DE69630622T2

DE69630622T2 - Nukleinsäuren und deren Verwendung zur Bestimmung von Beta-Laktamase

Info

Publication number: DE69630622T2
Application number: DE69630622T
Authority: DE
Inventors: Roger Y. Tsien; Gregor Zlokarnik
Original assignee: University of California
Current assignee: University of California
Priority date: 1995-03-20
Filing date: 1996-03-20
Publication date: 2004-09-23
Anticipated expiration: 2016-03-21
Also published as: US5741657A; WO1996030540A2; CA2215310C; DK0817785T3; US6472205B1; EP0982398B1; ATE521715T1; EP0982398A1; CN1066731C; JPH11502714A; EP1405922B1; ATE200287T1; CN1296078A; ES2209305T3; PT982398E; EP1405922A3; CN1184479A; JP3856807B2; EP1405922A2; US20070184513A1

Description

Hintergrund der Erfindung
Die Erfindung betrifft allgemein das Gebiet der Chemie und Biologie. Insbesondere betrifft die Erfindung Zusammensetzungen und Verfahren für die Messung von Gen-Expression.
Durch einen Reporter-Gentest wird die Aktivität des Promotors eines Gens gemessen. Er wird ermöglicht durch Verfahren der Molekularbiologie, die es erlauben, heterologe. Gene unter die Kontrolle eines jeglichen Promotors zu stellen und das Konstrukt in das Genom einer Säugerzelle einzubringen [Gorman, C. M. et al., Mol. Cell. Biol. 2: 1044–1051 (1982); Alam, J. und Cook, J. L., Anal. Biochem. 188: 245–254 (1990)]. Eine Aktivierung des Promotors induziert das Reporter-Gen sowie das oder anstelle des endogenen Gens. Das Reporter-Gen kodiert für ein Protein, das leicht nachgewiesen und gemessen werden kann. Gewöhnlich ist es ein Enzym, das ein käuflich erhältliches Substrat in ein Produkt umwandelt. Diese Umwandlung wird einfach durch Chromatographie oder direkte optische Messung verfolgt und ermöglicht die Quantifizierung der Menge des produzierten Enzyms.
Reporter-Gene sind auf einer Vielzahl von Plasmiden für die Untersuchung der Gen-Regulation in einer Vielzahl von Organismen käuflich verfügbar [Alam und Cook, supra]. Interessierende Promotoren können in multiple Klonierungsstellen eingesetzt werden, die für diesen Zweck vor dem Reporter-Gen auf dem Plasmid bereitgestellt werden [Rosenthal, N., Methods Enzymol. 152: 704–720 (1987); Shiau, A. und Smith, J. M., Gene 67: 295–299 (1988)]. Standardverfahren werden für das Einbringen dieser Gene in einen Zelltyp oder einen ganzen Organismus eingesetzt (vgl. z. B. Sambrook, J., Fritsch, E. F. und Maniatis, T., Expression of cloned genes in cultured mammalian cells. In: Molecular Cloning, herausgegeben von Nolan, C., New York: Gold Spring Harbor Laboratory Press, 1989]. Resistenzmarker auf dem Plasmid können sodann für die Auswahl erfolgreich transformierter Zellen verwendet werden.
Die einfache Verwendung und die starke Signalverstärkung machen dieses Verfahren für die Untersuchung von Gen-Regulation immer beliebter. Jeder Schritt in der Kaskade DNA → RNA → Enzym → Produkt → Signal amplifiziert den nächsten in der Sequenz. Je weiter unten in der Kaskade gemessen wird, desto stärker ist das Signal.
In einem idealen Reporter-Gentest wird das Reporter-Gen unter Kontrolle des interessierenden Promotors in Zellen entweder transient oder stabil transfiziert. Eine Rezeptoraktivierung führt zu einer Veränderung der Enzymmengen über transkriptionelle und translationelle Ereignisse. Die vorhandene Enzymmenge kann mit Hilfe ihrer enzymatischen Aktivität auf ein Substrat gemessen werden. Das Substrat ist ein kleines, ungeladenes Molekül, das bei Zugabe zu der extrazellulären Lösung die Plasmamembran durchdringen kann, um auf das Enzym zu treffen. Ein geladenes Molekül ist auch einsetzbar, jedoch muss die Ladung durch Gruppen, die von endogenen zellulären Enzymen abgespalten werden (z. B. durch cytoplasmatische Esterasen abgespaltene Ester), maskiert werden.
Aus einer Vielzahl von Gründen ist die Verwendung von Substraten, die Veränderungen ihrer Fluoreszenzspektren bei Interaktion mit einem Enzym zeigen, besonders erwünscht. In manchen Tests wird das fluorogene Substrat in ein fluoreszentes Produkt umgewandelt. Alternativ verändert das fluoreszente Substrat die Fluoreszenzeigenschaften bei der Umwandlung am Reporter-Enzym. Das Produkt sollte stark fluoreszent sein, um ein maximales Signal zu erhalten, und es sollte sehr polar sein, um innerhalb der Zelle eingeschlossen zu bleiben.
Für die Erreichung der höchstmöglichen Sensitivität in einem Reportertest muss man die Signalmenge, die von einem einzigen Reporterenzym geschaffen wird, maximieren. Ein optimales Enzym wird 10⁵ Substratmoleküle pro Sekunde unter Sättigungsbedingungen umwandeln [Stryer, L., Introduction to enzymes. In: Biochemistry, New York: W. H. Freeman and Company, 1981, Seiten 103–134]. β-Laktamasen werden etwa 10³ Moleküle ihrer bevorzugten Substrate pro Sekunde spalten [Chang, Y. H. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 2823–2827 (1990)]. Bei Verwendung eines fluorogenen Substrats kann man bis zu 10⁶ Photonen pro produziertem fluoreszentem Produkt erhalten, abhängig von dem verwendeten Farbstofftyp, falls mit Licht der geeigneten Wellenlänge angeregt wird. Das Signal bricht mit der Gleichung des Fluorophors ab [Tsien, R. Y. und Waggoner, A. S., Fluorophores for confocal microscopy: Photophysics and photochemistry. In: Handbook of Biological Confocal Microscopy, herausgegeben von Pawley, J. B. Plenum Publishing Corporation, 1990, Seiten 169–178]. Diese Zahlen verdeutlichen die theoretische Signalstärke, die bei diesem Typ einer Messung erreichbar ist. In der Praxis wird der Anteil der erzeugten Photonen über 1 Minute nachgewiesen, jedoch trifft dies für Fluoreszenz, Biolumineszenz oder Chemilumineszenz zu. Ein gutes fluorogenes Substrat für ein Reporter-Enyzm muss einen hohen Umsatz am Enzym aufweisen, zusätzlich zu guten optischen Eigenschaften wie hohe Extinktion und hohe Fluoreszenz-Quantumausbeute.
Zusammenfassung der Erfindung
Eine erfindungsgemäße Aufgabe ist die Herstellung von Zellen, die die β-Laktamase-Reporter-Gene enthalten, die funktionell mit einem Promotor verbunden sind, so dass bei Anschalten des Promotors das Reporter-Gen exprimiert wird. Eine Expression der β-Laktamase wird mit Hilfe der β-Laktamase-Substrate gemessen, die Strahlung (Licht) nach Hydrolyse durch die β-Laktamase aussenden.
Eine weitere erfindungsgemäße Aufgabe ist die Verwendung der β-Laktamase-Reporter-Gene in Zellen und der erfindungsgemäßen β-Laktamase-Substrate für das Screenen auf biochemische Aktivität.
Fluorogene Substrate werden bereitgestellt der allgemeinen Formel I
worin: eine der Gruppen X oder Y ist ein als Energiedonor (-geber) wirkendes Fluorophor oder ein membrangängiges Derivat davon, und die andere Gruppe ist eine Quenchergruppe, ein als Energieakzeptor (-empfänger) wirkendes Fluorophor oder ein membrangängiges Derivat davon;
R' ist ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus H, niederem Alkyl, (CH₂)_nOH, (CH₂)_nCOOR'' und =NOJ, wobei n 0 oder eine ganze Zahl von 1 bis 5 und J H, CH₃, CH₂COOH, CHCH₃COOH und C(CH₃)₂COOH ist;
R'' ist ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus H, physiologisch verträglichen Metall- und Ammoniumkationen, -CHR²COO(CH₂)_nCH₃, -CHR²COOC(CH₃)₃, Acylthiomethyl, Acyloxyalpha-benzyl, delta-Butyrolactonyl, Methoxycarbonyloxymethyl, Phenyl, Methylsulfinylmethyl, beta-Morpholinoethyl, Dialkylaminoethyl und Dialkylaminocarbonyloxymethyl, wobei R² ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus H und niederem Alkyl;
A ist ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus S, O, SO, SO₂ und CH₂;
Z' ist ein Linker (Verbindungsgruppe) für X;
und Z'' ist ein Linker für Y.
In einem weiteren Aspekt werden erfindungsgemäß Verfahren zur Bestimmung, ob eine Probe β-Laktamase-Aktivität enthält, bereitgestellt. Die Verfahren umfassen das Kontaktieren der Probe mit einem erfindungsgemäßen Substrat, das bei einer Anregung Fluoreszenz-Resonanz-Energietransfer aufweist, das Anregen der Verbindung und die Bestimmung des Grads an Fluoreszenz-Resonanz-Energietransfer in der Probe. Ein Grad an Fluoreszenz-Resonanz-Energietransfer, der niedriger als erwartet ausfällt, zeigt β-Laktamase-Aktivität an. Eine Ausführungsform dieses Verfahrens dient der Bestimmung der Menge eines Enzyms in einer Probe. Gemäß diesem Verfahren umfasst die Bestimmung des Grads an Fluoreszenz-Resonanz-Energietransfer in der Probe die Bestimmung des Grads zu einem ersten und zweiten Zeitpunkt nach Kontaktierung der Probe mit dem Substrat und die Bestimmung des Unterschieds in dem Grad an Fluoreszenz-Resonanz-Energietransfer. Der Unterschied in dem Grad an Fluoreszenz-Resonanz-Energietransfer spiegelt die Menge an Enzym in der Probe wider.
In einem weiteren Aspekt stellt die Erfindung Säugerwirtszellen bereit, die mit einem rekombinanten Nukleinsäuremolekül transfiziert sind, das Expressionkontrollsequenzen enthält, die zur Funktion in Vertebratenzellen angepasst und funktionell an eine Nukleotidsequenz gekoppelt sind, die für die Expression eines aktiven β-Lactamase Reportergens kodieren, wobei das Nukleinsäuremolekül weiterhin Säuger-Kozak-Sequenzen für das β-Lactamase-Reportergen enthält und die Nukleotisequenz, die für die Expression des β-Lactamase Reportergens kodiert, besitzt keine Signalsequenz. Sie stellt ebenfalls eine Säugerwirtszelle bereit, die mit einem Expressionsvektor transfiziert ist, der ein rekombinantes Nukleinsäuremolekül umfasst, umfassend Expressionkontrollsequenzen, die zur Funktion in Vertebratenzellen angepasst und funktionell an eine Nukleotidsequenz gekoppelt sind, die für die Expression eines aktiven cytosolischen β-Lactamase Reportergens kodieren, wobei das Nukleinsäuremolekül weiterhin Säuger-Kozak-Sequenzen für das β-Lactamase-Reportergen enthält und die Nukleotisequenz, die für die Expression des β-Lactamase Reportergens kodiert, besitzt keine Signalsequenz.
In einem weiteren Aspekt werden erfindungsgemäß Verfahren zur Bestimmung der Menge von β-Laktamase-Aktivität in einer Zelle bereitgestellt. Die Verfahren umfassen die Bereitstellung einer Säuger-Wirtszelle, die mit einem rekombinanten Nukleinsäuremolekül transfiziert wurde, das Expressionskontrollsequenzen umfasst, die funktionell mit für ein aktives β-Laktamase Reportergen kodierenden Nukleinsäuresequenzen verbunden sind, wobei das Nukleinsäuremolekül weiterhin Säuger-Kozak-Sequenzen für das β-Lactamase-Reportergen enthält und die Nukleotisequenz, die für die Expression des β-Lactamase Reportergens kodiert, besitzt keine Signalsequenz; die Kontaktierung einer die Säugerzelle umfassenden Probe mit einem β-Laktamase-Substrat, und die Bestimmung der Menge an gespaltenem Substrat, wobei die Menge an gespaltenem Substrat mit der Menge an β-Laktamase-Aktivität in Beziehung steht.
In einem weiteren Aspekt werden erfindungsgemäß Verfahren zur Überwachung der Expression eines Gens bereitgestellt, das funktionell mit einem Satz von Expressionskontrollsequenzen verbunden ist. Die Verfahren umfassen die Bereitstellung einer eukaryotischen Wirtszelle, die mit einem rekombinanten Nukleinsäuremolekül transfiziert worden ist, das Expressionskontrollsequenzen umfasst, die zur Funktion in einer Säugerzelle angepasst sind, die funktionell mit für ein aktives β-Laktamase Reportergen kodierenden Nukleinsäuresequenzen verbunden sind, wobei das Nukleinsäuremolekül weiterhin Säuger-Kozak-Sequenzen für das β-Lactamase-Reportergen enthält und die Nukleotisequenz, die für die Expression des β-Lactamase Reportergens kodiert, besitzt keine Signalsequenz; die Kontaktierung einer die Zelle umfassenden Probe mit einem erfindungsgemäßen β-Laktamase-Substrat und die Bestimmung der Menge an gespaltenem Substrat. Die Menge an gespaltenem Substrat steht mit der Menge an β-Laktamase-Aktivität in Beziehung.
In einem weiteren Aspekt werden erfindungsgemäß Verfahren für die Bestimmung bereitgestellt, ob eine Testverbindung die Expression eines Gens verändert, das funktionell mit einem Satz von Expressionskontrollsequenzen verbunden ist. Die Verfahren umfassen die Bereitstellung einer Säugerzelle, die mit einem rekombinanten Nukleinsäurekonstrukt transfiziert wurde, das die Expressionskontrollsequenzen in funktioneller Verbindung mit Nukleinsäuresequenzen umfasst, die für die Expression eines aktiven β-Laktamase Reportergens kodieren, wobei das Nukleinsäuremolekül weiterhin Säuger-Kozak-Sequenzen für das β-Lactamase-Reportergen enthält und die Nukleotisequenz, die für die Expression des β-Lactamase Reportergens kodiert, besitzt keine Signalsequenz; Kontaktierung der Zelle mit der Testverbindung, die Kontaktierung einer die Säugerzelle umfassenden Probe mit einem erfindungsgemäßen β-Laktamase-Substrat und die Bestimmung der Menge an gespaltenem Substrat, wobei die Menge an gespaltenem Substrat mit der Menge an β-Laktamase-Aktivität in Beziehung steht. Der Schritt der Mengenbestimmung an gespaltenem Substrat umfasst die Anregung der Verbindung und die Bestimmung des Grads an Fluoreszenz-Resonanz-Energietransfer in der Probe. Ein Grad an Fluoreszenz-Resonanz-Energietransfer, der niedriger als erwartet ausfällt, zeigt β-Laktamase-Aktivität an.
In einem weiteren Aspekt werden erfindungsgemäß Verfahren der klonalen Selektion bereitgestellt, umfassend die Bereitstellung von Zellen, die mit einem rekombinanten Nukleinsäuremolekül transfiziert wurden, das die Expressionskontrollsequenzen in funktioneller Verbindung mit Nukleinsäuresequenzen umfasst, die für die Expression einer cytosolischen β- Laktamase kodieren. Die Verfahren umfassen weiterhin die Kontaktierung der Zellen mit einer Substanz, die die Aktivierung der Expressionskontrollsequenzen aktiviert oder hemmt, die Kontaktierung der Zellen mit einer membrangängigen Verbindung gemäß Anspruch 9, die in ein Substrat umgewandelt wird, die Bestimmung, ob Substrat in jeder einzelnen Zelle gespalten wird, wobei die Spaltung β-Laktamase-Aktivität widerspiegelt, und die Auswahl und Vermehrung derjenigen Zellen, die einen ausgewählten Grad an β-Laktamase-Aktivität aufweisen. In einer weiteren Ausführungsform umfasst das Verfahren weiterhin die Kultivierung ausgewählter Zellen ohne Aktivator für eine Zeit, die für einen wesentlichen Verlust des gespaltenen Substrats aus den Zellen und für eine Rückkehr der β-Laktamase-Spiegel auf nicht-aktivierte Spiegel ausreichend ist, die Inkubation der ausgewählten Zellen mit einer Verbindung gemäß Anspruch 9, die in ein Substrat umgewandelt wird, und die Auswahl von Zellen, die das Substrat im wesentlichen nicht gespalten haben.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
Die 1(a) und 1(b) zeigen die Emissionsspektren der Fluorescein (a)- und Rhodamin (b)-Komponenten der Verbindung 11 (Beispiel 1) vor und nach β-Laktamase-Spaltung des β-Laktam-Rings.
2 zeigt das Emissionsspektrum der Verbindung 17 vor und nach β-Laktamase-Spaltung des β-Laktam-Rings.
3 zeigt das Emissionsspektrum der Verbindung 22 vor und nach β-Laktamase-Spaltung des β-Laktam-Rings.
4 zeigt das Emissionsspektrum der Verbindung 25 vor und nach β-Laktamase-Spaltung des β-Laktam-Rings.
5 zeigt das Emissionsspektrum der Verbindung CCF2 vor und nach β-Laktamase-Spaltung des β-Laktam-Rings.
6 zeigt das Emissionsspektrum der Verbindung CCF1 vor und nach β-Laktamase-Spaltung des β-Laktam-Rings.
7A zeigt eine Tabelle, in der verschiedene erfindungsgemäß verwendbare Nukleotid- und Aminosäuresequenzen dargestellt sind.
7B–C zeigt die Sequenz 1, die Nukleotid- und abgeleitete Aminosäuresequenz von E. coli RTEM, modifiziert von Kadonaga et al. (1984).
7D–E zeigt die Sequenz 2, die Nukleotid- und abgeleitete Aminosäuresequenz von sekretiertem Wildtyp-RTEM-Enzym mit Ser2→Arg und Ala23→Gly.
7F–G zeigt die Sequenz 3, die Nukleotid- und abgeleitete Aminosäuresequenz des RTEM-Enzyms mit einer stromaufwärts gelegenen β-Globin-Leitsequenz, einer Säuger-Kozak-Sequenz und einem Austausch der Signalsequenz durch Met Gly.
7H–E zeigt die Sequenz 4, die Nukleotid- und abgeleitete Aminosäuresequenz der RTEM-β-Laktamase mit einer Säuger-Kozak-Sequenz und einem Austausch der Signalsequenz durch Met Asp.
7J–K zeigt die Sequenz 5, die Nukleotid- und abgeleitete Aminosäuresequenz von Bacillus licheniformis-β-Laktamase mit einer ausgetauschten Signalsequenz.
Beschreibung der Erfindung
Definitionen
Erfindungsgemäß besitzen die nachstehenden Begriffe die nachfolgend angeführten Bedeutungen, es sei denn, es ist anders erwähnt.
Der Begriff "fluoreszenter Donor-Rest" betrifft die Gruppe einer fluorogenen Verbindung, die Energie absorbieren und die Energie auf ein anderes fluorogenes Molekül oder einen Teil einer Verbindung transferieren kann. Geeignete fluorogene Donor-Moleküle umfassen in nicht begrenzender Weise Coumarine und verwandte Farbstoffe, Xanthen-Farbstoffe wie Fluoresceine, Rhodole und Rhodamine, Resorufine, Cyanin-Farbstoffe, Bimane, Acridine, Isoindole, Dansyl-Farbstoffe, Aminophthalsäurehydrazide wie Luminol- und Isoluminolderivate, Aminophthalimide, Aminonaphthalimide, Aminobenzofurane, Aminochinoline, Dicyanohydrochinone, Europium- und Terbium-Komplexe und verwandte Verbindungen.
Der Begriff "Quencher" betrifft ein chromophores Molekül oder einen Teil einer Verbindung, das die Emission von einem fluoreszenten Donor vermindern kann, falls es an den Donor gebunden ist. Ein Quenching kann durch irgendeinen mehrerer Mechanismen erfolgen, einschließlich Fluoreszenz-Resonanz-Energietransfer, photoinduzierter Elektronentransfer, paramagnetische Verstärkung einer Interkombination, Dexter-Austauschkopplung und Exziton-Kopplung, wie die Bildung dunkler Komplexe. Der Begriff "Akzeptor" betrifft hier einen Quencher, der über Fluoreszenz-Resonanz-Energietransfer arbeitet. Viele Akzeptoren können die transferierte Energie als Fluoreszenz aussenden. Beispiele umfassen Coumarine und verwandte Fluorophore, Xanthene wie Fluoresceine, Rhodole und Rhodamine, Resorufine, Cyanine, Difluorboradiazaindacene und Phthalocyanine. Andere chemische Klassen von Akzeptoren senden im allgemeinen die transferierte Energie nicht erneut aus. Beispiele umfassen Indigoverbindungen, Benzochinone, Antrachinone, Azoverbindungen, Nitroverbindungen, Indoaniline, Di- und Triphenylmethane.
Der Begriff "Farbstoff' betrifft ein Molekül oder einen Teil einer Verbindung, das/der bestimmte Lichtfrequenzen absorbiert, einschließlich in nicht begrenzender Weise ultraviolettes Licht. Die Begriffe "Farbstoff' und "Chromophor" werden synonym verwendet.
Der Begriff "Fluorophor" betrifft ein fluoreszierendes Chromophor.
Der Begriff "membrangängiges Derivat" meint ein chemisches Derivat einer Verbindung der allgemeinen Formel, worin wenigstens einer der Reste X und Y wenigstens ein acyliertes aromatisches Hydroxyl, ein acyliertes Amin oder ein alkyliertes aromatisches Hydroxyl enthält, wobei die Acylgruppe 1 bis 5 Kohlenstoffatome enthält und wobei die Alkylgruppe ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus -CH₂OC(O)alk, -CH₂SC(O)alk, -CH₂OC(O)Oalk, niederer Acyloxy-alpha-benzyl und delta-Butyrolactonyl, worin alk ein Niederalkylrest mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen ist. Diese Derivate wurden für das Durchdringen von Zellmembranen verbessert, d. h. membrangängig gemacht, da hydrophile Gruppen maskiert sind, um hydrophobere Derivate bereitzustellen. Die Maskierungsgruppen sind derart, dass sie von dem fluorogenen Substrat in der Zelle gespalten werden, um das abgeleitete Substrat intrazellulär zu schaffen. Da das Substrat hydrophiler als das membrangängige Derivat ist, wird es sodann in den Zellen eingeschlossen.
