DE69534759T2

DE69534759T2 - Polyanionische Polysaccharide und hydrophobe, bioabsorbierbare Polymere enthaltende Zusammensetzungen

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Publication number: DE69534759T2
Application number: DE69534759T
Authority: DE
Inventors: James W. Boston Burns; Keith E. Milton Greenawalt; Louis Framingham Masi
Original assignee: Genzyme Corp
Current assignee: Genzyme Corp
Priority date: 1994-10-06
Filing date: 1995-10-05
Publication date: 2006-10-26
Anticipated expiration: 2015-10-06
Also published as: AU707022B2; AU3286095A; EP0705878B1; JP2007277579A; DE69534759D1; US6294202B1; EP0705878A3; JP2012205928A; JPH08208706A; JP4312270B2; CA2159055A1; US20020018813A1; EP0705878A2; CA2159055C; US6703041B2; JP5576905B2

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft wasserunlösliche, biokompatible Zusammensetzungen, die aus einem oder mehreren chemisch veränderten, polyanionischen Polysacchariden gebildet sind, und insbesondere Zusammensetzungen dieser chemisch veränderten, polyanionischen Polysaccharide und hydrophoben, bioabsorbierbaren Polymere.
Polyanionische Polysaccharide sind Polysaccharide, auch Glykane genannt, die mehr als eine negativ geladene Gruppe (z.B. Carboxylgruppen bei pH-Werten oberhalb von 4,0) enthalten; sie bestehen aus langen Ketten mit hunderten oder tausenden basischer Wiederholungseinheiten. Diese Moleküle können sich in der Eigenschaft ihrer wiederkehrenden Wiederholungseinheiten, in der Länge ihrer Ketten und im Grad der Verzweigung unterscheiden. Es gibt zwei hauptsächliche Arten von polyanionischen Polysacchariden: Homopolysaccharide, die nur eine einzige Art von monomerer Einheit enthalten, und Heteropolysaccharide, die zwei oder mehrere unterschiedliche Arten von monomeren Einheiten enthalten.
Polysaccharide treten natürlich in einer Vielzahl von Geweben im Körper auf und assoziieren in einigen Fällen mit Proteinen in komplexen makromolekularen Strukturen. Beispiele schließen Proteoglykane, die in der gelartigen Grundsubstanz gefunden werden, oder eine extrazelluläre Matrix, die den Raum zwischen den Zellen der meisten Gewebe füllt, ein. Proteoglykane liegen auch im Knorpel, den Sehnen, der Haut und in der Gelenkflüssigkeit vor. Ähnlich sind Glucosaminoglykane wasserlösliche Polysaccharide, die in der Grundsubstanz verbindenden Gewebes gefunden werden, und die hoch geladene lineare Polyanione mit der allgemeinen Formel (AB)_n sind, wobei A ein Uronsäurerest und B ein Hexosamin ist.
Hyaluronsäure (HA) und sein Salz Natriumhyaluronat ist ein Beispiel eines natürlich auftretenden Glucosaminoglykans oder Mucopolysaccharids, das ein üblicher, extrazellulärer Matrixbestandteil ist. HA ist innerhalb des menschlichen Körpers allgegenwärtig und existiert in einem großen Spektrum von Formen in einer Vielzahl von Geweben, einschließlich der Gelenkflüssigkeit, dem Glaskörper, Blutgefäßwänden, der Perikardialflüssigkeit und der Nabelschnur.
Hyaluronsäure in chemisch modifizierter („derivatisierter") Form ist als eine chirurgische Hilfe nützlich, um Anhaftungen oder Ablagerungen von Körpergewebe während der nachoperativen Zeit zu verhindern (z.B. US-Patent Nr. 5,017,229). Die derivatisierte HA in Form eines Gels oder einer Membran wird über und zwischen beschädigte Gewebeoberflächen gelegt, um Anhaftungsbildung zwischen gegenüberliegenden Oberflächen zu verhindern. Um wirksam zu sein, muss das Gel oder der Film an Ort und Stelle bleiben und Gewebekontakt über einen Zeitraum verhindern, der lang genug ist, sodass, wenn das Gel schlussendlich sich verteilt und die Gewebe in Kontakt kommen, diese keine Tendenz mehr besitzen, aneinander zu kleben.
Chemisch modifizierte HA ist auch nützlich für Arzneimittelgabe mit kontrollierter Abgabe. Balazs et al., 1986, US-Patent Nr. 4,582,865, sagen, dass „quervernetzte Gele aus HA die Abgabe einer Substanz mit niedrigem Molekulargewicht, die darin dispergiert, jedoch nicht kovalent an die makromolekulare Gelmatrix gebunden ist, verlangsamen kann". Sparer et al., 1983, Kapitel 6, Seiten 107 bis 119, in Roseman et al., Controlled Release Delivery Systems, Marcel Dekker, Inc., New York, beschreibt die anhaltende Abgabe von Chloramphenicol, das kovalent über eine Esterbindung entweder direkt oder in einem Esterkomplex einschließlich einer Alaninbrücke als dazwischenliegende Linkergruppe an Hyaluronsäure gebunden ist.
Danishefsky et al., 1971, Carbohydrate Res., Band 16, Seiten 199 bis 205, beschreiben das Modifizieren eines Mucopolysaccharids durch Umwandeln der Carboxylgruppen des Mucopolysaccharids in substituierte Amide durch Umsetzung des Mucopolysaccharids mit einem Aminosäureester in Gegenwart von 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimidhydrochlorid („EDC") in wässriger Lösung. Sie setzten Glycinmethylester mit einer Vielzahl von Polysacchariden einschließlich HA um. Die resultierenden Produkte sind wasserlöslich; das heißt, dass sie schnell in Wasser oder in einer wässrigen Umgebung, wie sie zwischen Körpergeweben angetroffen wird, dispergieren.
Vorschläge, um die HA-Zusammensetzungen weniger wasserlöslich zu machen, schließen Quervernetzen der HA ein. R.V. Sparer et al., 1983, Kapitel 6, Seiten 107 bis 119 beschreiben in T.J. Roseman et al., Controlled Release Delivery Systems, Marcel Dekker, Inc., New York, das Modifizieren von HA durch Anbringen von Cysteinresten an die HA über Amidbindungen und anschließendes Quervernetzen des cysteinmodifizierten HA durch Bilden von Disulfidbindungen zwischen den angebrachten Cysteinresten. Die cysteinmodifizierte HA selbst war wasserlöslich und wurde nur durch Quervernetzen durch Oxidation zur Disulfidform wasserunlöslich.
De Belder et al., PCT-Veröffentlichung Nr. WO 86/00912, beschreiben ein langsam abbaubares Gel zum Verhindern von Gewebeadhäsionen infolge von Operationen, hergestellt durch Quervernetzen eines Carboxyl enthaltenden Polysaccharids mit einem bi- oder polyfunktionellen Epoxid. Andere reaktive bi- oder polyfunktionelle Reagenzien, die zur Herstellung von quervernetzten Gelen aus HA mit verminderter Wasserlöslichkeit vorgeschlagen wurden, schließen ein: 1,2,3,4-Diepoxybutan in alkalischem Medium bei 50°C (Laurent et al., 1964, Acta Chem. Scand., Band 18, Seite 274); Divinylsulfon in alkalischem Medium (Balazs et al., US-Patent Nr. 4,582,865 (1986)); und eine Vielzahl anderer Reagenzien einschließlich Formaldehyd, Dimethylolharnstoff Dimethylolethylenharnstoff, Ethylenoxid, ein Polyaziridin und ein Polyisocyanat (Balazs et al., Britische Patentanmeldung Nr. 84 20 560 (1984)). Mälson et al., 1986, PCT-Veröffentlichung Nr. WO 86/00079, beschreiben die Herstellung eines quervernetzten Gels aus HA für die Verwendung als Glaskörperersatz durch Umsetzung von HA mit einem bi- oder polyfunktionellen Quervernetzungsmittel, wie z.B. di- oder polyfunktionellem Epoxid. Mälson et al., 1986, EP 0 193 510 , beschreiben die Herstellung eines geformten Gegenstands durch Vakuumtrocknen oder Verdichten eines quervernetzten HA-Gels.
