DE69633974T2

DE69633974T2 - Nachweis von nukleinsäure-variationen

Info

Publication number: DE69633974T2
Application number: DE69633974T
Authority: DE
Inventors: Mellor Edwin SOUTHERN; Elizabeth Clare PRITCHARD; Charles Stephen CASE-GREEN
Original assignee: Oxford Gene Technology IP Ltd
Current assignee: Oxford Gene Technology IP Ltd
Priority date: 1995-04-07
Filing date: 1996-04-09
Publication date: 2005-12-01
Anticipated expiration: 2016-04-10
Also published as: DE69636843D1; EP1693469A2; US20070111235A1; JPH11503019A; DE69638248D1; EP1308523B1; EP0820524B1; GB9507238D0; EP1308523A3; DE69633974D1; JP3908784B2; US20020106665A1; EP0820524A1; EP1308523A2; EP1693469A3; WO1996031622A1; US6770751B2; US6150095A; US7192707B2; EP1693469B1

Description

EINLEITUNG
Der Nachweis einer Variation in DNA-Sequenzen bildet die Grundlage bei vielen Anwendungen der modernen Gen-Analyse: er wird bei der Kopplungsanalyse verwendet, um Krankheitsgene in menschlichen Ahnenreihen oder wirtschaftlich wichtige Charakterzüge bei Tier- und Pflanzenzuchtprogrammen zu verfolgen; er bildet die Grundlage der Fingerabdruck-Verfahren, die bei der forensischen Testung und bei der Vaterschaftstestung [Krawczak und Schmidtke, 1994] verwendet werden; er wird zum Nachweis von Mutationen in biologisch und klinisch wichtigen Genen [Cooper und Krawczak, 1989] verwendet. Die Bedeutung des DNA-Polymorphismus wird durch die große Anzahl von Verfahren unterstrichen, die zu seinem Nachweis und seiner Messung entwickelt wurde [Cotton, 1993]. Die meisten dieser Verfahren hängen von einer der zwei analytischen Verfahrensweisen, Gelelektrophorese oder Molekül-Reassoziierung, ab, um die Sequenzvariation nachzuweisen. Jede dieser potenten Verfahrensweisen hat ihre Nachteile. Die Gelelektrophorese verfügt über eine sehr hohe Auflösungskraft und ist besonders zum Nachweis einer Variation in den Mini- und Mikrosatellitenmarkern geeignet, die bei der Kopplungsanalyse und beim Fingerabdruck verwendet werden; sie ist auch das zur Analyse der Variation angewandte Verfahren, die in den Triplett-Sequenzwiederholungen, die eine Anzahl von Mutationen verursachen, die nun bekanntlich etwa 10 genetische Störungen in Menschen verursachen [Willems, 1994], festgestellt wird. Trotz des großen Erfolgs und der weit verbreiteten Anwendung, hat sich die Gelelektrophorese in der Automatisierung als schwierig erwiesen: sogar die Systeme, die das Datensammeln automatisieren, erfordern die manuelle Gelpräparation; und da die Proben von Hand geladen werden, ist eine Verwechslung der Proben leicht. Kontinuierlich lesende Elektrophoresegeräte sind teuer, und die manuelle Analyse ist technisch anspruchsvoll, so dass ihre Verwendung auf Speziallaboratorien mit hohem Durchsatz begrenzt ist. Außerdem schließen Schwierigkeiten beim Messen der Fragmentgröße eine exakte statistische Auswertung der Ergebnisse aus.
Im Gegensatz dazu eignet sich die Oligonucleotid-Hybridisierung zur Automatisierung und quantitativen Analyse [Southern et al., 1992], ist allerdings zur Analyse der Variation in der Anzahl der Wiederholungen in den Mikro- und Minisatelliten nicht gut geeignet, da die geringen partiellen Änderung in der Anzahl der Sequenzwiederholungen eine kaum nachweisbare Änderung in der Signalstärke hervorruft; und es wäre natürlich nicht möglich, zwei Allele in der gleichen Probe zu unterscheiden, da jedes zu einer einzigen Intensitätsmessung beitragen würde. Somit würden viele verschiedene Kombinationen von Allelen das gleiche Signal erzeugen. Die derzeitigen Hybridisierungsverfahren sind zur Analyse der Variation in der DNA aufgrund von Punktmutation – Basen-Substitutionsdeletionen und -Insertionen, für die es möglich ist, Allel-spezifische Oligonucleotide (ASOs) zu konstruieren, die sowohl den Wildtyp als auch die mutierten Sequenzen erkennen [Conner et al., 1983], viel besser geeignet. Somit ist es im Prinzip möglich, in einem relativ einfachen Test alle möglichen Genotypen nachzuweisen. Jedoch besteht ein bei der Verwendung der Oligonucleotid-Hybridisierung in der Praxis auftretendes Problem darin, dass in einigen Fällen das Ausmaß der Reassoziierung durch ein fehlgepaartes Basenpaar kaum beeinflusst wird.
DIE ERFINDUNG
Die Erfindung beschreibt einen allgemeinen Weg, der auf sämtliche Formen von Variationen, die üblicherweise als DNA-Marker zur Genanalyse verwendet werden, angewandt werden kann. Sie kombiniert die Sequenz-spezifische Hybridisierung an Oligonucleotide, die bei der bevorzugten Ausführungsform an einen festen Träger gebunden sind, mit enzymatischen Reaktionen, die die Diskriminierung zwischen zusammenpassenden und nicht zusammenpassenden Doppelhelices verstärken und gleichzeitig einen Weg für das Anknüpfen eines Markers bereitstellen, um anzuzeigen, wann oder welche Reaktion erfolgt ist. Zwei enzymatische Reaktionen, Kettenextension durch DNA-abhängige DNA-Polymerasen und DNA-Strangverknüpfung durch DNA-Ligasen, sind von einem perfekten Zusammenpassen der Sequenzen am oder in der Nähe des Extensions- oder Verknüpfungspunkt abhängig. Wie wir zeigen werden, existieren mehrere Wege, wobei diese Enzyme mit Sequenz-spezifischen Oligonucleotiden zum Nachweis von Variation in Zielsequenzen eingesetzt werden können.
In sämtlichen Fällen ist die zu analysierende Sequenz, die Zielsequenz, als Nukleinsäuremolekül zugänglich und kann ein DNA-Molekül sein, das beispielsweise durch die Polymerasekettenreaktion erzeugt worden ist. Allerdings sind die Verfahren nicht auf die Analyse der auf diesem Weg erzeugten DNA beschränkt. Bei sämtlichen Anwendungen wird die Zielsequenz zuerst durch Hybridisieren mit Oligonucleotiden abgefangen, die an einen festen Träger gebunden sind; beispielsweise können die Oligonucleotide in situ synthetisiert werden, wie beschrieben [Maskos und Southern, 1992]; oder sie können zuvor synthetisiert und sodann an die Oberfläche gekoppelt werden [Khrapko et al., 1991].
Bei einem Aspekt der Erfindung ergibt sich die Neuheit durch die Ausnutzung von Enzymen in Kombination mit Substraten oder Primern, die an feste Träger gebunden sind. Eine weitere Neuheit nutzt die Beobachtung aus, dass DNA-Ligasen und -Polymerasen zur Unterscheidung von Sequenzvarianten verwendet werden können, die sich in der Anzahl der Einheiten einer tandemartig angeordneten Wiederholungssequenz unterscheiden. Diese Beobachtung ist überraschend, da tandemartig wiederholte Sequenzen in jeder beliebigen gegenseitigen Anordnung eine Doppelhelix bilden können und somit die Längenvarianten im Prinzip Doppelhelices bilden können, die an den Enden zusammenpassen, auch wenn die beiden Stränge verschiedene Anzahlen von Wiederholungseinheiten enthalten. Obwohl die beanspruchte Erfindung gebundene Oligonucleotide einsetzt, sollte es klar sein, dass diese Reaktion zur Analyse von VNTR(variable Anzahl von Wiederholungseinheiten in Tandemanordnung)-Sequenzen in der flüssigen Phase und anschließend ein anderes Analyseverfahren, wie Gelelektrophorese, verwendet werden könnte.
