DE69636216T2 - Zusammensetzungen und verfahren zur behandlung und diagnose von immunstörungen - Google Patents

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Description

  • 1. Einführung
  • Die vorliegende Erfindung betrifft Verfahren und Zusammensetzungen für die Behandlung und Diagnose von Immunstörungen, insbesondere mit T-Helfer-(TH)-Zellen und TH-ähnlichen Zellen verbundene Störungen.
  • Die vorliegende Erfindung stellt Verfahren zur Diagnose und Zusammensetzungen für die Behandlung derartiger Störungen und Verfahren zur Überwachung der Effizienz der in klinischen Studien verwendeten Verbindungen bereit.
  • 2. Stand der Technik
  • Es werden zwei unterschiedliche Arten von T-Lymphozyten unterschieden: CD8+-zytotoxische T-Lymphozyten (ZTLs) und CD4+-T-Helfer-Lymphozyten (TH-Zellen). ZTLs erkennen und töten Zellen, die fremde Antigene auf ihrer Oberfläche aufweisen. ZTL-Vorläufermoleküle weisen T-Zell-Rezeptoren auf, die prozessierte Peptide, die aus fremden Proteinen stammen, gekoppelt mit MHC-Klasse-I-Molekülen auf anderen Zelloberflächen erkennen. Dieser Erkennungsprozess löst die Aktivierung, Reifung und Proliferation der ZTL-Vorläufermoleküle aus, was zu ZTL-Klonen führt, die Zellen, die als fremd erkannte Antigene aufweisen, zerstören können.
  • TH-Zellen sind sowohl bei den humoralen wie auch den zellvermittelten Formen der Effektorimmunantworten beteiligt. Bezüglich der humoralen, oder Antikörper-, Immunantwort, werden Antikörper von B-Lymphozyten durch Wechselwirkung mit TH-Zellen produziert. Insbesondere werden extrazelluläre Antigene durch Antigen-präsentierende Zellen (APCs) endozytosiert, prozessiert und vorzugsweise zusammen mit Haupthistokompatibilitätskomplex-(MHC)-Klasse-II-Molekülen den auf CD4+-MHC-Klasse-II beschränkten TH-Zellen präsentiert. Diese TH-Zellen aktivieren ihrerseits B-Lymphozyten, was zu einer Antikörperproduktion führt.
  • Die zellvermittelte, oder zelluläre, Immunantwort funktioniert so, dass Mikroorganismen, die intrazelluläre Orte bewohnen, neutralisiert werden. Fremde Antigene, wie zum Beispiel virale Antigene, werden in infizierten Zellen synthetisiert und auf den Oberflächen solcher Zellen zusammen mit MHC-Klasse-I-Molekülen präsentiert. Dies führt dann zur Stimulierung der auf CD8+-MHC-Klasse-I beschränkten ZTLs.
  • Einige Erreger, wie Mykobakterien, die Tuberkulose und Lepra verursachen, werden von Makrophagen umschlossen und in Bläschen prozessiert, die proteolytische Enzyme und andere toxische Substanzen enthalten. Während diese Makrophagenbestandteile die meisten Mikroorganismen töten und verdauen können, überleben Erreger wie Mykobakterien und vermehren sich die Erreger-Antigene werden dennoch von den Makrophagen prozessiert und vorzugsweise zusammen mit MHC-Klasse-II-Molekülen den auf CD4+-MHC-Klasse-II beschränkten TH-Zellen präsentiert, welche stimuliert werden, um Interferon-γ zu sezernieren, das seinerseits die Makrophagen aktiviert. Eine derartige Aktivierung führt zu einer erhöhten bakteriziden Fähigkeit der Zellen.
  • TH-Zellen bestehen aus mindestens zwei getrennten Subpopulationen, der TH1- und TH2-Zell-Subpopulation. Nachweise legen nahe, dass TH1- und TH2-Subtypen extrem polarisierte Populationen von TH-Zellen darstellen. Während derartige Subpopulationen ursprünglich in murinen Systemen entdeckt wurden (Review in: Mosmann, T. R. und Coffman, R. L., 1989, Ann. Rev. Immunol. 7: 145), wurde die Existenz von TH1- und TH2-ähnlichen Subpopulationen auch bei Menschen festgestellt (Del Prete, A. F. et al., 1991, J. Clin. Invest. 88: 346; Wiernenga, E. A. et al., 1990, J. Imm. 144: 4651; Yamamura, M. et al., 1991, Science 254: 277; Robinson, D. et al., 1993, J. Allergy Clin. Imm. 92: 313). Während TH1-ähnliche und TH2-ähnliche Zellen die am stärksten polarisierten TH-Zell-Subpopulationen darstellen, stellen andere TH-Zell-Subpopulationen wie THO-Zellen (Firestein, G. S. et al., 1989, J. Imm. 143: 518) TH-Zellen dar, welche Eigenschaften der TH1- und TH2-Zell-Subpopulationen aufweisen.