Es kann auch auf das Folgende verwiesen werden: K. Herrmann et al., Journal of Materials Science: Materials in Medicine, 5 (1994), Seiten 728 bis 731, das heparinmodifiziertes Polylactid als bioabbaubares, haemokompatibles Biomaterial betrifft; WO-A-94/01468, die ein Biomaterial betrifft, das ein durchdringendes Polymernetzwerk umfasst, worin eines der Polymerbestandteile ein saures Polysaccharid oder ein Derivat davon ist; WO-A-94/21299, die eine biokompatible Zusammensetzung für die Gewebevermehrung betrifft; und WO-A-96/02286, die Zusammensetzungen und Verfahren für eine bioartifizielle, extrazelluläre Matrix betrifft.
In einem Aspekt stellt die vorliegende Erfindung eine wasserunlösliche, biokompatible Zusammensetzung bereit, die dadurch gekennzeichnet ist, dass sie eine Kombination von Folgendem umfasst:

(a) ein wasserunlösliches, polyanionisches Polysaccharidderivat in Form eines Gels, das keine kovalenten Quervernetzungen zwischen den polyanionischen Polysaccharidmolekülen enthält, wobei das Gel durch Kombinieren von Hyaluronsäure, einem polyanionischen Polysaccharid und einem Carbodiimidaktivierungsmittel hergestellt wird; mit
(b) einem hydrophoben, bioabsorbierbaren Polymer, ausgewählt aus Polyglykolid, Polylactid (D, L, DL), Polydioxanonen, Polyestercarbonaten, Polyhydroxyalkanoaten, Polylactonen und Copolymeren davon.

In bevorzugten Ausführungsformen ist das polyanionische Polysaccharid ausgewählt aus Carboxymethylcellulose (CMC), Carboxymethylamylose (CMA), Chondroitin-6-sulfat, Dermatinsulfat, Heparin, Heparinsulfat, Heparansulfat oder Dermatin-6-sulfat. Bevorzugter ist das polyanionische Polysaccharid CMC oder CMA. In bevorzugten Ausführungsformen umfasst die biokompatible Zusammensetzung auch zwei oder mehr polyanionische Polysaccharidderivate, z.B. HA und CMC oder HA und Heparin. Bevorzugte hydrophobe, bioabsorbierbare Polymere schließen Polyglykolid oder Polylactid oder ein Copolymer oder Polyglykolid-Caprolacton oder Polyglykolid und Polylactid, Polylactid-Polycaprolacton ein. Die Zusammensetzungen der Erfindung können in Form einer adhäsionvermeidenden Zusammensetzung bereitgestellt werden, z.B. in einer Membran, einem Schaum, einem Film oder einer für die Extrusion geeigneten Zusammensetzung. Die Zusammensetzung, die ein wasserunlösliches, polyanionisches Polysaccharidderivat enthält, kann auch in Form von Fasern oder gestricktem oder gewebtem Stoff hergestellt werden.
Die Zusammensetzungen der Erfindung, die ein wasserunlösliches, polyanionisches Polysaccharidderivat enthalten, können auch als eine Verbundmatrix bereitgestellt werden, um Zell- und Gewebewachstum und -proliferation zu unterstützen. Z.B. kann jeder gewünschte Zelltyp in vitro kultiviert werden in Gegenwart einer der wasserunlöslichen Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung, um eine wasserunlösliche Matrix zu bilden, die mit den Zellen beschichtet, imprägniert oder infiltriert ist. Bevorzugt stammen die Zellen aus einem Säugetier und am bevorzugtesten von einem Menschen. In einem Beispiel können Fibroblast infiltrierte Matrizen auf die Stelle einer Hautläsion (z.B. Wunde oder Ulkus) gelegt werden, um die Heilung der Läsion zu beschleunigen. Andere Zelltypen, die auf den Matrizen dieser Erfindung kultiviert werden können, schließen Osteozyten, Chondrozyten, Keratinozyten und Tenozyten ein, sind jedoch nicht darauf beschränkt. Mit diesen Zellen imprägnierte Matrizen können verwendet werden, um bei der Heilung von Knochen, Knorpel, Haut bzw. Sehnen bzw. Bändern zu helfen. Es können auch Matrizen hergestellt werden, die eine Mischung von Zelltypen enthalten, z.B. um den Zellaufbau eines gewünschten Gewebes nachzuahmen. Die Matrizen dieser Erfindung können auch mit nicht differenzierten Mesenchymzellen, die zu einer Vielzahl von gewebespezifischen Arten nach ihrer Implantierung differenzieren können, oder mit Fötus- oder Neonatalzellen des gewünschten Typs beimpft werden. Ein Vorteil, der mit der Verwendung der wasserunlöslichen Zusammensetzungen als zelluläre Matrizen in vivo verbunden ist, ist der, dass die Matrix vollständig biokompatibel ist und durch den Körper reabsorbiert wird. Alternativ sind mit unterschiedlichen Zelltypen imprägnierte Matrizen hilfreich für in vitro diagnostische Anwendungen. Z.B. können Matrizen, die mit Fibroblasten infiltriert sind, verwendet werden, um die Wirksamkeit und/oder Toxizität unterschiedlicher pharmazeutischer oder kosmetischer Verbindungen zu testen.
Die Zusammensetzungen der Erfindung können des Weiteren ein Arzneimittel für die Verwendung als Arzneimittelabgabesystem einschließen. Das spezielle Arzneimittel, das verwendet wird, ist eine Frage der Auswahl in Abhängigkeit von der vorgesehenen Verwendung der Zusammensetzung. Bevorzugte Arzneimittel schließen Proteine (z.B. Wachstumsfaktoren, Enzyme), Steroide, nicht steroidale, entzündungshemmende Arzneimittel, cytotoxische Mittel (z.B. Antitumorarzneimittel), Antibiotika, Oligonukleotide (z.B. Antisense) und Biopolymere ein, sind jedoch nicht darauf beschränkt. Die Zusammensetzungen der Erfindung können des Weiteren Wachstumsfaktoren und Zellanhaftungsproteine oder -peptide einschließen, wenn sie für Zell- und Gewebewachstum und -proliferation bereitgestellt werden.
In einem zweiten Aspekt stellt die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung einer solchen biokompatiblen Zusammensetzung durch Kombinieren eines oder mehrerer polyanionischer Polysaccharide mit einem hydrophoben, bioabsorbierbaren Polymer unter Bedingungen bereit, die ausreichend sind, um die biokompatible Zusammensetzung zu bilden. Bevorzugt liegt das polyanionische Polysaccharid in Form eines Films oder Schaums vor.
