DE69626196T3 - Dna-diagnostik mittels massenspektrometrie - Google Patents
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Description
- Hintergrund der Erfindung
- Die genetische Information aller lebenden Organismen (z. B. Tiere, Pflanzen und Mikroorganismen) ist in Deoxyribonukleinsäure (DNA) kodiert. In Menschen umfaßt das vollständige Genom etwa 100.000 Gene, die auf 24 Chromosomen angeordnet sind (The Human Genome, T. Strachan, BIOS Scientific Publishers, 1992). Jedes Gen kodiert für ein spezifisches Protein, das nach seiner Expression mittels Transkription und Translation eine spezifische biochemische Funktion innerhalb einer lebenden Zelle erfüllt. Veränderungen in einer DNA-Sequenz sind als Mutationen bekannt, und können zu Proteinen führen, deren biochemische Aktivitäten verändert oder manchmal sogar verloren gegangen sind, was wiederum eine Erbkrankheit verursachen kann. Mutationen umfassen Deletionen, Insertionen oder Veränderungen (d. h. Punktmutationen) von Nukleotiden. Punktmutationen können sowohl ”missense” sein, was zu einer Veränderung in der Aminosäuresequenz eines Proteins führt, als auch ”nonsense”, indem sie für einen Stopcodon kodieren, und dadurch zu einem verkürzten Protein führen.
- Derzeit sind mehr als 3000 Erbkrankheiten bekannt (Human Genome Mutations, D. N. Cooper and M. Krawczak, BIOS Publishers, 1993), umfassend Hämophilien, Thalassämien, Duchenne Muskeldystrophie (DMD), Huntington Krankheit (HD), Alzheimer Krankheit und Mukoviszidose (CF, cystic fibrosis). Zusätzlich zu Genmutationen, die in einer Erbkrankheit resultieren, sind bestimmte angeborene Störungen das Ergebnis von Chromosomenabnormalitäten, wie etwa Trisomie 21 (Down Syndrom), Trisomie 13 (Patau Syndrom), Trisomie 18 (Edward Syndrom), Monosomie X (Turner Syndrom), und andere Aneuploidien der Geschlechtschromosomen wie etwa das Klienfelter Syndrom (XXY). Weiterhin gibt es zunehmende Hinweise, dass bestimmte DNA-Sequenzen ein Individuum für eine einer Reihe von Erkrankungen, wie etwa Diabetes, Arteriosklerose, Fettleibigkeit, verschiedene Autoimmunerkrankungen und Krebs (z. B. Kolonkarzinom, Brust-, Eierstock-, Lungenkrebs), prädisponieren können.
- Viren, Bakterien, Pilze und andere infektiöse Organismen enthalten charakteristische Nukleinsäuresequenzen, welche von den in der Wirtszelle vorhandenen verschieden sind. Daher können auch infektiöse Organismen auf Basis ihrer spezifischen DNA-Sequenzen nachgewiesen und identifiziert werden.
- Da eine Sequenz von etwa 16 Nukleotiden aus statistischen Gründen sogar für die Größe des Humangenoms spezifisch ist, können relativ kurze Nukleinsäuresequenzen verwendet werden, um normale und defekte Gene in höheren Organismen nachzuweisen, und um infektiöse Mikroorganismen (z. B. Bakterien, Pilze, Protisten und Hefen) und Viren nachzuweisen. DNA-Sequenzen können auch als ein Fingerabdruck dienen, um verschiedene Individuen innerhalb derselben Spezies zu bestimmen (Thompson, J. S. and M. W. Thompson, Hrsg., Genetics in Medicine, W. B. Saunders Co., Philadelphia, PA (1986)).
- Derzeit werden mehrere Methoden zur Bestimmung von DNA verwendet. Beispielsweise können Nukleinsäuresequenzen identifiziert werden durch Vergleichen der Mobilität eines amplifizierten Nukleinsäurefragments mit einem bekannten Standard durch Gelelektrophorese, oder durch Hybridisierung mit einer Sonde, welche zu der zu identifizierenden Sequenz komplementär ist. Eine Identifizierung kann jedoch nur dann erreicht werden, wenn das Nukleinsäurefragment mit einer empfindlichen Reporterfunktion (z. B. radioaktiv (32P, 35S), fluoreszierend oder chemilumineszent) markiert ist. Radioaktive Markierungen können jedoch gesundheitsgefährend sein, und die von ihnen erzeugten Signale nehmen im Zeitverlauf ab. Nicht-Isotopen-Markierungen (z. B. Fluoreszenzmarkierungen) haben eine geringere Empfindlichkeit, und bei Verwendung von Hochintensitätslasern bleicht das Signal aus. Zusätzlich sind die Durchführung von Markierung, Gelelektrophorese und nachfolgender Bestimmung arbeitsintensive, zeitraubende und fehleranfällige Verfahren. Elektrophorese ist insbesondere fehleranfällig, da die Größe oder die Molekülmasse der Nukleinsäure nicht direkt mit der Mobilität in der Gelmatrix korreliert werden können. Es ist bekannt, dass sequenzspezifische Effekte, Sekundärstrukturen und Wechselwirkungen mit der Gelmatrix Artefakte hervorrufen.
- Methoden zur Identifizierung von Nukleinsäuresequenzen, welche die Verwendung von Elektrophorese und/oder die Markierung von Nukleinsäuren mit Reporterfunktionen erfordern, sind beispielsweise in
WO 93/20236 JP6294796 EP-A-412883 WO 92/15712 WO 91/13075 WO 91/15600 - Im Allgemeinen stellt Massenspektrometrie ein Mittel zum ”Wiegen” von individuellen Molekülen bereit, indem die Moleküle in vacuo ionisiert werden und durch Verdampfen zum ”Fliegen” gebracht werden. Unter dem Einfluss von Kombinationen von elektrischen und magnetischen Feldern folgen die Ionen Flugbahnen in Abhängigkeit von ihrer individuellen Masse (m) und Ladung (z). Auf dem Gebiet von Molekülen mit niedriger Molekülmasse ist Massenspektrometrie seit langem ein Bestandteil des routinemäßigen physikalisch-organischen Repertoires zur Analyse und Charakterisierung organischer Moleküle durch die Bestimmung der Masse des Stammmolekülions. Zusätzlich wird, indem Kollisionen dieses Stammmolekülions mit anderen Partikeln (z. B. Argonatomen) veranlasst werden, das Molekülion durch die so genannte Kollisions-induzierte Dissoziation (CID) fragmentiert, wobei sekundäre Ionen gebildet werden. Das Fragmentierungsmuster bzw. der Fragmentierungsweg ermöglicht oftmals, detaillierte Strukturinformation abzuleiten. Es sind viele Anwendungen massenspektrometrischer Methoden in der Technik, insbesondere in den Biowissenschaften bekannt, und eine Zusammenfassung kann gefunden werden in Methods in Enzymology, Vol. 193: ”Mass Spectrometry” (Hrsg. J. A. McCloskey), 1990, Academic Press, New York.
- Aufgrund der offensichtlichen analytischen Vorteile von Massenspektrometrie hinsichtlich der Bereitstellung von hoher Nachweisempfindlichkeit, hoher Genauigkeit der Massebestimmung, detaillierter Strukturinformation durch CID in Verbindung mit einer MS/MS-Konfiguration und Geschwindigkeit, sowie online-Datentransfer zu einem Computer besteht ein beträchtliches Interesse, Massenspektrometrie für die Strukturanalyse von Nukleinsäuren zu verwenden. Neuere Übersichten, welche dieses Gebiet zusammenfassen, umfassen K. H. Schram, ”Mass Spectometry of Nucleic Acid Components. Biomedical Applications of Mass Spectrometry” 34, 203–287 (1990); und P. F. Crain, ”Mass Spectrometric Techniques in Nucleic Acid Research”, Mass Spectrometry Reviews 9, 505–554 (1990).
- Nukleinsäuren sind jedoch stark polare Biopolymere, die schwierig zu verdampfen sind. Dementsprechend war die massenspektrometrische Bestimmung auf synthetische Oligonukleotide mit niedriger Molekülmasse begrenzt, indem die Masse des Stammmolekülions bestimmt und dadurch die bereits bekannte Oligonukleotidsequenz bestätigt wurde, oder alternativ die bereits bekannte Sequenz bestätigt wurde durch die Erzeugung von sekundären Ionen (Fragmentionen) über CID in einer MS/MS-Konfiguration, wobei für die Ionisierung und Verdampfung insbesondere die Methode des Beschusses mit schnellen Atomen (FAB Massenspektrometrie) oder der Plasmadesorption (PD Massenspektrometrie) verwendet wurde. Als ein Beispiel wurde die Anwendung von FAB für die Analyse von geschützten Dimerblöcken für die chemische Synthese von Oligodeoxynukleotiden beschrieben (Köster et al., Biomedical Enviromental Mass Spectrometry 14, 111–116 (1987)).
- Zwei weitere neuere Ionisierungs/Desorptionstechniken sind Elektrospray/Ionenspray (ES) und Matrix-unterstützte Laserdesorption/Ionisation (MALDI). ES-Massenspektrometrie wurde von Fenn et al. (J. Phys. Chem. 88, 4451–59 (1984); PCT-Anmeldung Nr.
WO 90/14148 - MALDI Massenspektrometrie kann im Gegensatz dazu insbesondere attraktiv sein, wenn eine Flugzeit (TOF, time-of-fligth) Konfiguration als ein Massanalysator verwendet wird. Die MALDI-TOF Massenspektrometrie ist von Hillenkamp et al. (”Matrix Assisted UV-Laser Desorption/Ionization: A New Approach to Mass Spectrometry of Large Biomolecules”, Biological Mass Spectrometry (Hrsg. Burlingame und McCloskey), Elsevier Science Publishers, Amsterdam, Seiten 49–60, 1990) eingeführt worden. Da mit dieser Technik in den meisten Fällen keine zahlreichen Molekülionenpeaks erzeugt werden, sehen die Massenspektren im Prinzip einfacher aus, verglichen zu ES Massenspektrometrie.
- Obwohl DNA-Moleküle bis zu einer Molekülmasse von 410.000 Dalton desorbiert und verdampft worden sind (Williams et al., ”Volatilization of High Molecular Weight DNA by Pulsed Laser Ablation of Frozen Aqueous Solutions”, Science 246, 1585–87 (1989)), hat diese Technik bisher nur geringe Auflösung gezeigt (Oligothymidinsäuren bis zu 18 Nukleotiden, Huth-Fehre et al., Rapid Communications in Mass Spectrometry 6, 209–13 (1992); DNA-Fragmente mit einer Länge von bis zu 500 Nukleotiden, K. Tang et al., Rapid Communications in Mass Spectrometry 8, 727–730 (1994); und eine doppelsträngige DNA mit 28 Basenpaaren, Williams et al., ”Time-of Flight Mass Spectrometry of Nucleic Acids by Laser Ablation and Ionization from a Frozen Aqueous Matrix”, Rapid Communications in Mass Spectrometry 4, 348–351 (1990)).
- Das
japanische Patent Nr. 59-131909 - Zusammenfassung der Erfindung
- Die vorliegende Erfindung stellt massenspektrometrische Verfahren zum Nachweis einer besonderen Nukleinsäuresequenz in einer biologischen Probe bereit. In Abhängigkeit von der nachzuweisenden Sequenz können die Verfahren dazu verwendet werden, um beispielsweise eine Erbkrankheit oder Chromosomenabnormalität, eine Prädisposition für eine Krankheit oder Störung (z. B. Fettleibigkeit, Arteriosklerose, Krebs) oder eine Infektion durch einen pathogenen Organismus (z. B. Virus, Bakterienparasit oder Pilz) zu diagnostizieren (z. B. pränatal oder postnatal), oder um Information bezüglich Identität, Erbanlagen oder Kompatibilität (z. B. HLA-Phänotypisierung) bereitzustellen.
- In einer ersten Ausführungsform werden ein oder mehrere Detektornukleinsäuremoleküle (z. B. ein Oligonukleotid oder Oligonukleotidmimetikum), welche zu der nachzuweisenden Targetstelle komplementär ist, mit der nachzuweisenden Targetstelle hybridisiert, und nicht hybridisiertes Oligonukleotid wird entfernt. Das Produkt wird ionisiert und verdampft und danach mittels Massenspektrometrie analysiert, wobei der Nachweis des Detektoroligonukleotids durch Massenspektrometrie das Vorliegen der Targetnukleinsäure in der biologischen Probe anzeigt.
- Ein Nukleinsäuremolekül, welches die nachzuweisende Nukleinsäuresequenz (d. h. das Target) enthält, kann anfangs auf einem festen Träger immobilisiert werden. Eine Immobilisierung kann beispielsweise verwirklicht werden auf Basis von Hybridisierung zwischen einem Abschnitt des Targetnukleinsäuremoleküls, der von der nachzuweisenden Targetstelle verschieden ist, und einem Einfangnukleinsäuremolekül, das zuvor auf einem festen Träger immobilisiert worden ist. Alternativ kann eine Immobilisierung verwirklicht werden durch direktes Binden des Targetnukleinsäuremoleküls an den festen Träger. Bevorzugt ist zwischen dem Targetnukleinsäuremolekül und dem Träger ein Abstandhalter bzw. Spacer (z. B. ein Nukleinsäuremolekül) vorhanden.
- In bevorzugten Ausführungsformen wird die nachzuweisende Targetstelle vor dem Nachweis amplifiziert und werden die Nukleinsäuremoleküle konditioniert. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform werden die nachzuweisenden Targetsequenzen in einem Format angeordnet, welches mehrere gleichzeitige Nachweise (Multiplexverfahren) ermöglicht sowie parallele Verfahrensführung unter Verwendung von Oligonukleotidanordnungen (”DNA-Chips”).
- In einer zweiten Ausführungsform ist die Immobilisierung des Targetnukleinsäuremoleküls ein fakultativer Schritt. Sobald ein Nukleinsäuremolekül aus einer biologischen Probe erhalten wurde, wird die nachzuweisende Targetsequenz amplifiziert und direkt durch Massenspektrometrie nachgewiesen. In bevorzugten Ausführungsformen werden die nachzuweisende Targetstelle und/oder die Detektoroligonukleotide vor dem massenspektrometrischen Nachweis konditioniert. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform werden die amplifizierten nachzuweisenden Targetsequenzen in einem Format angeordnet, welches mehrere gleichzeitige Nachweise (Multiplexverfahren) ermöglicht sowie parallele Verfahrensführung unter Verwendung von Oligonukleotidanordnungen (”DNA-Chips”).
- In einer dritten Ausführungsform können Nukleinsäuremoleküle, welche von einem Nukleinsäuremolekül repliziert wurden, das aus einer biologischen Probe erhalten worden war, unter Verwendung einer oder mehrerer Nukleasen (unter Verwendung von Deoxyribonukleasen für DNA oder von Ribonukleasen für RNA) spezifisch verdaut werden. Die Fragmente werden mittels Massenspektrometrie analysiert, wobei die Bestimmung der Molekülmasse der Fragmente anzeigt, ob die Targetnukleinsäuresequenz vorhanden ist. Hybridisierungsereignisse und die tatsächlichen Molekülmassen der Targetsequenzen liefern Information darüber, ob und an welcher Stelle Mutationen in dem Gen vorhanden sind. Die Fragmente können auf einem festen Träger, welcher die entsprechenden komplementären Sequenzen aufweist, eingefangen werden. Die Anordnung kann Punkt für Punkt unter Verwendung von Massenspektrometrie analysiert werden. DNA kann in ähnlicher Weise unter Verwendung eines Cocktails von Nukleasen, umfassend Restriktionsendonukleasen, verdaut werden. In einer bevorzugten Ausführungsform werden die Nukleinsäurefragmente vor dem massenspektrometrischen Nachweis konditioniert.
- In einer weiteren Ausführungsform wird mindestens ein Primer mit einer 3'-endständigen Base, welche zu einem Allel (mutiert oder normal) komplementär ist, mit einem das Allel enthaltenden Targetnukleinsäuremolekül hybridisiert. Eine geeignete Polymerase und ein vollständiger Satz von Nukleosidtriphosphaten oder nur eines der Nukleosidtriphosphate werden in separaten Reaktionen verwendet um eine charakteristische Extension des Primers zu bewerkstelligen. Nur wenn der Primer korrekt annealt ist (d. h. kein Mismatch (fehlende Übereinstimmung) am 3'-Ende) und wenn das korrekte (d. h. komplementäre) Nukleosid zugegeben wird, wird der Primer extendiert. Die Produkte können aufgelöst werden durch Verschiebung der Molekülmassen, wie mittels Massenspektrometrie bestimmt.
- In einer fünften Ausführungsform wird ein Nukleinsäureprimer, der zu einem einer Mutationsstelle benachbarten Abschnitt der nachzuweisenden Targetstelle komplementär ist, mit dem Targetnukleinsäuremolekül hybridisiert. Die Zugabe eines vollständigen Satzes von Dideoxynukleosiden, 3'-Deoxynukleosidtriphosphaten (z. B. pppAdd, pppTdd, pppCdd und pppGdd) oder Ribonukleotidtriphosphaten und einer Polymerase gestattet nur die Extension des Primers mit dem zu dem Targetnukleotid komplementären Dideoxynukleosid, 3'-Deoxynukleosid oder Ribonukleotidtriphosphat. Das Produkt wird ionisiert und verdampft und danach durch Massenspektrometrie analysiert, wobei der Nachweis des Primers durch Massenspektrometrie die Identität des Targetnukleotids bestimmt.
- Das Nukleinsäuremolekül, welches die nachzuweisende Nukleinsäuresequenz (d. h. das Target) enthält, kann anfangs auf einem festen Träger immobilisiert werden. Eine Immobilisierung kann beispielsweise verwirklicht werden auf Basis von Hybridisierung zwischen einem Abschnitt des Targetnukleinsäuremoleküls, der von der nachzuweisenden Targetstelle beabstandet ist, und einem Einfangnukleinsäuremolekül, das zuvor auf einem festen Träger immobilisiert worden ist. Alternativ kann eine Immobilisierung verwirklicht werden durch direktes Binden des Targetnukleinsäuremoleküls an den festen Träger. Bevorzugt ist zwischen dem Targetnukleinsäuremolekül und dem Träger ein Abstandhalter (z. B. ein Nukleinsäuremolekül) vorhanden.
- In einer sechsten Ausführungsform wird eine Targetnukleinsäure mit einem komplementären Oligonukleotid hybridisiert, welches innerhalb einer Region, die eine Mutation M umfasst, an das Target hybridisiert. Der Heteroduplex wird danach mit einem Mittel in Kontakt gebracht, das spezifisch einen nicht hybridisierten Abschnitt spaltet (z. B. eine Einzelstrang-spezifische Endonuklease), so dass ein Mismatch, der die Gegenwart einer Mutation anzeigt, zu einer Spaltung der Targetnukleinsäure führt. Die zwei Spaltungsprodukte können danach durch Massenspektrometrie nachgewiesen werden.
- In einer siebten Ausführungsform, welche auf der Ligasekettenreaktion (LCR) beruht, wird eine Targetnukleinsäure mit einem Satz von Ligationsedukten und einer wärmestabilen DNA-Ligase hybridisiert, so dass die Ligationsedukte kovalent aneinander gebunden werden, wobei ein Ligationsprodukt gebildet wird.
- Das Ligationsprodukt kann danach durch Massenspektrometrie nachgewiesen und mit einem bekannten Wert verglichen werden. Wenn die Reaktion zyklisch durchgeführt wird, kann das erhaltene Ligationsprodukt amplifiziert werden um den Nachweis kleiner Volumina an Targetnukleinsäure zu erleichtern. Selektion zwischen Wildtyp- und mutierten Primern an der Ligationsstelle kann zum Nachweis einer Punktmutation führen.
- Die erfindungsgemäßen Verfahren stellen erhöhte Genauigkeit und Zuverlässigkeit des Nachweises von Nukleinsäuren durch Massenspektrometrie bereit. Zusätzlich ermöglichen die Verfahren strenge Kontrollen um falsch negative oder positive Ergebnisse zu verhindern. Die erfindungsgemäßen Verfahren vermeiden Elektrophoreseschritte, Markierung und nachfolgenden Nachweis einer Markierung. Tatsächlich erfordert das gesamte Verfahren, umfassend Nukleinsäureisolierung, Amplifizierung und massenspektrometrische Analyse schätzungsweise lediglich etwa 2–3 Stunden. Daher sind die hierin offenbarten erfindungsgemäßen Verfahren schneller und kostengünstiger durchzuführen als existierende Systeme zum DNA-Nachweis. Da die hierin offenbarten Verfahren die Identifizierung und den Nachweis der Nukleinsäurefragmente gleichzeitig anhand ihrer spezifischen Molekülmassen (ein eindeutiger physikalischer Standard) ermöglichen, sind die offenbarten Verfahren zusätzlich auch erheblich genauer und zuverlässiger als derzeit verfügbare Verfahren.
