DE69535459T2

DE69535459T2 - Monoklonale antikörper spezifisch gegen vegf-rezeptoren und ihre verwendung

Info

Publication number: DE69535459T2
Application number: DE69535459T
Authority: DE
Inventors: Patricia West Redding ROCKWELL; Neil I. Maplewood Goldstein
Original assignee: ImClone Systems Inc
Current assignee: ImClone LLC
Priority date: 1994-02-10
Filing date: 1995-02-10
Publication date: 2007-12-13
Anticipated expiration: 2015-02-11
Also published as: DE69535459D1; ATE359090T1; EP0741748A4; EP0741748A1; EP1602668A1; WO1995021868A1; US5840301A; EP0741748B1; AU1914795A; US5874542A; CA2185683A1

Description

HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Angiogenese ist der Vorgang der Entwicklung neuer Blutgefäße, der die Proliferation, Migration und Gewebsinfiltration von kapillären Endothelzellen aus bereits existierenden Blutgefäßen umfasst. Angiogenese ist wichtig in normalen physiologischen Vorgängen, einschließlich der embryonalen Entwicklung, des follikulären Wachstums und der Wundheilung, ebenso wie in pathologischen Zuständen, die Tumorwachstum und nichtneoplastische Erkrankungen umfassen, einschließlich der anomalen Neovaskularisierung, einschließlich des neovaskulären Glaukoms (Folkman, J. und Klagsbrun, M. Science 235:442–447 (1987)).
Das vaskuläre Endothel befindet sich im Allgemeinen im Ruhezustand, und dessen Aktivierung wird während der Angiogenese streng reguliert. Mehrere Faktoren wurden als mögliche Regulatoren der Angiogenese in vivo impliziert. Diese schließen den transformierenden Wachstumsfaktor (transforming growth factor, TGFb), den sauren und basischen Fibroblasten-Wachstumsfaktor (acidic and basic fibroblast growth factor, aFGF und bFGF), den aus Blutplättchen gewonnenen Wachstumsfaktor (platelet derived growth factor, PDGF) und den vaskulären endothelialen Wachstumsfaktor (vascular endothelial growth factor, VEGF) ein (Klagsbrun, M. und D'Amore, P. (1991) Annual Rev. Physiol. 53:217–239). VEGF, ein für Endothelzellen spezifisches Mitogen, unterscheidet sich von diesen Faktoren dadurch, dass er als ein Induktor der Angiogenese wirkt, indem er die Proliferation von Endothelzellen spezifisch fördert.
VEGF ist ein homodimeres Glycoprotein, das aus zwei 23 kD-Untereinheiten mit einer strukturellen Ähnlichkeit zu PDGF besteht. Vier verschiedene monomere Isoformen von VEGF existieren, die aus einem alternativen Spleißen der mRNA resultieren. Diese umfassen zwei Membran-gebundene Formen (VEGF₂₀ ₆ und VEGF₁₈₉) sowie zwei lösliche Formen (VEGF₁₆₅ und VEGF₁₂₁). In sämtlichen humanen Geweben, außer der Plazenta, ist VEGF₁₆₅ die am reichlichsten vorhandene Isoform.
VEGF wird in embryonalen Geweben exprimiert (Breier et al., Development (Camb.) 114:521 (1992)), in Makrophagen, in proliferierenden epidermalen Keratinozyten wäh rend der Wundheilung (Brown et al., J. Exp. Med., 176:1375 (1992)) und kann für Gewebsödeme, die mit Entzündung assoziiert sind, verantwortlich sein (Ferrara et al., Endocr. Rev. 13:18 (1992)). In situ Hybridisierungsstudien haben eine hohe Expression von VEGF in etlichen humanen Tumorlinien gezeigt, einschließlich des Gliobastoma multiforme, des Hämangioblastoms, Neoplasien des zentralen Nervensystems und des AIDS-assoziierten Kaposi-Sarkoms (Plate, K. et al. (1992) Nature 359: 845–848; Plate, K. et al. (1993) Cancer Res. 53: 5822–5827; Beckman, R. et al. (1993) J. Clin. Invest. 91: 153–159; Nakamura, S. et al. AIDS Weekly, 13 (1)). Hohe Konzentrationen an VEGF wurden außerdem in der Hypoxie-induzierten Angiogenese beobachtet (Shweiki, D. et al. (1992) Nature 359: 843–845).
Die biologische Antwort von VEGF wird durch dessen hoch affinen VEGF-Rezeptoren vermittelt, die während der Embryogenese (Millauer, B., et al. (1993) Cell 72: 835–846) und während der Tumorbildung selektiv auf Endothelzellen exprimiert werden. VEGF-Rezeptoren sind üblicherweise Thyrosinkinasen der Klasse III-Rezeptor-Art, die dadurch gekennzeichnet sind, dass sie mehrere, üblicherweise 5 oder 7, Immunglobulin-ähnliche Schlaufen in ihren aminoterminalen extrazellulären Rezeptor-Liganden-bindenden Domänen aufweisen (Kaipainen et al., J. Exp. Med. 178:2077–2088 (1993)). Die anderen beiden Regionen umfassen eine Transmembranregion und eine carboxyterminale intrazelluläre katalytische Domäne, unterbrochen durch eine Insertion hydrophiler Interkinasesequenzen mit variablen Längen, die Kinase-Insert-Domäne genannt wird (Terman et al., Oncogene 6: 1677–1683 (1991). VEGF-Rezeptoren schließen flt-1 ein, der von Shibuya M. et al., Oncogene 5, 519–524 (1990) sequenziert wurde; KDR, der in PCT/US92/01300 beschrieben wird, eingereicht am 20. Februar 1992 sowie in Terman et al., Oncogene 6:1677–1683 (1991) und flk-1, der von Matthews W. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88:9026–9030 (1991) sequenziert wurde.
Hohe Konzentrationen an flk-1 werden von Endothelzellen exprimiert, die Gliome infiltrieren (Plate, K. et al., (1992) Nature 359:845–848). Flk-1-Konzentrationen werden spezifisch von VEGF hochreguliert, der von humanen Glioblastomen produziert wird (Plate, K. et al. (1993) Cancer Res. 53:5822–5827). Der Befund hoher Expressionslevel von flk-1 in Glioblastomen, die mit Endothelzellen assoziiert sind (glioblastoma associated endothelials cells, GAEC) deutet darauf hin, dass die Rezeptoraktivität wahrscheinlich während der Tumorbildung induziert wird, da flk-1-Transkripte in normalen Endothelzellen des Gehirns kaum nachweisbar sind. Diese Hochregulierung ist auf die vaskulären Endothelzellen beschränkt, die sich in unmittelbarer Nähe zu dem Tumor finden. Eine Blockie rung der VEGF-Aktivität mit Hilfe von neutralisierenden anti-VEGF monoklonalen Antikörpern (mAbs) führte zu einer Inhibition des Wachstums humaner Tumor-Xenotransplantate in Nacktmäusen (Kim, K. et al. (1993) Nature 362: 841–844), was auf eine direkte Rolle für VEGF in der Tumor-bezogenen Angiogenese hindeutet.
Obwohl der VEGF-Ligand in Tumorzellen hochreguliert ist und seine Rezeptoren in Tumor-infiltrierten vaskulären Endothelzellen hochreguliert sind, ist die Expression des VEGF-Liganden und seiner Rezeptoren in normalen Zellen, die nicht mit der Angiogenese im Zusammenhang stehen, niedrig. Daher würden derartige normale Zellen durch ein Blockieren der Interaktion zwischen VEGF und seinen Rezeptoren, um die Angiogenese zu inhibieren und damit das Tumorwachstum, nicht beeinträchtigt werden. Ein Blockieren dieser VEGF-VEGF-Rezeptor-Interaktion unter Verwendung eines monoklonalen Antikörpers gegen den VEGF-Rezeptor wurde vor der vorliegenden Erfindung nicht beschrieben.
WO 92/14748 offenbart die Identifikation eines Genes, das für einen Rezeptor kodiert, der spezifisch an den vaskulären endothelialen Wachstumsfaktor bindet, ebenso wie die mutmaßliche Aminosäuresequenz des genannten Rezeptors. Weiterhin beschreibt sie die Herstellung Peptid-abgeleiteter polyklonaler Antikörper gegen den Rezeptor, indem Kaninchen mit einem synthetischen Peptid mit 13 Resten, das auf Grundlage der mutmaßlichen Aminosäuresequenz des KDR-Rezeptors synthetisiert wurde, immunisiert werden.
Millauer et al. (Cell 72, 835–846; 1993) beschreiben die Identifikation des vaskulären endothelialen Wachstumsfaktors (VEGF) als hoch affinen Liganden des murinen flk-1-Rezeptors. Polyklonale Antikörper gegen ein Fusionsprotein, das die 128 C-terminalen Aminosäuren des flk-1-Rezeptors umfasst, werden erzeugt.
Kim et al. (Growth Factors 7, 53–64; 1992) beschreiben die Erzeugung monoklonaler Antikörper gegen den humanen rekombinanten VEGF-Proteinliganden, der auf CHO-Zellen exprimiert wird.
WO 94/11499 ist Stand der Technik gemäß Artikel 54(3) EPÜ und offenbart die DNA-Sequenz des Gens, das für den murinen Rezeptor für VEGF (Flk-1-Rezeptor) kodiert. Die Autoren zeigen, dass die Expression des Rezeptors mit Endothelzellen assoziiert ist und identifizieren VEGF als den hoch affinen Liganden für den Flk-1-Rezeptor.
WO 94/10202 ist Stand der Technik gemäß Artikel 54(3) EPÜ und offenbart Antagonisten des humanen vaskulären endothelialen Faktors hVEGF.
Kim et al. (Nature 362, 841–844; 1993) berichten, dass die Inhibition der Wirkung des VEGF-Rezeptorliganden, der spontan von Tumorzellen produziert wird, das Tumorwachstum in vivo unterdrücken könnte.
Plate et al. (Nature 359, 845–848; 1992) beschreibt, dass die Expression von VEGF in zwei verschiedenen Untergruppen von Tumorzellen hochreguliert ist, die aus einem Glioblastom erhalten wurden, einem malignen Gehirntumor in Menschen, der durch vaskuläre Proliferationen gekennzeichnet ist. Diese Ergebnisse scheinen VEGF als einen potenziellen Tumor-Angiogenesefaktor in vivo zu identifizieren.
Ein Vorteil der Blockierung des VEGF-Rezeptors im Gegensatz zu der Blockierung des VEGF-Liganden, um die Angiogenese zu inhibieren und dadurch pathologische Zustände wie z.B. das Tumorwachstum zu inhibieren, ist, dass weniger Antikörper gebraucht werden können, um eine derartige Inhibition zu erreichen. Darüber hinaus können die Rezeptor-Expressionslevel konstanter sein als die des durch die Umgebung induzierten Liganden. Ein weiterer Vorteil der Blockierung des VEGF-Rezeptors ist, dass eine effizientere Inhibition erreicht werden kann, wenn sie mit einer Blockierung des VEGF-Liganden kombiniert wird.