Der Begriff "Alkyl" betrifft gerade, verzweigte und cyclische aliphatische Gruppen aus 1 bis 8 Kohlenstoffatomen, vorzugsweise 1 bis 6 Kohlenstoffatomen und insbesondere 1 bis 4 Kohlenstoffatomen. Der Begriff "Niederalkyl" betrifft gerade und verzweigtkettige Alkylgruppen mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen.
Der Begriff "aliphatisch" betrifft gesättigte und nicht-gesättigte Alkylgruppen mit 1 bis 10 Kohlenstoffatomen, vorzugsweise 1 bis 6 Kohlenstoffatomen und insbesondere 1 bis 4 Kohlenstoffatomen.
Substrate
β-Laktamasen sind nahezu optimale Enzyme in Bezug auf ihre fast ausschließlich diffusionskontrollierte Katalyse der β-Laktam-Hydrolyse [Christensen, H. et al., Biochem. J. 266: 853–861 (1990)]. Bei der Untersuchung der anderen Eigenschaften dieser Enzymklasse fand man heraus, dass sie für die Funktion als intrazelluläres Reporter-Enzym geeignet waren. Sie spalten den β-Laktamring von β-Laktam-Antibiotika wie Penicillinen und Cephalosporinen, wobei neue, geladene Gruppen entstehen [O'Callaghan, C. H. et al., Antimicrob. Agents Chemother. 8: 57–63 (1968); Stratton, C. W., J. Antimicrob. Chemother. 22, Suppl. A. 23–35 (1988)]. Ein Cephalosporin der ersten Generation ist nachstehend links gezeigt, wobei der Pfeil auf die Spaltstelle durch β-Laktamase deutet. Die freie Aminogruppe, die so entsteht (mittlere Struktur, nachstehend), wirkt als Elektronen-Donor durch die Vinylgruppe und verstärkt eine irreversible Spaltung einer nukleofugen Gruppe R₂ von der 3'-Position. R₂ wird somit frei und kann von dem R₁-Cephalosporin-Konjugat wegdiffundieren (rechte Struktur, nachstehend).
β-Laktamasen sind eine Enzymklasse, die aufgrund ihrer klinischen Relevanz einer Bakterienresistenz gegenüber β-Laktam-Antibiotika sehr gut untersucht wurden [Waley, S. G., Sci. Prog. 72: 579–597 (1988); Richmond, M. H. et al., Ann. N. Y. Acad. Sci. 182: 243–257 (1971)]. Die meisten β-Laktamasen wurden kloniert und ihre Aminosäuresequenz bestimmt [vgl. z. B. Ambler, R. P., Phil. Trans. R. Soc. Lond. [Ser. B.] 289: 321–331 (1980)].
Das für β-Laktamase kodierende Gen ist Molekularbiologen als Ampicillin-Resistenzgen (Amp^r) bekannt und wird gewöhnlich für die Selektion erfolgreich transduzierter Bakterien eingesetzt [Castagnoli, L. et al., Genet. Res. 40: 217–231 (1982)]. Klone davon sind fast überall verfügbar. Das Enzym katalysiert die Hydrolyse eines β-Laktamrings und akzeptiert keine Peptide oder Proteinsubstrate [Pratt, R. F. und Govardhan, C. P., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 1302–1306 (1984); Murphy, B. P. und Pratt, R. F., Biochemistry 30: 3640–3649 (1991)]. Die Kinetik dieser Reaktion wird gut verstanden und es gibt keine Produkthemmung [Bush, K. und Sykes, R. B., Antimicrob. Agents Chemother. 30: 6–10 (1986); Christensen et al. (1990), supra]. Die Enzymsubstrate sind weniger polar als die Produkte.
Die Carboxylgruppe in dem Substrat kann leicht durch einen Acetoxymethylester maskiert werden [Jansen, A. B. A. und Russell, T. J., J. Chem. Soc. 2127–2132 (1965); Daehne, W. et al., J. Med. Chem. 13: 607–612 (1970)], der leicht durch endogene intrazelluläre Esterasen von Säugern gespalten wird. Eine Umwandlung durch diese Esterasen, gefolgt von der Spaltung des β-Laktams durch β-Laktamase schafft zwei negative Ladungen und ein tertiäres Amin, das protoniert. Bisher wurde kein fluorogenes Substrat mit geeigneten Eigenschaften beschrieben, jedoch wurden viele chromogene Substrate einer unterschiedlichen Ausgestaltung beschrieben und sind käuflich verfügbar [Jones, R. N. et al., J. Clip. Microbiol. 15: 677–683 (1982); Jones, R. N. et al., J. Clip. Microbiol. 15: 954–958 (1982); O'Callaghan, C. H. et al., Antimicrob. Agents Chemother. 1: 283–288 (1972)].
Eine große Anzahl an β-Laktamasen wurde isoliert und charakterisiert und alle wären für eine erfindungsgemäße Verwendung geeignet. Anfänglich wurden β-Laktamasen in verschiedene Klassen (I bis V) aufgrund ihrer Substrat- und Inhibitorprofile und ihrem Molekulargewicht eingeteilt [Richmond, M. H. und Sykes, R. B., Adv. Microb. Physiol. 9: 31–88 (1973)]. In jüngerer Zeit wurde ein Klassifizierungssystem, basierend auf der Aminosäure- und Nukleotidsequenz, eingeführt [Ambler, R. P., Phil. Trans. R. Soc. Lond. [er. B.] 289: 321–331 (1980)]. β-Laktamasen der Klasse A besitzen ein Serin im aktiven Zentrum und weisen ein Molekulargewicht von etwa 29 kD auf. Diese Klasse enthält die Plasmid-vermittelten TEM β-Laktamasen wie das RTEM-Enzym von pBR322. β-Laktamasen der Klasse B besitzen ein Zink im aktiven Zentrum, das an einen Cysteinrest gebunden ist. Enzyme der Klasse C besitzen ein Serin im aktiven Zentrum und weisen ein Molekulargewicht von etwa 39 kD auf, zeigen jedoch keine Aminosäure-Homologie mit den Enzymen der Klasse A.
Die kodierende Region einer beispielhaften β-Laktamase, die in den hier beschriebenen Reporter-Gentests eingesetzt wird, ist in SEQ ID NO: 1 (Nukleinsäuresequenz) und SEQ ID NO: 2 (Aminosäuresequenz) gezeigt. Der diese Sequenz enthaltende pTG2del1 wurde beschrieben [Kadonaga, J. T. et al., J. Biol. Chem. 259: 2149–2154 (1984)]. Die gesamte kodierende Sequenz der Wildtyp pBR322-β-Laktamase wurde ebenfalls veröffentlicht [Sutcliffe, J. G., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75: 3737–3741 (1978)]. Wie dem Fachmann bekannt ist, wären diese und andere vergleichbare Sequenzen von Peptiden mit β-Laktamase-Aktivität gleichermaßen für eine erfindungsgemäße Verwendung geeignet. Das β-Laktamase-Reporter-Gen wird in einem Testsystem in einer Weise eingesetzt, die per se in Bezug auf die Verwendung von Reporter-Genen gut bekannt ist (z. B. in Form eines geeigneten Plasmidvektors).
In Verbindung mit einer geeigneten β-Laktamase werden erfindungsgemäß fluorogene Substrate der allgemeinen Formel (I)
eingesetzt, worin: eine der Gruppen X oder Y ist ein als Energiedonor wirkendes Fluorophor und die andere Gruppe ist ein Quencher (der reemittiert oder nicht reemittiert); R' ist ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus H, niederem Alkyl, (CH₂)_nOH, (CH₂)_nCOOR'' und =NOJ, wobei n 0 oder eine ganze Zahl von 1 bis 5 und J H, Me, CN₂COOH, CHMeCOOH und CMe₂COOH ist; R'' ist ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus H, physiologisch verträglichen Metall- und Ammoniumkationen, -CHR²COO(CH₂)_nCH₃, -CHR²OCOC(CH₃)₃, Acylthiomethyl, Acyloxy-alpha-benzyl, delta-Butyrolactonyl, Methoxycarbonyloxymethyl, Phenyl, Methylsulfinylmethyl, beta-Morpholinoethyl, Dialkylaminoethyl und Dialkylaminocarbonyloxymethyl, wobei R² ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus H und niederem Alkyl; A ist ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus S, O, SO, SO₂ und CH₂; und Z' und Z'' sind Linker für die Fluoreszenzdonor- und Quencherreste.
Die Linker Z' und Z'' dienen zur Anheftung der Fluoreszenzdonorreste und Quencherreste an das von Cephalosporing abgeleitete Gerüst und kann die Synthese der Verbindungen gemäß der allgemeinen Formel I erleichtern. In der allgemeinen Formel I kann Z' eine direkte Bindung an das Gerüst darstellen; alternativ umfassen geeignete Linker zur Verwendung als Z' in nicht beschränkender Weise die folgenden: -(CH₂)_nCONR²(CH₂)_m-, -(CH₂)_nNR²CO(CH₂)_m-, -(CH₂)_nNR³CONR²(CH₂)_m-, -(CH₂)_nNR³CSNR²(CH₂)_m-, -(CH₂)_nCONR³(CH₂)_pCONR²(CH₂)_m-, -(CH₂)_n-, -(CH₂)_nNR³CO(CH₂)_pS(CH₂)_m-, -(CH₂)_nS(CH₂)_m-, -(CH₂)_nO(CH₂)_m-, -(CH₂)_nNR²(CH₂)_m-, -(CH₂)_nSO₂NR²(CH₂)_m-, -(CH₂)_nCO₂(CH₂)_m-,
wobei R² und n die vorstehend definierte Bedeutung haben. R³ ist ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Wasserstoff und Niederalkyl und m und p sind unabhängig voneinander ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus 0 und ganzen Zahlen von 1 bis 4. Besonders bevorzugt sind Z'-Gruppen, bei denen n und m 0 sind. Ebenfalls besonders bevorzugt sind Z'-Gruppen, bei denen R² H ist.
Geeignete Linker Z'' für den Y-Rest beinhalten in nicht-beschränkender Weise eine direkte Bindung an ein Heteroatom (z. B., O, N oder S) im Chromophor des Farbstoffs oder die folgenden: -O(CH₂)_n-, -S(CH₂)_n-, NR²(CH₂)_n-, -N⁺R² ₂(CH₂)_n-, -OCONR²(CH₂)_n-, -O₂C(CH₂)_n-, -SCSNR²(CH₂)_n-, -SCSO(CH₂)_n-, -S(CH₂)_nCONR²(CH₂)_m, -S(CH₂)_nNR²CO(CH₂)_m und
wobei R², n und m die vorstehend definierte Bedeutung haben; und m ist eine ganze Zahl von 0 bis 4. Eine besonders bevorzugte Z''-Gruppe ist -S(CH₂)_n. Besonders bevorzugt ist H.
Bevorzugte R'-Gruppen umfassen H und Methyl. Besonders bevorzugt ist H. Bevorzugte R''-Gruppen umfassen H und Acetoxymethyl. Eine bevorzugte R²-Gruppe ist H. Eine bevorzugte A-Gruppe ist -S-.
In einer bevorzugten Ausführungsform sind die erfindungsgemäßen Verbindungen membrangängig. Besonders bevorzugt sind solche Verbindungen, bei denen wenigstens einer der Reste X und Y wenigstens ein acyliertes aromatisches Hydroxyl, acyliertes Amin oder ein alkyliertes aromatisches Hydroxyl enthält, wobei die Acylgruppe 1 bis 5 Kohlenstoffatome enthält und die Alylgruppe ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus -CH₂OC(O)alk, -CH₂SC(O)alk, -CH₂OC(O)Oalk, niederer Acyloxy-alpha-benzyl und delta-Butyrolactonyl, wobei alk eine Niederalkylgruppe mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen ist. Besonders bevorzugt sind solche Verbindungen, bei denen wenigstens einer der Reste X und Y wenigstens eine acylierte aromatische Hydroxylgruppe enhält, wobei die Acylgruppe entweder Acetyl, n-Propionyl oder n-Butyryl ist. Ebenfalls besonders bevorzugt sind solche Verbindungen, bei denen wenigstens einer der Reste X und Y eine Acetoxymethylgruppe an einer aromatischen Hydroxylgruppe enthält.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist der Quencher oder Akzeptor ein Fluorescein, Rhodol oder Rhodamin der Formeln VIII bis XII. Bevorzugt sind solche Verbindungen, bei denen der Donor ein Fluorescein der Formel VIII und der Quencher oder Akzeptor ein Rhodol oder Rhodamin der Formeln VIII bis XII ist. Ebenfalls bevorzugt sind solche Verbindungen, bei denen der Donor ein Fluorescein der Formel VIII und der Quencher oder Akzeptor ein Tetrahalofluorescein der Formel VIII ist, wobei R^a, R^b, R^c und R^d unabhängig voneinander Br oder Cl sind. Ebenfalls bevorzugt sind solche Verbindungen, bei denen der Quencher oder Akzeptor ein Rhodol der Formeln VIII, IX und XI ist. Bei einer weiteren bevorzugten Gruppe derartiger Verbindungen ist der Quencher oder Akzeptor ein Rhodamin der Formel VIII, X und XII.
In einem weiteren bevorzugten Aspekt ist der Donor ein Coumarin der Formeln II–VII und der Quencher/Akzeptor ist ein Fluorescein, Rhodol oder Rhodamin der Formeln VIII–XII, XLVII oder XLVII und membrangängige fluorogene Derivate davon. Besonders bevorzugt sind Verbindungen mit einem Fluorescein-Quencher/Akzeptor der Formel VIII. Insbesondere bevorzugt sind Verbindungen, bei denen das Coumarin 7-Hydroxycoumarin oder 7-Hydroxy-6-chlorcoumarin und der Fluorescein-Akzeptor Fluorescein oder Dichlorfluorescein ist.
Wie dem Fachmann bekannt ist, hängt die Effizienz des Fluoreszenz-Resonanz-Energietransfers von der Fluoreszenz-Quantumausbeute des Donor-Fluorophors, der Entfernung von Donor zu Akzeptor und dem Überlappungsintegral der Fluoreszenzemission des Donors und der Absorption des Akzeptors ab. Der Energietransfer ist am effizientesten, wenn ein Donor-Fluorophor mit einer hohen Fluoreszenz-Quantumausbeute (vorzugsweise nahe 100%) mit einem Akzeptor gepaart ist, der einen großen Extinktionskoeffizienten bei Wellenlängen, die mit der Emission des Donors zusammenfallen, besitzt. Die Abhängigkeit des Fluoreszenz-Energietransfers von den vorstehend genannten Parametern wurde beschrieben [Forsten, T. (1948), Ann. Physik 2: 55–75; Lakowicz, J. R., Principles of Fluorescence Spectroscopy, New York: Plenum Press (1983); Herman, B., Resonance energy transfer microscopy, in: Fluorescence Microscopy of Living Cells in Culture, Part 8, Methods in Cell Biology, Bd. 30, Hrsg. Taylor, D. L. & Wang, Y.-L., San Diego, Academic Press (1989), Seiten 219–243; Turro, N. J., Modern Molecular Photochemistry, Menlo Part: Benjamin/Cummings Publishing Co., Inc. (1978), Seiten 296–361]. Tabellen von spektralen Überlappungsintegralen sind einfach verfügbar (vgl, z. B. Berlman, I. B., Energy transfer Parameters of aromatic compounds, Academic Press, New York und London (1973)]. Die Entfernung zwischen dem Donor-Fluorophor und dem Akzeptor-Farbstoff, bei der ein Fluoreszenz-Resonanz-Energietransfer (FRET) mit einer Effizienz von 50% auftritt, wird als R₀ bezeichnet und kann aus den spektralen Überlappungsintegralen berechnet werden. Für das Donor-Akzeptor-Paar Fluorescein-Tetramethylrhodamin, das häufig für die Abstandsmessung in Proteinen verwendet wird, beträgt diese Entfernung R₀ etwa 50–70 Å [dos Remedios, C. G. et al. (1987), J. Muscle Research and Cell Motility 8: 97–117]. Die Entfernung, bei der der Energietransfer bei diesem Paar 90% überschreitet, beträgt etwa 45 Å. Bei Bindung an das Cephalosporin-Rückgrat betragen die Entfernungen zwischen den Donoren und Akzeptoren 10 Å bis 20 Å, abhängig von den verwendeten Linkem und der Größe der Chromophore. Im Fall eines Abstands von 20 Å wird ein Chromophorenpaar einen berechneten R₀ von mehr als 30 Å für 90% der Donoren besitzen müssen, um die Energie auf den Akzeptor zu übertragen, was zu mehr als 90% Quenching der Donor-Fluoreszenz führt. Eine Spaltung eines derartigen Cephalosporins durch β-Laktamase verringert das Quenching und erhöht die Effizienz der Donor-Fluoreszenz mehr als 10-fach. Demgemäß ist eine Identifizierung geeigneter Donor-Akzeptor-Paare für eine erfindungsgemäße Verwendung im wesentlichen Routinearbeit für den Fachmann.
Für die Messung der β-Laktamase-Aktivität im Cytoplasma von lebenden Zellen sind Chromophore mit einem kleineren Molekulargewicht, wie nachstehend beschrieben, im allgemei nen gegenüber größeren bevorzugt, da die Bereitstellung von Substrat im Fall von größeren Verbindungen schwierig wird. Größere Moleküle, insbesondere mit mehr als etwa 1200 Dalton neigen ebenfalls zur Bindung mit einer höheren Avidität an zelluläre Bestandteile als kleinere, wodurch zumindest manche einem Zugang und einer Spaltung durch β-Laktamase entzogen werden.
Für die Verwendung als X und Y geeignete Chromophore sind dem Fachmann bekannt. Allgemeine Strukturen von bestimmten Chromophorklassen, die für die Verwendung als X und Y geeignet sind, sind nachstehend beschrieben. Verbindungen der allgemeinen Formeln II–XXXIV sind Beispiele von Fluorophoren, die als Basis für besonders geeignete Donor-Reste in den Verbindungen der allgemeinen Formel Idienen. Geeignete Chromophore für eine Verwendung als Basis von Akzeptor-Resten in den Verbindungen der allgemeinen Formel umfassen in nicht begrenzender Weise Verbindungen der allgemeinen Formeln II– LIV. Chromophore der allgemeinen Formeln XXXV–LIV re-emittieren gewöhnlich nicht effizient.
Coumarine und verwandte Farbstoffe
Xanthen-Farbstoffe (einschließlich Fluoresceine, Rhodole und Rhodamine)
Resorufine
Cyanin-Farbstoffe
Acridine
Isoindole
Dansyl-Farbstoffe
Aminophthalsäurehydrazide (Luminol- und Isoluminolderivate)
Aminophthalimide
Polymethin-Farbstoffe
Nitro-Farbstoffe und Cyanoderivate
Chinon-Farbstoffe
Xanthen-Farbstoffe
Dicyanovinyl- und Tricyanovinyl-Farbstoffe
Indamine und verwandte Farbstoffe
In bevorzugten Ausführungsformen der Verbindungen der allgemeinen Formeln II–LVI
sind a und a' unabhängig H oder ein Anlagerungspunkt (d. h. eine Stelle, an die der Farbstoffrest an die Kernstruktur der allgemeinen Formel I gebunden ist),
ist E ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus H, OH, OR^k und NR^gR^h,
ist G ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus O und N⁺R^g'R^h',
sind L und L' unabhängig voneinander ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus CH und N,
ist M ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus H, Mg, Al, Si, Zn und Cu,
ist Q ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus O, S, C(CH₃)₂ und NR^g,
ist Q' ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus O, CH₂, C(CH₃)₂, NR^k und SO₂,
ist T ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus O und NR^k,
sind W und W' ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus O, S, Se und NH,
sind R^a, R^b, R^c und R^d unabhängig voneinander ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus einem Anlagerungspunkt, H, Halogen und Niederalkyl,
ist R^e ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus einem Anlagerungspunkt, H, Niederalkyl, (CH₂)_nCO₂H, (CH₂)_nCHaCO₂H, Cha(CH₂)_nCO₂H, (CH₂)_nCOa, CH=CHCOa,
sind R^f, R^g, R^g', R^h, R^h' und R^k unabhängig voneinander ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus einem Anlagerungspunkt, H, Niederalkyl und CH₂(CH₂)_na,
ist Rⁱ ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus einem Anlagerungspunkt, H, Halogen, Niederalkyl, CN, CF₃, Phenyl, CO₂H und CONR^g'R^h',
ist R^j ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus einem Anlagerungspunkt, H, Halogen, Niederalkyl, CN, CF₃, Phenyl, CH₂CO₂H, CH₂CONR^g'R^h',
sind R¹ und R^r unabhängig voneinander ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus einem Anlagerungspunkt, H, Niederalkyl,
sind R^m, Rⁿ, R^p und R^q unabhängig voneinander ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus einem Anlagerungspunkt, H, Niederalkyl und Phenyl,
ist R^o ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus einem Anlagerungspunkt, H und Niederalkyl,
sind R^s und R^t unabhängig voneinander ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus einem Anlagerungspunkt, H, Halogen, Niederalkyl und Or^f,
sind R^u und R^v unabhängig voneinander ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus einem Anlagerungspunkt, H, Halogen, CN und NO₂,
ist R^w unabhängig ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus einem Anlagerungspunkt, H, COO^–, SO₃ ^– und PO₃ ^2–, ist Ln ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Eu³⁺, Ln³⁺ und Sm³⁺.
Chel ist ein mehrzähniger Chelator mit wenigstens 6 und vorzugsweise 8 bis 10 Donor-Atomen, die einen Hohlraum mit einem Durchmesser zwischen 4 und 6 Å besetzen können, der makrozyklisch sein kann, ein Chromophor enthält, das zwischen 300 und 400 nm absorbiert und einen Anlagerungspunkt enthält, durch den Chel an Z' oder Z'' gebunden werden kann. Ein geeigneter Chel-Rest ist ein Europium-tris-(bipyridin)-Kryptand. Bei den Anthrachinon-Chromophoren der allgemeinen Formel XXXIX kann eine jede der Positionen 1–8 einen Substituenten H oder E tragen oder als Anlagerungspunkt dienen.
Europium-tris-(bipyridin)-Kryptand-Donoren können in geeigneter Weise mit Akzeptoren der Formeln XV–XVII, XXXVI, XLVI–XLVII, LIV und LVI gepaart werden. Terbium-tris-(bipyridin)-Kryptand-Donoren können geeigneterweise mit Akzeptoren der Formeln VIII–XVIII, XXXVI– XLI und XLV–LIV und LVI gepaart werden.