- Kurze Beschreibung der Zeichnungen
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1A ist ein Diagramm, welches ein Verfahren zum Durchführen einer massenspektrometrischen Analyse an einer nachzuweisenden Targetstelle bzw. einer Targetdetektionsstelle (TDS), welche in einem aus einer biologischen Probe erhaltenen Targetnukleinsäuremolekül (T) enthalten ist, zeigt. Eine spezifische Einfangsequenz (C) ist über einen Abstandhalter (S) an einem festen Träger (SS) gebunden. Die Einfangsequenz ist derart ausgewählt, so dass sie spezifisch mit einer komplementären Sequenz auf dem Targetnukleinsäuremolekül (T), bezeichnet als die Targeteinfangstelle (TCS), hybridisiert. Der Abstandhalter (S) erleichtert eine unbehinderte Hybridisierung. Eine Detektornukleinsäuresequenz (D), welche zu der TDS komplementär ist, wird danach mit der TDS in Kontakt gebracht. Eine Hybridisierung zwischen D und der TDS kann mittels Massenspektrometrie nachgewiesen werden. -
1B ist ein Diagramm, welches ein Verfahren zum Durchführen einer massenspektrometrischen Analyse an mindestens einer Targetdetektionsstelle (hier TDS1 und TDS2) über direkte Bindung an einen festen Träger zeigt. Die Targetsequenz (T), welche die Targetdetektionsstelle (TDS1 und TDS2) enthält, wird über die Bildung einer reversiblen oder irreversiblen Bindung, welche über eine geeignete Funktionalität (L') auf dem Targetnukleinsäuremolekül (T) und eine geeignete Funktionalität (L) auf dem festen Träger gebildet wird, auf einem festen Träger immobilisiert. Detektornukleinsäuresequenzen (hier D1 und D2), welche zu einer Targetdetektionsstelle (TDS1 oder TDS2) komplementär sind, werden danach mit der TDS in Kontakt gebracht. Hybridisierung zwischen TDS1 und D1 und/oder TDS2 und D2 kann auf Basis von Molekülmassendifferenzen nachgewiesen und unterschieden werden. -
1C ist ein Diagramm, welches ein Verfahren zum Nachweis einer Wildtypsequenz (Dwt) und/oder einer mutierten Sequenz (Dmut) in einem Targetnukleinsäuremolekül (T) zeigt. Wie in1A ist eine spezifische Einfangsequenz (C) über einen Abstandhalter (S) an einen festen Träger (SS) gebunden. Zusätzlich ist die Einfangsequenz derart ausgewählt, so dass sie spezifisch mit einer komplementären Sequenz auf der Targetsequenz (T) wechselwirkt, wobei die nachzuweisende Targeteinfangstelle (TCS) durch Hybridisierung nachzuweisen ist. Wenn die Targetdetektionsstelle (TDS) jedoch eine Mutation X umfasst, welche die Molekülmasse ändert, können mutierte Targetdetektionsstellen durch Massenspektrometrie vom Wildtyp unterschieden werden. Bevorzugt ist das Detektornukleinsäuremolekül (D) derart ausgelegt, so dass die Mutation in der Mitte des Moleküls vorliegt und daher nicht zu einer stabilen Hybride führen würde, wenn das Wildtyp-Detektoroligonukleotid (Dwt) z. B. als eine Kontrolle mit der Targetdetektorsequenz in Kontakt gebracht wird. Die Mutation kann auch nachgewiesen werden, wenn das mutierte Detektoroligonukleotid (Dmut) mit der einen Match ausbildenden Base an der mutierten Position für die Hybridisierung verwendet wird. Wenn ein aus einer biologischen Probe erhaltenes Nukleinsäuremolekül für die besondere Sequenz heterozygot ist (d. h. sowohl Dwt als auch Dmut enthält), binden sowohl Dwt als auch Dmut an den entsprechenden Strang und die Massendifferenz ermöglicht den gleichzeitigen Nachweis von Dwt und Dmut. -
2 ist ein Diagramm, welches ein Verfahren zeigt, bei dem mehrere Mutationen gleichzeitig auf einer Targetsequenz unter Verwendung entsprechender Detektoroligonukleotide nachgewiesen werden. Die Molekülmassendifferenzen zwischen den Detektoroligonukleotiden D1, D2 und D3 müssen groß genug sein, so dass ein gleichzeitiger Nachweis (Multiplexverfahren) möglich ist. Dies kann bewirkt werden durch die Sequenz selbst (Zusammensetzung oder Länge), oder durch Einführen von Massen-modifizierenden Funktionalitäten M1–M3 in das Detektoroligonukleotid. -
3 ist ein Diagramm, welches ein nochmals weiteres Multiplexdetektionsformat zeigt. In dieser Ausführungsform wird eine Unterscheidung bewirkt durch Verwendung unterschiedlicher spezifischer Einfangsequenzen, welche positionsspezifisch auf einer ebenen Oberfläche (z. B. einer ”Chip-Anordnung”) immobilisiert sind. Wenn unterschiedliche Targetsequenzen T1–Tn vorhanden sind. Wechselwirken ihre Targeteinfangstellen TCS1–TCSn mit komplementären immobilisierten Einfangsequenzen C1–Cn. Ein Nachweis wird bewirkt durch Verwendung von Detektoroligonukleotiden D1–Dn mit geeigneter Massendifferenz, wobei die Massendifferenzen entweder von ihren Sequenzen oder von Massen-modifizierenden Funktionalitäten M1–Mn bedingt sind. -
4 ist ein Diagramm, welches ein Format zeigt, worin eine zuvor konstruierte Targeteinfangstelle (TCS) unter Verwendung von PCR-Amplifikation in die Targetsequenz eingeführt wird. Nur ein Strang wird eingefangen, der andere wird entfernt (z. B. auf Basis der Wechselwirkung zwischen Biotin und Streptavidin-beschichteten Magnetkügelchen). Wenn das Biotin an Primer 1 gebunden ist, kann der andere Strang durch eine TCS geeignet markiert werden. Der Nachweis erfolgt wie vorstehend beschrieben durch die Wechselwirkung eines spezifischen Detektoroligonukleotids D mit der entsprechenden Targetdetektionsstelle TDS über Massenspektrometrie. -
5 ist ein Diagramm, welches zeigt, wie Amplifikationsprodukte (hier über Ligasekettenreaktion (LCR)) hergestellt und über Massenspektrometrie nachgewiesen werden können. Unterscheidung der Massen kann bewirkt werden über die an die Primer (P1 bzw. P4) gebundenen Massen-modifizierenden Funktionalitäten (M1 und M2). Ein Nachweis durch Massenspektrometrie kann direkt bewirkt werden (d. h. ohne eine Verwendung von Immobilisierung und Targeteinfangstellen (TCS)). Durch Bereitstellen einer geordneten Anordnung von Einfangsequenzen (C) können mehrere LCR-Reaktionen parallel durchgeführt werden. Dieses Format ermöglicht eine Auftrennung der Ligationsprodukte und eine Identifizierung Punkt für Punkt durch Massenspektrometrie, oder ein Multiplexverfahren, wenn die Massenunterscheidung ausreichend ist. -
6A ist ein Diagramm, welches die massenspektrometrische Analyse eines durch ein Transkriptionsamplifizierungsverfahren amplifizierten Nukleinsäuremoleküls zeigt. Eine RNA-Sequenz wird über ihre TCS-Sequenz eingefangen, so dass Wildtyp- und mutierte Targetdetektionsstellen wie vorstehend durch Verwendung geeigneter Detektoroligonukleotide (D) nachgewiesen werden können. -
6B ist ein Diagramm, welches ein Multiplexverfahren zum Nachweis zweier verschiedener (mutierter) Stellen auf der gleichen RNA gleichzeitig unter Verwendung Massen-modifizierter Detektoroligonukleotide M1–D1 und M2–D2 zeigt. -
6C ist ein Diagramm eines unterschiedlichen Multiplexverfahrens zum Nachweis spezifischer Mutationen unter Verwendung Massen-modifizierter Dideoxynukleosid- oder 3'-Deoxynukleosidtriphosphate und einer RNA-abhängigen DNA-Polymerase. Alternativ können eine DNA-abhängige RNA-Polymerase und Ribonukleotidtriphosphate verwendet werden. Dieses Format ermöglicht den gleichzeitigen Nachweis aller vier möglichen Basen an einer Mutationsstelle (X). -
7A ist ein Diagramm, welches ein Verfahren zur Durchführung einer massenspektrometrischen Analyse an einer Targetdetektionsstelle (TDS), welche in einem aus einer biologischen Probe erhaltenen Targetnukleinsäuremolekül (T) vorhanden ist, zeigt. Eine spezifische Einfangsequenz (C) ist über einen Abstandhalter (S) an einen festen Träger (SS) gebunden. Die Einfangsequenz ist derart ausgewählt, so dass sie spezifisch mit einer komplementären Sequenz auf T, bezeichnet als die Targeteinfangstelle (TCS), hybridisiert. Ein Nukleinsäuremolekül, das zu einem Abschnitt der TDS komplementär ist, wird 5' der Mutationsstelle (X) innerhalb der TDS an die TDS hybridisiert. Die Zugabe eines vollständigen Satzes von Dideoxynukleosiden oder 3'-Deoxynukleosidtriphosphaten (z. B. pppAdd, pppTdd, pppCdd und pppGdd) und einer DNA-abhängigen DNA-Polymerase gestattet, dass nur das zu X komplementäre Dideoxynukleosid oder 3'-Deoxynukleosidtriphosphat angefügt wird. -
7B ist ein Diagramm, welches ein Verfahren zur Durchführung einer massenspektrometrischen Analyse zum Nachweis der Gegenwart einer Mutation an einer potentiellen Mutationsstelle (M) in einem Nukleinsäuremolekül zeigt. Dieses Format ermöglicht eine gleichzeitige Analyse beider Allele (A) und (B) eines doppelsträngigen Targetnukleinsäuremoleküls, so dass eine Diagnose von normal homozygot, mutiert homozygot und heterozygot bereitgestellt werden kann. Allel A und B werden jeweils mit komplementären Oligonukleotiden ((C) bzw. (D)) hybridisiert, welche innerhalb einer Region, die M umfasst, an A und B hybridisieren. Jeder Heteroduplex wird danach mit einer Einzelstrang-spezifischen Endonuklease in Kontakt gebracht, so dass ein Mismatch an Position M, der die Gegenwart einer Mutation anzeigt, zur Spaltung von (C) und/oder (D) führt, was danach durch Massenspektrometrie nachgewiesen werden kann. -
8 ist ein Diagramm, welches zeigt, wie beide Stränge einer Target-DNA für den Nachweis vorbereitet werden können, unter Verwendung von Transkriptionsvektoren mit zwei verschiedenen Promotoren an gegenüber liegenden Positionen (z. B. der SP6 und der T7 Promoter). Dieses Format ist insbesondere nützlich für den Nachweis von heterozygoten Targetdetektionsstellen (TDS). Unter Verwendung von SP6 oder T7 RNA-Polymerase könnten beide Stränge separat oder gleichzeitig transkribiert werden. Beide RNA können spezifisch eingefangen werden und gleichzeitig unter Verwendung von Detektoroligonukleotiden mit geeigneter Massendifferenz nachgewiesen werden. Dies kann entweder direkt in Lösung oder durch parallele Bearbeitung vieler Targetsequenzen an einer geordneten Anordnung spezifisch immobilisierter Einfangsequenzen bewirkt werden. -
9 ist ein Diagramm, welches zeigt, wie RNA, die hergestellt wurden wie in den6 ,7 und8 beschrieben, unter Verwendung einer oder mehrerer Ribonukleasen spezifisch verdaut, und die Fragmente an einem festen Träger, welcher die entsprechenden komplementären Sequenzen aufweist, eingefangen werden können. Hybridisierungsereignisse und die tatsächlichen Molekülmassen der eingefangenen Targetsequenzen liefern Information darüber, ob und an welcher Stelle Mutationen in dem Gen vorhanden sind. Die Anordnung kann Punkt für Punkt unter Verwendung von Massenspektrometrie analysiert werden. DNA kann in ähnlicher Weise unter Verwendung eines Cocktails von Nukleasen, umfassend Restriktionsendonukleasen, verdaut werden. Mutationen können nachgewiesen werden durch unterschiedliche Molekülmassen spezifischer individueller Fragmente im Vergleich zu den Molekülmassen der Wildtypfragmente. -
10A zeigt ein aus dem im nachfolgenden Beispiel 1 beschriebenen Experiment resultierendes Spektrum. Abbildung i) zeigt die Absorption des 26-mers vor Hybridisierung. Abbildung ii) zeigt das Filtrat der Zentrifugation nach Hybridisierung. Abbildung iii) zeigt die Ergebnisse nach dem ersten Waschschritt mit 50 mM Ammoniumcitrat. Abbildung iv) zeigt die Ergebnisse nach dem zweiten Waschschritt mit 50 mM Ammoniumcitrat. -
10B zeigt ein Spektrum, welches aus dem im nachfolgenden Beispiel 1 beschriebenen Experiment nach drei Wasch/Zentrifugationsschritten resultiert. -
10C zeigt ein Spektrum, welches aus dem im nachfolgenden Beispiel 1 beschriebenen Experiment resultiert, und das die erfolgreiche Desorption des hybridisierten 26-mers von den Kügelchen zeigt. -
11 zeigt ein Spektrum, welches aus dem im nachfolgenden Beispiel 1 beschriebenen Experiment resultiert, und das die erfolgreiche Desorption des hybridisierten 40-mers zeigt. Die Nachweiseffizienz legt nahe, dass auch erheblich längere Fragmente als 40-mere desorbiert werden können. -
12 zeigt ein Spektrum, welches aus dem im nachfolgenden Beispiel 2 beschriebenen Experiment resultiert, und das die erfolgreiche Desorption und Unterscheidung eines 18-mers und eines 19-mers durch Elektrospray-Massenspektrometrie zeigt; das Gemisch (oben); hervorgehobene Peaks, die auf das 18-mer zurückzuführen sind (Mitte); und hervorgehobene Peaks, die auf das 19-mer zurückzuführen sind (unten). -
13 ist eine graphische Darstellung des Verfahrens zum Nachweis der Mukoviszidose-Mutation ΔF508, wie in Beispiel 3 beschrieben. -
14 ist ein Massenspektrum des DNA-Extensionsprodukts einer für ΔF508 homozygot normalen Probe. -
15 ist ein Massenspektrum des DNA-Extensionsprodukts einer für ΔF508 heterozygot mutierten Probe. -
16 ist ein Massenspektrum des DNA-Extensionsprodukts einer für ΔF508 homozygot normalen Probe. -
17 ist ein Massenspektrum des DNA-Extensionsprodukts einer für ΔF508 homozygot mutierten Probe. -
18 ist ein Massenspektrum des DNA-Extensionsprodukts einer für ΔF508 heterozygot mutierten Probe. -
19 ist eine graphische Darstellung der verschiedenen Verfahren zur Durchführung einer Genotypisierung von Apolipoprotein E. -
20 zeigt die Nukleinsäuresequenz von normalem Apolipoprotein E (kodiert vom E3 Allel) und von anderen Isotypen, die von den Allelen E2 und E4 kodiert werden. -
21A zeigt ein zusammengesetztes Restriktionsmuster für verschiedene Apolipoprotein E-Genotypen. -
21B zeigt das in einem 3,5% MetPhor Agarosegel erhaltene Restriktionsmuster für verschiedene Apolipoprotein E-Genotypen. -
21C zeigt das in einem 12% Polyacrylamidgel erhaltene Restriktionsmuster für verschiedene Apolipoprotein E-Genotypen. -
22A ist eine Tabelle, welche die Molekülmassen der 91-, 83-, 72-, 48- und 35-Basenpaarfragmente, die durch Restriktionsenzymspaltung der Allele E2, E3 und E4 von Apolipoprotein E erhalten wurden, zeigt. -
22B ist das Massenspektrum des Restriktionsprodukts eines homozygoten E4 Apolipoprotein E Genotyps. -
23A ist das Massenspektrum des Restriktionsprodukts eines homozygoten E3 Apolipoprotein E Genotyps. -
23B ist das Massenspektrum des Restriktionsprodukts eines E3/E4 Apolipoprotein E Genotyps. -
24 ist eine Autoradiographie eines 7,5% Polyacrylamidgels, auf das 10% (5 μl) jeder PCR aufgetragen wurden. Probe M: Alul-verdauter pBr322; Probe 1: HBV-positiv nach serologischer Analyse; Probe 2: ebenfalls HBV-positiv; Probe 3: ohne serologische Analyse, aber mit einem erhöhten Transaminasenwert, was eine Leberkranknheit andeutet; Probe 4: HBV-negativ; Probe 5: HBV-positiv nach serologischer Analyse; Probe 6: HBV-negativ, (–) Negativkontrolle, (+) Positivkontrolle. Anfärbung erfolgte mit Ethidiumbromid. -
25A ist ein Massenspektrum von Probe 1, die HBV-positiv ist. Das Signal bei 20754 Da stellt das HBV-verwandte PCR-Produkt dar (67 Nukleotide, berechnete Masse: 20735 Da). Das Massensignal bei 10390 Da stellt das [M+2H]2+ Signal dar (berechnet: 10378 Da). -
25B ist ein Massenspektrum von Probe 3, die nach PCR, serologischen Untersuchungen und Untersuchungen auf Basis von Dot Blots HBV-negativ ist. Das PCR-Produkt wird lediglich in Spurenmengen hergestellt. Nichtsdestoweniger wird es eindeutig bei 20751 Da (berechnet 20735 Da) nachgewiesen. Das Massensignal bei 10397 Da stellt das [M+2H]2+ Molekülion dar (berechnet: 10376 Da). -
25C ist ein Massenspektrum von Probe 4, die HBV-negativ aber CMV-positiv ist. Wie erwartet konnten keine HBV-spezifischen Signale erhalten werden. -
26 zeigt einen Teil des E. coli lacl-Gens mit Bindungsstellen der in der Ligasekettenreaktion (LCR) verwendeten komplementären Oligonukleotide. Hier ist die Wildtypsequenz abgebildet. Die Mutante enthält eine Punktmutation an bp 191, was auch die Ligationsstelle ist (fett). Die Mutation ist eine Transition von C nach T (bzw. G nach A). Dies führt zu einem T-G-Mismatch mit Oligo A (bzw. einem A-C-Mismatch mit Oligo B). -
27 ist ein mit Ethidiumbromid angefärbtes 7,5% Polyacrylamidgel. M: Längenstandard (Mspl-verdaute pUC19 DNA). Bahn 1: LCR mit Wildtyptemplat. Bahn 2: LCR mit mutiertem Templat. Bahn 3: (Kontrolle) LCR ohne Templat. Das Ligationsprodukt (50 bp) wurde nur in der positiven, Wildtyptemplat enthaltenden Reaktion erzeugt. -
28 ist ein HPLC-Chromatogramm von zwei gepoolten positiven LCR. -
29 zeigt ein HPLC-Chromatogramm der gleichen Bedingungen, aber es wurde mutiertes Templat verwendet. Das schwache Signal des Ligationsprodukts beruht entweder auf Templat-freier Ligation der Edukte oder einer Ligation an einem (G-T, A-C) Mismatch. Das ”falsch positive” Signal ist signifikant schwächer als das in28 abgebildete Signal des Ligationsprodukts mit Wildtyptemplat. Die Analyse der Ligationsedukte führt zu ”Doppelpeaks”, da zwei der Oligonukleotide 5'-phosphoryliert sind. -
30 . In a ist das komplexe, durch MALDI-TOF-MS Analyse von Pfu DNA-Ligase-Lösung erhaltene Signalmuster abgebildet. In b ist ein MALDI-TOF Spektrum einer ungereinigten LCR gezeigt. Das Massensignal bei 67569 Da stellt vermutlich die Pfu DNA-Ligase dar. -
31 zeigt ein MALDI-TOF Spektrum von zwei gepoolten positiven LCR (a). Das Signal bei 7523 Da stellt nicht ligiertes Oligo A dar (berechnet: 7521 Da), während das Signal bei 15449 Da das Ligationsprodukt darstellt (berechnet: 15450 Da). Das Signal bei 3774 Da ist das [M+2H]2+ Signal von Oligo A. Die Signale im Massenbereich unter 2000 sind auf die Matrixionen zurückzuführen. Das Spektrum entspricht Bahn 1 in2A und dem Chromatogramm in2B . In b ist ein Spektrum von zwei gepoolten negativen LCR (mutiertes Templat) gezeigt. Das Signal bei 7517 Da stellt Oligo A dar (berechnet: 7521 Da). In c ist ein Spektrum von zwei gepoolten Kontrollreaktionen (mit Lachssperma-DNA als Templat) abgebildet. Die Signale im Massenbereich um 2000 Da sind auf Tween20 zurückzuführen. -
32 zeigt ein Spektrum, das von zwei gepoolten LCR erhalten wurde, bei denen lediglich Lachssperma-DNA als eine negative Kontrolle verwendet worden war; wie erwartet konnte lediglich Oligo A nachgewiesen werden. -
33 zeigt ein Spektrum von zwei gepoolten positiven LCR (a). Die Reinigung wurde durchgeführt mit einer Kombination aus Ultrafiltration und Streptavidin-DynaBeads, wie im Text beschrieben. Das Signal bei 15448 Da stellt das Ligationsprodukt dar (berechnet: 15450 Da). Das Signal bei 7527 Da stellt Oligo A dar (berechnet: 7521 Da). Die Signale bei 3761 sind das [M+2H]2+ Signal von Oligo A, während das Signal bei 5140 Da das [M+3H]2+ Signal des Ligationsprodukts ist. In b ist ein Spektrum von zwei gepoolten negativen LCR (ohne Templat) gezeigt. Das Signal bei 7514 Da stellt Oligo A dar (berechnet: 7521 Da). -
34 ist eine schematische Darstellung der Oligobasisextension des Mutationsdetektionsprimers B unter Verwendung von ddTTP (A) bzw. ddCTP (B) im Reaktionsgemisch. Die theoretische Massenberechnung ist in Klammern angegeben. Die gezeigte Sequenz ist ein Teil von Exon 10 des CFTR-Gens, das die am häufigsten auftretende Mucoviszidosemutation ΔF508 und die selteneren Mutationen Δ1507 sowie Ile506Ser trägt. -
35 sind MALDI-TOF-MS Spektren, die direkt von präzipitierten Oligobasisextendierten Primern aufgezeichnet wurden. Die jeweils oberen Spektren (ddTTP bzw. ddCTP) zeigen den annealten Primer (CF508) ohne weitere Extensionsreaktion. Das Diagnosetemplat ist unterhalb jedes Spektrums angegeben und die beobachteten/erwarteten Molekülmassen sind in Klammern angeführt. -
36 zeigt denjenigen Teil der Sequenz von pRFc1-DNA, der als Templat für die PCR-Amplifikation von unmodifizierten und 7-Deazapurin-enthaltenden 99-mer und 200-mer Nukleinsäuren verwendet wurde, sowie die Sequenzen der 19-mer Primer und der zwei 18-mer reversen Primer. -
37 zeigt denjenigen Teil der Nukleotidsequenz von M13mp18 RFI-DNA, der für die PCR-Amplifikation von unmodifizierten und 7-Deazapurin-enthaltenden 103-mer Nukleinsäuren verwendet wurde. Ebenfalls gezeigt sind die Nukleotidsequenzen der in der PCR verwendeten 17-mer Primer. -
38 zeigt das Ergebnis einer Polyacrylamidgelelektrophorese von PCR-Produkten, die für eine MALDI-TOF MS Analyse gereinigt und aufkonzentriert worden waren. M: Längenmarker; Bahn 1: 7-Deazapurin-enthaltendes 99-mer PCR-Produkt; Bahn 2: unmodifiziertes 99-mer; Bahn 3: 7-Deazapurin-enthaltendes 103-mer; und Bahn 4: unmodifiziertes 103-mer PCR-Produkt. -
39 : ein Autoradiogramm einer Polyacrylamidgelelektrophorese von PCR-Reaktionen, die mit 5'-[32P]-markierten Primern 1 und 4 durchgeführt wurden. Bahnen 1 und 2: unmodifiziertes und 7-Deazapurin-modifiziertes 103-mer PCR-Produkt (53321 und 23520 Zählimpulse); Bahnen 3 und 4: unmodifiziertes und 7-Deazapurin-modifiziertes 200-mer (71123 und 39582 Zählimpulse); und Bahnen 5 und 6: unmodifiziertes und 7-Deazapurin-modifiziertes 99-mer (173216 und 94400 Zählimpulse). -
40 : a) MALDI-TOF Massenspektrum der unmodifizierten 103-mer PCR-Produkte (Summe aus zwölf Einzelspektren (singls shot)). Der Mittelwert der für die zwei Einzelstränge berechneten Massen (31768 u und 31759 u) beträgt 31763 u. Massenauflösung: 18. b) MALDI-TOF Massenspektrum von 7-Deazapurin-enthaltendem 103-mer PCR-Produkt (Summe aus drei Einzelspektren). Der Mittelwert der für die zwei Einzelstränge berechneten Massen (31727 u und 31719 u) beträgt 31723 u. Massenauflösung: 67. -
41 : a) MALDI-TOF Massenspektrum des unmodifizierten 99-mer PCR-Produkts (Summe aus zwanzig Einzelspektren). Werte der für die zwei Einzelstränge berechneten Massen: 30261 u und 30794 u. b) MALDI-TOF Massenspektrum des 7-Deazapurin-enthaltenden 99-mer PCR-Produkts (Summe aus zwölf Einzelspektren). Werte der für die zwei Einzelstränge berechneten Massen: 30224 u und 30750 u. -
42 : a) MALDI-TOF Massenspektrum des unmodifizierten 200-mer PCR-Produkts (Summe aus 30 Einzelspektren). Der Mittelwert der für die zwei Einzelstränge berechneten Massen (61873 u und 61595 u) beträgt 61734 u. Massenauflösung: 28. b) MALDI-TOF Massenspektrum von 7-Deazapurin-enthaltendem 200-mer PCR-Produkt (Summe aus 30 Einzelspektren). Der Mittelwert der für die zwei Einzelstränge berechneten Massen (61772 u und 61514 u) beträgt 61643 u. Massenauflösung: 39. -
43 : a) MALDI-TOF Massenspektrum von 7-Deazapurin-enthaltendem 100-mer PCR-Produkt mit ribomodifizierten Primern. Der Mittelwert der für die zwei Einzelstränge berechneten Massen (30529 u und 31095 u) beträgt 30812 u. b) MALDI-TOF Massenspektrum des PCR-Produkts nach hydrolytischer Primerabspaltung. Der Mittelwert der für die zwei Einzelstränge berechneten Massen (25104 u und 25229 u) beträgt 25167 u. Der Mittelwert der abgespaltenen Primer (5437 u und 5918 u) beträgt 5677 u. -
44A –D zeigt das MALDI-TOF Massenspektrum der vier Sequenzleitern, welche von einem 39-mer Templat (SEQ ID Nr. 13) erhalten wurden, das über eine 3'-Biotinylierung an Streptavidinkügelchen immobilisiert worden war. Für die Sequenzierung wurde ein 14-mer Primer (SEQ ID Nr. 14) verwendet. -
45 zeigt ein MALDI-TOF Massenspektrum einer Festphasensequenzierung eines 78-mer Templats (SEQ ID Nr. 15), das über eine 3'-Biotinylierung an Streptavidinkügelchen immobilisiert worden war. Für die Sequenzierung wurden ein 18-mer Primer (SEQ ID Nr. 16) und ddGTP verwendet. -
46 zeigt ein Schema, worin doppelsträngige DNA-Sonden mit Einzelstrangüberhang spezifische DNA-Template einfangen und auch als Primer zur Festphasensequenzierung dienen. -
47A –D zeigt ein MALDI-TOF Massenspektrum, das erhalten wurde von einem 5'-Fluoreszenz-markierten 23-mer (SEQ ID Nr. 19), annealt an ein 3'-biotinyliertes 18-mer (SEQ ID Nr. 20), wobei ein Überhang von 5 Basen verbleibt, der ein 15-mer Templat (SEQ ID Nr. 21) einfing. -
48 zeigt ein Stapelfluorogramm der gleichen Produkte, welche aus der in35 beschriebenen Reaktion erhalten wurden, jedoch auf einer herkömmlichen DNA-Sequenziervorrichtung gefahren. - Ausführliche Beschreibung der Erfindung
- Im Allgemeinen stellt die vorliegende Erfindung massenspektrometrische Verfahren zum Nachweis einer besonderen Nukleinsäuresequenz in einer biologischen Probe bereit. Wie hierin verwendet bezeichnet der Begriff ”biologische Probe” jedes aus einer lebenden Quelle (z. B. Mensch, Tier, Pflanze, Bakterium. Pilz, Protist, Virus) erhaltene Material. Zur Verwendung in der Erfindung sollte die biologische Probe ein Nukleinsäuremolekül enthalten. Beispiele geeigneter biologischer Proben zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung umfassen: feste Materialien (z. B. Gewebe, Zellpellets, Biopsien) und biologische Fluide (z. B. Urin, Blut, Speichel, Fruchtwasser, Mundwasser).
