DE69629478T2

DE69629478T2 - Vorrichtung und verfahren zur erzeugung von gasbläschen optimaler grösse

Info

Publication number: DE69629478T2
Application number: DE69629478T
Authority: DE
Inventors: C. Evan UNGER; Thomas Mccreery; David Yellowhair; R. Terrence BARRETTE
Original assignee: ImaRx Pharmaceutical Corp
Current assignee: ImaRx Pharmaceutical Corp
Priority date: 1995-06-07
Filing date: 1996-06-06
Publication date: 2004-06-17
Anticipated expiration: 2016-06-07
Also published as: CA2218860C; JPH11507873A; CN1221214C; US6039557A; EP0840570A2; MX9709717A; AR002310A1; ES2207687T3; HK1010127A1; JP3645909B2; US5656211A; WO1997000638A3; EP0840570B1; AU703846B2; BR9609343A; CA2218860A1; DE69629478D1; AU7594796A; WO1997000638A2; EP0840570A4

Description

Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung richtet sich auf ein Verfahren und eine Vorrichtung zur Herstellung gasgefüllter Vesikel, insbesondere gasgefüllter Vesikel, die zur Ultraschallabbildung verwendbar sind. Insbesondere richtet sich die vorliegende Erfindung auf ein Verfahren und eine Vorrichtung zur Herstellung gasgefüllter Vesikel durch Schütteln, wobei die Schüttelparameter zur Bereitstellung von Vesikeln optimaler Größe in einer minimalen Zeit gesteuert werden.
Hintergrund der Erfindung
Ultraschall ist eine diagnostische Abbildungstechnik, die eine Reihe von Vorteilen gegenüber anderen diagnostischen Methodologien bietet. Im Gegensatz zu Techniken, wie Nuklearmedizin und Röntgenstrahlung setzt Ultraschall den Patienten nicht möglichen schädlichen Bestrahlungen durch ionisierende Elektronenstrahlung aus, die möglicherweise biologische Materialien, wie zum Beispiel DNA, RNA und Proteine beschädigen kann. Zusätzlich ist die Ultraschalltechnologie eine relativ günstige Variante im Vergleich zu Techniken, wie Computertomographie (CT) oder Magnetische Resonanzabbildung.
Das Prinzip des Ultraschalls basiert auf der Tatsache, dass Schallwellen unterschiedlich von Geweben reflektiert werden, in Abhängigkeit von der Zusammensetzung und Dichte des beobachteten Gewebes oder Gefäßsystems. In Abhängigkeit von der Gewebezusammensetzung werden die Ultraschallwellen entweder durch Absorption dissipieren, das Gewebe durchdringen oder reflektieren. Die Reflexion, die als Rückstreuung oder Reflexionsvermögen bezeichnet wird, ist die Grundlage zur Entwicklung einer Ultraschallabbildung. Ein Schallumwandler, der typischennreise in der Lage ist, in klinischen apparativen Anordnungen Schallwellen im Bereich von 1 MHz bis 10 MHz nachzuweisen, wird zum äußerst genauen Nachweis der zurückkehrenden Schallwellen verwendet. Diese Wellen werden dann zu einem Bild integriert, das quantitativ bestimmt werden kann. Die quantitativ bestimmten Wellen werden dann in ein Bild des beobachteten Gewebes umgewandelt.
Trotz der technischen Verbesserungen der Ultraschallvariante werden die Abbildungen noch weiter verfeinert, insbesondere im Hinblick auf die Abbildung des Gefäßsystems und Geweben, die mit Blut, das von dem Gefäßsystem geliefert wird, durchtränkt sind. Es gibt daher einen Bedarf für die Formulierung von Mitteln, die bei der Visualisierung des Gefäßsystems und der vaskulär assoziierten Organe helfen.
Vesikel sind wünschenswerte Kontrastmittel für den Ultraschall, weil die Schallreflexion an einer Flüssigkeits-Gas-Grenzfläche, wie zum Beispiel die Oberfläche eines Vesikels, äußerst wirksam ist.
Damit die Vesikel wirksame Ultraschallkontrastmittel sind, sollten sie so groß und elastisch wie möglich sein, da beide Eigenschaften (Blasengröße und Elastizität) zur Maximierung des Schallreflexionsvermögens von den Vesikeln wichtig sind. Die Vesikel sollten zusätzlich druckbeständig sein, das heißt, sie sollten mehr als 50% des Gasinhalts nach Aussetzen gegenüber Druck zurückbehalten. Es ist ebenfalls höchst erwünscht, dass sich die Vesikel nach Nachlassen des Drucks wieder zurückausdehnen. Es ist weiterhin höchst erwünscht eine hohe Vesikelkonzentration zu haben, um das Reflexionsvermögen und folglich den Kontrast zu maximieren. Die Vesikelkonzentration ist daher ein wichtiger Faktor bei der Bestimmung der Leistungsfähigkeit der Vesikel. Insbesondere ist es wünschenswert mehr als 100 × 10⁶ Vesikel pro ml und bevorzugter mehr als 500 × 10⁶ Vesikel pro ml zu haben.
Die Größe bleibt jedoch ein entscheidender Faktor bei der Bestimmung der Eignung von Vesikeln zur Abbildung. Im Bereich der Vesikel, die sicher durch das Kapillargefäßsystem hindurchgehen können, kann das reflektierte Signal (Rayleigh Streuung) eine Funktion des Durchmessers der Vesikel sein, die bis zur sechsten Potenz verstärkt ist, so dass ein Vesikel mit einem Durchmesser von 4 μm die 64-fache Streufähigkeit eines Vesikels mit einem Durchmesser 2 μm besitzt.
Die Größe ist ebenfalls wichtig, weil Vesikel, die größer als 10 μm sind, gefährlich sein können. Große Vesikel weisen nach intravenöser oder intravaskulärer Injektion eine Tendenz zum Verschließen von Mikrogefäßen auf. Es ist daher wichtig, dass die Vesikel so groß wie möglich sind, um den Schall wirkungsvoll zu reflektieren, aber klein genug sind, um durch die Kapillaren hindurch zukommen.
Im Hinblick darauf ist es höchst erwünscht, dass 99% der Vesikel kleiner als 10 μm sind. Weiterhin sollte die durchschnittliche Vesikelgröße mindestens 0,5 μm, vorzugsweise mehr als 1 μm und besonders bevorzugt in der Nähe von 2 μm für einen besonders wirkungsvollen Kontrast sein. Zusätzlich sollte der volumengewichtete Mittelwert in der Größenordnung von 7 μm sein.
Die Elastizität der Vesikel kann ihre maximal zulässige Größe beeinflussen, da mit größerer Elastizität des Vesikels die Fähigkeit, sich durch die Kapillaren zu „zwängen" zunimmt. Leider kann eine Anzahl Faktoren die Bildung hoch elastischer Vesikel verhindern, wodurch die Bedeutung der Optimierung der Vesikelgröße untermauert wird.
Obwohl unbeschichtete Vesikel eine maximale Elastizität aufweisen, sind sie im allgemeinen instabil. Folglich werden oftmals Anstrengungen unternommen, um die Stabilität der Vesikel zu verbessern, wie zum Beispiel durch Beschichtung, die die Verringerung ihrer Elastizität bewirkt. Zusätzlich wurde die Verwendung von Gas oder Gasvorläufern vorgeschlagen, die in einer proteinhaltigen Hülle eingekapselt sind, wobei das Protein mit biozersetzbaren Vernetzungsmitteln vernetzt wird, so wie auch die Verwendung nicht porteinhaltiger Vesikel, die mit bioverträglichen Verbindungen kovalent vernetzt sind. Es kann angenommen werden, dass solche Vernetzer dem Vesikel eine Komponente der Starrheit verleihen und somit deren Elastizität verringern.
Obwohl bekannt ist, dass Liposomen durch Schütteln einer Lösung eines grenzflächenaktiven Stoffs in einem flüssigen Medium hergestellt werden können (siehe U.S. Patent 4,684,479 (D'Arrigo), ist bis jetzt kein Verfahren zur Herstellung von Vesikeln optimaler Größe in minimaler Zeit entwickelt worden. Aus den vorstehenden Gründen gibt es folglich einen Bedarf für ein Verfahren und eine Vorrichtung zur Herstellung von Vesikeln, wobei die Schüttelparameter so gesteuert werden, dass Vesikel optimaler Größe in minimaler Zeit hergestellt werden.
Zusammenfassung der Erfindung
Es ist ein Ziel der vorliegenden Erfindung ein Verfahren und eine Vorrichtung zur Herstellung von Vesikeln, entsprechend der Definition in den beigefügten Ansprüchen, zur Verfügung zu stellen, wobei die Schüttelvariablen so gesteuert werden, dass Vesikel optimaler Größe in einer minimalen Zeit hergestellt werden. Dieses und andere Ziele werden über ein Verfahren erreicht, bei dem ein Behälter, der eine wässrige Suspensionsphase und eine gasförmige Phase enthält, unter Verwendung einer reziproken Bewegung geschüttelt wird. Die reziproke Bewegung wird durch einen Schüttelarm erzeugt, der den Behälter in zwei, im wesentlichen zueinander senkrechten Richtungen bewegt. Die Bewegung in der ersten Richtung findet entlang einer gekrümmten Strecke mit einem Krümmungsradius von mindestens 6 cm statt und überdeckt einen Winkel von mindestens 3°. Die Gesamtstrecke der Bewegung erfolgt in der Figur einer Acht. Die Schüttelfrequenz beträgt mindestens 2800 Upm, die Schüttelamplitude beträgt mindestens 0,3 cm und die Gesamtfänge des von dem Behälter durchlaufenen Weges, während eines jeden Zyklus beträgt mindestens 0,7 cm.
Die vorliegende Erfindung umfaßt ebenfalls eine Vorrichtung zum Schütteln eines Behälters, der eine wässrige Suspensionsphase und eine gasförmige Phase enthält, unter Verwendung des vorstehend beschriebenen Verfahrens. Die Vorrichtung weist einen Schüttelarm mit einer Länge von mindestens 6 cm auf, der über einen Winkel von mindestens 3° rotiert.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1 ist ein Aufriß des Behälterteils der Schüttelvorrichtung der vorliegenden Erfindung, wobei die Vesikel durch das Schüttelverfahren der vorliegenden Erfindung hergestellt werden.
2 ist eine isometrische Ansicht der erfindungsgemäßen Schüttelvorrichtung ohne den Behälter.
3 ist ein Längsschnitt durch die in 2 gezeigte Schüttelvorrichtung, ohne die Abdeckung, jedoch einschließlich des in 1 gezeigten Behältereinbaus.
4 und 5 sind Aufrisse beziehungsweise Draufsichten der Strecke, die der in 1 gezeigte Behälter nimmt, wenn er auf dem in 2 gezeigten Schüttelarm befestigt wird, wobei 5 die Ansicht entlang der in 4 gezeigten V-V-Linie zeigt.
6 ist eine isometrische Ansicht der internen Hauptkomponenten der in 2 gezeigten Schüttelvorrichtung.
7 und 8 sind Längsschnitte durch die in 2 gezeigte Schüttelvorrichtung, in der Nähe des Bereichs in dem der Schüttelarm auf der Motorwelle befestigt ist, wobei die Position des Schüttelarms so ist, dass die exzentrische Laufbüchse in der in 8 gezeigten Orientierung ist, die in 7 als Schattenriß gezeigt ist.
9(a) und (b) sind Ansichten entlang der in 7 gezeigten Linie IX-IX des Schüttelarms, mit Ausnahme davon, dass in den 9(a) und (b) die exzentrische Laufbüchse um 90° beziehungsweise 270° bezüglich ihrer in 7 gezeigten Ausrichtung gedreht ist.
10 ist ein Querschnitt entlang der in 9(b) gezeigten Linie X-X, wobei die Orientierung der Büchse so ist, dass die exzentrische Laufbüchse um 180°, wie sie im Schattenriß gezeigt ist, gedreht ist.
11 ist eine isometrische Ansicht der exzentrischen Laufbüchse, wie sie auf der Motorwelle befestigt ist.
12 ist eine zu 9 ähnliche Ansicht, die die Ausrichtung des Schüttelarms bei geringerer Anwendung von Federspannung zeigt.
13 ist eine graphische Darstellung, die einerseits die Beziehung zwischen der Schüttelfrequenz in Upm und der Schüttelarmlänge L in cm und einen aufgespannten Verschiebungswinkel Θ, zeigt und andererseits dazu verwendet wurde, um die in den 14–16 gezeigten Testergebnisse zu erhalten.
Die 14(a)–(c) sind graphische Darstellungen, die den Prozentsatz der Vesikel mit einer Größe von weniger als 10 μm, die zahlengewichtete mittlere Größe und die Teilchen pro ml gegen die Schüttelarmlänge L in mm zeigt, während die Schüttelarmlänge und Upm entsprechend 13 bei einer aufgespannten Winkelverschiebung Θ von 6° variiert werden.
Die 15(a)–(c) sind zu den 14(a)–(c) ähnliche graphische Darstellungen, die die Ergebnisse, die unter Verwendung eines aufgespannten Verschiebungswinkels Θ von 9° erhalten wurden mit denjenigen vergleichen, die in den 14(a) bis (c) erhalten wurden.
Die 16(a)–(c) sind graphische Darstellungen, die den Prozentsatz der Vesikel mit einer Größe von weniger als 10 μm, die zahlengewichtete mittlere Größe und die Teilchen pro ml gegen die Gesamtlänge der Schüttelstrecke in cm zeigen.
17 ist eine graphische Darstellung, die die Beziehung zwischen der Schüttelfrequenz in Upm und der Gesamtlänge der Schüttelstrecke in cm zeigt und die zum Erhalten der in 16 gezeigten Testergebnisse verwendet wurde.
Die 18(a)–(c) sind graphische Darstellungen, die den Prozentsatz der Vesikel mit einer Größe von weniger als 10 μm, die zahlengewichtete mittlere Größe und die Teilchen pro ml für drei unterschiedliche Arten von Schüttelvorrichtungen zeigt.
Beschreibung der bevorzugten Ausführungsform
Entsprechend dem erfindungsgemäßen Verfahren werden Vesikel optimaler Größe hergestellt, indem zuerst eine wässrige Suspension 34, die vorzugsweise Lipide umfaßt, in einen Behälter 9 gegeben wird, wie in 1 gezeigt wird.
Wie hier verwendet wird, bezieht sich der Ausdruck „Vesikel" auf eine kugelförmige Einheit, die durch das Vorhandensein eines inneren Hohlraums charakterisiert ist. Bevorzugte Vesikel werden von Lipiden, einschließlich der hier beschriebenen verschiedenen Lipide formuliert. In einem beliebigen gegebenen Vesikel können die Lipide in Form einer Monoschicht oder Doppelschicht sein und die Lipide der Mono- oder Doppelschicht können zur Bildung von einer oder mehreren Mono- oder Doppelschichten verwendet werden. Im Falle von mehr als einer Mono- oder Doppelschicht sind die Mono- oder Doppelschichten im allgemeinen konzentrisch. Die hier beschriebenen Vesikel werden ebenfalls manchmal als Blasen oder Mikroblasen bezeichnet und umfassen solche Einheiten, die im allgemeinen als Liposomen und Mizellen und dergleichen bezeichnet werden. Die Vesikel können daher zur Bildung eines unilamellaren Vesikels (das eine Monoschicht oder Doppelschicht umfaßt), eines oligolamellaren Vesikels (das ungefähr zwei oder ungefähr drei Monoschichten oder Doppelschichten umfaßt) oder eines multilamellaren Vesikels (das mehr als ungefähr drei Monoschichten oder Doppelschichten umfaßt) verwendet werden. Der innere Hohlraum der Vesikel kann mit einem Gas oder einem gasförmigen Vorläufer gefüllt sein.
„Liposom" bezieht sich im allgemeinen auf einen kugelförmigen Cluster oder ein Aggregat amphipatischer Verbindungen, die Lipidverbindungen typischerweise in Form von einer oder mehreren konzentrischen Schichten umfassen. Das gasgefüllte Liposom ist besonders bevorzugt aus einer einzelnen Schicht (das heißt unilamellar) oder einer einzelnen Lipidmonoschicht aufgebaut. Eine große Vielfalt von Lipiden kann zur Herstellung der Liposomen verwendet werden, einschließlich Phospholipide und nichtionische grenzflächenaktive Stoffe (zum Beispiel Niosome). Besonders bevorzugt sind die, das gasgefüllte Liposom umfassenden Lipide in dem Gelzustand bei physiologischer Temperatur. Die Liposomen können vernetzt oder polymerisiert sein und können Polymere, wie zum Beispiel Polyethylenglycol auf ihren Oberflächen tragen. Targetingliganden, die auf endotheliale Zellen gerichtet sind, werden an die Oberfläche der gasgefüllten Liposomen gebunden. Ein Targetingligand ist eine Substanz, die an ein Vesikel gebunden ist und das Vesikel auf einen speziellen Zelltyp richtet, wie zum Beispiel und nicht einschränkend auf endotheliales Gewebe und/oder Zellen. Der Targetingligand kann an das Vesikel durch kovalente oder nicht kovalente Bindungen gebunden sein. Die Liposomen können ebenfalls hier als Lipidvesikel bezeichnet werden. Besonders bevorzugt sind die Liposomen im wesentlichen ohne Wasser in ihrem Inneren.
„Mizelle" bezieht sich auf kolloidale Einheiten, die von lipidischen Verbindungen gebildet werden, wenn die Konzentration der lipidischen Verbindungen, wie zum Beispiel Laurylsulfat oberhalb einer kritischen Konznetration ist. Da viele der Verbindungen, die Mizellen bilden, ebenfalls Eigenschaften von grenzflächenaktiven Stoffen aufweisen (das heißt, die Fähigkeit zur Herabsetzung der Oberflächenspannung und sowohl wasser- als auch fettliebende – hydrophile und lipophile Domänen), können dieselben Materialen ebenfalls zur Stabilisierung von Blasen verwendet werden. Im allgemeinen nehmen diese mizellaren Materialien eine Monoschicht oder eine hexagonale H2-Phasenkonfiguration bevorzugt ein, sie können jedoch auch eine Doppelschichtkonfiguration einnehmen. Wird ein mizellares Material zur Bildung eines gasgefüllten Vesikels verwendet, so werden die Verbindungen im allgemeinen eine radiale Konfiguration einnehmen, wobei die aliphatischen (fettliebende) Einheiten zu dem Vesikel hin gerichtet sind und die hydrophilen Domänen weg von der Vesikeloberfläche gerichtet sind. Zum Abzielen auf endotheliale Zellen können die Targetingliganden an die mizellaren Verbindungen oder an amphipatische Materialien gebunden sein, die den mizellaren Verbindungen beigemischt sind. Alternativ dazu können Targetingliganden an die Oberfläche der mizellaren Materialien adsorbiert sein, wobei sie die Vesikel stabilisieren.