Das Europium-tris-(bipyridin)-Kryptand/Phthalocyanine-Donor/Akzeptor-Paar kann besonders von Interesse sein, falls eine Messung der β-Laktamase-Aktivität durch Emission von Energie in der Nähe des Dunkelrot-Bereichs erwünscht ist. Bei vielen Anwendungen ist eine Derivatisierung der Verbindungen der allgemeinen Formel I erwünscht, damit sie hydrophob und durchgängig für Zellmembranen werden. Die Derivatisierungsgruppen sollten eine Hydrolyse innerhalb der Zellen erfahren, um die Verbindungen der allgemeinen Formel I wiederherzustellen und sie innerhalb der Zellen zu halten. Zu diesem Zweck ist es bevorzugt, dass eine jegliche phenolische Hydroxylgruppe oder freie Aminogruppe in dem Farbstoff mit C₁-C₄-Acylgruppen (z. B. Formyl, Acetyl, n-Butyl) acyliert oder zu verschiedenen anderen Estern und Carbonaten umgewandelt wird [vgl. Beispiele in Bundgaard, H., Design of Prodrugs, Elsevier Science Publishers (1985), Kapitel I, Seite 3ff.]. Phenole können auch mit 1-(Acyloxy)-alkyl-, Acylthiomethyl-, Acyloxy-alpha-benzyl-, delta-Butyrolactonyl- oder Methoxycarbonyloxymethylgruppen alkyliert werden. Im Fall von Fluoresceinen, Rhodolen und Rhodaminen ist diese Veränderung besonders hilfreich, da sie auch zu einer Umwandlung des Säurerests in diesen Farbstoffen zu dem Spirolacton führt. Für eine Verstärkung der Membrandurchdringung sollte die Carboxylgruppe an der 4-Position des Cephalosporins mit 1-(Acyloxy)-alkyl-, Acylthiomethyl-, Acyloxy-alpha-benzyl-, delta-Butyrolactonyl-, Methoxycarbonyloxymethyl-, Phenyl-, Methylsulfinylmethyl-, beta-Morpholinoethyl-, 2-(Dimethylamino)-ethyl-, 2-(Diethylamino)-ethyl- oder Dialkylaminocarbonyloxymethylgruppen verestert wer den, wie erörtert in Ferres, H. (1980), Chem. Ind. 1980: 435–440. Die bevorzugteste Esterbildende Gruppe für die Carboxylgruppe ist Acetoxymethyl.
Ein allgemeines Verfahren für die Synthese von Verbindungen der allgemeinen Formel I ist nachstehend gezeigt. Der Fachmann wird erkennen, dass die nachstehenden Verfahren für eine Vielzahl von Derivaten eingesetzt werden können und dass andere Syntheseverfahren möglich sind.
Bei diesen Verbindungen ist RG eine Nukleophil-reaktive Gruppe (z. B. Iodacetamid, Isocyanat, Isothiocyanat, usw.), Nu ist ein Nukleophil (z. B. -SH, -NH₂, -OH, usw.), R₀ ist H oder eine Estergruppe (z. B. Benzhydrylester, tertiärer Butylester, usw.), Nu₀ ist ein zweizähniges Nukleophil (z. B. NS^–, NSCH₂CH₂NH₂, Xanthat, usw.) und Hal ist ein Halogen (z. B. Chlor, Brom oder Iod).
Die Cephalosporin-Ausgangsmaterialien sind käuflich verfügbare Cephalosporinderivate 7-Aminocephalosporansäure oder 7-Amino-3'-chlorcephalosporansäure als ihre Benzhydryl- oder tertiären Butylester (R₀). Vor der Kopplung der Farbstoffe A und B, die Nukleophil-reaktive Gruppen (RG) tragen, ist es manchmal vorteilhaft, ihre phenolischen und freien Aminoreste zu verestern oder zu alkylieren. Die Reihenfolge der Bindung von Farbstoff A und Farbstoff B hängt von der Wahl der Reagenzien ab. Farbstoff A wird an das Cephalosporin über einen Alkylamid-Linker gebunden. Dies erfolgt durch Umsetzung eines Farbstoffs A, der eine Nukleophil-reaktive Gruppe (RG) trägt, mit einer bifunktionellen aliphatischen Säure (z. B. Amino-, Mercapto- oder Hydroxyalkylsäure) und Kopplung der Säure an die 7-Aminogruppe des Cephalosporins (Reaktion 1). Alternativ dazu wird der Farbstoff A, der eine nukleophile Gruppe (z. B. Amin oder Thiol) trägt, mit einer halogenierten Alkylsäure zur Reaktion gebracht und die Säure mit der 7-Aminogruppe des Cephalosporins gekoppelt (Reaktion 2). Bei beiden Reaktionen kann die Reihenfolge der zwei Reaktionen umgedreht werden. Der Farbstoff A mit einer aliphatischen Säure kann direkt an das Cephalosporin gebunden werden (Reaktion 3). Der Farbstoff B mit einem nukleophilen Substituenten kann an die 3'-Position des Cephalosporins durch direkten Austausch der verlassenden Gruppe (LG) gebunden werden (Reaktion 4). Ein Farbstoff B mit einer Nukleophil-reaktiven Gruppe kann mit einem bidentaten Nukleophil zur Reaktion gebracht werden, das sodann gebunden an das Cephalosporin durch einen Austausch der austretenden Gruppe (LG) gekoppelt wird (Reaktion 5). Die Reihenfolge der Reaktionen kann umgedreht werden.
In manchen Fällen kann es notwendig sein, die erste Reaktion mit einem zweizähnigen Nukleophil bei einer Maskierung einer seiner nukleophilen Gruppen durchzuführen. Die zweite Kopplung erfolgt dann nach Entfernung dieser Schutzgruppe. Nach Binden beider Farbstoffe wird der Cephalosporinester gespalten (falls R₀ kein Wasserstoffatom ist). Für die Herstellung membrangängiger Substrate wird die Säure sodann erneut verestert und somit Ester hergestellt, die durch die cytoplasmatische Umgebung einer Säugerzelle entschützt werden können. Für Anwendungen, bei denen kein Zell-Cytoplasma in Erscheinung tritt, wird eine jegliche verbleibende Acyl- und Alkylgruppe, die für die Maskierung von Phenolen und freien Aminen auf den Farbstoffen eingesetzt wurde, entfernt.
Bevorzugte Kombinationen von Donor- und Akzeptor-Klassen, die für eine erfindungsgemäße Verwendung geeignet sind, sind in Tabelle 1 gezeigt. Bei den Ausführungsformen mit Verbindungen der allgemeinen Formel I erfolgt bei Verwendung dieser Kombinationen ein Fluoreszenz-Resonanz-Energietransfer (FRET). Natürlich wären, wie dem Fachmann klar ist, viele andere Kombinationen von Donoren und Akzeptoren/Quenchern (einschließlich derjenigen, die Strahlung wieder aussenden und derjenigen, die dies nicht tun) für eine erfindungsgemäße Verwendung geeignet. Im allgemeinen überlappt bei geeigneten Donor- und Akzeptor-Paaren das Emissionsspektrum des Donors signifikant mit dem Exzitationsspektrum des Akzeptors.
TABELLE 1 DONOREN
Besonders interessante fluoreszente Donorreste umfassen Coumarine und Fluoresceine. Besonders interessante Quencher umfassen Fluoresceine, Rhodole und Rhodamine. Interessante Kombinationen umfassen die Verwendung eines Coumarin-Donors mit einem Fluorescein-, Rhodol- oder Rhodamin-Quencher und eines Fluorescein-Donors mit einem Rhodol- oder Rhodamin-Quencher. Spezifische interessante Kombinationen umfassen die nachstehenden: ein Coumarin (wie 7-Hydroxycoumarin) oder ein Chlorderivat davon mit einem Fluorescein oder Dichlorderivat davon, ein Fluorescein mit einem Eosin oder Tetrachiorfluorescein, ein Fluorescein mit einem Rhodolderivat und ein Rhodamin mit einem Fluorescein.
Europium-Chelatdonoren können geeigneterweise mit Akzeptoren der allgemeinen Formeln XV–XVII, XXXVI, XLVI–XLVII, LIV und LVI gepaart werden. Terbium-Chelatdonoren können geeigneterweise mit Akzeptoren der Formeln VIII–XVIII, XXXVI–XLI und XLV–LIV und LVI gepaart werden. Die Europium- und Terbium-Chelatdonoren können aufgrund ihrer sehr schmalen Emissionsspitzen und ihrer Anregungszustände mit einer Lebensdauer im Mikrosekunden- bis Millisekundenbereich besonders interessant sein, die einfach von einer Hintergrund-Fluoreszenz und einer Streuung mit einer Lebensdauer der Anregungszustände im Nanosekundenbereich oder weniger unterschieden werden können.
Bei vielen Anwendungen kann eine Derivatisierung von Verbindungen der allgemeinen Formel I erwünscht sein, um sie hydrophober und für Zellmembranen durchgängig zu machen. Die derivatisierenden Gruppen sollten innerhalb der Zelle hydrolysiert werden, um die Verbindungen der allgemeinen Formel I wiederherzustellen und sie innerhalb der Zellen einzuschließen. Für diesen Zweck ist bevorzugt, dass jede phenolische Hydroxylgruppe oder jedes freie Amin in den Farbstoffen mit C₁-C₄-Acylgruppen (wie Formyl-, Acetyl-, n-Butyrylgruppe) acyliert wird oder in verschiedene andere Ester und Carbonate umgewandelt wird [z. B. wie beschrieben in Bundgaard, H., Design of Prodrugs, Elsevier Science Publishers (1985), Kapitel 1, Seite 3ff.]. Phenole können ebenfalls mit 1-(Acyloxy)-alkyl-, Acylthiomethyl-, Acyloxy-alpha-benzyl-, delta-Butyrolactonyl- oder Methoxycarbonyloxymethylgruppen alkyliert werden. Im Fall von Fluoresceinen, Rhodolen und Rhodaminen ist eine Acylierung oder Alkylierung der freien Phenolgruppen besonders hilfreich, da es zu einer Umwandlung des Säurerests in den Farbstoffen zu einem Spirolacton führt. Für eine Verbesserung der Membrangängigkeit sollte der Carboxylrest an der 4-Position des Cephalosporins mit 1-(Acyloxy)-alkyl-, Acylthiomethyl-, Acyloxy-alpha-benzyl-, delta-Butyrolactonyl-, Methoxycarbonyloxymethyl-, Phenyl-, Methylsulfinylmethyl-, beta-Morpholinoethyl-, 2-(Dimethylamino)-ethyl-, 2-(Diethylamino)-ethyl- oder Dialkylaminocarbonyloxymethylgruppen wie in Fernes, H. (1980) Chem. Ind. 1980: 435–440 erörtert, verestert werden. Die bevorzugte veresternde Gruppe für den Carboxylrest ist Acetoxymethyl.
Das Cephalosporin-Rückgrat dient als spaltbarer Linker zwischen zwei Farbstoffen. Nach Spaltung stellt es die Ladungen bereit, die notwendig sind, um einen der zwei Farbstoffe innerhalb der Zelle zu halten. Die Farbstoffe werden in einer Weise ausgewählt, dass einer Licht bei einer Wellenlänge absorbiert (Quencher oder Akzeptor-Chromophor), bei der der andere aussendet (Donor-Fluorophor). Bei dem intakten Cephalosporin sind die zwei Farbstoffe nahe benachbart. Bei einer Anregung des Donor-Fluorophors tritt Fluoreszenz-Resonanz-Energietransfer (FRET) von dem Donor zu dem Akzeptor auf, anstelle von Donor-Fluoreszenz [Forsten, T., Ann. Physik 2: 55–75 (1948)]. Falls der Akzeptor ein nicht-fluoreszenter Farbstoff ist, wird die Energie an das Lösungsmittel abgegeben und die Donor-Fluoreszenz ausgelöscht. Falls der Akzeptor selbst ein fluoreszenter Farbstoff ist, tritt eine erneute Abstrahlung von Fluoreszenz bei der Emissionswellenlänge des Akzeptors auf. In polaren Lösungsmitteln wie Wasser können sich hydrophobe Donor- und Akzeptor-Fluorophore stapeln, falls sie durch einen kurzen flexiblen Linker getrennt sind. Aufgrund dieser Assoziierung im Grundzustand wird ein "dunkler Komplex" gebildet [Yaron, A. et al., Anal. Biochem. 95: 228–235 (1979)]. In diesem Komplex kann keines der Fluorophore Licht aussenden, was zu einer Auslöschung der Fluoreszenz von beiden Farbstoffen führt [Bojarski, C. und Sienicki, K., Energy transfer and migration in fluorescent solutions. In: Photochemistry and Photophysics, herausgegeben von Rabek, J. F., Boca Raton: CRC Press, Inc., 1990, Seiten 1–57]. In beiden Fällen tritt bei Spaltung des β-Laktams eine große Veränderung der Fluoreszenz auf, die zur Messung der β-Laktamase-Aktivität eingesetzt werden kann. Da beide Farbstoffe voneinander weg diffundieren, wird die Stapelung und der Energietransfer unterbrochen. Cephalosporine mit einem Donor- und einem Akzeptor-Farbstoft, der fluoresziert, werden hier als FRET-Cephalosporine bezeichnet.
Fluoreszenz-Resonanz-Energietransfer wurde als spektroskopisches Maß für die Messung der molekularen Entfernung in Proteinen und Peptiden eingesetzt, da er in einem Bereich von 10–100 Å wirksam ist. Dieser Energietransfer ist proportional zu der inversen sechsten Potenz der Entfernung zwischen Donor und Akzeptor. Seine Effizienz ist umso höher, je besser Donor-Emission und Akzeptor-Absorption überlappen und je länger die Dauer der Fluoreszenz des Donors ist (bei Fehlen des Akzeptors). FRET kann sehr effizient über Entfernungen von 10–20 Å sein.
In dem Cephalosporin sind die Entfernungen für eine Bindung von Donor und Akzeptor größer als 10 Å und mindestens 10 Bindungsfängen, falls man die zwei minimalen Abstandshalter (Spaten) an den 7- und 3-Positionen einbezieht. Über diese Entfernung ist FRET sehr effizient, falls die richtigen Donor-Akzeptor-Paare ausgewählt werden. Günstigerweise bleibt in einem FRET-Cephalosporin der über das 7-Amin gebundene Farbstoff an die polaren Hydrolyseprodukte nach der Spaltung des Cephalosporins gebunden, was es in dem Cyto plasma der Zelle einschließt. Diese Position wird am besten von dem Donor-Fiuorophor besetzt, obwohl in manchen Fällen der Akzeptor diese Position besetzen kann. Bei einer Spaltung erhöht sich die Fluoreszenz aufgrund des Verlusts des Quencher-Farbstoffs.
Das Akzeptor-Fluorophor ist im allgemeinen durch einen Linker gebunden, der eine höhere Stabilität des Substrats gegenüber einem nukleophilen Angriff verleiht. Ein bevorzugter Linker ist eine Thioether-Bindung (-S-), die sehr stabil ist und aufgrund ihrer induktiven Wirkung die Reaktivität des β-Laktamrings gegenüber Nukleophilen verringert [Page, M. I., Adv. Phys. Org. Chem. 23: 165–270 (1987)]. Zusätzlich löscht die bei einer Hydrolyse freigesetzte freie Thiol- oder Thiolatgruppe häufig das gebundene Fluorophor aus, was additiv zu der gewünschten großen Veränderung der Fluoreszenz bei einer Hydrolyse wirkt.
Die erfindungsgemäßen fluorogenen Substrate sind anfänglich farblos und außerhalb der Zelle nicht-fuoreszent. Die Substrate überqueren einfach Zellmembranen in das Cytoplasma, wo sie zu fluorezenten Verbindungen durch endogene, nicht-spezifische Esterasen umgewandelt werden und aufgrund ihrer Ladungen eingeschlossen bleiben. Bei den intakten Molekülen tritt Fluorszenz-Energietransfer auf und führt zu einer Fluoreszenz bei einer bestimmten Wellenlänge, falls die Substrate angeregt werden. Eine Spaltung durch Laktamase des β-Laktamrings wird von einem Ausstoß des Fluoresceinrests bei einem Verlust von Fluoreszenz-Energietransfer gefolgt. Eine Anregung des modifizierten Substrats führt nun zu einer Fluoreszenz bei einer anderen Wellenlänge.
Die erfindungsgemäßen Testsysteme stellen ferner ein vorteilhaftes und schnelles Verfahren zur Isolierung und klonalen Selektion stabil transfizierter Zelllinien bereit, die Reportergene enthalten und die erwünschten Eigenschaften, die eine Transfektion verleihen sollte, aufweisen, z. B. Reaktion mit einem fluoreszenten Signal nach Aktivierung eines transfizierten Rezeptors mit einem hohen Signal-zu-Hintergrund-Verhältnis aus einem großen Teil isolierter Zellen. Gängige Verfahren zur klonalen Selektion zufriedenstellend transfizierter, genetisch veränderter Zellen aus der anfänglichen Population erfolgen hauptsächlich durch Replika-Plattierung von Kolonien, Testen von einem Satz an Kolonien, visuelle Selektion bevorzugter Klone, manuelle Isolierung der Replikas der bevorzugten Klone durch Pipettierung und ausgedehnte Kultivierungen der Zellen. Dieses Verfahren ist arbeitsaufwendig und zeitintensiv und kann mehrere Monate erfordern, um einen Klon zu schalten, der für Tests für ein Arzneistoff-Screening geeignet ist. Ferner ist es schwierig, mehr als wenige Hundert Klone manuell zu selektieren und zu halten. Bei erfindungsgemäßen Tests kann das gewünschte Signal des zellulären β-Laktamase-Reportersystems in lebenden und lebensfähigen Zellen aufrecht erhalten werden. Replika-Plattierung von Kolonien ist nicht nötig, da einzelne Zellen getestet werden können und für eine weitere Vermehrung lebensfähig bleiben. Somit kann man aus der Population von anfänglich transfizierten Zellen schnell die wenigen, einzelnen, lebenden Zellen mit dem besten Fluoreszenzsignal mit Hilfe von automatisierten Systemen wie einem Fluoreszenzgesteuerten Zellsortierer, z. B. der Becton Dickinson FACS Vantage^TM, auswählen. Die ausgewählten Zellen werden sodann für eine Kultivierung und Vermehrung gesammelt, um eine klonale Zelllinie mit den geeigneten Eigenschaften für die Tests und das Arzneistoff-Screening zu schaffen.
Dem Fachmann ist klar, dass die Kombination eines neuen, erfindungsgemäßen Substrats und einer geeigneten β-Laktamase in einer Vielzahl verschiedener Testsysteme eingesetzt werden kann (derartige sind in der US-PS 4,740,459 beschrieben). Insbesondere ermöglichen die erfindungsgemäßen fluorogenen Substrate den Nachweis von β-Laktamase-Aktivität in einer Vielzahl biologisch wichtiger Umgebungen, wie menschliches Blutserum, zelluläres Cytoplasma und intrazelluläre Kompartimente. Dies erleichtert die Messung von periplasmatischer oder sekretierter β-Laktamase.
Ferner kann die Expression eines jeglichen Zielproteins durch Fusion eines für das Zielprotein kodierenden Gens an ein β-Laktamase-Gen nachgewiesen werden, das durch Immunofärbung und Fluoreszenz- oder Elektronenmikroskopie lokalisiert werden kann. Zum Beispiel können β-Laktamase-Fusionsproteine in dem Lumen von Organellen durch die Verwendung erfindungsgemäßer Substrate nachgewiesen werden. Nur subzelluläre Kompartimente mit dem Fusionsprotein fluoreszieren bei einer Wellenlänge, die charakteristisch für das gespaltene Substrat ist, während alle anderen bei einer Wellenlänge fluoreszieren, die für das intakte Molekül charakteristisch ist.
Sowohl das intakte als auch das gespaltene Substrat werden gut in den Zellen ohne Einsatz spezieller Maßnahmen wie Abkühlen zurückgehalten. Die Farbänderung (selbst in einzelnen, kleinen Säugerzellen) ist mit Hilfe eines Fluoreszenzmikroskops unter Verwendung normaler Farbdarstellung oder photographischer Filme erkennbar. Das Fluoreszenzsignal kann quantifiziert und weiter durch konventionelle Verfahren zur Verarbeitung eines digitalen Bilds verstärkt werden. Ferner sind die erfindungsgemäßen Tests relativ unempfindlich gegenüber vielen Artefakten wie einem veränderlichen Auslaufen von Zellen, der Quantität des Substrats, Beleuchtungsintensität, absoluter Nachweissensitivität und Ausbleichen der Farbstoffe, da eine Gen-Aktivierung nicht durch eine Veränderung einer Signalintensität, sondern durch eine Farbänderung oder eine Veränderung in dem Verhältnis zwischen beiden Intensitäten bei verschiedenen Wellenlängen nachgewiesen wird.
Eine Vielzahl von Substraten (z. B. Verbindungen der allgemeinen Formeln 17, 22 und 25) wurden hergestellt und ihre Emissionsspektren vor und nach Spaltung durch β-Laktamase aufgenommen. Diese Substrate ermöglichen einen Nachweis von β-Laktamase primär in vitro, da sie stark an Proteine im Serum und in den Zellen binden. Aufgrund ihrer Hydrophobizität stapeln sich die Fluorophore. Dies führt zu einem Verlust an Fluoreszenz bei dem intakten Substrat. β-Laktamase spaltet das Substrat und beseitigt die Stapelung, was eine Fluoreszenz ermöglicht. Verbindungen (z. B. Verbindung 11, Beispiel 1) mit einer reversen Anordnung von Donor- und Akzeptor-Fluorophor auf dem Cephalosporin zeigen ein ähnliches Fluoreszenzverhalten.
In einer bevorzugten erfindungsgemäßen Ausführungsform wurde eine Verbindung der allgemeinen Formel 1 an eine Verbindung der allgemeinen Formel 2 gekoppelt, um eine Verbindung der allgemeinen Formel 3 zu bilden. Die käuflich erhältliche Verbindung 4 wurde sodann an die Verbindung 3 mit Hilfe von Dicyclohexylcarbodiimid gekoppelt und das Produkt mit der Verbindung 5 zur Reaktion gebracht, was eine Verbindung der allgemeinen Formel 6 ergab. Eine Entschützung der Verbindung 6 schuf eine Verbindung der allgemeinen Formel 7. In beispielhaften Ausführungsformen war Acyl ein Acetylrest, R^x war ein Me-Rest und R^y war ein Wasserstoffatom (a) oder Acyl war ein Butyrylrest, R^x war ein Wasserstoffatom und R^y war ein Cl-Rest (b). R^z war ein Trimethylsilyl- oder Benzylrest.
