DE69630033T2

DE69630033T2 - Immunologische kombinationsmittel und dazugehörige verfahren

Info

Publication number: DE69630033T2
Application number: DE69630033T
Authority: DE
Inventors: S. Robert BECKER; C. Robert HUEBNER; B. Maryann GRAY; S. Karen BISCARDI; F. Lorne ERDILE; Bruno Guy
Original assignee: Aventis Pasteur Inc
Current assignee: Sanofi Pasteur Inc
Priority date: 1995-06-07
Filing date: 1996-06-05
Publication date: 2004-04-01
Anticipated expiration: 2016-06-06
Also published as: US20060110408A1; EP0831937B1; US6251405B1; AU6151996A; JPH11510370A; EP0831937A1; NO975620D0; WO1996040290A1; EP0831937A4; AU717890B2; FI974423A; US20080089911A1; US7235243B2; US6379675B1; ZA964894B; NO975620L; IL118579A; FI118591B; US6984385B2; FI974423A0

Description

Diese Anmeldung ist eine Continuation-in-Part-Anmeldung mit der Serien-Nr. 08/476,656, eingereicht am 7. Juni 1995.
Insbesondere hinsichtlich rekombinanter Borrelia-Proteine wird auf jede der Anmeldungen mit den Serien-Nummern 07/973,338, eingereicht am 29. Oktober 1992, 08/373,455 (Richtlinie 62 FWC der USSN 07/973,338), eingereicht am 17. Januar 1995, 07/888,765, eingereicht am 27. Mai 1992, 08/211,891, eingereicht am 16. Oktober 1992 (nationale Phase von PCT/US92/08697) und 07/779,048, eingereicht am 18. Oktober 1991, hingewiesen. Insbesondere hinsichtlich der Strukturgene von Pneumokokken-Proteinen, epitopen Bereichen davon und Verabreichung von Pneumokokken-Proteinen wird auf jede der Anmeldungen mit den Serien-Nummern 656,773, eingereicht am 15. Februar 1991, 835,698, eingereicht am 12. Februar 1992, 072,065, eingereicht am 3. Juni 1993, 072,164, eingereicht am 3. Juni 1993, 214,222, eingereicht am 17. März 1994, 214, 164, eingereicht am 17. März 1994, 247,491, eingereicht am 23. Mai 1994, 048,896, eingereicht am 20. April 1993, 246,636, eingereicht am 20. Mai 1994, 08/458,399 (Continuation-in-Part-Anmeldung mit der Serien-Nr. 246,636, eingereicht am 7. Oktober 1994), eingereicht am 2. Juni 1995, 08/446,201, eingereicht am 19. Mai 1995, 08/312,949, eingereicht am 30. September 1994, hingewiesen. Hinsichtlich der Expression der Lipoproteine wird auf die Anmeldung mit der Serien-Nr. 08/475,781, eingereicht am 7. Juni 1995, hingewiesen. Und hinsichtlich der Zusammensetzungen und der Verfahren für das mucosale, z. B. orale, Verabreichen von Borrelia-Burgdorferi-Antigenen zum Anregen einer immunologischen Antwort, wird auf Barbour et al., Anmeldungsnr., die gleichzeitig hiermit eingereicht wurde (Anwaltsaktenzeichen 454312-2420) hingewiesen.
Im folgenden Text werden mehrere Schriftstücke zitiert und jedes wird hiermit ebenso hierin durch Hinweis aufgenommen.
GEBIET DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft Zusammensetzungen, die in einem Wirt, einem Tier oder einem Menschen, eine immunologische Antwort hervorrufen, und Verfahren für die Herstellung und die Verwendung derselben. Die Erfindung betrifft des weiteren solche Zusammensetzungen und Verfahren, bei denen die Zusammensetzung ein Antigen und ein Lipoprotein an einen Hilfsstoff angelagert umfaßt. Besonders bevorzugt ist das Lipoprotein ebenfalls antigen oder immunogen, und die Zusammensetzung kann daher eine Kombinationszusammensetzung, eine multivalente Zusammensetzung oder eine "Cocktail-Zusammensetzung" sein. Dementsprechend betrifft die Erfindung ebenfalls die gleichzeitige Verabreichung von wenigstens einem Antigen und wenigstens einem Lipoprotein in einer Zusammensetzung, die zusätzliche Inhaltsstoffe, wie z. B. einen Hilfsstoff, einschließen kann.
Das Lipoprotein kann ein natürlich vorkommendes Lipoprotein oder ein rekombinantes Lipoprotein sein. Das rekombinante Lipoprotein kann aus der Expression von homologen Sequenzen der mit Lipid versehenen und der Protein-Anteile des Lipoproteins durch einen Vektor stammen, d. h. die Sequenzen für das Versehen mit Lipid und das Protein können auf natürliche Weise zusammen vorliegen. Bei solch einem rekombinanten Lipoprotein kann das Versehen davon mit einem Lipid aus der Expression einer ersten Nukleinsäuresequenz und das Protein davon aus der Expression einer zweiten Nukleinsäuresequenz stammen, wobei die ersten und die zweiten Nukleinsäuresequenzen, welche nicht natürlich zusammen vorliegen, und solche Sequenzen als ein zusammenhängendes Lipoprotein exprimiert werden können. Daher betrifft die Erfindung Zusammensetzungen und Verfahren, die die Verabreichung von Lipoproteinen, einschließlich rekombinanter Lipoproteine, einschließen, und die rekombinanten Lipoproteine können ähnlich zu nativen Proteinen oder neuartige Hybrid-Proteine sein.
Die Erfindung betrifft des weiteren die zuvor genannten Zusammensetzungen zum Hervorrufen einer immunologischen Antwort und Verfahren zur Herstellung und Verwendung derselben, wobei das Lipoprotein rekombinant exprimiertes Lipoprotein der Expression der zuvor genannten ersten und zweiten Nukleinsäuresequenzen ist, wobei die erste Nukleinsäuresequenz eine Borrelia-Lipoprotein-Leitsequenz codiert, bevorzugt solch ein rekombinantes, mit Lipid versehenes Protein, das unter Verwendung der Nukleinsäuresequenz, die die OspA-Leitsequenz codiert, exprimiert wird. Bei einer bevorzugten Ausführungsform kann das Lipoprotein OspA sein, und daher betrifft die Erfindung ebenso rekombinantes OspA und verwendet davon die Zusammensetzungen und Verfahren.
Auf mehrere Veröffentlichungen wird in dieser Anmeldung hingewiesen. Die vollständige Zitierung dieser Hinweise ist am Ende der Beschreibung, den Ansprüchen unmittelbar vorangehend zu finden , oder dort, wo die Veröffentlichung erwähnt wird.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Die immunogene Aktivität kann signifikant verbessert werden, wenn ein Antigen gemeinsam mit einem Hilfsstoff verabreicht wird, üblicherweise verwendet als 0,001%-ige bis 50%-ige Lösung in einer phosphatgepufferten Salzlösung (PBS). Hilfsstoffe verstärken die immunogene Aktivität eines Antigens, sind aber nicht unbedingt selbst immunogen. Hilfsstoffe können sich so verhalten, daß sie das Antigen örtlich in der Nähe der Stelle der Verabreichung zurückbehalten, um so eine Speicherwirkung hervorzurufen und so eine langsame, anhaltende Freisetzung des Antigens an die Zellen des Immunsystems zu erleichtern. Hilfsstoffe können auch die Zellen des Immunsystems zu einem Antigen-Speicher anziehen und solche Zellen stimulieren, Immunantworten hervorzurufen.
Immunstimulierende Mittel oder Hilfsstoffe werden seit vielen Jahren verwendet, um die Wirts-Immunantwort auf z. B. Impfstoffe zu verbessern. Intrinsische Hilfsstoffe, wie z. B. Lipopolysaccharide, sind normalerweise die Bestandteile der abgetöteten oder abgeschwächten Bakterien, die als Impfstoffe verwendet werden. Extrinsische Hilfsstoffe sind Immunmodulatoren, welche typischerweise nicht-kovalent mit Antigenen verknüpft sind und die formuliert werden, um die Wirts- Immunantwort zu verstärken. Aluminiumhydroxid und Aluminiumphosphat (gewöhnlich gemeinsam als Alaun bezeichnet) werden routinemäßig als Hilfsstoffe in human- und veterinärmedizinischen Impfstoffen verwendet. Die Wirksamkeit von Alaun beim Erhöhen der Antikörperantworten auf Diphtherie- und Tetanus-Toxoide ist gut etabliert und erst kürzlich wurde ein HBsAg-Impfstoff mit Alaun als einem Hilfsstoff versehen.
Ein weiter Bereich von extrinsischen Hilfsstoffen kann starke Immunantworten auf Antigene auslösen. Diese umfassen mit Membranproteinantigenen komplexierte Saponine (immunstimulierende Komplexe), Pluronic-Polymere mit Mineralöl, abgetötete Mycobakterien in Mineralöl, Freunds Adjuvans, bakterielle Produkte, wie z. B. Muramyldipeptid (MDP) und Lipopolysaccharide (LPS), sowie Lipid A und Liposome. Um die humorale Immunantwort (HIR) und die zellvermittelte Immunität (CMI) wirksam zu induzieren, werden die Immunogene vorzugsweise in Hilfsstoffen emulgiert.
Die wünschenswerten Merkmale von idealen Hilfsstoffen schließen einige oder alle der folgenden ein:

(1) keine Giftigkeit,
(2) Fähigkeit, eine langandauernde Immunantwort zu stimulieren,
(3) Einfachheit der Herstellung und Stabilität bei Langzeitlagerung,
(4) Fähigkeit, sowohl CMI als auch HIR auf über verschiedene Wege verabreichte Antigene hervorzurufen,
(5) Synergie mit anderen Hilfsstoffen,
(6) Fähigkeit, selektiv mit Populationen von antigen-präsentierenden Zelten (APC) Wechselwirkung einzugehen,
(7) Fähigkeit, spezifisch angemessene T_H1- oder T_H2-zellspezifische Immunantworten hervorzurufen und
(8) Fähigkeit, die angemessenen Antikörper-Isotyp-Niveaus (z. B. IgA) gegen Antigene selektiv zu erhöhen.

Das US-Patent Nr. 4,855,283, erteilt für Lockhoff et al. am 8. August 1989, welches hierin durch Bezugnahme darauf eingeschlossen ist, lehrt dazu Glycolipidanaloga, die N-Glycosylamide, N-Glycosylharnstoffe und N-Glycosylcarbamate einschließen, von denen jedes am Zuckerrest durch eine Aminosäure substituiert ist, als Immunmodulatoren oder Hilfsstoffe. Demnach berichteten Lockhoff et al. (US-Patent Nr. 4,855,283), daß N-Glycolipidanaloga, die strukturelle Ähnlichkeiten zu den natürlich vorkommenden Glycolipiden, wie z. B. Glycosphingolipiden und Glycoglycerollipiden, aufweisen, dazu fähig sind, starke Immunantworten bei sowohl Herpes-simplex-Virusimpstoft und Pseudorabies-Virusimpfstoff hervorzurufen. Einige Glycolipide wurden aus langkettigen Alkylaminen und Fettsäuren synthetisiert, die über ein anomeres Kohlenstoffatom direkt mit dem Zucker verknüpft sind, um die Funktionen der natürlich vorkommenden Lipidreste nachzuahmen.
Das US-Patent Nr. 4,258,029, erteilt für Moloney, das auf Connaught Laboratories Limited übertragen wurde und hierin durch Bezugnahme mit eingeschlossen ist, lehrt dazu, daß Octadecyltyrosinhydrochlorid (OTH) als ein Hilfsstoff wirkt, wenn es mit Tetanus-Toxoid und formalininaktiviertem Poliomyelitis-Virusimpfstoff vom Typ I, II und III komplexiert ist. Octadecylester von aromatischen Aminosäuren, die mit rekombinantem Hepatitis-B-Oberflächenantigen komplexiert sind, verstärkten die Wirts-Immunantworten gegen das Hepatitis-B-Virus.
Bessler et al., "Synthetic lipopeptides as novel adjuvants" im 44. Forum In Immunology (1992) auf S. 548 ff., insbesondere auf S. 548–550, welches hierin durch Bezugnahme eingeschlossen ist, ist auf das Anwenden von Lipopeptiden als Hilfsstoffe gerichtet, wenn sie in Verbindung mit einem Antigen gegeben werden. Die Lipopeptide wiesen typischerweise als die mit Lipid versehene Untereinheit P3C und nur bis zu 5 Aminosäuren auf, z. B. P3C-SG, P3C-SK4, P3C-SS, P3C-SSNA, P3C-SSNA. Das Lipopeptid wurde nur mit bestimmten Antigenen oder nicht-immunogenen Proteinen gekoppelt oder zu diesen hinzugegeben, wie z. B. P3C-SSNA, das den S.-Typhimurium-Impfstoff ergänzt, mit VP1 (135–154) der Maul- und Klauenseuche gekoppeltes PC3-SS, mit dem nicht-immunogenen Protein Hirudin gekoppeltes PC3-SG-OSu, mit FITC oder DNP gekoppeltes P3C-SK oder mit einem Stoffwechselprodukt von Sfreptomyces venezuelae gekoppeltes P3C-SG. Obwohl die Verfahren des Mischens und Konjugierens von Hilfsstoff nach Bessler beim Gebrauch der vorliegenden Erfindung angewendet werden können, versäumt es Bessler, das Anwenden eines Lipoproteins mit zumindest einem Antigen in einer Zusammensetzung, insbesondere solche Zusammensetzungen, bei denen das Lipoprotein ebenso antigen ist, oder die immunologischen Kombinationszusammensetzungen und die Verfahren dieser Erfindung zu lehren oder anzudeuten.
In dieser Hinsicht wird ein Unterschied zwischen einem Peptid, insbesondere einem Peptid, das nur bis zu etwa 5 Aminosäuren hat, und einem Protein gemacht, wie unter anderem ein Unterschied zwischen einem antigenen Lipoprotein und einem nicht-antigenen Lipopeptid besteht. Peptide unterscheiden sich immunologisch von Proteinen dadurch, daß kurze Peptide die Möglichkeit der direkten Präsentation durch den Haupthistokompatibilitätskomplex (MHC) aufweisen, während Proteine vor der Präsentation zu den T-Zellen aufbereitet werden müssen. Ein Peptid unterscheidet sich des weiteren von einem Protein dadurch, daß ein Protein groß genug ist, um funktionelle Bereiche (z. B. Aufweisen einer Tertiärstruktur) auszubilden, was ein Peptid nicht kann.