Eine Gasphase wird über der wässrigen Suspensionsphase 34 in dem restlichen Teil oder oberen Gasraum 32 der Behälters 9 verwendet. Die Einführung der Gasphase kann durch Spülen des Behälters 9 mit einem Gas erreicht werden, falls als Gasphase ein anderes Gas als Luft verwendet werden soll, so dass das Gas den oberen Gasraum 32 über der wässrigen Suspension 34 einnimmt. Vor dem Schütteln enthält daher der Behälter 9 eine wässrige Suspensionsphase und eine gasförmige Phase. Dann wird der Behälter 9 an dem Schüttelarm 7 der Schüttelvorrichtung 1 der vorliegenden Erfindung angebracht, wovon eine bevorzugte Ausführungsform in den 2, 3 und 6–11 gezeigt ist, und während einer Zeitdauer geschüttelt, die zur Bildung der erwünschten Vesikel ausreicht.
Obwohl Filter zur weiteren Verfeinerung der Größenverteilung der Vesikel nach dem Schütteln verwendet werden können, liegt der Fokus der vorliegenden Erfindung auf der Steuerung der Schüttelparameter, um vorrangig Vesikel optimaler Größe herzu stellen, als auf irgendeiner Filtration nach dem Schütteln. Bis dahin haben die Erfinder festgestellt, dass die Größe der durch Schütteln hergestellten Vesikel hauptsächlich eine Funktion von vier Variablen ist:

(i) die Zusammensetzung der wässrigen Suspensionsphase,
(ii) die Zusammensetzung der Gasphase im oberen Gasraum,
(iii) das Volumen des Behälters und das relative Volumen des oberen Gasraums, das anfänglich durch die gasförmige Phase eingenommen wird und
(iv) die Definition der wichtigsten Schüttelparameter – das heißt, die Form der von dem Behälter durchlaufenen Strecke während des Schüttelns, die Amplitude der Schüttelbewegung und die Dauer und Frequenz des Schüttelns.

Entsprechend dem Verfahren der vorliegenden Erfindung sollte jede dieser Variablen in einem Verfahren zur Herstellung von Vesikeln so angepasst werden, dass eine erwünschte Vesikelgrößenverteilung und Konzentration erhalten wird, wobei eine bevorzugte Vesikelgrößenverteilung so ist, daß die Vesikel eine durchschnittliche Größe von mindestens ungefähr 0,5 μm aufweisen und wobei mindestens 95% der Vesikel und bevorzugter mindestens 99% der Vesikel einen Durchmesser von weniger als 10 μm aufweisen und die Konzentration der hergestellten Vesikel mindestens 100 × 10⁶ Vesikel pro ml und bevorzugter mindestens 500 × 10⁶ Vesikel pro ml beträgt. Folglich wird in den nachstehenden Abschnitten I-IV jede dieser vier Variablen einzeln diskutiert. In Abschnitt V wird eine bevorzugte Vorrichtung zur Ausübung des Verfahrens der vorliegenden Erfindung offenbart. Abschnitt VI diskutiert einige Anwendungen der erfindungsgemäß hergestellten Vesikel.
I. Die Zusammensetzung der wässrigen Suspensionsphase
In der wässrigen Suspensionsphase kann eine große Vielfalt von Blasen beschichtenden Mitteln verwendet werden. Die Beschichtungsmittel sind vorzugsweise Lipide. Die Lipide können gesättigt oder ungesättigt sein und können auf Wunsch eine lineare oder verzweigte Form aufweisen. Solche Lipide können zum Beispiel Fettsäuremoleküle umfassen, die einen großen Bereich von Kohlenstoffatomen, vorzugsweise zwischen ungefähr 12 Kohlenstoffatomen und ungefähr 22 Kohlenstoffatomen enthalten. Es können auf Wunsch ebenfalls Kohlenwasserstoffgruppen, bestehend aus Isoprenoideinheiten, Prenylgruppen und/oder Steroleinheiten (zum Beispiel Cholesterol, Cholesterolsulfat und deren Analoga) angewandt werden. Die Lipide können ebenfalls Polymerketten, wie zum Beispiel amphipatische Polymere Polyethylenglycol (PEG) oder Polyvinylpyrrolidon (PVP) oder deren Derivate (für das in vivo Targeting) oder geladene Aminosäuren, wie zum Beispiel Polylysin oder Polyarginin (zur Bindung einer negativ geladenen Verbindung) oder Kohlenhydrate (für das in vivo Targeting), wie zum Beispiel im U.S. Patent Nr. 4,310,505 beschrieben ist, oder Glycolipide (für das in vivo Targeting) oder Antikörper und andere Peptide und Proteine (für das in vivo Targeting) usw. tragen. Solche Targeting- oder bindende Verbindungen können einfach der wässrigen Lipidsuspensionsphase zugefügt werden oder sie können chemisch spezifisch an die Lipide gebunden werden. Auf Wunsch können die Lipide ebenfalls anionische oder kationische Lipide sein, so dass sie selbst in der Lage sein können andere Verbindungen, wie zum Beispiel pharmazeutische Mittel, genetisches Material oder andere therapeutischen Mittel zu binden.
Beispiele von Klassen geeigneter Lipide und spezifisch geeigneter Lipide umfassen: Phosphatidylcholine, wie zum Beispiel Dioleoylphoshatidylcholin, Dimyristoylphosphatidylcholin, Dipalmitoylphosphatidylcholin (DPPC) und Distearoylphosphatidylcholin; Phosphatidylethanolamine, wie zum Beispiel Dipalmitoylphosphatidylethanolamin (DPPE), Dioleoylphosphatidylethanolamin und N-Succinyldioleoylphosphatidylethanolamin; Phosphatidylserine; Phosphatidylglycerole; Sphingolipide; Glycolipide, wie zum Beispiel Gangliosid GM1; Glucolipide; Sulfatide; Glycosphingolipide; Phosphatidsäuren, wie zum Beispiel Dipalmatoylphsophatidsäure (DPPA); Palmitinfettsäuren; Stearinfettsäuren; Arachidonfettsäuren; Laurinfettsäuren; Myristinfettsäuren, Lauroleinfettsäuren; Physeterinfettsäuren; Myristoleinfettsäuren; Palmitoleinfettsäuren; Petroselininfettsäuren; Oleinfettsäuren; Isolaurinfettsäuren; Isomyristinfettsäuren; Isopalmitinfettsäuren; Isostearinfettsäuren; Cholesterol und Cholesterolderivate, wie zum Beispiel Cholesterolhemisuccinat, Cholesterolsulfat und Cholesteryl-(4'-trimethylammonium)butanoat; Polyoxyethylenfettsäureester; Polyoxyethylenfettsäurealkohole, Polyoxyethylenfettsäurealkoholether; polyoxyethylierte Sorbitfettsäurester; Glycerolpolyethylenglycoloxystearat; Glycerolpolyethylenglycolricinoleat; ethoxylierte Sojabohnensterole; ethoxyliertes Rizinusöl; Polyoxyethylenpolyoxypropylenfettsäurepolymere; Polyoxyethylenfettsäurestearate; 12-(((7'-Diethylaminocumarin-3-yl)-carbonyl)-methylamino)-octadecanoinsäure; N-[12-(((7'- Diethylaminocumarin-3-yl)-carbonyl)methylamino)octadecanoyl]-2-aminopalmitinsäure; 1,2-Dioleoyl-sn-glycerol; 1,2-Dipalmitoyl-sn-3-succinylglycerol; 1,3-Dipalmitoyl-2-succinylglycerol und 1-Hexadecyl-2-palmitoylglycerolphosphoethanolamin und Palmitoylhomocystein; Lauryltrimethylammoniumbromid (Lauryl- = Dodecyl-); Cetyltrimethylammoniumbromid (Cetyl- = Hexadecyl); Myristyltrimethylammoniumbromid (Myristyl- = Tetradecyl-); Alkyldimethylbenzylammoniumchloride, wobei Alkyl zum Beispiel C₁₂-, C₁₄- oder C₁₆-Alkyl ist; Benzyldimethyldodecylammoniumbromid; Benzyldimethyldodecylammoniumchlorid, Benzyldimethylhexadecylammoniumbromid; Benzyldimethylhexadecylammoniumchlorid; Benzyldimethyltetradecylammoniumbromid; Benzyldimethyltetradecylammoniumchlorid; Cetyldimethylethylammoniumbromid; Cetyldimethylethylammoniumchlorid; Cetylpyridiniumbromid; Cetylpyridiniumchlorid; N-[1-2,3-Dioleoyloxy)propyl]-N,N,N-trimethylammoniumchlorid (DOTMA); 1,2-Dioleoyloxy-3-(trimethylammonium)propan (DOTAP) und 1,2-Dioleoyl-e-(4'-trimethylammonium)butanoyl-sn-glycerol (DOTB).
Wie für den Fachmann offensichtlich ist, sobald er im Besitz der vorliegenden Offenbarungen ist, ist die vorstehende Liste von Lipiden nur beispielhaft und es können andere verwendbare Lipide, Fettsäuren und Derivate und deren Kombinationen verwendet werden und diese zusätzlichen Verbindungen sollen ebenfalls innerhalb des Umfangs des Ausdrucks Lipid liegen, wie er hier verwendet wird. Wie der Fachmann erkennt, bilden solche Lipide und/oder deren Kombinationen, durch Schütteln des Behälters Liposomen (das heißt, Lipidkugeln mit einem inneren Hohlraum), die Gas von der gasförmigen Phase in ihrem inneren Hohlraum einschließen. Die Liposomen können eine einzelne Lipidschicht (eine Lipidmonoschicht), zwei Lipidschichten (eine Lipiddoppelschicht) oder von mehr als zwei Lipidschichten (eine Lipidmultischicht) umfassen.
Allgemein wird bevorzugt, dass die Lipide insbesondere während des Schüttelns in dem Gelzustand bleiben, das heißt unterhalb der Phasenübergangstemperatur T_m von Gelzustand zu flüssigkristallinem Zustand des Lipidmaterials. Die Phasenübergangstemperaturen von Gelzustand zu flüssigkristallinem Zustand sind für verschiedene Lipide gut bekannt. Solche Temperaturen können ebenfalls einfach unter Verwendung gut bekannter Techniken berechnet werden. Die nachstehende Tabelle 1 von Derek Marsh, „CRC Handbook of Lipid Bilayers", Seite 139, CRC Press, Boca Raton, Florida (1990) zeigt zum Beispiel die Hauptketten-Phasenübergangstemperaturen für eine Vielfalt repräsentativer gesättigter Phosphocholinlipide.
TABELLE 1 Gesättigte Diacyl-sn-glycero-(3)-phosphocholine: Hauptkettenschmelzübergänge
In einer bevorzugten AUsfphrungsform der Erfindung umfaßt die wässrige Lipidphase weiterhin ein Polymer, vorzugsweise ein amphipatisches Polymer und vorzugsweise eines, das direkt an das Lipid gebunden ist (das heißt chemisch gebunden ist). Das amphipatische Polymer ist vorzugsweise Polyethylenglycol oder ein Derivat davon. Die besonders bevorzugte Kombination ist das Lipid Dipalmitoylphsophatidylethanolamin (DPPE), das an Polyethylenglycol (PEG) gebunden ist, insbesondere PEG mit einem durchschnittlichen Molekulargewicht von ungefähr 5000 (DPPE-PEG5000). Das PEG oder ein anderes Polymer kann an das DPPE oder ein anderes Lipid durch eine kovalente Verknüpfung, wie zum Beispiel durch eine Amid-, Carbamat- oder Aminverknüpfung gebunden sein. Alternativ dazu können Ester-, Ether-, Thioester-, Thioamid- oder Disulfid- (Thioester-) Verknüpfungen mit PEG oder einem anderen Polymer verwendet werden, um das Polymer beispielsweise an Cholesterol oder an andere Phospholipide zu binden. Eine besonders bevorzugte Kombination von Lipiden ist DPPC, DPPE-PEG5000 und DPPA, besonders in einem Verhältnis DPPC : DPPE-PEG5000 : DPPA von ungefähr 82% : 8% : 10% (Mol %).
Andere Beschichtungsmittel, die alternativ dazu oder zusätzlich in der wässrigen Suspensionsphase angewandt werden können umfassen Polymere, wie zum Beispiel Proteine, natürliche und halbnatürliche Kohlenhydrate und synthetische Polymere. In der Erfindung kann eine Vielfalt verschiedener Proteine zur Herstellung der gasgefüllten Vesikel verwendet werden. Solche Proteine umfassen Albumin natürlichen (Mensch und Tier) und rekombinanten Ursprungs, Fibrin, Collagen, Antikörper und Elastin. Natürliche Polysaccharide umfassen Stärke, Cellulose, Alginsäure, Pectin, Dextran, Heparin und Hyaluronsäure. Halbnatürliche Polysaccharide umfassen Methylcellulose, Hydroxypropylcellulose, Carboxymethylcellulose und Hydroxyethylstärke. Synthetische Polymere umfassen Polyvinylpyrrolidon, Copolymere aus Ethylen und Propylenglycol (zum Beispiel Pluronic F-68 und die anderen Pluronics), Polyethylenglycol, Polyvinylalkohol, Polyessigsäure, Copolymere aus Milch- und Glycolsäuren, Polymethacrylat und Doppelesterpolymere. In der Erfindung können ebenfalls anorganische Medien, wie zum Beispiel Hydroxyapatit und Calciumpyrophosphat verwendet werden. In allen diesen Fällen werden die Blasenbeschichtungsmittel in der wässrigen Phase in einem Behälter suspendiert und dann geschüttelt, wobei ein oberer Gasraum das vorher ausgewählte Gas enthält. Dies führt zur Bildung der stabilisierten beschichteten Vesikel. Wie der Fachmann erkennt, sobald er im Besitz der Offenbarung dieser Erfindung ist, kann eine große Vielfalt verschiedener Stabilisatoren verwendet werden, um Vesikel nach den erfindungsgemäßen Prinzipien herzustellen.
In einem Experiment mit menschlichem Serumalbumin, BRL-Life Technologies, Gaithersburg, Maryland, wurde ein 10 ml Glasfläschchen, das eine Albuminlösung und einen oberen Gasraum mit Pertluorpropangas (Vol der Flüssigkeit = 6 ml, 5 mg pro ml Albuminlösung) während 2 Minuten bei 2800 Upm mit einem Wig-L-Bug^TM geschüttelt, um Albumin beschichtete Pertluorpropanvesikel mit einem durchschnittlichen Durchmesser von 5 Mikrometern, mit einer Konzentration von 50 Millionen Teilchen pro ml herzustellen.
Der Verwendung der Erfindung ist zusätzlich mit einer Vielfalt von Suspensions- und/oder Viskositätsmitteln verwendbar. Der Ausdruck Suspensionsmittel, wie er hier verwendet wird, bezeichnet eine Verbindung, die zum Bereitstellen einer relativen Einheitlichkeit oder Homogenität des Kontrastmittels beiträgt. Es sind eine Anzahl solcher Mittel, einschließlich Xanthangummi, Akazin, Agar, Alginsäure, Aluminiummonostearat, Bassorin, Karaya, Gummiarabicum, nicht gereinigtes Bentonit, gereinigtes Bentonit, Bentonitmasse, Carbomer 934P, Calciumcarboxymethylcellulose, Natriumcarboxymethylcellulose, Carboxymethylcellulosenatrium 12, Carrageen, Cellulose (mikrokristallin), Dextran, Gelatin, Guar Gum, Hydroxyethylcellulose, Hydroxypropylcellulose, Hydroxypropylmethylcellulose, Magnesiumaluminiumsilicat, Methylcellulose, Pectin, Casein, Gelatin, Polyethylenoxid, Polyvinylalkohol, Povidon, Propylenglycol, Alginat, Siliziumdioxid, kolloidales Siliziumdioxid, Natriumalginat und andere Alginate und Tragant verfügbar. Wie der Fachmann erkennt, kann ein großer Bereich von Suspensionsmitteln in dem Kontrastmedium der Erfindung auf Wunsch oder bei Bedarf verwendet werden.
Die Konzentrationen dieser Mittel werden in Abhängigkeit von den ausgewählten blasenstabilisierenden Medien variieren und die Schüttelparameter können ebenfalls in Abhängigkeit der verwendeten Materialien variieren. Lipide sind aufgrund ihrer biologischen Verträglichkeit, geringen Toxizität und Verfügbarkeit als reine und als Materialien von pharmazeutischer Qualität die bevorzugten Blasenbeschichtungsmittel zur Herstellung der gasgefüllten Vesikel dieser Erfindung.
Wie für den Fachmann offensichtlich ist, können zur Herstellung der wässrigen Phase, die Lipide oder ein anderes Beschichtungsmittel mit Wasser (vorzugsweise mit destilliertem Wasser), normaler (physiologischer) Salzlösung, phosphatgepufferter Salzlösung oder einer anderen Lösung auf Wasserbasis kombiniert werden.
Wie der Fachmann erkennt, sobald er im Besitz der vorliegenden Offenbarung ist, können verschiedene Zusatzstoffe in der wässrigen Suspensionsphase der Erfindung zur Stabilisierung dieser Phase oder zur Stabilisierung der gasgefüllten Vesikel nach Schütteln verwendet werden. Auf Wunsch können diese Zusatzstoffe zu der wässrigen Suspensionsphase vor dem Schütteln gegeben werden oder sie können zu der Zusammensetzung nach dem Schütteln und der daraus resultierenden Herstellung der gasgefüllten Vesikel gegeben werden. Die Verwendung solche Zusatzstoffe wird natürlich von der speziellen beabsichtigten Anwendung der resultierenden gasgefüllten Vesikel abhängen, wie für den Fachmann leicht offensichtlich ist.
