DE69636122T2

DE69636122T2 - Verfahren zum gentransfer in zielzellen mit einem retrovirus

Info

Publication number: DE69636122T2
Application number: DE69636122T
Authority: DE
Inventors: Kiyozo Koka-gun ASADA; Takashi Otsu-shi Uemori; Takashi Kusatsu-shi UENO; Nobuto Uji-shi KOYAMA; Kimikazu Takatsuki-shi HASHINO; Ikunoshiu Uji-shi KATO
Original assignee: Takara Bio Inc
Current assignee: Takara Bio Inc
Priority date: 1995-11-13
Filing date: 1996-11-07
Publication date: 2006-12-07
Anticipated expiration: 2016-11-08
Also published as: CA2235629A1; US7446170B2; US20060030046A1; KR100395420B1; CN100390290C; EP0870839A1; CN1207774A; KR100353115B1; US6426042B1; EA003195B1; EP0870839A4; US20030087437A1; ATE325884T1; US6949623B2; KR19990067446A; WO1997018318A1; DE69636122D1; EA200001110A1; EP0870839B1; US20090209730A1

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum Erhöhen der Wirksamkeit des Gentransfers in Zielzellen. Das Verfahren ermöglicht eine wirksame Transformation von Zielzellen auf verschiedenen technischen Gebieten wie der medizinischen Naturwissenschaft, Zelltechnologie, genetischen Manipulation und Entwicklungstechnologie und einer Reihe damit verbundener Techniken.
STAND DER TECHNIK
Um die Mechanismen von vielen menschlichen Krankheiten und den Fortschritt rekombinanter DNA-Technologie und Gentransfertechnologie zu verstehen, wurden kürzlich Protokolle zur somatischen Gentherapie zur Behandlung schwerer genetischer Krankheiten entwickelt. Zusätzlich zielten derzeit Anstrengungen darauf ab, eine Gentherapie nicht nur zur Behandlung genetischer Krankheiten sondern auch zur Behandlung viraler Infektionen wie AIDS und Krebs anzuwenden.
Die meisten der Gentransferexperimente in Menschen, die von der Lebensmittel- und Arzneimittelkontrollbehörde (FDA) genehmigt wurden, beinhalten die Transduktion von Zellen durch rekombinante retrovirale Vektoren. Retrovirale Vektoren können ein benötigtes exogenes Gen in Zellen effizient übertragen, um das exogene Gen in die chromosomale DNA stabil zu integrieren. Insbesondere deshalb sind sie bevorzugte Gentransfermittel für die Gentherapie, bei der eine langfristige Gen-Expression wünschenswert ist. Solche Vektoren werden auf unterschiedliche Weise entwickelt, um alle Nebenwirkungen auf die transduzierten Organismen zu vermeiden. Zum Beispiel gehen Replikationsfunktionen von Vektoren verloren, um eine unbeschränkte Vervielfältigung der Infektion (Transduktion) aufgrund der Autoreplikation der Vektoren, die zum Gentransfer in Zellen verwendet werden, zu verhindern. Da diese Vektoren (Replikations-defiziente retrovirale Vektoren) im Allgemei nen keine Fähigkeit zur Autoreplikation besitzen, werden retrovirale Vektoren, die in virale Partikel verpackt werden, unter Verwendung von Retrovirus-Erzeugerzellen (Verpackungszellen) hergestellt.
Andererseits sind Knochenmarkszellen ein gutes Ziel für die somatische Gentherapie, da Knochenmarkszellen leicht in vitro manipuliert werden können und hämatopoetische Stammzellen enthalten, die zur Autoreplikation fähig sind. Alternativ wurde kürzlich für menschliches Nabelschnurblut gezeigt, dass es eine große Anzahl primitiver Vorläuferzellen, einschließlich hämatopoetischer Stammzellen, enthält. Wenn eine Gentherapie durch Gentransfer in diese Zielzellen durchgeführt wird und diese in einen lebenden Körper eingepflanzt werden, wird das so übertragene Gen über einen langen Zeitraum in den Blutzellen exprimiert, um eine lebenslange Heilung für Krankheiten zu bewirken.
Trotz den intensiven Studien durch verschiedene Gruppen gehören hämatopoetische Stammzellen jedoch zu denen, bei denen eine wirksame Transduktion schwierig ist. Bisher beinhaltete das wirksamste Gentransferprotokoll, das sich auf hämatopoetische Stammzellen von Mäusen und anderen Tieren bezieht, eine Co-Kultivierung von hämatopoetischen Stammzellen mit Retrovirus-Erzeugerzellen. Jedoch ist für eine klinische Gentherapie von Menschen eine zellfreie Transduktion aufgrund der Bedenken bezüglich der biologischen Sicherheit wünschenswerter. Unglücklicherweise war ein effizienter Gentransfer in hämatopoetische Stammzellen im Allgemeinen ohne eine Co-Kultivierung mit Retrovirus-Erzeugerzellen nicht möglich.
Kürzlich wurde berichtet, dass die Gentransferwirksamkeit durch Retroviren allein durch einen Bestandteil einer extrazellulären Matrix, Fibronectin oder dessen Fragmente verbessert werden kann (J. Clin. Invest., 93, Seiten 1451–1457 (1994); Blood, 88, Seiten 855–862 (1996)). Zusätzlich wurde offenbart, dass Fibronectin-Fragmente, die durch genetische Manipulation erzeugt wurden, dieselben Eigenschaften aufwiesen und dass unter deren Einsatz ein effizienter Transfer eines exogenen Transgens in hämatopoetische Stammzellen durchgeführt werden konnte (WO 95/26200). Für die Bindung einer Heparin-bindenden Domäne von Fibronectin an einen Retrovirus wird vorgeschlagen, dass sie bei einer solchen Verbesserung der Gentransferwirksamkeit durch Fibronectin beteiligt ist. In all diesen Verfahren, bei denen Fibronectin und Fibronectin-Fragmente verwendet werden, werden Zellen mit Retroviren in Platten, auf denen Fibronectin oder dessen Fragmente immobilisiert sind, infiziert.
AUFGABE DER ERFINDUNG
Für die oben beschriebenen Gentransferverfahren, die Fibronectin und Fibronectin-Fragmente einsetzen, wird angenommen, dass sie durch Fibronectin oder dessen fragmentierte Moleküle, die sowohl eine Retrovirusbindungsdomäne als auch eine Zielzellbindungsdomäne auf demselben Molekül besitzen, erreicht werden (Nature Medicine, 2, Seiten 876–882 (1996)). Daher ist es für einen effizienten Gentransfer in verschiedenen Zielzellen unter Verwendung des oben beschriebenen Verfahrens notwendig, einen funktionellen Stoff mit sowohl Virus- als auch Zielzellbindungsdomänen auf einem Molekül entsprechend den jeweiligen spezifischen Zellen herzustellen. Es besteht jedoch noch ein Problem hinsichtlich deren Verwendung in einem allgemeinen Gentransferverfahren.
Weiter wird das oben beschriebene Gentransferverfahren durch Immobilisieren von Fibronectin oder einem Fibronectin-Fragment auf der Oberfläche auf einer Platte, die zur Kultivierung von Zielzellen nach einer Infektion von Retroviren verwendet wird, durchgeführt. Jedoch sind komplizierte Prozeduren zur Immobilisierung auf einer Platte erforderlich und daher ist es weit davon entfernt, als einfaches und zweckmäßiges Gentransferverfahren angesehen zu werden.
Darüber hinaus ist der in dem oben beschriebenen Gentransferverfahren zu verwendende funktionelle Stoff auf einen Stoff beschränkt, der eine Heparin-Bindungsdomäne als eine von Fibronectin abgeleitete Retrovirusbindungsdomäne enthält. Dann gibt es Möglichkeiten, dass ein verbessertes Gentransferverfahren entwickelt werden kann, indem eine andere Retrovirusbindungssubstanz gefunden wird.
Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, das Problem zu lösen und ein zweckmäßigeres und effizienteres Gentransferverfahren zur Verfügung zu stellen.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die Erfinder haben festgestellt, dass eine Retrovirus-Infektion durch einen funktionellen Stoff, typischerweise Fibronectin oder dessen Fragment, gefördert werden kann, selbst wenn eine Region mit einer Retrovirusbindungsdomäne und eine Region mit einer Zellbindungsdomäne nicht auf demselben Molekül vorhanden sind. Das heißt, die Erfinder der vorliegenden Erfindung haben festgestellt, dass die Wirksamkeit eines Gentransfers in Zielzellen durch Retroviren unter Verwendung einer wirksamen Menge eines funktionellen Stoffes, der eine Retrovirusbindungsdomäne erhält, der mit einem funktionellen Stoff, der eine Zielzellbindungsdomäne enthält, vermischt wird, verbessert werden kann.
Zusätzlich haben die Erfinder festgestellt, dass eine Retrovirusinfektions-verstärkende Aktivität durch einen funktionellen Stoff beobachtet werden kann, selbst wenn der funktionelle Stoff nicht auf der Oberfläche einer Platte immobilisiert ist. Die Erfinder haben weiter festgestellt, dass die Wirksamkeit des Gentransfers in Zielzellen verbessert werden kann, indem Retroviren mit den Zielzellen in der Gegenwart eines funktionellen Stoffes, der an Beads immobilisiert ist, in Kontakt gebracht wird.
Zusätzlich haben die Erfinder weiter eine Retrovirusbindungssubstanz gefunden, die keine von Fibronectin abgeleitete Heparinbindungsdomäne enthält und es wurde auch gefunden, dass der Stoff und Derivate davon für den Gentransfer in Zielzellen mit Retroviren verwendbar ist. Darüber hinaus waren die Erfinder erfolgreich bei der Erzeugung von funktionellen Stoffen, die für den Gentransfer in Zielzellen mit Retroviren verwendbar sind. Auf diese Weise wurde die vorliegende Erfindung fertiggestellt.
Der erste Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft ein ex vivo-Verfahren zum Gentransfer in Zielzellen mit einem Retrovirus, wobei die Transduktion durch Infektion der Zielzellen mit dem Retrovirus in der Gegenwart eines isolierten funktionellen Stoffes, der eine Retrovirusbindungsdomäne besitzt, und eines anderen isolierten funktionellen Stoffes, der eine Zielzellbindungsdomäne besitzt, durchgeführt wird, wobei der isolierte funktionelle Stoff, der eine Retrovirusbindungsdomäne besitzt, und der isolierte funktionelle Stoff, der eine Zielbindungsdomäne besitzt, nicht auf demselben Molekül vorhanden sind.
Der funktionelle Stoff mit einer Retrovirusbindungsdomäne, der in dem ersten Aspekt der vorliegenden Erfindung verwendet worden ist, ist nicht spezifisch beschränkt und ist z.B. ein funktioneller Stoff ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus der Heparin-II-Bindungsdomäne von Fibronectin, einem Fibroblasten-Wachstumsfaktor, einem Collagen, einem Polylysin und einem Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz, in der eine Deletion, Substitution, Insertion und/oder Addition einer oder mehrerer Aminosäure(n) in der Aminosäuresequenz der genannten Stoffe vorhanden ist/sind, wobei die Retrovirusbindungsaktivität, die den Gentransfer mit hoher Effizienz bewirkt, erhalten bleibt. Der isolierte funktionelle Stoff, der die Zielzellbindungsdomäne aufweist, kann eine Substanz sein, die einen Liganden enthält, der an Zielzellen bindet. Als Ligand kommen Zelladhäsionsproteine, Hormone, Cytokine, Antikörper, Zuckerketten, Kohlenhydrate und Metaboliten von Zielzellen und dergleichen in Frage. Beispiele von Adhäsionsproteinen umfassen Polypeptide einer Zellbindungsdomäne von Fibronectin. Als Zellbindungsdomänen von Fibronectin gibt es Polypeptide mit einer der Bindungsdomänen für VLA-5 und/oder VLA-4. Weitere Beispiele eines Liganden umfassen Erythropoietin.
Der funktionelle Stoff, der in dem ersten Aspekt der vorliegenden Erfindung verwendet wird, kann ohne Immobilisierung verwendet werden oder kann immobilisiert sein. Wenn er an Beads immobilisiert ist, kann er zweckmäßig verwendet werden. Zusätzlich kann der erste Aspekt der vorliegenden Erfindung eine einfache Transduktion der betroffenen Zielzellen ermöglichen, wenn ein Ligand als funktioneller Stoff mit einer Zielzellbindungsdomäne ausgewählt wird, der spezifisch für die Zielzellen ist.
Wie oben beschrieben, wird es bei den konventionellen Verfahren, wie sie in WO 95/26200 und Nature Medicine offenbart sind, als ein essentieller Mechanismus zur Verbesserung der Gentransferwirksamkeit in Zielzellen mit einem Retrovirus angesehen, dass das Retrovirus und die Zielzellen auf einem funktionellen Stoff, der sowohl eine Retrovirusbindungsdomäne als auch eine Zielzellbindungsdomäne auf demselben Molekül besitzt, co-lokalisiert sind. Jedoch kann gemäß der vorliegenden Erfindung der Gentransfer in Zielzellen mit einem Retrovirus in der Gegenwart eines funktionellen Stoffes mit einer Retrovirusbindungsdomäne und eines anderen funktionellen Stoffes mit einer Zielzellbindungsdomäne durchgeführt werden.
Der zweite Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft ein Kulturmedium für Zielzellen, das für einen Gentransfer in die Zielzellen mit Retroviren verwendet werden kann und das einen isolierten funktionellen Stoff mit einer Retrovirusbindungsdomäne und einen unterschiedlichen isolierten Stoff mit einer Zielzelldomäne umfasst, wobei der isolierte funktionelle Stoff mit der Retrovirusdomäne und der isolierte funktionelle Stoff mit der Zielzellbindungsdomäne nicht auf demselben Molekül vorhanden sind.
Unter Verwendung des Kulturmediums gemäß dem zweiten Aspekt der vorliegenden Erfindung kann der erste Aspekt der vorliegenden Erfindung auf zweckmäßige Weise durchgeführt werden.
Der dritte Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft ein Lokalisationsverfahren von Retroviren, wobei das Verfahren durch das Inkubieren eines Kulturmediums, das ein Retrovirus enthält, das mit einem Gemisch einer wirksamen Menge eines funktionellen Stoffes mit einer Retrovirusbindungsdomäne und einer wirksamen Menge eines anderen funktionellen Stoffes mit einer Zielzellbindungsdomäne in Kontakt gebracht wurde, gekennzeichnet ist.
Der vierte Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft einen Kit, der zur Durchführung eines Retrovirus-vermittelten Gentransfers in Zielzellen verwendet wird, wobei der Kit umfasst:

(a) einen isolierten funktionellen Stoff mit einer Retrovirusbindungsdomäne und/oder einen unterschiedlichen isolierten funktionellen Stoff mit einer Zielzellbindungsdomäne, wobei der isolierte funktionelle Stoff mit der Retrovirusdomäne und der isolierte funktionelle Stoff mit der Zielzellbindungsdomäne nicht auf demselben Molekül vorhanden sind;
(b) ein artifizielles Substrat zur Inkubation von Zielzellen und einem Retrovirus und
(c) einen Zielzell-Wachstumsfaktor zur Prä-Stimulation der Zielzellen.

Unter Verwendung des Reagenzkits gemäß dem vierten Aspekt der vorliegenden Erfindung können die ersten und dritten Aspekte der vorliegenden Erfindung auf zweckmäßige Weise durchgeführt werden.
Der fünfte Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft ein Verfahren zur Verbesserung der Gentransferwirksamkeit in Zielzellen mit Retroviren, wobei das Verfahren durch das Infizieren der Zielzellen mit einem Retrovirus in der Gegenwart einer wirksamen Menge eines funktionellen Stoffes mit einer Zielzellbindungsdomäne sowie einer Retrovirusbindungsdomäne, die von einem Fibroblasten-Wachstumsfaktor, einem Collagen oder einem Polylysin oder einem funktionellen Äquivalent davon abgeleitet ist, auf demselben Molekül, um eine Transduktion der Zielzellen zu ermöglichen, gekennzeichnet ist.
In den oben genannten konventionellen Verfahren, die in WO 95/26200 und Nature Medicine beschrieben sind, sind Fibronectin-Fragmente als der Stoff offenbart, der in dem effizientesten Verfahren zur Verbesserung des Gentransfers in Zielzellen mit Retroviren verwendet werden kann. Jedoch gibt es bei funktionellen Stoffen, die keine Fibronectin-Fragmente sind, keine spezifische Offenbarung über die Art eines funktionellen Stoffes, der in einem effizienten Verfahren zum Gentransfer in Zielzellen mit Retroviren verwendet werden kann. Insbesondere ist in dem konventionellen Verfahren lediglich die wiederholte Sequenz 12-14 („Repeat 12-14") des Fibronectins als Retrovirusbindungsdomäne offenbart.
Die Erfinder haben unerwartet festgestellt, dass ein Fibroblasten-Wachstumsfaktor, ein Collagen, ein Lysin, ein Polylysin und so weiter, die keine strukturelle Verwandtschaft mit der wiederholten Sequenz 12-14 („Repeat 12-14") des Fibronectins aufweisen, effektiv in einem Verfahren zur Verbesserung des Gentransfers in Zielzellen mit Retroviren verwendet werden können. Daher kann jedes funktionelle Äquivalent dieser Stoffe, d.h. jeder Stoff, der eine Retrovirusbindungsdomäne besitzt und der zu diesen Stoffen funktionell äquivalent ist und den Gentransfer effizient in Zielzellen mit einem Retrovirus verbessern kann, in dem fünften Aspekt der vorliegenden Erfindung verwendet werden.
In dem fünften Aspekt der vorliegenden Erfindung kann als Zielzellbindungsdomäne ein Stoff mit einem Liganden verwendet werden, der an Zielzellen binden kann, und dieser Stoff wird an die Retrovirusbindungsdomäne gekoppelt.
Beispiele von Liganden umfassen Zelladhäsionsproteine, Hormone, Cytokine, Antikörper, Zuckerketten, Kohlenhydrate, Metaboliten von Zielzellen und dergleichen. Beispiele von Zelladhäsionsproteinen umfassen Polypeptide von einer Zellbindungsdomäne von Fibronectin. Zum Beispiel können Polypeptide der Bindungsdomäne für VLA-5 und/oder VLA-4 in der vorliegenden Erfindung verwendet werden. Weitere Beispiele von Liganden umfassen Erythropoietin.
In dem fünften Aspekt der vorliegenden Erfindung kann als Fibroblasten-Wachstumsfaktor, der als Retrovirusbindungsdomäne verwendet wird, Fibroblasten-Wachstumsfaktoren verwendet werden, ausgewählt z.B. aus einem Fibroblasten- Wachstumsfaktor, wiedergegeben durch SEQ ID NO:3 des Sequenzprotokolls, funktionelle Äquivalente des Faktors und Polypeptide, die den Faktor oder funktionelle Äquivalente davon enthalten.
Beispiele von diesen funktionellen Stoffen umfassen Polypeptide, die eine Aminosäuresequenz enthalten, wie sie in SEQ ID NOs 4 und 5 des Sequenzprotokolls wiedergegeben ist.
In dem fünften Aspekt der vorliegenden Erfindung können Collagene als Retrovirusbindungsdomäne verwendet werden, einschließlich, z.B. Collagene ausgewählt aus einem Collagen-Fragment, das eine Insulinbindungsdomäne enthält, die vom Typ V-Collagen abgeleitet ist, funktionelle Äquivalente der Fragmente und Polypeptide, die die Fragmente oder funktionelle Äquivalente davon enthalten. Zusätzlich umfassen Beispiele der Fragmente ein Fragment, das eine Aminosäuresequenz enthält, wie sie in SEQ ID NO:6 des Sequenzprotokolls wiedergegeben ist.
Beispiele von diesen funktionellen Stoffen umfassen Polypeptide, wie sie in SEQ ID NOs: 7 und 8 des Sequenzprotokolls wiedergegeben sind.
In dem fünften Aspekt der vorliegenden Erfindung ist das Polylysin, das als Retrovirusbindungsdomäne verwendet wird, ein Polymer aus L-Lysin und es kann z.B. eines mit einem geeigneten Polymerisationsgrad von kommerziell erhältlichen Produkten ausgewählt werden und verwendet werden.
Wenn die von einem Fibroblasten-Wachstumsfaktor, einem Collagen oder einem Polylysin abgeleitete Retrovirusbindungsdomäne gleichzeitig eine Zielzellbindungsdomäne besitzt, dann kann die Gentransfereffizienz in Zielzellen mit einem Retrovirus verbessert werden, indem die Zielzellen mit dem Retrovirus in der Gegenwart einer wirksamen Menge der von dem Fibroblasten-Wachstumsfaktor, dem Collagen oder dem Polylysin abgeleiteten Retrovirusbindungsdomäne verbessert werden. Wenn die Zielzellen Adhäsionszellen sind, dann binden und haften ein Retrovirus bzw. die Zielzellen an den funktionellen Stoff und die Gentransfereffizienz in die Zielzellen mit dem Retrovirus kann verbessert werden, indem die Zielzellen mit dem Retrovirus in der Gegenwart einer wirksamen Menge der von dem Fibroblasten-Wachstumsfaktor, dem Collagen oder dem Polylysin abgeleiteten Retrovirusbindungsdomäne infiziert werden.
Es wurde auch festgestellt, dass die Gentransfereffizienz in die Zielzelle mit einem Retrovirus verbessert werden kann, indem die Zielzellen mit dem Retrovirus in der Gegenwart einer wirksamen Menge des Polypeptids infiziert werden, wenn ein Polypeptid, wie es in SEQ ID NO:1 des Sequenzprotokolls wiedergegeben ist (hier als H-271 bezeichnet), gleichzeitig eine Zielzellbindungsdomäne besitzt, d.h. wenn die Zielzellen an das Polypeptid H-271 binden.
Das bedeutet, dass, obwohl die Retrovirusbindungsdomäne, die in dem oben genannten Nature Medicine offenbart ist, lediglich der wiederholten Sequenz 12-14 („Repeat 12-14") des Fibronectins entspricht, die Erfinder überraschenderweise festgestellt haben, dass dieses H-271 als Zielzellbindungsdomäne entsprechend einer bestimmten Art von Zielzellen effektiv wirkt, um die Gentransfereffizienz in die Zielzellen zu verbessern. Zusätzlich binden und haften im Falle, dass die Zielzellen Adhäsionszellen sind, die Zielzellen und ein Retrovirus an das Polypeptid und die Gentransfereffizienz in die Zielzellen mit dem Retrovirus verbessert werden kann, indem die Zielzellen mit dem Retrovirus in der Gegenwart einer wirksamen Menge des Polypeptids infiziert werden.
In dem fünften Aspekt der vorliegenden Erfindung kann der funktionelle Stoff ohne Immobilisierung verwendet werden oder kann immobilisiert sein, wobei eine Immobilisierung im Falle, dass die Zielzellen anhaftende Zellen sind, bevorzugt ist.
Der sechste Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft ein Kulturmedium von Zielzellen, das für den Gentransfer in die Zielzellen mit einem Retrovirus verwendet wird, und das eine wirksame Menge eines funktionellen Stoffes mit einer Zielzellbindungsdomäne sowie eine Retrovirusbindungsdomäne auf demselben Molekül umfasst, die von einem Fibroblasten-Wachstumsfaktor, einem Collagen oder einem Polylysin oder einem funktionellen Äquivalent davon abgeleitet ist.
Der siebte Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft ein Lokalisationsverfahren für ein Retrovirus, umfassend die Inkubation eines Kulturmediums, das das Retrovirus enthält, das mit einer wirksamen Menge eines funktionellen Stoffes, der eine von einem Fibroblasten-Wachstumsfaktor, einem Collagen oder Polylysin abgeleitete Retrovirus-Domäne enthält, in Kontakt gebracht wurde. Diese funktionellen Stoffe können effizient für die Lokalisation eines Retrovirus zur Verbesserung des Gentransfers in Zielzellen mit dem Retrovirus verwendet werden.
Darüber hinaus umfasst das erfindungsgemäße Lokalisationsverfahren eines Retrovirus, die Inkubation des Retrovirus, das mit einer wirksamen Menge eines funktionellen Stoffes in Kontakt gebracht wurde, der eine Zielzellbindungsdomäne sowie eine von einem Fibroblasten-Wachstumsfaktor, einem Collagen oder einem Polylysin oder einem funktionellen Äquivalent davon abgeleitete Retrovirusbindungsdomäne auf demselben Molekül umfasst.
Der achte Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft ein Kit, der zur Durchführung des Retrovirus-vermittelten Gentransfers in Zielzellen verwendet wird, wobei der Kit umfasst:

(a) eine wirksame Menge eines funktionellen Stoffes mit einer Retrovirusbindungsdomäne, sowie einer von einem Fibroblasten-Wachstumsfaktor, einem Collagen oder einem Polylysin oder einem funktionellen Äquivalent davon abgeleiteten Zielzellbindungsdomäne auf demselben Molekül;
(b) ein artifizielles Substrat zur Inkubation von Zielzellen, die mit einem Retrovirus in Kontakt gebracht wurden; und
(c) einen Zielzell-Wachstumsfaktor zur Prä-Stimulation der Zielzellen.

Zur Durchführung eines der Verfahren gemäß der ersten und fünften Aspekten kann ein beliebiges Kulturmedium des zweiten und sechsten Aspekts, ein beliebiges Verfahren des dritten und siebten Aspekts und ein beliebiger Kit des vierten und achten Aspekts der vorliegenden Erfindung verwendet werden, und es können funktionelle Stoffe, die auf Beads immobilisiert sind, in geeigneter Weise verwendet werden.
Der neunte Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft ein Verfahren zur Verbesserung der Gentransfereffizienz in Zielzellen mit einem Retrovirus, dadurch gekennzeichnet, dass die Zielzellen mit dem Retrovirus in der Gegenwart einer wirksamen Menge eines funktionellen Stoffes, der an Beads immobilisiert ist, ausgewählt aus substantiell reinem Fibronectin, einem substantiell reinen Fibronectin-Fragment oder einem Gemisch davon infiziert sind, um eine Transduktion der Zielzellen mit dem Retrovirus zu ermöglichen.
Der zehnte Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Verbesserung der Gentransfereffizienz in Zielzellen mit einem Retrovirus und ist dadurch gekennzeichnet, dass die Zielzellen mit dem Retrovirus in der Gegenwart einer wirksamen Menge eines funktionellen Stoffes, ausgewählt aus substantiell reinem Fibronectin, einem substantiell reinen Fibronectin-Fragment oder ein Gemisch davon, ohne Immobilisierung infiziert werden, um eine Transduktion der Zielzellen mit dem Retrovirus zu ermöglichen.
In den oben genannten konventionellen Verfahren, wie sie in WO 95/26200 und Nature Medicine offenbart sind, besteht ein essenzieller Mechanismus zur Verbesserung der Gentransfereffizienz mit einem Retrovirus darin, dass das Retrovirus und die Zielzellen auf einem funktionellen Stoff mit einer Retrovirusbindungsdomäne und einer Zielbindungsdomäne auf demselben Molekül co-lokalisiert sein sollten. Bei diesem Verfahren wird die Co-Lokalisierung sowohl des Retrovirus als auch der Zielzellen auf dem funktionellen Stoff, der sowohl eine Retrovirusbindungsdomäne als auch eine Zielzellbindungsdomäne auf demselben Molekül besitzt, zum ersten Mal dadurch möglich, dass der funktionelle Stoff mit der Retrovirusbindungsdomäne und der Zielzellbindungsdomäne auf demselben Molekül auf einem Kultursubstrat immobilisiert wird.
Jedoch wird gemäß der vorliegenden Erfindung selbst bei Verwendung von substantiell reinem Fibronectin, einem substantiell reinen Fibronectin-Fragment und einem Gemisch davon, die Gentransfereffizienz in Zielzellen mit einem Retrovirus unerwarteterweise effizient verbessert werden, indem der funktionelle Stoff, der sowohl eine Retrovirusbindungsdomäne als auch eine Zielzellbindungsdomäne auf demselben Molekül besitzt, ohne Immobilisierung auf einem Kultursubstrat verwendet wird.