Die Verbindungen der allgemeinen Formel 6 wurden modifiziert, um membrangängige Derivate zu erhalten, die zu den entsprechenden fluoreszenten Verbindungen der allgemeinen Formel 7 in intakten Zellen aufgrund der Aktivität von endogenen, nicht-spezifischen Esterasen umgewandelt wurden. Bei diesen Molekülen tritt Fluoreszenz-Resonanz-Energietransfer von dem 7-Hydroxycoumarinrest zu dem Fluoresceinrest auf, was zu einer Grünfluoreszenz führt, falls die Verbindungen bei etwa 400 nm angeregt werden. Nach Spaltung des β-Laktamrings führt eine Anregung des 7-Hydroxycoumarinrests zu einer Blaufluoreszenz. In beispielhaften Ausführungsformen wurde eine 25-fache Erhöhung der Fluoreszenz bei etwa 450 nm und eine 3- bis 4-fache Erhöhung der Fluoreszenz bei 515 nm beobachtet.
ÜBERWACHUNG DER GENEXPRESSION
Die erfindungsgemäßen Substrate ermöglichen die Verwendung von β-Laktamase als Reportergen für die Überwachung der Expression ausgehend von einem Satz von Expressionskontrollsequenzen. In einem Aspekt werden erfindungsgemäß Verfahren zur Überwachung der Genexpression ausgehend von einem Satz von Expressionskontrollsequenzen bereitgestellt, wobei β-Laktamase als Reportergen verwendet wird. Eine Zelle wird bereitgestellt, die mit einem rekombinanten Nukleinsäuremolekül transfiziert worden war, das die Expressionskontrollsequenzen in funktioneller Verbindung zu Nukleinsäuresequenzen umfasst, die für die Expression von β-Laktamase kodieren.
Rekombinante Nukleinsäuren
Der Begriff "Nukleinsäuremolekül" umfasst hier DNA- und RNA-Moleküle. Man wird einsehen, dass auch RNA-Moleküle mit der entsprechenden RNA-Sequenz, wobei "T" durch "U" ersetzt ist, umfasst sind, falls davon gesprochen wird, dass ein Nukleinsäuremolekül eine DNA-Sequenz besitzt. Der Begriff "rekombinantes Nukleinsäuremolekül" betrifft ein Nukleinsäuremolekül, das nicht natürlicherweise auftritt und zwei Nukleotidsequenzen umfasst, die natürlicherweise nicht miteinander verbunden sind. Rekombinante Nukleinsäuremoleküle werden durch künstliche Kombination geschaffen, z. B. durch genetische Veränderung oder chemische Synthese.
Nukleinsäuren, die für β-Laktamasen kodieren, können durch bekannte Verfahren erhalten werden, z. B. durch Polymerase-Kettenreaktion von cDNA unter Verwendung von Primern, die auf der in 1 gezeigten DNA-Sequenz basieren. PCR-Verfahren sind z. B. in der US-PS Ni. 4,683,195; in Mullis et al. (1987), Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 51: 263 und in Ehrlich, Hrsg., PCR Technology (Stockton Press, NY, 1989) beschrieben.
Die Herstellung von Expressionsvektoren und die Expression von Genen in transfizierten Zellen umfasst die Verwendung von bekannten Verfahren der molekularen Klonierung; vgl. Sambrook et al., Molecular Cloning – A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1989) und Current Protocols in Molecular Biology, F. M. Ausubel et al., Hrsg. (Current Protocols, eine Zusammenarbeit zwischen Greene Publishing Associates, Inc. und John Wiley & Sons, Inc. (neueste Ergänzung)).
Nukleinsäuren, die für die Transfektion von Zellen mit Sequenzen, die für die Expression des interessierenden Polypeptids kodieren, verwendet werden, werden im allgemeinen in Form eines Expressionsvektors vorliegen, der Expressionskontrollsequenzen umfasst, die funktio nell mit einer Nukleotidsequenz verbunden sind, die für die Expression des Polypeptids kodiert. Der Begriff "Nukleotidsequenz, die für die Expression eines Polypeptids kodiert" betrifft eine Sequenz, die bei Transkription und Translation von mRNA das Polypeptid schafft. Wie dem Fachmann bekannt ist, umfasst dies alle degenerierten Nukleinsäuresequenzen, die für die gleiche Aminosäuresequenz kodieren. Dies kann auch Sequenzen umfassen, die z. B. Introns enthalten. Der Begriff "Expressionskontrollsequenzen" betrifft hier Nukleinsäuresequenzen, die die Expression einer Nukieinsäuresequenz, mit der sie funktionell verbunden sind, regulieren. Expressionskontrollsequenzen sind mit einer Nukieinsäuresequenz "funktionell verbunden", falls die Expressionskontrollsequenzen die Transkription und, soweit geeignet, die Translation der Nukieinsäuresequenz kontrollieren und regulieren. Somit können Expressionskontrolsequenzen geeignete Promotoren, Enhancer, Transkriptions-Terminatoren, ein Startkodon (d. h. ATG) vor einem für das Protein kodierenden Gen, Splice-Signale für Introns, Aufrechterhaltung des richtigen Leserahmens des Gens für eine richtige Translation der mRNA und Stopp-Kodons umfassen.
Die rekombinante Nukleinsäure kann in einen Expressionsvektor eingebaut werden, der Expressionskontrollsequenzen umfasst, die funktionell mit der rekombinanten Nukleinsäure verbunden sind. Der Expressionsvektor kann für eine Funktion in Prokaryonten oder Eukaryonten durch Einbau geeigneter Promotoren, Replikationssequenzen, Marken, usw. angepasst sein.
Die für die Transfektion der Zelle verwendete rekombinante Nukleinsäure enthält Expressionskontrollsequenzen, die funktionell mit einer für β-Laktamase kodierenden Nukleotidsequenz verbunden sind. Die kodierte β-Laktamase kann eine jede bekannte oder hier beschriebene sein und umfasst z. B. die in 7 gezeigten Enzyme.
Die Erfindung stellt neue rekombinante Nukleinsäuremoleküle bereit, die Expressionskontrollsequenzen umfassen, die für eine Funktion in einer Nicht-Säugereukaryontischen Zelle angepasst wurden und funktionell mit einer Nukleotidsequenz verbunden sind, die für die Expression einer cytosolischen β-Laktamase kodiert. Der Begriff "cytosolische β-Laktamase" betrifft hier eine β-Laktamase ohne Aminosäuresequenzen für eine Sekretion aus der Zelle, z. B. eine Signalsequenz. Zum Beispiel wurde in dem Polypeptid mit der Sequenz 1 in 7 die Signalsequenz durch die Aminosäuren Met-Ser ersetzt. Dementsprechend verbleibt diese β-Laktamase bei einer Expression in der Zelle.
Die Erfindung stellt rekombinante Nukleinsäuremoleküle bereit, einschließlich Expressionskontrollsequenzen, die für eine Funktion in einer eukaryontischen Säugerzelle angepasst wurden und funktionell mit einer Nukleotidsequenz verbunden sind, die für die Expression einer β-Laktamase kodiert.
Es ist weiter bevorzugt, dass die Ribosomen-Bindestelle und die Nukleotidsequenz, die für die Expression der β-Laktamase kodiert, Sequenzen enthalten, die von Säugerzellen bevorzugt werden. Derartige Sequenzen verbessern eine Expression der β-Laktamase in Säugerzellen. Bevorzugte Sequenzen für eine Expression in Säugerzellen sind z. B. in Kozak, M., J. Cell Biol. 108: 229–241 (1989) beschrieben und werden hier als "Kozak-Sequenzen" bezeichnet. Die Nukleotidsequenz für cytosolische β-Laktamase in der Sequenz 3 der 7 enthält Kozak-Sequenzen für die Nukleotide -9 bis 4 (GGTACCACCATGA).
Bei einer Verwendung in Säugerzellen werden die Expressionskontrollsequenzen für eine Funktion in Säugerzellen angepasst. Das erfindungsgemäße Verfahren ist für das Testen der Expression von einem jeglichen gewünschten Satz an Expressionskontrollsequenzen einsetzbar. Insbesondere kann die Expression durch induzierbare Expressionskontrollsequenzen getestet werden. "Induzierbare Expressionskontrollsequenzen" betrifft hier Expressionskontrollsequenzen, die auf biochemische Signale entweder durch Erhöhung oder durch Verringerung der Expression von Sequenzen, mit denen sie funktionell verbunden sind, reagieren. Zum Beispiel umfassen im Fall von Steroidhormon-induzierten Genen die Expressionskontrollsequenzen Hormon-Reaktionselemente. Die Bindung eines Steroidhormon-Rezeptors an das Reaktionselement induziert eine Transkription des mit diesen Expressionskontrollsequenzen funktionell verbundenen Gens. Expressionskontrollsequenzen für viele Gene und insbesondere für induzierbare Gene wurden isoliert und sind bekannt. Erfindungsgemäß können auch konstitutiv aktive Expressionskontrollsequenzen eingesetzt werden.
Die transfizierte Zelle wird unter den Bedingungen, unter denen eine Expression von β-Laktamase durch die Expressionskontrollsequenzen getestet werden soll, inkubiert. Die Zelle oder ein Extrakt der Zelle werden mit einem erfindungsgemäßen β-Laktamase-Substrat unter ausgewählten Testbedingungen und für einen Zeitraum, der eine Umsetzung des Substrats durch eine exprimierte β-Laktamase ermöglicht, in Kontakt gebracht. Sodann wird der Donor-Rest aus dieser Probe mit geeigneter ultravioletter oder sichtbarer Strahlung angeregt. Der Grad an Fluoreszenz-Resonanz-Energietransfer in der Probe wird gemessen.
Falls die Zelle keine β-Laktamase exprimierte, wird nur wenig Substrat gespalten worden sein, die Effizienz von FRET in der Zelle wird hoch sein und die Fluoreszenzcharakteristika der Zelle oder Probe davon werden diese Effizienz widerspiegeln. Falls die Zelle eine große Menge β-Laktamase exprimierte, wird ein Großteil des Substrats gespalten werden. In diesem Fall ist die FRET-Effizienz gering, was eine große Menge oder hohe Effizienz des Spaltenzyms im Vergleich zur Syntheserate des fluoreszenten Tandem-Proteinkonstrukts widerspiegelt. In einem Aspekt kann dieses Verfahren für den Vergleich von mutanten Zellen eingesetzt werden, um zu identifizieren, welche eine höhere oder geringere enzymatische Aktivität besitzen. Solche Zellen können durch ein Sortiergerät für fluoreszente Zellen basierend auf der Fluoreszenz sortiert werden.
Es wird den Fachleuten klar sein, die in einem Gebiet arbeiten, in dem auf Zellen basierende Reportergentests für ein Screening von Proben oder Proben-Pools (wie Verbindungen (kombinatorisch oder synthetisch), natürliche Produktextrakte oder Extrakte von marinen Tieren) für die Identifizierung möglicher Arzneistoffkandidaten, die als Agonisten, inverse Agonisten oder Antagonisten des zellulären Signalsystems oder der Aktivierung eingesetzt werden, dass die Kombination von Zellen (vorzugsweise von Säugern), die für eine Expression von β-Laktamase unter Kontrolle von verschiedenen regulatorischen Elementen/Promotoren genetisch verändert wurden, und die Verwendung der neuen erfindungsgemäßen β-Laktamase-Substratverbindungen entscheidende Vorteile gegenüber bekannten Reportergenen (einschließlich in nicht begrenzender Weise Chloramphenicolacetyl-Transferase, Glühwürmchen-Luciferase, bakterielle Luciferase, Luciferase von Vargula, Aequorin, beta-Galactosidase, alkalische Phosphatase) und ihren jeweiligen Substraten bieten werden.
Durch die Auswahl geeigneter regulatorischer Elemente und Promotoren für eine Kontrolle der Expression von β-Laktamase können Tests für den Nachweis oder die Messung der Fähigkeit von Testsubstanzen, funktionelle Reaktionen intrazellulärer Hormonrezeptoren auszulösen oder zu hemmen, geschaffen werden. Diese umfassen Expressionskontrolisequenzen, die gegenüber einer Induktion durch Mineralkortikosteroide, einschließlich Dexamethason [J. Steroid Biochem. Molec. Biol., Bd. 49, Nr. 1 1994, Seiten 31–3], Glukokortikoid- und Thyroid-Hormonrezeptoren [wie in der US-PS 5,071,773 beschrieben] reaktiv sind. Weitere derartige intrazelluläre Rezeptoren umfassen Retinoide, Vitamin D3 und Vitamin A [Leukemia, Bd. 8, Ergänzung 3, 1994, Seiten S1–S10, Nature Bd. 374, 1995, Seiten 118– 119, Seminars in Cell Biol., Bd. 5, 1994, Seiten 95–103]. Eine Spezifität würde durch die Verwendung des geeigneten Promotor/Enhancer-Elements ermöglicht werden. Außerdem können durch die Wahl anderer regulatorischer Elemente oder spezifischer Promotoren Arz- neistoffe, die eine Expression spezifischer Gene beeinflussen, identifiziert werden. Solche Arzneistoffe könnten auf bestimmte Signalmoleküle wie Kinasen, Transkriptionsfaktoren oder Moleküle wie Signaltransducer und Transkriptionsaktivatoren wirken [Science, Bd. 264, 1994, Seiten 1415–1421, Mol. Cell Biol, Bd. 16, 1996, Seiten 369–375]. Spezifische Promotoren von Mikroben oder Viren, die mögliche Arzneistoffziele sind, können auch in derartigen Testsystemen getestet werden.
Es können auch durch die Wahl von Promotoren wie c-fos oder c-jun [ US-PS 5,436,128 ; Proc., Natl. Acad. Sci. Bd. 88, 1991, Seiten 5665–5669] oder Promotor-Konstrukten, die auf second messenger reagierende regulatorische Elemente enthalten [Oncogene 6: 745–751 (1991)] (einschließlich cyclisches AMP-reaktive Elemente, Phorbolester-reaktives Element (reaktiv gegenüber Aktivierung durch Proteinkinase C), Serum-Reaktionselement (reaktiv gegenüber Proteinkinase C-abhängigen und -unabhängigen Wegen) und nukleärer Faktor von aktivierten T-Zellen-Reaktionselement (reaktiv auf Calcium)) für die Kontrolle der Expression von β-Laktamase, Tests geschaffen werden, um Substanzen oder Gemische von Substanzen nachzuweisen oder zu messen, die Rezeptoren der Zelloberfläche modulieren, einschließlich in nicht begrenzender Weise die nachstehenden Klassen: Rezeptoren der Cytokin-Superfamilie wie Erythropoetin, Wachstumshormon, Interferone und Interleukine (andere als IL-8) und Kolonie-stimulierende Faktoren; G-Protein-gekoppelte Rezeptoren [ US-PS 5,436,128 ] für Hormone wie Calcitonin, Epinephrin oder Gastrin, pankrine oder autokrine Mediatoren wie Somatostatin oder Prostaglandine und Neurotransmitter wie Norepinephrin, Dopamin, Serotonin oder Acetylcholin; Tyrosinkinase-Rezeptoren wie Insulin-Wachstumsfaktor, Nervenwachstumsfaktor [ US-PS 5,436,128 ]. Ferner können Tests für die Identifizierung von Substanzen erstellt werden, die die Aktivität von spannungsabhängigen oder Liganden-abhängigen Ionenkanälen modulieren, wobei die Modulation die zelluläre Konzentration an second messengern, insbesondere Calcium [ US-PS 5,436,128 ] verändert. Tests können unter Verwendung von Zellen erstellt werden, die intrinsisch den interessierenden Promotor, Rezeptor oder Ionenkanal exprimieren oder in die das geeignete Protein gentechnisch eingebracht wurde.
Die Expressionskontrollsequenzen können auch gegenüber Substanzen reaktiv sein, die Rezeptoren der Zelloberfläche oder intrazelluläre Rezeptoren modulieren.
Für die Messung, ob eine Substanz oder ein Substanzgemisch extrazelluläre oder intrazelluläre Rezeptoren oder andere zelluläre Reaktionen aktiviert, werden Zellen, die eine durch ein gewünschtes Promotor/Enhancer-Element kontrollierte β-Laktamase enthalten, mit der/den Test-Substanzen) inkubiert, Substrat sodann hinzugegeben und nach einem bestimmten Zeitraum das Fluoreszenzsignal bei einem oder zwei Anregungs-Emissions-Paaren, die für die ausgewählte erfindungsgemäße Verbindung geeignet sind, gemessen (z. B. die Verbindung CCF2 mit Wellenlängenpaaren von nahe 400 nm und nahe 450 nm und nahe 405 nm und nahe 510 nm). Dieses Fluoreszenzergebnis wird mit Kontrollproben, die keiner Behandlung mit dem Stoff unterzogen wurden und, soweit möglich, mit Kontrollproben mit einem bekannten Hemmstoff und einem bekannten Aktivator verglichen. Die Wirkung eines jeglichen aktiven Stoffs wird sodann mit Hilfe des Verhältnisses des bei den Proben gemessenen Fluoreszenzsignals zu den Signalen, die ohne Behandlung mit dem Stoff gemessen wurden, bestimmt. Die Tests erfolgen in den Löchern einer Mikrotiterplatte, die 96 oder mehr Löcher enthält, oder in einem Testsystem ohne Kompartimente wie eine Gelmatrix oder eine feuchte Membran. Ein Nachweis kann z. B. mit Fluorimetern für Mikrotiter platten, wie einem Millipore Cytofluor, oder mit Bilddarstellungsvorrichtungen, die zur Analyse von einem oder mehreren Löchern oder einem oder mehreren Testpunkten in einem bestimmten Oberflächenbereich fähig sind, z. B. von Astromed, erfolgen. Die Fähigkeit, das Substrat im Cytoplasma lebender Zellen zurückzuhalten, ist vorteilhaft, da es eine Verringerung der Signalinterferenz von gefärbten oder auslöschenden Substanzen in dem Testmedium ermöglichen kann. Ferner kann das Fluoreszenzsignal der erfindungsgemäßen Verbindungen wie CCF2 einfach in einzelnen Zellen nachgewiesen werden, was somit eine Miniaturisierung des Tests und eine höhere Anzahl an Tests pro Oberflächenbereich ermöglicht. Miniaturisierte Tests erhöhen auch weiter den Durchsatz eines Bild-Nachweissystems, da mehrere Proben in das Bildfeld passen.
Die erfindungsgemäßen Testsysteme stellen ferner ein vorteilhaftes und schnelles Verfahren zur Isolierung und klonalen Selektion stabil transfizierten Zelllinien bereit, die Reportergene enthalten und die gewünschten Eigenschaften aufweisen, die die Transfektion verleihen sollte, z. B. Reaktion durch Fluoreszenzsignal nach Aktivierung eines transfizierten Rezeptors mit einem hohen Signal-zu-Hintergrund-Verhältnis von wenigstens 10 : 1 aus einem großen Teil isolierter Zellen. Gebräuchliche Verfahren für eine klonale Selektion zufriedenstellend transfizierter, genetisch veränderter Zellen aus der anfänglich mit den interessierenden Vektoren transfizierten Population erfolgen hauptsächlich manuell und umfassen mehrere Runden einer mikroskopischen Analyse, wobei der visuell bevorzugte Klon ausgewählt wird, eine Isolierung des Klons durch manuelles Pipettieren und zeitintensive Kultivierungen der Zellen. Dieses Verfahren ist arbeitsaufwendig und zeitintensiv. Mehrere Monate können für die Schaffung eines Klons erforderlich sein, der in für das Arzneistoff-Screening geeigneten Tests einsetzbar ist. Ferner ist es schwierig, mehr als wenige Hundert Klone manuell zu selektieren und aufrecht zu erhalten. Mit Hilfe der erfindungsgemäßen Tests kann das gewünschte Signal des zellulären β-Laktamase-Reportersystems in lebenden und lebensfähigen Zellen aufrechterhalten werden. Somit ist eine rasche Selektion aus der Population anfänglich transfizierten Zellen von den wenigen lebenden Zellen mit dem besten Fluoreszenzsignal mit Hilfe automatisierter Instrumente wie einem fluoreszenzgesteuerten Zellsortierer, z. B. dem Becton Dickinson FACS Vantage, möglich. Die selektierten Zellen werden sodann für eine Kultivierung und Vermehrung gesammelt, um eine klonale Zelllinie mit den gewünschten Eigenschaften für die Tests und das Arzneistoff-Screening zu schaffen.
Zusätzlich kann das Auftreten (z. B. in menschlichem Serum, Eiter oder Urin) von Bakterien, die gegenüber β-Laktam-Antibiotika resistent sind, einfach mit Hilfe der erfindungsgemäßen Substrate nachgewiesen werden. Nur bei Auftreten einer aktiven β-Laktamase erfolgt eine Änderung des Fluoreszenzspektrums von dem des intakten Moleküls zu einem, das für das Spaltprodukt charakteristisch ist. Die erfindungsgemäßen Substrate sind besser als die chromogenen Substrate Nitrocephin und PADAC des Stands der Technik, da die erfindungsgemäßen Substrate gegenüber menschlichem Serum stabil sind. Die neuen Substrate sind auch sensitiver als das chromogene Substrat CENTA, da sie ein viel kleineres optisches Hintergrundsignal aus menschlichem Serum und eine geringere Nachweisgrenze für die Fluoreszenz gegenüber der Absorption aufweisen.
Die Erfindung wird deutlicher durch die begleitenden Beispiele, die der Veranschaulichung dienen und nicht begrenzend für den Umfang der Erfindung, der durch die beigefügten Ansprüche bestimmt wird, aufzufassen sind.
MESSUNGEN
Der Grad an FRET kann durch ein jegliches spektrales oder Fluoreszenz-Lebensdauer-Charakteristikum des angeregten Konstrukts bestimmt werden, z. B. durch Bestimmung der Intensität des Fluoreszenzsignals des Donors, der Intensität des Fluoreszenzsignals des Akzeptors, des Verhältnisses der Fluoreszenzamplituden in der Nähe der Emissionsmaxima des Akzeptors im Vergleich zu den Fluoreszenzamplituden in der Nähe des Emissionsmaximums des Donors oder der Lebensdauer des angeregten Zustands des Donors. Zum Beispiel erhöht eine Spaltung des Linkers die Fluoreszenzintensität des Donors, verringert die Fluoreszenzintensität des Akzeptors, verringert das Verhältnis der Fluoreszenzamplituden des Akzeptors zu der des Donors und erhöht die Lebensdauer des angeregten Zustands des Donors.
Vorzugsweise werden Veränderungen im Ausmaß an FRET als Funktion der Veränderung des Verhältnisses der Menge an Fluoreszenz der Donor- und Akzeptor-Reste bestimmt, ein Verfahren, das als "Verhältnisbildung" ("Ratioing") bezeichnet wird. Veränderungen in der absoluten Substratmenge, Anregungsintensität und Trübheit oder anderen Hintergrund-Absorptionen in der Probe bei der Anregungswellenlänge beeinflussen die Fluoreszenzintensitäten sowohl des Donors als auch des Akzeptors etwa gleichermaßen. Daher ist das Verhältnis der zwei Emissionsintensitäten ein genaueres und bevorzugtes Maß der Spaltung als eine der beiden Intensitäten allein.