  • TH1-ähnliche und TH2-ähnliche Zellen scheinen als Teil der unterschiedlichen Effektorfunktionen des Immunsystems zu funktionieren (Mosmann, T. R. und Coffmann, R. L., 1989, Ann. Rev. Imm. 7: 145). Insbesondere steuern TH1-ähnliche Zellen die Entwicklung der zellvermittelten Immunität, lösen die Phagozyten-vermittelte Wirtsverteidigung aus und sind mit einer verzögerten Hypersensitivität verbunden. Demzufolge neigen Infektionen mit intrazellulären Mikroorganismen dazu, eine TH1-Typ-Antwort zu induzieren. TH2-Zellen steuern humorale Immunantworten, welche, zum Beispiel, mit der Verteidigung gegen helminthische Parasiten verbunden sind, und sind bei Antiköper- und allergischen Antworten beteiligt.
  • Es wurde festgestellt, dass die Fähigkeit der verschiedenen TH-Zelltypen, unterschiedliche Immuneffektorantworten zu steuern, in den ausschließlichen Kombinationen von Zytokinen begründet liegt, die innerhalb einer bestimmten TH-Zell-Subpopulation exprimiert werden. Zum Beispiel ist von TH1-Zellen bekannt, dass sie Interleukin-2 (IL-2), Interferon-γ (IFN-γ) und Lymphotoxin sezernieren, während TH2-Zellen Interleukin-4 (IL-4), Interleukin-5 (IL-5) und Interleukin-10 (IL-10) sezernieren.
  • Man glaubt, dass TH1- und TH2-Subpopulationen aus dem gleichen naiven Vorläufermolekül entstehen (bezeichnet als THP). Zum Beispiel können naive CD4+-Zellen aus Mäusen, welche einen einzelnen transgenen T-Zell-Rezeptor exprimieren, induziert werden, um sich entweder in den TH1- oder den TH2-Zelltyp zu entwickeln. Die Bedingungen der Antigenstimulierung, einschließlich der Art und Menge an beteiligtem Antigen, die Art der antigenpräsentierenden Zellen und die Art der anwesenden Hormon- und Zytokinmoleküle scheinen alle Determinanten des Musters von TH1- versus TH2-Differenzierung darzustellen, wobei, vielleicht, die anwesenden Zytokine die entscheidende Rolle übernehmen. Bei einer derartigen komplexen Reihe von möglichen Determinanten ist eine vollständige Erklärung der genauen Faktoren, die für die Steuerung der TH1- oder TH2-Differenzierung wichtig sind, bisher weitestgehend unbekannt.
  • Weiterhin wurde kürzlich festgestellt, dass zusätzlich zu CD4+-TH-Zellen, CD8+-ZTLs unter bestimmten Bedingungen auch TH-1-ähnliche oder TH2-ähnliche Zytokinprofile aufweisen können (Seder, R. A. et al., 1995, J. Exp. Med. 181: 5–7; Manetti, R. et al., 1994, J. Exp. Med. 180: 2407–2411; Maggi, E. et al., 1994, J. Exp. Med. 180: 489–495). Während die genaue funktionelle Rolle derartiger CD8+-TH-ähnlichen Zellen derzeit noch unbekannt ist, scheinen diese Zell-Subpopulationen eine größere Relevanz für Immunantworten gegenüber infektiösen Erregern wie Viren und intrazelluläre Parasiten zu haben.
  • Sind die TH1- und TH2-Subpopulationen einmal expandiert, neigen die Zelltypen dazu, sich gegenseitig durch die Wirkung der Zytokine, die ihnen jeweils zu Eigen sind, negativ zu regulieren. Zum Beispiel reguliert TH1-produziertes IFN-γ negativ TH2-Zellen, während TH2-produziertes IL-10 TH1-Zellen negativ reguliert. Darüber hinaus sind von TH1 und TH2 produzierte Zytokine Antagonisten der Effektorfunktion für einander (Mosmann, T. R. und Moore, 1991, Immunol. Today 12: 49).
  • Das Versagen der Kontrolle oder der Lösung eines infektiösen Prozesses resultiert oftmals eher aus einer ungeeigneten, als aus einer unzureichenden Immunantwort und dies kann einer Vielzahl von unterschiedlichen immunologischen Störungen zu Grunde liegen. Derartige Störungen können, zum Beispiel, atopische Zustände umfassen (das sind IgE-vermittelte allergische Zustände) wie Asthma, Allergie, einschließlich Rhinitis allergica, Dermatitis, einschließlich Psoriasis, pathogene Reizbarkeiten, chronische Entzündungskrankheiten, organspezifische Autoimmunität, Transplantatabstoßungen und „graft-versus-host"-Reaktionen. Zum Beispiel resultieren nichtheilende Formen von humaner und muriner Leishmaniasis aus starken aber kontraproduktiven TH2-ähnlich dominierten Immunantworten. Lepromatöse Lepra scheint sich auch durch eine prävalente, aber ungeeignete, TH2-ähnliche Antwort auszuzeichnen.