- Nukleinsäuremoleküle können aus einer besonderen biologischen Probe unter Verwendung einer Reihe von Verfahren isoliert werden, die in der Technik gut bekannt sind, wobei das besonders ausgewählte Isolierungsverfahren für die besondere biologische Probe geeignet ist. Beispielsweise können Frier-Auftau- und alkalische Lyseverfahren geeignet sein um Nukleinsäuremoleküle aus festen Materialien zu erhalten; Wärme und alkalische Lyseverfahren können geeignet sein um Nukleinsäuremoleküle aus Urin zu erhalten, und Proteinase K-Extraktion kann verwendet werden, um Nukleinsäure aus Blut zu erhalten (Rolff, A. et al., PCR: Clinical Diagnostics and Research, Springer (1994)).
- Um eine geeignete Menge an Nukleinsäuremolekülen zu erhalten, mit denen eine Massenspektrometrie durchgeführt werden soll, kann eine Amplifikation erforderlich sein. Beispiele geeigneter Amplifikationsverfahren zur Verwendung in der Erfindung umfassen: Klonierung (Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989); Polymerasekettenreaktion (PCR) (C. R. Newton and A. Graham, PCR, BIOS Publishers, 1994); Ligasekettenreaktion (LCR) (Wiedmann, M. et al. (1994), PCR Methods Appl. Vol. 3, Seiten 57–64; F. Barany, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 189–93 (1991)), Strangumordnungsamplifikation (SDA) (G. Terrance Walker et al., Nucleic Acids Res. 22, 2670–77 (1994)) und Variationen wie etwa RT-PCR (Higuchi et al., Bio/Technology 11: 1026–1030 (1993)); allelspezifische Amplifikation (ASA) und Verfahren auf Basis von Transkription.
- Um die massenspektrometrische Analyse zu vereinfachen kann ein Nukleinsäuremolekül, das eine nachzuweisende Nukleinsäuresequenz enthält, auf einem festen Träger immobilisiert werden. Beispiele von geeigneten festen Trägern umfassen Kügelchen (z. B. Silikagel, Glas mit kontrollierter Porengröße, Magnetkügelchen, Sephadex/Sepharose, Cellulose), ebene Flächen oder Chips (z. B. Glasfaserfilter, Glasflächen, Metallflächen (Stahl, Gold, Silber, Aluminium, Kupfer und Silizium), Kapillaren, Kunststoff (z. B. Polyethylen, Polypropylen, Polyamid, Polyvinylidendifluorid-Membranen oder -Mikrotiterplatten)); oder Nadeln oder Kämme aus ähnlichen Materialien, umfassend Kügelchen oder ebene Flächen, oder Kügelchen, die in Vertiefungen in ebenen Flächen positioniert sind, wie etwa Wafer (z. B. Siliziumwafer).
- Eine Immobilisierung kann beispielsweise bewirkt werden auf Basis von Hybridisierung zwischen einer Einfangnukleinsäuresequenz, welche bereits auf dem Träger immobilisiert worden ist, und einer komplementären Nukleinsäuresequenz, die ebenfalls in dem Nukleinsäuremolekül vorhanden ist, welches die nachzuweisende Nukleinsäuresequenz enthält (
1A ). Damit die Hybridisierung zwischen den komplementären Nukleinsäuremolekülen nicht durch den Träger behindert wird, kann die Einfangnukleinsäure eine Abstandhalterregion mit einer Länge von mindestens etwa fünf Nukleotiden zwischen dem festen Träger und der Einfangnukleinsäuresequenz umfassen. Der gebildete Doppelstrang wird unter dem Einfluss des Laserimpulses gespalten, und die Desorption kann initiiert werden. Die an den festen Träger gebundene Basissequenz mittels natürlich vorkommender Oligoribo- oder Oligodeoxyribonukleotide dargestellt sein, sowie mittels Analoga (z. B. Thio-modifiziertes Phosphodiester- oder Phosphotriester-Grundgerüst) oder unter Verwendung von Oligonukleotidmimetika wie etwa PNA-Analoga (siehe z. B. Nielsen et al., Science 254, 1497 (1991)), welche die Basissequenz gegenüber enzymatischem Abbau unempfindlicher machen und damit die Gesamtstabilität der an den festen Träger gebundenen Basissequenz erhöhen. - Alternativ kann eine Targetdetektionsstelle direkt an einen festen Träger gebunden werden, über eine reversible oder irreversible Bindung zwischen einer geeigneten Funktionalität (L') auf dem Targetnukleinsäuremolekül (T) und einer geeigneten Funktionalität (L) auf dem Einfangmolekül (
1B ). Eine reversible Bindung kann derart sein, dass sie unter den Bedingungen der Massenspektrometrie gespalten wird (d. h. eine durch Strahlung spaltbare Bindung wie etwa ein Ladungstransferkomplex oder eine labile Bindung, die zwischen relativ stabilen organischen Resten gebildet wird). Weiterhin kann die Bindung derart gebildet werden, so dass L' eine quaternäre Ammoniumgruppe ist, wobei dann die Oberfläche des festen Trägers bevorzugt negative Ladungen aufweist, die das negativ geladene Nukleinsäuregrundgerüst abstoßen und somit die zur Analyse durch ein Massenspektrometer erforderliche Desorption erleichtern. Desorption erfolgt entweder durch die von dem Laserimpuls erzeugte Wärme und/oder in Abhängigkeit von L durch spezifische Absorption von Laserenergie in Resonanz mit dem Chromphor von L'. - Als Beispiele kann die L-L' Chemie vom Typ her eine Disulfidbindung sein (chemisch spaltbar, beispielsweise durch Mercaptoethanol oder Dithioerythrol), ein Biotin/Streptavidin-System, ein heterobifunktionelles Derivat einer Tritylethergruppe (Köster et al., ”A Versstile Acid-Labile Linker for Modification of Synthetic Biomolecules”, Tetrahedron Letters 31, 7095 (1990)), das unter schwach sauren Bedingungen sowie unter den Bedingungen der Massenspektrometrie gespalten werden kann, eine Lävulingruppe, die unter nahezu neutralen Bedingungen mit einem Hydrazinium/Acetat-Puffer gespalten werden kann, eine Arginin-Arginin- oder Lysin-Lysin-Bindung, die durch ein Endopeptidaseenzym wie etwa Trypsin spaltbar ist, oder eine Pyrophosphatbindung, die durch eine Pyrophosphatase spaltbar ist, oder eine Ribonukleotidbindung innerhalb der Oligodeoxynukleotidsequenz, die beispielsweise durch eine Ribonuklease oder Alkali spaltbar ist.
- Die Funktionalitäten L und L' können auch einen Ladungstransferkomplex bilden und dadurch die temporäre L-L'-Bindung ausbilden. Da in vielen Fällen die ”Ladungstransferbande” mittels UV/vis-Spektrometrie bestimmt werden kann (siehe z. B. Organic Charge Transfer Complexes von R. Foster, Academic Press, 1969), kann die Laserenergie auf die entsprechende Energie der Ladungstransferwellenlänge abgestimmt werden und somit eine spezifische Desorption vom festen Träger weg initiiert werden. Der Fachmann wird erkennen, dass eine Reihe von Kombination dafür in Frage kommen, und dass die Donorfunktionalität entweder am festen Träger vorliegen kann oder an das nachzuweisende Nukleinsäuremolekül gekoppelt sein kann, oder umgekehrt.
- In einem nochmals weiteren Ansatz kann eine reversible L-L'-Bindung gebildet werden, indem homolytisch relativ stabile Reste gebildet werden. Unter dem Einfluss des Laserimpulses erfolgen Desorption (wie vorstehend diskutiert) sowie Ionisierung an der Position des Rests. Der Fachmann wird erkennen, dass andere organische Reste ausgewählt werden können, und dass bezüglich der Dissoziationsenergien, die erforderlich sind um die Bindung zwischen ihnen homolytisch zu spalten, eine entsprechende Laserwellenlänge ausgewählt werden kann (siehe z. B. Reactive Molecules von C. Wentrup, John Wiley & Sons, 1984).
- Eine Verankerungsfunktion L' kann auch in eine Targeteinfangsequenz eingeführt werden, indem während eines Amplifikationsverfahrens, wie etwa PCR (
4 ), LCR (5 ), oder Transkriptionsamplifikation (6A ), geeignete Primer verwendet werden. - Vor der massenspektrometrischen Analyse kann es nützlich sein Nukleinsäuremoleküle zu ”konditionieren”, beispielsweise um die für die Verdampfung erforderliche Laserenergie zu verringern und/oder um Fragmentierung zu minimieren. Eine Konditionierung wird bevorzugt durchgeführt, während eine Targetdetektionsstelle immobilisiert ist. Ein Beispiel einer Konditionierung ist eine Modifikation des Phosphodiestergrundgerüsts des Nukleinsäuremoleküls (z. B. Kationenaustausch), was nützlich sein kann um eine Peakverbreiterung aufgrund einer Heterogenität der pro Nukleotideinheit gebundenen Kationen zu beseitigen. Durch in Kontakt Bringen eines Nukleinsäuremoleküls mit einem Alkylierungsmittel, wie etwa Alkyljodid, Jodacetamid, β-Jodethanol oder 2,3-Epoxy-1-propanol können die Monothiophosphodiesterbindungen eines Nukleinsäuremoleküls in eine Phosphotriesterbindung überführt werden. Ebenso können Phosphodiesterbindungen unter Verwendung von Trialkylsilylchloriden in ungeladene Derivate überführt werden. Weitere Konditionierung umfasst das Einführen von Nukleotiden, welche die Empfindlichkeit auf Depurinierung (Fragmentierung während MS) verringern, wie etwa von N7- oder N9-Deazapurinnukleotiden, oder von RNA-Baublöcken, oder die Verwendung von Oligonukleotidtriestern oder das Einführen von Phosphorothioatfunktionen, die alkyliert sind, oder die Verwendung von Oligonukleotidmimetika wie etwa PNA.
- Für bestimmte Anwendungen kann es nützlich sein, mehr als einen (mutierten) Locus auf einem besonderen eingefangenen Nukleinsäurefragment (auf einem Punkt einer Anordnung) gleichzeitig nachzuweisen, oder es kann nützlich sein, unter Verwendung von Oligonukleotid- oder Oligonukleotidmimetikaanordnungen auf verschiedenen festen Trägern eine parallele Bearbeitung durchzuführen. Ein ”Multiplexverfahren” kann durch mehrere unterschiedliche Methodiken erreicht werden. Beispielsweise können mehrere Mutationen gleichzeitig auf einer Targetsequenz nachgewiesen werden durch Verwendung entsprechender Detektormoleküle (Sonden) (z. B. Oligonukleotide oder Oligonukleotidmimetika). Die Molekülmassendifferenzen zwischen den Detektoroligonukleotiden D1, D2 und D3 müssen jedoch groß genug sein, so dass ein gleichzeitiger Nachweis (”Multiplexverfahren) möglich ist. Dies kann bewirkt werden durch die Sequenz selbst (Zusammensetzung oder Länge), oder durch Einführen von Massen-modifizierenden Funktionalitäten M1–M3 in das Detektoroligonukleotid (
2 ). - Massen-modifizierende Reste können beispielsweise an das 5'-Ende des Oligonukleotids (M1), an die Nukleobase (oder Basen) (M2, M7), an das Phosphatgrundgerüst (M3), und an die 2'-Position des Nukleosids (von Nukleosiden) (M4, M6), oder/und an die terminale 3'-Position (M5) gebunden werden. Beispiele von Massen-modifizierenden Resten umfassen beispielsweise ein Halogen, eine Azidgruppe, oder eine Gruppe vom Typ-XR, worin X eine Verknüpfungsgruppe ist und R eine Massen-modifizierende Funktionalität ist. Die Massen-modifizierende Funktionalität kann somit verwendet werden, um definierte Masseninkremente in das Oligonukleotidmolekül einzuführen.
- Hier kann der Massen-modifizierende Rest M an die Nukleobase, M2 (bei c7-Deazanukleosiden auch an C-7, M7), an die Triphosphatgruppe am alpha-Phosphat, M3, oder an die 2'-Position des Zuckerrings des Nukleosidtriphosphats, M4 und M6, gebunden werden. Weiterhin kann die Massen-modifizierende Funktionalität derart zugefügt werden, so dass sie einen Kettenabbruch bewirkt, wie etwa durch Bindung an die 3'-Position des Zuckerrings des Nukleosidtriphosphats, M5. Für den Fachmann ist ersichtlich, dass viele Kombinationen den Zweck der Erfindung gleichwertig erfüllen. Gleichermaßen wird der Fachmann erkennen, dass kettenverlängernde Nukleosidtriphosphate ebenfalls in einer ähnlichen Weise Massen-modifiziert werden können, mit zahlreichen Variationen und Kombinationen hinsichtlich Funktionalität und Bindepositionen.
- Ohne den Umfang der Erfindung zu begrenzen kann die Massenmodifikation M für X in XR eingeführt werden, sowie unter Verwendung von Oligo-/Polyethylenglykolderivaten für R. Das Massen-modifizierende Inkrement ist in diesem Fall 44, d. h. fünf verschiedene Massen-modifizierte Spezies können erzeugt werden, indem m von 0 bis 4 variiert wird, wodurch dem Nukleinsäuremolekül (z. B. dem Detektoroligonukleotid (D) bzw. den Nukleosidtriphosphaten (
6C )) somit Masseneinheiten von 45 (m = 0), 89 (m = 1), 133 (m = 2), 177 (m = 3) und 221 (m = 4) zugefügt werden. Die Oligo/Polyethylenglykole können auch mit einem Niederalkyl wie etwa Methyl, Ethyl, Propyl, Isopropyl, t-Butyl und dergleichen monoalkyliert sein. Eine Auswahl von Verknüpfungsfunktionalitäten X wird ebenfalls erläutert. Andere Chemie kann für die Massen-modifizierten Verbindungen verwendet werden, wie beispielsweise die vor kurzem in Oligonucleotides and Analogues. A Practical Approach, Hrsg. F. Eckstein, IRL Press, Oxford, 1991 beschriebenen. - In einer nochmals weiteren Ausführungsform können eine Reihe von von Oligo/Polyethylenglykolen verschiedenen Massen-modifizierenden Funktionalitäten R ausgewählt und über geeignete Verknüpfungschemie X gebunden werden. Eine einfache Massenmodifikation kann erreicht werden durch Austausch von H gegen Halogene wie etwa F, Cl, Br und/oder I, oder gegen Pseudohalogene wie etwa SCN, NCS, oder durch Verwendung von verschiedenen Alkyl-, Aryl- oder Aralkylresten, wie etwa Methyl, Ethyl, Propyl, Isopropyl, t-Butyl, Hexyl, Phenyl, substituiertem Phenyl, Benzyl, oder funktionellen Gruppen wie etwa CH2F, CHF2, CF3, Si(CH3)3, Si(CH3)2(C2H5), Si(CH3)(C2H5)2, Si(C2H5)3. Eine nochmals weitere Massenmodifikation kann erreicht werden durch Anbringen von Homo- oder Heteropeptiden an dem Nukleinsäuremolekül (z. B. Detektor (D)) oder an Nukleosidtriphosphaten. Ein Beispiel, das zur Erzeugung von Massen-modifizierten Spezies mit einem Masseninkrement von 57 geeignet ist, ist das Anbringen von Oligoglycinen, z. B. werden Massenmodifikationen von 74 (r = 1, m = 0), 131 (r = 1, m = 2), 188 (r = 1, m = 3), 245 (r = 1, m = 4) erreicht. Einfache Oligoamide können ebenfalls verwendet werden z. B. sind Massenmodifikationen von 74 (r = 1, m = 0), 88 (r = 2, m = 0), 102 (r = 3, m = 0), 116 (r = 4, m = 0) erreichbar. Für den Fachmann wird klar ersichtlich sein, dass es zusätzlich zu den vorstehend erwähnten zahlreiche Möglichkeiten gibt.
- Wie hierin verwendet bezeichnet der Index 0–i gleich i + 1 Massen-differenzierte Nukleotide, Primer oder Markierungen. In manchen Fällen kann der Index 0 eine nicht modifizierte Spezies eines besonderen Recktanten bezeichnen, und der Index i kann die i-te Massen-modifizierte Spezies dieses Recktanten bezeichnen. Wenn beispielsweise mehr als eine Nukleinsäurespezies gleichzeitig nachgewiesen werden sollen, dann können +1 unterschiedliche Massen-modifizierte Detektoroligonukleotide (D0, D1, ..., Di) verwendet werden, um jede Spezies Massen-modifizierter Detektoroligonukleotide (D) von den anderen durch Massenspektrometrie zu unterscheiden.
- Unterschiedliche Massen-modifizierte Detektoroligonukleotide können verwendet werden, um gleichzeitig alle möglichen Varianten/Mutanten nachzuweisen (
6B ). Alternativ können alle vier Basenpermutationen an einer Mutationsstelle nachgewiesen werden, indem ein Detektoroligonukleotid derart konstruiert und positioniert wird, dass es als ein Primer für eine DNA/RNA-Polymerase dient (6C ). Massenmodifikationen können beispielsweise auch während des Amplifikationsverfahrens eingeführt werden. -
3 zeigt ein unterschiedliches Multiplexdetektionsformat, bei dem eine Differenzierung erreicht wird durch Verwendung unterschiedlicher spezifischer Einfangsequenzen, die positionsspezifisch auf einer ebenen Oberfläche (z. B. einer ”Chip-Anordnung”) immobilisiert sind. Wenn unterschiedliche Targetsequenzen T1–Tn vorhanden sind, Wechselwirken deren Targeteinfangstellen TCSI–TCSn spezifisch mit komplementären, immobilisierten Eingangsequenzen C1–Cn. Der Nachweis wird erreicht durch Verwendung geeignet massendifferenzierter Detektoroligonukleotide D1–Dn, welche entweder aufgrund ihrer Sequenzen oder durch Massen-modifizierende Funktionalitäten M1–Mn massendifferenziert sind. - Bevorzugte Massenspektrometerformate zur Verwendung in der Erfindung sind Matrix-unterstützte Laserdesorption/Ionisation (MALDI), Elektrospray (ES), Ionencyclotronresonanz (ICR) und Fourier-Transform. Für ES werden die in Wasser oder einem flüchtigen Puffer aufgelösten Proben entweder kontinuierlich oder diskontinuierlich in eine bei Atmosphärendruck gehaltene Ionisationsschnittstelle (API, atmospheric pressure ionization interface) eingespritzt und danach durch einen Quadrupol massenanalysiert. Die Erzeugung zahlreicher Ionenpeaks, welche unter Verwendung von ES Massenspektrometrie erhalten werden können, kann die Genauigkeit der Massenbestimmung erhöhen. Noch detailliertere Information über die spezifische Struktur kann unter Verwendung einer MS/MS Quadrupol-Konfiguration erhalten werden.
- Bei MALDI Massenspektrometrie können verschiedene Massenanalysatoren verwendet werden, z. B. Magnetsektor/Magnetablenkungsinstrumente in einfachem oder dreifachem Quadrupolmodus (MS/MS), Fourier-Transform und Flugzeit (TOF) Konfigurationen, wie in der Massenspektrometrietechnik bekannt. Für das Desorption/Ionisationsverfahren können zahlreiche Matrix/Laser-Kombinationen verwendet werden. Ionenfalle- und Reflektron-Konfigurationen können ebenfalls verwendet werden.
- Die vorstehend beschriebenen massenspektrometrischen Verfahren können beispielsweise dazu verwendet werden, eine der mehr als 3000 derzeit bekannten Erbkrankheiten (z. B. Hämophilien, Thalassämien, Duchenne Muskeldystrophie (DMD), Huntington Krankheit (HD), Alzheimer Krankheit und Mukoviszidose (CF)) zu diagnostizieren oder zu identifizieren.
- Das nachfolgende Beispiel 3 stellt ein massenspektrometrisches Verfahren bereit zum Nachweis einer Mutation (ΔF508) des Transmembranleitfähigkeitregulatorgens bei Mukoviszidose (CFTR, cystic fibrosis transmembrane conductance regulator), das sich lediglich um drei Basenpaare (900 Dalton) vom Wildtyp des CFTR-Gens unterscheidet. Wie weiter in Beispiel 3 beschrieben, beruht der Nachweis auf einer Eintopfreaktion einer kompetitiven Einzelbasenextension eines Oligonukleotids (COSBE, competitive oligonucleotide singls base extension) unter Verwendung eines Primerpaars deren 3'-endständige Base entweder zu dem normalen oder dem mutierten Allel komplementär ist. Nach Hybridisierung und Zugabe einer Polymerase und des Nukleosidtriphosphats eine Base stromabwärts werden nur diejenigen Primer extendiert, die korrekt annealt sind (d. h. kein 3'-endständiger Mismatch); die Produkte werden anhand von Molekülmassenverschiebungen aufgelöst, wie mittels Matrix-unterstützter Laserdesorption/Ionisation-Flugzeit-Massenspektrometrie bestimmt. Für den Mukoviszidose ΔF508 Polymorphismus erzeugen 28-mer ”normale” (N) und 30-mer ”mutierte” (M) Primer 29- bzw. 31-mere für N- bzw. M-Homozygote, und beide für Heterozygote. Da die Primer- und Produktmolekülmassen relativ gering sind (< 10 kDa), und die Massendifferenz zwischen ihnen mindestens die einer einzelnen ~300 Da Nukleotideinheit ist, ist ein Gerät mit niedriger Auflösung für derartige Messungen geeignet.
