DE69633565T3

DE69633565T3 - Verpackungssysteme für humane, menschliche adenoviren, zur verwendung in die gentherapie

Info

Publication number: DE69633565T3
Application number: DE69633565T
Authority: DE
Inventors: Frits Fallaux; Robert Hoeben; Abraham Bout; Domenico Valerio; Alex Van Der Eb
Original assignee: Crucell Holand BV
Current assignee: Janssen Vaccines and Prevention BV
Priority date: 1995-06-15
Filing date: 1996-06-14
Publication date: 2013-01-17
Anticipated expiration: 2016-06-15
Also published as: DE69633565D1; US6238893B1; EP0833934A1; JP4051416B2; DK0833934T3; CA2222140C; US20020151032A1; IL122614A0; HK1064406A1; ES2231813T3; US6306652B1; KR20040065317A; US20090023196A1; KR100470180B1; US6033908A; DE69633565T2; EP0833934B1; EP1445322B2; EP1445322B1; ES2231813T5

Description

Die Erfindung betrifft das Feld der rekombinanten DNA-Technologie, insbesondere das Feld der Gentherapie. Die Erfindung betrifft insbesondere die Gentherapie durch Anwendung von Materialien, welche von Adenoviren, insbesondere humanen rekombinanten Adenoviren, abgeleitet sind. Sie betrifft insbesondere neue, von Viren abgeleitete Vektoren und neue Verpackungszelllinien für auf Adenoviren basierende Vektoren.
Gentherapie ist ein kürzlich entwickeltes Konzept, für welches eine große Bandbreite von Anwendungen vorausgesehen wurde und werden kann.
In der Gentherapie wird ein Molekül, welches genetische Information trägt, in einige oder alle Zellen eines Wirtes eingeführt, woraus resultiert, dass dem Wirt die genetische Information in einer funktionellen Form hinzugefügt wird.
Die hinzugefügte genetische Information kann ein Gen oder das Derivat eines Genes sein, so wie eine cDNA, welche für ein Protein codiert. In diesem Fall bedeutet die funktionelle Form, dass das Protein durch die Maschinerie der Wirtszelle exprimiert werden kann.
Die genetische Information kann ebenfalls eine Sequenz von Nucleotiden sein, welche komplementär zu einer Sequenz von Nucleotiden ist, (sei es DNA oder RNA) die in der Wirtszelle vorhanden ist. Die funktionelle Form in diesem Fall bedeutet, dass das hinzugefügte DNA-Molekül (Nucleinsäuremolekül) oder davon in situ hergestellte Kopien fähig sind, Basenpaarungen mit der in der Wirtszelle vorhandenen komplementären Sequenz zu bilden.
Anwendungen schließen ein: die Behandlung von genetisch bedingten Erkrankungen durch die Ergänzung eines Proteins oder einer Substanz, welche aufgrund der genetisch bedingten Erkrankung nicht vorhanden ist oder wenigstens in unzureichender Menge im Wirt vorhanden ist, die Behandlung von Tumoren und (anderen) erworbenen Erkrankungen, wie (Auto-)Immunerkrankungen oder Infektionen etc.
Wie aus dem Vorangehenden klar geworden sein könnte, gibt es im Grunde drei verschiedene Ansätze in der Gentherapie, einen gerichtet auf die Kompensation eines Mangels vorliegend in einem (zu den Säugetieren gehörigen) Wirt; der zweite gerichtet auf die Entfernung oder Beseitigung von unerwünschten Substanzen (Organismen oder Zellen) und der dritte auf die Anwendung eines rekombinanten Impfstoffes (Tumoren oder fremde Mikroorganismen).
Zur Anwendung in der Gentherapie wurden Adenoviren, welche Deletionen aufweisen, als geeignete Träger vorgeschlagen. Adenoviren sind nicht-umhüllte DNA-Viren. Gentransfervektoren abgeleitet von Adenoviren (sogenannte adenovirale Vektoren) haben eine Vielzahl von Eigenschaften, welche sie besonders geeignet für den Gentransfer bei solchen Anwendungen machen. Zum Beispiel ist die Biologie der Adenoviren bis ins Detail charakterisiert, die Adenoviren stehen nicht im Zusammenhang mit schweren Erkrankungen des Menschen, der Virus ist extrem effizient bei der Einschleusung seiner DNA in die Wirtszelle, der Virus kann eine Vielzahl verschiedener Zellen infizieren und hat einen großen Wirtsbereich, der Virus kann vergleichsweise einfach in großen Mengen hergestellt werden und der Virus kann durch Deletionen in der Early-Region 1 (E1) des viralen Genoms replikationsunfähig gemacht werden.
Das Adenovirusgenom ist ein lineares Doppelstrang-DNA-Molekül von annähernd 36000 Basenpaaren mit dem 55-kDa-Terminalen-Protein kovalent gebunden an das 5'-Ende jedes Stranges. Die Adenovirus(Ad)-DNA enthält identische Inverted Terminal Repeats (ITR) von ungefähr 100 Basenpaaren, wobei die genaue Länge vom Serotyp abhängt. Die viralen Replikationsursprünge liegen in den ITRs exakt an den Enden des Genoms. Die DNA-Synthese verläuft in zwei Stadien. Zunächst verläuft die Replikation durch Verdrängung des DNA-Stranges, was ein Tochterduplexmolekül und einen verdrängten, parentalen Strang erzeugt. Der verdrängte Strang ist einzelsträngig und kann ein sogenanntes Panhandle-Intermediat bilden, welches die Initiation der Replikation und die Bildung eines Tochterduplexmoleküls erlaubt. Alternativ kann die Replikation von beiden Enden des Genoms simultan ablaufen, was die Notwendigkeit der Bildung einer Panhandle-Struktur erübrigt. Die Replikation wird in 14, angepasst aus (Lechner und Kelly, 1977), zusammengefasst.
Während des produktiven Infektionszyklus, werden die viralen Gene in zwei Phasen exprimiert: Die frühe Phase, welches der Zeitraum bis zur viralen DNA-Replikation ist, und die späte Phase, welche mit der Initiation der Replikation der viralen DNA zusammenfällt. Während der frühen Phase werden nur die frühen Genprodukte, codiert durch die Regionen E1, E2, E3 und E4, exprimiert, welche eine Vielzahl von Funktionen ausführen, die die Zelle auf die Synthese der viralen Strukturproteine vorbereiten (Berk, 1986). Während der späten Phase werden, zusätzlich zu den frühen Genprodukten, die späten Genprodukte exprimiert und die DNA- und Proteinsynthese der Wirtszelle werden abgeschaltet. Daraus resultierend wird die Zelle auf die Produktion von viraler DNA und von viralen Strukturproteinen festgelegt (Tooze, 1981).
Die E1-Region des Adenovirus ist die erste Region des Adenovirus, die nach der Infektion der Zielzelle exprimiert wird. Diese Region besteht aus zwei transkriptionellen Einheiten, dem E1A- und dem E1B-Gen, welche beide für die onkogene Transformation von primären (embryonalen) Nagerzellkulturen benötigt werden. Die Hauptfunktionen der E1A-Genprodukte sind:

1) bei ruhenden Zellen den Eintritt in den Zellzyklus und die Wiederaufnahme der zellulären DNA-Synthese einzuleiten und
2) das E1B-Gen und die anderen frühen Regionen (E2, E3, E4) transkriptionell zu aktivieren.

Transfektion von primären Zellen alleine mit dem E1A-Gen, kann unbegrenzte Proliferation (Immortalisierung) induzieren, resultiert aber nicht in vollständiger Transformation. Die Expression von E1A führt jedoch in den meisten Fällen zur Induktion des programmierten Zelltodes (Apoptose), und nur gelegentlich wird eine Immortalisierung erzielt (Jochemsen et al., 1987). Coexpression des E1B-Gens wird benötigt, um die Induktion der Apoptose zu verhindern und das Eintreten der vollständigen morphologischen Transformation zu ermöglichen. In etablierten, immortalisierten Zelllinien kann die Expression von E1A auf hohem Niveau die vollständige Transformation in Abwesenheit von E1B bewirken (Roberts et al., 1985).