In bevorzugten Ausführungsformen dieses Aspekts der Erfindung schließen Verfahren zum Kombinieren des hydrophoben, bioabsorbierbaren Polymers und des polyanionischen Polysaccharids die Beschichtung des polyanionischen Polysaccharids mit dem hydrophoben, bioabsorbierbaren Polymer ein, z.B. durch Besprühen oder Bebürsten des polyanionischen Polysaccharids mit einer hydrophoben, bioabsorbierbaren Polymerlösung; die Anwendung einer hydrophoben, bioabsorbierbaren Polymerbeschichtung nur auf einer Seite der polyanionischen Polysaccharidzusammensetzung; Vermischen des hydrophoben, bioabsorbierbaren Polymers mit einer Lösung der polyanionischen Polysaccharidzusammensetzung; Dispergieren von Fasern des hydrophoben, bioabsorbierbaren Polymers in einer Lösung der polyanionischen Polysaccharidzusammensetzung; und Verpressen eines Films des hydrophoben, bioabsorbierbaren Polymers auf die polyanionische Polysaccharidzusammensetzung, z.B. durch Hitzeverpressen bei erhöhter Temperatur, um sicherzustellen, dass das hydrophobe Polymer auf die polyanionische Polysaccharidzusammensetzung fließt. Das Verfahren der Erfindung kann auch das Eintauchen der unlöslichen Zusammensetzung in eine hydrophobe, bioabsorbierbare Polymerlösung unter Verwendung eines wasserunlöslichen Derivats eines polyanionischen Polysaccharids einschließen, um beide Seiten der unlöslichen, polyanionischen Polysaccharidzusammensetzung gleichzeitig zu beschichten. Nach Anwendung des hydrophoben, bioabsorbierbaren Polymers wird die Zusammensetzung getrocknet, um Lösungsmittel zu entfernen, wobei eine hydrophobe, bioabsorbierbare Polymermatrix aus polyanionischem Polysaccharid zurückbleibt.
Die hydrophobe, bioabsorbierbare Polymerlösung wird durch Auflösen des Polymers, der Polymere oder der Copolymere in einem flüchtigen Lösungsmittel, wie z.B. Methylenchlorid, bei einer Konzentration von 0,1 bis 50 Gew.-% hergestellt; bevorzugt 0,5 bis 20 Gew.-%; bevorzugter 0,5 bis 5 Gew.-%; und am bevorzugtesten 1,0 bis 3,0 Gew.-%.
In einem anderen Aspekt stellt die Erfindung ein Verfahren zum Fördern von Zellwachstum und -proliferation in vitro bereit. In diesem Aspekt schließt das Verfahren die Schritte des Nehmens einer Zellprobe, Vermischen der Zellen mit der wasserunlöslichen, biokompatiblen Matrix, die ein wasserunlösliches Derivat eines polyanionischen Polysaccharids kombiniert mit einem hydrophoben bioabsorbierbaren Polymer enthält, und anschließendes Kultivieren der Mischung unter Bedingungen, die ausreichend sind, um Wachstum und Eindringen der Zellen in die Matrix zu fördern. Zellen, die gemäß dem Verfahren der Erfindung gezüchtet werden können, schließen jeglichen Zelltyp ein, der in vitro kultiviert werden kann; bevorzugt handelt es sich um Säugetierzellen; und am bevorzugtesten stammen sie von einem Menschen.
In noch einem anderen Aspekt schließt die Erfindung ein Verfahren zum Fördern von Zellwachstum und -proliferation in vivo an einer Verletzungsstelle ein, z.B. in einem Säugetier, bevorzugt einem Menschen. Dieses Verfahren schließt die Schritte des Nehmens einer Zellprobe, die in der Lage ist, die Heilung der Verletzung zu fördern, Vermischen der Zellen mit einer wasserunlöslichen, biokompatiblen Matrix, die ein wasserunlösliches Derivat eines polyanionischen Polysaccharids kombiniert mit einem hydrophoben, bioabsorbierbaren Polymer, enthält, und Aufbringen der Mischung auf die Stelle der Verletzung in dem Säugetier, um Wachstum und Proliferation der Zellen an der Stelle zu fördern, um die Heilung der Verletzung zu vereinfachen.
Ausführungsformen dieses Aspekts der Erfindung schließen das Nehmen der Zellprobe direkt aus dem gewünschten Gewebe und Vermischen der Probe mit der wasserunlöslichen, biokompatiblen Matrix ein; Nehmen der Zellprobe aus dem gewünschten Gewebe und Kultivieren der Zelle in vitro vor dem Vermischen mit der wasserunlöslichen, biokompatiblen Matrix; und Nehmen der Zellprobe aus einer etablierten Zelllinie und Vermischen der Zellen mit der wasserunlöslichen, biokompatiblen Matrix. Bevorzugt wird die Beimischung, die die Zellprobe und die wasserunlösliche, biokompatible Matrix enthält, in vitro unter Bedingungen kultiviert, die ausreichend sind, um Proliferation und das Eindringen der Zellen in die Matrix vor dem Aufbringen auf die Stelle der Verletzung zu fördern.
Die Zellen, die mit der biokompatiblen Matrix für diesen Aspekt der Erfindung vermischt wurden, können von jedem beliebigen Zelltyp sein, der in der Lage ist, Zellwachstum und -proliferation an der Stelle der Verletzung zu unterstützen. Z.B. kann die Quelle der Zellen für das Säugetier xenogen sein, bevorzugt sind die Zellen jedoch allogen, und am bevorzugtesten sind die Zellen immunologisch kompatibel mit dem Säugetier. Des Weiteren kann die infiltrierte Matrix Zellen desselben Zelltyps enthalten, wie die Zellen, die an der Stelle der Verletzung (z.B. von demselben Gewebe) gefunden werden, oder die Zellmatrix kann Zellen enthalten, die von einem unterschiedlichen Zelltyp sind, die jedoch extrazelluläre Matrixbestandteile innerhalb der biokompatiblen Matrix deponieren, um als Gerüst für das Zellwachstum in vivo zu dienen.
Bevorzugte Ausführungsformen dieses Aspektes der Erfindung sind dadurch gekennzeichnet, dass die Zellen Fibroblasten sind und die infiltrierte Matrix auf die Stelle einer Hautläsion (z.B. eine Wunde, Verbrennung, klinischer Schnitt oder Hautulkus) gelegt wird; dass die Zellen Osteozyten sind und die infiltrierte Matrix auf die Stelle einer Knochenverletzung gelegt wird; dass die Zellen Chondrozyten sind und die infiltrierte Matrix auf die Stelle einer Verletzung an Knorpelgewebe gelegt wird; dass die Zellen Keratinozyten sind und die infiltrierte Matrix auf die Stelle einer Hautläsion gelegt wird; dass die Zellen Tenozyten sind und die infiltrierte Matrix an die Stelle der Verletzung einer Sehne gelegt wird; oder dass die Zellen nicht differenzierende Mesenchymzellen sind.
Die biokompatible Matrix, die in den Verfahren der Erfindung verwendet wird, kann des Weiteren eines oder mehrere Arzneimittel, z.B. ein Wachstumsfaktor, um das Wachstum der Zellen weiter zu fördern, und/oder ein Antibiotikum, um das Risiko einer Infektion an der Auflegestelle zu vermindern, enthalten.
Durch den Begriff „immunologisch kompatibel", wie er hierin verwendet wird, wird verstanden, dass die Zellen aus einem histokompatiblen Donor erhalten werden, um die Wahrscheinlichkeit einer Abstoßung durch das Immunsystem des behandelten Säugetieres zu minimieren. Bevorzugt sind die Zellen aus einem Individuum, das denselben oder einen kompatiblen HLA-Phenotyp besitzt. Am bevorzugtesten werden die Zellen direkt aus dem zu behandelnden Säugetier erhalten.
Ein „polyanionisches Polysaccharid" (PAS), wie der Begriff hierin verwendet wird, ist ein Polysaccharid, einschließlich sowohl nicht modifizierte als auch chemische Derivate davon, das mehr als eine negativ geladene Gruppe (z.B. Carboxylgruppe bei einem pH-Wert oberhalb ungefähr 4,0) enthält, und schließt Salze davon ein, wie z.B. Natrium- oder Kaliumsalze, Erdalkalimetallsalze, wie z.B. Calcium- oder Magnesiumsalze.