Es ist das Ziel der vorliegenden Erfindung, die Aktivierung von flt-1 durch dessen Liganden VEGF zu neutralisieren. Ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung ist es, einen monoklonalen Antikörper zur Verfügung zu stellen, der die Interaktion zwischen VEGF und dessen Rezeptor neutralisiert und dadurch die VEGF-Phosphorylierung des Rezeptors verhindert. Ein weiteres Ziel dieser Erfindung ist es, pharmazeutische Zusammensetzungen zur Inhibierung des Tumorwachstums in Säugern unter Verwendung monoklonaler Antikörper zur Verfügung zu stellen.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung stellt einen monoklonalen Antikörper zur Verfügung, der spezifisch an eine extrazelluläre Domäne eines VEGF-Rezeptors bindet, der durch das flt-1-Gen kodiert wird und der die Aktivierung des Rezeptors neutralisiert, indem er die Phosphorylierung des Rezeptors verhindert.
Die Erfindung stellt weiterhin eine Hybridom-Zellinie DC101 (IgG1k) zur Verfügung, die den monoklonalen Antikörper produziert und die als ATCC-Zugangsnummer ATCC HB 11534 hinterlegt wurde, ebenso wie den monoklonalen Antikörper, der daraus hergestellt wird.
Weiterhin sind die Antikörper nützlich zur Neutralisierung der VEGF-Aktivierung eines VEGF-Rezeptors von Endothelzellen in vitro, was ein Inkontaktbringen der Zellen mit dem monoklonalen Antikörper gemäß der Erfindung umfasst.
Die Erfindung stellt ferner eine pharmazeutische Zusammensetzung zum Inhibieren der Angiogenese in einem Säugetier zur Verfügung, zur Verabreichung einer wirksamen Menge irgendeines der Antikörper gemäß der Erfindung an den Säuger. Darüber hinaus stellt die Erfindung eine pharmazeutische Zusammensetzung zum Inhibieren des Tumorwachstums in einem Säuger zur Verfügung, zur Verabreichung einer wirksamen Menge irgendeines der Antikörper gemäß der Erfindung an den Säuger.
Die Erfindung stellt außerdem eine pharmazeutische Zusammensetzung zur Verfügung, die irgendeinen der Antikörper gemäß der Erfindung sowie einen pharmazeutisch annehmbaren Träger umfasst.
BESCHREIBUNG DER FIGUREN
1: Western-Blot der flk-1/SEAPS-Immunpräzipitation mit dem monoklonalen Antikörper DC101, der zeigt, dass DC101 murines flk-1:SEAPS, nicht jedoch SEAPS allein immunpräzipitiert.
2a: Kompetitives Inhibitionsassay, das den Effekt eines anti-flk-1 monoklonalen Antikörpers DC101 auf die VEGF₁₆₅-induzierte Phosphorylierung des flk-1/fms-Rezeptors in transfizierten 3T3-Zellen zeigt.
2b: Sensitivität der VEGF-induzierten Phosphorylierung des flk-1/fms-Rezeptors gegenüber einer Inhibierung durch den monoklonalen Antikörper DC101. C441-Zellen wurden mit maximalen stimulatorischen Konzentrationen an VEGF₁₆₅ (40 ng/ml), kombiniert mit verschiedenen Konzentrationen des Antikörpers, untersucht.
3: Titration der VEGF-induzierten Phosphorylierung des flk-1/fms-Rezeptors in der Gegenwart des mAb DC101. C441-Zellen wurden mit den Konzentrationen an VEGF stimuliert, die in der Gegenwart (Spuren 1 bis 4) oder der Abwesenheit (Spuren 5 bis 8) von 5 μg/ml des MAb DC101 angegeben sind. Nicht-stimulierte Zellen, die in Gegenwart des Antikörpers untersucht wurden (Spur 9) dienten als Kontrolle. Densitometrische Aufnahmen der Menge des phosphorylierten Rezeptors in jeder Spur relativ zur jeweiligen VEGF-Konzentration sind dargestellt, um das Ausmaß der MAb-Inhibition bei einem Überschuss an Liganden-Konzentrationen zu zeigen. Zelllysate wurden für den Nachweis mittels anti-Phosphotyrosin, wie in den Beispielen unten beschrieben, hergestellt.
4: Inhibition der VEGF-flk-1/fms-Aktivierung durch vorgebundenen mAb DC101. C441-Zellen wurden mit den angegebenen Konzentrationen an VEGF stimuliert, in der Abwesenheit (Spuren 3 und 4) und Gegenwart (Spuren 5 und 6) von DC101. Nicht-stimulierte Zellen (Spuren 1 und 2) dienten als Kontrollen. MAb wurde unter Verwendung von zwei Sets von Versuchsbedingungen untersucht. Für P wurden Zellen mit Mab vorgebunden, gefolgt von einer Stimulation mit VEGF für 15 Minuten bei Raumtemperatur. Für C wurden MAb und Ligand gleichzeitig dazugegeben und wie oben beschrieben untersucht.
5: VEGF-induzierte Phosphorylierung des flk-1/fms-Rezeptors durch Behandlung mit verschiedenen Konzentrationen des monoklonalen Antikörpers DC101 und konditioniertem Medium von Glioblastomzellen (GB CM).
6: FACS-Analyse des anti-flk-1 mAb, der an flk-1/fms transfizierte 3T3-Zellen (C441) bindet. Transfizierte flk-1/fms 3T3-Zellen wurden für 60 Minuten mit 10 μg/ml des anti-flk-1 MAb DC101 oder dem Isotypen-passenden (isotype matched), irrelevanten anti-flk-1 MAb 23H7 auf Eis inkubiert. Die Zellen wurden gewaschen und mit 5 μg des Ziege-anti-Maus-IgG, der mit qFITC konjugiert ist, reinkubiert, gewaschen und mittels Durchflusszytometrie analysiert, um die Antikörperbindung zu bestimmen. Die Daten zeigen den Grad der Fluoreszenz für DC101 an C441-Zellen relativ zu dem Grad, der mit dem irrelevanten MAb 23H7 detektiert wurde.
7: Sättigungsbindung von mAb DC101 an den flk-1/fms-Rezeptor auf der transfizierten 3T3-Zelllinie C441. Konfluente C441-Zellen wurden in 24 Well-Platten mit zunehmenden Konzentrationen an MAb DC101 (50 ng/ml bis 2 μg/ml) für zwei Stunden bei 4°C inkubiert. Die Zellen wurden gewaschen und mit 5 μg anti-Ratte IgG-Biotinkonjugat inkubiert. Um die Bindung nachzuweisen, wurden die Zellen gewaschen, mit einer 1 : 1000 Verdünnung von Streptavidin-HRP inkubiert, gewaschen und in einem kolorimetrischen Nachweissystem (TMB) inkubiert. Die Daten stellen die Absorption bei 540 nm versus zunehmenden Konzentrationen an MAb DC101 dar. Die Bindung des sekundären Antikörpers an Zellen allein wurde von jeder Bestimmung subtrahiert, um die nicht-spezifische Bindung auszugleichen. Die Daten repräsentieren den Mittelwert von drei unabhängigen Experimenten.
8: Immunpräzipitation des phosphorylierten flk-1/fms aus mit VEGF stimulierten flk-1/fms transfizierten 3T3-Zellen. Die Zellen wurden mit VEGF wie in den experimentellen Methoden beschrieben stimuliert, und Lysate wurden mit irrelevanten oder relevanten Antikörpern wie folgt immunpräzipitiert: 1. Ratte-anti-flk2 IgG2a (Mab 2A13); 2. Ratte-anti-flk-1 IgG1 (Mab DC101); 3. Ratte-anti-flk2 IgG1 (Mab 23H7); 4. Kaninchen-anti-fms polyklonaler Antikörper. Immunpräzipitiertes Protein wurde einer SDS PAGE, gefolgt von Western-Blotting, unterzogen. Die Immunpräzipitation des VEGF-aktivierten Rezeptors wurde mittels Sondieren der Blots mit einem anti-Phosphotyrosin Antikörper nachgewiesen.
9: Sensitivität der VEGF-induzierten Phoshorylierung des flk-1/fms-Rezeptors gegenüber einer Inhibition durch den mAb DC101. Vorgebundene und kompetitive Assays wurden mit 40 ng/ml VEGF bei den angegebenen Antikörperkonzentrationen durchgeführt. Zelllysate wurden zur Rezeptordetektion mit anti-Phosphotyrosin wie in den Beispielen unten beschrieben hergestellt.
10: Wirkung des mAb DC101 auf CSF-1-induzierte Phosphorylierung des FMS-Rezeptors. In (B) wurde die mit fms/flk-2 transfizierte 3T3-Zelllinie, 10A2, mit optimalen stimulatorischen Konzentrationen an CSF-1 in der Abwesenheit (Spuren 3 und 4) und Gegenwart (Spuren 5 und 6) von 5 μg/ml MAb DC101 stimuliert. Nicht-stimulierte Zellen, die in Abwesenheit (Spur 1) oder Gegenwart (Spur 2) des Antikörpers untersucht wurden, dienten als Kontrollen. Zelllysate wurden für den Nachweis durch anti-Phosphotyrosin wie in den Beispielen unten beschrieben, hergestellt.
11: Spezifität der Neutralisierung des aktivierten flk-1/fms-Rezeptors durch mAb DC101. C441-Zellen wurden mit 20 oder 40 ng/ml VEGF in der Gegenwart von DC101 (IgG1) oder den irrelevanten anti-flk-2 Ratten monoklonalen Antikörpern 2A13 (IgG2a) oder 23H7 (IgG1) stimuliert. Assays wurden mit jedem Antikörper in der Abwesenheit von VEGF (Spuren 1 bis 3) und in der Gegenwart von VEGF unter kompetitiven (Spuren 4 bis 8) oder vorgebundenen (Spuren 9 bis 11) Bedingungen durchgeführt. Die Zelllysate wurden für den Nachweis mittels anti-Phosphotyrosin wie in den Beispielen unten beschrieben, hergestellt. Die Blots wurden gestrippt und erneut sondiert, um den flk-1/fms-Rezeptor unter Verwendung eines Kaninchen-polyklonalen Antikörpers gegen den C-terminalen Bereich des fms-Rezeptors nachzuweisen.
12: Bindung des MAb DC101 an intakte HUVEC-Zellen. Konfluente HUVEC-Zellen wurden auf mit Gelatine beschichteten 24 Well-Mikrotiterplatten mit den angegebenen Antikörperkonzentrationen auf ihre Bindung untersucht. Die Bindung wurde unter Verwendung desselben Protokolls wie den in der Legende zu 7 beschriebenen bestimmt.
13: Immunpräzipitation der phosphorylierten Rezeptorbanden aus VEGF-stimulierten HUVEC-Zellen. HUVEC-Zellen wurden bis zur Subkonfluenz in endothelialem Wachstumsmedium (EGM) für drei Tage ohne einen Wechsel des Mediums wachsen gelassen. Rezeptorformen wurden mit MAb DC101 aus Lysaten von stimulierten Zellen (Spur 1), VEGF-stimulierten Zellen (Spur 2) und Zellen, die mit VEGF in der Gegenwart von 1 μg/ml Heparin stimuliert wurden (Spur 3) immunpräzipitiert. Die Phosphorylierungsassays, Immunpräzipitationen und der Nachweis der phosphorylierten Rezeptorformen wurden wie in den experimentellen Methoden beschrieben durchgeführt.