Als Zielzellen, die in dem ersten, fünften, neunten und zehnten Aspekt der vorliegenden Erfindung verwendet werden, können beispielsweise Zellen verwendet werden, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Stammzellen, die keine menschlichen embryonalen Stammzellen sind, hämatopoetische Zellen, nicht-adhärente mononukleare Zellen mit geringer Dichte, adhärente Zellen, Knochenmarkszellen, hämatopoetische Stammzellen, periphere Blutstammzellen, Nabelschnurblutzellen, fötale hämatopoetische Stammzellen, nicht-menschliche embryoplastische Stammzellen, nicht-menschliche embryonale Zellen, nicht-menschliche primordiale Keimzellen, nicht-menschliche Oozyten, nicht-menschliche Oogonien, nicht-menschliche Ova, nicht-menschliche Spermatozyten, nicht-menschliche Spermazellen, Cd34+-Zellen, C-Kit+-Zellen, multipotentielle hämatopoetische Vorläuferzellen, unipotentielle hämatopoetische Vorläuferzellen, Erythrozyten-Vorläuferzellen, Lymphozytenvorläuferzellen, reife Blutzellen, Lymphozyten, B-Zellen, T-Zellen, Fibroblasten, Neuroblasten, Nervenzellen, Endothelzellen, angioendotheliale Zellen, hepatische Zellen, Myoblasten, Skelettmuskelzellen, Glattmuskelzellen, Krebszellen, Myelomzellen und Leukämiezellen.
Als Retrovirus, der in dem ersten, dritten, fünften, siebten, neunten und zehnten Aspekt der vorliegenden Erfindung verwendet werden kann, kann ein Retrovirus verwendet werden, der ein exogenes Gen enthält, und das Retrovirus kann beispielsweise ein rekombinanter retroviraler Vektor sein. Weiter kann das Retrovirus beispielsweise ein Replikations-defizienter rekombinanter retroviraler Vektor sein.
Der elfte Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft transduzierte Zellen, die gemäß dem ersten, fünften, neunten oder zehnten Aspekt der vorliegenden Erfindung erhalten wurden.
Der zwölfte Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft ein Zelltransplantationsverfahren zur Transplantation der transduzierten Zellen des elften Aspekts der vorliegenden Erfindung in ein Wirbeltier.
Der dreizehnte Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft ein Polypeptid, wie es in SEQ ID NO:13 des Sequenzprotokolls wiedergegeben ist oder ein Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz, in der eine Deletion, Substitution, Inkubation und/oder Addition einer oder mehrerer Aminosäure(n) in der Aminosäuresequenz des genannten Stoffes vorhanden ist/ sind, wobei die Retrovirusbindungsaktivität, welche den Gentransfer mit hoher Effizienz bewirken kann, erhalten bleibt.
Der vierzehnte Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft ein Gen, das für das Polypeptid des dreizehnten Aspekts der vorliegenden Erfindung kodiert. Beispiele des Gens umfassen ein Gen, wie es in SEQ ID NO:17 des Sequenzprotokolls wiedergegeben ist oder ein Gen, das an das oben genannte Gen unter stringenten Bedingungen hybridisieren kann und für ein Polypeptid kodiert, das die Gentransfereffizienz in Zielzellen mit einem Retrovirus verbessern kann.
In den oben genannten konventionellen Verfahren von WO 95/26200 und Nature Medicine ist das für den Gentransfer wirksamste Peptid CH-296. Auf der anderen Seite haben die Erfinder unerwarteterweise festgestellt, dass dasselbe Polypeptid ohne VLA-5-Bindungsdomäne und VLA-4-Bindungsdomäne in der vorliegenden Erfindung verwendet werden kann.
Der fünfzehnte Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft ein Polypeptid, wie es in SEQ ID NO:30 des Sequenzprotokolls wiedergegeben ist, oder ein Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz, in der eine Deletion, Substitution, Inkubation und/oder Addition einer oder mehrerer Aminosäure(n) in der Aminosäuresequenz des genannten Stoffes vorhanden ist/ sind, wobei die Retrovirusbindungsaktivität und die Zielzellbindungsaktivität, die den Gentransfer mit hoher Effizienz bewirken kann, erhalten bleibt.
Der sechzehnte Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft ein Gen, das für das Polypeptid des fünfzehnten Aspekts der vorliegenden Erfindung kodiert. Beispiele des Gens umfassen ein Gen, wie es in SEQ ID NO:33 des Sequenzprotokolls wiedergegeben ist, oder ein Gen, das an das oben genannte Gen unter stringenten Bedingungen hybridisieren kann und für ein Polypeptid kodiert, das die Gentransfereffizienz in Zielzellen mit einem Retrovirus verbessern kann.
Der siebzehnte Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft ein Polypeptid wie es in SEQ ID NO:5 wiedergegeben ist, oder ein Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz, in der eine Deletion, Substitution, Inkubation und/oder Addition einer oder mehrerer Aminosäure(n) in der Aminosäuresequenz des genannten Stoffes vorhanden ist/sind, wobei die Retrovirusbindungsaktivität und die Zielzellbindungsaktivität, die den Gentransfer mit hoher Effizienz bewirken kann, erhalten bleibt.
Der achtzehnte Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft ein Gen, das für das Polypeptid des siebzehnten Aspekts der vorliegenden Erfindung kodiert. Beispiele des Gens umfassen ein Gen, wie es in SEQ ID NO:26 wiedergegeben ist, oder ein Gen, das an das oben genannte Gen hybridisieren kann und für ein Polypeptid kodiert, das die Gentransfereffizienz in Zielzellen mit einem Retrovirus verbessern kann.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
In dem Gentransfer-Verfahren der vorliegenden Erfindung werden gewöhnlicherweise rekombinante retrovirale Vektoren verwendet, wobei insbesondere ein Replikations-defizienter retroviraler Vektor geeignet ist. Die Replikationsfähigkeit des Vektors ist verloren gegangen, um eine Autoreplikation in infizierten Zellen zu verhindern, so dass der Vektor nicht pathogen ist. Diese Vektoren können in Wirtszellen, wie Vertebratentierzellen, insbesondere Säugetierzellen, eindringen, um exogene Gene, die in den Vektoren eingefügt sind, in die chromosomale DNA von Wirtszellen stabil zu integrieren.
In der vorliegenden Erfindung kann ein exogenes Gen, das in Zellen transfiziert werden soll, verwendet werden, indem es in einen retroviralen Vektor unter der Kontrolle eines geeigneten Promoters eingeführt wird, beispielsweise einem Promoter von LTR, der in einem Retrovirus vorkommt, oder durch einen exogenen Promoter. Zusätzlich können andere regulatorische Elemente, die mit einem Promoter und einer Transkriptionsinitiationsstelle kooperieren können, z.B. ein Enhancer auch in einem Vektor vorhanden sein, um die Transkription eines exogenen Gens zu bewirken. Darüber hinaus kann ein eingeführtes Gen vorzugsweise eine Terminationssequenz an dessen stromabwärts gelegenen Ende besitzen. Das exogene Gen, das in die Zellen eingeführt werden soll, kann ein natürliches oder ein künstliches Gen sein und kann ein zusätzliches DNA-Molekül besitzen, das von heterologen Quellen stammt und das daran durch Ligation oder auf andere Weise, die auf dem Gebiet bekannt sind, gekoppelt ist.
Die exogenen Gene, die in ein Retrovirus eingeführt werden, können beliebige Gene von Interesse zur Transduktion der Zellen sein. Zum Beispiel können die exogenen Gene für ein Enzym kodieren, das mit einer zu behandelnden Krankheit, einem Protein, einer Antisense-Nukleinsäure, einem Ribozym oder einem Falschprimer (siehe z.B. WO 90/13641), einem intrazellulären Antikörper (siehe z.B. WO 94/02610), einem Wachstumsfaktor oder dergleichen assoziiert ist.
Die in der vorliegenden Erfindung verwendeten retroviralen Vektoren können ein Marker-Gen besitzen, so dass die transduzierten Zellen leicht selektiert werden können. Als Marker-Gen kann beispielsweise ein Arzneimittel-resistentes Gen, das den transformierten Zellen eine Antibiotika-Resistenz verleiht oder ein Reporter- Gen, das transformierten Zellen mit einer Enzymaktivität zu dessen Detektion verleiht, verwendet werden.
Als Vektoren, die verwendet werden können, kommen retrovirale Vektoren, wie z.B. der bekannte MFG-Vektor (ATC No. 68754), α-SGC (ATCC No. 68755) und dergleichen in Frage. Zusätzlich können sowohl N2/ZipTKNEO-Vektor (TKNEO, Blood, Band 78, Seiten 310–317 (1991)) und PM5neo-Vektor (Exp. Hematol., Band 23, Seiten 630–638 (1995)), die in den nachfolgenden Beispielen verwendet wurden, Neomycin-resistente Gene (Neomycinphosphotransferase-Gen) als Marker-Gene enthalten. Dann können Zellen, die mit diesen Vektoren transformiert wurden, als Zellen mit einer Resistenz gegenüber Antibiotika (Neomycin, G418, etc.), die durch die Genprodukte inaktiviert werden, erkannt werden. Darüber hinaus können diese Vektoren als Viruspartikel präpariert werden, die die darin verpackten Vektoren enthalten, indem bekannte Verpackungszelllinien, z.B. PG13 (ATCC CRL-10686), PG13/LNc8 (ATCC CRL-10685), PA317 (ATCC CRL-9078), die in US-Patent Nr. 5,278,056, GP + E-86 (ATCC CRL-9642), GP + envAm-12 (ATCC CRL-9641) verwendeten Zelllinien und dergleichen verwendet werden.
Der Ausdruck "wirksame Menge" des funktionellen Stoffes, wie hier verwendet, bezeichnet die zur Transformation von Zielzellen beim Gentransfer zu Zielzellen mit einem Retrovirus benötigte Menge. Die Menge kann in Abhängigkeit eines bestimmten funktionellen Stoffes, eines Retrovirus und einer bestimmten Art von Zielzellen ausgewählt werden, indem das hier beschriebene Verfahren verwendet wird. Der Ausdruck "Gentransfereffizienz", wie hier verwendet, bezeichnet die Transformationseffizienz.
Die Fähigkeit des funktionellen Stoffes zur Bindung an Retroviren, d.h. die Wirksamkeit und Verwendbarkeit des funktionellen Stoffes in der vorliegenden Erfindung kann durch Routine-Assays, wie sie in den nachfolgenden Beispielen offenbart sind, sichergestellt werden.
Diese Assays bestimmen, wie viele Retroviruspartikel an den funktionellen Stoff gebunden sind, der an die Matrix immobilisiert ist, die in der vorliegenden Erfindung verwendet wird, so dass ein Abwaschen von der Matrix unterbleibt. Kurz gesagt wird z.B. ein Virus-enthaltender Überstand in einer Vertiefung inkubiert, welche den immobilisierten funktionellen Stoff mit einer Retrovirusbindungsdomäne enthält. Die Vertiefung wird dann mit einem physiologischen Saline-Puffer gründlich gewaschen und danach werden die Zielzellen in der Vertiefung inkubiert, um die Menge der infektiösen Aktivität des Virus, die in der Vertiefung verbleibt, zu bestimmen. Die Abnahme der infektiösen Aktivität oder des Titers relativ zu dem anfänglichen viralen Überstand wird bestimmt und mit der einer ähnlichen Kontrolle (z.B. unter Verwendung einer BSA-beschichteten Vertiefung) verglichen. Ein signifikant höherer Titer, der in der Vertiefung, die den funktionellen Stoff enthält, vorliegt, im Vergleich zu der Kontrollvertiefung deutet darauf hin, dass der Stoff als funktioneller Stoff gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet werden kann.
Um dieses Screening-Verfahren zu ermöglichen, kann der virale Vektor ein selektierbares Marker-Gen enthalten.
Der funktionelle Stoff mit einer Retrovirusbindungsdomäne, die in der vorliegenden Erfindung verwendet werden soll, kann anhand dieser Assays durchmustert werden.
Als funktioneller Stoff mit einer Retrovirusbindungsdomäne kommt ein funktioneller Stoff in Frage, der eine Retrovirusbindungsdomäne besitzt, die von einer Heparin-II-Bindungsdomäne von Fibronectin, einem Fibroblasten-Wachstumsfaktor, einem Collagen oder einem Polylysin abgeleitet ist.
Die Bindung einer Zellbindungsdomäne des funktionellen Stoffes, der in der vorliegenden Erfindung verwendet wird, an Zellen, d.h. die Bindung eines Stoffes, der einen Zielzellbindungs-Liganden enthält, an Zellen kann auf gleiche Weise unter Verwendung konventioneller Verfahren untersucht werden. Zum Beispiel umfassen solche Verfahren solche, wie sie in Nature 352: 438–441 (1991) beschrieben sind.
Kurz gesagt ist der funktionelle Stoff mit einer Zellbindungsdomäne an eine Kulturplatte immobilisiert und die zu testende Zellpopulation wird in einem Medium überschichtet, gefolgt von einer Inkubation für 30 Minuten bis 2 Stunden. Nach diesem Inkubationszeitraum werden Zellen, die nicht an dem funktionellen Stoff gebunden sind, geerntet, gezählt und auf deren Viabilität untersucht. Zellen, die an dem funktionellen Stoff gebunden sind, werden mittels Trypsin oder eines Zelldissoziationspuffers (z.B. Gibco) freigesetzt, gezählt und deren Lebensfähigkeit getestet. In einigen Fällen, z.B. bei hämatopoetischen Kolonie-bildenden Zellen, werden die Zellen weiter für zusätzliche 12 bis 14 Tage kultiviert, um die Kolonie-bildenden Eigenschaften der Zellen sicherzustellen. Der Prozentsatz von adhärenten Zellen wird dann berechnet und mit einem Standard oder einer Standardkontrolle, wie Rinderserumalbumin (BSA = „bovine serum albumin"), das auf einer Kulturplatte immobilisiert ist, verglichen. Eine substantielle Bindung der Zielzellen an die untersuchte funktionelle Substanz liefert einen Hinweis darauf, dass der funktionelle Stoff/Zellkombination für die vorliegende Erfindung geeignet ist und dass der funktionelle Stoff mit einer Zellbindungsdomäne zusammen mit dem funktionellen Stoff mit einer Retrovirusbindungsdomäne co-existieren kann oder daran gekoppelt sein kann, gefolgt von der Bestimmung der Retrovirus-Infektion der Zielzellen, um den funktionellen Stoff, der in der vorliegenden Erfindung verwendet werden soll, zu konstruieren.
Als funktioneller Stoff mit Retrovirusbindungsdomäne, der in der vorliegenden Erfindung verwendet werden kann, kommt, wie oben beschrieben, ein funktioneller Stoff in Frage, der eine Retrovirusbindungsdomäne besitzt, die von einer Heparin-II-Bindungsdomäne von Fibronectin, einem Fibroblasten-Wachstumsfaktor, einem Collagen oder einem Polylysin abgeleitet ist. Alle Substanzen, die ein Retrovirusbindungsdomänen-Äquivalent zu dem oben genannten besitzen und welche die Gentransfereffizienz in Zielzellen mit Retroviren verbessern können, indem ein Ligand mit einer Zielzellbindungsdomäne an die von einem Fibroblasten-Wachstumsfaktor, einem Collagen oder einem Polylysin abgeleiteten Retrovirusbindungsdomäne gekoppelt ist oder mit diesem coexistiert, sind als funktionelle Äquivalente eingeschlossen.
Die wirksame Menge der (des) funktionellen Stoffe(s), der/die in der vorliegenden Erfindung verwendet wird/werden, kann bestimmt werden, indem Zielzellen und ein Retrovirus in dem erfindungsgemäßen Gentransferverfahren in der Gegenwart des ausgewählten funktionellen Stoffes mit Retrovirusbindungsdomäne, die an den funktionellen Stoff mit Zielzellbindungsdomäne gekoppelt ist oder mit diesem coexistiert, verwendet wird und die Verbesserung der Gentransfereffizienz gemäß dem oben beschriebenen Verfahren bestimmt wird.
Im Folgenden wird die vorliegende Erfindung genauer beschrieben.
Ein Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft ein Verfahren zur Verbesserung der Gentransfereffizienz in Zielzellen mit einem Retrovirus. Dieses Verfahren ist gekennzeichnet durch das Infizieren von lebenden Zielzellen mit einem Retrovirus in der Gegenwart des funktionellen Stoffes mit einer Retrovirusbindungsdomäne und dem funktionellen Stoff mit einer Zielzellbindungsdomäne, die zur Verbesserung der Gentransfereffizienz in den Zielzellen mit dem Retrovirus wirksam ist, und wobei der isolierte funktionelle Stoff mit der Retrovirus-Domäne und der isolierte funktionelle Stoff mit der Zielzellbindungsdomäne nicht auf demselben Molekül vorhanden sind.
Dieses Verfahren kann verwendet werden, um Transformantenzellen zu erhalten, die mit dem Retrovirus transfiziert wurden und eine Transplantation der Zellen in einen individuellen Organismus ermöglicht einen Gentransfer in dem individuellen Organismus.
Der funktionelle Stoff mit Retrovirusbindungsdomäne, der in diesem Verfahren verwendet werden soll, ist nicht besonders beschränkt und Beispiele davon umfassen die Heparin-II-Bindungsdomäne von Fibronectin, einen Fibroblasten-Wachstumsfaktor, ein Collagen, ein Polylysin und dergleichen. In gleicher Weise können auch funktionelle Äquivalente davon, z.B. ein funktioneller Stoff mit einer Heparin-Bindungsdomäne verwendet werden. Zusätzlich kann auch ein Gemisch der funktionellen Stoffe, ein Polypeptid, das den funktionellen Stoff enthält, ein Polymer des funktionellen Stoffes, ein Derivat des funktionellen Stoffes und dergleichen verwendet werden. Diese funktionellen Stoffe können von natürlich vorkommenden Produkten erhalten werden oder können künstlich erzeugt werden (z.B. durch genetische Manipulationstechniken oder chemische Synthesen hergestellt werden). Des Weiteren können sie hergestellt werden, indem natürlich vorkommende Produkte mit künstlichen Produkten kombiniert werden.
Soweit die Retrovirusbindungsdomäne und/oder Zielzellbindungsdomäne, die den Gentransfer mit der hohen Effizienz, wie hier beschrieben, bewirken kann, erhalten bleiben, kann der verwendete funktionelle Stoff ein Stoff sein, der eine Mutation in den Aminosäuresequenzen von natürlich vorkommenden Polypeptiden trägt. In der vorliegenden Erfindung werden solche Polypeptide als funktionelle Äquivalente der Polypeptide mit natürlich vorkommenden Aminosäuresequenzen bezeichnet, selbst wenn diese eine Deletion, Substitution, Insertion und/oder Addition einer oder mehrerer, z.B. bis zu mehreren Aminosäuren, in den Aminosäuresequenzen von natürlich vorkommenden Polypeptiden besitzen, vorausgesetzt die gewünschte Retrovirusbindungsdomäne und/oder Zielzellbindungsdomäne bleiben erhalten. Diese funktionellen Äquivalente können gewonnen werden, indem Gene, die für die funk tionellen Äquivalente kodieren, präpariert werden, um auf diese Weise die Äquivalente herzustellen und deren biologische Aktivitäten sicherzustellen.
In dieser Hinsicht ist die einschlägige biotechnologische Technik bereits in einem Stadium angelangt, bei dem die Deletion, Substitution, Addition oder andere Modifikationen von Aminosäuren in den benötigten funktionellen Domänen routinemäßig durchgeführt werden können. Dann können die entsprechenden Aminosäuresequenzen routinemäßig auf die gewünschte Zellbindungsaktivität oder Virusbindungsaktivität durchsucht werden.
Ein Gen, das für ein funktionelles Äquivalent kodiert, kann erhalten werden, indem Gene, die an das Gen, das für den oben genannten Stoff kodiert, hybridisierbar sind, durchmustert werden.
Das bedeutet, dass das Gen, das für den oben genannten Stoff kodiert oder einen Teil von dessen Nukleotidsequenz als Sonde zur Hybridisierung oder als Primer für ein Gen-Amplifikationsverfahren, wie PCR oder dergleichen, verwendet werden kann, um ein Gen zu durchmustern, das für ein Protein mit einer ähnlichen Aktivität wie der des funktionellen Stoffes kodiert. Manchmal kann bei diesem Verfahren ein DNA-Fragment erhalten werden, das lediglich einen Teil des gewünschten Gens enthält. In diesem Fall kann, nachdem sichergestellt ist, dass das entstandene DNA-Fragment ein Teil des gewünschten Gens ist, das gesamte gewünschte Gen erhalten werden, indem eine Hybridisierung mit dem DNA-Fragment oder einem Teil davon als Sonde durchgeführt wird oder indem eine PCR mit Primern durchgeführt wird, die beruhend auf der Nukleotidsequenz des DNA-Fragments synthetisiert wurden.
Die oben genannte Hybridisierung kann beispielsweise unter den folgenden Bedingungen durchgeführt werden.
Dazu wird eine Membran, auf der DNA immobilisiert ist, in 6 × SSC (1 × SSC: 0,15 M NaCl, 0,015 M Natriumcitrat, pH 7,0) enthaltend 0,5% SDS, 0,1% BSA, 0,1% Polyvinylpyrrolidon, 0,1% Ficoll 400 und 0,01% denaturierte Lachsspermien-DNA zusammen mit einer Sonde bei 50°C für 12 bis 20 Stunden inkubiert. Am Ende der Inkubation wird die Membran zuerst mit 2 × SSC, enthaltend 0,5% SDS, bei 37°C gewaschen und dann unter Wechseln der Konzentrationen von SSC auf 0,1 SSC und Temperaturen von 50°C solange gewaschen, bis das Signal, das von der immobilisierten DNA stammt, von dem Hintergrund unterschieden werden kann.
Zusätzlich kann man sicherstellen, ob das so erhaltene entstandene Gen das gewünschte ist oder nicht, indem die Aktivität des Proteins, das durch das sich daraus ergebende Gen kodiert wird, gemäß dem oben genannten Verfahren analysiert wird.
Wie oben in WO 95/26200 beschrieben, ist die Heparin II-Bindungsdomäne von Fibronectin das Polypeptid mit einer Retrovirusbindungsdomäne. Obwohl ein Fibroblasten-Wachstumsfaktor, ein Collagen und ein Polylysin keine strukturelle Ähnlichkeit mit der Heparin II-Bindungsdomäne von Fibronectin aufweisen (z.B. Ähnlichkeiten der Aminosäuresequenzen), haben die Erfinder festgestellt, dass diese Substanzen Retrovirusbindungsdomänen besitzen.
Der funktionelle Stoff mit der Zielzellbindungsdomäne, der in der vorliegenden Erfindung verwendet wird, ist nicht spezifisch beschränkt und ist beispielsweise eine Substanz mit einem Liganden, die an Zielzellen binden kann. Beispiele von Liganden umfassen Zelladhäsionsproteine, Hormone, Cytokine, Antikörper gegen Antigene auf Zelloberflächen, Polysaccharide, Zuckerketten in Glycoproteine oder Glycolipide, Metaboliten von Zielzellen und dergleichen. Zusätzlich können Polypeptide verwendet werden, welche die funktionellen Stoffe, Polymere der funktionellen Stoffe, Derivate der funktionellen Stoffe, funktionelle Äquivalente der funktionellen Stoffe und dergleichen enthalten. Diese funktionellen Stoffe können von natürlich vorkommenden Produkten erhalten werden oder können künstlich hergestellt werden (z.B. durch Genmanipulationstechniken oder chemische Synthesetechniken hergestellt werden). Weiter können sie hergestellt werden, indem natürlich vorkommende Produkte mit künstlichen Produkten kombiniert werden.
Zelladhäsionsproteine, die verwendet werden können, sind beispielsweise Fibronectin und dessen Fragmente. Zum Beispiel wurde bei der Zellbindungsdomäne von humanem Fibronectin, welche Pro¹²³⁹-Ser¹⁵¹⁵ entspricht, wie in US-Patent Nr. 5,198,423 beschrieben, gezeigt, dass es das funktionelle Äquivalent zu dem hier offenbarten Polypeptid C-274 ist und an Zellen, einschließlich BHK- und B16-F10-Zellen, bindet (Kimizuka et al., J. Biochem. Band 110, Seiten 285–291 (1991)). Eine Sequenz, die aus vier Aminosäuren von RGDS zusammengesetzt ist, das in diesen Polypeptiden vorkommt, stellt einen Ligand für den VLA-5-Rezeptor dar. Die Ex pression des VLA-5-Rezeptors wird in einer Reihe von Zellen nachgewiesen und er wird in undifferenzierten Zellen besser exprimiert als in differenzierten Zellen. Zusätzlich ist die CS-1-Region von Fibronectin dafür bekannt, dass sie einen Ligand für den VLA-4-Rezeptor darstellt und an Zellen bindet, die den Rezeptor exprimieren (T-Zellen, B-Zellen, Monozyten, NK-Zellen, Acidophile, Basophile, Thermozyten, myelomonozytische Zellen, Erythroblasten-Vorläuferzellen, lymphozytische Vorläuferzellen, Melanomzellen, Muskelzellen und dergleichen). Das in JP-A 3-284700 beschriebene Polypeptid, das in SEQ ID NO:29 wiedergegeben ist (im Folgenden als C277-CS1 bezeichnet), ist ein Polypeptid mit Liganden sowohl für die oben genannten VLA-5- als auch VLA-4-Rezeptoren und kann für den Gentransfer in Zellen mit diesen Rezeptoren verwendet werden. Darüber hinaus wurde gezeigt, dass die Heparin II-Domäne an Fibroblasten, Endothelzellen und Tumorzellen binden kann. Die Polypeptidsequenz der Zielbindungsdomäne der Heparin II-Domäne ist für eine gerichtete Retrovirus-Infektion zu den Zielzellen in der Gegenwart eines Polypeptids des funktionellen Stoffes mit einer Retrovirusbindungsdomäne verwendbar.
Hormone und Cytokine mit Zell-spezifischen Aktivitäten sind als funktioneller Stoff mit Zellbindungsdomäne in der vorliegenden Erfindung geeignet. Zum Beispiel kann Erythropoietin, welches ein Cytokin in dem hämatopoetischen System ist, für einen Gentransfer in erythrozytische Zellen verwendet werden. Erythropoietin kann gemäß einem bekannten Verfahren hergestellt und verwendet werden. Zusätzlich können funktionelle Äquivalente von Erythropoietin und Polypeptide, die Erythropoietin enthalten oder funktionelle Äquivalente davon auch verwendet werden.
Wie in den nachfolgenden Beispielen beschrieben, kann eine hohe Gentransfereffizienz erhalten werden, wenn der funktionelle Stoff mit der Retrovirusbindungsaktivität (z.B. H-271 und ein Fibroblasten-Wachstumsfaktor) im Gemisch mit C-274, welches ein Polypeptid mit einer Zellbindungsaktivität ist, die sich von Fibronectin oder dergleichen ableitet, verwendet wird. NIH/3T3-Zellen, die in diesen Experimenten verwendet werden, exprimieren den VLA-5-Rezeptor, der an C-274 binden kann und deren Interaktion trägt direkt zur Verbesserung der Gentransferwirksamkeit bei.
Weiter wird dasselbe Phänomen auch beobachtet, wenn ein Derivat von Erythropoietin beim Gentransfer in TF-1-Zellen, welche den Erythropoietin-Rezeptor exprimieren, vorhanden ist (Blood, Band 73, Seiten 375–380 (1989)). Darüber hinaus wird diese Wirkung nicht in Zellen beobachtet, die keinen Erythropoietin-Rezeptor besitzen.
Aus diesen Ergebnissen wird klar, dass ein Zell-spezifischer Anstieg bei der Gentransferwirksamkeit in der Gegenwart des funktionellen Stoffes mit einer Retrovirusbindungsdomäne zusammen mit dem funktionellen Stoff mit einer Zellbindungsdomäne stattfindet.
Bei diesem Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein funktioneller Stoff mit einer Retrovirusbindungsdomäne in Form eines Gemisches mit einem anderen funktionellen Stoff mit einer Zielzellbindungsdomäne verwendet, wobei der isolierte funktionelle Stoff, der eine Retrovirusdomäne aufweist und der isolierte funktionelle Stoff, der eine Zielzellbindungsdomäne aufweist, nicht auf demselben Molekül vorhanden sind. Dadurch wird die Gentransfereffizienz in Zielzellen mit einer Affinität zu den funktionellen Stoffen merklich verbessert. Da die Gentransfereffizienz verbessert wird, kann eine Co-Kultivierung mit Virus-Erzeugerzellen vermieden werden und dies ist einer der Vorteile der vorliegenden Erfindung.
