DE69534569T2 - Hiv-1- und hiv-2-peptide zur inhibition von mit membranfusionen in zusammenhang stehenden phänomenen, einschliesslich der übertragung von hiv - Google Patents

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Description

  • 1. EINLEITUNG
  • Die vorliegende Erfindung betrifft zunächst DP178 (SEQ ID NO: 1), einem Peptid, das den Aminosäuren 638 bis 673 des HIV-1LAI-Transmembranprotenis (TM) gp41 entspricht, und Teile oder Analoge von DP178 (SEQ ID NO: 1), die eine Befähigung zur Veränderung der Membranfusion, eine antivirale Aktivität bzw. Wirksamkeit wie die Befähigung zur Inhibition der HIV-Übertragung auf nicht-infizierte CD-4+-Zellen, oder eine Befähigung zur Modulation intrazellulärer Prozesse, die an den Coiled-Coil-Peptidstrukturen beteiligt sind, aufweisen. Des Weiteren betrifft die Erfindung die Verwendung von DP178 (SEQ ID NO: 1) und Teilen und/oder Analogen von DP178 als antifusiogene oder antivirale Verbindungen oder als Inhibitoren intrazellulärer Ereignisse bzw. Phänomene, an denen Coiled-Coil-Peptidstrukturen beteiligt sind. Die vorliegende Erfindung betrifft ebenfalls zu DP107 (SEQ ID NO: 25) analoge Peptide, einem Peptid, das den Aminosäuren 558 bis 595 des HIV-1LAI-Transmembranproteins (TM) gp41 entspricht, die Aminosäuresequenzen aufweisen, die in anderen Viren, wie umhüllte Viren, und/oder anderen Organismen vorhanden sind, und betrifft weiter die Verwendungen derartiger Peptide. Diese Peptide zeigen eine Befähigung zur Verhinderung der Membranfusion, eine antivirale Wirksamkeit oder die Befähigung zur Modulation intrazellulärer Prozesse, an denen Coiled-Coil-Peptidstrukturen beteiligt sind. Die vorliegende Erfindung betrifft des Weiteren Verfahren zur Identifizierung von Verbindungen, welche die Welchselwirkung zwischen DP178 und DP107, und/oder zwischen DP107-ähnlichen und DP178-ähnlichen Peptiden (zer)stört. Weiterhin betrifft die Erfindung die Verwendung der erfindungsgemäßen Peptide als diagnostische Mittel. Beispielsweise kann ein DP178-Peptid als ein HIV-Subtyp-spezifisches Diagnostikum verwendet werden. Die Erfindung wird zunächst anhand eines Beispiels dargestellt, in dem gezeigt wird, dass DP178 (SEQ ID: 1) und ein Peptid, dessen Sequenz zu DP178 homolog ist, jeweils wirksame, nicht-cytotoxische Inhibitoren der HIV-1-Übertragung auf nicht-infizierte CD-4+-Zellen sind. Die Erfindung wird weiter durch Beispiele dargestellt, in denen Peptide mit einer strukturellen und/oder Aminosäuremotivähnlichkeit zu DP107 und DP178 in verschiedenen viralen und nicht-viralen Organismen identifiziert werden, und in Beispielen dargestellt, in denen gezeigt wird, dass eine Anzahl derartiger identifizierter Peptide, die von einigen verschiedenen viralen Systemen abgeleitet sind, eine antivirale Aktivität entfalten.
  • 2. HINTERGRUND DER ERFINDUNG
  • 2.1 MEMBRANFUSIONSEREIGNISSE
  • Die Membranfusion ist ein ubiquitärer zellbiologischer Prozess (hinsichtlich einer Übersicht siehe White, J. M., 1992, Science 258: 917–924). Fusionsereignisse, die essentielle zelluläre Funktionen wie Endocytose, konstitutive Sekretion und Recycling von Membrankomponenten vermitteln, treten kontinuierlich in allen eukaryotischen Zellen auf.
  • Weitere Fusionsereignisse treten in spezialisierten Zellen auf. Intrazelluläre Fusionsereignisse sind beispielsweise an solchen Prozessen beteiligt, die bei der regulierten Exocytose von Hormonen, Enzymen und Neurotransmittern auftreten. Intrazellulär treten derartige Fusionsereignisse hauptsächlich bei spielsweise bei der Spermien-Ei-Fusion und der Myoblastenfusion auf.
  • Fusionsereignisse stehen ebenfalls mit Krankheitszuständen in Zusammenhang. Beispielsweise sind Fusionsereignisse bei der Bildung von Riesenzellen während entzündlicher Reaktionen, dem Eintritt aller umhüllter Viren in Zellen und beispielsweise im Fall des humanen Immundefizienzvirus (HIV) sind für die viral induzierte Zell-Zell-Fusion verantwortlich, welche zum Zelltod führt.
  • 2.2 DER HUMANE IMMUNDEFIZIENZVIRUS
  • Der humane Immundefizienzvirus (HIV) wurde als primärer Erreger mit der langsam degenerativen Immunsystemerkrankung, die als erworbenes Immundefizienzsyndrom (AIDS) bezeichnet wird, in Zusammenhang gebracht (Barre-Sinoussi, F. et al., 1983, Science 220: 868–870; Gallo, R. et al., 1984, Science 224: 500–503). Es gibt mindestens zwei verschiedene HIV-Typen: HIV-1 (Barre-Sinoussi, F. et al., 1983, Science 220: 868–870; Gallo R. et al., 1984, Science 224: 500–503) und HIV-2 (Clavel, F. et al., 1986, Science 233: 343–346; Guyader, M. et al., 1987, Nature 326: 662–669). Des Weiteren besteht innerhalb der Populationen von jedem dieser Typen eine große genetische Heterogenität. Die Infektion humaner CD-4+-T-Lymphozyten mit einem HIV-Virus führt zur Verarmung dieses Zelltyps und schließlich zu opportunistischen Infektionen, neurologischen Dysfunktionen, neoplastischem Wachstum und am Ende zum Tod.
  • HIV ist ein Mitglied der Lentivirus-Familie von Retroviren (Teich, N. et al., 1984, RNA Tumor Viruses, Weiss, R. et al., Hsg., CSH-Press, Seiten 949–956). Retroviren sind kleine, mit einer Hülle umgebene Viren, die ein diploides, einzelsträngiges RNA-Genom enthalten und sich über ein DNA-Intermediat, das durch eine viral kodierte reverse Transkriptase, einer RNA- abhängigen DNA-Polymerase, hergestellt wird (Varmus, H., 1988, Science 240: 1427–1439) replizieren. Andere Retroviren schließen beispielsweise onkogene Viren wie humane T-Zell-Leukämieviren (HTLV-I, -II, -III) und den Katzenleukämievirus ein.
  • Das virale HIV-Partikel besteht aus einem aus Capsid-Proteinen zusammengesetzten viralen Kern, der das virale RNA-Genom und diejenigen Enzyme enthält, die für die frühen Replikationsschritte erforderlich sind. Das myristylierte Gag-Protein bildet eine äußere Virushülle, um den viralen Kern, die wiederum von einer Lipidmembranhülle umgeben ist, die aus der infizierten Zellmembran stammt. Die Oberflächenglycoproteine von HIV werden als einzelnes Vorläuferprotein von 160 kDa synthetisiert, das während der viralen Ausknospung durch eine zelluläre Protease in zwei Glycoproteine, gp41 und gp120, gespalten wird. gp41 ist ein Transmembranprotein und gp120 ist ein extrazelluläres Protein, das, möglicherweise in einer trimeren oder multimeren Form, mit gp41 nicht-kovalent assoziiert bleibt (Hammarskjold, M. und Rekosh, D., 1989, Biochem. Biophys. Acta 989: 269–280).
  • HIV richtet sich gegen CD-4+-Zellen, da das CD-4-Zelloberflächenprotein als zellulärer Rezeptor für das HIV-1-Virus wirkt (Dalgleish, A. et al., 1984, Nature 312: 763–767; Klatzmann et al., 1984, Nature 312: 767–768; Maddon et al., 1986, Cell 47: 333–348). Der Eintritt des Virus in die Zellen ist von der Bindung von gp120 an die zellulären CD-4+-Rezeptormoleküle abhängig (McDougal, J. S. et al., 1986, Science 231: 382–385; Maddon, P. J. et al., 1986, Cell 47: 333–348) und erklärt daher die Tropie von HIV gegenüber CD-4+-Zellen, während gp41 den Hüllglycoproteinkomplex in der viralen Membran verankert.
  • 2.2 HIV-BEHANDLUNG
  • Die HIV-Infektion ist pandemisch, und HIV-assoziierte Erkrankungen stellen ein wesentliches weltweites Gesundheitsproblem dar. Obwohl beträchtliche Anstrengungen für eine erfolgreiche Entwicklung wirksamer Therapeutika unternommen werden, existiert derzeit kein heilender anti-retroviraler Wirkstoff gegen AIDS. Bei den Versuchen, derartige Wirkstoffe zu entwickeln, wurden einige Schritte des Lebenszyklus von HIV als Ziele für einen therapeutischen Eingriff in Betracht gezogen (Mitsuya, H. et al., 1991, FASEB J. 5: 2369–2381). Beispielsweise ist die viral kodierte Reverse Transkriptase ein Fokus der Wirkstoffentwicklung gewesen. Es ist eine Anzahl gegen die Reverse Transkriptase gerichteter Wirkstoffe, einschließlich 2',3'-Didesoxynukleosidanaloga, wie AZT, ddI, ddC und d4T, entwickelt worden, von denen gezeigt wurde, dass sie gegen HIV wirksam sind (Mitsuya, H. et al., 1991, Science 249: 1533–1544). Obwohl sie vorteilhaft, sind diese Nukleosid-Analoge nicht heilend, was wahrscheinlich auf das schnelle Auftauchen von wirkstoffresistenten HIV-Mutanten zurückzuführen ist (Lander, B. et al., 1989, Science 243: 1731–1734). Außerdem weisen diese Wirkstoffe oftmals toxische Nebenwirkungen, wie Knochenmarkssuppression, Erbrechen und Leberfunktionsabnormalitäten, auf.
  • Es werden ebenfalls Versuche unternommen, Wirkstoffe zu entwickeln, die den Eintritt des Virus in die Zelle, den frühesten Schritt der HIV-Infektion, inhibieren können. Hierbei wurde bis jetzt das Hauptaugenmerk auf CD4, den Zelloberflächenrezeptor für HIV, gelegt. Es wurde beispielsweise gezeigt, dass rekombinantes lösliches CD4 die Infektion von CD-4+-T-Zellen durch einige HIV-1-Stämme inhibiert (Smith, D. H. et al., 1987, Science 238: 1704–1707). Gewisse primäre HIV-1-Isolate sind jedoch vergleichsweise weniger empfindlich gegenüber der Inhibition durch rekombinantes CD-4 (Daar, E. et al., 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 6574–6579). Des Weiteren ergaben klinische Versuche mit rekombinantem löslichem CD-4 keine schlüssigen Ergebnisse (Schooley, R. et al., 1990, Ann. Int. Med. 112: 247–253; Kahn, J. O. et al., 1990, Ann. Int. Med. 112: 254–261; Yarchoan, R. et al., 1989, Proc. Vth Int. Conf. on AIDS, Seite 564, MCP 137).
  • Die späten Schritte der HIV-Replikation, welche die entscheidende virusspezifische sekundäre Prozessierung viraler Proteine einschließt, wurden ebenfalls als mögliche Anti-HIV-Wirkstoffziele vorgeschlagen. Die Prozessierung während der späten Stufen ist von der Aktivität einer viralen Protease abhängig, und es werden Wirkstoffe entwickelt, welche diese Protease inhibieren (Erickson, J., 1990, Science 249: 527–533). Die klinischen Ergebnisse dieser Kandidatenwirkstoffe sind jedoch noch immer fraglich.
  • Die Aufmerksamkeit wird ebenfalls auf die Entwicklung von Vakzinen zur Behandlung der HIV-Infektion gelegt. Es wurde gezeigt, dass die HIV-1-Hüllproteine (gp160, gp120, gp41) die Hauptantigene von in AIDS-Patienten vorliegenden Anti-HIV-Antikörpern sind (Barin, et al., 1985, Science 228: 1094–1096). Bis jetzt scheinen daher diese Proteine die viel versprechendsten Kandidaten zur Wirkung als Antigene für die Entwicklung eines Anti-HIV-Vakzins zu sein. Zu diesem Zweck haben einige Gruppen begonnen, verschiedene Teile von gp160, gp120 und/oder gp41 als immunogene Ziele für das Wirtsimmunsystem zu verwenden. Siehe beispielsweise Ivanoff, L. et al., U.S.-Pat. Nr. 5,141,867; Saith, G. et al., WO 92/22,654; Shafferman, A., WO 91/09,872; Formoso, C. et al., WO 90/07,119. Klinische Ergebnisse in Bezug auf diese Kandidatenvakzine liegen jedoch in ferner Zukunft.
  • Wild et al., (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Bd. 89, Seiten 10537–10541, Nov. 1992) beschreiben ein synthetisches Peptid, welches die Aminosäurereste 558–595 des Hüllglycoproteins gp160 des humanen Immundefizienzvirustyp I Stamm LAI enthält. Dieses Peptid blockiert wirksam Virus-vermittelte Zell-Zell-Fusionsprozesse sowie die Infektion von mononukleären Zellen des peripheren Blutes durch sowohl prototypische als auch primäre Isolate von HIV-1. Wild et al., (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Bd. 91, Seiten 12676–12680, Dez. 1994) zeigen eine Korrelation zwischen den destabilisierenden Effekten von Aminosäuresubstitutionen in Coiled-Coil-Strukturen im Peptidmodell von HIV-1 und dem Phänotyp des Viruseintritts. Wild et al., (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Bd. 91, Seiten 9770–9774, Okt. 1994) beschreiben ein synthetisches Peptid, das den Resten 643–678 des HIV-1LAI-Isolats entspricht, als wirksames antivirales Mittel, das einen frühen Schritt im Viruslebenszyklus vor der reversen Transkription blockiert.
  • US-Patent Nr. 5,464,933 (Prioritätstag 7. Juni 1993, Offenlegungstag 7. November 1995) betrifft Peptide, die eine wirksamt anti-retrovirale Aktivität entfalten. Diese Peptide entsprechen den Aminosäuren 638 bis 673 des gp41-Proteins von HIV-1LAI. WO 94/28920 (Prioritätstag 7. Juni 1993, Offenlegungstag 22. Dezember 1994) betrifft Peptide, die eine wirksame antiretrovirale Aktivität entfalten. Diese Peptide entsprechen den Aminosäuren 638 bis 673 des gp41-Proteins von HIV-1LAI. WO-96/40191 (Prioritätstag 7. Juni 1995, Offenlegungstag 19. Dezember 1996) beschreibt neue antivirale Kombinationen zur Behandlung oder Verhinderung viraler Infektionen, insbesondere durch HIV, in denen virale DP-178- oder DP-107-Fusionsinhibitoren in Kombination mit mindestens einem anderen antiviralen therapeutischen Mittel eingesetzt werden.
  • Obwohl somit große Anstrengungen in Bezug auf das Design und die Untersuchung anti-retroviraler Wirkstoffe unternommen werden, wird weiterhin eine tatsächlich wirksame, nicht-toxische Behandlung benötigt.
  • 3. ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
  • Die vorliegende Erfindung betrifft zunächst ein isoliertes HIV-1- oder HIV-2-Peptid mit der Formel:
    Figure 00080001
    Figure 00090001
    ein isoliertes Respiratory-Syncytial-Virus-Peptid mit der Formel:
    Figure 00090002
    ein isoliertes Influenza-A-Peptid mit der Formel:
    Figure 00090003
    Figure 00100001
    ein isoliertes Epstein-Barr-Virus-Peptid mit der Formel:
    Figure 00100002
    ein isoliertes Masernvirus-Peptid mit der Formel:
    Figure 00100003
    ein isoliertes Hepatitis-B-Virus-Peptid mit der Formel:
    Figure 00110001
    worin Aminosäurereste durch den Ein-Buchstaben-Code dargestellt sind, X eine Aminogruppe, eine 9-Fluorenylmethoxycarbonylgruppe, eine hydrophobe Gruppe oder eine makromolekulare Trägergruppe umfasst, und Z eine Carbo xylgruppe, eine Amidogruppe, eine T-Methoxycarbonylgruppe oder eine makromolekulare Trägergruppe umfasst.
  • Die vorliegende Erfindung betrifft auch die Verwendung der vorstehenden Peptide zur Herstellung von Medikamenten zur Behandlung des humanen Immundefizienzvirus Typ 1 oder Typ 2, des Respiratory-Syncytial-Virus, des Influenza Typ A, des Epstein-Barr-Virus, des Masern- und Hepatitis-B-Virus.
  • DP178 (SEQ ID: 1) ist ein synthetisches Peptid mit 36 Aminosäuren, welche den Aminosäuren 638 bis 673 des Transmembranproteins (TM) gp41 aus dem HIV-1-Isolat LAI (HIV-1LAI) entspricht, das eine wirksame Anti-HIV-1-Aktivität entfaltet. Wie durch das im Abschnitt 6 nachstehend dargestellte Beispiel belegt, ist die antivirale Aktivität von DP178 (SEQ ID: 1) derart hoch, dass, bezogen auf das Gewicht, kein anderes bekanntes Anti-HIV-Mittel bei derart geringen Konzentrationen wirksam ist, bei denen DP178 (SEQ ID: 1) seine inhibitorischen Wirkungen entfaltet.
  • Teile und Analoge von DP178 zeigen ebenfalls eine antivirale Aktivität, und sie zeigen eine Befähigung zur Verhinderung der Membranfusion oder eine Befähigung zur Modulation intrazellulärer Prozesse, an denen Coiled-Coil-Peptidstrukturen beteiligt sind. Der Ausdruck „DP178-Analog" bezeichnet ein Peptid, das eine Aminosäuresequenz enthält, welches der im gp41-Protein von HIV-1LAI vorliegenden DP178-Peptidsequenz entspricht, jedoch in von HIV-1LAI verschiedenen Viren und/oder Organismen gefunden wird. Derartige zu DP178 analoge Peptide können daher DP178-ähnlichen Aminosäuresequenzen entsprechen, die in anderen Viren wie beispielsweise umhüllten Viren wie von HIV-1LAI verschiedenen Retroviren sowie in nicht-umhüllten Viren vorhanden sind. Des Weiteren können derartige zu DP178 analoge Peptide auch DP178-ähnlichen Aminosäuresequenzen entsprechen, die in nicht-viralen Organismen vorliegen.
  • DP107 ist ein Peptid, das in Aminosäuren 558–595 des HIV-1LAI-Transmembranproteins (TM) gp41 entspricht. Der Ausdruck „DP107-Analog", wie vorliegend verwendet, bezeichnet ein Peptid, das eine Aminosäuresequenz enthält, die der im gp41-Protein von HIV-1LAI vorliegenden DP107-Peptidsequenz entspricht, jedoch in von HIV-1LAI verschiedenen Viren und Organismen gefunden wird. Derartige zu DP107 analoge Peptide können daher zu DP107-ähnlichen Aminosäuresequenzen entsprechen, die in anderen Viren, wie beispielsweise umhüllten Viren wie von HIV-1LAI verschiedenen Retroviren sowie nicht-umhüllten Viren vorhanden sind. Des Weiteren können derartige zu DP107 analoge Peptide auch zu DP107-ähnlichen Aminosäuresequenzen entsprechen, die in nicht-viralen Organismen vorhanden sind.
  • Die Peptide der Erfindung können beispielsweise eine antifusiogene Aktivität, antivirale Aktivität aufweisen und/oder sie können die Befähigung aufweisen, intrazelluläre Prozesse, an denen Coiled-Coil-Peptidstrukturen beteiligt sind, zu modulieren. Hinsichtlich der antiviralen Aktivität der erfindungsgemäßen Peptide schließt eine derartige antivirale Aktivität die Inhibition der HIV-Übertragung auf nicht-infizierte CD-4+-Zellen ein, ist aber nicht darauf beschränkt. Des Weiteren erfordert die antifusiogene Befähigung, antivirale Aktivität oder intrazelluläre modulatorische Aktivität der erfindungsgemäßen Peptide lediglich das Vorhandensein der Peptide der Erfindung und erfordert insbesondere keine Stimulation einer Immunantwort des Wirtes, die gegen derartige Peptide gerichtet ist.
  • Die erfindungsgemäßen Peptide können beispielsweise als Inhibitoren von mit einer Membranfusion zusammenhängenden Phänomenen bzw. Ereignissen wie beispielsweise der Inhibition der humanen und nicht-humanen retroviralen Übertragung, insbesondere von HIV, auf nicht-infizierte Zellen verwendet werden. Es ist weiter vorgesehen, dass die erfindungsgemäßen Peptide als Modulatoren intrazellulärer Phänomene bzw. Ereignisse verwendet werden können, an denen Coiled-Coil-Peptidstrukturen beteiligt sind.
  • Die Peptide der Erfindung können in einer anderen Ausführungsform zur Identifizierung von Verbindungen verwendet werden, die selbst wiederum eine antifusiogene, antivirale oder intrazelluläre modulatorische Aktivität entfalten. Weitere Verwendungen schließen beispielsweise die Verwendung der erfindungsgemäßen Peptide als Organismen- oder Virustyp- und/oder -subtyp-spezifische Diagnostika ein.
  • Die Ausdrücke „antifusiogen" und „Antimembranfusion" beziehen sich vorwiegend auf die Befähigung eines Wirkstoffs zur Inhibition oder Verminderung von Membranfusionsereignissen zwischen zwei oder mehr Einheiten im Vergleich zu der Anzahl von Membranfusionen, die zwischen diesen Einheiten in Abwesenheit des Peptids auftreten. Die Einheiten können beispielsweise Zellmembranen oder virale Strukturen wie virale Hüllen oder Pili sein. Der Ausdruck „antiviral" bezieht sich vorliegend auf die Befähigung der Verbindung zur Inhibition der viralen Infektion von Zellen, beispielsweise über eine Zell-Zell-Fusion oder einer Infektion durch den freien Virus. Eine derartige Infektion kann eine Membranfusion, wie sie im Fall von umhüllten Viren auftritt, oder ein beliebiges anderes Fusionsereignis einschließen, an dem eine virale Struktur und eine zelluläre Struktur beteiligt sind (z.B. wie die Fusion eines viralen Pilus und einer bakteriellen Membran während der bakteriellen Konjugation).
  • Es ist ebenfalls vorgesehen, dass die Peptide der Erfindung die Befähigung zur Modulation intrazellulärer Ereignisse entfalten können, an welchen Coiled-Coil-Peptidstrukturen beteiligt sind. Eine „Modulation" bezieht sich vorliegend auf einen stimulatorischen oder inhibitorischen Effekt auf den interessierenden intrazellulären Prozess im Vergleich zur Stärke oder Aktivität eines derartigen Prozesses in Abwesenheit eines erfindungsgemäßen Peptids.
  • Nachstehend werden Ausführungsformen der Erfindung dargestellt, bei denen gezeigt wird, dass eine extrem geringe Konzentration an DP178 (SEQ ID: 1) und sehr geringe Konzentrationen eines DP178-Homologen (SEQ ID: 3) wirksame Inhibitoren der HIV-1-vermittelten CD-4+-Zell-Zell-Fusion (d.h. Syncytienbildung) und der Infektion von CD-4+-Zellen durch zellfreie Viren sind. Weiter wird gezeigt, dass DP178 (SEQ ID: 1) selbst bei Konzentrationen, die drei Größenordnungen über der inhibitorischen Konzentration von DP178 (SEQ ID: 1) liegen, gegenüber Zellen nicht-toxisch ist.
  • Die vorliegende Erfindung stützt sich teilweise auf die überraschende Erkenntnis, dass die DP107- und DP178-Domänen des HIV-gp41-Proteins einen nicht-kovalenten Komplex miteinander bilden und dass ihre Wechselwirkungen für die normale Infektivität des Virus erforderlich ist. Diese Erkenntnis wird in dem im nachstehenden Abschnitt 8 dargestellten Beispiel beschrieben. Die Erfindung betrifft daher außerdem Verfahren zur Identifizierung antifusiogener, einschließlich antiviraler, Verbindungen, welche die Wechselwirkung zwischen DP107 und DP178 und/oder zwischen DP107-ähnlichen und DP178-ähnlichen Peptiden (zer)stören.
  • 3.1 DEFINITIONEN
  • Peptide werden vorliegend als organische Verbindungen definiert, die zwei oder mehrere durch Peptid-Bindungen kovalent miteinander verbundene Aminosäuren umfassen. Peptide können mit Bezug auf die Anzahl der sie aufbauenden Aminosäuren bezeichnet werden, d.h. ein Dipeptid enthält zwei Aminosäure reste, ein Tripeptid enthält drei usw. Peptide, die 10 oder weniger Aminosäuren enthalten, können als Oligopeptide bezeichnet werden, während diejenigen mit mehr als 10 Aminosäureresten Polypeptide sind.
  • Vorliegend definierte Peptid-Sequenzen werden durch Ein-Buchstaben-Symbole für Aminosäurereste wie folgt dargestellt:
    • A
    (Alanin)
    R
    (Arginin)
    N
    (Asparagin)
    D
    (Asparaginsäure)
    C
    (Cystein)
    Q
    (Glutamin)
    E
    (Glutaminsäure)
    G
    (Glycin)
    H
    (Histidin)
    I
    (Isoleucin)
    L
    (Leucin)
    K
    (Lysin)
    M
    (Methionin)
    F
    (Phenylalanin)
    P
    (Prolin)
    S
    (Serin)
    T
    (Threonin)
    W
    (Tryptophan)
    Y
    (Tyrosin)
    V
    (Valin)
  • Die folgende Beschreibung bezieht sich auf verschiedene Peptide, die anhand von nachstehend beschriebenen Suchmotiven definiert sind. Die Aminosäuresequenzen der vorliegenden Erfindung werden sämtlich durch das Suchmotiv ALLMOTI5 eingeschlossen. Aminosäuresequenzen, die von allen anderen Suchmotiven, aber nicht durch das ALLMOTI5-Suchmotiv eingeschlossen werden, sind von der vorliegenden Erfindung ausgeschlossen. Auch sind Aminosäuresequenzen ausgeschlossen, die unter ALLMOTI5, aber nicht unter den Schutzbereich der vorliegenden Ansprüche fallen.
  • 4. KURZE BESCHREIBUNG DER FIGUREN
  • 1. Von HIVLAI abgeleitete Aminosäuresequenz von DP-178 (SEQ ID: 1); DP-178-Homologe, die von HIV-1SP2 (DP-185; SEQ ID: 3), HIV-1RF (SEQ ID: 4) und HIV-1MN, (SEQ ID: 5) abgeleitet sind; DP-178-Homologe, die von den Aminosäuresequenzen zweier prototypischer HIV-2-Isolate, nämlich HIF-2rod (SEQ ID: 6) und HIV-2NIHZ (SEQ ID: 7), abgeleitet sind, Kontroll-Peptide: DP-180 (SEQ ID: 2), ein Peptid, das die Aminosäurereste von DP-178 als Zufallssequenz enthält; DP-118 (SEQ ID: 10), nicht mit DP-178 verwandt, das die HIV-1-Infektion durch zellfreie Viren inhibiert; es wurde gezeigt, dass DP-125 (SEQ ID: 8), das nicht mit DP-178 verwandt ist, die HIV-1-Infektion durch zellfreie Viren inhibiert (Wild et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 10,537–10,541), es wurde zuvor gezeigt, dass DP-116 (SEQ ID: 9), das mit DP-178 nicht verwandt ist, hinsichtlich der Inhibition der HIV-1-Infektion negativ ist, wobei der zellfreie Virusinfektionstest verwendet wurde (Wild et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 10,537–10,541). In allen Figuren wird der Ein-Buchstaben-Code für Aminosäuren verwendet.
  • 2. Inhibition der zellfreien HIV-1-Virusinfektion durch synthetische Peptide. IC50 bezeichnet die Konzentration des Peptids, welche die RT-Produktion aus infizierten Zellen um 50 im Vergleich zur nicht-behandelten Kontrolle inhibiert. Kontrolle: Die von nicht-behandelten Zellkulturen, die mit der gleichen Menge von Viren wie bei behandelten Kulturen infiziert wurden, hergestellte RT-Menge.
  • 3. Inhibition der zellfreien HIV-1- und HIV-2-Virusinfektion durch das synthetische Peptid DP-178 (SEQ ID: 1). IC50: Konzentration des Peptids, welche die RT-Produktion um 50% im Vergleich zu der unbehandelten Kontrolle inhibiert. Kontrolle: RT-Menge, die von unbehandelten Zellkulturen, die mit der gleichen Virusmenge wie die behandelten Kulturen infiziert wurden, hergestellt wurde.
  • 4A–4B. Fusionsinhibitionstest. 4A: Inhibition der HIV-1-prototypischen, Isolat-vermittelten Syncytien-Bildung durch DP-178 (SEQ ID: 1). Die Daten stellen die Anzahl Virusinduzierter Syncytien pro Zelle dar. 4B: DP-180 (SEQ ID: 2) ist ein Zufallskontrollpeptid. DP-185 (SEQ ID: 3) ist ein DP-178-Homologes, abgeleitet vom HIV-1SP2-Isolat. Die Kontrolle bezieht sich auf die Anzahl der von in Abwesenheit des Peptids produzierten Syncytien.
  • 5. Fusionsinhibitionstest: HIV-1 vs. HIV-2. Die Daten stellen die Anzahl Virus-induzierter Syncytien pro Vertiefung dar. ND: nicht bestimmt.
  • 6. Zytotoxizitätsuntersuchung von DP-178 (SEQ ID: 1) und DP-116 (SEQ ID: 9) bei CEM-Zellen. Es sind die Zellproliferationsdaten gezeigt.
  • 7. Schematische Darstellung von Fusionsproteinen von HIV-gp41- und dem Maltosebindungsprotein (MBP)-gp41. DP-107 und DP-178 sind synthetische Peptide auf Basis der zwei mutmaßlichen Helices von gp41. Der Buchstabe P in den DP-107-Boxen bezeichnet eine Mutation von Ile zu Pro bei der Aminosäurenummer 578. Aminosäurereste werden gemäß Meyers et al., Human Retroviruses and AIDS, 1991, Theoret. Biol. and Biophys. Group, Los Alamos Natl. Lab., Los Alamos, NM, nummeriert. Die Proteine sind nachstehend im Abschnitt 8.1.1 genauer beschrieben.
  • 8. Eine Punktmutation ändert die Konformation und Anti-HIV-Aktivität von M41.
  • 9. Aufhebung der Anti-HIV-Aktivität von DP-178. Es wurden Zellfusionstests in Gegenwart von 10 nM DP-178 und verschiedenen Konzentrationen von M41Δ178 oder M41PΔ178 durchgeführt.
  • 10. Bindung von DP-178 an den Leucin-Zipper bzw. -Reißverschluss, analysiert durch FAb-D-ELISA.
  • 11A–B. Modelle für einen strukturellen Übergang im HIV-1-TM-Protein. Es werden zwei Modelle vorgeschlagen, die einen strukturellen Übergang aus einem nativen Oligomer- in einen fusiogenen Zustand nach einem Auslösungsereignis (möglicherweise die Bindung von gp120 an CD4) anzeigen. Gemeinsame Merkmale beider Modelle enthalten: (1) Der native Zustand wird durch nicht-kovalente Protein-Protein-Wechselwirkungen zur Bildung des Heterodimers aus gp120/41 und anderen Wechselwirkungen, hauptsächlich über wechselwirkende Stellen in gp41, zur Bildung von Homooligomeren der gp120/41-Komplexe auf der Virusoberfläche zusammengehalten, (2) Abschirmung hydrophober fusiongener Peptide am N-Terminus (F) im nativen Zustand und (3) die Leucin-Zipper-Domäne (DP-107) existiert als homooligomeres Coiled-Coil nur im fusiogenen Zustand. Die wesentlichen Unterschiede zwischen den zwei Modellen schließen den strukturellen Zustand (nativ oder fusiogen) ein, in welchem die DP-107- und DP-178-Domänen miteinander komplexiert sind. Im ersten Modell (A; 11A) tritt diese Wechselwirkung im nativen Zustand und in B während des fusiogenen Zustands auf. Im Falle der Auslösung bildet sich der Fusionskomplex im Modell, das in (A) gezeigt wird, durch Bildung von Coiled-Coil-Wechselwirkungen in zu DP-107 homologen Domänen, was in einer gestreckten α-Helix resultiert. Diese Konformationsänderung bringt das Fusionspeptid zur Wechselwirkung mit der Zellmembran in Stellung. Im zweiten Modell (B; 11B) wird der fusiogene Komplex durch die Assoziation der DP-178-Domne mit dem DP-107-Coiled-Coil stabilisiert.
  • 12. Motiv-Design unter Verwendung der heptadischen Wiederholungspositionierung von Aminosäuren in bekannten Coiled-Coils.
  • 13. Motiv-Design unter Verwendung einer vorgeschlagenen heptadischen Wiederholungspositionierung von Aminosäuren in DP-107 und DP-178.
  • 14. Hybridmotiv-Design, das GCN4 mit DP-107 kreuzt.
  • 15. Hybridmotiv-Design, das GCN4 mit DP-178 kreuzt.
  • 16. Hybridmotiv-Design 107 × 178 × 4, das DP-107 mit DP-178 kreuzt. Es wurde festgestellt, dass dieses Motiv bei der Identifizierung relevanter DP-107-ähnlicher und DP-178-ähnlicher Peptidregionen am einheitlichsten bzw. am beständigsten ist.
  • 17. Hybridmotiv-Design, das GCN4, DP-107 und DP-178 kreuzt.