Bei einem Aspekt stellt die Erfindung das Verfahren nach Anspruch 1 oder Anspruch 2 bereit.
Bei einem anderen Aspekt stellt die Erfindung das Verfahren nach Anspruch 3 bereit.
Ein Polynucleotid-Ziel wird in Lösung bereitgestellt und kann DNA oder RNA sein. Dieses Polynucleotid-Ziel wird mit einer Oligonucleotid-Sonde zur Hybridisierung gebracht. Der Begriff Oligonucleotid wird hier als die übliche Terminologie für Primer und Substrate verwendet, die in der Regel von Polymerase- und Ligase-Enzymen verwendet werden. Allerdings wird der Begriff im weiten Sinne verwendet, um jede beliebige Substanz abzudecken, die für die Enzyme als Substrat dient, einschließlich von einzelsträngigen Ketten von kurzer oder mittlerer Länge, bestehend aus den Resten von Nucleotiden oder Oligonucleotid-Analogen, und auch von längeren Ketten, die üblicherweise als Polynucleotide bezeichnet werden.
Die Sonden sind an einen Träger gebunden, vorzugsweise über eine kovalente Verknüpfung und vorzugsweise über einen 5'- oder 3'-terminalen Nucleotidrest. Eine Aneinanderreihung von Oligonucleotid-Sonden kann an beabstandeten Stellen, beispielsweise an eine derivatisierte Glasoberfläche oder an die Oberfläche eines Siliciummikrochips oder alternativ an einzelne Perlen, gebunden sein.
Bei einem weiteren Aspekt stellt die Erfindung eine Aneinanderreihung, wie nach Anspruch 17 oder Anspruch 18 oder Anspruch 25 definiert, bereit.
Die Erfindung stellt auch ein Verfahren zur Herstellung einer Aneinanderreihung, wie in Anspruch 26 definiert, bereit.
Bezug genommen wird auf die beigefügten Zeichnungen, in denen jede der 1 bis 6 eine Reihe von Diagrammen darstellt, die ein erfindungsgemäßes Verfahren erläutert.
1 zeigt den Nachweis einer Punktmutation durch Einzelbasenextension.
2 zeigt den Nachweis einer Punktmutation durch Hybridisierung mit Allel-spezifischen Oligonucleotiden und Kettenextension.
3A zeigt den Nachweis einer Punktmutation durch Ligation eines markieren Anhangs an Allel-spezifische Oligonucleotide.
3B zeigt den Nachweis einer Punktmutation durch Ligation mit einer Bibliothek von verschieden markierten Allel-spezifischen Oligonucleotiden.
4A zeigt die Analyse der variablen Anzahl von Sequenzwiederholungen in Tandemanordnung durch Ligation des markierten Anhangs an Allel-Varianten.
4B zeigt die Analyse der variablen Anzahl von Sequenzwiederholungen in Tandemanordnung durch Ligation des markierten Anhangs an Allel-Varianten.
5 zeigt die Messung der variablen Anzahl von Sequenzwiederholung in Tandem-Anordnung durch markierte Kettenextension.
6 zeigt die Analyse der variablen Anzahl von Sequenzwiederholung in Tandem-Anordnung durch Ligation des markierten Anhangs und anschließende Kettenextension.
AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG
Nachweis von Punktmutation
I. Einzelbasen-spezifische Extension von gebundenen Primern
Bei dieser Anwendung endet das gebundene Oligonucleotid in einer Position einer Base vor der variablen Base in der Zielsequenz (1). Ein Nucleotidvorläufertriphosphat oder Dideoxyribonucleotidtriphosphat, das beispielsweise mit einer fluoreszierenden angehängten Markierung markiert ist, wird in Gegenwart eines Nukleinsäure-synthetisierenden Enzyms zugesetzt, das ein zum Einbau der komplementären Base spezifisches Templat erfordert. Im Falle von DNA-Polymerase wird die markierte Base nur dann von einem Deoxyribonucleotid-Vorläufer eingebaut, wenn die Vorläuferbase zu der Base in der Zielsequenz komplementär ist. Somit ergeben Mutanten ein negatives Ergebnis.
II. Kettenextension aus gebundenen ASOs
In diesem Fall endet das gebundene Oligonucleotid in einer Base, die zu der variablen Base in der Zielsequenz komplementär ist. Es werden markierte Vorläufer-Nucleotidtriphosphate und Polymerase zugesetzt. Die Polymerisation erfolgt nur dann, wenn die letzte Base des Primers zu den variablen Basen in dem Ziel komplementär ist (2). Somit ergeben Mutanten ein negatives Ergebnis.
III. Ligation von Markierungssequenzen an gebundene ASOs
Bei diesem Verfahren kann das gebundene Oligonucleotid an der variablen Position in der Zielsequenz enden, oder es kann nahe an dieser Position enden. In jedem Fall erzeugt die Hybridisierung des Ziels an die gebundenen ASOs nur dann ein Substrat zur Ligation eines Markierungsoligonucleotids, wenn die Basen an der Verknüpfung gut zusammenpassen (3a). Somit ergeben Mutanten, die nahe genug an der Verknüpfungsposition sind, um die Ligation zu verhindern, ein negatives Ergebnis. Alternativ kann das gebundene Oligonucleotid an der Base vor der variablen Position enden; in diesem Fall kann die Ligationsreaktion unter Verwendung eines Gemisches von Markierungsoligonucleotiden, eines für jede der möglichen alternativen Varianten, durchgeführt werden. Jede Markierung wäre unterschiedlich markiert, beispielsweise mit einem unterschiedlichen Fluorophor, so dass diejenigen, die ligiert werden, erkannt werden könnten und die Basenvariante identifizieren (3b).
IV. Analyse der VNTR-Längen durch Ligation an verankerte VNTRS
Bei dieser Anwendung werden nach der Hybridisierung des Ziels, das als Templat dient, "Markierungs"-Oligonucleotide an Serien von gebundenen Oligonucleotiden ligiert, um die Markierungen und die gebundenen Oligonucleotide zusammenzubringen.
In 4a umfassen die gebundenen Oligonucleotide drei Teile, eine "Anker"-Sequenz, die sämtlichen Mitgliedern einer VNTR-Serie gemeinsam ist, die an den festen Träger angeknüpft ist und die mit einer Sequenz hybridisiert, die die variable Region flankiert, eine variable Anzahl der wiederholten Sequenzeinheit und eine distale Sequenz. Jedes Allel, das durch eine verschiedene Anzahl von Sequenzwiederholungen dargestellt ist, befindet sich auf einem verschiedenen festen Träger oder an verschiedenen Stellen auf den gleichen festen Träger. Die Hybridisierung der Zielsequenz erzeugt eine Serie von Doppelhelices, deren Strukturen von der Anzahl von Einheiten, die das Ziel enthalten, abhängen. Wenn die Anzahl mit der Anzahl in einem gebundenen Oligonucleotid übereinstimmt, trifft das Ziel das Ende einer Markierung, wenn die Markierung mit der distalen Sequenz des gebundenen Oligonucleotids hybridisiert ist. Wenn die Anzahl größer oder kleiner ist, entsteht eine Lücke in der Doppelhelix, die die Ligation des markierten Anhangs herabsetzt oder verhindert.