Ein „polyanionisches Polysaccharidderivat", wie der Begriff hierin verwendet wird, ist ein oder mehrere polyanionische Polysaccharide (PAS), das chemisch aus der natürlichen Form modifiziert wurde. Solche Modifikationen können die Addition von funktionellen Gruppen (z.B. substituierten Amidgruppen, Esterkupplungen und Amingruppen) einschließen; Reaktionen, die die Wasserunlöslichkeit des PAS durch kovalentes quervernetzen der PAS-Moleküle erhöhen; und Reaktionen, die die Wasserunlöslichkeit des PAS durch nicht kovalente Interaktionen, wie hierin beschrieben, erhöhen.
Mit „nicht modifiziertem, polyanionischen Polysaccharid" ist ein polyanionisches Polysaccharid mit seiner intakten, natürlichen chemischen Struktur gemeint.
Der Begriff „Film", wie er hierin verwendet wird, meint eine Substanz, die durch Verdichten eines Schaums zu einer dünnen Membran gebildet wird, durch Gießen in eine flache Gussform und Lufttrocknen zu einer dünnen Membran, oder durch Verdichten eines Gels oder von Fasern oder durch Trocknenlassen, oder durch Trocknen eines Gels oder von Fasern.
Der Begriff „Schaum", wie er hierin verwendet wird, meint Substanzen mit einer porösen Struktur, gebildet z.B. durch Lyophilisieren von polyanionischen Polysaccharidlösungen, -suspensionen, -gelen oder -fasern gemäß der Erfindung.
Der Begriff „hydrophob", wie er hierin verwendet wird, bezieht sich auf Verbindungen oder Zusammensetzungen, denen eine Affinität für Wasser fehlt.
Der Begriff „bioabsorbierbar", wie er hierin verwendet wird, bezieht sich auf die Fähigkeit eines gewebekompatiblen Materials, sich im Körper nach der Implantierung zu nicht toxischen Produkten abzubauen, die aus dem Körper eliminiert werden oder metabolisieren (Barrows, „Synthetic Bioabsorbable Polymers", Seite 243 in High Performance Biomaterials – A Comprehensive Guide to Medical and Pharmaceutical Applications, Michael Szycher, Hrsg., Technomic Publishing: Lancaster, PA, 1991).
Der Begriff „Polymer", wie er hierin verwendet wird, bezieht sich auf ein Molekül, das durch wiederholtes Binden von mindestens zwei, und bevorzugt mehr als zwei, kleinerer, monomerer Wiederholungseinheiten (z.B. Monosaccharid, Aminosäure, Nukleotide, Alkene oder organische Säureeinheiten) hergestellt wird. Demgemäß bezieht sich der Begriff Copolymer auf ein Polymer, das durch Kombinieren von zwei oder mehr copolymerisierten monomeren oder polymeren Spezies gebildet wird.
Eine „biokompatible" Substenz, wie der Begriff hierin verwendet wird, ist eine, die keine medizinisch nicht akzeptable, toxische oder verletzende Wirkungen auf eine biologische Funktionen besitzt.
Ein „wasserlöslicher" Film oder Schaum, wie der Begriff hierin verwendet wird, ist einer, der durch Trocknen einer wässrigen Lösung eines 1%igen Gewicht/Gewicht („Gew./Gew.") nicht modifizierten, polyanionischen Polysaccharids in Wasser hergestellt wird, und der Ausmessungen von 3 cm × 3 cm × 0,3 mm besitzt, der, wenn er in ein Becherglas von 50 ml destilliertem Wasser bei 20°C gegeben wird, und ohne Rühren stehengelassen wird, seine strukturelle Integrität als ein Film nach 3 min verliert und innerhalb von 20 min vollständig aufgelöst wird. Ein „wasserunlöslicher" Film gemäß der Erfindung, wie er hierin verwendet wird, sowie dieser Ausdruck und ähnliche Begriffe, die hierin verwendet werden, wird unter Verwendung einer 1%igen wässrigen Lösung eines polyanionischen Polysaccharids, das wie oben beschrieben modifiziert ist, gebildet und besitzt dieselben Größenabmessungen und wird ähnlich in einem Becherglas von 50 ml destilliertem Wasser bei 20°C ohne Rühren stehengelassen und ist nach 20 min strukturell intakt; die Ränder und Kanten des Files sind nach 24 h nach wie vor vorhanden.
Die Schäume, Filme oder andere Formen der Erfindung können in gefärbter Form hergestellt werden durch Einschließen eines Farbstoffs oder eines Färbemittels in die Reaktionsmischung. Solche gefärbten Filme und Gele können leichter gesehen werden, wenn sie eingebracht werden oder an Ort und Stelle, wodurch sie leichter während des Operationsverfahrens zu handhaben sind als farblose.
Im Allgemeinen besitzen die Zusammensetzungen der Erfindung verbesserte biokompatible und physikalische Eigenschaften gegenüber herkömmlichen Verbindungen. Daher sind die Zusammensetzungen der Erfindung besonders nützlich bei Verfahren zum Verhindern von Verklebungsbildung zwischen verletzten Geweben. Eine oder mehrere der Zusammensetzungen der Erfindung können zwischen oder unter die verletzten Gewebe, die dazu neigen Verklebungen zu bilden (z.B. chirurgische Einschnitte oder eine Verletzung) in einer Menge eingebracht werden, die ausreichend ist, um Verklebung der Gewebe während des Heilungsprozesses zu verhindern. Die Zusammensetzungen agieren als zeitlich begrenzte Grenzschicht zwischen den Geweben und bleiben lange genug dort, sodass, sobald die Zusammensetzung wieder absorbiert wurde und die Gewebe miteinander in Kontakt kommen, die Gewebe nicht mehr die Neigung haben zu verkleben.
Zusätzliche Verwendungen schließen Nervenführungen durch Formen des Schaums, Films oder Gels zu Röhren oder Matrizen für die Führung von Axonen infolge von Nervenverletzung ein, um die Wachstumszäpfchenverlängerung zu fördern, während das Risiko einer Neuromabildung vermindert wird. Sie sind auch nützlich als Gerüst für Zellproliferation und -migration, z.B. zur Hautregenerierung, wie auch zur Sehnen-, Band- und Knorpelregeneration. Diese Substanzen sind auch als Vehikel für die Arzneimittelgabe geeignet, da das Arzneimittel entweder vor oder nachdem die biokompatible Zusammensetzung gebildet wurde, eingeführt werden kann, wodurch eine kontrollierte Abgabe des zu verabreichenden Arzneimittels gestattet wird.
Die wasserunlöslichen, polyanionischen Polysaccharidzusammensetzungen, die mit den hydrophoben, bioabsorbierbaren Polymeren kombiniert wurden, besitzen die folgenden zusätzlichen Vorteile gegenüber unbeschichteten, chemisch modifizierten oder unmodifizierten, polyanionischen Polysaccharidzusammensetzungen: verbesserte mechanische Eigenschaften sowohl im trockenen als auch im nassen Zustand, wodurch das Produkt stärker und leichter zu handhaben wird und zu einer längeren Widerstandszeit in vivo führt; langsamere Hydratation des polyanionischen Polysaccharidbestandteils, um die anhaftenden Eigenschaften und die Lage der Zusammensetzungen beizubehalten; und verbesserte Wirksamkeit bei der Verhinderung postchirurgischer Verklebungen aufgrund der Zugabe des hydrophoben, bioabsorbierbaren Polymerbestandteils. Die Zusammensetzungen können mit einer hydrophilen Seite, die an Gewebe anhaftet, und einer nicht anhaftenden, hydrophoben Seite verarbeitet werden. Die hydrophobe Seite wird die Hydratation der hydrophilen Seite verlangsamen, die an dem Gewebe anhaften wird, während die hydrophobe Seite andere Gewebe, chirurgische Instrumente und Handschuhe daran hindert, an der Zusammensetzung anzuhaften.