Die durch E1B codierten Proteine unterstützen E1A bei der Umlenkung der zellulären Funktionen, um die virale Replikation zu ermöglichen. Die E1B-55kD- und E4-33kD-Proteine, welche einen Komplex bilden, der im wesentlichen im Zellkern lokalisiert ist, wirken durch Inhibition der Synthese der Wirtsproteine und durch die Förderung der Expression der viralen Gene. Ihre Hauptwirkung ist, den selektiven Transport viraler mRNA aus dem Zellkern in das Cytoplasma während der gleichzeitig einsetzenden späten Phase der Infektion zu etablieren. Das E1B-21kD-Protein ist wichtig für die korrekte zeitliche Kontrolle des produktiven Infektionszyklus, wodurch der vorzeitige Tod der Wirtszelle, vor dem Abschluss des viralen Lebenszyklus verhindert wird. Mutierte Viren, welche unfähig zur Expression des E1B-21kD-Genproduktes sind, zeigen einen verkürzten Infektionszyklus, welcher von einer exzessiven Degradation der chromosomalen DNA der Wirtszelle begleitet wird (deg-Phänotyp) und einen verstärkten cytopathischen Effekt aufweist (cyt-Phänotyp) (Telling et al., 1994). Die deg- und cyt-Phänotypen werden supprimiert, wenn zusätzlich das E1A-Gen mutiert ist, was zeigt, dass diese Phänotypen Funktionen von E1A sind (White et al., 1988). Weiterhin verzögert das E1B-21kD-Protein die Geschwindigkeit, mit der E1A die anderen viralen Gene anschaltet. Es ist noch nicht bekannt, durch welche Mechanismen das E1B-21kD-Protein diese E1A-abhängigen Funktionen dämpft.
Von humanen Adenoviren abgeleitete Vektoren, in welchen wenigstens die E1-Region deletiert worden ist und durch ein interessierendes Gen ersetzt worden ist, wurden in großem Umfang zu gentherapeutischen Experimenten in der präklinischen- und klinischen Phase verwendet.
Wie vorangehend festgestellt, besitzen alle gegenwärtig in der Gentherapie verwendeten adenoviralen Vektoren Deletionen in der E1-Region, wo neue genetische Information eingefügt werden kann. Die E1-Deletion macht den rekombinanten Virus replikationsunfähig (Stratford-Perricaudet und Perricaudet, 1991). Wir haben gezeigt, dass rekombinante Adenoviren fähig sind, effizient rekombinante Gene in Rattenlebern und Atemwegsepithelien des Rhesusaffen zu übertragen (Bout et al., 1994b; Bout et al., 1994a).
Zudem haben wir (Vincent et al., 1996a; Vincent et al., 1996b) und andere (siehe zum Beispiel Haddada et al., 1993) einen sehr effizienten in vivo Adenovirusvermittelten Gentransfer in eine Vielzahl von Tumorzellen in vitro und in solide Tumoren in Tiermodellen (Lungentumoren, Gliome) und in humane Fremd-Transplantate in immundefizienten Mäusen (Lunge) in vivo beobachtet (Übersichtsartikel von Blaese et al., 1995).
Im Gegensatz zu zum Beispiel Retroviren, gilt für Adenoviren, a) dass sie nicht ins Genom der Wirtszelle integrieren, b) dass sie fähig sind, sich nicht teilende Zellen zu infizieren und c) fähig sind, rekombinante Gene in vivo effizient zu übertragen (Brody und Crystal, 1994). Diese Eigenschaften machen Adenoviren zu attraktiven Kandidaten für den in vivo Gentransfer von zum Beispiel Suizid- oder Cytokingenen in Tumorzellen.
Ein mit der aktuellen Technik rekombinanter Adenoviren verbundenes Problem ist jedoch die Möglichkeit der unerwünschten Erzeugung von replikationsfähigen Adenoviren (RCA) während der Produktion von rekombinanten Adenoviren (Lochmüller et al., 1994; Imler et al., 1996). Dies wird verursacht durch homologe Rekombination zwischen überlappenden Sequenzen aus dem rekombinanten Vektor und den Adenoviruskonstrukten, welche in der komplementierenden Zelllinie, so wie die 293-Zellen (Graham et al., 1977), vorhanden sind. RCA in Chargen, welche für klinische Studien verwendet werden sollen, ist unerwünscht, weil RCA i) in einer unkontrollierten Weise replizieren wird; ii) replikationsunfähige rekombinante Adenoviren komplementieren kann, was zu unkontrollierter Vervielfältigung des rekombinanten Adenovirus führen kann und iii) weil Chargen, welche RCA enthalten, signifikanten Gewebsschaden und damit starke, krankhafte Nebenwirkungen verursachen (Lochmüller et al., 1994). Deshalb sollten Chargen, welche in klinischen Studien verwendet werden sollen, erwiesenermaßen frei von RCA sein (Ostrove, 1994). In einem Aspekt der Erfindung wird dieses Problem bei der Virusproduktion dadurch gelöst, dass wir Verpackungszellen entwickelt haben, welche keine überlappenden Sequenzen mit einem neuen Grundvektor haben und damit geeignet sind für die sichere Produktion von rekombinanten Adenoviren im großen Maßstab. Eines der zusätzlichen Probleme, welches mit der Verwendung rekombinanter Adenoviren verbunden ist, ist die Abwehrreaktion des Wirtes gegen die Behandlung mit Adenoviren.
Kurz gefasst: Bei rekombinanten Adenoviren ist die E1-Region deletiert (siehe oben). Die E1-Produkte des Adenovirus lösen die Transkription der anderen frühen Gene (E2, E3, E4) aus, welche als Folge die Expression der späten viralen Gene aktivieren. Deswegen wurde im allgemeinen gedacht, dass die für E1 deletierten Vektoren keine anderen adenoviralen Gene exprimieren würden. Vor kurzem wurde jedoch demonstriert, das einige Zelltypen fähig sind, adenovirale Gene in der Abwesenheit von E1-Sequenzen zu exprimieren. Dies zeigt, dass einige Zelltypen die Maschinerie besitzen, um die Transkription von adenoviralen Genen anzutreiben. Insbesondere wurde gezeigt, dass solche Zellen E2A und späte adenovirale Proteine synthetisieren.
In einem gentherapeutischen Zusammenhang bedeutet das, dass der Transfer des therapeutischen rekombinanten Gens in somatische Zellen nicht nur in der Expression des therapeutischen Proteins resultiert, sondern auch in der Synthese von viralen Proteinen resultieren kann. Zellen, welche adenovirale Proteine exprimieren, werden von zytotoxischen T-Lymphozyten erkannt und abgetötet, was somit a) die transduzierten Zellen ausmerzt und b) Entzündungen verursacht (Bout et al., 1994a; Engelhardt et al., 1993; Simon et al., 1993). Da diese nachteilige Reaktion die Gentherapie beeinträchtigt, wurden mehrere Lösungen für dieses Problem vorgeschlagen, so wie a) die Verwendung von immunsuppressiven Wirkstoffen nach der Behandlung; b) Beibehaltung der adenoviralen E3-Region im rekombinanten Vektor (siehe Patentanmeldung EP 0707071 ) und c) die Verwendung von temperaturempfindlichen (ts) Mutanten des humanen Adenovirus, welche eine Punktmutation in der E2A-Region haben (Patent WO 94/28938 ).
Diese Strategien zur Umgehung der Immunantwort haben jedoch ihre Limitationen.
Die Verwendung von ts-mutierten rekombinanten Adenoviren verringert die Immunantwort in bestimmtem Umfang, war aber weniger effektiv bei der Prävention pathologischer Reaktionen in der Lunge (Engelhardt et al., 1994a).
