DE69610370T3

DE69610370T3 - Mit Antioxidantien gepfropfte Polysaccharide und deren Verwendungen

Info

Publication number: DE69610370T3
Application number: DE69610370T
Authority: DE
Inventors: Tuyen Thanh Wilmington Nguyen
Original assignee: Hercules LLC
Current assignee: Hercules LLC
Priority date: 1995-06-22
Filing date: 1996-06-13
Publication date: 2005-03-17
Anticipated expiration: 2016-06-14
Also published as: BR9602856A; US5612321A; DE69610370T2; ES2150050T3; EP0749982A1; RU2174985C2; ATE196479T1; KR970001374A; CA2179105A1; JPH0912603A; AU5612596A; DK0749982T3; DE69610370D1; ES2150050T5; EP0749982B1; AU699608B2; CN1143084A; PL314905A1; EP0749982B2; AR003439A1

Description

Diese Erfindung betrifft Polysaccharide mit aufgepfropften Antioxidantien und vorzugsweise Hyaluronsäure oder vernetzte Hyaluronsäure mit aufgepfropften gehinderten Phenolen.
Die Synovialflüssigkeit, die in den Gelenken von Säugern gefunden wird, wirkt als Schmiermittel und Stossdämpfer. Die wichtigste Komponente der Synovialflüssigkeit ist Natriumhyaluronat, welches den grössten Beitrag zu den mechanischen Eigenschaften der Flüssigkeit leistet. Hyaluronsäure ist ein natürlich vorkommendes Glykosaminoglycan mit hohem Molekulargewicht, das eine Disaccharid-Repetiereinheit von 2-Amino-2-desoxy-3-O-(β-D-glucopyranosyluronsäure)-D-glucose besitzt. Die Disaccharide sind verknüpft und bilden so durch β1-4-glykosidische Bindungen eine unverzweigte unvernetzte Polysaccharidkette. Zusätzlich zu ihrem Vorkommen in Synovialflüssigkeit tritt Hyaluronsäure in Zellhüllen, perizellulären Gelen, der extrazellulären Matrixsubstanz der Bindegewebe von Wirbeltieren, dem Glaskörper des Auges, dem menschlichen Nabelschnurgewebe, in Hahnenkämmen und in einigen Bakterien auf.
Während der Entzündung eines Gelenks, die beispielsweise durch Osteo-oder rheumatische Arthritis verursacht wird, verringern sich sowohl das Molekulargewicht der Hyaluronsäure als auch ihre Konzentration. Diese Verringerung des Molekulargewichts verringert die Fähigkeit der Synovialflüssigkeit als Stossdämpfer zu wirken, und so liefert die Flüssigkeit keinen adäquaten Schutz für den Knorpel des Gelenks. Darüber hinaus reduziert die Verringerung des Molekulargewichts auch die Viskosität und fördert so ein Auslaufen aus dem Gelenk. Im Fall fortgeschrittener Arthritis wird der Knorpel weggefressen, was zu Schmerzen führt, wenn das Gelenk in Bewegung ist (siehe z.B. "The Merck Manual of Diagnosis and Therapy-16th Edition", Seiten 1338-42).
Einer der Gründe für die Verringerung des Molekulargewichts und für die hohe Rate des Verlusts von Natriumhyaluronat aus der Synovialhöhle ist der Abbau des Moleküls durch Hydroxylradikale. Hydroxylradikale stammen aus zwei Quellen. Die erste Quelle sind weisse Blutzellen, welche in die Gelenke eindringen wenn sie entzündet sind und Xanthinperoxidase und andere En zyme unter Bildung von Superoxidanionen, Wasserstoffperoxid und Hypochlorit, welche beim Auseinanderbrechen Hydroxylradikale bilden, freisetzen. Eine andere Quelle für Hydroxylradikale ist die Reduktion von Sauerstoff durch Reduktionsmittel in Gegenwart von Eisen. Ein häufiges Reduktionsmittel im Körper ist Ascorbinsäure. Sauerstoff wird durch Eisen(II) unter Bildung des Superoxidanions reduziert, welches dann mit Eisen(III) unter Bildung von Wasserstoffperoxid reagiert. Wasserstoffperoxid wird zum Hydroxylradikal reduziert.
Über die Verwendung von Natriumhyaluronat mit recht niedrigem Molekulargewicht als Ergänzungssynovialflüssigkeit im Beingelenk von Rennpferden wurde berichtet (Balazs et al, J. Equine Vet. Sci, Seiten 217-228, 1985). Die Synovialflüssigkeit in den Gelenken von Menschen enthält jedoch Natriumhyaluronat mit wesentlich höherem Molekulargewicht als das von Pferden.
Lösungen von Natriumhyaluronat wurden auch als Ergänzungssynovialflüssigkeit für menschliche osteoarthritische Gelenke mittels Injektion in die Gelenke getestet. Die Behandlung von Arthritis durch Injektion von Natriumhyaluronat wurde von Weiss et al, Semin. Arthritis Rheum., 11, Seite 143 (1981); Nakimi et al, J. Clin. Pharmacol. Therapy Toxicology, 20, Seite 501 (1982); Grecomoro et al, Pharmatherapeutica, 5, Seite 137 (1987) und Briganiti et al, Clinical Trials Journal, 24, Seite 333 (1987), offenbart. Es wurde jedoch berichtet, dass intraartikuläre Injektionen von Natriumhyaluronatlösungen nicht messbar verschieden von Plazebos wirken (Dahlberg et al in "Arthritis & Rheumatism", 37, Seite 521, 1994). Brown et al in Exp. Physiol. 76, Seite 125 (1991), berichteten, dass die Halbwertszeit von Hyaluronsäure, die in ein Gelenk injiziert wurde, nur etwa 13 Stunden beträgt. Dahlberg, siehe oben, hat offenbart, dass eine Halbwertszeit von 13 Stunden für einen therapeutischen Wert kurz ist. Vermutlich ist die kurze Halbwertszeit von injizierter Hyaluronsäure teilweise eine Folge des Abbaus durch Hydroxylradikale (J.M. McCord, Science, 185, Seite 529, 1974).
Diese Erfindung betrifft neue Wege, die Beständigkeit von Polysacchariden, insbesondere Hyaluronsäure und Natriumhyaluronat, gegen Hydroxylradikale zu erhöhen, indem Antioxidantien auf sie aufgepfropft werden.
