zwecke verwendet werden, wobei keine Löslichmachung in toxischen Lösungen mehr
erforderlich ist.