Eine Anzahl Stabilisatoren, die in der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, einschließlich Xanthangummi, Akazin, Agar, Agarose, Alginsäure, Alginat, Natriumalginat, Carrageen, Dextran, Dextrin, Gelatin, Guar Gum, Tragant, Johannisbrot, Bassorin, Karaya, Gummiarabicum, Pectin, Casein, Bentonit, nicht gereinigtes Bentonit, gereinigtes Bentonit, Bentonitmasse, kolloidale, Cellulose, Cellulose (mikrokristallin), Methylcellulose, Hydroxyethylcellulose, Hydroxypropylcellulose, Hydroxypropylmethylcellulose, Carboxymethylcellulose, Calciumcarboxymethylcellulose, Natriumcarboxymethylcellulose, Carboxymethylcellulosenatrium 12, sowie andere natürliche oder modifizierte natürliche Cellulosen, Polysorbat, Carbomer 934P, Magnesiumaluminiumsilicat, Aluminiummonostearat, Polyethylenoxid, Polyvinylalkohol, Povidon, Polyethylenglycol, Propylenglycol, Polyvinylpyrrolidon, Siliziumdioxid, kolloidales Siliziumdioxid sind verfügbar.
Ebenfalls können Verbindungen, wie zum Beispiel Perfluoroctylbromid (PFOB), Perfluoroctyliodid, Perfluortripropylamin und Perfluortributylamin als Stabilisatoren in der Lipidphase verwendet werden. Perfluorkohlenstoffe mit mehr als fünf Kohlenstoffatomen werden im allgemeinen bei Körpertemperatur flüssig sein und solche Perfluorkohlenstoffe werden ebenfalls als Stabilisatoren besonders bevorzugt. Geeignete Perfluorkohlenstoffe umfassen Perfluorhexan, Perfluorheptan, Perfluoroctan, Perfluordecalin und Perfluordodecalin. Es können zusätzlich ebenso perfluorierte Lipide oder teilweise fluorierte Lipide zur Unterstützung der Stabilisierung verwendet werden. Wie für den Fachmann offensichtlich ist, können eine große Vielfalt perfluorierter und teilweise fluorierter Analoga der in der vorliegenden Erfindung beschriebenen Lipide verwendet werden. Solche perfluorierten oder teilweise fluorierten Lipide können sogar aufgrund ihrer relativ hydrophoben Natur, was die Kohlenwasserstofflipide anbelangt, Vorteile bezüglich der Stabilität liefern. Beispiele perfluorierter oder teilweise fluorierter Lipide sind F₆C₁₁-Phosphatidylcholin(PC) und F₈F₅PC. Solche Analoga sind zum Beispiel in Santaella et al., Federation of European Biochemical Societies (FEBS), Vol. 336, Nr. 3 Seiten 418–484 (1993) beschrieben.
Eine große Vielfalt biologisch verträglicher Öle können ebenfalls für den Zweck zur Unterstützung der Stabilisierung verwendet werden, wie zum Beispiel Erdnussöl, Canolaöl, Olivenöl, Safloröl, Maisöl, Mandelöl, Baumwollsamenöl, Pfirsichkernöl, Se samöl, Sojabohnenöl, Mineralöl, leichtes Mineralöl, Ethyloleat, Myristylalkohol, Isopropylmyristat, Isopropylpalmitat, Octyldodecanol, Propylenglycol, Glycerol, Squalen oder ein beliebiges anderes im allgemeinen als unverdaulich bekanntes Öl. Diese können ebenfalls Lecithin, Sphingomyelin, Cholesterol, Cholesterolsulfat und Triglyceride umfassen.
Die Stabilisierung kann ebenfalls durch Zugabe einer großen Vielfalt an Viskositätsmodifikatoren (das heißt Visokosität modifizierende Mittel) bewirkt werden, die als erfindungsgemäße Stabilisatoren dienen. Dies Klasse von Verbindungen umfaßt, ist aber keineswegs beschränkt auf:
1) Kohlenhydrate und ihre phosphorylierten und sulfonierten Derivate, 2) Polyether mit einem Molekulargewicht im Bereich von 400 bis 8000, 3) Di- und Trihydroxyalkane und ihre Polymere in dem Molekulargewichtsbereich zwischen 800 und 8000. Es könne ebenfalls Liposomen in Verbindung mit Emulgatoren und/oder Lösungsvermittlern verwendet werden, die aus folgenden Verbindungen bestehen können, jedoch keineswegs darauf beschränkt sind: Akazin, Cholesterol, Diethanolamin, Glycerylmonostearat, Lanolinalkohole, Lecithin, Mono- und Diglyceride, Monoethanolamin, Oleinsäure, Oleylalkohol, Poloxymer, Polyoxyethylen-50-stearat, Polyoxyl-35-rizinusöl, Polyoxyl-10-oleylether, Polyoxyl-20-cetostearylether, Polyoxyl-40-stearat, Polysorbat-20, Polysorbat-40, Polysorbat-60, Polysorbat-80, Propylenglycoldiacetat, Propylenglycolmonostearat, Natriumlaurylsulfat, Natriumstearat, Sorbitmonolaurat, Sorbitmonooleat, Sorbitmonopalmitat, Sorbitmonostearat, Stearinsäure, Trolamin, Emulgatorwachs, Pluronic F61, Pluronic F64 und Pluronic F68.
Andere Mittel, die hinzugefügt werden können, umfassen stärkende Mittel, wie zum Beispiel Polyalkohole, wie beispielsweise Glycerol, Propylenglycol, Polyvinylalkohol, Polyethylenglycol, Glucose, Mannitol, Sorbitol, Natriumchlorid und dergleichen.
Auf Wunsch können antibakterielle Mittel und/oder Konservierungsmittel in die Formulierung eingefügt werden. Solche Mittel umfassen Natriumbenzoat, alle quartären Ammoniumsalze, Natriumazid, Methylparaben, Propylparaben, Sorbinsäure, Kaliumsorbat, Natriumsorbat, Ascorbylpalmitat, butyliertes Hydroxyanisol, butyliertes Hydroxytoluol, Chorbutanol, Dehydroessigsäure, Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA), Monothioglycerol, Kaliumbenzoat, Kaliummetabisulfit, Kaliumsorbat, Natriumbisulfit, Schwefeldioxid und organische Quecksilbersalze.
Auf Wunsch kann ein Osmolariätsmittel zur Regelung der Osmolarität verwendet werden. Geeignete osmotisch aktive Materialien umfassen solche physiologisch verträglichen Verbindungen, wie Monosaccharidzucker, Disaccharidzucker, Zuckeralkohole, Aminosäuren und verschiedene synthetische Verbindungen. Geeignete Monosaccharidzucker oder Zuckeralkohole umfassen zum Beispiel Erythrose, Threose, Ribose, Arabinose, Xylose, Lyxose, Allose, Altrose, Glucose, Mannose, Idose, Galactose, Talose, Trehalose, Ribulose, Fructose, Sorbitol, Mannitol und Sedoheptulose, wobei die bevorzugten Monosaccharide Fructose, Mannose, Xylose, Arabinose, Mannitol und Sorbitol sind. Geeignete Disaccharidzuckerumfassen zum Beispiel Lactose, Sucrose, Maltose und Cellobiose. Geeignete Aminosäuren umfassen zum Beispiel Glycin, Serin, Threonin, Cystein, Tyrosin, Asparagin, Glutamin, Asparaginsäure, Glutaminsäure, Lysin, Arginin und Histidin. Synthetische Verbindungen umfassen zum Beispiel Glycerol, Propylenglycol, Polypropylenglycol, Ethylenglycol, Polyethylenglycol und Polyvinylpyrrolidon. Verschiedene andere geeignete osmotisch aktive Materialien sind dem Fachmann gut bekannt und sollen innerhalb des Umfangs des Ausdrucks osmotisch aktives Mittel liegen, wie er hier verwendet wird.
Eine Vielfalt von Polymeren, wie zum Beispiel die vorstehend diskutierten, können ebenfalls für eine Vielfalt verschiedener Zwecke und Verwendungen hinzugefügt werden.
Wie der Fachmann erkennt, kann ein großer Bereich zusätzlicher Mengen, wie zum Beispiel der vorstehend beschriebenen Suspensionsmittel in der wässrigen Phase der Erfindung nach Bedarf oder auf Wunsch, in Abhängigkeit von der speziellen Verwendung verwendet werden. Solche Zusatzstoffe können im allgemeinen zwischen 0,01 Vol.-% bis ungefähr 95 Vol.-% der resultierenden Kontrastmittelformulierung umfassen, obwohl höhere oder geringere Mengen verwendet werden können. In Form einer allgemeine Anleitung ist ein Suspensionsmittel typischerweise in einer Menge von mindestens ungefähr 0,5 Vol.-%, bevorzugter von mindestens ungefähr 10 Vol.-% vorhanden. Im allgemeinen ist das Suspensionsmittel typischerweise in einer Menge von weniger als ungefähr 50 Vol.-%, vorzugsweise von weniger als un gefähr 40 Vol.-% und besonders bevorzugt von weniger als ungefähr 30 Vol-% vorhanden. Eine typische Menge eines Suspensionsmittels könnte zum Beispiel ungefähr 20 Vol-% betragen. Ebenfalls werden typischerweise zum Erreichen allgemein bevorzugter Osmolaritätsbereiche weniger als ungefähr 25 g/l, vorzugsweise weniger als ungefähr 20 g/l, bevorzugter weniger als ungefähr 15 g/l und besonders bevorzugt weniger als ungefähr 10 g/l des osmotisch aktiven Materials verwendet und in manchen Fällen werden keine osmotisch aktiven Materialien verwendet. Ein besonders bevorzugter Bereich an osmotisch aktiven Materialien liegt im allgemeinen zwischen ungefähr 0,002 g/l und ungefähr 10 g/l. Diese sowie auch andere geeignete Bereich an Zusatzstoffen sind für den Fachmann leicht offensichtlich, sobald er im Besitz der vorliegenden Erfindung ist.
Eine große Vielfalt an therapeutischen und/oder diagnostischen Mitteln kann ebenfalls der wässrigen Suspensionsphase einfach durch Zugeben der gewünschten therapeutischen oder diagnostischen Mittel zu dieser Phase beigemengt werden. Geeignete therapeutische und diagnostische Mittel und deren geeigneten Mengen sind für den Fachmann leicht offensichtlich, sobald er in Besitz der vorliegenden Offenbarung ist. Die Mittel können in oder auf die Lipidmembranen eingebaut werden oder in die resultierenden Liposomen eingekapselt werden.
Zur weiteren Verbesserung des magnetischen Effekts der resultierenden gasgefüllten Vesikel, beispielsweise für die magnetische Resonanzabbildung, können ein oder mehrere MRI-Kontrastverstärkungsmittel, wie zum Beispiel paramagnetische oder supermagnetische Kontrastverstärkungsmittel zugegeben werden. Geeignete MRI-Kontrastverstärkungsmittelumfassen paramagnetische Ionen, wie zum Beispiel Übergangsmetalle, einschließlich Eisen (Fe⁺³), Kupfer (Cu⁺²) und Mangan (Mn⁺²) und Lanthanide, wie zum Beispiel Gadolinium (Gd⁺³) und Dysprosium (Dy⁺³), Nitroxide, Eisenoxide (Fe₃O₄), Eisensulfide und paramagnetische Teilchen, wie zum Beispiel Mangan (Mn⁺²) substituierte Hydroxyapatite. Sowie Mittel, wie zum Beispiel Chrom (Cr⁺³), Nickel (Ni⁺²), Cobalt (Co⁺²) und Europium (Eu⁺²), die andere Beispiele paramagnetischer Ionen sind, die verwendet werden können. Es können andere Kontrastverstärkungsmittel, wie zum Beispiel Nitroxidradikale oder ein beliebiges anderes Atom verwendet werden, das einen ungepaarten Elektronenspin mit paramagnetischen Eigenschaften beibehält. Das Kontrastverstärkungsmittel wird Idealerweise der wässrigen Suspensionsphase vor dem Schütteln zugegeben und ist so ausgelegt, dass nach dem Schütteln das Kontrastverstärkungsmittel in oder auf der Oberfläche der resultierenden gasgefüllten Vesikel eingebaut wird, obwohl die Zugabe nach der Vesikelherstellung ebenfalls möglich ist. Die resultierenden gasgefüllten Vesikel können ein stark erhöhtes Relaxationsvermögen aufweisen, wodurch ein besonders wirksames Kontrastmittel für die magnetische Resonanzabbildung zur Verfügung gestellt wird. Zum Beispiel wird bei Verwendung von Phosphatidylcholin oder Phsophatidylserin in der wässriges Lipidphase sich Mangan (Mn⁺²) selbst auf den Kopfgruppen des Lipids einfügen. Auf Wunsch können die Metalle unter Verwendung von fettlöslichen Verbindungen chelatisiert werden, wie zum Beispiel in Unger et al., U.S. Patent Nr. 5,312,617 gezeigt wird, auf dessen Offenbarungsgehalt hier vollumfänglich Bezug genommen wird. Solche fettlöslichen Verbindungen sind recht nützlich, da sie sich leicht in die Liposomenmembran einfügen. Eisenoxide und andere Teilchen sollten im allgemeinen klein, vorzugsweise kleiner als ungefähr 1 μm, bevorzugter kleiner als ungefähr 200 nm und besonders bevorzugt kleiner als 100 nm sein, um einen optimalen Einbau in oder auf der Liposomenoberfläche zu erreichen. Zur Verbesserung des Einbaus können mit aliphatischen oder lipophilen Verbindungen beschichtete Eisenoxide verwendet werden, da diese dazu tendieren, sich selbst in die Lipidbeschichtung der Blasenoberfläche einzufügen.
Es liegt ebenfalls im Bereich der vorliegenden Erfindung, dass die wässrige Suspensionsphase einen Bestandteil zur Bewirkung von Gelbildung enthält, wie zum Beispiel einen Bestandteil der Gelbildung mit Lipidpolymeren und Metallen bewirkt, die nicht spontan gelieren, oder einen Bestandteil, der die Gelbildung verstärkt. Gelatinierungsmittel, wie zum Beispiel polyvalente Metallkationen, Zucker und Polyalkohole können verwendet werden. Beispielhafte polyvalente Metallkationen, die als Gelatinierungsmittel verwendbar sind, umfassen Calcium, Zink, Mangan, Eisen und Magnesium. Verwendbare Zucker umfassen Monosaccharide, wie zum Beispiel Glucose, Galactose, Fructose, Arabinose, Allose und Altrose, Disaccharide, wie zum Beispiel Maltose, Sucrose, Cellobiose und Lactose und Polysaccharide, wie zum Beispiel Stärke. Der Zucker ist vorzugsweise ein einfacher Zucker, das heißt ein Monosaccharid oder ein Disaccharid. In der vorliegenden Erfindung verwendbare Polyalkohol-Gelatinierungsmittel umfassen zum Beispiel Glycidol, Inositol, Mannitol, Sorbitol, Pentaerythritol, Galacitol und Polyvinylalkohol. Das besonders bevorzugte in der vor liegenden Erfindung verwendete Gelatinierungsmittel ist Sucrose und/oder Calcium. Die speziellen Gelatinierungsmittel, die in den verschiedenen Formulierungen der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, sind für den Fachmann leicht offensichtlich, sobald er im Besitz der vorliegenden Offenbarung ist.
Zur Stabilisierung von Lipiden können Kombinationen von Lipiden, wie zum Beispiel Phosphatidsäure mit Calcium- oder Magnesiumsalzen und Polymere, wie zum Beispiel Aginsäure, Hyaluronsäure oder Carboxymethylcellulose verwendet werden. Es wird angenommen, dass die divalenten Kationen zwischen den Lipiden und Polymeren Metallbrücken zur Stabilisierung der gasgefüllten Liposomen innerhalb der Lipid/Polymersysteme bilden. Ähnlich können Suspensionen, die Mischungen aus Chitosan (oder Chitin-basierenden Materialien), Polylysin, Polyethylenimin und Alginsäure (oder deren Derivate) oder Hyaluronsäure enthalten, hergestellt werden.
Es wurde herausgefunden, dass die verschiedenen Materialien in der wässrigen Phase bei der Steuerung der resultierenden Größe der gasgefüllten Vesikel von Bedeutung sein können. Tabelle 2 zeigt die Größen der Liposomen, die durch Schütteln des mit der wässrigen Phase gefüllten sterilen Behälters und einem oberen Gasraum mit Stickstoff hergestellt wurden. In allen Fällen wurde die Liposomengröße durch ein Teilchen-Größenbestimmungssystem Modell 770 Lichtverdunkelungsteilchenbemessungsgerät (Teilchen-Größenbestimmungssysteme, Santa Barbara, CA) gemessen. Wie die Daten zeigen, beeinflusst der Lipidanteil in der wässrigen Phase die Größenverteilung der resultierenden gasgefüllten Liposomen. Insbesondere zeigt die untenstehende Tabelle 2 die Wirkung der Lipidzusammensetzung auf die mittlere Liposomengröße.
TABELLE 2 Wirkung der Lipidzusammensetzung auf die mittlere Liposomengröße
Tabelle 3 zeigt die Abhängigkeit der Konzentration einer definierten Lipidzusammensetzungsmischung von der mittleren Liposomengröße. Wie in Tabelle 3 gezeigt wird, sind ebenfalls Variationen in den Gesamtlipidkonzentrationen für die Beeinflussung der Liposomengröße nach dem Schütteln von Bedeutung. In diesen Experimenten wurde das Verhältnis der drei verschiedenen Lipidkomponenten konstant gehalten und die Lipidkonzentration in der wässrigen Phase wurde zwischen 0,5 und 5,0 mg ml^–1 variiert. Das verwendete Gas war Stickstoff. Die optimale Größe von Vesikeln für die Ultraschalldiagnose mit einem oberen Gasraum mit Perfluorbutan wurde bei einer Lipidkonzentration in der wässrigen Phase von 1,0 mg ml^–1 hergestellt.