  • 18. Hybridmotiv-Design ALLMOTI5, das GCN4, DP-107, DP-178, c-Fos c-Jun, c-Myc und Flu Loop 36 kreuzt.
  • 19. Beispielhafte PLZIP-Motive, die zur Identifizierung N-terminaler Prolin-Leucin-Zipper-Motive entworfen wurden.
  • 20. Suchergebnisse zum Hüllprotein gp41 von HIV-1- (BRU-Isolat). Sequenzsuchmotivbezeichnungen: Pik (♠): 107 × 178 × 4; Herzen (♥) ALLMOTI5; Kreuze (♣): PLZIP; Karos (♦): Transmembranregion (die vermutlichen Transmembrandomänen wurden un ter Verwendung eines PC/Gene-Programms, das zur Suche nach derartigen Peptidregionen ausgelegt ist, identifiziert). Stern (*): Lupas-Verfahren. Die durch jedes Motiv identifizierten Aminosäuresequenzen sind durch die jeweiligen Schriftzeichen in Klammern angegeben. Repräsentative Sequenzen, die auf Basis aller Suchverfahren ausgewählt wurden, sind unterstrichen und fett gezeigt. Die DP-107- und DP-178-Sequenzen sind markiert und zusätzlich doppelt unterstrichen und kursiv dargestellt.
  • 21. Suchergebnisse für das Fusionsglycoprotein F1 des humanen Respiratory-Syncytial-Virus (RSV) vom Stamm A2. Die Sequenzsuchmotivbezeichnungen sind wie in 20 angegeben.
  • 22. Suchergebnisse für das Hüllprotein gp41 des Affenimmundefiziensvirus (SIV) (AGM3-Isolat). Die Sequenzsuchmotivbezeichnungen sind wie in 20 angegeben.
  • 23. Suchergebnisse für das Fusionsglycoprotein 1 des Kaninchen-Distemper-Virus (Stamm Onderstepoort). Die Sequenzsuchmotivbezeichnungen sind wie in 20 angegeben.
  • 24. Suchergebnisse für das Fusionsglycoprotein F1 des Newcastle-Disease-Virus (Stamm Australia-Victoria/32). Die Sequenzsuchmotivbezeichnungen sind wie in 20 angegeben.
  • 25. Suchergebnisse für das Fusionsglycoprotein F1 des humanen Parainfluenza-3-Virus (Stamm NIH 47885). Die Sequenzsuchmotivbezeichnungen sind wie in 20 angegeben.
  • 26. Suchergebnisse für den Hämagglutinin-Vorläufer HA2 des Influenza-A-Virus (Stamm A/AICHI/2/68). Die Sequenzsuchmotivbezeichnungen sind wie in 20 angegeben.
  • 27A–D. Antivirale und Circulardichroismus-Daten des Peptids des Respiratory-Syncytial-Virus (RSV). 27A–B: Peptide, die aus der DP178/DP107-ähnlichen Region von F2 abgeleitet sind. Antivirale und CD-Daten. 27C–D: Aus der DP107-ähnlichen Region von F1 abgeleitete Peptide. Peptid- und CD-Daten.
  • Die antivirale Aktivität (AV) wird durch die folgenden qualitativen Symbole dargestellt.
    • „–",
    negative antivirale Aktivität;
    „+/–",
    antivirale Aktivität bei > 100 μg/ml;
    „+",
    antivirale Aktivität bei zwischen 50–100 μg/ml;
    „++",
    antivirale Aktivität bei zwischen 20–50 μg/ml;
    „+++",
    antivirale Aktivität bei zwischen 1–20 μg/ml;
    „++++",
    antivirale Aktivität bei < 1 μg/ml.
  • Die CD-Daten, die sich auf den Helikalitätsgrad beziehen, werden durch die folgenden qualitativen Symbole dargestellt:
    • „–",
    keine Helikalität;
    „+",
    25–50% Helikalität;
    „++",
    50–75% Helikalität;
    „+++",
    75–100% Helikalität.
  • IC50 bezieht sich auf die Konzentration des Peptids, die erforderlich ist, nur 50% der Anzahl von Syncytien im Vergleich zu infizierten Kontrollkulturen, die kein Peptid enthalten, zu erzeugen. IC50-Werte wurden nur unter Verwendung gereinigter Peptide erhalten.
  • 28A–B. Antivirale und CD-Daten des F1-Peptids der DP178-ähnlichen Region des Respiratory-Syncytial-Virus (RSV). Die antiviralen Symbole, CD-Symbole und IC50, sind wie in 27A–D. IC50-Werte wurden unter Verwendung der gereinigten Peptide allein erhalten.
  • 29A–B. Aus der DP107-ähnlichen F1-Region von HPIV3 abgeleitete Peptide. Antivirale und CD-Daten der Peptide. Antivirale Symbole, CD-Symbole und IC50 sind wie in 27A–D. Gereinigte Peptide wurden verwendet, um IC50-Werte zu erhalten, außer dort, wo die Werte mit einem Stern (*) gekennzeichnet sind, wobei in diesen Fällen die IC50-Werte unter Verwendung einer rohen Peptidpräparation erhalten wurden.
  • 30A–B. Von der DP178-ähnlichen F1-Region von HPIV3 abgeleitete Peptide. Antivirale und CD-Daten der Peptide. Die antiviralen Symbole, CD-Symbole und IC50 sind wie in 27A–D. Gereinigte Peptide wurden verwendet, um IC50-Werte zu erhalten, außer dort, wo die Werte mit einem Stern (*) gekennzeichnet sind, wobei in diesen Fällen die IC50-Werte unter Verwendung einer hohen Peptidpräparation erhalten wurden.
  • 31. Motivsuchergebnisse für Affenimmundefizienzvirus (SIV) Isolat MM251, Hüllpolyprotein gp41. Die Sequenzsuchbezeichnungen sind wie in 20.
  • 32. Motivsuchergebnisse für den Epstein-Barr-Virus (Stamm B95-8), Glycoprotein gp110-Vorläufer (mit gp115 bezeichnet). GALF4. Sequenzsuchbezeichnungen sind wie in 20.
  • 33. Motivsuchergebnisse für Epstein-Barr-Virus (Stamm B95-8), Trans-Aktivatorprotein BZLF1 (mit EB1 oder Zebra bezeichnet). Sequenzsuchbezeichnungen sind wie in 20. Des Weiteren bezieht sich „@" auf eine bekannte DNA-Bindungsdomäne und „+" bezieht sich auf ein bekannte Dimerisierungsdomäne, wie von Flemington und Speck (Flemington, E. und Speck, S. H., 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 9459–9463) definiert.
  • 34. Motivsuchergebnisse für Masernvirus (Stamm Edmonston), Fusionsglycoprotein F1. Sequenzsuchbezeichnungen sind wie in 20.
  • 35. Motivsuchergebnisse für Hepatitis-B-Virus (Subtyp AYW), Hauptoberflächenantigenvorläufer S. Sequenzsuchbezeichnungen sind wie in 20.
  • 36. Motivsuchergebnisse für den Affen-Mason-Pfizer-Affenvirus, Hüll-(TM)-Protein gp20. Sequenzsuchbezeichnungen sind wie in 20.
  • 37. Motivsuchergebnisse für Pseudomonas aeroginosa, Fimbrialprotein (Pilin). Sequenzsuchbezeichnungen sind wie in 20.
  • 38. Motivsuchergebnisse für Neisseria gonorrhoeae Fimbrialprotein (Pilin). Sequenzsuchbezeichnungen sind wie in 20.
  • 39. Motivsuchergebnisse für Hemophilus influenzae Fimbrialprotein. Sequenzsuchbezeichnungen sind wie in 20.
  • 40. Motivsuchergebnisse für Staphylococcus aureus, toxisches Schocksyndromtoxin-1. Sequenzsuchbezeichnungen sind wie in 20.
  • 41. Motivsuchergebnisse für Staphylococcus aureus Enterotoxin Typ E. Sequenzsuchbezeichnungen sind wie in 20.
  • 42. Motivsuchergebnisse für Staphylococcus aureus Enterotoxin A. Sequenzsuchbezeichnungen sind wie in 20.
  • 43. Motivsuchergebnisse für Escherichia coli, hitzelabiles Enterotoxin A. Sequenzsuchbezeichnungen sind wie in 20.
  • 44. Motivsuchergebnisse für das humane c-Fos-Proto-Oncoprotein. Sequenzsuchbezeichnungen sind wie in 20.
  • 45. Motivsuchergebnisse für das humane Lupus-KU-Autoantigenprotein P70. Sequenzsuchbezeichnungen sind wie in 20.
  • 46. Motivsuchergebnisse für das humane Zinkfingerprotein 10. Sequenzsuchbezeichnungen sind wie in 20.
  • 47. Antivirale und CD-Daten der DP178-ähnlichen Region des Masernvirus(MeV)-Fusionsproteins. Antivirale Symbole, CD-Symbole und IC50 sind wie in 27A–D. IC50-Werte wurden unter Verwendung von gereinigten Peptiden erhalten.
  • 48. Antivirale Daten der DP178-ähnlichen Region des TM(Fusions)-Proteins des Affenimmundefizienzvirus (SIV). Die antiviralen Symbole sind wie in 27A–D. „NT", nicht getestet.
  • 49A–C. Die viralen Daten von DP-178 abgeleiteten Peptiden. Die vorliegend angegebenen Peptide wurden aus der Umgebung der DP178-Region des HIV-1-BRU-Isolats (z.b. gp41 Aminosäurereste 615–717) abgeleitet.
  • In Fällen, in denen Peptide DP178-Punktmutationen enthielten, sind die mutierten Aminosäurereste mit einem schattierten Hintergrund gezeigt. In Fällen, bei denen eine Amino- und/oder Carboxy-terminale Gruppe an das Testpeptid angefügt oder davon entfernt wurde (neben den in der in Peptiden zu findenden Standard-Amido- und -Acetyl-Blockierungsgruppen) sind derartige Modifikationen angezeigt. 49A: Die Säule direkt rechts neben dem Namen des Testpeptids zeigt die Größe des Testpeptids und deutet darauf hin, ob das Peptid anhand eines Ein-Aminosäurepeptid-„Walk" über die DP178-Region abgeleitet wurde. Die nächste Säule rechts zeigt an, ob das Testpeptid eine Punktmutation enthält, während die Säule zu seiner Rechten anzeigt, ob bestimmte Aminosäurereste zu der von DP178 abgeleiteten Aminosäuresequenz hinzugefügt oder davon entfernt wurden. 49B: Die Säule direkt rechts neben dem Testpeptidnamen gibt an, ob das Peptid eine DP178-Verkürzung darstellt, die nächste Säule rechts deutet darauf hin, ob das Peptid eine Punktmutation enthält, und die Säule zur Rechten zeigt an, ob das Peptid Aminosäuren enthält, die zu der DP178-Sequenz selbst hinzugefügt oder davon entfernt wurden. 49C: Die Säule direkt rechts neben dem Peptidnamen zeigt an, ob das Testpeptid eine Punktmutation enthält, während die Säule zur Rechten anzeigt, ob Aminosäurereste zu der DP178-Sequenz selbst hinzugefügt wurden oder davon entfernt wurden. IC50 ist wie in 27A–D definiert, und die IC50-Werte wurden unter Verwendung gereinigter Peptide erhalten, außer an dem mit einem Stern (*) markierten Stern, wobei in diesem Fall der IC50-Wert unter Verwendung einer rohen Peptidpräparation erhalten wurde.
  • 50. Antivirale Daten von DP107- und verkürzten DP107-Peptiden der gp41-Region. IC50 ist wie in 27A–D definiert, und die IC50-Werte wurden unter Verwendung von gereinigten Peptiden erhalten, außer an den mit einem Stern (*) markierten Stellen, wobei in diesen Fällen der IC50-Wert unter Verwendung einer rohen Peptidpräparation erhalten wurde.
  • 51A–B. Peptid-„Walks" über die zu DP178/DP107 analoge Region des BZLF1-Protein des Epstein-Barr-Virus vom Stamm B95-8 und Ergebnisse von Tests zur Verschiebung der elektrophoretischen Mobilität. Die Peptide (T-423 bis T-446, 51A; T-447 bis T-461, 51B) stellen einen Aminosäurerest „Walk" über die EBV-Zebra-Proteinregion der Aminosäurereste 173 bis 2246 dar.
  • Der Aminosäurerest in dieser Region, welcher den ersten Aminosäurerest des jeweiligen Peptids entspricht, ist links neben jedem Peptid dargestellt, während der Aminosäurerest innerhalb dieser Region, welcher dem letzten Aminosäurerest des jeweiligen Peptids entspricht, rechts neben jedem Peptid angegeben ist. Die Länge des jeweiligen Testpeptids ist am rechten Ende jeder Zeile unter der Rubrik „Res" angegeben.
  • „ACT" bezieht sich auf die Befähigung eines Testpeptids, die Bindung von Zebra an dessen Antwort- bzw. Reaktionselement zu inhibieren. „+" bezieht sich auf eine sichtbare aber unvollständige Aufhebung des Reaktionselement/Zebra-Homodimerkomplexes. „+++" bezieht sich auf eine vollständige Aufhebung des Komplexes, und „–" stellt ein Fehlen der Komplexstörung dar.
  • 52A–B. DP178/DP107-analoge Region des Hauptoberflächenantigen-Vorläuferproteins S des Hepatitis-B-Virus Subtyp AYW und Peptid- „Walks" darüber. 52A stellt die Domäne I (Aminosäurereste 174–220 des 5-Proteins) dar, die eine potentielle DP178/DP107-analoge Region enthält. Außerdem sind Peptide gezeigt, die Ein-Aminosäure-Peptid-„Walks" über die Domäne I darstelle5. 32B zeigt die Domäne II (Aminosäurereste 233–291 des 5-Proteins), das eine zweite potentielle DP178/DP107-analoge Region enthält. Außerdem sind Peptide angegeben, die Ein-Aminosäure-Peptid-„Walks" über die Domäne II darstellen.
  • 5. BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG IM EINZELNEN
  • Vorliegend werden Peptide beschrieben, welche eine antifusiogene Aktivität, antivirale Befähigung und/oder die Befähigung zur Modulation intrazellulärer Prozesse, an denen Coiled-Coil-Peptidstrukturen -beteiligt sind, enthalten können. Die beschriebenen Peptide schließen zunächst DP178 (SEQ ID NO: 1) ein von gp41 abgeleitetes Peptid mit 36 Aminosäuren und Fragmente und Analoge von DP178 ein.
  • Des Weiteren schließen die Peptide der vorliegend beschriebenen Erfindung Peptide ein, die DP107-Analoge sind. DP107 (SEQ ID NO: 25) ist ein Peptid mit 38 Aminosäuren, das den Resten 558 bis 595 des HIV-1LAI-Transmembran(TM)-Proteins gp41 entspricht. Derartige DP107-Analoge können eine antifusiogene Befähigung, antivirale Aktivität oder ein Befähigung zur Modulation intrazellulärer Prozesse, an denen Coiled-Coil-Strukturen beteiligt sind, enthalten.
  • Des Weiteren werden vorliegend antifusiogene, antivirale, intrazellulär modulatorische und diagnostische Verwendungen der erfindungsgemäßen Peptide beschrieben. Des Weiteren werden Verfahren zur Verwendung der erfindungsgemäßen Peptide zur Identifizierung von Verbindungen beschrieben, die eine antifusiogene, antivirale oder intrazellulär modulatorische Aktivität entfalten.
  • Ohne auf eine beliebige Theorie der Wirkungsweise festgelegt zu sein, wird das folgende Modell zur Erklärung der wirksamen Anti-HIV-Aktivität von DP178 vorgeschlagen, das teilweise auf den nachstehend in den Arbeitsbeispielen beschriebenen Experimenten beruht. In dem viralen Protein gp41 entspricht DP178 einer vermuteten α-Helix-Region, die sich am C-terminalen Ende der Ektodomäne von gp41 befin det und sich mit einer distalen Stelle von gp41 zu assoziieren scheint, dessen wechselwirkende Struktur durch das Leucin-Zipper-Motiv, einer Coiled-Coil-Struktur, mit DP107 bezeichnet, beeinflusst wird. Die Assoziierung könnte eine molekulare Verknüpfung oder „molekulare Klammer" darstellen, die eng am Fusionsprozess beteiligt ist. Es ist von Interesse, dass Mutationen im C-terminalen α-Helix-Motiv von gp41 (d.h. die D178-Domäne) dazu neigen, die Fusionsfähigkeit von gp41 zu verstärken, während Mutationen in der Leucin-Zipper-Region (d.h. die DP107-Domäne) die Fusionsfähigkeit des viralen Proteins herabsetzen oder aufheben. Es ist möglich, dass das Leucin-Zipper-Motiv an der Membranfusion beteiligt ist, während das C-terminale α-Helix-Motiv als molekulare Sicherung dient, um die Verfügbarkeit des Leucin-Zippers während der Virus-induzierten Membranfusion zu regulieren.
  • Aufgrund des Vorangehenden werden zwei Modelle der gp41-vermittelten Membranfusion vorgeschlagen, die schematisch in 11A–B gezeigt sind. Der Grund für das Vorschlagen von zwei Modellen ist, dass die temporale Natur der Wechselwirkung zwischen den durch DP107 und DP178 definierten Regionen bis jetzt nicht festgemacht werden kann. Jedes Modell sieht zwei Konformationen für gp41 – eine in einem „nativen" Zustand, wie er bei einem ruhenden Virion bzw. Virus zu finden sein könnte – vor. Der andere ist ein „fusiogener" Zustand, um Konformationsänderungen zu reflektieren, die nach der Bindung von gp120 an CD4 und direkt vor der Fusion mit der Zielzellmembran ausgelöst werden. Die starke Bindungsaffinität zwischen gp120 und CD4 könnte tatsächlich der Auslöser für den Fusionsprozess sein, was das Erfordernis einer pH-Änderung, wie sie bei Viren auftritt, die innerhalb intrazellulärer Vesikel fusionieren, aus dem Weg räumt. Die zwei Hauptmerkmale beider Modelle sind: (1) Die Leucin-Zipper-Sequenzen (DP107) in jeder Kette der oligomeren Hülle werden im nativen Zustand auseinandergehalten und ihr Ineinandergreifen wird nur im fusiongenen Zustand erlaubt, was die Bildung extrem stabiler Coiled-Coils erlaubt, und (2) die Assoziierung der DP178- und DP107-Stellen, wie sie in gp41 vorliegen, tritt entweder im nativen oder fusiogenen Zustand auf. Die 11A stellt die DP178/DP107-Wechselwirkung im nativen Zustand als molekulare Klasse dar. Falls man andererseits annimmt, dass die stabilste Form der Hülle im fusiogenem Zustand auftritt, kommt das Modell in 11B in Betracht.
  • Wenn sie als Peptide synthetisiert werden, sind sowohl DP107 als auch DP178 wirksame Inhibitoren der HIV-Infektion und -Fusion, was wahrscheinlich auf ihre Befähigung zur Bildung von Komplexen mit viralem gp41 zurückzuführen ist, und sie stören seinen fusiogenen Prozess, z.B. während des strukturellen Übergangs des viralen Proteins von der nativen Struktur in den fusiogenen Zustand könnten die DP178- und DP107-Peptide Zugang zu ihren jeweiligen Bindungsstellen im viralen gp41 gewinnen und einen trennenden Einfluss ausüben. DP107-Peptide, die eine Anti-HIV-Wirksamkeit zeigen, sind in der ebenfalls anhängigen Anmeldung mit der Seriennummer 07/927,532, angemeldet am 7. August 1992, der Anmelderin beschrieben.
  • Wie in den nachstehenden Arbeitsbeispielen gezeigt, inhibierte ein trunkiertes bzw. verkürztes rekombinantes, der Ektodomäne von gp41 entsprechendes gp41-Protein, dass sowohl DP107- als auch DP178-Domänen (ohne das Fusionspeptid, die Transmembranregion und die zytoplasmatische Domäne von gp41) enthält, die HIV-1-induzierte Fusion nicht. Wenn jedoch eine einzelne Mutation eingeführt wurde, um die Coiled-Coil-Struktur der DP107-Domäne zu zerstören –– eine Mutation, die in einem vollständigen Verlust der biologischen Aktivität von DP107-Peptiden resultiert ––, wurde das inaktive rekombinante Protein in einen aktiven bzw. wirksamen Inhibitor der HIV-1-induzierten Fusion umgewandelt. Diese Umwandlung könnte aus einer Freisetzung der wirksamen DP178-Domäne aus der molekularen Klammer mit der Leucin-Zipper-DP107-Domäne resultieren.
  • Es wird klargestellt, dass die vorstehenden Prinzipien primär in Bezug auf die DP178-Peptidinhibitoren von HIV beschrieben werden. Die Prinzipien können jedoch in analoger Weise auf andere Viren, sie sowohl umhüllt als auch nicht-umhüllt sein können, und auf andere nicht-virale Organismen angewandt werden.
  • 5.1. DP178 UND DP178-ÄHNLICHE PEPTIDE
  • Das erfindungsgemäße Peptid DP-178 (SEQ ID: 1) entspricht den Aminosäureresten 638 bis 673 des Transmembranproteins gp41 aus dem Isolat HIV-1LAI und weist die 36 Aminosäuren umfassende Sequenz (vom Amino- zum Carboxy-Terminus):
    Figure 00300001
    auf.
  • Zusätzlich zum vollständigen DP-178-36-mer (SEQ ID: 1) schließen verwendbare Peptide Verkürzungen des DP-178-Peptids (SEQ ID: 1) ein, die eine antifusiogene, antivirale Aktivität und/oder eine Befähigung zur Modulation intrazellulärer Prozesse, an denen Coiled-Coil-Peptidstrukturen beteiligt sind, entfalten. Derartige verkürzte DP-178-(SEQ ID: 1)-Peptide können Peptide zwischen 3 und 36 Aminosäureresten (d.h. Peptide, deren Größe von einem Tripeptid bis zu einem 36-meren Polypeptid reicht) umfassen und können diejenigen, die in den nachstehenden Tabellen I und IA angegeben sind, einschließen, sind aber nicht darauf beschränkt. Die Peptidsequenzen in diesen Tabellen sind vom Amino-(links) zum Carboxy-Terminus (rechts) angegeben. „X" kann eine Amino-Gruppe (-NH2) darstellen, und „Z" kann eine Carboxyl(-COOH)-Gruppe darstellen. In anderen Ausführungsformen kann „X" eine hydrophobe Gruppe, die eine Carbobenzyl, Danyl- oder T-Butoxycarbonylgruppe einschließt, jedoch nicht darauf beschränkt ist, eine Acetyl-Gruppe, eine 9-Fluorenylmethoxycarbonyl(FMOC)-Gruppe, oder eine kovalent angefügte Makromolekülgruppe darstellen, die eine Lipid-Fettsäure-Konjugat-, eine Polyethylenglycol- eine Kohlenhydrat- oder eine Peptidgruppe einschließt, jedoch nicht darauf beschränkt ist. Des weiteren kann „Z" eine Amidogruppe, eine T-Butoxycarbonylgruppe oder eine kovalent angefügte Makromolekülgruppe darstellen, die eine Lipid-Fettsäure-Konjugat-, eine Polyethylenglycol-, eine Kohlenhydrat- oder eine Peptidgruppe einschließt, jedoch nicht darauf beschränkt ist. Eine bevorzugte makromolekulare Gruppe „X" oder „Z" ist eine Peptidgruppe.
  • TABELLE I DP-178 (SEQ ID: 1) CARBOXY-VERKÜRZUNGEN
    Figure 00310001
  • Es wird der Ein-Buchstaben-Aminosäure-Code verwendet.
  • Außerdem kann
    „X" eine Amino-Gruppe, eine hydrophobe Gruppe, einschließlich, jedoch nicht beschränkt auf Carbobenzoxyl, Dansyl oder T- Butyloxycarbonyl, eine Acetyl-Gruppe, eine 9-Fluorenylmethoxycarbonyl(FMOC)-Gruppe, eine makromolekulare Trägergruppe, einschließlich, jedoch nicht beschränkt auf, Lipid-Fettsäure-Konjugate, Polyethylenglycol oder Kohlenhydrate, darstellen.
    „Z" kann eine Carboxyl-Gruppe, eine Amido-Gruppe, eine T-Butyloxycarbonyl-Gruppe, eine makromolekulare Trägergruppe, einschließlich, jedoch nicht beschränkt auf, Lipid-Fettsäure-Konjugate, Polyethylenglycol oder Kohlenhydrate, darstellen.
  • TABELLE IA DP-178 (SEQ ID: 1) Amino-Verkürzungen
    Figure 00320001
  • Es wird der Ein-Buchstaben-Aminosäure-Code verwendet.
  • Außerdem kann
    „X" eine Amino-Gruppe, eine hydrophobe Gruppe, einschließlich, aber nicht beschränkt auf, Carbobenzoxyl, Dansyl oder T-Butyloxycarbonyl, eine Acetyl-Gruppe, eine 9-Fluorenylmethoxycarbonyl-Gruppe, eine makromolekulare Trägergruppe, einschließlich, aber nicht beschränkt auf, Lipid-Fettsäure-Konjugate, Polyethylenglycol oder Kohlenhydrate, darstellen.
    „Z" kann eine Carboxyl-Gruppe, eine Amido-Gruppe, eine T-Butyloxycarbonyl-Gruppe, eine makromolekulare Trägergruppe, einschließlich, aber nicht beschränkt auf, Lipid-Fettsäure-Konjugate, Polyethylenglycol oder Kohlenhydrate, darstellen.
  • Die Peptide der Erfindung schließen auch zu DP-178 ähnliche Peptide ein. „DP178-ähnlich" schließt zunächst vorliegend DP-178 und/oder DP-178-Verkürzungen ein, die ein oder mehrere Aminosäuresubstitutionen, -insertionen und/oder -deletionen enthalten, ein.
  • Die zu DP178 ähnlichen Peptide der Erfindung können eine antifusiogene oder antivirale Aktivität entfalten, oder sie können eine Befähigung zur Modulation intrazellulärer Prozesse, an denen Coiled-Coil-Peptide beteiligt sind, aufweisen. Des Weiteren können derartige zu DP178 ähnliche Peptide zusätzliche vorteilhafte Eigenschaften, wie beispielsweise eine erhöhte Bioverfügbarkeit und/oder -stabilität oder eine verminderte Wirtsimmunerkennung, aufweisen.
  • HIV-1- und HIV-2-Hüllproteine sind strukturell verschieden, es besteht jedoch eine auffallende Aminosäurekonservierung innerhalb der DP-178-entsprechenden Regionen von HIV-1 und HIV-2.
  • Die Aminosäurekonservierung ist von periodischer Natur, was eine gewisse Konservierung der Struktur und/oder Funktion nahelegt. Daher würde eine mögliche Klasse von Aminosäuresubstitutionen diejenigen Aminosäureänderungen einschließen, von denen vorausgesagt wird, dass sie die Struktur der erfindungsgemäßen DP-178-Peptide stabilisieren.
  • Unter Verwendung der DP178- und DP178-analogen Sequenzen, die vorliegend beschrieben werden, kann ein Fachmann leicht DP178-Konsensussequenzen darstellen und anhand dieser konservierte Aminosäurereste feststellen, die bevorzugte Aminosäuresubstitutionen darstellen würden.
  • Aminosäuresubstitutionen können von konservativer oder nichtkonservativer Natur sein. Konservative Aminosäuresubstitutionen bestehen aus dem Austausch einer oder mehrerer Aminosäuren der DP-178(SEQ ID: 1)-Peptidsequenz durch Aminosäuren mit ähnlicher Ladung, Größe und/oder Hydrophobizitätsmerkmale, wie beispielsweise einer Aminosäuresubstitution von Glutaminsäure (E) zu Asparaginsäure (D). Nicht-konservative Substitutionen bestehen aus einem Austausch ein oder mehrerer Aminosäuren der DP-178(SEQ ID: 1)-Peptidsequenz durch Aminosäuren, die unähnliche Ladungs-, Größen- und/oder Hydrophobizitätsmerkmale aufweisen, wie beispielsweise eine Substitution von Glutaminsäure (E) zu Valin (V).
  • Aminosäureinsertionen können aus einzelnen Aminosäureresten oder Strängen von Resten bestehen. Die Insertionen können am Carboxy- oder Amino-terminalen Ende der DP178- oder DP178-verkürzten Peptide sowie in einer internen Position des Peptids erfolgen. Derartige Insertionen weisen im allgemeinen eine Länge in einem Bereich von 2 bis 15 Aminosäuren auf. Es ist vorgesehen, dass die entweder am Carboxy- oder Aminoterminus des Peptids vorgenommene Insertionen im interessierenden Pep tid einen breiteren Größenbereich aufweisen, wobei etwa 2 bis etwa 50 Aminosäuren bevorzugt sind.
  • Bevorzugte Amino- oder Carboxy-terminale Insertionen sind Peptide, deren Länge im Bereich von etwa 2 bis etwa 50 Aminosäurereste liegt, die gp41-Proteinregionen entweder Amino- bzw. Carboxy-terminal zur in Rede stehenden DP178-gp41-Aminosäuresequenz entsprechen. Daher würde eine bevorzugte Amino-terminale oder Carboxy-terminale Aminosäureinsertion gp41-Aminosäuresequenzen enthalten, die sich direkt Amino- oder Carboxy-terminal zur DP178-Region des gp41-Proteins befinden.
  • Deletionen von DP178 (SEQ ID: 1) oder DP178-Verkürzungen liegen ebenfalls im Schutzbereich der Erfindung. Derartige Deletionen bestehen aus der Entfernung einer oder mehrerer Aminosäuren aus den DP178- oder DP178-ähnlichen Peptidsequenzen, wobei die untere Grenze der Länge der resultierenden Peptidsequenz bei 4 bis 6 Aminosäuren liegt. Derartige Deletionen können einen einzelnen zusammenhängenden oder mehr als einen abgeschlossenen Teil der Peptidsequenzen einschließen.
  • DP107-Analoge sind nachstehend im Abschnitt 5.3 genauer beschrieben.
  • 5.2 DP107- UND DP107-ÄHNLICHE PEPTIDE
  • Des Weiteren schließen die erfindungsgemäßen Peptide Peptide ein, die Aminosäuresequenzen aufweisen, welche DP107-Analogen entsprechen. DP107 ist ein Peptid mit 38 Aminosäuren, das eine wirksame antivirale Aktivität entfaltet und den Resten 558 bis 595 des HIV-1LAT-Transmembran(TM)-gp41-Proteins entspricht und vorliegend gezeigt wird:
  • Figure 00350001
  • Zusätzlich zum vollständigen 38-meren DP107 (SEQ ID: 25) können die erfindungsgemäßen Peptide Verkürzungen des DP107-Peptids (SEQ ID: 25) einschließen, die eine antifusiogene Aktivität, antivirale Aktivität und/oder die Befähigung zur Modulation intrazellulärer Prozesse, an denen Coiled-Coil-Peptidstrukturen beteiligt sind, entfalten. Verkürzungen von DP107(SEQ ID: 25)-Peptiden können Peptide mit zwischen 3 und 38 Aminosäureresten (d.h. Peptide, die in der Größe von einem Tripeptid bis zu einem 38-meren Polypeptid reichen), wie in den nachstehenden Tabellen II und IIA gezeigt, umfassen. Die Peptidsequenzen sind in diesen Tabellen vom Amino-(links) zum Carboxy-Terminus (rechts) angegeben. „X" kann eine Amino-Gruppe (-NH2) darstellen, und „Z" kann eine Carboxyl(-COOH)-Gruppe darstellen. In anderen Ausführungsformen kann „X" eine hydrophobe Gruppe, die eine Carbobenzyl, Danyl- oder T-Butoxycarbonylgruppe einschließt, jedoch nicht darauf beschränkt ist, eine Acetyl-Gruppe, eine 9-Fluorenylmethoxycarbonyl(FMOC)-Gruppe, oder eine kovalent angefügte Makromolekülgruppe darstellen, die eine Lipid-Fettsäure-Konjugat-, eine Polyethylenglycol- eine Kohlenhydrat- oder eine Peptidgruppe einschließt, jedoch nicht darauf beschränkt ist. Des Weiteren kann „Z" eine Amidogruppe, eine T-Butoxycarbonylgruppe oder eine kovalent angefügte Makromolekülgruppe darstellen, die eine Lipid-Fettsäure-Konjugat-, eine Polyethylenglycol- eine Kohlenhydrat- oder eine Peptidgruppe einschließt, jedoch nicht darauf beschränkt ist. Eine bevorzugte makromolekulare Gruppe „X" oder „Z" ist eine Peptidgruppe.
  • TABELLE II DP107 (SEQ ID: 25) CARBOXY-VERKÜRZUNGEN
    Figure 00370001
  • Es wird der Ein-Buchstaben-Aminosäure-Code verwendet.
  • Außerdem kann „
    X" eine Aminogruppe, eine hydrophobe Gruppe, einschließlich, jedoch nicht beschränkt auf, Carbobenzoxyl, Dansyl oder T-Butyloxycarbonyl- eine Acetylgruppe, eine 9-Fluorenylmethoxycarbonyl(FMOC)-Gruppe, eine makromolekulare Trägergruppe, einschließlich, jedoch nicht beschränkt auf, Lipid-Fettsäure-Konjugate, Polyethylenglycol oder Kohlenhydrate, darstellen.
    „Z" kann eine Carboxylgruppe, eine Amidogruppe, eine T-Butyloxycarbonylgruppe, eine makromolekulare Trägergruppe, einschließlich, jedoch nicht beschränkt auf, Lipid-Fettsäure-Konjugate, Polyethylenglycol oder Kohlenhydrate, darstellen.
  • TABELLE IIA DP178 (SEQ ID: 25) AMINO-VERKÜRZUNGEN
    Figure 00380001
  • Es wird der Ein-Buchstaben-Aminosäure-Code verwendet.