14: Wirkung des mAb DC101 auf die Proliferation von HUVEC-Zellen in Antwort auf VEGF. Die Zellen wurden für 48 Stunden wie in der Legende zu 6 beschrieben wachsen gelassen. Die Zellen wurden anschließend den folgenden Assay-Bedingungen unterzogen: keine Zugabe von Medium (unbehandelt); ein Wechsel von frischem endothelialem Wachstumsmedium (Vollmedium); die Zugabe von 10 ng/ml VEGF in der Abwesenheit oder Gegenwart von 1 μg/ml Heparin; und VEGF und VEGF-Heparin-behandelte Zellen, untersucht in der Gegenwart von 1 μg/ml DC101. Die Zellen wurden mittels kolori metrischem Nachweis bei 550 nm unter Verwendung eines Zellproliferation-Assay-Kits (Promega) auf Proliferation untersucht.
15: Wirkung des mAb DC101 auf VEGF-Rezeptorformen in den Tumorzelllinien A431 und 8161.
16: Vergleich der Reduktion des Tumorwachstums in einzelnen Tieren zwischen der 2A13-Kontrollgruppe (Ratte-anti-flk2 monoklonaler Antikörper) und DC101 (Ratte-anti-flk-1 monoklonaler Antikörper).
17: Athymischen Nacktmäusen wurde subkutan die humane Glioblastomzelllinie GBM-18 injiziert, und sie wurden in 3 Gruppen eingeteilt: eine PBS-Kontrolle, eine Kontrolle mit irrelevantem Ratte-IgG1 23H7 und DC101. Die Behandlungen wurden gleichzeitig mit den Tumor-Xenotransplantaten verabreicht und für 4 Wochen fortgeführt.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung stellt monoklonale Antikörper zur Verfügung, die spezifisch an eine extrazelluläre Domäne eines VEGF-Rezeptors binden, der durch das flt-1-Gen kodiert wird. Eine extrazelluläre Domäne eines VEGF-Rezeptors ist hierin definiert als eine Liganden-bindende Domäne auf der aminoterminalen, extrazellulären Region des Rezeptors, der durch das flt-1-Gen kodiert wird.
Die Antikörper gemäß der Erfindung neutralisieren die Aktivierung des VEGF-Rezeptors, indem sie die Bindung des VEGF-Liganden an die extrazelluläre Bindungsdomäne des VEGF-Rezeptors verhindern und dadurch die Phosphorylierung des Rezeptors verhindern.
ANWENDBARKEIT
A. Neutralisieren der VEGF-Aktivierung des VEGF-Rezeptors
In vivo:
Die Neutralisierung der VEGF-Aktivierung eines VEGF-Rezeptors in einer Probe von Endothelzellen oder Nicht-Endothelzellen, wie z.B. Tumorzellen, kann in vivo durchge führt werden, wobei ein Antikörper gemäß der Erfindung durch Verabreichung an ein Säugetier mit einem VEGF-Rezeptor in Kontakt gebracht wird.
Verfahren zur Verabreichung an Säuger umfassen z.B. die orale, intravenöse, intraperitoneale, subkutane oder intramuskuläre Verabreichung.
Dieses in vivo-Neutralisierungsverfahren ist nützlich zum Inhibieren der Angiogenese in einem Säuger. Das in vivo-Neutralisierungsverfahren ist ein nützliches therapeutisches Verfahren, z.B. zur Verhinderung oder zum Inhibieren der Angiogenese, die mit pathologischen Zuständen im Zusammenhang steht, wie z.B. dem Tumorwachstum in einen Säuger. Entsprechend sind die Antikörper gemäß der Erfindung anti-angiogene immuntherapeutische Mittel.
Flk-1-Rezeptoren wurden unerwarteterweise auf Nicht-Endothelzellen gefunden, wie z.B. Tumorzellen, was auf das unerwartete Vorhandensein eines autokrinen Zyklus in diesen Zellen hindeutet. Die Antikörper gemäß dieser Erfindung sind nützlich zur Neutralisierung der VEGF-Phosphorylierung dieser Rezeptoren, wodurch der autokrine Zyklus blockiert wird und das Tumorwachstum inhibiert wird.
Die pharmazeutischen Zusammensetzungen zum Inhibieren der Angiogenese und pathologischer Zustände, wie z.B. dem Tumorwachstum in einem Säuger, sind nützlich zur Verabreichung einer wirksamen Menge einer der erfindungsgemäßen Antikörper an einen Säuger oder direkt an den Tumor in dem Säuger. Der Säuger ist vorzugsweise human. Die Zusammensetzung ist wirksam zur Behandlung von Individuen mit Karzinomen oder Sarkomen, vorzugsweise hochvaskulären Tumoren, wie z.B. dem Kaposi-Sarkom, ZNS-Neoplasien (kapilläre Hämangioblastome, Meningiome und cerebrale Metastasen), Melanome, gastrointestinale und renale Sarkome, Rhabdomyosarkome, Glioblastome, vorzugsweise Glioblastoma multiforme und Leiomysarkom.
Ein Cocktail mit etwa 3–6 monoklonalen Antikörpern gemäß der Erfindung stellt eine besonders wirksame Zusammensetzung zum Inhibieren des Wachstums von Tumorzellen dar.
Die kombinierte Zusammensetzung von einem oder mehreren Antikörpern gemäß der Erfindung mit anti-VEGF Antikörpern stellt eine wirksamere Zusammensetzung zum Inhibieren des Wachstums von Tumorzellen dar, als die Verwendung des Antikörpers oder der Antikörper allein.
Darüber hinaus stellt die kombinierte Zusammensetzung von einem oder mehreren Antikörpern gemäß der Erfindung mit einem anti-neoplastischen oder anti-chemotherapeutischen Arzneimittel, wie z.B. Doxorubicin, Cisplatin oder Taxol eine wirksamere Zusammensetzung zum Inhibieren des Wachstums von Tumorzellen zur Verfügung, als die Verwendung des Antikörpers allein. In einer Ausführungsform umfasst die pharmazeutische Zusammensetzung den Antikörper und den Träger mit einem anti-chemotherapeutischen Arzneimittel, das daran angefügt ist.
Die Verhinderung oder Inhibierung der Angiogenese ist ferner nützlich, um nicht-neoplastische angiogene pathologische Zustände, wie z.B. das neovaskuläre Glaukom, die proliferative Retinopathie, einschließlich der proliferativen diabetischen Retinopathie, der Makular-Degeneration, Hämangiome, Angiofibrome und Psoriasis, zu behandeln.
In vitro:
Die Erfindung stellt ein Verfahren zum Neutralisieren der VEGF-Aktivierung durch Phosphorylierung eines VEGF-Rezeptors in einer Probe von Endothelzellen zur Verfügung, das das Inkontaktbringen der Probe mit einem Antikörper gemäß der Erfindung, gleichzeitig mit oder nach der Zugabe von VEGF zu der Zellprobe, umfasst.
Da die flk-1-Rezeptorformen, wie in dieser Erfindung gezeigt wird, in nicht-Endothelzellen, wie z.B. Tumorzellen, exprimiert werden, ebenso wie in Endothelzellen, stellt die Erfindung ein Verfahren zum Neutralisieren der VEGF-Rezeptoraktivierung in Nicht-Endothelzellen, vorzugsweise Tumorzellen, zur Verfügung, das das Inkontaktbringen der Zellen einem Antikörper gemäß der Erfindung vor, gleichzeitig mit oder nach der Zugabe von VEGF zu den Zellen umfasst.
HERSTELLUNG DER ANTIKÖRPER
Die monoklonalen Antikörper gemäß der Erfindung, die spezifisch an den VEGF-Rezeptor binden, können mittels auf dem Gebiet bekannter Verfahren hergestellt werden. Diese Verfahren schließen das von Kohler und Milstein in Nature 256, 495–497 (1975) und Campbell in "Monoclonal Antibody Technology, the Production and Characterization of Rodent and Human Hybridomas" in Burdon et al., Hrsg., Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, Band 13, Elsevier Science Publishers, Amsterdam (1985) beschriebene immunologische Verfahren ein; ebenso wie das von Huse et al. in Science 246, 1275–1281 (1989) beschriebene rekombinante DNA-Verfahren.
Der Antikörper kann in einem Säuger hergestellt werden, einschließlich Mäusen, Ratten, Kaninchen, Ziegen und Menschen. Der Antikörper kann ein Mitglied einer der folgenden Immunglobulinklassen sein: IgG, IgM, IgA, IgD oder IgE und Unterklassen davon und ist vorzugsweise in IgG1-Antikörper.
In einer Ausführungsform ist der Antikörper ein monoklonaler Antikörper, der gegen ein Epitop des VEGF-Rezeptors gerichtet ist, der auf der Oberfläche einer Zelle vorhanden ist. In einer weiteren Ausführungsform ist der monoklonale Antikörper ein Ratte-IgG1 monoklonaler Antikörper, der spezifisch für den murinen VEGF-Rezeptor flk-1 ist und von dem Hybridom DC101 produziert wird. Die Hybridom-Zelllinie DC101 wurde am 26. Januar 1994 bei der American Type Culture Collection hinterlegt und wird als ATCC HB 11534 bezeichnet. In einer bevorzugten Ausführungsform ist der monoklonale Antikörper gegen ein Epitop des humanen flt-1-Rezeptors oder gegen einen humanen KDR-Rezeptor gerichtet.
Funktionelle Äquivalente von Antikörpern
Die Erfindung umfasst weiterhin funktionelle Äquivalente der in dieser Beschreibung beschriebenen Antikörper. Funktionelle Äquivalente haben Bindungseigenschaften, die mit denen der Antikörper vergleichbar sind und umfassen z.B. chimärisierte, humanisierte und Einzelketten-Antikörper, ebenso wie Fragmente davon. Verfahren zur Herstellung derartiger funktioneller Äquivalente sind in der PCT-Anmeldung Nr. WO 93/21319, in der europäischen Patentanmeldung Nr. EPO 239,400; der PCT-Anmeldung WO 89/09622; der europäischen Patentanmeldung Nr. 338,745; und der europäischen Patentanmeldung EPO 332,424 offenbart.
Funktionelle Äquivalente schließen Polypeptide mit Aminosäuresequenzen ein, die im Wesentlichen dieselben sind wie die Aminosäuresequenzen der variablen oder hypervariablen Regionen der Antikörper gemäß der Erfindung. "Im Wesentlichen dieselbe" Aminosäuresequenz wird hierin definiert als eine Sequenz mit wenigstens 70 % Homologie zu einer Aminosäuresequenz eines Antikörpers gemäß der Erfindung, wie mit Hilfe des FASTA-Suchverfahrens in Übereinstimmung mit Pearson and Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 2444–2448 (1988) bestimmt wird.
Chimärisierte Antikörper weisen vorzugsweise konstante Regionen auf, die im Wesentlichen oder ausschließlich von den konstanten Regionen eines humanen Antikörpers abgeleitet sind und variable Regionen, die im Wesentlichen oder ausschließlich von den Sequenzen der variablen Region eines anderen Säugers als dem Menschen abgeleitet sind.
Humanisierte Antikörper weisen vorzugsweise andere konstante Regionen und variable Regionen als die die Komplementarität determinierenden Regionen (CDRs) auf, die im Wesentlichen oder ausschließlich von den korrespondierenden humanen Antikörperregionen abgeleitet sind sowie CDRs, die im Wesentlichen oder ausschließlich von einem anderen Säuger als einem Menschen abgeleitet sind.