Das E2A-Protein selbst kann eine Immunantwort induzieren und es spielt eine fundamentale Rolle in der Umstellung zur Synthese von späten adenoviralen Proteinen. Deshalb ist es attraktiv, rekombinante Adenoviren herzustellen, welche in der E2-Region mutiert sind, was diese temperaturempfindlich (ts) macht, wie dies in der Patentanmeldung WO 94/28938 beansprucht wurde.
Ein wesentlicher Nachteil dieses Systems ist die Tatsache, dass das immunogene Protein, obwohl das E2-Protein bei der nicht-permissiven Temperatur instabil ist, immer noch synthetisiert wird. Zudem muss erwartet werden, dass das instabile Protein, wenn auch in geringem Ausmaß, die späte Genexpression aktiviert. Rekombinante Adenoviren mit der ts125-Mutation wurden untersucht und verlängerte Expression der rekombinanten Gene wurde berichtet (Yang et al., 1994b; Engelhardt et al., 1994a; Engelhardt et al., 1994b; Yang et al., 1995). Es traten jedoch immer noch starke krankhafte Veränderungen in den Lungen von Baumwollratten auf (Engelhardt et al., 1994a), was darauf hindeutet, dass die Verwendung von ts-Mutanten nur in einer teilweisen Verbesserung in der Technik rekombinanter Adenoviren resultiert. Andere (Fang et al., 1996) haben bei der Verwendung rekombinanter ts125-Adenoviren keine verlängerte Genexpression in Mäusen und Hunden beobachtet. Ein zusätzliches Problem, das mit der Verwendung von ts125-mutierten Adenoviren assoziiert ist, ist dass eine hohe Frequenz von Reversionen beobachtet wird. Diese Revertanten sind entweder echte Revertanten oder das Ergebnis von Mutationen an einer zweiten Stelle (Kruijer et al., 1983; Nicolas et al., 1981). Beide Arten von Revertanten haben ein E2A-Protein, welches bei normalen Temperaturen funktioniert, und weisen deshalb eine ähnliche Toxizität wie der Wildtypvirus auf.
In einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung deletieren wir deshalb E2A-codierende Sequenzen aus dem rekombinanten Adenovirusgenom und transfizieren diese E2A-Sequenzen in die (Verpackungs-)Zelllinien, welche die E1-Sequenzen enthalten, um die rekombinanten adenoviralen Vektoren zu komplementieren.
Wesentliche Hürden bei diesem Ansatz sind, a) dass E2A auf sehr hohem Niveau exprimiert werden sollte und b) dass das E2A-Protein sehr toxisch für die Zellen ist.
Die vorliegende Erfindung offenbart deshalb in noch einem anderen Aspekt die Verwendung des ts125-mutierten E2A-Gens, welches ein Protein produziert, das nicht fähig ist, bei der nicht-permissiven Temperatur DNA-Sequenzen zu binden. Hohe Spiegel dieses Proteins können in den Zellen aufrechterhalten werden (weil es bei dieser Temperatur nicht toxisch ist), bis der Wechsel zur permissiven Temperatur erfolgt. Dies kann damit kombiniert werden, dass das mutierte E2A-Gen unter die Kontrolle eines induzierbaren Promotors, so wie zum Beispiel dem Tet, Methallothionein, Steroid-induzierbaren Promotor, Retinsäure-β-Rezeptor oder andere induzierbare Systeme, gestellt wird. In noch einem anderen Aspekt der Erfindung wird jedoch die Verwendung eines induzierbaren Promotors zur Kontrolle des Zeitpunktes der Produktion von toxischem Wildtyp-E2A offenbart.
Zwei zusätzliche, hervorstechende Vorteile der E2A-deletierten, rekombinanten Adenoviren sind die erhöhte Kapazität, heterologe Sequenzen zu beherbergen, und die permanente Selektion von Zellen, welche das mutierte E2A exprimieren. Dieser zweite Vorteil betrifft die hohe Frequenz von Reversionen der ts125-Mutation: Wenn eine Reversion in einer Zelllinie auftritt, die ts125-E2A enthält, wird dies für die Zelle tödlich sein. Deswegen besteht eine permanente Selektion auf die Zellen, welche das ts125-mutierte E2A-Protein exprimieren. Zusätzlich werden wir, da wir in einem Aspekt der Erfindung einen für E2A deletierten rekombinanten Adenovirus herstellen, nicht das Problem der Reversion in unseren Adenoviren haben.
Weiterhin offenbaren wir die Konzeption neuer und verbesserter Kombinationen von (neuen und verbesserten) Verpackungszelllinien und (neuen und verbesserten) rekombinanten adenoviralen Vektoren. Wir stellen zur Verfügung:

1. Verpackungskonstrukte, zur Verwendung für die Herstellung von komplementierenden Verpackungszelllinien aus HER-, HEK-, HEL-Zellen, ohne die Notwendigkeit der Selektion durch Marker-Gene. Diese Zellen sind durch die Expression von E1A immortalisiert. Die Expression von E1B ist jedoch in diesem besonderen Fall essentiell, um die durch E1A-Proteine induzierte Apoptose zu verhindern. Selektion von E1-exprimierenden Zellen wird durch die Selektion auf Fokusbildung (Immortalisierung) erreicht, wie dies für 293-Zellen (Graham et al., 1977) und 911-Zellen (Fallaux et al., 1996) beschrieben wurde. Dies sind E1-transformierte, humane embryonale Nierenzellen (HEK), beziehungsweise humane embryonale Retinoblasten (HER).
2. Nach Transfektion von HER-Zellen mit dem Konstrukt pIG.E1A.E1B (4), konnten sieben unabhängige Zelllinien etabliert werden. Diese Zelllinien wurden als: PER.C1, PER.C3, PER.C4, PER.C5, PER.C6, PER.C8, und PER.C9 bezeichnet. PER bedeutet PGK-E1-Retinoblasten. Diese Zelllinien exprimieren E1A- und E1B-Proteine, sind stabil (zum Beispiel PER.C6 über mehr als 57 Passagen) und komplementieren E1-defiziente adenovirale Vektoren. Ausbeuten von rekombinanten Adenoviren, welche mit PER-Zellen erhalten wurden, sind ein wenig größer als sie mit 293-Zellen erhalten werden. Eine dieser Zelllinien (PER.C6) wurde bei der ECACC unter der Nummer 96022940 deponiert.
3. Neue adenovirale Vektoren mit erweiterten E1-Deletionen (Deletion von nt. 459–3510). Diesen viralen Vektoren fehlen Sequenzen, welche zu den E1-Sequenzen in den Verpackungszelllinien homolog sind. Diese adenoviralen Vektoren enthalten pIX-Promotorsequenzen und das pIX-Gen, da pIX (über seine natürlichen Promotorsequenzen) nur vom Vektor aus und nicht durch Verpackungszellen exprimiert werden kann (Matsui et al., 1986, Hoeben und Fallaux, persönliche Mitteilung; Imler et al., 1996).
4. E2A-exprimierende Verpackungszelllinien, bevorzugt basierend auf entweder E1A-exprimierenden etablierten Zelllinien oder E1A- und E1B-exprimierenden diploiden Zellen (siehe unter 1). E2A-Expression steht entweder unter der Kontrolle eines induzierbaren Promotors oder die E2A-ts125-Mutante wird entweder durch einen induzierbaren oder einen konstitutiven Promotor gesteuert.
5. Rekombinante adenovirale Vektoren, wie vorstehend beschrieben (siehe 3), die aber eine zusätzliche Deletion von E2A-Sequenzen aufweisen.

Die Vektoren werden auch ein Transgen, verbunden mit einer Promotor-Sequenz zur Steuerung der Expression des Transgens, enthalten.
Die wesentlichen Probleme, welche mit den aktuellen, von Adenoviren abgeleiteten Vektoren assoziiert sind, sind:

A) Die starke Immunogenizität des Viruspartikels
B) Die Expression von adenoviralen Genen, die in den adenoviralen Vektoren vorliegen, welche in einer Reaktion der cytotoxischen T-Zellen gegen die transduzierten Zellen resultiert.
C) Die geringe Menge von heterologen Sequenzen, die in den aktuellen Vektoren untergebracht werden kann (annähernd bis zu maximal 8000 Basenpaare heterologer DNA).

