DE69615199T3

DE69615199T3 - Verfahren zur stabilisierung von proteinen in saurer umgebung mittel hoch veresterter pektine

Info

Publication number: DE69615199T3
Application number: DE69615199T
Authority: DE
Inventors: Martel Tove CHRISTENSEN; Dina Jette KREIBERG; Hanne Thorsoe; Christian Hans BUCHHOLT; Preben Rasmussen; John Nielsen
Original assignee: Danisco AS; Danisco US Inc
Current assignee: DuPont Nutrition Biosciences ApS
Priority date: 1995-07-14
Filing date: 1996-07-12
Publication date: 2011-02-10
Anticipated expiration: 2016-07-13
Also published as: ES2163644T3; US20030157230A1; AU714570B2; GB9514438D0; AU6614496A; DE69635625D1; PL185172B1; CA2225481A1; ATE205366T1; WO1997003574A1; ES2163644T5; EP1101412A3; DE69615199T2; DK0839006T4; ATE313270T1; RU2207761C2; EP0976822A2; NZ313625A; EP0976822A3; DK1101412T3

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren und ein Enzym zur Verwendung in solch einem Verfahren.
Spezieller betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung und Verwendung eines enzymatisch modifizierten Pektins.
Pektin ist eine wichtige Handelsware in der heutigen Industrie. Zum Beispiel kann es in der Nahrungsmittelindustrie als ein Verdickungs- oder Geliermittel verwendet werden, wie bei der Herstellung von Marmeladen.
Pektin ist ein strukturelles Polysaccharid, das man im allgemeinen in der Form von Protopektin in Pflanzenzellwänden findet. Das Rückgrat von Pektin enthält α-1-4-verknüpfte Galakturonsäurereste, die von einer kleinen Anzahl an 1,2-verknüpften α-L-Rhamnoseeinheiten unterbrochen sind. Darüber hinaus enthält Pektin hochverzweigte Bereiche mit einer fast alternierenden Rhamno-Galakturonan-Kette. Diese hochverzweigten Bereiche enthalten auch andere Zuckereinheiten (wie D-Galaktose, L-Arabinose und Xylose), die durch glycosidische Bindungen mit den C3- oder C4-Atomen der Rhamnoseeinheiten oder den C2- oder C3-Atomen der Galakturonsäureeinheiten verbunden sind. Die langen Ketten eines α-1-4-verknüpften Galakturonsäurerestes werden im allgemeinen als ”glatte Bereiche” bezeichnet, wogegen die hochverzweigten Bereiche im allgemeinen als die ”haarigen Bereiche” bezeichnet werden.
Einige der Carboxylgruppen der Galakturonreste sind verestert (z. B. die Carboxylgruppen sind methyliert). Typischerweise findet die Veresterung der Carboxylgruppen nach der Polymerisation der Galakturonsäurereste statt. Es ist jedoch äußerst selten, daß alle der Carboxylgruppen verestert sind (z. B. methyliert). Üblicherweise variiert der Grad der Veresterung von 0–90%. Wenn 50% oder mehr der Carboxylgruppen verestert sind, bezeichnet man das resultierende Pektin als ein ”hochverestertes Pektin” (kurz ”HE-Pektin”) oder ein ”hochmethoxyliertes Pektin”. Wenn weniger als 50% der Carboxylgruppen verester sind, bezeichnet man das resultierende Pektin als ein ”niedrigverestertes Pektin” (kurz ”LE-Pektin”) oder ein ”niedrigmethoxyliertes Pektin”. Wenn das Pektin keine – oder nur wenige – veresterte Gruppen enthält, wird es im allgemeinen als Pektinsäure bezeichnet.
Die Struktur des Pektins, insbesondere das Ausmaß der Veresterung (z. B. Methylierung), gibt viele der resultierenden physikalischen und/oder chemischen Eigenschaften des Pektins vor. Zum Beispiel hängt die Pektin-Gelbildung von der chemischen Natur des Pektins ab, insbesondere vom Grad der Veresterung. Darüber hinaus hängt die Pektin-Gelbildung jedoch auch von dem Gehalt an löslichen Feststoffen, dem pH-Wert und der Calciumionenkonzentration ab. Bezüglich der zuletzt genannten nimmt man an, daß die Calciumionen Komplexe mit freien Carboxylgruppen, insbesondere mit solchen an einem LE-Pektin bilden.
Pektinenzyme werden nach ihrer Art und Weise, an dem Galakturonanteil des Pektinmoleküls anzugreifen, klassifiziert. Ein Überblick über einige Pektinenzyme wurde von Pilnik und Voragen erstellt (Fond Enzymology, Ed.: P. F. Fox; Elsevier; (1991); S. 303–337). Insbesondere entesterifizieren Pektinmethylesterasen (EC 3.1.1.11), die ansonsten als PMEs bezeichnet werden, HE-Pektine zu LE-Pektinen oder Pektinsäuren. Im Gegensatz dazu und beispielhaft spalten Pektindepolymerasen die glycosidischen Bindungen zwischen Galakturonosylmethylesterresten.
Genauer erzeugt die PME-Aktivität freie Carboxylgruppen und freien Methanol. Der Anstieg an freien Carboxylgruppen kann durch automatische Titration leicht kontrolliert werden. In diesem Zusammenhang haben frühere Studien gezeigt, daß einige PMEs Pektine in einer zufälligen Art und Weise in dem Sinne entesterifizieren, daß sie irgendeinen der veresterten (z. B. methylierten) Galakturonsäurereste an mehr als einer der Pektinketten entesterifizieren. Beispiele für PMEs, die Pektine zufällig entesterifizieren, können aus Pilzen als Quellen erhalten werden, wie Aspergillus aculeatus (siehe WO 94/25575 ) und Aspergillus japonicus (Ishii et al., J. Food Sci. 44, S. 611–14). Baron et al. (Lebensm. Wiss. M-Technol. 13, S. 330–333) haben offensichtlich eine Pilz-PME aus Aspergillus niger isoliert. Von dieser Pilz-PME wird berichtet, daß sie ein Molekulargewicht von 39.000 Da, einen isoelektrischen Punkt von 3,9, einen optimalen pH-Wert von 4,5 und einen K_m-Wert (mg/ml) von 3 hat.
Im Gegensatz hierzu sind einige PMEs dafür bekannt, daß sie Pektine in einer blockweisen Art und Weise in dem Sinne entesterifizieren, daß man annimmt, daß sie Pektine entweder an nicht reduzierenden Enden oder in der Nähe von freien Carboxylgruppen angreifen und anschließend entlang des Pektinmoleküls über einen Einzelkettenmechanismus fortfahren, wobei sie Blöcke von nicht veresterten Galakturonsäureeinheiten erzeugen, welche sehr calciumempfindlich sind. Beispiele für solche Enzyme, welche Pektin blockweise enzymatisch verestern, sind Pflanzen-PMEs. Es wurde angenommen, daß bis zu 12 Isoformen von PME in Zitrusgewächsen existieren (Pilnik W. und Voragen A. G. J., Food Enzymology (Ed.: P. F. Fox); Elsevier; 1991; S. 303–337). Diese Isoformen haben verschiedene Eigenschaften.
Versteeg et al. (J. Food Sci. 45, S. 969–971) haben offensichtlich eine PME aus Orange isoliert. Von dieser Pflanzen-PME wird berichtet, daß sie in mehreren Isoformen mit verschiedenen Eigenschaften vorkommt. Isoform I hat ein Molekulargewicht von 36.000 Da, einen isoelektrischen Punkt von 10,0, amen optimalen pH-Wert von 7,6 und einen K_m-Wert (mg/ml) von 0,083. Isoform II hat ein Molekulargewicht von 36.200 Da, einen isoelektrischen Punkt von 11,0, einen optimalen pH-Wert von 8,8 und einen K_m-Wert (mg/ml) von 0,0046. Isoform III (HMW-PE) hat ein Molekulargewicht von 54.000 Da, einen isoelektrischen Punkt von 10,2, einen optimalen pH-Wert von 8 und einen K_m-Wert (mg/ml) von 0,041. Jedoch liegen zur Zeit sehr beschränkte Sequenzdaten für diese PMEs vor.
Gemäß Pilnik und Voragen (ibid.) können PMEs in einer Anzahl anderer höherer Pflanzen gefunden werden, wie Apfel, Aprikose, Avocado, Banane, Beeren, Limone, Grapefruit, Mandarine, Kirschen, Johannisbeeren, Trauben, Mango, Papaya, Passionsfrucht, Pfirsich, Birne, Pflaumen, Bohnen, Karotten, Blumenkohl, Gurke, Lauch, Zwiebeln, Erbse, Kartoffel, Rettich und Tomate. Jedoch liegen zur Zeit ebenso sehr beschränkte Sequenzdaten für diese PMEs vor.
Zufällige oder blockweise Verteilung von freien Carboxylgruppen kann durch Hochleistungsionenaustauschchromatographie unterschieden werden (Schols et al., Food Hydrocolloids, 1989, 6, S. 115–121). Diese Tests werden oft verwendet, um auf unerwünschte PME-Restaktivität in Zitrussäften nach der Pasteurisierung zu prüfen, weil zurückbleibende PME sogenannten ”Trübungsverlust” in Orangensaft zusammen mit einer Bildung von Methanol in dem Saft verursachen kann.
PMEs haben wichtige Anwendungen in der Industrie. Zum Beispiel können sie in oder als Maskierungsmittel für Calciumionen verwendet werden. in diesem Zusammenhang und gemäß Pilnik und Voragen (ibid) kann Viehfutter hergestellt werden, indem man einen Brei aus Calciumhydroxid nach der Saftextraktion zu Zitrusschalen hinzugibt. Nach der Zugabe aktivieren der hohe pH-Wert und die Calciumionen jede native PME in der Schale, was eine schnelle Entesterifizierung des Pektins bewirkt, und es tritt eine Calciumpektatkoagulation auf. Gebundene Flüssigphase wird freigesetzt und läßt sich leicht auspressen, so daß nur ein Anteil des ursprünglichen Wassergehalts durch teure thermische Trocknung entfernt werden muß. Die Preßflüssigkeit wird dann als Tierfutter verwendet.
Pilnik und Voragen (ibid.) listen Verwendungen von endogenen PMEs auf, welche deren Zugabe zu Fruchtsäften umfassen, um die Viskosität des Saftes zu verringern, wenn er zuviel von der Frucht herrührendes Pektin enthält, deren Zugabe als Pektinaselösungen zu den Gasblasen in der Albedo von Zitrusfrucht, die auf eine Kerntemperatur von 20 bis 40°C erhitzt wurde, um die Entfernung der Schale und anderer Membran von intakten Saftsegmenten zu erleichtern ( US-A-4 284 651 ), und deren Verwendung zum Schutz und zur Verbesserung der Struktur und der Festigkeit verschiedener verarbeiteter Früchte und Gemüse, wie Apfel (Wiley & Lee 1970, Food Technol., 24, 1168–70), Dosentomaten (Hsu et al., 1995, J. Food Sci., 30, S. 583–588) und Kartoffeln (Bartolome & Hoff, 1972, J. Agric. Food Chem., 20, S. 262–266).
Glahn und Rolin (1994 Food Ingredients Europe, Conf. Proceedings, S. 252–256) berichten über die hypothetische Anwendung des industriellen ”GENU-Pektin Typ YM-100” zur Beeinflussung von sauren Milchgetränken. Es werden überhaupt keine Details präsentiert, wie GENU-Pekin Typ YM-100 hergestellt wird.
Die EP-A-0 664 300 offenbart ein chemisches Fraktionierungsverfahren zur Herstellung von calciumsensitivem Pektin. Es wird gesagt, daß dieses calciumsensitive Pektin für die Nahrungsmittelindustrie vorteilhaft sei.
Somit haben Pektine und entesterifizierte Pektine zusätzlich zu PMEs eine industrielle Bedeutung. Es besteht jedoch ein anhaltender Bedarf, die bekannten Verfahren zur Stabilisierung von Proteinen in einer sauren Umgebung zu verbessern, ohne jedoch die Viskosität dieser Umgebung nachteilig zu beeinflussen. In diesem Zusammenhang kann ein nachteiliger Effekt auf die Viskosität der Umgebung der Gesamterscheinung und/oder Struktur und/oder Genießbarkeit und/oder dem Mundgefühl des resultierenden Produkts schaden.
Gemäß einem ersten Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren wie in Anspruch 1 beschrieben bereitgestellt.
Somit betrifft die vorliegende Erfindung eine neue Verwendung von entesterifizierten Pektinen und eine neue rekombinante PME zur Herstellung solcher Pektine.
Einige der Hauptvorteile der vorliegenden Erfindung bestehen darin, daß das entesterifizierte Pektin der vorliegenden Erfindung Proteinen in einer sauren Umgebung Stabilität bietet, ohne die Viskosität der Umgebung nachteilig zu beeinflussen.
Der Ausdruck ”ein blockweise enzymatisch entesterifiziertes Pektin, hergestellt unter Verwendung rekombinanter DNA-Techniken” bedeutet ein Pektin, das blockweise entesterifizierte Gruppen enthält, wobei das Pektin hergestellt wird, indem man ein Pektin, welches veresterte Gruppen enthält, mit einem Enzym behandelt (z. B. in Kontakt bringt), das unter Verwendung rekombinanter DNA-Techniken hergestellt wurde.
Einige der Hauptvorteile dieses bevorzugten Aspekts der vorliegenden Erfindung bestehen darin, daß das entesterifizierte Pektin mit Leichtigkeit und mit einem relativen Maß an Konsistenz hergestellt werden kann. In diesem Zusammenhang kann die rekombinante PME selbst ziemlich einfach und leicht und auch mit einem hohen Maß an Homogenität hergestellt werden. Dies bedeutet wiederum, anders als bei den PME-Herstellungen nach dem Stand der Technik, daß die resultierende PME-Aktivität konsistenter und homogener ist und so ermöglicht, daß das gesamte Entesterifizierungsverfahren kontrollierter abläuft.
Die Verwendung eines blockweise enzymatisch entesterifizierten Pektins, welches vorzugsweise unter Verwendung rekombinanter DNA-Techniken hergestellt wird, ist in dem Verfahren der vorliegenden Erfindung zur Stabilisierung von wenigstens einem Protein in einem sauren Milieu vorteilhaft, da sie es erlaubt, daß Proteine, wie Molke- und Milchproteine (wie Casein), in sauren Lösungen stabil sind. Dies ist von Bedeutung für den Getränkemarkt, wie Magermilch, Fruchtsäfte und Molkeproteingetränke, wo es vorher nur möglich war, den Geschmack der Hauptproteine unter ziemlich hochsauren Bedingungen – wie pH 4,2 – zu erhalten, wenn hohe Mengen eines Stabilisators zugegen waren.
Wir haben nun herausgefunden, daß für einige Anwendungen geringe Mengen des entesterifizierten Pektins gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet werden können. Bei diesen niedrigen Mengen wirkt das entesterifizierte Pektin gemäß der vorliegenden Erfindung nicht nur als Stabilisator, sondern es hat auch keinen nachteiligen Effekt auf das Endprodukt.
Wenn es erwünscht wäre, würde die Verwendung des entesterifizierten Pektins der vorliegenden Erfindung es den Nahrungsmittelherstellern erlauben, den pH-Wert von Nahrungsmitteln, wie Getränken, zu erhöhen. Diesbezüglich macht in manchen Fällen die weniger saure Natur der Getränke diese für Personen, insbesondere Kinder, schmackhafter. Im Gegensatz zu den Verfahren nach dem Stand der Technik ist es somit nun möglich, den Geschmack dieser Proteine bei pH-Bedingungen höher als 4,2, wie bis zu pH 5,5 (wie pH 5,2), unter Verwendung des blockweise enzymatisch entesterifizierten Pektins, insbesondere des blockweise enzymatisch entesterifizierten Pektins, das unter Verwendung rekombinanter DNA-Techniken hergestellt ist, zu erhalten.
Darüber hinaus nimmt man an, daß das blockweise enzymatisch entesterifizierte Protein – insbesondere das blockweise enzymatisch entesterifizierte Pektin, das unter Verwendung rekombinanter DNA-Techniken hergestellt ist – das/die Protein(e) sogar unter niedrigen pH-Bedingungen, wie pH 4,2 oder weniger, besser stabilisiert als die Stabilisatoren nach dem Stand der Technik, welche für solche pH-Bedingungen verwendet werden.
Ein weiterer Vorteil besteht darin, daß die rekombinante PME in der Lage ist, ein im wesentlichen homogenes blockweise entesterifiziertes Pektin herzustellen. Damit meinen wir, daß im wesentlichen alle der Pektinketten wenigstens zwei benachbarte entesterifizierte Carboxylgruppen enthalten. Für einige Anwendungen mag es jedoch nicht notwendig sein, solch ein im wesentlichen homogenes blockweise entesterifiziertes Pektin herzustellen oder zu verwenden.
Ohne an eine Theorie gebunden sein zu wollen, wird angenommen, daß das blockweise enzymatisch entesterifizierte Pektin – insbesondere dasjenige, welches unter Verwendung rekombinanter DNA-Techniken hergestellt ist – das/die Protein(e) stabilisiert, indem es das/die Protein(e) in einem Kissen aus negativen Ladungen einschließt, wobei eine stabile Emulsion gebildet wird.
Das Verfahren der vorliegenden Erfindung ist für die blockweise Entesterifizierung von Pektinen geeignet, wenn die Pektine mit dem rekombinanten PME-Enzym in einem im wesentlichen wäßrigen Medium in Kontakt gebracht werden. In bestimmten Fällen können entesterifizierte Pektine die Calciumionensensitivität eines Pektins erhöhen, was wiederum vorteilhaft sein kann.
Alternativ ist das Verfahren der vorliegenden Erfindung zur Veresterung von Pektinen geeignet, wenn die Pektine mit dem rekombinanten PME-Enzym in einem im wesentlichen nicht wäßrigen Medium, wie in der Gegenwart von Methanol oder in der Gegenwart von hohen Konzentrationen an Ammoniumsulfat, in Kontakt gebracht werden. Dieser Gesichtspunkt ist z. B. vorteilhaft, wenn es erwünscht ist, die Calciumsensitivität eines Pektins zu vermindern.
Dieses Verfahren zur Veresterung von Pektinen ist vorteilhaft, weil es die Notwendigkeit von Veresterungsbedingungen unter hoher Temperatur und Methanol, die mit den Verfahren nach dem Stand der Technik einhergehen, unnötig macht. Somit wird hierin die Verwendung dieses veresterten Pektins bei der Herstellung eines Nahrungsmittels beschrieben sowie das Pektin per se.