- Zusätzlich zu Genmutationen, die in einer Erbkrankheit resultieren, sind bestimmte angeborene Störungen das Ergebnis von Chromosomenabnormalitäten, wie etwa Trisomie 21 (Down Syndrom), Trisomie 13 (Patau Syndrom), Trisomie 18 (Edward Syndrom), Monosomie X (Turner Syndrom), und andere Aneuploidien der Geschlechtschromosomen wie etwa das Klienfelter Syndrom (XXY).
- Weiterhin gibt es zunehmende Hinweise, dass bestimmte DNA-Sequenzen ein Individuum für eine Reihe von Erkrankungen, wie etwa Diabetes, Arteriosklerose, Fettleibigkeit, verschiedene Autoimmunerkrankungen und Krebs (z. B. Kolonkarzinom, Brust-, Eierstock-, Lungenkrebs), prädisponieren können; Chromosomenabnormalität (pränatal oder ostnatal); oder eine Prädispoaition für eine Krankheit oder Störung (z. B. Fettleibigkeit, Artherosklerose, Krebs). Der Nachweis von ”DNA-Fingerabdrücken”, z. B. Polymorphismen wie etwa ”Mikrosatellitsequenzen” ist auch geeignet, um die Identität oder Erbanlagen (z. B. Vaterschaft oder Mutterschaft) nachzuweisen.
- Das nachfolgende Beispiel 4 stellt ein massenspektrometrisches Verfahren zur Identifizierung einer der drei verschiedenen Isoformen von Humanapolipoprotein E bereit, welche von den Allelen E2, E3 und E4 kodiert werden. Hier können die Molekülmassen der nach Verdau mit geeigneten Restriktionsendonukleasen erhaltenen DNA-Fragmente verwendet werden um die Gegenwart einer Mutation nachzuweisen.
- In Abhängigkeit von der biologischen Probe kann die Diagnose auf eine Erbkrankheit, Chromosomenaneuploidie oder genetische Veranlagung entweder prä- oder postnatal durchgeführt werden.
- Viren, Bakterien, Pilze und andere infektiöse Organismen enthalten charakteristische Nukleinsäuresequenzen, welche von den in der Wirtszelle vorhandenen Sequenzen verschieden sind. Der Nachweis oder die Quantifizierung von Nukleinsäuresequenzen, die für den infektiösen Organismus spezifisch sind, ist für die Diagnose oder Überwachung einer Infektion wichtig. Beispiele für krankheitserregende Viren, die Menschen und Tiere infizieren, und die durch das offenbarte Verfahren nachgewiesen werden können, umfassen: Retroviridae (z. B. humane Immundefizienzviren, wie etwa HIV-1 (auch bezeichnet als HTLV-III, LAV oder HTLV-III/LAV, siehe Ratner, L., et al., Nature, Vol. 313, Seiten 227–284 (1985); Wain Hobson, S., et al., Cell, Vol. 40, Seiten 9–17 (1985)); HIV-2 (siehe Guyader et al., Nature, Vol. 328, Seiten 662–669 (1987);
Europäische Patentveröffentlichung Nr. 0 269 520 ; Chakraborti et al., Nature, Vol. 328, Seiten 543–547 (1987); undEuropäische Patentanmeldung Nr. 0 655 501 ); und andere Isolate, wie etwa HIV-LP (Internationale Veröffentlichung Nr.WO 94/00562 - Beispiele von infektiösen Bakterien umfassen: Helicobacter pyloris, Borelia burgdorferi, Legionella Pneumophilia, Mycobacteria Spezies (z. B. M. tuberculosis, M. avium, M. intracelulare, M. kansaii, M. gordonae), Staphylococcus aureus, Neisseria gonorrhoeae, Neisseria meningitidis, Listeria monocytogenes, Streptococcus pyogenes (Gruppe A Streptococcus), Streptococcus agalactiae (Gruppe B Streptococcus), Streptococcus (Viridansgruppe), Streptococcus faecalis, Streptococcus bovis, Streptococcus (anaerobe Spezies), Streptococcus pneumoniae, pathogene Campylobacter Spezies, Enterococcus Spezies, Haemophilus influenzae, Bacillus antracis, Corynebakterium diphtheriae, Corynebakterium Spezies, Erysipelothrix rhusiopathiae, Clostridium perfringers, Clostridium tetani, Enterobacter aerogenes, Klebsiella pneumoniae, Pasturella multocida, Bacteroides Spezies, Fusobacterium nucleatum, Streptobacillus moniliformis, Treponema pallidium, Treponema pertenue, Leptospira und Actinomyces israelli.
- Beispiele von infektiösen Pilzen umfassen: Cryptococcus neoformans, Histoplasma capsulatum, Coccidioides immitis, Blastomyces dermatitidis, Chlamydia trachomatis, Candida albicans. Andere infektiöse Organismen (d. h. Protisten) umfassen: Plasmodium falciparum und Toxoplasma gondii.
- Das nachfolgende Beispiel 5 stellt eine geschachtelte PCR und ein auf einem Massenspektrometer beruhendes Verfahren bereit, die verwendet wurden um Hepatitis B-Virus-DNA (HBV) in Blutproben nachzuweisen. In ähnlicher Weise können andere in Blut vorkommende Viren (z. B. HIV-1, HIV-2, Hepatitis C-Virus (HCV), Hepatitis A-Virus (HAV) und andere Hepatitisviren (z. B. non-A-non-B Hepatitis, Hepatitis G, Hepatitis E), Cytomegalovirus und Herpex simplex-Virus (HSV)) auf Basis der hierin beschriebenen Verfahren jeweils alleine oder in Kombination nachgewiesen werden.
- Da eine Sequenz von etwa 16 Nukleotiden aus statistischen Gründen (sogar für ein Genom mit der Größe des Humangenoms) spezifisch ist, können relativ kurze Nukleinsäuresequenzen verwendet werden, um normale und defekte Gene in höheren Organismen nachzuweisen, und um infektiöse Mikroorganismen (z. B. Bakterien, Pilze, Protisten und Hefen) und Viren nachzuweisen. DNA-Sequenzen können auch als ein Fingerabdruck dienen, um verschiedene Individuen innerhalb derselben Spezies zu bestimmen (Thompson, J. S. and M. W. Thompson, Hrsg., Genetics in Medicine, W. B. Saunders Co., Philadelphia, PA (1986)).
- Ein Verfahren zum Nachweis einer Wildtypsequenz (Dwt) und/oder einer mutierten Sequenz (Dmut) in einem Targetnukleinsäuremolekül (T) ist in
1C gezeigt. Eine spezifische Einfangsequenz (C) ist über einen Abstandhalter (S) an einen festen Träger (SS) gebunden. Zusätzlich ist die Einfangsequenz derart ausgewählt, so dass sie spezifisch mit einer komplementären Sequenz auf der Targetsequenz (T) wechselwirkt, wobei die Targeteinfangstelle (TCS) durch Hybridisierung nachzuweisen ist. Wenn die Targetdetektionsstelle (TDS) jedoch eine Mutation X umfasst, welche die Molekülmasse erhöht oder erniedrigt, können mutierte TDS durch Massenspektrometrie vom Wildtyp unterschieden werden. Beispielsweise wäre für eine Insertion einer Adeninbase (dA) die Molekülmassendifferenz zwischen Dwt und Dmut etwa 314 Dalton. - Bevorzugt ist die Detektornukleinsäure (D) derart ausgelegt, so dass die Mutation in der Mitte des Moleküls vorliegt und die flankierenden Regionen sind kurz genug, so dass keine stabile Hybride gebildet würde, wenn das Wildtyp-Detektoroligonukleotid (Dwt) als eine Kontrolle mit der mutierten Targetdetektorsequenz in Kontakt gebracht wird. Die Mutation kann auch nachgewiesen werden, wenn das mutierte Detektoroligonukleotid (Dmut) mit der einen Match ausbildenden Base an der mutierten Position für die Hybridisierung verwendet wird. Wenn eine aus einer biologischen Probe erhaltene Nukleinsäure für die besondere Sequenz heterozygot ist (d. h. sowohl Dwt als auch Dmut enthält), binden sowohl Dwt als auch Dmut an den entsprechenden Strang und die Massendifferenz ermöglicht den gleichzeitigen Nachweis von Dwt und Dmut.
- Das erfindungsgemäße Verfahren nützt die bekannte Sequenzinformation über die Targetsequenz und bekannte Mutationsstellen. Dennoch können auch neue Mutationen nachgewiesen werden. Beispielsweise kann, wie in
8 gezeigt, ein Transkript eines aus einer biologischen Probe erhaltenen Nukleinsäuremoleküls unter Verwendung einer oder mehrerer Nukleasen spezifisch verdaut werden, und die Fragmente an einem festen Träger, der die entsprechenden komplementären Nukleinsäuresequenzen aufweist, eingefangen werden. Der Nachweis der Hybridisierung und der Molekülmassen der eingefangenen Targetsequenzen liefert Information darüber, ob und an welcher Position in einem Gen eine Mutation vorhanden ist. Alternativ kann DNA durch eine oder mehrere spezifische Endonukleasen gespalten werden, wobei ein Fragmentgemisch erhalten wird. Ein Vergleich der Molekülmassen von Fragmentgemischen von Wildtyp und Mutante führt zu einem Nachweis einer Mutation. - Die vorliegende Erfindung wird durch die nachfolgenden Beispiele näher erläutert, die nicht in irgendeiner Weise als einschränkend ausgelegt werden sollten. Die internationale Patentanmeldung mit der Veröffentlichungsnummer
WO 94/16101 WO 94/21822 - Beispiel 1 MALDI-TOF Desorption von Oligonukleotiden direkt auf festen Trägern
- 1 g CPG (Glas mit kontrollierter Porengröße, Controlled Pore Glass) wurde mit 3-(Triethoxysilyl)epoxypropan funktionalisiert, wobei OH-Gruppen auf der Polymeroberfläche gebildet werden. Eine Standard-Oligonukleotid-Synthese wurde mit 13 mg des OH-CPG an einem DNA-Synthesizer (Milligen, Model 7500) unter Verwendung von β-Cyanoethylphosphoamiditen (Köster et al., Nucleic Acids Res. 12, 4539 (1994)) und TAC N-Schutzgruppen (Köster et al., Tetrahedron 37, 362 (1981)) durchgeführt, wobei eine 3'-T5-50-mer Oligonukleotidsequenz synthetisiert wurde, bei der 50 Nukleotide zu einer ”hypothetischen” 50-mer Sequenz komplementär sind. T5 dient als Abstandhalter. Entfernung der Schutzgruppen mit gesättigtem Ammoniak in Methanol bei Raumtemperatur während 2 Stunden lieferte gemäß der Bestimmung der DMT-Gruppe ein CPG, das etwa 10 μMol 55-mer/g CPG enthielt. Dieses 55-mer diente als ein Templat für Hybridisierungen mit einem 26-mer (mit 5'-DMT-Gruppe) und einem 40-mer (ohne DMT-Gruppe). Das Reaktionsvolumen beträgt 100 μl und enthält etwa 1 nMol CPG-gebundenes 55-mer als Templat, eine äquimolare Menge Oligonukleotid in Lösung (26-mer oder 40-mer) in 20 mM Tris-HCl, pH 7,5, 10 mM MgCl2 und 25 mM NaCl. Das Gemisch wurde 10' bei 65°C erwärmt und während 30' auf 37°C abkühlen gelassen (Annealing). Oligonukleotid, das nicht an das Polymer-gebundene Templat hybridisiert hatte, wurde durch Zentrifugation und drei anschließende Wasch/Zentrifugationsschritte mit jeweils 100 μl eiskaltem 50 mM Ammoniumcitrat entfernt. Die Kügelchen wurden an Luft getrocknet und mit Matrixlösung (3-Hydroxypicolinsäure/10 mM Ammoniumcitrat in Acetonitril/Wasser 1:1) gemischt und mittels MALDI-TOF Massenspektrometrie analysiert. Die Ergebnisse sind in den
10 und11 gezeigt. - Beispiel 2 Elektrospray (ES) Desorption und Unterscheidung zwischen einem 18-mer und einem 19-mer
- DNA-Fragmente mit einer Konzentration von 50 pMol/μl in 2-Propanol/10 mM Ammoniumcarbonat (1/9, v/v) wurden gleichzeitig mittels eines Elektrospray Massenspektrometers analysiert.
- Die erfolgreiche Desorption und Unterscheidung zwischen einem 18-mer und einem 19-mer mittels Elektrospray Massenspektrometrie ist in
12 gezeigt. - Beispiel 3 Nachweis der Mukoviszidosemutation ΔF508 durch Einschritt- Dideoxyextension und Analyse mittels MALDI-TOF Massenspektrometrie
- MATERIALIEN UND METHODEN
- PCR-Amplifikation und Strangimmobilisierung
- Die Amplifikation wurde durchgeführt mit Primern, die für Exon 10 spezifisch waren, unter Verwendung von Standard-PCR-Bedingungen (30 Zyklen: 1' bei 95°C, 1' bei 55°C, 2' bei 72°C); der reverse Primer war 5' mit Biotin markiert und war säulengereinigt (Oligopurification Cartridge, Cruachem). Nach der Amplifikation wurden die PCR-Produkte durch Säulenauftrennung gereinigt (Qiagen Quickspin) und auf Streptavidin-beschichteten Magnetkügelchen (Dynabeads, Dynal, Norwegen) nach deren Standardprotokoll immobilisiert; DNA wurde unter Verwendung von 0,1 M NaOH denaturiert und mit 0,1 M NaOH, 1 × B + W Puffer und TE Puffer gewaschen, um den nicht biotinylierten Sense-Strang zu entfernen.
- COSBE Bedingungen
- Die ligierten Antisense-Strang enthaltenden Kügelchen wurden in 18 μl Reaktionsgemisch 1 (2 μl 10 x Taq Puffer, 1 μl (1 Einheit) Taq Polymerase, 2 μl 2 mM dGTP und 13 μl H2O) resuspendiert und vor Zugabe von Reaktionsgemisch 2 (100 ng jedes COSBE Primers) 5' bei 80°C inkubiert. Die Temperatur wurde auf 60°C erniedrigt und die Gemische wurden während eines 5' Annealing/Extensionszeitraums inkubiert; die Kügelchen wurden danach in 25 mM Triethylammoniumacetat (TEAA), gefolgt von 50 mM Ammoniumcitrat gewaschen.
- Primersequenzen
- Alle Primer wurden auf einem Perseptive Biosystems Expedite 8900 DNA-Synthesizer unter Verwendung herkömmlicher Phosphoramiditchemie (Sinha et al. (1984), Nucleic Acids Res. 12: 4539) synthetisiert. COSBE Primer (beide enthaltend einen gewollten Mismatch eine Base vor dem 3'-Terminus) waren diejenigen, die in einer früheren ARMS Studie verwendet worden waren (Ferrie et al. (1992), Am. J. Hum. Genet. 51: 251–262), außer dass vom 5'-Ende des normalen Primers zwei Basen entfernt wurden:
- Massenspektrometrie
- Nach dem Waschen wurden die Kügelchen in 1 μl 18 Mohm/cm H2O resuspendiert. Jeweils 300 nl Matrixlösung (Wu et al., 1993) (0,7 M 3-Hydroxypicolinsäure, 0,7 M zweibasisches Ammoniumcitrat in 1:1 H2O:CH3CN) und resuspendierte Kügelchen (Tang et al. (1995) Rapid Commun. Mass Spectrom 8: 727–730) wurden auf einem Probentarget gemischt und an Luft trocknen gelassen. Bis zu 20 Proben wurden punktförmig auf eine Probentargetscheibe aufgetragen, zum Einbringen in den Quellbereich eines nicht modifizierten Thermo Bioanalysis (früher Finnegan) Visions 2000 MALDI-TOF, der in einem Reflektronmodus mit 5 bzw. 20 kV auf der Target- bzw. Konversionsdynode betrieben wurde. Theoretische mittlere Molekülmassen (Mr(calc)) wurden aus Atomzusammensetzungen berechnet. Die vom Verkäufer gelieferte Software wurde verwendet um unter Verwendung externer Kalibrierung Peakschwerpunkte zu bestimmen; zur Korrektur für die ladungstragende Protonenmasse wurden davon 1,08 Da subtrahiert, um die im Text angegebenen Mr(exp) Werte zu ergeben.
- Schema
- Nach dem Annealing an das gebundene Templat werden den Primern N und M (8508,6 bzw. 9148,0 Da) dGTP angeboten; nur Primer mit der korrekten Watson-Crick-Basenpaarung an der variablen (V) Position werden von der Polymerase extendiert. Wenn V mit der 3'-terminalen Base von N eine Paarung ausbildet, wird somit N zu einem 8837,9 Da Produkt (N + 1) extendiert. Andererseits wird, wenn V korrekt an den M-Terminus gepaart vorliegt, M zu einem 9477,3 Da M + 1 Produkt extendiert.
- Ergebnisse
- Die
14 –18 zeigen die repräsentativen Massenspektren von COSBE Reaktionsprodukten. Bessere Ergebnisse wurden erhalten, wenn PCR-Produkte gereinigt wurden, bevor der biotinylierte Antisense-Strang gebunden wurde. - Beispiel 4 Unterscheidung von humanen Apolipoprotein E Isoformen durch Massenspektrometrie
- Apolipoprotein E (Apo E), eine Proteinkomponente von Lipoproteinen, spielt eine essentielle Rolle im Fettstoffwechsel. Es ist beispielsweise am Cholesterintransport, dem Metabolismus von Lipoproteinpartikeln, der Immunregulation und der Aktivierung einer Reihe von lipolytischen Enzymen beteiligt.
- Es gibt drei häufige Isoformen von humanem Apo E (kodiert von den Allelen E2, E3 und E4). Das häufigste ist das E3 Allel. Es ist gezeigt worden, dass das E2 Allel den Cholesteringehalt im Plasma senkt, und es kann daher eine Schutzwirkung gegen die Ausbildung von Atherosklerose haben. Schließlich ist die E4 Isoform mit erhöhten Cholesteringehalten korreliert worden, und vermittelt somit eine Prädisposition für Atherosklerose. Die Identität des Apo E Allels eines Individuums ist daher ein wichtiger Parameter für das Risiko der Ausbildung kardiovaskulärer Erkrankungen.
- Wie in
19 gezeigt, kann eine für Apolipoprotein E kodierende DNA-Probe von einem Individuum erhalten werden, amplifiziert werden (z. B. über PCR), und das PCR-Produkt kann unter Verwendung eines geeigneten Enzyms (z. B. Cfol) verdaut werden. Der erhaltene Restriktionsverdau kann danach durch eine Reihe von Mitteln analysiert werden. Wie in20 gezeigt, haben die drei Isotypen von Apolipoprotein E (E2, E3 und E4) unterschiedliche Nukleinsäuresequenzen und haben daher auch unterscheidbare Molekülmassenwerte. - Wie in
21A –C gezeigt, zeigen unterschiedliche Apolipoprotein E Genotypen unterschiedliche Restriktionsmuster in einem 3,5% MetPhor Agarosegel oder einem 12% Polyacrylamidgel. Wie in den22 und23 gezeigt, können die verschiedenen Apolipoprotein E Genotypen durch Massenspektrometrie auch genau und schnell nachgewiesen werden. - Beispiel 5 Nachweis von Hepatitis B-Virus in Serumproben
- MATERIALIEN UND METHODEN
- Probenvorbereitung
- Phenol/Chloroform Extraktion von viraler DNA und die Ethanolpräzipitation am Schluß wurden nach Standardprotokollen durchgeführt.
- Erste PCR
- Jede Reaktion wurde mit 5 μl der DNA-Präparation aus Serum durchgeführt. 15 pMol jedes Primers und 2 Einheiten Taq DNA-Polymerase (Perkin Elmer, Weiterstadt, Deutschland) wurden verwendet. Die Endkonzentration jedes dNTP betrug 200 μM, das Endvolumen der Reaktion war 50 μl. 10 × PCR Puffer (Perkin Elmer, Weiterstadt, Deutschland) enthielt 100 mM Tris-HCl, pH 8,3, 500 mM KCl, 15 mM MgCl2, 0,01% Gelatine (w/v). Primersequenzen
- Geschachtelte PCR
- Jede Reaktion wurde mit 1 μl der ersten Reaktion bzw. mit einer 1:10 Verdünnung der ersten PCR als Templat durchgeführt. 100 pMol jedes Primers, 2,5 U Pfu(exo-)DNA-Polymerase (Stratagene, Heidelberg, Deutschland), eine Endkonzentration jedes dNTP von 200 μM und 5 μl 10 × Pfu Puffer (200 mM Tris-HCl, pH 8,75, 100 mM KCl, 100 mM (NH4)2SO4, 20 mM MgSO4, 1% Triton X-100, 1 mg/ml BSA (Stratagene, Heidelberg, Deutschland)) wurden in einem Endvolumen von 50 μl verwendet. Die Reaktionen wurden in einem Thermocycler (OmniGene, MWG-Biotech, Ebersberg, Deutschland) unter Verwendung des folgenden Programms durchgeführt: 1 Minute bei 92°C, 1 Minute bei 60°C und 1 Minute bei 72°C, mit 20 Zyklen. Sequenz der Oligodeoxynukleotide (HPLC-gereinigt von MWG-Biotech, Ebersberg, Deutschland, bezogen):
- Reinigung von PCR-Produkten
- Zur Aufzeichnung jedes Spektrums wurde eine PCR, 50 μl, verwendet (durchgeführt wie vorstehend beschrieben). Die Reinigung wurde nach dem folgenden Verfahren durchgeführt: Ultrafiltration wurde unter Verwendung von Ultrafree-MC Filtrationseinheiten (Millipore, Eschborn, Deutschland) nach Herstellerangaben mit 20-minütiger Zentrifugation bei 8000 Umdrehungen pro Minute durchgeführt. 25 μl (10 μg/μl) Dynabeads (Dynal, Hamburg, Deutschland) wurden gemäß den Anweisungen des Herstellers präpariert und in 25 μl B/W Puffer (10 mM Tris-HCl, pH 7,5, 1 mM EDTA, 2 M NaCl) resuspendiert. Diese Suspension wurde zu den noch in der Filtrationseinheit vorliegenden PCR-Proben zugegeben, und das Gemisch wurde 15 Minuten bei Umgebungstemperatur unter sanftem Schütteln inkubiert. Die Suspension wurde in ein 1,5 ml Eppendorf-Röhrchen überführt, und der Überstand wurde mit Hilfe eines Magnetic Particle Collector, MPC, (Dynal, Hamburg, Deutschland) entfernt. Die Kügelchen wurden zweimal mit 50 μl 0,7 M Ammoniumcitratlösung, pH 8,0, gewaschen (der Überstand wurde jedes Mal unter Verwendung des MPC entfernt). Eine Spaltung von den Kügelchen kann durch Verwendung von Formamid bei 90°C bewirkt werden. Der Überstand wurde in etwa eine Stunde in einer Speedvac getrocknet und in 4 μl ultrareinem Wasser (MilliQ UF plus, Millipore, Eschborn, Deutschland) resuspendiert. Diese Präparation wurde für die MALDI-TOF MS Analyse verwendet.
- MALDI-TOF MS
- Ein halber Mikroliter der Probe wurde auf den Probenhalter pipettiert, danach sofort mit 0,5 μl Matrixlösung (0,7 M 3-Hydroxypicolinsäure, 50% Acetonitril, 70 mM Ammoniumcitrat) gemischt. Dieses Gemisch wurde bei Umgebungstemperatur trocknen gelassen und in das Massenspektrometer eingebracht. Alle Spektren wurden im positiven Ionenmodus aufgenommen, unter Verwendung eines Finnigan MAT Vision 2000 (Finnigan MAT, Bremen, Deutschland), der mit einem Reflektron (5 keV Ionenquelle, 20 keV Nachbeschleunigung) und einem 337 nm Stickstofflaser ausgestattet war. Kalibrierung wurde mit einem Gemisch eines 40-mers und eines 100-mers durchgeführt. Jede Probe wurde mit unterschiedlichen Laserenergien gemessen. In den Negativproben wurde das PCR-Produkt weder mit mehr noch mit weniger Laserenergie nachgewiesen. In den positiven Proben wurde das PCR-Produkt an unterschiedlichen Stellen des Auftragspunkts und auch mit variierenden Laserenergien nachgewiesen.