  • Möglicherweise kann ein anderes Beispiel die HIV-Infektion sein. Hier wurde vorgeschlagen, dass ein Absinken des Verhältnisses von TH1-ähnlichen Zellen zu anderen TH-Zell-Subpopulationen eine kritische Rolle beim Fortschreiten zu Krankheitssymptomen spielen kann. Weiterhin wurde festgestellt, dass zumindest in vitro, TH2-ähnliche Klone effizientere Unterstützer der HIV-viralen Replikation zu sein scheinen als TH1-ähnliche Klone.
  • Weiterhin sind, während TH1-vermittelte Entzündungsantworten auf viele pathogene Mikroorganismen vorteilhaft sind, derartige Antworten auf Selbstantigene gewöhnlich schädlich. Es wurde vorgeschlagen, dass die bevorzugte Aktivierung von TH1-ähnlichen Antworten im Mittelpunkt der Pathogenese derartiger humaner entzündlicher Immunerkrankungen wie Multipler Sklerose und insulinabhängiger Diabetes steht. Zum Beispiel herrschen TH1-Typ-Zytokine in der zerebrospinalen Flüssigkeit von Patienten mit Multipler Sklerose, in Bauchspeicheldrüsen von Patienten mit insulinabhängiger Diabetes, den Schilddrüsen bei Hashimoto-Thyreoiditis, dem Darm bei Patienten mit Morbus Crohn vor, was darauf hindeutet, dass derartige Patienten eine TH1-ähnliche und keine TH2-ähnliche Antwort auf das/die bei der Äthiopathogenese derartiger Störungen beteiligte(n) Antigen(e) in Gang setzen.
  • Ein primäres Ziel sowohl aus diagnostischen wie auch therapeutischen Gründen wäre daher die Fähigkeit, Elemente einer bestimmten TH-Zell-Subpopulation zu identifizieren, zu isolieren und/oder sie anzusteuern. Die Fähigkeit solche Gene zu identifizieren, welche innerhalb und/oder unter einer solchen TH-Zell- Subpopulation differenziell exprimiert werden, wird benötigt, um ein derartiges Ziel zu erreichen. Bisher waren Untersuchungen auf die Expression einer begrenzten Anzahl an spezifisch bekannten Zytokinen und Zytokinrezeptoren in der TH-Zellpopulation gerichtet. Zytokine üben jedoch Wirkungen zusätzlich zu spezifischen TH-Zell-Subpopulationen auf Zelltypen auf, das heißt, sie zeigen eine Vielzahl von pleiotropen Wirkungen. Daher wäre es von Vorteil, verlässliche Marker (z.B. Gensequenzen) von TH-Zell-Subpopulationen zu identifizieren, deren Wirkungen spezifisch für TH-Zell-Subpopulationen sind, z.B. welche, anders als sezernierte Zytokine, spezifisch für TH-Zellensubpopulationen sind.
  • Lederer et al. (J. Immunol. 1994, vol. 152, 77–86) haben die Expression von Promoter-CAT-Konstrukten gemessen, um zu zeigen, dass die differentielle Expression von IL-2 und IL-4 in TH1- und TH2-Zellen transkriptorisch kontrolliert ist und verbanden den Mangel an IL-2-Transkription in aktivierten TH2-Zellen mit einem Versagen, IL-2-Genpromoter-bindende Proteine zu erzeugen, insbesondere NF-kappa-B im Zellkern. Ramsdell et al. (Int. Immunol. 1994, vol. 6, 1545–1553) haben gezeigt, dass geklonte TH1-Zellen hohe Spiegel an Fas-L exprimieren, dem Liganden für Fas (CD95), während geklonte TH1-Zellen geringe Spiegel exprimieren. Diese Expressionsspiegel sind mit einer relativen Fähigkeit der TH1- und TH2-Zelltypen korreliert, einen aktivierungsinduzierten Zelltod zu erleiden, der nicht mit der Gegenwart von verschiedenen Zytokinen einherzugehen scheint.
  • 3. Zusammenfassung der Erfindung
  • Die vorliegende Erfindung betrifft Verfahren und Zusammensetzungen für die Behandlung von Immunstörungen, insbesondere von mit T-Helfer-(TH)-Zellen und TH-ähnlichen Zellen verbundenen Störungen. Zunächst werden Gene identifiziert und beschrieben, welche innerhalb und unter TH-Zellen und TH-Zell-Subpopulationen differenziell exprimiert werden. Als nächstes werden Gene identifiziert und beschrieben, welche innerhalb von TH-Zell-Subpopulationen bei mit TH-Zell-Subpopulationen verbundenen Störungen differenziell exprimiert werden. Die Veränderung der Expression der identifizierten Gene und/oder der Aktivität der identifizierten Genprodukte kann therapeutisch genutzt werden, um die Symptome von Immunstörungen zu verbessern und die Reaktionsfähigkeit der TH-Zellen, zum Beispiel die Reaktionsfähigkeit auf Antigene, zu verändern. Weiterhin können die identifizierten Gene und/oder Genprodukte verwendet werden, um Individuen, die derartige Immunstörungen zeigen oder dafür prädisponiert sind, zu diagnostizieren. Und weiterhin können die identifizierten Gene und/oder Genprodukte verwendet werden, um die Reaktionsfähigkeit der TH-Zellen, zum Beispiel, die Reaktionsfähigkeit auf Antigene, zu detektieren.