Geeignete andere Säuger als ein Mensch umfassen jeden Säuger, von dem monoklonale Antikörper hergestellt werden können, z.B. Kaninchen, Ratte, Maus, Pferd, Ziege oder Primat.
Einzelketten-Antikörper oder Fv-Fragmente sind Polypeptide, die aus der V-Region der schweren Kette des Antikörpers, verbunden mit der V-Region der leichten Kette mit oder ohne einen dazwischen liegenden Linker, bestehen. Dies umfasst die gesamte Antikörper-Kombinierungsstelle und ist die minimale Antikörper-Bindungsstelle. Diese Ketten können in Bakterien hergestellt werden.
Funktionelle Äquivalente umfassen weiterhin Fragmente von Antikörpern, die dieselben Bindungseigenschaften wie vollständige Antikörper oder mit denen von vollständigen Antikörpern vergleichbare Bindungseigenschaften aufweisen. Derartige Fragmente können ein oder beide Fab-Fragmente oder das F(ab')₂-Fragment enthalten. Bevorzugt enthält das Antikörperfragment alle sechs Komplementaritäts-determinierenden Regionen des vollständigen Antikörpers, obwohl Fragmente mit weniger als allen diesen Regionen, wie z.B. mit drei, vier oder fünf CDRs, ebenfalls funktionell sein können.
Weiterhin können die funktionellen Äquivalente Mitglieder irgendeiner der folgenden Immunglobulinklassen sein oder Mitglieder dieser Klassen kombinieren: IgG, IgM, IgA, IgD oder IgE und Unterklassen davon.
Herstellung von VEGF-Rezeptor-Immunogenen
Der VEGF-Rezeptor kann als ein Immunogen verwendet werden, um einen Antikörper gemäß der Erfindung zu erzeugen. Alternativ können synthetische VEGF-Rezeptorpeptide unter Verwendung kommerziell erhältlicher Maschinen und der Aminosäuresequenz des VEGF-Rezeptors, die z.B. von Shibuya M. et al., Oncogene 5, 519–524 (1990) für flt-1; PCT/US92/01300 und Terman et al., Oncogene 6:1677–1683 (1991) für KDR; und Matthews W. et al., Proc. Natl. Sci. USA, 88:9026–9030 (1991) für flk-1 zur Verfügung gestellt wurden, hergestellt werden.
Als weitere Alternative kann die für einen VEGF-Rezeptor kodierende DNA, wie z.B. eine cDNA oder ein Fragment davon, kloniert und exprimiert und das resultierende Polypeptid gewonnen werden und als ein Immunogen verwendet werden, um einen Antikörper gemäß der Erfindung zu erzeugen. Um die VEGF-Rezeptoren herzustellen, gegen welche die Antikörper erzeugt werden, können Nukleinsäuremoleküle, die für die VEGF-Rezeptoren gemäß der Erfindung oder für Teile davon kodieren, insbesondere für die extrazellulären Teile davon, in bekannte Vektoren für die Expression in Wirtszellen unter Verwendung von rekombinanten DNA-Standardverfahren insertiert werden. Standardmethoden für rekombinante DNA sind in Sambrook et al, "Molecular Cloning", zweite Ausgabe, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1987) und in Ausubel et al., (Hrsg.), "Current Protocols in Molecular Biology", Greene Associates/Wiley Interscience, New York (1990) beschrieben.
Eine geeignete Quelle für Zellen, die Nukleinsäuremoleküle enthalten, die den VEGF-Rezeptor exprimieren, schließen vaskuläre Endothelzellen ein.
Gesamt-RNA wird mit Hilfe von Standardmethoden aus Endothelrezeptor-enthaltendem Gewebe hergestellt. Die Gesamt-RNA wird zur Durchführung der cDNA-Synthese verwendet. Standardverfahren zum Isolieren von RNA und zum Synthetisieren von cDNA werden in Standard-Handbüchern der Molekularbiologie, wie z.B. in Sambrook et al., "Molecular Cloning", zweite Ausgabe, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1987) und in Ausubel et al., (Hersg.), "Current Protocols in Molecular Biology", Greene Associates/Wiley Interscience, New York (1990), zur Verfügung gestellt.
Die cDNA der Rezeptoren kann durch bekannte Verfahren amplifiziert werden. Zum Beispiel kann die cDNA als Template für die Amplifikation mittels Polymerasekettenreaktion (PCR) verwendet werden; siehe Saiki et al., Science, 239, 487 (1988) oder Mullis et al., US-Patent 4,683,195. Die Sequenzen der Oligonukleotidprimer für die PCR-Amplifikation sind von den Sequenzen des VEGF-Rezeptors der Maus bzw. des humanen VEGF-Rezeptors abgeleitet. Die Oligonukleotide werden mittels auf dem Gebiet bekannter Verfahren synthetisiert. Geeignete Verfahren schließen die von Caruthers in Science 230, 281–285 (1985) beschriebenen ein.
Um die gesamten Protein-kodierenden Bereiche für die VEGF-Rezeptoren zu isolieren, ist der stromaufwärts gelegene PCR-Oligonukleotidprimer komplementär zu der Sequenz an dem 5'-Ende, vorzugsweise umfassend das ATG-Startkodon und wenigstens 5–10 Nukleotide stromaufwärts des Startkodons. Der Downstream-PCR-Oligonukleotidprimer ist komplementär zu der Sequenz an dem 3'-Ende der gewünschten DNA-Sequenz. Die gewünschte DNA-Sequenz kodiert vorzugsweise für den gesamten extrazellulären Teil des VEGF-Rezeptors und kodiert optional für die gesamte oder einen Teil der Transmembranregion und/oder die gesamte oder einen Teil der intrazellulären Region, einschließlich des Stopkodons. Eine Mischung von Upstream- und Downstream-Oligonukleotiden wird in der PCR-Amplifikation verwendet. Die Bedingungen werden für jedes einzelne Primerpaar in Übereinstimmung mit Standardverfahren optimiert. Das PCR-Produkt wird mittels Elektrophorese für eine cDNA mit der korrekten Größe, die der Sequenz zwischen den Primern entspricht, analysiert.
Alternativ kann der kodierende Bereich in zwei oder mehreren überlappenden Fragmenten amplifiziert werden. Die überlappenden Fragmente sind so gestaltet, dass sie eine Restriktionsstelle enthalten, die die Zusammensetzung der intakten cDNA aus den Fragmenten erlaubt.
Die für die VEGF-Rezeptoren kodierende DNA kann außerdem in einer Vielzahl von Klonierungsvektoren in einer Vielzahl von Wirtszellen repliziert werden. Die Wirtszelle kann prokaryontisch oder eukaryontisch sein.
Der Vektor, in den die DNA gespleißt wird, kann Segmente chromosomaler, nicht-chromosomaler und synthetischer DNA-Sequenzen umfassen. Einige geeignete prokaryontische Klonierungsvektoren schließen die Plasmide aus E. coli, wie z.B. colE1, pCR1, pBR322, pMB9, pUC, pKSM und RP4, ein. Prokaryontische Vektoren umfassen außerdem Derivate von Phagen-DNA, wie z.B. M13 und andere filamentöse einzelsträngige DNA-Phagen.
Ein bevorzugter Vektor für die Klonierung der Nukleinsäure, die für den VEGF-Rezeptor kodiert, ist der Baculovirus-Vektor.
Expression und Isolation von Rezeptor-Immunogenen
Die DNAs, die für die VEGF-Rezeptoren gemäß der Erfindung kodieren, werden in einen geeigneten Expressionsvektor insertiert und in einem geeigneten prokaryontischen oder eukaryontischen Wirt exprimiert. Die in einen Wirt insertierte DNA kann für den gesamten extrazellulären Teil des VEGF-Rezeptors kodieren oder für ein lösliches Fragment des extrazellulären Teils des VEGF-Rezeptors. Der extrazelluläre Teil des VEGF-Rezeptors, der durch die DNA kodiert wird, ist optional an dem 5'-Ende oder dem 3'-Ende oder an beiden Enden an (eine) zusätzliche Aminosäuresequenz(en) angefügt. Die zusätzliche Aminosäuresequenz kann an die extrazelluläre Region des VEGF-Rezeptors natürlicherweise angefügt sein, wie z.B. die Leadersequenz, die Transmembranregion und/oder die intrazelluläre Region des VEGF-Rezeptors. Die zusätzlichen Aminosäuresequenzen können außerdem Sequenzen sein, die natürlicherweise nicht an den VEGF-Rezeptor angefügt sind. Vorzugsweise dienen derartige zusätzliche Aminosäuresequenzen einem bestimmten Zweck, wie z.B. der Verbesserung der Expressionslevel, der Sekretion, der Löslichkeit oder Immunogenität.
Vektoren zum Exprimieren von Proteinen in Bakterien, insbesondere E. coli, sind bekannt. Derartige Vektoren schließen die PATH-Vektoren ein, die von Dieckmann und Tzagoloff in J. Biol. Chem. 260, 1513–1520 (1985) beschrieben wurden. Diese Vektoren erhalten DNA-Sequenzen, die für die Anthranilat-Synthetase (TrpE) kodieren, gefolgt von einem Polylinker an dem Carboxyterminus. Andere Expressionsvektorsysteme basieren auf beta-Galactosidase (pEX); lambda P_L; Maltosebindungsprotein (pMAL); und Glutathion-S-Transferase (pGST) – siehe Gene 67, 21 (1988) und Peptide Research 3, 167 (1990).
In Hefe nützliche Vektoren stehen zur Verfügung. Ein geeignetes Beispiel ist das 2 μ-Plasmid.
Geeignete Vektoren für die Verwendung in Säugerzellen sind ebenfalls bekannt. Derartige Vektoren schließen wohlbekannte Derivate von SV-40, Adenovirus-, Retrovirusabgeleitete DNA-Sequenzen und Shuttle-Vektoren, die aus einer Kombination funktioneller Säugervektoren stammen, wie z.B. die oben beschriebenen, sowie funktionelle Plasmide und Phagen-DNA ein.
Weitere eukaryontische Expressionsvektoren sind auf dem Gebiet bekannt (z.B. P.J. Southern und P. Berg, J. Mol. Appl. Genet. 1, 327–341 (1982); S. Subramani et al., Mol. Cell. Biol. 1, 854–864 (1981); R.J. Kaufmann und P. A. Sharp, "Amplification And Expression Of Sequences Cotransfected with A Modular Dihydrofolate Reductase Complementary DNA Gene", J. Mol. Biol. 159, 601–621 (1982); R.J. Kaufmann und P.A. Sharp, Mol. Cell. Biol. 159, 601–664 (1982); S.I. Scahill et al., "Expression And Charac terization Of The Product Of A Human Immune Interferon DNA Gene In Chinese Hamster Ovary Cells, "Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80, 4654–4659 (1983); G. Urlaub und L.A. Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77, 4216–4220 (1980).