  • Außerdem kann
    „X" eine Amino-Gruppe, eine hydrophobe Gruppe, einschließlich, jedoch nicht beschränkt auf Carbobenzoxyl, Dansyl oder T-Butyloxycarbonyl, eine Acetyl-Gruppe, eine 9-Fluorenylmethoxycarbonyl(FMOC)-Gruppe, eine makromolekulare Trägergruppe, einschließlich, jedoch nicht beschränkt auf, Lipid-Fettsäure-Konjugate, Polyethylenglycol oder Kohlenhydrate, darstellen.
    „Z" kann eine Carboxyl-Gruppe, eine Amido-Gruppe, eine T-Butyloxycarbonyl-Gruppe, eine makromolekulare Trägergruppe, einschließlich, jedoch nicht beschränkt auf, Lipid-Fettsäure-Konjugate, Polyethylenglycol oder Kohlenhydrate, darstellen.
  • Die erfindungsgemäßen Peptide schließen auch DP107-ähnliche Peptide ein. „DP107-ähnlich" bezieht sich vorliegend zunächst auf DP107 und DP107-Verkürzungen, die ein oder mehrere Aminosäuresubstitutionen, Insertionen und/oder Deletionen enthalten. Die DP107-ähnlichen Peptide der Erfindung können eine antifusiogene oder antivirale Aktivität entfalten, oder sie können die Befähigung zur Modulation intrazellulärer Prozesse, an denen Coiled-Coil-Peptide beteiligt sind, aufweisen. Des Weiteren können derartige DP107-ähnliche Peptide zusätzliche vorteilhafte Eigenschaften, wie beispielsweise eine erhöhte Bioverfügbarkeit und/oder -stabilität oder eine verminderte Wirtsimmunerkennung, aufweisen.
  • HIV-1- und HIV-2-Hüllproteine sind strukturell verschieden, es besteht jedoch eine auffallende Aminosäurekonservierung innerhalb der DP107-entsprechenden Regionen von HIV-1 und HIV-2. Die Aminosäurekonservierung ist von periodischer Natur, was eine gewisse Konservierung der Struktur und/oder Funktion nahelegt. Daher würde eine mögliche Klasse von Aminosäuresubstitutionen diejenigen Aminosäureänderungen einschließen, von denen vorausgesagt wird, dass sie die Struktur der erfindungsgemäßen DP107-Peptide der Erfindung stabilisieren. Für Verwen dung der DP107- und DP107-analogen Sequenzen, die vorliegend beschrieben werden, kann Fachmann leicht DP107-Konsensussequenzen zusammenstellen und anhand dieser konservierte Aminosäurereste feststellen, die bevorzugte Aminosäuresubstitutionen darstellen würden.
  • Die Aminosäuresubstitutionen können von konservativer oder nicht-konservativer Natur sein. Konservative Aminosäuresubstitutionen bestehen aus dem Austausch einer oder mehrerer Aminosäuren der DP107(SEQ ID: 25)-Peptidsequenz durch Aminosäuren mit ähnlicher Ladung, Größe und/oder Hydrophobizitätsmerkmale, wie beispielsweise einer Aminosäuresubstitution von Glutaminsäure (E) zu Asparaginsäure (D). Nicht-konservierte Substitutionen bestehen aus einem Austausch ein oder mehrerer Aminosäuren der DP107(SEQ ID: 25)-Peptidsequenz durch Aminosäuren, die unähnliche Ladungs-, Größen- und/oder Hydrophobizitätsmerkmale aufweisen, wie beispielsweise eine Substitution von Glutaminsäure (E) zu Valin (V).
  • Aminosäureinsertionen können aus einzelnen Aminosäureresten oder Strängen von Resten bestehen. Die Insertionen können am Carboxy- oder Amino-terminalen Ende der DP107- oder DP-107-verkürzten Peptide sowie an einer internen Position des Peptids vorgenommen werden. Derartige Insertionen reichen im allgemeinen in der Länge von 2 bis 15 Aminosäuren. Es ist vorgesehen, dass Insertionen, die entweder am Carboxy- oder Aminoterminus des interessierenden Peptids vorgenommen werden, einen breiteren Größenbereich aufweisen können, wobei etwa 2 bis etwa 50 Aminosäuren bevorzugt sind.
  • Bevorzugte Amino- oder Carboxy-terminale Insertionen sind Peptide im Längenbereich von etwa 2 bis etwa 50 Aminosäureresten, die gp41-Proteinregionen entweder Amino- bzw. Carboxy-terminal zur in Rede stehenden DP107-gp41-Aminosäuresequenz entsprechen. Daher würde eine bevorzugte Amino-terminale oder Carbo xy-terminale Aminosäureinsertion gp41-Aminosäuresequenzen enthalten, die sich unmittelbar Amino- oder Carboxy-terminal zur DP107-Region des gp41-Proteins befinden.
  • Deletionen von DP107 (SEQ ID: 25) oder DP178-Verkürzungen liegen ebenfalls im Schutzbereich der Erfindung. Derartige Deletionen bestehen aus der Entfernung einer oder mehrerer Aminosäuren aus der DP107- oder DP107-ähnlichen Peptidsequenz, wobei die untere Grenze der Länge der resultierenden Peptidsequenz bei 4 bis 6 Aminosäuren liegt. Derartige Deletionen können einen einzelnen zusammenhängenden oder mehr als einen abgeschlossenen Anteil der Peptidsequenzen einschließen.
  • Lediglich zum Zwecke der Veranschaulichung wird die zur Identifizierung der erfindungsgemäßen Peptide verwendete Suchstrategie nachstehend im Beispiel, das im Abschnitt 9 dargestellt wird, vollständig beschrieben. Während diese Suchstrategie teilweise auf einem primären Aminosäuremotiv beruht, das von DP107 und DP178 abgeleitet wird, basiert es nicht allein auf einer Suche nach primären Aminosäuresequenzhomologien, da derartige Proteinsequenzhomologien innerhalb von, jedoch nicht zwischen, Virushauptgruppen existieren, beispielsweise ist die primäre Aminosäuresequenzhomologie innerhalb der TM-Proteine verschiedener Stämme von HIV-1 oder innerhalb der TM-Proteine verschiedener Isolate des Affenimmundefizienzvirus (SIV) hoch. Die primäre Aminosäuresequenzhomologie zwischen HIV-1 und SIV ist jedoch derart gering, dass sie nicht verwendbar ist. Es ist daher nicht möglich, zu DP107 oder DP178 ähnliche Peptidregionen innerhalb anderer Viren oder innerhalb nicht-viraler Organismen, sei es strukturell oder in anderer Weise, auf Basis der Primärsequenzhomologie allein zu finden.
  • Des Weiteren hat sich erwiesen, dass, obwohl es potentiell geeignet wäre, Primärsequenzanordnungen eher beispielsweise auf Basis der physikalisch-chemischen Eigenschaften unterschiedli cher Klassen von Aminosäuren als auf Basis der spezifischen Aminosäuren selbst zu identifizieren, derartige Strategien nicht geeignet sind. Beispielsweise ist ein Computeralgorithmus, der von Lupas et al. zur Identifizierung von Coiled-Coil-Eigenschaften von Bereichen innerhalb von Proteinen entworfen wurde (Lupas, A., et al., 1991, Science 252: 1162–1164) zur Identifizierung von Proteinregionen, die zu DP107 oder DP178 analog sind, ungeeignet.
  • Insbesondere identifiziert eine Analyse von HIV-1-gp160 (das sowohl gp120 als auch gp41 enthält) unter Verwendung des Lupas-Algorithmus nicht die Coiled-Coil-Region in DP-107. Tatsächlich identifiziert er jedoch eine Region in DP-178, die acht Aminosäuren N-terminal zum Start von DP-178 beginnt und acht Aminosäuren von dem C-Terminus endet. Es wurde experimentell gezeigt, dass das DP-107-Peptid ein stabiles Coiled-Coil bildet. Eine auf dem Lupas-Suchalgorithmus basierende Suche hätte daher die Coiled-Coil-Region von DP-107 nicht identifiziert. Umgekehrt identifizierte der Lupas-Algorithmus die DP-178-Region als ein potentielles Coiled-Coil-Motiv. Das DP-178-Peptid, das aus dieser Region abgeleitet ist, bildete jedoch in Lösung kein Coiled-Coil. Eine mögliche Erklärung für die Unfähigkeit des Lupas-Suchalgorithmus zur exakten Identifizierung von Coiled-Coil-Sequenzen im HIV-1-TM ist, dass der Lupas-Algorithmus auf der Struktur von Coiled-Coils aus Proteinen basiert, die zu den TM-Proteinen von Viren strukturell oder funktionell nicht ähnlich sind, von denen vorliegend antivirale Peptide (z.B. DP-107 und DP-178) beschrieben werden.
  • Die in den nachstehend in den Abschnitten 9 bis 16 und 19 bis 25 dargestellten Beispielen beschriebene Computersuchstrategie identifiziert erfolgreich Regionen in viralen TM-Proteinen, die zu DP-107 oder DP-178 ähnlich sind. Diese Suchstrategie wurde entworfen, um mit einem im Handel erhältlichen Sequenzdatenbankpaket, vorzugsweise PC/Gene, verwendet zu werden.
  • Es wurde eine Reihe von Motiven, die Motive 107 × 178 × 4, ALLMOTI5 und PLZIP, entworfen und derart gestaltet, dass sie in der Stringenz von streng bis breit reichen, wie in diesem Abschnitt und im Abschnitt 9 diskutiert. Die über derartige Suchmotive identifizierten Sequenzen, wie diejenigen, die in den nachstehenden Tabellen V–XIV angegeben sind, enthalten potentiell eine antifusiogene, wie eine antivirale, Aktivität, können des Weiteren zur Identifizierung antifusiogener, wie antiviraler, Verbindungen geeignet sind, und es ist vorgesehen, dass sie im Schutzbereich der vorliegenden Erfindung liegen.
  • Man geht davon aus, dass Coiled-Coil-Sequenzen aus Wiederholungen von 7 Aminosäuren bestehen. Zur Erleichterung der Beschreibung werden die Aminosäurepositionen in den Siebener-Wiederholungen gelegentlich mit A bis G bezeichnet, wobei die erste Position A ist, die zweite B usw. Die zur Identifizierung von DP-107-ähnlichen und DP-178-ähnlichen Sequenzen vorliegend verwendeten Motive sind zur spezifischen Suche nach und Identifizierung von derartigen Siebener-Wiederholungen ausgestaltet. In der Beschreibung von jedem der nachstehend beschriebenen Motive bezeichnen Aminosäuren in Klammern, d.h. [], nur diejenigen Aminosäurereste, die in der gegebenen Position akzeptabel sind, während Aminosäuren in geschweiften Klammern, d.h. {}, nur diejenigen Aminosäuren bezeichnen, die in der gegebenen Siebener-Position nicht akzeptabel sind. Wenn ein Satz von Aminosäuren in eckigen oder geschweiften Klammern von einer Zahl in runden Klammern, d.h. (), gefolgt wird, bezieht sie sich auf die Anzahl nachfolgender Aminosäurepositionen, für die der bezeichnete Satz von Aminosäuren gilt, z.B. eine (2) bedeutet „für die nächsten zwei heptadischen Aminosäurepositionen".
  • Das ALLMOTI5 wird wie folgt geschrieben:
  • Figure 00440001
  • Die Übersetzung dieses Motivs würde sich lesen: „In der ersten Position (A) der Heptade ist jeder Aminosäurerest außer C, D, G, H oder P akzeptabel, in den nächsten zwei (B, C) Aminosäurepositionen ist jeder Aminosäurerest außer C, F oder P akzeptabel, in der vierten Heptadenposition (D) ist jeder Aminosäurerest außer C, D, G, H oder P akzeptabel, in den nächsten drei (E, F, G) Aminosäurepositionen ist jeder Aminosäurerest außer C, F oder P akzeptabel. Dieses Motiv ist für die Suche nach fünf aufeinander folgenden Siebener-Wiederholungen ausgestaltet (daher die fünffache Wiederholung der ersten Zeile), was bedeutet, dass es nach Peptiden mit einer Größe von 35-Mer sucht. Es kann ebenfalls dazu entworfen werden, nach 28-Meren zu suchen, indem das Anfangsmotiv nur viermal wiederholt wird. Hinsichtlich des ALLMOTI5-Motivs ist eine 35-Mer-Suche bevorzugt.
  • Diejenigen viralen (Nicht-Bacteriophagen) Sequenzen, die über ein derartiges ALLMOTI5-Motiv identifiziert wurden, sind nachstehend in der Tabelle V am Ende dieses Abschnitts angegeben. In denjenigen Fällen, wo ein einzelnes Gen mehr als eine Sequenz aufweist, die durch das ALLMOTI5-Suchmotiv erkannt wird, sind die Aminosäurerestnummern dieser Sequenzen unter „Bereich 2", „Bereich 3" usw. angegeben. Diese Übereinkunft wird für jede der nachstehend am Ende dieses Abschnitts angegebenen Tabellen verwendet.
  • Das 107 × 178 × 4-Motiv schreibt sich wie folgt:
  • Figure 00440002
  • Figure 00450001
  • Eine Übersetzung dieses Motivs würde sich lesen: „In der ersten (A) Position der Heptade ist jeder Aminosäurerest außer E, F, I, K, L, N, Q, S, T, V, W oder Y akzeptabel, in den nächsten zwei (B, C) Aminosäurepositionen ist jeder Aminosäurerest außer C, F, M oder P akzeptabel, in der vierten Position (D) ist jeder Aminosäurerest außer E, F, I, K, L, N, Q, S, T, V, W oder Y akzeptabel, in den nächsten drei (E, F, G) Aminosäurepositionen ist jeder Aminosäurerest außer C, F, M oder P akzeptabel. Dieses Motiv ist zur Suche nach vier aufeinanderfolgenden Siebener-Wiederholungen ausgestaltet (daher die viermalige Wiederholung der ersten Zeile), was bedeutet, dass es nach Peptiden von 28-Mer-Größe sucht. Es kann ebenfalls zur Suche nach 35-Meren ausgestaltet werden, indem das anfängliche Motiv fünfmal wiederholt wird. Hinsichtlich des 107 × 178 × 4-Motivs ist eine 28-Mer-Suche bevorzugt.
  • Diejenigen viralen (nicht-Bakteriophagen) Sequenzen, die über ein derartiges 107 × 178 × 4-Motiv identifiziert wurden, sind in der nachstehenden Tabelle VI am Ende dieses Abschnitts angegeben.
  • Das 107 × 178 × 4 Suchmotiv wurde ebenfalls zur Identifizierung nicht-viraler prokaryotischer Proteinsequenzen, wie in der nachstehenden Tabelle VIII am Ende dieses Abschnitts angegeben, verwendet. Des Weiteren wurde dieses Suchmotiv verwendet, um eine Anzahl humaner Proteine zu identifizieren. Die Ergebnisse dieser 107 × 178 × 4-Suche in humanen Proteinen ist in der nachstehenden Tabelle IX am Ende dieses Abschnitts angegeben.
  • Die Reihe der PLZIP-Motive ist in der 19 angegeben. Diese Motive sind zur Identifizierung Leucin-Zipper-Coiled-Coilähnlicher Siebener-Wiederholungen ausgestaltet, wobei sich mindestens ein Prolinrest in einem vorbestimmten Abstand N- terminal zur Wiederholung befindet. Diese PLZIP-Motive finden Proteinregionen mit Ähnlichkeiten zu HIV-1-DP178, die sich im Allgemeinen direkt N-terminal zum Transmembrananker befinden. Diese Motive können gemäß der gleichen Übereinkunft, die vorstehend beschrieben ist, übersetzt werden. Jede in 19 dargestellte Zeile stellen ein einzelnes vollständiges Suchmotiv dar. „X" in diesen Motiven bezeichnet einen beliebigen Aminosäurerest. In Fällen, in denen ein Motiv zwei Zahlen in Klammern enthält, bezeichnet dies eine variable Anzahl von Aminosäurenresten. Beispielsweise wird X(1,12) in „die nächsten ein bis zwölf Aminosäurereste, einschließlich, können eine beliebige Aminosäure sein" übersetzt.
  • Die nachstehenden Tabellen X bis XIV am Ende dieses Abschnitts zeigen Sequenzen, die über Suchen identifiziert wurden, welche mit derartigen PLZIP-Motiven durchgeführt wurden. insbesondere zeigt die Tabelle X virale Sequenzen, die über PCTLZIP-, PICTLZIP- und P2CTLZIP-Suchmotive identifiziert wurden, die Tabelle XI zeigt virale Sequenzen, die über P3CTLZIP-, P4CTLZIP-, P5CTLZIP- und P6CTLZIP-Suchmotive identifiziert wurden, die Tabelle XII zeigt virale Sequenzen, die über P7CTLZIP-, P8CTLZIP und P9CTLZIP-Suchmotive identifiziert wurden, die Tabelle XIII zeigt virale Sequenzen, die über P12LZIPC-Suchen identifiziert wurden, und die Tabelle XIV zeigt virale Sequenzen, die über P23TLZIPC-Suchmotive identifiziert wurden.
  • Die nachstehend in den Abschnitten 17, 18, 26 und 27 dargestellten Beispiele zeigen, dass die über die vorliegend beschriebenen Motivsuchen identifizierten viralen Sequenzen deutliche antivirale Eigenschaften aufweisen. Insbesondere beschreibt das im Abschnitt 17 dargestellte Beispiel Peptide mit einer Aktivität gegen den Respiratory-Syncytial-Virus, das im Abschnitt 18 dargestellte Beispiel beschreibt Peptide mit einer Aktivität gegen den Parainfluenza-Virus, das im Abschnitt 26 dargestellte Beispiel beschreibt Peptide mit einer Aktivität gegen den Masernvirus, und das im Abschnitt 27 dargestellte Beispiel beschreibt Peptide mit einer Anti-Affenimmundefizienzvirus-Aktivität.
  • Die DP107- und DP178-Analogen können des Weiteren beliebige der vorstehend im Abschnitt 5.1 hinsichtlich DP178 beschriebenen zusätzlichen Gruppen enthalten. Beispielsweise können diese Peptide beliebige der zusätzlichen Aminoterminalen Gruppen einschließen, die vorstehend hinsichtlich der „X"-Gruppen beschrieben wurden, und können auch beliebige der Carboxy-terminalen Gruppen einschließen, die vorstehend hinsichtlich der „Z"-Gruppen beschrieben wurden.
  • Des Weiteren fallen Verkürzungen der identifizierten DP107- und DP178-Peptide unter die erfindungsgemäßen Peptide. Wieterhin können derartige DP107- und DP178-Analoge und DP107/DP178-analoge Verkürzungen eine oder mehrere Aminosäuresubstitutionen, -insertionen und/oder -deletionen aufweisen. Die DP178-analogen Aminosäuresubstitutionen, -insertionen und -deletionen sind wie vorstehend hinsichtlich der DP107-ähnlichen Peptide im Abschnitt 5.1 beschrieben. Die DP-107-analogen Aminosäuresubstitutionen, -insertionen und -deletionen sind ebenfalls wie vorstehend hinsichtlich der DP107-ähnlichen Peptide im Abschnitt 5.2 beschrieben.
  • Die nachstehenden Tabellen XV bis XXII zeigen repräsentive Beispiele derartiger DP107/DP178-Verkürzungen. Insbesondere stellt die Tabelle XV Carboxy-Verkürzungen der DP107-analogen F1-Region des Respiratory-Syncytial-Virus dar, die Tabelle XVI stellt Amino-Verkürzungen der DP107-analogen F1-Region des Respiratory-Syncytial-Virus dar, die Tabelle XVII stellt Carboxy-Verkürzungen der DP178-analogen F1-Region des Respiratory-Syncytial-Virus dar, die Tabelle XVIII stellt Amino-Verkürzungen der DP178-analogen F1-Region des Respiratory-Syncytial-Virus dar, die Tabelle XIX stellt Carboxy-Verkürzungen der DP178-analogen F1-Region des humanen Parainfluenza-3-Virus dar, die Tabelle XX stellt Amino-Verkürzungen der DP178-analogen F1-Region des humanen Parainfluenza-3-Virus dar, die Tabelle XXI stellt Carboxy-Verkürzungen der DP107-analogen F1-Region des humanen Parainfluenza-3-Virus dar und die Tabelle XXII stellt Amino-Verkürzungen der DP107-analogen F1-Region des humanen Parainfluenza-3-Virus dar. Des Weiteren stellt die nachstehende Tabelle XXIII DP107/DP178-Analoge und Analog-Verkürzungen dar, die eine deutliche antivirale Aktivität zeigen. Diese antiviralen Peptide werden gemäß dem spezifischen Virus, den sie inhibieren, einschließlich Respiratory-Syncythial-Virus, humaner Parainfluenza-3-Virus, Affenimmundefizienz-Virus und Masern-Virus, gruppiert.
  • TABELLE V ALLMOTI5-SUCHERGEBNISSZUSAMMENFASSUNG FÜR ALLE VIRALEN (NICHT-BACTERIOPHAGEN) PROTEINE
    Figure 00490001
  • Figure 00500001
  • Figure 00510001
  • Figure 00520001
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  • Figure 01030001
  • Figure 01040001
  • TABELLE VI ZUSAMMENFASSUNG DER 107 × 178 × 4 MOTIVSUCHERGEBNISSE FÜR ALLE VIRALEN (NICHT-BAKTERIOPHAGEN) PROTEINE LEDIGLICH ZUM ZWECKE DER VERANSCHAULICHUNG
    Figure 01060001
  • Figure 01070001
  • Figure 01080001
  • Figure 01090001
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  • Figure 01380001
  • Figure 01390001
  • Figure 01400001
  • TABELLE VII ZUSAMMENFASSUNG DER 107 × 178 × 4 MOTIVSUCHERGEBNISSE LEDIGLICH ZUM ZWECKE DER VERANSCHAULICHUNG
    Figure 01420001
  • Figure 01430001
  • Figure 01440001
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  • Figure 01460001
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  • Figure 01490001
  • Figure 01500001
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  • Figure 01530001
  • Figure 01540001
  • Figure 01550001
  • Figure 01560001
  • TABELLE VIII ZUSAMMENFASSUNG DER 107 × 178 × 4 MOTIVSUCHERGEBNISSE FÜR ALLE PROKARYOTISCHEN PROTEINE LEDIGLICH ZUM ZWECKE DER VERANSCHAULICHUNG
    Figure 01580001
  • Figure 01590001
  • Figure 01600001
  • Figure 01610001
  • Figure 01620001
  • Figure 01630001
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  • Figure 01730001
  • Figure 01740001
  • Figure 01750001
  • Figure 01760001
  • Figure 01770001
  • Figure 01780001
  • Figure 01790001
  • Figure 01800001
  • Figure 01810001
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  • Figure 01830001
  • Figure 01840001
  • Figure 01850001
  • Figure 01860001
  • Figure 01870001
  • Figure 01880001
  • Figure 01890001
  • Figure 01900001
  • Figure 01910001
  • Figure 01920001
  • Figure 01930001
  • Figure 01940001
  • Figure 01950001
  • Figure 01960001
  • Figure 01970001
  • Figure 01980001
  • Figure 01990001
  • Figure 02000001
  • Figure 02010001
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  • Figure 02080001
  • Figure 02090001
  • Figure 02100001
  • TABELLE IX ZUSAMMENFASSUNG DER 107 × 178 × 4 MOTIVSUCHERGEBNISSE FÜR ALLE HUMANEN PROTEINE LEDIGLICH ZUM ZWECKE DER VERANSCHAULICHUNG
    Figure 02120001
  • Figure 02130001
  • Figure 02140001
  • Figure 02150001
  • Figure 02160001
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  • Figure 02200001
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  • Figure 02230001
  • Figure 02240001
  • Figure 02250001
  • Figure 02260001
  • TABELLE X ZUSAMMENFASSUNG DER SUCHERGEBNISSE FÜR DIE MOTIVE PCTLZIP, PICTLZIP UND P2PCTLZIP LEDIGLICH ZUM ZWECKE DER VERANSCHAULICHUNG
    Figure 02280001
  • Figure 02290001
  • Figure 02300001
  • Figure 02310001
  • Figure 02320001
  • Figure 02330001
  • Figure 02340001
  • TABELLE XI ZUSAMMENFASSUNG DER SUCHERGEBNISSE FÜR DIE MOTIVE P3CTLZIP, P4CTLZIP, P5PCTLZIP UND P6PCTLZIP LEDIGLICH ZUM ZWECKE DER VERANSCHAULICHUNG
    Figure 02360001
  • Figure 02370001
  • Figure 02380001
  • Figure 02390001
  • TABELLE XII ZUSAMMENFASSUNG DER SUCHERGEBNISSE FÜR DIE MOTIVE P7CTLZIP, P8CTLZIP UND P9PCTLZIP LEDIGLICH ZUM ZWECKE DER VERANSCHAULICHUNG
    Figure 02410001
  • Figure 02420001
  • Figure 02430001
  • TABELLE XIII ZUSAMMENFASSUNG DER SUCHERGEBNISSE FÜR DAS MOTIV P12LZIPC LEDIGLICH ZUM ZWECKE DER VERANSCHAULICHUNG
    Figure 02450001
  • Figure 02460001
  • Figure 02470001
  • Figure 02480001
  • Figure 02490001
  • Figure 02500001
  • Figure 02510001
  • Figure 02520001
  • Figure 02530001
  • Figure 02540001
  • Figure 02550001
  • Figure 02560001
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  • Figure 02590001
  • Figure 02600001
  • Figure 02610001
  • Figure 02620001
  • Figure 02630001
  • Figure 02640001
  • Figure 02650001
  • Figure 02660001
  • Figure 02670001
  • Figure 02680001
  • Figure 02690001
  • Figure 02700001
  • Figure 02710001
  • Figure 02720001
  • Figure 02730001
  • Figure 02740001
  • Figure 02750001
  • Figure 02760001
  • Figure 02770001
  • Figure 02780001
  • Figure 02790001
  • Figure 02800001
  • Figure 02810001
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  • Figure 02830001
  • Figure 02840001
  • Figure 02850001
  • Figure 02860001
  • Figure 02870001
  • Figure 02880001
  • Figure 02890001
  • Figure 02900001
  • Figure 02910001
  • Figure 02920001
  • Figure 02930001
  • Figure 02940001
  • ZUSAMMENFASSUNG DER SUCHERGEBNISSE FÜR DAS MOTIV P23TLZIPC LEDIGLICH ZUM ZWECKE DER VERANSCHAULICHUNG
    Figure 02960001
  • Figure 02970001
  • Figure 02980001
  • Figure 02990001
  • Figure 03000001
  • Figure 03010001
  • Figure 03020001
  • Figure 03030001
  • Figure 03040001
  • Figure 03050001
  • Figure 03060001
  • Figure 03070001
  • Figure 03080001
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  • Figure 03100001
  • Figure 03110001
  • Figure 03120001
  • Figure 03130001
  • Figure 03140001
  • Figure 03150001
  • Figure 03160001
  • TABELLE XV DP107-ANALOGE F2-REGION DES RESPIRATORY-SYNCYCIAL-VIRUS CARBOXY-VERKÜRZUNGEN
    Figure 03170001
  • Es wird der Ein-Buchstaben-Aminosäure-Code verwendet.
  • Außerdem kann
    „X" eine Aminogruppe, eine hydrophobe Gruppe, einschließlich, jedoch nicht beschränkt auf, Carbobenzoxyl, Dansyl oder T-Butyloxycarbonyl, eine Acetylgruppe, eine 9-Fluorenylmethoxycarbonyl(FMOC)-Gruppe, eine makromolekulare Trägergruppe, einschließlich, jedoch nicht beschränkt auf, Lipid-Fettsäure-Konjugate, Polyethylenglykol oder Kohlenhydrate, darstellen.
    „Z" kann eine Carboxylgruppe, eine Amidogruppe, eine T-Butyloxycarbonylgruppe, eine makromolekulare Trägergruppe, einschließlich, jedoch nicht beschränkt auf Lipid-Fettsäure-Konjugate, Polyethylenglykol oder Kohlenhydrate, darstellen.
  • TABELLE XVI DP178/DP107-ANALOGE F2-REGION DES RESPIRATORY-SYNCYCIAL-VIRUS AMINO-VERKÜRZUNGEN
    Figure 03190001
  • Es wird der Ein-Buchstaben-Aminosäure-Code verwendet.
  • Außerdem kann
    „X" eine Aminogruppe, eine Hydrophobegruppe, einschließlich, jedoch nicht beschränkt auf, Carbobenzoxyl, Dansyl oder T-Butyloxycarbonyl – eine Acetylgruppe, eine 9-Fluorenylmethoxy-Carbonyl(FMOC)-Gruppe, eine makromolekulare Trägergruppe, einschließlich, jedoch nicht beschränkt auf, Lipid-Fettsäure-Konjugate, Polyethylenglykol oder Kohlenhydrate, darstellen.
    „Z" kann eine Carboxylgruppe, eine Amidogruppe, eine T-Butyloxycarbonylgruppe, eine makromolekulare Trägergruppe, einschließlich, jedoch nicht beschränkt auf Lipid-Fettsäure-Konjugate, Polyethylenglykol oder Kohlenhydrate, darstellen.
  • TABELLE XVII DP178-ANALOGE F1-REGION DES RESPIRATORY-SYNCYCIAL-VIRUS CARBOXY-VERKÜRZUNGEN
    Figure 03210001
  • Es wird der Ein-Buchstaben-Aminosäure-Code verwendet.
  • Außerdem kann
    „X" eine Aminogruppe, eine Hydrophobegruppe, einschließlich, jedoch nicht beschränkt auf, Carbobenzoxyl, Dansyl oder T-Butyloxycarbonyl – eine Acetylgruppe, eine 9-Fluorenylmethoxy-Carbonyl(FMOC)-Gruppe, eine makromolekulare Trägergruppe, einschließlich, jedoch nicht beschränkt auf, Lipid-Fettsäure-Konjugate, Polyethylenglykol oder Kohlenhydrate, darstellen.
    „Z" kann eine Carboxylgruppe, eine Amidogruppe, eine T-Butyloxycarbonylgruppe, eine makromolekulare Trägergruppe, einschließlich, jedoch nicht beschränkt auf Lipid-Fettsäure-Konjugate, Polyethylenglykol oder Kohlenhydrate, darstellen.
  • TABELLE XVIII DP178-ANALOGE F1-REGION DES RESPIRATORY-SYNCYCIAL-VIRUS AMINO-VERKÜRZUNGEN
    Figure 03220001
  • Es wird der Ein-Buchstaben-Aminosäure-Code verwendet.
  • Außerdem kann
    „X" eine Aminogruppe, eine Hydrophobegruppe, einschließlich, jedoch nicht beschränkt auf, Carbobenzoxyl, Dansyl oder T- Butyloxycarbonyl – eine Acetylgruppe, eine 9-Fluorenylmethoxy-Carbonyl(FMOC)-Gruppe, eine makromolekulare Trägergruppe, einschließlich, jedoch nicht beschränkt auf, Lipid-Fettsäure-Konjugate, Polyethylenglykol oder Kohlenhydrate, darstellen.
    „Z" kann eine Carboxylgruppe, eine Amidogruppe, eine T-Butyloxycarbonylgruppe, eine makromolekulare Trägergruppe, einschließlich, jedoch nicht beschränkt auf Lipid-Fettsäure-Konjugate, Polyethylenglykol oder Kohlenhydrate, darstellen.
  • TABELLE XIX DP178-ANALOGE F1-REGION DES HUMANEN PARAINFLUENZA-3-VIRUS CARBOXY-VERKÜRZUNGEN
    Figure 03230001
  • Es wird der Ein-Buchstaben-Aminosäure-Code verwendet.
  • Außerdem kann
    „X" eine Aminogruppe, eine Hydrophobegruppe, einschließlich, jedoch nicht beschränkt auf, Carbobenzoxyl, Dansyl oder T-Butyloxycarbonyl – eine Acetylgruppe, eine 9-Fluorenylmethoxy-Carbonyl(FMOC)-Gruppe, eine makromolekulare Trägergruppe, einschließlich, jedoch nicht beschränkt auf, Lipid-Fettsäure-Konjugate, Polyethylenglykol oder Kohlenhydrate, darstellen.
    „Z" kann eine Carboxylgruppe, eine Amidogruppe, eine T-Butyloxycarbonylgruppe, eine makromolekulare Trägergruppe, einschließlich, jedoch nicht beschränkt auf Lipid-Fettsäure-Konjugate, Polyethylenglykol oder Kohlenhydrate, darstellen.
  • TABELLE XX DP178-ANALOGE F1-REGION DES HUMANEN PARAINFLUENZA-3-VIRUS AMINO-VERKÜRZUNGEN
    Figure 03250001
  • Es wird der Ein-Buchstaben-Aminosäure-Code verwendet.
  • Außerdem kann
  • „X" eine Aminogruppe, eine Hydrophobegruppe, einschließlich, jedoch nicht beschränkt auf, Carbobenzoxyl, Dansyl oder T-Butyloxycarbonyl – eine Acetylgruppe, eine 9-Fluorenylmethoxy-Carbonyl(FMOC)-Gruppe, eine makromolekulare Trägergruppe, einschließlich, jedoch nicht beschränkt auf, Lipid-Fettsäure-Konjugate, Polyethylenglykol oder Kohlenhydrate, darstellen.
    „Z" kann eine Carboxylgruppe, eine Amidogruppe, eine T-Butyloxycarbonylgruppe, eine makromolekulare Trägergruppe, einschließlich, jedoch nicht beschränkt auf Lipid-Fettsäure-Konjugate, Polyethylenglykol oder Kohlenhydrate, darstellen.
  • TABELLE XXI DP107-ANALOGE F1-REGION DES HUMANEN PARAINFLUENZA-3-VIRUS CARBOXY-VERKÜRZUNGEN
    Figure 03260001
  • Es wird der Ein-Buchstaben-Aminosäure-Code verwendet.