Diese Erfindung betrifft Pfropfpolysaccharid-Zusammensetzungen, die Polysaccharid umfassen, wobei auf mindestens eine Hydroxylgruppe des Polysaccharids ein Antioxidans aufgepfropft ist, wie in Anspruch 1 definiert.
Das Polysaccharid umfasst Polysaccharid, das saure Gruppen enthält. In der am meisten bevorzugten Ausführungsform umfasst das Polysaccharid Hyaluronsäure oder ein Salz der Hyaluronsäure; das Antioxidans umfasst gehindertes Phenol; und die Pfropfzusammensetzung hat wesentlich grössere Beständigkeit gegen Hydroxylradikale als ungepfropfte Hyaluronsäure oder ihr Natriumsalz.
In einer anderen Ausführungsform betrifft die Erfindung auch pharmazeutische Zusammensetzungen zur Behandlung der Entzündung von Säugergelenken, z.B. Arthritis, zur Verhinderung postoperativer Adhäsionsbildung und zur Förderung der Heilung chronischer Wunden, umfassend als Wirkstoff das erfindungsgemässe Polysaccharid mit aufgepfropftem Antioxidans.
In einer weiteren Ausführungsform betrifft die Erfindung Drug-Delivery-Systeme, umfassend ein vernetztes, mit einem Antioxidans gepfropftes Polysaccharid.
Die Erfindung betrifft auch kosmetische Zusammensetzungen, umfassend das erfindungsgemässe Pfropfpolysaccharid.
In einer anderen Ausführungsform betrifft die Erfindung Verfahren zur Behandlung der Entzündungen von Säugergelenken, z.B. Arthritis, zur Verhinderung des Auftretens postoperativer Adhäsionsbildung und zur Förderung der Heilung von chronischen Wunden und Geschwüren, umfassend die Injektion oder Applikation einer wirksamen Menge einer pharmazeutischen Zusammensetzung, die als Wirkstoff das erfindungsgemässe, mit einem Antioxidans gepfropfte Polysaccharid umfasst.
Die erfindungsgemässen Zusammensetzungen umfassen Stoffe mit einer Formel, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus:

worin R für das Rückgrat des Polysaccharids oder des vernetzten Polysaccharids, das saure Gruppen enthält, oder Salze davon steht, -(O)- der Rest einer Polysaccharidhydroxylgruppe ist, R₁ Wasserstoff, C_1-20-Alkyl, Phenyl oder substituiertes Phenyl ist, R₂ C_1-20-Alkyl, Phenyl oder substituiertes Phenyl ist und Ar Aryl oder substituiertes Aryl ist.
Vorzugsweise umfassen die erfindungsgemässen Zusammensetzungen Stoffe mit einer Formel, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus:

worin R für das Rückgrat eines Polysaccharids oder vernetzten Polysaccharids, enthaltend saure Gruppen oder Salze davon, steht, -(0)- der Rest einer Polysaccharidhydroxylgruppe ist; R₁ Wasserstoff, C_1-20-Alkyl, Phenyl oder substituiertes Phenyl ist; und R₂ C_1-20-Alkyl, Phenyl oder substituiertes Phenyl ist.
In den Formeln (I) bis (V) wird R₁ vorzugsweise ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Wasserstoff, Methyl, Ethyl, i-Propyl und t-Butyl und R₂ wird ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Methyl, Ethyl, i-Propyl und t-Butyl.
Besonders bevorzugt umfassen die Zusammensetzungen Stoffe der Formeln (I), (II) und (IV), worin R₁ und R₂ t-Butyl sind und worin das Polysaccharid Hyaluronsäure umfasst.
Die Polysaccharide für die erfindungsgemässe Verwendung, die eine saure Gruppe enthalten, schliessen Vertreter ein, die ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus Hyaluronsäure, Chondroitinsulfat, Keratansulfat, Dermatansulfat, Heparansulfat, Heparin, Carboxymethylcellulose, Hydroxyethylcarboxymethylcellulose, Carboxymethylstärke, Pectin, Xanthan, Alginsäure, Polygalacturonsäure, Polymannuronsäure, Polyglucuronsäure und Karrageen. Das am meisten bevorzugte ist Hyaluronsäure.
Die bevorzugten Salze in Übereinstimmung mit der Erfindung umfassen Salze eines Alkali- oder Erdalkalimetalls, von Aluminium oder Ammonium. Das am meisten bevorzugte Salz ist ein Natriumsalz.
Die erfindungsgemässen Pfropfpolysaccharide können auch vernetzt sein. Vernetzte Polysaccharide können durch ein beliebiges Verfahren des Standes der Technik hergestellt werden. Sakurai et al offenbaren in US-PS 4 716 224 vernetzte Hyaluronsäure oder Salze davon, die durch Vernetzung von Hyaluronsäure oder ihrer Salze mit einem polyfunktionellen Epoxid hergestellt werden. In US-PS 4 863 907 offenbaren Sakurai et al vernetztes Glukosaminoglycan oder Salze davon, das durch Vernetzung eines Glukosaminoglycans oder eines Salzes davon mit einer polyfunktionellen Epoxyverbindung hergestellt wird. Huang et al offenbaren in EP-A2-0 507 604 ionisch ver netzte carboxylhaltige Polysaccharide, worin das Vernetzungsmittel eine Verbindung ist, die ein dreiwertiges Kation enthält. Mälson et al offenbaren in US-PS 4 716 154 die Vernetzung von Hyaluronsäure mit bi- oder polyfunktionellen Epoxiden oder ihrer korrespondierenden Halohydrine, Epihalohydrine oder Halogenide, und Divinylsulfon. Mälson et al offenbaren in US-PS 4 772 419 auch die Vernetzung von Hyaluronsäure mit polyfunktionellen Epoxiden. In US-PS 4 957 744 offenbaren della Valle et al vernetzte Ester von Hyaluronsäure, die durch Veresterung der Carboxylgruppen von Hyaluronsäure mit mehrwertigen Alkoholen hergestellt werden. Balazs et al offenbaren in US-PSen 4 582 865, 4 605 691 und 4 636 524 die Vernetzung von Hyaluronsäure und ihrer Salze und von anderen Polysacchariden durch Reaktion mit Divinylsulfon. In US-PSen 5 128 326 und 4 582 865 offenbaren Balazs et al die Vernetzung von Hyaluronsäure mit Formaldehyd, Epoxiden, Polyaziridylverbindungen und Divinylsulfon. In US-PS 4 713 448 offenbaren Balazs et al die chemische Modifizierung von Hyaluronsäure durch Reaktion mit Aldehyden, wie Formaldehyd, Glutaraldehyd und Glyoxal, und beschreiben die Möglichkeit, dass eine Vernetzung stattgefunden hat. In US-PS 5 356 883 beschreiben Kuo et al die Vernetzung von Hyaluronsäure durch Reaktion mit Biscarbodiimiden.