  • „Differenzielle Expression", wie hier verwendet, bezeichnet sowohl die quantitativen wie auch die qualitativen Unterschiede bei den temporalen und/oder zellulären Expressionsmustern der Gene innerhalb und unter der TH-Zell-Subpopulation. Differenziell exprimierte Gene können „Fingerprintgene" und/oder „Zielgene" darstellen.
  • „Fingerprintgen", wie hier verwendet, bezeichnet ein differenziell exprimiertes Gen, dessen Expressionsmuster als Teil einer prognostischen oder diagnostischen Untersuchung von Immunstörungen, z.B. mit TH-Zellen verbundene Störungen, genutzt werden kann oder das, alternativ, in Verfahren zur Identifizierung von Verbindungen verwendet wird, die für die Behandlung von derartigen Störungen nützlich sind. Zum Beispiel kann die Wirkung einer Verbindung auf die Fingerprintgenexpression, die normalerweise zusammen mit der Störung auftritt, verwendet werden, um die Effizienz der Verbindung als Behandlung für eine derartige Störung zu untersuchen, oder kann, zusätzlich, verwendet werden, um Patienten zu überwachen, die sich einer klinischen Untersuchung für die Behandlung derartiger Störungen unterziehen.
  • „Fingerprintmuster", wie hier verwendet, bezeichnet das Muster, dass erzeugt wird, wenn das Expressionsmuster einer Reihe (welche zwischen zwei und bis zu allen Fingerprintgenen reichen kann, die für einen gegebenen Zustand existieren) von Fingerprintgenen bestimmt wird. Ein Fingerprintmuster kann bei den gleichen diagnostischen, prognostischen und verbindungsidentifizierenden Verfahren als Expression eines einzelnen Fingerprintgens verwendet werden.
  • „Zielgen", wie hier verwendet, bezeichnet ein differenziell exprimiertes Gen, das an Immunstörungen beteiligt ist, z.B. an mit TH-Zellen verbundenen Störungen, so dass die Veränderung des Spiegels an Zielgenexpression oder der Wirkung eines Zielgenprodukts so wirken kann, dass die Immunstörung verbessert wird. Verbindungen, welche die Zielgenexpression oder Aktivität des Zielgenprodukts verändern, können bei der Behandlung von Immunstörungen verwendet werden.
  • Weiterhin sind „Pathwaygene" über ihre Fähigkeit ihrer Genprodukte definiert, mit Genprodukten zu wechselwirken, die an TH-Zell-Subpopulation verbundenen Immunstörungen beteiligt sind, und/oder mit Genprodukten zu wechselwirken, die an der Differenzierung und der Effektorfunktion der TH-Zell-Subpopulation beteiligt sind. Pathwaygene können auch Zielgen- und/oder Fingerprintgen-Eigenschaften aufweisen.
  • Obwohl die hier beschriebenen Ziel-, Fingerprint- und/oder Pathwaygene innerhalb und unter TH-Zell-Subpopulationen differenziell exprimiert werden und/oder mit TH-Zell-Subpopulationsgenprodukten wechselwirken können, können die Gene auch an Mechanismen beteiligt sein, die für weitere Immunprozesse wichtig sind.
  • Die Erfindung schließt die folgenden Nucleotide, derartige Nucleotide exprimierende Wirtszellen und die Expressionsprodukte derartiger Nucleotide mit ein: (a) Nucleotide, die ein bei Säugetieren differenziell exprimiertes 200-Genprodukt, einschließlich eines humanen und murinen 200-Genprodukts kodieren; (b) Nucleotide, die Teile von differenziell exprimierten und/oder Pathway-200-Genprodukten kodieren, die dessen Funktionsdomäne entsprechen, und die Polypeptidprodukte, die von derartigen Nucleotidsequenzen kodiert werden, und in welchen, im Falle von Rezeptortyp-Genprodukten, derartige Domänen extrazelluläre Domänen (ECD), transmembrane Domänen (TM) und zytoplasmatische Domänen (CD) umfassen, aber nicht darauf beschränkt sind; (c) Nucleotide, die Mutanten eines differenziell exprimierten 200-Genprodukt kodieren, in welchem alle oder Teile von einer seiner Domänen entfernt oder verändert wurden, und welche, im Falle von Rezeptortyp-Genprodukten solche Mutanten mit löslichen Rezeptoren umfassen, aber nicht darauf beschränkt sind, in welchen alle oder ein Teil der TM entfernt wurden, und nichtfunktionelle Rezeptoren, in welchen alle oder Teile der CD entfernt wurden; und (d) Nucleotide, die Fusionsprotein kodieren, die ein differenziell exprimiertes 200-Genprodukt enthalten oder bei dem eine seiner Domänen mit einem anderen Polypeptid verschmolzen ist.