- Ergebnisse
- Ein geschachteltes PCR-System wurde für den Nachweis von HBV DNA in Blutproben verwendet, unter Verwendung von Oligonukleotiden, die komplementär zur c-Region des HBV-Genoms waren (Primer 1 beginnend an Kartierungsposition 1763, Primer 2 beginnend an Kartierungsposition 2032 des Komplementärstrangs), welche für das HBV Kernantigen (HBVcAg) kodiert. DNA wurde unter Verwendung von Standardprotokollen aus dem Serum von Patienten isoliert. Mit der DNA aus diesen Präparationen wurde eine erste PCR unter Verwendung eines ersten Satzes von Primern durchgeführt. Wenn HBV DNA in der Probe vorhanden war, wurde ein DNA-Fragment von 269 bp erzeugt.
- In der zweiten Reaktion wurden Primer verwendet, die zu einer Region innerhalb des in der ersten PCR erzeugten PCR-Fragments komplementär waren. Wenn HBV-verwandte PCR-Produkte in der ersten PCR vorhanden waren, wurde in dieser geschachtelten PCR ein DNA-Fragment von 67 bp erzeugt (siehe
25A ). Die Verwendung eines geschachtelten PCR-Systems zum Nachweis stellt eine hohe Empfindlichkeit bereit und dient auch als eine Spezifitätskontrolle für die externe PCR (Rolfs, A. et al., PCR: Clinical Diagnostics and Research, Springer, Heidelberg, 1992). Ein weiterer Vorteil besteht darin, dass die in der zweiten PCR erzeugte Menge an Fragmenten ausreichend groß ist, um einen unproblematischen Nachweis zu gewährleisten, obwohl Reinigungsverluste nicht vermieden werden können. - Die Proben wurden unter Verwendung von Ultrafiltration gereinigt um die Primer vor Immobilisierung auf Streptavidin-Dynabeads zu entfernen. Diese Reinigung wurde durchgeführt, da die kürzeren Primerfragmente aufgrund von sterischen Gründen in höherer Ausbeute auf den Kügelchen immobilisiert wurden. Die Immobilisierung wurde direkt auf der Ultrafiltrationsmembran durchgeführt, um Ausbeuteverluste aufgrund unspezifischer Absorption an der Membran zu vermeiden. Nach der Immobilisierung wurden die Kügelchen mit Ammoniumcitrat gewaschen, um einen Kationenaustausch durchzuführen (Pieles, U. et al (1993), Nucleic Acids Res. 21: 3191–3196). Die immobilisierte DNA wurden von den Kügelchen abgespalten unter Verwendung von 25% Ammoniak, was eine Spaltung von DNA von den Kügelchen in einer sehr kurzen Zeit ermöglicht, aber nicht zu einem Einbringen von Natriumkationen führt.
- Die geschachtelten PCR und die MALDI-TOF Analysen wurden ohne Kenntnis der Ergebnisse der serologischen Analyse durchgeführt. Aufgrund des nicht bekannten Virustiters wurde jede Probe der ersten PCR unverdünnt als Templat sowie in einer 1:10 Verdünnung verwendet.
- Probe 1 war einem Patienten mit chronisch aktiver HBV-Infektion entnommen worden, der in HBs- und HBe-Antigentests positiv, aber in einer Dot Blot Analyse negativ war. Probe 2 war eine Serumprobe eines Patienten mit einer aktiven HBV-Infektion und einer massiven Virämie, der in einer Dot Blot Analyse HBV-positiv war. Probe 3 war eine denaturierte Serumprobe, daher konnte keine serologische Analyse durchgeführt werden, aber ein erhöhter Gehalt von Transaminasen wurde nachgewiesen, was eine Leberkrankheit andeutet. In Autoradiographieanalyse (
24 ) war die erste PCR dieser Probe negativ. Nichtsdestoweniger gab es Hinweise auf eine HBV-Infektion. Diese Probe ist für eine MALDI-TOF Analyse von Interesse, da sie zeigt, dass sogar geringe Mengen an PCR-Produkten nach dem Reinigungsverfahren nachgewiesen können. Probe 4 stammte von einem Patienten, der von einer HBV-Infektion geheilt war. Die Proben 5 und 6 wurden Patienten mit einer chronisch aktiven HBV-Infektion entnommen. -
24 zeigt die Ergebnisse einer PAGE-Analyse der geschachtelten PCR-Reaktion. In den Proben 1, 2, 3, 5 und 6 ist ein PCR-Produkt deutlich erkennbar. In Probe 4 wurde kein PCR-Produkt erzeugt, sie ist nach serologischer Analyse in der Tat HBV-negativ. Negative und positive Kontrollen sind durch + bzw. – bezeichnet. In den Bahnen 2, 5, 6 und + sind Amplifikationsartefakte sichtbar, wenn unverdünntes Templat verwendet wurde. Diese Artefakte wurden nicht erzeugt, wenn das Templat in einer 1:10 Verdünnung verwendet wurde. In Probe 3 war ein PCR-Produkt nur nachweisbar, wenn das Templat nicht verdünnt worden war. Die Ergebnisse der PAGE-Analyse stimmen mit den Daten überein, die durch serologische Analyse erhalten worden waren, mit Ausnahme von Probe 3, wie vorstehend diskutiert. -
25A zeigt ein Massenspektrum eines geschachtelten PCR-Produkts von Probe Nr. 1, welches wie vorstehend beschrieben erzeugt und gereinigt worden war. Das Signal bei 20754 Da stellt das einzelsträngige PCR-Produkt dar (berechnet: 20735 Da, als die mittlere Masse beider Stränge des von den Kügelchen abgespaltenen PCR-Produkts). Die Massendifferenz zwischen berechneter und erhaltener Masse beträgt 19 Da (0,09%). Wie in25A gezeigt, erzeugte Probe Nr. 1 eine große Menge PCR-Produkt, was zu einem eindeutigen Nachweis führt. -
25B zeigt ein von Probe Nr. 3 erhaltenes Spektrum. Wie in24 abgebildet ist die Menge an PCR-Produkt, die mit dieser Probe erzeugt wurde, erheblich geringer als die von Probe Nr. 1. Nichtsdestoweniger ist das PCR-Produkt klar erkenntlich, mit einer Masse von 20751 Da (berechnet: 20735). Die Massendifferenz beträgt 16 Da (0,08%). Das in25C abgebildete Spektrum wurde von Probe Nr. 4 erhalten, die HBV-negativ ist (wie auch in24 gezeigt). Wie erwartet, konnten keine dem PCR-Produkt entsprechenden Signale nachgewiesen werden. Alle in25 gezeigten Proben wurden mit MALDI-TOF MS analysiert, wobei in allen HBV-positiven Proben, aber nicht in den HBV-negativen Proben, PCR-Produkt nachgewiesen wurde. Diese Ergebnisse wurden in mehreren unabhängigen Experimenten reproduziert. - Beispiel 6 Analyse von Ligasekettenreaktionsprodukten über MALDI-TOF Massenspektrometrie
- MATERIALIEN UND METHODEN
- Oligodeoxynukleotide
- Außer dem biotinylierten wurden alle anderen Oligonukleotide in einem 0,2 μMol Maßstab auf einem MilliGen 7500 DNA Synthesizer (Millipore, Bedford, MA, USA) unter Verwendung der β-Cyanoethylphosphoamidit-Methode (Sinha N. D. et al. (1984), Nucleic Acids Res. Vol. 12, Seiten 4539–4577) synthetisiert. Die Oligodeoxynukleotide wurden RP-HPLC-gereinigt und die Schutzgruppen nach Standardprotokollen entfernt. Das biotinylierte Oligodeoxynukleotid wurde (HPLC-gereinigt) von Biometra, Göttingen, Deutschland, bezogen. Sequenzen und berechnete Massen der verwendeten Oligonukleotide:
- 5'-Phosphorylierung der Oligonukieotide A und D
- Dies wurde mit Polynukleotidkinase (Boehringer Mannheim, Deutschland) nach veröffentlichten Verfahren durchgeführt; die 5'-phosphorylierten Oligonukleotide wurden ungereinigt in der LCR eingesetzt.
- Ligasekettenreaktion
- Die LCR wurde mit Pfu DNA-Ligase und einem Ligase Chain Reaction Kit (Stratagene, Heidelberg, Deutschland), enthaltend zwei verschiedene pBluescript KII Phagemide, durchgeführt. Eines davon enthält die Wildtypform des E. coli lacl Gens, und das andere eine Mutante dieses Gens mit einer einzigen Punktmutation an bp 191 des lacl Gens.
- Die folgenden LCR-Bedingungen wurden für jede Reaktion verwendet: 100 pg Templat-DNA (0,74 fMol) mit 500 pg beschallter Lachssperma-DNA als Träger, 25 ng (3,3 pMol) jedes 5'-phosphorylierten Oligonukleotids, 20 ng (2,5 pMol) jedes nicht-phosphorylierten Oligonukleotids, 4 U Pfu DNA-Ligase in einem Endvolumen von 20 μl, gepuffert mit Pfu DNA-Ligase Reaktionspuffer (Stratagene, Heidelberg, Deutschland). In einem Modellexperiment wurde ein chemisch synthetisiertes ss 50-mer (1 fMol) als Templat verwendet, in diesem Fall war Oligo C ebenfalls biotinyliert. Alle Reaktionen wurden in einem Thermocycler (OmniGene, MWG-Biotech, Ebersberg, Deutschland) mit dem folgenden Programm durchgeführt: 4 Minuten 92°C, 2 Minuten 60°C und 25 Zyklen von 20 Sekunden 92°C, 40 Sekunden 60°C. Mit Ausnahme der HPLC-Analyse wurde das biotinylierte Ligationsedukt C verwendet. In einem Kontrollexperiment ergaben die biotinylierten und nicht-biotinylierten Oligonukleotide die gleichen Ergebnisse bei Gelelektrophorese. Die Reaktionen wurden auf 7,5% Polyacrylamidgelen analysiert. Berechnete Masse von Ligationsprodukt 1 (Oligo A und B): 15450 Da; berechnete Masse von Ligationsprodukt 2 (Oligo C und D): 15387 Da.
- SMART-HPLC
- Ionenaustausch-HPLC (IE HPLC) wurde auf dem SMART-System (Pharmacia, Freiburg, Deutschland) unter Verwendung einer Pharmacia Mono Q, PC 1.6/5 Säule durchgeführt. Eluenten waren Puffer A (25 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA und 0,3 M NaCl bei pH 8,0) und Puffer B (wie A, aber 1 M NaCl). Beginnend mit 100% A während 5 Minuten bei einer Fließrate von 50 μl/min wurde ein Gradient von 0 bis 70% B in 30 Minuten angewendet, danach in 2 Minuten auf 100% B erhöht und 5 Minuten bei 100% B gehalten. Zwei gepoolte LCR-Volumina (40 μl), die entweder mit Wildtyp oder mutiertem Templat durchgeführt worden waren, wurden injiziert.
- Probenpräparation für MALDI-TOF MS
- Präparation von immobilisierter DNA: Zur Aufzeichnung jedes Spektrums wurden zwei LCR (durchgeführt wie vorstehend beschrieben) gepoolt und 1:1 mit 2 × B/W Puffer (10 mM Tris-HCl, pH 7,5, 1 mM EDTA, 2 M NaCl) verdünnt. Zu den Proben wurden 5 μl Streptavidin-Dynabeads (Dynal, Hamburg, Deutschland) zugegeben, das Gemisch wurde 15 Minuten bei Umgebungstemperatur unter sanftem Schütteln binden gelassen. Der Überstand wurde mit Hilfe eines Magnetic Particle Collector, MPC, (Dynal, Hamburg, Deutschland) entfernt, und die Kügelchen wurden zweimal mit 50 μl 0,7 M Ammoniumcitratlösung (pH 8,0) gewaschen (der Überstand wurde jedes Mal unter Verwendung des MPC entfernt). Die Kügelchen wurden in 1 μl ultrareinem Wasser (MilliQ, Millipore, Bedford, MA, USA) resuspendiert. Diese Suspension wurde direkt für die MALDI-TOF Analyse, wie nachstehend beschrieben, verwendet.
- Kombination von Ultrafiltration und Streptavidin-Dynabeads: Zum Aufzeichnen eines Spektrums wurden zwei LCR (durchgeführt wie vorstehend beschrieben) gepoolt, 1:1 mit 2 × B/W Puffer verdünnt und mit einer 5000 NMWL Ultrafree-MC Filtereinheit (Millipore, Eschborn, Deutschland) gemäß den Angaben des Herstellers eingeengt. Nach der Einengung wurden die Proben gewaschen, indem 300 μl 1 × B/W Puffer zu Streptavidin-Dynabeads zugegeben wurden. Die Kügelchen wurden einmal auf der Ultrafree-MC Filtrationseinheit mit 300 μl 1 × B/W Puffer gewaschen und bearbeitet, wie vorstehend beschrieben. Die Kügelchen wurden in 30 bis 50 μl 1 × B/W Puffer resuspendiert und in ein 1,5 ml Eppendorf-Röhrchen überführt. Der Überstand wurde entfernt und die Kügelchen wurden zweimal mit 50 μl 0,7 M Ammoniumcitrat (pH 8,0) gewaschen. Schließlich wurden die Kügelchen einmal mit 30 μl Aceton gewaschen und in 1 μl ultrareinem Wasser resuspendiert. Das Ligationsgemisch nach Immobilisierung auf den Kügelchen wurde für die MALDI-TOF MS Analyse, wie nachstehend beschrieben, verwendet.
- MALDI-TOF MS
- Eine Suspension von Streptavidin-beschichteten Magnetkügelchen mit der immobilisierten DNA wurde auf den Probenhalter pipettiert, danach sofort mit 0,5 μl Matrixlösung (0,7 M 3-Hydroxypicolinsäure in 50% Acetonitril, 70 mM Ammoniumcitrat) gemischt. Dieses Gemisch wurde bei Umgebungstemperatur trocknen gelassen und in das Massenspektrometer eingebracht. Alle Spektren wurden im positiven Ionenmodus aufgenommen, unter Verwendung eines Finnigan MAT Vision 2000 (Finnigan MAT, Bremen, Deutschland), das mit einem Reflektron (5 keV Ionenquelle, 20 keV Nachbeschleunigung) und einem Stickstofflaser (337 nm) ausgestattet war. Für die Analyse von Pfu DNA-Ligase wurden 0,5 μl der Lösung auf dem Probenhalter mit 1 μl Matrixlösung gemischt und wie vorstehend beschrieben präpariert. Für die Analyse von ungereinigten LCR wurde 1 μl einer LCR mit 1 μl Matrixlösung gemischt.
- ERGEBNISSE UND DISKUSSION
- Das E. coli lacl Gen diente als ein einfaches Modellsystem, um die Eignung von MALDI-TOF MS als ein Nachweisverfahren für Produkte, die in Ligasekettenreaktionen erzeugt worden waren, zu untersuchen. Dieses Templatsystem besteht aus einem E. coli lacl Wildtypgen in einem pBluescript KII Phagemid, und einem E. coli lacl Gen, das eine einzige Punktmutation an bp 191 (Transition C nach T) aufweist, im gleichen Phagemid. Vier verschiedene Oligonukleotide wurden verwendet, die nur ligiert werden konnten, wenn das E. coli lacl Wildtypgen vorhanden war (
26 ). - Die LCR-Bedingungen wurden unter Verwendung von Pfu DNA-Ligase optimiert, um mindestens 1 pMol Ligationsprodukt in jeder positiven Reaktion zu erhalten. Die Ligationsreaktionen wurden mittels Polyacrylamid-Gelelektrophorese (PAGE) und HPLC auf dem SMART-System (
27 ,28 und29 ) analysiert.27 zeigt eine PAGE einer positiven LCR mit Wildtyptemplat (Bahn 1), eine negative LCR mit mutiertem Templat (1 und 2), und eine negative Kontrolle, die Enzym, Oligonukleotide und kein Templat enthält. Die Gelelektrophorese zeigt klar, dass das Ligationsprodukt (50 bp) nur in der Reaktion mit Wildtyptemplat erzeugt wurde, während weder das Templat mit der Punktmutation noch die Kontrollreaktion mit Lachssperma-DNA Amplifikationsprodukte erzeugten. In28 wurde HPLC verwendet, um zwei gepoolte LCR mit Wildtyptemplat, die unter den gleichen Bedingungen durchgeführt worden waren, zu analysieren. Das Ligationsprodukt ist klar zu erkennen.29 zeigt die Ergebnisse einer HPLC, bei der zwei gepoolte negative LCR mit mutiertem Templat analysiert wurden. Diese Chromatogramme bestätigen die in27 gezeigten Daten und zusammen genommen zeigen die Ergebnisse klar, dass das System nur dann Ligationsprodukte in einer signifikanten Menge erzeugt, wenn das Wildtyptemplat bereitgestellt wird. - Es wurden geeignete Kontrollläufe durchgeführt, um Retentionszeiten der verschiedenen, an den LCR-Experimenten beteiligten Verbindungen zu bestimmen. Diese umfassen die vier Oligonukleotide (A, B, C und D), ein synthetisches ds 50-mer (mit der gleichen Sequenz wie das Ligationsprodukt), die Wildtyptemplat-DNA, beschallte Lachssperma-DNA und die Pfu DNA-Ligase in Ligationspuffer.
- Um zu testen, welches Reinigungsverfahren angewandt werden sollte, bevor eine LCR-Reaktion mittels MALDI-TOF MS analysiert werden kann, wurden Aliquots einer ungereinigten LCR (
30A ) und Aliquots der Enzym-Vorratslösung (30B ) mit MALDI-TOF MS analysiert. Es stellte sich heraus, dass eine geeignete Probenpräparation absolut notwendig ist, da alle Signale in der ungereinigten LCR Signalen entsprechen, die in der MALDI-TOF MS Analyse der Pfu DNA-Ligase erhalten wurden. Die berechneten Werte der Massen von Oligo A und dem Ligationsprodukt sind 7521 Da bzw. 15450 Da. Die Daten in30 zeigen, dass die Enzymlösung zu Massensignalen führt, welche die erwarteten Signale der Ligationsedukte und -produkte überlagern und daher eine eindeutige Signalzuordnung unmöglich machen. Weiterhin zeigten die Spektren Signale des oberflächenaktiven Mittels Tween20, das Bestandteil des Enzymlagerpuffers ist und das Kristallisationsverhalten des Analyt/Matrix-Gemisches auf ungünstige Weise beeinflusst. - In einem Reinigungsformat wurden Streptavidin-beschichtete Magnetkügelchen verwendet. Wie in einer vor kurzem erschienenen Veröffentlichung gezeigt wurde, ist die direkte Desorption von DNA, die immobilisiert ist durch Watson-Crick-Basenpaarung an ein komplementäres DNA-Fragment, welches kovalent an die Kügelchen gebunden ist, möglich und es wird ausschließlich der nicht-biotinylierte Strang desorbiert (Tang, K. et al. (1995), Nucleic Acids Res. 23: 3126–3131). Dieser Ansatz bei Verwendung von immobilisierten ds DNA stellt sicher, dass ausschließlich der nicht-biotinylierte Strang desorbiert wird. Wenn nicht-immobilisierte ds DNA analysiert wird, werden beide Stränge desorbiert (Tang, K. et al. (1994), Rapid Comm. Mass Spectrom. 7: 183–186), was in Abhängigkeit von der Massendifferenz der zwei Stränge zu breiten Signalen führt. Daher werden unter Verwendung dieses Systems für die LCR nur das nicht-ligierte Oligonukleotid A mit einer berechneten Masse von 7521 Da und das Ligationsprodukt aus Oligo A und Oligo B (berechnete Masse: 15450 Da) desorbiert, wenn Oligo C am 5'-Ende biotinyliert ist und auf Streptavidin-beschichteten Kügelchen immobilisiert ist. Dies führt zu einer einfachen und eindeutigen Identifizierung der LCR-Edukte und -Produkte.
-
31A zeigt ein MALDI-TOF Massenspektrum, das von zwei gepoolten LCR (durchgeführt wie vorstehend beschrieben), gereinigt auf Streptavidin-Dynabeads und direkt von den Kügelchen desorbiert, erhalten worden war, und zeigt, dass das verwendete Reinigungsverfahren (im Vergleich zu30 ) effizient war. Es konnten ein Signal, welches das nicht-ligierte Oligo A darstellt, und ein dem Ligationsprodukt entsprechendes Signal nachgewiesen werden. Die Übereinstimmung zwischen den berechneten und den experimentell erhaltenen Massenwerten ist bemerkenswert und ermöglicht eine eindeutige Peakzuordnung und einen genauen Nachweis des Ligationsprodukts. Im Gegensatz dazu konnte im Spektrum, das von zwei gepoolten LCR mit mutiertem Templat erhalten wurde (31B ), kein Ligationsprodukt sondern nur Oligo A nachgewiesen werden. Die Spezifität und Selektivität der LCR-Bedingungen und die Empfindlichkeit des MALDI-TOF Nachweises wird weiter aufgezeigt, wenn die Ligationsreaktion in Abwesenheit eines spezifischen Templats durchgeführt wird.32 zeigt ein Spektrum, welches von zwei gepoolten LCR erhalten wurde, bei denen nur Lachssperma-DNA als eine negative Kontrolle verwendet wurde; wie erwartet, konnte nur Oligo A nachgewiesen werden. - Während die in
31A gezeigten Ergebnisse mit Bahn 1 des Gels in27 korreliert werden können, ist das in31B gezeigte Spektrum äquivalent zu Bahn 2 in27 , und schließlich entspricht auch das Spektrum in32 Bahn 3 in27 . Die Ergebnisse sind im Einklang mit der in den28 und29 dargestellten HPLC-Analyse. Während sowohl Gelelektrophorese27 ) als auch HPLC (28 und29 ) entweder einen Überschuss oder annähernd gleiche Mengen von Ligationsprodukt gegenüber den Ligationsedukten zeigen, erzeugt die Analyse mittels MALDI-TOF Massenspektrometrie ein kleineres Signal für das Ligationsprodukt (31A ). - Die geringere Intensität des Signals des Ligationsprodukts könnte an unterschiedlichen Desorption/Ionisation-Effizienzen zwischen einem 24-mer und einem 50-mer liegen. Da der Tm-Wert eines Doppelstrangs mit 50 Basenpaaren, verglichen mit 24, erheblich höher ist, könnte mehr 24-mer desorbiert worden sein. Eine Verringerung der Signalintensität kann auch auf einen höheren Fragmentierungsgrad bei den längeren Oligonukleotiden zurückzuführen sein.