Ad A) Die starke Immunogenizität der Adenoviruspartikel resultiert in einer Immunantwort des Wirts, sogar nach einer einzigen Verabreichung des adenoviralen Vektors. Als Folge der Entwicklung neutralisierender Antikörper, wird eine nachfolgende Verabreichung des Virus weniger wirksam oder sogar vollständig unwirksam sein. Die verlängerte oder anhaltende Expression der transferierten Gene wird jedoch die Zahl der benötigten Verabreichungen reduzieren und so das Problem umgehen.
Ad B) Experimente, die von Wilson und Mitarbeitern durchgeführt wurden, haben gezeigt, dass nach durch Adenoviren vermitteltem Gentransfer in immunkompetente Tiere die Expression des Transgens graduell abnimmt und annähernd 2–4 Wochen nach der Infektion verschwindet (Yang et al., 1994a; Yang et al., 1994b). Dies wird verursacht durch die Entwicklung einer zytotoxischen T-Zell(CTL)-Antwort gegen die transduzierten Zellen. Die CTLs waren gegen adenovirale Proteine gerichtet, welche von den viralen Vektoren exprimiert wurden. In den transduzierten Zellen konnte die Synthese des adenoviralen DNA-bindenden-Proteins (das E2A-Genprodukt), der Penton- und Fiberproteine (späte Genprodukte) etabliert werden. Diese adenoviralen Proteine, kodiert durch den viralen Vektor, wurden trotz der Deletion der E1-Region exprimiert. Dies zeigt, dass die Deletion der E1-Region nicht ausreichend ist, um die Expression der viralen Gene vollkommen zu verhindern (Engelhardt et al., 1994a)
Ad C) Untersuchungen von Graham und Mitarbeitern haben gezeigt, dass Adenoviren fähig sind, DNA von bis zu 105% der normalen Größe des Genoms zu verpacken (Bett et al., 1993). Größere Genome neigen dazu, instabil zu sein, was in einem Verlust von DNA-Sequenzen während der Vermehrung des Virus resultiert. Die Kombination von Deletionen in der E1- und E3-Region des viralen Genoms steigert die maximale Größe des Fremdmaterials, das verpackt werden kann, bis auf annähernd 8.3 kb. Zudem scheinen einige Sequenzen der E4-Region verzichtbar für das Wachstum des Virus zu sein (was der maximalen Kapazität zur Verpackung weitere 1,8 kb hinzufügt). Auch die E2A-Region kann aus dem Vektor deletiert werden, wenn das E2A-Genprodukt in der Verpackungszelllinie in trans zur Verfügung gestellt wird, was weitere 1,6 kb hinzufügt. Es ist jedoch unwahrscheinlich, dass die maximale Kapazität für fremde DNA signifikant über 12 kb erhöht werden kann.
Die Anwendungen der offenbarten Erfindungen werden nachstehend umrissen und werden im experimentellen Teil veranschaulicht, was nur für diesen Zweck gedacht ist und nicht dazu verwendet werden sollte, den Umfang der vorliegenden Erfindung, wie sie von einem Fachmann verstanden wird, einzuschränken.
Verwendung der IG-Verpackungskonstrukte – Diploide Zellen.
Die Konstrukte, insbesondere pIG.E1A.E1B, werden verwendet, um diploide humane Zellen, wie humane embryonale Retinoblasten (HER), humane embryonale Nierenzellen (HEK) und humane embryonale Lungenzellen (HEL), zu transfizieren. Transfizierte Zellen werden auf den transformierten Phänotyp (Fokusbildung) hin selektioniert und auf ihre Fähigkeit untersucht, die Vermehrung von E1-deletiertem rekombinantem Adenovirus, wie IG.Ad.MLPI.TK, zu ermöglichen. Solche Zelllinien werden für die Erzeugung und (Großmaßstabs-)Produktion von E1-deletierten rekombinanten Adenoviren verwendet. Solche Zellen, die mit rekombinantem Adenovirus infiziert sind, sind ebenfalls dazu gedacht, in vivo als lokale Produzenten von rekombinantem Adenovirus, zum Beispiel für die Behandlung von soliden Tumoren, verwendet zu werden.
HER-Zellen, welche mit pIG.E1A.E1B transfiziert sind, haben 7 unabhängige Klone ergeben (diese werden als PER-Zellen bezeichnet). Diese Klone werden für die Produktion von E1-deletierten (einschließlich nicht-überlappender adenoviraler Vektoren) oder E1-defizienten rekombinanten adenoviralen Vektoren verwendet und bilden die Basis für die Einführung von zum Beispiel E2B- oder E2A-Konstrukten (zum Beispiel ts125E2A, siehe unten), E4 etc., welche die Vermehrung von adenoviralen Vektoren erlauben, die Mutationen in zum Beispiel E2A oder E4 aufweisen.
Transformierte diploide Zelllinien können als Basis für die Erzeugung von Verpackungszelllinien der ”nächsten Generation” verwendet werden, welche die Vermehrung von E1-defizienten rekombinanten Adenoviren ermöglichen, welche Deletionen auch in anderen Genen, so wie E2A und E4, aufweisen.
E2 exprimierende Zelllinien
Verpackungszellen, die E2A-Sequenzen exprimieren, werden jetzt und zukünftig zur Erzeugung und Produktion (in großem Maßstab) von E2A-deletierten rekombinanten Adenoviren verwendet.
Die neu erzeugten humanen Adenovirus-Verpackungszelllinien oder Zelllinien, die aus Spezies abgeleitet wurden, die permissiv für humane Adenoviren sind (E2A oder ts125E2A; E1A + E2A; E1A + E1B + E2A; E1A + E2A/ts125; E1A + E1B-E2A/ts125) werden jetzt und zukünftig zur Erzeugung und (Großmaßstabs-)Produktion von E2A-deletierten rekombinanten adenoviralen Vektoren verwendet. Zusätzlich werden sie in vivo für die lokale Produktion von rekombinantem Virus angewendet werden, wie für die diploiden Zellen beschrieben (siehe oben).
Neue adenovirale Vektoren
Die neu entwickelten adenoviralen Vektoren, die eine E1-Deletion von nt. 459–3510 enthalten, werden zum Zwecke des Gentransfers verwendet werden. Diese Vektoren sind auch die Basis für die Entwicklung von umfangreicher deletierten adenoviralen Vektoren, welche zum Beispiel für E2A, E2B oder E4 mutiert sind.
Experimenteller Teil
Erzeugung von Zelllinien, die fähig sind, E1-defiziente recombinante adenovirale Vektoren in trans zu komplementieren.
1. 911-Zelllinie
Wir haben eine Zelllinie erzeugt, die E1-Sequenzen des Adenovirus Typ 5 enthält und fähig ist, E1-deletierte rekombinante Adenoviren in trans zu komplementieren (Fallaux et al., 1996).
Diese Zelllinie wurde erhalten durch Transfektion von humanen diploiden embryonalen Retinoblasten (HER) mit pAd5XhoIC, welches nt. 80–5788 des Ad5 enthält. Eine der resultierenden Transformanten erhielt die Bezeichnung 911. Für diese Zelllinie wurde gezeigt, dass sie sehr nützlich für die Vermehrung von E1-defizienten rekombinanten Adenoviren ist. Man fand heraus, dass sie den 293-Zellen überlegen ist. Im Gegensatz zu den 293-Zellen, fehlt den 911-Zellen der vollständig transformierte Phänotyp, was am wahrscheinlichsten der Grund dafür ist, dass diese Linie als adenovirale Verpackungszellline leistungsfähiger ist:
Plaquetests können schneller durchgeführt werden (4–5 Tage anstatt 8–14 Tage bei 293)
Einzellige Schichten von 911-Zellen überleben besser unter einer Agar-Überschichtung wie dies für einen Plaquetest notwendig ist
Stärkere Amplifikation von E1-deletierten Vektoren
Zudem wurden 911-Zellen im Gegensatz zu 293-Zellen, die mit gescherter adenoviraler DNA transfiziert wurden, durch Anwendung eines definierten Konstruktes transfiziert. Die Transfektionseffizienzen von 911-Zellen sind vergleichbar mit denen von 293-Zellen.