In 4b umfassen die gebundenen Oligonucleotide zwei Teile: eine "Anker"-Sequenz, die sämtlichen Elementen einer VNTR-Serie gemeinsam ist und die mit einer Sequenz, die die wiederholte Region flankiert, hybridisiert, und eine variable Anzahl der wiederholten Sequenzeinheit. Jedes Allel, das durch eine verschiedene Anzahl von Sequenzwiederholungen dargestellt ist, befindet sich auf einem verschiedenen festen Träger oder an einer verschiedenen Stelle auf dem gleichen festen Träger. Die Hybridisierung der Zielsequenz erzeugt eine Reihe von Doppelhelices, deren Strukturen von der Anzahl von Sequenzwiederholungen, die das Ziel enthält, abhängt (4b). Wenn die Anzahl mit der Anzahl in einem gebundenen Oligonucleotid übereinstimmt, trifft letzteres auf das Ende der angehängten Markierung, wenn die Markierung an ihr Komplement in der Zielsequenz hybridisiert ist, und bildet ein Substrat zur Ligation des markierten Anhangs. Wenn die Anzahl größer oder kleiner ist, liegt in der Doppelhelix eine Lücke vor, die die Ligation des markierten Anhangs herabsetzt oder verhindert.
V. Analyse der VNTR-Längen durch Kettenextension
Die Anzahl der Wiederholungseinheiten in einer VNTR kann innerhalb enger Grenzen variieren, und unter diesen Umständen ist das vorstehend beschriebene Analyseverfahren unter Verwendung einer Ligase angemessen; in anderen Fällen, beispielsweise bei Trinucleotid-Sequenzwiederholungen, die mit einer Anzahl von menschlichen vererbten Störungen zusammen hängen, kann die Variation für eine Analyse auf diesem Weg zu groß sein. Für eine Anzahl von Triplett- Wiederholungssequenzen kann die Variation etwa 10–50 in dem normalen Chromosom bis zu mehr als Tausend in dem betroffenen Individuum betragen (Tabelle 1). Wahrscheinlich ist es unrealistisch, solche großen Anzahlen von Wiederholungssequenzen unter Verwendung der Ligasereaktion zu messen. In diesen Fällen, wobei der Unterschied zwischen dem normalen und dem mutierten Allel groß ist, besteht eine Alternative darin, unter Verwendung markierter Vorläufer mit einem polymerisierenden Enzym die Anzahl der Wiederholungseinheiten ungefähr zu messen. Das Enzym kann entweder eine Polymerase sein, wie eine DNA-abhängige DNA-Polymerase oder eine Ligase. Im ersten Fall müssen Oligonucleotide mit ihren 5'-Enden gebunden sein, um die Anforderung für die enzymatische Extention durch die Polymerase zu erfüllen. Der feste Träger trägt einen Oligonucleotid-Anker, der zu einer Sequenz komplementär ist, die die Wiederholungseinheit flankiert; beispielsweise kann die Sequenz diejenige von einem der Primer sein, der zur Amplifizierung der Testsequenz durch die PCR verwendet wird. Nach der Hybridisierung der Testsequenz mit dem Anker kann die inserierte Sequenzwiederholung durch eine Polymerase oder Ligase kopiert werden (5), die einen markierten Vorläufer umfasst. Die Menge des eingebauten Markers ist proportional zu der Anzahl der Wiederholungseinheiten. Eine unvollständige Hybridisierung des Ziels an die Ankersequenz würde ein täuschend niedriges Maß für die Wiederholungseinheitsanzahl ergeben. Dieses Problem kann durch Standardisieren der Messung auf einen von mehreren möglichen Wegen behoben werden. Wenn beispielsweise die Zielsequenz an sich markiert ist, wie in 5 gezeigt, besteht eine endgültige Messung in dem Verhältnis von zwei Markern: Ziel und eingebautem Vorläufer.
Alternativ endet, im Falle einer Triplett-Sequenzwiederholung, der Einbau am Punkt in der Sequenz, wo die fehlende Vorläuferbase zur weiteren Extension benötigt wird; wo eine Ligase zur Polymerisierung von Monomeren der basalen Wiederholungseinheit verwendet wurde, endet diese ebenfalls am Ende des VNTR-Inserts. Zu diesem Zeitpunkt kann eine markierte "Kappungs"-Sequenz durch Ligation addiert werden. In solchen Fällen besteht die Messung in dem Verhältnis von Kappungs- zu Polymermarkern.
VI. Analyse der VNTR-Längen durch Kombinieren von Ligation und Kettenextension
Ein wirksamerer Weg der Analyse von VNTRs, die über einen breiten Bereich in der Länge variieren können, besteht darin, zuerst die Ligation an ein markiertes angehängtes Oligonucleotid zu testen; dies ergibt die Ergebnisse, die bereits für Ziele mit verschieden langen Wiederholungseinheiten beschrieben worden sind: ein negatives Ergebnis, wobei die VNTR-Längen im Ziel länger oder kürzer sind als in den gebundenen Oligonucleotiden, und positive Ergebnisse, wo sie gleich waren. Im Anschluss an die Ligation, von der wir gezeigt haben, dass sie bis zum vollständigen Ablauf durchgeführt werden kann, verhalten sich die verschiedenen Längenklassen als Substrate für die DNA-Polymerase unterschiedlich. Diejenigen Ziele, in denen die Sequenzwiederholungsanzahl geringer ist als diejenige der gebundenen Sonde, wirken nicht als Substrate (6c). Ziele, die die gleiche Anzahl von Sequenzwiederholungen aufweisen wie die Sonden, werden durch Polymerase nicht verlängert, da die ligierte Markierung die Extension blockiert (6a). Die einzigen Fälle, wobei die Extension auftritt, sind diejenigen, für die die Ziele länger sind als die Sonden (6b). Wenn die Analyse an einer Aneinanderreihung von Sonden mit verschiedenen Anzahlen von Inserts bis zu einer bestimmten Grenze erfolgt, existiert aus den Ligationsergebnissen ein klarer Hinweis über die Anzahl der Sequenzwiederholungen in den Zielen, mit der Maßgabe, dass sie innerhalb des Bereichs der in der Sonden-Aneinanderreihung dargestellten Größen liegen. Wenn unter den Zielen ein Ziel existiert, das länger ist als dieser Bereich, taucht es bei der Polymeraseanalyse auf. Der Test ist besonders für Triplett-Sequenzwiederholungen geeignet, die mit den so genannten "dynamischen Mutationen" zusammenhängen, beispielsweise mit derjenigen, die bei der fragilen X-Mutation festgestellt wird, wobei der Größenbereich von ca. 10– 1000 variiert. Es wäre schwer, für alle diese Größenklassen eine einzige Aneinanderreihung zu übernehmen.