- Trotz der Reinigung mit Streptavidin-Dynabeads offenbart
32 Spuren von Tween20 im Bereich um 2000 Da. Substanzen mit einer viskosen Konsistenz beeinträchtigen den Kristallisierungsvorgang und können daher für eine massenspektrometrische Analyse nachteilig sein. Tween20 und auch Glyzerin, die Bestandteile des Enzymlagerpuffers sind, sollten daher vor massenspektrometrischer Analyse vollständig entfernt werden. Aus diesem Grund wurde ein verbessertes Reinigungsverfahren untersucht, das einen zusätzlichen Ultrafiltrationsschritt vor der Behandlung mit Dynabeads umfasst. Tatsächlich führte diese Probenaufreinigung zu einer signifikanten Verbesserung des Leistungsverhaltens der MALDI-TOF Massenspektrometrie. -
33 zeigt Spektren, die von zwei gepoolten positiven (33A ) bzw. negativen (33B ) LCR erhalten wurden. Die positive Reaktion wurde mit einem chemisch synthetisierten einzelsträngigen 50-mer, mit einer dem Ligationsprodukt von Oligo C und D äquivalenten Sequenz, als Templat durchgeführt. Oligo C war 5'-biotinyliert. Daher wurde das Templat nicht nachgewiesen. Wie erwartet, konnte ausschließlich das Ligationsprodukt von Oligo A und B (berechnete Masse: 15450 Da) von dem immobilisierten und ligierten Oligo C und D desorbiert werden. Dieses neu erzeugte DNA-Fragment wird durch das Massensignal von 15448 Da in33A dargestellt. Im Vergleich zu32A zeigt dieses Spektrum deutlich, dass dieses Probenpräparationsverfahren Signale mit verbesserter Auflösung und Intensität erzeugt. - Beispiel 7 Mutationsnachweis durch Festphase-Oligobasisextension eines Primers und Analyse mittels MALDI-TOF Massenspektrometrie
- Zusammenfassung
- Das Festphase-Oligobasisextension-Verfahren entdeckt Punktmutationen und kleine Deletionen sowie kleine Insertionen in amplifizierter DNA. Das Verfahren beruht auf der Extension eines Detektionsprimers, der angrenzend an eine variable Nukleotidposition in einem Affinitäts-eingefangenen amplifizierten Templat annealt, unter Verwendung einer DNA-Polymerase, eines Gemisches von drei dNTP und dem fehlenden als Dideoxynukleotid. Die resultierenden Produkte werden ohne weitere Markierungsverfahren mittels MALDI-TOF Massenspektrometrie bewertet und aufgelöst. Das Ziel des nachfolgenden Experiments war es, mutierte Allele und Wildtypallele rasch und zuverlässig nachzuweisen.
- Beschreibung des Experiments
- Das Verfahren verwendete einen einzigen Detektionsprimer, gefolgt von einem Oligonukleotidextensionsschritt, wobei Produkte erhalten werden, welche sich in spezifischer Weise für mutierte Allele oder Wildtypallele um ein paar Basen in der Länge unterscheiden, was in einfacher Weise durch MALDI-TOF Massenspektrometrie aufgelöst werden kann. Das Verfahren wird beschrieben unter Verwendung von Exon 10 des CFTR-Gens als Beispiel. Exon 10 dieses Gens enthält die häufigste Mutation in vielen ethnischen Gruppen (ΔF508), die wenn homozygot vorhanden zum klinischen Phänotyp der Mukoviszidose führt.
- MATERIALIEN UND METHODEN
- Genomische DNA
- Genomische DNA wurde von gesunden Individuen, von Individuen, die für die ΔF508 Mutation homozygot oder heterozygot sind, und von einem Individuum, das für die I506S Mutation heterozygot ist, erhalten. Die Wildtypallele und mutierten Allele wurden durch Standardsequenzierung nach Sanger bestätigt.
- PCR-Amplifizierung von Exon 10 des CFTR-Gens
- Die Primer für die PCR-Amplifikation waren CFEx10-F (5'-GCAAGTGAATCCTGAGCGTG-3' (SEQ ID Nr. 13) aus Intron 9 und biotinyliert) und CGEx10-R (5'-GTGTGAAGGGCGTG-3' (SEQ ID Nr. 14) aus Intron 10). Primer wurden in einer Konzentration von 8 pMol verwendet. Taq Polymerase, umfassend 10 × Puffer wurde von Boehringer Mannheim bezogen, und dNTP wurden von Pharmacia erhalten. Das Reaktionsvolumen betrug 50 μl insgesamt. Zyklusbedingungen für die PCR waren anfangs 5 min bei 95°C, gefolgt von 1 min bei 94°C, 45 sec bei 53°C, und 30 sec bei 72°C für 40 Zyklen, mit einer Schlußextensionsdauer von 5 min bei 72°C.
- Reinigung der PCR-Produkte
- Amplifizierungsprodukte wurden gereinigt unter Verwendung des Qiagen PCR Purification Kit (No. 28106) gemäß den Angaben des Herstellers. Die Elution der gereinigten Produkte von der Säule wurde in 50 μl TE-Puffer (10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 7,5) durchgeführt.
- Affinitätseinfang und Denaturierung der doppelsträngigen DNA
- 10 μl Aliquots des gereinigten PCR-Produkts wurden in eine Vertiefung einer Streptavidin-beschichteten Mikrotiterplatte (No. 1645684 Boehringer Mannheim oder No. 95029262 Labysytems) transferiert. Danach wurden 10 μl Inkubationspuffer (80 mM Natriumphosphat, 400 mM NaCl, 0,4% Tween20, pH 7,5) und 30 μl Wasser zugegeben. Nach einstündiger Inkubation bei Raumtemperatur wurden die Vertiefungen dreimal mit 200 μl Waschpuffer (40 mM Tris, 1 mM EDTA, 50 mM NaCl, 0,1% Tween20, pH 8,8) gewaschen. Zur Denaturierung der doppelsträngigen DNA wurden die Vertiefungen 3 min mit 100 μl einer 50 mM NaOH-Lösung behandelt. Danach wurden die Vertiefungen dreimal mit 200 μl Waschpuffer gewaschen.
- Oligobasisextensionsreaktion
- Das Annealen von 25 pMol Detektionsprimer (CF508: 5'-CTATATTCATCATAGGAAACACCA-3' (SEQ ID Nr. 15)) wurde in 50 μl Annealingpuffer (20 mM Tris, 10 mM KCl, 10 mM (NH4)2SO4, 2 mM MgSO4, 1% Triton X-100, pH 8,75) während 10 min bei 50°C durchgeführt. Die Vertiefungen wurden dreimal mit 200 μl Waschpuffer und einmal in 200 μl TE-Puffer gewaschen. Die Extensionsreaktion wurde unter Verwendung mancher Komponenten des DNA Sequencing Kit von USB (No. 70770) und von dNTP oder ddNTP von Pharmacia durchgeführt. Das gesamte Reaktionsvolumen betrug 45 μl, bestehend aus 21 μl Wasser, 6 μl Sequenasepuffer, 3 μl 10 mM DTT-Lösung, 4,5 μl 0,5 mM von drei dNTP, 4,5 μl 2 mM des fehlenden Nukleotids als ddNTP, 5,5 μl Glyzerin-Enzymverdünnungspuffer, 0,25 μl Sequenase 2.0, und 0,25 μl Pyrophosphatase. Die Reaktion wurde auf Eis zusammenpipettiert und danach 15 min bei Raumtemperatur und 5 min bei 37°C inkubiert. Danach wurden die Vertiefungen dreimal mit 200 μl Waschpuffer und einmal mit 60 μl einer 70 mM NH4-Citratlösung gewaschen.
- Denaturierung und Präzipitation des extendierten Primers
- Der extendierte Primer wurde 10 min in 50 μl 10% DMSO (Dimethylsulfoxid) in Wasser bei 80°C denaturiert. Zur Präzipitation wurden 10 μl NH4-Acetat (pH 6,5), 0,5 μl Glykogen (10 mg/ml Wasser, Sigma No. G1765) und 100 μl absoluter Ethanol zum Überstand zugegeben und es wurde 1 Stunde bei Raumtemperatur inkubiert. Nach 10-minütiger Zentrifugation bei 13.000 G wurde das Pellet in 70% Ethanol gewaschen und in 1 μl 18 Mohm/cm H2O Wasser resuspendiert.
- Probenpräparation und Analyse mittels MALDI-TOF Massenspektrometrie
- Die Probenpräparation wurde durchgeführt, indem jeweils 0,3 μl Matrixlösung (0,7 M 3-Hydroxypicolinsäure, 0,07 M zweibasisches Ammoniumcitrat in 1:1 H2O:CH3CN) und resuspendiertes DNA/Glykogen-Pellet auf einem Probentarget gemischt und an Luft trocknen gelassen wurden. Bis zu 20 Proben wurden punktförmig auf eine Probentargetscheibe aufgetragen, zum Einbringen in den Quellbereich eines nicht modifizierten Thermo Bioanalysis (früher Finnegan) Visions 2000 MALDI-TOF, der in einem Reflektronmodus mit 5 bzw. 20 kV auf der Target- bzw. Konversionsdynode betrieben wurde. Theoretische mittlere Molekülmassen (Mr(calc)) wurden aus Atomzusammensetzungen berechnet, angegebene experimentelle Mr-Werte (Mr(exp)) sind diejenigen der einfach protonierten Form, bestimmt unter Verwendung externer Kalibrierung.
- ERGEBNISSE
- Das Ziel des Experiments war es, ein schnelles und zuverlässiges Verfahren zum Mutationsnachweis zu entwickeln, das von genauen Stringenzen unabhängig ist, und das zu hoher Qualität und hohem Durchsatz bei der Diagnose von Erbkrankheiten führt. Daher wurde eine spezielle Art von DNA-Sequenzierung (Oligobasisextension eines Mutationsdetektionsprimers) mit der Bewertung der resultierenden Minisequenzierprodukte durch Matrix-unterstützte Laserdesorption/Ionisation (MALDI) Massenspektrometrie (MS) kombiniert. Die Flugzeit (TOF) Reflektronanordnung wurde als ein mögliches System zur Messung der Massen ausgewählt. Um diese Hypothese zu beweisen wurde die Untersuchung mit Exon 10 des CFTR-Gens durchgeführt, in dem manche Mutationen zum klinischen Phänotyp der Mukoviszidose, der häufigsten monogenetischen Krankheit in der kaukasischen Bevölkerung, führen können.
- Die schematische Darstellung, wie in
34 dargestellt, zeigt die erwarteten kurzen Sequenzierprodukte mit den theoretisch berechneten Molekülmassen des Wildtyps und verschiedener Mutationen von Exon 10 des CFTR-Gens. Die kurzen Sequenzierprodukte wurden entweder unter Verwendung von ddTTP (34A ) oder von ddCTP (34B ) erzeugt, wobei ein definitiv sequenzabhängiger Stop in dem entstehenden DNA-Strang eingeführt wird. Die MALDI-TOF MS Spektren von gesunden, für die Mutation heterozygoten und für die Mutation homozygoten Individuen sind in34 dargestellt. Alle Proben wurden durch Standardsequenzierung nach Sanger bestätigt, die im Vergleich zu der massenspektrometrischen Analyse keine Diskrepanz aufzeigte. Die Genauigkeit der experimentellen Messungen der verschiedenen Molekülmassen war in einem Bereich von minus 21,8 bis plus 87,1 Dalton (Da) des erwarteten Bereichs. Dies ermöglichte eine definitive Interpretation der Ergebnisse in allen Fällen. Ein weiterer Vorteil dieses Verfahrens ist der eindeutige Nachweis der ΔI507 Mutation. In der ddTTP-Reaktion würde das Wildtypallel nachgewiesen werden, während in der ddCTP-Reaktion die Deletion von drei Basenpaaren offensichtlich werden würde. - Das beschriebene Verfahren ist in hohem Maße geeignet zum Nachweis von einzelnen Punktmutationen oder DNA-Mikroläsionen. Eine sorgfältige Auswahl der Mutationsdetektionsprimer eröffnet die Möglichkeit von Multiplexverfahren und führt zu einem hohen Durchsatz, einschließlich hoher Qualität, bei der genetischen Diagnose ohne eine Erfordernis für genaue Stringenzen, die in vergleichbaren allelspezifischen Verfahren notwendig ist. Aufgrund der Einzigartigkeit der genetischen Information ist die Oligobasisextension eines Mutationsdetektionsprimers in jedem Krankheitsgen oder jeder polymorphen Region im Genom, wie von Tandemwiederholungen mit variabler Anzahl (VNTR, variable number tandem repeats) oder anderen Einzelnukieotidpolymorphismen (z. B. beim Apolipoprotein E Gen) anwendbar.
- Beispiel 8 Nachweis von Polymerasekettenreaktionsprodukten, die 7-Deazapurinreste enthalten, mit Matrix-unterstützter Laserdesorption/Ionisation Flugzeit (MALDI-TOF) Massenspektrometrie
- MATERIALIEN UND METHODEN
- PCR-Amplifikationen
- Die nachfolgenden Oligodeoxynukleotidprimer wurden nach Standardphosphoamiditchemie (Sinha, N. D. et al. (1983), Tetrahedron Let., Vol. 24, Seiten 5843–5846; Sinha, N. D. et al. (1984), Nucleic Acids Res., Vol. 12, Seiten 4539–4557) auf einem MilliGen 7500 DNA-Synthesizer (Millipore, Bedford, MA, USA) in einem 200 pMol Maßstab synthetisiert oder von MWG-Biotech (Ebersberg, Deutschland, Primer 3) und Biometra (Göttingen, Deutschland, Primer 6–7) bezogen.
- Die 99-mer und 200-mer DNA-Stränge (modifiziert und nicht-modifiziert) sowie das Ribo- und 7-Deaza-modifizierte 100-mer wurden von pRFc1 DNA (10 ng, großzügig bereitgestellt von S. Feyerabend, Universität Hamburg) amplifiziert, in einem Reaktionsvolumen von 100 μl, enthaltend 10 mMol/l KCl, 10 mMol/l (NH4)2SO4, 20 mMol/l Tris HCl (pH = 8,8), 2 mMol/l MgSO4, (exo(-)Pseudococcus furiosus (Pfu) Puffer, Pharmacia, Freiburg, Deutschland), 0,2 mMol/l jedes dNTP (Pharmacia, Freiburg, Deutschland), 1 μMol/l jedes Primers und 1 Einheit exo(-)Pfu DNA-Polymerase (Stratagene, Heidelberg, Deutschland).
- Für das 99-mer wurden die Primer 1 und 2, für das 200-mer wurden die Primer 1 und 3 und für das 100-mer wurden die Primer 6 und 7 verwendet. Um 7-Deazapurin-modifizierte Nukleinsäuren zu erhalten wurden während der PCR-Amplifikation dATP und dGTP durch 7-Deaza-dATP und 7-Deaza-dGTP ersetzt. Die Reaktion wurde in einem Thermocycler (OmniGene, MWG-Biotech, Ebersberg, Deutschland) durchgeführt, unter Verwendung des Zyklus: 1 min Denaturierung bei 95°C, 1 min Annealing bei 51°C und 1 min Extension bei 72°C. Für alle PCR betrug die Anzahl der Reaktionszyklen 30. Nach dem letzten Zyklus wurde die Reaktion weitere 10 min bei 72°C extendieren gelassen.
- Die 103-mer DNA-Stränge (modifiziert und nicht-modifiziert) wurden von M13mp18 RFI DNA (100 ng, Pharmacia, Freiburg, Deutschland) in einem Reaktionsvolumen von 100 μl unter Verwendung der Primer 4 und 5 amplifiziert, wobei alle anderen Konzentrationen unverändert waren. Die Reaktion wurde durchgeführt unter Verwendung des Zyklus: 1 min Denaturierung bei 95°C, 1 min Annealing bei 40°C und 1 min Extension bei 72°C. Nach 30 Zyklen für das nicht-modifizierte bzw. 40 Zyklen für das modifizierte 103-mer wurden die Proben weitere 10 min bei 72°C inkubiert.
- Synthese von 5'-[32P]-markierten PCR-Primern
- Die Primer 1 und 4 wurden unter Verwendung von T4-Polynukleotidkinase (Epicentre Technologies) und (γ-32P)-ATP (BLU/NGG/502A, Dupont, Deutschland) nach den Protokollen des Herstellers 5'-[32P]-markiert. Die Reaktionen wurden durchgeführt, indem 10% der Primer 1 und 4 in der PCR durch die markierten Primer ersetzt wurden, unter ansonsten unveränderten Reaktionsbedingungen. Die amplifizierten DNA wurden mittels Gelelektrophorese auf einem 10% Polyacrylamidgel aufgetrennt. Die entsprechenden Banden wurden ausgeschnitten und auf einem Packard TRI-CARS 460C Flüssigszintillationssystem (Packard, CT, USA) ausgezählt.
- Primerabspaltung von Ribo-modifiziertem PCR-Produkt
- Die amplifizierte DNA wurde unter Verwendung von Ultrafree-MC Filtereinheiten (30.000 NMWL) gereinigt, und wurde danach in 100 μl 0,2 Mol/l NaOH erneut aufgelöst und 25 Minuten bei 95°C erwärmt. Die Lösung wurde danach mit HCl (1 Mol/l) angesäuert und unter Verwendung von Ultrafree-MC Filtereinheiten (10.000 NMWL) für die MALDI-TOF Analyse weiter gereinigt, wie nachstehend beschrieben.
- Reinigung von PCR-Produkten
- Alle Proben wurden unter Verwendung von Ultrafree-MC Einheiten 30.000 NMWL (Millipore, Eschborn, Deutschland) nach der Beschreibung des Herstellers gereinigt und eingeengt. Nach Lyophilisierung wurden PCR-Produkte wieder in 5 μl (3 μl für das 200-mer) ultrareinem Wasser aufgelöst. Diese Analytlösung wurde direkt für MALDI-TOF Messungen verwendet.
- MALDI-TOF MS
- Aliquots von 0,5 μl Analytlösung und 0,5 μl Matrixlösung (0,7 Mol/l 3-HPA und 0,07 Mol/l Ammoniumcitrat in Acetonitril/Wasser (1:1, v/v)) wurden auf einem ebenen Metallprobenträger gemischt. Nach Trocknen bei Umgebungstemperatur wurde die Probe zur Analyse in das Massenspektrometer eingebracht. Das verwendete MALDI-TOF Massenspektrometer war ein Finnigan MAT Vision 2000 (Finnigan MAT, Bremen, Deutschland). Spektren wurden im positiven Ionenreflektormodus mit einer 5 keV Ionenquelle und 20 keV Nachbeschleunigung aufgenommen. Das Gerät war mit einem Stickstofflaser (Wellenlänge 337 nm) ausgestattet. Das Vakuum des Systems war 3 – 4·10–8 hPa im Analysatorbereich und 1 – 4·10-7 hPa im Quellbereich. Spektren von modifizierten und nicht-modifizierten DNA-Proben wurden mit der gleichen relativen Laserleistung erhalten, externe Kalibrierung wurde mit einem Gemisch von synthetischen Oligodeoxynukleotiden (7- bis 50-mer) durchgeführt.
- ERGEBNISSE UND DISKUSSION
- Enzymatische Synthese von 7-Deazapurinnukleotid-enthaltenden Nukleinsäuren mittels PCR
- Um die Machbarkeit einer MALDI-TOF MS für die schnelle, Gel-freie Analyse von kurzen PCR-Produkten zu zeigen, und die Wirkung von 7-Deazapurin-Modifikation von Nukleinsäuren unter MALDI-TOF Bedingungen zu untersuchen, wurden zwei unterschiedliche Primer-Templat-Systeme zur Synthese von DNA-Fragmenten verwendet. Sequenzen sind in den
36 und37 gezeigt. Während die zwei Einzelstränge des 103-mer PCR-Produkts nahezu gleiche Massen hatten (Δm = 8 u), unterschieden sich die zwei Einzelstränge des 99-mers um 526 u. - Unter Berücksichtigung, dass 7-Deazapurinnukleotid-Baublöcke für die chemische DNA-Synthese etwa 160 Mal teurer sind als die normalen (Produktinformation, Glen Research Corporation, Sterling, VA), und dass ihre Anwendung in Standard-β-Cyanphosphoamiditchemie nicht trivial ist (Produktinformation, Glen Research Corporation, Sterling, VA, Schneider, K., und B. T. Chait (1995) Nucleic Acids Res. 23, 1570), wären die Kosten für 7-Deazapurin-modifizierte Primer sehr hoch. Daher wurden, um die Anwendbarkeit und den Umfang des Verfahrens zu erhöhen, alle PCR unter Verwendung von nicht-modifizierten Oligonukleotidprimern, die routinemäßig verfügbar sind, durchgeführt. Ein Austausch von dATP und dGTP gegen c7-dATP und c7-dGTP in der Polymerasekettenreaktion führte zu Produkten, die etwa 80% 7-Deazapurin-modifizierte Nukleoside für das 99-mer und das 103-mer bzw. etwa 90% für das 200-mer enthielten. Tabelle I zeigt die Basenzusammensetzungen aller PCR-Produkte. TABELLE I Basenzusammensetzung der 99-mer, 103-mer und 200-mer PCR-Amplifikationsprodukte (nicht-modifiziert und 7-Deazapurin-modifiziert)
DNA-Fragmente1 C T A G c7-Deaza-A c7-Deaza-G rel. Modifizierung2 200-mer s 54 34 56 56 modifiziertes 200-mer s 54 34 6 5 50 51 90% 200-mer a 56 56 34 54 modifiziertes 200-mer a 56 56 3 4 31 50 92% 103-mer s 28 23 24 28 modifiziertes 103-mer s 28 23 6 5 18 23 79% 103-mer a 28 24 23 28 modifiziertes 103-mer a 28 24 7 4 16 24 78% 99-mer s 34 21 24 20 modifiziertes 99-mer s 34 21 6 5 18 15 75% 99-mer a 20 24 21 34 modifiziertes 99-mer a 20 24 3 4 18 30 87%
2 bezeichnet relative Modifizierung als Prozentanteil von 7-Deazapurin-modifizierten Nukleotiden der Gesamtmenge von Purinnukleotiden. - Es bleibt jedoch zu bestimmen, ob 80–90% 7-Deazapurin-Modifikation für einen genauen massenspektrometrischen Nachweis ausreichend sind. Es war daher wichtig zu bestimmen, ob alle Purinnukleotide während des enzymatischen Amplifikationsschritts ersetzt werden könnten. Dies war nicht trivial, da gezeigt worden war, dass c7-dATP in PCR dATP nicht vollständig ersetzen kann, wenn Taq DNA-Polymerase verwendet wird (Seela, F. and A. Roelling (1992), Nucleic Acids Res. 20, 55–61). Glücklicherweise fanden wir heraus, dass exo(-)Pfu DNA-Polymerase in der Tat c7-dATP und c7-dGTP in Abwesenheit nicht-modifizierter Purintriphosphate akzeptieren konnte. Der Einbau war jedoch weniger effizient, was zu einer geringeren Ausbeute an PCR-Produkt führt (
38 ). Ethidiumbromid färbt durch Interkalation zwischen die gestapelten Basen des DNA-Doppelstrangs. Geringere Bandenintensitäten im Ethidiumbromid-gefärbten Gel können daher Artefakte sein, da die modifizierten DNA-Stränge nicht notwendigerweise die gleichen Bandenintensitäten ergeben wie die nicht-modifizierten. - Um diese Ergebnisse zu verifizieren wurden die PCR mit [32P]-markierten Primern wiederholt. Das Autoradiogramm (
39 ) zeigt klar geringere Ausbeuten für die modifizierten PCR-Produkte. Die Banden wurden aus dem Gel ausgeschnitten und ausgezählt. Für alle PCR-Produkte betrug die Ausbeute der modifizierten Nukleinsäuren etwa 50%, bezogen auf das entsprechende nicht-modifizierte Amplifikationsprodukt. Weitere Experimente zeigten, dass auch exo(-)Deep Vent und Vent DNA-Polymerase während der PCR c7-dATP und c7-dGTP einbauen konnten. Es stellte sich jedoch heraus, dass das Leistungsverhalten insgesamt für die exo(-)Pfu DNA-Polymerase am besten war, welche die wenigsten Nebenprodukte während der Amplifikation ergab. Es wurde herausgefunden, das derartige PCR, die c7-dATP und c7-dGTP anstelle ihrer Isostere verwendeten, bei Verwendung aller drei Polymerasen weniger Nebenreaktionen zeigten, was zu einem reineren PCR-Produkt führt. Ein geringeres Auftreten von Amplifikationsnebenprodukten kann erklärt werden durch eine Verringerung von Primermismatchen aufgrund einer niedrigeren Stabilität des Komplexes, der aus dem Primer und dem 7-Deazapurin-enthaltenden Templat, das während der PCR synthetisiert wird, gebildet wird. Ein erniedrigter Schmelzpunkt von 7-Deazapurin-enthaltenden DNA-Doppelsträngen ist beschrieben worden (Mizusawa, S. et al. (1986), Nucleic Acids Res. 14, 1319–1324). Es wird davon ausgegangen, dass zusätzlich zu den drei vorstehend angegebenen Polymerasen (exo(-)Deep Vent DNA-Polymerase, Vent DNA-Polymerase und exo(-)Pfu DNA-Polymerase) andere Polymerasen verwendet werden können, wie etwa das große Klenow-Fragment von E. coli DNA-Polymerase, Sequenase, Taq DNA-Polymerase und U AmpliTaq DNA-Polymerase. Zusätzlich müssen, wenn das Templat RNA ist, RNA-Polymerasen wie etwa die SP6 oder die T7 RNA-Polymerase verwendet werden. - MALDI-TOF Massenspektrometrie von modifizierten und nicht-modifizierten PCR-Produkten
- Die 99-mer, 103-mer und 200-mer PCR-Produkte wurden mittels MALDI-TOF MS analysiert. Aufgrund früherer Erfahrung war bekannt, dass der Depurinierungsgrad von der zur Desorption und Ionisation des Analyten verwendeten Laserenergie abhängt. Da der Einfluss von 7-Deazapurin-Modifikation aufgrund von Depurinierung auf die Fragmentierung untersucht werden sollte, wurden alle Spektren mit der gleichen relativen Laserenergie gemessen.