Nardelli et al. [Vaccine (1994), 12(14): 1335–1339] haben ein vierwertiges multiples Antigenpeptid, das eine gp120-Sequenz enthält, mit einer Lipid-Untereinheit verbunden und das resultierende synthetische Lipopeptid Mäusen verabreicht. Es wurde beobachtet, daß sowohl die mucosale IgA-Antwort als auch das systemische Plasma-IgG stimuliert wurden, und die zelluläre Immunität wurde induziert, wie anhand der Lymphokin-Produktion und der Erzeugung einer spezifischen zytotoxischen Antwort gezeigt wurde. Anstelle eines ganzen Lipoproteins wurde nur ein kurzes Peptid verwendet und es gibt keine Lehre oder Andeutung, daß das synthetische Lipopeptid als ein Hilfsstoff für andere Proteine verwendet werden könnte. Vielmehr führt diese Referenz sogar von der Anwendung von Lipoproteinen, welche löslicher als Lipopeptide sind, als Immunogene weg; siehe z. B. S. 1338, letzte Zeile ("lösliche Proteine sind keine Immunogene über die oralen Verabreichungswege").
Croft et al. [J. Immunol. (1991), 146(5): 793–796) haben aus E. coli isolierte integrale Membranproteine (Imps) kovalent mit verschiedenen Antigenen verknüpft und durch intramuskuläre Injektion in Mäuse und Kaninchen verstärkte Immunantworten erhalten. Dennoch gibt es Nachteile beim kovalenten Verknüpfen des Lipoproteins und des Antigens. Wichtige Epitope können beschädigt werden und das Verknüpfungsverfahren ist schwer zu kontrollieren und erfordert häufig die Verwendung von toxischen Vernetzungsmitteln. Daher wäre es vorteilhaft, ein Verfahren für das Induzieren einer verstärkten immunologischen Antwort bereitzustellen, bei dem es nicht erforderlich ist, daß das Antigen mit einem Protein vernetzt wird. Darüber hinaus wurde nur eine geringe Erhöhung der Antikörperantwort erhalten, wenn das Antigen CSP-OVA mit dem Lipoprotein TraT lediglich gemischt anstelle von kovalent verknüpft wurde. Croft et al. schlossen daher, daß das Lipid für die Hilfsstoffwirkung nicht notwendig ist im Gegensatz zu den überraschenden Ergebnissen der Erfinder der vorliegenden Erfindung.
Das US-Patent Nr. 4,439,425 betrifft Lipopeptide, die 2 bis 10 Aminosäuren aufweisen und deren prophylaktische Verabreichung über den oralen oder rektalen Verabreichungsweg.
Bessler et al. ["Synthetic Lipopeptide Conjugates Constitute Efficient Novel Immunogens and Adjuvants in Parenteral and Oral Immunization" (Abstract), Meeting on Molecular Approaches to the Control of Infectious Diseases, (13.–17. September 1995) Cold Spring Harbor Laboratory (kein Stand der Technik im Hinblick auf den 7. Juni 1995, dem Einreichungsdatum von USSN 08/476,656)] betrifft die orale Verabreichung von Lipopeptiden, die 6 Aminosäuren aufweisen, welche kovalent mit Antigenen verknüpft wurden. Für die Lipopeptid-Antigen-Konjugate wurde gezeigt, daß sie eine haptenspezifische Immunantwort induzieren.
Schlecht of al. Zbl. Bakt. (1989) 271: 493–500] betrifft Salmonella-typhimurium-Impfstoffe, die mit synthetisch zubereiteten Derivaten eines bakteriellen Lipoproteins, das 5 Aminosäuren aufweist, ergänzt. Die Impfstoffe wurden durch zwei intraperitoneale Injektionen verabreicht und intraperitoneal mit abgestuften Dosen von S. typhimurium herausgefordert. Wenn man die protektive Leistungsfähigkeit der ergänzten Impfstoffe mit der des nicht ergänzten Impfstoffs verglich, wurde beobachtet, daß 90% des S.-typhimurium-Impfstoffs durch das Lipopeptid ersetzt werden konnten, ohne eine bemerkbare Abnahme der protektiven Leistungsfähigkeit.
Eine wesentliche Anstrengung wurde auf die Entwicklung eines Impfstoffs für die Lyme-Borreliose gerichtet. Zwei verschiedene Ansätze wurden für die Impfstoffentwicklung verwendet. Ein Ansatz ist es, einen aus ganzen inaktivierten Spirochaeten gebildeten Impfstoff zu verwenden, wie von Johnson im US-Patent Nr. 4,721,617 beschrieben wurde. Für einen ganzen inaktivierten Impfstoff wurde gezeigt, daß er Hamster vor der Herausforderung schützt, und er wurde für die Verwendung bei Hunden zugelassen.
Aufgrund der Bedenken bezüglich kreuzreaktiver Antigene bei Zubereitungen mit ganzen Zellen hat sich die Humanimpfstoff-Forschung auf die Identifizierung und die Entwicklung von nichtkreuzreaktiven protektiven Antigenen, die von B. burgdorferi exprimiert werden, konzentriert. Mehrere Antigenkandidaten sind bis heute identifiziert worden. Ein großer Teil dieser Bemühungen wurde auf das am reichlichsten vorhandene äußere Oberflächenprotein von B. burgdorferi konzentriert, nämlich das äußere Oberflächenprotein A (OspA), wie beschrieben in der veröffentlichten PCT-Patentanmeldung WO 92/14488, die dem Inhaber hiervon zugeordnet ist. In Maus-, Hamster- und Hund-Herausforderungsstudien wurde für mehrere Versionen dieses Proteins gezeigt, daß sie pro tektive Immunität induzieren. Klinische Prüfungen am Menschen haben gezeigt, daß die Formulierungen von OspA beim Menschen sicher und immunogen sind [Keller et al., JAMA (1994) 271: 1764-1768]. In der Tat durchläuft eine Formulierung, die rekombinantes, mit Lipid versehenes OspA enthält, wie in der zuvor genannten WO 92/14488 beschrieben, derzeit die Sicherheits-/Wirksamkeitsuntersuchungen beim Menschen der Phase III.
Obwohl OspA bei der überwiegenden Mehrheit der klinischen Isolate von B. burgdorferi aus Nordamerika exprimiert wird, stellte sich bei der Untersuchung der klinischen Borrelia-Isolate in Europa ein unterschiedliches Bild dar. In Europa wird die Lyme-Borreliose durch drei genetische Arten von Borrelia, nämlich B. burgdorferi, B. garinii und B. afzelli, verursacht. Bei ungefähr der Hälfte der europäischen Isolate ist OspA nicht das am reichlichsten vorhandene äußere Oberflächenprotein. Ein zweites äußeres Oberflächenprotein C (OspC) ist das Hauptoberflächenantigen, das auf diesen Spirochaeten gefunden wird. Tatsächlich wurde eine Reihe von europäischen klinischen Isolaten identifiziert, die OspA nicht exprimieren. Die Immunisierung von Wüstenrennmäusen und Mäusen mit aufgereinigtem, rekombinantem OspC liefert protektive Immunität gegenüber B.-burgdorferi-Stämmen, die das homologe OspC-Protein exprimieren [V. Preac-Mursic et al., INFECTION (1992) 20: 342–349; W. S. Probert et al., INFECTION AND IMMUNITY (1994) 62: 1920–1926]. Das OspC-Protein wird derzeit als ein möglicher Bestandteil einer zweiten Generation von Lyme-Borreliose-Impfstoff-Formulierungen in Betracht gezogen.
Rekombinante Proteine sind vielversprechende Kandidaten für Impfstoffe oder immunogene Zusammensetzungen, weil sie mit hoher Ausbeute und hoher Reinheit produziert und zum Maximieren der gewünschten Aktivitäten und zum Minimieren der ungewünschten manipuliert werden können. Weil sie schwach immunogen sein können, sind bei der Entwicklung von Impfstoffen oder immunogenen Zusammensetzungen trotzdem Verfahren wichtig, um die Immunantwort auf rekombinante Proteine zu verstärken. Darüber hinaus ist es sehr wünschenswert, in der Lage zu sein, solche Proteine in Verbindung mit anderen Antigenen verabreichen zu können.
Ein sehr vielversprechender Immunstimulator ist die Lipiduntereinheit N-Palmitoyl-S-(2RS)-2,3-bis-(palmitoyloxy)-propylcystein, abgekürzt Pam₃Cys. Diese Untereinheit ist am Aminoende der bakteriellen Lipoproteine zu finden, welche mit einer Signalsequenz synthetisiert werden, die den Lipidanhang und die Spaltung durch die Signalpeptidase II spezifiziert. Synthetische Peptide, die selbst nicht immunogen sind, induzieren eine starke Antikörperantwort, wenn sie kovalent mit Pam₃Cys verknüpft werden [Bessler et al. (1992)].
Zusätzlich zu einer Antikörperantwort braucht man häufig die Induzierung einer zellulären Immunantwort, insbesondere von cytotoxischen T-Lymphozyten (CTLs). Pam₃Cys-verknüpfte synthetische Peptide sind äußerst leistungsfähige Induziermittel für CTLs, aber niemand hat bisher von CTL-Induzierung durch große rekombinante Lipoproteine berichtet.
Die Nukleinsäuresequenz und die codierte Aminosäuresequenz von OspA sind für mehrere klinische Isolate von B. burgdorferi bekannt und sind z. B. in der veröffentlichten PCT-Anmeldung WO 90/04411 (Symbicom AB) für den Stamm B31 von B. burgdorferi und in Johnson et al., Infect. Immun. 60: 1845–1853 für einen Vergleich der ospA-Operons von drei B. burgdorferi-Isolaten verschiedenen geographischen Ursprungs, nämlich B31, ACA1 und Ip90, beschrieben.
Wie in der WO 90/04411 beschrieben, zeigt eine Analyse der DNA-Sequenz für den B31-Stamm, daß das OspA durch ein offenes Leseraster aus 819 Nukleotiden, beginnend an Position 151 der DNA-Sequenz und an Position 970 der DNA-Sequenz aufhörend, codiert wird (siehe 1 darin). Die ersten sechzehn Aminosäurereste von OspA stellen eine hydrophobe Signalsequenz von OspA dar. Das primäre Translationsprodukt des B.-burgdorferi-Gens über die gesamte Länge beinhaltet eine hydrophobe N-terminale Signalsequenz, welche ein Substrat für die Anlagerung eines Diazylglycerols an die Sulfhydryl-Seitenkette des benachbarten Cysteinrests ist. Im Anschluß an diese Anlagerung tritt die Spaltung durch die Signalpeptidase II und die Anlagerung einer dritten Fettsäure an den N-Terminus auf. Die vollständige Lipiduntereinheit wird als Pam₃Cys bezeichnet. Es wurde gezeigt, daß das Versehen von OspA mit einem Lipid für die Immunogenität notwendig ist, da das OspA-Lipoprotein mit einem N-terminalen Pam₃Cys-Rest eine starke Antikörperantwort stimuliert, während OspA ohne das angelagerte Lipid keine nachweisbaren Antikörper induzierte [Erdile et al., Infect. Immun., (1993), 61: 81–90].
Die veröffentlichte internationale Patentanmeldung WO 91/09870 (Mikrogen Molekularbiologische Entwicklungs-GmbH) beschreibt die DNA-Sequenz des ospC-Gens des B.-burgdorferi-Stamms Pko und das dadurch codierte OspC-Protein (in dieser Referenz als pC bezeichnet) mit einem Molekulargewicht von 22 kDa. Diese Sequenz läßt erkennen, daß OspC ein Lipoprotein ist, das eine Signalsequenz verwendet, die ähnlich zu der ist, die für OspA verwendet wird. Auf der Grundlage der Ergebnisse hinsichtlich OspA könnte man erwarten, daß das Versehen von rekombinantem OspC mit Lipid nützlich wäre, um seine Immunogenität zu verstärken. Wie in USSN 08/475,781, auf die oben Bezug genommen wurde, diskutiert, machten deren Anmelder aber die Erfahrung mit Schwierigkeiten, nachweisbare Expression von rekombinantem OspC zu erhalten. Es wäre nützlich, die Immunogenität von rekombinantem OspC zu verstärken. Darüber hinaus wäre es nützlich, eine mehrwertige immunologische Zusammensetzung für die Lyme-Borreliose zu haben, welche sowohl gegen nordamerikanische als auch europäische Borrelia-Isolate Antigene enthält.
Strepfococcus pneumoniae verursacht weltweit mehr tödliche Infektionen als fast jedes andere Pathogen. In den USA kommen die durch S. pneumoniae verursachten Todesfälle denen, die durch AIDS verursacht wurden, in der Anzahl gleich. Die meisten tödlichen Pneumokokken-Infektionen in den USA treten bei Individuen auf, die über 65 Jahre alt sind, bei denen S. pneumoniae die häufigste Ursache für ambulant erworbene Lungenentzündung ist. In der entwickelten Welt treten die meisten Pneumokokken-Todesfälle bei älteren oder bei immungeschwächten Patienten, einschließlich denjenigen mit Sichelzellanämie, auf. In den weniger entwickelten Bereichen der Erde ist die Pneumokokken-Infektion eine der größten Todesursachen unter Kindern, die jünger als 5 Jahre alt sind. Die Zunahme der Häufigkeit von multiplen Antibiotika-Resistenzen unter Pneumokokken und die unerschwinglich hohen Kosten der Arzneimittelbehandlung in armen Ländern bestimmen den derzeitigen Ausblick für die Kontrolle der Pneumokokken-Erkrankungsproblematik.
Das Sammelbecken von Pneumokokken, die den Menschen infizieren, wird primär über den nasopharyngealen Transport durch den Menschen unterhalten. Die Menschen erwerben die Pneumokokken zuerst über Aerosole oder durch direkten Kontakt. Die Pneumokokken besiedeln zunächst die oberen Atemwege und können in der Nasenschleimhaut über Wochen oder Monate verbleiben. Nicht weniger als 50% oder mehr der jungen Kinder und der älteren Menschen sind besiedelt. In den meisten Fällen resultiert diese Besiedelung in nicht offensichtlichen Infektionen. Dennoch kann der im Nasopharynx getragene Organismus bei einigen Individuen symptomatische Nebenhöhlenentzündung oder Mittelohrinfektion verursachen. Wenn Pneumokokken in die Lunge eingeatmet werden, insbesondere mit Essenspartikeln oder Schleim, können sie eine Lungenentzündung verursachen. Infektionen an diesen Stellen können allgemein einige Pneumokokken in das Blut abgeben, wo sie zu Sepsis führen können, insbesondere wenn sie kontinuierlich in großer Zahl vom ursprünglichen Infektionsherd abgegeben werden. Pneumokokken im Blut können das Gehirn erreichen, wo sie Meningitis auslösen können. Obwohl Pneumokokken-Meningitis weniger üblich als andere durch diese Bakterien verursachte Infektionen ist, ist sie ausgesprochen vernichtend. Etwa 10% der Patienten sterben, und über 50% der Überlebenden weisen lebenslange neurologische Folgekrankheiten auf.