EXPERIMENTELLE BESTÄTIGUNG DER ANSPRÜCHE
Eigenschaften der DNA-Polymerasen und -Ligasen
Die meisten DNA-Polymerasen, reversen Transcriptasen, einige DNA-abhängige RNA-Polymerasen und -Ligasen können als Substrate ein oder mehrere Oligonucleotide verwenden, die über eine Watson-Crick-Basenpaarung an einen langen DNA-Strang gebunden sind. Im Falle der Polymerasen wird ein Oligonucleotid als Primer verwendet, an den die erste Base in der wachsenden Kette addiert wird. Im Falle von Ligasen werden zwei Oligonucleotide verknüpft, mit der Maßgabe dass beide mit dem DNA-Strang gepaart sind und in den Basenpaaren an oder in der Nähe des Verknüpfungspunktes perfekt zusammen passen. Es sind diese Eigenschaften, die die Enzyme zum Nachweis der DNA-Sequenzvariation brauchbar machen; insbesondere die Anforderung für die spezifische Basenpaarung an der Extensions- oder Verknüpfungsstelle ergänzt die Sequenzdiskriminierung, die bereits durch die Watson-Crick-Paarung bereitgestellt ist, zwischen Oligonucleotid und Zielsequenz, die zur Bildung einer stabilen Doppelhelix benötigt wird. Somit wurde gefunden, dass die Diskriminierung durch Hybridisierung allein besonders empfindlich ist, wenn die variante(n) Base(n) in der Nähe der Mitte des Oligonucleotids liegt (liegen). Im Gegensatz dazu ist für die Enzyme die Diskriminierung am stärksten, wenn die varianten fehlgepaarten Basen in der Nähe des Endes liegen, wo die Extension oder die Verknüpfung erfolgt. Zusammengenommen stellen Hybridisierung unter stringenten Bedingungen und enzymatische Extension oder Verknüpfung eine größere Diskriminierung als eines allein bereit, und es wurden bereits mehrere Verfahren entwickelt, um diese Kombination in Systemen zur Genanalyse zu nutzen [Hinweise bei Cotton, 1993]. Hybridisierung und Enzymreaktion werden normalerweise in Lösung durchgeführt, worauf das Produkt an einem festen Träger abgefangen oder durch Gelelektrophorese zum Nachweis und/oder zur Messung abgetrennt wird.
Bei einer Ausführungsform setzt die hier beschriebene Erfindung Oligonucleotide ein, die an eine feste Oberfläche gekoppelt sind, so dass die Vorteile des Arbeitens in einer Mischphase sämtlichen Schritten: Hybridisierung, enzymatische Extension oder Verknüpfung und Nachweis, zugute kommt. Dies liefert eine große Empfindlichkeit und Zweckmäßigkeit. Da an 1 Oberfläche viele verschiedene Oligonucleotide in einer Aneinanderreihung gebunden werden können, wird die Analyse vieler verschiedener Sequenzen auf einmal in einer einzigen Reaktion ermöglicht. Dies gewährleistet auch, dass sämtliche Reaktionen unter identischen Bedingungen durchgeführt werden, was Vergleiche zuverlässiger macht.
Träger-gebundene Oligonucleotide
Zwei verschiedene Verfahren wurden zur Herstellung von Oligonucleotiden entwickelt, die an einen festen Träger gebunden sind: sie können in situ synthetisiert oder zuvor synthetisiert und mit dem Träger verknüpft werden. In jedem Fall ist die Verwendung der Träger-gebundenen Oligonucleotide in einer Hybridisierungsreaktion mit Oligonucleotiden in der flüssigen Phase unter Bildung von Doppelhelices möglich; der Oligonucleotid-Überschuss in Lösung kann anschließend weg gewaschen werden. Die Hybridisierung kann unter stringenten Bedingungen durchgeführt werden, so dass nur gut zusammen passende Doppelhelices stabil sind. Sollen Enzyme verwendet werden, ist die chemische Orientierung des Oligonucleotids wichtig. Polymerasen addieren Basen an das 3'-Ende der Kette; Ligasen verknüpfen Oligonucleotide, die am 5'-Ende phosphoryliert sind, mit denjenigen mit einer 3'-OH-Gruppe. Oligonucleotide, die über ein Ende an das feste Substrat gebunden sind, können in situ unter Verwendung der entsprechenden Phosphoramidit-Vorläufer hergestellt werden [Hinweise bei Beaucage und Lyer, 1992]; oder zuvor synthetisierte Oligonucleotide können über entsprechende Gruppen an einem Ende fixiert werden. Wir zeigen, dass Oligonucleotide unter Verwendung von ATP und Polynucleotidkinase am 5'-Ende in situ phosphoryliert werden können, oder sie können chemisch phosphoryliert werden [Horn und Urdea, 1986].
Gebundene Oligonucleotide als Substrate für DNA-modifizierende Enzyme
Die hier in Betracht gezogenen Anwendungen erfordern, dass die an das feste Substrat gebundenen Oligonucleotide an Reaktionen teilnehmen können, die durch DNA-Polymerasen und -Ligasen katalysiert werden.
DNA-Polymerase
Der M13-Sequenzierungsprimer – 5'-GTAAAACGACGGCCAGT-3' – der über sein 5'-Ende an aminiertes Polypropylen gebunden ist, wurde synthetisiert, wie beschrieben. Eine Lösung von M13-DNA (einzelsträngig, replikative Form, 0,1 μl, 200 ng/μl) wurde in zwei kleinen Flecken auf die Oberfläche des derivatisierten Polypropylens aufgebracht. Eine Lösung, die drei nicht radioaktive Deoxyribonucleotidtriphosphate, dATP, dGTP, dTTP (jeweils 10 μmol), α³²P-dCTP (10 μCi), Taq-DNA-Polymerase und die entsprechenden Salze enthielt, wurde über einen breite Bereich des Polypropylens, einschließlich des Bereichs, wo die M13-DNA aufgetüpfelt wurde, aufgebracht. Das Polypropylen wurde 1 h bei 37°C in einer dampfgesättigten Kammer inkubiert. Anschließend wurde es in 1% SDS bei 100°C 1 min gewaschen und eine Minute einem Phosphorspeicherbildschirm ausgesetzt und in einem Phosphor-Bilderzeugungsgerät durchmustert. Die Regionen, wo DNA aufgebracht wurde, zeigten ein hohes Maß an Radioaktivität gegen einen schwachen Hintergrund, wo keine DNA aufgebracht wurde. Das Experiment zeigt, dass die an einen festen Träger gebundenen Oligonucleotide als Primer für die DNA-abhängige Synthese durch DNA-Polymerase wirken können, wie für Anwendungen unter Verwendung dieses Enzyms zur Mutationsdetektion erforderlich.
Die nachstehend beschriebenen Experimente zeigen, dass sowohl die Polynucleotidkinase als auch DNA-Ligase zur Modifizierung von Oligonucleotiden verwendet werden können, die an einen festen Träger gebunden sind. Es existieren mehrere Wege, wobei phosphorylierte Oligonucleotide und die Ligasereaktion zum Nachweis einer Sequenzvariation eingesetzt werden können.
Verfahren zur Herstellung von Aneinanderreihungen von Sequenzvarianten
1. Allel-spezifische Oligonucleotide für Punktmutationen
Für die bevorzugte Ausführungsform ist die Verwendung von Oligonucleotiden, die an einen festen Träger gebunden sind, notwendig. Der Träger kann die Form von Teilchen, beispielsweise Glaskügelchen oder Magnetperlen, einnehmen. In diesem Fall können die Reaktionen in Röhrchen oder in den Vertiefungen einer Mikrotiterplatte durchgeführt werden. Verfahren sowohl zur Synthese von Oligonucleotiden als auch zum Binden von vorsynthetisierten Oligonucleotiden an diese Materialien sind bekannt [Stahl et al., 1988]. Verfahren zur Herstellung von Aneinanderreihungen von ASOs, die Punktmutationen repräsentieren, wurden in der Patentanmeldung PCT/GB89/00460 und bei Maskos und Southern (1993) beschrieben. Wir zeigten auch, wie die Oligonucleotide, die in einer Aneinanderreihung an einen festen Träger gebunden sind, durch molekulare Hybridisierung mutierte Allele von Wildtyp-Allelen unterscheiden können.