Neue Verpackungskonstrukte.
Quelle adenoviraler Sequenzen.
Adenovirale Sequenzen werden entweder aus pAd5.SalB, welches nt. 80–9460 des humanen Adenovirus Typ 5 enthält (Bernards et al., 1983) oder aus Wildtyp Ad5-DNA gewonnen.
pAd5.SalB wurde mit SalI und XhoI gespalten, das große Fragment wurde religiert und dieser neue Klon wurde mit pAd5.X/S bezeichnet.
Das pTN-Konstrukt (hergestellt durch Dr. R. Vogels, IntroGene, Niederlande) wurde als Quelle für den humanen PGK-Promotor und das NEO-Gen verwendet.
Der humane PGK-Promotor und das NEO^R-Gen.
Die Transkription von E1A-Sequenzen in den neuen Verpackungskonstrukten wird durch den humanen PGK-Promotor reguliert (Michelson et al., 1983; Singer-Sam et al., 1984), welcher aus dem Plasmid pTN (Geschenk von R. Vogels), welches pUC119 (Vieira und Messing, 1987) als Rückgrat verwendet, gewonnen wurde. Dieses Plasmid wurde auch als Quelle für das NEO-Gen verwendet, welches mit dem Polyadenylierungssignal aus dem Hepatitis-B-Virus (HBV) verbunden ist.
Verbindung des PGK-Promotors mit den E1-Genen (Fig. 1)
Um die Sequenzen von E1 des Ad5 (ITR, Replikationsursprung und Verpackungssignal) durch heterologe Sequenzen zu ersetzen, haben wir E1-Sequenzen von Ad5 (nt. 459 bis 960), durch Anwendung der Primer Ea1 und Ea2 (siehe Tabelle I) mittels PCR amplifiziert. Das resultierende PCR-Produkt wurde mit ClaI gespalten und in Bluescript (Stratagene), vorher gespalten mit ClaI und EcoRV, ligiert, woraus das Konstrukt pBS.PCRI resultiert.
Der Vektor pTN wurde mit den Restriktionsenzymen EcoRI (partiell) und ScaI gespalten und das DNA-Fragment, welches die PGK-Promotorsequenzen enthält, wurde in PBS.PCRI, gespalten mit ScaI und EcoRI, ligiert. Das resultierende Konstrukt PBS.PGK.PCRI enthält den humanen PGK-Promotor funktionell verbunden mit den Ad5-E1-Sequenzen von nt. 459 bis nt. 916.
Konstruktion von pIG.E1A.E1B.X (Fig. 2)
pIG.E1A.E1B.X wurde dadurch hergestellt, dass das ScaI-BspEI-Fragment von pAT-X/S durch das entsprechende Fragment aus PBS.PGK.PCRI (enthält den PGK-Promotor verbunden mit den E1A-Sequenzen) ersetzt wurde.
pIG.E1A.E1B.X enthält die für E1A und E1B kodierenden Sequenzen unter der Kontrolle des PGK-Promotors.
Da die Ad5-Sequenzen von nt. 459 bis nt. 5788 in diesem Konstrukt vorhanden sind, wird auch das pIX-Protein des Adenovirus durch dieses Plasmid kodiert.
Konstruktion von pIG.E1A.NEO (Fig. 3)
Um den vollständigen E1B-Promotor einzufügen und diesen Promotor in solcher Weise anzubinden, dass das AUG-Codon des E1B-21 kD exakt als AUG-Codon von NEO^R fungiert, haben wir den E1B-Promotor durch Anwendung der Primer Ea3 und Ep2 amplifiziert, wobei der Primer Ep2 eine NcoI-Stelle in das PCR-Fragment einführt. Das resultierende PCR-Fragment, bezeichnet als PCRII, wurde mit HpaI und NcoI gespalten und in pAT-X/S ligiert, welches vorher mit HpaI und mit NcoI gespalten wurde. Das resultierende Plasmid wurde als pAT-X/S-PCR2 bezeichnet. Das NcoI-StuI-Fragment von pTN, welches das NEO-Gen und einen Teil des Polyadenylierungsignals des Hepatitis-B-Virus (HBV) enthält, wurde in pAT-X/S-PCR2 (gespalten mit NcoI und NruI) kloniert. Das resultierende Konstrukt ist: pAT-PCR2-NEO. Das Polyadenylierungsignal wurde durch den Austausch des ScaI-SalI-Fragmentes von pAT-PCR2-NEO durch das entsprechende Fragment von pTN, vervollständigt (resultierend in pAT.PCR2.NEO.p(A)). Das ScaI-XbaI-Fragment von pAT.PCR2.NEO.p(A) wurde durch das entsprechende Fragment von pIG.E1A.E1B-X, welches den PGK-Promotor verbunden mit den E1A-Genen enthält, ersetzt.
Das resultierende Konstrukt wurde als pIG.E1A.NEO bezeichnet und enthält somit E1-Sequenzen aus Ad5 (nt. 459 bis nt. 1713) unter der Kontrolle des humanen PGK-Promotors.
Konstruktion von pIG.E1A.E1B (Fig. 4)
pIG.E1A.E1B wurde durch Amplifikation der Sequenzen, welche die N-terminalen Aminosäuren von E1B-55kD kodieren, durch Anwendung der Primer Eb1 und Eb2 (führt eine XhoI-Stelle ein) hergestellt. Das resultierende PCR-Fragment wurde mit BglII gespalten und in das BglII/NruI-Fragment von pAT-X/S kloniert, wodurch pAT-FCR3 erhalten wurde.
pIG.E1A.E1B wurde hergestellt durch die Einführung der HBV-Poly(A)-Sequenzen aus pIG.E1A.NEO stromabwärts von den E1B-Sequenzen von pAT-PCR3 durch Austausch des XbaI-SalI-Fragmentes von pIG.E1A.NEO mit dem XbaI-XhoI-Fragment von pAT.PCR3.
pIG.E1A.E1B enthält nt. 459 bis nt. 3510 des Ad5, welche die E1A- und E1B-Proteine kodieren. Die E1B-Sequenzen werden am Splice-Akzeptor bei nt. 3511 begrenzt. In diesem Konstrukt sind keine pIX-Sequenzen vorhanden.
Konstruktion von pIG.NEO (Fig. 5)
pIG.NEO wurde durch die Klonierung des HpaI-ScaI-Fragmentes von pIG.E1A.NEO, welches das NEO-Gen unter der Kontrolle des Ad.5-E1B-Promotors enthält, in pBS gespalten mit EcoRV und ScaI, hergestellt.
Dieses Konstrukt ist von Nutzen, wenn etablierte Zellen mit E1A.E1B-Konstrukten transfiziert werden und eine NEO-Selektion benötigt wird. Da die NEO-Expression vom E1B-Promotor gesteuert wird, kann davon ausgegangen werden, dass NEO-resistente Zellen E1A coexprimieren, was auch vorteilhaft ist, um ein hohes Expressionsniveau von E1A während der Langzeitkultur der Zellen zu erhalten.
Überprüfung der Konstrukte
Die Vollständigkeit der Konstrukte pIG.E1A.NEO, pIG.E1A.E1B.X und pIG.E1A.E1B wurde durch Restriktionsenzymkartierung untersucht; weiterhin wurden Teile der Konstrukte, die durch PCR-Analyse erhalten wurden, durch Sequenzanalyse bestätigt. In der Nucleotidsequenz wurden keine Änderungen gefunden.
Die Konstrukte wurden in primäre BRK-Zellen (Baby-Rat-Kidney-Zellen) transfiziert und daraufhin getestet, ob sie die Fähigkeit besitzen, diese Zellen zu immortalisieren (pIG.E1A.NEO) oder vollständig zu transformieren (pAd5.XhoIC, pIG.E1A.E1B.X und pIG.E1A.E1B).