Ein bevorzugtes Verfahren zur Vernetzung von Polysacchariden ist durch ihre Reaktion mit Carbonsäure-di- oder -polyanhydriden. Eine bevorzugte vernetzte Zusammensetzung umfasst einen Stoff der Formel (I) von oben, wo R₁ und R₂ t-Butyl sind und das Polysaccharid Hyaluronsäure oder sein Natriumsalz ist, das durch Umsetzung mit Pyromellitsäuredianhydrid vernetzt wurde.
In den Pfropfzusammensetzungen wird der Pfropflevel am einfachsten als Zahl der Äquivalente von Antioxidans angegeben, die pro Äquivalent der Polysaccharid-Repetiereinheit vorliegen. Für den erfindungsgemässen Zweck kann der minimale Pfropflevel nur etwa 1 Äquivalent Antioxidans pro 1000 Äquivalente der Polysaccharid-Repetiereinheiten sein. Ein bevorzugter Minimallevel ist etwa 1 Äquivalent pro 700 und der am meisten bevorzugte Minimallevel etwa 1 Äquivalent pro 600 Polysaccharid-Repetiereinheiten.
Der maximale Pfropflevel kann so hoch wie etwa 1 Äquivalent pro 10 Äquivalente der Polysaccharid-Repetiereinheiten sein. Ein bevorzugter Maximallevel ist etwa 1 Äquivalent pro 100 und der am meisten bevorzugte Maximallevel etwa 1 Äquivalent pro 400 Polysaccharid-Repetiereinheiten.
Wie festgestellt wurde, hat die erfindungsgemässe Zusammensetzung mit aufgepfropftem Antioxidans, wenn sie sich von Hyaluronsäure oder ihren Sal zen ableitet, eine wesentlich grössere Beständigkeit gegen durch Hydroxylradikale verursachten Abbau als ungepfropfte Hyaluronsäure oder ihre Salze.
In Tests zum Abbau durch Hydroxylradikale wurden die Hydroxylradikale durch Reaktion von Eisen(III)chlorid mit Ascorbinsäure erzeugt, wie von Wong et al, Inorganic Biochemistry, 14, Seite 127 (1981), beschrieben. In einem typischen Test betrug die Halbwertszeit der Viskosität für Hyaluronsäure 0,9 Stunden. Wenn der gleiche Test unter den gleichen Bedingungen sowohl an vernetzten als auch unvernetzten, erfindungsgemässen Pfropfzusammensetzungen mit Formel (I) durchgeführt wurde, worin das Polysaccharid R Hyaluronsäure war und R₁ und R₂ t-Butyl waren, reichten die Halbwertszeiten der Viskosität von 3 bis 48 Stunden, was ein Indiz für die wesentlich grössere Beständigkeit der Pfropfzusammensetzungen gegen den Abbau durch Hydroxylradikale war.
Die mit Antioxidans gepfropften Zusammensetzungen wurden durch Reaktion von Polysacchariden mit hydroxylreaktiven Antioxidansderivaten hergestellt. Die Bezeichnung "hydroxylreaktives Antioxidansderivat" soll ein Antioxidans bedeuten, das eine funktionelle Gruppe enthält, die mit Hydroxylgruppen reagieren kann, die in einem Polysaccharid enthalten sind.
Die bevorzugten hydroxylreaktiven Antioxidantien zur Herstellung der erfindungsgemässen Zusammensetzungen werden ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus:
worin R₁ Wasserstoff, C_1-20-Alkyl, Phenyl oder substituiertes Phenyl ist; R₂ C_1-20-Alkyl, Phenyl oder substituiertes Phenyl ist; A -C(O)X, -C(O)OCH₂CH₂OCH₂CH₂Y, -C(O)NHCH₂CH₂CH₂Y, -OCH₂CH₂OCH₂CH₂Y oder -CH₂Y ist; B -C(O)X, -CH₂Y oder X ist; X Halogen, 1-Imidazol, Phenoxy, Nitrophenoxy, p-Toluolsulfonat, Methansulfonat oder Alkyl- oder Arylcarboxylat ist; Y Halogen, p-Toluolsulfonat oder Methansulfonat ist.
Die bevorzugten hydroxylreaktiven Antioxidantien umfassen hydroxylreaktive gehinderte Phenole der Struktur (XII), worin R1 Wasserstoff, Methyl, Ethyl, i-Propyl oder t-Butyl ist und R2 Methyl, Ethyl, i-Propyl oder t-Butyl ist. Die Bezeichnung "gehindertes Phenol" bezieht sich auf Phenole in denen mindestens eine Position ortho zur Hydroxylgruppe durch einen Phenyl-, substituierten Phenyl- oder C_1-20-Alkylsubstituenten besetzt ist.
Bevorzugte hydroxylreaktive gehinderte Phenole der Struktur (XII) umfassen diejenigen, worin R₁ und R₂ t-Butyl sind und A -C(O)X, -CH₂Y oder -C(O)OCH₂CH₂OCH₂CH₂Y ist, worin X Chlor oder 1-Imidazol und Y Brom ist. Speziell bevorzugte hydroxylreaktive gehinderte Phenole sind 3,5-Di-t-butyl-4-hydroxybenzoylchlorid, 2,6-Di-t-butyl-4-brommethylphenol, 3,5-Di-t-butyl-4-hydroxybenzoyl-2-[2-(chlorethoxy)ethoxy]ethylester und 3,5-Di-tbutyl-4-hydroxybenzoyl-1-imidazol.