  • Die vorliegende Erfindung umfasst auch Produkte derartiger Fingerprint-, Ziel- und Pathwaygene wie auch die Antikörper derartiger Genprodukte. Weiterhin werden auch die Veränderung und Verwendung von Zell- und tierbasierten Modellen von mit TH-Zell-Subpopulation verbundenen Störungen, zu denen derartige Genprodukte beitragen können, beschrieben.
  • Die vorliegende Erfindung betrifft auch Verfahren zur prognostischen und diagnostischen Untersuchung von verschiedenen mit einer TH-Zell-Subpopulation verbundenen Störungen und für die Identifizierung von Patienten, die für solche Störungen prädisponiert sind.
  • Weiterhin stellt die Erfindung Verfahren zur Untersuchung der Effizienz von Wirkstoffen für Immunstörungen und die Überwachung des Fortschritts bei Patienten, die an klinischen Studien über die Behandlung derartiger Störungen beteiligt sind, bereit.
  • Die hier beschriebenen mit TH-Zell-Subpopulationen verbundenen Störungen können, zum Beispiel, mit TH1- oder TH1-ähnlich verbundene Störungen umfassen oder können, alternativ, mit TH2- oder TH2-ähnlich verbundene Störungen umfassen. Beispiele für mit TH1- oder TH1-ähnlich verbundene Störungen umfassen chronische Entzündungskrankheiten und Störungen wie Morbus Crohn, reaktive Arthritis einschließlich Lyme-Borreliose, insulin-abhängige Diabetes, organspezifische Autoimmunität einschließlich Multipler Sklerose, Hashimoto-Thyreoiditis und Morbus Basedow, Kontaktdermatitis, Psoriasis, Transplantatabstoßung, „Graft-versus-host"-Reaktionen und Sarkoidose. Beispiele für mit TH2- oder TH2-ähnlich verbundene Störungen umfassen atopische Zustände wie Asthma und Allergie, einschließlich Rhinitis allergica, gastrointestinale Allergien, einschließlich Lebensmittelallergien, Eosinophilie, Konjunktivitis, Glomerulonephritis, bestimmten pathogenen Empfindlichkeiten wie helminthischen (z.B. Leishmaniasis) und bestimmten viralen Infektionen, einschließlich HIV, und bakteriellen Infektionen, einschließlich Tuberkulose und lepromatöser Lepra.
  • Weiterhin werden Betrachtungen darüber angestellt, dass hier beschriebene Verfahren und Zusammensetzungen bei der prognostischen und diagnostischen Untersuchung von Störungen genutzt werden können, die andere Immunzellen, einschließlich CD8+-ZTLs, beteiligen, die ein TH-ähnliches Zell-Subpopulationsgenexpressionsmuster und/oder -aktivität aufweisen. Und weiterhin werden Betrachtungen darüber angestellt, dass hier beschriebene Verfahren und Zusammensetzungen zur Verbesserung von Symptomen genutzt werden können, die aus Störungen stammen, an denen derartige Immunzellen, einschließlich solche wie CD8+-ZTLs, beteiligt sind, die ein TH-ähnliches Zell-Subpopulationsgenexpressionsmuster und/oder -aktivität aufweisen.
  • Die Erfindung stellt weiterhin Verfahren zur Identifizierung von Verbindungen bereit, welche die Expression von Genen oder die Aktivität von Genprodukten anpassen, die an mit TH-Zell-Subpopulationen verbundenen Störungen und Prozessen beteiligt sind, die bei der Differenzierung, Aufrechterhaltung und/oder Effektorfunktion der Subpopulationen relevant sind. Und weiterhin stellt die vorliegende Erfindung Verfahren zur Behandlung von mit TH-Zell-Subpopulationen verbundenen Störungen bereit, welche, zum Beispiel, die Verwaltung von solchen angepassten Verbindungen bei Individuen beteiligen können, die Symptome oder Neigungen zu mit TH-Zell-Subpopulationen verbundenen Störungen aufweisen. Zusätzlich kann die Behandlung zur Stimulierung oder Entleerung von einer oder mehreren der TH-Zell-Subpopulationen führen.
  • „Stimulierung", wie hier verwendet, kann eine effiziente Zunahme der Anzahl von Zellen bezeichnen, die zu einer TH-Zell-Subpopulation gehören, über, zum Beispiel, die Proliferation von derartigen TH-Zell-Subpopulationszellen. Der Begriff kann auch eine Zunahme der Aktivität von zu einer TH-Zell-Subpopulation gehörenden Zellen bezeichnen, wie zum Beispiel durch eine Pro-Zelle-Zunahme bei der Expression des für die TH-Zell-Subpopulation spezifischen Zytokinmusters nachgewiesen würde.
  • „Entleerung", wie hier verwendet, kann eine effiziente Verminderung der Anzahl von Zellen bezeichnen, die zu einer TH-Zell-Subpopulation gehören, über, zum Beispiel, eine Verminderung der Proliferation von derartigen TH-Zell-Subpopulationszellen. Der Begriff kann auch eine Abnahme der Aktivität von zu einer TH-Zell-Subpopulation gehörenden Zellen bezeichnen, wie zum Beispiel durch eine Pro-Zelle-Abnahme bei der Expression des für die TH-Zell-Subpopulation spezifischen Zytokinmusters nachgewiesen würde.