Nieren von 6 Tage alten WAG-Rij-Ratten wurden entnommen, homogenisiert und trypsiniert. Subkonfluente Schalen (Durchmesser 5 cm) der BRK-Zellkulturen wurden transfiziert mit 1 oder 5 μg von pIG.NEO, pIG.E1A.NEO, p1G.E1A.E1B, p1G.E1A.E1B.X, pAd5XhoIC oder mit pIG.E1A.NEO zusammen mit PDC26 (Van der Elsen et al., 1983), welches das Ad5.E1B-Gen unter der Kontrolle des SV40-Early-Promotors enthält. Drei Wochen nach der Transfektion, wenn Fokusse sichtbar waren, wurden die Schalen fixiert, einer Giemsa-Färbung unterzogen und die Fokusse gezählt.
Eine Übersicht der erzeugten adenoviralen Verpackungskonstrukte und ihrer Fähigkeit BRK-Zellen zu transformieren wird in 6 gezeigt. Die Ergebnisse zeigen, dass die Konstrukte pIG.E1A.E1B und pIG.E1A.E1B.X fähig sind, BRK-Zellen in dosisabhängiger Form zu transformieren. Die Effizienz der Transformation ist für beide Konstrukte ähnlich und ist vergleichbar zu der, die für das Konstrukt gefunden wurde, welches verwendet wurde, um die 911-Zellen herzustellen, nämlich pAdS.XhoIC.
Wie erwartet, war pIG.E1A.NEO kaum fähig BRK-Zellen zu immortalisieren. Die Cotransfektion eines E1B-exprimierenden Konstruktes (PDC26) resultierte jedoch in einer signifikanten Erhöhung der Zahl der Transformanten (18 gegenüber 1), was zeigt, dass das durch pIG.E1A.NEO kodierte E1A funktionell ist.
Wir schließen deshalb, dass die neu erzeugten Verpackungskonstrukte zur Herstellung neuer Verpackungslinien für Adenoviren geeignet sind.
Herstellung von Zelllinien mit neuen Verpackungskonstrukten – Zelllinien und Zellkultur
Humane A549-Bronchialkarzinomzellen (Shapiro et al., 1978), humane embryonale Retinoblasten (HER), Ad5-E1-transformierte, humane embryonale Nierenzellen (HEK-Zellen) (293; Graham et al., 1977) und Ad5-tranformierte HER-Zellen (911; Fallaux et al., 1996) und PER-Zellen wurden in Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), ergänzt mit 10% fötalem Kälberserum (FCS) und Antibiotika in einer 5% CO₂ Atmosphäre bei 37°C, gezüchtet. Zellkulturmedien, Reagenzien und Seren wurden bei Gibco Laboratories (Grand Island, NY) erworben. Plastikwaren für die Zellkultur wurden von Greiner (Nürtingen, Deutschland) und Corning (Corning, NY) erworben.
Viren und Virustechniken
Die Konstruktion von adenoviralen Vektoren, IG.Ad.MLP.nls.lacZ, IG.Ad.MLP.luc, IG.Ad.MPL.TK und IG.Ad.CMV.TK wird detailliert in der Patentanmeldung EP 0707071 beschrieben.
Der rekombinante adenovirale Vektor IG.Ad.MLP.nls.lacZ enthält das lacZ-Gen aus E. coli, welches die β-Galactosidase unter der Kontrolle des Ad2-Major-Late-Promotors (MLP) enthält. IG.Ad.MLP.luc enthält das Leuchtkäfer-Luciferase-Gen reguliert durch den Ad2-MLP. Die adenoviralen Vektoren IG.Ad.MLP.TK und IG.Ad.CMV.TK enthalten das Thymidinkinase-Gen (TK-Gen) des Herpes-Simplex-Virus unter der Kontrolle des Ad2-MLP beziehungsweise des Zytomegalie-Virus-Enhancers/Promotors (CMV-Enhancer/Promotor).
Transfektionen
Alle Transfektionen wurden mit durch Calcium-Phosphat-Präzipitation präzipitierter DNA (Graham und Van der Eb, 1973), durch Anwendung des GBICO Calcium Phosphate Transfection System (GIBCO BRL Life Technologies Inc., Gaithersburg, USA) gemäß dem Versuchsprotokoll des Herstellers, durchgeführt.
Westernblot
Subkonfluente Zellkulturen von exponentiell wachsenden 293-, 911- und Ad5-E1-transformierten A549- und PER-Zellen wurden mit PBS gewaschen und in Fos-RIPA-Puffer (10 mM Tris (pH 7,5), 150 mM NaCl, 1% NP40, 01% Natriumdodecylsulfat (SDS), 1% NA-DOC, 0,5 mM Phenyl-methyl-sulphonyl-fluorid (PMSF), 0,5 mM Trypsininhibitor, 50 mM NaF und 1 mM Natriumvanadat) abgeschabt. Nach 10 Minuten bei Raumtemperatur wurden die Lysate durch Zentrifugation geklärt. Die Proteinkonzentrationen wurden mit dem Proteinbestimmungskit von Biorad gemessen und 25 μg des zellulären Gesamtproteins wurden auf ein 12,5% SDS-PAA-Gel geladen. Nach der Elektrophorese wurden die Proteine auf Nitrocellulose transferiert (1 h bei 300 mA). Vorgefärbte Standardproben (Sigma, USA) wurden parallel mitlaufen gelassen. Die Filter wurden mit 1% bovinem Serumalbumin (BSA) in TBST (10 qmM Tris, pH 8, 15 mM NaCl und 0,05% Tween-20) für 1 Stunde geblockt. Die Primärantikörper waren der murine monoklonale Anti-Ad5-E1B-55-kD-Antikörper A1C6 (Zantema et al., unveröffentlicht) und der monoklonale Anti-Ad5-E1B-221-kD-Antikörper C1G11 aus der Ratte (Zantema et al., 1985). Der Zweitantikörper war ein mit Meerrettichperoxidase markierter Ziege-Anti-Maus-Antikörper (Promega). Signale wurden durch verstärkte Chemolumineszenz visualisiert (Amersham Corp, UK).
Southernblot-Analyse
Hochmolekulare DNA wurde isoliert und 10 μg wurden vollständig gespalten und auf einem 0,7% Agarosegel aufgetrennt. Ein Southernblot-Transfer auf eine Hybond N+-Membran (Amersham, UK) wurde mit 0,4 M NaOH, 0,6 M NaCl Transferlösung (Church und Gilbert, 1984) durchgeführt. Die Hybridisierung wurde mit einem 2463-nt. SspI-HindIII-Fragment aus pAd5.SalB (Bernards et al., 1983) durchgeführt. Dieses Fragment besteht aus dem 342–2805 bp-Abschnitt von Ad5. Das Fragment wurde mit α-³²P-dCTP durch Anwendung von Zufallshexanucleotidprimern und der Klenow-DNA-Polymerase radioaktiv markiert. Die Southernblots wurden auf einem Kodak XAR-5 Film bei –80°C exponiert und auf einen Phospho-(mager-Schirm, welcher mittels der Molecular Dynamics Software von B&L-Systems analysiert wurde.
A549
Ad5-E1-transformierte A549 humane Bronchialkarzinomzelllinien wurden durch die Transfektion mit pIG.E1A.NEO und die Selektion auf G418-Resistenz erzeugt. Einunddreißig G418-resistente Klone wurden etabliert. Die Cotransfektion von pIG.E1A.E1B mit pIG.NEO ergab sieben G418-resistente Zelllinien.
PER
Ad5-E1-transformierte, humane embryonale Retinazellen (HER-Zellen) wurden durch die Transfektion von primären HER-Zellen mit dem Plasmid pIG.E1A.E1B erzeugt. Transformierte Zelllinien wurden aus gut abgegrenzten Fokussen etabliert. Wir waren in der Lage sieben klonale Zelllinien zu etablieren, welche wir als PER.C1, PER.C3, PER.C4, PER.C5, PER.C6, PER.C8 und PER.C9 bezeichneten.