Die Expressionsvektoren, die in der vorliegenden Erfindung geeignet sind, enthalten wenigstens eine Expressionskontrollsequenz, die funktionell mit der DNA-Sequenz oder dem Fragment, die/das exprimiert werden soll, verbunden ist. Die Kontrollsequenz wird in den Vektor insertiert, um die Expression der klonierten DNA-Sequenz zu kontrollieren und zu regulieren. Beispiele für nützliche Expressionskontrollsequenzen sind das lac-System, das trp-System, das tac-System, das trc-System, wichtige Operator- und Promotor-Regionen des lambda-Phagen, die Kontrollregion des fd-Hüllproteins, die glycolytischen Promotoren der Hefe, z.B. der Promotor für die 3-Phosphoglyceratkinase, die Promotoren der sauren Phosphatase der Hefe, z.B. Pho5, die Promotoren der alphamating Faktoren der Hefe sowie Promotoren, die von Polyoma, Adenovirus, Retrovirus und Simian-Virus abgeleitet sind, z.B. die frühen und späten Promotoren oder SV40 und weitere Sequenzen, die dafür bekannt sind, dass sie die Expression von Genen von prokaryontischen oder eukaryontischen Zellen und deren Viren kontrollieren, oder Kombinationen davon.
Vektoren, welche die Rezeptor-kodierende DNA und Kontrollsignale enthalten, werden für die Expression des Rezeptors in eine Wirtszelle insertiert. Einige nützliche Expressions-Wirtszellen umfassen wohlbekannte prokaryontische und eukaryontische Zellen. Einige geeignete prokaryontische Wirte schließen z.B. E. coli, wie z.B. E. coli SG-936, E. coli HB 101, E. coli W3100, E. coli X1776, E. coli X2282, E. coli DHI und E. coli MRCI, Pseudomonas, Bacillus, wie z.B. Bacillus subtilis und Streptomyces ein. Geeignete eukaryontische Zellen schließen Hefe und andere Pilze, Insektenzellen, Tierzellen, wie z.B. COS-Zellen und CHO-Zellen, humane Zellen und Pflanzenzellen in Gewebekultur ein.
Nach der Expression in einer Wirtszelle, die in einem geeigneten Medium gehalten wird, können die VEGF-Rezeptoren aus dem Medium isoliert werden und mittels auf dem Gebiet bekannter Verfahren gereinigt werden. Wenn die VEGF-Rezeptoren nicht in das Kulturmedium sezerniert werden, werden die Wirtszellen vor der Isolation und Reinigung lysiert.
Die Antikörper gemäß der Erfindung können außerdem von VEGF-Rezeptoren hergestellt werden, die an die Oberfläche von Zellen gebunden sind, die den VEGF-Rezeptor exprimieren. Die Zelle, an die die VEGF-Rezeptoren gebunden sind, kann eine Zelle sein, die den Rezeptor natürlicherweise exprimiert, wie z.B. eine vaskuläre Endothelzelle. Alternativ kann die Zelle, an die der Rezeptor gebunden ist, eine Zelle sein, in welche die für den Rezeptor kodierende DNA transfiziert worden ist, wie z.B. eine 3T3-Zelle.
BEISPIELE:
Die folgenden Beispiele sind dargestellt, um das Verständnis der Erfindung zu unterstützen, sind jedoch nicht als den Umfang in irgendeiner Weise einschränkend gemeint und sollten so nicht aufgefasst werden. Die Beispiele enthalten keine detaillierten Beschreibungen konventioneller Verfahren, die bei der Konstruktion von Vektoren und Plasmiden, der Insertion von Genen, die für Polypeptide kodieren, in derartige Vektoren und Plasmide oder die Einführung der Plasmide in Wirte verwendet werden. Derartige Verfahren sind den durchschnittlichen Fachleuten auf dem Gebiet wohlbekannt und sind in zahlreichen Publikationen beschrieben, einschließlich Sambrook, J., Fritsch, E.F. und Maniatis, T. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Ausgabe, Cold Spring Harbor Laboratory Press.
Die experimentellen Ergebnisse dieser Erfindung zeigen, dass DC101 die VEGF₁₆₅-induzierte Phsophorylierung eines Maus flk-1/fms chimären Rezeptors, der in transfizierten 3T3-Zellen exprimiert wird, spezifisch blockiert. Der Mab zeigte keine Wirkung auf einen vollständig stimulierten chimären fms/flk2-Rezeptor durch CSF-1. Die unten beschriebenen in vivo-Studien zeigen, dass der mAb in der Lage war, das Tumorwachstum in Nackmäusen signifikant zu inhibieren.
IN VITRO-STUDIEN UNTER VERWENDUNG VON DC101
Experimentelle Methoden
Zelllinien und Medien
NIH 3T3-Zellen wurden von der American Type Culture Collection (Rockville MD) erhalten. Die C441-Zelllinie wurde konstruiert, indem 3T3-Zellen mit dem chimären Rezeptor Maus flk1/humanes fms transfiziert wurden. 10A2 ist ein 3T3-Transfektant, der den chimären Rezeptor humanes fms/Maus flk2 enthält, dessen Isolation und Charakterisierung beschrieben worden ist (Dosil, M. et al., Mol. Cell. Biol. 13:6572–6585 (1993)). Die Zellen wurden routinemäßig in Dulbecco's modified Eagle's medium (DME), dem 10 % Kälber serum (CS), 1 mM L-Glutamin, Antibiotika und 600 μg/ml G418 (Geneticin; Sigma, St Louis MO) zugesetzt war, gehalten.
Eine Gliobastom-Zelllinie wurde in DME gehalten, das mit 5 % CS, 1 mM L-Glutamin und Antibiotika angereichert war.
Eine stabile 3T3-Linie, die das lösliche chimäre Protein, Maus flk1:SEAPs (sekretorische alkalische Phosphatase) sezerniert, wurde erzeugt und aufrechterhalten.
Isolation monoklonaler Antikörper
Lewis-Ratten (Charles River Laboratorien) wurden mit einem Immunkomplex hyperimmunisiert, der aus dem Maus flk-1:SEAPs-löslichen Rezeptor, immunpräzipitiert unter Verwendung eines Kaninchen anti-alkalische Phosphatase polyklonalen Antikörpers und Protein-G-Sepharosekügelchen, besteht. Die Tiere erhielten 7 intraperitoneale Injektionen dieses Komplexes, verteilt über 3 Monate (Tage 0, 14, 21, 28, 49, 63, 67). Zu verschiedenen Zeitpunkten wurde den Tieren Blut aus der Schwanzvene entnommen, und die Immunseren wurden mit Hilfe eines ELISA auf einen hohen Titer, der an mflk-1:SEAPs bindet, untersucht. Fünf Tage nach der letzten Injektion wurden die Ratten getötet, und die Milzen wurden aseptisch entnommen. Die Splenozyten wurden gewaschen, gezählt und mit einem Verhältnis von 2 : 1 mit der murinen Myelomzelllinie NS1 fusioniert. Hybridome wurden in HAT-Medium selektiert, und Kolonien wurden mit Hilfe eines ELISA auf eine spezifische Bindung an mflk-1:SEAPs, nicht jedoch das SEAPs-Protein, untersucht. Eine Reihe positiver Hybridome wurde expandiert und dreimal mittels limitierender Verdünnung kloniert. Ein Subklon, DC101 genannt, wurde weiter charakterisiert.
ELISA-Verfahren
Antikörper wurden mittels Festphase-ELISA, in dem die Bindungseigenschaften verschiedener mAbs an flk-1:SEAP-Protein und SEAP-Protein verglichen wurden, untersucht. Mikrotiterplatten wurden mit 50 bis 100 ng/Vertiefung von entweder flk-1:SEAP oder AP in Carbonatpuffer mit pH 9,6 über Nacht bei 4°C beschichtet. Die Platten wurden mit phosphatgepufferter Salzlösung, die mit 10 % Neugeborenen-Kälberserum (NB10) ergänzt war, für eine Stunde bei 37°C blockiert. Überstände des Hybridoms oder gereinigte Antikörper wurden für zwei Stunden bei 37°C zu den Platten gegeben, gefolgt von Ziege-anti-Ratten-IgG, konjugiert mit Meerrettich-Peroxidase (Tago), der für eine weitere Stunde bei 37°C dazugegeben wurde. Nach ausgiebigem Waschen wurde TMB (Kirkegaard und Perry, Gaithersburg MD) plus Wasserstoffperoxidase als Chromogen dazugegeben, und die Platten wurden bei 450 nm in einem ELISA-Lesegerät ausgelesen.
Isotypisierung
Die Isotypisierung der verschiedenen monoklonalen Antikörper wurde wie zuvor beschrieben durchgeführt (Songsakphisam, R. und Goldstein, N.I., Hybridoma 12:343–348, 1993), unter Verwendung von Ratten Isotypen-spezifischen Reagenzien (Zymed Labs, South San Francisco CA).
Phosphorylierung, Immunpräzipitation und Immunblot-Assays
Die Phosphorylierungs-Assays und Western-Blot-Analysen mit C441- und 10A2-Zellen wurden wie zuvor beschrieben (Tessler et al., 1994) mit einigen Modifikationen durchgeführt.
Kurz beschrieben wurden die Zellen bis 90 % Konfluenz in DME-10 % CS wachsen gelassen, und anschließend unter Serum-Entzug in DME-0,5 % CS für 24 Stunden vor den Experimenten. HUVEC-Zellen wurden in EGM-Basismedium bis zur Subkonfluenz wachsen gelassen. Für die Neutralisierungsassays wurden die Zellen mit verschiedenen Konzentrationen des geeigneten Liganden unter serumfreien Bedingungen (DME-0,1 % BSA) in der Gegenwart oder Abwesenheit von mAb DC101 für 15 Minuten bei Raumtemperatur stimuliert. Die Liganden, VEGF und CSF-1, wurden mit Konzentrationen von 10–80 ng/ml bzw. 20–40 ng/ml untersucht. Monoklonale Antikörper wurden mit Konzentrationen im Bereich von 0,5 μg/ml bis 10 μg/ml untersucht. Um die Wirkungen des mAb DC101 auf die VEGF-induzierte Aktivierung des flk-1-fms-Rezeptors zu untersuchen, wurde der Antikörper entweder gleichzeitig dazugegeben (kompetitive Inhibierung) oder vor der Zugabe des Liganden für 15 Minuten bei Raumtemperatur an Zellen vorgebunden. Zellen, die in der Abwesenheit und Gegenwart von DC101 im serumfreien Medium inkubiert wurden, dienten als Kontrollen für die Rezeptor-Autophosphorylierung in der Abwesenheit des Liganden bzw. der Gegenwart des Antikörpers. Eine Kontrollzelllinie, die den fms/flk2-chimären Rezeptor (10A2) exprimiert, wurde hungern gelassen und mit 20 und 40 ng/ml CSF-1 stimuliert und in der Gegenwart und Abwesenheit von 5 μg/ml DC101 untersucht.