  • Die Erfindung basiert, zum Teil auf systematischen Suchstrategien, die Musterbeispiele beteiligen, die TH0, TH1, TH2, TH1-ähnliche und TH2-ähnliche Zellen nutzen, in Systemen, welche die Aktivität des Immunsystems oder Immunstörungen nachahmen, gekoppelt mit sensitiven und Hochdurchsatz-Genexpressionsassays, um Gene zu identifizieren, die innerhalb und/oder unter TH-Zell-Subpopulationen differenziell exprimiert wurden. Im Gegensatz zu Ansätzen, bei denen nur die Expression eines einzigen bekannten Genprodukts untersucht wird, von dem man annimmt, dass es bei einigen mit Immunzellen verbundenen Prozessen oder Störungen eine Rolle spielt, ermöglichen die hier verwendeten Suchstrategien und Assays die Identifizierung aller Gene, egal ob bekannt oder neu, welche innerhalb und unter TH-Zell-Subpopulationen differenziell exprimiert werden, und dabei auch die Charakterisierung ihrer temporären Regulierung und Funktion bei der TH-Zellantwort und/oder bei TH-Zell-vermittelten Störungen möglich macht. Dieser umfassende Ansatz und die Untersuchung ermöglichen die Entdeckung neuer Gene und Genprodukte, wie auch die Identifizierung eine Konstellation von Genen und Genprodukten (egal ob neu oder bekannt), die in neuen Stoffwechselwegen (z.B. Anpassungsstoffwechselwege) beteiligt sind, die eine wesentliche Rolle bei TH-Zell-vermittelten Immunantworten und mit TH-Zell-Subpopulation verbundenen Störungen spielen. So ermöglicht die vorliegende Erfindung die Identifizierung und Charakterisierung von Zielen, die für Prognose, Diagnose, Überwachung, rationales Wirkstoffdesign und/oder einer therapeutischen Intervention von Immunsystemstörungen nützlich sind.
  • Die in den folgenden Abschnitten 6 bis 8 beschriebenen Beispiele zeigen die erfolgreiche Verwendung von Suchstrategien dieser Erfindung zur Identifizierung von Genen, welche unter und/oder innerhalb von TH-Zell- Subpopulationen differenziell exprimiert werden. Abschnitt 9 beschreibt das erfolgreiche Klonen von humanen Homologen von einem der identifizierten Gene (das 200-Gen).
  • Es wird nachgewiesen, dass das murine 200-Gen innerhalb der TH1-Zell-Subpopulation differenziell exprimiert wird. Insbesondere wird dieses Gen in Spiegeln exprimiert, die in TH1-Zell-Subpopulationen um ein vielfaches höher liegen als in TH2-Zell-Subpopulationen.
  • Eine Ausführungsform „C1" der vorliegenden Erfindung ist ein isoliertes Nucleinsäuremolekül, umfassend:
    • (a) die Nucleotidsequenz von SEQ ID NO: 8 oder SEQ ID NO: 23;
    • (b) eine Nucleotidsequenz, welche ein Polypeptid kodiert, umfassend die Aminosäurensequenz, die durch den cDNA-Einschub des Klons codiert wird, der in den Klonen von E. coli enthalten ist, die unter der American Type Culture Collection (ATCC) Accession Number 69967, der Agricultural Research Service Culture Collection (NRRL) Accession Number B-21395, der NRRL Accession Number B-21415, oder der NRRL Accession Number B-21457 hinterlegt sind, wobei genannter cDNA-Einschub unter stringenten Bedingungen „S" an ein Nucleinsäuremolekül hybridisiert, das ein Komplement einer Nucleinsäure mit der Nucleotidsequenz SEQ ID NO: 8 oder SEQ ID NO: 23 ist, und wobei genannte stringente Bedingungen „S" die Hybridisierung an filtergebundene DNA in 0,5 M NaHPO4, 7% Natriumlaurylsulfat (SDS), 1 mM EDTA bei 65°C, und Waschen in 0,1 × SSC/0,1% SDS bei 68°C umfassen; oder
    • (c) eine Nucleotidsequenz, welche ein Polypeptid kodiert, umfassend die Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 10 oder SEQ ID NO: 24.
  • Eine weitere Ausführungsform „C2" der vorliegenden Erfindung ist ein isoliertes Nucleinsäuremolekül, umfassend eine Nucleotidsequenz, welche mindestens eine der folgenden Peptiddomänen kodiert, die in 17 (SEQ ID NO: 10) oder 24 (SEQ ID NO: 24) abgebildet sind: (a) Signalsequenzdomäne, (b) extrazelluläre Domäne, (c) gereifte extrazelluläre Domäne, (d) variable SET-Domäne vom Ig-Typ, (e) transmembrane Domäne oder (f) zytoplasmatische Domäne.