Bei älteren Patienten ist der derzeitige 23-wertige, kapselförmige Polysaccharid-Impfstoff zu etwa 60% wirksam gegen invasive Pneumokokken-Erkrankungen mit in den Impfstoff eingeschlossenen Stämmen des kapselförmigen Typs. Der 23-wertige Impfstoff ist aufgrund ihrer Unfähigkeit, angemessene Antworten auf die meisten Polysaccharide auszubilden, nicht wirksam bei Kindern, die weniger als 2 Jahre alt sind. Verbesserte Impfstoffe, die Kinder und Erwachsene gegen invasive Infektionen mit Pneumokokken schützen können, würden einige der schädlichsten Aspekte dieser Krankheit verringern helfen.
Es wurde nachgewiesen, daß das Oberflächenprotein PspA der S.-pneumoniae-Zelle ein Virulenzfaktor und ein protektives Antigen ist. In der veröffentlichten internationalen Patentanmeldung WO 92/14488 werden die DNA-Sequenzen des pspA-Gens von S. pneumoniae Rx1, die gentechnische Herstellung einer verkürzten Form von PspA und der Beweis, daß diese verkürzte Form von PspA Mäusen Schutz von der Herausforderung mit lebenden Pneumokokken verleiht, beschrieben.
Bei der Bemühung, einen Impfstoff oder eine immunogene Zusammensetzung auf der Basis von PspA zu entwickeln, wurde PspA rekombinant in E. coli exprimiert. Es wurde beobachtet, daß es für wirksames Exprimieren von PspA nützlich ist, das reife PspA-Molekül des Rx1-Stamms von seiner normalen Länge von 589 Aminosäuren auf 314 Aminosäuren zu verkürzen, wobei die Aminosäuren 1 bis 314 umfaßt sind. Dieser Bereich des PspA-Moleküls beinhaltet die meisten, wenn nicht alle der protektiven Epitope von PspA. Dennoch haben Immunogenitäts- und Schutz-Untersuchungen bei Mäusen ergeben, daß die verkürzte, rekombinante Form von PspA in natürlichen Mäusen nicht immunogen ist. Daher wäre es nützlich, die Immunogenität von rekombinantem PspA und Fragmenten davon zu verbessern. Darüber hinaus wäre es sehr wünschenswert, ein Pneumokokken-Antigen in einer Kombination oder mehrwertigen Zusammensetzung anzuwenden. Zum Beispiel ist die Influenza (Grippe) ebenso wie die Lungenentzündung, insbesondere bei den Älteren und den Jungen, eine problematische Infektion, und jährliche Grippeimpfungen sind insbesondere in Nordamerika üblich. Daher ist es wünschenswert, in der Lage zu sein, Grippe- und Pneumokokken-Antigene in einer Zubereitung zu verabreichen.
Helicobacter pylori ist das spiralförmige Bakterium, welches speziell schleimabsondernde Zellen im menschlichen Magen besiedelt und ist der ursächliche Grund bei den meisten Fällen von nicht-erosiver Gastritis bei Menschen. Neueste Forschungsaktivitäten weisen darauf hin, daß H. pylori, welches eine hohe Urease-Aktivität aufweist, für die meisten peptischen Ulcera sowie häufig für Magenkrebs verantwortlich ist. Viele Studien haben angedeutet, daß die Urease, ein Komplex aus den Produkten der ureA- und ureB-Gene, ein protektives Antigen sein kann. Dennoch war es bis jetzt nicht bekannt, wie eine hinreichende mucosale Immunantwort auf Urease ohne Choleratoxin oder verwandte Hilfsstoffe zu bewirken ist.
Antigene oder immunogene Fragmente davon stimulieren eine Immunantwort, wenn sie einem Wirt verabreicht werden. Solche Antigene, insbesondere wenn sie rekombinant hergestellt sind, können eine stärkere Immunantwort hervorrufen, wenn sie in Verbindung mit einem Hilfsstoff verabreicht werden. Gegenwärtig ist Alaun der einzige zugelassene Hilfsstoff für die Verwendung beim Menschen, obwohl Hunderte von experimentellen Hilfsstoffen, wie z. B. Choleratoxin B, getestet werden. Dennoch weisen diese Hilfsstoffe Unzulänglichkeiten auf. Zum Beispiel ist das Choleratoxin, obwohl es ein guter Hilfsstoff ist, sehr toxisch. Auf der anderen Seite hat das Choleratoxin B, obwohl es nicht toxisch ist, keine Hilfsstoffaktivität. Es ist daher wünschenswert, eine immunologische Zusammensetzung bereitzustellen, die in der Lage ist, eine starke Antwort ohne die Notwendigkeit eines Hilfsstoffs hervorzurufen.
In manchen Fällen tritt ein Wirksamkeitsstörung genanntes Phänomen auf, wenn mehrere Antigene (zwei oder mehr) in derselben Zubereitung oder aufeinanderfolgend verabreicht werden. Einfach aufgrund der Wechselwirkung eines oder mehrerer Antigene in der Zubereitung mit dem Wirts-Immunsystem ruft das zweite oder andere Antigene in der Zubereitung keine hinreichende Antwort hervor, z. B. wird die Wirksamkeit des letzteren Antigens oder der letzteren Antigene durch das vorige Antigen oder die vorigen Antigene beeinträchtigt. Es ist daher wünschenswert, mehrwertige immunologische Zusammensetzungen bereitzustellen, welche dieses Phänomen der Wirksamkeitsstörung nicht verursachen, z. B. weil das zweite Antigen ein Lipoprotein ist und als solches eine Hilfsstoffwirkung auf das erste Antigen aufweist, und eine synergistische potenzierende Wirkung erhalten wird, wenn es in einer Kombinationszusammensetzung mit einem Hilfsstoff ist (wobei das erste Antigen nicht das zweite Antigen beeinträchtigt und umgekehrt), wobei es nicht gewünscht wird, notwendigerweise auf eine einzelne besondere Theorie beschränkt zu werden.
Noch allgemeiner ist es wünschenswert, die Immunogenität von Antigenen durch andere Verfahren als die Verwendung eines Hilfsstoffs zu verstärken und die Möglichkeit zu haben, solche Mittel für verstärkte Immunogenität mit einem Hilfsstoff anzuwenden, um so eine noch größere immunologische Antwort zu erhalten.
Die USSN 081446,201, auf die oben verwiesen wurde, offenbart, daß die mucosale Verabreichung von abgetöteten ganzen Pneumokokken, Pneumokokkenlysat oder isoliertem und aufgereinigtem PspA sowie immunogenen Fragmenten davon, insbesondere bei Verabreichung mit einem Hilfsstoff, Schutz gegen Pneumokokkenbesiedelung und systemische Infektion bei Tieren liefert. Es wurde jetzt überraschenderweise beobachtet, daß die mucosale Verabreichung von anderen Antigenen, wie z. B. Urease, gemeinsam mit einem Lipoprotein bei Tieren systemische und lokale Antworten ohne die Verwendung eines Hilfsstoffs hervorruft.
Es wird angenommen, daß der Stand der Technik vordem folgendes nicht gelehrt oder nahegelegt hat: Immunologische Zusammensetzungen, die wenigstens ein Antigen und ein Lipoprotein und wahlweise einen Hilfsstoff umfassen, vorzugsweise ein Antigen, ein antigenes Lipoprotein und wahlweise einen Hilfsstoff, sowie Verfahren für die Verabreichung derselben als eine mehrwertige Zusammensetzung oder für die gleichzeitige oder aufeinanderfolgende Verabreichung dieser Bestandteile, insbesondere solche Zusammensetzungen und Verfahren, die eine verstärkte Immunogenität aufweisen.
AUFGABEN UND ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Es ist eine Aufgabe der Erfindung, immunologische Zusammensetzungen und Verfahren für die Herstellung und Verwendung derselben bereitzustellen.
Es ist eine weitere Aufgabe der Erfindung, immunologische Zusammensetzungen bereitzustellen, die verstärkte Immunogenität aufweisen oder Zusammensetzungen, deren Verabreichung die immunologische Antwort potenziert.
Es ist eine weitere Aufgabe der Erfindung, Verfahren für das Induzieren einer immunologischen Antwort, vorzugsweise einer potenzierten Antwort bereitzustellen, die die Verabreichung solcher immunologischer Zusammensetzungen an einen geeigneten Wirt einschließen.
Es ist noch eine zusätzliche Aufgabe der Erfindung, eine immunologische Zusammensetzung bereitzustellen mit einer ersten Zusammensetzung, die wenigstens ein Antigen umfaßt, und einer zweiten Zusammensetzung, die wenigstens ein Lipoprotein umfaßt, und wahlweise einem Hilfsstoff, vorzugsweise solche Zusammensetzungen, bei denen das Lipoprotein antigen wirkt.
Noch eine weitere Aufgabe der Erfindung ist es, ein Verfahren für das Induzieren oder Potenzieren einer immunologischen Antwort bereitzustellen, das die Verabreichung einer ersten Zusammensetzung, die wenigstens ein Antigen umfaßt, und einer zweiten Zusammensetzung, die wenigstens ein Lipoprotein umfaßt, und wahlweise eines Hilfsstoffs an einen Wirt, Tier oder Mensch, umfaßt, und besonders bevorzugt solche Verfahren, bei denen das Lipoprotein antigen wirkt.
Es wurde überraschenderweise beobachtet, daß die Verabreichung einer Zusammensetzung, die wenigstens ein Lipoprotein umfaßt, mit einer Zusammensetzung, die wenigstens ein Antigen umfaßt, an einen Wirt eine immunologische Antwort durch den Wirt liefert. Die immunologische Antwort ist im allgemeinen besser als die, die durch die alleinige Verabreichung des Antigens erhalten wird.
Darüber hinaus wurde auch überraschenderweise beobachtet, daß die Verabreichung einer ersten Zusammensetzung, die wenigstens ein Antigen umfaßt, einer zweiten Zusammensetzung, die wenigstens ein Lipoprotein umfaßt, und wahlweise eines Hilfsstoffs entweder durch gemeinsame Verabreichung oder durch aufeinanderfolgende Verabreichung (über einen geeigneten Zeitraum, so daß sowohl das Antigen, der Hilfsstoff als auch das Lipoprotein zur gleichen Zeit im Wirt vorliegen) an einen Wirt eine immunologische Antwort auf das Antigen durch den Wirt liefert. Diese immunologische Antwort ist im allgemeinen besser als die, die durch die alleinige Verabreichung des Antigens oder durch die Verabreichung des Antigens und des Hilfsstoffs erhalten wird. Mit Lipid versehene Proteine scheinen die Immunantwort auf die Weise wie der Hilfsstoff Choleratoxin B zu stimulieren.
Darüber hinaus wurde zusätzlich überraschenderweise beobachtet, daß bei diesen Verabreichungen das Lipoprotein selbst immunogen oder antigen sein kann, z. B. daß es ein Antigen sein kann, und daß nicht nur die immunologische Antwort durch den Wirt auf das Antigen erhalten wird, sondern ebenso die immunologische Antwort auf das antigene Lipoprotein erhalten wird. Die immunologische Antwort auf das antigene Lipoprotein kann ebensogut oder besser sein als die, die durch die Verabreichung des Lipoproteins alleine oder mit einem Hilfsstoff erhalten wird, und die immunologische Antwort auf das Antigen kann besser sein als die, die durch die Verabreichung des Antigens alleine oder des Antigens und des Hilfsstoffs erhalten wird.
Der Begriff Lipoprotein, wie er hier verwendet wird, soll die Lipopeptide aus dem Stand der Technik ausschließen, also ein Lipoprotein kann mehr als 2 bis 10 Aminosäuren oder mehr als 18 bis 20 Aminosäuren oder mehr als 24 Aminosäuren oder 30 oder mehr Aminosäuren aufweisen. Lipoproteine sind größere Moleküle, die, trotz eines Vorurteils im Stand der Technik gegen Lipoproteine, die Menge an Antigen und/oder Verabreichungen des Antigens reduzieren, z. B. Vaccine (1994) 12 (14): 1335, 1338 letzte Zeile, Spalte 1 bis 1. Zeile, Spalte 2 ("Lösliche Proteine ... nicht immunogen [über den oralen Verabreichungsweg]"). Herkömmliche Lipopeptide können infolge ihrer geringen Größe höchstens ein Epitop haben, wohingegen Lipoproteine, die bei der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, mehr als ein Epitop aufweisen können, z. B. ein B und ein T, oder sie können sogar an sich antigen sein. Zusätzlich dazu, daß sie kürzer sind und ein geringeres Molekulargewicht aufweisen als Lipoproteine und daß sie schwierig zu synthetisieren sind, weil sie normalerweise durch Merrifield- oder andere Syntheseverfahren hergestellt werden, unterscheiden sich Lipopeptide von Lipoproteinen darin, daß Lipoproteine größer sind, im allgemeinen nicht durch das Merrifield-Syntheseverfahren hergestellt sind und daß sie aus Isolierungen aus natürlichen Quellen oder aus Rekombinationsverfahren stammen können. Das heißt, Lipopeptide aus dem Stand der Technik wurden synthetisch hergestellt, was ihre Größe auf nicht mehr als etwa 30 Aminosäuren begrenzt. Lipoproteine sind größer und von höherem Molekulargewicht als Lipopeptide und werden im Gegensatz zu Lipopeptiden im allgemeinen nicht durch Merrifield-Syntheseverfahren hergestellt. Lipoproteine können aus natürlichen Quellen isoliert oder durch Rekombinationsverfahren hergestellt werden. Außerdem sind Lipoproteine besser löslich als Lipopeptide. Zudem weisen Peptide keine Quartär- oder Tertiärstruktur auf, wohingegen Proteine eine Quartär- und/oder Tertiärstruktur aufweisen können. Aufgrund ihrer Fähigkeit, eine Tertiärstruktur auszubilden, haben Protei ne die Fähigkeit, funktionelle Bereiche auszubilden, was Peptide nicht können. Folglich gibt es eine Reihe von Unterschieden zwischen herkömmlichen "Lipopeptiden" und "Lipoproteinen", wie sie bei dieser Erfindung verwendet werden.