  • Außerdem kann
    „X" eine Aminogruppe, eine Hydrophobegruppe, einschließlich, jedoch nicht beschränkt auf, Carbobenzoxyl, Dansyl oder T-Butyloxycarbonyl – eine Acetylgruppe, eine 9-Fluorenylmethoxy-Carbonyl(FMOC)-Gruppe, eine makromolekulare Trägergruppe, einschließlich, jedoch nicht beschränkt auf, Lipid-Fettsäure-Konjugate, Polyethylenglykol oder Kohlenhydrate, darstellen.
    „Z" kann eine Carboxylgruppe, eine Amidogruppe, eine T-Butyloxycarbonylgruppe, eine makromolekulare Trägergruppe, einschließlich, jedoch nicht beschränkt auf Lipid-Fettsäure-Konjugate, Polyethylenglykol oder Kohlenhydrate, darstellen.
  • TABELLE XXII DP107-ANALOGE F1-REGION DES HUMANEN PARAINFLUENZA-3-VIRUS AMINO-VERKÜRZUNGEN
    Figure 03270001
  • Es wird der Ein-Buchstaben-Aminosäure-Code verwendet.
  • Außerdem kann
    „X" eine Aminogruppe, eine Hydrophobegruppe, einschließlich, jedoch nicht beschränkt auf, Carbobenzoxyl, Dansyl oder T-Butyloxycarbonyl – eine Acetylgruppe, eine 9-Fluorenylmethoxy-Carbonyl(FMOC)-Gruppe, eine makromolekulare Trägergruppe, einschließlich, jedoch nicht beschränkt auf, Lipid-Fettsäure-Konjugate, Polyethylenglykol oder Kohlenhydrate, darstellen.
    „Z" kann eine Carboxylgruppe, eine Amidogruppe, eine T-Butyloxycarbonylgruppe, eine makromolekulare Trägergruppe, einschließlich, jedoch nicht beschränkt auf Lipid-Fettsäure-Konjugate, Polyethylenglykol oder Kohlenhydrate, darstellen
  • TABELLE XXIII REPRÄSENTATIVE DP107/DP178-ANALOGE ANTIVIRALE PEPTIDE Anti-Respiratory-Syncytial-Virus-Peptide
    Figure 03280001
  • Anti-Humaner-Parainfluenza-Virus-3-Peptide
    Figure 03290001
  • Anti-Affenimmundefizienzvirus-Peptide
    Figure 03290002
  • Anti-Masernvirus-Peptide
    Figure 03290003
  • Es wird der Ein-Buchstaben-Aminosäure-Code verwendet.
  • Außerdem kann
    „X" eine Aminogruppe, eine Hydrophobegruppe, einschließlich, jedoch nicht beschränkt auf, Carbobenzoxyl, Dansyl oder T-Butyloxycarbonyl – eine Acetylgruppe, eine 9-Fluorenylmethoxy-Carbonyl(FMOC)-Gruppe, eine makromolekulare Trägergruppe, einschließlich, jedoch nicht beschränkt auf, Lipid-Fettsäure-Konjugate, Polyethylenglykol oder Kohlenhydrate, darstellen.
    „Z" kann eine Carboxylgruppe, eine Amidogruppe, eine T-Butyloxycarbonylgruppe, eine makromolekulare Trägergruppe, einschließlich, jedoch nicht beschränkt auf Lipid-Fettsäure-Konjugate, Polyethylenglykol oder Kohlenhydrate, darstellen
  • 5.4. SYNTHESE VON PEPTIDEN
  • Die erfindungsgemäßen Peptide können durch im Fachgebiet bekannte Techniken synthetisiert oder hergestellt werden. Siehe beispielsweise Creighton, 1983, Proteins: Structures and Molecular Principles, W. H. Freeman and Co., NY. Kurze Peptide können beispielsweise auf einem festen Träger oder in Lösung synthetisiert werden. Längere Peptide können unter Verwendung rekombinanter DNA-Techniken hergestellt werden. Hierbei können die für die erfindungsgemäßen Peptide codierenden Nukleotidsequenzen synthetisiert und/oder kloniert und gemäß einem Fachmann bekannter Techniken exprimiert werden. Siehe beispielsweise Sambrook, et al., 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Bde. 1–3, Cold Spring Harbor Press, N.Y.
  • In einer anderen Ausführungsform können die erfindungsgemäßen Peptide derart synthetisiert werden, dass eine oder mehrere der Bindungen, welche die Aminosäurereste der Peptide verknüpfen, Nicht-Peptid-Bindungen sind. Diese alternativen Nicht-Peptid-Bindungen können durch Ausnutzen von einem Fachmann bekannten Reaktionen gebildet werden und können, um nur einige zu nennen, Imino-, Ester-, Hydrazid-, Semicarbazid- und Azo-Bindungen einschließen, sind aber nicht darauf beschränkt. In einer weiteren Ausführungsform können die Peptide der Erfindung mit zusätzlichen chemischen Gruppen, die an ihren Amino- und/oder Carboxy-Termini vorliegen, synthetisiert werden, so dass beispielsweise die Stabilität, Bioverfügbarkeit und/oder die inhibitorische Aktivität der Peptide erhöht wird. Beispielsweise können hydrophobe Gruppen wie Carbobenzoxyl-, Dansyl- oder t-Butyloxycarbonyl-Gruppen an die Aminotermini der Peptide angefügt werden. In ähnlicher Weise kann eine Acetyl-Gruppe oder eine 9-Fluorenylmethoxycarbonyl-Gruppe an den Aminotermini der Peptide angeordnet werden. (Siehe „X" in den vorstehenden Tabellen I bis IV). Außerdem kann die hydrophobe Gruppe, die t-Butyloxycarbonyl- oder eine Amido-Gruppe an die Carboxyl-Termini der Peptide angefügt werden. (Siehe „Z" in den vorstehenden Tabelle I bis IV). Des Weiteren können die Peptide der Erfindung derart synthetisiert werden, dass ihre sterische Konfiguration geändert wird. Beispielsweise kann das D-Isomer eines oder mehrerer der Aminosäurereste des Peptids anstatt des üblichen L-Isomers verwendet werden. Mindestens einer der Aminosäurereste der vorliegend beschriebenen Peptide kann durch einen der bekannten, natürlicherweise nicht vorkommenden Aminosäurereste ersetzt werden. Modifikationen wie diese können dazu dienen, die Stabilität, Bioverfügbarkeit und/oder inhibitorische Wirkung der Peptide zu erhöhen.
  • Beliebige der vorstehend beschriebenen Peptide können zusätzlich eine mit ihren Amino- und/oder Carboxy-Termini kovalent verbundene nicht-peptidische makromolekulare Trägergruppe aufweisen. Derartige makromolekulare Trägergruppen können beispielsweise Lipid-Fettsäure-Konjugate, Polyethylenglycol oder Kohlenhydrate einschließen. „X" in den vorstehenden Tabellen I bis IV kann daher zusätzlich beliebige der mit dem Aminoterminus eines Peptids kovalent verknüpften vorstehenden makromolekularen Trägergruppen darstellen. In ähnlicher Weise kann „Z" in den Tabellen I bis IV außerdem beliebige der vorstehend beschriebenen makromolekularen Trägergruppen darstellen.
  • 5.5 TESTS ZUR ANTI-MEMBRANFUSIONSAKTIVITÄT
  • Vorliegend werden Verfahren hinsichtlich der Befähigung einer Verbindung, wie den erfindungsgemäßen Peptiden, zur Inhibition von Membranfusionsereignissen bzw. -phänomenen beschrieben. Insbesondere werden Tests für Zellfusionsereignisse im nachstehenden Abschnitt 5.5.1 beschrieben, und Tests zur antiviralen Aktivität werden im nachstehenden Abschnitt 5.5.2 beschrieben.
  • 5.5.1 TESTS FÜR ZELLFUSIONSEREIGNISSE
  • Tests für Zellfusionsereignisse sind einem Fachmann bekannt und können beispielsweise in Verbindung mit den erfindungsgemäßen Peptiden verwendet werden, um die antifusiogenen Eigenschaften der Peptide zu testen.
  • Zellfusionstests werden allgemein in vitro durchgeführt. Ein derartiger Test kann das Kultivieren von Zellen umfassen, die in Abwesenheit irgendeiner Behandlung einer beobachtbaren Anzahl der Syncytialbildung unterliegen. Beispielsweise können nicht-infizierte Zellen in Gegenwart von mit einem Virus, das eine Zellfusion induziert, chronisch infizierten Zellen inkubiert werden. Derartige Viren können HIV, SIV oder den Respiratoy-Syncytial-Virus einschließen, sind aber nicht darauf beschränkt.
  • Für den Test werden die Zellen in Gegenwart eines zu testenden Peptids inkubiert. Für jedes Peptid kann ein Bereich von Peptidkonzentrationen getestet werden. Dieser Bereich sollte eine Kontrollkultur einschließen, bei der kein Peptid zugegeben wird.
  • Es werden einem Fachmann bekannte Standardbedingungen für die Kultivierung von Zellen verwendet. Nach der Inkubation für eine geeignete Zeitspanne (beispielsweise 24 Stunden bei 37°C) wird die Kultur mikroskopisch hinsichtlich des Vorhandenseins von multinukleären Riesenzellen untersucht, die eine Zellfusion und Syncytienbildung anzeigen. Es können bekannte Färbungen, wie eine Kristallviolettfärbung, zur Erleichterung der Sichtbarmachung der Syncytienbildung verwendet werden.
  • 5.5.2 TESTS ZUR ANTIVIRALEN AKTIVITÄT
  • Die von den Peptiden der Erfindung entfaltete antivirale Aktivität kann beispielsweise durch leicht durchführbare In-vitro-Tests, wie die nachstehend beschriebenen, gemessen werden, welche die Befähigung der Peptide zur Inhibition der Syncytien-Bildung oder ihre Befähigung zur Inhibition der Infektion durch zellfreie Viren testen können. Unter Verwendung dieser Tests können Parameter, wie die gegen einen gegebenen Stamm eines Virus entfaltete relative antivirale Aktivität der Peptide und/oder die stammspezifische inhibitorische Aktivität des Peptids bestimmt werden. Es kann ein Zellfusionstest verwendet werden, um die Befähigung der Peptide zur Inhibition der HIV-induzierten Syncytien-Bildung in vitro zu testen. Ein derartiger Test kann das Züchten nicht-infizierter CD-4*-Zellen (wie beispielsweise Molt- oder CEM-Zellen) in Gegenwart chronisch HIV-infizierter Zellen und eines zu testenden Peptids umfassen. Für jedes Peptid wird ein Bereich von Peptidkonzentrationen getestet. Dieser Bereich sollte eine Kontrollkultur, bei der kein Peptid zugegeben worden ist, einschließen. Für die Kultur werden Standardbedingungen, die einem Fachmann bekannt sind, verwendet. Nach Inkubation für eine geeignete Zeitspanne (beispielsweise 24 Stunden bei 37°C) wird die Kultur mikroskopisch hinsichtlich des Vorhandenseins multinukleärer Riesenzellen, die eine Zellfusion und Syncytien-Bildung anzeigen, untersucht.
  • Es kann ein Reverse-Transkriptase(RT)-Test verwendet werden, um die Befähigung der Peptide zur Inhibition der Infektion von CD-4+-Zellen durch zellfreie HIV zu testen. Ein derartiger Test kann das Züchten einer geeigneten Konzentration (d.h. TCID50) von Viren und CD-4+-Zellen in Gegenwart des zu testenden Peptids umfassen. Es werden einem Fachmann bekannte Kulturbedingungen angewandt. Wie oben, kann zusätzlich zu einer Kontrollkultur, bei der kein Peptid zugegeben wird, ein Bereich von Peptidkonzentrationen verwendet werden. Nach der Inkubation für eine geeignete Zeitspanne (z.B. 7 Tage) der Kultur, wird ein zellfreier Überstand unter Verwendung von Standardverfahren hergestellt und hinsichtlich der vorhandenen RT-Aktivität als Maß für eine erfolgreiche Infektion getestet. Die RT-Aktivität kann unter Verwendung von Standardtechniken, wie diejenigen, die beispielsweise von Goff et al. (Goff, S. et al., 1981, J. Virol. 38: 239–248) und/oder Willey et al., (Willey, R. et al., 1988, J. Virol. 62: 139–147) beschrieben wurden, getestet werden.
  • Es können einem Fachmann bekannte Standardverfahren zum Testen der nicht-retroviralen Aktivität verwendet werden. Siehe beispielsweise Pringle et al. (Pringle, C. R. et al., 1985. J. Medical Virology 17: 377–386) hinsichtlich einer Diskussion von Aktivitätstesttechniken für den Respiratory-Syncytial-Virus und Parainfluenza-Virus. Des Weiteren siehe beispielsweise „Zinsser Microbiology", 1988, Joklik, W. K. et al., Hsg., Appleton & Lange, Norwalk, CT: 19. Aufl., hinsichtlich eines allgemeinen Überblicks über derartige Techniken.
  • Diese Literaturstellen sind in ihrer Gesamtheit in die vorliegende Beschreibung durch Bezugnahme aufgenommen. Des Weiteren stellen die in den nachstehenden Abschnitten 17, 18, 26 und 27 dargestellten Beispiele jeweils weitere Tests zum Testen der antiviralen Eigenschaften einer Verbindung bereit.
  • In-vivo-Tests können ebenfalls beispielsweise zum Testen der antiviralen Aktivität der erfindungsgemäßen Peptide verwendet werden. Zum Testen einer Anti-HIV-Aktivität kann beispielsweise das in Barnett et al. (Barnett, S. W. et al., 1994, Science 266: 642–646) beschriebene in-vivo-Modell verwendet werden. Des Weiteren kann eine Anti-RSV-Aktivität über bekannte Mausmodelle in vivo getestet werden. Beispielsweise kann RSV intranasal an Mäuse verschiedener eingezüchteter Stämme verabreicht werden. Das Virus vermehrt sich in den Lungen von allen Stämmen, jedoch werden die höchsten Titer in P/N-, C57/L/N- und DBA/2N-Mäusen erhalten. Eine Infektion von BALB/c-Mäusen erzeugt eine asymptomatische Bronchiolitis, die durch lymphocytische Infiltrate und pulmonäre Virustiter von 104 bis 105 pfu/g Lungengewebe gekennzeichnet ist (Taylor, G. et al. 1984, Infect. Immun. 43: 649–655).
  • Baumwollrattenmodelle für RSV sind ebenfalls bekannt. Das Virus repliziert sich mit hohen Titern in der Nase und den Lungen der Baumwollratte, erzeugt jedoch, falls überhaupt, kaum Anzeichen einer Entzündung.
  • 5.6 VERWENDUNGEN DER ERFINDUNGSGEMÄßEN PEPTIDE
  • Die erfindungsgemäßen Peptide können als antifusiogene oder antivirale Verbindungen oder als Verbindungen verwendet werden, die intrazelläre Prozesse, an denen Coiled-Coil-Peptidstrukturen beteiligt sind modulieren. Des Weiteren können derartige Peptide zur Identifizierung von Wirkstoffen verwendet werden, die eine antifusiogene, antivirale oder intrazellulär modulatorische Aktivität entfalten. Des Weiteren können die erfindungsgemäßen Peptide als Organismus- oder Viraltyp/-subtyp-spezifische Diagnostikmittel verwendet werden.
  • Die antifusiogenen Eigenschaften der erfindungsgemäßen Peptide können außerdem zur Inhibition oder Behandlung/Verbesserung von Symptomen verwendet werden, die durch Prozesse hervorgerufen werden, an denen Membranfusionsereignisse bzw. -phänomene beteiligt sind. Derartige Phänomene schließen beispielsweise eine Virusübertragung über eine Zell-Zell-Fusion, einen abnormen Neurotransmitteraustausch über eine Zell-Fusion und die Sperma-Eizell-Fusion ein. Des Weiteren können die erfindungsgemäßen Peptide zur Inhibition der freien viralen wie retroviralen, insbesondere HIV-Übertragung auf nicht-infizierte Zellen, verwendet werden, wobei eine derartige virale Infektion Membranfusionsereignisse oder eine Fusion einer viralen Struktur mit einer Zellmembran einschließt. Zu den intrazellulären Störungen, an denen Coiled-Coil-Peptidstrukturen beteiligt sind, die durch die erfindungsgemäßen Peptide verbessert werden können, gehören Störungen, an denen beispielsweise bakterielle Toxine beteiligt sind.
  • Hinsichtlich der antiviralen Aktivität schließen die Viren, deren Übertragung durch die erfindungsgemäßen Peptide inhibiert werden kann, alle Stämme der vorstehend in den Tabellen V bis VII und IX bis XIV aufgeführten Viren ein, sind jedoch nicht darauf beschränkt.
  • Diese Viren schließen beispielsweise humane Retroviren, insbesondere HIV-1 und HIV-2 und die humanen T-Lymphocyen-Viren (HTLV-I und II) ein. Die nicht-humanen Retroviren, deren Übertragung durch die erfindungsgemäßen Peptide inhibiert werden kann, schließen den Rinderleukosevirus, Katzensarkom- und -leukämieviren, Affenimmundefizienz-, -sarkom- und -leukämieviren und Schaf-progressive-Pneumonie-Viren ein, sind aber nicht darauf beschränkt.
  • Nicht-retrovirale Viren, deren Übertragung durch die erfindungsgemäßen Peptide inhibiert werden kann, schließen den Humanen-Respiratory-Syncytial-Virus, den Kaninchen-Distemper-Virus, den Newcastle-Disease-Virus, den humanen Parainfluenza-Virus, Influenzaviren, Masernviren, Epstein-Barr-Viren, Hepatits-B-Viren und Affen-Mason-Pfizer-Viren ein, sind aber nicht darauf beschränkt.
  • Nicht-umhüllte Viren, deren Übertragung durch die erfindungsgemäßen Peptide inhibiert werden kann, schließen Picornaviren wie Polioviren, Hepatitis-A-Virus, Enterovirus, Echoviren und Coxsackie-Viren, Papovaviren wie den Papillomavirus, Parvoviren, Adenoviren und Reoviren ein, sind aber nicht darauf beschränkt.
  • Wie im nachstehenden Abschnitt 5.5.1 und den im nachstehenden Abschnitt 8 dargestellten Beispiel näher erläutert, bilden DP107, DP178, DP107-analoge und DP178-analoge Peptide nicht-kovalente Protein-Protein-Wechselwirkungen aus die für die normale Aktivität des Virus erforderlich sind. Daher können die erfindungsgemäßen Peptide auch als Komponenten in Tests zur Identifizierung von Verbindungen verwendet werden, welche derartige Protein-Protein-Wechselwirkungen stören und daher als antivirale Mittel wirken können. Diese Tests sind nachstehend im Abschnitt 5.5.1 beschrieben.
  • Wie in dem im nachstehenden Abschnitt 6 dargestellten Beispiel gezeigt wird, kann die antivirale Aktivität der erfindungsgemäßen Peptide eine ausgeprägte Typ- und Subtyp- Spezifität zeigen, d.h. die spezifischen Peptide können zur Inhibition der Aktivität nur spezifischer Viren wirksam sein. Dieses Merkmal der Erfindung bietet viele Vorteile. Ein derartiger Vorteil liegt beispielsweise auf dem Gebiet der Diagnostika, indem man die antivirale Spezifität des erfindungsgemäßen Peptids zur Feststellung der Identität eines viralen Isolats ausnutzen kann. In Bezug auf HIV kann man leicht bestimmen, ob ein virales Isolat aus einem HIV-1- oder HIV-2-Stamm besteht. Beispielsweise können nicht-infizierte CD4+-Zellen mit einem Isolat co-infiziert werden, bei dem festgestellt wurde, dass es das HIV-DP178 (SEQ ID: 1)-Peptid enthält, wonach die retrovirale Aktivität von Zellüberständen beispielsweise unter Verwendung der vorstehend im Abschnitt 5.2 beschriebenen Techniken getestet werden kann. Diejenigen Isolate, deren retrovirale Aktivität vollständig oder beinahe vollständig inhibiert wird, enthalten HIV-1. Diejenigen Isolate, deren virale Aktivität unverändert oder nur in einem geringen Ausmaß vermindert ist, können als HIV-1-nicht-enthaltend betrachtet werden. Ein derartiges Isolat kann dann mit einem oder mehreren der anderen DP178-Peptide der Erfindung behandelt und nachfolgend hinsichtlich seiner viralen Aktivität getestet werden, um die Identität des viralen Isolats zu bestimmen. Die DP107- und DP178-Analogen der Erfindung können auch in einem Diagnostikum verwendet werden, das für den Typ und Subtyp eines Virus oder eines Organismus spezifisch ist, in welchem sich die spezifische Peptidsequenz befindet. Es kann ein wie vorstehend hinsichtlich DP178 beschriebenes diagnostisches Verfahren in Verbindung mit dem interessierenden DP107/DP178-Analogen verwendet werden.
  • 5.5.1. SCREENING-TESTS
  • Wie in dem im nachstehenden Abschnitt 8 dargestellten Beispiel gezeigt, bilden die DP-107- und DP-178-Abschnitte des TM-Proteins gp41 nicht-kovalente Protein-Protein-Wechselwirkungen aus. Wie ebenfalls gezeigt, ist die Aufrechterhaltung derartiger Wechselwirkungen für die normale Virusaktivität erforderlich. Daher können Verbindungen, die an DP-107 binden, an DP-178 binden und/oder derart wirken, dass sie die normalen DP-107/DP-178-Protein-Protein-Wechselwirkungen aufheben, als patente antivirale Mittel wirken. Es werden nachstehend Tests zur Identifizierung derartiger Verbindungen beschrieben. Es wird darauf hingewiesen, dass aus Gründen der Einfachheit und Klarheit der Diskussion DP-107- und DP-178-Peptide als Komponenten der beschriebenen Tests verwendet werden, es jedoch klar ist, dass beliebige der vorstehend in den Abschnitten 5.1 und 5.2 beschriebenen DP-107-ähnlichen oder DP-178-ähnlichen Peptide ebenfalls als Teil dieser Screenings nach antiviralen Verbindungen verwendet werden können.
  • Verbindungen, die hinsichtlich einer Befähigung, an DP-107, DP-178 zu binden und/oder DP-107/DP-178-Wechselwirkungen aufzuheben und daher potentiell antivirale Verbindungen darstellen, schließen Peptide aus Aminosäuren mit D- und/oder L-Konfiguration (beispielsweise in Form von Zufallspeptidbibliotheken; siehe Lam, K. S. et al., 1991, Nature 354: 82–84), Phosphorpeptide (beispielsweise in Form von zufälligen oder partiell degenerierten, zielgerichteten Phosphorpeptid-Bibliotheken; siehe beispielsweise Songyang, Z. et al., 1993, Cell 72: 767–778), Antikörper und kleine organische oder anorganische Moleküle ein, sind aber nicht darauf beschränkt. Synthetische Verbindungen, natürliche Produkte und andere Quellen potentiell wirksamer Materialien können auf verschiedenen Wegen, wie in diesem Abschnitt beschrieben, gescreent werden. Die identifizierten Verbindungen, Antikörper oder anderen Mo leküle können hinsichtlich einer Befähigung zur Inhibition der viralen Aktivität unter Verwendung von beispielsweise viralen Tests, wie diejenigen, die vorstehend im Abschnitt 5.4 beschrieben sind, getestet werden.
  • Unter den Peptiden, die getestet werden können, sind lösliche Peptide, welche DP-107- und/oder DP-178-Domänen umfassen, und Peptide, die DP-107- und/oder DP-178-Domänen mit einer oder mehreren Mutationen in einer oder beiden Domänen umfassen, wie das nachstehend in dem im Abschnitt 8 dargestellten Beispiel beschriebene M41-P-Peptid, das eine Mutation von Isoleucin zu Prolin in der DP-178-Sequenz aufweist.
  • Ein Beispiel derartiger Screeningverfahren ist ein Verfahren zur Identifizierung einer Verbindung, das hinsichtlich einer antiviralen Befähigung zu testen ist, umfassend:
    • (a) Aussetzen mindestens einer Verbindung einem Peptid, das ein DP-107-Peptid umfasst, für eine Zeitspanne, die ausreicht, um eine Bindung der Verbindung mit dem DP-107-Peptid erlaubt,
    • (b) Entfernen nicht-gebundener Verbindungen und
    • (c) Bestimmen des Vorhandenseins der mit dem DP-107-Peptid verbundenen Verbindung,
    wodurch ein hinsichtlich einer antiviralen Befähigung zum testender Wirkstoff identifiziert wird.
  • Ein zweites Beispiel derartiger Screeningverfahren ist ein Verfahren zur Identifizierung einer hinsichtlich einer antiviralen Befähigung zu testenden Verbindung, umfassend:
    • (a) Aussetzen mindestens einer Verbindung einem Peptid, das ein DP-178-Peptid umfasst, für eine Zeitspanne, die ausreicht, um eine Bindung der Verbindung an das DP-178-Peptid zu erlauben,
    • (b) Entfernen nicht-gebundener Verbindungen und
    • (c) Bestimmen des Vorhandenseins der mit dem DP-178-Peptid verbundenen Verbindung, wodurch ein hinsichtlich einer antiviralen Befähigung zu testender Wirkstoff identifiziert wird.
  • Ein Verfahren, das diese Arten von Vorgehensweisen verwendet und das bei der Isolierung derartiger DP-107-bindender oder DP-178-bindender Verbindungen betrieben werden kann, ist ein Test, der das Anbringen entweder des DP-107- oder DP-178-Peptids auf einer festen Matrix, wie beispielsweise Agarose- oder Kunststoff-Kügelchen, Microtiterplattenvertiefungen, Petrischalen oder beispielsweise aus Nylon oder Nitrocellulose aufgebauten Membranen, einschließen würde. In einem derartigen Testsystem kann entweder das DP-107- oder DP-178-Protein auf einer festen Oberfläche verankert werden, und die Verbindung oder Testsubstanz, die nicht verankert ist, wird entweder direkt oder indirekt markiert. In der Praxis werden Microtiterplatten in geeigneter Weise verwendet. Die verankerte Komponente kann durch nicht-kovalente oder kovalente Bindungen immobilisiert werden. Eine nicht-kovalente Bindung kann einfach durch Beschichten der festen Oberfläche mit einer Lösung des Proteins und Trocknen erreicht werden. In einer anderen Ausführungsform kann ein immobilisierter Antikörper, vorzugsweise ein monoklonaler Antikörper, der für das Protein spezifisch ist, verwendet werden, um das Protein auf der festen Oberfläche zu verankern. Die Oberflächen können vorher hergestellt und gelagert werden.
  • Um den Test durchzuführen, wird die markierte Verbindung auf die beschichtete Oberfläche, die das verankerte DP-107- oder DP-178-Peptid enthält, gegeben. Nach der vollständigen Reaktion werden nicht-reagierte Komponenten unter derartigen Bedingungen entfernt (z.B. durch Waschen), dass alle gebildeten Komplexe auf der festen Oberfläche immobilisiert verbleiben. Die Detektion der Komplexe, die auf der Oberfläche verankert sind, kann durch eine Anzahl von Wegen erreicht werden. Wenn die Verbindung zuvor markiert wurde, zeigt die Detektion der auf der Oberfläche immobilisierten Markierung an, dass Komplexe gebildet wurden. Wenn die markierte Verbindung zuvor nicht markiert wurde, kann eine indirekte Markierung verwendet werden, um auf der Oberfläche verankerte Komplexe zu detektieren, z.B. unter Verwendung eines markierten Antikörpers, der für die Verbindung spezifisch ist (der Antikörper kann wiederum direkt markiert oder mit einem markierten Anti-Ig-Antikörper markiert werden).
  • In einer anderen Ausführungsform kann ein derartiger Test, in der flüssigen Phase durchgeführt, die Reaktionsprodukte von nicht-umgesetzten Komponenten getrennt und Komplexe detektiert werden, z.B. unter Verwendung eines für DP-107 oder DP-178 spezifischen immobilisierten Antikörpers, was auch immer für den gegebenen Test geeignet ist, oder eines für die Verbindung, d.h. die Testsubstanz, spezifischen Antikörpers, um jeden in Lösung gebildeten Komplex zu verankern, und eines markierten für den anderen Teil des Komplexes spezifischen markierten Antikörpers, um verankerte Komplexe zu detektieren.
  • Durch Anwenden von Verfahren wie diesem, kann eine große Anzahl von Molekültypen gleichzeitig hinsichtlich der Befähigung zur DP-107- oder DP-178-Bindung und somit hinsichtlich ihrer potentiellen antiviralen Aktivität getestet werden.
  • Des Weiteren können Verbindungen hinsichtlich einer Befähigung zur Inhibition der Bildung oder, in einer anderen Ausführungsform, Spaltung von DP-107/DP-178-Komplexen gescreent werden. Derartige Verbindungen können dann hinsichtlich einer antiviralen Befähigung getestet werden. Zur Vereinfachung der Beschreibung werden DP-107 und DP-178 als „Bindungspartner" bezeichnet. Verbindungen, welche derartige Wechselwirkungen aufheben, können eine antivirale Aktivität aufweisen. Derartige Verbindungen können Moleküle, wie vorstehend beschriebene Antikörper, Peptide und ähnliche einschließen, sind aber nicht darauf beschränkt.
  • Das zugrundeliegende Prinzip der zur Identifizierung von Verbindungen, welche die Wechselwirkung zwischen den DP-107- und DP-178-Peptiden stören, verwendeten Testsysteme, schließt das Herstellen eines die Peptide enthaltenden Reaktionsgemischs unter Bedingungen und für eine Zeitspanne ein, die ausreicht, um es den zwei Peptiden zu erlauben, miteinander zu Wechselwirken und zu binden und so einen Komplex zu bilden. Um eine Verbindung hinsichtlich einer Spaltungsaktivität zu testen, wird die Reaktion in Gegenwart und Abwesenheit der Testverbindung durchgeführt, d.h., die Testverbindung kann anfänglich in dem Reaktionsgemisch enthalten sein oder zu einem nach dem Zufügen eines der Bindungspartner liegenden Zeitpunkt zugegeben werden. Kontrollen werden ohne die Testverbindung oder mit einem Placebo inkubiert. Dann wird die Bildung eines jeden Komplexes zwischen den Bindungspartnern detektiert. Die Bildung eines Komplexes in der Kontrollreaktion, nicht aber in dem die Testverbindung enthaltenden Reaktionsgemisch, zeigt, dass die Verbindung die Wechselwirkung zwischen den DP-107- und DP-178-Peptiden stört.
  • Der Test für Verbindungen, welche die Wechselwirkung zwischen den Bindungspartnern stören, kann in heterogener oder homogener Form durchgeführt werden. Heterogene Tests schließen die Verankerung von einem der Bindungspartner auf einer festen Phase und die Detektion von auf der festen Phase verankerten Komplexen am Ende der Reaktion ein. In homogenen Tests wird die gesamte Reaktion in einer flüssigen Phase durchgeführt. Bei beiden Vorgehensweisen kann die Reihenfolge des Zugebens der Reaktanden verändert werden, um unterschiedliche Informationen über die getesteten Verbindungen zu erhalten. Beispielsweise können Testverbindungen, welche die Wechselwirkung zwischen den Bindungspartnern, z.B. durch Kompetition, stören, identifiziert werden, indem die Reaktion in Gegenwart der Testsubstanz, d.h. durch Zugeben der Testsubstanz zum Reaktionsgemisch vor oder gleichzeitig mit den Bindungspartnern, durchgeführt wird. Andererseits können Verbindungen, welche die zuvor gebildeten Komplexe spalten, z.B. Verbindungen mit höheren Bindungskonstanten, die einen der Bindungspartner aus dem Komplex verdrängen, durch Zugeben der Testverbindung zu dem Reaktionsgemisch, nachdem sich Komplexe gebildet haben, getestet werden. Die verschiedenen Formate sind nachstehend kurz beschrieben.
  • In einem heterogenen Testsystem wird ein Bindungspartner, z.B. entweder das DP-107- oder das DP-178-Peptid, auf einer festen Oberfläche verankert und sein Bindungspartner, der nicht verankert wird, wird entweder direkt oder indirekt markiert. In der Praxis werden Microtiterplatten in geeigneter Weise verwendet. Die verankerte Spezies kann durch nicht-kovalente oder kovalente Bindungen immobilisiert werden. Eine nicht-kovalente Bindung kann einfach durch Beschichten der festen Oberfläche mit einer Lösung des Proteins und Trocknen herbeigeführt werden. In einer anderen Ausführungsform kann ein für das Protein spezifischer, immobilisierter Antikörper verwendet werden, um das Protein auf der festen Oberfläche zu verankern. Die Oberflächen können zuvor hergestellt und gelagert werden.
  • Um den Test durchzuführen, wird der Bindungspartner der immobilisierten Spezies auf die beschichtete Oberfläche mit der oder ohne die Testverbindung gegeben. Nach der vollständigen Reaktion werden nicht-reagierte Komponenten (z.B. durch Waschen) entfernt, und alle gebildeten Komplexe bleiben auf der festen Oberfläche immobilisiert. Die Detektion der auf der festen Oberfläche verankerten Komplexe kann auf verschiedene Art und Weise durchgeführt werden. Wenn der Bindungspartner zuvor markiert wurde, zeigt die Detektion der auf der Oberflä che immobilisierten Markierung an, dass Komplexe gebildet wurden. Wenn der Bindungspartner nicht vorher markiert wurde, kann eine indirekte Markierung verwendet werden, um die auf der Oberfläche verankerten Komplexe zu detektieren, z.B. unter Verwendung eines markierten, für den Bindungspartner spezifischen Antikörpers (der Antikörper kann wiederum direkt markiert oder mit einem markierten Anti-Ig-Antikörper indirekt markiert sein). In Abhängigkeit von der Reihenfolge des Zugebens von Reaktionskomponenten können Testverbindungen, welche die Komplexbildung inhibieren oder die zuvor gebildeten Komplexe spalten, detektiert werden.