Da hydroxylreaktive Antioxidansderivate leicht mit Wasser reagieren, wird ihre Reaktion mit dem Polysaccharid vorzugsweise in einem trockenen, polaren, aprotischen Lösungsmittel durchgeführt. Bevorzugte Lösungsmittel sind N-Methylpyrrolidinon, N-Ethylpyrrolidinon, N-Cyclohexylpyrrolidinon, 4-Methylmorpholin-N-oxid, Dimethylformamid, Sulfolan und Dimethylsulfoxid.
Salze der sauren Polysaccharide können in den bevorzugten Lösungsmitteln unlöslich sein. Insbesondere ist das Natriumsalz von Hyaluronsäure nicht löslich in den bevorzugten Lösungsmitteln und so ist es im allgemeinen für den Zweck dieser Ausführungsform zweckdienlich, das Natriumsalz zur Erhöhung der Löslichkeit in ein Tetraalkylammoniumsalz zu überführen. Nach der Pfropfreaktion des Tetraalkylammoniumsalzes und hydroxylreaktiven Antioxidansderivats kann das Produkt mittels Ionenaustausch zurück in die Natriumform überführt werden.
Wenn die Herstellung einer vernetzten Zusammensetzung mit aufgepfropftem Antioxidans gewünscht ist, kann die Vernetzungsreaktion entweder vor oder nach der Pfropfreaktion durchgeführt werden. Sie kann auch gleichzeitig mit der Pfropfreaktion durchgeführt werden, in solchen Fällen, wo die für die Vernetzung verwendeten Lösungsmittel die gleichen sind wie die für die Pfropfreaktion verwendeten.
In der Pfropfreaktion wird das Verhältnis des hydroxylreaktiven Antioxidansderivats zum Polysaccharid am einfachsten bezogen auf die molaren Mengen des verwendeten Antioxidansderivats pro Äquivalent der Repetiereinheit in dem Polysaccharid angegeben. Für den erfindungsgemässen Zweck kann der Minimallevel des hydroxylreaktiven Antioxidansderivats nur etwa 1 Äqui valent pro 1000 Äquivalente Polysaccharid-Repetiereinheiten sein. Ein bevorzugter Minimallevel ist etwa 1 Äquivalent pro 700, und der am meisten bevorzugte Minimallevel etwa 1 Äquivalent pro 600 Polysaccharid-Repetiereinheiten.
Der Maximallevel des hydroxylreaktiven Antioxidansderivats kann so hoch wie etwa 1 Äquivalent pro 10 Äquivalente Polysaccharid-Repetiereinheiten sein. Ein bevorzugter Maximallevel ist etwa 1 Äquivalent pro 100 und der am meisten bevorzugte Maximallevel etwa 1 Äquivalent pro 400 Polysaccharid-Repetiereinheiten.
Wie zuvor festgestellt, betrifft die Erfindung in anderen Ausführungsformen Zusammensetzungen zur Behandlung entzündeter Gelenke von Säugern, z.B. Arthritis, zur Verhinderung postoperativer Adhäsionen und zur Förderung der Heilung chronischer Wunden und Geschwüre. Der Wirkstoff dieser Zusammensetzungen umfasst die erfindungsgemässen Polysaccharide mit aufgepfropftem Antioxidans. Die bevorzugten Polysaccharide mit aufgepfropftem Antioxidans sind Hyaluronsäure mit aufgepfropftem gehindertem Phenol oder vernetzte Hyaluronsäure mit aufgepfropftem gehindertem Phenol oder pharmazeutisch akzeptable Salze davon.
Pharmazeutisch akzeptable Salze schliessen Salze eines Alkali- oder Erdalkalimetalls, von Aluminium oder Ammonium ein. Das bevorzugte pharmazeutisch akzeptable Salz ist Natrium.
Die erfindungsgemässen Polysaccharid-Zusammensetzungen mit aufgepfropftem Antioxidans können zur Verhinderung postoperativer Adhäsionen in jedem Tier verwendet werden, das nach Operationen zur Ausbildung ungewollter Adhäsionen neigt. Die Zusammensetzungen werden verwendet, um die Entwicklung von Adhäsionen in Säugern, vorzugsweise Menschen, zu verhindern. Sie sind nützlich bei allen Arten von Operationen, wo es wünschenswert ist, die Bildung postoperativer Adhäsionen zu unterdrücken, z.B. Operationen des Abdomens, gynäkologische Operationen, Toraxoperationen, orthopädische Operationen, neurologische Operationen und Augenoperationen. Die bevorzugten Zusammensetzungen für diese Verwendung sind Hyaluronsäure mit aufgepfropftem gehindertem Phenol oder vernetzte Hyaluronsäure mit aufgepfropftem gehindertem Phenol oder pharmazeutisch akzeptable Salze davon.
Adhäsionsverhinderer können auf die Stelle der operativen Verletzung auf jede geeignete Weise, wie beispielsweise durch Spülung, durch direktes Aufbringen als Schicht in einem Gel, einer Creme, einem Film oder Schaum oder durch jedes andere geeignete Verfahren aufgebracht werden. Die Verabreichung von Adhäsionsverhinderern kann zu jeder Zeit erfolgen bevor sig nifikante Wundheilung stattfindet. Vorzugsweise wird er am Ende der Operation direkt vor dem Verschliessen der Wunde verabreicht. In einigen Fällen kann es jedoch gewünscht sein, den Verhinderer kontinuierlich über einen Zeitraum zu verabreichen. Eine wirksame Menge eines Adhäsionsverhinderers ist eine Menge, die notwendig ist, um eine Verringerung im Auftreten postoperativer Operationsadhäsionen zu bewirken. Vorzugsweise sollte die Menge ausreichen, um die gesamte der operativen Verletzung ausgesetzte Fläche zu bedecken und gewünschtenfalls wird eine zusätzliche Menge verwendet, die ausreicht, um das an die Fläche der Verletzung angrenzende Körpergewebe zu bedecken.