Gemäß der vorliegenden Erfindung ist das entesterifizierte Pektin der vorliegenden Erfindung für die Herstellung eines Nahrungsmittels vorteilhaft.
Typische Nahrungsmittel umfassen Milchprodukte, Fleischprodukte, Geflügelprodukte, Fischprodukte und Backwaren. Vorzugsweise ist das Nahrungsmittel ein Getränk.
Das durch die vorliegende Erfindung hergestellte entesterifizierte Pektin ist auch vorteilhaft für die Verwendung als ein Stabilisator und/oder Viskositätsmodifizierer bei der Herstellung von Arzneimitteln, pharmazeutischen Hilfsmitteln, Kosmetika und kosmetischen Hilfsmitteln.
Vorzugsweise ist das saure Milieu eine wäßrige Lösung.
Vorzugsweise ist die wäßrige Lösung ein Getränk.
Vorzugsweise ist das Getränk ein Trinkjoghurt, ein Fruchtsaft oder ein Getränk, das Molkenprotein enthält.
Vorzugsweise ist das Protein aus Milchprodukten, wie Milch oder Käse, erhalten oder erhältlich.
Vorzugsweise ist das Protein Casein oder Molkenprotein.
Vorzugsweise hat das saure Milieu einen pH-Wert von etwa 3,5 bis etwa 5,5.
Vorzugsweise hat das saure Milieu einen pH-Wert von 4 bis etwa 5,5.
Vorzugsweise hat das saure Milieu einen pH-Wert von etwa 4.
Vorzugsweise ist das blockweise enzymatisch entesterifizierte Pektin, insbesondere dasjenige, welches mittels rekombinanter DNA-Techniken hergestellt ist, ein hochverestertes Pektin, welches etwa 80% Estergruppen oder weniger (d. h. einen Veresterungsgrad (DE) von 80% oder weniger), vorzugsweise etwa 75% Estergruppen oder weniger (d. h. einen DE von etwa 75% oder weniger) enthält. in diesem Zusammenhang beträgt das Verhältnis freier Carboxylgruppen zu veresterten Carboxylgruppen an dem Pektin von 1:1 bis 1:4, vorzugsweise von 1:2 bis 1:3.
Vorzugsweise enthält das blockweise enzymatisch entesterifizierte Pektin etwa 76% Estergruppen.
Unter bestimmten Umständen ist das blockweise enzymatisch entesterifizierte Pektin vorzugsweise sensitiv für Ca²⁺-Ionen. Calciumsensitivität kann bestimmt werden, indem man dem Protokoll folgt, wie es in den Beispielen erwähnt ist.
Besonders bevorzugt ist das blockweise enzymatisch entesterifizierte Pektin, insbesondere dasjenige, welches durch rekombinante DNA-Techniken hergestellt ist, jedoch nicht sensitiv für Ca²⁺-Ionen. Calciuminsensitivität kann bestimmt werden, indem man dem Protokoll folgt, wie es in den Beispielen erwähnt ist.
Vorzugsweise hat das blockweise enzymatisch entesterifizierte Pektin ein hohes Molekulargewicht.
Typischerweise liegt das Molekulargewicht zwischen etwa 50 kDa bis etwa 150 kDa.
Vorzugsweise wird das blockweise enzymatisch entesterifizierte Pektin hergestellt, indem man ein Pektin mit einer rekombinanten Pektinmethylesterase behandelt, welche zwei oder mehr benachbarte Galakturonsäurereste des Pektins an im wesentlichen allen der Pektinketten entesterifiziert.
Vorzugsweise wird das blockweise enzymatisch entesterifizierte Pektin hergestellt, indem man das Pektin mit der rekombinanten Pektinmethylesterase in der Gegenwart von Natriumionen behandelt.
Vorzugsweise wird das blockweise enzymatisch entesterifizierte Pektin, welches durch rekombinante DNA-Techniken hergestellt wird, durch Behandlung des Pektins mit der rekombinanten Pektinmethylesterase in der Gegenwart von NaCl, NaNO₃ oder Na₂SO₄ hergestellt.
Der Ausdruck ”Pektin” umfaßt Pektin in seiner normalen Bedeutung sowie Stücke und Derivate davon als auch modifizierte Pektine (z. B. chemisch modifizierte Pektine und enzymatisch modifizierte Pektine).
Vorzugsweise ist das Pektin kein Pektin, das vorher mit dem Enzym Polygalakturonase behandelt wurde, um die Länge des Pektinrückgrats im wesentlichen zu reduzieren.
Der Ausdruck ”Homologes” im Zusammenhang mit dem rekombinanten Enzym für die Verwendung in dem Verfahren der vorliegenden Erfindung umfasst jede Substitution, Variation, Modifikation, Ersetzung, Entfernung oder Zufügung von einer (oder mehreren) Aminosäure(n) aus oder in der Sequenz, vorausgesetzt, daß die resultierende Aminosäuresequenz PME-Aktivität und vorzugsweise wenigstens die gleiche Aktivität hat, wie ein rekombinantes Enzym, das irgendeine oder mehrere der als SEQ. I.D. Nr. 1 und 2 gezeigten Sequenzen enthält und wobei die Aminosäuresequenz wenigstens 75%, besonders bevorzugt wenigstens 85%, ganz besonders bevorzugt wenigstens 90% Homologie zu den Sequenzen aufweist, die als SEQ. ID. Nr. 1 und SEQ ID. Nr. 2 gezeigt sind. Mehr bevorzugt besteht wenigstens 95%, noch bevorzugter wenigstens 98% Homologie zu den Sequenzen, die als SEQ. ID. Nr. 1 und SEQ ID. Nr. 2 gezeigt sind. Speziell umfaßt der Ausdruck ”Homologes” Homologie in Bezug auf Struktur und/oder Funktion, vorausgesetzt, daß das resultierende rekombinante Enzym PME-Aktivität hat.
Die oben genannten Ausdrücke sind synonym zu allelen Variationen der Sequenzen.
Der Ausdruck ”komplementär” bedeutet, daß die vorliegende Erfindung auch Nukleotidsequenzen umfaßt, die an die Nukleotidsequenzen der codierenden Sequenz hybridisieren können.
Der Ausdruck ”Nukleotid” umfaßt im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung genomische DNA, cDNA, synthetische DNA und RNA. Vorzugsweise bedeutet er DNA, ganz besonders bevorzugt cDNA für die codierende Sequenz der vorliegenden Erfindung.
Der Ausdruck ”Konstrukt” – welcher synonym ist zu Ausdrücken, wie ”Konjugat”, ”Kassette” und ”Hybrid” – umfaßt die Nukleotidsequenz, welche direkt oder indirekt an einen Promotor gebunden ist. Ein Beispiel für eine indirekte Bindung ist das Vorsehen einer geeigneten Abstandshaltergruppe, wie einer Intron-Sequenz, wie dem Sh1-Intron oder dem ADH-Intron, zwischen dem Promotor und der Nukleotidsequenz. Das gleiche gilt für den Ausdruck ”verschmolzen”, welcher direkte oder indirekte Bindung umfaßt. In jedem Fall umfassen die Ausdrücke nicht die natürliche Kombination des Gens, welches das Enzym codiert, das normalerweise mit dem Wildtyp-Genpromotor assoziiert ist, wenn sie beide in ihrer natürlichen Umgebung vorliegen.
Das Konstrukt kann auch einen Marker enthalten oder exprimieren, welcher die Selektion des genetischen Konstrukts in beispielsweise einem Fadenpilz, vorzugsweise der Gattung Aspergillus, wie Aspergillus niger, oder Pflanzen, wie Kartoffeln, Zuckerrübe etc., in welche es transferiert wurde, erlaubt. Es gibt verschiedene Marker, die verwendet werden können, wie z. B. solche, die Manose-6-Phosphatisomerase (insbesondere für Pflanzen) codieren, oder solche Marker, die eine Antibiotika-Resistenz liefern – z. B. Resistenz gegen G418, Hygromycin, Bleomycin, Kanamycin und Gentamycin.
Der Ausdruck ”Vektor” umfaßt Expressionsvektoren und Transformationsvektoren.
Der Ausdruck ”Expressionsvektor” bedeutet ein Konstrukt, das zur Expression in vivo oder in vitro in der Lage ist.
Der Ausdruck ”Transformationsvektor” bedeutet ein Konstrukt, das von einer Spezies in eine andere transferiert werden kann – wie von einem E. coli-Plasmid in einen Fadenpilz, vorzugsweise der Gattung Aspergillus. Es kann auch ein Konstrukt sein, das von einem E. coli-Plasmid über ein Agrobacterium in eine Pflanze transferiert werden kann.
Der Ausdruck ”Gewebe” umfaßt Gewebe per se und Organe.
Der Ausdruck ”Organismus” wie hierin beschrieben umfaßt jeden Organismus, der die Nukleotidsequenz enthalten könnte, die das rekombinante Enzym codiert, wobei ein Promotor die Expression der Nukleotidsequenz erlauben kann, wenn er in dem Organismus vorhanden ist.
Vorzugsweise ist der Organismus ein Fadenpilz, vorzugsweise der Gattung Aspergillus, besonders bevorzugt Aspergillus niger.
Der Ausdruck ”transgener Organismus” wie hierin beschrieben umfaßt jeden Organismus, der die Nukleotidsequenz enthält, die das rekombinante Enzym codiert, wobei der Promotor die Expression der Nukleotidsequenz in dem Organismus erlauben kann. Vorzugsweise ist die Nukleotidsequenz in das Genom des Organismus aufgenommen.
Vorzugsweise ist der transgene Organismus ein Fadenpilz, bevorzugt der Gattung Aspergillus, besonders bevorzugt Aspergillus niger.
Daher umfaßt der transgene Organismus wie hierin beschrieben einen Organismus, der irgendeinen von einem Promotor, der Nukleotidsequenz, die das rekombinante Enzym codiert, oder Kombinationen davon umfasst.
Der Ausdruck ”transgener Organismus” umfaßt nicht die native codierende Nukleotidsequenz in ihrer natürlichen Umgebung, wenn sie unter der Kontrolle ihres nativen Promotors ist, welcher auch in seiner natürlichen Umgebung vorliegt. Die transformierte Zelle oder der transformierte Organismus könnte akzeptable Mengen der erwünschten Komponente herstellen, welche einfach aus der Zelle oder dem Organismus erhältlich wären.
Vorzugsweise umfaßt das Konstrukt wie hierin beschrieben die Nukleotidsequenz wie hierin beschrieben und einen Promotor.
Der Ausdruck ”Promotor” wird in dem auf dem Gebiet normalen Sinne verwendet, z. B. einer RNA-Polymerase-Bindungsstelle in der Jacob-Monod-Theorie der Genexpression.
Gemäß einem Aspekt befindet sich die Nukleotidsequenz unter der Kontrolle eines Promotors, der ein zell- oder gewebespezifischer Promotor sein kann. Wenn der Organismus z. B. eine Pflanze ist, dann kann der Promotor ein solcher sein, der die Expression der Nukleotidsequenz in irgendeinem oder mehreren aus Knollen-, Stamm-, Knospen-, Wurzel- und Blattgewebe beeinflußt.
Beispielhaft kann der Promotor für die Nukleotidsequenz der α-Amy 1-Promotor sein (auch bekannt als der Amy 1-Promotor, der Amy 637-Promotor oder der α-Amy 637-Promotor), wie er in unserer parallel anhängigen UK-Patentanmeldung Nr. 9421292.5 , angemeldet am 21. Oktober 1994, beschrieben ist. Alternativ kann der Promotor für die Nukleotidsequenz der vorliegenden Erfindung der α-Amy 3-Promotor sein (auch bekannt als der Amy 3-Promotor, der Amy 351-Promotor oder der α-Amy 351-Promotor), wie er in unserer parallel anhängigen UK-Patentanmeldung Nr. 9421286.7 , angemeldet am 21. Oktober 1994, beschrieben ist.
Der Promotor könnte zusätzlich Merkmale zum Sicherstellen oder zur Erhöhung der Expression in einem geeigneten Wirt enthalten. Zum Beispiel können die Merkmale konservierte Bereiche sein, wie eine Pribnow-Box oder eine TATA-Box. Der Promotor kann auch andere Sequenzen zur Beeinflussung (wie zum Aufrechterhalten, Verstärken, Vermindern) der Expressionsniveaus der Nukleotidsequenz enthalten. Zum Beispiel umfassen geeignete andere Sequenzen das Sh1-Intron oder ein ADH-Intron. Andere Sequenzen umfassen induzierbare Elemente – wie durch Temperatur, chemisch, durch Licht oder durch Streß induzierbare Elemente. Es können auch geeignete Elemente zur Verstärkung der Transkription oder Translation vorhanden sein. Ein Beispiel für das zuletzt genannte Element ist die TMV 5'-Signalsequenz (siehe Sleat Gene 217 [1987] 217–225; und Dawson Plant Mol. Biol. 23 [1993] 97).
Darüber hinaus ist es möglich, dass die vorliegende Erfindung Kombinationen von Promotoren und/oder Nukleotidsequenzen verwendet, welche Proteine oder rekombinante Enzyme und/oder Elemente codieren.
Hierin ist außerdem die Verwendung der Promotoren beschrieben, um eine Nukleotidsequenz zu exprimieren, welche das rekombinante Enzym codiert, wobei ein Teil des Promotors inaktiviert ist, der Promotor aber noch als Promotor funktionieren kann. Eine teilweise Inaktivierung eines Promotors ist unter bestimmten Umständen vorteilhaft. Insbesondere ist es bei dem oben erwähnten Amy 351-Promotor möglich, einen Teil davon zu inaktivieren, so daß der teilweise inaktivierte Promotor das Nukleotid in einer spezifischeren Art und Weise, wie in nur einem spezifischen Gewebetyp oder Organ, exprimiert.
Der Ausdruck ”inaktiviert” bedeutet eine teilweise Inaktivierung in dem Sinne, daß das Expressionsmuster des Promotors modifiziert ist, wobei der teilweise inaktivierte Promotor jedoch noch als Promotor funktioniert. Wie es oben erwähnt wurde, ist der modifizierte Promotor jedoch in der Lage, das Nukleotid der vorliegenden Erfindung oder ein GOI in wenigstens einem (aber nicht allen) spezifischen Gewebe des Original-Promotors zu exprimieren. Ein solcher Promotor ist der oben beschriebene Amy 351-Promotor. Beispiele für eine teilweise Inaktivierung umfassen eine Veränderung des Faltungsmusters der Promotorsequenz oder an Teile der Nukleotidsequenz bindende Spezies, so daß ein Teil der Nukleotidsequenz von z. B. RNA-Polymerase nicht erkannt wird. Ein anderer und bevorzugter Weg, den Promotor teilweise zu inaktivieren, besteht darin, ihn unter Bildung von Fragmenten davon zu trunkieren. Ein anderer Weg wäre, wenigstens einen Teil der Sequenz zu mutieren, so daß die RNA-Polymerase an diesen Teil oder einen anderen Teil nicht binden kann. Eine weitere Modifikation besteht darin, die Bindungsstellen für regulatorische Proteine zu mutieren, z. B. für das CreA-Protein, welches aus Fadenpilzen dafür bekannt ist, eine Unterdrückung des Kohlenstoffabbaus auszuüben und damit die Abbauunterdrückung des nativen Promotors zu zerstören.
Der Wirtsorganismus kann ein prokaryontischer oder ein eukaryontischer Organismus sein. Beispiele für geeignete prokaryontische Wirte umfassen E. coli und Bacillus subtilis. Lehren über die Transformation von prokaryontischen Wirten sind auf dem Gebiet gut dokumentiert, siehe z. B. Sambrook et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Auflage, 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press). Wenn ein prokaryontischer Wirt verwendet wird, kann es notwendig sein, das Gen vor der Transformation in geeigneter Weise zu modifizieren, wie durch Entfernen von Introns.
Wie oben erwähnt, ist ein bevorzugter Wirtsorganismus von der Gattung Aspergillus, wie Aspergillus niger.
Ein transgener Aspergillus gemäß der vorliegenden Erfindung kann hergestellt werden, indem man den Lehren von Rambosek, J. und Lesch, J. 1987 (Recombinant DNA in filamentous fungi: Progress and Prospects. CRC Crit. Rev. Biotechnol. 6: 357–393), Davis R. W. 1994 (Heterologous gene expression and protein secretion in Aspergillus. In: Martinelli S. D., Kinghorn J. R. (Herausgeber) Aspergillus: 50 years on. Progress in industrial microbiology, Band 29, Elsevier Amsterdam 1994, S. 525–560), Ballance, D. J. 1991 (Transformation systems for Filamentous Fungi and an Overview of Fungal Gene structure. In: Leong, S. A., Berka R. M. (Herausgeber) Molecular Industrial Mycology. Systems and Applications for Filamentous Fungi, Marcel Dekker Inc. New York 1991, S. 1–29) und Turner G. 1994 (Vectors for genetic manipulation. In: Martinelli S. D., Kinghorn J. R. (Herausgeber) Aspergillus: 50 years on. Progress in industrial microbiology Band 29, Elsevier Amsterdam 1994, S. 641–666). Die folgende Erläuterung liefert jedoch eine Zusammenfassung dieser Lehren zur Herstellung von transgenem Aspergillus gemäß der vorliegenden Erfindung.
Für fast ein Jahrhundert wurden Fadenpilze in breitem Maße in vielen Industriezweigen für die Herstellung organischer Verbindungen und von Enzymen verwendet. Zum Beispiel verwendeten traditionelle japanische Koji- und Soja-Fermentationen Aspergillus sp. Auch in diesem Jahrhundert wurde Aspergillus niger für die Herstellung von organischen Säuren, insbesondere Zitronensäure, und zur Herstellung verschiedener Enzyme für die Verwendung in der Industrie hergestellt.
Es gibt zwei Hauptgründe, warum Fadenpilze in so breitem Maße in der Industrie verwendet wurden. Erstens können Fadenpilze hohe Mengen an extrazellulären Produkten herstellen, z. B. Enzyme und organische Verbindungen, wie Antibiotika oder organische Säuren. Zweitens können Fadenpilze auf preiswerten Substraten wachsen, wie Getreiden, Kleie, Rübenpulpe etc. Die gleichen Gründe haben Fadenpilze als Wirte für heterologe Expression gemäß der vorliegenden Erfindung zu attraktiven Organismen gemacht.
Um den transgenen Aspergillus herzustellen, werden Expressionskonstrukte durch Einsetzen der Nukleotidsequenzen gemäß der vorliegenden Erfindung (oder auch der GOI) in ein Konstrukt, das für eine Expression in Fadenpilzen ausgestaltet ist, hergestellt.