Polyanionische Polysaccharide und ihre Salze können aus einer Vielzahl kommerzieller Standardquellen erhalten werden. Wasserunlösliche, polyanionische Polysaccharidgele, -filme und -schäume können nach irgendeinem Verfahren für die Verwendung in dieser Erfindung hergestellt werden. Die Gele können über die Bildung kovalenter Intra- und Interkettenquervernetzungen, wie vorher beschrieben, hergestellt werden (siehe beispielsweise Sparer et al., supra; De Belder et al., supra; Balazs et al., supra; Mälson et al., supra; und Prestwich et al., EP-Veröffentlichung Nr. 0 416 250 A2, 1991). Alternativ können wasserunlösliche Gele, die keine kovalenten Quervernetzungen zwischen den polyanionischen Polysaccharidmolekülen enthalten, unter Verwendung der Verfahren, beschrieben in Hamilton et al., US-Patent Nr. 4,937,270; Burns et al., US-Patent Nr. 5,017,229, siehe insbesondere Spalte 5, hergestellt werden.
Wie in dem letztgenannten Literaturhinweis offenbart, werden polyanionische, polysaccharidmodifizierte HA-Gele und -Filme im Allgemeinen hergestellt durch Vermischen von HA mit einem polyanionischen Polysaccharid und einem Aktivierungsmittel aus einem wasserunlöslichen Niederschlag. Schäume und Filme von Zusammensetzungen, die lösliche, polyanionische Polysaccharide und ihre Derivate enthalten, können durch Lyophilisieren oder Gefriertrocknen der Lösung erhalten werden. Zusammensetzungen, die wasserunlösliche, polyanionische Polysaccharidzusammensetzungen enthalten, können auch behandelt werden, um den gewünschten Film, Schaum, Pulver oder Fasern zu erzeugen. Um z.B. Filme zu erhalten, wird die Reaktionsmischung üblicherweise in ein Gefäß, z.B. eine Wanne, mit der gewünschten Größe und Form geschüttet und an der Luft trocknen gelassen.
Alternativ kann ein Film durch Verdichten eines wasserunlöslichen Gels unter Bedingungen, die das Entrinnen von Wasser ermöglichen, wie z.B. durch Verdichten des wasserunlöslichen Gels zwischen zwei Oberflächen, von denen mindestens eine porös ist, wie z.B. in EP 0 193 510 beschrieben, hergestellt werden.
Ein anderes alternatives Verfahren zur Herstellung von Blättern des Materials ist es, es dem Gefriertrocknen zu unterwerfen. Die Porengröße des endgültigen Produktes kann durch Anpassen der anfänglichen Gefriertemperatur unter Trocknungsbedingungen gesteuert werden. Gewölbte Oberflächen und andere Formen können in ähnlicher Art und Weise durch anfängliches Gießen des wasserunlöslichen Gels auf eine Negativabbildoberfläche und anschließendes Verarbeiten wie beschrieben hergestellt werden. Das getrocknete Blatt kann weiter verarbeitet werden, wenn gewünscht, durch Pressen zu einer bestimmten Dicke, z.B. in einer Carver-Laborpresse. Dies ist besonders hilfreich für Anwendungen, die das Einbringen eines dünnen Films zwischen anatomische Strukturen verlangt, wo der Platz beschränkt ist, und um zusätzliche mechanische Festigkeit zu verleihen.
Die Bildung von Schäumen, Fasern und anderen Formen oder Gegenständen kann auch durch Verwenden altbekannter Methoden in der Plastik- und Textilindustrie erreicht werden.
Z.B. können Schäume der wasserunlöslichen Polysaccharidderivate durch Gefriertrocknungsverfahren erzeugt werden, die im Stand der Technik gut bekannt sind, z.B. beschreiben Yannas et al., (US-Patent Nr. 4,280,954) und Dagalakis et al. (1980, J. Biomed. Mater. Res., Band 14, Seiten 511 bis 528), Verfahren zum Gefriertrocknen von Collagen-Mucopolysaccharidverbundstoffen und Steuern der Porenstruktur. Übliche Bedingungen sind Temperaturen unter –20°C und ein Vakuum unter 250 mTorr.
Fasern der wasserunlöslichen Polysaccharidderivate können durch Nassspinnverfahren, die im Stand der Technik wohlbekannt sind, hergestellt werden. Z.B. beschreibt Rupprecht (1979, Acta Chem. Scand., Band 33, Seiten 779 bis 780) das Nassspinnen von wässrigen Hyaluronsäurelösungen in einem Ethanolkoagulationsbad, um Fasern zu bilden. Alternativ können Fasern des hydrophoben, bioabsorbierbaren Polymers durch herkömmlichere Schmelzspinnmethoden, die im Stand der Technik wohlbekannt sind, hergestellt werden. Z.B. beschreiben Wassermann et al. (US-Patent Nr. 3,792,010 und 3,839,297) das Herstellen von Monofilament und umsponnenen Polyesternähten aus Lactid-Glykolid-Copolymeren. Die Fasern können durch Knüpf- oder Webmethoden, die im Stand der Technik bekannt sind, zu Stoffen verarbeitet werden.
Die Film- und Schaumderivate der polyanionischen Polysaccharidzusammensetzungen können durch dehydrothermale Bearbeitung (DHT: 95 bis 105°C bei 200 bis 760 mm Hg über 6 bis 24 h) gestärkt werden und mit hydrophoben, bioabsorbierbaren Polymeren kombiniert werden. Z.B. werden bioabsorbierbare Polymere, wie z.B. Polyglykolid (PGA), Polylactid (PLA) und Copolymere von PGA/PLA in leicht flüchtigen Lösungsmitteln, wie z.B. Methylenchlorid, Aceton, Ethylacetat, Tetrahydrofuran, n-Methylpyrrolidon, bei Konzentrationen von 0,5 bis 50,0 Gew.-% mit einem bevorzugten Bereich von 1 bis 3 Gew.-% gelöst. Unterschiedliche Verhältnisse von PGA und PLA können verwendet werden, einschließlich 100% PGA, 85% PGA:15% PLA, 50% PGA:50% PLA und 100% PLA; 1:1 PGA:PLA ist bevorzugt. Zusätzlich können andere hydrophobe, bioabsorbierbare Polymere, wie z.B. Polydioxanone, Polyorthoester, Polyestercarbonate, Polylactone (insbesondere Polycaprolacton) und Polyhdroxybutyrat/Valerat, einzeln oder als Copolymere, insbesondere Copolymere von PLA und Polycaprolacton, verwendet werden. Diese Lösungen werden dann auf die auf polyanionischem Polysaccharid basierte Vorrichtung unter Verwendung von Sprühgeräten, wie z.B. einem kleinen Chromatographiesprüher, mit Druckluft oder Argongas bei 2 bis 20 psi gesprüht, um einen 5%igen bis 100%igen Gewichtsgewinn zu erzielen. Beschichtete Schäume können zu dünnen Membranen bei 1,0 bis 5,0 metrischen Tonnen unter Anwendung einer Carver-Laborpresse mit 1 bis 50 mm Abstandshaltern gepresst werden oder ungepresst als dicke Schäume bestehen bleiben.
In einem alternativen Verfahren werden die polysaccharidbasierten Materialien und die hydrophoben, bioabsorbierbaren Polymere zusammen durch Wärmepressen einer Form des Polymers (Film, Schaum, Gitter, etc.) auf einen polyanionischen Polysaccharidschaum oder – film laminiert. Die bevorzugten Bedingungen der Laminierung hängen von den Wärmeeigenschaften der unterschiedlichen hydrophoben Polymere ab, fallen jedoch im allgemeinen in die folgenden Bereiche: 40 bis 230°C bei 0 bis 8 metrischen Tonnen Druck über 0 bis 5 min. Zusätzlich kann das hydrophobe Polymer durch Plasmabehandlung im Anschluss an die Laminierung hydrophiler gestaltet werden.