Die erfindungsgemässen Polysaccharid-Zusammensetzungen mit aufgepfropftem Antioxidans können auch verwendet werden, um die Heilung chronischer Wunden, z.B. Verbrennungen, und Geschwüre, z.B. Diabetes-Fussgeschwüre bei Säugern, insbesondere Menschen, zu fördern. Die bevorzugten Zusammensetzungen für diese Verwendung sind Hyaluronsäure mit aufgepfropftem gehindertem Phenol oder vernetzte Hyaluronsäure mit aufgepfropftem gehindertem Phenol oder pharmazeutisch akzeptable Salze davon. Hyaluronsäure hält Feuchtigkeit zurück und besitzt ausserdem Gefässbildungseigenschaften, die es für diese Anwendung nützlich machen. Wenn sie für die Wundheilung verwendet werden, können die Zusammensetzungen allein in wässriger Lösung, vorzugsweise physiologischer Kochsalzlösung, verwendet werden oder die Lösungen können mit Arzneimitteln für die Wundheilung und anderen wasserlöslichen Polymeren kombiniert werden. Sie können auf die Stelle der Wunde oder des Geschwürs auf jede geeignete Weise, z.B. durch Spülung, durch direktes Aufbringen auf die Stelle als Schicht in einem Gel, einer Creme, einem Film oder Schaum, durch Imprägnierung in einer Bandage oder einem Wundverband, die/der auf die Wunde oder das Geschwür angelegt wird, oder durch jedes andere geeignete Verfahren aufgebracht werden. Eine wirksame Menge zur Förderung der Heilung reicht aus, um die gesamte Fläche der Wunde oder des Geschwürs zu bedecken und gewünschtenfalls wird eine zusätzliche Menge zugesetzt, die ausreicht, um an die wunde oder das Geschwür angrenzendes Körpergewebe zu bedecken. Ein typisches Polysaccharid mit aufgepfropftem Antioxidans kann als andere Bestandteile wasserlösliche Polymere, Antibiotika, Immunosuppressiva und Schmerzmittel enthalten.
Bei der Anwendung der erfindungsgemässen gepfropften Hyaluronsäure oder vernetzten gepfropften Hyaluronsäure für die Behandlung entzündeter Gelenke, z.B. Arthritis, bei Säugern, insbesondere Menschen, wird das Hyaluronsäurederivat üblicherweise in physiologischer Kochsalzlösung bis zu einer Viskosität aufgelöst, die ausreicht, um eine Injektionsnadel passieren zu können. Die maximale Viskosität ist etwa 50.000 cps, vorzugsweise etwa 30.000 cps. Die minimale Viskosität ist etwa 5.000 cps. Die Behandlungslösung wird dann in das erkrankte Gelenk injiziert.
Ein typisches Injektionsverfahren für Ergänzungssynovialflüssigkeit in das Kniegelenk ist dem von Miller et al in J. Bone and Joint Surgery, 40, Seite 636 (1985), beschriebenen ähnlich. In diesem Verfahren werden 2,5 ml einer sterilen Lösung des Natriumsalzes der Hyaluronsäure mit aufgepfropftem Antioxidans (Konzentration der gepfropften Hyaluronsäure: 10 mg/ml) in gepufferter Kochsalzlösung (Natriumchlorid 8,5 mg/ml, dibasisches Natriumphosphat 0,537 mg/ml, Natriumdihydrogenphosphat 0,016 mg/ml) langsam in eine Spritze gezogen, um die Abwesenheit von Lufteinschlüssen sicherzustellen. Das Knie wird dann durch Reinigung mit Seife, Abwischen mit Cetyltrimethylammoniumbromid und Aufpinseln von Iodtinktur für die Injektion vorbereitet. Durch einen vorher markierten dreieckförmigen Bogen an der lateralen Seite des Gelenks, der durch das Tibialplateau, den Rand des Bandes der Kniescheibe (ligamentum patellae) und die Krümmung des lateralen femoralen Gelenkkopfes eingefasst ist, wird die Lösung in eine Synovialhöhle injiziert. Lokalanästhesie kann vor der Injektion angewendet werden. In bestimmten Fällen kann vor der Ergänzungsinjektion mit Synovialflüssigkeit die Punktion des Knies mit der gepufferten Kochsalzlösung notwendig sein. Ein derartiges Verfahren wird von Dahlberg et al in Arthritis & Rheumatism, 37, 1994, Seite 521, beschrieben.
Die injizierbare Lösung kann zusätzlich zur Pfropfzusammensetzung weitere Stoffe enthalten. Diese schliessen wasserlösliche Polymere, wie Chondroitinsulfat, Dermatansulfat und/oder ein Phospholipid zur Verbesserung der Schmierfähigkeit der Lösung ein. Anästhetika, entzündungshemmende Mittel, Antibiotika, antibakterielle Mittel, Cytotoxine und Zucker können ebenso zugesetzt werden.
Die erfindungsgemässen Polysaccharide mit aufgepfropftem Antioxidans können insbesondere in der vernetzten Form als Drug-Delivery-System verwendet werden. Die bevorzugten Zusammensetzungen für diese Verwendung sind Hyaluronsäure mit aufgepfropftem gehindertem Phenol oder vernetzte Hyaluronsäure mit aufgepfropftem gehindertem Phenol oder pharmazeutisch akzeptable Salze davon. Vernetzte Hyaluronsäure bildet einen molekularen Käfig, in dem Moleküle mit pharmakologischer Aktivität dispergiert werden können. Die im Käfig enthaltenen Substanzen werden durch Diffusion in die Umgebung freigesetzt. Das Wirkstoffmolekül oder die Mischung der Wirkstoffmoleküle kann kovalent oder nicht-kovalent an die Hyaluronsäure gebunden sein. Die kovalente Bindung kann durch Anbindung an die Carbonsäure- oder Hydroxylgruppen der Hyaluronsäureeinheiten erfolgen. Die Gele, Filme, Fäden, Partikel oder Schwämme der Zusammensetzung auf Hyaluronsäurebasis können plaziert, aufgesprüht, mit der Nahrung aufgenommen, injiziert oder implantiert werden an die Stelle, wo die enthaltene pharmakologische Substanz gebraucht wird. Diese Substanzen können therapeutische Arzneimittel (wie Anästhetika, Analgetika, entzündungshemmende Mittel, Diuretika, Antagonisten, Antibiotika, Hormone, Antirheumatika, adrenergische Antagonisten, Cytostatika, Antihypertonika oder Immunosuppressiva), Wachstumsfaktoren, Enzyme oder Verbindungen gegen die zelluläre Adhäsion sein.