Es wurden mehrere Typen von Konstrukten entwickelt, die für heterologe Expression verwendet wurden. Diese Konstrukte enthalten vorzugsweise einen Promotor, der in Pilzen aktiv ist. Beispiele für Promotoren umfassen einen Pilzpromotor für ein hochgradig exprimiertes extrazelluläres Enzym, wie den Glucoamylasepromotor oder den α-Amylasepromotor. Die Nukleotidsequenz gemäß der vorliegenden Erfindung (oder auch das GOI) kann mit einer Signalsequenz verschmolzen sein, welche das auszuscheidende Protein steuert, das von der Nukleotidsequenz gemäß der vorliegenden Erfindung (oder auch dem GOI), codiert wird. Üblicherweise wird eine Signalsequenz mit Pilzursprung. Ein Terminator, der in Pilzen aktiv ist, schließt das Expressionssystem ab.
Ein weiterer Typ eines Expressionssystems wurde in Pilzen entwickelt, bei dem die Nukleotidsequenz mit einem kleineren oder einem größeren Teil eines Pilzgens, welches ein stabiles Protein codiert, verschmolzen sein kann. Dies kann das von der Nukleotidsequenz codierte Protein stabilisieren. In solch einem System kann eine Spaltstelle, die von einer spezifischen Protease erkannt wird, zwischen dem Pilzprotein und dem von der Nukleotidsequenz codierten Protein eingeführt sein, so daß das erzeugte Fusionsprotein an dieser Stelle von der spezifischen Protease gespalten werden kann, wodurch das von der Nukleotidsequenz codierte Protein freigesetzt wird. Beispielhaft kann man eine Stelle einführen, die von einer KEX-2 ähnlichen Peptidase, die man in wenigstens einigen Aspergilli findet, erkannt wird. Solch eine Fusion führt zu einer Spaltung in vivo, was in einem Schutz des exprimierten Produkts und nicht eines größeren Fusionsproteins resultiert.
Heterologe Expression in Aspergillus wurde für einige Gene, die bakterielle, Pilz-, Wirbeltier- oder Pflanzenproteine codieren, berichtet. Die Proteine können intrazellulär abgeschieden werden, wenn die Nukleotidsequenz nicht mit einer Signalsequenz verschmolzen ist. Solche Proteine sammeln sich im Zytoplasma und werden üblicherweise nicht glycosyliert, was für einige bakterielle Proteine ein Vorteil sein kann. Wenn die Nukleotidsequenz mit einer Signalsequenz ausgestattet ist, wird sich das Protein extrazellulär ansammeln.
In Bezug auf Produktstabilität und Wirtsstammodifikationen sind einige heterologe Proteine nicht sehr stabil, wenn sie in die Kulturflüssigkeit von Pilzen ausgeschieden werden. Die meisten Pilze produzieren mehrere extrazelluläre Proteasen, welche heterologe Proteine abbauen. Um dieses Problem zu vermeiden, wurden spezielle Pilzstämme mit verminderter Proteaseproduktion als Wirt für heterologe Produktion verwendet.
Für die Transformation von Fadenpilzen wurden mehrere Transformationsprotokolle für viele Fadenpilze entwickelt (Ballance 1991, ibid.). Viele davon basieren auf der Herstellung von Protoplasten und der Einführung von DNA in die Protoplasten unter Verwendung von PEG und Ca²⁺-Ionen. Die transformierten Protoplasten regenerieren sich dann, und die transformierten Pilze werden unter Verwendung verschiedener Selektionsmarker selektiert. Unter den für die Transformation verwendeten Markern ist eine Anzahl von auxotrophen Markern, wie argB, trpC, niaD und pyrG, Antibiotikaresistenzmarker, wie Benomylresistenz, Hygromycinresistenz und Phleomycinresistenz. Ein allgemein verwendeter Transformationsmarker ist das amdS-Gen von A. nidulans, welches in einer hohen Kopienzahl erlaubt, daß die Pilze mit Acrylamid als der einzigen Stickstoffquelle wachsen.
In einer weiteren Ausführungsform kann der transgene Organismus eine Hefe sein. In diesem Zusammenhang wurde Hefe auch in breitem Umfang als ein Vehikel für die heterologe Genexpression verwendet. Die Spezies Saccharomyces cerevisiae hat eine lange Historie der industriellen Verwendung, einschließlich ihrer Verwendung für die heterologe Genexpression. Expression von heterologen Genen in Saccharomyces cerevisiae wurde von Goodey et al. (1987, Yeast Biotechnology, D. R. Berry et al., eds, S. 401–429, Allen and Unwin, London) und von King et al. (1989, Molecular and Cell Biology of Yeasts, E. F. Walton und G. T. Yarronton. eds, S. 107–133, Blackie, Glasgow) beschrieben.
Aus mehreren Gründen ist Saccharomyces cerevisiae für die heterologe Genexpression gut geeignet. Erstens ist sie für Menschen nicht pathogen und sie ist nicht in der Lage, bestimmte Endotoxine zu produzieren. Zweitens hat sie eine lange Historie der sicheren Verwendung, gefolgt von Jahrhunderten kommerzieller Nutzung für verschiedene Zwecke. Dies hat zu einer breiten öffentlichen Akzeptanz geführt. Drittens hat die extensive kommerzielle Nutzung und Forschung, die dem Organismus gewidmet wurde, zu einem Wissensreichtum über die Genetik und Physiologie sowie Fermentationseigenschaften in großem Maßstab von Saccharomyces cerevisiae geführt.
Eine Übersicht der Prinzipien der heterologen Genexpression in Saccharomyces cerevisiae und der Ausscheidung von Genprodukten geben E. Hinchcliffe und E. Kenny (1993, ”Yeast as a vehicle for the expression of heterologous genes”, Yeasts, Band 5, Anthony H. Rose und J. Stuart Harrison, eds, 2. Auflage, Academic Press Ltd.).
Es stehen mehrere Typen von Hefevektoren zur Verfügung, einschließlich integrative Vektoren, welche für ihre Aufrechterhaltung eine Rekombination mit dem Wirtsgenom erfordern, und autonom replizierende Plasmidvektoren.
Um die transgene Saccharomyces herzustellen, werden Expressionskonstrukte durch Einsetzen der Nukleotidsequenz in ein für die Expression in Hefe ausgestaltetes Konstrukt hergestellt. Es wurden verschiedene Typen von Konstrukten, die für heterologe Expression verwendet werden, entwickelt. Die Konstrukte enthalten einen in Hefe aktiven Promotor, der mit der Nukleotidsequenz verschmolzen ist, wobei üblicherweise ein Promotor mit Hefeursprung, wie der GAL1-Promotor, verwendet wird. Üblicherweise wird eine Signalsequenz mit Hefeursprung, wie die Sequenz, die das SUC2-Signalpeptid codiert, verwendet. Ein in Hefe aktiver Terminator schließt das Expressionssystem ab.
Für die Transformation von Hefe wurden verschiedene Transformationsprotokolle entwickelt. Zum Beispiel kann eine transgene Saccharomyces hergestellt werden, indem man den Lehren von Hinnen et al., (1978, Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA 75, 1929); Beggs J. D. (1978, Nature, London, 275, 104), und Ito, H. et al., (1983, J. Bacteriology 153, 163–168) folgt.
Die transformierten Hefezellen werden unter Verwendung verschiedener Selektionsmarker selektiert. Unter den für die Transformation verwendeten Markern ist eine Anzahl auxotropher Marker, wie LEU2, HIS4 und TRP1, und dominante Antibiotikaresistenzmarker, wie Aminoglycosidantibiotikamarker, z. B. G418.
Ein weiterer Wirtsorganismus ist eine Pflanze.
Auch wenn das Enzym und die Nukleotidsequenz, welche dafür codiert, in der EP-B-0 470 145 und der CA-A-2006454 nicht offenbart sind, bieten diese zwei Dokumente einige nützliche Hintergrunderläuterungen über die Arten von Techniken, die zur Herstellung von transgenen Pflanzen gemäß der vorliegenden Erfindung eingesetzt werden können. Einige dieser Hintergrundlehren sind nun in den folgenden Erläuterungen enthalten.
Das Grundprinzip der Konstruktion von genetisch modifizierten Pflanzen besteht darin, genetische Information in das Pflanzengenom einzusetzen, so daß man eine stabile Aufrechterhaltung des eingesetzten genetischen Materials erreicht.
Es existieren verschiedene Techniken zum Einsetzen von genetischer Information, wobei die zwei Hauptprinzipien ein direktes Einsetzen der genetischen Information und ein Einsetzen der genetischen Information unter Verwendung eines Vektorsystems sind. Eine Übersicht der allgemeinen Techniken kann man in den Artikeln von Potrykus (Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol [1991] 42: 205–225) und Christou (Agro-Food-Industruy Hi-Tech March/April 1994 17–27) finden.
Das Vektorsystem kann einen Vektor umfassen, aber es kann auch zwei Vektoren umfassen. Im Fall von zwei Vektoren, bezeichnet man das Vektorsystem normalerweise als ein binäres Vektorsystem. Binäre Vektorsysteme sind in weiterem Detail bei Gynheung An et al. (1980), Binary Vectors, Plant Molecular Biology Manual A3, 1–19, beschrieben.
Ein extensiv verwendetes System zur Transformation von Pflanzenzellen mit einem vorgegebenen Promotor oder einer Nukleotidsequenz oder einem Konstrukt basiert auf der Verwendung eines Ti-Plasmids von Agrobacterium tumefaciens oder eines Ri-Plasmids von Agrobacterium rhizogenes, An et al. (1986), Plant Physiol. 81, 301–305 und Butcher D. N. et al. (1980), Tissue Culture Methods for Plant Pathologists, eds.: D. S. Ingrams und J. P. Helgeson, 203–208.
Es wurden verschiedene Ti- und Ri-Plasmide konstruiert, die für den Aufbau der oben beschriebenen Pflanzen- oder Pflanzenzellkonstrukte geeignet sind. Ein nicht beschränkendes Beispiel für solch ein Ti-Plasmid ist pGV3850.
Die Nukleotidsequenz oder das Konstrukt wie hierin beschrieben sollte vorzugsweise in das Ti-Plasmid zwischen den terminalen Sequenzen der T-DNA oder in Nachbarschaft einer T-DNA-Sequenz eingesetzt werden, um eine Zerstörung der die T-DNA-Grenzen unmittelbar umgebenden Sequenzen zu vermeiden, da wenigstens einer dieser Bereiche für das Einführen von modifizierter T-DNA in das Pflanzengenom wichtig zu sein scheint.
Wie es aus der vorangegangenen Erläuterung klar wird, ist das Vektorsystem, wenn der Organismus eine Pflanze ist, dann vorzugsweise ein solches, welches die Sequenzen enthält, die erforderlich sind, um die Pflanze zu infizieren (z. B. der vir-Bereich) und wenigstens ein Grenzteil einer T-DNA-Sequenz, wobei der Grenzteil auf dem gleichen Vektor wie das genetische Konstrukt angeordnet ist. Vorzugsweise ist das Vektorsystem ein Agrobacterium tumefaciens-Ti-Plasmid oder ein Agrobacterium rhizogenes-Ri-Plasmid oder ein Derivat davon, da diese Plasmide gut bekannt sind und für die Herstellung von transgenen Pflanzen in breitem Umfang verwendet werden, wobei viele Vektorsysteme existieren, die auf diesen Plasmiden oder Derivaten davon basieren.
Bei der Herstellung einer transgenen Pflanze kann die Nukleotidsequenz oder das Konstrukt zuerst in einem Mikroorganismus hergestellt werden, in dem sich der Vektor replizieren kann und der vor dem Einsetzen in die Pflanze leicht zu manipulieren ist. Ein Beispiel für einen geeigneten Mikroorganismus ist E. coli, aber es können auch andere Mikroorganismen mit den oben beschriebenen Eigenschaften verwendet werden. Wenn ein Vektor eines Vektorsystems, wie es oben definiert ist, in E. coli aufgebaut wurde, wird er, falls erforderlich, in einen geeigneten Agrobacferium-Stamm, z. B. Agrobacterium tumefaciens, überführt. Das Ti-Plasmid, welches die Nukleotidsequenz oder das Konstrukt enthält, wird daher vorzugsweise in einen geeigneten Agrobacterium-Stamm, z. B. A. tumefaciens, überführt, um eine Agrobacterium-Zelle zu erhalten, welche die Nukleotidsequenz oder das Konstrukt beherbergt, dessen DNA anschließend in die zu modifizierende Pflanzenzelle transferiert wird.
Wie es in der CA-A-2006454 berichtet wird, steht eine große Menge an Klonierungsvektoren zur Verfügung, welche ein Replikationssystem in E. coli und einen Marker, welcher eine Selektion der transformierten Zellen erlaubt, enthalten. Die Vektoren enthalten z. B. pBR 322, die pUC-Serie, die M13 mp-Serie, pACYC 184 etc.
Auf diese Weise kann das Nukleotid oder Konstrukt in einer geeigneten Restriktionsposition in den Vektor eingeführt werden. Das enthaltene Plasmid wird für die Transformation in E. coli verwendet. Die E. coli-Zellen werden in einem geeigneten Nährmedium kultiviert und anschließend geerntet und lysiert. Das Plasmid wird anschließend gewonnen. Als Verfahren zur Analyse werden im allgemeinen Sequenzanalyse, Restriktionsanalyse, Elektrophorese und weitere biochemische und molekularbiologische Methoden verwendet. Nach jeder Manipulation kann die verwendete DNA-Sequenz geschnitten und mit der nächsten DNA-Sequenz verbunden werden. Jede Sequenz kann in das gleiche oder in ein anderes Plasmid kloniert werden.
Nach jedem Einfügungsverfahren des gewünschten Promotors oder Konstrukts oder der Nukleotidsequenz gemäß der vorliegenden Erfindung in die Pflanzen, kann das Vorhandensein und/oder Einsetzen von weiteren DNA-Sequenzen erforderlich sein. Wenn z. B. das Ti- oder Ri-Plasmid der Pflanzenzellen für die Transformation verwendet wird, kann wenigstens die rechte Grenze und häufig auch die rechte und die linke Grenze der Ti- und Ri-Plasmid-T-DNA als flankierende Bereiche der eingeführten Gene damit verbunden werden. Die Verwendung von T-DNA für die Transformation von Pflanzenzellen wurde intensiv studiert und ist in der EP-A-120 516 ; bei Hoekema, in: The Binary Plant Vector System Offset-drukkerij Kanters B. B., Alblasserdam, 1985, Chapter V; Fraley, et al., Crit. Rev. Plant Sci., 4: 1–46; und An et al., EMBO J. (1985) 4: 277–284 beschrieben.
Direkte Infektion von Pflanzengeweben mittels Agrobacterium ist eine einfache Technik, die in breitem Umfang verwendet wurde und bei Butcher D. N. et al. (1980), Tissue Culture Methods for Plant Pathologists, eds.: D. S. Ingrams und J. P. Helgeson, 203–208 beschrieben ist. Für weitere Informationen zu diesem Thema siehe Potrykus (Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol [1991] 42: 205–225) und Christou (Agro-Food-Industry Hi-Tech March/April 1994 17–27). Mit dieser Technik kann eine Infektion einer Pflanze an einem bestimmten Teil oder Gewebe der Pflanze durchgeführt werden, d. h. an einem Teil eines Blattes, einer Wurzel, eines Stamms oder einem anderen Teil der Pflanze.
Typischerweise wird bei einer direkten Infektion von Pflanzengeweben durch Agrobacterium, welches den Promotor und/oder das GOI trägt, eine zu infizierende Pflanze verwundet, z. B. durch Anschneiden der Pflanze mit einer Rasierklinge oder Punktieren der Pflanze mit einer Nadel oder Reiben der Pflanze mit einem Schleifgerät. Die Wunde wird dann mit dem Agrobacterium angeimpft. Die angeimpfte Pflanze oder der Pflanzenteil wird dann auf einem geeigneten Kulturmedium gezüchtet und zu reifen Pflanzen entwickeln gelassen.
Wenn Pflanzenzellen hergestellt werden, können diese Zellen gemäß gut bekannten Gewebekulturverfahren gezüchtet und gehalten werden, wie durch Kultivieren der Zellen in einem geeigneten Kulturmedium, das mit den notwendigen Wachstumsfaktoren, wie Aminosäuren, Pflanzenhormonen, Vitaminen etc., versetzt ist. Die Regenerierung der transformierten Zellen zu genetisch modifizierten Pflanzen kann unter Verwendung von bekannten Verfahren für die Regenerierung von Pflanzen aus Zell- oder Gewebekulturen erreicht werden, z. B. durch Selektieren von transformierten Trieben unter Verwendung eines Antibiotikums und durch Subkultivierung der Triebe auf einem Medium, das die geeigneten Nährstoffe, Pflanzenhormone etc. enthält.
Weitere Informationen zur Pflanzentransformation kann man in der EP-A-0 449 375 finden.
Zusammengefaßt liefert die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Stabilisierung von wenigstens einem Protein in einem sauren Milieu, bei dem man das Protein mit einem blockweise enzymatisch entesterifizierten Pektin, insbesondere einem durch rekombinante DNA-Techniken hergestellten blockweise enzymatisch entesterifizierten Pektin in Berührung bringt.
Eine bevorzugte Ausführungsform der vorliegenden Erfindung betrifft ein Verfahren zur Stabilisierung von wenigstens einem Protein in einem sauren Milieu, bei dem man das Protein mit einem blockweise enzymatisch entesterifizierten Pektin, welches durch rekombinante DNA-Techniken hergestellt ist, in Berührung bringt, wobei das blockweise enzymatisch entesterifizierte Pektin unter Verwendung eines rekombinanten Enzyms hergestellt ist und wobei das rekombinante Enzym eine der Aminosäuresequenzen enthält, die als SEQ. I.D. Nr. 1 oder SEQ. I.D. Nr. 2 gezeigt sind, oder eine Aminosäuresequenz enthält, die wenigstens 75% Homologie mit irgendeiner der Aminosäursequenzen aufweist, die als SEQ. ID. Nr. 1 oder SEQ. ID. Nr. 2 gezeigt sind, und welches die folgenden Eigenschaften aufweist:

1. Ein Molekulargewicht von etwa 36 kDa bis etwa 64 kDa;
2. ein pH-Optimum von pH 7–8, wenn man mit 0,5% Limonenpektin in 0,15 M NaCl mißt;
3. ein Temperaturoptimum von wenigstens 50°C;
4. eine Temperaturstabilität im Bereich von 10° bis wenigstens 40°C;
5. einen K_m-Wert von 0,07%;
6. ein Aktivitätsmaximum bei Mengen von etwa 0,25 M NaCl;
7. ein Aktivitätsmaximum bei Mengen von etwa 0,2 M Na₂SO₄; und
8. ein Aktivitätsmaximum bei Mengen von etwa 0,3 M NaNO₃.

Hierin ist ein Verfahren zum blockweise enzymatischen Entesterifizieren eines Pektins beschrieben, bei dem man das Pektin mit einem rekombinanten Enzym behandelt, das eine der Aminosäuresequenzen umfasst, die als SEQ. I.D. Nr. 1 oder SEQ. I.D. Nr. 2 gezeigt sind, oder das eine Aminosäuresequenz umfasst, welche wenigstens 75% Homologie mit einer der Aminosäuresequenzen aufweist, die als SEQ ID. Nr. 1 oder SEQ ID. Nr. 2 gezeigt sind, wobei das rekombinante Enzym die folgenden Eigenschaften aufweist:

Hierin ist ein rekombinantes Enzym offenbart, das eine der Aminosäuresequenzen umfasst, die als SEQ. I.D. Nr. 1 oder SEQ. I.D. Nr. 2 gezeigt sind, oder das eine Aminosäuresequenz umfasst, welche wenigstens 75% Homologie mit einer der Aminosäuresequenzen aufweist, die als SEQ ID. Nr. 1 oder SEQ ID. Nr. 2 gezeigt sind, wobei das rekombinante Enzym die folgenden Eigenschaften aufweist:

Besonders bevorzugte Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung betreffen den vorgenannten bevorzugten Prozeß, wobei das rekombinante Enzym mittels einer Nukleotidsequenz exprimiert wurde, welche die als SEQ. I. D. Nr. 3 oder SEQ. I. D. Nr. 4 gezeigte Sequenz oder Varianten, Derivate oder Homologe davon enthält.
Die folgende Probe wurde nach dem Budapester Vertrag bei der anerkannten Hinterlegungsstelle The National Collections of Industrial and Marine Bacteria Limited (NCIMB), 23 St Machar Drive, Aberdeen, Scotland, AB2 1RY, Großbritannien am 6. Juli 1995 hinterlegt: NCIMB 40749 (welche Plasmid pO34 entspricht).
Die folgende Probe wurde nach dem Budapester Vertrag bei der anerkannten Hinterlegungsstelle The National Collections of Industrial and Marine Bacteria Limited (NCIMB), 23 St Machar Drive, Aberdeen, Scotland, AB2 1RY, Großbritannien am 12. Juli hinterleget: NCIMB 40750 (welche Plasmid pO17 entspricht).
Daher betreffen besonders bevorzugte Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung den vorgenannten Prozeß, wobei das rekombinante Enzym durch NCIMB 40749 oder NCIMB 40750 exprimiert werden kann.
Die Aminosäuresequenz, welche die als SEQ. I. D. Nr. 5 dargestellte Sequenz enthält, ist dafür geeignet, die Hitzestabilität eines Proteins zu verschlechtern oder zu verbessern.
Darüber hinaus ist die Nukleotidsequenz, welche die als SEQ. I. D. Nr. 6 dargestellte Sequenz enthält, geeignet für die Expression einer Aminosäuresequenz zur Verschlechterung oder Verbesserung der Hitzestabilität eines Proteins verwendet zu werden.
Bezüglich dieser letztgenannten Gesichtspunkte ist die oben genannte Erläuterung zu Varianten, Derivaten, Homologen, Konstrukten, Vektoren, der Transformation von Wirtsorganismen in gleicher Weise anwendbar, obwohl die Aminosäuresequenz und die Nukleotidsequenz in diesem Fall natürlich die Hitzestabilität von Proteinen beeinflußt.
In diesem Zusammenhang wird angenommen, daß die als SEQ. I. D. Nr. 5 dargestellt Aminosäuresequenz in der Lage ist, die Hitzestabilität eines Proteins, wie der rekombinanten PME für die Verwendung in der vorliegenden Erfindung, zu verschlechtern oder zu verbessern. Die Aminosäuresequenz kann auch die Hitzestabilität anderer Proteine, einschließlich PMEs aus anderen Quellen, verbessern oder verschlechtern.
Die vorliegende Erfindung wird nun nur anhand von Beispielen beschrieben, in denen auf die folgenden angehängten Figuren Bezug genommen wird:
1 ist eine schematische Darstellung einer Zitrusfrucht, wie einer Orange;
2 ist ein SDS-PAGE-Gel eines rekombinanten Enzyms der vorliegenden Erfindung;
3 ist ein Diagramm zur Bestimmung des pH-Optimums;
4 ist ein Diagramm zur Bestimmung des Temperaturoptimums;
5 ist ein Diagramm zur Bestimmung der Temperaturstabilität;
6 ist ein Diagramm zur Bestimmung der K_m-Wertes;
7 ist ein Diagramm zur Bestimmung der Aktivität in Gegenwart oder Abwesenheit von NaCl;
8 ist ein Diagramm zur Bestimmung der Aktivität in Gegenwart oder Abwesenheit von Na₂SO₄;
9 ist ein Diagramm zur Bestimmung der Aktivität in Gegenwart oder Abwesenheit von NaNO₃;
10 ist ein Plasmidkarte von pO17;
11 ist eine Plasmidkarte von pO34;
12 ist eine schematische Darstellung von zwei Genen;
13 ist eine Plasmidkarte von pJK10;
14 ist eine Plasmidkarte von pJK11;
15 ist eine Plasmidkarte von pJK12;
16 ist eine Plasmidkarte von pJK20;
17 ist eine Plasmidkarte von pJK21; und
18 ist eine Plasmidkarte von pJK22.
Auf 1 wurde in der vorangegangenen Beschreibung Bezug genommen. Die anderen Figuren werden in der nachfolgenden Erläuterung diskutiert.
Experimenteller Abschnitt
Material und Methoden der Biochemie
Pflanzenmaterial: noch nicht ausgereifte spanische Orangen der Varietät Navelina Klasse I ohne Samen wurden zur Isolierung von PME verwendet. Die Orangen wurden von Hand geschält, und die Schalen wurden bei –80°C gelagert.
Extraktion von PME aus Orangenschale
PME wurde nach dem folgenden Verfahren gereinigt. Alle Arbeitsschritte wurden bei 4°C durchgeführt. 600 g gefrorene Orangenschalen wurden aufgetaut und in kleinere Stücke geschnitten. Sie wurden anschließend in einem Warring-Mixer für 2 Minuten in 1200 ml Puffer (100 mM Na-Succinat, pH 6,2, 1 mM DTT) homogenisiert. Dem Homogenat wurden 36 g festes NaCl unter Erhalt einer Endkonzentration von 3% (w/v) zugefügt, um membrangebundene Proteine zu isolieren (Versteeg et al. (1978) Lebensmittel-Wiss. u. Technol., 11: 267–274). Nach 2 Stunden Inkubation unter mäßigem Rühren bei 4°C wurde die Suspension durch ein Nylonsieb filtriert, und das Filtrat wurde bei 10.000 U. p. M. für 20 Minuten zentrifugiert, um unlösliche Reste zu entfernen.
Der Überstand wurde anschließend unter Anwendung von (NH₄)₂SO₄-Präzipitation fraktioniert. Der Überstand wurde zuerst mit 30% (NH₄)₂SO₄ unter langsamen Rühren für 30 Minuten präzipitiert. Nach Zentrifugation bei 20.000 U. p. M. für 10 Minuten wurde der Überstand weiter mit 60% (Nh₄)₂SO₄ für 30 Minuten präzipitiert. Die Suspension wurde wie zuvor zentrifugiert und das Präzipitat wurde in 50 ml 50 mM MES, 1 mM DTT, pH 6,8 resuspendiert und gegen den gleichen Puffer über Nacht dialysiert.
Chromatographie
Die dialysierte Probe wurde mittels Kationenaustauscherchromatographie weiter getrennt. Eine 40–50 ml Probe wurde in zwei Läufen auf eine CM-Sepharose^TM CL-6B (1,5 × 15 cm) aufgetragen mit einem 30-minütigen Waschschritt zwischen den Läufen mit Puffer A: 50 mM MES, 1 mM DTT, pH 6,8. Nach dem Wegwaschen von ungebundenen Proteinen mit Puffer A wurden die gebundenen Proteine mit einem zunehmenden NaCl-Gradienten von 0–0,4 M NaCl in insgesamt 500 ml eluiert. Der Durchfluß betrug 25 ml/h, und es wurden Fraktionen von 8,33 ml gesammelt. Das Proteinabsorptionsprofil wurde bei 280 nm gemessen.
Alle Fraktionen wurden auf PME-Aktivität und Protein analysiert. Der Proteingehalt wurde photospektrometrisch nach der BioRad-Methode gemessen.
Die Fraktionen, welche PME-Aktivität enthielten, wurden vereinigt und mittels Druckdialyse unter Verwendung eines Amicon-Filtersystems konzentriert. Auf dem gleichen System wurde ein Pufferaustausch auf 50 mM Tris, 1 mM DTT, 0,1 M NaCl, pH 7 durchgeführt.
9 ml konzentrierte PME-Probe wurden anschließend auf eine Gelfiltrationssäule Sephacryl^TM S-200 (2,6 × 70 cm) aufgetragen. Die Säule war mit 50 mM Tris, 1 mM DTT, 0,1 M NaCl, pH 7 äquilibriert. Der Durchfluß betrug 40 ml/h, und es wurden Fraktionen von 5,33 ml gesammelt. Die Fraktionen, welche PME-Aktivität enthielten, wurden vereinigt und konzentriert.
Enzymaktivität
PME katalysiert die Spaltung von Methylestergruppen von Pektin. Während der Reinigungsschritte wurde PME durch ein schnelles Verfahren unter Verwendung eines Methylrot-Indikatortests festgestellt. Aufgrund der Spaltung von Methylgruppen von Galakturonsäureresten in der Pektinkette wurden Carboxylgruppen gebildet, und der pH-Wert fällt in dem Test ab. Der pH-Wert-Indikator Methylrot wechselt bei einem pH-Wertabfall die Farbe von Gelb (pH 6,2) nach Pink (pH 4,2). Der Test enthielt 1 ml 0,5% Grindsted^TM Pektin 1450 (DE 70%) (geliefert von Danisco Ingredients, Danisco A/S), gelöst in 0,15 M NaCl, pH 7 und 125 μl Probe. Die Proben, welche nach 10 Minuten Inkubation bei 30°C einen positiven Methylrot-Test zeigten, wurden anschließend weiter nach dem Titrationsverfahren gemessen (Versteeg et al. (1978) (9 Lebensmittel-Wiss. u. Technol., 11: 267–274).
Bei dem Titrationsverfahren enthielt der Test 10 ml 0,5% Zitronenpektin (Grindsted^TM Pektin 1450 – geliefert von Danisco ingredients, Danisco A/S), gelöst in 0,15 M NaCl, pH 6,8 und 10–100 μl Probe. Die Titration wurde mit 0,02 M NaOH durchgeführt, und die Reaktion wurde bei Raumtemperatur gemessen. Es wurde ein automatischer Titrationsapparat verwendet (Versteeg et al. (1978) Lebensmittel-Wiss. u. Technol., 11: 267–274).
SDS-PAGE/Western-Blot
Die Reinheit der PME-Fraktion wurde durch SDS-PAGE unter Verwendung des Pharmacia PhastSystem^TM mit 10–15% SDS-Gradientengelen untersucht. Elektrophorese und Silberfärbung der Proteine wurden so durchgeführt, wie es in den Anleitungen von Pharmacia beschrieben ist. Zur Bestimmung von pl IEF wurden 3–9 PhastSysteme^TM-Gele verwendet.
Zur Charakterisierung von polyklonalen Antikörpern, die gegen Orangenschalen-PME gerichtet waren, wurde Immunogelelektrophorese verwendet. Die Enzymfraktionen wurden durch SDS-PAGE getrennt und durch halbtrockene Blot-Technik auf einer Semydry-Transfereinheit des PhastSystem^TM auf NC-Papier übertragen. Das NC-Papier wurde mit dem ersten Antikörper inkubiert, welcher 1:50 verdünnt war, und mit dem zweiten an alkalische Phosphatase gekoppelten Antikörper (Dako A/S Glsotrup, Dänemark), welcher in einer Verdünnung von 1:1000 verwendet wurde, gefärbt.
Peptidkartierung
PME wurde entweder mit Trypsin oder Endoproteinase Lys-C aus Lysobacter enzymogenes verdaut (beide Enzyme entsprachen dem Sequenzierungsgrad und wurden von Boehringer Mannheim, Deutschland, bezogen).
100 μg gereinigte PME wurde mit Iodoacetamid carboxymethyliert, um die reduzierten SH-Gruppen zu schützen. Anschließend wurde das Protein mit Trypsin (4 μg/20–100 μl) gespalten. Die hydrolytische Spaltung wurde bei 40°C für 2 × 3 Stunden durchgeführt. Die Reaktion wurde durch Zugabe von 20 μl TFA gestoppt. Nach Zentrifugation bei 15000 U. p. M. für 5 Minuten wurden die Peptide auf einer Phasenumkehr-HPLC-Säule (Vydac 10 C18-Säule) gereinigt. 2 × 500 μl Proben wurden aufgetragen. Die Peptide wurden mit einem zunehmenden Acetonitrilgradienten von 0,05–0,35% in 60 Minuten in 0,1% TFA eluiert und getrennt. Die Peptide wurden von Hand in Eppendorf-Reaktionsgefäßen gesammelt.
Für den Verdau mit Endoproteinase Lys-C wurde gefriergetrocknete PME (0,1 mg) in 50 μl 8 M Harnstoff, 0,4 M NH₄HCO₃, pH 8,4, gelöst. Nach Bedecken mit N₂ und Zugabe von 5 μl 45 mM DTT wurde das Protein für 15 Minuten bei 50°C unter N₂ denaturiert und reduziert. Nach Abkühlen auf Raumtemperatur wurden 5 μl 100 mM Iodoacetamid hinzugegeben, um die Cysteine für 15 Minuten bei Raumtemperatur in der Dunkelheit unter N₂ zu derivatisieren. Anschließend wurden 90 μl Wasser und 5 μg Endoproteinase Lys-C in 50 μl 50 mM Tricin und 10 mM EDTA, pH 8,0, hinzugegeben, und der Verdau wurde für 24 Stunden bei 37°C unter N₂ durchgeführt.
Die erhaltenen Peptide wurden getrennt, wie es für trypsinverdaute Peptide beschrieben ist.
Ausgewählte Peptide wurden weiter auf einer Devosil 3 C₁₈RP-HPLC-Säule, 0,46 × 10 cm, (Novo Nordisk, Dänemark) gereinigt. Die gereinigten Peptide wurden anschließend auf einen Aminosäuresequenzierer Applied Biosystems 476A aufgetragen, wobei schnelle Zyklen mit gepulster Flüssigkeit eingesetzt wurden.
Untersuchung 1
Bei der Reinigung vom PME wurden 600 g gefrorene Orangeschalen homogenisiert, und nach Präzipitation mit 30–60% (NH₄)₂SO₄ und Dialyse wurde die Probe auf eine Kationenaustauschersäule (CM-Sepharose^TM CL-6B) aufgetragen. PME bindet stark an Kationenaustauschersäulenmaterial bei pH 6,8, wogegen die meisten der Proteine nicht an die Säule binden und daher in dem Waschvolumen eluieren. Mit zunehmendem NaCl-Gradienten eluierte PME in zwei Maxima mit der Hauptaktivität in PME I(Fraktion 49–53) bei einer NaCl-Konzentration von 0,25 M. Ein kleineres PME-Maximum eluierte bei einer niedrigern Konzentration an NaCl (Fraktion 25–32). Die weitere Reinigung wurde nur für PME I durchgeführt, welches die höchste Aktivität enthielt.
Nach der Konzentrierung wurde die PME-Fraktion weiter unter Verwendung von Gelfiltrationschromatographie (Sephacryl^TM S-200-Säule) gereinigt. Fraktionen, welche die höchste PME-Aktivität enthielten, wurden vereinigt und durch Amicon-Filterdialyse konzentriert.
Insgesamt wurden etwa 4 mg PME aus 600 g Orangenschalen erhalten, was einer Proteinausbeute von 12% entspricht.
SDS-PAGE zeigte nur eine Proteinbande in der gereinigten PME-Fraktion mit einem Molekulargewicht von 36.000 Da (2). Isoelektrische Fokussierung von PME zeigte, daß der pl-Wert > 9 war.
Charakterisierung und kinetische Daten
Die Charakterisierung von PME und Optimabestimmungen wurden alle nach dem Titrationsverfahren durchgeführt, wie es unter Material und Methoden beschrieben ist.
Das pH-Optimum der PME-Aktivität wurde mit 0,5% Zitronenpektin (Grinsted^TM Pektin 1450 – geliefert von Danisco ingredients, Danisco A/S) in 0,15 M NaCl gemessen. Die Daten sind in 3 gezeigt. Das Optimum wurde bei pH 7–8 gefunden.
Das Temperaturoptimum wurden bei 50°C ermittelt – siehe in 4 gezeigte Daten.
Die Hitze-(Temperatur-)Stabilität von PME wurde durch Inkubieren der Enzymprobe in Eppendorf-Reaktionsgefäßen bei verschiedenen Temperaturen für 15 Minuten bestimmt. Nach der Inkubation wurde die Enzymaktivität durch einen traditionellen Test nach dem Titrationsverfahren gemessen. Die Stabilität der Enzymaktivität lag zwischen 10°–40°C – siehe Daten in 5.
Die Affinität für Zitronenpektin (Grindsted^TM Pektin 1450 – geliefert von Danisco Ingredients, Danisco A/S) wurde mittels eines Lineweaver-Burk-Diagramms von verschiedenen Pektinkonzentrationen gegen die Aktivität bestimmt. Die Daten sind in 6 gezeigt. Der K_m-Wert wurde aus der Kurve mit 0,07% berechnet.
Wir haben auch herausgefunden, daß die PME auch Zuckerrübenpektin entesterifizieren konnte. Zuckerrübenpektin enthält 60% Galakturonsäurereste, wobei einige von deren Carboxylgruppen methyliert sind (ein ungefährer DE von 60%), und darüber hinaus sind einige der Galakturonsäuregruppen am C-2 und/oder C-3 acetyliert. Die PME-Aktivität wurde gemessen, wie es unter Material und Methoden beschrieben ist, mit der Ausnahme, daß in dem Test 1% in 0,15 M NaCl gelöstes Zuckerrübenpektin verwendet wurde, da das Zuckerrübenpektin etwa 60% Pektin enthielt. Die Ergebnisse zeigten, daß die PME Zuckerrübenpektin entesterifizieren konnte, obwohl die Galakturonsäurereste an den C-2/C-3-Positionen acetyliert sind.