TABELLE 3 Wirkung der Lipidkonzentration auf die mittlere Liposomengröße
Die Größe der Vesikel kann ebenfalls von der Konzentration der Stabilisierungsmedien, zum Beispiel der Lipide abhängen. Es wurde zum Beispiel gefunden, dass bei Verwendung von Stickstoff eine Lipidkonzentration von 1,0 mg ml^–1 gasgefüllte Liposomen mit ungefähr demselben Durchmesser erzeugt, wie eine Lipidkonzentration von 5,0 mg ml^–1 mit Perfluorbutan. Es wurde jedoch festgestellt, dass die höhere Konzentration zu einer Verteilung führt, die etwas in Richtung größerer gasgefüllter Liposomen verzerrt ist. Dieses Phänomen neigt dazu, die erhöhte Stabilität der gas gefültlen Liposomen bei höherer Lipidkonzentration widerzuspiegeln. Es wird daher angenommen, dass die höhere Lipidkonzentration entweder zur Stabilität durch Wirkung als Stabilisator in der wässrigen Phase beiträgt oder, dass die höhere Lipidkonzentration für mehr Lamellen um das Gas herum sorgt und sie daher einem größeren Anteil der größeren Liposomen gestattet fortzubestehen.
Es wird ebenfalls angenommen, dass die Oberflächenspannung an der Grenzfläche der gasgefüllten Vesikel und dem wässrigen Milieu ein zusätzlicher bestimmender Faktor für die letztendliche Größe der gasgefüllten Vesikel, bei Berücksichtung zusammen mit anderen Variablen, ist.
II. DIE ZUSAMMENSETZUNG DER GASFÖRMIGEN PHASE
Eine große Vielfalt verschiedener Gase kann als gasförmige Phase der vorliegenden Erfindung verwendet werden. Die Gase sind vorzugsweise in der wässrigen Suspensionsphase im wesentlichen unlöslich. Mit im wesentlichen unlöslich ist gemeint, dass das Gas in Wasser bei 20°C und 1 Atmosphäre Druck eine Löslichkeit beibehält, die gleich oder weniger als ungefähr 18 ml Gas pro kg Wasser ist. Somit haben im wesentlichen unlösliche Gase eine Löslichkeit, die geringer als die Löslichkeit von gasförmigem Stickstoff ist. Die Löslichkeit ist vorzugsweise gleich oder weniger als ungefähr 15 ml Gas pro kg Wasser und bevorzugter gleich oder weniger als ungefähr 10 ml Gas pro kg Wasser bei 20°C und 1 Atmosphäre Druck. In einer bevorzugten Klasse von Gasen liegt die Löslichkeit zwischen ungefähr 0,001 und ungefähr 18 ml Gas pro kg Wasser oder zwischen ungefähr 0,01 und ungefähr 15 ml Gas pro kg Wasser oder zwischen ungefähr 0,1 und ungefähr 10 ml Gas pro kg Wasser oder zwischen ungefähr 1 und ungefähr 8 ml Gas pro kg Wasser oder zwischen ungefähr 2 und 6 ml pro kg Wasser bei der vorher erwähnten Temperatur und Druck. Zum Beispiel sind Perfluorkohlenstoffgase und das fluorierte Gas Schwefelhexafluorid bei 20°C und 1 Atmosphäre Druck weniger löslich als 10 ml Gas pro kg Wasser und sind daher bevorzugte Gase, die im wesentlichen nicht unlöslich sind, wie hier definiert ist, und werden als lösliche Gase bezeichnet.
Andere geeignete im wesentlichen unlösliche oder lösliche Gase umfassen, sind aber nicht beschränkt auf Hexafluoraceton, isopropylacetylen, Allen, Tetrafluorallen, Bortrifluorid, 1,2-Butadien, 1,3-Butadien, 1,2,3-Trichlorbutadien, 2-Fluor-1,3-butadien, 2-Methyl-1,3-butadien, Hexafluor-1,3-butadien, Butadiin, 1-Fluorbutan, 2-Methylbutan, Decafluorbutan (Perfluorbutan), Decafluorisobutan (Perfluorisobutan), 1-Buten, 2-Buten, 2-Methyl-1-buten, 2-Methyl-1-buten, Perfluor-1-buten, Perfluor-1-buten, Perfluor-2-buten, 4-Phenyl-3-buten-2-on, 2-Methyl-1-buten-3-in, Butylnitrat, 1-Butin, 2-Butin, 2-Chlor-1,1,1,4,4,4-Hexafluorbutin, 3-Methyl-1-butin, Perfluor-2-butin, 2-Brombutyraldehyd, Carbonylsulfid, Crotonnitril, Cyclobutan, Methylcyclobutan, Octafluorcyclobutan (Perfluorcyclobutan), Perfluorisobutan, 3-Chlorcyclopenten, Cyclopropan, 1,2-Dimethylcyclopropan, 1,1-Dimethylcyclopropan, Ethylcyclopropan, Methylcyclopropan, Diacetylen, 3-Ethyl-3-methyldiaziridin, 1,1,1-Trifluordiazoethan, Dimethylamin, Hexafluordimethylamin, Dimethylethylamin, Bis-(dimethylphosphin)amin, 2,3-Dimethyl-2-norbornan, Perfluordimethylamin, Dimethyloxoniumchlorid, 1,3-Dioxolan-2-on, 1,1,1,1,2-Tetrafluorethan, 1,1,1-Trifluorethan, 1,1,2,2-Tetrafluorethan, 1,1,2-Trichlor-1,2,2-Trifluorethan, 1,1-Dichlorethan, 1,1-Dichlor-1,2,2,2-tetrafluorethan, 1,2-Difluorethan, 1-Chlor-1,1,2,2,2-pentafluorethan, 2-Chlor-1,1-difluorethan, 1-Chlor-1,1,2,2-tetrafluorethan, 2-Chlor-1,1-difluorethan, Chlorethan, Chlorpentafluorethan, Dichlortrifluorethan, Fluorethan, Nitropentafluorethan, Nitrosopentafluorethan, Perfluorethan, Perfluorethylamin, Ethylvinylether, 1,1-Dlchlorethylen, 1,1-Dichlor-1,2-difluorethylen, 1,2-Difluorethylen, Methan, Sulfonylchloridtrifluormethan, Sulfonylfluoridtrifluormethan, (Pentafluorthio)trifluormethan, Bromdifluornitrosomethan, Bromfluormethan, Bromchlorfluormethan, Bromtrifluormethan, Chlordifluornitromethan, Chlordinitromethan, Chlorfluormethan, Chlortrifluormethan, Chlordifluormethan, Dibromdifluormethan, Dichlordifluormethan, Dichlorfluormethan, Difluormethan, Difluoriodmethan, Disilanmethan, Fluormethan, Iodmethaniodtrifluormethan, Nitrotrifluormethan, Nitrosotrifluormethan, Tetrafluormethan, Trichlorfluormethan, Trifluormethan, Trifluormethansulfenylchlorid, 2-Methylbutan, Methylether, Methylisopropylether, Methyllactat, Methylnitrat, Methylsulfid, Methylvinylether, Neopentan, Stickstoff (N₂), Distickoxid, 1,2,3-Nonadecantricarbonsäure-2-hydroxytrimethylester, Non-1-en-3-in, Sauerstoff (O₂), Sauerstoff 17 (¹⁷O₂), 1,4-Pentadien, n-Pentan, Dodecafluorpentan (Perfluorpentan), Tetradecafluorhexan (Perfluorhexan), Perfluorisopentan, Perfluorneopentan, Pentan-2-on-4-amino-4-methyl, 1-Penten, 2-Penten {cis}, 2-Penten {trans}, 3-Brompent-1-en, Perfluor-1-penten, Tetrachlorphthalsäure, 2,3,6-Trimethylpiperidin, Propan, 1,1,1,2,2,3-Hexafluorpropan, 1,2-Epoxypropan, 2,2-Difluorpropan, 2-Aminopropan, 2- Chlorpropan, 1-Nitroheptafluorpropan, 1-Nitrosoheptafluorpropan, Perfluorpropan, Propen, 1,1,1,2,3,3-Hexafluor-2,3-dichlorpropylen, 1-Chlorpropylen, Chlor-{trans}-propylen, 2-Chlorpropylen, 3-Fluorpropylen, Perfluorpropylen, Propin, 3,3,3-Trifluorpropin, 3-Fluorstyrol, Schwefelhexafluorid, (Di)-Decafluor(S₂F₁₀)Schwefel, Diamino-2,4-Toluol, Trifluoracetonitril, Trifluormethyiperoxid, Trifluormethylsulfid, Wolframhexafluorid, Vinylacetylen, Vinylether, Neon, Helium, Krypton, Xenon (insbesondere Rubidium angereichertes hyperpolarisiertes gasförmiges Xenon), Kohlenstoffdioxid, Helium und Luft. Es werden fluorierte Gase (das heißt, ein Gas, das ein oder mehrere Fluormoleküle enthält, wie zum Beispiel Schwefelhexafluorid), Fluorkohlenstoffgase (das heißt, ein fluoriertes Gas, das ein fluorierter Kohlenstoff oder Gas ist) und Perfluorkohlenstoffgase (das heißt, ein Fluorkohlenstoffgas, das vollständig fluoriert ist, wie zum Beispiel Perfluorpropan und Perfluorbutan) bevorzugt.
Obwohl so gut wie jedes Gas theoretisch in der gasförmigen Phase der vorliegenden Erfindung verwendet werden kann, kann ein spezielles Gas so ausgewählt werden, dass die gewünschten Eigenschaften des resultierenden Kontrastmediums optimiert werden und zu der speziellen diagnostischen Anwendung passen. Es wurde zum Beispiel festgestellt, dass bestimmte Gase nach Schütteln stabilere gasgefüllte Vesikel ergeben als andere Gase, und solche Gase werden bevorzugt. Es wurde ebenfalls festgestellt, dass bestimmte Gase bessere Abbildungsergebnisse bei der diagnostischen Bilderzeugung, wie zum Beispiel bei Ultraschall oder MRI liefern.
Als Beispiel für die zunehmende Stabilität der gasgefüllten Vesikel wurde festgestellt, dass Kohlenstoffdioxid < Sauerstoff < Luft < Stickstoff < Neon 0 Helium < Perfluorkohlenstoffgase ist. Aus diesen und anderen Gründen werden fluorierte Gase, insbesondere Perfluorkohlenstoffgase bevorzugt.
Obwohl in manchen Fällen ebenfalls lösliche Gase angemessen als gasförmige Phase in der vorliegenden Erfindung dienen, tendieren im wesentlichen unlösliche Gase zur Erzeugung einer größeren Stabilität, als Gase mit höherer Löslichkeit, insbesondere nach Erzeugung des Kontrastmittels nach dem Schütteln. Es ist ebenfalls leichter eine gasförmige Phase mit solchen unlöslichen Gasen vor dem Schütteln im wesentlichen getrennt von der wässrigen Suspensionsphase zu halten, entsprechend der vorliegenden Erfindung. Daher werden im wesentlichen unlösliche Gase, entsprechend der vorstehenden Definition, bevorzugt.
Die Qualität der Ultraschallbilder und die Dauer solcher Bilder ist ebenfalls mit der Löslichkeit des Gases in dem wässrigen Milieu korreliert. Im allgemeinen bringt eine Verringerung in der Gaslöslichkeit ein besser aufgelöstes Bild mit längerer Ultraschalldauer hervor.
Zusätzlich wurde allgemein beobachtet, dass die Größe der durch Schütteln hergestellten gasgefüllten Vesikel mit der Löslichkeit des Gases in dem wässrigen Milieu korreliert ist, wobei die Gase mit größerer Löslichkeit zu größeren gasgefüllten Vesikeln führt.
Es wird ebenfalls angenommen, dass die Größe der Vesikel durch die Wechselwirkung des Gases mit der inneren Wand der Vesikel beeinflusst werden kann. Insbesondere wird angenommen, dass die Wechselwirkung an der Grenzfläche die Spannung und folglich die nach außen gerichtete Kraft des inneren Gases auf die innere Vesikelwand des Vesikels beeinflusst. Eine Abnahme der Spannung ermöglicht kleinere Vesikel, indem die durch das innere Gas ausgeübte Kraft verringert wird und gestattet daher, daß die durch das wässrige Milieu auf das Äußere des Vesikels ausgeübte Kraft die gasgefüllten Vesikel kleiner macht.
Die Löslichkeit von Gasen in wässrigen Lösungsmittel kann durch Verwendung von Henrys Gesetz abgeschätzt werden, das im allgemeinen bis zu Drücken von ungefähr 1 Atmosphäre und für leicht lösliche Gase anwendbar ist (Daniele, F. und Alberty, R. A., Physical Chemistry, 3. Ausgabe, Wiley & Sons, Inc., New York, 1966). Zum Beispiel weist Sauerstoff eine Löslichkeit von 31,6 ml pro kg Wasser bei 25°C auf, atmosphärische Luft besitzt eine Löslichkeit von 21,36 ml in 1 kg Wasser bei 25°C und Stickstoff behält eine Löslichkeit von näherungsweise 18,8 ml kg^–1 bei 25°C bei. Andererseits weist Schwefelhexafluorid eine Löslichkeit von näherungsweise 5,4 ml kg^–1 bei 25°C auf.
Zusammenfassend werden aus Gründen der Stabilität, Unlöslichkeit und resultierenden Vesikelgöße die fluorierten Gase, Fluorkohlenstoffgase und Perfluorkohlenstoff gase bevorzugt. Besonders bevorzugt wird das fluorierte Gas Schwefelhexafluorid und die Perfluorkohlenstoftgase Perfluorpropan, Perfluorbutan, Perfluorcyclobutan, Perfluormethan, Perfluorethan und Perfluorpentan, besonders Perfluorpropan und Perfluorbutan.
Es zu beachten, dass Perfluorkohlenstoffe mit weniger als fünf Kohlenstoftatome bei Raumtemperatur Gase sind. Perfluorpentan ist zum Beispiel bis ungefähr 27°C eine Flüssigkeit. Oberhalb dieser Temperatur werden sie den oberen Gasraum des Behälters einnehmen. Es wurde gezeigt, dass ebenfalls Perfluorpentan zum Füllen des oberen Gasraumes (das heißt, des Raumes in dem Fläschchen über der Lipid-Suspensionsphase) sogar bei Raumtemperatur verwendet werden kann. Durch Wahl einer definierten Menge flüssigen Perfluorpentans, die so berechnet wird, dass der obere Gasraum gefüllt wird, und Zugabe der Flüssigkeit in den Behälter bei niedriger Temperatur, zum Beispiel –20°C und dann Evakuieren des Behälters (zum wirkungsvollen Entfernen der Luft aus dem oberen Gasraum) und dann Abdichten des Behälters, wird Perfluorpentan bei einer Temperatur unterhalb seines Siedepunkts bei 1 Atmosphäre einen Übergang von der flüssigen Phase zur Gasphase durchlaufen. Bei Raumtemperatur wird es daher einen Teil oder den gesamten oberen Gasraum mit Gas einnehmen. Wie der Fachmann erkennt, kann man die Abnahme in der Phasenübergangstemperatur von der flüssigen zur Gasphase unter Verwendung einer allgemeinen „Daumenregel" schätzen. Insbesondere nimmt die Siedetemperatur bei jeder Druckverringerung um die Hälfte um ungefähr 10°C ab. Alternativ dazu kann man die Temperaturabnahme als Funktion des abnehmenden Drucks unter Verwendung von Boyles Gesetz berechnen, das auf dem idealen Gasgesetz basiert. Bei einem anderen Verfahren zum Füllen des oberen Raumes mit Perfluorpentan wird zuerst der obere Gasraum evakuiert und dann der obere Gasraum mit Perfluopentangas oberhalb 27°C befüllt. Natürliche ist dieses Verfahren nicht nur auf Perfluorpentan beschränkt, sondern kann auf alle Perfluorkohlenstoftgase, sowie allgemein auf Gase angewandt werden, vorausgesetzt, der Siedepunkt des Gases ist bekannt.
Auf Wunsch können zwei oder mehrere verschiedene Gase zusammen zum Füllen des oberen Gasraumes verwendet werden. Eine Mischung aus Gasen kann eine Reihe von Vorteilen bei einer großen Vielfalt von Anwendungen der resultierenden gasgefüllten Vesikel (wie zum Beispiel Anwendungen bei der Ultraschallabbildung, MR Abbildung, usw.) aufweisen. Es wurde festgestellt, dass eine kleine Mange eines im wesentlichen unlöslichen Gases mit einem löslichen Gas gemischt werden kann, um für eine größere Stabilität zu sorgen, als durch die Kombination zu erwarten wäre. Zum Beispiel kann eine kleine Menge Perfluorkohlenstoffgas (im allgemeinen mindestens ungefähr 1 Mol % beispielsweise) mit Luft, Stickstoff, Sauerstoff, Kohlenstoffdioxid oder anderen löslicheren Gasen gemischt werden. Das nach dem Schütteln erzeugte resultierende gasgefüllte Vesikel-Kontrastmittel kann dann stabiler als nur Luft, Stickstoff, Sauerstoff, Kohlenstoffdioxid oder andere löslichere Gase sein.
Zusätzlich kann der Gebrauch einer Mischung von Gasen dazu verwendet werden, eine Zunahme der Größe der gasgefüllten Vesikel auszugleichen, die ansonsten bei in vivo einzuspritzenden Gas-enthaltenden Vesikeln mit reinem Perfluorkohlenstoffgas in vivo auftritt. Es wurde festgestellt, dass manche Pertluorkohlenstoftgase zur Absorption oder Aufnahme anderer Gase, wie zum Beispiel Sauerstoff neigen. Wird Perfluorkohlenstoftgas intravenös injiziert, so kann es daher den Sauerstoff oder andere im zirkulierenden Blut gelöste Gase aufnehmen. Als Ergebnis dieser Aufnahme können dann die resultierenden Vesikel in vivo wachsen. Mit der Kenntnis dieses Phänomens kann man dann das Perfluorkohlenstoftgas mit einem löslichen Gas, wie zum Beispiel Luft, Stickstoff, Sauerstoff, Kohlenstoffdioxid mischen und dadurch die Absorptions- oder Aufnahmeeigenschaften des Pertluorkohlenstoffs sättigen. Dies würde folglich das Potential zur Ausdehnung der gasgefüllten Vesikel im Blutstrom verzögern oder sogar beseitigen. Dies ist signifikant im Hinblick auf die Tatsache, dass bei einem Anwachsen eines Vesikels zu einer Größe von mehr als 10 μm potentiell gefährliche Embolie-Fälle auftreten können, bei Verabreichung in den Blutstrom. Durch Füllung des oberen Raumes mit löslicheren Gasen als Perfluorkohlenstoftgas, zusammen mit dem Pertluorkohlenstoftgas machen die gasgefüllten Vesikel im allgemeinen nicht diese Größenzunahme nach der in vivo Injizierung durch. Als Ergebnis der vorliegenden Erfindung kann daher das Problem von Embolie-Fällen als Ergebnis der Vesikelausdehnung durch Herstellung von Vesikeln umgangen werden, wobei eine solche Ausdehnung beseitigt oder ausreichend verzögert wird.