Nach der Stimulation wurden die Monolayer mit eiskaltem PBS gewaschen, das 1 mM Natriumorthovanadat enthält. Die Zellen wurden anschließend in Lydepuffer [(20 mM Tris-HCl, pH 7,4, 1 % Triton X-100, 137 mM NaCl, 10 % Glycerin, 10 mM EDTA, 2 mM Natriumorthovanadat, 100 mM NaF, 100 mM Natriumpyrophosphat, 5 mM Pefabloc (Boehringer Mannheim Biochemicals, Indianapolis IN), 100 μg Aprotinin und 100 μg/ml Leupeptin] lysiert und bei 14000 x g für 10 Minuten zentrifugiert. Das Protein wurde aus den geklärten Lysaten der transfizierten Zellen unter Verwendung von polyklonalen Antikörpern immunpräzipitiert, die gegen Peptide erzeugt wurden, die dem C-terminalen Bereich des humanen fms-Rezeptors (Tessler et al., J. Biol. Chem. 269, 12456–12461, 1994) oder der murinen flk-2-Interkinasedomäne entsprechen (Small et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91, 459–463, 1994), gekoppelt an Protein A Sepharosekügelchen. Wo dies angebracht war, wurden Immunpräzipitationen mit DC101 oder irrelevantem Ratten-IgG mit 10 μg Antikörper, gekoppelt an Protein-G-Kügelchen, durchgeführt. Die Kügelchen wurden anschließend einmal mit 0,2 % Triton X-100, 10 mM Tris-HCl, pH 8,0, 150 mM NaCl, 2 mM EDTA (Puffer A) gewaschen, zweimal mit Puffer A, enthaltend 500 mM NaCl und zweimal mit Tris-HCl, pH 8,0. Die abgetropften Kügelchen wurden mit 30 μl in 2x SDS-Ladepuffer gemischt und einer SDS PAGE in 4–12 % Gradientengelen (Novex, San Diego CA) unterzogen. Nach der Elektrophorese wurden die Proteine für die Analyse auf Nitrocellulosefilter geblottet. Die Filter wurden über Nacht in Blockierungspuffer (50 mM Tris-HCl, pH 7,4, 150 mM NaCl (TBS), enthaltend 5 % Rinderserumalbumin und 10 % fettfreie Trockenmilch (Biorad, CA) blockiert. Um phosphorylierten Rezeptor nachzuweisen, wurden die Blots mit einem monoklonalen Antikörper sondiert, der gegen Phosphotyrosin gerichtet ist (UBI, Lake Placid, NY), in Blocking-Puffer für 1 Stunde bei Raumtemperatur. Die Blots wurden anschließend ausgiebig mit 0,5 × TBS, enthaltend 0,1 % Tween-20 (TBS-T), gewaschen und mit Ziege-anti-Maus Ig, konjugiert mit Meerrettichperoxidase (Amersham) inkubiert. Die Blots wurden mit TBS gewaschen und für 1 Minute mit einem Chemilumineszenz-Reagenz (ECL, Amersham) inkubiert. Anti-Phosphotyrosin, das mit phosphorylierten Proteinen reagiert, wurde mittels Exposition auf einem leistungsstarken Lumineszenz-Detektionsfilm (Hyperfilm-ECL, Amersham) für 0,5 bis 10 Minuten detektiert.
Um flk-1/fms Rezeptorkonzentrationen in C441-Zellen nachzuweisen, wurden die Blots in Übereinstimmung mit den Angaben des Herstellers (Amersham) gestrippt und erneut mit dem anti-fms Kaninchen polyklonalen Antikörper sondiert.
Durchflusszytometrische Bindungsassays
C441-Zellen wurden nahezu bis zur Konfluenz in 10 cm-Platten wachsen gelassen. Die Zellen wurden mit einem nicht-enzymatischen Dissoziierungspuffer (Sigma) entfernt, in kaltem, serumfreiem Medium gewaschen und in Hanks balancierter Salzlösung, ergänzt mit 1 % BSA (HBSS-BSA), mit einer Konzentration von 1 Million Zellen pro Gefäß resuspendiert. Der mAb DC101 oder ein Isotypen-passender irrelevanter Antikörper anti-flk-2 23H7 wurde mit 10 μg pro Gefäß für 60 Minuten auf Eis dazugegeben. Nach dem Waschen wurden 5 μl Ziege-anti-Maus-IgG, konjugiert mit FITC (TAGO), für weitere 30 Minuten auf Eis dazugegeben. Die Zellen wurden dreimal gewaschen, in 1 ml HBSS-BSA resuspendiert und auf einem Coulter Epics Elite Cytometer analysiert. Die nicht-spezifische Bindung des fluoreszenten sekundären Antikörpers wurde in Proben bestimmt, denen der primäre Antikörper fehlt.
Bindungsassays an intakte Zellen
Assays mit C441-Zellen wurden mit Zellen durchgeführt, die in Schalen mit 24 Vertiefungen bis zur Konfluenz wachsen gelassen wurden. HUVEC-Zellen wurden in Schalen mit 6 Vertiefungen bis zur Konfluenz wachsen gelassen. Monolayer wurden bei 4°C für 2 Stunden mit verschiedenen Mengen des mAb DC101 in Bindungspuffer (DMEM, 50 mM HEPES, pH 7,0, 0,5 % Rinderserumalbumin) inkubiert. Die Zellen wurden anschließend mit kalter phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) gewaschen und mit einem sekundären anti-Ratte IgG-Antikörper, der mit Biotin konjugiert war, mit einer Endkonzentration von 2,5 μg/ml inkubiert. Nach 1 Stunde bei 4°C wurden die Zellen gewaschen und mit einem Streptavidin-Meerrettich-Peroxidase-Komplex für 30 Minuten bei 4°C inkubiert. Nach dem Waschen wurde zellgebundener Antikörper durch Messen der Absorption bei 540 nm, die mit Hilfe eines kolorimetrischen Nachweissystems (TMB, Kirkegaard und Perry) erhalten wurde, bestimmt. Die OD540 nm des sekundären Antikörpers allein diente als Kontrolle für die nicht-spezifische Bindung.
Zellproliferationsassays
Mitogene Assays wurden unter Verwendung des Cell Titer 96 Non Radioactive Cell Proliferation Assay Kits (Promega Corp., Madison, WI) durchgeführt. In diesem Assay wird die Proliferation kolorimetrisch als Wert gemessen, der aus der Reduktion eines Tetrazoiumsalzes durch lebende Zellen zu einem Formazanprodukt erhalten wird. Kurz be schrieben wurden die HUVEC-Zellen in 24-Well-Platten mit, die mit Gelatine beschichtet waren, in EGM-Basismedium mit 1000 Zellen/Vertiefung wachsen gelassen. Nach einer 48-stundigen Inkubation wurden verschiedene Komponenten zu den Vertiefungen gegeben. VEGF wurde mit 10 ng/ml in das Medium in der Gegenwart und Abwesenheit von 1 μg/ml des mAb DC101 gegeben. Wo dies angebracht war, wurde Heparin (Sigma) mit einer Endkonzentration von 1 μg/ml dazugegeben. Die Zellen wurden anschließend für weitere 3 Tage inkubiert. Um das Zellwachstum zu messen, wurde ein 20 μl-Aliquot des Tetrazolium-Farbstoffes zu jeder Vertiefung dazugegeben, und die Zellen wurden für 3 Stunden bei 37°C inkubiert. Die Zellen wurden gelöst, und die Absorption (OD570) des Formazanproduktes wurde zur Quantifizierung der Proliferation gemessen.
Ergebnisse
Ergebnisse des ELISA und der Immunpräzipitation
Es wurde festgestellt, dass der Ratte-IgG1 monoklonale Antikörper DC101 spezifisch für den murinen Tyrosinkinaserezeptor flk-1 ist. Die ELISA-Daten zeigten, dass der Antikörper an gereinigtes flk-1:SEAP band, nicht jedoch an alkalische Phosphatase oder andere Rezeptor-Tyrosinkinasen, wie z.B. flk-2. Wie in 1 zu sehen, immunpräzipierte DC101 murines flk-1:SEAPS, nicht jedoch SEAPS allein.
DC101 Neutralisierung des Flk-1-Rezeptors
Anschließend wurden Experimente durchgeführt, um zu bestimmen, ob DC101 die Phosphorylierung von flk1 in C441-Zellen durch dessen zugehörigen Liganden, VEGF₁₆₅, neutralisieren könnte. In diesen Studien wurden monoklonale Antikörper und VEGF gleichzeitig zu Monolayern gegeben, für 15 Minuten bei Raumtemperatur. Diese Bedingungen wurden vorgesehen, um die kompetitiven Wirkungen (kompetitive Inhibition) des Antikörpers auf die Rezeptor/Liganden-Bindung zu bestimmen. Die Ergebnisse dieser Assays, die in 2a gezeigt sind, zeigen, dass die VEGF₁₆₅-induzierte Phosphorylierung des flk1/fms-Rezeptors merklich reduziert war, wenn die Zellen in Gegenwart von DC101 untersucht wurden. Darüber hinaus legen diese Daten nahe, dass der Mab mit VEGF₁₆₅ kompetitiert, um eine vollständige Aktivierung des Rezeptors durch Liganden zu verhindern. Um die Sensitivität der VEGF-flk1-Interaktion gegenüber einer Inhibition durch DC101 zu bestimmen, wurden C441-Zellen mit maximalen stimulatorischen Konzentrationen an VEGF₁₆₅ (40 ng/ml), kombiniert mit verschiedenen Konzentrationen des Antikörpers, untersucht. Die Ergebnisse dieser Mab-Titrationen sind in 2b gezeigt. Eine deutliche Abnahme der Phosphorylierung von flk1 durch VEGF₁₆₅ wurde beobachtet, wenn DC101 mit Konzentrationen von größer als 0,5 μg/ml eingesetzt wurde. Diese Daten zeigen, dass relativ geringe Konzentrationen des Antikörpers (< 1 μg/ml) ausreichend sind, um die Rezeptoraktivierung durch den Liganden zu inhibieren. Bei 5 μg/ml ist der Antikörper fähig, die VEGF₁₆₅-Stimulierung von flk1 in der Gegenwart eines Überschusses des Liganden mit 80 ng/ml zu neutralisieren (3). Als Kontrolle wurde die Wirkung von DC101 auf den vollständig stimulierten fms/flk2-Rezeptor (10A2-Zelllinie) unter Verwendung von CSF-1 getestet. Unter diesen Bedingungen zeigte DC101 keine Wirkung auf die Rezeptoraktivierung.
Mab-Inhibition
Das Ausmaß und die Spezifität der Mab-Inhibition wurden mit Hilfe von Studien weiter untersucht, in denen DC101 vor der Zugabe des Liganden mit Zellen präinkubiert wurde, um eine maximale Interaktion des Antikörpers mit dem Rezeptor zu ermöglichen. In diesen Experimenten wurden Monolayer mit 5 μg/ml DC101, einem Ratten-anti-flk2 Mab (2A13), der mit Hilfe konventioneller Methoden hergestellt wurde (ImClone, NY) und einem Kontroll-Ratte-IgG1 (Zymed Labs) für 15 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert, vor der Zugabe von 40 ng/ml VEGF₁₆₅ für weitere 15 Minuten. Zum Vergleich wurden Assays durchgeführt, in denen DC101 und VEGF₁₆₅ gleichzeitig dazugegeben wurden (kompetitive Inhibition). Die Ergebnisse dieser Studien (4) zeigen, dass die Präinkubation des anti-flk-1 monoklonalen Antikörpers mit flk1/fms-transfizierten Zellen die Rezeptoraktivierung durch VEGF₁₆₅ vollständig außer Kraft setzt. Vergleichbare Ergebnisse wurden unter Verwendung von VEGF₁₂₁ für die Stimulation beobachtet. Während die Phosphorylierung von flk1 durch VEGF durch die Zugabe von irrelevanten Isotyppassenden Ratten-Antikörpern nicht beeinträchtigt wird, zeigt die Reaktivität desselben Blotes, der mit einem anti-fms polyklonalen Antikörper sondiert wurde, eine gleichmäßige Konzentration des Rezeptorproteins pro Spur. Diese Daten zeigen, dass die Inhibition der Phosphorylierung, die mit DC101 beobachtet wurde, auf die Blockierung der Rezeptoraktivierung eher als auf einen Mangel an Rezeptorprotein in der Testprobe zurückzuführen war.