Die Lipoprotein-Formulierungen dieser Erfindung können nasal verabreicht werden und dies ist vorteilhaft.
Gemäß der vorliegenden Erfindung wurde auch beobachtet, daß ein gemäß der vorliegenden Erfindung mit einem Antigen verabreichtes Lipoprotein 500-mal wirksamer ist als die Verabreichung eines Lipopeptids und eines Antigens.
Dementsprechend stellt die vorliegende Erfindung eine immunologische Zusammensetzung bereit mit einer ersten Zusammensetzung, die wenigstens ein Antigen umfaßt, und einer zweiten Zusammensetzung, die wenigstens ein Lipoprotein umfaßt. Die Zusammensetzung kann zudem wahlweise, aber nicht notwendigerweise, einen Hilfsstoff umfassen. Vorzugsweise ist das Lipoprotein ein Antigen. Die immunologische Zusammensetzung kann ein Impfstoff sein.
Die vorliegende Erfindung umfaßt weiterhin ein Verfahren für das Induzieren einer immunologischen Antwort in einem Wirt, das das Verabreichen der zuvor genannten immunologischen Zusammensetzung umfaßt. Das Verfahren kann zum Induzieren einer Schutzantwort sein, z. B. wenn die immunologische Zusammensetzung ein Impfstoff ist.
Die vorliegende Erfindung umfaßt zudem ein Verfahren zum Induzieren einer immunologischen Antwort mit aufeinanderfolgender Verabreichung einer ersten Zusammensetzung, die ein Antigen umfaßt, und einer zweiten Zusammensetzung, die ein Lipoprotein umfaßt. Wahlweise können entweder die erste oder die zweite Zusammensetzung oder sowohl die erste als auch die zweite Zusammensetzung zusätzlich einen Hilfsstoff umfassen. Vorzugsweise ist das Lipoprotein ein Antigen. Die aufeinanderfolgende Verabreichung sollte in einem geeigneten Zeitraum vorgenommen werden, wobei sowohl das Antigen, das Lipoprotein und der wahlweise Hilfsstoff zu derselben Zeit im Wirt vorliegen, und ein solcher Zeitraum kann durch einen Fachmann anhand dieser Offenbarung ohne übermäßiges Experimentieren und durch Verfahren im Bereich des Fachmanns bestimmt werden, wie z. B. Wirtsseren-Titrationen, einschließlich der Analyse davon hinsichtlich des Vorhandenseins von Antigen oder Antikörper durch z. B. die ELISA-Analyse. Die Verabreichung kann mucosal, z. B. intragastrisch oder intranasal, erfolgen.
Die vorliegende Erfindung umfaßt insbesondere Verfahren zum Induzieren einer immunologischen Antwort in einem Wirt, die die Stufen der mucosalen Verabreichung wenigstens eines Antigens an den Wirt und die mucosale Verabreichung wenigstens eines Lipoproteins an den Wirt umfassen. Die Verabreichung kann gleichzeitig oder nacheinander erfolgen. Das Antigen kann ein bakterielles Protein oder ein Fragment davon sein, z. B. Urease.
Das "Antigen" bei den erfindungsgemäßen Zusammensetzungen und Verfahren kann jedes Antigen sein, gegen welches eine immunologische Antwort in einem Wirt, Tier oder Mensch, hervorzurufen gewünscht wird. Ohne die Erfindung notwendigerweise zu beschränken, kann das Antigen z. B. folgendes sein: ein Borrelia-Antigen, z. B. OspA, OspC, OspB, OspD, ein Pneumokokken-Antigen, z. B. PspA, ein Influenza- (Grippe-) Antigen, wie z. B. HA, ein Pertussis- oder Keuchhusten- Antigen, wie z. B. das Pertussis-69kD-Polypeptid, z. B. ein Hepatitis-Antigen, ein Hepatitis-B-Antigen, wie ein Hepatitis-B-Oberflächenantigen, ein Helicobacter-pylori-Antigen, wie Urease, ein Tollwutvirus-Antigen, z. B. Tollwut-G-Antigen, ein Flavivirus-Antigen, z. B. ein Japanische-Enzephalitis-Virus-, ein Denguevirus- oder Gelbfiebervirus-Antigen, ein Windpockenvirus-Antigen, ein Diphtherie-Antigen, ein C.-tetani-Antigen, z. B. ein Tetanustoxoid, ein Mumpsvirus-Antigen, ein Masernvirus-Antigen, ein Malaria-Antigen, ein Herpesvirus-Antigen, wie ein Alphaherpesvirus-, Betaherpesvirus- oder Gammaherpesvirus-Antigen, z. B. ein Herpesvirus-Glycoprotein, z. B. ein Pferde-Herpesvirus-Antigen, z. B. gp13, gp14, gD, gp63 oder gE, ein Pseudorabiesvirus-Antigen, z. B. gp50, gpll, gplll, gpl, ein Herpes-Simplex-Virus-Antigen, z. B. gC, gD, ein Rinder-Herpesvirus-Antigen, z. B. gl, ein Katzen-Herpesvirus-Antigen, z. B. gB, ein Epstein-Barr-Virus-Antigen, z. B. gp220, gp340 oder gH oder ein Mensch-Cytomegalovirus-Antigen, z. B. gB, ein Menschen-Immunschwächevirus-Antigen, z. B. gp160 oder gp120, ein Affen-Immunschwächevirus-Antigen, ein Rinder-Virale-Diarrhö-Virus-Antigen, ein Pferde-Influenzavirus-Antigen, ein Katzen-Leukämievirus-Antigen, ein Hundestaupevirus-Antigen, z. B. HA- oder F-Glycoproteine, ein Hunde-Adenovirus-Antigen, z. B. Hunde-Adenovirus-Typ-2-Antigen, ein Hunde-Koronavirus-Antigen, ein Hunde-Parainfluenza-Antigen, ein Hunde-Parvovirus-Antigen, ein Hantaanvirus-Antigen, ein Geflügelgrippevirus-Antigen, z. B. ein Nukleoprotein-Antigen, ein Newcastle-Krankheit-Virus-Antigen, z. B. F, HN, ein Antigen des mit Rous assoziierten Virus, z. B. ein RAV-1-Hüll-Antigen, ein Infektiöse-Bronchitis-Virus-Antigen, z. B. ein Matrix-Antigen oder ein Preplomer-Antigen, ein Infektiöse-Bursitis-Virus-Antigen, ein Cholera-Antigen, ein Tumor-assoziiertes Antigen, ein Katzen-Immunschwächevinas-Antigen, ein Maul-und-Klauenseuche-Virus-Antigen, ein Mareks-Krankheit-Virus-Antigen, ein Staphylococci-Antigen, ein Sfreptococci-Antigen, ein Haemophilus-influenza-Antigen, z. B. Polysaccharid-Protein-Konjugate der Gruppe B, ein Papillomavirus, ein Poliovirus-Antigen, ein Rubellavirus-Antigen, ein Pockenvirus, wie ein Pokken-Antigen, z. B. Vaccinia, ein Typhusvirus-Antigen, ein Typhoid-Virus-Antigen, ein Tuberkulosevirus-Antigen, ein HTLV-Antigen oder ein anderes Bakterien-, Virus- oder Pathogen-Antigen, wie z. B. ein bakterielles oder virales Oberflächenantigen oder Hüllprotein.
Das Antigen kann ein bekanntes Antigen sein, es kann aus Bakterien, Virus oder einem Pathogen isoliert sein oder kann ein rekombinantes Antigen aus der Expression einer dafür codierenden, geeigneten Nukleinsäure durch einen geeigneten Vektor und der Isolierung und/oder Aufreinigung des rekombinanten Antigens sein. Die Auswahl des Antigens ist natürlich abhängig von der gewünschten immunologischen Antwort und dem Wirt.
Das Lipoprotein kann jedes Lipoprotein sein, welches physiologisch mit dem Wirt verträglich ist. Besonders bevorzugt ist es ein bakterielles Lipoprotein oder ein Lipoprotein, das eine bakterielle Lipiduntereinheit aufweist.
Das Lipoprotein ist vorzugsweise auch selbst ein Antigen. Daher ist das Lipoprotein vorzugsweise ein Bestandteil der äußeren Membran eines Pathogens, z. B. eines Virus oder von Bakterien, besonders bevorzugt ein Lipoprotein, das ein extrinsisches oder peripheres Protein aufweist, so daß das Lipoprotein unter milden Bedingungen oder mit mildem Detergens extrahiert wird ohne wesentliche Denaturierung oder wesentlichen Verlust der Lipiduntereinheit (um so die Epitope zu be wahren). Jedoch kann jedes antigene Lipoprotein bei der Anwendung der Erfindung eingesetzt werden. Und das Lipoprotein kann aus einer geeigneten physiologischen Quelle isoliert werden oder aus einem Organismus, z. B. Bakterien, oder kann rekombinant hergestellt werden. Daher können die mit Lipid versehenen Borrelia-Antigene, z. B. rekombinantes OspA, und mit Lipid versehenes OspA und Borrelia-Fraktionen, die (unter milden Bedingungen isolierte) mit Lipid versehene Proteine enthalten, offenbart in den Anmeldungen, auf die in dem Verweis auf die verwandten Anmeldungen hingewiesen wird, und in WO 90/04411, als das Lipoprotein bei der Anwendung der Erfindung verwendet werden. Selbstverständlich sind das "Antigen" und das "Lipoprotein" bei der Erfindung getrennte, verschiedene Inhaltsstoffe (so daß z. B., wenn das "Lipoprotein" OspA ist, es nicht auch das "Antigen" ist).
In der Anmeldung mit der Serien-Nummer 08/475,781, eingereicht am 7. Juni 1995 und hierin durch Bezugnahme eingeschlossen, sind rekombinante Lipoproteine offenbart, insbesondere antigene rekombinante Lipoproteine, z. B. solche aus der Expression der Leitsequenz von OspA für das Versehen mit Lipid davon, und diese rekombinanten Lipoproteine können bei der Anwendung der Erfindung eingesetzt werden. Für die Expression der rekombinanten Proteine wird erwartet, daß der Fachmann mit den verschiedenen für eine solche Expression erhältlichen Vektorsystemen vertraut ist, z. B. Bakterien, wie z. B. E. coli und Bakterienviren und dergleichen.
Der Hilfsstoff kann jedes Transportmittel sein, welches typischerweise die Antigenität des Antigens verstärkt, z. B. eine Suspension oder ein Gel von Mineralien (z. B. Alaun, Aluminiumhydroxid oder -phosphat), auf welches das Antigen adsorbiert wird, oder eine Wasser-in-Öl-Emulsion, in welche Antigenlösung in Mineralöl emulgiert wird (z. B. Freunds unvollständiges Adjuvans), manchmal mit dem Einschluß von abgetöteten Mycobakterien (z. B. Freunds vollständiges Adjuvans), oder Choleratoxin (manchmal mit Choleratoxin B, welches die Wirkung verstärken kann) oder jeder der anderen aus dem Stand der Technik bekannten oder in dem Hintergrund der Erfindung diskutierten Hilfsstoffe. Das Antigen und/oder das Lipoprotein kann an den Hilfsstoff adsorbiert oder mit dem Hilfsstoff verknüpft werden.
Die derzeit bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung umfassen: Alaun als der Hilfsstoff, wenn ein Hilfsstoff vorliegt, OspA oder ein rekombinantes OspA-Leitsequenz/PspA, ein rekombinantes OspA-Leitsequenz/OspC, ein rekombinantes OspA-Leitsequenz/UreA von H. pylori oder ein rekombinantes OspA-Leitsequenz/UreB von H. pylori als das Lipoprotein (OspA-Leitsequenz/PspA ist ein rekombinantes Lipoprotein, das eine mit Lipid versehene Untereinheit aus der Expression der OspA-Leitnukleinsäuresequenz und eine Proteinuntereinheit aus der Expression einer pspA-Nukleinsäuresequenz aufweist, OspA-Leitsequenz/OspC ist analog zu OspA-Leitsequenz/PspA außer, daß die Proteinuntereinheit aus der Expression einer ospC-Nukleinsäuresequenz stammt, und OspA-Leitsequenz/ureA und OspA-Leitsequenz/ureB sind ebenfalls analog zu OspA-Leitsequenz/PspA außer, daß die Proteinuntereinheit aus der Expression einer ureA- oder ureB-Nukleinsäuresequenz stammt), und OspC oder ein anderes Borrelia-Antigen oder ein Influenza-Antigen, z. B. HA (wie z. B. aus Influenza A, z. B. Texas-Stamm) oder Urease als das Antigen. Besondere Ausführungsformen können die folgenden Zusammensetzungen einschließen: (i) Alaun [Hilfsstoff], OspA [Lipoprotein] und ein anderes Borrelia-Antigen, wie z. B. OspC [Antigen] umfassend, (ii) Alaun [Hilfsstoff], OspA [Antigen] und OspA-Leitsequenz/OspC [Lipoprotein] umfassend, (iii) Alaun [Hilfsstoff], OspA-Leitsequenz/PspA [Lipoprotein] und Influenza-Antigen, z. B. Influenza-A-HA [Antigen] umfassend, (iv) OspA [Lipoprotein] und ein H.-pylori-Antigen, z. B. Urease [Antigen] umfassend.
Andere Aufgaben und Ausführungsformen der Erfindung sind in der folgenden Beschreibung offenbart oder sind daraus offensichtliche Varianten.
KURZE BESCHREIBUNG DER FIGUREN
In der folgenden ausführlichen Beschreibung wird auf die begleitenden Figuren hingewiesen, wobei:
1 eine graphische Darstellung der Immunantwort von Mäusen ist, die mit OspC-Formulierungen mit oder ohne aufgereinigtem, mit Lipid versehenem OspA und mit oder ohne Alaun als einem Hilfsstoff immunisiert wurden, gemessen in einem Anti-OspC-ELISA am Tag 63 nach der Immunisierung, und
2 eine graphische Darstellung der Immunantwort von Mäusen ist, die mit OspC-Formulierungen mit oder ohne aufgereinigtem, mit Lipid versehenem OspA und mit oder ohne Alaun als einem Hilfsstoff immunisiert wurden, gemessen in einem Anti-OspC-ELISA am Tag 91 nach der Immunisierung.
3 ist eine graphische Darstellung der Immunantwort von Mäusen, die zweifach intranasal mit entweder mit Lipid versehenem oder nicht mit Lipid versehenem OspA immunisiert wurden, gemessen in einem Anti-OspA-ELISA am Tag 9 nach der zweiten Immunisierung.