Einer dieser PER-Klone, nämlich PER.C6, wurde bei der ECACC unter der Nummer 96022940 hinterlegt.
Expression der Ad5-E1A- und E1B-Gene in transformierten A549- und PER-Zellen
Die Expression der Ad5-E1A- und der 55-kD- und 21-kD-E1B-Proteine in den etablierten A549- und PER-Zellen wurde mittels Westernblot untersucht, wobei monoklonale Antikörper (mAb) verwendet wurden. Der mAb M73 erkennt die E1A-Produkte, während die mAb AlC6 und ClG11 gegen das 55-kD- beziehungsweise das 21-kD-E1B-Protein gerichtet sind.
Die Antikörper erkannten keine Proteine in Extrakten von den parentalen A549- oder den primären HER-Zellen (Daten nicht gezeigt). Keiner der A549-Klone, die durch Cotransfektion von pIG.NEO und pIG.E1A.E1B erzeugt wurden, exprimierte nachweisbare Mengen von E1A- oder E1B-Proteinen (nicht gezeigt). Einige der A549-Klone, die durch Transfektion mit pIG.E1A.NEO erzeugt wurden, exprimierten die Ad5-E1A-Proteine (7). Die Mengen waren aber viel geringer als die, welche in Proteinlysaten von 293-Zellen nachgewiesen wurden. Die E1A-Mengen im Fließgleichgewicht, welche in Proteinextrakten von PER-Zellen nachgewiesen wurden, waren viel größer als die, welche in Extrakten von aus A549-Zellen abgeleiteten Zellen nachgewiesen wurden. Alle PER-Zelllinien exprimierten ähnliche Mengen von E1A-Proteinen (7). Die Expression der E1B-Proteine, insbesondere im Fall von E1B-55kD, war variabler. Verglichen mit 911- und 293-Zellen, exprimierte die Mehrzahl der PER-Klone große Mengen von E1B-55kD und 21kD. Die E1B-21kD-Menge im Fließgleichgewicht war bei PER.C3 am größten. Keiner der PER-Klone büßte die Expression der Ad5-E1-Gene bei fortgesetzter Passage der Zellen ein (nicht gezeigt). Wir fanden heraus, dass das Niveau der E1-Expression in PER-Zellen über mindestens 100 Verdopplungen der Population stabil blieb. Wir beschlossen, die PER-Klone detaillierter zu charakterisieren.
Southern-Analyse der PER-Klone
Um die Anordnung der Ad5-E1 kodierenden Sequenzen in den PER-Klonen zu untersuchen, führten wir Southern-Analysen durch. Zelluläre DNA wurde aus allen PER-Klonen und aus 293- und 911-Zellen extrahiert. Die DNA wurde mit HindIII gespalten, welches einmal in der Ad5-E1-Region spaltet. Southern-Hybrdisierung auf mit HindIII gespaltener DNA, durch Anwendung einer radioaktiv markierten Ad5-E1-spezifischen Sonde, offenbarte das Vorliegen von mehreren integrierten Kopien von pIG.E1A.E1B im Genom der PER-Klone. Die 8 zeigt das Verteilungsmuster der E1-Sequenzen in der hochmolekularen DNA der verschiedenen PER-Zelllinien. Die Kopien konzentrieren sich in einer einzelnen Bande, was nahe legt, dass sie als Tandem-Repeats integriert sind. Im Fall von PER.C3, C5, C6 und C9 fanden wir zusätzliche hybridisierende Banden von geringem Molekulargewicht, welche das Vorliegen von verkürzten Kopien von pIG.E1A.E1B zeigen. Die Zahl der Kopien wurde durch Anwendung eines Phospho-Imager bestimmt. Wir schätzten, dass PER.C1, C3, C4, C5, C6, C8 und C9 jeweils 2, 88, 5, 4, 5, 5, beziehungsweise 3 Kopien der Ad5-E1 kodierenden Region enthalten und das 911- und 293-Zellen 1 beziehungsweise 4 Kopien der Ad5-E1-Sequenzen enthalten.
Transfektionseffizienz
Rekombinante Adenovektoren werden durch Cotransfektion von Adapter-Plasmiden und dem großen ClaI-Fragment von Ad5 in 293-Zellen erzeugt (siehe Patentanmeldung EP 0707071 ). Die DNA des rekombinanten Virus wird durch homologe Rekombination zwischen den homologen viralen Sequenzen, welche in dem Plasmid und der DNA des Adenovirus vorliegen, gebildet. Die Effizienz dieser Methode, so wie die von alternativen Strategien, hängt in hohem Maße von der Transfizierbarkeit der Helferzellen ab. Deshalb haben wir die Transfektionseffizienzen einiger PER-Klone mit 911-Zellen, durch Anwendung des die β-Galaktosidase kodierenden lacZ-Gens aus E. coli als Reporter, verglichen (9).
Produktion von rekombinanten Adenoviren
Ausbeuten von rekombinanten Adenoviren, welche nach Inokulation von 293-911-, PER.C3-, PER.C5-, und PER.C6-Zellen mit verschiedenen adenoviralen Vektoren erhalten wurden, werden in Tabelle II gezeigt.
Die Ergebnisse legen nahe, dass die Ausbeuten, welche mit PER-Zellen erhalten werden, wenigstens genauso groß wie jene sind, die mit den existierenden Zelllinien erhalten wurden.
Zudem waren die Ausbeuten des neuen adenoviralen Vektors IG.Ad.MLPI.TK mit allen untersuchten Zelllinien ähnlich oder größer, als die Ausbeuten, die mit anderen viralen Vektoren erhalten wurden.
Erzeugung von neuen adenoviralen Vektoren (Fig. 10).
Die verwendeten adenoviralen Vektoren (siehe Patentanmeldung EP 0707071 ) weisen eine Deletion der E1-Sequenzen von 459 bis nt. 3328 auf.
Da das Konstrukt pIG.E1A.E1B die Ad5-Sequenzen 459 bis nt. 3510 enthält, gibt es eine Sequenzüberlappung von 183 nt. zwischen den E1B-Sequenzen im Verpackungskonstrukt pIG.E1A.E1B und rekombinanten Adenoviren, wie zum Beispiel IG.Ad.MLP.TK. Die überlappenden Sequenzen wurden aus den neuen adenoviralen Vektoren deletiert. Zusätzlich wurden nicht-kodierende Sequenzen, welche aus lacZ abgeleitet sind und in den ursprünglichen Konstrukten vorhanden sind, ebenfalls deletiert. Dies wurde durch Amplifikation der SV40-Poly(A)-Sequenzen aus pMLP.TK mittels PCR durch Verwendung der Primer SV40-1 (führt eine BamHI-Stelle ein) und SV40-2 (führt eine BglII-Stelle ein) erreicht (siehe 10). Zusätzlich wurden Ad5-Sequenzen, welche in diesem Konstrukt vorhanden sind, von nt. 2496 (Ad5, führt eine BglII-Stelle ein) bis zu nt. 2779 (Ad5-2) amplifiziert. Beide PCR-Fragmente wurden mit BglII gespalten und ligiert. Das Ligierungsprodukt wurde mittels PCR durch Verwendung der Primer SV40-1 und Ad5-2 amplifiziert. Das gewonnene PCR-Produkt wurde mit BamHI und AflII gespalten und in pMLP.TK, welches vorher mit den gleichen Enzymen gespalten wurde, ligiert. Das resultierende Konstrukt, bezeichnet als pMLPI.TK, enthält eine Deletion in den adenoviralen E1-Sequenzen von nt. 459 bis nt. 3510.
Verpackungssystem
Die Kombination des neuen Verpackungskonstruktes pIG.E1A.E1B und des rekombinanten Adenovirus pMLPI.TK, welche keine Sequenzüberlappung aufweisen, werden in 11 dargestellt. In dieser Figur wird auch die ursprüngliche Situation, in der die Sequenzüberlappung angezeigt wird, dargestellt.