Die Lebensdauer des Anregungszustands des Donor-Rests ist in ähnlicher Weise unabhängig von der absoluten Substratmenge, Anregungsintensität oder Trübheit oder von anderen Hintergrund-Absorptionen. Seine Messung erfordert eine Ausrüstung mit einer Zeitauflösung im Nanosekundenbereich, mit der Ausnahme von Lanthanid-Komplexen, bei denen eine Auflösung im Mikrosekunden- bis Millisekundenbereich ausreichend ist.
Zusätzliche geeignete Chel-Reste sind beschrieben in Vallarino, L. M. & Leif, R. C., in der US-PS 5,373,093; in Sabbatini, N. et al., Pure and Applied Chem. 67: 135–140 (1995); Mathis, G., Clinical Chem. 41: 1391–1397 (1995); Horiguchi, D., Chem. Pharm. Bull. 42: 972–975 (1994); Takalo, N. et al., Bioconjugate Chem. 5: 278–282 (1994); Saha, A. K. et al., J. Amer. Chem. Soc. 115: 11032 (1993); Li, M. & Selvin, P. R., J. Amer. Chem. Soc. 117: 8132–8138 (1995).
Die Fluoreszenz in einer Probe wird mit Hilfe eines Fluorimeters gemessen. Im allgemeinen tritt die Anregungsstrahlung aus einer Anregungsquelle mit einer ersten Wellenlänge durch optische Einrichtungen der Anregung. Die optischen Einrichtungen der Anregung bewirken eine Anregung der Probe durch die Anregungsstrahlung. In Reaktion darauf emittieren fluoreszente Proteine in der Probe Strahlung mit einer Wellenlänge, die zu der Anregungswellenlänge verschieden ist. Optische Sammelvorrichtungen sammeln sodann die Emission aus der Probe. Die Vorrichtung kann ein Temperatursteuergerät für das Halten der Probe bei einer bestimmten Temperatur während einer Abtastung umfassen. Gemäß einer Ausführungsform bewegt ein Vielfach-Achsen-Translationstisch eine Mikrotiterplatte, die mehrere Proben enthält, um verschiedene Löcher für eine Exposition in Position zu bringen. Der Vielfach-Achsen-Translationstisch, das Temperatursteuergerät, eine Autofokussierungseinrichtung und elektronische Einrichtungen, die mit einer Darstellung und Datensammlung in Verbindung stehen, können durch einen geeigneterweise programmierten Digitalcomputer gesteuert werden. Der Computer kann die während des Tests gesammelten Daten in ein anderes Darstellungsformat umwandeln.
Verfahren zur Durchführung von Tests mit fluoreszenten Materialien sind bekannt und sind beispielsweise beschrieben in Lakowicz, J. R., Principles of Fluorescence Spectroscopy, New York, Plenum Press (1983); Herman, B., Resonance energy transfer microscopy, in: Fluorescence Microscopy of Living Cells in Culture, Teil B, Methods in Cell Biology, Bd. 30, Hrsg. Taylor, D.L. & Wang, Y.-L., San Diego, Academic Press (1989), Seiten 219–243; Turro, N. J., Modem Molecular Photochemistry, Menlo Park, Benjamini/Cummings Publishing Co., Inc. (1978), Seiten 296–361.
BEISPIELE
Die gesamte Silicagel-Chromatographie erfolgte mit Silicagel (Merck, Güte 60, Maschenweite 230–400, 60 Å) von Aldrich. Bakerbond-Octadecyl von J. T. Baker wurde für die C₁₈-Reverse-Phase-Chromatographie eingesetzt. Lösungsmittel (Güte für hochauflösende Flüssigkeitschromatographie) wurden für die Chromatographie in käuflicher Form verwendet oder für synthetische Zwecke- über aktivierte Molekularsiebe (3 Å) getrocknet.
Fluoreszenzanregungs- und -emissionsspektren wurden auf einem Spex Fluorolog 111 oder auf einem K2-Fluorimeter (ISS, Champaigne, IL) im Verhältnis-Modus mit einem Rhodamin B-Quantumzähler gemessen. Die Effizienz des Fluoreszenz-Energietransfers wurde aufgrund der Veränderung der integrierten Fluoreszenzemission bei der Emissionswellenlänge des Donors nach Behandlung mit β-Laktamase bestimmt. Für die Fluoreszenzmikroskopie wurden zwei verschiedene Bilddarstellungssysteme verwendet. Eines mit einem invertierten Fluoreszenzmikroskop, Zeiss IM-35 (Thornwood, NY ), das an eine SIT (Silicon-intensified-Target)-Kamera (Dage-MTI, Michigan City, IN) gekoppelt ist, wurde detailliert beschrieben [Tsien, R. Y. (1986), New tetracarboxylate chelators for fluorescence measurement and photochemical manipulation of cytosolic free calcium concentrations, in: Optical Methods in Cell Physiology, Hrsg. de Weer, P. & Salzberg, B., New York, Wiley, Seiten 327–345; Tsien und Harootunian (1990), Cell Calcium 11: 93–109]. Das andere bestand aus einer gekühlten, ladungsgekoppelten (CCD) Kamera (Photometrics, Tucson, AZ), die an ein invertiertes Fluoreszenzmikroskop (Zeiss Axiovert) angeschlossen war.

Fluoreszenz-Resonanz-Energietransfer wurde durch Überwachung des Verhältnisses der Fluoreszenzintensitäten bei den Emissionswellenlängen des Donors und Akzeptors mit Hilfe käuflich erhältlicher Filter (Omega Optical) gemessen.

Anregung	360 DF 40, dichriotischer Spiegel 390 DCLP
	oder 405 DF 15, dichriotischer Spiegel 420 DRLPO2
Emission	450 DF 65 (Donor-Emission)
	515 EFLP (Akzeptor-Emission)
	435 EFLP (für die gleichzeitige Darstellung von Donor- und Akzeptor-Fluoreszenz).

Beispiel 1 (Verbindung 11)
Für das Testen der optischen Eigenschaften eines Cephalosporins mit zwei gebundenen Farbstoffmolekülen wurde die nachstehende Modellverbindung synthetisiert.
Im ersten Syntheseschritt wurde 7-Aminocephalosporansäure in ein bifunktionelles Cephalosporin umgewandelt, das einen Thiolrest in der 3'-Position und den 7-Aminorest trägt [Van Heyningen, E. und Brown, C. N., J. Med. Chem. 8: 174–181 (1965); Japanisches Patent, Kokai 75/18494, CA 85, 97320d]. Dieses Cephalosporin wurde sodann selektiv mit einem Thiol-reaktiven Farbstoff zur Reaktion gebracht, gefolgt von einem mit einem Amin reaktiven Farbstoff. Der Thiol-reaktive Farbstoff 5,(6)-Iodacetamidfluorescein und der Amin-reaktive Farbstoff 5,(6)-Carboxy-N,N,N',N'-tetramethylrhodaminsuccinimid wurden an das Cephalosporin in wässrigem Dimethylformamid bei pH 8 gekoppelt. Das Produkt wird als RCF bezeichnet.
In Phosphatpuffer bei pH 7 ist RCF scheinbar nicht fluoreszent. Weder Fluoreszein noch Rhodamin zeigen eine große Fluoreszenz bei einer Anregung an ihren jeweiligen Anregungsmaxima, was auf eine Stapelung der Chromophore hinweist ("dunkler Komplex"). Nach einer Langzeitbehandlung mit β-Laktamase wird das β-Laktam gespalten, was zu einer Fluoreszenz beider Farbstoffe führt (1(a) und 1(b)). Dieses Experiment bestätigt, dass eine Messung einer durch β-Laktamase katalysierten Hydrolyse des β-Laktams in Cephalosporinen durch den Verlust an Fluoreszenzauslöschung mit Hilfe eines geeigneten Donor-Akzeptor-Paars möglich ist.
Beispiel 2
Der Thiomethyl-Linker wurde durch Umwandlung von 5-Fluoresceinamin zu 5-Mercaptofluorescein mit Hilfe von Diazotierung, Umwandlung in das Ethylxanthat und Abbau des Xanthats durch wässrige Säure zu dem freien Sulfhydryl eingebracht. Er wurde an 7-Bromacetamidcephalosporansäure durch nukleophilen Austausch des Bromids durch die Mercaptogruppe des Fluoresceins gekoppelt. 7-Bromacetamidcephalosporansäure wurde aus 7- Aminocephalosporansäure und Bromacetylbromid hergestellt [Bunnell, C. A. et al., Industrial manufacture of cephalosporins. In: Beta-Lactam Antibiotics for Clinical Use. Series: Clinical Pharmacology, Bd. 4, herausgegeben von Queener, S. F., Webber, J. A. und Queener, S. W., New York: M. Dekker, 1986, Seiten 255–283).
Für die Herstellung von 7β-[(5-Diacetylfluorescein)-thio]acetamido-3-(acetoxymethyl)-3-cephem-4-carboxylsäure (14) wurden 130 mg (0,29 mmol) 5-Fluoresceinthioldiacetat in 10 ml Dimethylformamid unter Stickstoff gelöst und zu 120 mg (0,31 mmol) 7β-Bromacetamido-3-(acetoxymethyl)-3-cephem-4-carboxylsäure in 10 ml auf pH 8,0 eingestellten 1 M Kaliumphosphatpufter hinzugegeben. Die Lösung wurde 8 Stunden bei Raumtemperatur gerührt und sodann die Lösungsmittel unter vermindertem Druck entfernt. Der Rest wurde in 10 ml Wasser gelöst und der pH der Lösung vorsichtig auf pH 5 mit verdünnter Phosphorsäure eingestellt. An diesem Punkt fielen nicht-polare Nebenprodukte aus und wurden durch Zentrifugation entfernt. Eine weitere Ansäuerung auf pH 2,7 fällte die Titelverbindung aus, die durch Zentrifugation gewonnen, dreimal mit 2 ml Diethylethertetrachlormethan (1 : 2) gewaschen und unter vermindertem Druck getrocknet wurde. ¹H-NMR (CDCl₃): δ 2,08 ppm (s, 3H, Acetat), δ 3,36 ppm, 3,53 ppm (2d, 2H, J = 17,3 Hz, C-2), δ 3,87 ppm (s, 2H, Seitenketten-Methylen), δ 4,88 ppm, 5,16 ppm (2d, 2H, J = 13,6 Hz, C-3'), δ 4,96 ppm (d, 1H, J = 4,9 Hz, C-6), δ 5,81 ppm (dd, 1H, J₁ = 8,2 Hz, J₂ = 4,9 Hz, C-7), δ 6,85 ppm (m, 4H, Xanthen), δ 7,10 (s, 2H, Xanthen), δ 7,15 ppm (d, 1H, J = 8,2 Hz, Amid), δ 7,69 ppm (d, 1H, J = 8,2 Hz, Phthalsäure), δ 7,91 ppm (d, 1H, J = 8,2 Hz, Phthalsäure), δ 8,11 ppm (s, 1H, Phthalsäure).
5-Fluoresceinamin wurde für die Herstellung von 5-Eosinamin bromiert, das in 5-Mercaptoeosin in einer zu dem 5-Mercaptofluorescein ähnlichen Weise umgewandelt wurde. Durch einen nukleophilen Austausch des Cephalosporin-Acetats durch 5-Mercaptoeosindiacetat wurde das FRET-Cephalosporin als geschütztes Tetraacetylderivat gebildet.
Für die Herstellung von 5-Eosinamin wurden 1,74 g (5 mmol) 5-Fluoresceinamin in 30 ml Eisessig suspendiert und 2,06 ml (40 mmol, 100%iger Überschuss) Brom hinzugegeben. Durch Zugabe von Brom ging das Fluoresceinamin in Lösung. Die Lösung wurde 6 Stunden bei 90°C erhitzt und währenddessen begann sich ein weißer Niederschlag zu bilden. Eine eisgekühlte Kühlfalle, die an die Flasche angebracht war, verhinderte ein Verdampfen des Broms. Überschüssiges Brom wurde sodann durch Destillation in eine mit flüssigem Stickstoff gekühlte Sammelflasche wiedergewonnen. Ein Volumen Wasser wurde zu der Essigsäurelösung hinzugegeben, um ein jegliches in der Lösung verbleibendes Produkt auszufällen. Der Niederschlag wurde durch Filtration gewonnen und in 1 N wässrigem Natriumhydroxid gelöst. 5-Eosinamin wurde als freies Amin durch Zugabe von Eisessig ausgefällt. Das Eosinamin wurde in wenig Chloroform gelöst und Methanol hinzugegeben. Eine Konzentrierung dieser Lösung auf einem Rotationsverdampfer ergab 2,56 g (3,85 mmol, 77%) Eosinamin als feines, weißes Pulver (das Eosinamin-Spirolacton).
Für die Herstellung von 5-Eosinethylxanthatdiacetat wurden 670 mg (1 mmol) 5-Eosinamin in 2 ml konzentrierter Schwefelsäure und 2 ml Eisessig gerührt. Die Suspension wurde mit einem Eis-Salz-Bad auf wenige Grad unter 0°C abgekühlt, was eine dicke Paste ergab, die schwierig zu rühren war 200 mg (2,9 mmol) Natriumnitrit in 1 ml Wasser wurden tropfenweise während 1 Stunde hinzugegeben. Nach weiteren 2 Stunden bei 0°C wurden langsam 20 g Eis hinzugegeben. Die Flasche wurde auf eine Pumpe mit einem starken Vakuum kühlgestellt, um überschüssige nitrose Gase zu entfernen (Gefahr!!). Eine gesättigte eiskalte wässrige Natriumhydrogencarbonatlösung wurde hinzugegeben, bis sich die Feststoffe in der dunkelroten Lösung auflösten. 200 mg (1,2 mmol) Kaliumethylxanthat wurden hinzugegeben und ein pinkfarbener Niederschlag bildete sich (5-Eosindiazoniumxanthat). Wenige Nickel(II)-chlorid-Kristalle katalysierten die Umlagerung des Diazoniumsalzes unter Stickstoffentwicklung. Sobald die Stickstoffentwicklung abgebrochen war, wurden die Produkte mit 1 N Chlorwasserstoffsäure gefällt. Das Präzipitat wurde durch Filtration gesammelt und unter vermindertem Druck getrocknet. Es wurde mit Essigsäureanhydrid-Pyridin (1 : 1) 1 Stunde bei 40°C behandelt. Nach Entfernung der Reagenzien unter vermindertem Druck wurde der Rest über Silicagel mit Ethylessigsäure-Hexan (1 : 4) als Elutionsmittel chromatographisch aufgetrennt. Das gewünschte Produkt eluierte zuerst. Die Ausbeute betrug 110 mg (0,13 mmol, 13%) der Titelverbindung als weißes Pulver.
Für die Herstellung des Disulfid-Dimers von 5-Eosinthioldiacetat (Dimer von 15) wurden 110 mg (0,13 mmol) 5-Eosinethylxanthatdieacetat in 10 ml konzentriertem (30%) wässrigen Ammoniak gerührt und die Lösung auf 70°C erhitzt. Luftblasen stiegen langsam durch die Lösung auf und oxidierten den Thiolrest zum Disulfidrest in situ. Nach 2 Stunden wurden die Lösungsmittel auf einem Rotationsverdampfer bei 40°C entfernt und der Rest mit Essigsäureanhydrid-Pyridin (1 : 1) behandelt. Nach Entfernung der Reagenzien in vacuo wurde der Rest über Silicagel mit Ethylacetat-Hexan (1 : 4) als Elutionsmittel chromatographiert. Die Ausbeute betrugt 90 mg (60 μmol, 91 %) des Titelprodukts als weißes Pulver. Die Verbindung wurde zum Monomer (15) durch Lösen in Methanol unter Zugabe von Natriumacetat und Zugabe von 20 Äquivalenten Mercaptoethanol reduziert. Nach 2 Stunden wurde die methanolische Lösung in 3 Volumina 5% wässrige Essigsäure geschüttet, aus der das ausfallende 5-Fluoresceinthiol-Monomer durch Zentrifugation gewonnen wurde. Der Feststoff wurde mit Wasser gewaschen, bis der Mercaptoethanolgeruch verschwunden war.
Eine Kopplung von Diacetyl-5-eosinthiol (15) mit 7β-[(5-Diacetylfluorescein)-thio]acetamido-3-(acetoxymethyl)-3-cephem-4-carboxylsäure (14) und Deacylierung mit Acetylesterase erfolgte wie folgt. 10 mg (13 μmol) 7β-[(5-Diacetylfluorescein)-thio]acetamido-3-(acetoxymethyl)-3-cephem-4-carboxylsäure und 10 mg (13 μmol) Diacetyl-5-eosinthiol wurden in 200 μl trockenem Acetonitril gelöst und die Lösung unter Argon in einem Glasröhrchen verschlossen. Das Röhrchen wurde in einem Ölbad 16 Stunden bei 84°C (± 2°C) gehalten. Sodann wurde es geöffnet, die Lösung in eine Flasche überführt und das Lösungsmittel durch verminderten Druck entfernt. Der Rest wurde über Silicagel mit Ethylacetat-Methanol-Essigsäure (100 : 1 : 1) als Elutionsmittel chromatographisch aufgetrennt. Eine Entschützung der Acetate erfolgte durch Inkubation des Produkts mit Orangenschalen-Acetylesterase in 50 mM Phosphatpuffer (pH 7) für 24 Stunden bei 37°C. Das deacylierte Produkt wurde durch C₁₈-Reverse Phase-Chromatographie gereinigt. Die Elution erfolgte durch einen Schrittgradienten mit 25 mM wässrigem Phosphatpuffer (pH 7) und Methanol. Fluorescein-Nebenprodukte eluierten mit 33% und 50% Methanol im Elutionsmittel und danach das gewünschte Produkt in 66% Methanol.
Die entschützte Verbindung zeigt wenig Fluoreszenz in Phosphatpuffer, da sich die zwei hydrophoben Farbstoffe stapeln. Die verbleibende Fluoreszenz beruht auf Fluoreszenz-Resonanz-Energietransfer (FRET). Diese Verbindung ist ein gutes Substrat für RTEM β-Laktamase und wird als FCE bezeichnet.
Spaltung der Verbindung erhöht die Fluoreszenz bei 515 nm etwa 70-fach (2). Die Fluoreszenzeigenschaften der Verbindung können einer Bildung eines Farbstoff-Dimers zugewiesen werden, da sich FRET stark erhöht, sobald Methanol zur Lösung hinzugefügt wird. Methanol bricht die hydrophobe Interaktion auf, die eine Stapelung der Fluorophore hervorruft.
Beispiel 3 (Verbindung 22)
Das 3'-Acetat von 7-Aminocephalosporansäure wurde durch Ethylxanthat ersetzt [van Heyningen und Brown (1965), supra), das zu dem freien Sulfhydrylrest mit wässrigem Acetylhydrazin hydrolysiert wurde [Japanisches Patent, Kokai 75/18494, CA85, 97320d]. Die Sulf hydrylgruppe wurde mit 5-Bromacetamid-Rhodol-X in wässrigem Dimethylformamid zur Reaktion gebracht. Das Cephalosporin-7-amin wurde mit Bromacetylbromid in wässrigem Dioxan zur Reaktion gebracht, gefolgt von einem Austausch des Broms durch 5-Fluoresceinthiol, was ein FRET-Cephalosporin ergab, das scheinbar in 50 mM Phosphatpuffer, pH 7, nicht fluoresziert. Diese Verbindung wird als FCRX bezeichnet: Der erste Schritt bei der Herstellung von 5-Rhodol-X-bromacetamid war die Synthese von 9-(2'-Carboxy-4'(5')-nitro-benzoyl)-8-hydroxyjulolidin und die Trennung der Isomere. 10,1 g (48 mmol, 92% Reinheit) 4-Nitrophthalsäureanhydrid wurden in 20 ml Toluol bei 70°C gelöst. 9,76 g (50 mmol, 97% Reinheit) 8-Hydroxyjulolidin in 20 ml Ethylacetat wurden hinzugegeben und die Lösung 30 min bei 70°C gehalten. Das Reaktionsgemisch wurde durch ein kurzes Silicagel-Bett geschickt, gefolgt von Ethylacetat als Elutionsmittel. Die Lösungsmittel wurden unter vermindertem Druck entfernt und der Feststoff in einer minimalen Menge Ethylacetat im Rückfluss gelöst. Das Isomer mit der Nitrogruppe in meta-Position zu der Benzoesäure kristallisiert über Nacht aus der Lösung in orangefarbenen Kristallen (3,47 g in der ersten Fraktion). Nach einer weiteren fraktionierten Kristallisierung wurde das reine Isomer erhalten. ¹H-NMR (CDCl₃) des kristallisierten Isomers: δ 1,91 ppm (m, 4H, aliphatische Methylene), δ 2,73 ppm, 2,46 ppm (2m, 4H, anilinische Methylene), δ 3,26 ppm (m, 4H, benzylische Methylene), δ 6,32 ppm (s, 1H, Julolidin), δ 7,53 ppm (d, 1H, J = 8,4 Hz, Phthalsäure), δ 8,43 ppm (dd, J₁ = 8,4 Hz, J₂ = 2,2 Hz, Phthalsäure), δ 8,90 ppm (d, 1H, J = 2,2 Hz, Phthalsäure).