4 ist eine graphische Darstellung der Immunantwort von Mäusen, die zweimal sowohl intranasal als auch intragastrisch entweder mit Jackbohnen-Urease allein oder sowohl mit Urease als auch mit OspA immunisiert wurden, gemessen in einem Anti-Urease-ELISA am Tag 9 nach der zweiten Immunisierung.
5 ist eine graphische Darstellung der Immunantwort von Mäusen, die zweimal intranasal mit Jackbohnen-Urease entweder wie oben oder mit OspA oder Choleratoxin immunisiert wurden, gemessen in einem Anti-Urease-ELISA am Tag 9 nach der zweiten Immunisierung.
AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Wie oben erörtert, umfaßt die Erfindung immunologische Zusammensetzungen und Verfahren für deren Herstellung und Verwendung (z. B. Verabreichung), welche in einem breiten Sinne immunologische Zusammensetzungen einschließen, die ein Antigen und ein Lipoprotein umfassen und wahlweise einen Hilfsstoff enthalten, und die Verfahren umfassen breit die Verabreichung solcher Zusammensetzungen an einen geeigneten Wirt, so daß die gemeinsame Verabreichung des Antigens und des Lipoproteins und wahlweise des Hilfsstoffs vorliegt oder die aufeinanderfolgende Verabreichung der Bestandteile davon.
Es wurde jetzt überraschenderweise beobachtet, daß die mucosale Verabreichung eines Antigens, z. B. eines bakteriellen Proteins oder eines Fragments davon, und eines Lipoproteins sowohl zu lokalen als auch zu Serum-Immunantworten führt. Der prinzipiell bestimmende Faktor der spezifischen Immunität auf mucosalen Oberflächen ist sekretorisches IgA (S-IgA), welches physiologisch und funktionell von den Bestandteilen des zirkulatorischen Immunsystems getrennt ist. S-IgA-Antikörperantworten können durch die Anwendung geeigneter Immunogene auf eine besondere mucosale Stelle induziert werden. Dennoch sind die mucosalen S-IgA-Antworten großteils die Ergebnisse der Immunität, die über das herkömmliche mucosale Immunsystem (CMIS) erzeugt wurde [Mestecky, J. J. Clin. Immunol. (1987) 7: 265–276], in welchem Immunogene durch spezialisierte lymphoepitheliale Strukturen aufgenommen werden, die gemeinsam als Mucosa-assoziiertes Lymphgewebe (MALT) bezeichnet werden. Die am besten untersuchten immunologischen lymphoepithelialen Strukturen sind die Darm-assoziierten Lymphgewebe (GALT), wie z. B. die Peyer'schen Plaques des Darms. Dennoch ist jetzt eindeutig, daß andere strukturell und funktionell ähnliche Lymphfollikel auf anderen mucosalen Oberflächen auftreten, einschließlich derer des Atmungstrakts [Croituru, K. et al., in "Handbook of Mucosal Immunology" (Bienenstock, J., Hrsg.) San Diego, CA: Academic Press, Inc. (1994), 141–149].
In den experimentellen Ergebnissen, die in den untenstehenden Beispielen angegeben werden, wird gezeigt, daß Mäuse durch intranasales (i. n.) oder intragastrisches (i. g.) Einbringen von bakteriellen Protein-Immunogenen in Verbindung mit einem Lipoprotein, wie z. B. OspA, wirksam immunisiert werden können. Spezifische IgA- und IgG-absondernde Zellen werden in den Speicheldrüsen und Mägen (die Mägen sind nicht dargestellt) induziert, und spezifische IgA-Antikörper werden im Speichel induziert (nicht dargestellt). Starke zirkulatorische Immunantworten werden ebenso mit IgG- und IgA-Antikörpern im Serum induziert. Dementsprechend scheint es, daß die mucosale Immunisierung mit Antigenen gemeinsam mit Lipoproteinen ein wirksamer Weg für die Stimulierung der üblichen mucosalen Antworten sowie der zirkulatorischen Antikörperantworten ist. Solche Immunisierung kann sowohl therapeutisch als auch prophylaktisch sein.
Die Bestimmung der Menge an Antigen, Lipoprotein und wahlweise Hilfsstoff bei den erfindungsgemäßen Zusammensetzungen und der Herstellung dieser Zusammensetzungen kann den Standardverfahren entsprechen, die dem Pharmazie- oder Veterinärfachmann gut bekannt sind. Insbesondere werden die Menge an Antigen, Lipoprotein und Hilfsstoff bei den erfindungsgemäßen Zusammensetzungen und den verabreichten Dosierungen durch Verfahren bestimmt, die den Fachleuten aus den medizinischen oder veterinärmedizinischen Fachbereichen wohlbekannt sind, wobei solche Faktoren, wie das spezielle Antigen, das Lipoprotein, der Hilfsstoff, das Alter, das Geschlecht, das Gewicht, die Gattung und der Zustand des speziellen Patienten und der Verabreichungsweg, berücksichtigt werden. Zum Beispiel sind die Dosierungen der jeweiligen oben aufgelisteten Antigene für geeignete Wirte, in denen eine immunologische Antwort gewünscht ist, ebenso wie die Menge an Hilfsstoff, die typischerweise damit verabreicht wird, den Fachleuten bekannt. Daher kann der Fachmann die Menge an Antigen und wahlweise an Hilfsstoff für die Zusammensetzungen und welche bei den Verfahren der Erfindung verabreicht werden soll, leicht bestimmen. Ty pischerweise wird ein Hilfsstoff gewöhnlich als eine 0,001–50 Gew.-%-ige Lösung in phosphatgepufferter Salzlösung verwendet, und das Antigen liegt in der Größenordnung von Mikrogramm bis Milligramm vor, wie z. B. etwa 0,0001 bis etwa 5 Gew.-%, bevorzugt etwa 0,0001 bis etwa 1 Gew.-%, besonders bevorzugt etwa 0,0001 bis etwa 0,05 Gew.-% (siehe z. B. die untenstehenden Beispiele).
Der Fachmann kann sich auf eine bekannte Dosierung für das bestimmte Antigen für einen bestimmten Wirt beziehen, um die Menge an Lipoprotein für die Zusammensetzungen und welche bei den Verfahren der vorliegenden Erfindung verabreicht wird, zu bestimmen (wenn das Lipoprotein antigen wirkt), wie z. B. aus den hierin zitierten Schriften bekannte Dosierungen für OspA, oder er kann die Dosierung für einen bestimmten Wirt anhand der hierin zitierten Schriften und der untenstehenden Beispiele bemessen (z. B. hinsichtlich OspA-Leitsequenz/PspA, OspA-Leitsequenz/OspC, OspA-Leitsequenz/ureA und OspA-Leitsequenz/ureB). Typischerweise liegt das antigene und/oder rekombinante Lipoprotein aber in einer Menge in der Größenordnung von Mikrogramm bis Milligramm vor oder von etwa 0,001 bis etwa 20 Gew.-%, bevorzugt von etwa 0,01 bis etwa 10 Gew.-% und besonders bevorzugt von etwa 0,05 bis etwa 5 Gew.-% (siehe z. B. die untenstehenden Beispiele).
Selbstverständlich ist es bevorzugt, für jede Zusammensetzung, die an ein Tier oder an einen Menschen verabreicht werden soll, einschließlich der Bestandteile davon, und für jedes spezielle Verfahren der Verabreichung, folgendes zu bestimmen: die Toxizität, wie z. B. über die Bestimmung der letalen Dosis (LD) und der LD₅₀ in einem geeigneten Tiermodell, z. B. mit einem Nager wie der Maus, und die Dosierung der Zusammensetzung(en), die Konzentration der Bestandteile darin und die zeitliche Planung der Verabreichung der Zusammensetzung(en), welche eine angemessene immunologische Antwort hervorrufen, z. B. durch Titrationen der Seren und deren Analyse auf Antikörper oder Antigene, z. B. durch ELISA. Solche Bestimmungen erfordern mit dem Wissen des Fachmanns, dieser Offenbarung und der hierin zitierten Schriften kein übermäßiges Experimentieren. Und die Zeit der aufeinandertolgenden Verabreichungen kann, wie oben diskutiert, ohne übermäßiges Experimentieren ermittelt werden.
Beispiele für Zusammensetzungen der Erfindung umfassen flüssige Zubereitungen wie z. B. Suspensionen, Sirupe oder Elixiere für die Verabreichung über die Körperöffnungen, z. B. oral, nasal, anal, vaginal, peroral, intragastrisch, mucosal (z. B. perlingual, alveolar, über das Zahnfleisch, über die olfaktorische oder respiratorische Schleimhaut) etc. und Zubereitungen für die parenterale, subkutane, intradermale, intramuskuläre oder intravenöse Verabreichung (z. B. injizierbare Verabreichung), wie z. B. sterile Suspensionen oder Emulsionen. Solche Zusammensetzungen können in einem Gemisch mit einem geeigneten Träger, Verdünnungsmittel oder Arzneistoftträger, wie z. B. sterilem Wasser, physiologischer Salzlösung, Glucose oder dergleichen sein. Die Zusammensetzungen können ebenso gefriergetrocknet sein. Die Zusammensetzungen können Hilfsstoffe, wie z. B. Benetzungs- oder Emulgiermittel, pH-Puffer-Mittel, gelierende oder die Viskosität verstärkende Zusatzstoffe, Konservierungsstoffe, Geschmacksmittel, Farben und dergleichen in Abhängigkeit von dem gewünschten Verabreichungsweg und der gewünschten Zubereitung enthalten. Standardschrif ten, wie z. B. "REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCE", 17. Ausgabe, 1985, können herangezogen werden, um geeignete Zubereitungen ohne übermäßiges Experimentieren herzustellen.
Die Zusammensetzungen der Erfindung können zweckmäßigerweise als flüssige Zubereitungen bereitgestellt werden, z. B. als isotonische wäßrige Lösungen, Suspensionen, Emulsionen oder viskose Zusammensetzungen, welche mit einem Puffer auf einen ausgewählten pH-Wert eingestellt sein können. Falls die Absorption über den Verdauungstrakt bevorzugt ist, können erfindungsgemäße Zusammensetzungen in der "festen" Form von Pillen, Tabletten, Kapseln, Caplets und dergleichen, einschließlich "fester" Zubereitungen, welche über die Zeit freigesetzt werden oder welche eine flüssige Füllung aufweisen, z. B. eine mit Gelatine umhüllte Flüssigkeit, bei der die Gelatine für die Beförderung in den Darm im Magen aufgelöst wird.
Falls die nasale oder respiratorische (mucosale) Verabreichung gewünscht ist, können Zusammensetzungen als Inhaliermittel, Sprays und dergleichen zubereitet und mit einem Druck-Sprüh-Spender, Pump-Spender oder Aerosol-Spender verabreicht werden. Aerosole sind gewöhnlich mit Hilfe eines Kohlenwasserstoffs unter Druck gesetzt. Pump-Spender können vorzugsweise eine abgemessenen Dosis oder eine Dosis, die eine bestimmte Partikelgröße aufweist, verabreichen.
Zusammensetzungen innerhalb des Umfangs dieser Erfindung können ein Befeuchtungsmittel enthalten, um das Austrocknen der Schleimhautmembran zu verhindern und um einer Reizung vorzubeugen. Jedes aus einer Vielzahl von pharmazeutisch verträglichen Befeuchtungsmitteln kann eingesetzt werden, einschließlich z. B. Sorbit, Propylenglycol oder Glycerol. Wie bei den Verdickern wird die Konzentration mit dem ausgewählten Mittel variieren, obwohl die Anwesenheit oder die Abwesenheit dieser Mittel oder ihre Konzentration kein wesentliches Merkmal dieser Erfindung ist.
Eine verstärkte Absorption über die mucosale und insbesondere über die nasale Membran kann durch das Einsetzen eines pharmazeutisch verträglichen oberflächenaktiven Stoffs erreicht werden. Typischerweise schließen die für die Zusammensetzungen nützlichen obertlächenaktiven Stoffe Polyoxyethylenderivate von teilweise fettsäureveresterten Sorbitolanhydriden ein, wie z. B. Tween 80, Polyoxynol-40-stearat, Polyoxyethylen-50-stearat und Octoxynol. Die gewöhnliche Konzentration beträgt von 1% bis 10%, bezogen auf das Gesamtgewicht.
Ein pharmazeutisch verträgliches Konservierungsmittel kann verwendet werden, um die Haltbarkeit der Zusammensetzungen zu erhöhen. Benzylalkohol kann geeignet sein, wenngleich eine Vielzahl von Konservierungsmitteln ebenso verwendet werden kann, einschließlich Parabenen, Thimerosal, Chlorbutanol oder Benzalkoniumchlorid. Eine geeignete Konzentration des Konservierungsstoffs in Bezug auf das Gesamtgewicht wird von 0,02% bis 2% betragen, wenngleich es abhängig von dem ausgewählten Mittel eine merkliche Variation geben kann.
Die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen können pharmazeutisch verträgliche Geschmacksstoffe und/oder Farben beinhalten, um sie ansprechender zu machen, insbesondere wenn sie oral verabreicht werden. Die viskosen Zusammensetzungen können in der Form von Gelen, Lotionen, Salben, Cremes und dergleichen vorliegen und werden typischerweise eine hinreichende Menge eines Verdickungsmittels enthalten, so daß die Viskosität von etwa 2.500 bis 6.500 cps beträgt, wenngleich viskosere Zusammensetzungen von sogar bis zu 10.000 cps verwendet werden können. Die viskosen Zusammensetzungen haben vorzugsweise eine Viskosität von 2.500 bis 5.000 cps, da sie oberhalb dieses Bereichs schwieriger zu verabreichen sind. Trotz allem können die Zusammensetzungen oberhalb dieses Bereichs feste oder gelatinöse Formen erreichen, welche dann als eine geschluckte Pille leicht für die orale Einnahme verabreicht werden können.
Flüssige Zubereitungen sind normalerweise leichter herzustellen als Gele, andere viskose Zusammensetzungen und feste Zusammensetzungen. Außerdem sind flüssige Zusammensetzungen etwas angenehmer zu verabreichen, insbesondere durch Injektion oder orale Verabreichung an Tiere, Kinder, insbesondere kleine Kinder, und andere, die Schwierigkeiten beim Schlucken einer Pille, Tablette, Kapsel oder dergleichen haben, oder unter Umständen in vielen Dosen. Viskose Zusammensetzungen können auf der anderen Seite innerhalb des angemessenen Viskositätsbereichs formuliert werden, um längere Kontaktzeiten mit der Schleimhaut, wie z. B. der inneren Oberfläche der Magen- oder Nasenschleimhaut, zu erreichen.