  • Eine weitere Ausführungsform „C5" der vorliegenden Erfindung ist ein isoliertes Nucleinsäuremolekül, welches unter stringenten Bedingungen „S" (beschrieben unter Ausführungsform „C1" (b)) an das Nucleinsäuremolekül nach Ausführungsform „C1" (a) oder Ausführungsform „C1" (b) oder an sein Komplement hybridisiert, wobei die Waschbedingungen gegebenenfalls 0,2 × SSC/0,1% SDS bei 42°C sein können.
  • Eine weitere Ausführungsform „C6" der vorliegenden Erfindung ist eine isolierte Nucleotidsequenz, welche ein Polypeptid kodiert, welchem mindestens eine der folgenden Peptiddomänen fehlt, die in 17 (SEQ ID NO: 10) oder 24 (SEQ ID NO: 24) abgebildet sind: (a) Signalsequenzdomäne, (b) extrazelluläre Domäne, (c) gereifte extrazelluläre Domäne, (d) variable SET-Domäne vom Ig-Typ, (e) transmembrane Domäne oder (f) zytoplasmatische Domäne, wobei das Polypeptid durch eine Nucleinsäure nach Anspruch 1 oder einem Teil davon kodiert wird.
  • Eine weitere Ausführungsform „C9" der vorliegenden Erfindung ist ein isoliertes Nucleinsäuremolekül, umfassend eine Nucleotidsequenz, die ein Fusionsprotein kodiert, welches das Nucleinsäuremolekül aus einem der Ausführungsformen „C1", „C2", „C5" oder „C6" und ein heterologes Polypeptid umfasst.
  • Eine weitere Ausführungsform „C11" der vorliegenden Erfindung ist ein Vektor, umfassend ein Nucleinsäuremolekül aus irgendeiner der Ausführungsformen „C1", „C2", „C5", „C6" oder „C9". Weitere Ausführungsformen „C13" und „C14" sind, jeweils, eine Wirtszelle, umfassend den Vektor aus Ausführungsform „C11" oder eine genetisch veränderte Wirtszelle, welche die Nucleinsäuresequenz aus irgendeiner der Ausführungsformen „C1", „C2", „C5", „C6" oder „C9" enthält. Eine Ausführungsform „C15" ist die Wirtszelle aus Ausführungsform „C14" in operativer Einheit mit einem Regulierungselement für die Nucleotidsequenz, welche die Expression der Nucleotidsequenz in der Wirtszelle kontrolliert.
  • Eine weitere Ausführungsform „C16" der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung eines Polypeptids, das durch die Nucleinsäure aus irgendeiner der Ausführungsformen „C1", „C2", „C5", „C6" oder „C9" kodiert wird, umfassend: Kultivieren der Wirtszelle aus Ausführungsform „C13", „C14" oder „C15", so dass das Polypeptid in der Zellkultur exprimiert wird, und Gewinnung des Polypeptids aus der Zellkultur.
  • Eine weitere Ausführungsform „C17" der vorliegenden Erfindung ist ein isoliertes Polypeptid, umfassend: (a) die Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 10 oder SEQ ID NO: 24; (b) die Aminosäuresequenz, die durch die Nucleotidsequenz von SEQ ID NO: 8 oder SEQ ID NO: 23 kodiert wird; oder (c) die Aminosäuresequenz, die durch den oben unter Ausführungsform „C1" (b) beschriebenen cDNA-Einschub kodiert wird.
  • Eine weitere Ausführungsform „C18" der vorliegenden Erfindung ist ein isoliertes Polypeptid, umfassend: (a) SEQ ID NO: 10 Aminosäurereste 1–20, 1–192, 1–214, 21–192, 21–214, 21–281, 193–214, 193–281 und/oder 215–281; und/oder (b) SEQ ID NO: 24 Aminosäurereste 1–20, 1–200, 1–224, 21–200, 21–224, 21–301, 30–128, 201–224, 201–301, 225–301.
  • Eine weitere Ausführungsform „C21" der vorliegenden Erfindung ist ein isoliertes Polypeptid, welches durch ein Nucleinsäuremolekül kodiert wird, das unter stringenten Bedingungen „S" (beschrieben unter Ausführungsform „C1" (b)) an das Komplement der Nucleotidsequenz hybridisiert, welches die Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 10 oder SEQ ID NO: 24 kodiert.
  • Eine weitere Ausführungsform „C22" der vorliegenden Erfindung ist ein Fusionsprotein, umfassend das Polypeptid aus irgendeiner der Ausführungsformen „C17", „C18" oder „C21" und einem unverbundenen Polypeptid.
  • Eine weitere Ausführungsform „C24" der vorliegenden Erfindung ist ein Antikörper oder Epitop-bindendes Fragment davon, welches spezifisch an das Polypeptid aus irgendeiner der Ausführungsformen „C17", „C18" oder „C21" bindet.
  • Eine weitere Ausführungsform „C30" der vorliegenden Erfindung ist eine pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend den Antikörper oder das Epitop-bindende Fragment davon nach Ausführungsform „C24" und ein physiologisch zulässiger Träger.