Enzymaktivität (μMol/Min/ml)

0,5% Zitronenpektin 387

(Grindsted^TM Pektin 1450 – geliefert von Danisco Ingredients, Danisco A/S)

1,0% Zuckerrübenpektin 80
Weitere Experimente zeigten, daß die PME der vorliegenden Erfindung für die Aktivität vorzugsweise NaCl benötigt – siehe Daten in 7. Die Aktivität steigt mit zunehmender NaCl-Konzentration an mit einem Optimum bei 0,25 M NaCl. Höhere Konzentrationen vermindern die Aktivität im Vergleich zu der maximalen Aktivität.
Weitere Experimente zeigten, daß andere Salze, z. B. Na₂SO₄ oder NaNO₃, NaCl hinsichtlich der PME-Aktivität ersetzen können. Diese Daten sind in den 8 und 9 gezeigt. Die optimale Aktivität wurde bei 0,2 M Na₂SO₄ bzw. 0,3 M NaNO₃ gefunden.
N-terminale Analyse
Untersuchungen zeigten, daß die N-terminale Sequenz von nativer PME blockiert war. Eine Entblockierung wurde erreicht, indem man PME, welches auf eine PVDF-Membran geblottet war, mit wasserfreier TFA für 4 Minuten bei 45°C in Reaktionsgefäßen behandelte. Nach Verdampfen der meisten TFA wurden die Reaktionsgefäße bei 65°C für 4 Stunden stehengelassen (Wellner, D. et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. 87: 1947–1949). Die erhaltende Sequenz war SSSVTPNVVVAADSSGNFK, und das N-Acetylserin ist der N-terminale Rest von PME.
Immunohistolokalisierung
Für die Herstellung von Gewebeproben für die Immunohistochemie wurden dünne Scheiben des mittleren Teils von reifer Frucht in 2% Paraformaldehyd, 0,25% Glutaraldehyd und 3% Sucrose, gepuffert mit 0,05 M Phosphatpuffer, pH 7, fixiert. Nach Inkubation für 2 Stunden bei 25°C und 63 Stunden bei 5°C wurden die Proben 3 × 20 Minuten in 0,05 M Phosphatpuffer, pH 7, gewaschen.
Dehydrierung wurde unter Anwendung einer Reihe von Ethanolwaschschritten (50%, 70%, 80% und 96%), gefolgt von drei Waschschritten mit 99% Ethanol (30 Minuten für jede Ethanolkonzentration) durchgeführt. Nach einer zusätzlichen Behandlung für 2 × 2 Stunden in Petroleum (Shellsol^TM D70k, Q7712) und 2 × 2 Stunden in Parafin mit 7% Bienenwachs wurden die Proben in Parafin eingebettet. Schnitte von 12,5 μm wurden auf einem Supercut 2050 Reichart Jung Pyramitom hergestellt.
Immunologie
Gewebeschnitte wurden mit 20% Schweineserum in TBS (0,5 M Tris/HCl, pH 7,6, 0,15 M NaCl, 0,1% Triton X-100) für 30 Minuten vorinkubiert vor einer Behandlung für 1 Stunde mit PME-Antikörpern, welche 1:50 in TBS verdünnt waren. Überschüssige Antikörper wurden durch Waschen für 5 × 5 Minuten mit TBS entfernt. Nach dem Waschen wurden die Schnitte für 30 Minuten mit sekundären Antikörpern, welche mit alkalischer Phosphatase gekoppelt waren, 1:20 in TBS-Puffer inkubiert. Überschuß an sekundärem Antikörper wurde durch Waschen mit TBS entfernt, wie es oben beschrieben ist. Vor dem Färben wurden die Schnitte mit veronalem Acetatpuffer, pH 9,2, für 5 Minuten behandelt und anschließend mit Fast Red und Naphtol AS-BI-Phosphat (Sigma Nr. N4875) für 20 Minuten gefärbt. Überschüssiges Reagenz wurde durch Waschen mit Wasser entfernt. Parallel wurden Kontrollen laufen gelassen und mit Pre-Immunserum behandelt.
Ergebnisse
Immunologische Lokalisierungen mit dem gegen Schalen-PME gerichteten Antikörper zeigten, daß PME in großen Mengen in der äußeren Zellschicht der Lamelle zwischen den Abschnitten, im Kern und in der äußeren Zellschicht der Saftblasen und auch in der inneren Zellschicht der Albedo vorhanden ist (siehe 1). Diese Ergebnisse zeigen, daß der Antikörper gegen Schalen-PME mit PME aus dem Fleisch (das Fleisch besteht aus Abschnitten, siehe 1) kreuzreagiert, was eine hohe Homologie zwischen der PME, welche in der Schale bzw. in dem Fleisch lokalisiert ist, zeigt.
Untersuchung 2
PME aus Orangenschale wurde in großen Mengen gereinigt. In diesem Zusammenhang wurden etwa 70 mg PME aus 5 kg Orangenschalen isoliert. Die gereinigte PME wurde dann in dem Anwendungstest unter Verwendung von Milchprotein, z. B. einem Trinkjoghurt, eingesetzt. In diesem Test verbesserte das blockweise enzymatisch entesterifizierte Pektin die proteinstabilisierenden Eigenschaften im Vergleich zu nicht entesterifiziertem Pektin vermutlich aufgrund der gebildeten Blockstruktur. Das Endprodukt hatte auch eine vorteilhafte Viskosität.
Enzym Isoformen
Obwohl man nicht durch eine Theorie gebunden sein will, wird angenommen, daß die PME der vorliegenden Erfindung in wenigstens zwei Isoformen vorliegen kann. Isoform S hat ein Molekulargewicht von etwa 36 kDa und kann als die „kurze PME” bezeichnet werden. Isoform L hat ein Molekulargewicht von etwa 64 kDa und kann als die „lange PME” bezeichnet werden.
Es wird auch angenommen, daß die Isoform L hitzestabiler ist als die Isoform S. Es wird auch angenommen, daß die Isoform S die anfängliche Entesterifizierungsstufe in einer blockweisen Art und Weise beginnt und anschließend von der Isoform L ersetzt wird.
Mit anderen Worten, es wird angenommen, daß die Isoform L eine größere Affinität zu teilweise entesterifiziertem Pektin hat als die Isoform S.
Es wird angenommen, daß die Hitzestabilität von Isoform L auf die Aminosäuresequenz zurückzuführen ist, welche als SEQ. I. D. Nr. 5 wiedergegeben ist.
Weitere Untersuchungen haben gezeigt, daß das Gen für die Isoform L eine N-terminale Verlängerung stromaufwärts der Signalsequenz hat. Diese ist schematisch in 12 gezeigt.
Isolierung und Charakterisierung von cDNAs, welche aus Orange erhältliche Pektinmethylesterase codieren
Material und Methoden der Molekularbiologie
1. Materialien
Es wurden Orangen (Citrus sinensis) der Varietät Navel, welche aus Marokko stammten, verwendet.
2. DNA
Genomische DNA wurde isoliert, wie es von Dellaporta S. L. et al. (1983) Plant Mol. Biol. Rep. 1(4): 19–21 beschrieben ist. Plasmid-DNA wurde isoliert, wie es in der EP-B-0 470 145 beschrieben ist.
3. RNA
Gesamt-RNA wurde aus reifen Orangenfrüchten isoliert. Der äußere Bereich des Fleisches und der innere Bereich der Albedo-Schicht (siehe 1) einer Navel-Orangenfrucht wurden für die RNA-Isolierung verwendet, gefolgt von dem Verfahren, welches von Logemann J., Schell J. und Willmitzer L. (1987) Anal. Biochem 163: 16–20, „Improved Method for the isolation of RNA from Plant Tissues”, beschrieben wird.
4. PCR
Orangen-Gesamt-RNA wurde zur Durchführung von reverser PCR mit dem rTth Reverse PCR-Kit (Perkin Elmer) nach den Anleitungen des Herstellers mit den folgenden Temperaturzyklen verwendet: Reverse Transkription:

70°C 2 Min

60°C 2 Min

50°C 2 Min

45°C 5 Min

40°C 5 Min

30°C 10 Min

42°C 10 Min

70°C 2,5 Min

5°C halten

Vervielfältigung (PCR):

94°C 2 Min

92°C 1 Min

45°C 2 Min

72°C 2 Min in 40 Zyklen

72°C 5 Min

5°C halten
5. Klonierung von PCR-Fragmenten
PCR-Fragmente wurden in die EcoRV-Schnittstelle des Vektors pT7Blue (Novagen) nach Anleitungen des Herstellers kloniert.
6. DNA-Sequenzierung
Doppelsträngige DNA wurde im wesentlichen nach der Didesoxymethode von Sanger et al. (1979) unter Verwendung des Auto Read Sequencing Kit (Pharmacia) und des Pharmacia LKB A. L. F. DNA-Sequenzierers durchgeführt (Literatur: Sanger, F., Nicklen S., und Coulson, A. R. (1979), DNA sequencing with chain-determinating inhibitors, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74: 5463–5467). Die für die Sequenzierung verwendeten Primer sind nachfolgend aufgeführt (dargestellt 5' nach 3'):
Die sequenzierte Nukleotidsequenz ist als SEQ. I. D. Nr. 3 (erhalten aus pO17) und SEQ. I. D. Nr. 4 (erhalten aus pO34) gezeigt. Die N-terminale Sequenz ist als SEQ I. D. Nr. 6 gezeigt.
7. Durchmusterung der Bibliothek
Eine cDNA-Bibliothek in lambda zapII (Stratagene), welche aus mRNA, isoliert aus dem Fleisch und der Albedo-Schicht der Orangenfrucht, hergestellt worden war, wurde mit der geeigneten radioaktiv markierten PCR-Sonde durchmustert. Die Durchmusterung wurde nach den Anleitungen des Herstellers durchgeführt mit der Ausnahme, daß die Vorhybridisierung und die Hybridisierung in 2 × SSC, 0,1% SDS, 10 × Denhardt's und 100 μg/ml denaturierter Lachssperma-DNA durchgeführt wurden. Die Hybridisierung wurde über Nacht bei 67°C durchgeführt. Die Filter wurden zweimal in 2 × SSC, 0,1% SDS, zweimal in 1 × SSC, 0,1% SDS und zweimal in 0,1 × SSC, 0,1% SDS gewaschen.
8. Sonde
Das klonierte PCR-Fragment wurde aus dem Vektor pT7 Blue durch Verdau mit den geeigneten Restriktionsenzymen isoliert. Das Fragment wurde von dem Vektor durch Agarosegelelektrophorese getrennt, und das Fragment wurde gereinigt und unter Verwendung des Ready to Go^TM DNA-Markierungskit (Pharmacia) radioaktiv markiert.
9. Southern-Analyse
Genomische Orangen-DNA oder Plasmid-DNA wurden nach den Anleitungen des Herstellers (Amersham) mit geeigneten Restriktionsenzymen verdaut, auf HybondN^+TM-Membrane übertragen und hybridisiert.
10. In situ-Hybridisierungsexperimente
In situ-Hybridisierungstechnik basiert auf dem Prinzip der Hybridisierung einer Antisense-Ribonukleotidsequenz an die mRNA. Die Technik wird verwendet, um Bereiche, in denen mRNA vorhanden ist, in mikroskopischen Schnitten zu visualisieren. In diesem speziellen Fall wurde die Technik verwendet, um die mRNA zu lokalisieren, welche das Enzym Pektinmethylesterase in Schnitten von C. sinensis codiert.
Herstellung von Gewebeproben für in situ-Hybridisierung
Dünne Scheiben aus dem mittleren Teil einer reifen Orangenfrucht wurden durch Fixierung mit FAA-Fixierung (45% Ethanol, 5% Formalin (40% Paraformaldehyd) und 5% Essigsäure) und Inkubation für 2 Stunden bei 25°C und 63 Stunden bei 5°C fixiert. Die Proben wurden für 3 × 20 Minuten in einem 0,05 M Phosphatpuffer, pH 7, gewaschen. Dehydrierung wurde durch Anwendung einer Reihe von Ethanolwaschschritten (50%, 70%, 80%, 96%) durchgeführt, welche mit drei Waschschritten in 99% Ethanol abgeschlossen wurden. Jeder Waschschritt dauerte 30 Minuten. Die Proben wurden dann mit Petroleum (Shellsol^TM D70k, Q7712) in 2 × 2 Stunden und für weitere 2 × 2 Stunden in Parafin mit 7% Bienenwachs behandelt. Danach wurden die Proben in Parafin eingebettet. Schnitte von 12,5 μm wurden unter Verwendung eines Supercut 2050 Reichart Jung Pyramitoms hergestellt.
Herstellung von ³⁵S-markierten Sonden für die in situ-Hybridisierung
Ein 501 Bp langes PCR-Fragment aus einer zweiten PCR-Vervielfältigung wurde in den Vektor pT7 Blue (Novagen) in beiden Richtungen kloniert. Der pT7-Vektor enthält einen T7-Promotor. Die Transkription der Antisense-RNA und der Sense-RNA wurden von dem SP-7 Promotor nach Verdauen des Plasmids mit BamHI gesteuert. Ein Maxiscript Kit^TM (Ambion) wurde mit den folgenden Modifikationen verwendet. Die Transkripte wurden auf einem 6%-igen Sequenziergel laufengelassen, um das eingebaute Nukleotid zu entfernen, und mit dem Elutionspuffer, der dem 17 RNA-Polymerase-in vitro-Transkriptionskit (Ambion) beigefügt war, eluiert. Die Transkripte enthielten 55 nicht codierende Nukleotide an einem Ende und auch 9 nicht codierende Nukleotide an dem anderen Ende. Für die Hybridisierung wurden 10⁷ cpm/ml der ³⁵S-markierten Sonde verwendet.
In situ-Hybridisierung wurde im wesentlichen so durchgeführt, wie es von Langedale J. A. (1994) in dem Maize-Handbuch M. Freeling und V. Walbot, eds., Seiten 165–180, Springer Verlag, New York, Inc. beschrieben ist. Es wurde ermittelt, daß die Hybridisierungstemperatur bei 57°C optimal ist. Nach Waschen bei 57°C wurden die Schnitte mit fotografischer Emulsion Kodak K-5 bedeckt und für 3 Tage bei 5°C in der Dunkelheit belassen.
11. Ergebnisse
Die folgende Sequenzinformation wurde verwendet, um Primer für die nachfolgend erwähnten PCR-Reaktionen zu generieren und um die von den entsprechenden Nukleotidsequenzen erzeugte Aminosäuresequenz zu prüfen – siehe anhängende SEQ. I. D. Nr. 7–19.
Peptidsequenzen von Pektinmethylesterase, welche für die Generierung von Primern verwendet wurden