Offensichtlich wird die Wahl des geeigneten Trägers und anderer Zusatzstoffe von dem genauen Weg der Verabreichung und der Natur der speziellen Dosierungsform abhängen, z. B. flüssige Dosierungsform [z. B. ob die Zusammensetzung in einer Lösung, einer Suspension, einem Gel oder einer anderen flüssigen Form formuliert werden soll) oder feste Dosierungsform [z. B. ob die Zusammensetzung in einer Pille, Tablette, Kapsel, Caplet, in einer über die Zeit freisetzenden Form oder flüssigkeitsgefüllten Form formuliert werden soll].
Lösungen, Suspensionen und Gele enthalten normalerweise einen größeren Anteil an Wasser (vorzugsweise aufgereinigtes Wasser) zusätzlich zu dem Antigen, dem Lipoprotein und dem wahlweisen Hilfsstoff. Kleinere Mengen von anderen Inhaltsstoffen, wie z. B. pH-einstellenden Stoffen (z. B. eine Base wie NaOH), Emulgier- oder Dispergiermittel, Puffermittel, Konservierungsmittel, Benetzungsmittel, gelierende Mittel (z. B. Methylzellulose), Farben und/oder Geschmacksstoffe können ebenso vorliegen. Die Zusammensetzungen können isotonisch sein, d. h. sie können den gleichen osmotischen Druck wie das Blut und die Tränenflüssigkeit aufweisen.
Die gewünschte Isotonizität der Zusammensetzungen dieser Erfindung können unter Verwendung von Natriumchlorid oder anderen pharmazeutisch verträglichen Mitteln, wie z. B. Dextrose, Borsäure, Natriumtartrat, Propylenglycol oder andere anorganischen oder organischen gelösten Substanzen, erreicht werden. Natriumchlorid wird insbesondere für Puffer, die Natriumionen enthalten, bevorzugt.
Die Viskosität der Zusammensetzungen kann auf dem ausgewählten Niveau unter Verwendung eines pharmazeutisch verträglichen Verdickungsmittels aufrechterhalten werden. Methylzellulose ist bevorzugt, weil sie einfach und wirtschaftlich erhältlich und leicht zu verarbeiten ist. Andere geeignete Verdickungsmittel umfassen z. B. Xanthangummi, Carboxymethylzellulose, Hydroxypropylzellulose, Carbomer und dergleichen. Die bevorzugte Konzentration des Verdickungsmittels wird von dem ausgewählten Mittel abhängen. Der wichtige Punkt ist, eine Menge zu verwenden, die die ausgewählte Viskosität erzielt. Viskose Zusammensetzungen werden normalerweise aus Lösungen durch den Zusatz solcher Verdickungsmittel zubereitet.
Ein pharmazeutisch verträgliches Konservierungsmittel kann verwendet werden, um die Haltbarkeit der Zusammensetzungen zu erhöhen. Benzylalkohol kann geeignet sein, wenngleich eine Vielzahl von Konservierungsmitteln ebenso verwendet werden kann, einschließlich z. B. Parabenen, Thimerosal, Chlorbutanol oder Benzalkoniumchlorid. Eine geeignete Konzentration des Konservierungsmittels wird von 0,02% bis 2%, bezogen auf das Gesamtgewicht, betragen, wenngleich es abhängend von dem ausgewählten Mittel eine merkliche Variation geben kann.
Fachleute werden bemerken, daß die Bestandteile der Zusammensetzungen so gewählt sein müssen, daß sie in Bezug auf das Antigen, das Lipoprotein und den wahlweisen Hilfsstoff chemisch inert sind. Dies wird für diejenigen, die mit chemischen und pharmazeutischen Prinzipien vertraut sind, keine Schwierigkeit darstellen oder Schwierigkeiten können unter Hinweis auf Standardschriften oder durch einfache Versuche (übermäßiges Experimentieren nicht einschließend) anhand dieser Offenbarung und der hierin zitierten Schriften einfach vermieden werden.
Die immunologisch wirksamen Zusammensetzungen dieser Erfindung werden durch Mischen der Gradienten zubereitet, wobei allgemein anerkannte Verfahren befolgt werden. Zum Beispiel können die ausgewählten Bestandteile einfach in einem Mixer oder einer anderen Standardeinrichtung gemischt werden, um ein konzentriertes Gemisch herzustellen, welches dann auf die Endkonzentration und Viskosität durch den Zusatz von Wasser oder Verdickungsmittel und möglicherweise eines Puffers, um den pH-Wert zu kontrollieren, oder eines zusätzlichen gelösten Stoffs, um die Tonizität zu kontrollieren, eingestellt werden kann. Im allgemeinen kann der pH-Wert von etwa 3 bis 7,5 betragen. Die Zusammensetzungen können in den Fachleuten aus den medizinischen und veterinärmedizinischen Gebieten bekannten Dosierungen und Verfahren verabreicht werden, wobei solche Faktoren, wie das Alter, das Geschlecht, das Gewicht und der Zustand des speziellen Patienten oder Tiers, und die für die Verabreichung verwendete Form der Zusammensetzung (z. B. fest gegenüber flüssig) berücksichtig werden. Die Dosierungen für Menschen oder andere Säugetiere können durch den Fachmann aus dieser Offenbarung, den hierin zitierten Schriften, den untenstehenden Beispielen (z. B. aus den Beispielen, die Mäuse einschließen) und den hierin erwähnten Kenntnissen von Antigenen und Lipoproteinen und Hilfsstoffen ohne übermäßiges Experimentieren bestimmt werden.
Die vorliegende Erfindung umfaßt auch ein Verfahren für das Induzieren einer immunologischen Antwort in einem Wirt, wobei das Antigen und das Lipoprotein an eine Schleimhaut verabreicht werden und eine Antwort bei einer anderen Schleimhaut nachweisbar ist, z. B. nasale Verabreichung und vaginale Antwort. Dieser Aspekt der Erfindung ist insbesondere für die Behandlung oder die Vorbeugung von sexuell übertragenen Erkrankungen nützlich.
Die geeigneten Therapiepläne für die initiale Verabreichung und zusätzliche Verabreichungen oder für aufeinanderfolgende Verabreichungen sind auch variabel, können eine initiale Verabreichung gefolgt von anschließenden Verabreichungen einschließen, aber sie können nichtsdestotrotz vom Fachmann aus dieser Offenbarung, den hierin zitierten Schriften, den untenstehenden Beispielen und aus der Kenntnis von Antigenen, Lipoproteinen und Hilfsstoffen, die hierin erwähnt wurden, ohne übermäßiges Experimentieren bestimmt werden.
Die folgenden Beispiele werden zu Erläuterungszwecken angegeben und sind nicht als eine Beschränkung der Erfindung gedacht.
BEISPIELE
BEISPIEL 1
Konstruktion eines pET9a-Expressionsvektors, der ein hybrides ospA/pspA-Gen enthält
Speziell entworfene Oligonukleotid-Primer wurden in einer PCR-Reaktion verwendet, um den Anteil des interessierenden pspA-Gens (in diesem Fall von Aminosäure 1 bis 314) aus dem S.pneumoniae-Stamm RX1 zu amplifizieren.
Der Primer für das 5'-Ende hatte die Nukleotidsequenz: 5'-GGG ACA GCA TGC GAA GAA TCT CCC GTA GCC AGT-3' (PspN1) (SEQ ID NO: 1).
Der Primer für das 3'-Ende hatte die Nukleotidsequenz: 5'-GAT GGA TCC TTT TGG TGC AGG AGC TGG TTT-3' (PspC370) (SEQ ID NO: 2).
Die PCR-Reaktion lief wie folgt ab: 94°C für 30 Sekunden, um die DNA zu denaturieren, 42°C für eine Minute für das Annealing der DNA und 72°C für eine Minute für die Verlängerung der DNA. Dies wurde in 25 Zyklen durchgeführt, gefolgt von einer 5-minütigen Verlängerung bei 72°C. Dieses Verfahren führte bei Aminosäure 315 ein Stop-Codon ein. Das PCR-Produkt wurde unter Verwendung des Verfahrens Gene Clean II (Bio101) aufgereinigt und mit Sphl und BamHI verdaut.
Das Plasmid pLF100 wurde wie folgt hergestellt.
Das Plasmid pBluescript KS+ (Stratagene) wurde mit Xbal und BamHI verdaut und mit einem Xbal-BamHI-DNA-Fragment mit 900 bp, das den vollständigen codierenden Bereich des ospA-Gens des B.-burgdorferi-Stamms ACA1 enthielt, ligiert, um einen Lipoprotein-Fusionsvektor pLF100 auszubilden. Dieses Verfahren ist in 1 der Anmeldung mit der Serien-Nr. 08/475,781, eingereicht am 7. Juni 1995, schematisch dargestellt.
Der Vektor pLF100 ist in der American Type Culture Collection in Rockville, Maryland am 2. Februar 1995 unter der Zugangsnr. 69750 hinterlegt worden. Diese Hinterlegung wurde gemäß der Bestimmungen des Budapester Vertrags vorgenommen.
pLF100 wurde mit Sphl und BamHI verdaut, und das amplifizierte pspA-Gen wurde mit diesem Plasmid ligiert, um das Plasmid pLF321 auszubilden, welches das hybride ospA pspA-Gen enthielt. Das Hybrid-Gen wurde aus pLF321 durch Verdau mit Ndel und BamHI ausgeschnitten und in die Ndel- und BamHI-Stellen des Plasmidvektors pET9a kloniert, um das Hybrid-Gen ospA-pspA unter die Kontrolle eines T7-Promotors zu bringen. Das resultierende Plasmid wird als pPA321-L bezeichnet. Dieses Verfahren ist in 9 der Anmeldung mit der Serien-Nr. 08/475,781, eingereicht am 7. Juni 1995, schematisch dargestellt.
BEISPIEL 2
Konstruktion eines pET9a-Expressionsvektors, der das pspA-Gen enthält
Speziell entworfene Oligonukleotid-Primer wurden bei einer PCR-Reaktion verwendet, um den Anteil des interessierenden pspA-Gens (in diesem Fall von Aminosäure 1 bis 314) aus dem S.pneumoniae-Stamm RX1 zu amplifizieren.
Der Primer für das 5'-Ende hatte die Nukleotidsequenz: 5'-GCT CCT GCA TAT GGA AGA ATC TCC CGT AGC C-3' (PspNL-2) (SEQ ID NO: 3).
Der Primer für das 3'-Ende hatte die Nukleotidsequenz 5'-GAT GGA TCC TTT TGG TGC AGG AGC TGG TTT-3' (PspC370) (SEQ ID NO: 4).
Die PCR-Reaktion lief wie folgt ab: 94°C für 30 Sekunden, um die DNA zu denaturieren, und 72°C für eine Minute für das Annealing und die Verlängerung der DNA. Dies wurde in 25 Zyklen ausgeführt, gefolgt von einer 5-minütigen Verlängerung bei 72°C. Dieses Verfahren führte bei Aminosäure 315 ein Stop-Codon ein. Das PCR-Produkt wurde unter Verwendung des Verfahrens Gene Clean II (Bio101) aufgereinigt und mit Ndel und BamHI verdaut. Das verdaute PCR-Produkt wurde in die Ndel- und BamHI-Stellen des Plasmidvektors pET9a kloniert, um das pspA-Gen unter die Kontrolle des T7-Promotors zu bringen. Das resultierende Plasmid wird als pPA321-NL bezeichnet. Dieses Verfahren ist in 10 der Anmeldung mit der Serien-Nr. 08/475,781, eingereicht am 7. Juni 1995, schematisch dargestellt.
BEISPIEL 3
Expression und Aufreinigung von mit Lipid versehenem PspA
Das Plasmid pPA321-L wurde verwendet, um den E.-coli-Stamm BL21(DE3)pLyS zu transformieren. Die transformierten E. coli wurden in LB-Medium, das 30 μg/ml Kanamycinsulfat und 25 μg/ml Chloramphenicol enthielt, inokuliert. Die Kultur wurde über Nacht in einem Flaschenschüttler bei 37°C angezogen.
Am darauffolgenden Morgen wurden 50 ml der Über-Nacht-Kultur in 1 L LB-Medium, das 30 μg/ml Kanamycinsulfat enthielt, überführt, und die Kultur wurde in einem Flaschenschüttler bei 37°C in ungefähr 3–5 Stunden angezogen bis zu einem Niveau der OD 600 nm von 0,6 bis 1,0. Zu dem Kulturmedium wurde zu einer Endkonzentration von 0,5 mM IPTG zugegeben, und die Kultur wurde für weitere 2 Stunden bei 30°C angezogen. Die Kulturen wurden durch Zentrifugation bei 4°C, bei 10.000x g geerntet und das Zellpellet wurde gesammelt. Mit Lipid versehenes PspA wurde aus dem Zellpellet zurückgewonnen.
Das Zellpellet wurde mit 30 g feuchter Zellmasse pro Liter PBS in PBS resuspendiert. Die Zellsuspension wurde eingefroren und bei –20°C gelagert. Die Zellen wurden bei Raumtemperatur aufgetaut, um die Lyse zu bewirken. DNase I wurde zu dem aufgetauten Material mit einer Endkonzentration von 1 μg/ml zugegeben, und das Gemisch wurde für 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert, was eine Abnahme der Viskosität des Materials zur Folge hatte.
Das Material wurde dann in einem Eisbad auf unter 10°C abgekühlt, und Triton^TM X-114 wurde als eine 10%-ige Stammlösung bis zu einer Endkonzentration von 0,3 bis 1% zugegeben. Das Gemisch wurde für 20 Minuten auf Eis gehalten. Das gekühlte Gemisch wurde dann auf 37°C erwärmt und bei dieser Temperatur für 10 Minuten gehalten. Dies bewirkte, daß die Lösung sehr trüb wurde, während die Phasentrennung auftrat. Das Gemisch wurde dann bei etwa 20°C für 10 Minuten bei 12.000x g zentrifugiert, was zu einer Trennung des Gemischs in eine untere Detergensphase, eine obere klare, wäßrige Phase und ein Pellet führte. Das mit Lipid versehene PspA verteilte sich in der Detergensphase. Die Detergensphase wurde von den anderen zwei Phasen abgetrennt, 1 : 10 mit einem Puffer verdünnt, der 50 mM Tris, 2 mM EDTA, 10 mM NaCl enthielt und einen pH-Wert von 7,5 hatte, und bei –20°C gelagert.