Mittel für einen selektiven Gentransfer in Zielzellen besitzen eine hohe Nützlichkeit und verschiedene Studien sind dazu durchgeführt worden. Zum Beispiel gibt es einen nicht-viralen Vektor (molekularer Konjugationsvektor), bei dem ein Stoff, der an einen Rezeptor bindet, der auf einer Zelloberfläche vorkommt, an einen DNA-Bindungsstoff gekoppelt ist. Beispiele für einen Gentransfer, bei dem ein solcher Vektor verwendet wird, umfassen den Gentransfer in Hepatom-Zellen mit Asialoglycoprotein (J. Biol. Chem., Band 262, Seiten 4429–4432 (1987)), Gentransfer in Lymphoblasten mit Transferrin (Proc. Nat1. Acad. Sci. USA, Band 89, Seiten 6099–6103 (1992)), Gentransfer in Krebszellen mit Anti-EGF-Rezeptor-Antikörper (FEBS Letters, Band 338, Seiten 167–169 (1994)) und dergleichen. Diese Gentransferverfahren unter Verwendung nicht-viraler Vektoren sind unter dem Gesichtspunkt einer langfristigen Gen-Expression von übertragenen Genen nicht erwünscht, da die übertragenden Gene nicht in die chromosomale DNA der Zellen eingebaut wird. Es wurden Versuche unternommen, um Retroviren zu verwenden, die gewöhnlicherweise als Vektoren verwendet werden, die zur Insertion von Genen in Chromosomen fähig sind, um spezifische Zellen zu infizieren. Beispiele hierzu sind Gentransfer in Hepatozyten durch direkte chemische Modifikation von Retroviren zur Kopplung an Laktose (J. Biol. Chem., Band 266, Seiten 14143–14146 (1991)), Gentransfer in Erythropoietin-Rezeptor-exprimierende Zellen unter Verwendung von rekombinan ten viralen Partikeln mit einem Hüllprotein, das ein fusioniertes Protein mit Erythropoietin ist (Science, Band 266, Seiten 1373–1376 (1994)) und dergleichen. Jedoch ist es für diesen Zweck notwendig, spezielle Proteinpartikel gemäß den spezifischen Zielzellen herzustellen. Zusätzlich beinhaltet eine chemische Modifikation von viralen Partikeln komplizierte Prozeduren und neigt dazu, Viren zu inaktivieren. Darüber hinaus wird das gewünschte Protein angesichts einer Virushülle, die durch genetische Manipulation modifiziert wurde, mit den benötigten Funktionen (Bindung an Zielzellen und Herstellung von viralen Partikeln) nicht immer erhalten.
Die oben genannte WO 95/26200 schlägt vor, dass ein retroviraler Vektor ohne eine besondere Modifikation in Zellen in der Gegenwart eines Fibronectin-Fragments, an das ein geeigneter Ligand mit einer Zellbindungsaktivität kovalent gekoppelt ist, übertragen werden kann. Dieses Verfahren verwendet jedoch einen funktionellen Stoff, der sowohl eine Virusbindungsaktivität als auch eine Zellbindungsaktivität besitzt, und daher sollte ein einzelner spezifischer funktioneller Stoff entsprechend bestimmten Arten von Zellen hergestellt werden. Zusätzlich ist nicht bekannt, ob der hergestellte funktionelle Stoff beide Aktivitäten aufrecht erhält oder nicht.
Die Kombination des funktionellen Stoffes, der eine Retrovirusbindungsdomäne aufweist, und des unterschiedlichen funktionellen Stoffes, der eine Zielzellbindungsdomäne aufweist, der vorliegenden Erfindung kann ein Gen-Abgabesystem unter Verwendung von Retroviren für eine große Vielzahl von Zellspezies bereitstellen. Für diesen Zweck muss der funktionelle Stoff mit der Retrovirusbindungsdomäne nicht an den funktionellen Stoff, der eine Zellbindungsdomäne aufweist, kovalent gekoppelt werden. Daher besteht kein Bedarf zur Herstellung eines einzelnen spezifischen funktionellen Stoffes, bei dem der funktionelle Stoff, der eine Retrovirusbindungsdomäne aufweist, an den funktionellen Stoff, der eine Zielzellbindungsdomäne aufweist, wie bei bestimmten Arten von Zellen kovalent gekoppelt ist und der Gentransfer in Zielzellen kann auf einfache Weise und effizient durchgeführt werden.
Beispiele eines Gentransfers in Zielzellen unter Verwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens ist ein Gentransfer in Zellen des hämatopoetischen Systems. Es ist bekannt, dass die oben genannte CS-1-Zelladhäsionsregion von Fibronectin für einen Gentransfer in hämatopoetische Stammzellen verwendbar ist. Weiter ist es bekannt, dass zusätzlich zu dem oben genannten Erythropoietin verschiedene andere Zell-spezifische Cytokine bei der Differenzierung von hämatopoetischen Zellen be teiligt sind und dass ein Gentransfer spezifisch in Zielzellen (Zelllinien) unter deren Verwendung durchgeführt werden kann. Zum Beispiel können, bei Verwendung von G-CSF, Megakaryoblasten und granulozytische Vorläuferzellen als Zielzellen zur Transduktion verwendet werden.
Wenn eine Substanz als funktioneller Stoff, der eine Zellbindungsdomäne aufweist, verwendet wird, die spezifisch oder vornehmlich an maligne Zellen bindet, dann findet ein Gentransfer in solche Zielzellen statt.
Zum Beispiel ist es bekannt, dass Rezeptoren, die als HER-2 und HER-4 bezeichnet werden, in bestimmten Brustkarzinomzellen exprimiert werden (Proc. Nat. Acad. Sci. USA, Band 92, Seiten 9747–9751 (1995)). Demgemäß ist es möglich, das Wachstum von Brustkarzinomzellen zu kontrollieren, indem Heregulin, welches ein Ligand für die Rezeptoren ist, mit dem funktionellen Stoff, der eine Retrovirusbindungsdomäne aufweist, kombiniert wird.
Zusätzlich können diese Zellen als Zielzellen für die Transduktion verwendet werden, indem der funktionelle Stoff, der Iod enthält, für Thyroid (Krebs)-Zellen oder der funktionelle Stoff, der ein Lipoprotein mit hoher Dichte (HDL) enthält, ein Asialoglycoprotein oder ein Teil davon für Leber (Krebs)-Zellen verwendet werden.
Zusätzlich können beliebige Zellen, deren Antikörper verfügbar sind, als Zielzellen verwendet werden, indem von Antikörpern gegen Antigene, die auf Zelloberflächen vorkommen, wie z.B. monoklonale Antikörper, als funktioneller Stoff mit einer Zellbindungsaktivität verwendet werden. Daher kann eine große Vielzahl von Zellen als Zielzellen unter Verwendung des Lokalisationsverfahrens eines retroviralen Vektors und den durch die vorliegende Erfindung offenbarten Zielzellen verwendet werden.
In dem besonders bevorzugten Aspekt wird die Gentransfereffizienz in Zielzellen mit einem Retrovirus unter Verwendung eines neuen funktionellen Stoffes erhöht.
Bisher war lediglich für die Heparin II-Domäne von Fibronectin bekannt, dass sie als funktioneller Stoff, der eine Retrovirusbindungsdomäne aufweist, für einen Gentransfer in Zielzellen mit Retroviren wirksam ist.
Wie oben beschrieben, hat die Domäne selbst die Aktivität an bestimmte Zellen zu binden und in einigen Fällen kann diese Aktivität unerwünscht sein, was von be stimmten Zielzellen abhängt. In solchen Fällen können die gewünschten Ergebnisse erhalten werden, indem die Bindungsdomäne mit einer anderen Zellbindungsdomäne ersetzt wird. Auf diese Weise können mehrere funktionelle Stoffe mit unterschiedlichen Eigenschaften verwendet werden und dies macht eine breitere Anwendbarkeit des erfindungsgemäßen Gentherapieverfahrens möglich und es kann auf einfache Weise eine Transduktion der betroffenen Zielzellen durchgeführt werden.
Der neue funktionelle Stoff, der eine Retrovirusbindungsdomäne aufweist, der von der vorliegenden Erfindung bereitgestellt wird, umfasst Fibroblasten-Wachstumsfaktoren, Polypeptide, welche die Faktoren enthalten, Collagenfragmente, ein Gemisch der Fragmente, Polypeptide, die die Fragmente enthalten, Polymere des funktionellen Stoffes und dergleichen. Polylysine werden auch zu diesem Zweck der vorliegenden Erfindung verwendet. Diese funktionellen Stoffe können von natürlich vorkommenden Produkten erhalten werden oder können künstlich hergestellt werden (z.B. durch genetische Manipulationstechniken oder chemische Synthesen hergestellt werden). Weiter können sie durch Kombination von natürlich vorkommen Produkten und chemisch synthetisierten Produkten hergestellt werden. Der funktionelle Stoff kann für das Gentransferverfahren des ersten Aspekts der vorliegenden Erfindung verwendet werden und die Chimärenmoleküle des funktionellen Stoffes und der andere funktionelle Stoff, der eine Zellbindungsdomäne aufweist, sind auch für den Gentransfer verwendbar.
Alle oben beschriebenen funktionellen Stoffe besitzen eine Retrovirusbindungsaktivität. Jedoch enthalten diese Stoffe keine Heparin II-Domäne von humanem Fibronectin, wie in WO 95/26200 beschrieben oder Polypeptide mit ähnlichen Aminosäuresequenzen.
Als Fibroblasten-Wachstumsfaktor kann ein substantiell gereinigtes natürlich vorkommendes Produkt verwendet werden oder es kann ein Produkt, das durch genetische Manipulationstechniken hergestellt wurde, verwendet werden. In der vorliegenden Erfindung kann der Fibroblasten-Wachstumsfaktor, wie er in SEQ ID NO:3 des Sequenzprotokolls wiedergegeben ist, verwendet werden und es können auch modifizierte Derivate davon, welche die Funktionen der Polypeptide besitzen, verwendet werden. Beispiele von Derivaten des Fibroblasten-Wachstumsfaktors umfassen ein Polypeptid, das in SEQ ID NO:4 des Sequenzprotokolls wiedergegeben ist (im Folgenden als C-FGF·A bezeichnet). Es handelt sich um ein Polypeptid, bei dem die Zelladhäsionsdomäne des Polypeptids Fibronectin an den N-Terminus eines Fibroblasten-Wachstumsfaktors, wie er in SEQ ID NO:3 wiedergegeben ist, gekoppelt ist und das durch genetische Manipulationstechniken, wie sie allgemein in US-Patent 5,302,701 offenbart sind, hergestellt werden kann. Das Polypeptid kann erhalten werden, indem E. coli verwendet wird, das in dem oben genannten Patent als FERM P-12637 offenbart ist und nunmehr gemäß dem Budapester Vertrag beim National Institute of Bioscience and Human-Technology (NIBH), Agency of Industrial Science & Technology, Ministry of International Trade & Industry of 1-1-3, Higashi, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, Japan, unter der Hinterlegungsnummer FERM BP-5278 hinterlegt wurde (Datum der ursprünglichen Hinterlegung: 9. Dezember 1991).
Ein Polypeptid-Derivat des oben genannten C-FGF·A mit einer CS-1-Zelladhäsionsdomäne, die sich von Fibronectin ableitet, wie sie in SEQ ID NO:5 wiedergegeben ist (hier als C-FGF-CS1 bezeichnet), kann unter Verwendung von Escherichia coli gemäß dem hier beschriebenen Verfahren erhalten werden, das gemäß dem Budapester Vertrag bei der NIBH 1-1-3, Higashi, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, Japan, mit der Hinterlegungsnummer FERM BP-5654 hinterlegt wurde (Datum der ursprünglichen Hinterlegung: 6. September 1996). Dieses C-FGF-CS 1 ist insbesondere für einen Gentransfer in Zielzellen mit CS-1-Bindungseigenschaften verwendbar, bevorzugt für hämatopoetische Stammzellen.
Als Collagenfragmente können substantiell aufgereinigte Fragmente, die durch enzymatische oder chemische Spaltung von natürlichen Collagenen erhalten wurden, verwendet werden oder solche, die durch genetische Manipulationstechniken hergestellt wurden. Zusätzlich können Modifikationen dieser Fragmente, welche ihre Funktionen erhalten, verwendet werden. Bei den Collagenen besitzt das humane Collagen Typ V eine starke Insulinbindungsaktivität (JP-A 2-209899). Ein Beispiel von Polypeptiden mit einer Insulinbindungsdomäne ist ein Polypeptid, das eine Aminosäuresequenz enthält, wie sie in SEQ ID NO:28 des Sequenzprotokolls wiedergegeben ist (JP-A 5-97698), zum Beispiel ein Polypeptid, wie es in SEQ ID NO:6 des Sequenzprotokolls wiedergegeben ist (hier als ColV bezeichnet). ColV kann gemäß einem in den hier aufgeführten Beispielen offenbarten Verfahren hergestellt werden. Ein Polypeptid, welches ColV enthält und in SEQ ID NO:7 wiedergegeben ist (hier als C277-ColV bezeichnet), ist ein Polypeptid, bei dem die Zelladhäsionsdomäne des Polypeptids Fibronectin an den N-Terminus von ColV gekoppelt ist und das durch eine genetische Manipulationstechnik gemäß JP-A 5-97698, wie oben be schrieben, hergestellt werden kann. C277-ColV kann unter Verwendung von E. coli erhalten werden, das unter der Hinterlegungsnummer FERM P-12560 in JP-A 5-97698 offenbart ist und gemäß dem Budapester Vertrag bei der NIBH 1-1-3, Higashi, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, Japan, mit der Hinterlegungsnummer FERM BP-5277 hinterlegt wurde (Datum der ursprünglichen Hinterlegung: 7. Oktober 1991).
Ein Polypeptid (im Folgenden als C-ColV-CS1 bezeichnet), das von C277-ColV abgeleitet ist und das in SEQ ID NO:8 wiedergegeben ist und eine CS-1-Zelladhäsionsdomäne besitzt, die von Fibronectin abgeleitet ist, kann wie folgt hergestellt werden: Es wird ein DNA-Fragment isoliert, indem es durch PCR unter Verwendung des oben genannten Plasmids pCH102 als Template, welches aus E. coli präpariert wurde, das gemäß dem Budapester Vertrag beim NIBH 1-1-3, Higashi, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, Japan mit der Hinterlegungsnummer FERM BP-2800 hinterlegt wurde (Datum der ursprünglichen Hinterlegung: 12. Mai 1989), und den Primern CS1-S (die Nukleotidsequenz ist in SEQ ID NO:9 des Sequenzprotokolls wiedergegeben) und M4 amplifiziert wurde, und dann mit den Restriktionsenzymen NheI und SalI verdaut wurde.
Auf der anderen Seite wird ein DNA-Fragment durch Amplifikation durch PCR isoliert, indem das Plasmid pTF7520ColV, das ein Gen enthält, das für C277-ColV kodiert und aus dem oben genannten E. coli FERM BP-5277 präpariert wurde, als Template sowie die Primer CF und CNR verwendet wurden und dann mit den Restriktionsenzymen AccIII und NheI verdaut wurde. Die Nukleotidsequenzen von CF und CNR sind in den SEQ ID NOs 10 und 12 des Sequenzprotokolls wiedergegeben. Die oben genannten zwei DNA-Fragmente werden vermischt und mit einem ungefähr 4,4 kb-DNA-Fragment ligiert, das durch Verdau des Plasmids pTF7520ColV mit den Restriktionsenzymen AccIII und SalI erhalten wurde. Das entstandene Plasmid kodiert für das Polypeptid C-ColV-CS1, welches die CS-1-Zelladhäsionsdomäne am C-Terminus von C277-ColV besitzt und bei dem eine zweite Glutaminsäure am C-Terminus von ColV und das C-terminale Threonin durch Alanin bzw. Serin ersetzt wurden. Nach der Kultivierung von E. coli, die mit diesem Plasmid transformiert wurden, kann das gewünschte Polypeptid von der Kultur isoliert werden. Dieses C-ColV-CS1 ist insbesondere für den Gentransfer in Zielzellen mit einer CS1-Bindungseigenschaft verwendbar, insbesondere von Stammzellen.
Als Polylysin mit einem geeigneten Polymerisationsgrad kann, wie oben beschrieben, ein kommerziell erhältliches Polylysin ausgewählt und verwendet werden.
Die in der vorliegenden Erfindung zu verwendenden funktionellen Stoffe können Derivate der oben genannten funktionellen Stoffe einschließen. Beispiele davon umfassen das oben genannte C-FGF-CS1 oder dessen funktionellen Äquivalente und C-ColV-CS1 oder dessen funktionellen Äquivalente. Zusätzlich können Polymere, die durch Polymerisation von mehreren Molekülen der funktionellen Stoffe erhalten wurden, und modifizierte Stoffe, die durch Modifikation der funktionellen Stoffe gemäß bekannten Verfahren erhalten wurden (Hinzufügen einer Zuckerkette etc.), ebenfalls für die vorliegende Verwendung eingesetzt werden. Diese Polymere und deren funktionelle Äquivalente können durch genetische Manipulationstechniken hergestellt werden unter Verwendung von Genen, die für die Polymere kodieren und Genen, die für deren funktionellen Äquivalente kodieren. Zusätzlich kann ein Cystein-enthaltender funktioneller Stoff, der zur Herstellung eines Polymers des funktionellen Stoffes verwendbar ist, durch Addition, Insertion und Substitution von Cystein in der Aminosäuresequenz des funktionellen Stoffes hergestellt werden. Zusätzlich wird ein Molekül, das ein Cystein-enthaltender funktioneller Stoff ist und eine Retrovirusbindungsdomäne besitzt, leicht an ein anderes Molekül gekoppelt werden, das ein Cystein-enthaltender funktioneller Stoff ist und eine Zielzellbindungsdomäne besitzt. Weiterhin kann ein Stoff, der an einen anderen funktionellen Stoff gekoppelt ist, hergestellt werden, indem die Reaktivität des Cysteinrestes des Cystein-enthaltenden funktionellen Stoffes ausgenutzt wird.
In einem weiteren bevorzugten Aspekt der vorliegenden Erfindung wird der Gentransfer unter Verwendung eines Polymers der Retrovirusbindungsdomäne von Fibronectin durchgeführt, was die Gentransfereffizienz in Zielzellen mit Retroviren erhöht.
Der funktionelle Stoff ist ein Polypeptid mit mehreren Heparin II-Bindungsdomänen des humanen Fibronectins in einem einzigen Molekül, was in der oben genannten WO 95/26200 beschrieben ist, sowie Derivate des Polypeptids. Soweit dieselbe Aktivität wie die des funktionellen Stoffes aufrecht erhalten wird, sind funktionelle Äquivalente, die sich in Teilen in ihren Aminosäuresequenzen von denen der natürlich vorkommenden Produkte unterscheiden, davon eingeschlossen.
Beispiele eines Polymers des funktionellen Stoffes umfassen solche, die durch enzymologische oder chemische Polymerisation des oben genannten Polypeptids, das von Fibronectin stammt, oder durch genetische Manipulationstechniken erhalten wurden. Ein Beispiel eines Polypeptids, das zwei Heparin-II-Bindungsdomänen in einem einzigen Molekül besitzt, die sich von Fibronectin ableiten, umfassen ein Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz, wie sie in SEQ ID NO:13 des Sequenzprotokolls wiedergegeben ist (im Folgenden als H2-547 bezeichnet). H2-547 kann gemäß dem hier beschriebenen Verfahren unter Verwendung von E. coli, das gemäß dem Budapester Vertrag beim NIBH 1-1-3, Higashi, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, Japan, unter der Hinterlegungsnummer FERM BP-5656 hinterlegt wurde (Datum der ursprünglichen Hinterlegung: 6. September 1996), erhalten werden. Ein Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz, wie sie in SEQ ID NO:14 des Sequenzprotokolls wiedergegeben ist, ist ein Polypeptid-Derivat, das ein Zelladhäsionspolypeptid von Fibronectin enthält, das an den N-Terminus von H2-547 gekoppelt ist (im Folgenden als CH 2-826 bezeichnet). Dieses Polypeptid kann gemäß dem hier offenbarten Verfahren erhalten werden. Weiter ist ein Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz, wie sie in SEQ ID NO:30 des Sequenzprotokolls wiedergegeben ist, ein Polypeptid-Derivat, das eine CS-1-Zelladhäsionsregion von Fibronectin enthält, die an den C-Terminus von H2-547 gekoppelt ist (im Folgenden als H2S-573 bezeichnet). Das Polypeptid kann gemäß dem hier offenbarten Verfahren unter Verwendung von E. coli, das gemäß dem Budapester Vertrag beim NIBH 1-1-3, Higashi, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, Japan, unter der Hinterlegungsnummer FERM BP-5655 hinterlegt wurde (Datum der ursprünglichen Hinterlegung: 6. September 1996), erhalten werden. H2S-573 mit einer CS-1-Zelladhäsionsregion ist für den Gentransfer in hämatopoetische Stammzellen verwendbar.
In einem noch weiteren bevorzugten Aspekt der vorliegenden Erfindung werden lebensfähige Zielzellen mit einem Replikations-defizienten retroviralen Vektor in der Gegenwart des funktionellen Stoffes, der an Beads immobilisiert ist, infiziert, was zur Steigerung der Gentransfereffizienz in Zielzellen mit einem retroviralen Vektor wirksam ist.
Konventionelle Verfahren zur Verbesserung der Gentransfereffizienz in Zielzellen mit einem retroviralen Vektor unter Verwendung der funktionellen Stoffe, die in der oben genannten WO 95/26200 und Nature Medicine beschrieben sind, werden durch Immobilisierung der funktionellen Stoffe auf einem Gefäß, das zur Infektion von Zellen mit Viren verwendet wird (eine Platte zur Zellkultur), durchgeführt. Diese Verfahren erfordern komplizierte Prozeduren, wie Waschen von überschüssigem funktionellen Stoff nach Behandlung der Platte mit einer Lösung, die den funktionellen Stoff enthält.
Man kann kaum sagen, dass die Gentransferverfahren, bei denen eine Platte mit den daran immobilisierten funktionellen Stoffen verwendet wird, ein zweckmäßiges Verfahren ist. Andererseits hat ein Verfahren, bei dem funktionelle Stoffe verwendet werden, die an Bead(s) immobilisiert sind, die folgenden Vorteile.
Im Vergleich zu einer Platte kann eine Immobilisierung von Beads in einem relativ geringen Raum durchgeführt werden und die Beads können in einem verschlossenen Gefäß gehandhabt werden. Da eine Oberfläche der Platte, an der der funktionelle Stoff immobilisiert ist, Luft ausgesetzt ist, ist es notwendig dafür Sorge zu tragen, dass eine Verschlechterung oder dergleichen aufgrund von Austrocknung während der Lagerung vermieden wird, im Falle, dass der funktionelle Stoff eine geringere Stabilität hat. Beads können jedoch gelagert werden, indem sie in einer Lösung suspendiert werden und so können solche Probleme vermieden werden. Darüber hinaus wird sich eine Oberfläche des funktionellen Stoffes vergrößern, wenn Beads verwendet werden und daher kann im Vergleich mit einer Platte eine höhere Gentransfereffizienz erreicht werden.
Eine Immobilisierung der funktionellen Stoffe kann mittels des konventionellen Verfahrens, z.B. einem Zielzellkulturgefäß, das mit den funktionellen Stoffen beschichtet ist, durchgeführt werden oder die funktionellen Stoffe können immobilisiert sein, z.B. auf Kultur-Beads von kultivierten Zellen. Das Rohmaterial und die Art der Beads können in Abhängigkeit von der beabsichtigten Verwendung ausgewählt werden. Zum Beispiel kann das Bead einen kreisförmigen oder kugelförmigen Kern als Zentralteil besitzen und die Oberfläche des Kerns kann mit einem hydrophilen Polymer beschichtet sein. Beispiele von Rohmaterialien und die Art des Kerns und des Polymers sind in JP-A 8-501092 beschrieben. Zum Beispiel können biodegradierbare Beads, auf denen funktionelle Stoffe immobilisiert sind, in einen lebenden Körper verabreicht werden. Alternativ kann in einem wirksamen Verfahren ein Gemisch von Beads verwendet werden, auf denen ein Molekül, das eine Retrovirusbindungsdomäne aufweist, immobilisiert ist, sowie Beads, auf denen ein Molekül, das eine Zielzellbindungsdomäne aufweist, immobilisiert ist.
Wenn diese funktionellen Stoffe ohne Immobilisierung verwendet werden, kann z.B. ein Zielzellkulturgefäß mit einer Substanz vorbehandelt werden, die die funktionellen Stoffe an eine Adhäsion an das Gefäß hindert, z.B. mit Rinderserumalbumin (BSA = „bovine serum albumin"). Daher können die funktionellen Stoffe ohne unspezifische Adhäsion an das Gefäß verwendet werden.
Gemäß der vorliegenden Erfindung kann der Gentransfer selbst in einem solchen System effizient durchgeführt werden, bei dem der funktionelle Stoff der vorliegenden Erfindung ohne Immobilisierung verwendet wird.
Zusätzlich kann bei Verwendung des Reagenzkits, der spezifisch zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens, wie es hier beschrieben ist, entworfen wurde, ein Gentransfer in Zellen sehr leicht durchgeführt werden.
Wie oben beschrieben können transformierte Zellen, die gemäß den erfindungsgemäßen Verfahren erhalten wurden, in einen lebenden Körper transplantiert werden, so dass dadurch eine Gentherapie durchgeführt werden kann, um ein exogenes Gen in einem lebenden Körper zu exprimieren.
Zum Beispiel kann bei Verwendung von hämatopoetischen Stammzellen als Zielzellen eine Gentherapie anhand der folgenden Prozeduren durchgeführt werden. Zuerst wird ein Stoff, das die hämatopoetischen Zellen enthält, z.B. Knochenmarksgewebe, peripheres Blut, fötales Nabelschnurblut oder dergleichen von einem Spender gesammelt. Der Stoff kann als solcher verwendet werden. Jedoch wird gewöhnlicherweise eine Monozytenfraktion, welche die hämatopoetischen Stammzellen enthält, durch Dichtegradientenzentrifugation oder dergleichen hergestellt. Alternativ können hämatopoetische Stammzellen unter Einsatz von Marker auf Zelloberflächen, wie CD34 und/oder C-Kit aufgereinigt werden. Der Stoff, welcher die hämatopoetische Stammzellen enthält, kann gegebenenfalls mit einem geeigneten Zellwachstumsfaktor oder dergleichen prä-stimuliert werden und dann können die Zellen mit einem rekombinanten retroviralen Vektor, in dem ein gewünschtes Gen gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren eingeführt worden ist, insbesondere in der Gegenwart des funktionellen Stoffes mit einer Stammzellbindungsaktivität, infiziert werden. Die transformierten Zellen, die so erhalten wurden, können in einen Empfänger eingepflanzt werden, beispielsweise durch eine intravenöse Verabreichung. Der Empfänger ist vorzugsweise ein autologer Spender, umfasst aber auch allogene Transplantate, wobei die letzteren insbesondere dann verwendet werden, wenn Nabelschnurblutzellen als Transplantat verwendet werden.
Eine Gentherapie unter Verwendung von hämatopoetischen Stammzellen als Zielzellen dient dazu, ein defizientes oder abnormales Gen eines Patienten zu kompensieren und Beispiele davon umfassen ADA-Defizienz und Gaucher's-Krankheit. Zusätzlich wird manchmal eine Transduktion eines Arzneimittel-resistenten Gens durchgeführt, um Krankheiten von hämatopoetischen Stammzellen zu lindern, welche auf eine Chemotherapie, die zur Behandlung von Krebs, Leukämien und dergleichen eingesetzt wird, zurückzuführen sind.
Es ist auch bekannt, dass hämatopoetische Stammzellen den VLA-4-Rezeptor exprimieren und es ist daher möglich, einen Gentransfer unter Verwendung des funktionellen Stoffes mit einer CS-1-Zelladhäsionsregion, wie sie in der vorliegenden Erfindung offenbart ist, effizient durchzuführen. Weiter können, wie oben beschrieben, Moleküle, wie CD34 und C-Kit, auf den Oberflächen von hämatopoetischen Stammzellen exprimiert werden und daher kann die Gentransfereffizienz verbessert werden, indem Antikörper gegen diese Moleküle oder ein Stammzellfaktor, der ein Ligand von C-Kit ist, mit dem funktionellen Stoff mit einer Retrovirusbindungsdomäne kombiniert wird.
Darüber hinaus wurden zur Gentherapie von Krebs Tumorvaccin-Therapeutika untersucht, bei denen Cytokin-Gene in Krebszellen eingeführt werden. Nachdem ihnen die Wachstumsfähigkeit entzogen wurde, wurden die Zellen zurück in den Körper des Patienten gegeben, um die Tumorimmunität zu erhöhen (Human Gene Therapy, Band 5, Seiten 153–164 (1994)). Eine solche Behandlung kann auch effizient unter Verwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens mit dem funktionellen Stoff mit hoher Affinität für Krebszellen durchgeführt werden.