Die Abwesenheit von überlappenden Sequenzen zwischen pIG.E1A.E1B und pMLPI.TK (11a) schließt die Möglichkeit einer homologen Rekombination zwischen Verpackungskonstrukt und rekombinantem Virus aus und ist deshalb eine wesentliche Verbesserung für die Produktion von rekombinanten Adenoviren im Vergleich zur ursprünglichen Situation.
In 11b ist die Situation für pIG.E1A.NEO und IG.Ad.MLPI.TK dargestellt. Von pIG.E1A.NEO ist zu erwarten, dass es, wenn es in etablierte Zelllinien transfiziert wird, ausreichend ist, um die Vermehrung von E1-deletierten rekombinanten Adenoviren zu ermöglichen. Diese Kombination hat keine Sequenzüberlappung, was die Erzeugung von RCA durch homologe Rekombination verhindert. Zusätzlich erlaubt dieses praktische Verpackungssystem die Vermehrung von rekombinanten Adenoviren, bei welchen nur die E1A-Sequenzen, aber nicht die E1B-Sequenzen deletiert sind. Rekombinante Adenoviren, die E1B in der Abwesenheit von E1A exprimieren, sind attraktiv, da das E1B-Protein, insbesondere E1B-19kD, fähig ist, infizierte humane Zellen vor der Lyse durch Tumor-Nekrose-Faktor (TNF) zu bewahren (Gooding et al., 1991).
Erzeugung rekombinanter, von pMLPI.TK abgeleiteter Adenoviren.
Rekombinante Adenoviren wurden durch Cotransfektion von 293-Zellen mit durch SalI linearisierter pMLPI.TK-DNA und mit ClaI linearisierter Ad5-wt-DNA erzeugt. Das Verfahren ist schematisch in 12 dargestellt.
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Tabelle I
Primer, die zur PCR-Amplifikation von DNA-Fragmenten verwendet werden, die zur Erzeugung von Konstrukten verwendet werden, die in dieser Patentanmeldung beschrieben werden.
Tabelle II

Claims

Kombination bestehend aus: einem rekombinantem Nucleinsäuremolekül, das auf einem Adenovirus beruht oder aus einem Adenovirus abgeleitet ist, wobei das Nucleinsäuremolekül ein funktionelles Enkapsidierungssignal und wenigstens einen funktionellen Inverted Terminal Repeat oder ein funktionelles Fragment oder Derivat davon aufweist, und einer Verpackungszelle, wobei die rekombinante Nucleinsäure und die Verpackungszelle zusammen alle Elemente umfassen, die notwendig sind, um ein rekombinantes adenovirales Partikel, das das rekombinante Nucleinsäuremolekül umfasst, zu erzeugen, wobei das rekombinante Nucleinsäuremolekül keine überlappenden Sequenzen aufweist, die eine homologe Rekombination, die zu einem replikationskompetenten Virus in der Verpackungszelle führt, ermöglichen, und wobei das Genom der Verpackungszelle eine adenovirale Sequenz umfasst, die aus Ad5-Nucleotiden 459–3510 besteht, und wobei die Zelle eine menschliche embryonale Retinoblasten(HER)-Zelle, eine menschliche embryonale Nieren(HEK)-Zelle oder eine menschliche embryonale Lungen(HEL)-Zelle ist.
Kombination nach Anspruch 1, wobei das Nucleinsäuremolekül in linearer Form vorliegt und einen Inverted Terminal Repeat an oder nahe an beiden Termini aufweist.
Kombination nach Anspruch 1, wobei das Nucleinsäuremolekül in linearer und im Wesentlichen einzelsträngiger Form vorliegt und am 3'-Terminus eine Sequenz umfasst, die komplementär zu einem Teil stromaufwärts des gleichen Strangs des Nucleinsäuremoleküls ist, wobei die Sequenz fähig ist, mit dem Teil eine Rasenpaarung in einer solchen Weise einzugehen, dass sie als Startstelle für eine Nucleinsäure-Polymerase dienen kann.
Kombination, die ein rekombinantes Nucleinsäuremolekül umfasst, das aus der Einwirkung einer Nucleinsäure-Polymerase auf ein Nucleinsäuremolekül resultiert, welches von einer Kombination nach Anspruch 3 umfasst ist.
Kombination nach Anspruch 4, wobei das Nucleinsäuremolekül einen Inverted Terminal Repeat an beiden Termini aufweist.
Kombination nach Anspruch 1, wobei die Verpackungszelle ein Nucleinsäuremolekül mit einer Wirtsbereichsmutation umfasst.
Kombination nach Anspruch 1, wobei die Verpackungszelle ein Nucleinsäuremolekül umfasst, das eine E2-Region unter der Kontrolle eines induzierbaren Promotors umfasst.
Kombination nach Anspruch 1, wobei die Verpackungszelle mit einem oder mehreren Verpackungsnucleinsäuremolekülen versehen ist, die der Zelle die Fähigkeit verleihen, adenovirale Genprodukte, die aus der E2A-Region abgeleitet sind, zu exprimieren.
Kombination nach Anspruch 8, wobei das rekombinante Nucleinsäuremolekül, das die E2A-Region codiert, unter der Kontrolle eines induzierbaren Promotors ist.
Verpackungszelle, die ein DNA-Fragment eines Adenovirus beherbergt, wobei das Fragment aus den Nucleotiden 459–3510 des Genoms des menschlichen Adenovirus 5 besteht, wobei die Zelle eine menschliche embryonale Retinoblasten(HER)-Zelle, eine menschliche embryonale Nieren(HEK)-Zelle oder eine menschliche embryonale Lungen(HEL)-Zelle ist.
Kombination nach einem der Ansprüche 8 oder 9, wobei die Verpackungszelle eine diploide Zelle ist.
Kombination nach einem der Ansprüche 1 bis 9 oder 11, wobei das rekombinante Nucleinsäuremolekül ein DNA-Molekül ist.
Kombination nach Anspruch 1, wobei das rekombinante Nucleinsäuremolekül wenigstens eine Deletion der Nucleotide 459–3510 der E1-Region aufweist.
Verwendung einer Kombination nach einem der Ansprüche 1 bis 9 oder 11 bis 13 zur Herstellung eines Batchs von rekombinanten Adenoviruspartikeln, wobei der Batch frei von replikationskompetenten Partikeln ist.
Kombination nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei das Nucleinsäuremolekül funktionelle E2A- und E2B-Gene oder funktionelle Fragmente oder Derivate davon unter der Kontrolle eines E1A-unabhängigen Promotors umfasst.
Zelle nach Anspruch 10 wie unter der Nummer 96022940 bei der ECACC hinterlegt.
Verpackungszelle zum Verpacken von Nucleinsäuremolekülen, die von Adenovirus abgeleitet sind, wobei die Verpackungszelle mit einem oder mehreren Verpackungsnucleinsäuremolekülen versehen ist, wobei das eine oder die mehreren Verpackungsnucleinsäuremoleküle der Zelle die Fähigkeit verleiht/verleihen, adenovirale Genprodukte zu exprimieren, die wenigstens sowohl von der E1A- als auch von der E2A-Region abgeleitet sind, wobei das Verpackungsnucleinsäuremolekül, das die E2A-Region codiert, so mutiert ist, dass wenigstens eines seiner Produkte temperaturempfindlich ist, und wobei die Zelle eine menschliche embryonale Retinoblasten (HER)-Zelle, eine menschliche embryonale Nieren(HEK)-Zelle oder eine menschliche embryonale Lungen(HEL)-Zelle ist.
Kombination nach Anspruch 1, wobei die Verpackungszelle eine PER.C6-Zelle wie unter der Nummer 96022940 bei der ECACC hinterlegt ist.
Verpackungszelle, dadurch gekennzeichnet, dass sie in ihrem Genom eine adenovirale Sequenz umfasst, die aus den Ad5-Nucleotiden 459–3510 besteht, und wobei die Zelle eine menschliche embryonale Retinoblasten(HER)-Zelle, eine menschliche embryonale Nieren(HEK)-Zelle oder eine menschliche embryonale Lungen(HEL)-Zelle ist.