Eine Q-Sepharose-Säule wurde mit einem Volumen von 1 ml pro 5 ml verdünnter Detergensphase zubereitet. Die Säule wurde mit dem zweifachen Säulenvolumen an Puffer gewaschen, der 50 mM Tris, 2 mM EDTA, 0,3% Triton^TM X-100, 1 M NaCl enthielt und einen pH-Wert von 4,0 hatte, und dann mit dem 5- bis 10-fachen Säulenvolumen an 50 mM Tris, 2 mM EDTA, 0,3% Triton^TM X-100, 10 mM NaCl mit einem pH-Wert von 4,0 äquilibriert. Der pH-Wert des Materials der verdünnten Detergensphase wurde auf 4,0 eingestellt, zu welchem Zeitpunkt eine Ausfällung eintrat. Dieses Material wurde durch eine 0,2 μM Zelluloseacetat-Filtereinheit laufen gelassen, um das ausgefällte Material zu entfernen. Die filtrierte verdünnte Detergensphase wurde auf die Q-Sepharose-Säule aufgetragen, und der Durchfluß (der PA321-L enthielt) wurde gesammelt. Die Säule wurde mit dem 1- bis 2-fachen Säulenvolumen an 50 mM Tris, 2 mM EDTA, 0,3% Triton^TM X-100, 10 mM NaCl mit einem pH-Wert von 4,0 gewaschen, und der Durchfluß wurde mit der vorherigen Durchflußfraktion vereinigt. Der pH-Wert des vereinigten Durchflusses wurde auf 7,5 eingestellt. Das gebundene Material, kontaminierende E.-coli-Proteine, wurde von der Q-Sepharose mit dem 2-fachen Säulenvolumen an 50 mM Tris, 2 mM EDTA, 0,3% TritonTM X-100, 1 M NaCl mit einem pH-Wert von 4,0 eluiert. Ein Schema des in diesem Beispiel beschriebenen Aufreinigungsvorgangs ist in 11 der Anmeldung mit der Serien-Nr. 08/475,781, eingereicht am 7. Juni 1995, dargestellt.
BEISPIEL 4
Expression und Aufreinigung von nicht mit Lipid versehenem PspA
Das Plasmid pPA321-NL wurde verwendet, um den E.-coli-Stamm BL21(DE3)pLyS zu transformieren. Die transformierten E. coli wurde in LB-Medium, das 30 μg/ml Kanamycinsulfat und 25 μg/ml Chloramphenicol enthielt, inokuliert. Die Kultur wurde über Nacht in einem Flaschenschüttler bei 37°C angezogen.
Am nächsten Morgen wurden 50 ml der Über-Nacht-Kultur in 1 L LB-Medium, das 30 μg/ml Kanamycinsulfat enthielt, überführt, und die Kultur wurde in einem Flaschenschüttler bei 37°C in ungefähr 3–5 Stunden angezogen bis zu einem Niveau der OD 600 nm von 0,6 bis 1,0. Zu dem Kulturmedium wurde bis zu einer Endkonzentration von 0,5 mM IPTG zugegeben, und die Kultur wurde für weitere 2 Stunden bei 30°C angezogen. Die Kulturen wurden durch Zentrifugation bei 4°C bei 10.000x g geerntet und das Zellpellet gesammelt. Nicht mit Lipid versehenes PspA wurde aus dem Zellpellet zurückgewonnen.
Das Zellpellet wurde mit 30 g feuchter Zellmasse pro Liter PBS in PBS resuspendiert. Die Zellsuspension wurde eingefroren und bei –20°C gelagert. Die Zellen wurden bei Raumtemperatur aufgetaut, um die Lyse zu bewirken. DNase I wurde zu dem aufgetauten Material in einer Endkon zentration von 1 μg/ml zugegeben, und das Gemisch wurde für 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert, was zu einer Abnahme der Viskosität des Materials führte. Das Gemisch wurde bei 4°C bei 10.000x g zentrifugiert, und der Zellüberstand, welcher nicht mit Lipid versehenes PspA enthielt, wurde aufbewahrt. Das Pellet wurde mit PBS gewaschen, bei 4°C bei 10.000x g zentrifugiert und der Zellüberstand mit dem vorherigen Zellüberstand vereinigt.
Eine MonoQ-Säule (Pharmacia) wurde in einem Volumen von 1 ml pro 2 ml Zellüberstand erstellt. Die Säule wurde mit dem 2-fachen Säulenvolumen eines Puffers gewaschen, der 50 mM Tris, 2 mM EDTA, 1 M NaCl enthielt und einen pH-Wert von 7,5 hatte, und dann mit dem 5- bis 10-fachen Säulenvolumen eines Puffers, der 50 mM Tris, 2 mM EDTA, 10 mM NaCl enthielt und einen pH-Wert von 7,5 hatte, äquilibriert. Die vereinigten Zellüberstände wurden auf die Q-Sepharose-Säule aufgetragen, und der Durchfluß wurde gesammelt. Die Säule wurde mit dem 2- bis 5-fachen Säulenvolumen an 50 mM Tris, 2 mM EDTA, 10 mM NaCl mit einem pH-Wert von 7,5 gewaschen, und der Durchfluß wurde mit dem vorherigen Durchfluß vereinigt.
Die Eluierung von gebundenen Proteinen begann mit dem ersten Schritt des Waschens mit dem 5- bis 10-fachen Säulenvolumen an 50 mM Tris, 2 mM EDTA, 100 mM NaCl mit einem pH-Wert von 7,5. Der zweite Eluierungsschritt war ein Waschen mit dem 5- bis 10-fachen Säulenvolumen mit 50 mM Tris, 2 mM EDTA, 200 mM NaCl, mit einem pH-Wert von 7,5. Das nicht mit Lipid versehene PspA war in dieser Fraktion enthalten. Die verbleibenden, gebundenen, kontaminierenden Proteine wurden mit 50 mM Tris und 2 mM EDTA mit einem pH-Wert von 7,5, mit 300 mM-1 M NaCl entfernt.
Ein Schema des in diesem Beispiel beschriebenen Aufreinigungsprozesses ist in 12 der Anmeldung mit der Serien-Nr. 08/475,781, eingereicht am 7. Juni 1995, dargestellt.
BEISPIEL 5
Immunogenität von rekombinantem, mit Lipid versehenem PspA
Aufgereinigtes, rekombinantes, wie in Beispiel 3 beschrieben zubereitetes, mit Lipid versehenes PspA wurde auf Immunogenität in Mäusen getestet und mit der von wie in Beispiel 4 beschrieben zubereitetem, nicht mit Lipid versehenem PspA verglichen. Für diese Untersuchung wurden CBA/N-Mäuse auf der Hinterseite des Halses mit 0,5 ml der folgenden Formulierungen mit den angegebenen PspA-Antigen-Konzentrationen subkutan immunisiert.
Für jede Dosierung der Formulierungen wurden vier Mäuse an den Tagen 0 und 21 immunisiert. Den Mäusen wurde dann an Tag 35 Blut abgenommen, und sie wurden anschließend mit S. pneumoniae eines A66-Stamms herausgefordert. Die Tage des Überlebens nach der Herausforderung wurden für die Mäuse aufgezeichnet, und den überlebenden Mäusen wurde an den Tagen 36, 37, 42 und 46 Blut abgenommen. Von diesen folgenden Blutproben wurde das Blut auf die Anzahl von koloniebildenden Einheiten (CFU) von S. pneumoniae/ml untersucht. Die am Tag 35 genommenen Seren wurden unter Verwendung von ELISA mit ELISA auf Antikörper gegen PspA untersucht. In der folgenden Tabelle sind die Tage bis zum Tod der herausgeforderten Mäuse dargestellt.
Die Anzahl an CFU im Blut der Mäuse ist in der untenstehenden Tabelle dargestellt.
Diese Ergebnisse zeigen an, daß das rekombinante Protein nicht protektiv war, wenn es alleine injiziert wurde. Das rekombinante Antigen war, unterstützt mit Alaun und/oder durch das Versehen mit dem Lipid PAM₃cys, immunogen und protektiv. Das native PspA-Antigen der vollen Länge brauchte keinen Hilfsstoff, um protektiv zu sein. Die CFU-Ergebnisse zeigen an, daß durch die Immunisierung geschützte Mäuse die herausfordernden S. pneumoniae in zwei Tagen aus dem Blut entfernten.
Die ELISA-Untersuchung der Seren, die am Tag 35 entnommen wurden, zeigte an, daß es eine gute Korrelation zwischen dem Schutz der Mäuse vor der S.-pneumoniae-Herausforderung und der Induzierung von meßbaren Antikörperantworten gab. In den Seren der Mäuse, die mit nicht mit Lipid versehenem Antigen immunisiert wurden (pPA-321-NL), bei Salzlösung oder auf die Negativkontrollen, die kein PspA-Antigen enthielten, wurden keine nachweisbaren Antikörperantworten beobachtet (wie in der untenstehenden Tabelle dargestellt). Gute Antikörperantworten wurden auf das native RX1-PspA-Antigen nachgewiesen und auf das rekombinante PspA, wenn es mit dem Lipid PAM₃cys versehen und/oder an Alaun adsorbiert war.
Um zu ermitteln, ob der Schutz zumindest zum Teil durch die Anti-PspA-Antikörperantworten vermittelt wurde, wurde ein passiver Versuch durchgeführt. BALB/c-Mäuse wurden mit 0,5 μg eines rekombinanten, mit Lipid versehenen PspA alleine oder adsorbiert an Alaun, oder mit rekombinantem, nicht mit einem Lipid versehenem PspA, das an Alaun adsorbiert war, an den Tagen 0 und 21 immunisiert, und am Tag 35 wurde ihnen Blut abgenommen. Die Antiseren wurden 1 : 3 oder 1 : 15 in Salzlösung verdünnt, und 0,1 ml der Verdünnung wurden je Verdünnung in zwei Mäuse i. p. injiziert. Eine 1/3-Verdünnung von normalem BALB/c-Mausserum wurde als eine Negativkontrolle verwendet. Anschließend wurden die Tiere eine Stunde nach der passiven Immunisierung i. v. mit dem WU2-Stamm von S. pneumoniae (15.000 CFU) herausgefordert. Die passiv mit Anti-PspA-Seren immunisierten Mäuse wurden im Vergleich zu den Mäusen, die Verdünnungen von normalen Mausseren erhielten, geschützt, wie in der folgenden Tabelle dargestellt.
Passiver Schutz von BALBic auf WU2
BEISPIEL 6
PspA/Grippe-Kombinationsimpfstoff
Wie in Beispiel 3 beschrieben hergestelltes, aufgereinigtes, rekombinantes, mit Lipid versehenes PspA und wie in Beispiel 4 beschrieben zubereitetes, nicht mit Lipid versehenes PspA wurden mit gespaltenem Grippe-Antigen aus dem A/Texas-Stamm kombiniert.
Diese Kombinationen und das Grippe-Antigen alleine wurden entweder in Salzlösung formuliert oder an Alaun in Salzlösung adsorbiert. Der Alaun wurde, wenn er zugegeben wurde, konstant bei 100 μg/Injektion gehalten, und das PspA wurde konstant bei 0,5 μg/Injektion gehalten. Das Grippe-Antigen wurde auf Konzentrationen von 0,5, 0,1, 0,02 und 0,004 μg/Injektion verdünnt. Für jede der Formulierungen wurden vier BALB/c-Mäuse an den Tagen 0 und 21 immunisiert und ihnen wurde dann am Tag 35 Blut abgenommen. Die Seren der immunisierten Mäuse wurden dann auf ihre Fähigkeit, die Agglutination von roten Blutkörperchen von Hühnern durch das A/Texas-HA-Antigen zu hemmen, untersucht. Die resultierenden Titer der Hämagglutinationshemmung (HAI) sind in der folgenden Tabelle dargestellt.
HAI-Titer von Kombinationen von rekombinantem PspA und Grippe
BEISPIEL 7
Expression und Aufreinigung von nicht mit Lipid versehenem OspC
E.-coli-JM-109-Transformanten, die einen Plasmidvektor enthielten, der chromosomale Genfragmente enthielt, die nicht mit Lipid versehenes OspC codierten, wurden wie in der WO 91/09870 beschrieben zubereitet und angezogen. Die Kulturen wurden geerntet, das Kulturmedium bei 10.000x g für 10 Minuten bei 4°C zentrifugiert, der Überstand verworfen und das Pellet gesammelt.
Das Zellpellet wurde zunächst in dem Lyse-Puffer A, nämlich 50 mM Tris-HCl, pH 8,0, 2 mM EDTA, 0,1 mM DTT, 5% Glycerol und 0,4 mg/ml Lysozym, resuspendiert, und die Suspension wurde für 20 Minuten bei Raumtemperatur gerührt. Dann wurde zu der Zellsuspension TRITON^TM X-100 bis zu einer Konzentration von 1 Gew.-% zugegeben, DNase I wurde bis zu einer Konzentration von 1 μg/ml zugegeben und die Suspension bei Raumtemperatur für weitere 20 Minuten gerührt, um die Zelllyse zu bewirken. Als nächstes wurde zu der Zellsuspension Natriumchlorid in einer Konzentrati on von 1 M zugegeben und die Suspension wieder für weitere 20 Minuten bei 4°C gerührt. Die Suspension wurde dann bei 20.000x g für 30 Minuten zentrifugiert, der resultierende Überstand vom Pellet abgetrennt, und das Pellet wurde verworfen.
Der abgetrennte Überstand wurde gegen einen Puffer, der 50 mM Tris, pH 8, 2 mM EDTA enthielt, dialysiert. Als nächstes wurde der Überstand auf eine DEAE-Sepharose-CL-6B-Säule aufgetragen, und das nicht mit Lipid versehene OspC wurde in dem Säulendurchfluß gesammelt. Der Durchfluß wurde gegen einen 0,1 M Phosphatpuffer, pH 6,0, dialysiert.
Der dialysierte Durchfluß wurde als nächstes an eine S-Sepharose-Schnellflußsäule, die mit 0,1 M Phosphatpuffer, pH 6,0, äquilibriert war, gebunden. Das aufgereinigte, nicht mit Lipid versehene OspC wurde dann von der S-Sepharose-Säule unter Verwendung des Dialysepuffers mit zugesetztem 0,15 M NaCl eluiert.
Die wäßrige Lösung des hochgradig gereinigten, nicht mit Lipid versehenen OspC wurde mit Coomassie-gefärbten Gelen untersucht. Die Reinheit des Produkts wurde größer als 80% eingestuft.