Für die Herstellung von 5-Rhodol-X-amin-hydrochlorid (bezeichnet in Analogie zu Rhodamin-X) wurden 1,91 g (5,0 mmol) 9-(2'-Carboxy-4'-vitro-benzoyl)-8-hydroxyjulolidin in 5 ml konzentrierter (96%) Schwefelsäure gerührt. 700 mg (6,4 mmol, 1,25 Äquivalente) Resorcinol wurden unter Kühlung über einen Zeitraum von 15 Minuten hinzugegeben. Die Suspension wurde 1,5 Stunden bei Raumtemperatur gerührt und sodann in 200 ml Wasser unter heftigem Rühren geschüttet. Der purpurfarbene Niederschlag wurde durch Filtration gewonnen und in 75 ml Wasser mit Hilfe von 5,3 g (22 mmol) Natriumsulfidnonahydrat gelöst. 2,5 g (44,6 mmol) wasserfreies Natriumdisulfid wurde hinzugegeben und die Lösung 24 Stunden einem Rückfluss ausgesetzt. Dann wurde nach Abkühlen auf Raumtemperatur das Produkt durch Zugabe von Eisessig gefällt. Der Feststoff wurde durch Filtration gewonnen und mit 100 ml halb-gesättigter wässriger Chlonroasserstoftsäure gekocht. Die Lösung wurde heiß durch eine Glasfritte filtriert, um Schwefel zu entfernen. Das Lösungsvolumen wurde auf 10 ml auf einem Rotationsverdampfer eingeengt. 1 Volumen gesättigtes Brin wurde hinzugegeben und der Niederschlag durch Filtration gewonnen. Eine Kristallisierung aus der Chlorwasserstoffsäure im Rückfluss ergab 1,78 g (3,85 mmol, 77%) dunkelrote Kristalle von 5-Rhodol-X-amin-hydrochlorid. ¹H-NMR (dDMSO) von 5-Nitro-rhdol-X: δ 1,90 ppm, 2,05 ppm (2m, 4H, aliphatische Methylene), δ 2,72 ppm, 3,03 ppm (2m, 4H, anilinische Methylene), δ 3,66 ppm (m, 4H, benzylische Methylene), δ 6,90 ppm (s, 1H, Xanthen), δ 6,96 ppm (dd, 1H, J₁ = 9,0 Hz, J₂ = 2,1 Hz, Xanthen), δ 7,11 ppm (d, 1H, J = 9,0 Hz, Xanthen), δ 7,22 ppm (d, 1H, J = 2,1 Hz, Xanthen), δ 7,78 ppm (d, 1H, J = 8,4 Hz, Phthalsäure), δ 8,70 ppm (dd, 1H, J₁ = 8,4 Hz, J₂ = 2,4 Hz, Phthalsäure), δ 8,91 ppm (d, 1H, J = 2,4 Hz, Phthalsäure). ¹H-NMR (CD₃OD) von 5-Rhodol-X-amin-hydrochlorid: δ 2,00 ppm, 2,14 ppm (2m, 4H, aliphatische Methylene), δ 2,75 ppm, 3,11 ppm (2m, 4H, anilinische Methylene), δ 3,67 ppm (m, 4H, benzylische Methylene), δ 6,85 ppm (s, 1H, Xanthen), δ 6,94 ppm (dd, 1H, J₁ = 9,0 Hz, J₂ = 2,1 Hz, Xanthen), δ 7,13 ppm (d, 1H, J = 9,0 Hz, Xanthen), δ 7,16 ppm (d, 1H, J = 2,1 Hz, Xanthen), δ 7,55 ppm (d, 1H, J = 8,1 Hz, Phthalsäure), δ 7,82 ppm (dd, 1H, J₁ = 8,1 Hz, J₂ = 1,9 Hz, Phthalsäure), δ 8,28 ppm (d, 1H, J = 1,9 Hz, Phthalsäure).
Die Herstellung von 5-Rhodol-X-bromacetamid (18) erfolgte wie folgt. 115 mg (0,25 mmol) 5-Rhodol-X-amin-hydrochlorid wurden mit 180 mg (2,1 mmol) Natriumhydrogencarbonat in 2 ml Wasser-Dioxan (1 : 1) gelöst. Die Lösung wurde auf Eis abgekühlt und 175 μl (2 mmol) Bromacetylbromid unter Rühren über einen Zeitraum von 20 Minuten hinzugegeben. Die Lösung wurde sodann 1,5 Stunden bei Raumtemperatur gehalten und dann 5 Volumina Wasser hinzugegeben. Das Dioxan wurde auf einem Rotationsverdampfer entfernt und das Produkt aus der verbleibenden wässrigen Lösung durch Zugabe von Essigsäure gefällt. Der Niederschlag wurde abfiltriert und in einem kleinen Volumen Chloroform-Methanol (1 : 1) gelöst. Silicagel wurde zu der Lösung hinzugegeben und die Lösungsmittel unter vermindertem Druck entfernt. Die Feststoffe wurden auf eine Silicagel-Säule gegeben und das Produkt mit Methanol-Ethylacetat (1 : 4) eluiert. Dieses Elutionsmittel löste etwas Silicagel, das bei dem eluierten Produkt verblieb. ¹H-NMR (CD₃OD, 10% dDMSO): δ 1,98 ppm, 2,12 ppm (2m, 4H, aliphatische Methylene), δ 2,72 ppm, 3,06 ppm (2m, 4H, anilinische Methylene), δ 3,56 ppm (m, 4H, benzylische Methylene), δ 4,08 ppm (s, 2H, Bromacetyl), δ 6,79 ppm (dd, 1H, J₁ = 9,2 Hz, J₂ = 2,1 Hz, Xanthen), δ 6,83 ppm (s, 1H, Xanthen), δ 6,90 ppm (d 1H, J = 2,1 Hz, Xanthen), δ 7,19 ppm (d, 1H, J = 9,2 Hz, Xanthen), δ 7,24 ppm (d, 1H, J = 8,4 Hz, Phthalsäure), δ 9,02 ppm (dd, 1H, J₁ = 8,4 Hz, J₂ ≈ Hz, Phthalsäure), δ 8,30 ppm (d, 1H, J ≈ 1 Hz, Phthalsäure).
Für die Herstellung von 7β-(Bromacetamido)-3-[[[(5-rhodol-X-amido)-methyl]thio]methyl]-3-cephem-4-carboxylsäure (20) wurden 4,5 mg (10 μmol) 5-Rhodol-X-bromacetamid (18) in 0,5 ml auf pH 7,7 eingestellten 250 mM Phosphatpuffer und 0,5 ml Dimethylformamid gelöst. Die Lösung wurde desoxidiert und 10 mg (40 μmol) 7β-Amino-3-(thiomethyl)-3-cephem-4-carboxylsäure (8), die gemäß dem in der Literatur beschriebenen Verfahren hergestellt worden war, in 100 μl Phosphatpuffer unter Argon hinzugegeben. Die Lösung wurde 2 Stunden bei 30°C gehalten. Dann wurden die Lösungsmittel unter vermindertem Druck entfernt und der Rest in 1 ml Wasser gelöst, aus dem das Produkt durch Zugabe von Essigsäure gefällt wurde. Der Niederschlag wurde gewonnen und das Produkt durch C₁₈-Reverse Phase-Chromatographie mit 0,1% Trifluoressigsäure in 35% Methanol/Wasser als Elutionsmittel gereinigt.
Das vorstehende Produkt (19) wurde in 1 ml Dioxan-Wasser (1 : 1) mit 20 mg Natriumhydrogencarbonat gelöst. 10 μl Bromacetylbromid wurden zu der Lösung auf Eis hinzugegeben. Die Lösung wurde für weitere 1,5 Stunden bei Raumtemperatur gehalten. 20 mg Natriumhydrogencarbonat und 10 μl Bromacetylbromid wurden zu der Lösung unter Kühlen mit Eis hinzugegeben. Nach weiteren 1,5 Stunden bei Raumtemperatur wurde das Dioxan auf einem Rotationsverdampfer entfernt und die Produkte aus der wässrigen Lösung mit 1 M Phosphorsäure gefällt und durch Zentrifugation gewonnnen. Die Feststoffe wurden in einer verdünnten wässrigen Hydrogencarbonatlösung suspendiert und nicht-gelöste Partikel durch Zentrifugation entfernt und verworfen. Das Produkt wurde mit 1 M Phosphorsäure gefällt und durch Chromatographie auf Silicagel mit Chloroform-Methanol-Essigsäure-Wasser (55 : 15 : 4 : 2) gereinigt. Dieses Verfahren löste kleine Mengen des Silicagels.
Eine Kopplung von Diacetyl-5-fluoresceinthiol (21) mit 7β-(Bromacetamido)-3-[[[(5-rhodol-X-amido)-methyl]thio]methyl]-3-cephem-4-carboxylsäure (20) erfolgte wie folgt. 7β-(Bromacetamido)-3-[[[(5-rhodol-X-amido)-methyl]thio]methyl]-3-cephem-4-carboxylsäure wurde mit einem 50%igen Überschuss an 5-Fluoresceinthiol unter Argon mit Dimethylformamid-(250 mM wässriger Phosphatpuffer, pH 7,7) (1 : 1) als Lösungsmittel zur Reaktion gebracht. Das Produkt wurde von überschüssigem Fluoresceinthiol durch wiederholtes Auflösen in Methanol und Fällung in Ethylacetat gereinigt.
3 zeigt die Fluoreszenzemissionsspektren dieses FRET-Cephalosporins in 50 mM Phosphatpuffer, pH 7, vor und nach Behandlung mit β-Laktamase. Die geringe anfängliche Fluoreszenz beruht auf der Stapelung der Fluorophore, die einen Komplex im Grundzustand bilden, der nicht fluoresziert. Durch eine Zugabe von Methanol zu der Lösung kann diese Stapelung unterbrochen werden und ein effizienter Fluoreszenz-Resonanz-Energietransfer tritt auf.
Beispiel 4 (Verbindung 25)
N-[Resorufin-4-carbonyl]-N'-iodacetyl-piperazin (Boehringer Mannheim) wurde an das Cephalosporin als FRET-Akzeptor für Fluorescein gebunden. Es wird als FCRE bezeichnet.
Das FRET-Cephalosporin FCRE (25) mit Fluorescein als Donor und Resorufin als Quencher wurde durch das gleiche Verfahren hergestellt wie das mit dem Rhodol-X-Akzeptor. Das N-[Resorufin-4-carbonyl]-N'-iodacetyl-piperazin (Boehringer Mannheim) wurde an die freie 3'-Thiolgruppe des Cephalosporins gekoppelt, gefolgt von Bromacetylierung und Zugabe des 5-Fluoresceinthiols. In Abweichung von dem Protokoll wurden 3 Äquivalente 5-Fluorescein
thiol hinzugegeben, da das erste Äquivalent augenblicklich das Resorufin reduzierte und nicht-reaktives Difluorescein-disulfid bildete. Beim In-Kontakt-Bringen mit Luft oxidierte das Resorufin erneut zu dem ursprünglichen Farbstoff.
Die durch β-Laktamase katalysierte Hydrolyse dieser Verbindung schafft zwei fluoreszente Fragmente. Die Anregungs- und Emissionsspektren von Resorufin sind längerwellig und enger als die Spektren von Rhodol, was möglicherweise eine bessere spektrale Trennung zwischen dem nicht-gespaltenen Farbstoff gegenüber den Produkten der enzymatischen Spaltung ermöglicht. Jedoch stapeln sich wie im Fall von Rhodol als Akzeptor die Farbstoffe in wässrigem Phosphatpuffer und bilden einen dunklen Komplex. Eine Behandlung mit β-Laktamase zerstört die Stapelung und erhöht die Fluoreszenz des Donors (4).
Beispiel 5 (Verbindung 7b)
Für eine Synthese von 2,4-Dihydroxy-5-chlorbenzaldehyd wurden 21,7 g (0,15 mol) 4-Chlorresorcinol in 150 ml trockenem Diethylether gelöst und 27 g feinpulvriges Zink(II)-cyanid und 0,5 g Kaliumchlorid unter Rühren hinzugegeben. Die Suspension wurde auf Eis abgekühlt. Ein starker Strom mit Chlorwasserstoffgas wurde in die Lösung unter heftigem Rühren eingeblasen. Nach etwa 30 Minuten wurden die Reaktanten gelöst. Die Zugabe von Chlorwasserstoffgas wurde fortgesetzt, bis es nicht mehr in der Etherlösung absorbiert wurde (etwa 1 Stunde). Während dieser Zeit bildete sich ein Niederschlag. Die Suspension wurde für eine weitere Stunde auf Eis gerührt. Sodann ließ man den Feststoff absetzen. Die Etherlösung wurde von dem Feststoff dekantiert. Der Feststoff wurde mit 100 g Eis behandelt und auf 100°C in einem Wasserbad erhitzt. Bei der Abkühlung kristallisierte das Produkt in glänzenden Plättchen aus der Lösung aus. Sie wurden durch Filtration entfernt und über Kalium- hydroxid getrocknet. Die Ausbeute betrug 15,9 g (0,092 mol, 61%). ¹H-NMR (CDCl₃): δ 6,23 ppm (s, 1H, Phenol), δ 6,62 ppm (s, 1H, Phenyl), δ 7,52 ppm (s, 1H, Phenyl), δ 9,69 ppm (s, 1H, Formyl), δ 11,25 ppm (s, 1H, Phenol).
Für die Herstellung von 3-Carboxy-6-chlor-7-hydroxycoumarin wurden 5,76 g (0,033 mol) 2,4-Dihydroxy-5-chlorbenzaldehyd und 7,2 g (0,069 mol) Malonsäure in 5 ml warmem Pyridin gelöst. 75 μl Anilin wurden in die Lösung eingerührt und die Reaktion 3 Tage bei Raumtemperatur stehengelassen. Der gelbe Feststoff, der sich gebildet hatte, wurde in kleinere Stücke zerbrochen und 50 ml Ethanol hinzugegeben. Die cremige Suspension wurde durch eine Glasfritte filtriert und der Feststoff dreimal mit 1 N Chlorwasserstoffsäure und sodann mit Wasser gewaschen. Sodann wurde der Feststoff mit 100 ml Ethylacetat, 150 ml Ethanol und 10 ml halb-konzentrierter Chlorwasserstoffsäure gerührt. Das Lösungsmittelvolumen wurde unter vermindertem Druck eingeengt und der Niederschlag durch Filtration gewonnen, mit Diethylether gewaschen und über Phosphorpentoxid getrocknet. 4,97 g (0,021 mol, 63%) Produkt wurden als weißes Pulver erhalten. ¹H-NMR (dDMSO): δ 6,95 ppm (s, 1H), δ 8,02 ppm (s, 1H), δ 8,67 ppm (s, 1H).
Für die Herstellung von 7-Butyryloxy-3-carboxy-6-chlorcoumarin wurden 3,1 g (12,9 mmol) 3-Carboxy-6-chlor-7-hydroxycoumarin in 100 ml Dioxan gelöst und mit 5 ml Buttersäureanhydrid, 8 ml Pyridin und 20 mg Dimethylaminopyridin bei Raumtemperatur 2 Stunden behandelt. Die Reaktionslösung wurde unter Rühren zu 300 ml Heptan hinzugegeben, wonach sich ein weißer Niederschlag bildete. Er wurde durch Filtration gewonnen und in 150 ml Ethylacetat gelöst. Nicht-gelöstes Material wurde durch Filtration entfernt und das Filtrat zweimal mit 50 ml 1 N Chlorwasserstoffsäure/Brin (1 : 1) und sodann mit Brin extrahiert. Die Lösung wurde über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet. Das Verdampfen unter vermindertem Druck ergab 2,63 g (8,47 mmol, 66%) Produkt. ¹H-NMR (CDCl₃): δ 1,08 ppm (t, 3H, J = 7,4 Hz, Buttersäure-Methyl), δ 1,85 ppm (m, 2H, J₁ ≈ J₂ = 7,4 Hz, Buttersäure-Methylen), δ 2,68 ppm (t, 2H, J = 7,4 Hz, Buttersäure-Methylen), δ 7,37 ppm (s, 1H, Coumarin), δ 7,84 ppm (s, 1H, Coumarin), δ 8,86 ppm (s, 1H, Coumarin).
Die Herstellung von 7-Butyryloxy-3-benzyloxycarbonylmethylaminocarbonyl-6-chlorcoumarin erfolgt wie folgt. 2,5 g (8,06 mmol) 7-Butyryloxy-3-carboxy-6-chlorcoumarin, 2,36 g Hydroxybenztriazolhydrat (16 mmol) und 1,67 g (8,1 mmol) Dicyclohexylcarbodiimid wurden in 30 ml Dioxan gelöst. Eine Toluollösung von O-Benzylglycin [hergestellt durch Extraktion von 3,4 g (10 mmol) Benzylglycintosylsalz mit Ethylacetat-Toluol-gesättigtem wässrigen Hydrogencarbonat-Wasser (1 : 1 : 1 : 1, 250 ml), Trocknen der organischen Phase mit wasserfreiem Natriumsulfat und Einengen des Lösungsmittelvolumens auf 5 ml] wurde tropfenweise zu der Coumarinlösung hinzugegeben. Die Reaktion wurde 20 Stunden auf Raumtemperatur gehalten, danach der Niederschlag durch Filtrieren entfernt und ausgedehnt mit Ethylacetat und Aceton gewaschen. Die kombinierten Lösungsmittelfraktionen wurden auf 50 ml auf einem Rotationsverdampfer eingeengt, ein Volumen Toluol hinzugegeben und das Volumen weiter auf 30 ml eingeengt. Das ausfallende Produkt wurde durch Filtration wiedergewonnen und in 200 ml Chloroform-absolutem Ethanol (1 : 1) gelöst. Die Lösung wurde auf 50 ml auf einem Rotationsverdampfer eingeengt, das Produkt abfiltriert und unter vermindertem Druck getrocknet, was 1,29 g des Titelprodukts ergab. Eine weitere Einengung des Lösungsmittelvolumens ergab eine zweite Ausbeute (0,64 g). Gesamte Ausbeute: 1,93 g (4,22 mmol, 52%). ¹H-NMR (CDCl₃): δ 1,08 ppm (t, 3H, J = 7,4 Hz, Buttersäure-Methyl), δ 1,84 ppm (m, 2H, J₁ ≈ J₂ = 7,4 Hz, Buttersäure-Methylen), δ 2,66 ppm (t, 2H, J = 7,4 Hz, Buttersäure-Methylen), δ 4,29 ppm (d, 2H, J = 5,5 Hz, Glycin-Methylen), δ 5,24 ppm (s, 2H, Benzyl), δ 7,36 ppm (s, 1H, Coumarin), δ 7,38 ppm (s, 5H, Phenyl), δ 7,77 ppm (s, 1H, Coumarin), δ 8,83 ppm (s, 1H, Coumarin), δ 9,15 ppm (t, 1H, J = 5,5 Hz, Amid).
7-Butyryloxy-3-carboxymethylaminocarbonyl-6-chlorcoumarin wurde wie folgt hergestellt. 920 mg (2 mmol) 7-Butyryloxy-3-benzyloxycarbonylmethyiaminocarbonyl-6-chlorcoumarin wurden in 50 ml Dioxan gelöst. 100 mg Palladium auf Kohlenstoff (10%) und 100 μl Essigsäure wurden zu der Lösung hinzugegeben und die Suspension heftig unter Wasserstoff bei Umgebungsdruck gerührt. Nach Beendigung der Aufnahme von Wasserstoff wurde die Suspension filtriert. Das Kohlenstoff-enthaltende Produkt wurde fünfmal mit 25 ml kochendem Dioxan extrahiert. Die kombinierten Dioxanlösungen wurden abgekühlt, wobei das Produkt als weißes Pulver ausfiel. Bei einer Einengung des Lösungsmittels auf 20 ml fiel mehr Produkt aus. Die verbleibende Dioxanlösung wird zum Kochen erhitzt und Heptan hinzugefügt, bis die Lösung trüb wird. Die Gewichte der getrockneten Pulver betrugen 245 mg, 389 mg und 58 mg, insgesamt 692 mg (1,88 mmol, 94%) weißes Produkt. ¹H-NMR (dDMSO): δ 1,02 ppm (t, 3H, J = 7,4 Hz, Buttersäure-Methyl), δ 1,73 ppm (m, 2H, J₁ ≈ J₂ = 7,3 Hz, Buttersäure-Methylen), δ 2,70 ppm (t, 2H, J = 7,2 Hz, Buttersäure-Methylen), δ 4,07 ppm (d, 2H, J = 5,6 Hz, Glycin-Methylen), δ 7,67 ppm (s, 1H, Coumarin), δ 8,35 ppm (s, 1H, Coumarin), δ 8,90 ppm (s, 1H, Coumarin), δ 9,00 ppm (t, 1H, J = 5,6 Hz, Amid).
Eine Kopplung von 7-Butyryloxy-3-carboxymethylaminocarbonyl-6-chlorcoumarin mit 7-Amino-3'-chlorcephalosporänsäurebenzhydrylester erfolgte wie folgt. 368 mg (1 mmol) 7-Butyryloxy-3-carboxymethylaminocarbonyl-6-chlorcoumarin, 270 mg Hydroxybenztriazolhydrat und 415 mg (1 mmol) 7-Amino-3'-chlorcephalosporansäurebenzhydrylester wurden in 40 ml Dioxan-Acetonitril (1 : 1) suspendiert. 260 mg (1,25 mmol) Dicyclohexylcarbodiimid in 5 ml Acetonitril wurden hinzugegeben und die Suspension heftig 36 Stunden gerührt. Der Niederschlag wurde durch Filtrieren entfernt und das Volumen der Lösung auf 20 ml auf einem Rotationsverdampfer eingeengt. 50 ml Toluol wurden hinzugegeben und das Volumen auf 30 ml eingeengt. Unter Rühren wurden 50 ml Heptan hinzugegeben und die Suspension auf Eis abgekühlt. Der Niederschlag wurde durch Filtrieren gewonnen. Er wurde in 10 ml Chloroform gelöst und die verbleibenden nicht-gelösten Feststoffe abfiltriert. Durch Zugabe von 2 Volumina Heptan fiel das Titelprodukt aus, das gewonnen und unter vermindertem Druck getrocknet wurde, und 468 mg (0,64 mmol, 64%) eines "off-white"-farbenen Pulvers ergab. ¹H-NMR (CDCl₃): δ 1,08 ppm (t, 3H, J = 7,4 Hz, Buttersäure-Methyl), δ 1,84 ppm (m, 2H, J₁ ≈ J₂ = 7,4 Hz, Buttersäure-Methylen), δ 2,66 ppm (t, 2H, J = 7,4 Hz, Buttersäure-Methylen), δ 3,54 ppm (2d, 2H, J = 18,3 Hz, Cephalosporin C-2), δ 4,24 ppm (2d, 2H, J = 5,8 Hz, Cephalo sporin-3-Methylen), δ 4,37 ppm (d, 2H, J = 3,8 Hz, Glycin-Methylen), δ 5,02 ppm (d, 1H, J = 4,9 Hz, Cephalosporin C-6), δ 5,89 ppm (dd, 1H, J₁ = 9,0 Hz, J₂ = 5,0 Hz, Cephalosporin C-7), δ 6,96 ppm (s, 1H, Benzhydryl), δ 7,30–7,45 ppm (m, 12H, Phenyl, Coumarin, Amid), δ 7,79 ppm (s, 1H, Coumarin), δ 8,84 ppm (s, 1H, Coumarin), δ 9,28 ppm (t, 1H, J = 3,7 Hz, Amid).
Eine Kopplung des vorstehenden Produkts mit 5-Fluoresceinthiol erfolgte wie folgt. 90 mg (0,2 mmol) 5-Mercaptofluoresceindiacetatdisulfid-Dimer wurden in 10 ml Chloroform gelost und mit 25 μl Tributylphosphin und 25 μl Wasser unter Argon behandelt. Die Lösung wurde 2 Stunden bei Umgebungstemperatur gehalten und sodann zu einer Lösung von 20 mg Natriumhydrogencarbonat, 25 mg Natriumiodid und 110 mg (0,15 mmol) der vorstehenden Verbindung in 10 ml Dimethylformamid gegeben. Nach 4 Stunden wurden die Lösungsmittel unter vermindertem Druck entfernt und der Rest mit Diethylether titriert. Der Feststoff wurde in Ethylacetat-Acetonitril (1 : 1) gelöst. Nach Entfernung der Lösungsmittel wurde der Rest erneut mit Diethylether titriert, was 157 mg (0,13 mmol, 88%) eines cremefarbenen Pulvers ergab.