Es wurden weitere Anstrengungen unternommen, um AIDS durch Gentherapie zu behandeln. In diesem Fall wurde vorgeschlagen, ein Gen, das für ein Nukleinsäuremolekül kodiert, welches eine HIV-Replikation oder Gen-Expression hemmt (z.B. Antisense-Nukleinsäure, Ribozym, etc.) in T-Zellen einzuführen, die mit HIV, welches AIDS auslöst, infiziert sind (J. Virol., Band 69, Seiten 4045–4052 (1995)). Der Gentransfer in T-Zellen kann durch das erfindungsgemäße Verfahren erreicht werden, indem der funktionelle Stoff, z.B. ein CD4-Antikörper oder dergleichen, verwendet wird, welcher an ein auf der Oberfläche der T-Zellen vorkommendes Molekül binden kann.
Daher können als Zielzellen für den Gentransfer beliebige Zellen verwendet werden, sofern der erfindungsgemäße funktionelle Stoff mit der Zielzellbindungsdomäne verfügbar ist oder hergestellt werden kann.
Darüber hinaus ist das erfindungsgemäße Verfahren für Protokolle einer klinischen Gentherapie geeignet, da eine Co-Kultivierung von Zielzellen in der Gegenwart von Retrovirus-Erzeugerzellen nicht erforderlich ist und das erfindungsgemäße Verfahren kann in Abwesenheit von Hexadimethrinbromid durchgeführt werden, dessen klinische Verwendung beim Menschen nachteilig ist.
Weiter kann als Anwendung der vorliegenden Erfindung auf anderen Gebieten als der Gentherapie beispielsweise nicht-menschliche transgene Wirbeltiere auf einfache Weise hergestellt werden, indem als Zielzellen nicht-menschliche Embryoblasten-Stammzellen, nicht-menschliche prämordiale Keimzellen, nicht-menschliche Oozyten, nicht-menschliche Oogonien, nicht-menschliche Ova, nicht-menschliche Spermatozyten, nicht-menschliche Spermazellen und dergleichen verwendet werden.
Das bedeutet, dass die vorliegende Erfindung in einem Aspekt ein Verfahren zur zellulären Transplantation bereitstellt, welches die Transplantation der transformierten Zellen, die durch das erfindungsgemäße Verfahren erhalten wurden, in ein Wirbeltier umfasst. Beispiele von Wirbeltieren, die mit transformierten Zellen transplantiert werden sollen, umfassen Säugetiere (z.B. Maus, Ratte, Kaninchen, Ziege, Schwein, Pferd, Hund, Affe, Schimpanse, Mensch, etc.), Vögel (z.B. Hühnchen, Truthahn, Wachtel, Ente, Wildente, etc.), Reptilien (z.B. Schlange, Alligator, Schildkröte, etc.), Amphibien (z.B. Frosch, Salamander, Molch, etc.), Fische (z.B. Hundemakrele, Makrele, Seebarsch, Schnapper, Barsch, Gelbschwanz, Thunfisch, Lachs, Forelle, Karpfen, Süßwasserfisch, Aal, Flunder, Hai, Rochen, Stör, etc.).
Daher können gemäß diesem Aspekt der vorliegenden Erfindung, genauso wie substantiell reines Fibronectin, substantiell reine Fibronectin-Fragmente oder ein Gemisch davon, ein Gentransfer mit Retroviren effizient mittels der Retrovirusbindungsdomäne und der Zielzellbindungsdomäne des funktionellen Stoffes, der in der vorliegenden Erfindung verwendet wird, durchgeführt werden. Dann kann die vorliegende Erfindung eine Technik zur Übertragung von genetischen Stoffen in Wirbeltierzellen ohne Beschränkung der gebräuchlichen Techniken bereitstellen.
In einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung wird eine wirksame Menge eines Stoffes, der eine Retrovirusbindungsdomäne und Zielzellbindungsdomäne auf demselben Molekül besitzt und der äquivalente Funktionen besitzt wie die von substantiell reinem Fibronectin, substantiell reinen Fibronectin-Fragmenten oder einem Gemisch davon, als funktioneller Stoff verwendet.
Ein solcher funktioneller Stoff ist ein Stoff, der einen Gentransfer mit derselben Effizienz durchführen kann wie Fibronectin, ein Fibronectin-Fragment oder ein Gemisch davon. Typischerweise ist es der funktionelle Stoff, der die oben genannte neue Retrovirusbindungsdomäne und Zielzellbindungsdomäne der vorliegenden Erfindung auf demselben Molekül besitzt. Im Falle einer Verwendung dieser Stoffe wird davon ausgegangen, dass Retroviren sowie Zielzellen mindestens an einen funktionellen Stoff binden.
Beispiele des funktionellen Stoffes mit einer Retrovirusbindungsdomäne und einer Zielbindungsdomäne auf demselben Molekül umfassen Polypeptide, wie sie von den SEQ ID NOs 21 und 22 des Sequenzprotokolls wiedergegeben sind (hier als CHV-181 bzw. CHV-179 bezeichnet).
Diese Peptide umfassen Typ III-ähnliche Sequenzen (III-12, III-13 und III-14), die in H-271 enthalten sind. In CHV-181 werden III-12- und III-13-Sequenzen und in CHV-179 werden III-13- und III-14-Sequenzen zu dem C-Terminus des Zelladhäsionspolypeptids von Fibronectin über Methionin zugefügt (Pro¹²³⁹-Ser¹⁵¹⁵), Ein Plasmid zur Expression des Polypeptids CHV-181 kann beispielsweise anhand der folgenden Verfahren konstruiert werden.
Als erstes wird das Plasmid pHD101, welches ein DNA-Fragment enthält, das für das Heparin-Bindungspolypeptid (H-271) von Fibronectin kodiert, in Escherichia coli HB101/pHD101 hergestellt (FERM BP-2264). Eine HindIII-Stelle wird in einer Region, die für den C-Terminus der III-13-Sequenz auf diesem Plasmid kodiert, durch eine ortsgerichtete Mutagenese eingeführt, gefolgt von einem Verdau mit NcoI und HindIII, um ein DNA-Fragment zu erhalten, das für die III-12- und III-13-Sequenz kodiert. Andererseits wird der Plasmidvektor pINIII-ompA₁ mit HindIII und SalI verdaut, um ein DNA-Fragment zu erhalten, das für eine Lipoprotein-Terminatorregion kodiert.
Als nächstes wird das Plasmid pTF7021, das ein DNA-Fragment enthält, welches für das Zelladhäsionspolypeptid (C-279) von Fibronectin kodiert, aus Escherichia coli JM109/pTF7021 (FERM BP-1941) hergestellt und es wird eine NcoI-Stelle unmittelbar vor dem Terminations-Codon von C-279 auf dem Plasmid durch eine ortsgerichtete Mutagenese eingeführt, um das Plasmid pTF7520 zu erhalten. Dieses Plasmid wird mit NcoI und SalI gespalten, gefolgt von einem Vermischen mit dem DNA-Fragment, das für die III-12- und III-13-Sequenz kodiert und dem DNA-Fragment, das für eine Lipoprotein-Terminatorregion kodiert, um das Plasmid pCHV181 zur Expression des Polypeptids CHV-181 durch deren Ligation zu erhalten. Die Nukleotidsequenz von einer Region, die für das Polypeptid CHV-181 auf dem Plasmid pCHV 181 kodiert, ist in SEQ ID NO:27 des Sequenzprotokolls gezeigt.
Ein Plasmid zur Expression des Polypeptids CHV-179 kann beispielsweise anhand der folgenden Verfahren konstruiert werden.
Als erstes wird eine NcoI-Stelle in einer Region, die für den N-Terminus der III-13-Sequenz auf dem Plasmid pHD101 kodiert, durch ortsgerichtete Mutagenese eingeführt, gefolgt von einem Verdau mit NcoI und HindIII, um ein DNA-Fragment zu erhalten, das für die III-13- und III-14-Sequenz kodiert. Dieses wird zur Ligation mit einem DNA-Fragment vermengt, das für die oben genannte Lipoprotein-Terminatorregion kodiert, sowie dem NcoI- und SalI-verdauten Plasmid pTF7520, um das Plasmid pCHV 179 zur Expression des Polypeptids CHV-179 zu erhalten.
CHV-181 und CHV-179 können erhalten werden, indem E. coli, die jeweils mit den oben genannten Plasmiden transformiert sind, kultiviert werden und anschließend aus der entstehenden Kultur aufgereinigt werden.
Diese funktionellen Stoffe können durch Immobilisierung, beispielsweise auf den oben genannten Beads, oder ohne Immobilisierung verwendet werden.
In einem weiteren Aspekt liefert die vorliegende Erfindung ein Kulturmedium von Zielzellen, das für einen Gentransfer in die Zielzelle mit Retroviren verwendet werden kann und welches umfasst (1) das oben beschriebene Gemisch mit einer wirksamen Menge des funktionellen Stoffes mit einer Retrovirusbindungsdomäne und einer wirksamen Menge eines anderen funktionellen Stoffes mit der Zielzellbindungsdomäne oder (2) eine wirksame Menge des funktionellen Stoffes mit der oben beschriebenen neuen Retrovirusbindungsdomäne und der Zielzellbindungsdomäne auf demselben Molekül. Der funktionelle Stoff kann immobilisiert werden oder ohne Immobilisierung verwendet werden.
Andere Zusätze des Kulturmediums der vorliegenden Erfindung sind nicht auf besondere beschränkt, sofern sie für eine Kultur von Zielzellen verwendet werden können. Es können auch kommerziell erhältliche Kulturmedien zur Kultivierung von Zellen verwendet werden. Das erfindungsgemäße Kulturmedium kann auch Serum, einen Zellwachstumsfaktor, der für das Wachstum der Zielzellen notwendig ist, ein Antibiotikum zur Verhinderung einer Kontamination mit Mikroorganismen und dergleichen enthalten. Zum Beispiel kann im Falle von NIH/3T3-Zellen modifiziertes Dulbecco's Eagle's Medium (DMEM, JRH Bioscience), das 10% bovines fötales Serum (Gibco), 50 Einheiten/ml Penicillin und 50 μg/ml Streptomycin (beide Gibco) enthält, als Kulturmedium verwendet werden.
In einem weiteren Aspekt liefert die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Lokalisation eines Retrovirus, welches die Inkubation eines Kulturmediums, welches den Retrovirus enthält, der mit (1) dem oben beschriebenen Gemisch eines Moleküls, das die Retrovirusbindungsdomäne enthält und einem anderen Molekül, das die Zielzellbindungsdomäne enthält, in Kontakt gebracht wird, (2) der mit dem oben beschriebenen funktionellen Stoff mit der neuen Retrovirusbindungsdomäne der vorliegenden Erfindung und einer Zielzellbindungsdomäne aus demselben Molekül in Kontakt gebracht wird oder (3) der oben beschriebene funktionelle Stoff mit der Retrovirusbindungsdomäne in Kontakt gebracht wird.
Wie oben beschrieben kann der funktionelle Stoff immobilisiert sein oder ohne Immobilisierung verwendet werden. Eine Inkubation kann gemäß einem konventionellen Verfahren durchgeführt werden, z.B. bei 37°C unter Bedingungen, bei denen die CO₂-Konzentration 5% und die Luftfeuchtigkeit 99,5% beträgt. Diese Bedingungen können in geeigneter Weise in Abhängigkeit von den spezifischen zu verwendenden Zielzellen angepasst werden, und die Kulturdauer kann auch entsprechend den spezifischen Zellen und Zwecken verändert werden.
Bei Verwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens können virale Partikel in verschiedenen Konstrukten, welche die Viren in die Zielzellen übertragen, lokalisiert werden.
In einem anderen Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Kit bereitgestellt, der für einen Retrovirus-vermittelten Gentransfer in Zielzellen verwendet wird. Der Kit umfasst:

(a) eine wirksame Menge von (1) einem Gemisch des Moleküls mit der oben beschriebenen Retrovirusbindungsdomäne und einem anderen Molekül mit der Zielzellbindungsdomäne oder (2) dem funktionellen Stoff mit der neuen Retrovirusbindungsdomäne der vorliegenden Erfindung und der Zielzellbindungsdomäne auf demselben Molekül;
(b) ein künstliches Substrat zur Inkubation des Retrovirus, der mit den Zielzellen in Kontakt gebracht wird; und
(c) ein Zielzellwachstumsfaktor zur Prä-Stimulation der Zielzellen. Der funktionelle Stoff (a) kann immobilisiert oder nicht-immobilisiert sein. Dieser Kit kann weiter einen rekombinanten retroviralen Vektor, den erforderlichen Puffer und dergleichen enthalten.

Als künstliches Substrat können Platten zur Kultivierung von Zellen, Petrischalen, Kolben und dergleichen verwendet werden. Sie können aus Polystyrol hergestellt sein.
Für den Fall, dass es sich bei den Zielzellen um Zellen handelt, die sich in der G₀-Phase befinden, findet keine Infektion mit einem Retrovirus statt und deshalb werden die Zellen vorzugsweise prä-stimuliert, um die Zellen in den Zellzyklus zu führen. Für diesen Zweck werden die Zielzellen in der Gegenwart eines geeigneten Zellwachstumsfaktors vor der Infektion mit einem Retrovirus kultiviert. Zum Beispiel kann im Falle eines Gentransfers in Knochenmarkszellen und hämatopoetischen Stammzellen ein Zielzellwachstumsfaktor, wie Interleukin-6, oder ein Stammzellfaktor verwendet werden.
Entsprechende Einzelkomponenten des Kits können in Form von Trockengefrierprodukten, Granula, Tabletten zusätzlich zu wässrigen Lösungen entsprechend an sich bekannten Verfahren hergestellt werden.
Unter Verwendung des erfindungsgemäßen Kits kann z.B. eine transformierte lebensfähige Zielzellkultur erhalten werden und es kann eine Retrovirus-vermittelte Transduktion in Zielzellen auf einfache Weise durchgeführt werden.
Die vorliegende Erfindung umfasst auch ein Verfahren zum Gentransfer in Zielzellen mit einem Retrovirus, wobei der funktionelle Stoff ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus substantiell reinem Fibronectin, substantiell reinen Fibronectin-Fragmenten und einem Gemisch davon oder ein Polymer davon, das auf Beads immobilisiert ist oder nicht-immobilisiert ist, verwendet wird.
Die vorliegende Erfindung umfasst das oben beschriebene CH2-826 und dessen funktionelle Äquivalente. Zusätzlich stellt die vorliegende Erfindung ein Gen bereit, das für CH2-826 kodiert. Ein Beispiel dafür ist ein Gen, wie es in SEQ ID NO:20 des Sequenzprotokolls wiedergegeben ist. Die vorliegen de Erfindung umfasst auch funktionelle Äquivalente des Gens.
Weiter liefert die vorliegende Erfindung das oben beschriebene CHV-181 und umfasst dessen funktionelle Äquivalente. Zusätzlich stellt die vorliegende Erfindung ein Gen bereit, das für CHV-181 kodiert. Ein Beispiel des Gens ist ein Gen, das in SEQ ID NO:27 des Sequenzprotokolls wiedergegeben ist. Die folgende Erfindung umfasst auch funktionelle Äquivalente des Gens.
Die vorliegende Erfindung liefert auch ein Polymer, dass ein Polymer der Retrovirusbindungsdomäne und/oder ein Polymer der Zielzellbindungsdomäne enthält. Spezifische Beispiele des Polymers sind ein Polymer eines Fibroblasten-Wachstumsfaktors und ein Polymer eines Polypeptids mit einer Insulinbindungsdomäne, die von Typ V-Collagen abgeleitet ist.
Wie nachfolgend diskutiert, wird davon ausgegangen, dass ein Gentransfer in Zellen mit einem Retrovirus, d.h. eine Transformation durch Bindung des Retrovirus und der Zielzellen an ihre jeweiligen funktionellen Domänen verstärkt ist, obwohl die vorliegende Erfindung nicht durch irgendeine Theorie beschränkt sein soll.
Als funktioneller Stoff, der an ein Retrovirus bindet und daher für die vorliegende Erfindung verwendbar ist, kommt substantiell reines Fibronectin, substantiell reine Fibronectin-Fragmente oder ein Gemisch davon in Frage. Die Erfinder haben auch herausgefunden, dass die oben beschriebenen funktionellen Stoffe der vorliegenden Erfindung Funktionen besitzen, die im Wesentlichen dieselben sind wie diejenigen von substantiell reinem Fibronectin und dergleichen, die Gentransfereffizienz verbessern, d.h. die Transformationseffizienz von Zielzellen mit einem Retrovirus.
Die hier beschriebenen Fibronectin-Fragmente können von natürlichem oder synthetischem Ursprung sein und können im Wesentlichen rein aus natürlich vorkommenden Stoffen hergestellt werden, z.B. wie kürzlich beschrieben von Ruoslahti et al. (1981) J. Biol. Chem. 256:7277; Patel und Lodish (1986) J. Cell. Biol. 102:449; und Bernardi et al. (1987) J. Cell. Biol. 105:489. In dieser Hinsicht bedeutet eine Bezugnahme auf im Wesentlichen reines Fibronectin oder ein Fibronectin-Fragment, dass sie im Wesentlichen frei von anderen Proteinen sind, mit denen Fibronectin normalerweise vorkommt.
Das hier beschriebene im Wesentlichen reine Fibronectin oder Fibronectin-Fragment kann auch durch genetische Manipulationstechniken hergestellt werden, z.B. wie allgemein in dem US-Patent Nr. 5,198,423 beschrieben. Insbesondere werden die in den Beispielen unten beschriebenen rekombinanten Fragmente H-271, H-296, CH-271 (SEQ ID NO:23) und CH-296 (SEQ ID NO:24) und die Verfahren zu deren Erhalt im Detail in diesem Patent beschrieben. Das in den Beispielen unten verwendete C-274-Fragment wurde, wie in dem US-Patent Nr. 5,102,988 beschrieben, erhalten. Diese Fragmente oder Fragmente, von denen sie routinemäßig stammen können, werden erhalten, indem E. coli, das bei der NIBH 1-1-3, Higashi, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, Japan, gemäß dem Budapester Vertrag mit den Hinterlegungsnummern FERM P-10721 (H-296) (Datum der ursprünglichen Hinterlegung: 12. Mai 1989), FERM BP-2799 (C-277 gebunden an H-271 über Methionin; Datum der ursprünglichen Hinterlegung: 12. Mai 1989), FERM BP-2800 (C-277 gebunden an H-296 über Methionin; Datum der ursprünglichen Hinterlegung: 12. Mai 1989) und FERM BP-2264 (H-271; Datum der ursprünglichen Hinterlegung: 30. Januar 1989) hinterlegt wurde und wie auch in US-Patent Nr. 5,198,423 beschrieben, kultiviert werden.
Zusätzlich sind Informationen bezüglich der Verwendbarkeit von Fibronectin-Fragmenten oder für Ausgangsstoffe für solche Fragmente in Kimizuka et al., J. Biochem. 110, 284–291 (1991) vorzufinden, die weiter über die oben beschriebenen rekombinanten Fragmente berichten; in EMBO J., 4, 1755–1759 (1985), das über die Struktur des humanen Fibronectin-Gens berichtet und in Biochemistry, 25, 4936–4941 (1986), das über die Heparin II-Bindungsdomäne des humanen Fibronectins berichtet. Bei Fibronectin-Fragmenten, die sowohl die CS-1-Zelladhäsionsdomäne als auch die Heparin II-Bindungsdomäne besitzen, wurde neuerdings festgestellt, dass sie die Wirksamkeit eines Gentransfers in hämatopoetische Stammzellen signifikant erhöhen.
Es ist daher die Auffassung, dass die hier beschriebenen Fibronectin-verwandten Polypeptide eine Aminosäuresequenz, welche die Zellbindungsaktivität der CS-1-Zelladhäsionsdomäne von Fibronectin sowie eine Aminosäuresequenz der Heparin II-Bindungsdomäne von Fibronectin besitzen, welche das Virus bindet.
Das virale Bindungspolypeptid, das zur Verstärkung der Transduktion durch retrovirale Vektoren, wie in WO 95/26200 offenbart, eingesetzt wird, umfasst (i) eine erste Aminosäuresequenz, welche der Ala¹⁶⁹⁰-Thr¹⁹⁶⁰ der Heparin II-Bindungsdomäne von humanem Fibronectin entspricht, welche durch die Formel wiedergegeben ist (SEQ ID NO:1):
oder eine ausreichend ähnliche Aminosäuresequenz dazu, um die Fähigkeit zur Bindung des Retrovirus auszuüben;
und (ii) eine zweite Aminosäuresequenz (CS-1), die zu einem Teil der IIICS-Bindungsdomäne von humanem Fibronectin korrespondiert, welche durch die Formel wiedergegeben ist (SEQ ID NO:2):
Asp Glu Leu Pro Gln Leu Val Thr Leu Pro His Pro Asn Leu His
Gly Pro Glu Ile Leu Asp Val Pro Ser Thr;
oder eine ausreichend ähnliche Aminosäuresequenz dazu, um die Fähigkeit zur Bindung an hämatopoetische Zellen auszuüben, wie z.B. primitive Vorläufer- und/oder langfristig repopulierende (Stamm-) Zellen.
Die Retrovirusbindungsaktivität eines Polypeptids, wie es in der oben genannten SEQ ID NO:1 wiedergegeben ist (H-271), zeigt eine Konzentrationsabhängigkeit und, wie in Beispiel 8, unten gezeigt, eine im Wesentlichen gleiche Aktivität wie die von H-271 bei hohen Konzentrationen. Das bedeutet, dass ein Retrovirus und die Zielzellen mindestens an einem Molekül H-271 zum ersten Mal binden in der Gegenwart einer hohen Konzentration von H-271.
Die starke Virusbindung an die Virusbindungsdomäne des erfindungsgemäßen funktionellen Stoffes kann ausgenutzt werden, um Abgabesysteme für eine Virus-vermittelte Therapie über einen breiten Bereich von Zelltypen zu konstruieren. Zu diesem Zweck kann ein Polypeptid, das die Retrovirusbindungsdomäne des erfindungsgemäßen funktionellen Stoffes enthält, an einen beliebigen Stoff gekoppelt werden, der eine Zellbindungsdomäne enthält, was diesem Konstrukt eine Spezifität für die Zielzellen verleiht oder es kann mit einem Stoff, der dessen Zellbindungsdomäne enthält, co-lokalisiert sein. Das bedeutet, dass das Virusbindungspolypeptid kovalent an den Zellbindungsstoff gekoppelt werden kann oder dass es sich um unterschiedliche Moleküle handeln kann.
Diese Vorgehensweise umgeht die vorherige Notwendigkeit einer Konstruktion spezifischer Retroviruszelllinien für jede Zielzelle und ermöglicht eine Selektion des funktionellen Stoffes mit der am meisten geeigneten Zielzellbindungsdomäne entsprechend einer bestimmten Art von Zielzellen. Daher kann unter Verwendung des erfindungsgemäßen funktionellen Stoffes eine Transduktion, die spezifisch für die zu verwendenden Zielzellen ist, leicht durchgeführt werden und insbesondere ist das erfindungsgemäße Verfahren, bei dem ein Gemisch des funktionellen Stoffes mit einer Retrovirusbindungsdomäne und des funktionellen Stoffes mit einer Zielzellbindungsdomäne besonders nützlich, um das erforderliche Gen in die spezifische Zielzelle einzuführen. Zusätzlich wird ein neuer funktioneller Stoff durch die vorliegende Erfindung bereitgestellt, der für das Verfahren zur Erhöhung der Gentransfereffizienz in die Zielzellen mit Retroviren und verwandten Techniken besonders nützlich ist.
Die folgenden Beispiele veranschaulichen weiter die vorliegende Erfindung im Detail, sollen aber nicht deren Umfang beschränken.
Beispiel 1
(1) Herstellung von Virusüberstand
GP + E-86-Erzeugerzellen (ATCC CRL-9642), die das retrovirale Plasmid PMSneo-Vektor enthalten, der ein Neomycin-Resistenzgen enthält (Exp. Hematol., 23, 630–638 (1995)) wurden in modifizierten Dulbecco's Eagle's Medium (DMEM, JRH Bioscience), das 10% fötales Kälberserum (FCS, Gibco) und 50 Einheiten/ml Penicillin und 50 μg/ml Streptomycin enthält (beide Gibco) kultiviert. Alle DMEM-Medien, die hier verwendet wurden, enthielten 50 Einheiten/ml Penicillin und 50 μg/ml Streptomycin. PMSneo-Virus-enthaltender Überstand wurde gesammelt, indem 4ml DMEM, das 10% FCS enthält, zu semi-konfluenten Platten zugegeben wurde und über Nacht kultiviert wurde. Das geerntete Medium wurde über 0,45 Mikrometerfilter (Millipore) filtriert, um einen Virusüberstand zu erhalten, der bei –80°C bis zu dessen Verwendung gelagert wurde.
Beim Retrovirusplasmid, TKNEO-Vektor (Blood, 78, 310–317 (1991)) wurde separat ein TKNeo-Virusüberstand entsprechend denselben Verfahren wie den oben beschriebenen unter Verwendung von GP + envAm-12-Zellen (ATCC CRL-9641) hergestellt.
(2) Bestimmung des Virustiters des Überstandes
Der Virustiter des Überstandes wurde unter Verwendung von NIH/3T3-Zellen entsprechend dem Standardverfahren bestimmt (J. Virol., 62, Seiten 1120–1124 (1988)). Dazu wurden DMEM und 2000 Zellen/Vertiefung NIH/3T3-Zellen zu einer Gewebekulturplatte mit 6 Vertiefungen zugegeben. Nach einer Kultivierung über Nacht wurde der seriell verdünnte Virusüberstand zu jeder Vertiefung zusammen mit Hexadimethrinbromid (Polybren, hergestellt von Aldrich) mit einer Endkonzentration von 7,5 μg/ml zugegeben. Dies wurde bei 37°C für 24 Stunden inkubiert und das Medium wurde dann durch eines, das G418 (Gibco) enthält, bei einer Endkonzentration von 0,75 mg/ml ersetzt. Die Platte wurde weiter inkubiert. G418-resistente (G418^r)-Kolonien, die nach 10 bis 12 Tage wuchsen, wurden mit Kristallviolett gefärbt, um ihre Zahl aufzuzeichnen. Die Anzahl der infektiösen Partikel pro ml Überstand (cfu/ml) wurde berechnet, indem die Anzahl von Kolonien pro Vertiefung mit der Verdünnungsrate multipliziert wurde und diese wurde als Titer des Überstandes verwendet, um die Menge des Virusüberstandes zu bestimmen, der in den nachfolgenden Experimenten zugegeben wurde.
Beispiel 2
(1) Herstellung des von Fibronectin abgeleiteten Polypeptids
Das von humanem Fibronectin abgeleitete Polypeptid, H-271 (Aminosäuresequenz ist in SEQ ID NO:1 des Sequenzprotokolls gezeigt) wurde aus E. coli hergestellt, das das rekombinante Plasmid enthält, welches die für das Polypeptid kodierende DNA enthält, pHD 101, d.h., Escherichia coli HB101/pHD101 (FERM BP-2264) entsprechend den in US-Patent Nr. 5,198,423 offenbarten Verfahren.
Das Polypeptid CH-271 (Aminosäuresequenz ist in SEQ ID NO:23 des Sequenzprotokolls gezeigt) wurde wie folgt hergestellt. Dazu wurde Escherichia coli HB101/pCH101 (FERM BP-2799) entsprechend den in dem oberen Patent beschriebenen Verfahren kultiviert und CH-271 wurde von der Kultur erhalten.
Dann wurde das Polypeptid CH-296 (Aminosäuresequenz ist in SEQ ID NO:24 gezeigt) wie folgt hergestellt. Dazu wurde Escherichia coli HB101/pCH102 (FERM BP-2800) gemäß dem in dem oberen Patent beschriebenen Verfahren kultiviert und CH-296 wurde aus der Kultur erhalten.
Das Polypeptid C-274 (Aminosäuresequenz ist in SEQ ID NO:25 des Sequenzprotokolls gezeigt) wurde wie folgt hergestellt. Dazu wurde Escherichia coli JM109/pTF7221 (FERM BP-1915) entsprechend dem in US-Patent Nr. 5,102,988 beschriebenen Verfahren kultiviert und C-274 wurde aus der Kultur erhalten.
Weiter wurde das Polypeptid C277-CS1 (Aminosäuresequenz ist in SEQ ID NO:29 des Sequenzprotokolls gezeigt) wie folgt hergestellt. Dazu wurde Escherichia coli HB101/pCS25, das in JP-A 3-284700 unter FERM P-11339 offenbart ist und bei der NIBH 1-1-3, Higashi, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken gemäß dem Budapester Vertrag mit der Hinterlegungsnummer FERM BP-5723 hinterlegt worden ist (Datum der ursprünglichen Hinterlegung: 5. März 1990) gemäß dem in dem oben genannten Patent beschriebenen Verfahren kultiviert und C-277-CS1 wurde aus der Kultur erhalten.