Für die vorliegende Erfindung können die gleichen Verfahren angewandt werden, um Oligonucleotid-Aneinanderreihungen von ASOs zu erzeugen. Allerdings müssen sie, um als Substrat für die Enzyme verwendet werden zu können, modifiziert werden; zur Ligation kann die Phosphorylierung des 5'-Endes notwendig sein; zur Extension durch Polymerase ist die Anknüpfung an Oligonucleotide an den festen Substrat über ihre 5'-Enden notwendig.
2. Aneinanderreihungen zur Durchmusterung von Regionen auf Mutationen
Oft ist es erwünscht, eine relativ kurze Region eines Gens oder Genoms auf Punktmutationen zu durchmustern: beispielsweise sind viele verschiedene Stellen in dem CFTR-Gen mutiert, so dass zystische Fibrose hervorgerufen wird; gleichermaßen kann das Tumorsuppressorgen p53 an vielen Stellen mutiert sein. Die großen Anzahlen von Oligonucleotiden, die benötigt werden, um alle potentiellen Stellen in der Sequenz zu überprüfen, kann durch effiziente Kombinationsverfahren hergestellt werden [Southern et al., 1994]. Eine Modifikation des Protokolls könnte es ermöglichen, dass solche Aneinanderreihungen in Verbindung mit Enzymen verwendet werden können, um an sämtlichen Stellen in der Zielsequenz nach Mutationen zu suchen.
3. VNTRs
Die am häufigsten verwendeten VNTRs sind Sequenzwiederholungen von sehr kurzen Einheiten, typischerweise Mono- bis Tetranucleotide. Allerdings existiert eine andere Klasse, die Minisatelliten, in denen die Wiederholungseinheit etwas länger ist, bis zu 20 oder mehr Oligonucleotide. Die kurzen Wiederholungseinheiten können unter Anwendung von chemischer Synthese hergestellt werden; im Falle von Inserts mit großen Anzahlen von Wiederholungseinheiten wäre es wirtschaftlicher, einen Syntheseweg zu verwenden, der die Wiederholungseinheit als Reaktant verwendet, statt sie Base-für-Base aufzubauen; solche Verfahren wurden zur Herstellung von Polynucleotiden durch chemische Synthese verwendet. Eine attraktive Alternative wäre der Aufbau der Wiederholungseinheiten durch Ligation der Monomereinheiten; sie könnten schrittweise, eine Einheit gleichzeitig, addiert werden, mit der Maßgabe, dass ein Verfahren zur Blockierung eines Endes gefunden werden könnte, um eine Polymerisation zu verhindern; beispielsweise kann der Oligonucleotid-aufbauende Block mit einer Hydroxylgruppe terminiert werden, die anschließend nach Ligation phosphoryliert wird, so dass die Einheit zu einem Akzeptor für die nächste Einheit wird; das Monomer kann eine Phosphatgruppe aufweisen, die mit einer abspaltbaren Gruppe, wie eine Licht-abspaltbare Gruppe, geschützt ist, die nach Ligation entfernt werden kann, um eine anschließende Ligation zu ermöglichen [Pillai, 1980]. Eine zweite Alternative, die für längere Einheiten wie die Minisatelliten, besonders günstig ist, besteht darin, entweder klonierte oder enzymatisch amplifizierte Moleküle an den festen Träger zu binden. Beispielsweise kann jede variante Sequenz unter Verwendung eines biotinylierten Oligonucleotids für einen der Primer durch die PCR amplifiziert werden. Der Strang, der mit dieser Gruppe beginnt, kann sodann an eine Streptavidin-überzogene Oberfläche gebunden werden, und der andere durch Schmelzen entfernt werden [Stahl et al., 1988].
BEISPIEL 1
DEMONSTRATION DER ANALYSE DES LÄNGENPOLYMORPHISMUS DURCH LIGATION AN EINE ANEINANDERREIHUNG VON VNTRs
Eine Aneinanderreihung von VNTRs wurde hergestellt, wie in 4b beschrieben, wobei die Ankersequenz 5'-tgtagtggtgtgatcaaggc-3' war. Die Wiederholungseinheit war 5'-cttt-3'; ca. 3 mm breite Streifen von Sequenzvarianten der Form: Anker-Sequenzwiederholung_N, mit N = 4–10, wurden als Streifen auf der Oberfläche einer Polypropylenfolie hergestellt. Die Synthese wurde unter Verwendung von 3'-Deoxyribophosphoramiditen hergestellt, diese chemische Orientierung erzeugt Oligonucleotide, die über ihre 3'-Enden an das Polypropylen gebunden sind, und eine freie 5'-Hydroxylgruppe. Zur Erzeugung eines Substrats zur Ligation wurde diese OH-Gruppe durch Eintauchen eines Streifens des Polypropylens (3 mm × 18 mm), der die Aneinanderreihung von Oligonucleotiden trägt, in 0,5 ml einer Lösung, enthaltend 4 mM ATP und 77,6 Einheiten Polynucleotidkinase mit Puffer und Mg⁺⁺, nach den Anweisungen des Herstellers, phosphoryliert. Die Reaktion wurde 6 h bei 37°C stehen gelassen; der Streifen wurde entfernt und zum Abtöten der Polynucleotidkinase in kochendes Wasser eingetaucht. Die Zielsequenzen, die zu den Elementen der aneinander gereihten Oligonucleotide und zu der ligierten Markierung, 5'-Anker-Sequenzwiederholung₁₀-Markierung und 5'-Anker-Sequenzwiederholung₅-Markierung, komplementär sind, wurden zu 0,5 ml einer Lösung, die auf 95 °C vorgeheizt war, die die Markierung 5'-gtggtcactaaagtttctgct-3', die an ihrem 5'-Ende unter Verwendung von Polynucleotidkinase und ³³P-Gamma-ATP markiert war, thermische Ligase (500 Einheiten) und Puffer und Salze nach den Anweisungen des Herstellers enthielt, zugesetzt. Der Polypropylenstreifen wurde in die heiße Lösung eingetaucht, die sodann auf 68°C abkühlen gelassen und bei dieser Temperatur 16 h stehengelassen wurde. Der Polypropylenstreifen wurde entfernt und bei 95°C 5 min in 25% Formamid, eingetaucht, bei der gleichen Temperatur in Wasser gespült, getrocknet und einem Phosphorspeicherbildschirm ausgesetzt, von dem ein Bild der Radioaktivität gesammelt wurde. Die Ergebnisse zeigten über den größten Teil der Aneinanderreihung Counts, die dem Hintergrund sehr nahe kamen; die Counts an Anker-Sequenzwiederholung₅ und Anker-Sequenzwiederholung₁₀ betrugen mehr als das Fünffache derjenigen über die angrenzenden Zellen in der Aneinanderreihung. Dieses Experiment zeigt, dass die Ligase in der Lage ist, Längenvarianten der Wiederholungssequenz zu unterscheiden und sich eine optimale Ligation nur ergibt, wenn die Anzahl der Sequenzwiederholungen in dem Ziel mit derjenigen in dem Allel-spezifischen Oligonucleotid in der Aneinanderreihung übereinstimmt. Es sollte somit leicht möglich sein, die beiden Allelvarianten in einer Heterozygote nachzuweisen.
Die Ligation und/oder Polymerisation ist möglich, wenn das Oligonucleotid über das 5'-Ende gebunden ist. Die Oligonucleotide können in situ unter Verwendung von Deoxyribophosphoramiditen mit 3'-Dimethoxytritylgruppen und 5'-Phosphoramidit (reverse Phosphoramidite) synthetisiert werden. Es ist unnötig, das gebundene Oligonucleotid für die Ligationstests zu binden, da das zur Ligation benötigte Phosphat von dem angehängten Oligonucleotid bereitgestellt wird.