Asn Cys Asp Met Leu Ala Tyr Gln Asp Thr Leu Tyr (PE492B)
Val Ile Thr Ser Ala Thr Glu Ala Gln Ala Phe Thr Pro Gly Ser Phe Ile Ala Gly Ser Ser Trp Leu Gly Ser Thr Gly Phe (Pe701)

Die Aminosäuresequenz (PE492B, 4–7), welche für die Generierung von Primer A verwendet wurde (Met Leu Ala Tyr Gln Asp Thr)
Primer A

ATG(CT)T(GATC)GC(GATC)TA(TC)CA(AG)GA(TC)AC 256 Mix

Die Aminosäuresequenz (PE701, 7–13), die zur Generierung von Primer B verwendet wurde (Glu Ala Gln Ala Phe Thr Pro)
Primer B

GT(AG)AA(GATC)GC(TC)TG(GATC)GC(TC)TC 128 Mix
(Die Sequenz entspricht dem komplementären Strang)

Herstellung von PCR-DNA-Fragment, welches teilweise Pektinmethylesterase codiert
Die Aminosäuresequenzen der zwei nicht überlappenden Peptide (welche oben beschrieben sind) wurden verwendet, um gemischte Oligonukleotide herzustellen. Diese wurden als Primer für eine reverse Transkription und die nachfolgende Vervielfältigung (PCR) von Gesamt-RNA verwendet. Der resultierende PCR-Klon wurde sequenziert und hatte eine Insertion von 501 Bp Länge. Die aus der Nukleotidsequenz abgeleitete Aminosäuresequenz entsprach nahezu perfekt den in SEQ. I. D. Nr. 7–19 angegebenen Peptidsequenzen.
In situ-Hybridisierungsanalyse
Die in situ-Hybridisierungsexperimente (siehe Material und Methoden) mit den Ribosonden (hergestellt aus den geeigneten PCR-Klonen) gegen die mRNA von Pektinmethylesterase zeigten starke Hybridisierung in der äußeren Zellage der Lamelle zwischen den Segmenten (siehe 1). Starke Signale wurden auch von der äußeren Zellage der Saftblasen, der inneren Zellage der Albedo und dem Kern erhalten. Diese Ergebnisse entsprechen sehr gut den immunologischen Lokalisierungsergebnissen, die man mit dem gegen Schalen-PME gerichteten Antikörper beobachtet, wie sie zuvor beschrieben wurden.
Southern-Analyse
Southern-Analyse zeigte, daß in dem Genom von C. sinensis zusätzliche Kopien des isolierten PME-Gens (repräsentiert durch die cDNA-Klone) vorhanden sind. Diese anderen PME-Gene waren eher homolog zu denjenigen, welche in pO17 und pO34 repräsentiert wurden. In diesem Zusammenhang beobachteten wir in jeder Spur eine Bande eines starken Hybridisierungssignals, zwei Banden eines mittleren Hybridisierungssignals und wenigstens zwei weitere Banden eines im Vergleich zu dem Rest schwächeren Signals. Dieses Muster zeigt, daß C. sinensis wenigstens zwischen 5 und 7 Kopien des PME-Gens in dem Genom hat.
Isolierung und Charakterisierung neuer PME-cDNAs
Eine cDNA-Bibliothek in lambda zapII (Stratagene), welche hergestellt worden war, wie es unter Material und Methoden beschrieben ist, wurde mit der radioaktiv markierten, 501 Bp langen Insertion aus dem PCR-Klon durchmustert. Mehrere Hybridisierungsklone wurden identifiziert, und Plasmid-DNA wurde in vivo nach den Anleitungen des Herstellers herausgeschnitten. Die Größe der cDNA-Insertionen in den Klonen wurde durch Verdau mit EcoRV und SmaI, gefolgt von Agarosegelelektrophorese bestimmt. Ein Klon p034 hatte eine Insertionsgröße von etwa 2 kB, wogegen ein anderer Klon pO17 eine Insertionsgröße von etwa 1,4 kB hatte. Diese Klone wurden für eine weitere Analyse ausgewählt. Die Nukleotidsequenzen wurden bestimmt und sind als SEQ. I. D. Nr. 3 und SEQ I. D. Nr. 4 für pO17 bzw. pO34 gezeigt.
Der offene Leserahmen in O34, welcher bei Nukleotid 29 beginnt und bei Nukleotid 1780 endet, codiert ein PME mit 584 Aminosäuren, einschließlich eines mutmaßlichen Signalpeptids. Eine mögliche Spaltstelle zwischen Glycin ani Position 46 und Isoleucin an Position 47 kann nach den Regeln von Heijne, G. (1986) Nucl. Acids Res. 14, 4683–4690, „A new method for predicting signal sequence cleavage sites” vorausgesagt werden, wobei man ein langes reifes PME-Enzym mit 538 Aminosäuren mit einem berechneten Molekulargewicht von 58386 Dalton erhält. Das Molekulargewicht der langen PME, einschließlich der Signalsequenz, kann man mit 63.502 Dalton berechnen. Die pO34-Nukleotidsequenz umfaßt einen nicht translatierten 5'-Bereich von 29 Nukleotiden und einen nicht translatierten 3'-Bereich von 186 Nukleotiden, welcher in einem Poly-A-Schwanz endet.
Der offene Leserahmen in O17 beginnt bei Nukleotid 18 und endet bei Nukleotid 1103. Er codiert eine kurze PME mit 362 Aminosäuren, einschließlich eines Signalpeptids mit 44 Aminosäuren. Eine vermeintliche Spaltstelle kann zwischen Glutamin an Position 44 und dem Serin an Position 45 vorausgesagt werden, wobei eine reife kurze PME zurückbleibt, welche mit der Aminosäuresequenz Ser-Ser-Ser-Val-Thr-Pro beginnt. Diese N-terminale Aminosäuresequenz ist identisch mit der N-terminalen Aminosäuresequenz der gereinigten PME vom kurzen Typ, wie sie in dem biochemischen Abschnitt beschrieben ist. Die von dem gereinigten Enzym erhaltenen Aminosäuresequenzen wurden an der von pO17 abgeleiteten reifen Aminosäuresequenz ausgerichtet. Für die Peptidfragmente wurde vollständige Identität gefunden.
Es bestand nahezu vollständige Identität zwischen sämtlichen sequenzierten Peptiden und der abgeleiteten Aminosäuresequenz in pO17 und auch zu der aus pO34, der langen PME, abgeleiteten Aminosäuresequenz. In diesem Zusammenhang weicht pO17 an einer Aminosäureposition ab (Nr. 24 in der Sequenz, welche das reife Polypeptid codiert). Das reife kurze PME-Protein besitzt ein berechnetes Molekulargewicht von 33954 Dalton. Das berechnete Molekulargewicht der kurzen PME-Form, einschließlich des Signalpeptids, beträgt 39088 Dalton. O17 umfaßt einen 5'-nicht translatierten Bereich von 17 Nukleotiden und einen 3'-nicht translatierten Bereich von 180 Nukleotiden, welcher in einem Poly-A-Schwanz endet.
Der Hauptunterschied zwischen dem langen und dem kurzen PME-Enzym ist eine N-terminale Verlängerung von 220 Aminosäuren, die in dem aus O34 abgeleiteten reifen Enzym vorhanden und als SEQ. I. D. Nr. 5 wiedergegeben ist. Die entsprechende Nukleotidsequenz, welche diesen Bereich des langen PME-Enzyms codiert, ist als SEQ. I. D. Nr. 6 gezeigt.
Expression von PME in Mikroorganismen
Die DNA-Sequenz, welche entweder die lange oder die kurze Form von Orangen-PME codiert, wurde in Mikroorganismen eingeführt, um ein rekombinantes Enzym in großen Mengen herzustellen, welches eine hohe spezifische Aktivität für eine Verwendung zur enzymatischen Behandlung von Pektin aufweist.
Expression in Pichia Pastoris
Konstruktion von pJK10, pJK11 und pJK12 (siehe Fig. 13–Fig. 15)
pO34-Plasmid-DNA wurde als Vorlage-DNA in einer PCR-Reaktion mit dem folgenden Satz von Primern verwendet:
5'-GAATTCATTGTCGCCGGAGTGAAC-3' mit einer EcoRI-Schnittstelle an einem Ende und
5'-AAGACCAGAGACCTATGGATCCAC-3' mit einer BamHI-Schnittstelle nahe dem Ende.
AmpliTaq^®-DNA-Polymerase (Perkin Elmer), Vorlage-DNA, XdATP, dGTP, dCTP und dTTP und die zwei Primer wurden in dem folgenden Puffer zusammengegeben:
60 mM Tris-HCl (pH 8,5), 15 mM (NH₄)₂SO₄ und 1,5 mM MgCl₂, und es wurden die folgenden Temperaturzyklen verwendet:

94°C 2 Min

94°C 1 Min

55°C 2 Min

72°C 2 Min in 35 Zyklen

72°C in 7 Min

5°C halten
Es wurde das erwartete PCR-Produkt mit 1690 Bp hergestellt, welches gereinigt und in den Vektor pT7 Blue (von Novagen) nach den Anleitungen des Herstellers subkloniert wurde.
Die erhaltenen Klone (welche pT7-O34 genannte wurden), welche ein EcoRI-BamHI-Fragment der erwarteten Größe enthielten, wurden durch DNA-Sequenzierung weiter verifiziert (siehe Material und Methoden der Molekularbiologie). Ein pT7-O34-Subklon, welcher die korrekte Sequenz enthielt, wurde mit EcoRrI und BamHI verdaut, und das Fragment mit 1685 Bp wurde gereinigt und in den Pichia pastoris-Vektor pHIL-S1 (von Invitrogen), welcher mit den gleichen Enzymen verdaut war, subkloniert.
Die Sequenz, welche die reife lange Form von PME codiert, wurde auf diese Weise in den Rahmen des PHO1-Ausscheidungssignal (S) in den Vektor kloniert. Das erhaltene Plasmid wird als pJK10 bezeichnet und ist in 13 gezeigt.
Zur Herstellung von pJK11 (Siehe 14) wurde das EcoRI-BamHI-Fragment des pT7-O34-Klons weiter in einen pBSK-Vektor (von Stratagene), welcher mit den gleichen Enzymen verdaut war, subkloniert. Anschließend wurde ein EcoRI-NotI-Fragment aus einem der erhaltenen Klone (welcher durch DNA-Sequenzierung verifiziert worden war) in den Pichia pastoris-Expressionsvektor pPIC9 (von Invitrogen), welcher mit den gleichen Enzymen verdaut war, subkloniert. Dadurch wird der Leserahmen, welcher das reife Protein der langen Form von PME codiert, stromabwärts in dem Rahmen des Alpha-Faktor-Ausscheidungssignals (S) in pPIC9 angeordnet, siehe 14.
Darüber hinaus wurde das EcoRI-NotI-Fragment aus pT7-O34 ebenfalls in den pPIC9K-Vektor (Invitrogen) subkloniert, wobei das in 15 gezeigte pJK12-Plasmid erzeugt wurde. Der einzige Unterschied zwischen pJK11 und pJK12 besteht in einem Gen, welches Resistenz gegen Kanamycin codiert, und dieses ist in pJK12 vorhanden.
Sowohl das PHO1-Ausscheidungssignal in pJK10 als auch das Alpha-Ausscheidungssignal in pJK11 und pJK12 können die Ausscheidung des reifen Polypeptids, welches die lange Form von PME codiert, steuern.
Konstruktion von pJK20, pJK21 und pJK22
pO17-Plasmid-DNA wurde als Vorlagen-DNA in einer PCR-Reaktion mit den folgenden Primern eingesetzt:
5'-GAATTCTCCTCGTCGGTGACACCG-3' mit einer EcorRI-Schnittstelle an einem Ende und
5'-AAGACCAGAGACCTATGGATCCAC-3' mit einer BamHI-Schnittstelle nahe dem Ende.
Die Vorlagen-DNA, AmpliTaq^®-Polymerase, dATP, dGTP, cCTP und dTTP wurden mit dem Puffer (10 mM Tris-HCl, pH 8,5, 15 mM (NH₄)₂SO₄ und 1,5 mM MgCl₂) zusammengegeben und in einen Thermoblock mit den folgenden Temperaturzyklen gestellt:

94°C 2 Min

94°C 1 Min

55°C 2 Min

72°C 2 Min in 35 Zyklen

72°C in 7 Min

5°C halten
Hierbei wurde eine erwartete PCR-Bande mit 1008 Bp erzeugt, welche gereinigt und in pT7 Blue (Novagen) subkloniert wurde. Die erhaltenen Klone wurden durch DNA-Sequenzierung verifiziert, wie es oben erläutert ist. Ein Plasmid mit der korrekten Sequenz wurde mit EcoRI und BamHI verdaut und das erhaltene Fragment weiter in den pHIL-S1-Vektor (Invitrogen) subkloniert, wobei das erhaltene Plasmid als pJK20 bezeichnet wird (dargestellt in 16) und diesem der Bereich, welcher das reife Polypeptid der kurzen Form von PME codiert, im Rahmen mit und stromabwärts von dem PHO1-Ausscheidungssignal angeordnet ist.
Die Plasmide pJK21 und pJK22 wurden auf die gleiche Art und Weise konstruiert, wie es für pJK11 und pJK12 beschrieben ist, mit der Ausnahme, daß das EcoRI-NotI-Fragement aus dem pBSK-O17-Klon erhalten wurde. Die 17 und 18 zeigen die resultierenden Plasmide, in denen der Bereich, welcher das reife Polypeptid codiert, stromabwärts von und im Rahmen mit dem Alpha-Ausscheidungssignal in pPIC9 und pPIC9K angeordnet ist.
Einführung der langen und der kurzen Form von PME in Pichia pastoris durch Sphäroplastenbildung und Transformation
Die Plasmide pJK10, pJK11, pJK12, pJK20, pJK21 und pJK22 wurden in verschiedenen Experimenten in Pichia pastoris-GS115-Zellen eingeführt.
In diesem Zusammenhang wurden Sphäroplasten aus GS115-Zellen hergestellt, welche in Hefeextrakt-Pepton-Dextrose-Medium (YPD) bei 28–30°C wachsen. Die Herstellung von Sphäroplasten und das Transformationsverfahren wurden durchgeführt, wie es in dem Pichia-Expressionskit-Anleitungshandbuch (Invitrogen) beschrieben ist. Die erhaltenen Pichia pastoris-Mut⁺- oder -Mut^s-Transformanten wurden anschließend hinsichtlich der Expression des rekombinanten PME-Gens analysiert, indem der Überstand unter Verwendung der unter Material und Methoden der Biochemie beschriebenen Verfahren auf PME-Aktivität untersucht wurde.
Durchmusterung von Transformanten nach hoher Expression der langen und der kurzen Form von PME
Vermeintlich positive Transformanten wurden weiter in Minimalmedium gezüchtet (entweder Minimal-Dextrosemedium oder Minimal-Glycerinmedium, wie es in der Anleitung des Pichia-Expressionskits, Invitrogen, spezifiziert ist), und die genomische DNA wurde isoliert und mittels PCR analysiert, wie es in dem Anleitungshandbuch beschrieben ist.
Positive Klone, die bei der ersten Durchmusterung gefunden wurden und welche auch eine PCR-Bande der erwarteten Größe produzierten, wurden nach dem in dem Pichia-Anleitungshandbuch beschriebenen Verfahren ausgewählt und in einem Kolben bei 28–30°C weiter gezüchtet.
Wenigstens 10 verifizierte rekombinante Klone von jedem Konstrukt (pJK10, pJK11, pJK12, pJK20, pJK21 und pJK22) wurden hinsichtlich der Ausscheidung von PME durchmustert und ihre relative Expressionsmenge wurde durch Probennahme alle 2 bis 6 Stunden über die Zeit gemessen. Die Zellen in den Proben wurden pelletiert und der Überstand nach den unter Material und Methoden der Biochemie erläuterten Verfahren auf PME-Aktivität getestet.
Die nach der Transformation entweder mir pJK12 oder pJK22 erhaltenen Klone wurden unter Nutzung des integrierten Kanamycin-Resistenzgens als dem Auswahlgen vorselektiert, wie es von Scorer C. A. et al. (1994) Bio/Technology, Band 12, Seiten 181–183, und Laroche Y. et al. (1994) Bio/Technology, Band 12, Seiten 1119–1124, beschrieben ist. Auf diese Weise wurden Transformanten mit Mehrkopienintegration erhalten und weiter durchmustert, wie es oben beschrieben ist.
Transformanten, welche entweder die lange oder die kurze Form von PME repräsentierten und zeigten, daß sie das rekombinante Protein in hohen Mengen exprimierten, wurden ausgewählt und mittels Western-Blot-Analyse weiter analysiert (siehe Material und Methoden der Biochemie).
Reinigung und Charakterisierung von rekombinanter PME
Rekombinantes PME-Protein wurde aus den Kulturüberständen gereinigt, wobei die unter Material und Methoden der Biochemie beschriebenen Verfahren angewendet wurden, soweit erforderlich.
Die angenommene Hochtemperaturstabilität der langen Form von PME wurde durch Testen der Enzymaktivität nach Inkubation bei verschiedenen Temperaturen verifiziert, wie es in dem Abschnitt Charakterisierung und kinetische Daten erläutert ist. Die gereinigten rekombinanten Enzyme (sowohl die lange als auch die kurze PME-Form) wurden weiter charakterisiert, wie es in dem Abschnitt Charakterisierung und kinetische Daten erläutert ist. Diese Analysen zeigten, daß beide Typen ein pH-Optimum um 7–8 hatten, und die Temperaturstabilität der kurzen rekombinanten PME wurde zwischen 10 und 40°C und bis zu 80°C für die lange rekombinante PME ermittelt.
Expression in Aspergillus Niger
In einer weiteren Ausführungsform wurden pO34 oder pO17 mit den geeigneten Restriktionsenzymen verdaut, und die codierende Sequenz für die lange oder die kurze Form von PME der vorliegenden Erfindung wurde in den Aspergillus-Expressionsvektor pBAMTE1 (welcher den Methyltryptophanresistenz-Promotor von Neurospora crassa enthält) für eine Expression in Aspergillus niger (Pall et al. (1993) Fungal Genet. Newslett., Band 40, Seiten 59–62) kloniert.
Die Protoplasten wurden nach Daboussi et al. (Curr. Genet. (1989), Band 15, Seiten 453–456) unter Verwendung der lysierenden Enzyme Sigma L-2773 und der Lyticase Sigma L-8012 hergestellt. Die Transformation der Protoplasten folgte dem Protokoll, welches von Buxton et al. (Gene (1985), Band 37, Seiten 207–214) angegeben ist, mit der Ausnahme, daß für das Plattieren der transformierten Protoplasten dem in Punt et al. (Methods in Enymology (1992), Band 216, Seiten 447–457) gefolgt wurde, jedoch unter Verwendung von 0,6% osmotisch stabilisierter Top-Agarose.
Die Ergebnisse zeigten, daß gereinigte Orangen-PME-Aktivität aus Aspergillus niger-Kulturen erhältlich war.
Anwendungen
Wirkung von mit Orangen-PME behandeltem Pektin auf die Viskosität und Stabilität von Proteingetränken
Methoden
Enzymatische Behandlung von Pektin mit PME, erhältlich aus Orange
Eine Charge von enzymatisch behandeltem Pektin wurde wie folgt hergestellt:
125 g Pektin wurden in heißem Wasser unter effizientem Rühren gelöst. 45,3 g NaCl (analysenrein) wurden hinzugegeben und das Volumen mit Wasser auf 4,0 l eingestellt. Diese Lösung wurde gerührt, bis sich das Salz gelöst hatte. Die Pektinlösung wurde auf 40°C gekühlt, und der pH-Wert wurde auf pH 7,0 unter Verwendung von 1 N NaOH (analysenrein) und effizientem Rühren erhöht. Eine geeignete Probe von Orangen-PME wurde hinzugefügt, und die enzymatische Reaktion wurde fortgesetzt, bis der gewünschte Grad an Entesterifizierung erreicht war. Der pH-Wert wurde konstant bei pH 7 durch automatische Dosierung von 1 N NaOH (analysenrein) während des Inkubationszeitraums gehalten, und die enzymatische Reaktion wurde anhand des Verbrauchs von NaOH verfolgt.
Wenn die Pektinprobe den gewünschten Grad an Entesterifizierung erreicht hatte, wurde die NaOH-Zugabe gestoppt und der pH-Wert der Lösung durch Zugabe von 2% HCl auf etwa 3,0 abgesenkt. Die Pektinlösung wurde dann für 5 Minuten auf 70°C erhitzt, um das Enzym vollständig zu inaktivieren. Das behandelte Pektin wurde mit 1 Volumen Isopropanol präzipitiert, mit 60% Isopropanol gewaschen und auf etwa 50% trockene Substanz gepreßt. Die enzymatisch behandelte Pektincharge wurde dann bei 40°C luftgetrocknet und schließlich zu einem trockenen Pulver gemahlen.
Protokoll
Bestimmung des Caciumsensitivitätsindex (CF) von Pektinproben
Die Calciumsensitivität wird als die Viskosität eines Pektins, das in einer Lösung mit 57,6 mg Calcium/g Pektin gelöst ist, geteilt durch die Viskosität von exakt der gleichen Menge an Pektin in Lösung, jedoch ohne zugegebenem Calcium, gemessen. Ein nicht calciumsensitives Pektin hat einen CF-Wert von 1.
4,2 g Pektinprobe werden in 550 ml heißem Wasser unter kräftigem Rühren gelöst. Die Lösung wird auf etwa 20°C gekühlt und der pH-Wert auf 1,5 mit 1 N HCl eingestellt. Die Pektinlösung wird mit Wasser auf 700 ml eingestellt und gerührt. 145 g dieser Lösung werden einzeln in 4 Viskositätsgläser eingemessen. 10 ml Wasser werden zu zwei der Gläser (Doppelbestimmungen) zugegeben, und es werden 10 ml einer 250 mM CaCl₂-Lösung zu den anderen zwei Gläsern unter Rühren hinzugegeben.
50 ml eines Acetatpuffers (0,5 M, pH-Wert von etwa 4,6) werden zu allen Viskositätsgläsern unter kräftigem magnetischem Rühren hinzugegeben, wobei der pH-Wert der Pektinlösung auf über 4,0 nach oben gebracht wird. Die Magnete werden entfernt und die Gläser über Nacht bei 20°C stehen gelassen. Die Viskositäten werden am nächsten Tag mit einem Brookfield-Viskosimeter gemessen. Der Calciumsensitivitätsindex wird wir folgt berechnet:
Bestimmung des Veresterungsgrades (%DE) von Pektinproben
Zu 50 ml einer Lösung von 60% Isopropanol und 5% HCl werden 2,5 g Pektinprobe hinzugegeben und für 10 Minuten gerührt. Die Pektinlösung wird durch einen Glasfilter filtriert und mit 15 ml 60% Isopropanol/5% HCl-Lösung sechsmal gewaschen, gefolgt von weiteren Waschschritten mit 60% Isopropanol, bis das Filtrat frei von Chloriden ist. Das Filtrat wird über Nacht bei 80°C getrocknet.
20,0 ml 0,5 N NaOH und 20,0 ml 0,5 N HCl werden in einem konischen Kolben vereinigt und zwei Tropfen Phenolphthalein zugegeben. Dieses wird mit 0,1 N NaOH titriert, bis eine dauerhafte Farbveränderung erreicht ist. Die 0,5 N HCl sollte etwas stärker sein als die 0,5 N NaOH. Das zugegebene Volumen an 0,1 N NaOH wird als V₀ festgehalten.
0,5 g der getrockneten Pektinprobe (das Filtrat) werden in einen konischen Kolben eingemessen, und die Probe wird mit 96%igem Ethanol befeuchtet. 100 ml kurz zuvor gekochtes und gekühltes destilliertes Wasser werden hinzugegeben, und die erhaltene Lösung wird gerührt, bis das Pektin vollständig gelöst ist. Anschließend werden fünf Tropfen Phenolphthalein hinzugegeben und die Lösung mit 0,1 N NaOH titriert (bis zu einer Veränderung der Farbe und bis der pH-Wert 8,5 ist). Die Menge an hierbei verwendeter 0,1 N NaOH wird als V₁ festgehalten. 20,0 ml 0,5 N NaOH werden hinzugefügt und der Kolben kräftig geschüttelt und anschließend für 15 Minuten stehen gelassen. 20,0 ml 0,5 N HCl werden hinzugegeben und der Kolben geschüttelt, bis die rosa Farbe verschwindet. Anschließend werden drei Tropfen Phenolphthalein hinzugegeben und danach die erhaltene Lösung mit 0,1 N NaOH titriert. Das Volumen an verwendeter 0,1 N NaOH wird als V₂ festgehalten.
Der Grad der Veresterung (%DE: % aller Carboxylgruppen) wird wie folgt berechnet:
Joghurtherstellung
Standardisierte entrahmte Milch (hergestellt durch Mischen von pulverisierter Milch mit einem geeigneten Volumen an Wasser) wurde in 5 Minuten auf 90°C erhitzt und anschließend bei 200 kp/cm² homogenisiert und die Milch auf 31°C abgekühlt. Eine Joghurtkultur wurde hinzugefügt und die Milch bis etwa pH 4,0 fermentiert. Der Joghurt wurde auf etwa 20°C gekühlt, und die Pektinprobe wurde als eine gesättigte Zuckerlösung (etwa 65% Zucker) hinzugegeben und für 15 Minuten gerührt. Der pH-Wert wurde mit Milchsäure auf pH 4,0 eingestellt. Der Joghurt wurde bei 88°C für 15 Sekunden pasteurisiert und bei 150 kp/cm² homogenisiert, anschließend auf 20°C abgekühlt und in sterile 250 ml Blaudeckelflaschen (200 ml/Flasche) gefüllt.
Die Zusammensetzung des Endprodukts war: 7,6% MSNF (Milchfeststoffgehalt), 9,15% Zucker und 0,25% oder 0,35% Pektinprobe, was einen Gesamtfeststoffgehalt von 17,0% bzw. 17,10% ergab.
Viskositätsbestimmung von Joghurtgetränk
Die Viskosität einer Joghurtprobe wurde unter Verwendung entweder eines Bohlin Rheometer^TM (geliefert von Bohlin Instruments) mit Scherraten von 18,5–46,0 oder unter Verwendung eines StressTech^TM (Rheologica Instruments AB) mit den gleichen Scherraten bestimmt (Doppelbestimmungen).
Proteinstabilität gemessen durch einen Zentrifugationstest
20 g einer Probe (z. B. Trinkjoghurt) wurden bei 10°C, 2300 × g für 20 Minuten zentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen und das Zentrifugenglas für 30 Minuten umgekehrt angeordnet. Das Glas wurde gewogen, und der Prozentsatz an Sedimentation wurde wie folgt berechnet:
wobei Gew. = Gewicht und Zentri. = Zentrifugation.
Proteinstabilität, bestimmt durch die Teilchengrößenverteilung in der Probe
Die Teilchengrößenverteilung einer Joghurtprobe wurde unter Verwendung eines Malvern 2600 Easy^TM Größenbestimmungsgerätes bestimmt. Die Teilchengröße wird nach diesem Verfahren durch Laserlichtstreuung bestimmt. 1 ml Joghurtprobe wurden zu 9 ml entgaster Pufferlösung (30,7% 0, 1 M Zitronensäure, 19,3% 0,2 M Na₂HPO₄ und 50,0% Wasser) hinzugegeben und gemischt. Der entgaste Puffer wurde in das Meßglas gegeben, und das Gemisch aus Probe/Puffer Tröpfchen für Tröpfchen hinzugegeben, bis die optimale Konzentration erreicht war. Die durchschnittliche Teilchengröße wurde aus den Messungen berechnet.
Ein Joghurt mit der durchschnittlichen Teilchengröße unter etwa 3 μm wird als eher stabil angesehen, wogegen ein Joghurt mit einer durchschnittlichen Teilchengröße über etwa 10 μm und höher als nicht stabil für eine Langzeitlagerung angesehen wird.
Bestimmung von Langzeitstabilität
Proben wurden bei 4°C oder bei Umgebungstemperatur gelagert und die Molkeseparierung gemessen (in mm Molke auf der Oberseite der Probe in der Flasche). Die Probe wurde in 250 ml Blaudeckelflaschen gefüllt (Doppelbestimmungen). Die Tiefe der Probe war in jedem Fall etwa 70 mm, was für jede Flasche der 200 ml Marke entsprach.
Beispiel 1
Saures Milchgetränk
Der Zweck einer Zugabe von Pektin zu einem sauren Milchgetränk (z. B. einem Joghurtgetränk) besteht darin, ein Getränk herzustellen, das während der bakteriologischen und organoleptischen Lagerbeständigkeit des Getränks physikalisch homogen bleibt. Darüber hinaus destabilisiert die Behandlung des Joghurtgetränks bei Langzeitlagerung das Protein in dem Getränk, was zu einem Getränk mit einem sandigen Mundgefühl führt und welches ziemlich schnell Synärese zeigt, wenn Pektin nicht hinzugefügt wird.
Behandlung des Pektins
Ein handelsüblich erhältliches, hochverestertes Pektin, Grindsted^TM Pektin URS (Pektin vom Typ Ultra Rapid Set), wurde aufgrund seines hohen Veresterungsgrades (%DE von 82, siehe 19) als das Mutterpektin ausgewählt. Die Behandlung dieses Mutterpektins mit dem Orangen-PME-Enzym ist in dem Methodenabschnitt erläutert.
Die enzymatische Reaktion wurde, gestoppt und das erhaltene experimentelle Pektin (welches als Pektin Nr. 1944-96-2 bezeichnet wird) wurde auf seinen Veresterungsgrad nach dem in dem Methodenabschnitt beschriebenen Verfahren untersucht. Darüber hinaus wurde, um die zwei Pektintypen, das Mutterpektin und das behandelte Pektin, zu vergleichen, ein bekannter guter handelsüblicher Trinkjoghurt-Pektintyp, das Grindsted^TM Pektin AM453, in die Experimente aufgenommen.
Die relative Calciumsensitivität der drei ausgewählten Pektine wurde bestimmt, wie es in dem Methodenabschnitt erläutert ist: Bestimmung des Calciumsensitivitätsindex (CF) der Pektinproben; und die Ergebnisse sind in der nachfolgenden Tabelle gezeigt.

Pektintyp Δ CF DE%

Grindsted^TM Pektin URS 1,1 82

Pektin 1944-96-2 1,4 76

Grindsted^TM Pektin AM453 > 20 72
Entesterifizierung des Mutterpektins Grindsted^TM Pektin URS von 82% DE herunter auf 76% DE ergab nahezu keine Veränderung der Calciumsensitivität dieser zwei Pektine (ein ΔCF von 1 hat keine Sensitivität). Ein Pektin mit meßbarer Calciumsensitivität konnte durch weitere Behandlung des Mutterpektins mit dem Orangen-PME-Enzym herunter bis zu 70% DE erzeugt werden, da dieses Pektin eine ΔCF von 14 hatte.
Ergebnisse von Joghurt-Trinkjoghurt-Analysen
Yoghurt wurde hergestellt, wie es in dem Methodenabschnitt erläutert ist. Die drei Pektine (Grindsted^TM Pektin URS, Pektin 1944-96-2 und Grindsted^TM Pektin AM453) wurden in den folgenden Anweisungen einzeln eingesetzt:
7,6% MSNF (Milchfeststoffgehalt), 9,15% Zucker und 0,25% oder 0,35% Pektinprobe ergaben einen Gesamtfeststoffgehalt von 17,0% bzw. 17,10% in dem Endprodukt.
Die Qualität der hergestellten einzelnen Joghurts wurde anhand des Prozentsatzes von deren Sedimentation, die im Zentrifugationstest beobachtet wurde, durch Messung der Teilchengröße in dem Joghurt, durch Messung der Viskosität und durch Untersuchung von möglicher Molkeseparierung während Langzeitlagerung untersucht, wie es im Methodenabschnitt beschrieben ist.
Die Sedimentation der mit den drei Pektintypen hergestellten Joghurts ist in der nachfolgenden Tabelle wiedergegeben. Sediment (in%) des Joghurts

Pektintyp Konzentration – 0,25% Konzentration – 0,35%

Grindsted^TM Pektin URS 29,40 21,2

Pektin 1944-96-2 1,53 2,95

Grindsted^TM Pektin AM453 2,20 1,85
Die Ergebnisse sind der Durchschnitt von einer bis vier individuellen Herstellungen.
Es ist klar, daß das Mutterpektin (vom URS-Typ) einen hohen Sedimentationsprozentsatz hatte und folglich zeigte der hergestellte Joghurt Molkeseparierung und war bei beiden verwendeten Pektinkonzentrationen (0,25 und 0,35%) instabil. Dies ist nicht überraschend, da das Pektin vom URS-Ty normalerweise nicht für eine Stabilisierung von wärmebehandelten Joghurttypen für eine Langzeitlagerung verwendet werden kann.
Der mit dem Pektin 1944-96-2 hergestellte Joghurt zeigte bei beiden verwendeten Pektindosierungen Stabilität und geringe Sedimentation, wie man es anhand der obigen Ergebnisse sieht, und keine Molkeseparierung nach über 75 Tagen Lagerung. Im Vergleich dazu zeigte das ausgezeichnete Grindsted^TM Pektin AM453, welches normalerweise für die Joghurtherstellung verwendet wird, auch eine niedrige Sedimentation, wie erwartet, und produzierte stabile Joghurts ohne Molkeseparierung (siehe obige Ergebnisse).
Durch Behandeln des Mutter-URS-Pektins mit Orangen-PME wurde ein ungeeignetes Pektin zu einem als ein Stabilisierungsmittel in dem Joghurt geeignetes gemacht, und dieses Pektin verhält sich ebenso gut, wie ein ausgezeichnetes handelsübliches Stabilisierungsmittel.
Eine weitere Untersuchung der hergestellten Joghurts mittels Teilchengrößenbestimmung (siehe Methodenabschnitt) wurde durchgeführt, und die Ergebnisse sind in der nachfolgenden Tabelle wiedergegeben. Teilchengröße (in μm) des Joghurts

Pektintyp Konzentration – 0,25% Konzentration – 0,35%

Grindsted^TM Pektin URS 9,32 6,41

Pektin 1944-96-2 1,33 1,55

Grindsted^TM Pektin AM453 1,40 1,53
Die durchschnittliche Teilchengröße (die Anzahl, welche unter Verwendung des Malvern-Instrumentes der D (4,3)-Fraktion entspricht, ist gezeigt) des mit dem Mutter-URS-Pektin hergestellten Yoghurts ist wie erwartet hoch. Wiederum sind die Ergebnisse ein Durchschnitt von einer bis vier Herstellungen.
Die durchschnittliche Teilchengröße des Joghurts, welcher sowohl mit dem Pektin 1944-96-2 und dem Grindsted^TM Pektin AM453 hergestellt wurde, ist bei beiden verwendeten Pektindosierungen klein (siehe obige Ergebnisse). Es wird wiederum gezeigt, daß der mit diesen Pektintypen hergestellte Joghurt zur Herstellung von stabilen Joghurts geeignet ist.
Abschließend und für den Fall der Trinkyoghurtherstellung für eine Langzeitlagerung sehr wichtig wurde die Viskosität bestimmt, und die Ergebnisse sind in der nachfolgenden Tabelle wiedergegeben. Viskosität (in MPa s) des Joghurts