Eine Probe der vorstehenden Verbindung wurde mit einem großen Überschuss an Trifluoressigsäure-Anisol (1 : 1) bei Raumtemperatur 20 Minuten behandelt. Die Reagenzien werden unter vermindertem Druck entfernt und der Rest mit Ether titriert. Hochauflösende Flüssigkeitschromatographie des Feststoffs in 45% wässrigem Acetonitril mit 0,5% Essigsäure ergibt ein Produkt, bei dem die Buttersäure- und Diphenylmethylester gespalten wurden. Es wurde durch hochauflösende Flüssigkeitschromatographie auf einer C₁₈-Reverse Phase-Säule mit Hilfe von 45% wässrigem Acetonitril mit 5% Essigsäure als Elutionsmittel gereinigt.
Eine Entschützung der Fluorescein-Acetate in der Verbindung 27 erfolgte mit Natriumhydrogencarbonat in Methanol (Raumtemperatur, 30 Minuten), um das fluoreszente Enzymsubstrat CCF2 bereitzustellen. Es wurde durch hochauflösende Flüssigkeitschromatographie auf einer C₁₈-Reverse Phase-Säule mit Hilfe von 35% wässrigem Acetonitril mit 0,5% Essigsäure als Elutionsmittel gereinigt.
Ein Rühren der Verbindung 27 mit überschüssigem Acetoxymethylbromid in trockenem Lutidin erzeugte das membrangängige Derivat des Substrats (CCF2/ac₂AM₂). Es wurde durch hochauflösende Flüssigkeitschromatographie auf einer C₁₈-Reverse Phase-Säule mit Hilfe von 65% wässrigem Acetonitril mit 0,5% Essigsäure als Elutionsmittel gereinigt. CCF2/ac₂AM₂ wird einfach zu CCF2 im Cytoplasma der Zellen umgewandelt.
Im Gegensatz zu den Beispielen 1–4 stapeln sich die Donor- und Akzeptor-Farbstoffe in dem Substrat CCF2 nicht. Das Substrat ist in Phosphatpuffer vollständig fluoreszent und es tritt keine Bildung des "dunklen Komplexes" auf (d. h. Zugabe von Methanol verändert nicht das Fluoreszenzspektrum von CCF2, mit der Ausnahme des Verdünnungseffekts). Dies beruht auf der viel kleineren und polareren Beschaffenheit des 7-Nydroxycoumarins im Vergleich zu der der Xanthen-Farbstoffe (Eosin, Rhodamin, Rhodol und Resorufin) in den Beispielen 1–4.
5 zeigt das Emissionsspektrum der Verbindung CCF2 in 50 millimolarem Phosphatpuffer, pH 7,0, vor und nach Spaltung des β-Laktamrings durch β-Laktamase. In dem intakten Substrat tritt ein effizienter Energietransfer von dem 7-Hydroxycoumarinrest zu dem Fluoresceinrest auf. Eine Anregung des Substrats bei 405 nm führt zu einer Fluoreszenzemission bei 515 nm (grün) des Akzeptor-Farbstoffs Fluorescein. Der Energietransfer wird unterbrochen, falls β-Laktamase den β-Laktamring spaltet, wodurch die Bindung zwischen den beiden Farbstoffen gelöst wird. Eine Anregung der Produkte bei 405 nm führt nun vollständig zu einer Donor-Fluoreszenzemission bei 448 nm (blau). Die Fluoreszenzemission des Donor-Rests erhöht sich 25-fach bei einer Spaltung des β-Laktams. Die Fluoreszenz bei 515 nm wird um einen Faktor von 3,5 verringert und die gesamte verbleibende Fluoreszenz stammt von dem 7-Nydroxycoumarin, da sich sein Emissionsspektrum in den Grün-Bereich erstreckt. Eine 25-fache Auslöschung des Donors in dem Substrat entspricht einer Effizienz des Fluoreszenz-Energietransfers von 96%. Diese große Änderung der Fluoreszenz bei Spaltung des β-Laktams kann gut für den Nachweis von β-Laktamase im Cytoplasma lebender Säugerzellen eingesetzt werden, wie in den Beispielen 6 und 7 beschrieben.
Der 7-Hydroxycoumarinrest in dem Cephalosporin besaß eine Fluoreszenz-Quantumeffizienz bei Fehlen des Akzeptors von 98–100%. Dieser Wert wurde durch Vergleich des Integrals des berichtigten Fluoreszenzemissionsspektrums des Farbstoffs mit dem einer Lösung mit 9-Aminoacridinhydrochlorid in Wasser, passend für die Absorption bei der Anregungswellenlänge, bestimmt. Es folgt, dass 7-Hydroxycoumarin ein idealer Donor-Farbstoff ist, da scheinbar jedes durch den Farbstoff absorbierte Photon einen Fluoreszenzenergietransfer zum Akzeptor durchläuft.
Beispiel 6
Zellen der T-Zell-Lymphomlinie Jurkat wurden in einer isotonischen Salzlösung (Hanks gepufferte Salzlösung) mit etwa 10¹² β-Laktamase-Enzymmolekülen pro Milliliter (etwa 1,7 nM; Penicillinase 205 TEM R⁺, von Sigma) und 1 mg/ml an Dextran (40 kD) konjugiertes Rhodamin als Beladungsmarker suspendiert. Die Suspension wurde durch eine Spritzennadel (30-Gauge) viermal gedrückt. Dies verursacht transiente überlebbare Disruptionen der zellulären Plasmamembran, und ermöglicht den Eintritt von markiertem Dextran und β-Laktamase. Erfolgreich permeabilisierte Zellen enthielten β-Laktamase und waren bei Beleuchtung bei der Anregungswellenlänge von Rhodamin auf einem Fluoreszenzmikroskop rot-fluoreszent. Die Zellen wurden mit 5 μM fluorogenem β-Laktamase-Substrat, CCF2/ac₂AM₂ 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Eine Bestrahlung mit violettem Licht (405 nm) zeigte blau-fluoreszente und grün-fluoreszente Zellen. Alle Zellen, die den Macker Rhodamin-Dextran aufgenommen hatten, erschienen blau-fluoreszent, während Zellen ohne Enzym grün-fluoreszent erschienen.
Beispiel 7
Zellen von Zelllinien eines unterschiedlichen Säugerursprungs wurden transient mit einem Plasmid transfiziert, das das RTEM β-Laktamase-Gen unter der Kontrolle eines Säugerpromotors enthielt. Das Gen kodiert für eine cytosolische β-Laktamase ohne irgendeine Signalsequenz und ist in SEQ ID NO: 1 aufgeführt. 10–48 Stunden nach der Transfektion wurden die Zellen 1–6 Stunden 5 μmol CCF2/ac₂AM₂ ausgesetzt. In allen Fällen wurden fluoreszente blaue Zellen bei einer Untersuchung mit einem Fluoreszenzmikroskop nachgewiesen. Keine einzige blau-fluoreszente Zelle wurde jemals in nicht-transfizierten Kontrollzellen nachgewiesen. Für die Quantifizierung der Fluoreszenzmessungen wurden die Zellen zuerst durch Coumarin (450 DF 65)- und sodann durch Fluorescein (515 EFLP)-Emissionsfilter betrachtet und Bilder mit einer ladungsgekoppelten Kamera aufgenommen. Die durchschnittlichen Pixelintensitäten von mit CCF2 beladenen transfizierten Zellen (blau) und Kontrollen (grün) bei den Coumarin- und Fluorescein-Wellenlängen in COS-7 (Tabelle 2)- und CHO (Tabelle 3)-Zellen sind zusammengefasst. Die Werte für 4 beispielhafte Zellen einer jeden Population sind widergegeben. Somit zeigte das Substrat CCF2 eine Genexpression in einzelnen lebenden Säugerzellen.
Tabelle 2 COS-7 (Ursprung: SV40-transformierte Nierenzellen der Afrikanischen Grünen Meerkatze)
Tabelle 3 CHO (Ursprung: Ovarialzellen des Chinesischen Hamsters)
Beispiel 8
Für die Herstellung von 7-Acetyloxy-3-(N-carboxymethyl-N-methylaminocarbonyl)-coumarin wurden 400 mg (1,6 mmol) 3-Carboxy-7-acetylcoumarin mit 4 ml Thionylchlorid 20 Minuten unter Rückfluss gehalten. Überschüssiges Thionylchlorid wurde durch Destillation entfernt und der Rest (7-Acetyloxy-3-chlorcarbonylcoumarin) unter vermindertem Druck über Nacht über Kaliumhydroxid-Plätzchen aufbewahrt. In einem getrennten Gefäß wurden 142,5 mg (1,6 mmol) Sarkosin in 1,05 ml (5,4 mmol) N-Methyltrimethylsilyltrifluoracetamid (MSTFA) gelöst und 16 Stunden bei Raumtemperatur gehalten. 2 ml trockenes Acetonitril und 187 μl (1,7 mmol) N-Methylmorpholin wurden hinzugegeben und die Lösung auf Eis auf das feste 7-Acetyloxy-3-chlorcarbonylcoumarin geschüttet. Nach 20-minütigem Rühren auf Eis wurde die Lösung auf Raumtemperatur erwärmt. Nach 4 Stunden wurden die Lösungsmittel unter vermindertem Druck entfernt. Der Rest wurde in Methanol gelöst, um die Säure zu entschützen, und sodann das Lösungsmittel unter vermindertem Druck entfernt. Der Feststoff wurde in 30 ml Ethylacetat-Acetonitril (2 : 1) gelöst und die Lösung zweimal mit einem gleichen Volumen 1 N Chlorwasserstoftsäure und sodann mit Brin extrahiert. Die organische Phase wurde über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet. Das Lösungsmittel wurde unter vermindertem Druck entfernt und der Feststoff aus kochendem Ethylacetat unter Zugabe von Hexan kristallisiert. Die Ausbeute betrug 316 mg (1,0 mmol, 63%) eines weißen, kristallinen Feststoffs.
Die Kopplung von 7-Acetyloxy-3-(N-carboxymethyl-N-methylaminocarbonyl)-coumarin mit 7-Amino-3'-ctilorcephalosporansäurebenzhydrylester erfolgte wie folgt. 62 mg (0,2 mmol) 7-Acetyloxy-3-(N-carboxymethyl-N-methylaminocarbonyl)-coumarin wurde mit 1 ml trockenem Methylenchlorid gerührt, zu dem 27 mg (0,2 mmol) Hydroxybenztriazol und 41 mg Dicyclohexylcarbodiimid gegeben worden waren. Eine Lösung von 82,6 mg (0,2 mmol) 7-Amino-3'-chlorcephalosporansäurebenzhydrylester in 1 ml Methylenchlorid wurde tropfenweise über einen Zeitraum von 5 Minuten hinzugegeben. Die Reaktion wurde 20 Stunden bei Raumtemperatur gerührt und sodann der Niederschlag durch Filtrieren entfernt. Das Filtrat wurde unter vermindertem Druck verdampft und das Produkt in Methylenchlorid extrahiert. Das Lösungsmittel wurde erneut entfernt und der Rest in 1 ml Ethylacetat gelöst. Durch Zugabe von 3 Volumina Hexan fiel das Produkt aus, das durch Zentrifugation gewonnen wurde. Die Ausbeute betrug 49,9 mg (70 μmol, 35%) des Produkts als weißes Pulver.
Die Umwandlung des Cephalosporin-3'-chlor-Substituenten in dem vorstehenden Produkt zum 3'-Iod-Substituenten erfolgte wie folgt. 49,9 mg (70 μmol) des vorstehenden Produkts wurden mit 52,5 mg Natriumiodid (5 Äquivalente) in 1,2 ml trockenem Methylethylketon bei Raumtemperatur 2 Stunden gerührt. Das Lösungsmittel wurde unter vermindertem Druck entfernt und der Rest in 2 ml Ethylacetat-Methylenchlorid (1 : 1) gelöst und mit einer kalten 2% wässrigen Natriumthiosulfatlösung extrahiert, gefolgt von zwei Extraktionen mit Brin. Die organische Schicht wurde über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet. Das leicht orange Pulver (32 mg, 40 μmol, 57%) wurde ohne eine weitere Reinigung für die nächste Reaktion eingesetzt.
Eine Kopplung des vorstehenden Produkts mit 5-Mercaptofluoresceindiacetat (Produkt CCF1ac₃-diphenylmethylester) erfolgte durch Lösen von 32 mg (40 μmol) des Iod-Derivats in 0,4 ml Dimethylformamid und Zugabe von 3,4 mg Natriumhydrogencarbonat. 22 mg (50 μmol) 5-Mercaptofluoresceindiacetat wurden in 0,3 ml desoxygeniertem Dimethylformamid gelöst und zu der Iod-Verbindung unter Argon hinzugegeben. Nach 2 Stunden wurde das Lösungsmittel unter vermindertem Druck entfernt. Der Rest wurde in Methylenchlorid-Ethylacetat (1 : 1) suspendiert. Die organische Lösung wurde mit Wasser gewaschen und über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet. Das Lösungsmittel wurde entfernt und der Rest mit Ethylether-Hexan (1 : 1) titriert. Eine Chromatographie auf Silicagel einer Maschenweite von 60 und mit Ethylacetat-Toluol (2 : 1) ergab 4,2 mg (4 μmol, 10%) eines farblosen Produkts.
Eine Spaltung des Diphenylmethylesters, um CCF1ac₃ zu ergeben, erfolgte wie folgt. 4 mg (4 μmol) CCF1ac₃-diphenylmethylester wurden mit 200 μl Trifluoressigsäure-Anisol-Methylenchlorid (10 : 1 : 10) 15 Minuten auf Eis behandelt. Die Reagenzien wurden unter vermindertem Druck entfernt und der Rest in 0,5 ml Ethylacetat gelöst und das Lösungsmittel unter vermindertem Druck verdampft. Der Feststoff wurde mit Ether titriert und sodann in 0,5 ml Methanol gelöst. Durch Zugabe der methanolischen Lösung zu 2 ml Wasser fiel das Produkt aus. Das Produkt wurde durch Zentrifugation gewonnen und unter vermindertem Druck getrocknet. Die Ausbeute betrug 2 mg (2 μmol, 50%) eines weißen Feststoffs. Die Verbindung wurde weiter durch hochauflösende Flüssigkeitschromatographie auf einer C₁₈-Reverse Phase-Säule mit Hilfe von 55% wässrigem Acetonitril mit 0,5% Essigsäure als Elutionsmittel gereinigt.
Das Fluoreszenzemissionsspektrum von CCF1 vor und nach Spaltung durch β-Laktamase (6) wurde mit Hilfe einer Probe von CCF1ac₃ erhalten, die zu CCF1 durch Behandlung mit Orangenschalen-Acetylesterase in 50 mM wässrigem Phosphatpuffer, pH 7, umgewandelt worden war.
Substrat CCF1 besitzt ähnliche Fluoreszenzeigenschaften wie das Substrat CCF2 in Beispiel 5. Bei dem intakten Substrat tritt ein wirksamer Energietransfer von dem 7-Hydroxycoumarinrest zu dem Fluoresceinrest auf. Eine Anregung des Substrats bei 390 nm führt zu einer Fluoreszenzemission bei 515 nm (grün) von dem Akzeptor-Farbstoff Fluorescein. Der Energietransfer wird unterbrochen, falls β-Laktamase den β-Laktamring spaltet, wodurch die Verbindung zwischen den zwei Farbstoffen unterbrochen wird. Eine Anregung der Produkte bei 390 nm führt nun vollständig zu einer Fluoreszenzemission des Donors bei 460 nm (blau). Die Fluoreszenzemission des Donor-Rests erhöht sich 25-fach bei Spaltung des β-Laktams. Die Fluoreszenz bei 515 nm ist 3-fach verringert und die gesamte verbleibende Fluoreszenz stammt von dem 7-Hydroxycoumarin, da sein Emissionsspektrum sich in den Grün-Bereich erstreckt. Ein 25-faches Auslöschen des Donors in dem Substrat entspricht einer Effizienz des Fluoreszenzenergietransfers von 96%. Diese große Veränderung der Fluoreszenz bei Spaltung des β-Laktams kann gut für den Nachweis von β-Laktamase im Cytoplasma lebender Säugerzellen eingesetzt werden, wie in Beispiel 9 beschrieben.
Beispiel 9
Zellen der T-Zell-Lymphomlinie Jurkat wurden in einer isotonischen Salzlösung (Hanks gepufferte Salzlösung) mit etwa 10¹² β-Laktamase-Enzymmolekülen pro Milliliter (etwa 1,7 nM; Penicillinase 205 TEM R⁺, von Sigma) und 1 mg/ml an Dextran (40 kD) konjugiertes Rhodamin als Beladungsmarker suspendiert. Die Suspension wurde durch eine Spritzennadel (30-Gauge) viermal gedrückt. Dies verursacht transiente überlebbare Disruptionen der zellulären Plasmamembran, und ermöglicht den Eintritt von markiertem Dextran und β-Laktamase. Erfolgreich permeabilisierte Zellen enthielten β-Laktamase und waren bei Beleuchtung bei der Anregungswellenlänge von Rhodamin auf einem Fluoreszenzmikroskop rot-fluoreszent. Die Zellen wurden mit 30 μM fluorogenem β-Laktamase-Substrat, CCF1ac₃ 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Eine Bestrahlung mit ultraviolettem Licht (360 nm) zeigte blau-fluoreszente und grün-fluoreszente Zellen. Alle Zellen, die den Marker Rhodamin-Dextran aufgenommen hatten, erschienen blau-fluoreszent, während Zellen ohne Enzym grün-fluoreszent erschienen.
Beispiel 10
Der bevorzugte membrangängige Ester von CCF2 wurde wie folgt hergestellt:
Eine Kopplung des 5-Fluoresceinthioldiacetats (5) und des 7-Amino-3'-chlorcephalosporansäurebenzhydrylesters erfolgte wie folgt. 450 mg (1 mmol) 5-Mercaptofluoresceindiacetatdisulfid-Dimer wurden in 30 ml Chloroform gelöst und mit 50 μl Wasser und 125 μl Tributylphosphin unter Stickstoff behandelt, wodurch das freie 5-Fluoresceinthiol entstand. 450 mg (1 mmol) 7-Amino-3'-chlorcephalosporansäurebenzhydrylesterhydrochloridsalz wurden in 10 ml Acetonitril mit Hilfe von 220 μl (2 mmol) N-Methylmorpholin gelöst und die zwei Lösungen nach 30 Minuten vereinigt. 1 Stunde später wurde das Lösungsmittelvolumen auf 5 ml eingeengt und 50 ml Kohlenstofftetrachlorid hinzugegeben. Das Lösungsmittelvolumen wurde auf 15 ml eingeengt und Hexan unter Rühren hinzugegeben. Der anfängliche orange Niederschlag, der hauptsächlich aus N-Methylmorpholinhydrochlorid bestand, wurde durch Filtrieren entfernt. Nach einer weiteren Zugabe von 2 Volumina Hexan wurden 630 mg (0,76 mmol, 76%) weißes Produkt gefällt und gewonnen.
Das vorstehende Produkt wurde mit 7-Butyryloxy-3-carboxymethylaminocarbonyl-6-chlorcoumarin gekoppelt. 325 mg (0,88 mmol) 7-Butyryloxy-3-carboxymethylaminocarbonyl-6-chlorcoumarin wurden in 15 ml heißem, trockenem Dioxan gelöst. Unter raschem Abkühlen wurden 110 μl (1 mmol) N-Methylmorpholin in 1 ml Dioxan und 115 μl (0,9 mmol) Isobutylchlorformiat in 8 ml Methylenchlorid hinzugegeben. Die Reaktion wurde 30 Minuten bei 0°C gehalten und sodann 661 mg (0,8 mmol) des vorstehenden Fluorescein-Cephalosporin-Addukts in 7 ml trockenem Methylenchlorid hinzugegeben. Die Lösung wurde auf Raumtemperatur erwärmt und nach 3 Stunden die Lösungsmittel unter vermindertem Druck entfernt. Der Rest wurde in 30 ml Methylenchlorid gelöst und zweimal mit 1 Volumen 10% wässriger Essigsäure und einmal mit Wasser extrahiert. Die organische Phase wurde über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet. Durch Zugabe von 150 ml trockenem Ethanol, Einengen des Lösungsmittelvolumens auf 50 ml und Abkühlung auf –20°C fiel das Produkt aus (Rohprodukt, 850 mg). Eine Reinigung erfolgte durch Chromatographie über Silicagel mit 25% Ethylacetat in Toluol als Elutionsmittel. 250 mg (0,21 mmol, 26%) eines weißen pulverförmigen Produkts wurden gewonnen.
Eine Spaltung des Cephalosporinbenzhydrylesters erfolgte durch Behandlung mit Trifluoressigsäure 145 mg (0,12 mmol) des vorstehenden Produkts wurden mit Trifluoressigsäure/Methylenchlorid/Anisol (10/10/1) 20 Minuten bei 0°C behandelt. Die Reagenzien wurden unter vermindertem Druck entfernt und der Rest mit Diisopropylether titriert. Der Feststoff wurde in 1 ml Dimethylsulfoxid gelöst und das Produkt durch Zugabe von 25 ml Wasser gefällt. Es wurde weiter auf einem C₁₈-Reverse Phase-Harz mit einem Schrittgradienten von 40 bis 60% wässrigem Acetonitril mit 0,5% Essigsäure als Elutionsmittel gereinigt, was 74 mg (73 μmol, 60%) eines weißen Pulvers ergab.
Ein Schützen der Cephalosporinsäure als membrangängigen Acetoxymethylester erfolgte wie folgt. 15 mg (15 μmol) des vorstehenden Produkts wurden in 250 μl Methylenchlorid gelöst. 25 μl Brommethylacetat und 50 μl Lutidin wurden zu der Lösung hinzugegeben. Die Reaktion wurde 7 Stunden bei Umgebungstemperatur gehalten und sodann die Reagenzien unter vermindertem Druck entfernt. Der Rest wurde durch Chromatographie auf Silicagel mit Ethylacetat als Elutionsmittel gereinigt. 15 mg (14 μmol, 92%) weißes Produkt wurden erhalten. Diese Verbindung, genannt CCF2/btAMac₂, wurde für den intrazellulären Nachweis der β-Laktamase-Aktivität eingesetzt.