BEISPIEL 2
Analyse der VNTR-Längen
Eine Aneinanderreihung von VNTRs wurde, wie in 4B beschrieben, mit den über ihr 5'-Ende-verankerten Oligonucleotide hergestellt. Die Wiederholungseinheit war 5'-ttca und die Verankerungssequenz 5'-cttatttccctca. Streifen von 6 mm Breite von Sequenzvarianten der Form: Anker-Sequenzwiederholung_N, wobei N = 4–8, wurden unter Verwendung von "reversen" Phosphoramidit-Monomeren auf der Oberfläche einer Polypropylenfolie hergestellt.
Analyse durch Ligation
Ein Streifen der Aneinanderreihung (30 mm × 2 mm) wurde in eine Lösung von 600 pmol des Ziel-Oligonucleotids 5'-cacagactccatgg(tgaa)₆-tgagggaaataag, 1,4 pmol Oligo-5'-ccatggagtctgtg (markiert an seinem 5'-Ende unter Verwendung von Polynucleotidkinase und ³³P-Gamma-ATP) und Puffer und Salzen, nach den Anweisungen des Herstellers, wobei das Gesamtvolumen 293 μl betrug, eingetaucht. Die Lösung wurde auf 65°C erwärmt, und 7 μl Tth-DNA-Ligase wurden zugesetzt. Anschließend wurde die Reaktion auf 37°C abgekühlt und 18 h bei dieser Temperatur belassen. Nach Entnahme aus der Reaktionslösung wurde der Streifen mit T. E.-Puffer gewaschen, trocken getupft und einem Phosphorspeicherbildschirm ausgesetzt, von dem ein Bild der Radioaktivität aufgenommen wurde. Die Ergebnisse zeigen, dass die Zielsequenz, die an die korrekte Sequenz ligiert war, mit höherer Ausbeute als an die kürzeren und längeren Sequenzen in den danebenliegenden Zellen der Anordnung ligierte.
BEISPIEL 3
Analyse durch Ligation und Polymerisation
Ein Streifen der Aneinanderreihung (30 mm × 2 mm) aus Beispiel 2 wurde einer Lösung von 200 pmol des Ziel-Olegonucleotids 5'- cacagactccatgg(tgaa)₆tgagggaaataag, 200 pmol Oligo-5'-ccatggagtctgtg (chemisch phosphoryliert am 5'-Ende) mit Puffer und Salzen nach den Anweisungen des Herstellers, wobei das Gesamtvolumen 243 μl betrug, zugesetzt. Die Lösung wurde auf 85°C erwärmt und während 30 min auf 37 °C abgekühlt. 7 μl Tth-DNA-Ligase wurden zugesetzt, und das Reaktionsgemisch wurde 17 h bei 34°C erhitzt. Der Streifen wurde entnommen und einer Lösung von 8 mM DTT, 3,3 pmol ³²P-α-dTTP, 13 Einheiten Sequenase, Version 2,0, und Puffer und Salzen nach den Anweisungen des Herstellers zugesetzt. Das Gesamtvolumen betrug 250 μl. Nach 3 h Erhitzen bei 37°C wurde der Streifen der Reaktionslösung entnommen, in TE-Puffer gewaschen, trocken getupft und einem Phosphorspeicherbildschirm ausgesetzt, von dem ein Bild der Radioaktivität aufgenommen wurde. Die Ergebnisse zeigten Counts, die dem Hintergrund entsprechen, über den Bereich der Aneinanderreihung, wo die Wiederholungseinheiten in der Länge gleich waren oder größer waren als die Wiederholungslänge des Ziels, mit einem 20-fachen Signal in den Bereichen, wo die Wiederholungslänge der Aneinanderreihung kürzer war als die Wiederholungslänge in dem Ziel.
BEISPIEL 4
Analyse durch Polymerisation
Zwei Typen von Polymerase-Analysen wurden durchgeführt, wobei in einem Fall zur Identifizierung der korrekten Wiederholungslänge und im anderen Fall zur Identifizierung kürzerer Sequenzwiederholungslängen Reporter-Oligonucleotide gewählt wurden. Dies wird möglich, wenn die Wiederholungssequenz weniger als alle vier Basen umfasst.
Im ersten Fall wird eine Base gewählt, die in der Wiederholungssequenz zugegen und von der ersten Base in der flankierenden Sequenz verschieden ist. Im letzteren Fall wird eine Base so gewählt, dass sie zu der ersten Base in der flankierenden Sequenz, die in der Wiederholungseinheit fehlt, komplementär ist.
Ein Streifen der Aneinanderreihung von Beispiel 2 (30 mm × 2 mm) wurde einer Lösung von 500 pmol des Zieloligonucleotids 5'-cacagactccatgg(tgaa)₆tgagggaaataag in Puffer und Salzen in 1,09-facher der vom Hersteller angegebenen Konzentration, wobei das Gesamtvolumen 275 μl betrug, zugesetzt. Die Lösung wurde 5 min auf 75°C erwärmt und während 25 min auf 37°C abgekühlt. Die Lösung wurde entfernt und zu 3,3 pmol ³²P-α-dCTP, 5 μl 1 M DTT, 13 Einheiten Sequenase, Version 2,0, und Wasser gegeben, um ein Endvolumen von 295 μl zu ergeben. Die Lösung wurde der Aneinanderreihung zugesetzt und bei 37°C 15 h 40 min erwärmt. Der Polypropylenstreifen wurde entnommen, in Wasser gewaschen und einem Phosphorspeicherbildschirm ausgesetzt. Die Ergebnisse zeigten für die korrekte Sequenz Counts, 5-fach stärker als die kürzeren Sequenzen, und zweimal stärker als die längeren Sequenzwiederholungen.
Ein ähnlicher Streifen der Aneinanderreihung (30 mm × 2 mm) wurde einer Lösung von 500 pmol des Ziel-Oligonucleotids 5'-cacagactccatgg(tgaa)₆-tgagggaaataag in Puffer und Salzen, das 1,09-Fache der Anweisungen des Herstellers, wobei das Gesamtvolumen 275 μl beträgt, zugesetzt. Die Lösung wurde 5 min auf 75°C erhitzt und während 25 min auf 37°C abgekühlt. Die Lösung wurde entfernt und zu 3,3 pmol ³²P-α-dTTP, 5 μl 1 M DTT, 13 Einheiten Sequenase, Version 2,0 und Wasser zugesetzt, um ein Endvolumen von 295 μl zu ergeben. Die Lösung wurde der Aneinanderreihung zugesetzt und bei 37°C 15 h 40 min erwärmt. Der Polypropylenstreifen wurde entnommen, in Wasser gewaschen und einem Phosphorspeicherbildschirm ausgesetzt. Die Ergebnisse zeigten für die kürzeren aneinander gereihten Sequenzen Counts, 4,5-fach stärker als die korrekten und die längeren Sequenzwiederholungslängen.
BEISPIEL 5
VNTR-Analyse durch Ligation
Bei einem Experiment, entsprechend dem in Beispiel 1 beschriebenen, wurde eine Aneinanderreihung unter Verwendung der menschlichen fes/fps-Locus-Sequenz als Ziel hergestellt. Die Anker-Sequenz 5'-agagatgtagtctcattctttcgccaggctgg-3' war die tatsächliche flankierende Sequenz für die attt-Sequenzwiederholungen des fes/fps-Mikrosatelliten (EMBL Zugangs-Nr. X06292 M14209 M14589) wie er in menschlicher Genom-DNA auftritt. Unter Verwendung eines Ziel-Oligonucleotids, das die 10 Wiederholungsallele darstellt, und Ligieren einer ³³P-markierten 5'-Flankierungssequenz (5'-g gag aca agg ata gca gtt c 3') und Durchführen eines zu den vorstehend beschriebenen ähnlichen Experiments lag die resultierende Radioaktivität an der Zelle Anker-Sequenzwiederholung₁₀ über dem 10-Fachen von derjenigen an den daneben liegenden Zellen in der Aneinanderreihung.