(2) Herstellung von C-FGF·A
Das Polypeptid C-FGF·A (Aminosäuresequenz ist in SEQ ID NO:4 des Sequenzprotokolls gezeigt) wurde wie folgt hergestellt. Dazu wurde E. coli, welches das rekombinante Plasmid enthält, welches DNA enthält, das für das oben genannte Polypeptid pYMH-CF·A kodiert, d.h. Escherichia coli JM109/pYMH-CF·A (FERM BP-5278) in 5 ml LB-Brühe, die 100 μg/ml Ampicillin enthält, bei 37°C für 8 Stunden kultiviert. Diese Vorkulturbrühe wurde in 500 ml LB-Brühe, die 100 μg/ml Ampicillin und 1 mM IPTG (Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid) enthält, angeimpft und über Nacht bei 37°C kultiviert. Die mikrobiellen Zellen wurden geerntet, in 10 mM PBS (Phosphat-gepufferte Salzlösung), das 1 mM PMSF (Phenylmethansulfoniumfluorid) und 0,05% Nonidet P-40 enthält, suspendiert und sonifiziert, um so die Zellen aufzubrechen. Das Gemisch wurde zentrifugiert, um einen Überstand zu erhalten. Bei einer Absorption von 4,000 bei 260 nm von diesem Überstand wurden 1 ml 5% Polyethylenimin dazugegeben und das Gemisch wurde zentrifugiert, um einen Überstand zu erhalten. Der Überstand wurde auf eine HiTrap-Heparinsäule aufgetragen (Pharmacia), die mit PBS äquilibriert war. Nach dem Waschen der nichtabsorbierten Fraktion mit PBS wurde die absorbierte Fraktion mit PBS in einem NaCl-Gradienten von 0,5 M bis 2 M eluiert. Das Eluat wurde unter Verwendung von SDS-Polyacrylamid-Gel-Elektrophorese (SDS-PAGE) analysiert, welche die Gegenwart von zwei Fraktionen, die das 47 kd-Polypeptid enthalten, zeigte. Eine Fraktion von diesen, welche bei der höheren NaCl-Konzentration eluierte, wurde gesammelt und auf eine Superose 6-Säule (Pharmacia) aufgetragen und mit PBS, welche 1,5 M NaCl enthielt, äquilibriert. Das Eluat wurde durch SDS-PAGE analysiert und es wurde eine Fraktion, die ein ungefähr 47 kd-Polypeptid enthielt, gesammelt, um das gereinigte C-FGF·A zu erhalten, welches in den nachfolgenden Schritten verwendet wurde.
(3) Herstellung von C-FGF-CS 1
Als erstes wurde ein Plasmid zur Expression des Polypeptids C-FCF-CS1 (Aminosäuresequenz ist in SEQ ID NO:5 des Sequenzprotokolls gezeigt) in Escherichia coli als Wirt konstruiert.
Escherichia coli HB101/pCH102 (FERM BP-2800) wurde kultiviert und das Plasmid pCH102 wurde durch ein Alkali-SDS-Verfahren von den entstehenden mikrobiellen Zellen hergestellt. Es wurde eine PCR unter Verwendung dieses Plasmids als Vorlage durchgeführt, sowie dem Primer M4 (Takara Shuzo Co., Ltd.) und dem Primer CS1-S, dessen Nukleotidsequenz in SEQ ID NO:9 des Sequenzprotokolls gezeigt ist. Ein amplifiziertes DNA-Fragment in der Reaktionslösung wurde durch Ethanolpräzipitation gewonnen. Das entstandene DNA-Fragment wurde mit NheI und SalI verdaut (beide Takara Shuzo Co., Ltd.), gefolgt von einer Agarose-Gel-Elektrophorese, um ein ungefähr 970 bp-DNA-Fragment aus dem Gel zu gewinnen.
Escherichia coli JM109/pYMH-CF·A (FERM BP-5278) wurde dann kultiviert und das Plasmid pYMH-CF·A wurde durch ein Alkali-SDS-Verfahren aus den entstehenden mikrobiellen Zellen hergestellt. Es wurde eine PCR-Reaktion unter Verwendung dieses Plasmids als Vorlage sowie einem Primer CF durchgeführt, dessen Nukleotidsequenz in SEQ ID NO:10 gezeigt ist und einem Primer FNR, dessen Nukleotidsequenz in SEQ ID NO:11 des Sequenzprotokolls gezeigt ist und es wurde ein amplifiziertes DNA-Fragment in der Reaktionslösung durch Ethanolpräzipitation gewonnen. Das entstandene DNA-Fragment wurde mit Eco52I (Takara Shuzo Co., Ltd.) und NheI verdaut, gefolgt von einer Agarose-Gel-Elektrophorese, um ein ungefähr 320 bp-DNA-Fragment aus dem Gel zu gewinnen.
Ein ungefähr 4,1 kb-DNA-Fragment, welches durch Verdau des Plasmids pYMH-CF·A mit Eco52I und SalI isoliert wurde, und einer Agarose-Gel-Elektrophorese unterzogen wurde, wurde mit dem oben genannten 970 bp-DNA-Fragment und dem ungefähr 320 bp-DNA-Fragment zur Ligation vermengt, um so ein rekombinantes Plasmid zu halten, das in E. coli JM109 eingeführt wurde. Es wurde ein Plasmid aus den entstandenen Transformanten hergestellt und dasjenige, das jeweils ein Molekül der oben genannten drei DNA-Fragmente enthielt, wurde ausgewählt und als Plasmid pCFS100 bezeichnet. E. coli JM109, das mit dem Plasmid pCFS100 transformiert war, wurde als Escherichia coli JM109/pCRS100 bezeichnet. Das Plasmid pCFS100 hat eine CS-1-Zelladhäsionsregion, die von Fibronectin abgeleitet war, am C-Terminus von C-FGF·A und kodiert für das Polypeptid C-FGF-CS1, wobei das zweite Lysin am C-Terminus von FGF mit Alanin substituiert war.
Das Polypeptid C-FGF-CS 1 wurde wie folgt hergestellt. Dazu wurde das oben genannte E. coli JM109/pCFS100 in 5 ml LB-Brühe, die 100 μg/ml Ampicillin enthielt, bei 37°C für 8 Stunden kultiviert. Diese vorkultivierte Brühe wurde in 500 ml LB-Brühe, die 100 μg/ml Ampicillin und 1 mM IPTG enthielt, angeimpft und über Nacht bei 37°C kultiviert, um die mikrobiellen Zellen einzusammeln. Die entstehenden mikrobiellen Zellen wurden in 10 ml PBS (Phosphat-gepufferte Salzlösung), die 0,5 M NaCl, 1 mM PMSF und 0,05% Nonidet P-40 enthielt, suspendiert und die mikrobiellen Zellen wurden sonifiziert, um diese aufzubrechen und zentrifugiert, um einen Überstand zu erhalten. Dieser Überstand wurde auf eine HiTrap-Heparin-Säule aufgetragen, die mit PBS, das 0,5 M NaCl enthielt, prä-äquilibriert wurde. Die nicht-adsorbierten Fraktionen wurden in PBS, das 0,5 mM NaCl enthielt, gewaschen und die adsorbierte Fraktion wurde mit PBS mit einem Konzentrationsgradienten von 0,5 M bis 2 M NaCl eluiert. Das Eluat wurde durch SDS-Polyacrylamid-Gel-Elektrophorese analysiert und Fraktionen, die ein Polypeptid mit ungefähr 50 kd enthielten, wurden gesammelt, um gereinigtes C-FGF-CS1 zu erhalten, das in den nachfolgenden Schritten verwendet wurde.
Die so erhaltene Aminosäuresequenz vom N-Terminus bis zu der fünften Aminosäure des gereinigten C-FGF-CS1 wurde untersucht und es wurde festgestellt, dass diese mit der SEQ ID NO:5 des gezeigten Sequenzprotokolls übereinstimmt. Darüber hinaus stimmte das Molekulargewicht des gereinigten C-FGF-CS1, das anhand von Massenspektroskopie gemessen wurde, mit dem erwarteten Molekulargewicht von der oben genannten Aminosäuresequenz überein.
(4) Herstellung von C277-ColV
Das Polypeptid C277-ColV (Aminosäuresequenz ist in SEQ ID NO:6 des Sequenzprotokolls gezeigt) wurde wie folgt aufgereinigt. Dazu wurde E. coli, das das rekombinante Plasmid enthält, welches DNA enthält, die für das oben genannte Polypeptid pTF7520ColV kodiert, d.h. Escherichia coli JM109/pTF7520 ColV (FERM BP-5277), in 5 ml LB-Brühe, die 100 μg/ml Ampicillin enthielt, bei 37°C für 6,5 Stunden kultiviert. Diese Vorkulturbrühe wurde in 500 ml LB-Brühe, die 100 μg/ml Ampicillin enthielt, angeimpft und bei 37°C kultiviert. Wenn die Absorption bei 660 nm 0,6 erreichte, wurde IPTG zu der Brühe zugegeben, um 1 mM der Endkonzen tration hervorzubringen und die Brühe wurde über Nacht kultiviert, um mikrobielle Zellen zu ernten. Die mikrobiellen Zellen, die so erhalten wurden, wurden in 10 ml PBS suspendiert, das 1 ml EDTA, 0,05% Nonidet P-40 und 2 mM PMSF enthielt und für 10 Minuten sonifiziert, um die Zellen aufzubrechen. Die Zellaufbruchslösung wurde zentrifugiert und der entstandene Überstand wurde auf eine Resource Q-Säule (Pharmacia) aufgetragen, um eine nicht-adsorbierte Fraktion, welche das gewünschte Polypeptid enthält, zu erhalten. Die Fraktion wurde auf eine HiTrap-Heparin-Säule aufgetragen, die mit PBS äquilibriert war. Nach dem Waschen der nicht-adsorbierten Fraktionen mit PBS wurde die adsorbierte Fraktion mit PBS mit einem NaCl-Gradienten von 0 M bis 0,5 M NaCl eluiert. Das Eluat wurde durch SDS-PAGE analysiert und die Fraktionen, welche das 48 kd-Polypeptid enthielten, wurden gesammelt, um das gereinigte C277-ColV zu erhalten, das in den nachfolgenden Schritten verwendet wurde.
(5) Herstellung von ColV
Als erstes wurde ein Plasmid zur Expression des Polypeptids ColV (Aminosäuresequenz ist in SEQ ID NO:6 des Sequenzprotokolls gezeigt) in Escherichia coli als Wirt konstruiert.
Escherichia coli HB101/pTF7520ColV (FERM BP-5277) wurde kultiviert und das Plasmid pTF7520ColV wurde durch ein Alkali-SDS-Verfahren aus den entstehenden mikrobiellen Zellen hergestellt. Dieses Plasmid wurde mit NcoI und BamHI (beide Takara Shuzo Co., Ltd.) verdaut, gefolgt von einer Agarose-Gel-Elektrophorese, um ein ungefähr 0,58 kb-DNA-Fragment aus dem Gel zu gewinnen. Dies wurde mit dem mit NcoI und BamHI vorverdauten Plasmidvektor pET8C (Novagen) vermischt, um sie zu ligieren. Das entstandene rekombinante Plasmid wurde in E. coli BL21 eingeführt, um eine Transformante zu erhalten, von der Plasmide präpariert wurden. Ein Plasmid, das lediglich ein Molekül des oben genannten ungefähr 0,58 kb-DNA-Fragments enthielt, wurde ausgewählt und als pETColV bezeichnet.
E. coli BL21, das mit dem oben genannten Plasmid pETColV transformiert war, d.h. Escherichia coli BL-21/pETColV wurde über Nacht in 10 ml LB-Brühe, die 50 μg/ml Ampicillin enthielt, bei 37°C über Nacht kultiviert. 0,2 ml dieser Vorkulturlösung wurde in 100 ml LB-Brühe, die 50 μg/ml Ampicillin enthielt, angeimpft, gefolgt von einer Kultivierung bei 37°C. Wenn die Absorption bei 600 nm 0,4 erreichte, wurde IPTG dazu bei einer Endkonzentration von 1 mM zugegeben, gefolgt von einer Übernachtkultivierung, um die mikrobiellen Zellen einzusammeln. Die entstandenen mikrobiellen Zellen wurden in 5 ml PBS (Phosphat-gepufferte Salzlösung), die 1 mM EDTA, 0,05% Nonidet P-40, 10 μg/ml Aprotinin, 10 μg/ml Leupeptin und 2 mM PMSF enthielt, suspendiert, die Zellen wurden sonifiziert, um diese aufzubrechen, gefolgt von einer Zentrifugation, um einen Überstand zu erhalten. Dieser Überstand wurde auf eine HiTrap-Heparin-Säule aufgetragen, die mit PBS äquilibriert war. Die nicht absorbierten Fraktionen wurden mit PBS gewaschen und die absorbierte Fraktion wurde mit PBS, das 0,5 M NaCl enthielt, eluiert. Das Eluat wurde durch eine SDS-Polyacrylamid-Gel-Elektrophorese analysiert und ein nahezu homogenes Polypeptid mit etwa 18 kd wurde nachgewiesen. Das so erhaltene gereinigte ColV wurde in den nachfolgenden Schritten verwendet.
(6) Herstellung von H2-547
Ein Plasmid zur Expression des Polypeptids H2-547 (Aminosäuresequenz ist in SEQ ID NO:13 des Sequenzprotokolls gezeigt) wurde wie folgt konstruiert. Escherichia coli HB101/pCH101 (FERM BP-2800) wurde kultiviert und das Plasmid pCH102 wurde aus den entstandenen Zellen unter Verwendung des Alkali-SDS-Verfahrens hergestellt. Die PCR wurde unter Verwendung dieses Plasmids als Vorlage sowie dem Primer 125, dessen Nukleotidsequenz in SEQ ID NO:15 des Sequenzprotokolls gezeigt ist und dem Primer 14A, dessen Nukleotidsequenz in SEQ ID NO:16 des Sequenzprotokolls gezeigt ist, durchgeführt, gefolgt von einer Agarose-Gel-Elektrophorese, um ein ungefähr 0,8 kb-DNA-Fragment, das für ein Heparin-Bindungspolypeptid von Fibronectin kodiert, aus dem Gel zu gewinnen. Das entstandene DNA-Fragment wurde mit NcoI und BamHI (beide Takara Shuzo Co., Ltd.) verdaut und mit NcoI-BamHI-verdautem pTV118N (Takara Shuzo Co., Ltd.) vermengt, um sie zu ligieren, und wurde dann in E. coli JM109 eingeführt. Die Plasmide wurden aus dem sich ergebenden Transformanten hergestellt und ein Plasmid, welches das oben genannte DNA-Fragment enthält, wurde ausgewählt und als Plasmid pRH1 bezeichnet.
Der Plasmidvektor pINIII-ompA₁ (The EMBO Journal, 3, 3437–3442 (1984)) wurde mit BamHI und HincII (Takara Shuzo Co., Ltd.) verdaut, um ein ungefähr 0,9 kb-DNA-Fragment zu gewinnen, das eine Lipoprotein-Terminatorregion enthält. Dieses wurde zur Ligation mit BamHI-HincII verdautem Plasmid pRH1 vermengt, um das Plasmid pRH1-T zu erhalten, welches den lac-Promoter, ein DNA-Fragment, das für ein Heparin-Bindungspolypeptid kodiert, und einen Lipoprotein-Terminator in dieser Reihenfolge enthält.
Ein ungefähr 3,1 kb-DNA-Fragment, das durch Verdau des Plasmids pRH1-T mit NheI und ScaI (beide Takara Shuzo Co., Ltd.) erhalten wurde, und ein ungefähr 2,5 kb-DNA-Fragment, das jeweils durch Verdau des Plasmids pRH1-T mit Spe I (Takara Shuzo Co., Ltd.) und ScaI erhalten wurde, wurden hergestellt und diese beiden Fragmente wurden ligiert, um das Plasmid pRH2-T zu erhalten, das den lac-Promoter, das offene Leseraster, das für ein Polypeptid kodiert, bei dem zwei Heparin-Bindungspolypeptide in Tandem verbunden sind, und dem Lipoprotein-Terminator in dieser Reihenfolge enthält. Eine Nukleotidsequenz des oben genannten offenen Leserasters ist in SEQ ID NO:17 des Sequenzprotokolls gezeigt.
Das Polypeptid H2-547 wurde wie folgt hergestellt. Vier 500 ml Erlenmeyer-Kolben, die mit einer Verschlussklappe versehen waren, die 120 ml LB-Brühe enthielten, welche 100 μg/ml Ampicillin enthielt, wurden präpariert, in diesen wurde E. coli HB101 angeimpft, die mit dem oben genannten pRH2-T-Plasmid transformiert waren, d.h. Escherichia coli HB101/pRH2-T, zur Kultivierung über Nacht bei 37°C. Die mikrobiellen Zellen wurden aus der Kultur durch Zentrifugation gesammelt, in 40 ml Aufbrechungspuffer (50 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, 150 mM NaCl, 1 mM DTT, 1 mM PMSF, pH 7,5) suspendiert, und die mikrobiellen Zellen wurden sonifiziert, um diese aufzubrechen. Der Überstand, der durch Zentrifugation erhalten wurde, wurde auf eine HiTrap-Heparin-Säule (Pharmacia) aufgetragen, die mit einem Aufreinigungspuffer (50 mM Tris-HCl, pH 7,5) äquilibriert war. Die nicht-adsorbierten Fraktionen in der Säule wurden mit demselben Puffer gewaschen, gefolgt von einer Elution mit einem Aufreinigungspuffer mit einem Konzentrationsgradienten von 0 bis 1 M NaCl. Das Eluat wurde durch SDS-Polyacrylamid-Gel-Elektrophorese analysiert, und die Fraktionen, die ein Polypeptid mit einem Molekulargewicht von etwa 60 000 enthielten, wurden gesammelt, um eine gereinigte H2-547-Zubereitung zu erhalten. Diese Proteinmenge, die in der entstandenen Zubereitung enthalten war, wurde mit einem BCA PROTEIN ASSAY REAGENZ (Pierce) unter Verwendung von Rinderserumalbumin als Standard analysiert, was darauf hindeutet, dass ungefähr 10 mg H2-547 erhalten wurde.
Die Aminosäuresequenz von dem N-Terminus bis zu dem fünften Rest des so erhaltenen gereinigten H2-547 wurde untersucht und es wurde festgestellt, dass diese mit der erwarteten Aminosäuresequenz von H2-547 von der Nukleotidsequenz, die in SEQ ID NO:17 des Sequenzprotokolls gezeigt ist minus dem Methionin am N-Terminus (Sequenz ist in SEQ ID NO:13 des Sequenzprotokolls gezeigt), übereinstimmt. Das Molekulargewicht des gereinigten H2-547, das mittels Massenspektroskopie gemessen wurde, stimmte mit dem erwarteten Molekulargewicht der Aminosäuresequenz, die in SEQ ID NO:13 des Sequenzprotokolls gezeigt ist, überein.
(7) Herstellung von CH2-826
Ein Plasmid zur Expression des Polypeptids CH2-826 (Aminosäuresequenz ist in SEQ ID NO:14 des Sequenzprotokolls gezeigt) wurde wie folgt konstruiert. Es wurde eine PCR des oben genannten Plasmids pCH102 als Vorlage sowie dem Primer CLS, dessen Nukleotidsequenz in SEQ ID NO:18 des Sequenzprotokolls gezeigt ist und dem Primer CLA, dessen Nukleotidsequenz in SEQ ID NO:19 des Sequenzprotokolls gezeigt ist, durchgeführt, gefolgt von einer Agarose-Gel-Elektrophorese, um ein ungefähr 0,8 kb-DNA-Fragment, das für das Zelladhäsionspolypeptid von Fibronectin kodiert, zu gewinnen. Das entstandene DNA-Fragment wurde mit NcoI und BglII (beide Takara Shuzo Co., Ltd.) verdaut und mit NciI-BamHI-verdautem pTV118N vermengt, um sie zu ligieren, und dann in E. coli JM109 eingeführt. Es wurden Plasmide von der entstandenen Transformante hergestellt und ein Plasmid, welches das oben genannte DNA-Fragment enthielt, wurde ausgewählt und als Plasmid pRC1 bezeichnet. Ein ungefähr 2,5 kb-DNA-Fragment, das durch Verdau dieses Plasmids pRC1 mit Spe1 und ScaI erhalten wurde und ein ungefähr 3,9 kb-DNA-Fragment, das durch Verdau des oben genannten Plasmids pRH2-T mit NheI und ScaI erhalten wurde, wurden vermengt, um diese zu ligieren, um so das Plasmid pRCH2-T zu erhalten, das für ein Polypeptid kodiert, bei dem zwei Heparin-Bindungspolypeptide tandemartig mit dem C-Terminus des Zelladhäsionspolypeptids verbunden sind. Eine Nukleotidsequenz des offenen Leserasters auf dem Plasmid pRCH2-T, das für dieses Polypeptid kodiert, ist in SEQ ID NO:20 des Sequenzprotokolls gezeigt.
Das Polypeptid CH2-826 wurde nach demselben Verfahren hergestellt, wie dasjenige für das Polypeptid H2-547, das in Beispiel 2 (6) beschrieben wurde. Die Fraktionen, die ein Polypeptid mit dem Molekulargewicht von ungefähr 90 000 enthielten, wurden von dem Eluat einer High-Trap-Heparin-Säule gesammelt, um gereinigtes CH2-826 zu erhalten.
(8) Herstellung von H2S-537
Ein Plasmid zur Expression des Polypeptids H2S-537 (Aminosäuresequenz ist in SEQ ID NO:30 des Sequenzprotokolls gezeigt) wurde wie folgt konstruiert. Es wurde eine PCR unter Verwendung des oben genannten Plasmids pCH102 als Vorlage sowie dem Primer CS1S, dessen Nukleotidsequenz in SEQ ID NO:31 des Sequenzprotokolls gezeigt ist und dem Primer CS1A, dessen Nukleotidsequenz in SEQ ID NO:32 des Sequenzprotokolls gezeigt ist, durchgeführt, gefolgt von einer Agarose-Gel-Elektrophorese, um ein ungefähr 0,1 kb-DNA-Fragment zu gewinnen, das für das Zelladhäsionspolypeptid von Fibronectin kodiert. Das entstandene DNA-Fragment wurde mit NcoI und BamHI verdaut (beide Takara Shuzo Co., Ltd.) und mit NcoI-BamHI-verdautem pTV118N vermengt, um sie zu ligieren, und dann in E. coli JM109 eingeführt. Es wurden Plasmide aus dem sich ergebenden Transformanten hergestellt und einem Plasmid, welches das oben genannte DNA-Fragment enthielt, wurde ausgewählt und als Plasmid pRS1 bezeichnet.
Der Plasmidvektor pINIII-ompA₁ wurde mit BamHI und HincII verdaut, um ein ungefähr 0,9 kb-DNA-Fragment zu gewinnen, das eine Lipoprotein-Terminatorregion enthält. Diese wurde mit BamHI-HincII-verdautem Plasmid pRS1 vermengt, um sie zu ligieren, um das Plasmid pRS1-T zu erhalten, das den lac-Promoter, ein DNA-Fragment, das für das CS-1-Region-Polypeptid kodiert und ein Lipoprotein-Terminator in dieser Reihenfolge enthält.
Ein ungefähr 2,4 kb-DNA-Fragment, das durch Verdau von diesem Plasmid pRS1-T mit NheI und ScaI erhalten wurde und ein ungefähr 3,3 kb-DNA-Fragment, das durch Verdau des oben genannten Plasmids pRH2-T mit SpeI, ScaI und PstI (Takara Shuzo Co., Ltd.) erhalten wurde, wurden hergestellt. Sie wurden ligiert, um das Plasmid pRH2S-T zu erhalten, welches einen lac-Promoter, ein offenes Leseraster, das für ein Polypeptid mit einer Struktur kodiert, bei der zwei Heparin-Bindungspolypeptide tandemartig verbunden sind, und eine CS1-Region des Weiteren an den C-Terminus davon und an den Lipoprotein-Terminator in dieser Reihenfolge gekoppelt sind. Eine Nukleotidsequenz des oben genannten offenen Leserasters ist in SEQ ID NO:32 des Sequenzprotokolls gezeigt.
Das Polypeptid H2S-573 wurde nach demselben Verfahren hergestellt, wie dasjenige, das für das Polypeptid H2-547, das in Beispiel 2 (6) beschrieben wurde, verwendet wurde. Die Fraktionen, die ein Polypeptid mit dem Molekulargewicht von unge fähr 60 000 enthielten, wurden von dem Eluat der High-Trap-Heparin-Säule gesammelt, um gereinigtes H2S-573 zu erhalten.
(9) Immobilisierung von einem funktionellen Stoff auf einer Platte
In dem Experiment zur Infektion von Zellen mit einem Retrovirus wurde bei Verwendung einer Platte, auf der der funktionelle Stoff immobilisiert ist, (Gewebekulturplatte mit 6 Vertiefungen, Falcon) eine Immobilisierung gemäß dem folgenden Verfahren durchgeführt. Dazu wurde eine Lösung von jedem funktionellen Stoff, der in den oben genannten Beispielen beschrieben ist, und bei einer geeigneten Konzentration in PBS gelöst war, zu einer Platte bei einer Menge von 2 ml pro Vertiefung zugegeben (Bodenfläche 9,6 cm²) und die Platte wurde bei UV-Licht bei Raumtemperatur für eine Stunde ohne Abdeckung inkubiert und dann für eine weitere Stunde mit deren Abdeckung. Dann wurde die Polypeptidlösung gegen 2 ml PBS, das 2 % Rinderserumalbumin enthielt (BSA, Boehringer Mannheim), ausgetauscht und bei Raumtemperatur für 30 Minuten inkubiert. Die Platte wurde mit PBS gewaschen, das 25 mM HEPES enthielt. Es wurde eine Kontrollplatte, auf der BSA immobilisiert war, auf dieselbe Weise wie oben beschrieben präpariert, außer dass die Inkubation mit der Polypeptidlösung nicht durchgeführt wurde.
Bei dem Gentransfer (Virusinfektions-) Experiment in den unten genannten Beispielen wurde die oben genannte Gewebekulturplatte mit 6 Vertiefungen verwendet, soweit nicht anders angegeben. Wenn die Konzentration des funktionellen Stoffes, der zur Immobilisierung auf der Platte verwendet wurde, angegeben ist, wird die Polypeptidmenge pro Einheit Bodengrundfläche von einer Vertiefung in Einheit pmol/cm² (und μg/cm²) verwendet. Wenn zum Beispiel eine Immobilisierung unter Verwendung von 2 ml 48 μg/ml H-271-Lösung auf der oben genannten Platte durchgeführt wurde (Grundfläche 9,6 cm²), dann entspricht dies einer "Immobilisierung mit 333 pmol/cm² (10 μg/cm²) H-271". Und wenn CH-296 auf der Platte immobilisiert wurde, die zur Kultivierung von nicht-adhärenten Zellen nach der Transduktion verwendet wurde (TF-1, HL-60), dann entsprach dies einer Immobilisierung von 48 pmol/cm² (3 μg; cm²) einer CH-296-Lösung gemäß den oben genannten Verfahren. In den nachfolgenden Beispielen wurde eine Virusinfektion von Zielzellen jeweils in einem Medium ohne Polybren durchgeführt. Wenn die Menge von Virus, Zellen, Medium und dergleichen angegeben ist, dann ist die Menge pro Vertiefung gemeint, soweit nicht anders angegeben.
Beispiel 3
(1) Gentransfer unter Verwendung eines Gemisches von funktionellen Stoffen
Das folgende Experiment wurde durchgeführt, um die Wirkung auf den Gentransfer im Falle einer Immobilisierung eines Gemisches eines Zellbindungsstoffes und eines Retrovirusbindungsstoffes auf einer Platte zu untersuchen. Als erstes wurde jedes Polypeptid auf einer Platte unter Verwendung von 32 pmol/cm² (1,5 μg/cm²) von C-FGF·A, einem Gemisch aus 32 pmol/cm² (1 μg/cm²) von C-274 und 32 pmol/cm² (0,5 μg/cm²) FGF oder 32 pmol/cm² (0,5 μg/cm²) FGF (Becton Dickinson) auf dieselbe Weise wie in Beispiel 2 (9) beschrieben immobilisiert. Nach einer Vorinkubation von 2 ml eines Virusüberstandes, der 1000 cfu PM5neo-Virus in den jeweiligen Platten enthält, und einer Kontrollplatte, die mit BSA bei 37°C für 30 Minuten beschichtet wurde, wurden die Platten gut mit PBS gewaschen. Zu jeder dieser Platten wurden 2 ml DMEM-Medium, das 2000 NIH/3T3-Zellen enthielt, zugegeben und bei 37°C für 2 Stunden in Abwesenheit von Polybren inkubiert. Nicht-adhärente Zellen wurden durch Dekantierung gesammelt und Zellen, die an der Platte hafteten, wurden durch Trypsin-Behandlung gesammelt, um diese von der Platte abzulösen. Die Zellen wurden dann kombiniert. Die entstandene Zellsuspension wurde in zwei Hälften aufgeteilt. Eine halbe Portion wurde in DMEM kultiviert und die andere Portion wurde in DMEM kultiviert, das G418 in einer Endkonzentration von 0,75 mg/ml enthielt. Beide Portionen wurden bei 37°C für 10 Tage inkubiert und die auftretenden Kolonien wurden gezählt. Indem das Verhältnis der Anzahl von G418-resistenten (G418^r) Kolonien relativ zu der Anzahl, die in dem Medium ohne G418 erhalten wurde, als Gentransfereffizienz genommen wurde, wurden die in 1 gezeigten Ergebnisse erhalten. In 1 bezeichnet die Abszisse die verwendeten funktionellen Stoffe und die Ordinate bezeichnet die Gentransfereffizienz.