Entsprechend der vorliegenden Erfindung kann daher auf Wunsch ein im wesentlichen unlösliches Gas mit einem löslichen Gas kombiniert werden, um wirkungsvoll hoch wirksame und stabile gasgefüllte Vesikel herzustellen.
Mehrfache Proben von Lipidlösungen (1 mg pro ml, 82 : 10 : 8 Mol % Verhältnisse von DPPC : DPPA : DPPE-PEG-5000) in Gewichtsverhältnissen von 8 : 1 : 1 von normaler Salzlösung : Glycerol : Propylenglycol in 2 ml Fläschchen (tatsächliche Größe 3,7 ml) Wheaton Industries (Millville, NJ) wurden in einen Gefriertrockenapparat, modifiziertes Edward Modell SO4, mit vier Kubikfuß Fassungsvermögen gesetzt und verringertem Druck ausgesetzt. In die oberen Gasräume der Glasfläschchen, die 60% des Gesamtvolumens bildeten, wurden 80% PFP mit 20% Luft, 60% PFP mit 40% Luft, 50% PFP mit 50% Luft, 20% PFP it 80% Luft oder 100% Luft eingelassen. Die prozentualen Anteile des Gases in den oberen Gasräumen der verschiedenen Proben wurde durch Gaschromatographie mit einem Hewlett Packard Gaschromatograph Modell 1050L in Kombination mit Hewlett Packard Chem^TM Software bestätigt. Die Nachweisart war Flammenionisationsnachweis. Dann wurden die Proben mit 3300 Upm während 60 Sekunden unter Verwendung eines Standard Wig-L-Bug^TM Modell 3110B geschüttelt und die Größen- und Vesikelzählungen durch optische Teilchengrößenbestimmung bestimmt. Zur Analyse der Größe gasgefüllter Vesikel und Gesamtzählungen wurde eine optische Teilchengrößenbestimmungsvorrichtung (Particle Sizing Systems, Santa Barbara, CA) verwendet. Für jede Analyse wurde ein Probenvolumen von 5 Mikrolitern verwendet, wobei für jede Bestimmung vier Proben verwendet wurden. Die Ergebnisse sind oben in Tabelle 4 gezeigt.
Sogar wenn nur 20% des Gases PFP (ein im wesentlichen unlösliches Gas) und 80 des Gases Luft (eine Mischung löslicher Gase) waren, wurden 100 mal mehr Vesikel hergestellt, als wenn nur Luft (0% PFP) verwendet wurde, wie in Tabelle 4 gezeigt ist. Wurde nur Luft (0% PFP) verwendet so waren überdies die Vesikel weitaus weniger stabil und ein größerer Anteil war größer als 10 Mikrometer. Die Vesikel mit 20% PFP und 80% Luft schienen jedoch genauso stabil zu sein, wie die Vesikel mit 80% PFP und 20% Luft, sowie die anderen Proben mit dazwischenliegenden PFP-Konzentrationen und 20% PFP mit 80% Luft erzeugte ungefähr ebenso viele gasgefüllte Vesikel, wie 80% PFP mit 20% Luft.
TABELLE 4 Wirkung des prozentualen Anteils von Perfluorpropan auf die Größe und Zahl der Vesikel
In Tabelle 4: Standardabw. = Standardabweichung und KV = Varianzkoeffizient. Ebenfalls in Tabelle 4, E+ bezeichnet einen Exponenten einer bestimmten Potenz, zum Beispiel, 5,45E+05 = 5,45 × 10⁵.
Kurzgefaßt wurde festgestellt, dass nur eine kleine Menge eines relativ unlöslichen Gases (wie zum Beispiel PFP) benötigt wird, um die Vesikel zu stabilisieren, wobei der größte Teil des Gases ein lösliches Gas ist. Obwohl die effektive Löslichkeit der Kombination aus zwei oder mehreren Gasen, wie mit nachstehender Formel berechnet wird:
sich nur wenig von der Löslichkeit des löslichen Gases unterscheiden kann, gibt es noch eine große Zahl gasgefüllter Vesikel und eine hohe Stabilität der gasgefüllten Vesikel mit nur einer kleinen Menge an zugegebenem unlöslichen Gas.
Obwohl keine Bindung an eine beliebige Theorie über die Wirkungsweise beabsichtigt ist, wird angenommen, dass das im wesentlichen unlösliche Gas für eine Membranstabilisierungswirkung von Bedeutung ist. Es wird allerdings angenommen, dass das im wesentlichen unlösliche Gas (wie zum Beispiel PFP) als Barriere gegen die Lipidmembran wirkt, wobei möglicherweise die Bildung einer Schicht auf der inneren Oberfläche der Membran bewirkt wird, die den Auslaß des löslichen Gases (wie zum Beispiel Luft, Stickstoff, usw.) verzögert. Diese Entdeckung ist sowohl überraschend als auch nützlich, da sie die Verwendung von nur einer kleinen Menge des im wesentlichen unlöslichen Gases (zum Beispiel ein Perfluorkohlenstoff- oder anderes fluoriertes Gas) gestattet und hauptsächlich die Verwendung eines biologisch verträglicheren (weniger potentiell toxischen) Gases, wie zum Beispiel Luft oder Stickstoff gestattet, den größten Teil des Vesikelvolumens einzunehmen.
Die Menge an im wesentlichen unlöslichen Gasen und löslichen Gases in einer beliebigen Mischung kann stark variieren, wie der Fachmann erkennt. Typischerweise ist jedoch mindestens ungefähr 0,01%, bevorzugter mindestens 0,1% und noch bevorzugter mindestens 1% und besonders bevorzugt mindestens 10% der Gesamtmenge des Gases ein im wesentlichen unlösliches Gas. Geeignete Bereiche des im wesentlichen unlöslichen Gases variieren in Abhängigkeit von verschiedenen Faktoren, wie zum Beispiel von dem zusätzlich anzuwendenden löslichen Gas, der Art des Lipids, der speziellen Anwendung, usw. Beispielhafte Bereiche umfassen Bereiche zwischen ungefähr 0,01% bis ungefähr 99%, vorzugsweise zwischen ungefähr 1 und ungefähr 95%, bevorzugter zwischen ungefähr 10% und ungefähr 90% und besonders bevorzugt zwischen ungefähr 30% und ungefähr 85% des im wesentlichen unlöslichen Gases.
Für andere Verwendungen außer der diagnostischen Ultraschallabbildung, wie zum Beispiel für Verwendungen in der diagnostischen Magnetresonanzabbildung (MRI) werden vorzugsweise paramagnetische Gase, wie zum Beispiel stark paramagnetischer gasförmiger Sauerstoff 17 (¹⁷O₂), Neon, Xenon, Helium, Argon (besonders mit Rubidium angereichtes hyperpolarisiertes gasförmiges Xenon) oder zum Beispiel Sauerstoff (der noch, wenn auch weniger stark paramagnetisch ist), zum Füllen des oberen Gasraumes verwendet, obwohl andere Gase ebenfalls verwendet werden können. Besonders bevorzugt wird gasförmiges ¹⁷O₂, Neon, mit Rubidium angereichertes hyperpolarisiertes gasförmiges Xenon oder gasförmiger Sauerstoff mit einem im wesentlichen unlöslichen Gas kombiniert, wie zum Beispiel ein Perfluorkohlenstoffgas. Paramagnetische Gase sind aus dem Stand der Technik gut bekannt und für den Fachmann sind geeignete paramagnetische Gase leicht offensichtlich. Das besonders bevorzugte Gas für MRI-Anwendungen, ob es nur alleine oder in Kombination mit einem anderen Gas verwendet wird, ist ¹⁷O₂.
Durch Verwendung einer Kombination von Gasen, sorgt ¹⁷O₂ oder ein anderes paramagnetische Gas für den optimalen Kontrast und der Perfluorkohlenstoff stabilisiert das ¹⁷O₂-Gas innerhalb des nach dem Schütteln eingeschlossenen Gases. Ohne die Zugabe von Perfluorkohlenstoffgas sind Gase, wie zum Beispiel ¹⁷O₂ im allgemeinen weitaus weniger wirksam, da es aufgrund seiner Löslichkeit aus dem Lipideinschluß nach intravenöser Injektion heraus diffundiert. Zusätzliches ¹⁷O₂-Gas ist recht teuer. Kombination des Perfluorkohlenstoffgases mit ¹⁷O₂-Gas erhöht stark die Wirksamkeit des Produkts und verringert die Kosten durch effizientere Verwendung des kostspieligen ¹⁷O₂-Gases. Ähnlich können andere Gase mit erwünschten paramagnetischen Eigenschaften, wie zum Beispiel Neon mit den Perfluorkohlenstoffgasen gemischt werden.
Wie nachstehende Tabelle 5 zeigt, kann eine große Vielfalt an verschiedenen Gasen bei Anwendung der MR-Abbildung verwendet werden. In Tabelle 5 werden R2-Werte (1/T2/mmol/lsek^–1) für verschiedene Gase in gasgefüllten Vesikeln gezeigt. Wie Tabelle 5 zeigt, gibt es dramatische Unterschiede im Relaxationsvermögen der verschiedenen gasgefüllten Vesikel, höhere R2 Relaxationswerte weisen auf wirksamere Vesikel als MR-Abbildungsmittel hin. Von den gezeigten Gasen weist Luft den höchsten R2-Wert auf. Es wird angenommen, dass Luft aufgrund der paramagnetischen Wirkung von Luftsauerstoff den höchsten Wert besitzt. Reiner Sauerstoff ist jedoch etwas weniger wirksam, wahrscheinlich aufgrund der höheren Löslichkeit des Sauerstoffs und dem Gleichgewicht von Sauerstoff mit dem die Vesikel umgebenden wässrigen Milieu. Zusammen mit Luft hilft der Stickstoff (Luft ist ungefähr 80% Stickstoff) den Sauerstoff innerhalb der Vesikel zu stabilisieren. Stickstoff weist eine viel geringere Wasserlöslichkeit auf als Luft. Wie vorstehend bemerkt ist, können PFP oder andere Perfluorkohlenstoffgase mit einem magnetisch aktiveren Gas, wie zum Beispiel Luft, Sauerstoff, ¹⁷O₂ oder mit Rubidium angereichertem hyperpolarisiertem Xenon gemischt werden. Wird dies ausgeführt, so können stabile hoch magnetisch aktive gasgefüllte Vesikel hergestellt werden.
TABELLE 5 Größenverteilung und Relaxationsvermögen
Der obere Gasraum des Behälters kann nach Wunsch mit dem Gas bei Umgebungsdruck, verringertem oder erhöhtem Druck gefüllt werden.
Im Behälter der Erfindung ist die gasförmige Phase im wesentlichen von der wässrigen Suspensionsphase getrennt. Mit im wesentlichen getrennt ist gemeint, dass vor dem Schütteln weniger als ungefähr 50% des Gases mit der wässrigen Suspensionsphase gemischt ist. Vorzugsweise ist weniger als ungefähr 40%, bevorzugter weniger als ungefähr 30%, noch bevorzugter weniger als ungefähr 20% und besonders bevorzugt weniger als ungefähr 10% des Gases mit der wässrigen Suspensionsphase gemischt. Die gasförmige Phase wird im wesentlichen von der wässrigen Suspensionsphase getrennt gehalten, bis zu ungefähr zu der Zeit der Verwendung, wobei dann der Behälter geschüttelt wird und die gasförmige Phase und die wässrige Suspensionsphase unter Bildung einer wässrigen Suspension gasgefüllter Vesikel gemischt werden. Auf dieser Weise wird ein ausgezeichnetes Kontrastmittel für die Ultraschall- oder magnetische Resonanzabbildung hergestellt. Überdies werden Probleme mit der Lagerbeständigkeit minimiert, da das Kontrastmittel unmittelbar vor der Verwendung hergestellt wird.
III. BEHÄLTERVOLUMEN UND OBERER RAUM
Es wurde gefunden, dass die Größe des oberen Gasraumes ebenfalls zur Beeinflussung der Größe gasgefüllter Vesikel verwendet werden kann. Da ein größerer oberer Gasraum in Bezug auf die Größe der wässrigen Phase proportional mehr Gas enthält, erzeugen im allgemeinen größere obere Gasräume größere Vesikel als kleiner dimensionierte obere Gasräume. Daher sollte der obere Gasraum, ausgedrückt als prozentualer Anteil des Gesamtvolumens des Behälters, einen maximalen Wert nicht überschreiten. Überdies wird ein zu kleiner oberer Gasraum der Flüssigkeit nicht ausreichend Patz zum Bewegen während des Schüttelns gewähren, um wirkungsvoll Vesikel zu bilden.
Zum Beispiel ist es eine Entdeckung dieser Erfindung, dass bei Verwendung von Fläschchen mit einem tatsächlichen Volumen von 3,7 ml (Wheaton 300 Borsilicatglas, Wheaton Industries, Millville, NJ, bezeichnet mit einer Nominalgröße von 2 ml, Durchmesser × Höhe = 15 mm × 32 mm), das Volumen des Gas-enthaltenden oberen Gasraumes vorzugsweise zwischen ungefähr 10% und ungefähr 60% des Gesamtvolumens des Glasfläschchens beträgt. Im allgemeinen beträgt der gasenthaltende obere Gasraum in einem Glasfläschchen zwischen ungefähr 10% und ungefähr 80% des Gesamtvolumens des Glasfläschchens, obwohl abhängig von den besonderen Umständen und der gewünschten Anwendung mehr oder weniger Gas geeignet sein kann. Der obere Gasraum umfaßt bevorzugter zwischen ungefähr 30% und ungefähr 70% des Gesamtvolumens. Im allgemeinen wurde festgestellt, dass das besonders bevorzugte Volumen des Gas-enthaltenden oberen Gasraumes ungefähr 60% des Gesamtvolumens des Behälters beträgt.
IV. OPTIMALE WERTE FÜR DIE SCHÜTTELPARAMETER
A. Die Form des durchlaufenen Weges und Schüttelamplitude
Wie vorstehend diskutiert wurde, beeinflusst zusätzlich zu den Zusammensetzungen der wässrigen Suspensions- und gasförmigen Phasen, die spezifische Art, in der der diese Phasen enthaltende Behälter geschüttelt wird, die Vesikelgrößenverteilung. Die optimalen Schüttelbedingungen können unter Bezugnahme auf vier Parameter definiert werden – die Form des von dem Behälter während des Schütteln durchlaufenen Weges, die Amplitude der Schüttelbewegung, die Schüttelfrequenz und die Zeitdauer des Schütteln.
Es wurde festgestellt, dass der von dem Behälter während des Schüttelns durchlaufene Weg besonders bei der Bildung von Vesikeln mit geeigneter Größe signifikant ist. Insbesondere wurde festgestellt, dass kleine Vesikel in einer minimalen Zeit hergestellt werden können, wenn das Schütteln in Form einer reziproken Bewegung stattfindet. Andere Schüttelarten, wie zum Beispiel Verwirbeln kann ebenfalls kleine Vesikel herstellen. Jedoch verringert reziprokes Schütteln stark die Zeitdauer des Schüttelns, die zum Erreichen einer hohen Konzentration an kleinen Vesikeln notwendig ist.
Die Erfinder haben festgestellt, dass Vesikel mit kleiner Größe in einer relativ kurzen Zeitdauer erhalten werden – das heißt in 2 Minuten oder weniger –, wenn die Schüttelamplitude – insbesondere die Länge C des von dem Behälter während des Schüt telns durchlaufenen reziproken Wegs – mindestens 0,3 cm beträgt. Im allgemeinen werden die Vesikel mit zunehmender Schüttelamplitude kleiner. Jedoch ist auch die Schüttelfrequenz ein wichtiger Parameter, wie nachstehend diskutiert wird. Da praktische mit der Schüttelausstattung zusammenhängende Erwägungen typischerweise zu einem Abfallen der Schüttelfrequenz zu unerwünscht geringen Werten führen, bei einer Zunahme der Schüttelamplitude außerhalb eines bestimmten maximalen Werts, sollte die Amplitude ausreichend gering gehalten werden, um sicherzustellen, dass die Schüttelfrequenz ausreichend bleibt. Für die Wig-L-Bug^TM Modell 3110B Schüttelvorrichtung beträgt diese maximale Amplitude näherungsweise 2,5 cm.
Die Erfinder haben ebenfalls festgestellt, dass die reziproke Bewegung vorzugsweise entlang eines gekrümmten Wegs 20 erfolgt, wie in 4 gezeigt ist, wobei die Amplitude der Schüttelbewegung mit C bezeichnet ist, da eine Schüttelbewegung mit hoher Frequenz leichter auf diese Art ausgeführt werden kann. In der bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist der gekrümmte Weg 20 durch einen Radius mit Krümmung L definiert, der durch den Schüttelarm mit Länge L gebildet wird. Der erfindungsgemäße Schüttelarm 7 weist vorzugsweise eine Länge L von mindestens 6 cm auf und rotiert um einen Winkel Θ von mindestens 3°. Wie nachstehend weiter diskutiert wird, wird entsprechend der bevorzugten Ausführungsform der Erfindung der Rotationswinkel des Schüttelarms Θ durch Anwenden einer Aufspannung mit einer Winkelverschiebung Θ erreicht. Weiterhin ist die Länge L des Schüttelarms als der Abstand von der Mitte der Achse einer exzentrischen Laufbüchse 40, auf der die Schüttelarm 7 Halterung 50 befestigt ist, wie weiter untenstehend diskutiert ist, zur Mittelachse des Behälters 9 definiert, wie in 3 gezeigt ist.