FACS-Analyse:
Der mAb wurde mittels FACS-Analyse auf eine Bindung an 3T3-Zellen, die mit dem flk-1/fms-Rezeptor transfiziert waren (C441-Zellen), untersucht. Die Ergebnisse, die in 6 gezeigt sind, zeigen, dass der auf der Oberfläche der C441-Zellen exprimierte chimäre flk-1/fms spezifisch durch den mAb DC101 erkannt wird und nicht durch einen Antikörper desselben Isotyps, der gegen einen verwandten Tyrosinkinaserezeptor, flk-2, erzeugt wurde. Die Wirksamkeit der mAb-Rezeptor-Interaktion auf der Zelloberfläche wurde in Assays bestimmt, in denen unterschiedliche Level der mAb-Bindung auf intakten C441-Zellen gemessen wurden. Diese Ergebnisse, die in 7 gezeigt sind, zeigen, dass der mAb an den flk-1/fms-Rezeptor mit einer relativen scheinbaren Affnität von etwa 500 ng/ml bindet. Diese Ergebnisse zeigen, dass der mAb eine starke Affinität für Zelloberflächen-exprimiertes flk-1 aufweist.
Immunpräzipitation:
Das Ausmaß der mAb-Reaktivität mit dem flk-1/fms-Rezeptor wurde weiterhin untersucht, indem die Kapazität des Antikörpers, den Rezeptor nach einer Aktivierung durch VEGF immunzupräzipitieren, untersucht wurde. 8 zeigt eine Immunpräzipitation des phosphorylierten flk-1/fms-Rezeptors aus VEGF-stimulierten C441-Zellen durch den mAb DC101. Die Ergebnisse zeigen, dass der DC101 monoklonale und der anti-fms-polyklonale Antikörper ähnliche Level der Rezeptorinteraktion aufweisen, während die Ratte anti-flk-2 Antikörper 2H37 (IgG1) und 2A13 (IgG2a) keine Reaktivität zeigten. Experimente wurden anschließend durchgeführt, um zu bestimmen, ob der mAb DC101 die VEGF-induzierte Phosphorylierung von flk-1/fms bei maximalen stimulatorischen Konzentrationen des Liganden (40 ng/ml) neutralisieren könnte. In diesen Studien wurde monoklonaler Antikörper zu Monolayern gegeben, entweder gleichzeitig mit dem Liganden oder vor der Ligandenstimulation, und für 15 Minuten bei Raumtemperatur untersucht. Diese Bedingungen wurden untersucht, um sowohl die kompetitiven Wirkungen (kompetitive Inhibition) des Antikörpers auf die Rezeptor/Liganden-Bindung, als auch die Wirksamkeit des vorgebundenen Antikörpers, die Rezeptoraktivierung zu verhindern, zu bestimmen. Die Ergebnisse dieser Assays, die in 4 gezeigt sind, zeigen, dass die Phosphorylierung des flk-1/fms durch die gleichzeitige Zugabe von mAb mit VEGF reduziert ist und durch an den Rezeptor vorgebundenen Antikörper deutlich inhibiert ist. Eine densitometrische Untersuchung dieser Daten zeigte, dass der mAb DC101 mit flk-1/fms interagiert, um die Phosphorylierung auf ein Niveau zu inhibieren, das 6 % (Spur 5, P) und 40 % (Spur 6, C) der vollständig stimulierten Rezeptorkontrolle (Spur 4) beträgt. Aus diesen Daten folgern wir, dass der mAb DC101 stark mit der Liganden-Rezeptor-Interaktion kompetiert, um die flk-1-Rezeptoraktivierung zu neutralisieren. Um die Sensitivität der VEGF-flk-1-Interaktion gegenüber einer Inhibition durch den mAb DC101 zu untersuchen, wurden C441-Zellen mit maximalen VEGF-Konzentrationen in der Gegen wart zunehmender Konzentrationen des Antikörpers untersucht. Die Assays wurden mit dem mAb unter kompetitiven und Vorbindungs-Bedingungen durchgeführt. Die Ergebnisse dieser mAb-Titrationen sind in 9 gezeigt. Eine deutliche Abnahme der Phosphorylierung von flk-1 wird beobachtet, wenn der mAb DC101 mit VEGF-Antikörper mit Konzentrationen von größer als 0,5 μg/ml kompetiert. Diese Daten zeigen außerdem, dass relativ geringe Konzentrationen des vorgebundenen Antikörpers (< 1 μg/ml) ausreichend sind, um die Rezeptoraktivierung durch den Liganden vollständig zu inhibieren.
Phosphorylierung:
Um weiterhin das antagonistische Verhalten des mAb DC101 auf die Rezeptoraktivierung zu beurteilen, wurden Phosphorylierungsassays durchgeführt, in denen eine feststehende Menge des Antikörpers (5 μg/ml) zu C441-Zellen gegeben wurde, die mit zunehmenden Mengen des Liganden stimuliert wurden (3). Der durch die jeweilige Ligandenkonzentration in der Gegenwart und Abwesenheit des mAb DC101 induzierte Grad der Phosphorylierung wurde ebenfalls durch densitometrische Messungen quantifiziert. Die grafische Darstellung dieser Daten in 3 zeigt, dass der Antikörper fähig war, die Rezeptorphosphorylierung sogar in der Gegenwart von Überschussmengen an VEGF teilweise zu neutralisieren. Um die Spezifität des mAb DC101 auf die Rezeptoraktivierung zu untersuchen, wurde der Antikörper auf dessen Fähigkeit, die CSF-1-induzierte Aktivierung des fms/flk-2-Rezeptors in der 3T3-transfizierten Zelllinie 10A2 vollständig zu inhibieren, getestet. In diesen Experimenten wurden 5 μg/ml des mAb DC101 zusammen mit CSF-1-Konzentrationen (20 bis 40 ng/ml), von denen bekannt ist, dass sie zu einer vollständigen Aktivierung des Rezeptors führen, zusammen getestet. Diese Ergebnisse, die in 10 gezeigt sind, zeigen, dass der mAb DC101 keine Wirkung auf die durch CSF-1-vermittelte Phosphorylierung des fms/flk-2-Rezeptors hat.
Präinkubation:
Das Ausmaß und die Spezifität der mAb-Inhibition wurde weiterhin durch Studien untersucht, in denen der mAb DC101 oder irrelevante Antikörper vor der Zugabe des Liganden mit den Zellen präinkubiert wurden, um eine maximale Interaktion des Antikörpers mit dem Rezeptor sicherzustellen. In diesen Experimenten wurden Monolayer entweder mit 5 μg/ml DC101, einem Ratte-anti-flk2 mAb (2A13) oder einem Kontroll-Ratte-IgG1 (Zymed Labs) vor der Zugabe von 40 mg/ml VEGF präinkubiert. Zum Vergleich wurden kompetitive Assays durchgeführt, in denen die Antikörper und VEGF gleichzeitig dazugegeben wurden. Die Ergebnisse dieser Studien zeigen, dass nur die Präinkubation des anti-flk-1 monoklonalen Antikörpers mit flk1/fms-transfizierten Zellen die Rezeptoraktivierung durch VEGF vollständig außer Kraft setzt, während die Phosphorylierung von flk1 durch VEGF durch die Zugabe irrelevanter Isotypen-passender Ratten-Antikörper nicht beeinträchtigt wird. Die Reaktivität desselben Blotes, der mit den anti-fms polyklonalen Antikörpern sondiert wurde (11), zeigt eine gleiche Menge des Rezeptorproteins pro Spur. Diese Daten zeigen, dass die fehlende Phosphorylierung, die bei Zellen beobachtet wird, die mit mAb DC101 behandelt wurden, auf die Blockierung einer VEGF-induzierten Phosphorylierung gleicher Mengen des exprimierten Rezeptors zurückzuführen ist.
Anschließend wurden Experimente durchgeführt, um zu bestimmen, ob der anti-flk-1 mAb mit homologen Rezeptorformen auf humanen Endothelzellen interagiert. Eine Titration mit zunehmenden Konzentrationen an mAb DC101 auf HUVEC-Zellen ist in 12 gezeigt. Die Ergebnisse zeigen, dass der Antikörper ein komplexes Bindungsverhalten zeigt, das zu einem Muster mit zwei Aktivitätsspitzen führt. Die Daten zeigen eine differenzielle Antikörperinteraktion mit den niedigaffinen und hochaffinen Rezeptoren, von denen berichtet wurde, dass sie in Endothelzellen vorkommen (Vaisman et al., J. Biol. Chem. 265, 19461–19466, 1990). Die Spezifität der mAb DC101-Interaktion mit VEGF-stimulierten HUVEC-Zellen wurde anschließend unter Verwendung von Phosphorylierungsassays unter ähnlichen Bedingungen wie den für 8 beschriebenen untersucht. In diesen Studien immunpräzipitiert mAb DC101 Proteinbanden aus HUVEC-Zellen, die Molekulargewichte aufweisen, die denen für kreuzvernetzte VEGF-Rezeptorbanden ähneln, wenn die Ligandenkomponente subtrahiert wird (13). Diese Banden zeigen eine zunehmende Phosphorylierung, wenn die Zellen durch VEGF stimuliert werden (vgl. Spuren 1 und 2 in 13). Darüber hinaus wird die VEGF-induzierte Phosphorylierung der Rezeptorbanden durch den Einschluss von 1 μg/ml Heparin in dem Assay potenziert (Spur 3 in 13). Diese Beobachtungen stimmen mit früheren Berichten einer erhöhten VEGF-Bindung an Endothelzellen in der Gegenwart niedriger Konzentrationen von Heparin überein (Gitay-Goren et. al., J. Biol. Chem. 267, 6093–6098, 1992).
Eine inhibitorische Wirkung des mAb auf Endothelzellen wird beobachtet, wenn der Antikörper in mitogenen Assays von HUVEC-Zellen getestet wurde, die mit VEGF in der Gegenwart und Abwesenheit von Antikörper stimuliert wurden (14). Diese Ergebnisse zeigen, dass eine deutliche Zunahme der Zellproliferation durch VEGF durch den mAb DC101 um etwa 35 % reduziert wird. Heparin zeigte keine unterschiedliche Wir kung auf das Zellwachstum unter den in diesen Assays verwendeten Wachstumsbedingungen.
Nicht-Endothelzellen
Mehrere Tumorlinien wurden mittels Immunpräzipitation und Detektion mit anti-Phosphotyrosin auf Proteinreaktivität mit DC101 untersucht. Immunblots von den Zelllinien 8161 (Melanom) und A431 (epidermoides Karzinom) ergaben phosphorylierte Banden mit Molekulargewichten von 180 und 125 kD. In Phosphorylierungsassays mit aus- gehungerten Zellen induzierte VEGF eine Phosphorylierung dieser Banden, die blockiert wurde, wenn die Zellen in der Gegenwart von mAb DC101 aktiviert wurden (15).