- Die
40a und40b zeigen die Massenspektren der modifizierten und nicht-modifizierten 103-mer Nukleinsäuren. Beim modifizierten 103-mer verursacht Fragmentierung ein breites (M+H)+ Signal. Das Maximum des Peaks ist zu niedrigeren Massen verschoben, so dass die zugeordnete Masse einen Mittelwert des (M+H)+ Signals und Signale von fragmentierten Ionen, anstelle des eigentlichen (M+H)+ Signals, darstellt. Obwohl das modifizierte 103-mer immer noch etwa 20% A und G von den Oligonukleotidprimern enthält, zeigt es weniger Fragmentierung, was sich durch schmalere und symmetrische Signale zeigt. Insbesondere ist eine Schwanzbildung des Peaks auf der unteren Massenseite aufgrund von Depurinierung erheblich verringert. Somit ist die Differenz zwischen gemessener und berechneter Masse stark verringert, obwohl sie immer noch unterhalb der erwarteten Masse ist. Für die nicht-modifizierte Probe wurde ein (M+H)+ Signal von 31670 beobachtet, was eine Differenz von 97 u oder 0,3% zu der berechneten Masse ist. Währenddessen nahm bei der modifizierten Probe diese Massendifferenz auf 10 u oder 0,03% ab (gefunden: 31713 u, berechnet: 31723 u). Diese Beobachtungen werden verifiziert durch eine signifikante Zunahme in der Massenauflösung des (M+H)+ Signals der zwei Signalstränge (m/Δm = 67, gegenüber 18 für die nicht-modifizierte Probe, mit Δm = volle Breite bei halbem Maximum, fwhm (full width at half maximum)). Aufgrund der geringen Massendifferenz zwischen den zwei Einzelsträngen (8 u) wurden ihre individuellen Signale nicht aufgelöst. - Mit den Ergebnissen der 99 Basenpaar DNA-Fragmente werden die Wirkungen einer erhöhten Massenauflösung für 7-Deazapurin-enthaltende DNA sogar noch offensichtlicher. Die zwei Einzelstränge in der nicht-modifizierten Probe wurden nicht aufgelöst, obwohl die Massendifferenz zwischen den zwei Strängen des PCR-Produkts aufgrund einer ungleichen Verteilung von Purinen und Pyrimidinen mit 526 u sehr hoch war (
41a ). Im Gegensatz dazu zeigte die modifizierte DNA unterscheidbare Peaks für die zwei Einzelstränge (41b ), was die Überlegenheit dieses Ansatzes für den Nachweis von Molekülmassen gegenüber gelelektrophoretischen Methoden noch hervorhebt. Obwohl keine Basislinienauflösung erhalten wurde, konnten die individuellen Massen mit einer Genauigkeit von 0,1% zugeordnet werden: Δm = 27 u für den leichteren Strang (berechnete Masse = 30224 u) und Δm = 14 u für den schwereren Strang (berechnete Masse = 30750 u). Es wurde wiederum festgestellt, dass die volle Breite bei halbem Maximum für die 7-Deazapurin-enthaltende Probe signifikant verringert war. - Sowohl beim 99-mer als auch beim 103-mer ergeben die 7-Deazapurin-enthaltenden Nukleinsäuren anscheinend eine höhere Empfindlichkeit, trotz der Tatsache, dass sie immer noch etwa 20% nicht-modifizierte Purinnukleotide enthalten. Um ein vergleichbares Signal-zu-Rauschen Verhältnis bei ähnlichen Intensitäten für die (M+H)+ Signale zu erhalten, brauchte das nicht-modifizierte 99-mer 20 Laserschüsse, gegenüber 12 für das modifizierte, und das 103-mer brauchte 12 Schüsse für die nicht-modifizierte Probe, gegenüber 3 für das 7-Deazapurinnukleosid-enthaltende PCR-Produkt.
- Beim Vergleich der Spektren der modifizierten und nicht-modifizierten 200-mer Amplicons wurde wiederum eine verbesserte Massenauflösung sowie erhöhte Signalintensitäten für die 7-Deazapurin-enthaltende Probe gefunden (
42a und42b ). Während im Spektrum der modifizierten Probe das Signal der Einzelstränge vorherrscht, ergaben für die nicht-modifizierte Probe der DNA-Doppelstrang und Dimere der Einzelstränge das stärkste Signal. - Eine vollständige 7-Deazapurin-Modifikation von Nukleinsäuren kann entweder durch Verwendung modifizierter Primer in der PCR oder durch Abspalten der nicht-modifizierten Primer aus dem teilweise modifizierten PCR-Produkt erreicht werden. Da mit modifizierten Primern Nachteile assoziiert sind, wie vorstehend beschrieben, wurde ein 100-mer synthetisiert, unter Verwendung von Primern mit einer Ribo-Modifikation. Die Primer wurden hydrolytisch mit NaOH abgespalten, nach einer Methode, die früher in unserem Labor entwickelt worden war (Koester, H. et al., Z. Physiol. Chem. 359, 1570–1589). Die
10a und10b zeigen das Spektrum des PCR-Produkts vor und nach Primerabspaltung.10b zeigt, dass die Hydrolyse erfolgreich war. Sowohl hydrolysiertes PCR-Produkt als auch die zwei freigesetzten Primer konnten nachgewiesen werden, zusammen mit einem schwachen Signal von restlichem, ungespaltetem 100-mer. Dieses Verfahren ist insbesondere für die MALDI-TOF Analyse von sehr kurzen PCR-Produkten geeignet, da der Anteil von nicht-modifizierten Purinen, die aus dem Primer stammen, mit abnehmender Länge der amplifizierten Sequenz zunimmt. - Die bemerkenswerten Eigenschaften von 7-Deazapurin-modifizierten Nukleinsäuren können durch eine effizientere Desorption und/oder Ionisation, eine erhöhte Ionenstabilität und/oder durch eine niedrigere Denaturierungsenergie der doppelsträngigen, Purin-modifizierten Nukleinsäure erklärt werden. Der Austausch von N-7 gegen eine Methingruppe führt zum Verlust eines Akzeptors für eine Wasserstoffbindung, was die Fähigkeit der Nukleinsäure, aufgrund von nicht-Watson-Crick-Basenpaarung Sekundärstrukturen auszubilden, beeinflusst (Seela, F. and A. Kehne (1987), Biochemistry 26, 2232–2238), was einen Grund für eine bessere Desorption während des MALDI-Verfahrens darstellen sollte. Zusätzlich dazu hat das aromatische System von 7-Deazapurin eine niedrigere Elektronendichte, was die Watson-Crick-Basenpaarung schwächt und zu einem erniedrigten Schmelzpunkt des Doppelstrangs führt (Mizusawa, S. et al. (1986), Nucleic Acids Res. 14, 1319–1324). Diese Wirkung kann die zur Denaturierung des Doppelstrangs während des MALDI-Verfahrens erforderliche Energie verringern. Diese Aspekte sowie der Verlust einer Stelle, die am N-7 Stickstoff vermutlich eine positive Ladung aufweisen wird, macht die 7-Deazapurin-modifizierte Nukleinsäure weniger polar, und kann die Desorptionswirksamkeit fördern.
- Aufgrund der Abwesenheit von N-7 als Protonenakzeptor und der verringerten Polarisierung der C-N-Bindung in 7-Deazapurinnukleosiden wird eine Depurinierung nach dem für Hydrolyse in Lösung aufgezeigten Mechanismus verhindert. Obwohl eine direkte Korrelation von Reaktionen in Lösung und in der Gasphase problematisch ist, kann im MALDI-Verfahren eine geringere Fragmentierung aufgrund von Depurinierung der modifizierten Nukleinsäuren erwartet werden. Depurinierung kann entweder von Ladungsverlust begleitet werden, was die Gesamtausbeute geladener Spezies verringert, oder sie kann geladene Fragmentierungsprodukte erzeugen, was die Intensität des nicht-fragmentierten Molekülionensignals verringert.
- Die Beobachtung sowohl einer höheren Empfindlichkeit als auch einer verringerten Peak-Schwanzbildung der (M+H)+ Signale an der unteren Massenseite aufgrund verringerter Fragmentierung der 7-Deazapurin-enthaltenden Proben deutet darauf hin, dass das N-7 Atom in der Tat für den Depurinierungsmechanismus im MALDI-TOF Verfahren essentiell ist. Zusammenfassend zeigen 7-Deazapurin-enthaltende Nukleinsäuren deutlich erhöhte Ionenstabilität und Empfindlichkeit unter MALDI-TOF Bedingungen, und sorgen somit für höhere Massengenauigkeit und Massenauflösung.
- Beispiel 9 Festphasensequenzierung und massenspektrometrischer Nachweis
- MATERIALIEN UND METHODEN
- Oligonukleotide wurden von Operon Technologies (Alameda, CA) in ungereinigter Form bezogen. Sequenzreaktionen wurden an einer festen Oberfläche unter Verwendung von Reagenzien aus dem Sequenzierkit für Sequenase, Version 2.0 (Amersham, Arlington Heights, Illinois) durchgeführt.
- Sequenzierung eines 39-mer Targets
- Um eine Festphase-DNA-Sequenzierung durchzuführen wurde der Templatstrang DNA11683 mittels terminaler Deoxynukleotidyltransferase 3'-biotinyliert. Eine 30 μl Reaktion, enthaltend 60 pMol DNA11683, 1,3 nMol Biotin 14-dATP (GIBCO BRL, Grand Island, NY), 30 Einheiten terminale Transferase (Amersham, Arlington Heights, Illinois) und 1 × Reaktionspuffer (mit dem Enzym geliefert), wurde 1 Stunde bei 37°C inkubiert. Die Reaktion wurde durch Hitzeinaktivierung der terminalen Transferase bei 70°C während 10 min gestoppt. Das resultierende Produkt wurde durch Leiten durch eine TE-10-Zentrifugiersäule (Clonetech) entsalzt. Es konnten mehr als ein Molekül Biotin 14-dATP an das 3'-Ende von DNA11683 angefügt werden. Die biotinylierte DNA11683 wurde 30 min bei Umgebungstemperatur mit 0,3 mg Dynal Streptavidin-Kügelchen in 30 μl 1 × Binde- und Waschpuffer inkubiert. Die Kügelchen wurden zweimal mit TE gewaschen und in 30 μl TE wieder aufgelöst, ein 10 μl Aliquot (enthaltend 0,1 mg Kügelchen) wurde für die Sequenzreaktionen verwendet.
- Die 0,1 mg Kügelchen aus dem obigen Schritt wurden in einem 10 μl Volumen, enthaltend 2 μl 5 × Sequenase-Puffer (200 mM Tris-HCl, pH 7,5), 100 mM MgCl2 und 250 mM NaCl) aus dem Sequenase Kit, und 5 pMol des entsprechenden Primers, PNA16/DNA, resuspendiert. Das Annealing-Gemisch wurde auf 70°C erwärmt und während eines Zeitraums von 20–30 min langsam auf Raumtemperatur abkühlen gelassen. Danach wurden 1 μl 0,1 M Dithiothreitol-Lösung, 1 μl Mn-Puffer (0,15 M Natriumisocitrat und 0,1 M MnCl2) und 2 μl verdünnte Sequenase (3,25 Einheiten) zugegeben. Das Reaktionsgemisch wurde in vier Aliquots von jeweils 3 μl aufgeteilt und mit Terminationsgemischen gemischt (jedes besteht aus 3 μl des entsprechenden Terminationsgemisches: 32 μM c7dATP, 32 μM dCTP, 32 μM c7dGTP, 32 μM dTTP und 3,2 μM eines der vier ddNTP, in 50 mM NaCl). Die Reaktionsgemische wurden 2 min bei 37°C inkubiert. Nach Beendigung der Extension wurden die Kügelchen präzipitiert und der Überstand wurde entfernt. Die Kügelchen wurden zweimal gewaschen und in TE resuspendiert und bei 4°C aufbewahrt.
- Sequenzierung eines 78-mer Targets
- Das Target TNR.PLASM2 wurde biotinyliert und sequenziert unter Verwendung von Verfahren, die den im vorstehenden Abschnitt beschriebenen (Sequenzierung eines 39-mer Targets) ähnlich waren.
- Sequenzierung eines 15-mer Targets mit teilweise doppelsträngiger Sonde
- CM1B3B wurde auf Dynabeads M280 mit Streptavidin (Dynal, Norwegen) immobilisiert durch 30-minütige Inkubation von 60 pMol CM1B3B mit 0,3 Magnetkügelchen in 30 μl 1M NaCl und TE (1 × Binde- und Waschpuffer) bei Raumtemperatur. Die Kügelchen wurden zweimal mit TE gewaschen und in 30 μl TE wieder aufgelöst, für Sequenzreaktionen wurden 10 oder 20 μl Aliquots (enthaltend 0,1 bzw. 0,2 mg Kügelchen verwendet.
- Der Doppelstrang wurde gebildet durch Annealen entsprechender Aliquots von Kügelchen aus dem obigen Schritt mit 10 pMol DF11a5F (oder 20 pMol DF11a5F für 0,2 mg Kügelchen) in einem 9 μl Volumen, enthaltend 2 μl 5 × Sequenase-Puffer (200 mM Tris-HCl, pH 7,5), 100 mM MgCl2 und 250 mM NaCl) aus dem Sequenase Kit. Das Annealing-Gemisch wurde auf 65°C erwärmt und während eines Zeitraums von 20–30 min langsam auf 37°C abkühlen gelassen. Der doppelsträngige Primer wurde danach mit 10 pMol TS10 (20 pMol TS10 für 0,2 mg Kügelchen) in einem Volumen von 1 μl gemischt und das resultierende Gemisch wurde weiter 5 min bei 37°C, 5–10 min bei Raumtemperatur inkubiert. Danach wurden 1 μl 0,1 M Dithiothreitol-Lösung, 1 μl Mn-Puffer (0,15 M Natriumisocitrat und 0,1 M MnCl2) und 2 μl verdünnte Sequenase (3,25 Einheiten) zugegeben. Das Reaktionsgemisch wurde in vier Aliquots von jeweils 3 μl aufgeteilt und mit Terminationsgemischen gemischt (jedes besteht aus 4 μl des entsprechenden Terminationsgemisches: 16 μM dATP, 16 μM dCTP, 16 μM dGTP, 16 μM dTTP und 1,6 μM eines der vier ddNTP, in 50 mM NaCl). Die Reaktionsgemische wurden 5 min bei Raumtemperatur und 5 min bei 37°C inkubiert. Nach Beendigung der Extension wurden die Kügelchen präzipitiert und der Überstand wurde entfernt. Die Kügelchen wurden in 20 μl TE resuspendiert und bei 4°C aufbewahrt. Ein Aliquot von 2 μl (von 20 μl) wurde aus jedem Röhrchen entnommen und mit 8 μl Formamid gemischt, die resultierenden Proben wurden 5 min bei 90–95°C denaturiert, und 2 μl (von insgesamt 10 μl) wurden auf eine ALF DNA-Sequenziervorrichtung (Pharmacia, Piscataway, NJ) unter Verwendung eines 10% Polyacrylamidgels, das 7 M Harnstoff und 0,6 × TBE enthielt, aufgetragen. Der Rest des Aliquots wurde für die MALDI-TOF MS Analyse verwendet.
- MALDI Probenpräparation und Instrumentierung
- Vor der MALDI Analyse wurden die mit der Sequenzleiter beladenen Magnetkügelchen zweimal unter Verwendung von 50 mM Ammoniumcitrat gewaschen und in 0,5 μl reinem Wasser resuspendiert. Die Suspension wurde danach auf das Probentarget des Massenspektrometers aufgetragen, und 0,5 μl gesättigte Matrixlösung (3-Hydroxypicolinsäure(HPA):Ammoniumcitrat = 10:1 Molverhältnis in 50% Acetonitril) wurden zugegeben. Vor der massenspektrometrischen Analyse wurde das Gemisch trocknen gelassen.
- Für die Analyse wurde das Reflektron TOF-MS Massenspektrometer (Vision 2000, Finnigan MAT, Bremen, Deutschland) verwendet. In der Ionenquelle wurden 5 kV angelegt, und für die Nachbeschleunigung wurden 20 kV angelegt. Alle Spektren wurden im positiven Ionenmodus aufgenommen und es wurde ein Stickstofflaser verwendet. Normalerweise wurde jedes Spektrum für mehr als 100 Schüsse gemittelt, und es wurde eine Standard-25 Punkt-Glättung angewandt.
- ERGEBNISSE UND DISKUSSION
- Herkömmliche Festphasensequenzierung
- Bei herkömmlichen Sequenziermethoden wird ein Primer direkt an das Templat annealt und danach extendiert und in einer Dideoxysequenzierung nach Sanger ein Kettenabbruch herbeigeführt. Normalerweise wird ein biotinylierter Primer verwendet und die Sequenzleitern durch Streptavidin-beschichtete Magnetkügelchen eingefangen. Nach dem Waschen werden die Produkte unter Verwendung von EDTA und Formamid von den Kügelchen eluiert. Unsere früheren Erkenntnisse deuteten jedoch darauf hin, dass nur der annealte Strang eines Doppelstrangs desorbiert wird und der immobilisierte Strang auf den Kügelchen verbleibt. Es ist daher vorteilhaft, das Templat zu immobilisieren und den Primer zu annealen. Nach der Sequenzreaktion und dem Waschen können die Kügelchen mit dem immobilisierten Templat und der annealten Sequenzleiter direkt auf das Massenspektrometertarget geladen und mit der Matrix gemischt werden. Bei MALDI wird nur die annealte Sequenzleiter desorbiert und ionisiert, und das immobilisierte Templat verbleibt auf dem Target.
- Ein 39-mer Templat (SEQ ID Nr. 23) wurde zunächst biotinyliert, durch Anfügen von Biotin 14-dATP an das 3'-Ende mit terminaler Transferase. Es konnten mehr als ein Biotin 14-dATP Molekül durch das Enzym angefügt werden. Da jedoch das Templat immobilisiert war und während MALDI auf den Kügelchen verblieb, würde die Anzahl von Biotin 14-dATP die Massenspektren nicht beeinträchtigen. Ein 14-mer Primer (SEQ ID Nr. 29) wurde für die Festphasensequenzierung verwendet. MALDI-TOF Massenspektren der vier Sequenzleitern sind in
34 gezeigt, und die erwarteten theoretischen Werte sind in Tabelle II gezeigt. TABELLE II TABELLE II (Fortsetzung)A-Reaktion C-Reaktion G-Reaktion T-Reaktion 1. 2. 4223,8 4223,8 4223,8 4223,8 3. 4521,1 4. 4809,2 5. 5122,4 6. 5434,6 7. 5737,8 8. 6051,1 9. 6379,2 10. 6704,4 11. 6995,6 12. 7284,8 13. 7574,0 14. 7878,2 15. 8207,4 16. 8495,6 17. 8808,8 18. 9097,0 19. 9386,2 20. 9699,4 21. 10027,6 22. 10355,8 23. 10644,0 24. 10933,2 25. 11246,4 26. 11574,6 27 11886,8 - Die Sequenzreaktion erzeugte eine relativ homogene Leiter, und die Volllängensequenz wurde leicht nachgewiesen. Ein Peak bei etwa 5150, der in allen Reaktionen erschien, ist nicht identifiziert. Eine mögliche Erklärung ist, dass ein kleiner Teil des Templats irgendeine Art von Sekundärstruktur ausbildete, wie etwa eine Schleife, was eine Extension durch Sequenase verhinderte. Falscher Einbau spielt eine geringe Rolle, da die Intensität dieser Peaks erheblich geringer war als die der Sequenzleitern. Obwohl 7-Deazapurine in der Sequenzreaktion verwendet wurden, welche die N-glykosidische Bindung stabilisieren und Depurinierung verhindern könnten, wurden immer noch in geringem Umfang Basenverluste beobachtet, da der Primer nicht durch 7-Deazapurine substituiert war. Die Volllängenleiter, mit einem ddA am 3'-Ende, trat in der A-Reaktion mit einer scheinbaren Masse von 11899,8 auf. In allen vier Reaktionen trat jedoch ein intensiverer Peak von 122 auf und ist wahrscheinlich auf das Anfügen eines zusätzlichen Nukleotids durch das Sequenase-Enzym zurückzuführen.