BEISPIEL 8
Potenzierung der Antwort auf nicht mit Lipid versehenes OspC mit mit Lipid versehenem OspA
Aufgereinigtes, rekombinantes, nicht mit Lipid versehenes OspC, zubereitet wie in Beispiel 7 beschrieben, wurde in Kombination mit oder ohne aufgereinigtem, mit Lipid versehenem OspA (zubereitet wie in der WO 92/14488 beschrieben) auf Immunogenität in Mäusen untersucht. Die Formulierungen wurden mit oder ohne Alaun als einem Hilfsstoff verabreicht. Die in diesem Versuch getestete Antigendosis betrug 1 μg/Dosis. Für diese Studie wurden 4 bis 8 Wochen alte weibliche C3H/He-Mäuse am Tag 0 immunisiert und an den Tagen 21 und 42 zusätzlich behandelt.
Drei repräsentativen Tieren wurde an den Tagen 21, 42, 63 und 91 Blut abgenommen. Mit diesen Seren wurde unter Verwendung von aufgereinigtem, mit Lipid versehenem OspC als dem beschichtenden Antigen die ELISA-Untersuchung durchgeführt.
Die einzigen nachweisbaren OspC-ELISA-Antworten, die in dieser Studie ausgebildet wurden, gab es mit der Formulierung von OspC auf Alaun. Trotz allem war die OspC-ELISA-Antwort, wenn mit Lipid versehenes OspA auf Alaun enthalten war, 20-mal höher am Tag 63 (wie in 1 dargestellt) und 5-mal höher am Tag 91 (wie in 2 dargestellt). Wenn mit Lipid versehenes OspA in der Formulierung ohne Alaun enthalten war, gab es keine offensichtliche Wirkung auf die Immunantwort.
BEISPIEL 9
Speicheldrüsen-ELISPOT-Untersuchung der Antworten auf Urease mit OspA
Über den mucosalen Weg wurden Mäuse (CH3/HeN, 4-5/Gruppe) mit den in der untenstehenden Tabelle angegebenen Antigenen an den Tagen 0 und 28 immunisiert. Die Proteine wurden in einer Endkonzentration von 25 μl für intranasal und 0,5 ml für intragastrisch in PBS verdünnt. 15-17 Tage nach der zweiten Immunisierung wurden die Mäuse für ELISPOTs getötet.
Das ELISPOT-Protokoll wurde von dem von Mega et al., J. Immunol. (1992), 148: 2030–2039 beschriebenen Protokoll abgeleitet. Die Speicheldrüsen wurden direkt nach dem Töten der Mäuse entnommen und sofort in ein großes Volumen an RPMI-1640-Medium (Gibco) gegeben. Die Organe wurden unter Verwendung eines automatischen Gewebeschneiders (Mc Illwain Gewebeschneider, The Mickle Laboratory Engineering, Gilford, UK) in kleine Stücke (1 × 1 mm) geschnitten und dann in 2 ml RPMI-1640-Medium, das 5% FCS und 1 mg/ml an Kollagenase des Typs IV (Sigma) enthielt, für 30 Minuten bei 37°C unter leichtem Schütteln verdaut. Die verdauten Zellen und Fragmente wurden durch einen 70 μm-Filter (Falcon) gegeben und die Verdauung wurde drei weitere Male wiederholt. Die verdauten Zellen wurden vereinigt und zweimal in einem großen Volumen des Mediums gewaschen. Die vereinigten Zellen wurden dann unter Verwendung von Geys Lösung für 4 Minuten auf Eis lysiert. Nach zwei weiteren Waschschritten wurden die Zellen in 2 ml Medium (+5% FCS) resuspendiert, gezählt und zu aliquoten Anteilen in 96-Well-Nitrozelluloseplatten (MILLIPORE) gegeben. Die Platten waren über Nacht mit 20 μg/ml an Jackbohnen-Urease (Boehringer Mannheim) oder 10 μg/ml OspA (Connaught) in PBS bei 4°C beschichtet und dann mit vollständigem Medium für 1 Stunde bei 37°C abgesättigt worden. Zwei fünffache Verdünnungen der Zellen wurden für jede Verdünnung und jeden Isotyp in vierfacher Ausführung in die Wells gegeben (100 μl/Well). Nach 4-16 Stunden bei 37°C unter 5% CO₂ wurden die Zellen 2 × 5 Minuten in PBS/Tween 20 (0,005%) lysiert, und biotinylierte Anti-Isotypen-Antikörper (Amersham) wurden für 2 Stunden bei Raumtemperatur zugegeben (Verdünnung 1/1000). Nach drei Waschschritten mit PBS-Tween wurde der biotinylierte Streptavidin-Peroxidase-Komplex (Amersham) für 1 Stunde zugegeben (Verdünnung 1/500) und dann die Flecken mit 3,9-Aminoethylcarbazol (SIGMA) dargestellt. Sobald die Platten getrocknet waren, wurden die Flecken unter einem Präpariermikroskop numeriert (Vergrößerung 16 oder 40X). Die Werte repräsentieren das Mittel von 4 Wells, die für jede Tiergruppe Bemittelt wurden.
Wie in der untenstehenden Tabelle dargestellt, wurde beobachtet, daß mit Lipid versehenes OspA-Lipoprotein ohne jedweden Zusatz von Hilfsstoff über den mucosalen Weg verabreicht sehr stark lokale IgG- und IgA-Antworten induzierte, während nicht mit Lipid versehenes OspA überhaupt keine nachweisbaren Antworten induzierte. Es wurde ebenso beobachtet, daß OspA eine starke Hilfsstoffwirkung auf die lokale Antwort auf Urease hat.
BEISPIEL 10
ELISA-Assay zur Messung der Serumantikörper gegen OspA und Urease
Mäuse (CH3/HeN, 4-5/Gruppe) wurden über den mucosalen Weg mit den in der Tabelle von Beispiel 9 angezeigten Antigenen an den Tagen 0 und 28 immunisiert. Die Proteine wurden in einem Endvolumen von 25 μl für intranasal und 0,5 ml für intragastrisch in PBS verdünnt. Neun Tage nach der zweiten Immunisierung wurde Blut entnommen.
Für den ELISA-Assay wurden 96-Well-Mikrotiterplatten mit flachem Boden (Dynatech) mit 100 μl/Well an 1 μg/ml OspA (Connaught) oder mit 2 μg/ml Jackbohnen-Urease (Boehringer Mannheim), verdünnt in 0,1M Natriumcarbonatpuffer, pH 9,6, beschichtet. Die Platten wurden über Nacht bei Raumtemperatur beschichtet.
Am nächsten Tag wurden die Platten 4x mit PBS/0,05% Tween 20 gewaschen und mit PBS mit 1% BSA für 30 Minuten bei Raumtemperatur blockiert. Nach einem weiteren Waschgang erhielt jedes Well 100 μl an PBS mit 0,05% Tween 20 und 0,1% BSA (PBS/T/B). Die Seren wurden innerhalb jeder Gruppe von Mäusen vereinigt und serienmäßig verdünnt, und die Platten wurden für 3 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert. Nach dem Waschen wurde 1 : 5000 in PBS/T/B verdünntes 2°-antikörperbiotinyliertes Ziege-Anti-Maus-IgG oder -IgA (Amersham) zugegeben, und die Platten wurden für 2 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert. Die Platten wurden wieder gewaschen und mit 1 : 2000 in PBS/T/B verdünnter Streptavidin-Meerrettich-Peroxidase (Amersham) für 1,5 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert. Nach einem abschließenden Waschgang wurde das Substrat OPD (Sigma) zugegeben, und die Platten wurden 10–20 Minuten inkubiert. Schließlich wurde die Reaktion mit 50 μl 2 N H₂SO₄ abgestoppt, und die Platten wurden bei 490/650 nm mit einem Molecular-Devices-Plattenlesegerät eingelesen. Die in den 3, 4 und 5 dargestellten Ergebnisse zeigen, daß mucosal verabreichtes, mit Lipid versehenes OspA, aber nicht das nicht mit Lipid versehene OspA, eine sehr starke Serum-IgG-Antwort induziert. Außerdem wies mit Lipid versehenes OspA eine starke Hilfsstoffwirkung auf die Serum-IgG-Antwort auf Urease auf.
Durch die ausführliche Beschreibung bestimmter bevorzugter Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung soll verdeutlicht werden, daß die durch die anhängenden Ansprüche definierte Erfindung nicht durch spezielle, in der obigen Beschreibung dargestellte Details beschränkt sein soll, da viele offensichtliche Variationen davon möglich sind, ohne hiervon abzuweichen.

Claims

Verwendung einer ersten Zusammensetzung, die wenigstens ein Antigen umfaßt, und einer zweiten Zusammensetzung, die ein antigenes Lipoprotein umfaßt, zur Herstellung eines Medikamentes für die Verwendung beim Induzieren einer immunologischen Antwort in einem Wirt, wobei das antigene Lipoprotein ein Expressionsprodukt eines hybriden Nukleinsäuremoleküls ist, welches eine erste Nukleinsäuresequenz umfaßt, die eine Signalsequenz eines Lipoproteins codiert, und eine zweite Nukleinsäuresequenz, die ein reifes Protein oder ein Fragment davon codiert, welches zu dem von der ersten Nukleinsäuresequenz codierten Lipoprotein heterolog ist.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei das Antigen und das Lipoprotein gleichzeitig verabreicht werden.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei das Antigen Epitope eines Bakterienproteins aufweist.
Verwendung nach Anspruch 3, wobei das Antigen Urease ist.
Verwendung nach Anspruch 3, wobei das Antigen ein Borrelia-Antigen ist, welches nicht OspA ist.
Verwendung nach Anspruch 5, wobei das Antigen OspC ist.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei das Lipoprotein auf natürliche Weise mit Lipid versehen ist.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei das Lipoprotein auf nicht natürliche Weise mit Lipid versehen ist.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei die Signalsequenz die Signalsequenz eines OspA-Proteins einer Borrelia-Art ist und die Sequenzen benachbart sind.
Verwendung nach Anspruch 9, wobei die erste Nukleinsäuresequenz und die zweite Nukleinsäuresequenz in einem Verhältnis in einem bezüglich Translation offenen Leserahmen verknüpft sind.
Verwendung nach Anspruch 9 oder Anspruch 10, wobei das reife Protein ein OspC-Protein einer Borrelia-Art oder ein Fragment davon ist.
Verwendung nach Anspruch 11, wobei das reife Protein ein OspC-Protein aus einem Stamm von Borrelia burgdorferi ist.
Verwendung nach Anspruch 12, wobei der Stamm von Borrelia burgdorferi unter den Familien B31, ACA1 und Ip90 von Stämmen ausgewählt ist.
Verwendung nach Anspruch 10, wobei das reife Protein PspA oder ein Fragment davon ist.
Verwendung nach Anspruch 14, wobei das Antigen ein Influenza-Antigen ist.
Verwendung nach Anspruch 15, wobei das Antigen ein HA-Antigen ist.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei das Lipoprotein OspA ist.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei das Antigen und das Lipoprotein mucosal verabreicht werden.
Verwendung nach Anspruch 18, wobei das Antigen und das Lipoprotein intranasal verabreicht werden.
Verwendung nach Anspruch 19, wobei das Antigen und das Lipoprotein intragastrisch verabreicht werden.
Verwendung nach Anspruch 20, wobei das Antigen und das Lipoprotein sowohl intranasal als auch intragastrisch verabreicht werden.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei die immunologische Antwort therapeutisch ist.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei die immunologische Antwort prophylaktisch ist.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 23, wobei die Zusammensetzung weiterhin einen Hilfsstoff umfaßt.
Impfstoff oder immunogene Zusammensetzung mit einer ersten Zusammensetzung, die eine wirksame Menge wenigstens eines Antigens umfaßt, und einer zweiten Zusammensetzung, die eine wirksame Menge wenigstens eines antigenen Lipoproteins umfaßt, wobei das anti gene Lipoprotein ein Expressionsprodukt eines hybriden Nukleinsäuremoleküls ist, welches eine erste Nukleinsäuresequenz umfaßt, die eine Signalsequenz eines Lipoproteins codiert, und eine zweite Nukleinsäuresequenz, die ein reifes Protein oder ein Fragment davon codiert, welches zu dem von der ersten Nukleinsäuresequenz codierten Lipoprotein heterolog ist.
Impfstoff oder Zusammensetzung nach Anspruch 25, wobei das Antigen wenigstens ein Epitop eines Bakterienproteins aufweist.
Impfstoff oder Zusammensetzung nach Anspruch 26, wobei das Antigen Urease ist.
Impfstoff oder Zusammensetzung nach Anspruch 26, wobei das Antigen ein Borrelia-Antigen ist, welches nicht OspA ist.
Impfstoff oder Zusammensetzung nach Anspruch 28, wobei das Antigen OspC ist.
Impfstoff oder Zusammensetzung nach Anspruch 25, wobei das Lipoprotein auf natürliche Weise mit Lipid versehen ist.
Impfstoff oder Zusammensetzung nach Anspruch 25, wobei das Lipoprotein auf nicht natürliche Weise mit Lipid versehen ist.
Impfstoff oder Zusammensetzung nach Anspruch 25, wobei die Signalsequenz die Signalsequenz eines OspA-Proteins einer Borrelia-Art ist und die Sequenzen benachbart sind.
Impfstoff oder Zusammensetzung nach Anspruch 32, wobei die erste Nukleinsäuresequenz und die zweite Nukleinsäuresequenz in einem Verhältnis in einem bezüglich Translation offenen Leserahmen verknüpft sind.
Impfstoff oder Zusammensetzung nach Anspruch 32 oder Anspruch 33, wobei das reife Protein ein OspC-Protein einer Borrelia-Art oder ein Fragment davon ist.
Impfstoff oder Zusammensetzung nach Anspruch 34, wobei das reife Protein ein Osp-C-Protein aus einem Stamm von Borrelia burgdorferi ist.
Impfstoff oder Zusammensetzung nach Anspruch 35, wobei der Stamm von Borrelia burgdorferi unter den Familien B31, ACA1 und Ip90 von Stämmen ausgewählt ist.
Impfstoff oder Zusammensetzung nach Anspruch 33, wobei in dem hybriden Nukleinsäuremolekül das reife Protein PspA oder ein Fragment davon ist.
Impfstoff oder Zusammensetzung nach Anspruch 37, wobei das Antigen ein Influenza-Antigen ist.
Impfstoff oder Zusammensetzung nach Anspruch 38, wobei das Antigen ein HA-Antigen ist.
Impfstoff oder Zusammensetzung nach Anspruch 25, wobei das Lipoprotein ein OspA-Protein einer Borrelia-Art ist.
Impfstoff oder Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 25 bis 40, welcher/welche weiterhin einen Hilfsstoff umfaßt.