Die Verwendung längerer Schüttelarmlängen L und größerer Rotationswinkel Θ wird die Schüttelamplitude und folglich allgemein die Vesikelgröße verringern. Jedoch sollten, wie vorstehend diskutiert ist, die maximalen Werte für die verwendete Schüttelarmlänge L und den Rotationswinkel Θ beschränkt werden, um sicherzustellen, dass die Schüttelamplitude C nicht so groß wird, dass daraus unzureichende Schüttelfrequenzen resultieren. Zusätzlich werden ebenfalls mechanische Erwägungen die Größe des Rotationswinkels des Schüttelarms 7 einschränken. Für das Wig-L-Bug^TM Modell 3110B sollten die verwendete maximale Schüttelarmlänge und Rotationswinkel näherungsweise 15 cm beziehungsweise näherungsweise 9° betragen.
Zusätzlich ist der Schüttelvorrichtung eine reziproke Bewegung in einer zweiten Richtung überlagert, die senkrecht zur reziproken Bewegung in der ersten Richtung ist. Die Schüttelamplitude in der zweiten Richtung C' ist vorzugsweise mindestens näherungsweise einzehntel von der Schüttelamplitude in der ersten Richtung C. Für Zwecke der Beschreibung wird die erste Richtung der reziproken Bewegung als longitudinale Richtung und die zweite Richtung der reziproken Bewegung als transversale Richtung bezeichnet.
Entsprechend der vorliegenden Erfindung wird die zeitliche Synchronisierung der Bewegungen in Iongitudinaler und transversaler Richtung so angepasst, dass die Summe der Bewegungen in den zwei Richtungen zu einem Schütteln des Behälters 9 entlang der Figur einer Acht führt.
In den 4 und 5 wird, gestützt auf das Vorstehende, der durch den Behälter 9 beschriebene bevorzugte Schüttelweg 20 gezeigt, wobei er am Ende des Schüttelarms 7 der Schüttelvorrichtung 1 der vorliegenden Erfindung befestigt ist. Wie in 5 entsprechend der vorliegenden Erfindung gezeigt ist, überträgt der Schüttelarm 7 die Bewegung auf den Behälter 9 in der transversalen Richtung, während er in der longitudinalen Richtung sich vor- und zurückbewegt, auf eine solche Art, dass ein Punkt auf dem Behälter 9 die Figur einer Acht durchläuft. Die Länge der Figur in Form einer Acht ist die Amplitude in der longitudinalen Richtung C und die Breite der Figur in Form einer Acht ist die Schüttelamplitude in der transversalen Richtung C'. Beim Anblick von der Seite, wie in 4 gezeigt ist, ist der Weg in longitudinalen Richtung gekrümmt – insbesondere ist er ein Bogen mit einem Radius mit einer Krümmung, die gleich der Länge L des Schüttelarms 7 ist. Die Bogenlänge C ist das Produkt aus der Schüttelarmlänge L und dem Winkel Θ, der von der Schüttelarmrotation in der longitudinalen Ebene überdeckt wird, ausgedrückt in Radiant – das heißt, dass C = LΘ ist.
Die Figur einer Acht besteht vorzugsweise aus näherungsweise zwei geraden Abschnitten 21, die sich mit einem Winkel Φ schneiden, und aus näherungsweise zwei Halbkreisabschnitten 22. Wie weiter untenstehend diskutiert wird, ist in der bevorzugten Ausführungsform der Erfindung der von der Figur einer Acht gebildete Winkel Φ näherungsweise gleich dem Rotationswinkel des Schüttelarms 7 in der longitudinalen Richtung Θ. Wie weiter unten diskutiert wird, wird die durch Anwendung einer Kraft auf den Schüttelarm 7 von einer Feder 46 erreicht, die ausreicht, um den Schüttelarm im wesentlichen in einer vertikaler Orientierung in der transversalen Ebene während des Schüttelns zu halten, wie in den 9 und 10 gezeigt ist. Wird die Federspannung so angepasst, dass dem Schüttelarm 7 gestattet wird, über einen Winkel in der transversalen Ebene w zu rotieren, wie in 12 gezeigt ist, dann wird der von dem Behälter 9 durchlaufene Winkel Φ der Schüttelfigur in Form einer Acht größer als Θ sein.
Falls Φ gleich Θ ist, dann wird der in einem Umlauf durchlaufene Gesamtabstand D um den Weg 20 eine Funktion von zwei Variablen sein – der Länge des Schüttelarms L und des Winkels Θ, der durch den Schüttelarm bei seinem Durchlauf in der longitudinalen Ebene beschrieben wird. Dieser Abstand D kann durch die Gleichung D = 2L[(2 sin Θ/2 + π tan2 Θ/2)/(1 + tan Θ/2)]angenähert werden.
Da die Länge L mindestens 6 cm und der Winkel Θ mindestens 3° beträgt, sollte der Abstand D mindestens ungefähr 0,6 cm betragen.
Mit Φ = Θ wird weiterhin die Schüttelamplitude in der transversalen Richtung C' eine Funktion der Amplitude in der longitudinalen Richtung C und des Winkels Θ sein und kann durch die Gleichung: C' = (2C tan Θ/2)/(1 + tan Θ/2)angenähert werden.
Da die Schüttelamplitude in der longitudinalen Richtung C vorzugsweise mindestens ungefähr 0,3 cm und der Winkel Θ mindestens ungefähr 3° beträgt, sollte die Amplitude in der transversalen Richtung C' vorzugsweise mindestens ungefähr 0,02 cm betragen.
Die optimalen Werte für die vorstehend diskutierte Amplitude und Form der Schüttelbewegung wurden gestützt auf eine Reihe von Tests ermittelt, die nachstehend im untergeordneten Abschnitt C diskutiert sind.
B Schüttelfrequenz und Schütteldauer
Zusätzlich zur Gestalt und Amplitude der Schüttelbewegung ist ebenfalls die Schüttelfrequenz ein wichtiger Parameter bei der Bildung von Vesikeln mit geeigneter Größe. Die Schüttelfrequenz wird bezüglich der Umläufe pro Minute („Upm"), die der Schüttelarm 7 durchläuft quantitativ bestimmt und ist als die Anzahl von Malen definiert, die der Schüttelarm und folglich der an ihm befestigte Behälter 9 die gesamte Schüttellänge in einer Minute durchläuft. Somit bedeutet in der bevorzugten Ausführungsform der Erfindung, dass bei Schütteln mit einer Frequenz von 3600 Upm der Behälter 9 die Schüttelbewegung entlang des Wegs in Figur einer Acht dreitausendsechshundert mal in einer Minute oder sechzig mal in einer Sekunde durchläuft.
Es wurde festgestellt, dass Vesikel unter Verwendung von Schüttelfrequenzen im Bereich von 100 Upm bis 10000 Upm hergestellt werden können. Jedoch wurde festgestellt, dass es eine minimale Schüttelfrequenz gibt, die zur Erzeugung von Vesikeln optimaler Größe innerhalb einer relativ kurzen Zeitdauer führen. Wie nachstehend in Abschnitt C diskutiert wird, wurde festgestellt, daß diese minimale Frequenz näherungsweise 2800 Upm beträgt. Obwohl im allgemeinen eine zunehmende Schüttelfrequenz die Vesikelgröße verringert, legen typischerweise die Einschränkungen der Schüttelvorrichtung die maximal erhältliche Frequenz fest. Für das Wig-L-Bug^TM beträgt die maximal erhältliche Frequenz ungefähr 3300 Upm. Entsprechend der vorliegenden Erfindung umfaßt die Frequenz Werte zwischen 2800 und 10000 Upm.
Bei Frequenzen im Bereich von 2800 bis 3300 Upm beträgt die optimale Schütteldauer mindestens näherungsweise 60 Sekunden. Jedoch steht die optimale Schütteldauer mit der Frequenz in Zusammenhang und kann bei höheren Frequenzen geringer sein. Daher beträgt zum Beispiel die optimale Schütteldauer bei 4500 Upm nur 50 Sekunden.
C. Testergebnisse
Der optimale Wert für die Schüttelfrequenz, sowie für die Form und Amplitude der Schüttelbewegung wurde über eine Reihe von Tests entwickelt, wie untenstehend diskutiert ist.
Eine erste Testreihe wurde zur Bestimmung der Wirkung der Schüttelfrequenz auf die Vesikelgöße durchgeführt. 1 mg ml^–1 Proben von Lipid, bestehend aus Dipalmitoylphosphatidylcholin (DPPC) (Avanti Polar Lipids, Alabaster, Ala), Dipalmitoylphosphatidsäure (DPPA) (Avanti Plolar Lipids, Alabaster, Ala) beziehungsweise Dipalmitoylphosphatidylethanolamin, kovalent gebunden an Polyethylenglycolmonomethylether mit einem Molekulargewicht = 5000, in einem Molverhältnis 82 Mol % : 10 Mol % : 8 Mol % wurden zu einem Verdünnungsmittel, bestehend aus normaler Salzlösung, Glycerol (Spectrum Chemical Co., Gardena, Kalif.) und Propylenglycol (Spectrum Chemical Co., Gardena, Kalif.) (8 : 1 : 1, v : v : v), gegeben. Dann wurden die Proben auf 45°C während 10 Minuten erhitzt und man ließ sie bei Raumtemperatur (25°C) äquilibrieren.
Die Proben wurden dann zu Borosilicatfläschchen mit nominal 2,0 ml VWR Scientific, Boston, Mass.) von dem in 1 gezeigten Typ (tatsächliches Volumen 3,7 ml) gegeben. Die Glasflächen wurden dann mit einem Butylgummistopfen dicht verschlossen und mit einer passenden Aluminiumklemmverbindung gasdicht verschlossen. Der obere Gasraum in den Glasfläschchen betrug näherungsweise 60% des Gesamtvolumens der Glasfläschchen. Dann wurden die Proben mit Perfluorpropan (Flura Corporation, Nashville, Tenn.) gespült und auf die in 3 gezeigte Schüttelvorrichtung gesetzt, was weiterhin in Abschnitt V diskutiert wird.
Die Behälter wurden während 2 Minuten unter Verwendung der in den 4 und 5 gezeigten Bewegung in Form einer Acht geschüttelt. Die Länge des Schüttelarms L betrug 7,7 cm und der aufgespannte Verschiebungswinkel Θ und daher der Rotationswinkel des Schüttelarms in der longitudinalen Ebene betrug 6°. Unter Verwendung der vorstehend diskutierten Beziehungen wurde ermittelt, dass die Schüttelamplitude in den longitudinalen und transversalen Richtungen C und C' näherungsweise 0,8 cm beziehungsweise 0,1 cm betrugen. Es wurden Schüttelfrequenzen von 1500, 2800 und 3300 Upm verwendet, entsprechend der Messung über ein Code-Palmer Modell 08210 Pistolengrifftachometer (Code-Palmer, Nile, III.). Die Größenbestimmung wurde durch optische Kleinteilchengößenbestimmung auf einem Teilchengrößenbestimmungssystem Lichtverdunkelungsteilchengrößenbestimmunggerät (Santa Barbara, Kalif.) ermittelt.
Tabelle 6 zeigt die Ergebnisse dieser Tests und zeigt die Wirkung, die die Schüttelfrequenz auf die resultierende mittlere Vesikelgröße ausübt.
TABELLE 6 Wirkung der Schüttelfrequenz auf die mittlere Vesikelgröße
Wie ersichtlich ist, verringert eine Schüttelfrequenz von mehr als 2800 Upm deutlich die mittlere Vesikelgröße, die nach 2 Minuten Schütteln erhalten wird.
Es wurde eine zweite Testreihe zur Bestimmung der Wirkung einer zunehmende Schüttelarmlänge L und folglich der Schüttelamplitude in den longitudinalen und transversalen Richtungen C und C', sowie auch des Schüttelabstands pro Zyklus D auf die Vesikelgröße durchgeführt. Die Tests wurden auf die gleiche Weise wie die vorstehend diskutierten durchgeführt, abgesehen davon, dass die Behälter während 60 Sekunden unter Verwendung von Schüttelarmlängen L über einen Bereich von 6,7 bis 14,8 cm geschüttelt wurden.
Die Veränderungen in der Schüttelarmlänge führten zu Veränderungen in der Schüttelfrequenz über einen Bereich von 2250 bis 3260 Upm, wobei die Schüttelfrequenz mit zunehmender Schüttelarmlänge abnahm. Die Veränderung der Schüttelfrequenz mit der Schüttelarmlänge L und dem Schüttelarmrotationswinkel Θ ist in 13 gezeigt. Daher betrug beispielsweise bei Verwendung einer Schüttelarmlänge L von 6,7 cm und einem Rotationswinkel Θ von 6 ° die Schüttelfrequenz näherungsweise 3200 Upm, wohingegen bei einer Zunahme der Schüttelarmlänge auf 13,8 cm, unter Beibehaltung desselben Rotationswinkels, die Frequenz auf ungefähr 2700 Upm abfiel.
Die Ergebnisse dieser Testreihen sind in den 14(a)–(c) gezeigt. Wie in 14(a) gezeigt ist, sind bei einem Rotationswinkel 0 von 6° in der longitudinalen Ebene mindestens 98% der Vesikel kleiner als 10 Mikrometer, wenn die Schüttelarmlänge L 7,7 cm oder mehr beträgt – das heißt, wenn die Schüttelamplituden in der longitudinalen Richtung C mehr als 0,8 cm beträgt. Überdies erreicht der Prozentsatz der Vesikel, die kleiner als 10 μm sind ein Plateau von ungefähr 99 bis 99,5% bei Schüttelarmlängen L von 9,8 cm und mehr – das heißt, wenn die Schüttelamplituden in der longitudinalen Richtung 1,0 cm oder mehr betragen. Die zahlengewichtete mittlere Größe der Vesikel erreicht ein Plateau von ungefähr 2 μm bei denselben Bedingungen, wie in 14(b) gezeigt ist.
Obwohl im allgemeinen eine zunehmende Schüttelfrequenz die Verringerung der Vesikelgröße bewirkt, wenn alle anderen Variablen konstant gehalten werden, wie vorstehend diskutiert und in Tabelle 6 gezeigt ist, zeigen diese Daten, dass eine Zunahme der Schüttelamplitude durch eine Zunahme der Schüttelarmlänge die Größe der Vesikel auch dann verringert, wenn solche Zunahmen mit Verringerungen in der Schüttelfrequenz kombiniert werden, wie in 13 gezeigt ist.
Wie in 14(c) gezeigt ist wurden bei allen Schüttelarmlängen mehr als 400 × 10⁶ Vesikel pro ml erhalten und tatsächlich führte die Verwendung von Schüttelarmlängen im Bereich von ungefähr 10 bis 12 cm zu der Erzeugung von mehr als 1000 × 10⁶ Vesikel pro ml. Wurde jedoch die Schüttelarmlänge auf mehr als 12 cm erhöht, begannen die Teilchenzahlen pro ml zu fallen und erreichten 800 × 10⁶ Vesikel pro ml bei 14,8 cm. Obwohl es in 13 nicht gezeigt ist, betrug die mit einer Schüttelarmlänge von 14,8 cm und einem Schüttelarmrotationswinkel von 6° bestimmte Frequenz nur 2550 Upm. Es wird daher angenommen, dass das Absinken der Konzentration der mit einer Armlänge von 14,8 cm hergestellten Vesikel durch das Absinken der Schüttelfrequenz verursacht wurde, die die Zunahmen in der Schüttelamplitude begleitet, wie vorstehend diskutiert wurde. Daher weisen diese Daten darauf hin, dass bei Verwendung einer Wig-L-Bug^TM Schüttelvorrichtung, die Schüttelarmlänge vor zugsweise weniger als näherungsweise 15 cm betragen sollte, um die Vesikelkonzentration zu maximieren.
Eine dritte Testreihe wurde unter Verwendung derselben vorstehend diskutierten Materialien und Verfahren hergestellt, abgesehen davon, dass der aufgespannte Verschiebungswinkel und folglich der Winkel der Schüttelarmrotation in der longitudinalen Richtung Θ von 6° auf 9° erhöht war, wodurch die Schüttelamplitude in der longitudinalen Richtung erhöht war. Zusätzlich wurden keine Schüttelarmlängen von mehr als 11,8 cm verwendet. Die Ergebnisse dieser Tests sind zum Vergleich zusammen mit den Ergebnissen der vorstehend diskutierten Testreihe in den 15(a)–(c) gezeigt.
Wie aus 15(a) ersichtlich ist, verringert eine Zunahme des Rotationswinkels des Schüttelarms Θ von 6° auf 9° die Vesikelgröße, obwohl sie sogar ebenfalls eine Verringerung der Schüttelfrequenz bewirkt, wie in 13 gezeigt ist. Somit führt ein Schüttelarmrotationswinkel von 9° und sogar einer Schüttelarmlänge von nur 6,7 cm zu Vesikeln, wobei über 99,5% kleiner als 10 μm sind und eine mittlere Größe von ungefähr 2 μm aufweisen. Zusätzlich wurden mehr als 1000 × 10⁶ Vesikel pro ml bei allen Schüttelarmlängen erhalten, wie in 15(c) gezeigt ist.
Eine andere Testreihe wurde unter Verwendung derselben vorstehend diskutierten Materialien und Verfahren durchgeführt, abgesehen davon; dass aufgespannte Verschiebungswinkel und daher Schüttelarmrotationswinkel Θ in der longitudinalen Richtung von 3°, 5,2°, 6°, 7,8° und 9° zusammen mit Schüttelarmlängen L zwischen 6,7 cm und 13,8 cm (zunehmend in näherungsweise 1 cm Schritten) verwendet wurden. An jedem Punkt wurde die Gesamtlänge D des Schüttelwegs 20 geschätzt. In 17 ist die Frequenz als Funktion der Gesamtweglänge gezeigt. Die Ergebnisse sind in den 16(a)–(c) als Funktion der Gesamtweglänge D gezeigt. Wie ersichtlich ist, waren unter allen Testbedingungen – das heißt bei Gesamtweglängen D von 0,7 cm und mehr – mehr als 95% der Vesikel kleiner als 10 μm und die Konzentration der hergestellten Vesikel betrug mehr als 100 × 10⁶ pro ml. Weiterhin waren unter allen Testbedingungen, bei denen die Gesamtweglänge D 2,19 cm oder größer war, mehr als 98% der Vesikel kleiner als 10 μm. Dies weist darauf hin, dass die Ge samtweglänge der Schüttelbewegung mindestens 0,7 cm und vorzugsweise mindestens 2,2 cm betragen sollte.