- Die gleiche Technik könnte verwendet werden, um längere DNA-Fragmente zu sequenzieren. Ein 78-mer Templat, das einen CTG-Repeat (mehrere CTG hintereinander) enthielt (SEQ ID Nr. 25) wurde 3'-biotinyliert durch Anfügen von Biotin 14-dATP mit terminaler Transferase. Ein 18-mer Primer (SEQ ID Nr. 26) wurde direkt außerhalb des CTG-Repeats annealt, so dass der Repeat sofort nach Primerextension sequenziert werden konnte. Die vier Reaktionen wurden gewaschen und wie üblich mittels MALDI-TOF MS analysiert. Ein Beispiel der G-Reaktion ist in
35 gezeigt, und die erwartete Sequenzleiter mit theoretischen Massenwerten für jede Komponente der Leiter ist in Tabelle III gezeigt. Alle Sequenzpeaks waren gut aufgelöst, mit Ausnahme der letzten Komponente (theoretischer Wert 20577,4), die vom Hintergrund nicht unterscheidbar war. Zwei benachbarte Sequenzpeaks (ein 62-mer und ein 63-mer) waren ebenfalls aufgetrennt, was anzeigt, dass eine derartige Sequenzanalyse auf längere Template anwendbar sein könnte. In diesem Spektrum wurde wiederum die Anfügung eines zusätzlichen Nukleotids durch das Sequenase-Enzym beobachtet. Diese Anfügung ist nicht Templat-spezifisch und trat in allen vier Reaktionen auf, was ihre Identifizierung einfach macht. Bei dem langen Templat hatten die Sequenzpeaks im Vergleich zu den Primerpeaks eine deutlich geringere Intensität. Weitere Optimierung der Sequenzreaktion mag erforderlich sein. TABELLE III (Fortsetzung)ddATP ddCTP ddGTP ddTTP 1. 5491,6 5491,6 5491,6 5491,6 2. 5764,8 3. 6078,0 4. 6407,2 5. 6696,4 6. 7009,6 7. 7338,8 8. 7628,0 9. 7941,2 10. 8270,4 11. 8559,6 12. 8872,8 13. 9202,0 14. 9491,2 15. 9804,4 16. 10133,6 17. 10422,88 18. 10736,0 19. 11065,2 20. 11354,4 21. 11667,6 22. 11996,8 23. 12286,0 24. 12599,2 25. 12928,4 26. 13232,6 27. 13521,8 28. 13835,0 29. 14124,2 30. 14453,4 21. 14742,6 32. 15046,8 33. 15360,0 34. 15673,2 35. 15962,4 36. 16251,6 37. 16580,8 38. 16894,0 39. 17207,2 40. 17511,4 41. 17800,6 42. 18089,8 43. 18379,0 44. 18683,2 45. 19012,4 46. 19341,6 47. 19645,8 48. 19935,0 49. 20248,2 50. 20577,4 51. 20890,6 52. 21194,4 53. 21484,0 54. 21788,2 55. 22092,4 - Sequenzierung unter Verwendung doppelsträngiger DNA-Sonden zum Einfang und Primen
- Es ist gezeigt worden, dass doppelsträngige DNA-Sonden mit Einzelstrangüberhang spezifische DNA-Template einfangen können und auch als Primer für die Festphasensequenzierung dienen können. Das Schema ist in
46 gezeigt. Stapelwechselwirkungen zwischen einer Doppelstrangsonde und einem einzelsträngigen Templat ermöglichen, dass nur ein Überhang von 5 Basen zum Einfang zur Verfügung steht. Auf Basis dieses Formats wurde ein 5'-Fluoreszenz-markiertes 23-mer (5'-GAT GAT CCG ACG CAT CAC AGC TC) (SEQ ID Nr. 29) an ein 3'-biotinyliertes 18-mer (5'-GTG ATG CGT CGG ATC ATC) (SEQ ID Nr. 30) annealt, wobei ein Überhang von 5 Basen verbleibt. Ein 15-mer Templat (5'-TCG GTT CCA AGA GCT) (SEQ ID Nr. 31) wurde durch den Doppelstrang eingefangen und mittels Extendierung des 5-Basenüberhangs wurden Sequenzreaktionen durchgeführt. MALDI-TOF Massenspektren der Reaktionen sind in47A –D gezeigt. Alle Sequenzpeaks waren aufgelöst, wenn auch mit relativ geringen Intensitäten. Der letzte Peak in jeder Reaktion ist auf die unspezifische Anfügung eines Nukleotids zum Volllängenextensionsprodukt durch das Sequenase-Enzym zurückzuführen. Zum Vergleich wurden die gleichen Produkte auf einer herkömmlichen DNA-Sequenziervorrichtung laufen gelassen, und ein Stapelfluorogramm der Ergebnisse ist in48 gezeigt. Wie aus der Figur ersichtlich ist, hatten die Massenspektren das gleiche Muster wie das Fluorogramm, mit Sequenzpeaks in einer im Vergleich zum 23-mer Primer erheblich geringeren Intensität. - Verbesserungen von MALDI-TOF Massenspektrometrie als Nachweistechnik
- Die Probenverteilung kann homogener gemacht werden und die Signalintensität könnte theoretisch erhöht werden, indem man die Pikoliterviolentechnik verwirklicht. In der Praxis können die Proben auf kleine Vertiefungen mit quadratischen Öffnungen mit einer Größe von 100 μm aufgetragen werden. Die bei der Festphasensequenzierung verwendeten Kügelchen haben einen Durchmesser kleiner 10 μm, so dass sie gut in die Mikroliterviolen passen sollten. Mikrokristalle aus Matrix und DNA, die ”Sweet Spots” enthalten, werden in der Viole eingeschlossen. Da der Laser eine Punktgröße mit einem Durchmesser von etwa 100 μm hat, bedeckt er die gesamte Öffnung der Viole. Daher ist eine Suche nach Sweet Spots nicht notwendig, und zur Aufnahme von Spektren kann ein Laser mit einer hohen Wiederholungsrate (z. B. > 10 Hz) verwendet werden. Ein früherer Bericht hat gezeigt, dass diese Vorrichtung im Vergleich zu der herkömmlichen MALDI Probenpräparationstechnik die Nachweisempfindlichkeit von Peptiden und Proteinen um mehrere Größenordnungen erhöhen kann.
- Die Auflösung von MALDI in bezug auf DNA muß weiter verbessert werden, um den Sequenzierbereich auf mehr als 100 Basen auszudehnen. Unter Verwendung von 3-HPA/Ammoniumcitrat als Matrix und eines Reflektron TOF Massenspektrometers mit einer 5 kV Ionenquelle und 20 kV Nachbeschleunigung ist derzeit die Auflösung des Peaks der Durchgangsreaktion in
33 (73-mer) größer 200 (FWHM), was in diesem Fall zur Sequenzbestimmung ausreichend ist. Diese Auflösung ist auch die höchste veröffentlichte für MALDI-desorbierte DNA-Ionen oberhalb des 70-mer Bereichs. Die Verwendung einer verzögerten Extraktionstechnik könnte die Auflösung weiter verstärken.
Claims (58)
- Verfahren zum Nachweis einer oder mehrerer Targetnukleinsäuresequenzen, die in einer biologischen Probe vorliegen, umfassend die Schritte: a) Hybridisieren eines oder mehrere Detektoroligonukleotide mit einem oder mehreren Nukleinsäuremolekülen und Entfernen von nicht hybridisiertem Detektoroligonukleotid; b) Ionisieren und Verdampfen des Produkts von Schritt a); und c) Analysieren der ionisierten und verdampften Nukleinsäure durch Massenspektrometrie, worin der Nachweis des Detektoroligonukleotids durch Massenspektrometrie das Vorliegen der Targetnukleinsäuresequenz in der biologischen Probe anzeigt.
- Verfahren nach Anspruch 1, worin das Nukleinsäuremolekül auf einem festen Träger immobilisiert ist.
- Verfahren nach Anspruch 2, worin Immobilisierung durch Hybridisierung zwischen einem komplementären Einfangnukleinsäuremolekül, das zuvor auf einem festen Träger immobilisiert worden ist, und einer komplementären spezifischen Sequenz auf dem Nukleinsäuremolekül verwirklicht wird.
- Verfahren nach Anspruch 2, worin Immobilisierung durch direktes Binden des Nukleinsäuremoleküls an den festen Träger verwirklicht wird.
- Verfahren nach Anspruch 2, worin vor Immobilisierung das Nukleinsäuremolekül amplifiziert wird.
- Verfahren nach Anspruch 5, worin das Nukleinsäuremolekül durch ein Amplifikationsverfahren amplifiziert wird, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus: Klonieren, transkriptionsbasierende Amplifikation, die Polymerasekettenreaktion (PCR), die Ligasekettenreaktion (LCR) und Strangumordnungsamplifikation (SDA).
- Verfahren nach Anspruch 2, worin der feste Träger ausgewählt wird aus der Gruppe, bestehend aus: Kügelchen, flachen Oberflächen, Nadeln, Kämmen und Wafer.
- Verfahren nach Anspruch 7, worin Immobilisierung verwirklicht wird durch Hybridisierung zwischen einer Anordnung komplementärer Einfangnukleinsäuremoleküle, welche zuvor auf einem Träger immobilisiert worden sind, und einem Teil des Nukleinsäuremoleküls, welcher verschieden von der Zielnukleinsäuresequenz ist.
- Verfahren nach Anspruch 8, worin die komplementären Einfangnukleinesäuremoleküle Oligonukleotide oder Oligonukleotidmimetika sind.
- Verfahren nach Anspruch 2, worin die Immobilisierung reversibel ist.
- Verfahren nach Anspruch 1, worin das Massenspektrometrieformat ausgewählt wird aus der Gruppe, bestehend aus: Matrix-unterstützte Laserdesorption/Ionisation, Flugzeit (MALDI-TOF), Elektrospray (ES), Ionencyclotronresonanz (ICR), Fourier-Transform und Kombinationen davon.
- Verfahren nach Anspruch 1, worin vor Schritt b) eines oder beide von dem Detektoroligonukleotid und Nukleinsäuremolekül behandelt werden, um die Laserenergie, die zur Verdampfung erforderlich ist, zu verringern, Fragmentierung zu minimieren oder Signalverbreiterung zu eliminieren.
- Verfahren nach Anspruch 1, worin mindestens zwei Detektoroligonukleotide oder Oligonukleotidmimetika massendifferenziert werden, um mindestens zwei Targetnukleinsäuresequenzen gleichzeitig nachzuweisen und zu unterscheiden.
- Verfahren nach Anspruch 13, worin die Massendifferenzierung erreicht wird durch Unterschiede der Länge oder Sequenz der mindestens zwei Oligonukleotide.
- Verfahren nach Anspruch 13, worin die Massendifferenzierung erreicht wird durch Einführen von Massen-modifizierenden Funktionalitäten in den Base-, Zucker- oder Phosphatrest der Detektoroligonukleotide.
- Verfahren nach Anspruch 13, worin die Massendifferenzierung durch den Austausch von Kationen an der Phosphodiesterbindung erreicht wird.
- Verfahren nach Anspruch 1, worin das Nukleinsäuremolekül unter Verwendung Massen-modifizierter Deoxynukleosidtriphosphate und RNA-abhängiger DNA-Polymerase vor der Massenspektrometrie repliziert wird.
- Verfahren nach Anspruch 1, worin das Nukleinsäuremolekül unter Verwendung von Massen-modifizierten Ribonukleosidtriphosphaten und DNA-abhängiger RNA-Polymerase vor der Massenspektrometrie repliziert wird.
- Verfahren nach Anspruch 1, worin die Targetnukleinsäuresequenz ein DNA-Fingerprint ist oder verbunden ist mit einer Krankheit oder einem Zustand, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus einer genetischen Krankheit Chromosomenanomalie, einer genetischen Predisposition, einer viralen Infektion, einer Pilzinfektion, einer Bakterieninfektion und einer Protistinfektion.
- Verfahren zum Nachweis einer oder mehrerer Zielnukleinsäuresequenzen, die in einer biologischen Probe vorliegen, umfassend die Schritte: a) Amplifizieren eines oder mehrerer Nukleinsäuremoleküle; b) Hybridisieren eines oder mehrerer Detektoroligonukleotide mit den Nukleinsäuremolekülen und Entfernen von nicht hybridisiertem Detektoroligonukleotid; c) Ionisieren und Verdampfen des Produkts von Schritt b); und d) Analysieren der ionisierten und verdampften Nukleinsäure durch Massenspektrometrie, worin der Nachweis des Detektoroligonukleotids durch Massenspektrometrie das Vorliegen der Targetnukleinsäuresequenz in der biologischen Probe anzeigt.
- Verfahren nach Anspruch 20, worin die Nukleinsäure durch ein Amplifikationsverfahren amplifiziert wird, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus: Klonieren, auf Transkription basierende Amplifikation, die Polymerasekettenreaktion (PCR), die Ligasekettenreaktion (LCR) und Strangumordnungsamplifikation (SDA).
- Verfahren nach Anspruch 20, worin das Massenspektrometer ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus Matrix-unterstützte Laserdesorption/Ionisation, Flugzeit (MALDI-TOF), Elektrospray (ES), Ionencyclotronresonanz (ICR), Fourier-Transform und Kombinationen davon.
- Verfahren nach Anspruch 20, worin vor Schritt c) eines oder beide von dem Detektoroligonukleotid und dem Nukleinsäuremolekül behandelt werden, um die für die Verdampfung erforderliche Laserenergie zu verringern, Fragmentierung zu minimieren oder Signalverbreiterung zu eliminieren.
- Verfahren nach Anspruch 23, worin mindestens zwei Detektoroligonukleotide oder Oligonukleotidmimetika massendifferenziert werden, um mindestens zwei Targetnukleinsäuresequenzen gleichzeitig nachzuweisen und zu unterscheiden.
- Verfahren nach Anspruch 24, worin die Massendifferenzierung durch Massenmodifizierungsfunktionalitäten, die an Primer gebunden sind, die zur Amplifikation verwendet werden, erreicht wird.
- Verfahren nach Anspruch 24, worin die Massendifferenzierung durch Austausch von Kationen oder Entfernung der Ladung an der Phosphodiesterbindung erreicht wird.
- Verfahren nach Anspruch 20, worin das Nukleinsäuremolekül DNA ist.
- Verfahren nach Anspruch 20, worin das Nukleinsäuremolekül RNA ist.
- Verfahren nach Anspruch 20, worin vor Schritt c) amplifizierte Nukleinsäuremoleküle auf einem festen Träger immobilisiert werden.
- Verfahren nach Anspruch 29, worin Immobilisierung durch Hybridisierung zwischen einem komplementären Einfangnukleinsäuremolekül, welches zuvor auf einem festen Träger immobilisiert worden ist, und dem Nukleinsäuremolekül verwirklicht wird.
- Verfahren nach Anspruch 29, worin der feste Träger ausgewählt wird aus der Gruppe, bestehend aus: Kügelchen, flache Oberflächen, Nadeln, Kämme und Wafer.
- Verfahren nach Anspruch 29, worin die Immobilisierung reversibel ist.
- Verfahren nach Anspruch 20, worin die Targetnukleinsäuresequenz ein DNA-Fingerprint ist oder kennzeichnend für eine Krankheit oder einen Zustand ist, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus einer genetischen Krankheit, einer Chromosomenanomalie, einer genetischen Predisposition, einer viralen Infektion, einer Pilzinfektion, einer Bakterieninfektion und einer Protistinfektion.
- Verfahren zum Nachweis einer Zielnukleinsäuresequenz in einer biologischen Probe, umfassend die Schritte: a) Replizieren eines Nukleinsäuremoleküls; b) spezifisches Verdauen des replizierten Nukleinsäuremoleküls unter Verwendung von mindestens einer geeigneten Nuklease, wobei verdaute Fragmente erhalten werden; und c) Analysieren der Fragmente durch Massenspektrometrie, worin der Nachweis des Molekulargewichts der Fragmente anzeigt, ob die Zielnukleinsäuresequenz vorliegt.
- Verfahren nach Anspruch 34, worin die Nukleinsäurefragmente auf einem festen Träger immobilisiert werden.
- Verfahren nach Anspruch 35, worin der feste Träger komplementäre Einfangnukleinsäuremoleküle enthält.
- Verfahren nach Anspruch 35, worin der feste Träger ausgewählt wird aus der Gruppe, bestehend aus: Kügelchen, flachen Oberflächen, Nadeln, Kämmen und Wafer.
- Verfahren nach Anspruch 36, worin die komplementären Einfangnukleinsäuremoleküle Oligonukleotide oder Oligonukleotidmimetika sind.
- Verfahren nach Anspruch 35, worin die Immobilisierung reversibel ist.
- Verfahren nach Anspruch 34, worin das Massenspektrometer ausgewählt wird aus der Gruppe, bestehend aus: Matrix-unterstützte Laserdesorption/Ionisation, Flugzeit (MALDI-TOF), Elektrospray (ES), Ionencyclotronresonanz (ICR), Fourier-Transform und Kombinationen davon.
- Verfahren nach Anspruch 34, worin vor Schritt c) die Nukleinsäurefragmente behandelt werden, um die Laserenergie, die zur Verdampfung erforderlich ist, zu erniedrigen, Fragmentierung zu minimieren oder Signalverbreiterung zu eliminieren.
- Verfahren nach Anspruch 41, worin die Behandlung Massendifferenzierung ist.
- Verfahren nach Anspruch 42, worin die Massendifferenzierung erreicht wird durch Einbringen Massen-modifizierender Funktionalitäten in den Base-, Zucker- oder Phosphatrest der Detektoroligonukleotide.
- Verfahren nach Anspruch 41, worin die Behandlung durch den Austausch von Kationen an der Phosphordieseterbindung erreicht wird.
- Verfahren nach Anspruch 34, worin das Nukleinsäuremolekül in DNA unter Verwendung Massen-modifizierter Deoxynukleosid- und/oder Dideoxynukleosidtriphosphate und RNA-abhängiger DNA-Polymerase repliziert wird.
- Verfahren nach Anspruch 34, worin das Nukleinsäuremolekül in RNA repliziert wird unter Verwendung von Massenmodifizierten Ribonukleosid- und/oder 3'-Dideoxynukleosidtriphosphaten und DNA-abhängiger RNA-Polymerase.
- Verfahren nach Anspruch 34, worin das Nukleinsäuremolekül in DNA repliziert wird unter Verwendung von Masse-modifizierten Deoxynukleosid- und/oder Dideoxynukleosidtriphosphaten und DNA-abhängiger DNA-Polymerase.
- Verfahren nach Anspruch 34, worin die Targetnukleinsäuresequenz ein DNA-Fingerprint ist oder kennzeichnend für eine Krankheit oder einen Zustand ist, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus einer genetischen Krankheit, einer Chromosomenanormalität, einer genetischen Predisposition, einer viralen Infektion, einer Pilzinfektion, einer Bakterieninfektion und einer Protestinfektion.
- Verfahren zum Identifizieren eines Targetnukleotids in einem Nukleinsäuremolekül, umfassend die Schritte: a) Hybridisieren des Nukleinsäuremoleküls mit einem Primeroligonukleotid, das komplementär zu einer Steile ist, die benachbart dem Targetnukleotid in einem Nukleinsäuremolekül ist; b) Inkontaktbringen des Produkts von Schritt a) mit einem vollständigen Satz von Dideoxynukleosidtriphosphaten, 3'-Deoxynukleosidtriphosphaten oder Ribonukleotidtriphosphaten und einer Polymerase, sodass nur die Dideoxynukleosid-, 3'-Deoxynukleosid oder Ribonukleotidtriphosphate, die komplementär zu dem Targetnukleotid sind, auf dem Primer verlängert werden; c) Ionisieren und Verdampfen des Produkts von Schritt b); und d) Analysieren der ionisierten und verdampften Nukleinsäure durch Massenspektrometrie, worin der Nachweis des Primers durch Massenspektrometrie die Identifizierung des Targetnukleotids bestimmt.
- Verfahren nach Anspruch 49, worin vor Schritt a) das Nukleinsäuremolekül auf einem Träger immobilisiert wird.
- Verfahren zum Nachweis einer Mutation in einem Nukleinsäuremolekül, umfassend die Schritte: a) Hybridisieren eines Nukleinsäuremoleküls mit einer Oligonukleotidsonde, wobei eine fehlende Übereinstimmung an der Stelle einer Mutation gebildet wird; b) Inkontaktbringen des Produkts von Schritt a) mit einer einstrangspezifischen Endonuklease; c) Ionisieren und Verdampfen des Produkts von Schritt b); und d) Nachweisen der durch Massenspektrometrie erhaltenen Produkte, worin das Vorliegen von mehr als einem Fragment anzeigt, dass das Nukleinsäuremolekül eine Mutation enthält.
- Verfahren zum Nachweis einer Targetnukleinsäuresequenz, die in einer biologischen Probe vorliegt, umfassend die Schritte: a) Erhalten einer Nukleinsäure, die eine Targetnukleinsäuresequenz enthält, aus einer biologischen Probe; b) Durchführen mindestens einer Hybridisierung der Targetnukleinsäuresequenz mit einem Satz von Ligationsedukten und einer thermostabilen DNA-Ligase, wobei ein Ligationsprodukt gebildet wird; c) Ionisieren und Verdampfen des Produkts von Schritt b); und d) Nachweisen des Ligationsprodukts durch Massenspektrometrie und Vergleichen des erhaltenen Wertes mit einem bekannten Wert, um die Targetnukleinsäuresequenz zu bestimmen.
- Verfahren nach Anspruch 34, worin die Nuklease eine Endonuklease ist.
- Verfahren zum Nachweis einer oder mehrerer Zielnukleinsäuresequenzen in einer biologischen Probe umfassend: a) Amplifizieren eines oder mehrerer Targetnukleinsäuremoleküle; b) Ionisieren und Verdampfen des Produkts von Schritt a); und c) Analysieren der ionisierten und verdampften Nukleinsäure durch Massenspektrometrie, worin der Nachweis der Targetnukleinsäuresequenz durch Massenspektrometrie das Vorliegen der Targetnukleinsäuresequenz in der biologischen Probe anzeigt; mit der Maßgabe, dass das ionisierte und verdampfte Produkt nicht ist: i) ein Nukleinsäuremolekül, das keine oder bis zu zehn negative Ladungen und keine oder bis zu zehn positive Ladungen enthält, worin wenn das Nukleinsäuremolekül keine negativen Ladungen aufweist, es mehr als 17 Zucker-Zucker-Bindungen aufweist und wenn die Nukleinsäure eine Ladung aufweist, gibt es weniger Ladungen als es Zucker-Zucker-Bindungen gibt; oder ii) ein Nukleinsäuremolekül, das eine negativ geladene nicht-Phosphat-Zucker-Zucker-Bindung umfasst und in welchem die Ladung von allen oder bis zu allen außer zehn der Zucker-Zucker-Bindungen des Nukleinsäuremoleküls eliminiert worden sind; und worin das Nukleinsäuremolekül, das in (i) und (ii) definiert ist, aus Templat-DNA, die von einem Patienten stammt, hergestellt ist, worin der Patient ein Patient ist, in dem das Vorliegen oder die Abwesenheit einer Mutation bestimmt werden soll und welche durch PCR amplifiziert wird.
- Verfahren nach Anspruch 1 oder 54, worin eine genetische Krankheit, Chromosomenanomalie, genetische Prädisposition für eine Krankheit oder einen Zustand oder eine Infektion durch ein Pathogen nachgewiesen oder ihre Identität bestimmt werden kann.
- Verfahren nach Anspruch 2, worin eine Pluralität von Nukleinsäuren auf einem festen Träger in einer Anordnung angeordnet werden und jeder Spot auf der Anordnung einer massenspektrometrischen Analyse unterzogen wird.
- Verwendung einer massenspektrometrischen Analyse zum Nachweis in einer biologischen Probe einer genetischen Krankheit, einer Chromosomenanomalität, einer Prädisposition für eine Krankheit oder einen Zustand oder eine Infektion durch einen pathogenen Organismus durch Bestimmung ob die Probe eine Zielnukleinsäuresequenz umfasst, die ein Molekulargewicht gemäß Bestimmung durch Massenspektrometrie aufweist, das charakteristisch ist für die Krankheit, Abnormität, den Zustand oder die Infektion; mit der Maßgabe, dass die Zielnukleinsäuresequenz nicht ist: i) ein Nukleinsäuremolekül, das keine oder bis zu zehn negative Ladungen und keine oder bis zu zehn positive Ladungen enthält, worin wenn das Nukleinsäuremolekül keine negativen Ladungen aufweist, es mehr als 17 Zucker-Zucker-Bindungen aufweist und wenn die Nukleinsäure eine Ladung aufweist, gibt es weniger Ladungen als es Zucker-Zucker-Bindungen gibt; oder ii) ein Nukleinsäuremolekül, das eine negativ geladene nicht-Phosphat-Zucker-Zucker-Bindung umfasst und in welchem die Ladung von allen oder bis zu allen außer zehn der Zucker-Zucker-Bindungen des Nukleinsäuremoleküls eliminiert worden sind; und worin das Nukleinsäuremolekül, das in (i) und (ii) definiert ist, aus Templat-DNA, die aus einem Patienten stammt, hergestellt ist, worin der Patient ein Patient ist, in dem das Vorliegen oder die Abwesenheit einer Mutation bestimmt werden soll, worin die Mutation eine genetische Krankheit verursacht, und welche durch PCR amplifiziert wird.
- Verwendung einer Massenspektrometrieanalyse zum Erhalten einer Information aus einer biologischen Probe, die in Bezug steht mit der Identität, Vererbung oder genetischen Kompatibilität des Individuums, aus welchem die Probe erhalten worden ist, durch Bestimmen ob die Probe eine Targetnukleinsäure umfasst, die ein Molekulargewicht gemäß Bestimmung durch Massenspektrometrie aufweist, das repräsentativ für die Identität, Vererbung oder Kompatibilität ist.
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