Diese Ergebnisse zeigen, dass humane flk-1-Rezeptorformen nicht nur in Endothelzellen, sondern auch in Nicht-Endothelzellen exprimiert werden, wie z.B. in Tumorzellen. Da A431-Zellen hohe Konzentrationen an VEGF sezernieren, zeigen diese Ergebnisse außerdem das Vorhandensein einer autokrinen Schleife für die VEGF-Rezeptoraktivierung.
IN-VIVO-STUDIEN UNTER VERWENDUNG VON DC101
In-vivo Studien dieser Erfindung wurden entwickelt, um zu bestimmen, ob ein anti-flk1 monoklonaler Antikörper das Wachstum von VEGF-exprimierenden Tumorzellen blockieren würde. In diesen Experimenten wurde eine humane Glioblastoma multiforme – Zelllinie verwendet, die hohe Konzentrationen an VEGF-Transkript aufweist und etwa 5 ng/ml VEGF-Wachstumsfaktor nach einer 24-stündigen Konditionierung in serumfreiem Medium sezerniert (5).
Am Tag null wurde athymischen Nacktmäusen (nu/nu; Charles River Labs) 1–2 Millionen Glioblastomzellen in die Flanken injiziert. Beginnend an demselben Tag erhielten die Tiere intraperitoneale Injektionen von DC101 und Kontroll-Antikörpern (100 μg/Tier). Die Mäuse erhielten anschließend Antikörperbehandlungen an den Tagen 3, 5, 7, 10, 12, 14, 17, 19 und 21. Die Tiere erhielten Injektionen von 100 μg entweder von DC101 oder von einem Kontroll-Ratten-Antikörper gegen den murinen flk2-Rezeptor (2A13) an den Tagen 0, 3, 5, 7, 10, 12, 14, 17, 19 und 21 für eine Gesamt-Inokulation von 1 mg/Tier. Tumore begannen am Tag 5 aufzutreten und folgten für 50 Tage. Die Tumorgröße wurde täglich mit einem Messschieber gemessen, und das Tumorvolumen wurde mit Hilfe der folgenden Formen berechnet: p/6 × größerer Durchmesser × (kleinerer Durchmesser)² (Baselga J. Natl. Cancer Ins. 85: 1327–1333). Messungen wurden wenigstens dreimal pro Woche durchgeführt, und das Tumorvolumen wurde wie oben beschrieben berechnet. Ein Tier mit einem Tumor in der DC101-Gruppe starb frühzeitig in der Studie und wurde nicht für die Bestimmung der statistischen Signifikanz zwischen den Gruppen verwendet.
16 zeigt einen Vergleich zwischen der DC101-Gruppe und der 2A13-Kontrollgruppe bezüglich der Reduktion des Tumorwachstums über 38 Tage in den einzelnen Tieren. Obwohl sämtliche Tiere Tumore verschiedener Größen und Anzahl während der Dauer der Studie entwickelten, zeigten mit DC101 behandelte Mäuse insgesamt eine Verzögerung bei der Tumorentwicklung. Eine Maus in der DC101-Gruppe blieb bis zum Tag 49 tumorfrei, als ein kleines Wachstum beobachtet wurde. Selbst dann war das Tumorwachstum deutlich supprimiert. Eine statistische Analyse der Daten wurde durchgeführt, um die Unterschiede in der Tumorgröße zwischen den beiden Gruppen zu bewerten. Die Daten wurden einer Standardanalyse der Covarianz unterzogen, in der sich die Tumorgröße über die Zeit der Behandlung als Covariate zurückentwickelte. Die Ergebnisse zeigten, dass sich die Abnahme der Tumorgröße über die Zeit für die DC101-Gruppe signifikant (p < 0,0001) von der für die mit 2A13 injizierten Mäuse unterschied.
17 zeigt die therapeutische Wirksamkeit von DC101 in athymischen Nacktmäusen, die mit der humanen Glioblastom-Tumorzelllinie GBM-18, die VEGF sezerniert, transplantiert wurden. Den Nacktmäusen wurden subkutan GBM-18-Zellen injiziert, und sie wurden in drei Behandlungsgruppen aufgeteilt: eine PBS-Kontrolle, eine Kontrolle mit irrelevantem Ratten-IgG1 und DC101. Die Behandlungen wurden gleichzeitig mit den Tumor-Xenotransplantaten verabreicht und für vier Wochen fortgesetzt. Die Ergebnisse zeigten, dass das GBM-18-Tumorwachstum in mit DC101 behandelten Nacktmäusen im Vergleich zu den Kontrollen signifikant reduziert war. Dieses Experiment zeigt, dass DC101 das Tumorwachstum supprimiert, indem es die VEGF-Aktivierung von flk-1 auf Tumor-assoziierten vaskulären Endothelzellen blockiert, und dass DC101 einen therapeutischen Wert als anti-angiogenes Reagenz gegen vaskularisierte Tumoren hat, die VEGF sezernieren.
ZUSÄTZLICHE NACHARBEITBARKEIT
Die beanspruchte Erfindung wird in Übereinstimmung mit der obigen Beschreibung und den einfach erhältlichen Referenzen und Ausgangsmaterialien ermöglicht. Nichtsdestotrotz haben die Anmelder am 26. Januar 1994 bei der American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Md., 20852 USA (ATCC), die Hybridom-Zelllinien hinterlegt, welche die unten aufgelisteten monoklonalen Antikörper produzieren:
Hybridom-Zelllinie DC101, die einen anti-Maus-flk-1 monoklonalen Antikörper produziert (ATCC Zugangsnummer ATCC HB 11534).
Diese Hinterlegung wurde unter den Bestimmungen des Budapester Vertrages über die internationale Anerkennung der Hinterlegung von Mikroorganismen für die Zwecke von Patentverfahren und den dazugehörigen Regeln (Budapester Vertrag) durchgeführt. Diese stellt eine Aufrechterhaltung einer lebensfähigen Kultur für 30 Jahre, ausgehend von dem Tag der Hinterlegung, sicher. Der Organismus wird gemäß den Bestimmungen des Budapester Vertrages durch ATCC zur Verfügung gestellt, und ist Gegenstand einer Vereinbarung zwischen den Anmeldern und ATCC, die eine unbeschränkte Verfügbarkeit nach Herausgabe des entsprechenden US-Patents sicherstellt. Die Verfügbarkeit der hinterlegten Stämme ist nicht als eine Lizenz zum Praktizieren der Erfindung in Zuwiderhandlung der unter der Autorität einer jeden Regierung in Übereinstimmung mit dessen Patentrecht garantierten Rechten auszulegen.

Claims

Monoklonaler Antikörper, der spezifisch an eine extrazelluläre Domäne eines humanen VEGF-Rezeptors bindet, welcher durch das flt-1-Gen kodiert wird, und der die Aktivierung des Rezeptors durch Verhinderung der Phosphorylierung des Rezeptors neutralisiert.
Eine Hybridomzelllinie, die einen monoklonalen Antikörper gemäß Anspruch 1 produziert.
Ein Polypeptid, das spezifisch an eine extrazelluläre Domäne eines humanen VEGF-Rezeptors bindet, der durch das flt-1-Gen kodiert wird, und das die Aktivierung des Rezeptors durch Verhinderung der Phosphorylierung des Rezeptors aufhebt, wobei das Polypeptid ein funktionelles Äquivalent des monoklonalen Antikörpers gemäß Anspruch 1 ist.
Das Polypeptid gemäß Anspruch 3, wobei das Polypeptid ein funktionelles Äquivalent des monoklonalen Antikörpers gemäß Anspruch 1 ist, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus chimärisierten, humanisierten und Einzelketten-Antikörpern sowie Fragmenten davon.
Eine Nukleinsäure, die das Polypeptid gemäß Anspruch 3 oder 4 kodiert.
Ein chimärer Antikörper oder ein Fragment davon gemäß Anspruch 3 oder 4.
Ein chimärer Antikörper gemäß Anspruch 6, der eine Aminosäuresequenz einer konstanten Region eines humanen Antikörpers und eine Aminosäuresequenz einer variablen Region eines nicht-humanen Antikörpers umfasst.
Ein chimärer Antikörper gemäß Anspruch 7, worin die nicht-humane variable Region von der Maus stammt.
Ein humanisierter Antikörper oder ein Fragment davon gemäß Anspruch 1, 3 oder 4.
Der humanisierte Antikörper gemäß Anspruch 9, der Aminosäuresequenzen der Gerüstregionen und konstanten Regionen eines humanen Antikörpers sowie eine Aminosäuresequenz einer hypervariablen Region eines nicht-humanen Antikörpers umfasst.
Der humanisierte Antikörper gemäß Anspruch 10, worin die Aminosäuresequenz der hypervariablen Region von der Maus stammt.
Ein Verfahren zur Neutralisierung der VEGF-Aktivierung eines humanen VEGF-Rezeptors, der durch das flt-1-Gen kodiert wird, in Zellen, welches das Inkontaktbringen der Zellen in vitro mit dem monoklonalen Antikörper gemäß einem der Ansprüche 1, 6 bis 11 umfasst.
Das Verfahren gemäß Anspruch 12, worin die Zellen Endothelzellen sind.
Das Verfahren gemäß Anspruch 12, worin die Zellen Tumorzellen sind.
Eine pharmazeutische Zusammensetzung, die einen der Antikörper gemäß den Ansprüchen 1, 6 bis 11 sowie einen pharmazeutisch annehmbaren Träger umfasst.
Die pharmazeutische Zusammensetzung gemäß Anspruch 15, die weiterhin ein chemotherapeutisches Agens umfasst.
Die pharmazeutische Zusammensetzung gemäß Anspruch 15 zur Verwendung in einem Verfahren zum Inhibieren der Angiogenese in einem Säugetier, wobei das genannte Verfahren die Verabreichung einer wirksamen Menge von einem der Antikörper gemäß den Ansprüchen 1, 6 bis 11 an das Säugetier umfasst.
Die pharmazeutische Zusammensetzung gemäß Anspruch 15 zur Verwendung in einem Verfahren zum Inhibieren des Tumorwachstums in einem Säugetier, wobei das genannte Verfahren die Verabreichung einer wirksamen Menge von einem der Antikörper gemäß den Ansprüchen 1, 6 bis 11 an das Säugetier umfasst.
Die pharmazeutische Zusammensetzung gemäß Anspruch 17 oder 18, wobei das Säugetier ein Mensch ist.
Die pharmazeutische Zusammensetzung gemäß Anspruch 16 zur Verwendung in einem Verfahren zum Inhibieren des Tumorwachstums in einem Säugetier, wobei das genannte Verfahren die Verabreichung einer wirksamen Menge von einem der Anti körper gemäß den Ansprüchen 1, 5, 6 bis 11 sowie ein chemotherapeutisches Agens umfasst.
Die pharmazeutische Zusammensetzung gemäß Anspruch 20, worin das chemotherapeutische Agens ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Doxorubicin, Cisplatin und Taxol.
Ein Verfahren zur Herstellung eines Antikörpers gemäß Anspruch 1, das die folgenden Schritte umfasst: a) Herstellen eines Hybridoms, das den Antikörper exprimiert; b) Kultivieren des Hybridoms; und c) Isolieren des Antikörpers.