  • In einer anderen Ausführungsform kann die Reaktion in einer flüssigen Phase in Gegenwart oder Abwesenheit der Testverbindung durchgeführt werden, die Reaktionsprodukte werden von nicht-reagierten Komponenten getrennt und Komplexe detektiert, z.B. unter Verwendung eines immobilisierten, für einen Bindungspartner spezifischen Antikörpers, um jeden in Lösung gebildeten Komplex zu verankern, und eines markierten Antikörpers, der für den anderen Bindungspartner spezifisch ist, um verankerte Komplexe zu detektieren. Es können wieder in Abhängigkeit von der Reihenfolge des Zugebens von Reaktanden zu der flüssigen Phase Testverbindungen identifiziert werden, die Komplexe inhibieren oder die zuvor gebildete Komplexe spalten.
  • In einer anderen Ausführungsform kann ein homogener Test verwendet werden. Bei dieser Vorgehensweise wird ein vorgebildeter Komplex aus den DP-107- und DP-178-Peptiden hergestellt, in welchem einer der Bindungspartner markiert ist, das vor der Markierung erzeugte Signal aufgrund der Komplexbildung jedoch gelöscht wird (siehe z.B. U.S.-Patent Nr. 4,109,496 von Rubenstein, worin diese Vorgehensweise bei Immuntests verwendet wird). Die Zugabe einer Testsubstanz, die mit einem der Bindungspartner konkurriert und diesen aus dem zuvor gebildeten Komplex verdrängt, resultiert in der Erzeugung eines Signals über dem Hintergrund. Auf diesem Weg können Testsubstanzen, welche die DP-107/DP-178-Protein-Protein-Wechselwirkung aufheben, identifiziert werden.
  • In einem anderen Screening-Test können Testverbindungen hinsichtlich ihrer Befähigung zur Störung bzw. zur Aufhebung einer DP178/DP107-Wechselwirkung durch immunometrische Messung unter Verwendung eines Antikörpers getestet werden, der spezifisch mit einem DP107/DP178-Komplex reagiert (d.h. ein Antikörper, der weder DP107 noch DP178 einzeln erkennt. Ein derartiger Test dient als Kompetitionstest und basiert auf einem Fachmann bekannten Techniken.
  • Der vorstehende Kompetitionstest kann beispielhaft und nicht-einschränkend anhand der Verwendung der DP178- und M41Δ178-Peptide und anhand des Testens von Testverbindungen hinsichtlich der Aufhebung der durch diese zwei Peptide gebildeten Komplexe durch immunometrische Sichtbarmachung von DP178/M41Δ178-Komplexen über das humane rekombinante Fab, Fab-b, wie nachstehend in den im Abschnitt 8 dargestellten Beispiel beschrieben, beschrieben werden. M41Δ178 ist ein Maltosebindungsfusionsprotein, das eine gp41-Region enthält, dessen DP178-Domäne deletiert wurde, und es wird nachstehend in dem in Abschnitt 8 dargestellten Beispiel beschrieben.
  • Unter Verwendung eines derartigen Tests kann M41Δ178 auf festen Trägern wie Mikrotiterplattenvertiefungen immobilisiert werden. Dann kann eine Reihe von Verdünnungen einer Testverbindung in jede M41Δ178 enthaltende Vertiefung in Gegenwart einer konstanten Konzentration des DP-178-Peptids gegeben werden. Nach Inkubation beispielsweise bei Raumtemperatur für eine Stunde werden nicht-gebundenes DP-178 und nicht gebundene Testverbindung aus den Vertiefungen entfernt, und die Vertiefungen werden dann mit dem DP178/M41Δ178-spezifischen Fab-b- Antikörper inkubiert. Nach der Inkubation und Waschen wird nicht-gebundenes Fab-d aus den Platten entfernt und gebundenes Fab-d quantifiziert: Eine Kontrolle ohne Inhibitor sollte ebenfalls durchgeführt werden. Testverbindungen, die eine Befähigung zur Aufhebung der Bildung von DP178/M41Δ178-Komplexen zeigen, werden anhand der Konzentrations-abhängigen Verminderung der Stärke der Fab-d-Bindung identifiziert.
  • Eine Variante eines derartigen Tests kann verwendet werden, um einen schnellen Hochdurchsatz-Bindungstest durchzuführen, der sich zur direkten Messung der DP178-Bindung an M41Δ178 zur Bestimmung von Bindungskonstanten des Liganden von inhibitorischen Konstanten von Kompetitoren der DP178-Bindung eignet.
  • Ein derartiger Test nutzt die Vorteile der anerkannten Prinzipien der Radioliganden- und Rezeptorbindung. (Siehe beispielsweise Yamamura, H. I. et al., 1985, „Neurotransmitter Receptor Binding", 2. Aufl., Raven Press, NY.). Wie vorstehend dargelegt, wird M41Δ178 auf einem festen Träger wie die Vertiefung einer Mikrotiterplatte, immobilisiert. Dann wird die DP178-Bindung an M41Δ178 durch Messung des Anteils von DP178, der als 127I-DP178 gebunden wurde, und Berechnung der gebundenen Gesamtmenge unter Verwendung eines Wertes für die spezifische Aktivität (dpm/Mikrogramm Peptid), der für jede markierte DP178-Präparation bestimmt wurde, quantifiziert. Die spezifische Bindung an M41Δ178 ist als Differenz der Bindung der markierten DP178-Präparation in den Mikrotitervertiefungen (gesamt) und der Bindung in identischen Vertiefungen, die zusätzlich überschüssiges nicht-markiertes DP178 enthalten (unspezifisch) definiert.
  • 5.5 PHARMAZEUTISCHE FORMULIERUNGEN, DOSIERUNGEN UND VERABREICHUNGSWEGE
  • Die Peptide der Erfindung können unter Verwendung von einem Fachmann bekannten Techniken verabreicht werden. Vorzugsweise werden Wirkstoffe formuliert und systemisch verabreicht. Techniken zur Formulierung und Verabreichung können in „Remington's Pharmaceutical Sciences", 18. Aufl., 1990, Mack Publishing Co., Easton, PA, gefunden werden. Geeignete Wege können eine orale, rektale, transmukosale oder intestinale Verabreichung, eine parenterale Gabe, einschließlich intramuskuläre, subkutane, intramedullare Injektionen sowie intrathekale, direkte intraventrikulare, intravenöse, intraperitoneale, intranasale oder intraoculäre Injektionen, um nur einige zu nennen, einschließen. Die am meisten bevorzugte Verabreichung erfolgt intravenös. Zur Injektion können die Wirkstoffe der Erfindung in wässerigen Lösungen, vorzugsweise in physiologisch verträglichen Puffern, wie die Hanks'sche Lösung, Ringer'sche Lösung oder physiologischer Kochsalzpuffer, formuliert werden. Für eine derartige transmukosale Verabreichung werden Durchdringungsmittel, die für die zu durchdringende Barriere geeignet sind, in der Formulierung verwendet. Derartige Durchdringungsmittel sind im Fachgebiet allgemein bekannt.
  • In Fällen, in denen eine intrazelluläre Verabreichung der erfindungsgemäßen Peptide oder anderer inhibitorischer Mittel bevorzugte ist, können einem Fachmann bekannte Techniken eingesetzt werden. Beispielsweise können derartige Mittel bzw. Wirkstoffe in Liposomen eingeschlossen werden und dann wie vorstehend beschrieben verabreicht werden. Liposomenm sind sphärische Lipiddoppelschichten mit wässrigen Inhalten. Alle zum Zeitpunkt der Liposomenbildung in einer wässrigen Lösung vorhandenen Moleküle werden in den wässrigen Inhalt aufgenommen. Die liposomalen Inhalte werden sowohl gegen die externe Mikroumgebung geschützt, und, da Liposomen mit Zellmembranen fusionieren, werden wirksam in das Zellcytoplasma abgegeben. Des Weiteren kann aufgrund ihrer Hydrophobizität eine direkte intrazelluläre Verabreichung erreicht werden, wenn kleine Moleküle verabreicht werden sollen.
  • Die erfindungsgemäßen Peptide codierende Nucleotidsequenzen, die intrazellulär verabreicht werden sollen, können in den interessierenden Zellen unter Verwendung von einem Fachmann bekannten Techniken exprimiert werden. Beispielsweise können Expressionsvektoren, die von Viren wie Retroviren, Vacciniaviren, Adeno-assoziierten Viren, Herpesviren oder bovinen Papillomviren abgeleitet sind, zur Einbringung und Expression derartiger Nucleotidsequenzen in die Zielzellpopulation verwendet werden. Verfahren zur Konstruktion derartiger Vektoren und Expressionskonstrukte sind bekannt. Siehe beispielsweise Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Coldspring Harbor Press, Coldspring Harbor NY, und Ausubel et al., 1989, Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates and Wiley Interscience, NY.
  • In Bezug auf HIV können die Peptide der Erfindung als Therapeutikum in der Behandlung von AIDS verwendet werden. Des Weiteren können die Peptide als prophylaktische Mittel in zuvor nicht-infizierten Individuen nach einem akuten Kontakt mit einem HIV-Virus verwendet werden. Beispiele einer derartige prophylaktischen Verwendung der Peptide kann eine Verhinderung der Virusübertragung von der Mutter auf das Kind und in anderen Situationen, in denen eine Wahrscheinlichkeit der HIV-Übertragung besteht, wie beispielsweise Unfällen im Gesundheitswesen, bei denen das Personal mit HIV-enthaltenden Blutprodukten in Kontakt kommt, einfließen, sind aber nicht darauf beschränkt. Die erfolgreiche Anwendung derartiger Behandlungen beruht nicht auf der Erzeugung einer Wirtsimmunantwort gegen derartige Peptide.
  • Zu verabreichende wirksame Dosen der erfindungsgemäßen Peptide können mittels einem Fachmann bekannter Verfahren bestimmt werden, mit denen Parameter wie die biologische Halbwertszeit, Bioverfügbarkeit und Toxizität bestimmt werden. Angesichts der im nachstehenden Abschnitt 6 dargestellten Daten kann sich DP178 beispielsweise als in vivo wirksam bei Dosen erweisen, die zum Erreichen von Blutspiegeln von etwa 1 bis etwa 10 Nanogramm pro Milliliter Peptid erforderlich sind.
  • Eine therapeutisch wirksame Dosis bezieht sich auf diejenige Menge der Verbindung, die ausreicht, um eine Verbesserung der Symptome oder eine Verlängerung der Überlebenszeit bei einem Patienten zu ergeben. Die Toxizität und die therapeutische Wirksamkeit derartiger Verbindungen können durch pharmazeutische Standardverfahren in Zellkulturen oder Tierexperimenten, z.B. zur Bestimmung der LD50 (die für 50% der Population tödliche Dosis) und der ED50 (die in 50% der Population therapeutisch wirksame Dosis), bestimmt werden. Das Dosisverhältnis zwischen den toxischen und therapeutischen Wirkungen ist der therapeutische Index, und er kann als das Verhältnis LD50/ED50 ausgedrückt werden. Verbindungen, die große therapeutische Indizes aufweisen, sind bevorzugt. Die aus diesen Zellkulturtests und Tierstudien erhaltenen Daten können bei der Formulierung einer Reihe von Dosierungen zur Anwendung beim Menschen verwendet werden. Die Dosierung derartiger Verbindungen liegt vorzugsweise innerhalb eines Bereichs von Kreislaufkonzentrationen, welche die ED50 bei einer geringen oder keiner Toxizität einschließen. Die Dosierung kann innerhalb dieses Bereichs in Abhängigkeit von der verwendeten Dosisform und dem angewandten Verabreichungsweg verändert werden. Für jede Verbindung kann die therapeutisch wirksame Dosis anfänglich anhand von Zellkulturtests geschätzt werden. Es kann in Tiermodellen eine Dosis formuliert werden, um einen Kreislaufplasmakonzentrationsbereich zu erreichen, der die IC50 (d.h. die Konzentration der Testverbindung, bei der eine halbmaximale Spaltung des PTK/Adapter-Proteinkomplexes oder eine halbmaximale Inhibition des zellulären Spiegels und/oder Aktivität einer Komplexkomponente erreicht wird), wie sie in der Zellkultur bestimmt wurde, einschließt. Eine derartige Information kann dazu verwendet werden, um in Menschen verwendbare Dosen genauer zu bestimmen. Plasmaspiegel können beispielsweise durch Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC) gemessen werden.
  • Die erfindungsgemäßen Peptide können des Weiteren als prophylaktisches Vaczin dienen, wobei der Wirt Antikörper gegen die erfindungsgemäßen Peptide erzeugt, welche dann zur Neutralisierung von HIV-Viren beispielsweise durch Inhibition einer weiteren HIV-Infektion dienen.
  • Die Verabreichung der Peptide der Erfindung als prophylaktisches Vakzin würde daher die Verabreichung einer Konzentration des Peptids, die zur Erzeugung einer Immunantwort wirksam ist ausreicht, um HIV, beispielsweise durch Inhibition der Befähigung von HIV zur Infektion von Zellen, zu neutralisieren, umfassen. Die exakte Konzentration hängt von dem spezifischen, zu verabreichenden Peptid ab, kann jedoch unter Verwendung von Standardtechniken zum Testen der Erzeugung einer Immunantwort, die einem Fachmann bekannt sind, bestimmt werden. Die als Vakzine zu verwendenden Peptide werden üblicherweise intramuskulär verabreicht.
  • Die Peptide können mit einem geeigneten Adjuvans formuliert werden, um die immunologische Reaktion zu verstärken. Derartige Adjuvantien schließen Mineralgele, wie Aluminiumhydroxid, oberflächenaktive Substanzen, wie Lysolecithin, Pluronic-Polyole, Polyanione, andere Peptide, Ölemulsionen und potentiell verwendbare humane Adjuvantien, wie BCG und Corynebacterium parvum, ein, sind aber nicht darauf beschränkt. Es können viele Verfahren angewendet werden, um die vorliegend beschrie benen Vakzin-Formulierungen einzusetzen. Diese Verfahren schließen orale, intradermale, intramuskuläre, intraperitoneale, intravenöse, subkutane und intranasale Wege ein, sind aber nicht darauf beschränkt.
  • In einer anderen Ausführungsform kann eine wirksame Konzentration von polyklonalen oder monoklonalen Antikörpern, die gegen die erfindungsgemäßen Peptide erzeugt wurden, an einen Wirt verabreicht werden, so dass keine nicht-infizierten Zellen durch HIV infiziert werden. Die exakte Konzentration derartiger Antikörper ist mit jeder spezifischen Antikörperpräparation veränderlich, kann aber unter Verwendung von einem Fachmann bekannten Standardtechniken bestimmt werden. Die Verabreichung der Antikörper kann unter Verwendung einer Vielzahl von Techniken durchgeführt werden, welche die in diesem Abschnitt beschriebenen einschließen, aber nicht darauf beschränkt sind.
  • Die exakte Formulierung, der Verabreichungsweg und die Dosierung können durch den jeweiligen Mediziner anhand des Zustandes des Patienten gewählt werden (siehe z.B. Fingl et al., 1975, in „The Pharmalogical Basis of Therapeutics", Kap. 1, Seite 1).
  • Es wird darauf hingewiesen, dass der behandelnde Arzt weiß, wann die Verabreichung aufgrund einer Toxizität oder Organdysfunktion zu beenden, zu unterbrechen oder anzupassen ist. Umgekehrt ist der behandelnde Arzt damit vertraut, die Behandlung auf höhere Spiegel einzustellen, falls die klinische Reaktion nicht angemessen ist (wobei eine Toxizität auszuschließen ist). Die Höhe der verabreichten Dosis bei der Behandlung der interessierenden onkogenen Erkrankung ist mit der Schwere des zu behandelnden Zustands und dem Verabreichungsweg veränderlich. Die Dosis und möglicherweise die Dosisfrequenz sind mit dem Alter, dem Körpergewicht und der Reaktion des einzelnen Patienten ebenfalls veränderlich. Eine mit der vorstehend diskutierten ähnliche Vorgehensweise kann in der Veterinärmedizin verwendet werden.
  • Die Verwendung pharmazeutisch verträglicher Träger zur Formulierung der vorliegend offenbarten Verbindungen zur Ausführung der Erfindung in für eine systemische Verarbeitung geeignete Dosen liegt im Schutzbereich der Erfindung.
  • Bei geeigneter Auswahl des Trägers und geeigneter Herstellungspraxis können die Zusammensetzungen, insbesondere diejenigen, die als Lösung formuliert sind, parenteral wie durch intravenöse Injektion verabreicht werden. Die Verbindungen können leicht unter Verwendung im Fachgebiet bekannter pharmazeutisch verträglicher Träger in Dosierungen formuliert werden, die für eine orale Verabreichung geeignet sind. Derartige Träger ermöglichen es den Verbindungen der Erfindung, als Tabletten, Pillen, Kapseln, Flüssigkeiten, Gele, Sirupe, Aufschlämmungen, Suspensionen und ähnliche zur oralen Aufnahme durch einen zu behandelnden Patienten formuliert zu werden.
  • Pharmazeutische Zusammensetzungen schließen Zusammensetzungen ein, bei denen die wirksamen Bestandteile in einer wirksamen Menge zum Erreichen des beabsichtigten Zwecks enthalten sind. Die Bestimmung der wirksamen Mengen liegt, insbesondere im Licht der vorliegend bereitgestellten detaillierten Offenbarung, innerhalb der Fähigkeiten eines Fachmanns.
  • Zusätzlich zu den wirksamen Bestandteilen können diese pharmazeutischen Zusammensetzungen geeignete, pharmazeutisch verträgliche Träger, umfassend Vehikel und Hilfsstoffe, enthalten, welche die Verarbeitung der wirksamen Verbindungen zu pharmazeutisch verwendbaren Präparaten erleichtern. Die für eine orale Verabreichung formulierten Präparate können in Form von Tabletten, Dragees, Kapseln oder Lösungen vorliegen.
  • Die erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzungen können in einer an sich bekannten Art und Weise, z.B. mit Hilfe üblicher Misch-, Auflösungs-, Granulierungs-, Drageeherstellungs-, Verreibungs-, Emulgierungs-, Einkapselungs-, Einfangungs- oder Lyophilisierungsverfahren, hergestellt werden.
  • Pharmazeutische Formulierungen zur parenteralen Verabreichung schließen wässerige Lösungen der wirksamen Verbindungen in wasserlöslicher Form ein. Des Weiteren können Suspensionen der wirksamen Verbindungen als geeignete ölige Injektionssuspensionen hergestellt werden. Geeignete lipophile Lösungsmittel oder Vehikel schließen Fettöle, wie Sesamöl, oder synthetische Fettsäureester, wie Ethyloleat oder Triglyceride, oder Liposomen ein. Wässrige Injektionssuspensionen können Substanzen, wie Natriumcarboxymethylcellulose, Sorbit oder Dextran, enthalten, welche die Viskosität der Suspension erhöhen. Gegebenenfalls kann die Suspension auch geeignete Stabilisatoren oder Mittel enthalten, welche die Löslichkeit der Verbindungen erhöhen, um die Herstellung hoch konzentrierter Lösungen zu ermöglichen.
  • Pharmazeutische Präparate für die orale Verwendung können durch Vereinigen der wirksamen Verbindungen mit festen Hilfsstoffen, ggf. Mahlen des resultierenden Gemischs und Verarbeiten des Granulatgemischs, nachdem, falls erwünscht, geeignete Hilfsstoffe zugegeben wurden, erhalten werden, um Tabletten oder Drageekerne zu erhalten. Geeignete Hilfsstoffe sind insbesondere Füllstoffe wie Zucker, einschließlich Lactose, Sucrose, Mannit oder Sorbit, Cellulose-Präparate, wie beispielsweise Maisstärke, Weizenstärke, Reisstärke, Kartoffelstärke, Gelatine, Traganthgummi, Methylcellulose, Hydroxypropylmethylcellulose, Natriumcarboxymethylcellulose und/oder Polyvinylpyrrolidon (PVP). Falls erwünscht, können Zerfallhilfsmittel wie quervernetztes Polyvinylpyrrolidon, Agar oder Alginsäure oder ein Salz davon, wie Natriumalginat, zugegeben werden.
  • Drageekerne werden mit geeigneten Beschichtungen bereitgestellt. Zu diesem Zweck können konzentrierte Zuckerlösungen verwendet werden, die ggf. Gummiarabicum, Talcum, Polyvinylpyrrolidon, Carbopol-Gel, Polyethylenglycol und/oder Titandioxid, Lacklösungen und geeignete organische Lösungsmittel oder Lösungsmittelgemische enthalten können. Es können Farbstoffe oder Pigmente zu den Tabletten- oder Drageebeschichtungen zu deren Kenntlichmachung oder zur Kennzeichnung verschiedener Kombinationen von Dosen wirksamer Verbindungen beigefügt werden.
  • Pharmazeutische Zusammensetzungen bzw. Präparate, die oral verwendet werden können, schließen Schiebesitz- bzw. „Push-fit"-Kapseln aus Gelatine sowie weiche, versiegelte Kapseln aus Gelatine und einem Weichmacher (wie Glycerin oder Sorbit) ein. Die „Push-fit"-Kapseln können die wirksamen Bestandteile im Gemisch mit einem Füllstoff, wie Lactose, Bindemitteln, wie Stärken, und/oder Gleitmitteln, wie Talcum oder Magnesiumstearat, und ggf. Stabilisatoren enthalten. In weichen Kapseln können die wirksamen Verbindungen in geeigneten Flüssigkeiten, wie Fettölen, flüssigem Paraffin oder flüssigen Polyethylenglykolen, gelöst oder suspendiert sein. Zusätzlich können Stabilisatoren zugegeben werden.
  • 6. BEISPIEL: DP-178 (SEQ ID: 1) IST EIN WIRKSAMER INHIBITOR DER HIV-1-INFEKTION
  • In diesem Beispiel wird gezeigt, dass DP-178 (SEQ ID: 1) ein wirksamer Inhibitor der HIV-1-vermittelten CD-4+-Zell-Zell-Fusion und Infektion durch zellfreie Viren ist. In dem Fusionstest blockiert dieses Peptid vollständig die Virusinduzierte Syncytien-Bildung bei Konzentrationen von 1–10 ng/ml. In dem Infektiositätstest ist die inhibitorische Konzentration etwas höher, wobei die Infektion bei 90 ng/ml blo ckiert wird. Es wird weiter gezeigt, dass die antivirale Aktivität von DP-178 (SEQ ID: 1) für HIV-1 hoch spezifisch ist. Des Weiteren wird festgestellt, dass ein synthetisches Peptid, DP-185 (SEQ ID: 3), das ein von DP-178 aus HIV-1-abgeleitetes Homologes darstellt, die HIV-1-vermittelte Syncytien-Bildung blockiert.
  • 6.1. MATERIALIEN UND METHODEN
  • 6.1.1. PEPTID-SYNTHESE
  • Peptide wurden unter der Verwendung der Fast-Moc-Chemie auf einem Peptidsynthetisierungsgerät Modell 431A von Applied Biosystems synthetisiert. Amidierte Peptide wurden unter Verwendung eines Rink-Harzes (Advanced Chemtech) hergestellt, während Peptide, die freie Carboxyl-Termini enthielten, auf einem Wang-(p-Alkoxybenzylalkohol)-Harz (Bachem) synthetisiert wurden. Die ersten Reste wurden doppelt mit dem geeigneten Harz gekoppelt und nachfolgende Reste wurden einfach gekoppelt. Jedem Kopplungsschritt folgte eine Kappenbildung mit Essigsäureanhydrid. Die Peptide wurden von dem Harz durch Behandlung mit Trifluoressigsäure (TFA) (10 ml), H2O (0,5 ml), Thioanisol (0,5 ml), Ethandithiol (0,25 ml) und kristallinem Phenol (0,75 g) abgespalten. Die Reinigung wurde durch Umkehrphasen-HPLC durchgeführt. Proben von ungefähr 50 mg rohem Peptid wurden auf einer Waters Delta Pak C18-Säule (19 mm × 30 cm, 15 m kugelförmig) mit einem linearen Gradienten von H2O/Acetonitril 0,1% TFA chromatographiert. Lyophilisierte Peptide wurden in einem Exsiccator gelagert, und es wurden Peptidlösungen in Wasser bei etwa 1 mg/ml hergestellt. Die Elektrospray-Massenspektroskopie ergab die folgenden Ergebnisse: DP-178 (SEQ ID: 1): 4491,87 (berechnet 4491,94); DP-180 (SEQ ID: 2): 4491,45 (berechnet 4491,94); DP-185 (SEQ ID: 3): nicht bestimmt (berechnet 4546.97).
  • 6.1.2. VIRUS
  • Der HIV-1LAI-Virus wurde von R. Gallo (Popovic, M. et al., 1984, Science 224: 497–508) erhalten und in CEM-Zellen, die in RPMI 1640, enthaltend 10% fötales Kälberserum, gezüchtet wurden, vermehrt. Der Überstand von den infizierten CEM-Zellen wurde durch einen 0,2-μm-Filter filtriert und der infektiöse Titer in einem Mikroinfektiositätstest unter Verwendung der AA5-Zelllinie zur Unterstützung der Virusreplikation abgeschätzt. Zu diesem Zweck wurden 25 μl seriell verdünnte Viren zu 25 μl AA5-Zellen bei einer Konzentration von 2 × 105/ml in einer Mikrotiterplatte mit 96 Vertiefungen gegeben. Jede Virusverdünnung wurde dreifach getestet. Die Zellen wurden für 8 Tage unter Zugabe von frischem Medium an jedem zweiten Tag kultiviert. Am Tag 8 nach der Infektion wurden Überstandsproben hinsichtlich der Virusreplikation anhand der in den Überstand abgegebenen Reverse-Transkriptase-Aktivität getestet. Der TCID50 wurde gemäß der Formel von Reed und Muench berechnet (Reed, L. J. et al., 1938, Am. J. Hyg. 27: 493–497). Der Titer der HIV-1LAI- und HIV-1MN-Stammlösungen, die für diese Untersuchungen verwendet wurden, betrug gemäß Messung mit der AA5-Zelllinie ungefähr 1,4 × 106 bzw. 3,8 × 104 TCID50/ml.
  • 6.1.3. ZELLFUSIONSTEST
  • Es wurden ungefähr 7 × 104 Molt-Zellen mit 1 × 104 CEM-Zellen, die chronisch mit dem HIV-1LAI-Virus infiziert waren, in Platten mit 96 Vertiefungen (Halbbereichsclusterplatten; Costar, Cambridge, MA) in einem Endvolumen von 100 μl Kulturmedium, wie zuvor beschrieben (Matthews, T. J. et al., 1987, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 5424–5428) inkubiert. Peptidinhibitoren wurden in einem Volumen von 10 μl zugegeben, und das Zellgemisch wurde für 24 h bei 37°C inkubiert. Zu diesem Zeitpunkt wurden multinukleäre Riesenzellen durch mikroskopische Untersuchung bei einer Vergrößerung von 40×, welche die Visualisierung der gesamten Vertiefung in einem einzelnen Feld erlaubte, beurteilt.
  • 6.1.4. TEST ZUR ZELLFREIEN VIRUSINFEKTION
  • Synthetische Peptide wurden bei 37°C mit entweder 247 TCID50- (bei dem in 2 dargestellten Experiment) oder 62 TCID50- (bei dem in 3 dargestellten Experiment) Einheiten des HIV-1LAI-Virus oder 25 TCID50-Einheiten des HIV-2NIH2- und CEM-CD4+-Zellen bei Peptidkonzentrationen von 0, 0,04, 0,4, 4,0 und 40 μg/ml für 7 Tage inkubiert. Die resultierende Reverse-Transkriptase(RT)-Aktivität in Zählungen pro Minute wurde unter Verwendung des nachstehend im Abschnitt 6.1.5. beschriebenen Tests bestimmt. Siehe Reed, L. J. et al., 1938, Am. J. Hyg. 27: 493–497 hinsichtlich einer Erklärung der TCID50-Berechnungen.
  • 6.1.5. REVERSE-TRANSKRIPTASE-TEST
  • Der Mikro-Reverse-Transkriptase(RT)-Test wurde von Goff et al. (Goff, S. et al., 1981, J. Virol. 38: 239–248 und Willey et al. (Willey, R. et al., 1988, J. Virol. 62: 139–147) adaptiert. Überstände von Virus/Zell-Kulturen werden auf 1% Triton-X100 eingestellt. Eine Überstandsprobe von 10 μl wurde zu 50 iml RT-Cocktail in einer Mikrotiterplatte mit 96 Vertiefungen mit U-förmigem Boden gegeben, und die Proben wurden bei 37°C für 90 min inkubiert. Der RT-Cocktail enthielt 75 mM KCl, 2 mM Dithiothreitol, 5 mM MgCl2, 5 μg/ml Poly-A (Pharmacia, Katalog-Nr. 27-4110-01), 0,25 Einheiten/ml Oligo-dT (Pharmacia, Katalog-Nr. 27-7858-01), 0,05% NP40, 50 mM Tris-HCl, pH 7,8, 0,5 μM nicht-radioaktives dTTP und 10 μCi/ml 32P-dTTP (Amersham, Katalog-Nr. PB.10167).
  • Nach der Inkubationszeit wurden 40 μl Reaktionsgemisch auf eine NA45-Membran (oder DE81-Papier) von Schleicher und Schnell (S + S), die mit 2 × SSC-Puffer (0,3 M NaCl und 0,003 M Natriumcitrat) gesättigt und in einem S + S-Minifold über einem Blatt GB003-Filterpapier (S + S) gehalten wurde, aufgetragen, wobei ein partielles Vakuum angelegt wurde. Jede Vertiefung des Minifold wurde viermal mit 200 μl 2 × SSC unter vollem Vakuum gewaschen. Die Membran wurde aus dem Minifold entnommen und zweimal mehr in einer Pyrex-Schale mit einem Überschuss von 2 × SSC gewaschen. Schließlich wurde die Membran auf absorbierendem Papier entwässert, auf ein Whatman-Nr.-3-Papier gelegt, mit Saran-Folie bedeckt und über Nacht bei –70°C einem Film exponiert.
  • 6.2. ERGEBNISSE
  • 6.2.1. PEPTIDINHIBITION DER VON INFIZIERTEN ZELLEN INDUZIERTEN SYNCYTIEN-BILDUNG
  • Beim anfänglichen Screening zur antiviralen Aktivität wurde die Befähigung von Peptiden getestet, die Syncytium-Bildung, die durch Co-Kultivierung über Nacht von nicht-infizierten Molt4-Zellen mit chronisch HIV-1-infizierten CEM-Zellen induziert wurde, zu blockieren. Die Ergebnisse von einigen derartigen Experimenten sind vorliegend dargestellt. In den ersten dieser Experimente wurden serielle Konzentrationen des DP-178-(SEQ ID: 1)Peptids zwischen 10 μg/ml und 12,5 ng/ml hinsichtlich der Blockierung des Zellfusionsprozesses getestet. Für diese Experimente wurden chronisch mit entweder HIV-1LAI-, HIV-1MN-, HIV-1RF oder HIV-1SF2-Viren infizierte CEM-Zellen über Nacht mit nicht-infizierten Molt-4-Zellen ko-kultiviert. Die Ergebnisse (4) zeigen, dass DP-178 (SEQ ID: 1) einen vollständigen Schutz gegen jedes der HIV-1-Isolate bis hinunter zur niedrigsten verwendeten Konzentration von DP-178 (SEQ ID: 1) ermöglichte. Bei der HIVLAI-Inhibition betrug die nied rigste Konzentration 12,5 ng/ml, bei allen anderen HIV-1-Viren betrug die geringste in dieser Untersuchung verwendete Konzentration von DP-178 (SEQ ID: 1) 100 ng/ml. Ein zweites Peptid, DP-180 SEQ ID: 2), das die gleichen Aminosäurereste wie DP-178 (SEQ ID: 1) enthält, die jedoch in einer zufälligen Reihenfolge angeordnet sind, zeigte keinen Hinweis auf eine antifusiogene Aktivität selbst bei einer hohen Konzentration von 40 μg/ml (4). Diese Beobachtungen zeigen, dass der inhibitorische Effekt von DP-178 (SEQ ID: 1) primärsequenzspezifisch ist und nicht mit nicht-spezifischen Peptid/Protein-Wechselwirkungen zusammenhängt. Der tatsächliche Endpunkt (d. h. die niedrigste wirksame inhibitorische Konzentration) der inhibitorischen Wirkung von DP-178 liegt im Bereich von 1–10 ng/ml.
  • Die nächste Reihe von Experimenten schloss die Herstellung und das Testen eines DP-178-(SEQ ID: 1)-Homologen hinsichtlich seiner Befähigung zur Inhibition der HIV-1-induzierten Syncytien-Bildung ein. Wie in 1 gezeigt, ist die Sequenz von DP-185 (SEQ ID: 3) leicht von DP-178 (SEQ ID: 1) dadurch verschieden, dass seine Primärsequenz dem HIV-1SF2-Isolat entnommen ist und einige Aminosäureunterschiede im Vergleich zu DP-178 (SEQ ID: 1) nahe dem N-Terminus enthält. Wie in der 4 gezeigt, entfaltet DP-185 (SEQ ID: 3) eine inhibitorische Aktivität selbst bei 312,5 ng/ml, der niedrigsten getesteten Konzentration.