In einem zweiten alternativen Verfahren werden die bioabsorbierbaren Polymerfasern in die polysaccharidbasierten Materialien durch Zerschneiden oder Zerhacken der Fasern auf bestimmte Größen und Dispergieren dieser in polysaccharidbasierten Lösungen, bevor diese zu Filmen oder Schäumen gegossen oder lyophilisiert werden, eingearbeitet. Die bioabsorbierbaren Polymerfasern können auch auf ein Substrat als Gitter oder Matte gelegt werden und anschließend können die polysaccharidbasierten Lösungen darauf gegossen werden.
In einem dritten Verfahren werden die polysaccharidbasierten Filme und Schäume mit hydrophobe Polymeren mittels anderer Verfahren als dem oben beschriebenen Sprühbeschichtungsverfahren beschichtet. Z.B. können bioabsorbierbare Polymere, wie z.B. PGA, PLA und Copolymere von PGA/PLA, PLA/Polycaprolacton, und PGA/Polycaprolacton in organischen Lösungsmitteln bei Konzentrationen von 0,5 bis 50%, bevorzugt 1,0 bis 3,0%, aufgelöst werden. Die Polymerlösung kann dann auf die Oberfläche eines polysaccharidbasierten Films oder Schaums mit einem Abziehmesser (drawdown knife) verteilt oder gegossen und anschließend getrocknet werden. Alternativ können die wasserunlöslichen, polysaccharidbasierten Geräte in die Polymerlösung getaucht oder eingeweicht werden und anschließend an der Luft trocknen gelassen werden, um die Einarbeitung zu erzielen.
In noch einem anderen Verfahren können Verbundfasern hergestellt werden, die einen wasserunlöslichen Polysaccharidderivatkern und eine hydrophobe, bioabsorbierbare Polymerbeschichtung enthalten. Wässrige Lösungen, die Polysaccharidderivate enthalten, werden durch eine Spinndüse oder Spritzennadel in ein Koagulationsbad extrudiert, das eine bioabsorbierbare Polymerlösung, wie z.B. PGA/PLA, PLA/Polycaprolacton, enthält, oder PGA/Polycaprolacton aufgelöst in organischem Lösungsmittel. Das wasserunlösliche, polysaccharidbasierte Material fällt in dem Koagulationsbad aus und wird gleichzeitig mit dem bioabsorbierbaren Polymer beschichtet. Alternativ kann die wasserunlösliche, polysaccharidbasierte Faser mit polyabsorbierbarem, hydrophobem Polymer nach dem Koagulationsschritt des Nassspinnverfahrens durch Ziehen der Polysaccharidderivatfaser durch eine Lösung von bioabsorbierbarem, hydrophobem Polymer beschichtet werden.
Die Erfindung wird in den folgenden Beispielen detaillierter beschrieben. Diese Beispiele werden zur Veranschaulichung gegeben und sind nicht dazu gedacht, die Erfindung zu beschränken, mit Ausnahme davon, wie sie in den Patentansprüchen dargelegt ist.
Beispiel 1
Eine Lösung aus HA (5,5 g, 13,7 mol, MW 2.350.000) und CMC (2,5 g, 9,7 mol, MW 250.000) in Wasser (1 l) wurde mit 0,1 M HCl auf einen pH-Wert von 4,74 eingestellt, wonach 1-(-3-Dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodümid (10,6 g, 55,5 mol) zugegeben wurde. Der pH-Wert wurde zwischen 4,6 bis 5,1 über 1 h durch Zugabe von 0,1 M HCl beibehalten. Die umgesetzte Lösung wurde in Membranröhren (MW Rückhaltevermögen (cut off) 12 bis 14.000) über 24 h gegenüber entionisiertem Wasser, pH 4,0, dialysiert. Die gereinigte, chemisch modifizierte HA/CMC-Lösung wurde in Edelstahlbehälter gegossen und zu festen Schaumbahnen lyophilisiert. Insbesondere wurde die Temperatur des Produktes mit einer Geschwindigkeit von 0,1°C/min auf –20°C erniedrigt. Dann wurde der Trockenzyklus mit einem auf 150 mTorr gesetzten Vakuum ausgeführt und die Ablagetemperatur wurde mit 0,1°C/min auf 0°C erhöht. Die Temperatur wurde bei 0°C über 900 min beibehalten und dann mit 0,1°C/min auf 27°C erhöht. Die Schäume wurden dann durch hydrothermale Behandlung (150°C bei 200 μm Hg über 24 h) gehärtet. Die Schäume wurden dann gewogen und vor der Beschichtung in einen Polypropylenrahmen gesetzt.
Ein Lactid/Glykolidcopolymer (2,0 g, 50% PGA:50% PLA, Medisorb Corporation) wurde in Methylenchlorid (100 ml) aufgelöst. Diese Beschichtungslösung wurde dann bei 5 psi auf die Schäume unter Verwendung einer kleinen Chromatographiesprüheinrichtung mit Druckluft gesprüht. Eine Gewichtszunahme von 10 bis 15% wurde durch Verändern der Sprühdauer erzielt, basierend auf der Größe des Schaums und der berechneten Flussrate des Sprühens. Das Verdampfen des Methylenchloridlösungsmittels wurde durch direkt an das Besprühen anschließendes Bedecken des Schaums verlangsamt. Nach dem Trocknen wurden die Schäume zu dünnen Filmen gepresst (1 metrische Tonne, 15 s, 0,25 mm Abstand), geschnitten, abgepackt und bei 2,5 Mrad gammabestrahlt.
Material, das durch dieses Verfahren bereitgestellt wurde, wurde dann auf ein Vorbeugen von postoperativen Anhaftungen in einem Ratten-Cecal-Abschürfungsmodell untersucht (Goldberg et al. in Gynecologic Surgery and Adhesion Prevention, Willey-Liss, Seiten 191 bis 204, 1993). HA/CMC-Membrane oder -Schäume, Interceed TC7-Membrane (Johnson & Johnson) und HA/CMC-Film oder -Schäume, die mit PGA:PLA-Polymer beschichtet waren, wurden um operativ abgeschürfte Ratten-Zäkum herum angebracht und mit nicht behandelten Kontrollen verglichen (Tiere, dessen Zäkum abgeschürft wurde, die aber keine Behandlung erhielten). Die Ergebnisse aus zwei Studien sind in Tabelle 1 gezeigt.
Tabelle 1
Diese Ergebnisse zeigen, dass Filme und Schäume, die mit dem PGA:PLA-Polymer beschichtet sind, durchwegs die Anhaftungsbildung, verglichen mit der Kontrollgruppe, mit Tieren, die Interceed TC7 erhielten und mit Tieren, die entweder HA/CMC-Filme oder -Schäume erhielten, reduzierten.
Beispiel 2
In diesem Beispiel wurde modifiziertes HA/CMC-Pulver, das gemäß den Verfahren des US-Patents Nr. 4,937,270 (4,5 g) hergestellt wurde, und in destilliertem Wasser (450 ml) unter Verwendung eines Hochgeschwindigkeitsvermischers (20 min bei 1.000 U/min) suspendiert. Die wieder suspendierte Lösung wurde in teflonbeschichtete Edelstahlbehälter gegossen und zu festen Schaumblättern lyophilisiert. Die Lyophilisierung wurde wie im Beispiel 1 beschrieben durchgeführt.