Erfindungsgemässe Polysaccharide mit aufgepfropftem Antioxidans können auch als Komponenten von Kosmetika für topische Verwendungen fungieren. Die bevorzugten Zusammensetzungen für diese Verwendung sind Hyaluronsäure mit aufgepfropftem gehindertem Phenol oder vernetzte Hyaluronsäure mit aufgepfropftem gehindertem Phenol oder pharmazeutisch akzeptable Salze davon. Da gezeigt wurde, dass Hyaluronsäure unter den Bedingungen einer niedrigen relativen Luftfeuchtigkeit Feuchtigkeit speichern kann und bei hoher relativer Luftfeuchtigkeit ein angenehmes und weiches Gefühl ergibt, wird sie als Feuchthaltemittel in kosmetischen Formulierungen verwendet. Die erfindungsgemässen Zusammensetzungen erreichen ähnliche Effekte. Mischungen der gepfropften Hyaluronsäure-Zusammensetzungen mit anderen preiswerten wasserlöslichen Polymeren, wie Carboxymethylcellulose, Pectin, Alginat, Sojaprotein, Casein und Gelatine, können ebenso verwendet werden.
Natürliche Extrakte aus Pflanzenquellen, wie Kaktus Aloe Vera, Mesquitebaum, Matricaria chamomilla, Gelbwurz, Karotte, Simmondsia chinensis ("jojoba"), Rose und anderen können einer kosmetischen Formulierung, die gepfropfte Hyaluronsäure enthält, zugemischt werden. α-Hydroxysäuren, wie Milch- und Hydroxyethansäure, können der Formulierung zugesetzt werden, um die Plastizität der Haut zu verbessern.
Eine typische kosmetische Zusammensetzung gegen die Alterung ist: 7 2-Hydroxyethansäure, 15 % Propylenglykol, 1 % Hyaluronsäurelösung mit aufgepfropftem gehindertem Phenol (1 g/100 ml), 60 % Wasser und 17 % Ethylalkohol, wobei alle Prozentangaben gewichtsbezogen sind.
Eine Formulierung für ein Gesichtssoftgel ist: 25 % wässrige Aufschlämmung von Carboxymethylcellulose (3 g/100 ml), 11 % wässrige Triethanolaminlösung (10 g/100 ml), 5 % Methyl Gluceth-10, 1 % wässrige Hyaluronsäurelösung mit aufgepfropftem gehindertem Phenol (1 g/100 ml), 1 % Parfüm und Konservierungsmittel, 57 % Wasser, wobei alle Prozentangaben gewichtsbezogen sind.
Eine typische essentielle Hautfeuchtigkeitszusammensetzung ist 0,5 % Hydroxyethylcellulose, 2 % Methyl Gluceth-10, 2 % Glycerin, 1 % wässrige Hyaluronsäurelösung mit aufgepfropftem gehindertem Phenol (1 g/100 ml), 94 % Wasser, 0,5 % Konservierungsmittel und Parfüm, wobei alle Prozentangaben gewichtsbezogen sind.
Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele erläutert, welche zum Zweck der Darstellung gegeben werden und nicht als den erfindungsgemässen Bereich begrenzend angesehen werden sollen. Alle Teile und Prozentangaben in den Beispielen sind gewichtsbezogen wenn nicht anders angegeben.
BEISPIEL 1
Synthese von 3,5-Di-t-butyl-4-hydroxybenzoylchlorid
Eine Mischung von 3,5-Di-t-butyl-4-hydroxybenzoesäure (4 g), 20 ml Hexan und 20 ml Thionylchlorid wurde 4,5 Stunden lang gekocht. Das Lösungsmittel und überschüssiges Thionylchlorid wurden durch Destillation entfernt, wobei ein Feststoff zurückblieb, der ohne weitere Reinigung verwendet wurde. Um die Identität des Säurechlorids zu bestätigen, wurde eine kleine Probe mit einem Überschuss an wasserfreiem Ethanol und Triethylamin gequencht. Die gequenchte Probe wurde mit Wasser und Methylenchlorid extrahiert. Nach dem Verdampfen des Lösungsmittels wurde ein Öl erhalten. Das ¹H-NMR-Spektrum (CDC1₃, ppm bezogen auf TMS) bestätigte, dass das Öl der korrespondierende Ester war: 7,9 ppm (s, Ar, 2), 5,25 ppm (s, OH, 1), 4,3 ppm (q, CH₃, 18) und 1,44 ppm (t, CH₃, 3). Dieses Ergebnis bestätigt, dass sich 3,5-Di-t-butyl-4-hydroxybenzoylchlorid gebildet hatte.
BEISPIEL 2
Synthese von 2,6-Di-t-butyl-4-brommethylphenol
Eine Mischung von 1 g 2,6-Di-t-butyl-4-methylphenol, 0,9 g N-Bromsuccinimid und 40 ml Tetrachlorkohlenstoff wurde 1,5 Stunden lang gekocht. Succinimid wurde durch Filtration entfernt und die erhaltene organische Lösung verdampft, wobei eine viskose Flüssigkeit mit dem folgenden 1H-NMR-Spektrum (CDC13, ppm bezogen auf TMS) erhalten wurde: 7,05 ppm (s, ArH, 2), 5,15 ppm (s, OH, 1), 4,35 ppm, (s, CH₂Br, 2) und 1,3 ppm (s, CH3, 18).
BEISPIEL 3
Synthese von 3,5-Di-t-butyl-4-hydroxybenzoyl-2-[2-(2-chlorethoxy)-ethoxy]ethylester
In einem mit einer Dean-Stark-Falle ausgerüsteten 250 ml-Kolben wurde eine Mischung von 5 g 3,5-Di-t-butyl-4-hydroxybenzoesäure, 3,7 g 2-[2-(2- Chlorethoxy)ethoxy]ethanol, 0,1 g p-Toluolsulfonsäure und 60 ml Toluol 4 Tage lang zum Sieden erhitzt. Die resultierende Mischung wurde mit Wasser und Methylenchlorid extrahiert und dann die Methylenchloridlösung über MgSO₄ getrocknet. Verdampfen des Lösungsmittels ergab 6,97 g des Esters mit dem folgenden ¹H-NMR-Spektrum (CDCl₃, ppm bezogen auf TMS): 7,9 ppm (s, ArH, 2), 5,72 ppm (s, OH, 1), 5,45 ppm (m, CH₂, 2), 3,86 ppm (m, CH₂, 2), 3,7 ppm (m, CH₂, 6), 3,6 ppm (m, CH₂, 2) und 2,45 ppm (s, CH₃, 18).