Wie in 1 gezeigt, wurden im Falle einer zweistündigen Retrovirusinfektion, bei der das Gemisch von C-274 und FGF verwendet wurde, G418^r-Kolonien mit beinahe derselben Gentransfereffizienz erhalten, wie mit C-FGF·A, bei dem diese beiden Polypeptide kovalent gebunden sind, obwohl die Gentransfereffizienz, die bei Verwendung von FGF alleine erhalten wurde, geringer war als die von C-FGF·A.
Um dies genauer zu untersuchen, wurde die Wirkung einer Immobilisierung von C-274 allein und FGF alleine mit einer Immobilisierung eines Gemisches davon verglichen. Dabei wurde auf die gleiche Weise wie in Beispiel 2 (9) beschrieben eine Bestimmung mit dem Unterschied durchgeführt, dass Platten mit 32 pmol/cm² (1 μg/cm²) C-274, 32 pmol/cm² (0,5 μg/cm²) FGF und ein Gemisch aus 32 pmol/cm² C-274 bzw. 32 pmol/cm² FGF hergestellt wurden. Die Ergebnisse sind in 2 gezeigt. In 2 bezeichnet die Abszisse die verwendeten funktionellen Stoffe und die Ordinate bezeichnet die Gentransfereffizienz.
Wie in 2 gezeigt, war die Gentransfereffizienz höher, wenn eine Platte verwendet wurde, bei der eine Immobilisierung mit dem Gemisch aus C-274 und FGF durchgeführt wurde, als bei Verwendung einer Platte, bei der lediglich FGF immobilisiert war. Und es traten keine G418^r-Kolonien in der Platte auf, bei der eine Immobilisierung mit C-274, das keine Retrovirusbindungsdomäne besitzt, durchgeführt wurde. Dies zeigt, dass durch Kombination von FGF, das die Retrovirusbindungsdomäne besitzt, mit C-274, das die Zellbindungsdomäne besitzt, eine höhere Gentransfereffizienz erhalten werden kann als bei Verwendung von FGF alleine und dass eine kovalente Kopplung der Polypeptide nicht unbedingt zur Herbeiführung einer solchen Wirkung der Kombination der Polypeptide erforderlich ist.
(2) Gentransfer unter Verwendung eines Gemisches von funktionellen Stoffen
Auf dieselbe Weise wie in Beispiel 3 (1) beschrieben, wurde eine Bestimmung mit dem Unterschied durchgeführt, dass das Polypeptid durch eine Retrovirusbindungsdomäne mit ColV ersetzt wurde. Bei diesem Experiment wurde die Wirkung durch Vermischen von C-274 und ColV in verschiedenen molaren Verhältnissen untersucht. Dabei wurde auf die gleiche Weise, wie in Beispiel 2 (9) beschrieben eine Immobilisierung auf den Platten unter Verwendung von 330 pmol (cm² (6 μg/cm²) ColV, einem Gemisch aus 330 pmol/cm² (10 μg/cm²) C-274 und 330 pmol/cm² ColV (molares Verhältnis von C-274: ColV = 10 : 10), einem Gemisch aus 100 pmol/cm² (3 μg/cm²) C-274 und 330 pmol/cm² ColV (3 : 10), einem Gemisch aus 33 pmol/cm² (1 μg/cm²) C-274 und 330 pmol/cm² ColV (1 : 10), 330 pmol/cm² (16 μg/cm²) C277-ColV bzw. 330 pmol/cm² (10 μg/cm²) C-274 durchgeführt. Unter Verwendung der so hergestellten Platten wurde die Wirkung einer Retrovirusinfektion auf dieselbe Weise wie oben beschrieben untersucht. Die Ergebnisse sind in 3 gezeigt. In 3 bezeichnet die Abszisse die verwendeten funktionellen Stoffe und die Ordinate bezeichnet die Gentransfereffizienz.
Wie in 3 gezeigt, war im Falle einer zweistündigen Infektion die Infektionseffizienz einer ColV-immobilisierten Platte mehr als die Hälfte geringer als bei einer C277-ColV-immobilisierten Platte, während die Infektionseffizienz der Platte, auf der eine Immobilisierung mit dem Gemisch von ColV und dessen 1/10 Menge (als molekulare Anzahl) von C274 durchgeführt wurde, gleich war wie bei einer C277-ColV-immobilisierten Platte. Dann wurde die Retrovirus-Infektions-verstärkende Aktivität von C-274 wie im Falle von FGF bestimmt. Diese Wirkung war eher erniedrigt im Falle, dass die Menge von C-274-Molekülen relativ zu ColV-Molekülen erhöht war. Wenn ein Gemisch, das dieselbe Mengen von ColV und C-274 enthielt, beschichtet wurde, gab es keinen wesentlichen Unterschied zwischen dem Gemisch und ColV alleine.
(3) Gentransfer unter Verwendung eines Gemisches von funktionellen Stoffen
Um die Wirkung auf die Gentransfereffizienz durch Immobilisierung eines Gemisches eines Stoffes mit einer Zellbindungsdomäne und eines Stoffes mit einer Retrovirusbindungsdomäne zu untersuchen, wurde das folgende Experiment durchgeführt. Als erstes wurde auf dieselbe Weise wie in Beispiel 2 (9) beschrieben eine Immobilisierung von Platten mit 32 pmol/cm² (1 μg/cm²) C-274, 333 pmol/cm² (10 μg/cm²) H-271 und einem Gemisch von 32 pmol/cm² (1 μg/cm²) C-274 bzw. 333 pmol/cm² (10 μg/cm²) H-271 durchgeführt. Nach einer Vorinkubation von 2 ml eines Virusüberstandes, der 1000 cfu PM5neo-Virus in den jeweiligen Platten enthielt, bei 37°C für 30 Minuten wurden die Platten gründlich mit PBS gewaschen. Zu jeder dieser Platten wurden 2 ml DMEM-Medium, das 2000 NIH/3T3-Zellen enthielt, zugegeben und bei 37°C für 2 Stunden inkubiert. Nicht-adhärente Zellen wurden durch Dekantierung gesammelt und Zellen, die an der Platte hafteten, wurden durch eine Trypsin-Behandlung gesammelt, um diese von der Platte abzulösen. Die Zellen wurden dann kombiniert. Die entstandene Zellsuspension wurde in zwei Hälften aufgeteilt. Ein halber Teil wurde in DMEM kultiviert und der andere Teil wurde in DMEM kultiviert, das G418 in einer Endkonzentration von 0,75 mg/ml enthielt. Beide Teile wurden bei 37°C für Tage inkubiert und die auftretenden Kolonien wurden gezählt. Indem das Verhältnis der Anzahl von G418^r-Kolonien relativ zu der Anzahl, die in dem Medium ohne G418 erhalten wurde, als Gentransfereffizienz genommen wurde, wurden die in 4 gezeigten Ergebnisse erhalten. In 4 bezeichnet die Abszisse die verwendeten funktionellen Stoffe und die Ordinate bezeichnet die Gentransfereffizienz.
Wie in 4 gezeigt, war die Infektionseffizienz signifikant erhöht, wenn eine Platte verwendet wurde, bei der ein Gemisch aus C-274 und H-271 (molares Verhältnis = 1 : 10) immobilisiert wurde. Es wurde kein Gentransfer bei einer C-274-immobilisierten Platte festgestellt.
(4) Gentransfer unter Verwendung von C277-CS 1
Um die Wirkung auf die Infektionseffizienz unter Verwendung von C277-CS1 als Stoff mit einer Zellbindungsdomäne und einer Immobilisierung eines Gemisches davon und eines Stoffes mit einer Retrovirusbindungsdomäne zu untersuchen, wurde das folgende Experiment durchgeführt. Als Stoff, der an einen Retrovirus bindet, wurde ein Polylysin [(Lys)_n, Poly-L-lysinhydrobromid, Molekulargewicht: 50000–100 000, Wako Pure Chemical Co., Ltd.] und H-271 verwendet. Als Zellen wurden nicht-adhärente Zellen, TF-1-Zellen (ATCC CRL-2003) verwendet. Als erstes wurde auf dieselbe Weise wie in Beispiel 2 (9) beschrieben eine Immobilisierung auf Platten durchgeführt, unter Verwendung der folgenden Lösung: C-277-CS1 (33 pmol/cm², 1,1 μg/cm²), Polylysin (133 pmol/cm², 10 μg/cm²), einem Gemisch aus C-277-CS1 (33 pmol/cm²) und Polylysin (133 pmol/cm²), H-271 (333 pmol/cm², 10 μg/cm²) und einem Gemisch aus C-277-CS1 (33 pmol/cm²) und H-271 (333 pmol/cm²) bzw. CH-296 (33 pmol/cm², 2,1 μg/cm²). Zu jeder Platte wurde RPMI 1640-Medium zugegeben (enthaltend 5ng/ml GM-CFS (Petro Tech), 50 Einheiten/ml Penicillin und 50 μg/ml Streptomycin), enthaltend 1 × 10⁴ cfu TKNEO-Virus, 1 × 10⁴ TF-1-Zellen und die Platten wurden bei 37°C für 24 Stunden inkubiert. Nach der Inkubation wurden nicht-adhärente Zellen durch Dekantierung gesammelt und Zellen, die an der Platte hafteten, wurden durch eine Trypsin-Behandlung gesammelt, um diese von der Platte zu entfernen. Die Zellen wurden dann kombiniert. Jeweils ein fünfter Teil einer sich ergebenden Zellsuspension wurde auf zwei Platten überführt, die mit CH-296 beschichtet waren und für 24 Stunden inkubiert. Dann wurde das Medium eines Teils gegen das oben genannte Medium ausgetauscht und das Medium des anderen Teils wurde gegen das oben genannte Medium, das G418 in einer Endkonzentration von 0,75 mg/ml enthielt, ausgetauscht. Beide Teile wurden bei 37°C für 8 Tage inkubiert und die auftretenden Kolonien wurden gezählt. Das Vorkommen von G418^r-Kolonien (die Gentransfereffizienz) wurde basierend auf den Anzahlen von Kolonien, die in der Gegenwart und Abwesenheit von G418 auftraten, berechnet.
Die Ergebnisse sind in 5 gezeigt. In 5 bezeichnet die Abszisse die verwendeten funktionellen Stoffe und die Ordinate bezeichnet die Gentransfereffizienz. In 5 stellt (a) die Verwendung des Polylysins als Retrovirusbindungsstoff dar und (b) stellt die Verwendung von H-271 dar. Im Vergleich zu der Platte, auf der lediglich ein Retrovirusbindungsstoff immobilisiert war, war die Gentransfereffizienz signifikant erhöht, wenn das Polylysin oder H-271 zusammen mit C277-CS1 mit der Zellbindungsdomäne verwendet wurde.
(5) Herstellung eines von Erythropoietin abgeleiteten Polypeptids
Zur Verwendung für einen Gentransfer in die Zellen mit Erythropoietin-Rezeptor wurde ein Polypeptid-Derivat hergestellt, bei dem Erythropoietin an Glutathion-S-Transferase fusioniert war (GST-Epo). Die Aminosäuresequenz ist in SEQ ID NO:34 des Sequenzprotokolls gezeigt. In dieser Sequenz entspricht die Aminosäuresequenz von der 233. Aminosäure bis zur 398. Aminosäure Erythropoietin.
Als erstes wurde ein Plasmid unter Verwendung der folgenden Verfahren konstruiert, um GST-Epo zu exprimieren. Es wurde eine PCR unter Verwendung einer cDNA-Bibliothek, die von humaner fötaler Leber (Clonetech) stammte, als Vorlage und den Primern EPF1 und EPR1 (die Nukleotidsequenzen der Primer EPF1 und EPR1 sind in den SEQ ID NOs 35 und 36 des Sequenzprotokolls gezeigt) durchgeführt. Ein Teil des Reaktionsgemisches wurde entnommen und, indem es als Vorlage und die Primer EPF2 und EPR2 (die Nukleotidsequenzen der Primer EPF2 und EPR2 sind in den SEQ ID NOs 37 und 38 des Sequenzprotokolls gezeigt) verwendet wurden, wurde eine zusätzliche PCR durchgeführt. Amplifizierte DNA-Fragmente wurden von dem Reaktionsgemisch gewonnen, mit EcoRI und BamHI (beide Takara Shuzo Co., Ltd.) verdaut und dann einer Agarose-Gel-Elektrophorese unterzogen, um ein DNA-Fragment von ungefähr 520 bp zu gewinnen, das eine Region enthielt, die für Erythropoietin kodiert. Das entstandene Fragment wurde mit einem Plasmidvektor pTV 118N (Takara Shuzo Co., Ltd.) vermengt, der mit EcoRI (Takara Shuzo Co., Ltd.) und BamHI verdaut war, um ihn in das Plasmid zu ligieren. Dann wurde E. coli JM109 mit dem Plasmid transformiert. Ein Transformant, der das oben genannte Plasmid trug, wurde aus den entstandenen Transformanten ausgewählt, um ein Plasmid herzustellen und dieses wurde als Plasmid pEPO bezeichnet. Dann wurde das so erhaltene Plasmid pEPO mit EcoRI und SalI (Takara Shuzo Co., Ltd.) verdaut und einer Agarose-Gel-Elektrophorese unterzogen, um ein DNA-Fragment von ungefähr 0,5 kb zu gewinnen. Dieses Fragment wurde mit einem Plasmidvektor pGEX5X-3 (Pharmacia), das mit EcoRI und SalI verdaut war, vermengt, um diese zu ligieren. E. coli JM109 wurde mit dem entstandenen Plasmid transformiert. Ein Transformant, der das oben genannte Plasmid trug, wurde aus den entstandenen Transformanten ausgewählt, um ein Plasmid herzustellen und das Plasmid wurde als pGSTEPO bezeichnet. Dieses Plasmid kodiert für GST-EPO, bei dem die Aminosäuresequenz von Erythropoietin an den C-Terminus von Glutathion-S-Transferase gekoppelt wurde, die von dem Vektor abgeleitet war. Die Nukleotidsequenz, die für GST-EPO auf das mit GST-EPO kodiert, ist in SEQ ID NO:39 des Sequenzprotokolls gezeigt.
Das Polypeptid GST-Epo wurde durch die folgenden Verfahren hergestellt. Sieben Kulturgefäße, die jeweils 5 ml LB-Brühe enthielten, welche 100 μg/ml Ampicillin enthielten, wurden bereitgestellt und E. coli JM109, das mit dem oben genannten Plasmid pGSTEPO transformiert war (Escherichia coli JM109/pGSTEPO), wurde in jede Brühe angeimpft, mit einer anschließenden Inkubation bei 37°C über Nacht. Dann wurden sieben 2-Liter-Erlenmeyer-Kolben, die jeweils 500 ml derselben Brühe enthielten, bereitgestellt und 5 ml-Teile der oben genannten Kultur wurden in die Kolben angeimpft, mit einer anschließenden Inkubation bei 37°C. 3,5 Stunden nach dem Beginn der Inkubation wurde IPTG in der Endkonzentration von 1 mM zugegeben und die Inkubation wurde für weitere 3,5 Stunden fortgesetzt. Nach Beendigung der Kultivierung wurden die Zellen aus der Kulturbrühe durch Zentrifugation gewonnen, in 100 ml PBS, das 1 mM PMSF und 1 mM EDTA enthielt, suspendiert und durch Sonifizierung aufgebrochen. Zu der aufgebrochenen Lösung wurden 100 ml PBS, das 1 mM PMSF, 1 mM EDTA und 2% Triton X-100 enthielt, zugegeben. Das Gemisch wurde für 30 Minuten auf Eis stehen gelassen und wurde dann zentrifugiert, um einen Überstand zu sammeln. Der entstandene Überstand wurde über einen Filter mit 0,45 μm (Millipore) filtriert und auf eine Glutathion-Sephallose-4B-Säule (Pharmacia, 3 ml), die mit PBS äquilibriert war, aufgetragen. Nach dem Waschen der Säule mit PBS wurde die Säule mit 50 mM Tris-HCl, das 10 mM Glutathion enthielt (pH 8,0), eluiert. Das Eluat wurde durch SDS-Polyacrylamid-Gel-Elektrophorese analysiert und eine Fraktion, die ein Polypeptid mit einem Molekulargewicht von ungefähr 44 000 enthielt, wurde gesammelt. Die Fraktion wurde gegen PBS dialysiert. Eine dialysierte Probe wurde auf eine Resource-Q-Säule (Pharmacia), die mit PBS äquilibriert war, aufgetragen. Nach dem Waschen der Säule mit PBS wurde die Säule mit PBS, das einen NaCl-Gradienten von 0 M bis 0,6 M aufwies, eluiert. In der gleichen Weise wie oben beschrieben wurde die Säule mit 50 mM Tris-HCl, das Glutathion (pH 8,0) enthielt, eluiert, um eine Fraktion zu sammeln, die ein Polypeptid mit einem Molekulargewicht von ungefähr 44 000 enthielt. Diese wurde einer Ultrafiltration mit Centricon 10 (Amicon) ausgesetzt, um sie auf ungefähr 50 μl zu konzentrieren. Weiter wurde sie mit Ultrafree C3GVSTRL (Millipore) filtriert und das Filtrat wurde einer Gel-Filtrationschromatographie unter Verwendung einer Superdex-200-Säule (Pharmacia, äquilibriert mit PBS) ausgesetzt. Eine eluierte Fraktion, die ein Polypeptid mit einem Molekulargewicht von ungefähr 44 000 enthielt, wurde gesammelt und diese wurde als GST-Epo-Polypeptidlösung in den nachfolgenden Experimenten verwendet. In dieser GST-Epo-Lösung bestanden ungefähr 50% der Gesamtproteine aus GST-Epo.
(6) Gentransfer in Erythropoietin-Rezeptor-exprimierenden Zellen
Die Wirkung eines Gentransfers unter Verwendung von Erythropoietin als Stoff mit Zellbindungsaktivität wurde unter Verwendung von zwei Arten von Zellen untersucht, TF-1, das einen Erythropoietin-Rezeptor exprimiert und HL-60 (ATCC CCL-240), welche den Erythropoietin-Rezeptor nicht exprimiert. Bei dieser Untersuchung wurde das oben genannte Polypeptid-Derivat von Erythropoietin (GST-Epo) als Erythropoietin verwendet und es wurde ein Polylysin als Retrovirusbindungsstoff verwendet. Als erstes wurde auf die gleiche Weise wie in Beispiel 2 (9) beschrieben eine Immobilisierung auf Platten unter Verwendung von GST-Epo durchgeführt, entsprechend 34 pmol/cm² (1,5 μg/cm²), Polylysin (133 pmol/cm², 10 μg/cm²), ein Gemisch aus GST-Epo (34 pmol/cm²) bzw. Polylysin (133 pmol/cm²). Zu jeder Platte wurde ein Medium zugesetzt, das 1 × 10⁴ cfu TKNEO-Virus und 1 × 10⁴ Zellen enthielt und die Platte wurde bei 37°C für 24 Stunden inkubiert. Als Medium wurde RPMI1640-Medium (enthaltend 5 ng/ml GM-CSF, 50 Einheiten/ml Penicillin und 50 μg/ml Streptomycin) für TF-1 und RPMI-Medium (Nissui, enthaltend 10% FCS, 50 Einheiten/ml Penicillin, 50 μg/ml Streptomycin) für HL-60 verwendet. Nach der Inkubation wurden nicht-adhärente Zellen durch Dekantierung gesammelt und die Zellen, die an der Platte hafteten, wurden durch eine Trypsin-Behandlung gesammelt, um diese von der Platte zu entfernen. Die Zellen wurden dann kombiniert. Jeder fünfte Teil der entstandenen Zellsuspension wurde auf zwei CH-296-immobilisierte Platten überführt und für 24 Stunden inkubiert. Dann wurde das Medium eines Teils gegen das oben genannte Medium ausgetauscht und das Medium des anderen Teils wurde gegen das oben genannte Medium, das G418 in einer Endkonzentration von 0,75 mg/ml enthielt, ausgetauscht. Beide Teile wurden bei 37°C für 8 Tage inkubiert und die auftretenden Kolonien wurden gezählt. Das Auftreten von G418^r-Kolonien (die Gentransfereffizienz) wurde basierend auf den Anzahlen von Kolonien, die in der Gegenwart und Abwesenheit von G418 auftraten, berechnet.
Die Ergebnisse sind in 6 gezeigt. In 6 bezeichnet die Abszisse die verwendeten funktionellen Stoffe bzw. die Ordinate bezeichnet die Gentransfereffizienz. Im Falle einer Verwendung von TF-1-Zellen wurde , wie in 6(a) gezeigt, eine höhere Gentransfereffizienz in der Gegenwart von GST-Epo erhalten, obwohl der Gentransfer nur in der Platte signifikant stattgefunden hatte, bei der nur Polylysin immobilisiert war. Andererseits konnte bei Verwendung von HL-60, wie in 6(b) gezeigt, kein Anstieg bei der Gentransfereffizienz in der Gegenwart von GST-Epo beobachtet werden. Diese Ergebnisse zeigten, dass ein Zielzell-spezifischer Gentransfer bei Verwendung von Erythropoietin möglich war.
Zusätzlich wurde ein Experiment eines Gentransfers in TF-1-Zellen durchgeführt, indem der Retrovirusbindungsstoff mit H2-547 ersetzt wurde. Auf die gleiche Weise wie in Beispiel 2 (9) beschrieben wurde eine Immobilisierung unter Verwendung von H2-547 (333 pmol/cm², 20 μg/cm²), GST-Epo entsprechend 34 pmol/cm², 1,5 μg/cm²) und einem Gemisch von GST-Epo (34 pmol/cm²) und H2-547 (333 pmol/cm², 20 μg/cm²) durchgeführt. Gleichzeitig wurde ein Kontrollexperiment unter Verwendung einer BSA-immobilisierten Platte durchgeführt.
Die Ergebnisse sind in 7 gezeigt. In 7 bezeichnet die Abszisse die verwendeten funktionellen Stoffe und die Ordinate bezeichnet die Gentransfereffizienz. Wie in 7 gezeigt, war im Falle einer Verwendung von H2-547 die Gentransfereffizienz in TF-1-Zellen in der Gegenwart von GST-Epo erhöht.
(7) Gentransfer unter Verwendung von Beads, auf denen ein Gemisch von funktionellen Stoffen immobilisiert war
Ob die Retrovirusinfektionseffizienz unter Verwendung von Beads, auf denen sowohl der Stoff mit Zellbindungsdomäne als auch der Stoff mit Retrovirusbindungsdomäne immobilisiert waren, erhöht war oder nicht, wurde untersucht.
Beads, auf denen Polypeptide immobilisiert waren, wurden entsprechend den folgenden Verfahren hergestellt. Als Beads wurden Polystyrol-Beads mit einem Durchmesser von 1,14 μm (Polybeads Polystyrene Microsphere, hergestellt von PolyScience) verwendet. Zu 20 μl einer 2,5 %-Suspension der oben genannten Beads wurden 80 μl Ethanol und 2 ml verschiedener Polypeptidlösungen in PBS zugegeben und dann über Nacht bei 4°C stehen gelassen. Dazu wurden BSA und PBS zugegeben, Suspension durch Zentrifugation gewonnen und in 5 ml 1% BSA/PBS erneut suspendiert. Dann wurde die Suspension für eine Stunde bei Raumtemperatur stehen gelassen, um eine Suspension eines Polypeptids zu erhalten, das an Beads immobilisiert war. Als Polypeptidlösungen wurden 100 μg/ml C-274, 100 μg/ml H-271, 100 μg/ml CH-271, 100 μg/ml CH-296 und ein Gemisch von 100 μg/ml H-271 und 10 μg/ml C-274 verwendet. Als Kontrolle wurden Beads, die mit 2% BSA-Lösung beschichtet waren, auf die gleiche Weise hergestellt.
Ein Zehntelteil der Polypeptid-immobilisierten Beads, die auf diese Weise präpariert wurden, wurden von der oben genannten Suspension gewonnen und bei 37°C über Nacht zusammen mit 2000 TF-1-Zellen bzw. 1000 cfu TKNEO-Virusüberstand inkubiert. Die Zellen wurden gewonnen und in RPMI-Medium (enthaltend 10% FCS, 5 ng/ml GM-CFS (Petrotech), 50 Einheiten/ml Penicillin und 50 μg/ml Streptomycin), enthaltend 0,3% Bacto agar (Difco) suspendiert und auf einer 35 mm-Platte, die von dem oben genannten Medium, das 0,5% Bacto agar enthielt, hergestellt wurde, ausgesät. Zwei Medien, die 0,75 mg/ml G418 enthielten und ohne G418 wurden verwendet. Die Platte wurde in 5% CO₂ bei 37°C für 14 Tage inkubiert. Die in der Gegenwart von G418 auftretenden und in der Abwesenheit von G418 auftretenden Kolonien wurden gezählt und das Auftrittsverhältnis von G418^r-Kolonien (Gentransfereffizienz) wurde berechnet.
Die Ergebnisse sind in 8 gezeigt. In 8 bezeichnet die Abszisse den verwendeten funktionellen Stoff und DNA und die Ordinate bezeichnet die Gentransfereffizienz. Wenn Beads verwendet wurden, auf denen das Gemisch von H-271 und C-274 immobilisiert war, wurde im Vergleich zu einer Verwendung von Beads, auf denen lediglich H-271 allein immobilisiert war und Beads, auf denen CH-271 oder CH-296 mit der Retrovirusbindungsdomäne bzw. Zellbindungsdomäne auf demselben Molekül immobilisiert waren, eine höhere Gentransfereffizienz erhalten.
Beispiel 4
(1) Gentransfer unter Verwendung von FGF und C-FGF·A
Die Wirkung von FGF (Becton Dickinson) und dem in SEQ ID NO:4 wiedergegebenen Polypeptid (C-FGF·A) auf die Retrovirusinfektion wurde durch einen NIH/3T3-Zellkolonie-bildenden Assay untersucht. Dazu wurde eine Bestimmung auf dieselbe Weise wie in Beispiel 2 (9) beschrieben, durch Immobilisierung von FGF (132 pmol/cm², 2,25 μg/cm²) bzw. C-FGF·A (133 pmol/cm², 6,3 μg/cm²) auf Platten und Immobilisierung von BSA auf einer Kontrollplatte durchgeführt. Zu jeder Platte wurden 2 ml eines Virusüberstandes, der 1000 cfu PM5neo-Virus enthielt, zugegeben und bei 37°C für 30 Minuten vorinkubiert, gefolgt von einem gründlichen Waschen mit PBS. Zu dieser Platte wurden 2 ml DMEM-Medium, das 2000 NIH/3T3-Zellen enthielt, zugegeben und bei 37°C für 24 Stunden inkubiert, gefolgt von einer Inkubation für 10 Tage in einem Selektionsmedium, das 0,75 mg/ml G418 enthielt. Die Kolonien wurden gefärbt und gezählt. Die Ergebnisse sind in 9 gezeigt. In 9 bezeichnet die Abszisse den verwendeten funktionellen Stoff und die Ordinate bezeichnet die Anzahl von auftretenden G418^r-Kolonien.
Wie in 9 gezeigt, trat keine Kolonie in der Kontrollplatte auf, auf der BSA immobilisiert war. Andererseits wurden bei FGF- und C-FGF·A-immobilisierten Platten G418^r-Kolonien festgestellt. Dieses Ergebnis zeigt, dass sowohl FGF als auch C-FGF·A eine Retrovirusbindungsdomäne besitzen und dass C-FGF·A, bei dem das Zellbindungsdomänenpolypeptid von Fibronectin gekoppelt war, einen viel besseren Gentransfer als FGF aufwies.