  • Die nächste Reihe von Experimenten schloss einen Vergleich der inhibitorischen Aktivität von DP-178 (SEQ ID: 1) gegenüber HIV-1 und HIV-2 ein. Wie in 5 gezeigt, blockierte DP-178 (SEQ ID: 1) die HIV-1-vermittelte Syncytien-Bildung bei Peptidkonzentrationen unterhalb von 1 ng/ml. DP-178 (SEQ ID: 1) versagte jedoch bei der Blockierung der HIV-2-vermittelten Syncytien-Bildung bei Konzentrationen von bis zu 10 μg/ml. Diese bemerkenswerte Selektivität über vier Größenordnungen von DP-178 (SEQ ID: 1) als Inhibitor der HIV-1-vermittelten Zellfusion zeigt eine unerwartete HIV-1-Spezifität bei der Wirkung von DP-178 (SEQ ID: 1). DP-178 (SEQ ID: 1) inhibierte die HIV-1-vermittelte Zellfusion, jedoch die Unfähigkeit des Peptids, die HIV-2-vermittelte Zellfusion im gleichen Zelltyp bei den getesteten Konzentrationen zu inhibieren, stellt einen weiteren Beweis für den hohen Selektivitätsgrad der antiviralen Wirkung von DP-178 (SEQ ID: 1) bereit.
  • 6.2.2. PEPTIDINHIBITION DER INFEKTION DURCH ZELLFREIE VIREN
  • Als nächstes wurde DP-178 (SEQ ID: 1) hinsichtlich seiner Befähigung zur Blockierung der CD-4+-CEM-Zellinfektion durch zellfreie HIV-1-Viren getestet. Die in der 2 gezeigten Ergebnisse stammen von einem Experiment, in dem DP-178 (SEQ ID: 1) hinsichtlich seiner Befähigung getestet wurde, die Infektion von CEM-Zellen durch ein HIV-1LAI-Isolat zu blockieren. Das Experiment schloss drei Kontrollpeptide, DP-116 (SEQ ID: 9), DP-125 (SEQ ID: 8) und DP-118 (SEQ ID: 10), ein. DP-116 (SEQ ID: 9) stellt ein Peptid dar, von dem zuvor gezeigt wurde, dass es unter Verwendung dieses Tests inaktiv ist, und DP-125 (SEQ ID: 8; Wild, C. et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 10,537) und DP-118 (SEQ ID: 10) sind Peptide, von denen zuvor gezeigt wurde, dass sie in diesem Test aktiv sind. Jede Peptidkonzentration (0, 0,04, 0,4, 4 und 40 μg/ml) wurde mit 247 TCID50-Einheiten des HIV-1LAI-Virus und CEM-Zellen inkubiert. Nach 7 Tagen Kultur wurde der zellfreie Überstand hinsichtlich des Vorhandenseins einer RT-Aktivität als Maß für eine erfolgreiche Infektion getestet. Die in der 2 gezeigten Ergebnisse zeigen, dass DP-178 (SEQ ID: 1) den vom viralen HIV-1-Isolat vermittelten De-novo-Infektionsprozess bei Konzentrationen von bis hinunter zu 90 ng/ml (IC50 = 90 ng/ml) inhibierte. Im Gegensatz dazu wiesen die zwei Positivkontrollpeptide, DP-125 (SEQ ID: 8) und DP-118 (SEQ ID: 10) mit ungefähr 5 μg/ml mehr als 60fach höhere IC50-Konzentrationen auf.
  • In einem getrennten Experiment wurde die inhibitorische Wirkung von DP-178 (SEQ ID: 1) gegenüber HIV-1 und HIV-2 mit CEM-Zellen und entweder HIV-1LAI oder HIV-2NIHZ getestet. Es wurden in diesen Experimenten 62 TCID50 von HIV-1LAI oder 25 GCID50 von HIV-2NIHZ verwendet und diese wurden für 7 Tage inkubiert. Wie man der 3 entnehmen kann, inhibierte DP-178 (SEQ ID: 1) die HIV-1-Infektion mit einer IC50 von etwa 31 ng/ml. Im Gegensatz dazu zeigte DP-178 (SEQ ID: 1) eine viel höhere IC50 bei HIV-2NIHZ was DP-178 (SEQ ID: 1) einen um zwei Größenordnungen wirksamen HIV-1-Inhibitor als einen HIV-2-Inhibitor werden lässt. Diese Erkenntnis ist mit den Ergebnissen der vorstehend im Abschnitt 6.2.1 beschriebenen Fusionsinhibitionstests konsistent und unterstützt weiter einen deutlichen Selektivitätsgrad (d.h. für HIV-1 gegenüber HIV-2).
  • 7. BEISPIEL: DER HIV-1-INHIBITOR DP-178 (SEQ ID: 1) IST NICHT TOXISCH
  • In diesem Beispiel wird gezeigt, dass der 36 Aminosäuren umfassende synthetische Peptidinhibitor DP-178 (SEQ ID: 1) gegenüber Zellen in Kultur selbst bei den höchsten getesteten Peptidkonzentrationen (40 μg/ml) nicht zytotoxisch ist.
  • 7.1. MATERIALIEN UND METHODEN
  • Zellproliferations- und Toxizitäts-Tests:
  • Ungefähr 3,8 × 105 CEM-Zellen für jede Peptidkonzentration wurden für 3 Tage bei 37°C in T25-Kolben inkubiert. Die getesteten Peptide waren DP-178 (SEQ ID: 1) und DP-116 (SEQ ID: 9), wie in 1 beschrieben. Die verwendeten Konzentrationen jedes Peptids waren 0, 2,5, 10 und 40 μg/ml. Es wurden Zellzählungen nach Inkubationszeiten von 0, 24, 48 und 72 Stunden vorgenommen.
  • 7.2. ERGEBNISSE
  • Ob der wirksame HIV-1-Inhibitor DP-178 (SEQ ID: 1) irgendwelche zytotoxischen Wirkungen entfaltete, wurde durch Testen der Auswirkungen des Peptids auf die Proliferation und Lebensfähigkeit von Zellen in Kultur beurteilt. CEM-Zellen wurden in Gegenwart veränderlicher Konzentrationen von DP-178 (SEQ ID: 1) und DP-116 (SEQ ID: 9), einem Peptid, von dem zuvor gezeigt wurde, dass es als HIV-Inhibitor unwirksam ist (Wild, C. et al., 1992, Proc, Natl. Acad. Sci. USA 89: 10,537–10,541), inkubiert. Zusätzlich wurden die Zellen in Abwesenheit jedes der Peptide inkubiert.
  • Die Ergebnisse der Zytotoxizitätsuntersuchungen zeigen, dass P-178 (SEQ ID: 1) keine zytotoxischen Wirkungen auf Zellen in Kultur entfaltet. Wie nachstehend in der Tabelle XXIV zu sehen ist, unterscheiden sich selbst die Proliferations- und Lebensfähigkeitseigenschaften von Zellen, die für 3 Tage in Gegenwart der höchsten getesteten Konzentration von DP-178 (SEQ ID: 1) (40 μg/ml) nicht signifikant von denjenigen der DP-116-(SEQ ID: 9) oder der Kontrollen ohne Peptid. Die Zellproliferationsdaten sind ebenfalls in graphischer Form in 6 dargestellt. Wie in dem im vorstehenden Abschnitt 6 dargestellten Arbeitsbeispiel gezeigt wurde, inhibiert DP-178 (SEQ ID: 1) vollständig die HIV-1-vermittelte Syncytien-Bildung bei Peptidkonzentrationen zwischen 1 und 10 ng/ml und inhibiert vollständig die zellfreie Virusinfektion bei Konzentrationen von mindestens 90 ng/ml. Somit zeigt diese Untersuchung, dass selbst bei Peptidkonzentrationen, die um 3 Größenordnungen höher sind als die gegenüber HIV inhibitorische Dosis sind, DP-178 (SEQ ID: 1) keine zytotoxischen Wirkungen entfaltet.
  • TABELLE XXIV
    Figure 03640001
  • 8. BEISPIEL: DIE WECHSELWIRKUNG ZWISCHEN DP178 UND DP107
  • Lösliche rekombinante Formen von gp41, die in dem nachstehend beschriebenen Beispiel verwendet werden, zeigen, dass das DP178-Peptid mit einer entfernten Stelle von gp41 assoziiert, deren wechselwirkende Struktur durch das Leucin-Zipper-Motiv von DP107 beeinflusst wird. Eine einzige Mutation, welche die Coiled-Coil-Struktur der Leucin-Zipper-Domäne zerstört, transformierte das lösliche rekombinante gp41-Protein von einem inaktiven zu einem aktiven Inhibitor der HIV-1-Fusion. Diese Transformation kann aus einer Freisetzung der wirksamen DP178-Domäne aus einer molekularen Klammer mit der Leucin-Zipper-Determinante DP107 resultieren. Die Ergebnisse deuten ebenfalls darauf hin, dass die Anti-HIV-Aktivität verschiedener gp41-Derivate (Peptide und rekombinante Proteine) auf ihre Befähigung zurückzuführen sind, Komplexe mit viralem gp41 zu bilden und seinen fusiogenen Prozess zu stören.
  • 8.1. MATERIALIEN UND METHODEN
  • 8.1.1. KONSTRUKTION VON FUSIONSPROTEINEN UND GP41-MUTANTEN
  • Die Konstruktion der in 7 gezeigten Fusionsproteine und Mutanten wurde wie folgt durchgeführt: Die der extrazellulären Domäne von gp41 (540–686) entsprechende DNA-Sequenz wurde in die Xmn I-Stelle des Expressionsvektors pMal-p2 (New England Biolab) kloniert, um M41 zu ergeben. Die gp41-Sequenz wurde, ausgehend von pgtat (Malin et al., 1988, Nature 355: 181–183) unter Verwendung der Polymerasekettenreaktion (PCR) mit dem Stromaufwärts-Primer 5'-ATGACGCTGACGGTACAGGCC-3' (Primer A) und dem Stromabwärts-Primer 5'-TGACTAAGCTTAATACCACAGCCAATTTGTTAT-3' (Primer B) amplifiziet. M41-P wurde unter Verwendung des T7-Gen-in-vitro-Mutagenese-Kits von United States Biochemicals (USB) nach den Angaben des Herstellers konstruiert. Der Mutagenese-Primer (5'-GGAGCTGCTTGGGGCCCCAGAC-3') führt eine Mutation von Ile zu Pro in M41 in der Position 578 ein. M41Δ107 wurde unter Verwendung eines Deletionsmutagenese-Primers 5'-CCAAATCCCCAGGAGCTGCTCGAGCTGCACTATACCAGAC-3' (Primer C) gemäß dem T7-Gen-Mutageneseprotokoll von USB hergestellt. M41Δ178 wurde durch Klonierung des den Aminosäuren 540–642 von gp41 entsprechenden DNA-Fragments in die Xmn I-Stelle von pMal-p2 hergestellt. Die Primer A und 5'-ATAGCTTCTAGATTAATTGTTAATTTCTCTGTCCC-3' (Primer D) wurden in der PCR mit der Matrize pgtat verwendet, um die eingefügten DNA-Fragmente zu erzeugen. M41-P wurde als Matrize mit den Primern A und D in einer PCR verwendet, um M41-PΔ178 zu erzeugen. Alle eingefügten Sequenzen und mutierten Reste wurden durch Restriktionsenzymanalyse kontrolliert und durch DNA-Sequenzierung bestätigt.
  • 8.1.2. REINIGUNG UND CHARAKTERISIERUNG VON FUSIONSPROTEINEN
  • Die Fusionsproteine wurden gemäß dem Protokoll, das in der Broschüre des Herstellers des Proteinfusions- und -reinigungssystems von New England Biolabs (NEB) beschrieben ist, gereinigt. Fusionsproteine (10 ng) wurden durch Elektrophorese auf 8% SDS-Polyacrylamid-Gelen analysiert. Die Western-Blot-Analyse wurde, wie von Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Aufl., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, Kapitel 18, Seiten 64–75, beschrieben, durchgeführt. Ein 1000fach verdünntes HIV-1-positives Serum oder ein humanes Fab, das durch eine Vorratsklonierung bzw. Repertoire-Klonierung erzeugt wurde, wurde zur Reaktion mit dem Fusionsprotein verwendet. Der zweite Antikörper war HRP-konjugiertes Ziege-Anti-Mensch-Fab. Es wurde ein ECL-Western-Blot-Detektionssystem (Amersham) verwendet, um den gebundenen Antikörper zu detektieren. Ein detailliertes Protokoll für dieses Detektionssystem wurde vom Hersteller bereitgestellt. Rainbow-Molekulargewichtsmarker (Amersham) wurden verwendet, um die Größe der Fusionsproteine abzuschätzen.
  • 8.1.3. ZELLFUSIONSTESTS ZUR ANTI-HIV-AKTIVITÄT
  • Zellfusionstests wurden wie zuvor beschrieben (Matthews et al., 1987, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 5424–5481) durchgeführt. CEM-Zellen (7 × 104) wurden mit chronisch mit HIV-1Mn-infizierten CEM-Zellen (104) in Halbbereichsplatten mit 96 Vertiefungen mit flachem Boden (Costar) in 100 μl Kulturmedium inkubiert. Peptid und Fusionsproteine wurden bei unterschiedlichen Konzentrationen in 10 μl Kulturmedium mit Zellgemischen bei 37°C für 24 Stunden inkubiert. Multinukleäre Syncytien wurden durch mikroskopische Untersuchung beurteilt. Sowohl M41 als auch M41-P zeigten keine Zytotoxizität bei den getesteten und in 8 gezeigten Konzentrationen.
  • Die Inhibition der HIV-1-induzierten Zell-Zell-Fusionsaktivität wurden in Gegenwart von 10 nM DP178 und verschiedenen Konzentrationen von M41Δ178 oder M41-PΔ178, wie in 9 angegeben, durchgeführt. Es lagen keine beobachtbaren Syncytien in Gegenwart von 10 nM DP178 vor. In den Kontrollproben wurde kein Peptid oder Fusionsprotein zugegeben.
  • 8.1.4. ELISA-ANALYSE DER DP178-BINDUNG AN DAS LEUCIN-ZIPPERMOTIV VON GP41
  • Die verwendete Aminosäuresequenz von DP178 ist: YTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWASLWNWF. Für den Enzymverknüpften Immuntest (ELISA) wurde M41Δ178 oder M41-PΔ178 (5 μg/ml) in 0,1 M NaHCO3, pH 8,6, auf Linbro-ELISA-Platten mit 96 Vertiefungen (Flow Lab, Inc.) über Nacht beschichtet. Jede Vertiefung wurde dreimal mit destilliertem Wasser gewaschen, dann mit 3% Rinderserumalbumin (BSA) für 2 Stunden blockiert. Nach dem Blockieren wurden Peptide mit 0,5% BSA in TBST (40 mM Tris-HCl, pH 7,5, 150 mM NaCl, 0,05% Tween 20) zu den ELISA-Platten gegeben und bei Raumtemperatur für 1 Stunde inkubiert. Nach dem dreimaligen Waschen mit TBST wurde Fab-d bei einer Konzentration von 10 ng/ml mit 0,1% BSA in TBST zugegeben. Die Platten wurden dreimal mit TBST nach Inkubation bei Raumtemperatur für 1 Stunde gewaschen. Mit Meerrettich-Peroxidase (HRP) konjugiertes Ziege-Anti-Mensch-Fab-Antiserum bei 2000facher Verdünnung in TBST mit 0,5% BSA wurde in jede Vertiefung gegeben und bei Raumtemperatur für 45 Minuten inkubiert. Die Platten wurden dann viermal mit TBST gewaschen. Das Peroxidase-Substrat o-Phenylendiamin (2,5 mg/ml) und 0,15 H2O2 wurden zur Entwicklung der Farbe zugegeben. Die Reaktion wurde mit einem gleichen Volumen von 4,5 N H2SO4 nach Inkubation bei Raumtemperatur für 10 Minuten gestoppt. Die optische Dichte des gestoppten Reaktionsgemischs wurde mit einem Mikro platten-Lesegerät (Molecular Design) bei 490 nm gemessen. Die Ergebnisse sind in 10 gezeigt.
  • 8.2. ERGEBNISSE
  • 8.2.1. DIE EXPRESSION UND CHARAKTERISIERUNG DER EKTODOMÄNE VON GP41
  • Als ein Schritt zum Verständnis der Rollen der zwei helikalen Regionen in der gp41-Struktur und deren Funktion wurde die Ektodomäne von gp41 als Maltosebindungs-Fusionsprotein (M41) exprimiert (7). Die fusiogene Peptidsequenz am N-Terminus von gp41 wurde bei diesem rekombinanten Protein und seinen Derivaten weggelassen, um die Löslichkeit zu verbessern. Das Maltosebindungsprotein erleichterte die Reinigung der Fusionsproteine unter vergleichsweise milden, nicht-denaturierenden Bedingungen. Da das lösliche rekombinante gp41 M41 nicht glycosyliert war, ihm einige Regionen des Transmembranproteins fehlten (d.h. das Fusionspeptid, die Transmembran- und die zytoplasmatischen Domänen) und es in Abwesenheit von gp120 exprimiert wurde, wurde nicht erwartet, dass es genau die Struktur des nativen gp41 bei HIV-1-Viren widerspiegelt. Ungeachtet dessen faltete sich gereinigtes M41 in einer Weise, die bestimmte diskontinuierliche Epitope bewahrte, was durch die Reaktivität mit humanen monoklonalen Antikörpern, 98-6, 126-6 und 50–69 belegt wurde, von denen zuvor gezeigt wurde, das sie an konformationelle Epitope in nativen gp41, das in eukaryontischen Zellen exprimiert wurde, binden (Xu et al., 1991, J. Virol. 65: 4832–4838; Chen, 1994, J. Virol. 68: 2002–2010). Somit scheinen mindestens gewisse, durch diese Antikörperkörper definierte Regionen des nativen gp41 im rekombinanten Fusionsprotein M41 wiedergegeben zu sein. Des Weiteren reagierte M41 mit einem humanen rekombinanten Fab (Fab-d), das ein konformationelles Epitop in gp41 erkennt und an HIV-1-Viren sowie an HIV-1-infizierte Zellen, nicht aber an nicht-infizierte Zellen, wie es durch FACS analysiert wurde, bindet. Die Deletion jeweils eines der Helix-Motive, d.h. DP107 oder DP178, des M41-Fusionsproteins eliminierte die Reaktivität mit Fab-d. Diese Ergebnisse deuten an, dass beide helikalen Regionen, die durch 60 Aminosäuren in der Primärsequenz voneinander getrennt sind, erforderlich sind, um das Fab-d-Epitop zu erhalten.
  • 8.2.2. ANTI-HIV-AKTIVITÄT DER REKOMBINANTEN EKTODOMÄNE VON GP41
  • Das Wild-Typ-M41-Fusionsprotein wurde hinsichtlich einer Anti-HIV-1-Aktivität getestet. Wie vorstehend dargelegt, zeigen synthetische Peptide, die dem Leucin-Zipper (DP107) und der C-terminalen vermuteten Helix (DP178) entsprechen, eine wirksame Anti-HIV-Aktivität. Trotz Einbeziehung beider dieser Regionen beeinflusste das rekombinante M41-Protein die HIV-1-induzierte Membranfusion bei Konzentrationen von bis zu 50 μM nicht (nachstehende Tabelle XXV). Tabelle XXV ZERSTÖRUNG DES LEUCIN-ZIPPERS VON GP41 BEFREIT DAS ANTI-HIV-MOTIV
    Figure 03690001
    • 1 Die Affinitätskonstanten der Fab-d-Bindung an die Fusionsproteine wurden unter Verwendung des von B. Friguet et al., 1985, J. Immunol. Method. 77: 305–319, beschriebenen Protokolls bestimmt.
    –
    = Keine detektierbare Bindung von Fab-d an die Fusionsproteine
  • Antivirale Infektiositätstests. 20 μl seriell verdünnte Virusstammlösung wurden für 60 Minuten bei Umgebungstemperatur mit 20 μl der angezeigten Konzentration von gereinigtem rekombinantem Fusionsprotein in RPMI 1640, enthaltend 10% fötales Kälberserum und Antibiotika, in einer Mikrotiterplatte mit 96 Vertiefungen inkubiert. 20 μl CEM4-Zellen bei 6 × 105 Zellen/ml wurden in jede Vertiefung gegeben, und die Kulturen wurden bei 37°C in einem befeuchteten CO2-Inkubator inkubiert. Die Zellen wurden für 9 Tage unter Zugabe von frischem Medium alle 2 bis 30 Tage kultiviert. An den Tagen 5, 7 und 9 nach der Infektion wurden Überstandsproben hinsichtlich einer Reverse-Transkriptase(RT)-Aktivität, wie nachstehend beschrieben, getestet, um die virale Replikation zu überwachen. Die 50%ige infektiöse Dosis in der Gewebekultur (TCID50) wurde für jede Bedingung gemäß der Formel von Reed & Muench, 1937, Am. J. Hyg. 27: 493–497, berechnet. Die RT-Aktivität wurde durch eine Modifikation der veröffentlichten Verfahren von Goff et al., 1981, J. Virol. 38: 239–248 und Willey et al., 1988, J. Virol. 62: 139–147, wie in Chen et al., 1993, AIDS Res. Human Retroviruses 9: 1079–1086 beschrieben, bestimmt.
  • Überraschenderweise ergab eine einzelne Aminosäuresubstitution, Prolin anstatt von Isoleucin in der Mitte des Leucin-Zipper-Motivs, ein Fusionsprotein (M41-P), das eine antivirale Aktivität entfaltete (Tabelle XII und 8). Wie in der Tabelle XII zu sehen ist, blockierte M41-P die Syncytien-Bildung um 90% bei ungefähr 85 nM und neutralisierte die HIV-1IIIB-Infektion um 90% bei Konzentrationen von ungefähr 70 nM. Die Anti-HIV-1-Aktivität von M41-P schien durch die C-terminale helikale Sequenz vermittelt zu werden, da die Deletion dieser Region aus M41-P ein inaktives Fusionsprotein, M41-PΔ178 (Tabelle XII) ergab. Diese Interpretation wurde durch Experimente unterstützt, die zeigen, dass ein verkürztes Fusionsprotein, M41Δ178, dem die DP178-Sequenz fehlt, die wirksame Anti-Fusionsaktivität des DP178-Peptids in einer konzentrationsabhängigen Weise aufhob (9). Das gleiche verkürzte Fusionsprotein, M41-PΔ178, das die Prolin-Mutation enthält, welche den Leucin-Zipper zerstört, war in ähnlichen Kompetitionsexperimenten inaktiv (9). Die Ergebnisse deuten an, dass das DP178-Peptid mit einer zweiten Stelle in gp41 assoziiert, de ren wechselwirkende Struktur von einer Wildtyp-Leucin-Zipper-Sequenz abhängt. Eine ähnliche Wechselwirkung kann innerhalb des Wildtyp-Fusionsproteins, M41, auftreten und bewirken, dass sich eine intramolekulare Klammer bildet, welche die DP178-Region sequestriert, was sie für eine antivirale Aktivität nicht verfügbar werden lässt.
  • Eine spezifische Assoziierung zwischen diesen zwei Domänen wird ebenfalls durch andere Studien mit humanem monoklonalem Fab-d angedeutet. Beispielsweise bindet Fab-d weder das DP178-Peptid noch das Fusionsprotein M41Δ178, jedoch wurde sein Epitop einfach durch Zusammenmischen dieser zwei Reagenzien wiederhergestellt (10). Wiederum versagte die Prolin-Mutation in der Leucin-Zipper-Domäne des Fusionsproteins, M41-PΔ178, bei der Wiederherstellung des Epitops in ähnlichen Mischungsexperimenten.
  • 9. BEISPIEL: VERFAHREN ZUR COMPUTER-GESTÜTZTEN IDENTIFIZIERUNG DP-107-ÄHNLICHER UNDDP-178-ÄHNLICHER SEQUENZEN
  • Es ist eine Anzahl bekannter Coiled-Coil-Sequenzen ausführlich in der Literatur beschrieben worden, und diese enthalten Siebener-Wiederholungspositionierungen für jede Aminosäure. Die Coiled-Coil-Nomenklatur bezeichnet jede der sieben Aminosäuren einer Siebener-Wiederholung mit A bis G, wobei die Aminosäuren A und D dazu tendieren, hydrophobe Positionen zu sein. Die Aminosäuren E und G tendieren dazu, geladen zu sein. Diese vier Positionen (A, D, E und G) bilden die amphipathische Rückgrat-Struktur einer monomeren alpha-Helix. Die Rückgrate von zwei oder mehr amphipathischen Helices Wechselwirken miteinander zur Bildung von di-, tri-, tetrameren usw. Coiled-Coil-Strukturen. Um mit dem Design von Computersuchmotiven zu beginnen, wurde eine Reihe gut charakterisierter Coiled-Coils, einschließlich dem Hefetranskriptionsfaktor GCN4, der Schleife 36 des Influenza-Virus-Hämagglutinins und der humanen Protoon kogene c-Myc, c-Fos und c-Jun, ausgewählt. Für jede Peptidsequenz wurde eine strenge Homologie in den A- und D-Positionen und eine Liste der Aminosäuren, die in den Positionen B, C, E, F und G ausgeschlossen werden konnten (da sie in diesen Positionen nicht vorkommen) bestimmt. Die Motive wurden auf die DP-107- und DP-178-Sequenzen durch Ableitung der wahrscheinlichsten Möglichkeiten der Siebener-Positionierung der Aminosäuren von HIV-1 Bru DP-107, von dem es bekannt ist, dass es eine Coiled-Coil-Struktur aufweist, und HIV-1 Bru DP-178, das immer noch nicht strukturell definiert ist, maßgeschneidert. Die Analyse von jeder der Sequenzen ist in der 12 enthalten. Beispielsweise wurde das Motiv für GCN4 wie folgt entworfen:
    • 1. Die einzigen Aminosäuren (unter Verwendung des Standard-Ein-Buchstaben-Aminosäurecodes), die in den A- oder D-Positionen von GCN4 gefunden wurden, waren [LMNV].
    • 2. Es wurden alle Aminosäuren in den Positionen B, C, E, F und G außer {CFGIMPTW} gefunden.
    • 3. Das PESEARCH-Motiv würde daher wie folgt geschrieben:
      Figure 03720001
  • Das Motiv übersetzt oder liest sich: „In der ersten Position A muss eines von L, M, N oder V auftreten, in den Positionen B und C (die nächsten zwei Positionen) wird alles außer C, F, G, I, M, P, T oder W akzeptiert, in der Position D muss eines von L, M, N oder V auftreten, in den Positionen E, F und G (die nächsten drei Positionen) wird alles außer C, F, G, I, M, P, T oder W akzeptiert." Diese Anweisung ist viermal in einem 28-mer-Motiv und fünfmal in einem 35-mer-Motiv enthalten. Der Basismotivschlüssel wäre dann: [LMNV]-{CFGIMPTW}. Die Motivschlüssel für die restlichen gut beschriebenen Coiled-Coil-Sequenzen sind in der 12 zusammengefasst.
  • Das Motiv-Design für DP-107 und DP-178 war etwas von den vorstehenden 28-meren Modellsequenzen verschieden, was auf die Tatsache zurückzuführen ist, dass die Siebener-Wiederholungspositionen nicht definiert sind und die Peptide beide länger als 28 Reste sind. Die 13 veranschaulicht einige mögliche Sequenzgegenüberstellungen sowohl für DP-107 als auch DP-178 und enthält ebenfalls Motiv-Gestaltungen, die auf 28–mer-, 35mer- und vollständigen Peptiden basieren. Es wird darauf hingewiesen, dass nur leichte Unterschiede in den Motiven auftreten, wenn die Peptide verlängert werden. Im Allgemeinen resultiert die Verlängerung des Basispeptids in einem weniger stringenten Motiv. Dies ist bei der Verbreiterung der Möglichkeiten zur Identifizierung von DP-107- oder DP-178-ähnlichen primären Aminosäuresequenzen, die in dieser Druckschrift als „Treffer" bezeichnet werden, sehr von Nutzen.
  • Zusätzlich zur Erzeugung hoch spezifischer Motive für jeden zu suchenden Peptidsequenztyp ist es ebenfalls möglich, „Hybrid"-Motive zu erzeugen. Diese Motive werden durch „Kreuzen" von zwei oder mehreren sehr stringenten Motiven hergestellt, um einen neuen Suchalgorithmus zu erzeugen, der nicht nur beide „Eltern"-Motivsequenzen findet, sondern auch beliebige Peptidsequenzen, die Ähnlichkeiten zu einem, dem anderen oder beiden „Eltern" aufweisen. Beispielsweise wird in Tabelle 3 die „Eltern"-Sequenz von GCN4 mit jedem der möglichen „Eltern"-Motive von DP-107 gekreuzt. Nunmehr muss das Hybridmotiv alle der in den A- und D-Positionen beider Eltern zu findenden Aminosäuren enthalten und alle diejenigen Aminosäuren ausschließen, die in keinem Elternteil in den anderen Positionen auftreten. Das aus der Kreuzung von GCN4 oder [LMNV] {CFGIMPTW} und DP-107 (28-mer mit dem ersten L in der D-Position) oder [ILQT]{CDFIMPST} resultierende Hybrid ist [ILMNQTV]{CFIMPT}. Es wird darauf hingewiesen, dass nunmehr nur zwei Basishybridmotive existieren, die beide Rastermöglichkeiten sowie alle Peptidlängen des DP-107-Elternmoleküls abdecken. Die 15 stellt die Hybridisierungen von GCN4 mit DP-178 dar. Die 16 stellt die Hybridisierungen von DP-107 und DP-178 dar. Es ist wichtig, daran zu denken, dass die dargestellten sowohl Eltern- als auch Hybridmotive Motivschlüssel sind und keine Darstellung der zur tatsächlichen Durchführung der Computersuche erforderlichen vollständigen Motive.
  • Hybridisierungen können mit jeder beliebigen Kombination von zwei oder mehr Motiven durchgeführt werden. Die Tabelle 5 fasst einige Hybridisierungen mit drei Motiven, einschließlich GCN4, DP-107 (beide Raster) und DP-178 (ebenfalls beide Raster), zusammen. Es wird darauf hingewiesen, dass die resultierenden Motive nun sehr viel ähnlicher zueinander werden. Tatsächlich sind die ersten und dritten Hybridmotive tatsächlich Teilmengen der zweiten bzw. vierten Hybridmotive. Dies bedeutet, dass die ersten und dritten Hybridmotive leicht stringenter sind als die zweiten und vierten. Es ist ebenfalls darauf hinzuweisen, dass mit nur geringen Veränderungen in diesen vier Motiven oder durch deren Hybridisierung ein einzelnes Motiv erhalten werden könnte, das alle diese Sequenzen finden würde. Es wird jedoch daran erinnert, dass die Stringenz ebenfalls reduziert ist. Schließlich ist das Hybridmotiv mit dem breitesten Spektrum und der geringsten Stringenz in 18 beschrieben, welche die Hybridisierung von GCN4, DP-107 (beide Raster), DP-178 (beide Raster), c-Fos, c-Jun, c-Myc und Flu Loop 36 zusammenfasst.
  • Es wurde ein spezieller Satz von Motiven auf Basis der Tatsache erzeugt, dass sich DP-178 nur ungefähr 10 Aminosäuren stromaufwärts der Transmembranregion von gp41 und direkt C-terminal von einem Prolin, das DP-107 und DP-178 trennt, befindet. Es wurde postuliert, dass DP-178 eine amphipathische Helix ist, wenn es Membran-assoziiert ist, und dass das Prolin die Initiation der Helix-Bildung unterstützt. Die gleiche An ordnung wurde im Respiratory-Syncytial-Virus beobachtet. Jedoch wies die DP-178-ähnliche Region in diesem Virus einen Leucin-Zipper unmittelbar C-terminal zum Prolin auf. Daher wurden designte Leucin-Zipper-Motive mit N-terminalem Prolin erzeugt, um zu analysieren, ob möglicherweise beliebige andere Viren das gleiche Muster enthalten. Die Motive sind in 19 zusammengefasst.
  • Die PC/Gene-Proteindatenbank enthält 5879 virale Aminosäuresequenzen (Bibliotheksdatei PVIRUSES; CD-ROM Ausgabe 11.0), Von diesen sind 1092 virale Hüll- oder Glycoproteinsequenzen (Bibliotheksdatei PVIRUSE1). Die Tabellen V bis X enthalten Listen von Proteinsequenznamen und Motivtrefferlokalisierungen für die gesamten gesuchten Motive.
  • 10. BEISPIEL: COMPUTER-GESTÜTZTE IDENTIFIZIERUNG VON DP-107- UND DP-178-ÄHNLICHEN SEQUENZEN IM HUMANEN IMMUNDEFIZIENZVIRUS
  • Die 20 stellt Suchergebnisse für das gp41 des HIV-1-BRU-Isolat dar (PC/Gene-Proteinsequenz PENV HV1BR). Man sieht, dass das Hybridmotiv, das DP-107 mit DP-178 kreuzt (107 × 178 × 4 genannt; das gleiche Motiv wie in 16) drei Treffer fand, welche die Aminosäuren 550–599, 636–688 und 796–823 einschließen. Diese drei Bereiche schließen DP-107 plus acht N-terminale und vier C-terminale Aminosäuren, DP-178 plus sieben N-terminale und zehn C-terminale Aminosäuren und einen Bereich innerhalb der Transmembranregion (zytoplasmatisch) ein. 20 enthält ebenfalls die Resultate, die aus einer Suche mit dem ALLMOTI5 genannten Motiv erhalten wurden, dessen Schlüssel in der 17 zu finden ist ({CDGHP}{CFP} × 5). Dieses Motiv fand ebenfalls drei Treffer, die DP-107 (Aminosäuren 510–599), DP-178 (615–717) und eine zytoplasmatische Region (772–841) einschließen. Diese Treffer überlappen mit den durch das Motiv 107 × 178 × 4 gefundenen Treffern, mit beträchtlichen zusätzlichen Sequenzen sowohl an den Amino- als auch den Carboxyl-Termini.