Das Vorstehende zeigt daher, dass Vesikel mit kleiner Größe in ungefähr 2-Minuten oder weniger erhalten werden können, wenn das reziproke Schütteln so ausgeführt wird, dass die Schüttelfrequenz mindestens näherungsweise 2800 Upm beträgt. Zusätzlich sollte die Schüttelbewegung in zwei im wesentlichen zueinander senkrechten Richtungen und besonders bevorzugt in der Figur einer Acht ausgeführt werden. Weiterhin sollte die Schüttelamplitude in der Hauptrichtung mindestens 0,3 cm und vorzugsweise mindestens 0,8 cm betragen oder die Gesamtlänge des Schüttelwegs sollte mindestens 0,7 cm und vorzugsweise mindestens 2,2 cm betragen.
V. DIE VORRICHTUNG DER ERFINDUNG
A. DIE BEVORZUGTE SCHÜTTELVORRICHTUNG
Die bevorzugte Schüttelvorrichtung 1 der vorliegenden Erfindung ist in den 2 und 3 gezeigt. Die Vorrichtung umfaßt eine Basis 2 und eine aufklappbare Sichterheitsabdeckung 3. Ein Startknopf 6 und eine Geschwindigkeitsreglerwahlscheibe 5 sind auf einem Gehäuse 4 befestigt, das die Basis 2 umgibt. Ein Arm 7 ragt durch eine Öffnung 12 im oberen Teil des Gehäuses 4 heraus. Drehen der Wahlscheibe 5 im Uhrzeigersinn erhöht die Schüttelgeschwindigkeit, während Drehen der Wahlscheibe entgegen dem Uhrzeigersinn die Schüttelgeschwindigkeit erniedrigt.
Entsprechend der vorliegenden Erfindung wird eine Befestigungsklammer 8 an das entfernte Ende des Arms 7 angebracht, die es gestattet, dass der Behälter 9 am Arm sicher befestigt ist, wie weiter untenstehend diskutiert wird. Die Befestigungsklammer 8 wird mit mehreren Federklemmen 11 und 12 befestigt, die den Behälter 9 sicher an seinem Ort halten. Alternativ dazu könnte ebenfalls eine Klammer in der Art einer Schraubzwinge verwendet werden, um noch für eine noch sicherere Befestigung des Behälters 9 zu sorgen. Wie in 3 gezeigt ist, kann die Befestigungsklammer bezüglich der Horizontalen in einem Winkel 6 so ausgerichtet sein, dass beim Einbau in die Vorrichtung 1, die Achse des Behälters 9 ebenfalls in einem Winkel 6 bezüglich der Horizontalen ausgerichtet ist. Der Winkel 6 liegt vorzugsweise im Bereich von –5° bis +5° und ist besonders bevorzugt ungefähr 0°. Während des Gebrauchs wird der Behälter 9 an der Befestigungsklammer 8 befestigt und die Schüttelvorrichtung 1 wird betrieben, um den Behälter entlang der Durchlaufstrecke, die in den 4 und 5 gezeigt ist, zu schütteln.
Die 6–12 zeigen die inneren Hauptkomponenten der Schüttelvorrichtung 1, entsprechend der vorliegenden Erfindung. Wie ersichtlich ist, ist der Schüttelarm 7 drehbar auf der Welle 42 eines elektrischen Motors 44 befestigt. Wie am besten in den 6 und 9 gezeigt ist, wird am nächstgelegenen Ende des Schüttelarms 7 eine zylindrische Büchse 41 gebildet. In der Büchse 41 ist ein Lager 50 angebracht, das eine zylindrische exzentrische Laufbüchse 40 trägt. Die Laufbüchse 40, am besten in 11 gezeigt, ist fest an der Welle 42 angebracht – indem sie zum Beispiel auf sie gepresst ist oder zusammen mit der Welle geformt wird – und sie rotiert innerhalb des Lagers 50.
Wie am besten in 11 gezeigt wird, ist ein Ende 43 der Laufbüchse 40 in Bezug auf die Welle 42 exzentrisch, während das andere Ende 45 der Laufbüchse mit der Welle konzentrisch ist. Folglich bildet die Mittelachse der Laufbüchse 40 einen spitzen Winkel Θ/2 mit der Mittelachse der Welle 42. Der Winkel Θ wird als die aufgespannte Winkelverschiebung bezeichnet. Wie vorstehend diskutiert ist, beträgt die aufgespannte Winkelverschiebung Θ vorzugsweise mindestens ungefähr 3°. Wie in den 7 und 8 gezeigt ist, rotiert der Schüttelarm 7 in der longitudinalen Ebene mit einem Winkel, der gleich Θ ist, vor und zurück, während die Welle 42 und die Laufbüchse 40 um 360° rotieren (ist die Ausrichtung der Laufbüchse so ausgerichtet, wie in 8 gezeigt ist, so ist die Position des Schüttelarms 7 wie im Phantom in 7 gezeigt). Somit rotiert die Drehbewegung der Welle 42 die Büchse 41 in der longitudinalen Ebene und überträgt auf das entfernte Ende des Schüttelarms 7, an den der Behälter 9 befestigt ist, eine geradlinige Bewegung entlang eines gekrümmten Weges, wie in 4 gezeigt ist.
Aufgrund der exzentrischen Natur der Laufbüchse 40 tendiert die Rotation der Welle 42 dazu, die Büchse 41 des Schüttelarms 7 durch die aufgespannte Winkelverschiebung Θ ebenfalls auch in der transversalen Richtung zu drehen, wie in 10 gezeigt ist (im Phantom in 10 ist die Position des Schüttelarms gezeigt, wenn die Laufbüchse um 180° gedreht worden ist). Ist somit die Rotation der Welle 42 im Uhrzeigersinn, beim Anblick von links nach rechts in 7, dann wird die Ausrichtung des Schüttelarms 7, wenn die exzentrische Laufbüchse 40 bei 0° ist, durch die durchgezogenen Linien in 7 gezeigt, in Phantom in 10 ist die Ausrichtung gezeigt, wenn die Laufbüchse bei 90° ist, in 8 wird die Ausrichtung gezeigt, wenn die Laufbüchse bei 180° ist und in 10 wird die Ausrichtung, wenn die Laufbüchse bei 70° ist durch die durchgezogenen Linien gezeigt. Bei Rotation der exzentrischen Laufbüchse um 360° innerhalb des Lagers 50, überträgt somit der Schüttelarm 7 eine Schüttelbewegung an den Behälter 9 in sowohl longitudinaler als auch transversaler Richtung, wobei die vorstehend diskutierte Figur einer Acht erreicht wird.
Eine Feder 46 ist von der unteren toten Mitte der Büchse 41 zur Grundplatte 5 des Gehäuses der Schüttelvorrichtung gespannt, wie in 6 gezeigt ist. Die Spannung der Feder 46 bewirkt, dass der Schüttelarm 7 in der aufrechten Position bleibt, wenn die Laufbüchse 40 rotiert. Die Feder 46 weist vorzugsweise eine Spannung auf, die ausreicht, um den Schüttelarm 7 im wesentlichen vertikal in der transversalen Ebene ausgerichtet zu halten, wie in den 9(a) und (b) gezeigt ist, obwohl er von der vertikalen in die longitudinale Ebene mit Θ/2 abweicht, wie in 7 gezeigt ist. Die Verwendung einer Feder 46 mit einer geringeren Federkonstante gestattet dem Schüttelarm 7 in der transversalen Ebene mit einem Winkel w zu rotieren, wie in 12 gezeigt ist. Dies bewirkt die Zunahme der Amplitude in der transversalen Richtung C'.
Die Schüttelvorrichtung 1 wird vorzugsweise durch Modifikation einer handelsüblichen Schüttelvorrichtung konstruiert, die von Crescent Dental Manufacturing, Inc., 7750 West 47-te Straße, Lyons, IL 60534 unter dem Namen Wig-L-Bug^TM 3110B Schüttelvorrichtung hergestellt wird. Diese Wig-L-Bug^TM Vorrichtungen verwenden ein Schüttelmuster in Form einer Acht und werden mit einem Schüttelarm mit einer Länge L von 4 cm, einem aufgespannten Verschiebungswinkel und daher mit einem Schüttelarmrotationswinkel in longitudinaler Richtung Θ von 6° vertrieben und arbeiten bei einer feststehenden Geschwindigkeit von 3200 Upm. Der Schüttelarm auf dem Wig-L-Bug zeichnet sich durch ein Löffelpaar zum Halten der Proben aus.
Somit kann die Schüttelvorrichtung der vorliegenden Erfindung durch Modifikation einer Wig-L-Bug^TM 31110B Schüttelvorrichtung erzeugt werden, indem ein Behälter 9 an dem entfernten Ende des mindestens 6 cm langen Armes 7 eingebaut wird, in dem die wässrige Suspensionsphase und gasförmige Phase zugegeben worden sind, wie vorstehend diskutiert ist. Die Wig-L-Bug^TM Schüttelvorrichtung wird vorzugsweise ebenfalls modifiziert, um die Befestigungsklammer 8 zur sicheren Befestigung des Behälters 9 auf dem Schüttelarm 7 zu enthalten, wie in den 3 und 6 gezeigt ist. Zusätzlich können in Abhängigkeit von der Zusammensetzung der wässrigen und gasförmigen Phasen, der Größe des Behälters, usw. optimale Ergebnisse erhalten werden, indem der Wig-L-Bug^TM weiterhin modifiziert wird, um (i) das Schütteln bei einer anderen Frequenz als 3200 Upm zur Verfügung zu stellen oder um den Betrieb über einen Bereich von Schüttelfrequenzen zu gestatten oder (ii) um einen anderen aufgespannten Verschiebungswinkel Θ als 6° durch Modifikation der Verschiebung der Laufbüchse 40 zu verwenden.
Es können ebenfalls in der Ausübung der vorliegenden Erfindung andere Arten von reziproken Schüttelvorrichtung verwendet werden, besonders bevorzugt Schüttelvorrichtungen, die eine Schüttelbewegung übertragen, die der Figur einer Acht folgen. Zusätzlich zu dem Wig-L-Bug^TM umfassen solche Vorrichtungen (i) den von Degussa AG, Frankfurt, Deutschland vertriebenen Mixomat, (ii) den von Espe Fabrik Pharmazeutischer Präparate GmbH & Co., Seefeld, Oberay Deutschland vertriebenen Cabmix, (iii) den von Vivadent, Lichtenstein vertriebenen Silamat Plus und (iv) den von Quayle Dental, Sussex, England vertriebenen Vibros.
Die 18(a)–(c) zeigen die Testergebnisse auf dem Mixomat und Capmix im Vergleich zu den von einem Wig-L-Bug^TM 3110B erhaltenen Testergebnissen, unter Verwendung derselben vorstehend diskutierten Materialien und Verfahren, in Bezug auf die in den 13–17 gezeigten Testergebnisse und einer Schütteldauer von 60 Sekunden, wobei der Wig-L-Bug^TM bei einer Frequenz von 3200 Upm, der Mixomat bei einer Frequenz von 4100 Upm und der Capmix bei einer Frequenz von 4500 Upm arbeitete. Wie in jedem Fall ersichtlich ist, waren mehr als 98% der Vesikel kleiner als 10 μm und es wurden mehr als 800 × 10⁶ Vesikel pro ml erzeugt.
B. DER BEVORZUGTE BEHÄLTER
Der erfindungsgemäß an der Schüttelvorrichtung 1 befestigte Behälter kann eine Vielfalt verschiedener Formen annehmen. Ein bevorzugter Behälter 9 ist in 1 gezeigt und umfaßt einen Körper 30 und einen gasdichten Verschluß 10. Bei Befüllung bildet der Behälter 9 einen oberen Gasraum 32 und eine wässrige Suspensionsphase 34, die im wesentlichen voneinander getrennt sind. Alternativ dazu kann der Behälter die Form einer vorher aufgefüllten Spritze annehmen, die auf Wunsch mit einem oder mehreren Filtern ausgestattet ist. Dementsprechend umfaßt der Ausdruck Behälter, wie er hier verwendet wird, eine Spritze. Spritzen, die mit einer wässrigen Phase und deren oberer Gasraum mit einem vorher ausgewählten Gas gefüllt sind, werden vorzugsweise auf der Schüttelvorrichtung 1 befestigt, wobei ihre langen Achsen in der transversalen Richtung – das heißt, senkrecht zur Bogenlänge C ausgerichtet sind. Nach Schütteln werden gebrauchsfertige gasgefüllte Vesikel in der Spritze erzeugt. Der Behälter ist unabhängig von seiner Art vorzugsweise zusammen mit seinen Inhalten steril.
Obwohl im allgemeinen die Erfindung mit sterilen Behältern ausgeübt wird, wobei die wässrige Phase schon in dem Behälter vorhanden ist, können für ausgewählte Anwendungen die Stabilisierungsmedien in dem Behälter in einem getrockneten oder gefriergetrockneten Zustand gelagert werden. In diesem Fall wird die wässrige Lösung, zum Beispiel sterile phosphatgepufferte Salzlösung, dem sterilen Behälter unmittelbar vor dem Schütteln zugegeben. Dabei treten die rehydratisierten Stabilisierungsmedien innerhalb der wässrigen Phase wieder mit dem Gas im oberen Gasraum während des Schüttelns in Wechselwirkung, so dass, wie vorstehend, gasgefüllte Vesikel erzeugt werden. Die Rehydratation eines getrockneten oder gefriergetrockneten Suspensionsmediums macht das Produkt notwendigerweise weiter komplizierter und ist im allgemeinen unerwünscht, jedoch kann sie für bestimmte Präparate nützlich sein, um die Lagerbeständigkeit des Produkts weiter zu verlängern. Zum Beispiel können bestimmte therapeutische Mittel, wie zum Beispiel Cyclophosphamid, Peptide und genetische Materialien (wie zum Beispiel DNA) bei langfristiger wässriger Lagerung hydrolysiert werden. Die Rehydratation einer vorher gefriergetrockneten Probe unter Bildung der wässrigen Phase und einem oberen Gasraum vor dem Schütteln kann zur Herstellung gasgefüllter Vesikel praktisch sein, die Ver bindungen enthalten, die ansonsten keine ausreichende Lagerbeständigkeit aufweisen könnten.
Zur Herstellung des Behälters kann eine Vielfalt verschiedener Materialien verwendet werden, wie zum Beispiel Glas, Borosilicatglas, Silicatglas, Polyethylen, Polypropylen, Polytetrafluorethylen, Polyacrylate, Polystyrol oder andere Kunststoffe. Die bevorzugten Behälter sind entweder gasundurchlässig oder von einer äußeren gasundurchlässigen Barriere umhüllt, bevor sie mit Gas gefüllt werden. Dies ist natürlich wünschenswert, um die Unversehrtheit des vorher ausgewählten Gases innerhalb des Behälters aufrechtzuerhalten. Beispiele von Spritzenmaterialien, die eine gasdichte Tauglichkeit aufweisen, können Glassilicate oder Borosilicate umfassen, die mit Quarzglasspritzen oder Feststellspritzen und Kolben mit Teflonende oder teflonbeschichteten Kolben ausgestattet sind, sie sind jedoch nicht darauf beschränkt.
Die Größe des Behälters, insbesondere sein Gewicht wird die Größe der gasgefüllten Vesikel beeinflussen. Die Schüttelvorrichtungen werden im allgemeinen langsamer schütteln, wenn das Gewicht des Behälters über eine bestimmte Höhe zunimmt – zum Beispiel schüttelt ein Wig-L-Bug^TM 3110B schneller mit einem 2 ml Glasfläschchen (tatsächliches Volumen 3,7 ml) als mit einem 10 ml Glasfläschchen. Daher sollte das Volumen des Behälters einen bestimmten Wert nicht überschreiten, in Abhängigkeit von der speziellen verwendeten Schüttelvorrichtung.
Auf einem Wig-L-Bug wurden Tests unter Verwendung von sowohl einem 10 ml klaren Glasfläschchen (Wheaton Industries, Millville, New Jersey) als auch einem 2 ml (tatsächliches Volumen 3,7 ml) bernsteinfarbenen Glasfläschchen (Wheaton Industreis, Millville, New Jersey) durchgeführt. Es wurde nochmals die Schüttelgeschwindigkeit unter Verwendung eines Code-Palmer Pistolengrifftachometers (Code-Palmer, Nile, III.) gemessen. Tabelle 7 listet die Ergebnisse auf, die zeigen, dass eine Zunahme in dem Fassungsvermögen des Glasfläschchens die Schüttelfrequenz verringert.
TABELLE 7 Auswirkung der Größe des Glasfläschchens auf die Wig-L-Bug^TM Schüttelfrequenz
Wie ersichtlich ist, gestattet ein Glasfläschchen mit nomial 2 ml die Verwendung einer hohen Schüttelfrequenz auf dem Wig-L-Bug. In Bezug auf die in 1 gezeigten Maße weist ein Behälter 9 mit nomial 2 ml und tatsächlich 3,7 ml vorzugsweise einen Durchmesser D von näherungsweise 1,8 cm (0,7 Inch) und eine Gesamthöhe H_o von näherungsweise 3,6 cm (1,4 Inch) und eine Körperhöhe von näherungsweise 2,5 cm (1 Inch) auf.