Konzentration/Pektintyp Konzentration – 0,25% Konzentration – 0,35%

Grindsted^TM Pektin URS 55 40

Pektin 1944-96-2 12 18

Grindsted^TM Pektin AM453 24 43
Da das Mutter-URS-Pektin den Joghurt nicht stabilisieren konnte, ist die erzielte Viskosität wie erwartet bei beiden Pektinkonzentrationen ziemlich hoch. Das ausgezeichnete Grindsted^TM Pektin AM453, welches stabile Joghurts mit niedriger Sedimentation und niedriger Teilchengröße produzierte, zeigte eine Viskosität von etwa der Hälfte der Viskosität, die man mit Grindsted^TM Pektin-URS bei der Pektindosierung von 0,25% beobachtet, und etwa der gleichen, wie bei dem URS-Pektin bei der Pektindosierung von 0,35%, unabhängig von der Tatsache, daß nur das AM453-Pektin einen stabilen Joghurt produzierte.
Sowohl im Fall von URS als auch AM453 konnte die beobachtete höhere Viskosität zum Teil der Menge an zugegebenem Pektin zugeschrieben werden, wobei dies insbesondere im Fall des AM453-Pektins den Umständen zu entsprechen scheint, da eine Erhöhung der Menge an zugegebenem Pektin (von 0,25 auf 0,35%) einen nahezu zweimal so viskosen Joghurt produzierte.
Die Viskosität, welche man bei dem mit dem Orangen-PME behandelten Pektin 1944-96-2 erzielte, zeigte einen dramatischen Abfall der Viskosität im Vergleich zu dem Mutter-URS-Pektin bei einer Konzentration von 0,25%. Dies ist zum Teil auf die Stabilisierung des Joghurts mit dem 1944-96-2-Pektin zurückzuführen, aber es ist nicht der einzige Grund, weil der AM453-Joghurt bei dieser Pektindosierung eine zweimal so hohe Viskosität besitzt. Tatsächlich erhöht die Zugabe von 0,35% des 1944-96-2-Pektin zu dem Joghurt die Viskosität nur um 6 Einheiten (im Vergleich zu der 0,25%-Dosierung), wogegen die Viskosität im Fall von AM453 beim Übergang von 0,25% auf 0,35% um 19 Einheiten ansteigt.
Das mit Orangen-PME behandelte Pektin 1944-96-2 kann Joghurt, welches eine sehr niedrige Viskosität hat, stabilisieren, obwohl die Pektindosierung 0,25% (oder 0,35%) war, was eine nahezu zweimal so hohe Viskosität gegenüber einer Verwendung anderer unbehandelter Pektine, z. B. Grindsted^TM Pektin AM453, ergab.
Dies ist eine neue und sehr wichtige Entwicklung für die Herstellung von sauren Milchgetränken.
Durch Behandlung des Grindsted^TM Pektins URS mit Orangen-PME wird ein neuer Pektintyp erzeugt, welcher im Gegensatz zu dem Mutterpektin Joghurt stabilisieren kann und, was am wichtigsten ist, eine viel niedrigere Viskosität als normalerweise verwendete Pektine zeigt. Andere hoch veresterte Pektine können durch Behandlung mit dem Orangen-PME ebenfalls verbessert werden.
Beispiel 2
Molkesaftgetränk
Das modifizierte Pektin gemäß der vorliegenden Erfindung (wie es oben hergestellt wurde) wurde wie folgt in einem Molkesaftgetränk verwendet:

Süße oder saure Molke 42,00%

Fruchtsaft 40,00%

Zucker 8,00%

Natriumcitrat 0,20%

PME-modifiziertes Pektin 0,20%

Grindsted-Aromatisierung +

Wasser 9,60%
Trockenes, PME-modifiziertes Pektin, Natriumcitrat und Zucker wurden gemischt und anschließend bei 80°C in Wasser gelöst. Diese Pektinlösung wurde auf unter 5°C abgekühlt, und Molke wurde bei 5°C hinzugegeben. Grindsted-Aroma (geliefert von Danisco Ingredients, Danisco A/S) und Saft wurden langsam zugegeben, und der pH-Wert in dem Probengemisch wurde mit Zitronen- oder Milchsäure auf pH 4,0 eingestellt. Das Probengemisch wurde für etwa 30 Minuten unter Rühren reifen gelassen. Die Pasteurisierung wurde bei 80°C/15 Sekunden und die Homogenisierung bei 200 bar (2.900 psi) durchgeführt. Die Proben wurden auf 20°C gekühlt und aseptisch in Behälter gefüllt.
Probentests wurden nach 24 Stunden, 1 Monat und 6 Monaten Inkubation bei Raumtemperatur analysiert. Die Analyseuntersuchung umfaßt Viskositätsmessungen, Stabilitätsindex, Teilchengröße und Langzeitstabilität – die Protokolle hierfür sind oben beschrieben.
Die Ergebnisse zeigten verbesserte Stabilität und Langzeitstabilität in dem Molkesaftgetränk, welches mit PME-modifiziertem Pektin verarbeitet wurde, im Vergleich zu dem Referenzpektin, welches in den Kontrolltests verwendet wurde. Darüber hinaus hatte das Molkesaftgetränk eine vorteilhafte Viskosität, die niedriger war als bei den Kontrollgetränken.
Das Molkesaftgetränk wurde auch mit durch Pflanzen-PME modifiziertem Zitronen- bzw. Limonenpektin verarbeitet, d. h. modifiziert mit der PME der vorliegenden Erfindung. Die Ergebnisse zeigen, daß mit PME modifiziertes Pektin im Vergleich zu dem nicht modifizierten Pektin auch im Vergleich zu dem Referenzpektin verbesserte Proteinstabilität aufweist.
Beispiel 3
Milch/Fruchtsaftgetränk
Grindsted^TM URS (erhalten von Danisco Ingredients, Danisco A/S) wurde mit der PME modifiziert, wie es für das Joghurtgetränk beschrieben ist. Das modifizierte Pektin wurde in einem Milch/Fruchtsaftgetränk verwendet, welches folgendes enthielt:

Entrahmte Milch 45,00%

Fruchtsaft 40,00%

Zucker 5,00%

PME-modifiziertes Pektin 0,25%

Grindsted-Aromatisierung +

Wasser 9,75%
Trockenes, PME-modifiziertes Pektin und Zucker wurden gemischt und anschließend bei 80°C in Wasser gelöst. Die Pektinlösung wurde auf unter 5°C abgekühlt, und Milch wurde bei 5°C zugegeben. Grindsted-Aroma und Saft wurden langsam zugegeben, und der pH-Wert in dem Probegemisch wurde (falls erforderlich) mit Zitronen- oder Milchsäure auf pH 4,0 eingestellt. Das Probegemisch wurde reifen gelassen, pasteurisiert und homogenisiert, wie es für das Molkesaftgetränk beschrieben ist. Die Proben wurden auf 20°C gekühlt und aseptisch in Behälter gefüllt.
Die Ergebnisse zeigten verbesserte Stabilität – einschließlich Langzeitstabilität – in dem Milch/Fruchtsaftgetränk, welches mit PME-modifiziertem Pektin verarbeitet wurde, verglichen mit dem in den Kontrolltests verwendeten Referenzpektin. Darüber hinaus wies das Milch/Fruchtsaftgetränk eine vorteilhafte Viskosität auf, die niedriger war als in den Kontrollgetränken. Es wurde auch eine verbesserte Funktionalität beobachtet.
Das Milch/Fruchtsaftgetränk kann auch mit Zitronen- und Limonenpektin, welches mit der PME der vorliegenden Erfindung modifiziert ist, verarbeitet werden.
Beispiel 4
Molkestabilität
Die enzymatisch modifizierten Pektine wurden bei pH 4,0 getestet. Der pH-Wert der resultierenden Pektinlösung wurde mit KOH/HCl auf pH 4,0 eingestellt. Die Pektinkonzentration wurde auf 1,0% eingestellt. Die Pektine wurden in Konzentrationen von 0,1%–0,25% getestet. Pektin, Jenness-Puffer (siehe unten) und Molkelösung (siehe unten) wurden gemischt und für 25 Minuten auf 96°C erhitzt. Nach Abkühlen auf Raumtemperatur wurde die Absorption bei 500 nm gemessen.
Jenness-Puffer-Trockengemisch:
Trockenpulver-Jenness (beschrieben in Jenness, R. und Koops, J. Preparation and Properties of a satt solution which simulates milk ultrafiltrate, Netherlands Melk-en Zuiveltijdschrift, Band 16, Nr. 3, Seiten 153–164, 1962):

15,8 g KH₂PO₄
5,08 g K₃-Citrat
17,91 g Na₃-Citrat 2 H₂O
1,80 g K₂SO₄
13,20 g CaCl₂ 2 H₂O
5,02 g Mg₃-Citrat H₂O
3,00 g K₂CO₃
10,78 g KCl

Pufferlösung: Wäßrige Lösung von 75900 g/l Trockenpulver-Jenness mit einem pH-Wert von 4,0.

Molkelösung
Ein Konzentrat aus Molkeprotein wird gefriergetrocknet und pulverisiert. Eine Lösung von 0,40% w/w Molkeprotein wird in Jenness-Puffer bei pH 4,0 hergestellt.
Pektinlösungen
Wäßrige Lösungen von Pektinen mit 1% w/w werden mit einem pH-Wert von 4,0 hergestellt.
Mischungskonzentrationen:
Pektin, Jenness-Puffer und Molkelösung werden gemischt, wie es in der nachfolgenden Tabelle angegeben ist. Die Gemische werden für 25 Minuten auf 96°C erhitzt, und nach dem Abkühlen auf Raumtemperatur werden die Proben in einem Spektrometer bei 500 nm vermessen.

μl Pektinlösung μl Jenness-Puffer μl Molkelösung μl Gesamtvolumen

500 2000 2500 5000

750 1750 2500 5000

1000 1500 2500 5000

1250 1250 2500 5000
Ergebnisse
Die Ergebnisse sind in der nachfolgenden Tabelle gezeigt. Der angegebene Absorptionswert bei 500 nm ist ein Mittelwert aus zwei Messungen. Für einen Vergleich zwischen den verschiedenen Typen von Pektinen und den enzymatisch modifizierten Pektinen gemäß der vorliegenden Erfindung ist der Index für nicht-modifiziertes Pektin Grindsted^TM Pektin 3450 (geliefert von Danisco Ingredients, Danisco A/S) auf 100 gesetzt.

Ein Index von > 100 bedeutet eine schlechtere Proteinstabilität, als wenn die Probe 3450 verwendet wird. Ein Index von 100 bedeutet eine ähnliche Stabilität wie bei der Probe 3450. Ein Index von < 100 bedeutet eine bessere Proteinstabilität, als wenn man die Probe 3450 verwendet. Ein Index von 95 oder < 95 bedeutet eine sehr gute Proteinstabilität.

Pektintyp	0,10% Pektin	0,15% Pektin	0,20% Pektin	0,25% Pektin
Grindsted^TM Pektin 3450	100	100	100	100
Grindsted^TM Pektin URS	127	140	155	161
5 Min enz	100	108	115	113
10 Min enz.	98	106	111	111
15 Min enz	92	94	100	100
20 Min enz.	90	95	100	99

Wie man aus den Ergebnissen sehen kann, zeigt das Grindsted^TM Pektin URS, welches nach der vorliegenden Erfindung modifiziert ist, vorteilhafte Eigenschaften und in einigen Fällen sehr gute Eigenschaften bezüglich einer Verbesserung der Stabilität, wenn man es mit dem Referenz-Grindsted^TM Pektin 3450 und dem nicht-modifizierten Grindsted^TM Pektin URS vergleicht.
Beispiel 5
Labangetränk mit langer Lagerungsfähigkeit und niedrigem pH-Wert
Das Labangetränk ist ein angesäuertes Milchgetränk mit einem pH-Wert unter 4,2. Das Labangetränk besteht aus Labangrundlage, gemischt mit Pektinlösung. Die Formulierung für die Labangrundlage ist die folgende:

Wasserfreies Milchfett 2,8%

Entrahmtes Milchpulver 10,0%

Grindsted-Aromatisierung +

Wasser 87,2%
Standardisierte Gesamtmilch (wasserfreies Milchfett und entrahmtes Milchpulver) werden bei 75–80°C und einem Druck von 200 bar (2900 psi) homogenisiert, gefolgt von einer Pasteurisierung bei 90–95°C für 5–10 Minuten. Nach Kultivierung auf einen pH-Wert um 4,0, wird der pH-Wert mit Zitronen- oder Milchsäure auf 3,8–4,2 eingestellt. Anschließend wird Pektinlösung zugegeben. Das Gemisch wird dann gerührt, bis es ein homogenes Gemisch ist. Es wird anschließend bei 90–95°C für 10–15 Sekunden pasteurisiert und weiter bei 150–200 bar homogenisiert. Nach Abkühlen auf 20–25°C wird das Produkt aseptisch in Behälter gefüllt.
Nach wenigen Tagen zeigt ein nicht stabilisiertes Labangetränk häufig Synärese.
Jedoch verhindert die Zugabe des enzymatisch modifizierten Pektins gemäß der vorliegenden Erfindung Synärese und verbessert die Viskosität.
Darüber hinaus hat das Produkt einen ausgeprägten Joghurtgeschmack und eine lange Lagerungsbeständigkeit.
Beispiel 6
Orangensaft (mit Protein angereichert)
Orangensaftgetränk ist ein angesäuertes Getränk (pH-Wert von etwa 4), welches 2% DANPROLACT 40^TM (Central Soya, Aarhus A/S), 6% Zucker, 10% Orangenkonzentrat, 0,4% Zitronenkonzentrat, 0,2% Pektin und 81,4% Wasser enthält. Das Produkt ist ein Orangensaftgetränk, das mit Sojaprotein angereichert ist. Das Produkt wird pasteurisiert und homogenisiert. Nach dem Abkühlen auf 20–25°C wird das Produkt aseptisch in Behälter gefüllt und kann für etwa 6 Monate bei Raumtemperatur gelagert werden. Eine Zugabe von enzymatisch modifizierten Pektinen gemäß der vorliegenden Erfindung zu Orangengetränk (mit Protein angereichert) zeigte vorteilhafte Eigenschaften – wie Langzeitstabilität – und es hatte ein gutes Mundgefühl.
Beispiel 7
Antikörperherstellung
Antikörper wurden gegen das Enzym der vorliegenden Erfindung gerichtet, indem Kaninchen mit dem gereinigten Enzym injiziert und die Immunglobuline aus Antiserum nach Verfahren isoliert wurden, die von N. Harboe und A. Ingild beschrieben wurden („Immunization, Isolation of Immunglobulins. Estimation of Antibody Titre” in A Manual of Quantitative Immunoelectrophoresis. Methods and Application, N. H. Axelsen et al. (eds.), Universitetsforlaget, Oslo, 1973) und von T. P. Cooper („The Tools of Biochemistry”, John Wiley & Sons, New York, 1977).
Andere Modifikationen der vorliegenden Erfindung werden dem Fachmann auf dem Gebiet deutlich, ohne vom Umfang der vorliegenden Erfindung abzuweichen.
Auf den folgenden Seiten wird eine Anzahl von Sequenzprotokollen präsentiert, welche aufeinanderfolgend von SEQ. I. D. Nr. 1 – SEQ. I. D. Nr. 19 numeriert wurden und welche Nukleotidsequenzen und Aminosäuresequenzen darstellen. Sequenzen

Claims

Verfahren, bei dem man ein Pektin bereitstellt und diesem Pektin ein rekombinantes Enzym zufügt, welches irgendeine der Aminosäuresequenzen umfasst, die als SEQ ID No. 1 oder SEQ ID No. 2 gezeigt sind, oder eine Aminosäuresequenz umfasst, die mindestens 75% Homologie mit einer der in SEQ ID No. 1 oder SEQ ID No. 2 gezeigten Aminosäuresequenzen aufweist, um ein blockweise enzymatisch entesterifiziertes Pektin bereitzustellen, wobei das Pektin ein hochverestertes Pektin ist, und einem sauren Milieu, welches wenigstens ein Protein aufweist, das blockweise enzymatisch entesterifzierte Pektin zufügt.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das saure Milieu eine wässrige Lösung ist, und wobei die wässrige Lösung vorzugsweise ein Getränk ist.
Verfahren nach Anspruch 2, wobei das Getränk ein Trinkjoghurt, ein Fruchtsaft oder ein Getränk, das Molkenprotein enthält, ist.
Verfahren nach einem der vorangegangenen Ansprüche, wobei das Protein in einem Molkereiprodukt, wie Milch oder Käse, enthalten, von diesem abgeleitet oder von diesem ableitbar ist.
Verfahren nach Anspruch 4, wobei das Protein Casein oder Molkenprotein ist.
Verfahren nach einem der vorangegangenen Ansprüche, wobei das saure Milieu einen pH-Wert von etwa 3,5 bis etwa 5,5 hat, wobei das saure Milieu vorzugsweise einen pH-Wert von 4 bis etwa 5,5 hat.
Verfahren nach einem der vorangegangenen Ansprüche, wobei das saure Milieu einen pH-Wert von etwa 4 hat.
Verfahren nach einem der vorangegangenen Ansprüche, wobei das blockweise enzymatisch entesterifizierte Pektin von etwa 70% bis etwa 80% Estergruppen, vorzugsweise etwa 76% Estergruppen, enthält.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das blockweise enzymatisch entesterifizierte Pektin ein hohes Molekulargewicht aufweist.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das blockweise enzymatisch entesterifizierte Pektin hergestellt wird durch Behandlung eines Pektins mit einer rekombinanten Pektinmethylesterase, welche zwei oder mehr benachbarte Galacturonsäurereste des Pektins an wenigstens im Wesentlichen allen der Pektinketten entesterifiziert.