(2) Beziehung zwischen der Konzentration von C-FGF·A und der Gentransfereffizienz
Die Gentransfereffizienzen wurden verglichen, indem Platten, die mit verschiedenen Konzentrationen von C-FGF·A beschichtet waren, verwendet wurden. Die Infektion mit Retrovirus wurde nach denselben Verfahren wie in Beispiel 4 (1) durchgeführt, mit dem Unterschied der Verwendung einer Platte, die mit 0,521 pmol/cm² (0,0247 μg/cm²)–5,21 pmol/cm² (0,247 μg/cm²) C-FGF·A gemäß dem in Beispiel 2 (9) beschriebenen Verfahren zubereitet war, und eine BSA-immobilisierte Platte (Kontrollplatte) verwendet wurde. Nach einer Virusinfektionsbehandlung wurden die nicht-adhärenten Zellen durch Dekantierung gesammelt und die Zellen, die an der Platte hafteten, wurden durch eine Trypsin-Behandlung gesammelt, um sie von der Platte zu entfernen. Die so gesammelten Zellen wurden kombiniert. Die entstandene Zellsuspension wurde in zwei Hälften geteilt, eine Hälfte wurde mit DMEM kultiviert und die andere wurde mit DMEM kultiviert, das G418 in einer Endkonzentration von 0,75 mg/ml enthielt. Beide Teile wurden bei 37°C für 10 Tage inkubiert und die Anzahl der entstandenen Kolonien wurde gezählt. Ein Verhältnis der Anzahl von G418^r-Kolonien relativ zu der Anzahl von Kolonien, die in einem Medium, das kein G418 enthielt, erhalten wurden, wurde als Gentransfereffizienz benutzt.
Die Ergebnisse sind in 10 gezeigt. In 10 bezeichnet die Abszisse die Konzentration von C-FGF·A, das zur Immobilisierung auf der Platte verwendet wurde, und die Ordinate bezeichnet die Gentransfereffizienz. Das experimentelle Ergebnis der Kontrollplatte wurde auch bei einer Polypeptidkonzentration von 0 μmol/cm² aufgetragen. Wie in 10 gezeigt, war die Gentransfereffizienz in Konzentrations-abhängiger Weise erhöht, wie die Erhöhung der C-FGF·A-Konzentration nach einer Immobilisierung.
(3) Gentransfer in HL-60-Zellen
Bezüglich der Retrovirusinfektion von HL-60-Zellen (ATCC CCL-240), welche nicht-adhärente Zellen sind, wurde die Wirkung des Vorliegens verschiedener Polypeptide gemäß den folgenden Verfahren untersucht. Dazu wurde zu jeder Platte, die unter Verwendung von 100 pmol/cm² C-FGF·A (4,8 μg/cm²) oder C-FGF-CS1 (5,1 μg/cm²) gemäß dem Verfahren nach Beispiel 2 (9) hergestellt wurde und einer Kontrollplatte, auf der BSA immobilisiert war, 2 ml RPMI-Medium (enthaltend 10% FCS, 50 Einheiten/ml Penicillin und 50 μg/ml Streptomycin), das 1 × 10⁴ cfu TKNEO-Virus und 2000 HL-60-Zellen enthielt, zugegeben, gefolgt von einer Inkubation bei 37°C für 24 Stunden. Nach der Inkubation wurden die nicht-adhärenten Zellen durch Dekantierung gesammelt und die Zellen, die an der Platte hafteten, wurden durch Pipettieren gesammelt und diese Zellen wurden kombiniert. Jeder 1/2-Teil der sich ergebenden Zellsuspension wurde auf eine Platte überführt, die mit CH-296 beschichtet war, für 24 Stunden inkubiert und das Medium wurde gegen RPMI-Medium, das G418 in einer Endkonzentration von 0,75 mg/ml enthielt, ausgetauscht. Nach einer Inkubation bei 37°C für 12 Tage wurde die Anzahl der auftretenden Kolonien gezählt. Die Anzahl von G418^r-Kolonien, die unter Verwendung von jedem Polypeptid erhalten wurde, ist in 11 gezeigt. In 11 bezeichnet die Abszisse den funktionellen Stoff bzw. die Ordinate bezeichnet die Anzahl von G418^r-Kolonien.
Wie in 11 gezeigt, war die Anzahl von G418^r-Kolonien beträchtlich erhöht, wenn eine mit C-FGF·A- oder C-FGF-CS1-immobilisierte Platte verwendet wurde, was darauf hinweist, dass die Polypeptide die Infektion von HL-60-Zellen mit Retrovirus fördern.
(4) Gentransfer in Knochenmarkszellen der Maus
Zur Untersuchung der Wirkung von FGF, C-FGF·A und C-FGF-CS1 auf eine Retrovirusinfektion von myeloiden Zellen der Maus wurde das folgende Experiment durchgeführt.
150 mg/kg 5-Fluoruracil (5-FU, Amlesco) wurden intraperitoneal an eine Maus verabreicht (C3H/HeJ), 6 bis 8 Wochen alt, und der Femur und die Tibia wurden zwei Tage nach Verabreichung entnommen, um das Knochenmark zu isolieren. Das gewonnene Knochenmark wurde einer Dichtegradientenzentrifugation unter Verwendung von Ficoll-Hypaque (Dichte 1,0875 g/ml, Pharmacia) unterzogen, um eine mononukleare Zellfraktion mit geringer Dichte zu erhalten, die als Knochenmarkszellen der Maus verwendet wurde.
Knochenmarkszellen der Maus wurden vor der Infektion mit Retrovirus gemäß dem Verfahren von Luskey et al. (Blood, 80, 396 (1992)) vorstimuliert. Dazu wurden die Knochenmarkszellen der Maus zu α-MEM (Gibco) zugegeben, das 20% FCS, 100 Einheiten/ml rekombinantes humanes Interleukin-6 (rhIL-6, Amgen), 100 ng/ml rekombinanter Mausstammzellfaktor (rmSCF, Amgen), 50 Einheiten/ml Penicillin und 50 μg/ml Streptomycin bei einer Zelldichte von 1 × 10⁶ Zellen/ml enthielt, gefolgt von einer Inkubation bei 37°C für 48 Stunden in 5% CO₂. Die vorstimulierten Zellen, einschließlich denen, die an dem Behälter hafteten, wurden durch Absaugen mit einer Pipette gesammelt.
Jeweils 2 ml des Mediums, das für die oben genannte Vorstimulation verwendet wurde, und das 1 × 10⁶ vorstimulierte Zellen und 1 × 10⁴ cfu PM5neo-Virus enthielt, wurde zu der Platte zugegeben, die mit 236 pmol/cm² (4 μg/cm²) FGF, 169 pmol/cm² (8 μg/cm²) C-FGF·A oder 159 pmol/cm² (8 μg/cm²) C-FGF-CS1 gemäß dem in Beispiel 2 (9) beschriebenen Verfahren hergestellt wurde und einer BSA-immobilisierten Platte (Kontrollplatte), gefolgt von einer Inkubation bei 37°C. Nach 2 Stunden wurde Medium (2 ml), das dieselbe Virusmenge enthielt, zu jeder Platte frisch dazu gegeben, gefolgt von einer weiteren Inkubation für 22 Stunden. Nach Beendigung der Inkubation wurden nicht-adhärente Zellen durch Dekantierung gesammelt und die Zellen, die an der Platte hafteten, wurden unter Verwendung eines Zelldissoziationspuffers (CDB, der keine Enzyme enthielt, Gibco) gesammelt und diese Zellen wurden kombiniert und zweimal mit demselben Puffer gewaschen. Die Anzahl der Zellen wurde gezählt. Die gesammelten Zellen wurden einem HPP-CFC (High Proliferative Potential-Colony Forming Cells) Assay unterworfen.
Der HPP-CFC-Assay wurde gemäß dem Verfahren von Bradley et al. (Aust. J. Exp. Biol. Med. Sci., 44, 287–293 (1966)) durchgeführt. Als Medium wurde 1%/0,66% überlagertes Soft-Agar-Medium mit oder ohne G418 in einer Endkonzentration von 1,5 mg/ml verwendet. Infizierte Zellen wurden dazu mit 1 × 10⁴ Zellen/Vertiefung dazugegeben, gefolgt von einer Inkubation bei 37°C für 13 Tage in 10% CO₂. Nach Beendigung der Inkubation wurden die Kolonien, die auftraten, mit einem Umkehr-Mikroskop analysiert und die Anzahl von Kolonien mit hoher Dichte (mit einem Durchmesser von nicht weniger als 0,5 mm), die von HPP-CFC abstammen, wurden gezählt, um das Vorkommen (Gentransfereffizienz) von G418^r-Kolonien zu berechnen. Die Ergebnisse sind in 12 gezeigt. In 12 bezeichnet die Abszisse den verwendeten funktionellen Stoff und BSA und die Ordinate bezeichnet die Gentransfereffizienz.
Wie in 12 gezeigt, traten keine G418^r-Kolonien auf der Platte auf, die mit BSA als Kontrolle beschichtet waren, während G418^r-Kolonien erhalten wurden, wenn eine Platte verwendet wurde, auf der die oben genannten jeweiligen Polypeptide immobilisiert waren. Die Gentransfereffizienzen wurden in der Reihenfolge von FGF, C-FGF·A und C-FGF-CS1 erhöht, was darauf hinweist, dass das Vorliegen einer Zelladhäsionsdomäne, die von Fibronectin abstammt und CS-1-Polypeptid, was die Bindungsaktivität an Zellen besitzt, die Infektion von Knochenmarkszellen mit Retrovirus erhöht.
(5) Beziehung zwischen Konzentration von C277-ColV, das zur Immobilisierung auf Platten verwendet wurde und Gentransfereffizienz
Die Gentransfereffizienzen wurden verglichen, indem Platten verwendet wurden, die mit verschiedenen Konzentrationen von C277-ColV gemäß den folgenden Verfahren beschichtet waren. Die Platten wurden gemäß dem in Beispiel 2 (9) beschriebenen Verfahren unter Verwendung von 0,1 pmol/cm² (0,1 μg/cm²)–416 pmol/cm² (20 μg/cm²) C277-ColV hergestellt. 2 ml eines Virusüberstandes, der 1000 cfu PM5neo-Virus enthielt, wurde zu den jeweiligen Platten zugegeben und es wurde eine Vorinkubation bei 37°C für 30 Minuten durchgeführt, gefolgt von einem gründlichen Waschen mit PBS. Zu dieser Platte wurden 2 ml DMEM-Medium, das 2000 NIH/3T3-Zellen enthielt, zugegeben und die Platte wurde bei 37°C für 24 Stunden inkubiert.
Die nicht-adhärenten Zellen wurden durch Dekantierung gesammelt und die Zellen, die an der Platte hafteten, wurden durch Trypsin-Behandlung gesammelt, um diese von der Platte loszulösen und diese Zellen wurden dann kombiniert. Die entstandene Zellsuspension wurde in zwei Hälften aufgeteilt und ein halber Teil wurde in DMEM kultiviert und der andere Teil wurde in DMEM, das G418 in einer Endkonzentration von 0,75 mg/ml enthielt, bei 37°C für 10 Tage inkubiert und die Anzahl der auftretenden Kolonien wurde gezählt. Ein Verhältnis der Anzahl von G418^r-Kolonien relativ zu der Anzahl von Kolonien, die in einem Medium ohne G418 erhalten wurde, wurde als Gentransfereffizienz genommen. Die Ergebnisse sind in 13 gezeigt. In 13 bezeichnet die Abszisse den verwendeten funktionellen Stoff und die Ordinate bezeichnet die Gentransfereffizienz.
Wie in 13 gezeigt, war die Gentransfereffizienz in Abhängigkeit von der Konzentration von dem zur Immobilisierung verwendeten C277-ColV erhöht, wenn eine mit C277-ColV immobilisierte Platte verwendet wurde.
(6) Gentransfer bei Verwendung von Polylysin
Die Bindung eines Polylysin [(Lys)n] zu einem Retrovirus wurde anhand der folgenden Verfahren untersucht. Als Polylysin wurde Poly-L-lysinhydrobromid (Molekulargewicht: 50 000–100 000, Wako Pure Chemical) verwendet und auf dieselbe Weise wie in Beispiel 2 (9) beschrieben unter Verwendung von 133 pmol/cm² (10 μg/cm²) Polylysin-Lösung in PBS auf einer Platte immobilisiert. Die Gentransfereffizienzen dieser Platte und einer Kontrollplatte, auf der BSA immobilisiert war, wurde auf dieselbe Weise wie in Beispiel 4 (2) beschrieben, durchgeführt. Die Ergebnisse sind in 14 gezeigt. In 14 bezeichnet die Abszisse den funktionellen Stoff und die Ordinate bezeichnet die Gentransfereffizienz. Wie in 14 gezeigt, traten keine Kolonien in der Kontrollplatte auf, die mit BSA beschichtet war, während G418^r-Kolonien auf der mit Polylysin immobilisierten Platte auftraten, was darauf hinweist, dass nach dem Waschen das Retrovirus auf der Platte verblieb, aufgrund einer Bindung des Retrovirus an das Polylysin, das auf der Platte immobilisiert war.
Beispiel 5
(1) Gentransfer unter Verwendung eines Polypeptidpolymers
Der Gentransfer unter Verwendung eines Polymers von einem Polypeptid wurde ohne Immobilisierung des Polypeptids auf einer Platte durchgeführt. Zu einer Platte, die mit BSA gemäß dem in Beispiel 2 (9) beschriebenen Verfahren vorbeschichtet war, wurden 2 ml DMEM, das 1000 cfu PM5neo-Virus, 2000 NIH/3T3-Zellen und die jeweiligen Polypeptide (H-271, CH-271, H2-547 und CH2-826) bei einer Endkonzentration von 0,63 nmol/ml enthielt, zugegeben, gefolgt von einer Inkubation für 24 Stunden. Die nicht-adhärenten Zellen wurden durch Dekantierung gesammelt und die Zellen, die an der Platte hafteten, wurden durch Trypsin-Behandlung gesammelt, um diese von der Platte zu entfernen. Dann wurden diese Zellen kombiniert. Als Kontrolle wurde das Zellgentransferexperiment ohne Zusatz eines Polypeptids auf dieselbe Weise durchgeführt. Die entstandene Zellsuspension wurde in zwei Hälften aufgeteilt und ein halber Teil wurde in DMEM kultiviert. Der andere Teil wurde in DMEM, das G418 in einer Endkonzentration von 0,75 mg/ml enthielt, kultiviert. Beide Teile wurden bei 37°C für 10 Tage inkubiert und die auftretenden Kolonien wurden gezählt. Indem das Verhältnis der Anzahl von G418^r-Kolonien relativ zu der Anzahl von Kolonien, die in dem Medium ohne G418 beobachtet wurden, als Gentransfereffizienz genommen wurde, wurden die in 15 gezeigten Ergebnisse erhalten. In 15 bezeichnet die Abszisse den verwendeten funktionellen Stoff und die Ordinate bezeichnet die Gentransfereffizienz.
Wie in 15 gezeigt, war die Gentransfereffizienz in der Gegenwart von H2-547 signifikant höher als in der Gegenwart von H-271 und im Fall von CH2-826 war die Gentransfereffizienz gleich oder höher als die von CH-271.
Weiter wurde eine detailliertere Untersuchung auf die gleiche Weise durchgeführt, außer dass CH-271, CH-296 und H2-547 als Polypeptide in Mengen von jeweils 0,126 nmol (Endkonzentration von 0,063 nmol/ml) und 1,26 nmol (Endkonzentration von 0,63 nmol/ml) für die jeweiligen Platten verwendet wurden. Die Ergebnisse sind in 16 gezeigt. In 16 bezeichnet die Abszisse die verwendeten funktionellen Stoffe und deren Mengen und die Ordinate bezeichnet die Gentransfereffizienz.
Wie in 16 gezeigt, war die Gentransfereffizienz bei beiden Mengen des Polypeptids signifikant höher als die von CH-271 und CH-296, wenn H2-547 verwendet wurde.
(2) Gentransfer in Knochenmarkszellen der Maus unter Verwendung von H2S-573
Zur Untersuchung der Wirkung von H2S-573 auf die Retrovirusinfektion von Knochenmarkszellen wurde ein Gentransferexperiment in Knochenmarkszellen der Maus auf dieselbe Weise wie in Beispiel 4 (4) beschrieben durchgeführt.
Knochenmarkszellen der Maus wurden auf dieselbe Weise wie oben in dem Beispiel beschrieben hergestellt und die Zellen wurden vorstimuliert.
Als Platten zur Retrovirusinfektion wurden zusätzlich eine H2S-573 (160 pmol/cm², 10 μg/cm²) immobilisierte Platte, eine CH-296 (132 pmol/cm², 8,3 μg/cm²) immobilisierte Platte und, als Kontrolle, eine BSA-immobilisierte Platte verwendet. Die Ergebnisse, die durch den HPP-CFC-Assay erhalten wurden, sind in 17 gezeigt. In 17 bezeichnet die Abszisse den verwendeten funktionellen Stoff und die Ordinate bezeichnet die Gentransfereffizienz.
Wie in 17 gezeigt, erschienen keine Kolonien von G418^r mit hoher Dichte auf der Platte, die mit BSA als Kontrolle beschichtet waren. Obwohl ungefähr 50% der Gentransfereffizienz in einer mit CH-296-immobilisierten Platte erhalten wurde, wurden Kolonien von G418^r mit hoher Dichte bei einer höheren Effizienz erhalten als bei Verwendung einer mit H2S-573-immobilisierten Platte.
Beispiel 6
(1) Gentransfer unter Verwendung eines funktionellen Stoffes ohne Immobilisierung
Die Wirkung auf die Retrovirusinfektionseffizienz bei Verwendung eines Polypeptids, das ohne Immobilisierung auf einer Platte vorhanden war, wurde wie folgt untersucht. Dazu wurde zu einer Platte, die mit BSA gemäß dem in Beispiel 2 (9) beschriebenen Verfahren vorbeschichtet war, 2 ml DMEM-Medium, das 100 cfu PM5neo-Virus, 2000 NIH/3T3-Zellen und CH-296 in einer Endkonzentration von 10, 40, 250 μg/ml (jeweils entsprechend 0,158, 0,632 und 3,950 nmol/ml) zugege ben, gefolgt von einer Inkubation für 24 Stunden. Die nicht-adhärenten Zellen wurden durch Dekantierung gesammelt und die Zellen, die an der Platte hafteten, wurden durch Trypsin-Behandlung gesammelt, um diese von der Platte zu entfernen. Diese Zellen wurden kombiniert. Die entstandene Zellsuspension wurde auf eine 10 cm-Zellkulturplatte überführt, gefolgt von einer Inkubation für 24 Stunden. Das Medium wurde gegen DMEM, das G418 in einer Endkonzentration von 0,75 mg/ml enthielt, ausgetauscht, gefolgt von einer Inkubation für weitere 10 Tage. Dazu wurde getrennt als eine Kontrolle eine Platte ohne CH-296 und eine Platte auf der 32 pmol/cm² (2 μg/cm²) oder 127 pmol/cm² (8 μg/cm²) CH-296 immobilisiert war, hergestellt und die oben genannten Verfahren wurden durchgeführt, indem ein Virusübertand und Zellen dazu zugegeben wurden. Die Anzahl von G418^r-Kolonien, die so erhalten wurden, wurden gezählt und die Ergebnisse sind in Tabelle 1 zusammengefasst.
Tabelle 1
Wie in Tabelle 1 gezeigt, war die Anzahl von G418^r-Kolonien beträchtlich im Vergleich zur Abwesenheit von CH-296 erhöht, wenn Zellen, Virus und CH-296 zusammen in der Lösung vorlagen. Die Anzahl war gleich oder höher als die bei Verwendung einer Platte, die mit CH-296 beschichtet war. Zusätzlich wurde bei Zusatz einer CH-296-Lösung mit den oben genannten jeweiligen Konzentrationen zu einer Platte, die mit BSA beschichtet war und die für eine Weile stehen gelassen wurde, die Platte gewaschen und für das Virusinfektionsexperiment verwendet. Die Anzahl der erhaltenen G418^r-Kolonien war ähnlich der Anzahl ohne Zusatz von CH-296. Daraus kann abgeleitet werden, dass CH-296 nicht an immobilisiertes BSA bindet. Daher wird angenommen, dass die oben genannte Retrovirusinfektions-fördernde Wirkung durch CH-296 nicht auf die Adhäsion von CH-296 in der Lösung auf einer Platte während einer Inkubation zurückzuführen ist.
(2) Gentransfer unter Verwendung eines funktionellen Stoffes ohne Immobilisierung
Die Wirkung auf die Retrovirusinfektionseffizienz, wenn Polypeptide zusammen auf einer Platte ohne Immobilisieren vorhanden waren, wurde wie folgt untersucht. Dazu wurde zu einer Platte, die mit BSA gemäß dem in Beispiel 2 (9) beschriebenen Verfahren vorbeschichtet war, 2 ml DMEM-Medium, das 1000 cfu PM5neo-Virus, 2000 NIH/3T3-Zellen und C-FGF·A, ColV bzw. C277-ColV in einer Endkonzentration von 1,67 nmol/ml enthielt, zugegeben, gefolgt von einer Inkubation bei 37°C für 24 Stunden. Die nicht-adhärenten Zellen wurden durch Dekantierung gesammelt und die Zellen, die an der Platte hafteten, wurden durch Trypsin-Behandlung gesammelt, um diese von der Platte zu entfernen. Diese Zellen wurden kombiniert. Die entstandene Zellsuspension wurde in zwei Hälften aufgeteilt, eine Hälfte wurde mit DMEM kultiviert und die andere Hälfte wurde mit DMEM, das G418 in einer Endkonzentration von 0,75 mg/ml enthielt, kultiviert. Beide Teile wurden bei 37°C für 10 Tage kultiviert und die Anzahl von auftretenden Kolonien wurde gezählt. Ein Verhältnis der Anzahl von G418^r-Kolonien relativ zu der Anzahl der Kolonien, die in einem Medium erhalten wurden, das kein G418 enthielt, wurde als Gentransfereffizienz genommen. Die Ergebnisse sind in 18 gezeigt. In 18 bezeichnet die Abszisse die verwendeten funktionellen Stoffe und die Ordinate bezeichnet die Gentransfereffizienz.
Wie in 18 gezeigt, wurde eine höhere Gentransfereffizienz erhalten, wenn eine Virusinfektion in der Gegenwart von jedem Polypeptid stattgefunden hat. Daher ist es klar, dass selbst, wenn diese Polypeptide nicht auf Platten immobilisiert sind, die Retrovirusinfektion gefördert wird.
(3) Gentransduktion von nicht-adhärenten Zellen unter Verwendung eines funktionellen Stoffes ohne Immobilisierung
Die Wirkung auf die Gentransfereffizienz in nicht-adhärenten Zellen durch ein Polypeptid ohne Immobilisierung wurde wie folgt untersucht. Dazu wurde zu jeder Platte, die mit 333 pmol/cm² (10 μg/cm²) H-271 und die auf dieselbe Weise wie in Beispiel 2 (9) beschrieben hergestellt wurde und einer Kontrollplatte, auf der BSA immobilisiert war, 2 ml RPMI-Medium (enthaltend 5 ng/ml GM-CFS, 50 Einheiten/ml Penicillin und 50 μg/ml Streptomycin), das 1 × 10⁴ cfu TKNEO-Virus und 1 × 10⁴ TF-1-Zellen enthielt, zugegeben. Zu der mit BSA-immobilisierten Platte wurden weiter H-271 mit einer Endkonzentration von 50 μg/ml (1,67 nmol/ml) H-271 zugegeben. Jede Platte wurde bei 37°C für 24 Stunden inkubiert. Nach der Inkubation wurden die nicht-adhärenten Zellen durch Dekantierung gesammelt und die Zellen, die an der Platte hafteten, wurden durch Trypsin-Behandlung gesammelt. Diese Zellen wurden kombiniert. Jeder 1/5-Teil der entstandenen Zellsuspension wurde auf zwei Platten überführt, die mit CH-296 beschichtet waren, und für 24 Stunden inkubiert. Das Medium auf einer Platte wurde gegen das oben genannte Medium ausgetauscht und das Medium der anderen Platte wurde gegen das oben genannte Medium, das G418 in einer Endkonzentration von 0,75 mg/ml enthielt, ausgetauscht. Nach der Inkubation bei 37°C für 8 Tage, wurde die Anzahl der auftretenden Kolonien gezählt. Das Auftreten (Gentransfereffizienz) wurde basierend auf der Anzahl von Kolonien berechnet, die in der Gegenwart und Abwesenheit von G418 gezählt wurden. Die Ergebnisse sind in 19 gezeigt. In 19 bezeichnet die Abszisse den funktionellen Stoff und dessen verwendete Form und die Ordinate bezeichnet die Gentransfereffizienz.
Wie in 19 gezeigt, ist die erhaltene Gentransfereffizienz höher, wenn nicht-immobilisiertes H-271 verwendet wurde, als wenn immobilisiertes H-271 verwendet wurde. Dann wurde gezeigt, dass ein nicht-immobilisierter Zustand bevorzugt ist, wenn H-271 für die Gentransduktion von TF-1-Zellen verwendet wurde.
(4) Aufklärung des Mechanismus der Förderung der Retrovirusinfektion durch das Polypeptid
Um sicherzustellen, dass eine Förderung der Retrovirusinfektion von Zellen durch das Polypeptid ohne Immobilisierung wie in den oben genannten Beispielen auf eine Bindung der Zellen an das Polypeptid und eine Bindung des Polypeptids an das Retrovirus zurückzuführen ist, wurde das folgende Experiment durchgeführt. Als erstes wurden zu BSA-immobilisierten Platten, die gemäß den in Beispiel 2 (9) beschriebenen Verfahren hergestellt wurden, 2 ml DMEM, das 1000 NIH/3T3-Zellen enthielt, zugegeben, gefolgt von einer Inkubation bei 37°C für 24 Stunden. Das Medium wurde von den Platten entfernt, jeweils 2 ml 1,67 nmol/ml H-271, CH-271, C-FGF·A bzw. PBS als Kontrolle wurden dazu zugegeben, gefolgt von einer Inkubation bei 37°C für 2,5 Stunden. Die Platten wurden mit einer ausgeglichenen Hanks-Salzlösung (HBBS, Gibco) gewaschen, die 25 mM HEPES enthielt. 2 ml eines Virusüberstandes, der 1000 cfu PM5neo-Virus enthielt, wurden zu den Platten zugegeben, gefolgt von einer Inkubation bei 37°C für 30 Minuten. Die Platten wurden mit PBS gewaschen. Zu diesen Platten wurden 2 ml DMEM zugegeben, gefolgt von einer Inkubation bei 37°C für 24 Stunden. Die nicht-adhärenten Zellen wurden durch Dekantierung gesammelt und die Zellen, die an der Platte hafteten, wurden durch Trypsin-Behandlung gesammelt, um diese von der Platte abzulösen. Diese Zellen wurden jeweils kombiniert. Jede Zellsuspension, die so erhalten wurde, wurde in zwei Hälften aufgeteilt, eine Hälfte wurde mit DMEM kultiviert und die andere Hälfte wurde mit DMEM, das G418 mit einer Endkonzentration von 0,75 mg/ml enthielt, kultiviert. Beide Teile wurden bei 37°C für 10 Tage inkubiert und die Anzahl von auftretenden Kolonien wurde gezählt. Ein Verhältnis der Anzahl von G418^r-Kolonien relativ zu der Anzahl von Kolonien, die in einem Medium ohne G418 erhalten wurde, wurde als Gentransfereffizienz genommen. Die Ergebnisse sind in 20 gezeigt. In 20 bezeichnet die Abszisse die verwendeten funktionellen Stoffe und eine Kontrolle und die Ordinate bezeichnet die Gentransfereffizienz.
Wie in 20 gezeigt, wurde ein bemerkenswerter Anstieg bei der Infektionseffizienz beobachtet, wenn eine Virusinfektion nach Behandlung der Zellen auf der Platte mit der oben genannten Polypeptidlösung durchgeführt wurde. Dies deutet darauf hin, dass die Infektionseffizienz durch Bindung des Polypeptids an Zellen und weiter durch Bindung des Retrovirus an das Polypeptid auf den Zellen erhöht wurde.
Ein ähnliches Experiment wurde mit dem Unterschied durchgeführt, dass das zugegebene Polypeptid mit 0,29 nmol/ml C-FGF·A bzw. 0,79 nmol/ml CH-296 ersetzt wurde. Die Ergebnisse sind in 21 gezeigt. In 21 bezeichnet die Abszisse die verwendeten funktionellen Stoffe und eine Kontrolle und die Ordinate bezeichnet die Gentransfereffizienz. Wie in 21 gezeigt, wurde ein Anstieg bei der Gentransfereffizienz im Falle von C-FGF·A und CH-296 nachgewiesen. Folglich wurde die oben genannte Aktivität für C-FGF·A bestätigt. Gleichzeitig wurde gezeigt, dass CH-296 dieselbe Aktivität besaß, um die Retrovirusinfektion durch denselben Mechanismus zu fördern.