VI. ANWENDUNGEN DER ERFINDUNGSGEMÄSS HERGESTELLTEN VESIKEL
Das Vorstehende erläutert die verschiedenen Parameter im Hinblick darauf, wie sie die Größe der gasgefüllten Vesikel bestimmen. Die Vesikelgröße ist in Bezug auf die Maximierung der Produktwirksamkeit und Minimierung der Toxizität von Bedeutung. Zusätzlich sollten die Vesikel so flexibel wie möglich sein, um sowohl die Wirksamkeit zu maximieren, als auch um nachteilige Gewebewechselwirkungen, wie zum Beispiel Steckenbleiben in der Lunge, zu minimieren. Die vorliegende Erfindung erzeugt Vesikel mit der gewünschten Größe mit sehr dünnen nachgiebigen Membranen. Da die Vesikelmembranen so dünn und nachgiebig sind, beispielsweise ist nur 1 mg ml^–1 Lipid zur Stabilisierung der Membranen notwendig, wurde festgestellt, dass gasgefüllte Vesikel mit größerem Durchmesser ohne Erzeugung von erhöhtem Blutdruck in der Lunge verwendet werden können. Zum Beispiel wurde Schweinen bis zur fünffachen der für die diagnostische Abbildung notwendigen Dosen verabreicht, ohne ein Anzeichen eines erhöhten Blutdruck in der Lunge. Im Vergleich verursachen in diesen Tieren viel geringere Dosen von Albumin beschichteten Luftblasen kleineren Durchmessers einen schweren erhöhten Blutdruck in der Lunge. Da die Vesikel der vorliegenden Erfindung so flexibel und deformierbar sind, können sie leicht durch die Lungenkapillaren gleiten. Zusätzlich verringern die mit den vorliegenden Lipiden (zum Beispiel Polyethylenglycol tragende Lipide) angewandten Beschichtungstechnologien nachteilige Wechselwirkungen in der Lunge, während gleichzeitig die in vitro und in vivo Stabilität und Wirksamkeit des Produkts erhöht wird.
Die Größe gasgefüllter Vesikel zur Verwendung als allgemeine Ultraschallkontrastmittel sollte so groß wie möglich sein (ohne Emboliewirkungen zu verursachen), da die Rückstreuung oder die Ultraschallwirkung zur sechsten Potenz des Radius proportional ist, wenn die Frequenzen so sind, dass die gasgefüllten Vesikel im Rayleighstreubereich sind. Für MRI werden ebenfalls größere Vesikel der Erfindung bevorzugt. Die Fähigkeit der vorliegenden Erfindung, größere Vesikel mit geringerem Potential für toxische Wirkungen herzustellen und zu verwenden, erhöht ihr Leistungsvermögen in Bezug auf andere Produkte.
Ein zusätzlicher, den Ultraschallkontrast beeinflussender Parameter ist die Elastizität der Vesikelmembran. Je größer die Elastizität ist, umso größer ist die Kontrastwirkung. Da die vorliegenden Vesikel mit ultradünnen Lipidmembranen beschichtet sind, ist die Elastizität ziemlich ähnlich zu derjenigen von bloßem Gas und das Reflexionsvermögen und die Kontrastwirkung sind maximiert.
Das Schüttelverfahren der vorliegenden Erfindung stellt leicht Vesikel von einer wässrigen Phase und einem oberen Gasraum mit Gas innerhalb eines sterilen Behälters her. Die Erfindung ist ausreichend, um Vesikel mit höchst erwünschten Eigenschaften für Ultraschall- oder magnetischen Resonanzabbildungsanwendungen herzustellen. Für ausgewählte Anwendungen kann jedoch ein Filter verwendet werden, um Vesikel mit sogar noch homogeneren Größenverteilungen und mit gewünschten Durchmessern herzustellen. Zum Beispiel kann es zur Messung von in vivo Drücken bei Ultraschall unter Verwendung harmonischer Phänomene gasgefüllter Vesikel nützlich sein, sehr eng definierte Vesikeldurchmesser innerhalb eines engen Größenbereichs zu haben. Dies kann leicht erreicht werden, indem die Vesikel (hergestellt durch Schütteln des Behälters mit einer wässrigen Phase und einem oberen Gasraum mit Gas) durch ein Filter mit definierter Größe gespritzt werden. Die resultierenden Vesikel werden in sehr guter Näherung nicht größer sein, als die Größe der Filterporen in der Filtermembran. Wie vorstehend bemerkt ist, ist es für viele Ultraschall- oder MRI-Anwendungen wünschenswert, gasgefüllte Vesikel zu haben, die so groß wie möglich sind. Für bestimmte Anwendungen können jedoch viel klei nere gasgefüllte Vesikel erwünscht sein. Beim Targeting auf Tumore oder andere erkrankten Gewebe, kann es für die gasgefüllten Vesikel notwendig sein, den Gefäßraum zu verlassen und in das Interstitiumgewebe einzudringen. Für diese Anwendungen können viel kleinere gasgefültle Vesikel nützlich sein. Diese kleineren gasgefüllten Vesikel (zum Beispiel merklich unterhalb eines Durchmessers von einem Mikrometer) können in großem Maße durch Modifkationen in den Verbindungen in der wässrigen Phase (Zusammensetzung und Konzentration), sowie auch des oberen Gasraumes (Gaszusammensetzung und Volumen des oberen Gasraumes), aber auch durch Einspritzen durch einen Filter hergestellt werden. Sehr kleine gasgefüllten Vesikel von im wesentlichen homogener Größe können durch Einspritzen durch zum Beispiel einen 0,22 Mikrometer Filter hergestellt werden. Die resultierenden gasgefüllten Vesikel in Nanometer Größe können dann für das Targeting wünschenswerte Eigenschaften aufweisen.
Die vorstehenden Beispiele von Lipidsuspensionen können ebenfalls durch Behandlung im Autoklaven, ohne merkliche Änderung der Größe der Suspensionen sterilisiert werden. Die Sterilisation des Kontrastmediums kann durch Behandlung im Autoklaven und/oder durch sterile Filtration, die entweder vor oder nach dem Schüttelschritt durchgeführt wird, oder durch andere dem Fachmann bekannt Mittel erreicht werden.
Nach Füllen der Behälter mit der wässrigen Phase und dem oberen Gasraum mit dem vorher ausgewählten Gas können die abgedichteten Flaschen unbegrenzt gelagert werden. Es gibt nicht notwendigerweise ausfallende Teilchen, zerplatzende gasgefüllte Vesikel oder andere Wechselwirkungen zwischen gasgefüllten Vesikeln, Teilchen, Kolloiden oder Emulsionen. Die Lagerbeständigkeit des mit der wässrigen Phase und dem oberen Gasraum mit Gas gefüllten Behälters hängt nur von der Stabilität der Verbindungen innerhalb der wässrigen Phase ab. Diese Eigenschaften der langen Lagerbeständigkeit und Sterilisierbarkeit verleihen der vorliegenden Erfindung gegenüber dem Stand der Technik wesentliche Vorteile. Die vorliegende Erfindung richtet sich auf das Problem der Stabilität, wie zum Beispiel die Aggregation und Fällung von Teilchen, das im Gebiet der Ultraschallkontrastmedien so üblich war.
Es wurde festgestellt, dass die gasgefüllten Vesikel, die durch Schütteln des Mehrphasenbehälters der Erfindung hergestellt werden, eine ausgezeichnete Verwendbarkeit als Kontrastmittel zur diagnostischen Abbildung, wie zum Beispiel Ultraschall- oder magnetische Resonanzabbildung, aufweisen. Die Vesikel sind bei der Abbildung eines Patienten im allgemeinen und/oder zur spezifischen Diagnose des Vorhandenseins von erkranktem Gewebe in einem Patienten verwendbar. Das Abbildungsverfahren kann durch Verabreichung eines gasgefüllten Vesikels der Erfindung an einen Patienten und Scannen des Patienten unter Verwendung von Ultraschall- oder magnetischer Resonanzabbildung ausgeführt werden, um sichtbare Bilder eines inneren Bereichs eines Patienten und/oder eines beliebigen erkrankten Gewebes in diesem Bereich zu erhalten. Mit Bereich eines Patienten ist der gesamte Patient oder ein spezielles Gebiet oder Teil eines Patienten gemeint. Das liposomale Kontrastmittel kann zur Bereitstellung von Abbildungen des Gefäßsystems, des Herzen, der Leber und Milz und zur Abbildung des gastrointestinalen Bereichs oder anderer Körperhöhlen oder auf andere Arten, wie dem Fachmann leicht offensichtlich ist, wie zum Beispiel zur Gewebecharakterisierung, Blutpoolabbildung, usw. verwendet werden. Jede der verschiedenen Arten von Ultraschall- oder magnetischer Resonanzabbildungsvorrichtungen kann in der Ausübung der Erfindung verwendet werden, wobei die spezielle Art oder das Modell der Vorrichtung für das Verfahren der Erfindung nicht entscheidend ist.
Die gasgefüllten Vesikel der Erfindung können ebenfalls zur Abgabe einer großen Vielfalt an therapeutischen Mitteln an einen Patienten zur Behandlung verschiedener Krankheiten, krankhaften Störungen oder Gebrechen verwendet werden, wie der Fachmann erkennt.
Es können ebenfalls magnetisch aktive Vesikel zur Druckeinschätzung durch MRI verwendet werden. Die Vesikel erhöhen die Massensuszeptibilität und erhöhen dementsprechend die T₂-Relaxation und sogar noch mehr die T₂*-Relaxation. Da die Effekte der stationären Feldgradienten in Spinechoexperimenten hauptsächlich kompensiert werden (aufgrund des refokussierenden 180° Radiofrequenzpulses) ist die Wirkung auf die Vesikel weniger bei T₂ als bei T₂* gewichteten Pulssequenzen ausgeprägt, bei denen die stationären Feldeffekte nicht kompensiert werden. Zunehmender Druck führt zu einem Verlust an Vesikeln oder zur Sprengung von Vesikeln (für löslichere Gase) sowie zu einer Abnahme im Vesikeldurchmesser. Dementsprechend nimmt 1/T₂ mit zunehmendem Druck ab. Nach Nachlassen des Drucks dehnen sich manche der übrigen Vesikel wieder aus und 1/T₂ nimmt wieder leicht zu. Vesikel, die aus ungefähr 80% PFP mit 20% Luft zusammengesetzt sind, zeigen eine erhöhte Stabilität und mit dem Druck einen leichten Abfall in 1/T₂, der nach Nachlassen des Drucks auf die Grundlinie zurückkehrt (das heißt, die Vesikel sind stabil, zeigen jedoch einen leichten 1/T₂ Druckeffekt). Werden Gradientechoabbildungen erhalten und wird die Signalintensität gemessen, so sind diese Auswirkungen viel ausgeprägter. Die Signalintensität nimmt mit zunehmendem Druck zu (1/T₂* nimmt mit zunehmendem Druck ab). Da das Experiment relativ schnell durchgeführt wird (es braucht weniger als einzehntel der Zeit zur Durchführung von Gradientechoabbildungen, als zur Messung von T₂). Die Aussetzungsdauer gegenüber Druck ist viel kürzer und die Stickstoff gefüllten Vesikel kehren nach Nachlassen des Drucks nahezu zur Grundlinie zurück (das heißt, es gibt einen sehr kleinen Verlust an Vesikeln). Dementsprechend fällt die Gradientechosignalintensität nach der Rückkehr zu Umgebungsdruck nahezu auf die Grundlinie zurück. Zur Druckmessung durch MRI können die Vesikel so ausgelegt sein, dass sie entweder mit zunehmendem Druck auseinander fallen oder stabil sind und aber der Vesikeldurchmesser mit zunehmendem Druck abnimmt. Da bei MRI der Vesikelradius 1/T₂* beeinflusst, kann diese Beziehung zum Schätzen des Drucks durch MRI verwendet werden.
Wie der Fachmann erkennt, kann die Verabreichung gasgefüllter Vesikel an den Patienten auf verschiedene Arten ausgeführt werden, wie zum Beispiel intravenös oder intraarteriell durch Injektion, oral oder rektal. Die zu verabreichende nützliche Dosierung und die spezielle Weise der Verabreichung werden in Abhängigkeit des Alters, des Gewichts und des speziellen Säugetiers und von dessen zu scannenden oder zu behandelnden Bereich und von dem anzuwendenden speziellen Kontrastmedium oder therapeutischem Mittel variieren. Die Dosierung wird typischerweise bei niedrigeren Gehalten begonnen und erhöht, bis die gewünschte Kontrastverstärkung oder therapeutische Wirkung erreicht ist. Der Patient kann jede Art von Säugetier sein, jedoch ist er vorzugsweise menschlich.
Verschiedene Modifkationen der Erfindung zusätzlich zu den hier beschriebenen und gezeigten sind für den Fachmann aus der vorstehenden Beschreibung offensichtlich. Es ist beabsichtigt, dass derartige Modifikationen ebenfalls in den Umfang der beigefügten Ansprüche fallen.

Claims

Vorrichtung zum Herstellen von Vesikeln optimaler Größe, wobei die Vorrichtung umfaßt: a) einen Behälter, der eine wäßrige Suspensionsphase und eine gasförmige Phase, die im wesentlichen von der wäßrigen Suspensionsphase getrennt ist, enthält; und b) eine Vorrichtung zum Schütteln des Behälters durch Anlegen einer reziproken Bewegung darauf, um so Vesikel zu bilden, wobei die Schüttelvorrichtung (i) einen Arm, (ii) Mittel zum Kuppeln des Behälters an den Arm und (iii) Mittel zum Schütteln des Arms vor und zurück in einer ersten und zweiten zueinander senkrechten Richtung umfaßt, dadurch gekennzeichnet, daß der Arm eine Länge von mindestens 6 cm aufweist, die Mittel zum Schütteln des Arms Mittel zum Rotieren des Arms in der ersten Richtung entlang einer gekrümmten Strecke mit einem Krümmungsradius von mindestens 6 cm und einen Winkel von mindestens 3° überdeckend umfaßt, und die Gesamtstrecke der reziproken Bewegung in der Figur einer Acht erfolgt.
Vorrichtung nach Anspruch 1, wobei die Mittel zum Schütteln Mittel zum Schütteln mit einer Amplitude von mindestens etwa 0,3 cm umfassen.
Vorrichtung nach Anspruch 2, wobei die Mittel zum Schütteln weiter Mittel zum Schütteln mit einer Amplitude von nicht mehr als etwa 2,5 cm umfassen:
Vorrichtung nach Anspruch 2, wobei die Mittel zum Schütteln des Arms Mittel zum Schütteln des Arms mit einer Amplitude von mindestens etwa 0,02 cm in der zweiten Richtung umfassen.
Vorrichtung nach Anspruch 1, wobei die Mittel zum Schütteln Mittel zum Schütteln des Behälters entlang einer Strecke mit der Figur einer Acht mit einer Gesamtlänge von mindestens etwa 0,7 cm umfassen.
Vorrichtung nach Anspruch 1, wobei der Winkel, welcher durch die gekrümmte Strecke überdeckt wird, nicht größer als etwa 9° ist.
Vorrichtung nach Anspruch 1, wobei der Krümmungsradius der gekrümmten Strecke nicht mehr als etwa 15 cm beträgt.
Vorrichtung nach Anspruch 1, wobei die Mittel zum Schütteln Mittel zum Schütteln mit einer Frequenz von mindestens etwa 2800 Upm umfassen.
Vorrichtung nach Anspruch 1, wobei die wäßrige Suspensionsphase Lipide umfaßt.
Vorrichtung nach Anspruch 9, wobei die wäßrige Suspensionsphase Dipalmitoylphosphatidylcholin, Dipalmitoylphosphatidsäure und Dipalmitoylphosphatidylethanolamin umfaßt.
Vorrichtung nach Anspruch 9, wobei das Lipid in der Form einer Monoschicht vorliegt.
Vorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Vesikel Liposome umfassen.
Vorrichtung nach Anspruch 12, wobei die Liposome ein Phospholipid umfassen.
Vorrichtung nach Anspruch 1, wobei die gasförmige Phase anfänglich mindestens 10% des Volumens des Behälters einnimmt.
Vorrichtung nach Anspruch 1, wobei die gasförmige Phase ein Pertluorkohlenstoffgas umfaßt.
Vorrichtung nach Anspruch 1, wobei die gasförmige Phase ein Gas, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Perfluorpropan, Perfluorbutan, Perfluorpentan, Perfluorhexan und Schwefelhexafluorid, umfaßt.
Vorrichtung nach Anspruch 16, wobei die gasförmige Phase Perfluorpentan umfaßt.
Vorrichtung nach Anspruch 16, wobei die gasförmige Phase Schwefelhexafluorid umfaßt.
Vorrichtung nach Anspruch 16, wobei die gasförmige Phase Perfluorpropan umfaßt.
Vorrichtung nach Anspruch 16, wobei die gasförmige Phase Perfluorhexan umfaßt.
Vorrichtung nach Anspruch 1, wobei die wäßrige Suspensionsphase ein Polymer umfaßt.
Vorrichtung nach Anspruch 21, wobei das Polymer ein Polymethacrylat umfaßt.
Vorrichtung nach Anspruch 21 oder 22, wobei die Gasphase Luft umfaßt.
Vorrichtung nach Anspruch 1, wobei die wäßrige Suspensionsphase ein Po lysaccharid umfaßt.
Vorrichtung nach Anspruch 1, wobei die wäßrige Suspensionsphase Galactose umfaßt.
Vorrichtung nach Anspruch 25, wobei die gasförmige Phase Stickstoff umfaßt.
Vorrichtung nach Anspruch 12, wobei die Liposome vernetzte Liposome oder polymerisierte Liposome umfassen.
Vorrichtung nach Anspruch 9, wobei die wäßrige Suspensionsphase weiter Polyethylenglykol umfaßt.
Verfahren zur Herstellung von Vesikeln optimaler Größe, wobei das Verfahren das Bereitstellen einer Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 28 und das Schütteln des Behälters mit einer Frequenz von mehr als etwa 2800 Upm und nicht mehr als etwa 10000 Upm für eine Zeitdauer, die ausreichend ist, Vesikel in dem Behälter zu erzeugen, umfaßt.
Verfahren nach Anspruch 29, wobei das Schütteln Vesikel erzeugt, von welchen 95% kleiner als 10 μm sind.
Verfahren nach Anspruch 30, wobei das Schütteln Vesikel mit einer mittleren Größe von weniger als 2,5 μm erzeugt.
Verfahren nach Anspruch 29, wobei die gasförmige Phase anfänglich mindestens 10% des Volumens des Behälters einnimmt.
Verfahren nach Anspruch 30, wobei die Zeitdauer des Schüttelns nicht mehr als etwa 2 Minuten beträgt.
Verfahren nach Anspruch 33, wobei der Behälter eine Spritze ist.