Beispiel 11
Messung der Aktivierung eines intrazellulären Rezeptors: Die Aktivierung des intrazellulären Glukokortikoid-Rezeptors wurde durch seine Fähigkeit gemessen, die transkriptionelle Aktivität des Glukokortikoid-Reaktionselements in dem Promotor des Maus-Mammatumorvirus hoch zu regulieren. Diese Reaktion gegenüber Steroiden wurde als erhöhte intrazelluläre β-Laktamase-Aktivität auf das Substrat CCF2 nachgewiesen, was eine entsprechende Änderung des Fluoreszenzsignals hervorruft.
Das Gen für die Plasmid-kodierte RTEM β-Laktamase von Escherichia coli ohne eine Signalsequenz (Sequenz 1 der 7) wurde unter die transkriptionelle Kontrolle des Maus-Mammatumorvirus-Promotors gestellt und in einen Säuger-Expressionsvektor eingebracht. Dieser Vektor trug auch den Chloramphenicol-Resistenzmarker für eine Vervielfältigung des Plasmids in Bakterien und den Neomycin-Resistenzmarker für eine Selektion in Säugern. Er wurde in Babyhamster-Nierenzellen (BHK) in Kultur mit Hilfe von Calciumphosphat-Fällung eingebracht. Die Zellen wurden sodann einer Selektion für eine stabile Integration des Plasmids in das Genom der Zellen mit Hilfe des Antibiotikums G418 unterzogen. Einer von 20 Klonen wurde für seine auffällige Erhöhung der Expression von β-Laktamase selektiert, folgend der Exposition für das Steroid-Analogon Dexamethason.
Nachstehend ist die Messung der Erhöhung der β-Laktamase-Genexpression in diesem Klon nach Zugabe des Agonisten Dexamethason beschrieben. Die Zellen des stabilen BHK-Zellklons G941, die β-Laktamase unter der Kontrolle des Glukokortikoid-induzierbaren Promotors exprimierten, wurden mit oder ohne Agonisten in einem Inkubator bei 37°C gehalten. Die Flaschen mit den Zellen wurden zu verschiedenen Zeiten nach Zugabe des Agonisten aus dem Inkubator entnommen und die Zellen in Hanks gepufferte Salzlösung mit 10 μmol CCF2/btAMac₂ überführt. Diese Verbindung lagert sich zu dem für β-Laktamase zugänglichen fluoreszenten Substrat CCF2 durch endogene cytoplasmatische Esterasen um. 10 Minuten später wurde der Zellüberstand mit CCF2/btAMac₂ entfernt. 30 Minuten später wurden die Zellen mit einer gekühlten CCD-Kamera, die auf einem Epifluoreszenz-Mikroskop montiert war, dargestellt. Die Fluoreszenzmessungen erfolgten mit violettem Anregungslicht (Filter 400DF15) und mit blauen (Filter 450DF65) und grünen (Filter 535DF45) Emissionsfiltern. Ein Verhältnis der Emissionsintensitäten von blau gegenüber grün wurde bestimmt. Das Verhältnis ist ein Maß für die Menge des in das Produkt umgewandelten Substrats. Mit einem 40 × Objektiv wurden 4 Felder mit jeweils etwa 60 Zellen zu einem jeden Zeitpunkt dargestellt. Die Ergebnisse zeigen eine signifikante Erhöhung des Verhältnisses der Fluo reszenzintensitäten, was eine erhöhte Expression und Produktion von β-Laktamase widerspiegelt.
Beispiel 12
Messung der Aktivierung von Zelloberflächen-Rezeptoren und der intrazellulären Signalweiterleitung über second-messenger-reaktive Elemente: Eine Aktivierung von Rezeptoren der Zelloberfläche führt zu einer Veränderung der intrazellulären Messenger-Konzentrationen, was wiederum die Aktivität von intrazellulären Transkriptionsfaktoren moduliert. Bei Lymphozyten führt eine Erhöhung der intrazellulären Konzentration des Messenger-Ions Calcium zur Aktivierung des nukleären Faktors von aktivierten T-Lymphozyten (NFAT). Dieses Ereignis erhöht die Transkription bei Promotoren, die die NFAT-Erkennungsstelle enthalten. Eine Erhöhung der Calciummengen alleine ist für die merkliche Erhöhung der Transkription eines Reportergens ausreichend, wie β-Laktamase unter der transkriptionellen Kontrolle eines Promotors mit einem Trimer an NFAT-Stellen.
Die T-Lymphozyten-Zelllinie B3Z aus Mäusen wurde transient mit zwei Plasmiden co-transfiziert. Ein Plasmid enthielt den β-adrenergen Rezeptor, der an der Oberfläche der Zellen liegt, unter der transkriptionellen Kontrolle des starken und konstitutiv aktiven Cytomegalovirus (CMV)-Promotors. Das andere Plasmid enthielt das bakterielle RTEM β-Laktamase-Gen aus Escherichia coli, das für eine verbesserte Expression in Säugern modifiziert worden war (SEQ ID NO: 3 mit einer optimalen Säuger-Kozak-Sequenz, β-Globin-Leitsequenz, die Prä-Sequenz wurde entfernt), unter der transkriptionellen Kontrolle eines Promotors mit einem Trimer an NFAT-Stellen. Die Plasmide wurden in die Zellen mit Hilfe von Elektroporation eingebracht. 5 × 10⁶ Zellen in 0,5 ml Elektroporationspuffer wurden in Gegenwart von 10 μg eines jeden der beiden Plasmide mit Hilfe des Biorad Genie Pulser (250 V, 960 μF, 16 μs) elektroporiert. 24 Stunden nach Transfektion wurden die Zellen mit oder ohne den β-adrenergen Agonisten Isoproterenol (10 μmol) 5 Stunden inkubiert. Der Überstand wurde ent fernt und durch Hanks gepufferte Salzlösung mit 10 μmol CCF2/btAMac₂ ersetzt. Nach 20 Minuten bei Raumtemperatur wurden die Zellen mit frischem Puffer gewaschen und mit einem Fluoreszenzmikroskop betrachtet. 4% der Isoproterenol-behandelten Zellen erschienen blau-fluoreszent (Anregungsfilter 400DF15, Emissionsfilter 435 nm Langweg), während keine blau-fluoreszenten Zellen in der Kontrollpopulation nachweisbar waren (Fehlen des Agonisten). Eine maximale Stimulierung mit 2 μM Ionomycin und 50 ng/ml Phorbolester für 5 Stunden führte zu 20% blau-fluoreszenten Zelten in der Population.
Beispiel 13
β-Laktamasen aus verschiedenen Mikroorganismen wurden für die Verwendung als Reporterenzyme in eukaryontischen Zellen, vorzugsweise Säugerzellen, modifiziert. Das bakterielle Gen für diese Enzyme umfasst eine N-terminale Prä-Sequenz (die ersten 23 Aminosäuren der Sequenz 2 in 7), die das Enzym in den extrazellulären Raum führt. Nach Translokation spaltet eine Prä-Sequenz-Peptidase die 23 Aminosäuren lange Prä-Sequenz ab und hinterlässt das reife β-Laktamase-Enzym. RTEM β-Laktamase aus Escherichia coli umfassend seine bakterielle Prä-Sequenz (Sequenz 2 in 7) wurde in einen Säuger-Expressionsvektor unter die Kontrolle des Maus-Mammatumorvirus-Promotors gesetzt. Dieses Konstrukt wurde in Babyhamster-Nierenzellen mit Hilfe von Standard-Calciumphosphat-Präzipitation eingebracht. Die β-Laktamase-Aktivität wurde in dem Zellkulturmedium nachgewiesen. Keine Aktivität konnte in dem Zellniederschlag nachgewiesen werden. Die Menge der β-Laktamase-Aktivität im Medium war Steroid-abhängig. Zellen, die vor der Messung 36 Stunden lang 1 μM Dexamethason ausgesetzt waren, produzierten dreifach mehr Enzym als Kontrollzellen. Dies macht die β-Laktamase mit ihrer bakteriellen Prä-Sequenz (Sequenz 2 in 7) verwendbar als extrazellulären Test der Reportergen-Aktivität in Säugern.
Eine bevorzugte Verwendung des β-Laktamase-Reporters ist dann gegeben, falls das Enzym produziert und in Cytoplasma der Zelle gehalten wird. Daher wurde die bakterielle Signalsequenz entfernt und durch ATG (Methionin) als neue translationelle Startstelle in drei modifizierten RTEM β-Laktamase-Genen (Sequenzen 1, 3 und 4 in 7) ersetzt. Für eine Erhöhung der Expression der β-Laktamasen in Säugerzellen wurden die RTEM β-Laktamasen der Sequenzen 3 und 4 in 7 mit veränderten Ribosomen-Bindestellen konstruiert, die für eine Expression in Säugern optimiert sind [Kozak, M., J. Cell. Biol. 108: 229–241 (1989)]. Für eine erhöhte Kompatibilität mit der Translationsmaschinerie von Säugern wurde die β-Laktamase mit der Sequenz ID No. 3 am Ende einer nicht-translatierten Säuger-β-Globin-Leitsequenz inseriert. Alle diese neuen DNA-Sequenzen, die für neue β-Laktamasen kodieren, wurden in Säuger-Expressionsvektoren inseriert, wobei der Cytomegalovirus-Promotor ihre Transkription kontrollierte. Säugerzellen in Gewebekultur (Hela, COS-7, CHO, BHK) wurden transient mit den Plasmiden mit Hilfe des Standard-Lipofektin-Verfahrens transfiziert. 2 bis 5 Tage nach Transfektion wurden die Zellen mit dem membrangängigen Derivat, CCF2/btAMac₂ des fluoreszenten Substrats CCF2 inkubiert, um die funktionelle Expression des Enzyms zu testen. 5–20% der Zellen, die mit Plasmiden transfiziert worden waren, die die cDNA-Sequenzen 2, 3 und 4 in 7 enthalten, zeigten eine Veränderung von einer Grün- zu einer Blau-Fluoreszenz, was eine Spaltung des intrazellulär eingeschlossenen Substrats durch exprimierte β-Laktamase anzeigt. Im Gegensatz dazu zeigten in nicht-transfizierfen oder mock-transfizierten Kontrollen alle Zellen die Grün-Fluoreszenz von ungespaltenem CCF2. Keine blau-fluoreszierenden Zellen wurden beobachtet, was das Fehlen einer endogenen β-Laktamase-Aktivität bestätigt.
Das Gen für β-Laktamase aus Bacillus licheniformis wurde aus Gesamt-DNA von Bacillus licheniformis mit Hilfe von Polymerase-Kettenreaktion isoliert. Die Oligonukleotid-Primer entfernten die β-Laktamase-Sekretionssequenz und schufen die DNA-Sequenz ID No. 5. Dieses Gen wurde in einen pCDNA3-Säuger-Expressionsvektor unter die transkriptionelle Kontrolle des konstitutiv aktiven Cytomegalovirus-Promotors inseriert. HeLa-Zellen wurden mit 10 μg Plasmid pro 25 cm² Kulturplatte mit Hilfe von Lipofektin transfiziert. 5 Tage nach Transfektion wurden die Zellen auf funktionelle Expression von β-Laktamase durch Inkubation in Gegenwart von 100 μmol CCF2/btAMac₂ und visuelle Untersuchung mit dem Epifluoreszenz-Mikroskop getestet. 30–40% der Zellen zeigten eine Blau-Fluoreszenz, während nur grün-fluoreszierende Zellen und keine blau-fluoreszierenden Zellen in den nicht-transfizierten Kontrollen nachweisbar waren. Bei transienten Transfektionen ist typisch, dass < 50% der Zellen transfiziert werden.
Beispiel 14
Ein Plasmid wurde mit β-Laktamase der Sequenz ID No. 3 (7) unter Kontrolle des Hefe-Elongationsfaktor EF-1-alpha-Enhancers und -Promotors konstruiert. Dieses Plasmid wurde zusammen mit dem Kaliumsalz des Substrats CCF2 (Verbindung 7b) in Zebrafisch-Embryos im Einzell-Stadium injiziert. Als Kontrolle wurde den Embryos das Kaliumsalz des Substrats CCF2 alleine injiziert. Nach 3 Stunden wurden die Embryos mit einem Epifluoreszenz-Mikroskop mit Hilfe von violettem Anregungslicht (Filter 400DF15) und einem 435 nm Langweg-Emissionsfilter betrachtet. Embryos, die Plasmid-DNA erhalten hatten, fluoreszierten blau, während die Kontrollen grün fluoreszierten.
Beispiel 15
Das β-Laktamase-Gen der Sequenz ID No. 3 wurde in einen Drosophila-Transformationsvektor unter die Kontrolle des Glas-Promotors kloniert und in Wildtyp-Drosophila-Embryos injiziert. Als Kontrolle wurde das β-Laktamase-Gen in falscher Orientierung eingesetzt. Drosophila-Embryos wurden mit Hilfe von P-Element-vermittelter Transformation Keimbahntransformiert. Die Transformationen und alle darauffolgenden Manipulationen der Fliegen erfolgten mit Hilfe von Standardverfahren [Karess, R. E. und Rubin, G. M., Cell 38: 135 (1984)]. Omatidien von in einem späten Stadium transformierten Puppen wurden zerschnitten und zu einzelnen Zellen zertrennt. Die Zellen wurden in Puffer mit 40 μmol CCF2/btAMac₂ (Verbindung 34) 20 Minuten inkubiert, gewaschen und mit einem Epifluoreszenz-Mikroskop betrachtet (Exzitationsfilter 400DF15, Emissionsfilter 435 nm Langweg). Omatidienzellen von mit dem β-Laktamase-Gen in der richtigen Orientierung transformierten Fliegen fluoreszierten blau, während Omatidienzellen mit dem Gen in der falschen Orientierung grün fluoreszierten.
Beispiel 16
In bestimmten Ausführungsformen kann die erfindungsgemäße Verbindung eine jegliche der nachstehenden Verbindungen sein.
wobei R^y ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Wasserstoff, Cl und Br,
R^x ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Wasserstoff und einem Methylrest,
wobei R^z und R^z1 unabhängig voneinander ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus einem -C(O)alk-, -CH₂OC(O)alk-, -CH₂SC(O)alk-, -CH₂OC(O)Oalk-, Nieder-acyloxy-alphabenzyl- und delta-Butyrolactonylrest, wobei alk ein Niederalkylrest mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen ist und membrangängige fluorogene Derivate davon,
und R'' ein 1-(Acyloxy)-alkylrest ist.
Ein weiteres Beispiel für die Verbindung ist:
worin R^z und R^z1 unabhängig voneinander ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus einem -C(O)alk-, -CH₂oC(O)alk-, -CH₂SC(O)alk-, -CH₂OC(O)alk-, Nieder-acyloxy-alphabenzyl- und delta-Butyrolactonylrest, wobei alk ein Niederalkylrest mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen ist.
Ein weiteres Beispiel für die Verbindung ist:
Ein letztes Beispiel für die Verbindung ist:
Während spezifische Beispiele bereitgestellt wurden, sind diese lediglich veranschaulichend und nicht beschränkend gedacht. Bei Durchsicht dieser Beschreibung werden dem Fachmann viele Variationen der Erfindung offensichtlich werden. Der Umfang der Erfindung sollte daher nicht unter Bezug auf die vorhergehenden Beispiele, stattdessen aber unter Bezug auf die nachfolgenden Ansprüche bestimmt werden.

Claims

Eine Säugerzelle, transfiziert mit einem rekombinanten Nukleinsäuremolekül, umfassend Expressions-Kontrollsequenzen, angepasst zur Funktion in Vertebratenzellen und funktionell verbunden mit einer Nukleotidsequenz die für die Expression eines aktiven β-Laktamase- Reportergens kodiert, wobei das Nukleinsäuremolekül weiterhin Säuger-Kozaksequenzen für das β-Laktamase- Reportergen umfasst und der Nukleotidsequenz, die für die Expression des β-Laktamase Reportergens kodiert, eine Signalsequenz fehlt.
Säugerzelle, transfiziert mit einem Expressionsvektor umfassend ein rekombinantes Nukleinsäuremolekül umfassend Expressions-Kontrollsequenzen, angepasst zur Funktion in einer eukaryotischen Zelle und funktionell verbunden mit einer Nukleotidsequenz, die für die Expression eines aktiven zytosolischen β-Laktamase- Reportergens kodiert, wobei das Nukleinsäuremolekül weiterhin Säuger- Kozaksequenzen für das β-Laktamase Reportergen umfasst und der Nukleotidsequenz, die für die Expression des β-Laktamase Reportergens kodiert, eine Signalsequenz fehlt.
Säugerzelle gemäß Anspruch 1 oder 2, wobei die Nukleotidsequenz eine Klasse A β-Laktamase kodiert.
Säugerzelle gemäß Anspruch 3, wobei die Nukleotidsequenz Sequenz 1, Sequenz 3, Sequenz 4 oder Sequenz 5 aus 7 ist.
Säugerzelle gemäß Anspruch 1 oder 2, wobei die Expressionskontrollsequenzen induzierbare Expressionskontrollsequenzen sind.
Säugerzelle gemäß Anspruch 1 oder 2, wobei die Expressionskontrollsequenzen konstitutiv aktive Expressionskontrollsequenzen sind.
Säugerzelle gemäß Anspruch 1 oder 2, wobei die Expressionskontrollsequenzen den c-fos Promotor oder den c-jun Promoter einschließen.
Säugerzelle gemäß Anspruch 1 oder 2, wobei die Expressionskontrollsequenzen zyklische AMP -responsive Elemente, Phorbolester Antwort Elemente, Serum Antwort Element oder Kernfaktor von aktivierten T-Zell Antwort Elementen einschließen.
Säugerzelle gemäß Anspruch 1 oder 2, wobei die Expressionskontrollsequenzen auf Substanzen ansprechen, die Zelloberflächenrezeptoren modulieren.
Säugerzelle gemäß Anspruch 1 oder 2, wobei die Expressionskontrollsequenzen auf Substanzen ansprechen, die intrazelluläre Rezeptoren modulieren.
Verfahren zur Bestimmung der Menge der β-Laktamase- Aktivität in einer Zelle, umfassend die Schritte: Zur-Verfügung-Stellen eine Säuger-Wirtszelle transfiziert mit einem rekombinanten Nukleinsäuremolekül, umfassend Expressionskontrollsequenzen funktionell verbunden mit Nukleinsäuresequenzen, die für die Expression eines aktiven β-Laktamase Reportergens kodieren; wobei das Nukleinsäuremolekül weiterhin Säuger- Kozaksequenzen für das β-Laktamase Reportergen umfasst und der Nukleotidsequenz, die für die Expression des β-Laktamase Reportergens kodiert, eine Signalsequenz fehlt; In-Kontakt-Bringen einer Probe, umfassend die Säuger- Wirtszelle, mit einem Substrat für β-Laktamase; und Bestimmen der Menge des gespaltenen Substrats, wobei die Menge des gespaltenen Substrats mit der Menge der β-Laktamase- Aktivität in Zusammenhang steht.
Verfahren zur Beobachtung der Expression eines Gens, das funktionell mit einem Satz von Expressions- Kontrollsequenzen verbunden ist, umfassend: Zur-Verfügung-Stellen einer eukaryotischen Wirtszelle transfiziert mit einem rekombinanten Nukleinsäuremolekül, umfassend Expressions-Kontrollsequenzen angepasst zur Funktion in einer Säugerzelle, funktionell verbunden mit Nukleinsäuresequenzen, die für die Expression eines aktiven β-Laktamase- Reportergens kodieren; wobei das Nukleinsäuremolekül weiterhin Säuger- Kozaksequenzen für das β-Laktamase- Reportergen umfasst und der Nukleotidsequenz, die für die Expression des β-Laktamase Reportergens kodiert, eine Signalsequenz fehlt; In-Kontakt-Bringen einer Probe umfassend die Zelle mit einem Substrat für β-Laktamase; und Bestimmen der Menge des gespaltenen Substrats, wobei die Menge des gespaltenen Substrats mit der Menge der β-Laktamase- Aktivität in Zusammenhang steht.
Verfahren gemäß Anspruch 12, wobei die eukaryotische Zelle von einem Säuger ist.
Verfahren gemäß Anspruch 12, wobei der Schritt der Bestimmung der Menge des gespaltenen Substrats die Anregung der Verbindung umfasst; und Bestimmen des Ausmaßes des Fluoreszenz-Resonanz-Energietransfers in der Probe, wobei ein Ausmaß des Fluoreszenz-Resonanz-Energietransfers das geringer ist, als die erwartete Menge, die Anwesenheit von β-Laktamase- Aktivität anzeigt.
Verfahren zur Bestimmung, ob eine Testverbindung die Expression eines Gens das funktionell mit einem Satz von Expressions- Kontrollsequenzen verbunden ist verändert, umfassend: Zur-Verfügung-Stellen eine Säugerzelle, transfiziert mit einem rekombinanten Nukleinsäurekonstrukt, umfassend die Expressionskontrollsequenzen funktionell verbunden mit Nukleinsäuresequenzen, die für die Expression eines aktiven β-Laktamase Reportergens kodieren; wobei das Nukleinsäuremolekül weiterhin Säuger- Kozaksequenzen für das β-Laktamase Reportergen umfasst und der Nukleotidsequenz, die für die Expression des β-Laktamase Reportergens kodiert, eine Signalsequenz fehlt; In-Kontakt-Bringen der Zelle mit der Testverbindung; In-Kontakt-Bringen einer Probe umfassend die Säugerzelle mit einem β-Laktamase-Substrat; und Bestimmen der Menge des gespaltenen Substrats, wobei die Menge des gespaltenen Substrats mit der Menge der β-Laktamase- Aktivität in Zusammenhang steht.
Verfahren gemäß Anspruch 15, wobei der Schritt der Bestimmung der Menge des gespaltenen Substrats die Anregung der Verbindung umfasst; und Bestimmen des Ausmaßes des Fluoreszenz-Resonanz-Energietransfers in der Probe, wobei ein Ausmaß des Fluoreszenz-Resonanz-Energietransfers das geringer ist, als die erwartete Menge, die Anwesenheit von β-Laktamase- Aktivität anzeigt.
Verfahren gemäß Anspruch 15, wobei die Nukleotidsequenz eine Klasse A β-Laktamase kodiert.
Verfahren gemäß Anspruch 17, wobei die Nukleotidsequenz Sequenz 1, Sequenz 3, Sequenz 4 oder Sequenz 5 aus 7 ist.
Verfahren gemäß Anspruch 15, wobei die Expressionskontrollsequenzen induzierbare Expressionskontrollsequenzen sind.
Verfahren gemäß Anspruch 15, wobei die Expression von β-Laktamase funktionell durch Aktivierung oder Inhibierung der Aktivierung eines intrazellulären Rezeptors, eines Zelloberflächenrezeptors oder eines Bestandteils eines intrazellulären Signalwegs reguliert wird.
Säugerzelle gemäß Anspruch 1 oder 2, wobei die Säuger-Expressionskontrollsequenzen Hormon-Antwort Elemente sind.