Ein dünner Film von Polylactidcopolymer (90% PLA-L:10% PLA-DL) wurde von Medisorb Corporation erhalten. Der HA/CMC-Schaum und der Polylactidfilm wurden dann zusammen hitzeverschweißt zu dünnen Blättern (155 bis 165°C, 15 bis 30 s, 1 metrische Tonne, 0,30 mm Abstand). Die nassen Dehneigenschaften der Zusammensetzungen wurden mit einem Instron^TM Universal Testing System Modell 4201, das mit einer 500 g Beladezelle ausgestattet ist, bestimmt. Eine Versuchskammer wurde speziell für das Messen der mechanischen Eigenschaften der Proben gestaltet, während diese in eine physiologische Umgebung eingetaucht sind. Die Ergebnisse, die in Tabelle 2 gezeigt sind, zeigen, dass die Belastung beim Bruch unter nassen Bedingungen für die HA/CMC-Filme, die mit PLA laminiert wurden, wesentlich verbessert wurde. In diesem Experiment wurden die Proben in einer speziell gestalteten Umgebungskammer unterstützt, die eine physiologische Umgebung (gepufferte Salzlösung bei pH 7 und 25°C) enthält. Der anfängliche Probenhalterabstand betrug 25 mm und die Traversegeschwindigkeit betrug 5 mm/min.
Tabelle 2
Beispiel 3
In diesem Beispiel wurde modifiziertes HA/CMC-Pulver (4,5 g) in destilliertem Wasser (450 ml) unter Verwendung eines Hochgeschwindigkeitsvermischers (20 min bei 1.000 U/min) suspendiert. Ein Teil eines 100%igen PGA-Gitters wurde in eine mit Teflon beschichtete Edelstahlwanne gelegt. Die wieder suspendierte HA/CMC-Lösung wurde in die Wanne geschüttet und zu einem festen Schaumblatt gemäß dem Verfahren, beschrieben in Beispiel 1, lyophilisiert. Die Schaum- und die Gitterzusammensetzung wurden zu dünnen Blättern gepresst (1 metrische Tonne, 15 s, 0,25 mm Abstand) und durch dehydrothermale Behandlung (100°C über 6 h) gehärtet. Die nassen Dehneigenschaften der Zusammensetzung wurden bestimmt und sind in Tabelle 2 dargestellt. Die nasse Stärke der Zusammensetzung war viel größer als die Stärke des ursprünglichen HA/CMC-Schaums.
Die Ergebnisse aus den Beispielen 2 und 3 zeigen, dass die Zusammensetzung des HA/CMC-Schaums und der hydrophoben, bioabsorbierbaren Polymere unter hydratisierten Bedingungen (Nassbeladung) eine viel größere Stärke haben, als HA/CMC-Schaum ohne das hydrophobe, bioabsorbierbare Polymer.
Beispiel 4
Hyaluronsäure (5,5 g, 13,7 mol, MW 2.350.000) und Carboxymethylcellulose (2,5 g, 9,7 mol, MW 250.000) wurden in 1 l Wasser aufgelöst, und der pH-Wert der Lösung wurde mit 0,1 M HCl auf 4,75 eingestellt. 1-(-3-Dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodümid (10,6 g, 55,5 mol) wurde dann zugegeben und die Lösung wurde über 1 h durch Zugabe von 0,1 M HCl bei einem pH-Wert von 4,6 bis 5,1 gehalten. Die umgesetzte Lösung wurde dann gegenüber entionisiertem Wasser mit pH 4,0 dialysiert (MW Rückhaltevermögen (cut off) 12 bis 14.000). Die gereinigte Reaktionsmischung wurde dann in eine Polystyrolwanne bei einer Gussdichte von 2,2 g HA/CMC/ft² gegossen.
Polyglykolsäurefasern wurden durch Zerschneiden von Dexon-Wundnahtfaden hergestellt. Die Fasern wurden in Wasser beschallt, um ein mattenähnliches Material mit einem hohen Grad von Faserverfilzung herzustellen. Dieses Material wurde dann in Methylenchlorid hydratisiert, um den Fasern zu ermöglichen, zu verschmelzen, wonach die Fasern luftgetrocknet wurden. Das resultierende mattenähnliche Material wurde auf die gegossene HA/CMC-Reaktionsmischung bei einer Dichte von 0,1 g/ft² gegeben. Die gesamte Zusammensetzung wurde dann luftgetrocknet, um eine zweilagige Schicht aus PGA-Fasern und modifiziertem HA/CMC zu bilden.
Beispiel 5
Verfahren zum Impfen und Züchten von Säugetierzellen auf physikalischen Matrizen sind im Stand der Technik wohlbekannt. Der Zweck der Matrix ist es, den Zellen Halt zu geben, den Zellen zu erlauben, durch die Matrix zu migrieren, eine einfache Handhabung der Zellen für die Implantation zu ermöglichen und zu Unterstützen, dass die Zellen, sobald sie implantiert sind, an Ort und Stelle bleiben. Die neuen PSA-Verbundstoffe der vorliegenden Erfindung können als Matrix für diesen Zweck verwendet werden. In einem Beispiel wird die hydrophobe, bioabsorbierbare Matrix aus PSA-Derivat, die wie in Beispiel 2 beschrieben hergestellt wurde, auf die Größe und die Form einer Zellkulturschale zurechtgeschnitten. Säugetierfibroblasten, die aus der Haut durch Trypsinisierung isoliert oder aus einer Standardzelllinie (z.B. von der ATCC erhältlich) erhalten wurden, wurden bei 37°C in einer 5%igen CO₂-Atmosphäre und ungefähr 95 bis 100% relativer Luftfeuchtigkeit kultiviert. Sobald sie gewachsen sind, wurden die Fibroblasten aus der Kulturflasche durch Trypsinisierung entfernt und mit Kulturmedium, das fötales Kalbserum enthält, gewaschen. Die Zelldichte wurde auf ungefähr 10⁴ bis 10⁶ Zellen/ml angepasst.
Die Matrix wurde in die Kulturschale mit der hydrophoben Seite nach unten gelegt. Die Zellsuspension wurde auf die Matrix in der Zellkulturschale gegeben unter Sicherstellung der vollständigen Bedeckung der Matrix; und diese Mischung wurde bei 37°C und 5% CO₂ inkubiert. Die Zellen wurden auf der Matrix gezüchtet bis Zellproliferation durch die ganze Matrix hindurch auftrat. Die mit den Fibroblasten infiltrierte Matrix kann dann auf dermale Geschwüre, Verbrennungen und Wunden gelegt werde, um in der Wundheilung zu unterstützen oder als Hautersatz zu dienen. Die bevorzugte Quelle für die Fibroblasten ist autologes Gewebe. In Fällen jedoch, in denen die Verwendung von autologem Gewebe nicht geeignet ist oder das Gewebe nicht sofort zur Verfügung steht, können allogene oder sogar xenogene Fibroblasten verwendet werden. Biokompatible Matrizen, die xenogene oder allogene Zellen enthalten, sind für die Bereitstellung von extrazellulärem Gerüst nützlich, um die Migration und Etablierung von autologen Zellen während des Heilungsprozesses zu unterstützen. Biokompatible Matrizen, die nichtautologe Zellen enthalten, können auch mit standardimmunsuppressiven Therapien (z.B. Steroiden, Azathioprin, Cyclosporin), wenn gewünscht, verabreicht werden (z.B. zur selben Zeit oder direkt folgend auf die Anwendung der Matrix).
Des Weiteren können die biokompatiblen Matrizen auch mit Arzneimitteln oder Wachstumsfaktoren imprägniert werden, um Infektion an der Auflegestelle zu verhindern bzw. das Wachstum der Zellen zu verbessern. Z.B. wird erwartet, dass mit Fibroblasten infiltrierte Matrizen, die TGFβ₂ enthalten, besonders nützlich bei der Beschleunigung von Wachstum von epidermalem Gewebe sind.
Wir haben gezeigt, dass diese Vorrichtungen gegenüber bestehenden Produkten die Handhabungseigenschaften verbessert und das Vorkommen von postoperativen Anhaftungen in experimentellen Tiermodellen erfolgreicher vermindert haben. In diesen Experimenten haben HA/CMC:PGA/PLA Zusammensetzungen die Anhaftungsbildung vermindert, verglichen mit Tieren, die HA/CMC-Vorrichtungen, Interceed CT7-Filme (vermarktet von Johnson & Johnson zur Anhaftungsvorbeugung) erhielten oder mit unbehandelten Kontrolltieren.