BEISPIEL 4
Synthese von 3,5-Di-t-butyl-4-hydroxybenzoyl-1-imidazol
Eine Mischung von 1 g 3,5-Di-t-butyl-4-hydroxybenzoesäure, 0,7 g 1,1'-Dicarbonyldiimidazol und 50 ml Methylenchlorid wurde bei Raumtemperatur 17 Stunden lang zusammen gerührt. Nach Entfernen des Lösungsmittels wurde das Produkt aus Toluol und Hexan umkristallisiert und so ein hygroskopischer Feststoff erhalten. Eine kleine Probe des Feststoffs wurde mit 0,2 g Ethanol und 2 ml Methylenchlorid vermischt und 10 Stunden stehen gelassen. Nach Entfernung des Lösungsmittels wurde wie in Beispiel 1 nur der korrespondierende Ethylester durch ¹H-NMR identifiziert. Dieses Ergebnis zeigt, dass sich 3,5-Di-t-butyl-4-hydroxybenzoyl-1-imidazol gebildet hatte.
BEISPIEL 5
Herstellung des Methyltricaprylammoniumsalzes von Hyaluronsäure
Zu einer Lösung von 10 g Natriumhyaluronat (Fermentationsprodukt, Chisso Corporation, Chiba, Japan) in 1000 ml Wasser wurde eine Lösung von 50 g Methyltricaprylammoniumchlorid (Aliquat 336, Aldrich Chemical, Milwaukee, Wisconsin) in 50 ml Aceton gegeben. Die Mischung wurde über Nacht gerührt und dann der gummiartige Niederschlag abfiltriert, mit Wasser und Aceton gewaschen und danach über Nacht im Vakuum getrocknet. Er wurde erneut in 500 ml Aceton 7 Stunden lang getränkt, über Nacht im Vakuum getrocknet und so 46,9 g eines gummiartigen Stoffs erhalten.
BEISPIEL 6
Aufpfropfen von 3,5-Di-t-butyl-4-hydroxybenzoylchlorid auf Hyaluronsäure
Zu einer Lösung von 10 g des Methyltricaprylammoniumsalzes von Hyaluronsäure (hergestellt nach dem Verfahren von Beispiel 5) in 1000 ml trockenem N-Methylpyrrolidinon (NMP) wurden 0,4 g 3,5-Di-t-butyl-4-hydroxybenzoylchlorid (Beispiel 1) gegeben. Die Mischung wurde 3 Stunden lang geschüttelt und dann 16 Stunden lang bei 10°C aufbewahrt. Für den Ionenaustausch zurück zum Natriumsalz wurde hierauf eine wässrige Lösung von NaCl (15 g in 250 ml Wasser) der Reaktionsmischung zugesetzt. Nach 1-ständigem Rühren der erhaltenen Lösung wurden 3 g Natriumbicarbonat und 200 ml Aceton zugesetzt, um das Produkt auszufällen. Das Polymer wurde filtriert und 5 mal mit Aceton/Wasser (Verhältnis 4:1, 200 ml) und dann mit 100 ml Aceton gewaschen . Das Produkt wurde weiter gereinigt, indem es in 1 l Wasser wieder aufgelöst und dann in einem grossen Volumen von Methanol ausgefällt wurde. 5 g Produkt wurden erhalten.
BEISPIEL 7
Aufpfropfen von 3,5-Di-t-butyl-4-hydroxybenzoyl-1-imidazol auf Hyaluronsäure
Zu einer Lösung von 2 g des Methyltricaprylammoniumsalzes von Hyaluronsäure (hergestellt nach dem Verfahren von Beispiel 5) in 280 ml NMP wurden 0,25 g 3,5-Di-t-butyl-4-hydroxybenzoyl-1-imidazol (Beispiel 4) gegeben. Die Mischung wurde 20 Stunden lang bei 45°C gehalten und dann mittels Ionenaustausch zurück in die Natriumsalzform überführt, wie in Beispiel 6 beschrieben. Das Gewicht des Produkts betrug 0,92 g.
BEISPIEL 8
Aufpfropfen von 3,5-Di-t-butyl-4-hydroxybenzoylchlorid auf mit dem Diglycidylether von Bisphenol A vernetzter Hyaluronsäure
Zuerst wurde die Vernetzungsreaktion durchgeführt, indem 2 g des Methyltricaprylammoniumsalzes von Hyaluronsäure (hergestellt nach dem Verfahren von Beispiel 5), 0,2 g Diglycidylether von Bisphenol A und 280 ml NMP gemischt wurden und die Mischung für 24 Stunden bei 45°C gehalten wurde. Zu dieser Mischung wurden hierauf 0,2 g 3,5-Di-t-butyl-4-hydroxybenzoylchlorid gegeben und dann die gesamte Reaktionsmischung für 17 Stunden bei Raumtemperatur gehalten. Das Produkt wurde in das Natriumsalz überführt und aufgearbeitet wie für Beispiel 6 beschrieben.
BEISPIEL 9
Aufpfropfen von 3,5-Di-t-butyl-4-hydroxybenzoylchlorid auf mit 1,2,4,5-Benzoltetracarbonsäuredianhydrid vernetzter Hyaluronsäure
Zu einer Lösung von 5 g des Methyltricaprylammoniumsalzes von Hyaluronsäure (hergestellt nach dem Verfahren von Beispiel 5) in 700 ml NMP wurden 0,5 g 1,2,4,5-Benzoltetracarbonsäuredianhydrid gegeben. Die Mischung wurde für 7 Tage bei 10°C gehalten. Triethylamin (1 ml) und 3,5-Di-t-butyl-4-hydroxybenzoylchlorid (0,5 g) wurden dann der Reaktionsmischung zugesetzt. Nach 16 Stunden wurde das Produkt mit einer Lösung von NaCl (0,5 g) und NaHCO₃ (0,5 g) in 50 ml Wasser ionenausgetauscht und hierauf durch Zusatz von 400 ml Aceton ausgefällt. Das Produkt wurde filtriert und mit 4:1 Aceton/Wasser und danach reinem Aceton gewaschen. Nach dem Trocknen wurden 2,9 g des Polymers erhalten.