BEISPIEL 6
Demonstration der stufenweise Ligation von an einen festen Träger gebundenen Oligonucleotiden
Ein Primer-Oligonucleotid 5'-PO₄ gta aaa cga cgg cca gt-3', das mit einem aminiertes Polypropylen über sein 3'-Ende verknüpft war, wurde wie beschrieben synthetisiert und phosphoryliert. Eine kleines quadratisches (2 mm × 2 mm) Stück dieses Materials wurde mit dem Templat-Oligonucleotid 5'-tcg ttt tac cgt cat gcg tcc tct ctc-3' (250 nM) und einem geschützten Ligations-Oligonucleotid 5'NB-PO₄-cgc-atg-acg-3' (250 nM) und ³³P-markiertem Extender-Oligonucleotid 5'-gag-aga-gga-3', wobei NB eine Schutzgruppe auf der Basis eines Licht-abspaltbaren O-Nitrobenzylderivats ist, in Ligations-Standardpuffer gegeben. Das NB-geschützte Phosphat des Ligator-Oligonucleotids hat sich bereits zur Teilnahme an der Ligationsreaktion als unfähig erwiesen. Die NB-Gruppe hat sich auch durch UV-Licht als entfernbar erwiesen, wobei eine voll funktionsfähige Phosphatgruppe zurück blieb. Zu diesem Gemisch wurde 25 U Thermus thermophilus-DNA-Ligase (Advanced Biotechnologies) gegeben, und die Reaktion wurde bei Raumtemperatur 6 h inkubiert. Anschließend wurde das Gemisch mit UV-Licht (20 min, Raumtemperatur) bestrahlt und weitere 12 h inkubiert. Der Polypropylenflicken wurde sodann mit 30% Formamid bei 95 °C 5 min gewaschen und 24 h einem Phosphorspeicherbildschirm ausgesetzt und in einem Phosphor-Bilderzeugungsgerät abgetastet. Der Flicken zeigte ein Radioaktivitätsniveau, das 50-fach höher war als ein auf ähnliche Weise, allerdings ohne Zugabe des zentralen "Ligator"-Oligonucleotids, behandelter Flicken. In einem ähnlichen Experiment, unter Verwendung eines phosphorylierten Ligator-Oligonucleotids, wurde eine ähnliche Menge an radioaktivem Extender-Oligonucleotid mit einem dritten Polypropylen/Oligonucleotidprimer-Quadrats kovalent verknüpft.
BEISPIEL 7
Demonstration der Punktmutationsanalyse durch Ligation an Allel-spezifische Oligonucleotide, die an feste Träger gebunden sind
Vier gebundene, sich nur in ihrer 5'-Base unterscheidende ASOs 5'-(gca oder t)ag aga gga-3' wurden synthetisiert, wie zuvor beschrieben, wobei das 3'-Ende an aminiertes Polypropylen gebunden wird. Die Phosphorylierung wurde wie beschrieben durchgeführt, und vier Polypropylenquadrate, jeweils mit ASO, wurden zusammen mit dem komplementären Ziel-Oligonucleotid 5'-tcc tct ctc cgt cat gcg tat cgt tca at-3' (250 nM) in Ligationsstandardpuffer gegeben. Nach Zugabe von ³²P-markiertem Ligator-Oligonucleotid 5'-cgc atg acg-3' (10 nM) und Thermus thermophilus-DNA-Ligase (100 U) wurde das Gemisch 18 h bei 37°C inkubiert. Es wurde gefunden, dass das ASO, das zu dem Ziel-Oligonucleotid vollkommen komplementär war, durch Ligation des markierten Ligators eine hundertfach größere Aktivität als die nicht komplementären ASOs angesammelt hat.
BEISPIEL 8
Demonstration der DNA-Ligationsspezifität
In einem Modellexperiment zur Bewertung der Spezifität von Tth-DNA-Ligase wurden Ligator- und Extender-Deoxyoligonucleotide mittels Hybridisierung an ein Oligonucleotid-Templat und Ligation durch DNA-Ligase miteinander ligiert.
Das Templat-Oligonucleotid 5'-tcc tct ctc cgt cat gcg tat cgt tca at-3' (250 nM), phosphoryliert, ³³P-markiert, das Extender-Oligonucleotid 5'-PO₄gag aga gga-3' (10 nM) und die Ligator-Sequenz 5'-gca gta cg-3' (250 nM) wurden in einem Ligationsstandardpuffer mit 25 U DNA-Ligase miteinander vermischt. Das Gemisch wurde bei 35°C inkubiert. Proben dieses Gemisches wurden entnommen und die Reaktion durch Zugabe von Formamid bei 15, 30, 60, 120 und 240 min gestoppt. Die ligierten und unligierten Produkte wurden durch 20% denaturierende Polyacrylamidgelelektrophorese aufgetrennt. Das Gel wurde 18 h einem Phosphorschirm ausgesetzt und durch ein Phosphor-Bilderzeugungsgerät abgetastet. Sodann wurden die relativen Anteile von ligiertem und unligiertem Produkt der Reaktion gemessen. In 30 min wurden 50% der Extender-Sequenz mit der Ligator-Sequenz ligiert. Durch Vergleich in einem ähnlichen Experiment mit dem Ligator 5'-gca tga ag-3' wurden nach 30 min nur 1% der Extensionssequenz ligiert.
Auch von weiteren Polymerasen und Ligasen, wie Taq-Polymerase, Thermosequenase, T4-DNA-Ligase und E. Coli-DNA-Ligase wurde gezeigt, dass sie bei Experimenten, entsprechend den vorstehend beschriebenen, geeignet sind.
LITERATURHINWEISE

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DNA-SEQUENZEN DER TRIPLETT-SEQUENZWIEDERHOLUNGEN
TABELLE 1

Claims

Verfahren zur Analyse, das umfasst: Bereitstellen eines Polynucleotid-Ziels, das ein Nucleotid an einer festgelegten Position einschließt, und von zwei oder mehreren verschiedenen Oligonucleotid-Sonden, die in Form einer Aneinanderreihung an verschiedene Stellen eines Trägers gebunden sind, wobei jede Sonde zu dem Ziel einschließlich einer erwarteten Variante des Ziels komplementär ist und an oder nahe an der festgelegten Position endet; und Durchführen der Schritte: (a) Inkubieren des Ziels mit den Sonden unter Bildung eines Doppelstrangs (von Doppelsträngen), (b) Inkubieren des Doppelstrangs (der Doppelstränge) unter (i) Ligationsbedingungen mit einem markierten Oligonucleotid, das zu dem Ziel komplementär ist, oder (ii) Kettenextensionsbedingungen mit mindestens einem markierten Nucleotid; und (c) Aufzeichnen der Zugabe des Nucleotids/Oligonucleotids zu einer Sonde durch Ligation oder Kettenextension in Schritt (b) als Zeichen einer Punktmutation an der festgelegten Position in dem Ziel.