Die wasserunlöslichen Zusammensetzungen der Erfindung können in Unterleibsoperationen, Operationen des Urogenitaltraktes, der Neurochirurgie, Gelenkoperationen und ophthalmologischen Operationen zu Zwecken verwendet werden, die die Beibehaltung von Gewebestellungen ohne Anhaftungsbildung verlangen. Sie können auch als abschließende Mittel an anastomotischen Stellen für Katheter, Darmanastomosen, endoskopischen Operationsverfahren, Gefäßtransplantaten und beliebigen prosthetischen Vorrichtungen, die das Zusammenkleben oder Abschließen von potentiellen Leckstellen verlangen; als neue, biokompatible Faser für die Verarbeitung für Fäden, Schnüre, gewobene oder nicht gewobene Netze, Bindungen und Matten und Fäden für den Wundverschluss; Sklerosierungsmittel zur Krampfadernentfernung, für Tumore und Aneurisma; künstliche, extrazelluläre Matrixmaterialien zum Zell- und Gewebeersatz für Haut, Sehne, Band, Knochen, Knorpel oder andere Gewebe oder Organe, verwendet werden.
Der Zeitraum, der nötig ist, um effektiv die Anhaftung zu verhindern, schwankt mit der vorliegenden Art der Operation oder Verletzung. Im Allgemeinen sollten Gewebe über mindestens 48 h getrennt bleiben, bevorzugt über einen Zeitraum von mindestens 7 Tagen. Demgemäß kann die Diffusionsgeschwindigkeit der Zusammensetzung, die in irgendeiner speziellen Situation verwendet wird, variieren, z.B. durch Ändern des Ausmaßes der Löslichkeit oder Unlöslichkeit der Zusammensetzung, durch Ändern der Dichte der verwendeten polyanionischen Polysaccharide oder durch Verändern der Dicke des Films, Schaums, Gels oder der verwendeten Fasern. Diese Eigenschaften können durch Routineverfahren verändert werden und die für irgendeine Art von Operation oder Trauma gewünschten Eigenschaften können durch Routineexperimente unter Verwendung der Anleitung der hierin beschriebenen Beispiele bestimmt werden.
Filme, Schäume oder Gele der Erfindung können des Weiteren für die Gabe von Arzneimitteln verwendet werden. Z.B. kann in dem Fall, in dem eine schnelle, lokale Gabe wünschenswert ist, wasserlösliche Zusammensetzungen innerhalb der Erfindung verwendet werden. Alternativ sind Zusammensetzungen, die wasserunlösliche, polyanionische Polysaccharide enthalten, nützlich für die fortwährende Abgabe von Arzneimitteln. Das zu gebende Arzneimittel kann innerhalb der Zusammensetzung dispergiert sein oder kann konventionell an den Schaum, Film oder das Gel, wie z.B. in R.V. Sparer et al., 1983, Kapitel 6, Seiten 107 bis 119, in T.J. Roseman et al., Controlled Release Delivery Systems, Marcel Dekker, Inc., New York, beschrieben, gebunden sein; und der Schaum, Film oder das Gel können dann an der Stelle, wo die Gabe wünschenswert ist, implantiert oder injiziert werden.

Claims

Wasserunlösliche, biokompatible Zusammensetzung, dadurch gekennzeichnet, dass sie eine Kombination umfasst von: a) einem wasserunlöslichen, polyanionischen Polysaccharidderivat in Form eines Gels, das keine kovalenten Querverbindungen zwischen den polyanionischen Polysaccharidmolekülen enthält, wobei das Gel durch Kombinieren von Hyaluronsäure, einem polyanionischen Polysaccharid und einem Carbodiimid-Aktivierungsmittel hergestellt wird; mit b) einem hydrophoben, bioabsorbierbaren Polymer, ausgewählt aus Polyglykolid, Polylactid, Polydioxanonen, Polyestercarbonaten, Polyhydroxyalkanoaten, Polylactonen und Copolymeren davon.
Zusammensetzung nach Anspruch 1, wobei das polyanionische Polysaccharid ausgewählt wird aus Carboxymethylcellulose, Carboxymethylamylose, Chondroitin-6-sulfat, Heparin, Heparinsulfat, Heparansulfat und Dermatinsulfat.
Zusammensetzung nach Anspruch 1 oder 2, wobei die biokompatible Zusammensetzung zwei oder mehr polyanionische Polysaccharidderivate umfasst.
Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei das hydrophobe, bioabsorbierbare Polymer in die Form von Fasern aufbereitet wird.
Zusammensetzung nach Anspruch 4, wobei die Fasern ein Netz oder eine Matte bilden.
Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei die Zusammensetzung in die Form einer Membran, eines Schaumes oder von Fasern aufbereitet wird.
Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei sie zusätzlich ein Medikament, ausgewählt aus Proteinen, Biopolymeren, Steroiden, nichtsteroidalen, entzündungshemmenden Medikamenten, zytotoxischen Mitteln, Antibiotika und Oligonukleotiden, enthält.
Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei die Zusammensetzung mit biologischen Zellen vermischt oder infiltriert ist.
Zusammensetzung nach Anspruch 8, wobei die Zellen von einem Säugetier abstammen.
Verfahren zur Herstellung einer wasserunlöslichen, biokompatiblen Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass es das Kombinieren eines polyanionischen Polysaccharidderivates mit einem hydrophoben, bioabsorbierbaren Polymer unter geeigneten Bedingungen umfasst.
Verfahren nach Anspruch 10, wobei das polyanionische Polysaccharidderivat in der Form eines Films oder Schaums vorliegt.
Verfahren nach Anspruch 10 oder 11, wobei die Kombination durch Beschichten einer Seite des polyanionischen Polysaccharidderivates mit dem hydrophoben, bioabsorbierbaren Polymer durch Sprühen des hydrophoben, bioabsorbierbaren Polymers auf das polyanionische Polysaccharidderivat, durch Überstreichen des hydrophoben, bioabsorbierbaren Polymers auf das wasserunlösliche, polyanionische Polysaccharidderivat, durch Eintauchen des wasserunlöslichen, polyanionischen Polysaccharidderivates in das hydrophobe, bioabsorbierbare Polymer, durch Dispergieren von Fasern des hydrophoben, bioabsorbierbaren Polymers in einer wässrigen Suspension des polyanionischen Polysaccharidderivates, oder durch Zusammendrücken eines Films des hydrophoben, bioabsorbierbaren Polymers auf das polyanionische Polysaccharidderivat, erreicht wird.
Verfahren zum Fördern von Zellwachstum und Proliferation, dadurch gekennzeichnet, dass es in vitro umfasst: Beschaffen einer Probe der Zellen; Vermischen der Zellen mit einer wasserunlöslichen, biokompatiblen Matrix, die eine Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 9 darstellt; und Kultivieren der Beimengung unter Bedingungen, die geeignet sind, um Wachstum und Infiltration der Zellen in die Matrix zu fördern.
Zusammensetzung zum Fördern von Zellwachstum und Proliferation in vivo an der Stelle einer Verletzung in einem Säugetier, dadurch gekennzeichnet, dass es eine Zellprobe umfasst, die mit einer wasserunlöslichen, biokompatiblen Matrix vermengt ist, die eine Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 9 darstellt.
Zusammensetzung nach Anspruch 14, wobei die Beimengung unter Bedingungen kultiviert wird, die geeignet sind, um Proliferation und Infiltration der Zellen in die Matrix vor der Anbringung an der Stelle der Verletzung in einem Säugetier zu fördern.
Zusammensetzung zur Verhinderung von Gewebeanhaftung, die eine Zusammensetzung gemäß einem der Ansprüche 1–9 ist.