BEISPIEL 10
Aufpfropfen von 3,5-Di-t-butyl-4-hydroxybenzoyl-2-[2-(2-chlorethoxy)-ethoxy]ethylester auf Hyaluronsäure
Eine Mischung von 2 g des Methyltricaprylammoniumsalzes von Hyaluronsäure (hergestellt nach dem Verfahren von Beispiel 5) und 0,25 g 3,5-Di-t-butyl-4-hydroxybenzoyl-2-[2-(2-chlorethoxy)ethoxy]ethylester in 280 ml NMP wurde für 20 Stunden bei 45°C gehalten. Die Mischung wurde mit einer Lösung von 0,1 g NaCl und 0,1 g NaHCO₃ in 20 ml Wasser behandelt und wie in Beispiel 9 aufgearbeitet. Nach dem Trocknen wurden 1,0 g eines Polymers erhalten.
BEISPIEL 11
Beständigkeit der gepfropften Hyaluronsäure gegen Abbau durch Hydroxylradikale
Hydroxylradikale wurden durch die Reaktion von Eisen(III)ionen mit Ascorbinsäure erzeugt, wie von Wong et al, Inorganic Biochemistry, 14, Seite 127 (1981), beschrieben.
Zu 100 ml einer wässrigen Lösung des Natriumsalzes von Hyalunorat mit aufgepfropftem gehindertem Phenol (0,3 bis 0,6 % Gew./Vol. wie angegeben, gepuffert bei pH 7,4) wurden 0,25 ml einer Eisen(III)chlorid-Lösung (1,1 g in 20 ml Wasser) und 0,25 ml einer Ascorbinsäurelösung (0,64 g in 20 ml Wasser) gegeben. Die Mischung wurde etwa 10 Sekunden geschüttelt und hierauf wurde nach 10 Minuten die erste Viskosität (Brookfield) gemessen. Es wurde angenommen, dass die Viskosität an diesem Punkt 100 % betrug. Die Beständigkeit der Probe gegen Abbau wurde beurteilt, indem die Zeit gemessen wurde, die zur Verringerung der Viskosität auf 50 % des 10 Minuten-Wertes (Viskositäts-Halbwertszeit) erforderlich war. Die Kontrolle bestand aus Natriumhyaluronat. Die Resultate sind in Tabelle 1 angegeben.

Claims

Gepfropfte Polysaccharid-Zusammensetzung, umfassend Polysaccharid, das an mindestens einer Hydroxylgruppe des Polysaccharids mit einem Antioxidans gepfropft ist, wobei das gepfropfte Polysaccharid mindestens einen Vertreter umfasst, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus
worin R das Rückgrat des Polysaccharids oder des vernetzten Polysaccharids, enthaltend azide Gruppen oder Salze davon, bedeutet, -(O)- der Rest einer Hydroxylgruppe des Polysaccharids ist, R₁ Wasserstoff, C_1-20-Alkyl, Phenyl oder substituiertes Phenyl ist, A₂ C_1–20-Alkyl, Phenyl oder substituiertes Phenyl ist und Ar Aryl oder substituiertes Aryl ist; und das Polysaccharid mindestens einen Vertreter umfasst, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Hyaluronsäure, Chondroitinsulfat, Keratansulfat, Dermatansulfat, Heparansulfat, Heparin, Carboxymethylcellulose, Hydroxyethylcarboxymethylcellulose, Carboxymethylstärke, Pectin, Xanthan, Alginsäure, Polygalacturonsäure, Polymannuronsäure, Polyglucuronsäure und Karrageen.
Zusammensetzung gemäss Anspruch 1, wobei das Antioxidans ein gehindertes Phenol umfasst.
Zusammensetzung gemäss Anspruch 1, wobei die Salze Salze von Alkali- oder Erdalkalimetallen, Aluminium oder Ammonium umfassen.
Zusammensetzung gemäss einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das aufgepfropfte Antioxidans in einem Level von 1 Äquivalent pro 1000 Repetiereinheiten des Polysaccharids bis 1 Äquivalent pro 10 Repetiereinheiten des Polysaccharids vorliegt.
Zusammensetzung gemäss einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das aufgepfropfte Antioxidans in einem Level von 1 Äquivalent pro 700 Repetiereinheiten des Polysaccharids bis 1 Äquivalent pro 100 Repetiereinheiten des Polysaccharids vorliegt.
Zusammensetzung gemäss einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das aufgepfropfte Antioxidans in einem Level von 1 Äquivalent pro 600 Repetiereinheiten des Polysaccharids bis 1 Äquivalent pro 400 Repetiereinheiten des Polysaccharids vorliegt.
Zusammensetzung gemäss einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die gepfropfte Polysaccharid-Zusammensetzung vernetzt ist.
Zusammensetzung gemäss einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die gepfropfte Polysaccharid-Zusammensetzung durch Reaktion mit Carbonsäuredi- oder -polyanhydrid vernetzt ist.
Zusammensetzung gemäss einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das gepfropfte Polysaccharid gepfropfte Hyaluronsäure umfasst.
Zusammensetzung gemäss Anspruch 9, wobei die gepfropfte Hyaluronsäure eine wesentlich grössere Beständigkeit gegen Hydroxylradikale als ungepfropfte Hyaluronsäure besitzt.
Pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend als Wirkstoff die Zusammensetzung gemäss einem der Ansprüche 1 bis 10.
Verwendung der Zusammensetzung gemäss einem der Ansprüche 1 bis 10 bei der Herstellung eines Medikaments, das nützlich ist für die Verhinderung postoperativer Adhäsionen bei Säugern.
Verwendung der Zusammensetzung gemäss einem der Ansprüche 1 bis 10 bei der Herstellung eines Medikaments, das nützlich ist bei der Behandlung chronischer Wunden bei Säugern.
Verwendung der Zusammensetzung gemäss einem der Ansprüche 1 bis 10 bei der Herstellung eines Medikaments, das nützlich ist bei der Behandlung der Entzündung von Säugergelenken.
Verwendung der Zusammensetzung gemäss Ansprüchen 9 oder 10 bei der Herstellung eines Medikaments, das nützlich ist bei der Behandlung der Arthritis bei Säugern.
Verwendung der Zusammensetzung gemäss einem der Ansprüche 1 bis 10 bei der Herstellung eines Drug-Delivery-Systems.
Verwendung der Zusammensetzung gemäss einem der Ansprüche 1 bis 10 als eine Komponente von Kosmetika für topische Anwendungen.