  • Dies ist nicht überraschend, da 107 × 178 × 4 eine Untermenge des ALLMOTI5-Hybridmotivs ist. Bedeutsamerweise, obgleich die Stringenz von ALLMOTI5 beträchtlich geringer ist als die von 107 × 178 × 4, identifiziert es dennoch selektiv die DP-107- und DP-178-Regionen von gp41, von denen gezeigt wurde, dass sie Sequenzen für inhibitorische Peptide von HIV-1 enthalten. Die Ergebnisse dieser zwei Motivsuchen sind in der Tabelle V unter dem PC/Gene-Proteinsequenznamen PENV HV1BR zusammengefasst. Die Prolin-Leucin-Zipper-Motive ergaben ebenfalls einige Treffer in HIV-1 BRU, einschließlich 503–525, die sich ganz am C-Terminus von gp120, direkt stromaufwärts von der Spaltstelle (P7LZIPC und P12LZIPC), befinden, und 735–768 in der zytoplasmatischen Domäne von gp41 (P23LZIPC). Diese Ergebnisse sind in den Tabellen VIII, IX und X unter den gleichen, wie vorstehend genannten Sequenznamen zu finden. Man beachte, dass der einzige Bereich von HIV-1 BRU, von dem vom Lupas-Algorithmus vorausgesagt wird, dass er eine Coiled-Coil-Region enthält, von Aminosäure 635–670 liegt. Dieser beginnt acht Aminosäuren N-terminal vom Start und endet acht Aminosäuren N-terminal vom Ende von DP-178. Obwohl bekannt ist, dass es ein Coiled-Coil ist, wird unter Verwendung des Lupas-Verfahrens nicht vorausgesagt, dass DP-107 eine Coiled-Coil-Region enthält.
  • 11. BEISPIEL: COMPUTER-GESTÜTZTE IDENTIFIZIERUNG VON DP-107- UND DP-178-ÄHNLICHEN SEQUENZEN IM HUMANEN RESPIRATORY-SYNCYTIAL-VIRUS
  • Die 21 stellt Suchergebnisse für das Fusionsglycoprotein F1 (PC/Gene-Proteinsequenzname PVGLF_HRSVA) des Respiratory-Syncytial-Virus (RSV; Stamm A2) dar. Das Motiv 107 × 178 × 4 findet drei Treffer, welche die Aminosäuren 152–202, 213–243 und 488–515 einschließen. Die Anordnung dieser drei Treffer ist ähnlich zu derjenigen, die in HIV-1 gefunden wird, außer, dass das Motiv zwei Regionen mit Ähnlichkeit zu DP-178, eine unmittelbar stromabwärts von dem, was mit DP-107-Region, oder Aminosäuren 213–243, und eine unmittelbar stromaufwärts der Transmembranregion (ebenfalls ähnlich zu DP-178) oder Aminosäuren 488–515, findet. Das Motiv ALLMOTI5 findet ebenfalls drei Bereiche, welche die Aminosäuren 116–202, 267–302 und 506–549 einschließen. Die Prolin-Leucin-Zipper-Motive ergaben ebenfalls einige Treffer, einschließlich Aminosäuren 205–221 und 265–287 (P1LZIPC 265–280, P12LZIPC) und 484–513 (P7LZIPC und P12LZIPC 484–506, P23LZIPC). Man beachte, dass die PLZIP-Motive ebenfalls Regionen identifizieren, die Lokalisierungsähnlichkeiten zu DP-178 von HIV-1 aufweisen.
  • 12. BEISPIEL: COMPUTER-GESTÜTZTE IDENTIFIZIERUNG VON DP-107- UND DP-178-ÄHNLICHEN SEQUENZEN IM AFFEN-IMMUNDEFIZIENZVIRUS
  • Motivtreffer für gp41 des Affen-Immundefizienz-Virus (AGM3-Isolat; PC/Gene-Proteinsequenzname PENV_SIVAG) sind in 22 gezeigt. Das Motiv 107 × 178 × 4 findet drei Treffer, welche die Aminosäuren 566–593, 597–624 und 703–730 einschließen. Die ersten zwei Treffer weisen nur drei Aminosäuren zwischen ihnen auf und können wahrscheinlich zu einem Treffer von 566–624 vereint werden, der einen DP-107-ähnlichen Treffer darstellen würde. Die Aminosäuren 703 bis 730 würden dann einen DP-178-ähnlichen Treffer darstellen. ALLMOTI5 findet ebenfalls drei Treffer, welche die Aminosäuren 556–628 (DP-107-ähnlich), 651–699 (DP-178-ähnlich) und 808–852, das die Transmembranregion darstellt, einschließen. SIV weist ebenfalls eine Region von 655–692 mit einer Tendenz zur Bildung eines Coiled-Coil nach der Voraussage des Lupas-Algorithmus auf. Sowohl das 107 × 178 × 4- als auch das ALLMOTI5-Motiv findet die gleiche Region. SIV weist keine PLZIP-Motivtreffer in gp41 auf.
  • Die Identifizierung von DP178/DP107-Analogen in einem zweiten SIV-Isolat (MN251) wird in dem nachstehend im Abschnitt 19 dargestellten Beispiel gezeigt.
  • 13. BEISPIEL: COMPUTER-GESTÜTZTE IDENTIFIZIERUNG VON DP-107- UND DP-178-ÄHNLICHEN SEQUENZEN IM KANINCHEN-DISTEMPER-VIRUS
  • Das Fusionsglycoprotein F1 des Kaninchen-Distemper-Virus (Stamm Onderstepoort) (PC/Gene-Proteinsequenzname PVGLF_CDVO) weist Regionen auf, die ähnlich zum humanen RSV sind, von denen vorausgesagt wird, dass sie DP-107-ähnlich und DP-178-ähnlich sind (23). Das Motiv 107 × 178 × 4 hebt einen Bereich unmittelbar C-terminal zum Fusionspeptid bei den Aminosäuren 252–293 hervor. Die Aminosäuren 252–286 bilden auch nach Voraussage des Lupas-Algorithmus ein Coiled-Coil. Beinahe 100 Aminosäuren C-terminal zur ersten Region befindet sich ein bei den Resten 340–367 ein DP-178-ähnlicher Bereich. ALLMOTI5 hebt drei Bereiche von Interesse hervor, einschließlich: Aminosäuren 228–297, was vollständig mit der Lupas-Vorhersage und dem DP-107-ähnlichen 107 × 178 × 4-Treffer überlappt, Reste 340–381, welche den zweiten 107 × 178 × 4-Treffer überlappen, und die Aminosäuren 568–602, die DP178-ähnlich sind, indem sie sich unmittelbar N-terminal zur Transmembranregion befinden. Sie überlappen eine weitere Region (Reste 570–602), von denen das Lupas-Verfahren vorhersagte, dass sie eine starke Tendenz zur Bildung eines Coiled-Coils aufweisen. Einige PLZIP-Motive identifizierten erfolgreich Bereiche von Interesse, einschließlich P6 und P12LZIPC, welche die Reste 336–357 bzw. 336–361 hervorheben, P1 und P12LZIPC, welche die Reste 398–414 finden, und P12 und P23LZIPC, welche die Reste 562–589 bzw. 562–592 finden.
  • 14. BEISPIEL: COMPUTER-GESTÜTZTE IDENTIFIZIERUNG VON DP-107- UND DP-178-ÄHNLICHEN SEQUENZEN IM NEWCASTLE-DISEASE-VIRUS
  • Die 24 zeigt die im Newcastle-Disease-Virus (Stamm Australia-Victoria/32; PC Gene-Proteinsequenzname PVGLF_NDVA) gefundenen Motivtreffer. Das Motiv 107 × 178 × 4 findet zwei Bereiche, einschließlich einen DP-107-ähnlichen Treffer bei den Aminosäuren 151–178 und einen DP-178-ähnlichen Treffer bei den Resten 42–512. ALLMOTI5 findet drei Bereiche, welche die Reste 117–182, 231–272 und 426–512 einschließen. Die Treffer von 426–512 schließen einen Bereich ein, von dem das Lupas-Verfahren vorhersagt, dass er eine hohe Coiled-Coil-Tendenz aufweist (460–503). Die PLZIP-Motive identifizieren nur eine Region von Interesse bei den Aminosäuren 273–289 (P1 und 12LZIPC).
  • 15. BEISPIEL: COMPUTER-GESTÜTZTE IDENTIFIZIERUNG VON DP-107- UND DP-178-ÄHNLICHEN SEQUENZEN IM HUMANEN PARAINFLUENZAVIRUS
  • Beide Motive 107 × 178 × 4 und ALLMOTI5 ergeben DP-107-ähnliche Treffer in der gleichen Region, 115–182 bzw. 117–182, im humanen Parainfluenza-Virus (Stamm NIH 47885; PC/Gene-Proteinsequenzname PVGLF_p13H4; 25). Zusätzlich ergeben die zwei Motive einen DP-178-ähnlichen Treffer unmittelbar leicht C-terminal bei den Aminosäuren 207–241. Beide Motive ergeben auch DP-178-ähnliche Treffer näher zur Transmembranregion, einschließlich Aminosäuren 457–497 bzw. 462–512. Einige PLZIP-Motivtreffer werden ebenfalls beobachtet, die 283–303 (P5LZIPC), 283–310 (P12LZIPC), 452–474 (P6LZIPC) und 453–481 (P23LZIPC) einschließen. Der Lupas-Algorithmus sagt voraus, dass die Aminosäuren 122–176 eine Tendenz zur Bildung eines Coiled-Coil aufweisen.
  • 16. BEISPIEL: COMPUTER-GESTÜTZTE IDENTIFIZIERUNG VON DP-107- UND DP-178-ÄHNLICHEN SEQUENZEN IM INFLUENZA-A-VIRUS
  • Die 26 stellt die Lupas-Vorhersage für ein Coiled-Coil im Influenza-A-Virus (Stamm A/Aichi/2/68) bei den Resten 379–436 sowie die Motivtreffer für 107 × 178 × 4 bei den Aminosäuren 387–453 und für ALLMOTI5 bei den Resten 380–456 dar. Es wurde von Carr und Kim gezeigt, dass die Reste 383–471 (38–125 von HA2), bei saurem pH ein gestrecktes Coiled-Coil bilden (Carr und Kim, 1993, Cell 73: 823–832). Der Lupas-Algorithmus sagt ein Coiled-Coil für die Reste 379–436 voraus. Alle drei Verfahren sagen erfolgreich die Region voraus, von der gezeigt wurde, dass sie tatsächlich eine Coiled-Coil-Struktur aufweist. Allerdings sagte ALLMOTI5 den größten Teil des Stranges von 88 Resten voraus.
  • 17. BEISPIEL: POTENTIELLE RESPIRATORY-SYNCYTIAL-VIRUS-DP178/DP107-ANALOGE: CD- UND ANTIVIRALE CHARAKTERISIERUNG
  • Im vorliegend dargestellten Beispiel wurden Peptide des Respiratory-Syncytial-Virus (RSV), die durch Verwendung der Computergestützten Suchmotive, die in den in den Abschnitten 9 und 11 dargestellten Beispiele beschrieben sind, identifiziert wurden, hinsichtlich einer Anti-RSV-Aktivität getestet. Des Weiteren wurden, wie nachstehend diskutiert, strukturelle Circular-Dichroismus(CD)-Analysen mit den Peptiden durchgeführt. Es wird gezeigt, dass einige der identifizierten Peptide wirksame antivirale Eigenschaften entfalten. Des Weiteren wird gezeigt, dass einige dieser Peptide einen deutlich helikalen Charakter aufweisen.
  • 17.1 MATERIALIEN UND METHODEN
  • Strukturelle Analysen: Die CD-Spektren wurden in einem 10 mM Natriumphosphat, 150 mM Natriumchlorid-Puffer, pH 7,0, bei Konzentrationen von ungefähr 10 mM unter Verwendung einer Zelle mit einer Weglänge von 1 cm mit einem Mobin/Yvon-Autodichrograph Mark V CD-Spektrophotometer aufgenommen. Die Peptide wurden gemäß dem vorstehend im Abschnitt 6.1 beschriebenen Verfahren synthetisiert. Die Peptidkonzentrationen wurden anhand der A280 unter Verwendung des Verfahrens nach Edlehoch (1967, Biochemistry 6: 1948) bestimmt.
  • Tests zur Anti-RSV-antiviralen Aktivität: Der vorliegend verwendete Test testete die Befähigung der Peptide zur Aufhebung der Befähigung von akut mit RSV infizierten HEp2-Zellen (d.h.
  • Zellen, die mit einer Infektionsmultiplizität von größer als 2 infiziert sind) zur Fusionierung und Hervorrufung einer Syncytien-Bildung auf einer Einzelschicht einer nicht-infizierten Linie von Hep-2-Zellen. Je geringer die beobachtete Fusionsanzahl ist, desto größer ist die bestimmte antivirale Aktivität des Peptids.
  • Nicht-infizierte konfluente Einzelschichten von Hep-2-Zellen wurden in Mikrotitervertiefungen in 3% EMEM (Eagle Minimum Essential Medium ohne L-Glutamin [Bio Whittaker Kat. Nr. 12-125F] mit [FBS, das für 30 Minuten bei 56°C hitzeinaktiviert wurde; Bio Whittaker Kat. Nr. 14-501F) ergänzt bei 3%, 1 Antibiotika (Penicillin/Streptomycin; Bio Whittaker Kat. Nr. 17-602E) und 1% Glutamin ... viert.
  • Zur Herstellung von Hep2-Zellen zur Zugabe zu nicht-infizierten Zellen, wurden Kulturen akut infizierter Hep2-Zellen mit DPBS (Dulbecco's Phophate Buffered Saline ohne Calcium oder Magnesium; Bio Whittaker Kat. Nr. 17-512F) gewaschen, und Zelleinzelschichten wurden mit Versene (1:5.000; Gibco Life Technologies Kat. Nr. 15040-017) entfernt. Die Zellen wurden für 10 Minuten zentrifugiert und in 3% FBS resuspendiert. Zellzählungen wurden unter Verwendung einer Hämacytometers durchgeführt. Zu den nicht-infizierten Hep-2-Zellen wurden persistierende Zellen gegeben.
  • Der antivirale Test wurde zunächst durch Entfernen sämtlichen Mediums aus den Vertiefungen, die nicht-infizierte Hep-2-Zellen enthalten, dann Zugeben der Peptide (bei den nachstehend beschriebenen Verdünnungen) in 3% EMEM und 100 akut mit RSV infizierten Hep2-Zellen pro Vertiefung durchgeführt. Die Vertiefungen wurden dann bei 37°C für 48 Stunden inkubiert.
  • Nach der Inkubation wurden die Zellen in Kontrollvertiefungen hinsichtlich Fusionszentren überprüft, das Medium wurde aus den Vertiefungen entfernt, gefolgt von der Zugabe von entweder Kristallviolettfärbung oder XTT zu jeder Vertiefung. Im Fall von Kristallviolett wurden ungefähr 50 μl 0,25% Kristallviolettfärbung in Methanol in jede Vertiefung gegeben. Die Vertiefungen wurden sofort zur Entfernung von überschüssigem Färbemittel gespült und dann getrocknet. Die Anzahl von Syncytien pro Vertiefung wurde dann unter Verwendung eines Seziermikroskops gezählt.
  • Im Fall von XTT (2,3-bis[2-Methoxy-4-nitro-5-sulfophenyl]-2H-tetrazolium-5-carboxyanilid, inneres Salz) wurden 50 μl XTT (1 mg/ml in RPMI, gepuffert mit 100 mM HEPES, pH 7,2–7,4, plus 5% DMSO) in jede Vertiefung gegeben. Die OD450/690 wurde gemäß Standardverfahren gemessen (nach Nullabgleich gegen Kulturmedium ohne Zellen oder Reagenzien und gegen Reagenzien).
  • Peptide: Die in der vorliegend dargestellten Untersuchung charakterisierten Peptide waren wie folgt:
    • 1) Peptide T-142 bis T-155 und T-575 gemäß 27A und Peptide T-22 bis T-27, T-68, T-334 und T-371 bis T-375 und T-575 gemäß 27B;
    • 2) Peptide T-120 bis T-141 und T-576 gemäß 27B und Peptide T-12, T-13, T-15, T-19, T-28 bis T-30, T-66, T-69, T-70 und T-576 gemäß 27D und
    • 3) Peptide T-67 und T-104 bis T-119 und T-384 gemäß 28A und Peptide T-71, T-613 bis T-617, T-662 bis T-676 und T-730 gemäß 28B.
  • Die Peptide der Gruppe 1 stellen Teile der DP178/107-ähnlichen Region des RSV-F2-Proteins dar. Die Peptide der Gruppe 2 stellen Teile der DP107-ähnlichen Region des RSV-F1-Proteins dar. Die Peptid der Gruppe 3 stellen Teile der DP178-ähnlichen Region des RSV-F1-Proteins dar.
  • Jedes Peptid wurde bei zweifachen Reihenverdünnungen im Bereich von 100 μg/ml bis etwa 100 ng/ml getestet. Bei jedem Test wurde ebenfalls eine Vertiefung, die kein Peptid enthielt, mitgeführt. Die IC50-Daten für jedes Peptid stellen den Mittelwert von mehreren unter Verwendung dieses Peptids durchgeführten Experimenten dar.
  • 17.2 ERGEBNISSE
  • Die in den 27A–B und 28A–B zusammengefassten Daten stellen antivirale und strukturelle Informationen dar, die von Peptiden erhalten wurden, welche aus der DP178/DP107-ähnlichen F2-Region von RSV-F2 (27A–B), der DP-107-ähnlichen Region von RSV-F1 (27C–D) und der DP178-ähnlichen Region von RSV-F2 (28A–B) abgeleitet sind.
  • Wie in den 27A–D gezeigt, zeigte eine Anzahl der DP178/DP107-ähnlichen Peptide von RSV eine nachweisbare antivirale Aktivität. Peptide der DP178/DP107-ähnlichen Region von RSV-F2 (27A–B), beispielsweise die gereinigten Peptide T-142 bis T-145 und T-334, zeigten eine nachweisbare antivirale Aktivität, was durch ihre IC50-Werte angezeigt wird. Des Weiteren zeigte eine Anzahl von DP107-ähnlichen Peptiden von RSV-F1 (27C–D), einschließlich beispielsweise die Peptide T-124 bis T-127, T-131, T-135 und T-137 bis T-139, eine erhebliche antivirale Aktivität als gereinigte Peptide, was durch deren geringe IC50-Werte demonstriert wird. Des Weiteren ergibt eine CD-Analyse (27A, 27C), dass viele der Peptide einen gewissen nachweisbaren Grad einer helikalen Struktur aufweisen.
  • Die in 28A–B zusammengefassten Ergebnisse zeigen, dass eine Anzahl von gereinigten DP178-ähnlichen Peptiden einen Bereich einer wirksamen antiviralen Aktivität aufweisen. Diese Peptide schließen beispielsweise T-67, T-104, T-105 und T-107 bis T-119 gemäß der Aufstellung in 28A und T-665 bis T- 669 und T-671 bis T-673 gemäß der Aufstellung in 28B ein. Des Weiteren wiesen einige der DP178-ähnlichen Peptide einen gewissen Helizitätsgrad auf.
  • Somit wurden durch die vorstehend beschriebenen Computergestützten Suche virale Peptiddomänen identifiziert, die sehr vielversprechende anti-RSV-antivirale Verbindungen darstellen.
  • 18. BEISPIEL: POTENTIELLE DP178/DP107-ANALOGE IM HUMANEN PARAINFLUENZA-VIRUS-TYP-3: CD- UND ANTIVIRALE CHARAKTERISIERUNG
  • Im vorliegend dargestellten Beispiel wurden Peptide des humanen Parainfluenza-Virus-Typ-3 (HPIV3), die unter Verwendung der computergestützten Suchmotive, welche in den vorstehenden Abschnitten 9 und 15 dargestellten Beispielen beschrieben sind, identifiziert wurden, hinsichtlich einer ASnti-HPIV3-Aktivität getestet. Des Weiteren wurden strukturelle Circulardichroismus(CD)-Analysen, wie nachstehend diskutiert, der Peptide durchgeführt. Es wird gezeigt, dass einige der identifizierten Peptide wirksame antivirale Eigenschaften entfalten. Des Weiteren wird gezeigt, dass einige dieser Peptide einen deutlich helikalen Charakter aufweisen.
  • 18.1 MATERIALIEN UND METHODEN
  • Strukturelle Analysen: Strukturelle Analysen bestanden aus Circulardichroismus(CD)-Untersuchungen. Die CD-Spektren wurden in einem 10 mM Natriumphosphat, 150 mM Natriumchloridpuffer pH 7,0 bei Konzentrationen von ungefähr 10 mM unter Verwendung einer Zelle mit einer Weglänge von 1 cm mit einem Jobin/Yvon-Autodichrograph Mark V CD-Spektrophotometer aufgenommen. Die Peptidkonzentrationen wurden anhand der A280 unter Verwendung des Verfahrens nach Edlehoch (1967, Biochemistry 6: 1948) bestimmt.
  • Tests zur Anti-HPIV3-antiviralen Aktivität: Der vorliegend verwendete die Befähigung der Peptide zur Aufhebung der Befähigung von Hep2-Zellen, die chronisch mit HPIV3 infiziert waren, zur Fusionierung und Hervorrufung der Syncytienbildung auf einer Einzelschicht einer nicht-infizierten Linie von CV-1W-Zellen. Je wirksamer je geringer die beobachtete Fusionszahl ist, desto größer ist die antivirale Aktivität des Peptids.
  • Nicht-infizierte konfluente Einzelschichten von CV-1W-Zellen wurden in Mikrotitervertiefungen in 3% EMEM (Eagle Minimum Essential Medium ohne L-Glutamin [Bio Whittaker Kat. Nr. 12-125F], ergänzt mit 3% fötalem Rinderserum [FBS, das für 30 Minuten bei 56°C hitzeinaktiviert wurde; Bio Whittaker Kat. Nr. 14-501F), unter Zugabe von 1% Antibiotika/Antimykotika (Gibco BRL Life Technologies Kat. NR. 15040-017) und 1% Glutamin kultiviert.
  • Zur Herstellung von Hep2-Zellen zur Zugabe zu nicht-infizierten Zellen wurden Kulturen chronisch infizierter Hep2-Zellen mit DPBS (Dulbecco's Phosphate Buffered Saline ohne Calcium oder MagnesiuM, Bio Whittaker Kat. Nr. 17-512F) gewaschen und Zelleinzelschichten wurden mit Versene (1:5.000; Gibco Life Technologies Kat. Nr. 15040-017) entfernt. Die Zellen wurden für 10 Minuten zentrifugiert und in 3% FBS resuspendiert. Zellzählungen wurden unter Verwendung eines Hämacytometers durchgeführt. Persistierende Zellen wurden zu den nicht-infizierten CV-1W-Zellen zugegeben.
  • Der antivirale Test wurde zunächst durch Entfernen des gesamten Mediums aus den Vertiefungen, die nicht-infizierte CV-1W-Zellen enthalten, und dann Zugabe der Peptide (bei den nachstehend beschriebenen Verdünnungen) in 3% EMEM und 500 chronisch HPIV3-infizierten Hep2-Zellen pro Vertiefung durchge führt. Die Vertiefungen wurden dann bei 37°C für 24 Stunden inkubiert.
  • Am Tag 2 wurde das Medium, nachdem die Zellen in Kontrollvertiefungen hinsichtlich Fusionszentren überprüft wurden, aus den Vertiefungen entfernt, gefolgt von der Zugabe von ungefähr 50 μl 0,25% Kristallviolett-Färbung in Methanol zu jeder Vertiefung. Die Vertiefungen wurden sofort gespült, um überschüssiges Färbemittel zu entfernen, und dann getrocknet. Die Anzahl von Syncytien pro Vertiefung wurde dann unter Verwendung eines Seziermikroskops gezählt.
  • In anderen Experimenten wurden die Zellen anstatt einer Analyse mit Kristallviolett mit XTT, wie vorstehend im Abschnitt 17.1 beschrieben gefärbt.
  • Peptide: Die in der vorliegend dargestellten Untersuchung charakterisierten Peptide waren folgende:
    • 1) Peptide 157 bis 188 gemäß 29A und Peptide T-38 bis T-40, T-42 bis T-46 und T-582 gemäß 29B. Diese Peptide sind aus der DP107-Region des HPIV3-F1-Fusionsproteins (wie in 29A gezeigt als HPF3 107 dargestellt) abgeleitet und
    • 2) Peptid 189 bis 210, gemäß 30A und T-269, T-626, T-383 und T-577 bis T-579 gemäß 30B.
  • Diese Peptide sind hauptsächlich aus der DP178-Region des HPIV3-F1-Fusionsproteins (wie in 30A gezeigt als HPF3 178 dargestellt) abgeleitet. Das Peptid T-626 enthält zwei mutierte Aminosäurereste (schattiert dargestellt). Des Weiteren entspricht das Peptid T-577 den Aminosäuren 65-100 von F1, T-578 entspricht den Aminosäuren 207–242 von F1, und T-579 entspricht den Aminosäuren 273–309 von F1.
  • Jedes Peptid wurde bei 2-fachen Reihenverbindungen im Bereich von 500 μg/ml bis ungefähr 500 ng/ml getestet. Für jeden der Tests wurde auch eine Vertiefung, die kein Peptid enthielt, verwendet.
  • 18.2 ERGEBNISSE
  • Die in den 29A–B und 30A–B zusammengefassten Daten zeigen antivirale und strukturelle Informationen, die von Peptiden erhalten wurden, welche sich aus der DP107-ähnlichen Region des HPIV3-Fusionsproteins (29A–B) und der DP178-ähnlichen Region des HPIV3-Fusionsproteins (30A–B) ableiten.
  • Wie in 29A–B gezeigt, entfaltete eine Anzahl der DP107-ähnlichen Peptide von HPIV3 eine wirksame antivirale Aktivität. Diese Peptide schließen beispielsweise die Peptide T-40, T-172 bis T-175, T-178, T-184 und T-185 ein.
  • Die in 30A–B zusammengefassten Ergebnisse zeigen, dass eine Anzahl der getesteten DP178-ähnlichen Peptid einen Bereich anti-viraler Aktivitäten entfalten. Diese Peptide schließen beispielsweise die Peptide 194 bis 211 ein, was durch deren niedrige IC50-Werte angezeigt wird. Tatsächlich zeigten die Peptide 201 bis 205 IC50-Werte im Nanogramm/Milliliter-Bereich. Des Weiteren zeigten viele der DP178-ähnlichen Peptide einen gewissen Helizitätsgrad.
  • Somit wurden durch die vorstehend beschriebenen computergeschützten Suchen erfolgreich virale Peptiddomänen identifiziert, die sehr vielversprechende anti-HPIV3-antivirale Verbindungen darstellen.
  • 19. BEISPIEL: COMPUTERGESTÜTZTE IDENTIFIZIERUNG VON DP178/DP107-ANALOGEN IM AFFEN-IMMUNDEFIZIENZ-VIRUS
  • Die 31 stellt Suchergebnisse für das SIV-Isolat MM251 (PC/Gene® Proteinsequenz PENV_SIVM2) dar. Sowohl 107 × 178 × 4 als auch ALLMOTI5-Suchmotive identifizierten zwei Regionen mit Ähnlichkeit zu DP107 und/oder DP178.
  • Die mittels 107 × 178 × 4 gefundenen Peptidregionen befanden sich bei den Aminosäureresten 156–215 und 277–289. Die mittels ALLMOTI5 gefundenen Peptidregionen befanden sich bei den Aminosäureresten 156–219 und 245–286 und identifizieren daher ähnliche Regionen.
  • Interessanterweise korreliert die erste SIV-Peptidregion (d. h. vom Aminosäurerest 156 bis etwa Aminosäurerest 219) mit einer DP107-Region, während die zweite identifizierte Region (d. h. von ungefähr Aminosäurerest 245 bis ungefähr Aminosäurerest 289) mit der DP178-Region von HIV korreliert. Tatsächlich ergibt eine Gegenüberstellung des SIV-Isolats MM251 und des HIV-Isolats BRU, gefolgt von einer Auswahl der besten Peptidübereinstimmungen bei HIV-DP107 und -DP178, dass die besten Übereinstimmungen in den Peptidregionen gefunden werden, die durch die 107 × 178 × 4- und ALLMOTI5-Suchmotive identifiziert wurden.
  • Es wird darauf hingewiesen, dass eine potentielle Coiled-Coil-Region bei den Aminosäureresten 242–282 durch das Lupas-Programm vorhergesagt wird. Dies ähnelt der Beobachtung bei HIV, bei welchem das Coiled-Coil gemäß der Vorhersage des Lupas-Programms eher die DP178- als die DP107-Region ist. Es ist daher möglich, dass SIV dahingehend zu HIV ähnlich sein könnte, dass es eine Coiled-Coil-Struktur in der DP107-Region enthält, obwohl eine derartige Struktur dem Lupas-Algorithmus entgeht. Ähnlich dazu kann es sein, dass die einem DP178-Analogen entsprechende Region in SIV eine undefinierte Struktur aufweist, obwohl das Lupas-Programm eine Coiled-Coil-Struktur vorhersagt.
  • 20. BEISPIEL: COMPUTERGESTÜTZTE IDENTIFIZIERUNG VON DP178/DP107-ANALOGEN IM EPSTEIN-BARR-VIRUS
  • Die vorliegend dargestellten Ergebnisse beschreiben die Identifizierung von DP178/DP107-Analogen in zwei verschiedenen Epstein-Barr-Virus-Proteinen. Der Epstein-Barr-Virus ist ein humaner Herpes-Virus, der das auslösende Agens beispielsweise für die Mononucleosis infectiosa (IM) ist und auch mit nasopharyngealen Karzinomen (NPC), Burkitt-Lymphom und anderen Erkrankungen zusammenhängt. Der Virus existiert hauptsächlich in der latenten Form und wird durch verschiedene Stimuli aktiviert.
  • 32 zeigt die Suchmotivergebnisse für den Epstein-Barr-Virus (Stamm B95-8; PC/Gene® Proteinsequenz PVGLB_EBV) Glycoprotein gp100 Vorläufer (gp115). Das 107 × 178 × 4-Motiv identifizierte zwei interessierende Regionen, nämlich die durch die Aminosäurereste 95–122 und 631–658 abgedeckten Regionen. Eine PZIP-Region wurde bei den Aminosäureresten 732–752 identifiziert, die höchstwahrscheinlich eine cytoplasmatische Region des Proteins darstellt. Der Lupas-Algorithmus sagt eine Coiled-Coil-Struktur für die Aminosäuren 657–684 voraus. Es wurden keine ALLMOTI5-Regionen identifiziert.
  • 33 stellt die Suchmotivergebnisse für das Zebra-(oder EB1-)Trans-Aktivatorprotein (BZLF1) des vorstehend genannten Epstein-Barr-Virus dar. Dieses Protein ist ein Transkriptionsfaktor, welcher den primären Mediator der viralen Reaktivierung darstellt. Es ist ein Mitglied der b-ZIP-Familie der Transkriptionsfaktoren und zeigt eine deutliche Homologie mit den aus DNA-Bindungs- und Dimerisierungs-Basisdomänen der zellulären Onkogene c-fos und C/EBP. Das Zebra-Protein wirkt als Homodimer.
  • Die Suchergebnisse zeigen, dass das Zebra-Protein eine einzelne Region aufweist, für die sowohl eine DP107- als auch eine DP178-Ähnlichkeit vorausgesagt wird, und die sich zwischen den bekannten DNA-Bindungs- und Dimerisierungsregionen des Proteins befindet. Insbesondere befindet sich diese Region bei den Aminosäureresten 193–220, wie in 33 gezeigt. Das Lupas-Programm sagt keine Coiled-Coil-Regionen voraus.
  • 21. BEISPIEL: COMPUTERGESTÜTZTE IDENTIFIZIERUNG VON DP178/DP107-ANALOGEN IM MASERNVIRUS
  • 34 veranschaulicht die Motivsuchergebnisse für das Fusionsprotein F1 des Masernvirus, Stamm Edmonston (PC Gene® Proteinsequenz PVGLF_MEASE), welche erfolgreich DP178/DP107-Analoge identifizieren.
  • Das 107 × 178 × 4-Motiv identifiziert eine einzelne Region bei den Aminosäureresten 228–269. Das ALLMOTI5-Suchmotiv identifiziert drei Regionen, welche die Aminosäurereste 116–184, 228–269 und 452–500 einschließen. Es wurden drei Regionen, die Prolinreste, gefolgt von Leucin-Zipper-ähnlichen Sequenzen, enthalten, die bei den Prolinresten 214, 286 und 451 beginnen.
  • Das Lupas-Programm identifizierte zwei Regionen mit einer vorhergesagten potentiellen Coiled-Coil-Struktur, welche die Aminosäurereste 141–172 und 444–483 einschließen.
  • 22. BEISPIEL: COMPUTERGESTÜTZTE IDENTIFIZIERUNG VON DP178/DP107-ANALOGEN IM HEPATITIS-B-VIRUS
  • 35 stellt die Ergebnisse einer im Hepatitis-B-Virus-Subtyp AYW durchgeführten PZIP-Motivsuche dar. Es wurden zwei interessante Regionen im Hauptoberflächenantigen-Vorläufer-S-Protein identifiziert. Die erste befindet sich direkt C-terminal zum vorhergesagten Fusionsprotein des Hauptoberflä chenantigens (Hbs), die sich bei den Aminosäureresten 174–191 befindet. Die zweite Region befindet sich bei den Aminosäureresten 233–267. Das Lupas-Programm sagt keine Coiled-Coil-Wiederholungsregion voraus.