Verfahren zur Analyse, welches umfasst: Bereitstellen eines Polynucleotid-Ziels, das ein Nucleotid an einer festgelegten Position einschließt, und einer Oligonucleotid-Sonde, die an einen Träger gebunden ist, wobei die Sonde zu dem Ziel komplementär ist und eine Base vor der festgelegten Position endet; und Durchführen der Schritte (a) Inkubieren des Ziels mit der Sonde unter Bildung eines Doppelstrangs, (b) Inkubieren des Doppelstrangs unter (i) Ligationsbedingungen mit einem markierten Oligonucleotid, das zu dem Ziel komplementär ist und eine erwartete Variante des Ziels einschließt, oder (ii) Kettenextensionsbedingungen mit einem markierten Nucleotid, das zu einer erwarteten Variante des Ziels komplementär ist; und (c) Aufzeichnen der Zugabe des Nucleotids/Oligonucleotids zu der Sonde durch Ligation oder Kettenextension in Schritt (b) als Zeichen einer Punktmutation an der festgelegten Position in dem Ziel.
Verfahren zur Analyse, welches umfasst: Bereitstellen eines Polynucleotid-Ziels mit einer variablen Anzahl von Wiederholungsabschnitten in Tandemanordnung und mit einem flankierenden Abschnitt und von zwei oder mehreren verschiedenen Oligonucleotid-Sonden, die in Form einer Aneinanderreihung an verschiedene Stellen eines Trägers gebunden sind, wobei jede Sonde einen Abschnitt, der zu dem Wiederholungsabschnitt und einem flankierenden Abschnitt des Ziels komplementär ist, aufweist; und Durchführen der Schritte (a) Inkubieren des Ziels mit den Sonden unter Bildung eines Doppelstrangs (von Doppelsträngen) (b) Inkubieren des Doppelstrangs (der Doppelstränge) unter (i) Ligationsbedingungen mit einem markierten Oligonucleotid, das zu dem Ziel komplementär ist, und/oder (ii) Kettenextensionsbedingungen mit mindestens einem markierten Nucleotid; und (c) Aufzeichnen der Zugabe des Nucleotids/Oligonucleotids zu einer Sonde oder einem Ziel durch Ligation oder Kettenextension in Schritt (b) als Zeichen der Länge der variablen Wiederholungsabschnitt-Anzahl des Ziels.
Verfahren nach Anspruch 3, wobei das Polynucleotid-Ziel eine variable Wiederholungsabschnittsanzahl in Tandemanordnung und zwei flankierende Abschnitte aufweist und wobei in Schritt (b) das (die) markierte(n) Oligonucleotid(e) an den Sondenstrang des Doppelstrangs (der Doppelstränge) ligiert wird (werden).
Verfahren nach Anspruch 3, wobei das Polynucleotid-Ziel eine variable Wiederholungsabschnittsanzahl in Tandemanordnung und zwei flankierende Abschnitte aufweist und wobei in Schritt (b) der Sondenstrang des Doppelstrangs (der Doppelstränge) durch Zugabe von markierten Nucleotiden kettenverlängert wird.
Verfahren nach einem vorhergehenden Anspruch, wobei in Schritt (b) ein Enzym verwendet wird.
Verfahren nach Anspruch 6, wobei das Enzym eine Polymerase oder eine Ligase ist.
Verfahren nach Anspruch 6 oder 7, wobei das Enzym eine DNA-Polymerase, eine reverse Transcriptase oder eine RNA-Polymerase ist.
Verfahren nach Anspruch 8, wobei das Enzym eine Taq-Polymerase, eine Thermosequenase, eine T4-DNA-Ligase oder eine E. coli-DNA-Ligase ist.
Verfahren nach einem vorhergehenden Anspruch, wobei die Sonden über eine kovalente Bindung gebunden sind.
Verfahren nach einem vorhergehenden Anspruch, wobei die Sonden über ein 5'- oder 3'-Nucleotid gebunden sind.
Verfahren nach einem vorhergehenden Anspruch, wobei die Sonden an beabstandete Stellen auf einer derivatisierten Glasoberfläche oder auf der Oberfläche eines Silicium-Mikrochips oder auf Propylen gebunden sind.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 11, wobei die Sonden an einzelne Perlen gebunden sind.
Verfahren nach einem vorhergehenden Anspruch, wobei das markierte Oligonucleotid oder Nucleotid Fluoreszenz-markiert ist.
Verfahren nach einem vorhergehenden Anspruch, wobei die markierten Nucleosidtriphosphate vor Schritt (c) zugesetzt werden.
Verfahren nach Anspruch 15, wobei die Nucleosidtriphosphate Deoxyribonucleotidtriphosphate sind.
Aneinanderreihung von Oligonucleotid-Sonden zur Analyse eines Polynucleotid-Ziels, enthaltend eine variable Sequenz, in der jedes Komponenten-Oligonucleotid (i) eine Sequenz umfasst, die zu dem Ziel einschließlich einer erwarteten Variante des Ziels komplementär ist, (ii) eine freie 3'-OH-Gruppe aufweist, und (iii) an einen festen Träger in einer Orientierung gebunden ist, die (a) die Doppelstrangbildung mit dem Ziel ermöglicht und (b) die Kettenextension nur ermöglicht, wenn die Sequenz des Oligonucleotids mit der variablen Sequenz des Ziels zusammenpasst.
Aneinanderreihung von Oligonucleotid-Sonden zur Analyse eines Polynucleotid-Ziels, enthaltend eine variable Wiederholungssequenzanzahl in Tandemanordnung, in der jedes Komponenten-Oligonucleotid an einen festen Träger gebunden ist und (i) eine zu einem Teil des Ziels unmittelbar im Anschluss an die Wiederholungssequenz komplementäre Sequenz umfasst, (ii) eine freie 3'-OH-Gruppe oder ein freies 5'-Phosphat aufweist und (iii) eine zu der Wiederholungssequenz des Ziels komplementäre Sequenz umfasst und eine Anzahl von in dem Ziel erwarteten Wiederholungen enthält, und (iii) auf eine Weise konfiguriert ist, die (a) die Doppelstrangbildung mit dem Ziel ermöglicht und (b) die Ligation oder Kettenextension nur ermöglicht, wenn die Anzahl von Wiederholungen in dem Oligonucleotid gleich oder kleiner ist als die Anzahl der Wiederholungen in dem Ziel.
Aneinanderreihung nach Anspruch 17 oder Anspruch 18, wobei die Sonden über eine kovalente Bindung gebunden sind.
Aneinanderreihung nach einem der Ansprüche 17 bis 19, wobei die Sonden über ein 5'- oder 3'-Nucleotid gebunden sind.
Aneinanderreihung nach einem der Ansprüche 17 bis 20, wobei die Sonden an beabstandete Stellen auf einer derivatisierten Glasoberfläche oder auf der Oberfläche eines Silicium-Mikrochips oder auf Polypropylen gebunden sind.
Aneinanderreihung nach einem der Ansprüche 17 bis 20, wobei die Sonden an einzelne Perlen gebunden sind.
Aneinanderreihung nach einem der Ansprüche 17 bis 22, wobei die Sonden in situ synthetisiert sind.
Aneinanderreihung nach einem der Ansprüche 17 bis 22, wobei die Sonden vorsynthetisiert sind.
Verfahren zur Herstellung einer Aneinanderreihung von verschiedenen Oligonucleotid-Sonden, die an verschiedene Stellen eines Trägers gebunden sind, wobei das Verfahren die Schritte umfasst: Bereitstellen eines ersten intermediären Oligonucleotids, das an den Träger gebunden ist, und eines zweiten intermediären Oligonucleotids in Lösung und eines dritten Oligonucleotids, das sowohl zu dem ersten als auch zu dem zweiten intermediären Oligonucleotid komplementär ist, Bilden eines Doppelstrangs des dritten Oligonucleotids mit dem ersten und zweiten intermediären Oligonucleotid, Ligieren des ersten intermediären Oligonucleotids mit dem zweiten intermediären Oligonucleotid; und Wiederholen der Schritte mit den Oligonucleotiden, die an verschiedene Stellen des Trägers gebunden sind.