Beispiel 7
(1) Gentransfer unter Verwendung eines funktionellen Stoffes, der auf Beads immobilisiert ist
Ob die Retrovirusinfektionseffizienz unter Verwendung von Beads erhöht werden konnte, die mit dem funktionellen Stoff beschichtet waren oder nicht, wurde gemäß den folgenden Verfahren untersucht. Als Beads wurden Polystyrol-Beads mit einem Durchmesser von 1,14 μm (Polybeads Polystyrene Microsphere, hergestellt von PolyScience) verwendet. Zu 20 μl einer 2,5%-Suspension von den oben genannten Beads wurden 80 μl Ethanol und 2 ml 40 μg/ml CH-296 dazu zugegeben, und dann über Nacht bei 4°C stehen gelassen. Dazu wurden BSA und PBS zugegeben, um eine 1% BSA/PBS-Suspension (4 ml) herzustellen, Beads wurden durch Zentrifugation gewonnen und 5 ml einer 1% BSA/PBS-Suspension wurden wiederum hergestellt und bei Raumtemperatur für eine Stunde stehen gelassen, um eine Suspension von CH-296-immobilisierten Beads zu erhalten. Als Kontrollen wurden Beads auf dieselbe Weise präpariert, mit dem Unterschied dass die Immobilisierung unter Verwendung von 2% BSA anstelle der CH-296-Lösung durchgeführt wurde.
Ein Zehntelteil (0,5 ml) wurde von der oben genannten Beads-Suspension genommen und die Beads wurden durch Zentrifugation gewonnen. DMEM, das 1000 cfu PM5neo-Virus enthielt, wurde dazu zugegeben, gefolgt von einer Inkubation bei 37°C für 30 Minuten. Die Beads wurden zweimal mit 1% BSA/PBS gewaschen, in 2 ml DMEM suspendiert und 1 ml davon wurde auf eine Platte übertragen. 1 ml DMEM, das 3 × 10⁵ NIH/3T3-Zellen enthielt, wurde dazu zugegeben, gefolgt von einer Inkubation in einem CO₂-Inkubator bei 37°C für 24 Stunden. Danach wurde das Medium gegen DMEM, das G418 in einer Endkonzentration von 0,75 mg/ml enthielt, ausgewechselt, gefolgt von einer Inkubation für weitere 10 Tage. Die Kolonien, die auftraten, wurden gefärbt und gezählt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 gezeigt.
Wie in Tabelle 2 gezeigt, traten 264 Kolonien von G418^r auf, wenn Beads, die mit CH-296 beschichtet waren, verwendet wurden, während keine resistente Kolonien erhalten wurden, wenn Beads verwendet wurden, die mit BSA als Kontrolle beschichtet waren. Dies deutet darauf hin, dass selbst eine Immobilisierung von CH-296 auf Beads die Wirkung zur Steigerung der Retrovirusinfektionseffizienz besaß, genauso wie eine Immobilisierung auf einer Platte.
Tabelle 2
(2) Gentransfer in Knochenmarkszellen der Maus unter Verwendung von Beads, auf denen ein funktioneller Stoff immobilisiert ist
Die Möglichkeit einer Steigerung der Retrovirusinfektionseffizienz von Knochenmarkszellen der Maus mit Beads, die mit dem funktionellen Stoff beschichtet sind, wurde gemäß den folgenden Verfahren untersucht.
Die Knochenmarkszellen der Maus wurden auf dieselbe Weise wie in Beispiel 4 (4) beschrieben hergestellt und vorstimuliert.
Jeweils 2 ml des Mediums, das für die oben genannte Vorstimulation verwendet wurde, das 1 × 10⁶ vorstimulierte Zellen und 1 × 10⁴ cfu PM5neo-Virus enthielt, wurde zu einer Platte zugegeben, die mit BSA auf dieselbe Weise wie in Beispiel 2 (9) beschrieben, beschichtet war und einer ähnlichen Platte, die mit BSA beschichtet war, zu der ein 1/10-Teil der CH-296 immobilisierten Beads wie in Beispiel 7 (1) beschrieben, zugegeben wurde, gefolgt von einer Inkubation bei 37°C. Nach 2 Stunden wurde Medium (2 ml), das dieselbe Virusmenge enthielt, zu jeder Platte frisch zugegeben, gefolgt von einer kontinuierlichen Inkubation für 22 Stunden. Nach Beendigung der Inkubation wurden die nicht-adhärenten Zellen durch Dekantierung gesammelt und die Zellen, die an der Platte hafteten, wurden unter Verwendung eines Zelldissoziationspuffers (CDB, der keine Enzyme enthielt, Gibco) gesammelt, und diese Zellen wurden kombiniert und zweimal mit demselben Puffer gewaschen. Die Anzahl der Zellen wurde gezählt. Die gesammelten Zellen wurden einem HPP-CFC-Assay auf dieselbe Weise wie in Beispiel 4 (4) beschrieben unterzogen.
Die Ergebnisse sind in 22 gezeigt. In 22 bezeichnet die Abszisse den funktionellen Stoff und dessen verwendete Form und die Ordinate bezeichnet die Gentransfereffizienz. Wie aus den Ergebnissen hervorgeht, kann die Retrovirusinfektionseffizienz von Knochenmarkszellen der Maus auch erhöht werden, wenn CH-296 immobilisierte Beads verwendet werden.
Beispiel 8
(1) Gentransfer unter Verwendung von H-271 und CH-271
Die Wirkungen von H-271 auf die Retrovirusinfektion wurden bestimmt, indem ein Virusüberstand in Platten, die mit H-271 bzw. CH-271 beschichtet waren, vorinkubiert wurde, was dafür bekannt war die Retrovirusinfektion zu steigern; nach gründlichem Waschen der Platten; Bestimmen der verbleibenden Menge des Virus durch einen NIH/3T3-Zellkolonie-Bildungs-Assay und Vergleichen der Ergebnisse von beiden Platten. Dazu wurde auf dieselbe Weise wie in Beispiel 2 (9) beschrieben, Platten mit verschiedenen Konzentrationen von H-271 [67 pmol/cm² (2 μg/cm²) bis 333 pmol/cm² (10 μg/cm²)] bzw. CH-271 [67 pmol/cm² (4 μg/cm²) bis 333 pmol/cm² (20 μg/cm²)] hergestellt. Zu jeder Platte wurden 2 ml eines Virusüberstandes, der 1000 cfu PM5neo-Virus enthielt, zugegeben und bei 37°C für 30 Minuten vorinkubiert, gefolgt von einem gründlichen Waschen mit PBS. Zu dieser Platte wurden 2 ml DMEM-Medium, das 2000 NIH/3T3-Zellen enthielt, zugegeben und bei 37°C für 24 Stunden inkubiert, gefolgt von einer Inkubation für 10 Tage in einem Selektionsmedium, das 0,75 mg/ml G418 enthielt. Die Kolonien wurden gefärbt und gezählt. Die Ergebnisse sind in 23 gezeigt. 23 ist ein Diagramm, das die Beziehung zwischen dem funktionellen Stoff und der Gentransfereffizienz zeigt. In 23 bezeichnet die Abszisse die Menge des verwendeten funktionellen Stoffes und die Ordinate bezeichnet die Anzahl von G418^r-Kolonien.
Wie in 23 gezeigt, war die Anzahl der auftretenden G418^r-Kolonien beinahe dieselbe, unabhängig von der Konzentration des Polypeptids, wenn eine CH-271-immobilisierte Platte verwendet wurde. Andererseits war im Falle von H-271 die Anzahl von auftretenden Kolonien in Abhängigkeit von der Konzentration erhöht, wenn die Konzentration des verwendeten Polypeptids für die Immobilisierung gesteigert wurde. Im Falle der Platte, die mit 333 pmol/cm² H-271 hergestellt wurde, war die Anzahl der Kolonien beinahe dieselbe wie die von CH-271. Dies legt nahe, dass eine äquivalente Virusinfektionseffizienz zu der von CH-271 erhalten werden kann, wenn eine ausreichende H-271 Menge auf einer Platte immobilisiert wurde.
(2) Gentransfer unter Verwendung von C-FGF·A
Die Wirkungen von C-FGF·A auf die Retrovirusinfektion wurde unter Verwendung eines NIH/3T3-Zellkolonieassays untersucht. Dazu wurde eine Bestimmung auf die gleiche Weise wie in Beispiel 8 (1) beschrieben durchgeführt, mit dem Unterschied, dass Platten verwendet wurden, die mit 127 pmol/cm² (6 μg/cm²) C-FGF·A, 127 pmol/cm² (7,6 μg/cm²) CH-271 und 127 pmol/cm² (8 μg/cm²) CH-289 gemäß dem in Beispiel 2 (9) beschriebenen Verfahren hergestellt wurden und eine Kontrollplatte auf der BSA immobilisiert war. Die Ergebnisse sind in 24 gezeigt. 24 ist ein Diagramm, das das Verhältnis zwischen den funktionellen Stoffen und den Gentransfereffizienzen veranschaulicht. In 24 bezeichnet die Abszisse die funktionellen Stoffe und BSA und die Ordinate bezeichnet die Gentransfereffizienz.
Wie in 24 gezeigt, trat keine Kolonie in der Kontrollplatte auf, auf der BSA immobilisiert war. Andererseits konnte ein Auftreten von G418^r-Kolonien bestätigt werden, wenn eine Platte verwendet wurde, auf der C-FGF·A immobilisiert war und die Anzahl der Kolonien war dieselbe wie die Anzahl auf den Platten, bei denen CH-271 und CH-296 verwendet wurden. Dies deutet darauf hin, dass eine Retrovirusbindungsdomäne, die im Wesentlichen dieselbe Funktion hat wie die von CH-271 und CH-296 auf dem FGF-Molekül vorlag.
(3) Gentransfer unter Verwendung von C-FGF-CS 1
Die Wirkungen des C-FGF-CS 1-Polypeptids auf die Retrovirusinfektion wurde gemäß den folgenden Verfahren untersucht. Dazu wurde ein NIH/3T3-Zellkolonieassay auf dieselbe Weise wie in Beispiel 8 (1) beschrieben, unter Verwendung von Platten, die mit 133 pmol/cm² C-FGF-CS1 (6,7 μg/cm²), C-FGF·A (6,3 μg/cm²), CH-271 (8 μg/cm²) bzw. CH-296 (8,4 μg/cm²), die gemäß dem in Beispiel 2 (9) beschriebenen Verfahren hergestellt wurden, durchgeführt. Die Ergebnisse sind in 25 gezeigt. 25 ist ein Diagramm, das die Beziehung zwischen funktionellen Stoffen und den Gentransfereffizienzen zeigt. In 25 bezeichnet die Abszisse die verwendeten funktionellen Stoffe und die Ordinate bezeichnet die Anzahl von G418^r-Kolonien.
Wie in 25 gezeigt, trat beinahe dieselbe Anzahl von Kolonien auf den Platten, auf denen diese vier Polypeptide jeweils immobilisiert waren, auf, was darauf hinweist, dass das C-FGF-CS1-Molekül eine Retrovirusbindungsaktivität besaß, die äquivalent war zu den anderen Polypeptiden.
(4) Gentransfer unter Verwendung von C277-ColV
Die Wirkungen des C277-ColV-Polypeptids auf die Retrovirusinfektion wurde auf dieselbe Weise wie in Beispiel 8 (1) beschrieben, unter Verwendung einer Platte, die mit 124 pmol/cm² (6,4 μg/cm²) C277-ColV hergestellt war und einer Kontrollplatte, auf der BSA immobilisiert war, bestimmt. Die Ergebnisse sind in 26 gezeigt. 26 ist ein Diagramm, das die Beziehung zwischen dem funktionellen Stoff und der Gentransfereffizienz veranschaulicht. Die Abszisse bezeichnet den verwendeten funktionellen Stoff und BSA und die Ordinate bezeichnet die Anzahl der G418^r-Kolonien.
Wie in 26 gezeigt, trat keine Kolonie auf der Kontrollplatte auf, die mit BSA beschichtet war. Auf der anderen Seite traten G418^r-Kolonien auf, wenn eine C277-ColV-immobilisierte Platte verwendet wurde. Dies deutet darauf hin, dass das Retrovirus auf der Platte nach dem Waschen verbleibt, was auf das Vorliegen einer Retrovirusbindungsdomäne auf dem ColV-Molekül zurückzuführen ist.
Wie hier beschrieben, stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren für einen effizienten Gentransfer in Zielzellen mit Retroviren bereit. Wenn das Verfahren der vorliegenden Erfindung durchgeführt wird, indem ein Zellbindungsstoff ausgewählt ist, der für Zielzellen geeignet ist, können transformierte Zielzellen auf einfache Weise mit einer hohen Gentransfereffizienz erhalten werden, ohne dass ein spezieller Retrovirusvektor erforderlich ist. Wenn diese transformierten Zellen in Wirbeltiere transplantiert werden, wird das transformierte Tier auf einfache Weise vorbereitet und die vorliegende Erfindung ist für verschiedene technische Gebiete, wie medizinische Wissenschaften, Zelltechnologie, genetische Manipulations- und Entwicklungstechnologie verwendbar. Zusätzlich wird ein Kulturmedium bereitgestellt, das den erfindungsgemäßen funktionellen Stoff oder ein Gemisch davon und ein Reagenzkit zur Durchführung eines Retrovirus-vermittelten Gentransfers in Zielzellen enthält. Unter Verwendung dieses Kulturmediums und Kits kann eine Lokalisation eines Retrovirus, eine Transduktion eines exogenen Gens in Zielzellen und dergleichen leicht und effizient durchgeführt werden.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1 ist ein Diagramm, das die Gentransfereffizienzen in den Zielzellen mit dem Fibroblasten-Wachstumsfaktor, dem funktionellen Stoff, der den Fibroblasten- Wachstumsfaktor enthält und dem Gemisch des Fibroblasten-Wachstumsfaktors und des Zelladhäsionsdomänepolypeptids des Fibronectins zeigt.
2 ist ein Diagramm, das die Gentransfereffizienzen in Zielzellen mit dem Fibroblasten-Wachstumsfaktor, dem Gemisch des Fibroblasten-Wachstumsfaktors und des Zelladhäsionsdomänepolypeptid des Fibronectins und dem Zelladhäsionsdomänepolypeptid des Fibronectins zeigt.
3 ist ein Diagramm, das die Gentransfereffizienzen in die Zielzellen mit dem Collagen-Fragment, dem Gemisch des Zellbindungsdomänepolypeptids des Fibronectins und dem Collagen-Fragment, dem funktionellen Stoff, der das Collagen-Fragment enthält und das Gemisch der Zielbindungsdomäne des Fibronectins zeigt.
4 ist ein Diagramm, das die Gentransfereffizienzen in Zielzellen mit dem Fibronectin-Fragment und dem Gemisch des Fibronectin-Fragments und dem Zellbindungsdomänepolypeptid des Fibronectins zeigt.
5 ist ein Diagramm, das die Gentransfereffizienzen in Zielzellen mit dem Zellbindungsdomänenpolypeptid des Fibronectins, dem Polylysin, dem Gemisch des Polylysins und dem Zellbindungsdomänepolypeptid des Fibronectins, dem Fibronectin-Fragment und dem Gemisch des Fibronectin-Fragments und dem Zellbindungsdomänepolypeptid des Fibronectins zeigt.
6 ist ein Diagramm, das die Gentransfereffizienz in Zielzellen mit dem Erythropoietin-Derivat, dem Polylysin und dem Gemisch des Erythropoietin-Derivats und des Polylysins zeigt.
7 ist ein Diagramm, das die Gentransfereffizienzen in Zielzellen mit dem Erythropoietin-Derivat, dem Fibronectin-Fragment-Polymer und Gemisch des Erythropoietin-Derivats und des Fibronectin-Fragment-Polymers zeigt.
8 ist ein Diagramm, das die Gentransfereffizienzen in Zielzellen mit den Beads, auf denen das Fibronectin immobilisiert ist, die Beads, auf denen das Zellbindungsdomänepolypeptid von Fibronectin immobilisiert ist und die Beads, auf denen das Gemisch des Fibronectin-Fragments und das Zellbindungsdomänepolypeptid des Fibronectins immobilisiert wurde, zeigt.
9 ist ein Diagramm, das die Transformation von Zielzellen mit dem Fibroblasten-Wachstumsfaktor und dem funktionellen Stoff, der den Fibroblasten-Wachstumsfaktor enthält, zeigt.
10 ist ein Diagramm, das die Beziehung zwischen der Menge des funktionellen Stoffes, der den verwendeten Fibroblasten-Wachstumsfaktor enthält und der Gentransfereffizienz zeigt.
11 ist ein Diagramm, das die Transformation der Zielzellen mit dem funktionellen Stoff, der den Fibroblasten-Wachstumsfaktor enthält, zeigt.
12 ist ein anderes Diagramm, das die Transformation der Zielzellen mit dem funktionellen Stoff, der den Fibroblasten-Wachstumsfaktor enthält, zeigt.
13 ist ein Diagramm, das die Beziehung zwischen der Gentransfereffizienz in Zielzellen und der Menge des funktionellen Stoffes, der das verwendete Collagen-Fragment enthält, zeigt.
14 ist ein Diagramm, das die Gentransfereffizienz in die Zielzellen mit Polylysin zeigt.
15 ist ein Diagramm, das die Transformation der Zielzellen mit dem Fibronectin-Fragment und dem Fibronectin-Fragment-Polymer zeigt.
16 ist ein anderes Diagramm, das die Transformation der Zielzellen mit dem Fibronectin-Fragment und dem Fibronectin-Fragment-Polymer zeigt.
17 ist noch ein weiteres Diagramm, das die Gentransfereffizienz in die Zielzellen mit dem Fibronectin-Fragment und dem Fibronectin-Fragment-Polymer zeigt.
18 ist ein Diagramm, das die Gentransfereffizienz in die Zielzellen mit dem funktionellen Stoff, der den Fibroblasten-Wachstumsfaktor enthält, dem Collagen-Fragment und dem funktionellen Stoff, der das Genfragment enthält, zeigt.
19 ist ein Diagramm, das die Gentransfereffizienz in die Zielzellen mit dem Fibronectin-Fragment zeigt.
20 ist ein Diagramm, das die Gentransfereffizienz in die Zielzellen mit dem funktionellen Stoff, der das Fibronectin-Fragment und den Fibroblasten-Wachstumsfaktor enthält, zeigt.
21 ist ein Diagramm, das die Gentransfereffizienz in die Zielzellen mit dem funktionellen Stoff, der den Fibroblasten-Wachstumsfaktor und das Fibronectin-Fragment enthält, zeigt.
22 ist ein Diagramm, das die Gentransfereffizienz in die Zielzellen mit dem Fibronectin-Fragment immobilisierten Beads zeigt.
23 ist ein Diagramm, das die Beziehung zwischen der Menge des verwendeten Fibronectin-Fragments und der Gentransduktion der Zielzellen zeigt.
24 ist ein Diagramm, das die Gentransduktion der Zielzellen mit dem funktionellen Stoff, der den Fibroblasten-Wachstumsfaktor und das Fibronectin-Fragment enthält, zeigt.
25 ist ein weiteres Diagramm, das die Gentransduktion der Zielzellen mit dem funktionellen Stoff, der den Fibroblasten-Wachstumsfaktor und das Fibronectin-Fragment enthält, zeigt.
26 ist ein Diagramm, das die Gentransduktion der Zielzellen mit dem funktionellen Stoff, der das Collagen-Fragment enthält, zeigt.
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Verfahren zum Gentransfer ex vivo in Zielzellen mit einem Retrovirus, wobei die Transduktion durch Infektion der Zielzellen mit dem Retrovirus in der Gegenwart eines isolierten funktionellen Stoffes, der eine Retrovirusbindungsdomäne besitzt, und eines anderen isolierten funktionellen Stoffes, der eine Zielzellbindungsdomäne besitzt, durchgeführt wird, wobei der isolierte funktionelle Stoff, der eine Retrovirusbindungsdomäne besitzt, und der isolierte funktionelle Stoff, der eine Zielbindungsdomäne besitzt, nicht auf demselben Molekül vorhanden sind.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei der isolierte funktionelle Stoff, der eine Retrovirusbindungsdomäne besitzt, ein Stoff ist, ausgewählt aus der Heparin-II-Bindungsregion von Fibronectin, Fibroblastenwachstumsfaktoren, Kollagenen, Polylysinen und Polypeptiden, die eine Aminosäuresequenz besitzen, in der eine Deletion, Substitution, Insertion und/oder Addition einer oder mehrerer Aminosäure(n) in der Aminosäuresequenz dieser Stoffe vorhanden ist/sind, wobei die Retrovirusbindungsaktivität, die einen Gentransfer mit hoher Effizienz bewirken kann, aufrecht erhalten wird.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei der isolierte funktionelle Stoff, der eine Zielzellbindungsdomäne besitzt, ein Ligand ist, der spezifisch an die Zielzellen bindet.
Verfahren nach Anspruch 3, wobei der Ligand ausgewählt ist aus Zelladhäsionsproteinen, Hormonen, Cytokinen, Antikörpern, Zuckerketten, Kohlenhydraten und Metaboliten.
Verfahren nach Anspruch 4, wobei das Zelladhäsionsprotein ein Polypeptid einer Zellbindungsdomäne von Fibronectin ist.
Verfahren nach Anspruch 5, wobei das Polypeptid einer Zellbindungsdomäne von Fibronectin ein Polypeptid der Bindungsdomäne zu VLA-5 und/oder VLA-4 ist.
Verfahren nach Anspruch 4, wobei der Ligand Erythropoietin ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei die isolierten funktionellen Stoffe immobilisiert sind.
Verfahren nach Anspruch 8, wobei die isolierten funktionellen Stoffe auf Kügelchen immobilisiert sind.
Kulturmedium für Zielzellen zur Verwendung in einem Verfahren zum Gentransfer in die Zielzellen nach einem der Ansprüche 1 bis 9, das einen isolierten funktionellen Stoff, der eine Retrovirusbindungsdomäne besitzt und einen anderen isolierten funktionellen Stoff, der eine Zielzellbindungsdomäne besitzt, umfasst, wobei der isolierte funktionelle Stoff, der eine Retrovirusbindungsdomäne besitzt, und der isolierte funktionelle Stoff, der eine Zielzellbindungsdomäne besitzt, nicht auf demselben Molekül vorhanden sind.
Verfahren zur Lokalisierung eines Retrovirus, umfassend das Inkubieren eines Kulturmediums, das den Retrovirus enthält, das mit einem isolierten funktionellen Stoff, der eine Retrovirusbindungsdomäne besitzt, und einem anderen isolierten funktionellen Stoff, der eine Zielzellbindungsdomäne besitzt, in Kontakt gebracht wurde, wobei der isolierte funktionelle Stoff, der eine Retrovirusbindungsdomäne besitzt, und der isolierte funktionelle Stoff, der eine Zielzellbindungsdomäne besitzt, nicht auf demselben Molekül vorhanden sind.
Verfahren zur Lokalisation nach Anspruch 11, wobei der isolierte funktionelle Stoff, der eine Retrovirusbindungsdomäne besitzt, ein Stoff ist, ausgewählt aus der Heparin-II-Bindungsregion von Fibronectin, Fibroblastenwachstumsfaktoren, Kollagenen, Polylysinen und Polypeptiden, die eine Aminosäuresequenz besitzen, in der eine Deletion, Substitution, Insertion und/oder Addition einer oder mehrerer Aminosäure(n) in der Aminosäuresequenz dieser Stoffe vorhanden ist/sind, wobei die Retrovirusbindungs aktivität, die einen Gentransfer mit hoher Wirksamkeit bewirken kann, aufrecht erhalten wird.
Verfahren zur Lokalisation nach Anspruch 11, wobei der isolierte Stoff, der eine Zellbindungsdomäne besitzt, ein Ligand ist, der spezifisch an die Zielzellen bindet.
Verfahren zur Lokalisation nach Anspruch 13, wobei der Ligand ausgewählt ist aus Zelladhäsionsproteinen, Hormonen, Cytokinen, Antikörpern, Zuckerketten, Kohlenhydraten und Metaboliten.
Verfahren zur Lokalisation nach Anspruch 14, wobei das Zelladhäsionsprotein ein Polypeptid einer Zellbindungsdomäne von Fibronectin ist.
Verfahren zur Lokalisation nach Anspruch 15, wobei das Polypeptid einer Zellbindungsdomäne die Bindungsdomäne zu VLA-5 und/oder VLA-4 ist.
Verfahren zur Lokalisation nach Anspruch 14, wobei der Ligand Erythropoietin ist.
Verfahren zur Lokalisation nach einem der Ansprüche 11 bis 17, wobei die funktionellen Stoffe immobilisiert sind.
Kit zur Durchführung eines Retrovirus-vermittelten Gentransfers in Zielzellen nach einem der Ansprüche 1 bis 9, umfassend: (a) einen isolierten funktionellen Stoff, der eine Retrovirusbindungsdomäne besitzt und/oder einen anderen isolierten funktionellen Stoff, der eine Zielzellbindungsdomäne besitzt, wobei der isolierte funktionelle Stoff, der eine Retrovirusbindungsdomäne besitzt, und der isolierte funktionelle Stoff, der eine Zielzellbindungsdomäne besitzt, nicht auf demselben Molekül vorhanden sind; (b) ein artifizielles Substrat zum Inkubieren des Retrovirus und der Zielzellen; und (c) einen Zielzellwachstumsfaktor zur Prä-Stimulation der Zielzellen.
Verfahren zur Lokalisation eines Retrovirus, umfassend das Inkubieren eines Kulturmediums, das das Retrovirus enthält, das mit einer wirksamen Menge von einem funktionellen Stoff, der eine Retrovirusbindungsdomäne besitzt, die sich von einem Fibroblastenwachstumsfaktor, einem Kollagen oder einem Polylysin ableitet, in Kontakt gebracht wurde.
Verfahren zur Lokalisation nach Anspruch 20, wobei der funktionelle Stoff immobilisiert ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, wobei die Zielzellen Zellen sind, ausgewählt aus Stammzellen, hämatopoetischen Zellen, nicht-adhärenten mononuklearen Zellen mit geringer Dichte, adhärenten Zellen, Knochenmarkszellen, hämatopoetischen Stammzellen, peripheren Blutstammzellen, Nabel-Blutzellen, fötalen hämatopoetischen Stammzellen, embryoplastischen Stammzellen, embryonalen Zellen, primordialen Keimzellen, Oozyten, Oogonien, Ovum, Spermatozyten, Samenzellen, CD 34 +-Zellen, C-Kit +-Zellen, multifunktionellen hämatopoetischen Vorläuferzellen, unifunktionellen hämatopoetischen Vorläuferzellen, Erythrozytenvorläuferzellen, lymphozytische Vorläuferzellen, ausgereifte Blutzellen, Lymphozyten, B-Zellen, T-Zellen, Fibroblasten, Neuroblasten, Nervenzellen, Endothelzellen, angioendotheliale Zellen, Leberzellen, Myoblasten, Skelettmuskelzellen, Glattmuskelzellen, Krebszellen, Myelomzellen und Leukämiezellen.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, 11 bis 18, 20 und 21, wobei das Retrovirus ein exogenes Gen einschließt.
Verfahren nach Anspruch 23, wobei das Retrovirus ein rekombinanter retroviraler Vektor ist.
Verfahren nach Anspruch 23, wobei das Retrovirus ein replikationsdefizienter rekombinanter retroviraler Vektor ist.
Polypeptid entsprechend SEQ. ID No. 13, SEQ. ID No. 30 oder SEQ. ID No. 5 des Sequenzprotokolls oder einem Polypeptid, das eine Aminosäuresequenz besitzt, in der eine Deletion, Substitution, Insertion und/oder Addition von einer oder mehreren Aminosäure(n) in SEQ ID No. 13, SEQ ID No. 30 oder SEQ ID No. 5 vorhanden ist/sind, wobei die Retrovirusbindungsaktivität oder sowohl die Retrovirusbindungsaktivität als auch die Zielzellaktivität, die einen Gentransfer mit hoher Wirksamkeit bewirken kann/können, aufrecht erhalten wird/werden.
Gen, das für das Polypeptid nach Anspruch 26 kodiert.
Gen nach Anspruch 27, das in den SEQ ID Nos. 17, 33 oder 26 des Sequenzprotokolls wiedergegeben ist.