  • Um die potentielle anti-HBV-antivirale Aktivität dieser DP178/DP107-analogen Regionen zu testen, wurden, wie in 52A–B gezeigt, Peptide synthetisiert, die aus dem Bereich um diese analogen Regionen abgeleitet sind. Diese Peptide stellen Ein-Aminosäure-Peptid-„Spaziergänge" bzw. -„Walks" durch, die putativen DP178/DP107-Analogregionen dar. Die Peptid werden gemäß der Standard Fmoc-Chemie auf Rinkamide-MBHA-Harzen synthetisiert, um eine Carboxy-terminale Blockierung sicherzustellen (Chang, c.D. und Meinhofer, J., 1978, Int. J. Pept. Protein Res. 11: 246–249; Fields, G. B. und Noble, R. L., 1990, Int. J. Pept. Protein Res. 35: 161–214). Nach der vollständigen Synthese wird der Amino-Terminus des Peptids über eine automatische Acetylierung blockiert, und das Peptid wird mit Trifluoressigsäure (TFA) und den geeigneten Fängern bzw. Scavengern abgespalten (King, D. S. et al., 1990, Int. J. Pept. Res. 36: 255–266). Nach der Abspaltung wird das Peptid mit Ether präzipitiert und unter Vakuum für 24 Stunden getrocknet.
  • Die Anti-HBV-Aktivität der Peptide wird unter Verwendung von Standardtests zur Bestimmung der Konzentration des Testpeptids, die zur Hervorrufung einer akzeptablen (z.B. 90%) Verminderung der Menge viraler Nachkommen, die von Zellen gebildet werden, welche mit einem viralen HBV inoculum beimpft wurden, erforderlich ist, getestet. Antivirale Kandidatenpeptide werden weiter in Modellsystemen wie der Murmeltiergewebekultur und Tiersystemen vor dem Testen beim Menschen charakterisiert.
  • 23. BEISPIEL: COMPUTERGESTÜTZTE IDENTIFIZIERUNG VON DP178/DP107-ANALOGEN IM AFFEN-MASON-PFIZER-AFFENVIRUS
  • Die vorliegend dargestellten Ergebnisse veranschaulichen die Ergebnisse von im Affen-Mason-Pfizer-Affenvirus durchgeführten Motivsuchen. Die Motive ergeben DP178/DP107-Analoge im Hüllprotein (TM) GP20, wie in 36 gezeigt.
  • Das 107 × 178 × 4-Motiv identifiziert eine Region bei den Aminosäureresten 422–470. Das ALLMOTI5 findet eine Region bei den Aminosäureresten 408–474. Das Lupas-Programm sagte eine Coiled-Coil-Struktur bei den Aminosäuren 424–459 voraus.
  • 24. BEISPIEL: COMPUTERGESTÜTZTE IDENTIFIZIERUNG VON DP178/DP107-ANALOGEN IN BAKTERIELLEN PROTEINEN
  • Die vorliegend dargestellten Ergebnisse zeigen die Identifizierug von DP178/DP107-Analogen, die Sequenzen entsprechen, welche in Proteinen von verschiedenen bakteriellen Spezies vorliegen.
  • 37 zeigt die Suchmotivergebnisse für das Fimbrialprotein (Pilin) von Pseudomonas aeroginosa. Mit den Motiven 107 × 178 × 4 und ALLMOTI5 wurden zwei Regionen identifiziert. Mit dem Motiv 107 × 178 × 4 wurden die bei den Aminosäureresten 30–67 und 80–144 befindlichen Regionen identifiziert. Die Regionen bei den Aminosäureresten 30–68 und 80–125 wurden durch ALLMOTI5 identifiziert.
  • 38 zeigt die Motivsuchergebnisse für das Fimbrialprotein (Pilin) von Pseudomonas gonorrhoeae. Sowohl mit dem 107 × 178 × 4-Motiv als auch mit dem ALLMOTI5-Motiv wurde eine einzelne Region identifiziert. Die bei den Aminosäureresten 66–97 befindliche Region wurde mit dem 107 × 178 × 4-Motiv identifiziert. Die bei den Aminosäureresten 66–125 befindliche Region wurde mit dem ALLMOTIV5-Suchmotiv identifiziert. Durch das Lupas-Programm wurden keine Coiled-Coil-Regionen vorhergesagt.
  • 39 zeigt die Motivsuchergebnisse für das Fimbrialprotein (Pilin) von Hemophilus influenza. Sowohl das 107 × 178 × 4-Motiv als auch das ALLMOTI5-Motiv identifizierte eine einzelne Region. Die bei den Aminosäureresten 102–129 befindliche Region wurde durch das 107 × 178 × 4-Motiv identifiziert. Die bei den Aminosäureresten 102–148 befindliche Region wurde durch das ALLMOTI5-Suchmotiv vom Lupas-Programm wurden keinen Coiled-Coil-Regionen vorhergesagt.
  • 40 zeigt die Motivsuchergebnisse für das Fimbrialprotein (Pilin) von Staphylococcus-aureus-toxischer-Schock-Syndrom-Hemophilus-influenza. Es wurde sowohl mit dem 107 × 178 × 4-Motiv als auch mit dem ALLMOTI5-Motiv eine einzelne Region identifiziert. Die bei den Aminosäurenresten 102–129 befindliche Region wurde durch das 107 × 178 × 4-Motiv identifiziert. Die bei den Aminosäureresten 102–148 befindliche Region wurde durch das ALLMOTI5-Suchmotiv identifiziert. Mit dem Lupas-Programm wurde keine Coiled-Coil-Region vorhergesagt.
  • 41 fasst die Motivsuchergebnisse zusammen, die bezüglich des Enterotoxins Typ-E-Proteins von Staphylococcus aureus durch geführt wurden. Diese Ergebnisse zeigen die erfolgreiche Identifizierung von DP178/DP107-Analogen, welche den nachstehend beschriebenen Peptidsequenzen in diesem Protein entsprechen.
  • Das ALLMOTI5-Motiv identifizierte eine Region bei den Aminosäureresten 22–27. Das 107 × 178 × 4-Motiv identifizierte zwei Regionen, wobei die erste sich bei den Aminosäureresten 26–69 und zweite bei 88–115 befindet. Eine P12LZIPC-Motivsuche iden tifizierte zwei Regionen bei den Aminosäureresten 168–181 bzw. 230–250.
  • Das Lupas-Programm sagte eine Region mit einer hoher Coiling-Wahrscheinlichkeit bei den Aminosäureresten 25–54 voraus. Diese Sequenz ist vollständig in der sowohl mit dem ALLMOTI5-Motiv als auch mit dem 107 × 178 × 4-Motiv identifizierten ersten Region enthalten.
  • 42 zeigt die Suchmotivergebnisse, die bei einem zweiten Staphylococcus-aureus-Toxin, Enterotoxin A, durchgeführt wurden. Es wurden zwei Regionen bei den Aminosäureresten 22–70 und Aminosäureresten 164–205 mit dem ALLMOTI5-Motiv identifiziert. Das 107 × 178 × 4-Motiv fand zwei Regionen, die erste bei den Aminosäureresten 26–69 und die zweite bei den Aminosäureresten 165–192. Eine P23LZIPC-Motivsuche ergab eine Region bei den Aminosäureresten 216–250. Das Lupas-Programm sagte keine Coiled-Coil-Regionen voraus.
  • 43 zeigt die Motivsuchergebnisse, die bei dem hitzelabilen Enterotoxin-A-Protein von E. coli durchgeführt wurden, welche die Identifiziertung von DP178/DP107-Analogen zeigen, welche innerhalb dieses Proteins befindlichen Peptiden entsprechen. Es wurden zwei Regionen mit dem ALLMOTI5-Motiv identifiziert, wobei sich die erste bei den Aminosäureresten 55–115 und die zweite bei den Aminosäureresten 216–254 befindet. Das 107 × 178 × 4-Motiv identifizierte eine einzelne Region bei den Aminosäureresten 78–105. Das Lupas-Programm sagte keine Coiled-Coil-Regionen voraus.
  • 25. BEISPIEL: COMPUTERGESTÜTZTE IDENTIFIZIERUNG VON DP178/DP107-ANALOGEN IN VERSCHIEDENEN HUMANEN PROTEINEN
  • Die vorliegend dargestellten Ergebnisse zeigen die Identifizierung von DP178/DP107-Analogen, die Peptidsequenzen entspre chen, welche in einigen verschiedenen humanen Proteinen vorhanden ind.
  • 44 veranschaulicht die Suchmotivergebnisse, die beim humanen c-fos-Oncoprotein durchgeführt wurden. Das ALLMOTI5-Motiv identifizierte eine einzelne Region bei den Aminosäureresten 155–193. Das 107 × 178 × 4-Motiv identifizierte eine Region bei den Aminosäureresten 162–193. Das Lupas-Programm sagte eine Region mit Coiled-Coil-Struktur bei den Aminosäureresten 148–201 voraus.
  • 45 veranschaulicht die Suchmotivergebnisse, die beim humanen Lupus-KU-Autoantigenprotein P70 durchgeführt wurden. Das ALLMOTI5-Motiv identifizierte eine einzelne Region bei den Aminosäureresten 229–280. Das 107 × 178 × 4-Motiv identifizierte eine Region bei den Aminosäureresten 235–292. Das Lupas-Programm sagte eine Region mit Coiled-Coil-Struktur bei den Aminosäureresten 232–267 voraus.
  • 46 veranschaulicht die Suchmotivergebnisse, die beim humanen Zink-Finger-Protein 10 durchgeführt wurden. Das ALLMOTI5-Motiv identifizierte eine einzelne Region bei den Aminosäureresten 29–81. Das 107 × 178 × 4-Motiv identifizierte eine Region bei den Aminosäureresten 29–56. Eine P23LZIPC-Motivsuche fand eine einzelne Region bei den Aminosäureresten 420–457. Das Lupas-Programm sagte keine Coiled-Coil-Regionen voraus.
  • 26. BEISPIEL: POTENTIELLE MASERNVIRUS-DP178/107-ANALOGE: CD- UND ANTIVIRALE CHARAKTERISIERUNG
  • In den vorliegend dargestellten Beispielen werden im Masernvirus (MeV) durch Verwendung der computergestützten Suchmotive, welche in den obigen Abschnitten 9 und 21 dargestellten Beispiele beschrieben sind, identifizierte DP178-ähnliche Peptide hinsichtlich einer Anti-MeV-Aktivität getestet. Des Weiteren werden mit den Peptiden, wie nachstehend diskutiert, strukturelle Circulardichroismus(CD)-Analysen durchgeführt. Es wird gezeigt, dass einige der identifizierten Peptide wirksame antivirale Eigenschaften aufweisen. Des Weiteren wird gezeigt, dass keines diese Peptide einen wesentlichen helikalen Charakter aufweist.
  • 26.1 MATERIALIEN UND METHODEN
  • Strukturelle Analysen: Die CD-Spektren wurden in einem Puffer mit 10 mM Natrium Phosphat, 150 mM Natrium Chlorid, pH 7,0, bei Konzentrationen von ungefähr 10 mM unter Verwendung einer Zelle mit einer Wegstrecke von 1 cm mit einem Jobin/Yvon-Autodichrograph Mark V CD-Spektrophotometer aufgenommen. Die Peptidkonzentrationen wurden anhand der A280 unter Verwendung des Verfahrens nach Edlehoch (1967, Biochemistry 6: 1948) bestimmt.
  • Tests zur Anti-MeV-antiviaralen Aktivität mittels Syncytienreduktion: Der vorliegend verwendete Test untersuchte die Befähigung der Peptide zur Aufhebung der Bewegung von Vero-Zellen, die mit MeV akut infiziert waren (d.h. Zellen, die mit einer Infektionsmultiplizität von 2–3 infiziert waren), zur Fusionierung und Hervorrufung der Syncytienbildung auf einer Einzelschicht einer nicht-infizierten Linie von Vero-Zellen. Je wirksamer das Peptid desto geringer die beobachtete Fusionszahl, desto größer die antivirale Aktivität des Peptids.
  • Nicht-inifizierte konfluente Einzelschichten von Vero-Zellen wurden in Mikrotitervertiefungen in 10% FBS EMEM (eagle minimum essential medium ohne L-Glutamin) [Bio Whittaker Katalog Nr. 12-125F], ergänzt mit 10% hydralem Rinderserum (FBS, das für 30 Minuten bei 56°C Hitze inaktiviert worden war; Bio Whittaker Katalog Nr. 14-501F), 1% Antibiotika/Antimykotika (Bio Whittaker Katalog Nr. 17-602E) und 1% Glutamin, gezüchtet.
  • Zur Herstellung akut infizierter Vero-Zellen zur Zugabe zu den nicht-infizierten Zellen wurden Kulturen akut infizierter Vero-Zellen zweimal mit HBSS (Bio Whittaker Katalog Nr. 10-543F) gewaschen und seine Einzelschichten wurden mit Trypsin (Bio Whittaker Katalog Nr. 17-161E) entfernt. Nach Ablösung der Zellen wurde Medium zugegeben, jegliche verbleibenden Zellklumpen wurden dispergiert und Zellzählungen mit einem Hemacytometer vorgenommen.
  • Der antivirale Test wurde zunächst durch Entfernen des gesamten Mediums aus den nicht-infizierte Vero-Zellen enthaltenden Vertiefungen und dann Zugabe der Peptide (bei den nachstehend angegebenen Verbindungen) in 10% FBS EMEM und 50–100 akut MeV der infizierten Vero-Zellen pro Vertiefung durchgeführt. Die Vertiefungen wurden dann bei 37°C für maximal 18 Stunden inkubiert.
  • Am Tag 2 wurde, nachdem Zellen in Kontrollvertiefungen hinsichtlich Fusionszentren überprüft wurden, das Medium auf den Vertiefungen entfernt, gefolgt von der Zugabe von ungefähr 50 μl 0,25% kristallviolett Farbstoff in Methanol in jede Vertiefung. Die Vertiefungen wurden sofort zweimal mit Wasser bespült um überschüssigen Farbstoff zu entfernen, und wurden dann getrocknet. Die Anzahl von Syncytien pro Vertiefung wurde dann unter Verwendung eines Seziermikroskops gezählt.
  • Test zur anti-MeV antiviralen Aktivität durch Plaquereduktion:
  • Der vorliegend verwendete Test untersuchte die Bewegung der Peptide zur Aufhebung der Bewegung MeV zur Infektion permissiver, nicht-infizierter Vero-Zellen, die zur Fusion der infizierten Zellen mit nicht-infizierten Zellen zur Erzeugung von Syncytien führt. Je geringer die beobachtete Syncytienbildung ist, desto größer ist die antivirale Aktivität des Peptids.
  • Einzelschichten nicht-infizierter Vero-Zellen werden wie vorstehend beschrieben gezüchtet.
  • Der anitvirale Test wurde zunächst durch Entfernen des gesamten Mediums aus den die nicht-infizierten Vero-Zellen enthaltenden Vertiefungen und dann Zugabe der Peptide (bei den nachstehend angegebenen Verdünnungen) in 10% FBS EMEM und MeV-Stammvirus bei einer Endkonzentration von 30 plaquebildenden Einheiten (PFO) pro Vertiefung. Die Vertiefungen wurden dann bei 37°C für wenigstens 36 Stunden und höchstens 48 Stunden inkubiert.
  • Am Tag 2 wurde, nachdem die Zellen in Kontrollvertiefungen hinsichtlich Fusionszentren überprüft wurden, das Medium aus den Vertiefungen entfernt, gefolgt von der Zugabe von ungefähr 50 μl 0,25% kristallviolett Farbstoff in Methanol in jede Vertiefung. Die Vertiefungen wurden sofort zweimal mit Wasser gewaschen, um überschüssigen Farbstoff zu entfernen, und wurden dann getrocknet. Die Anzahl von Syncytien pro Vertiefung wurde dann unter Verwendung eines Seziermikroskops gezählt.
  • Peptide: Die in der vorliegend dargestellten Untersuchung charakterisierten Peptide waren die Peptide T-252A0–T-256A0, T-257B1/C1 und T-258B1–T-265B0 und T-266A0–T-268A0, wie in 47 gezeigt. Diese Peptide stellen einen Gang durch die DP178-ähnliche Region des MeV Fusionsproteins dar.
  • Jedes Peptid wurde bei 2-fachen seriellen Verdünnungen im Bereich von 100 μg/ml bis ungefähr 100 ng/ml getestet. Für jeden der Tests wurde auch eine Vertiefung, die kein Peptid enthielt, mitgeführt.
  • 26.2 ERGEBNISSE
  • Die in 47 zusammengefassten Daten stellen antivirale und strukturelle Informationen dar, die über „Peptidgänge" (engl. Ausdruck „peptide walks") durch die DP178-ähnliche Region des MeV Fusionsproteins erhalten wurden.
  • Wie in 47 gezeigt, entfalten die DP178-ähnlichen Peptide von MeV als rohe Peptide einen Bereich antiviraler Aktivitäten. Einige dieser Peptide wurden zur Reinigung und weiteren antiviralen Charakterisierung auserwählt. Die IC50-Werte für derartige Peptide wurden, wie in 47 gezeigt, bestimmt und reichten von 1,35 μg/ml (T-257B1/C1) bis 0,072 μg/ml (T-265B1). Keines der DP178-ähnlichen Peptide zeigte anhand von CD-Analysen einen nachweisbaren Helizitätsgrad.
  • Somit identifizierten die vorstehend beispielsweise in dem in Abschnitt 9 Beispiel beschriebenen computergeschützten Suchen erfolgreich virale Peptiddomänenen, die sehr viel versprechende anit-MeV antivirale Verbindungen darstellen.
  • 27. BEISPIEL: POTENTIELLE DP178/DP107-ANALOGE IN SIV: ANTIVIRALE CHARAKTERISIERUNG
  • In dem vorliegend dargestellten Beispiel wurden DP178-ähnliche Peptide des Affenimmundeffizienzvirus (SEV), die durch Verwendung der computergeschützten Suchmotive, die in den obigen Abschnitten 9, 12 und 19 dargestellten Beispiele beschrieben werden, identifiziert wurden, hinsichtlich einer anti-SeV-Aktivität getestet. Es wird gezeigt, dass eine der indentifizierten Peptide wirksame antivirale Eigenschaften aufweisen.
  • 27.1 MATERIALIEN UND METHODEN
  • ANTI-SIV ANTIVIRALE TESTS: Der vorliegend verwendete Test war wie in Langolis et. al. (Langolis, A. J. et. al., 1991, AIDS Research and Human Retroviruses 7: 713–720) beschrieben.
  • Peptide: Die in der vorliegend dargestellten Untersuchung charakterisierten Peptide waren die Peptide T-391 bis T-400, wie in 48 gezeigt. Diese Peptide stellen einen Gang durch die DP178-ähnliche Region des SIV-TM-Proteins dar.
  • Jedes Peptid wurde bei zweifachen seriellen Verdünnungen im Bereich von 100 μg/ml bis ungefähr 100 ng/ml getestet. Bei jedem der Tests wurde auch eine Vertiefung, die kein Peptid enthielt, mitgeführt.
  • 27.2 ERGEBNISSE
  • Die in 48 zusammengefassten Daten stellen antivirale Informationen dar, die über „Peptid-walks" durch die DB178-ähnliche Region des SIV-TM-Proteins erhalten wurden.
  • Wie in 48 gezeigt, wurden die Peptide T-391 und T-400 getestet, und sie entfalteten eine wirksame antivirale Aktivität als rohe Peptide.
  • Somit identifizierten die beispielsweise die im Abschnitt 9 dargestellten im Beispiel beschriebenen computergestützten Suchen erfolgreich virale Peptiddomänen, die sehr vielversprechende ant-SIV antivirale Verbindungen darstellen.
  • 28. BEISPIEL: ANTIVIRALE AKTIVITÄT VON DP107- UND DP-178-PEPTIDVERKÜRZUNGEN UND -MUTATIONEN
  • Das in diesem Abschnitt dargestellte Beispiel zeigt eine Untersuchung der antiviralen Aktivität von DP107- und DP178-Verkürzungen und -Mutationen. Es wird gezeigt, dass einige dieser modifizierten DP107- und DP178-Peptide eine deutliche antivirale Aktivität entfalten.
  • 28.1 MATERIALIEN UND METHODEN
  • Anti-HIV-Tests: Die durchgeführten antiviralen Tests waren diejenigen, die vorstehend im Abschnitt 6.1 beschrieben wurden. Tests verwendeten HIV-1/IIIb- und/oder HIV-2 NIHZ-Isolate. Es wurden gereinigte Peptide verwendet, es sei denn, es ist in den 49A–C anders angegeben.
  • Peptide: Die in der vorliegend dargestellten Untersuchung charakterisierten Peptide waren:
    • 1) 49A–C zeigen Peptide, die aus der Region um die und enthaltend die DP178-Region des HIV-1 BRU-Isolats abgeleitet wurden. Insbesondere umfasst diese Region die Aminosäurereste 615 bis 717 von gp41. Die angegebenen Peptide enthalten Verkürzungen dieser Region und/oder Mutationen, die von der DP178-Aminosäuresequenz abweichen. Des weiteren wiesen bestimmte der Peptide angefügte oder entfernte Amino- und/oder Carboxy-Terminale Gruppen, wie in den Figuren gezeigt, auf und
    • 2) 50 zeigt Peptide, die Verkürzungen DP107 und/oder der die DP107 Aminosäuresequenz des HIV-1 BRU-Isolats umgebende gp41-Region darstellen. Bestimmte der Peptide sind, wie in der Figur angegeben, nicht-blockiert oder biotinyliert.
  • Blockierte Peptide enthielten einen Acyl-N-Terminus und einen Amido-C-Terminus.
  • 28.2 ERGEBNISSE
  • Anti-HIV-antivirale Daten wurden mit den von DP178 abgeleiteten Peptiden der Gruppe 1, wie in 49A–C angegeben, erhalten. Die für das vollständige, nicht-mutierte DP178-Peptide (in 49A–C mit T20 bezeichnet) gezeigten Ergebnisse sind für 4 ng/ml.
  • In 49A zeigte eine Anzahl der DP178-Verkürzungen eine hohe antivirale Aktivität, was durch ihre geringen IC50-Werte gezeigt wird. Diese schließen beispielsweise die Testpeptide T-50, T-624, T-636 bis T-641, und T-645 bis T-650, T-652–T654 und T-656 ein. T-50 stellt ein Testpeptid dar, das eine Punktmutation, wie durch den schattierten Hintergrund des Rests angezeigt, enthält. Die von HIV-1 abgeleiteten Testpeptide zeigten eine distinkte stammspezifische antivirale Aktivität, in dem keines der beim HIV-2 NIHZ-Isolat getesteten Peptide eine wahrnehmbare Anti-HIV-2-antivirale Aktivität zeigte.
  • Unter den in der 49B angegebenen Peptiden befinden sich Testpeptide, welche die Amino-(T-4) und Carboxy-(T-3) terminalen Hälften von DP178 repräsentieren, und die getestet wurden. Das aminoterminale Peptid war inaktiv (IC50 > 400 μg/ml), während das carboxyterminale Peptid eine wirksame antivirale Aktivität zeigte (IC50 = 3 μg/ml). Eine Anzahl weiterer Testpeptide zeigte ebenfalls eine hohe antivirale Aktivität. Diese schlossen beispielsweise T-61/T-102, T-217 bis T-221, T-235, T-381, T-677, T-377, T-590, T-378, T-591, T-271 bis T-272, T-611, T-222 bis T-223 und T-60/T-224 ein. Bestimmte der antiviralen Peptide enthalten Punkt mutationen und/oder Aminosäurerestanfügungen, die von der DP178-Aminosäuresequenz abweichen.
  • Gemäß 49C werden Punktmutationen und/oder amino- und/oder carboxyterminale Modifikationen in die DP178-Aminosäuresequenz selbst eingeführt. Wie in der Figur gezeigt, entfaltet die Mehrzahl der angegebenen Testpeptide eine wirksame antivirale Aktivität.
  • Wie in 50 gezeigt, wurden auch Verkürzungen des DP107-Peptides (in 50 mit T21 bezeichnet) hergestellt und getestet. 50 zeigt ebenfalls Daten bezüglich blockierter und nicht-blockierter Peptide, die zusätzliche Aminosäurereste aus der gp41-Region enthalten, in welcher sich die DP107-Sequenz befindet. Die meisten dieser Peptide zeigten, wie durch ihre geringen IC50-Werte gezeigt, eine antivirale Aktivität.
  • Somit zeigen die in diesem Abschnitt dargestellten Ergebnisse, dass nicht nur die vollständigen DP107 und DP178-Peptide eine wirksame antivirale Aktivität entfalten, sondern dass auch Verkürzungen und/oder mutierte Versionen dieser Peptide einen erheblichen antiviralen Charakter aufweisen können.
  • 29. BEISPIEL: POTENTIELLE EPSTEIN-BARR DP178/DP107-ANALOGE:
  • ANTIVIRALE CHARAKTERISIERUNG
  • In dem vorliegend dargestellten Beispiel werden von der DP-178/DP107-analogen Region des Epstein-Barr(EBV)Zebraproteins abgeleitete Peptide, die vorstehend in dem in Abschnitt 20 dargestellten Beispiel identifiziert wurden, beschrieben und hinsichtlich einer antiv-EBV-Aktivität getestet. Es wird gezeigt, dass sich unter diesen Peptiden solche befinden, die eine potentielle anti-virale Aktivität entfalten.
  • 29.1 MATERIALIEN UND METHODEN
  • Electrophoretische-Mobilitäts-Verschiebungstests(EMSA):
  • Kurz beschrieben, wurde ein EBV-Zebraprotein unter Verwendung von SP6-RNA Polymerase in vitro Transkriptions- und Weizenkeim in vitro Translationssystemen synthetisiert (gemäß den Angaben der Promega Corporation; Butler, E. T. und Chamberlain, M. J., 1984, J. Biol. Chem. 257: 5772; Pelham, H. R. B. und Jackson, R. J., 1976, Eur. J. Biochem. 67: 247). Das in vitro translatierte Zebraprotein wurde wurde dann mit ansteigenden Mengen des Peptids bis zu 250 ng/ml vor der Zugabe von 10.000 bis 20.000 c.p.m. eines 32P-markierten Zebra-Antwortelement-DNA-Fragments vorinkubiert. Nach einer Inkubation von 20 Minuten in Gegenwart des Antwortelements wurde die Reaktion auf einem nicht-denaturierenden 4%-Polyacrylamidgel, gefolgt von der Autoradiografie, unter Verwendung von Standardgel-Verschiebungsverfahren analysiert. Die Befähigung eines Testpeptides zur Verhinderung der DNA-Bindung des Zebra-Homodimers wurde durch die Befähigung des Peptids zur Aufhebung der charakteristischen Antwortelement-Gel-Migrationsretardation eines proteingebundenen Nukleinsäuremolekühls festgestellt.
  • Peptide: Die in dieser Untersuchung charakterisierten Peptide stellen Peptidgänge durch die Region dar, welche die DP178/DP107-analoge Region enthält und auf beiden Seiten von dieser flankiert ist, welche in dem im vorstehenden Abschnitt 20 dargestellten Beispiel identifiziert wurde und in 33 gezeigt ist. Insbesondere umfassten die Peptidwalks die Region von Aminosäurerest 173 bis Aminosäurerest 246 des EBV Zebraproteins.
  • Jedes der getesteten Peptide wurde bei einem Konzentrationsbereich getestet, wobei 150 ng/ml die geringste Konzentration war, bei dem eines der Peptide eine inhibitorische Wirkung entfaltete.
  • 29.2 ERGEBNISSE
  • Der EBV Zebraprotein-Transkriptionsfaktor enthält eine DP178/DP107 analoge Region, wie in dem im vorstehenden Abschnitt 20 dargestellten Beispiel gezeigt. Dieses Protein scheint der für die Reaktivierungsbefähigung des Virus hauptsächliche Faktor zu sein. Ein Verfahren, mit dem die DNA-Bindungsfunktion des Zebravirus aufgehoben werden kann, kann daher eine wirksame antivirale Technik darstellen. Um potentielle Anti-EBV-DP178/DP107-Peptide zu identifizieren, wurden daher aus der im vorstehenden Abschnitt 20 identifizierten Region abgeleitete Peptide hinsichtlich ihrer Befähigung zur Inhibition der Bindung des Zebraproteins an DNA getestet.
  • Die Befähigung der Testpeptide zur Inhibition der DNA-Bindung des Zebraproteins wurde mittels der im obigen Abschnitt 28.1 beschriebenen EMSA-Tests getestet. Die in 51A–B zusammengefassten Daten stellen die Ergebnisse der EMSA-Tests der angegebenen EBV-Testpeptide dar. Diese Peptide stellen Ein-Aminosäure-„walks" durch die Region dar, welche die in dem im vorstehenden Abschnitt 20 dargestellten Beispiel identifizierte und in 33 gezeigte DP178/DP107-analoge Region enthält und davon flankiert ist. Wie in 51A–B gezeigt, befindet sich die Region, von denen diese Peptide abgeleitet sind, bei den Aminosäureresten 173 bis 246 des EBV Zebraproteins. Eine Anzahl der getesteten Peptide zeigte eine Befähigung zur Inhibition der Bindung des Zebraprotein-Homodimers an DNA, einschließlich 439, 441, 444 und 445.
  • Diejenigen Peptide, die eine Befähigung zur Inhibition der Bindung des Zebraproteins an DNA aufweisen, stellen potentielle anti-EBV-antivirale Verbindungen dar, deren Befähigung zur Inhibition der EBV-Infektion weiter untersucht werden kann.

Claims (12)

  1. Isoliertes HIV-1- oder HIV-2-Peptid mit der Formel:
    Figure 04070001
    worin Aminosäurereste durch den Ein-Buchstaben-Code dargestellt sind, X eine Aminogruppe, eine Acetylgruppe, eine 9-Fluorenylmethoxycarbonylgruppe, eine hydrophobe Gruppe oder eine makromolekulare Trägergruppe umfasst und Z eine Carboxylgruppe, eine Amidogruppe, eine hydrophobe Gruppe oder eine makromolekulare Trägergruppe umfasst.
  2. Isoliertes respiratorisches Syncytialviruspeptid mit der Formel:
    Figure 04080001
    worin Aminosäurereste durch den Ein-Buchstaben-Code dargestellt sind, X eine Aminogruppe, eine Acetylgruppe, eine 9-Fluorenylmethoxycarbonylgruppe, eine hydrophobe Gruppe oder eine makromolekulare Trägergruppe umfasst und Z eine Carboxylgruppe, eine Amidogruppe, eine hydrophobe Gruppe oder eine makromolekulare Trägergruppe umfasst.
  3. Isoliertes Influenza-A-Peptid mit der Formel:
    Figure 04090001
    worin Aminosäurereste durch den Ein-Buchstaben-Code dargestellt sind, X eine Aminogruppe, eine Acetylgruppe, eine 9-Fluorenylmethoxycarbonylgruppe, eine hydrophobe Gruppe oder eine makromolekulare Trägergruppe umfasst und Z eine Carboxylgruppe, eine Amidogruppe, eine hydrophobe Gruppe oder eine makromolekulare Trägergruppe umfasst.
  4. Isoliertes Epstein-Barr-Virus-Peptid mit der Formel:
    Figure 04090002
    worin Aminosäurereste durch den Ein-Buchstaben-Code dargestellt sind, X eine Aminogruppe, eine Acetylgruppe, eine 9-Fluorenylmethoxycarbonylgruppe, eine hydrophobe Gruppe oder eine makromolekulare Trägergruppe umfasst und Z eine Carboxylgruppe, eine Amidogruppe, eine hydrophobe Gruppe oder eine makromolekulare Trägergruppe umfasst.
  5. Isoliertes Masernviruspeptid mit der Formel:
    Figure 04090003
    Figure 04100001
    worin: Aminosäurereste durch den Ein-Buchstaben-Code dargestellt sind, X eine Aminogruppe, eine Acetylgruppe, eine 9-Fluorenylmethoxycarbonylgruppe, eine hydrophobe Gruppe oder eine makromolekulare Trägergruppe umfasst und Z eine Carboxylgruppe, eine Amidogruppe, eine hydrophobe Gruppe oder eine makromolekulare Trägergruppe umfasst.
  6. Isoliertes Hepatitis-B-Viruspeptid mit der Formel:
    Figure 04100002
    Figure 04110001
    worin: Aminosäurereste durch den Ein-Buchstaben-Code dargestellt sind, X eine Aminogruppe, eine Acetylgruppe, eine 9-Fluorenylmethoxycarbonylgruppe, eine hydrophobe Gruppe oder eine makromolekulare Trägergruppe umfasst und Z eine Carboxylgruppe, eine Amidogruppe, eine hydrophobe Gruppe oder eine makromolekulare Trägergruppe umfasst.
  7. Verwendung eines Peptids, wie in Anspruch 1 beansprucht, bei der Herstellung eines Medikaments zur Behandlung des menschlichen Immunschwächevirus (HIV-Virus) vom Typ 1 oder Typ 2.
  8. Verwendung eines Peptids, wie in Anspruch 2 beansprucht, zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung eines respiratorischen Syncytialvirus.
  9. Verwendung eines Peptids, wie in Anspruch 3 beansprucht, zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung der Influenza Typ A.
  10. Verwendung eines Peptids, wie in Anspruch 4 beansprucht, zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung des Epstein-Barr-Virus.
  11. Verwendung eines Peptids, wie in Anspruch 5 beansprucht, bei der Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von Masern.
  12. Verwendung eines Peptids, wie in Anspruch 6 beansprucht, bei der Herstellung eines Medikaments zur Behandlung des Hepatitis B-Virus.
DE69534569T 1994-12-20 1995-12-20 Hiv-1- und hiv-2-peptide zur inhibition von mit membranfusionen in zusammenhang stehenden phänomenen, einschliesslich der übertragung von hiv Expired - Lifetime DE69534569T2 (de)

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