  • Eine weitere Ausführungsform „C31" der vorliegenden Erfindung ist ein Antikörperfusionspolypeptid, umfassend eine Antikörper-Fc-Domäne, die verbunden ist mit (a) der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 10 oder SEQ ID NO: 24, oder der Aminosäuresequenz, die durch den oben unter Ausführungsform „C1" (b) beschriebenen cDNA-Einschub kodiert wird, Aminosäurereste 1–20, 1–200, 1–224, 21–200, 21–224, 21–301, 30–128, 201–224, 201–301 und/oder 225–301 von SEQ ID NO: 24 kodiert werden, oder (c) den Aminosäureresten 1–20, 1–192, 1–214, 21–192, 21–214, 21–281, 193–214, 193–281 und/oder 215–281 von SEQ ID NO: 10.
  • Eine weitere Ausführungsform „C32" der vorliegenden Erfindung ist ein Antikörperfusionspolypeptid, umfassend eine Antikörper-Fc-Domäne, die mit einer Aminosäuresequenz verbunden ist, welche durch ein Nucleinsäuremolekül kodiert wird, das unter stringenten Bedingungen „S" (beschrieben unter Ausführungsform „C1" (b)) an das Komplement der Nucleotidsequenz bestehend aus SEQ ID NO: 8 oder SEQ ID NO: 23 hybridisiert.
  • Eine weitere Ausführungsform „C35" der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Detektion einer 200-Genexpression in einer Probe, umfassend: Detektion der Anwesenheit eines 200-Genprodukt oder einem RNA-Molekül, welches das 200-Genprodukt kodiert, wobei das 200-Genprodukt umfasst: (a) die Aminosäuresequenz, die unter Ausführungsform „C17"(a), „C17"(b) oder „C17"(c) beschrieben wird; (b) die Aminosäurereste, die unter „C18" (a) oder „C18"(b) beschrieben werden, oder (c) eine Aminosäuresequenz, die durch die Nucleotidsequenz kodiert wird, welche unter stringenten Bedingungen „S" (beschrieben unter Ausführungsform „C1" (b)) an (i) das Komplement der Nucleotidsequenz von SEQ ID NO: 8 oder eines Teiles davon, oder (ii) an das Komplement der Nucleotidsequenz von SEQ ID NO: 23 oder eines Teiles davon hybridisiert.
  • Eine weitere Ausführungsform „C40" der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Diagnose einer mit einer TH-Zell-Subpopulation verbundenen Störung, umfassend die Detektion in einer Probe aus einem Patienten, bei dem eine derartige Störung vermutet wird, des Spiegels an 200-Genprodukt oder an RNA-Molekülen, welche das 200-Genprodukt kodieren, so dass, wenn der detektierte Spiegel sich von dem der Kontrollprobe unterscheidet, eine mit einer TH-Zell-Subpopulation verbundene Störung diagnostiziert wird, wobei das 200-Genprodukt ist:
    • (a) die Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 24;
    • (b) die Aminosäuresequenz, die durch die Nucleotidsequenz von SEQ ID NO: 23 kodiert wird;
    • (c) die Aminosäuresequenz, die durch den oben unter Ausführungsform „C1"(b) beschriebenen cDNA-Einschub kodiert wird;
    • (d) Aminosäurereste 1–20, 1–200, 30–128, 201–224 oder 225–301 von SEQ ID NO: 24; oder
    • (e) eine Aminosäuresequenz, die durch die Nucleotidsequenz kodiert wird, welche unter stringenten Bedingungen „S" (beschrieben unter Ausführungsform „C1" (b)) an das Komplement der Nucleotidsequenz von SEQ ID NO: 23 hybridisiert.
  • Eine weitere Ausführungsform „C46" der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Identifizierung einer Testverbindung, die an ein 200-Genprodukt bindet und/oder die Aktivität des 200-Genprodukts anpasst, umfassend:
    • (a) In-Kontakt-Bringen einer Testverbindung mit einem 200-Genprodukt für eine Zeit, die ausreicht, an das Produkt gebunden zu werden und einen 200- Genprodukt/Verbindungs-Komplex zu bilden;
    • (b) Entfernen ungebundener Testverbindung; und
    • (c) Detektion des Komplexes, in welchem das 200-Genprodukt umfasst:
    • (i) die Aminosäuresequenz, die oben unter Ausführungsform „C17"(a) „C17"(b) oder „C17"(c) beschrieben wird;
    • (ii) die Aminosäuresequenz, die durch eine Nucleotidsequenz kodiert wird, welche unter stringenten Bedingungen „S" (beschrieben oben unter Ausführungsform „C1" (b)) an das Komplement der Nucleotidsequenz von SEQ ID NO: 8 oder SEQ ID NO: 23 hybridisiert; oder
    • (iii) die Aminosäuresequenz, die durch die Nucleotidsequenz kodiert wird, welche unter stringenten Bedingungen „S" (beschrieben oben unter Ausführungsform „C1" (b)) an das Komplement des oben unter Ausführungsform „C1"(b) beschriebenen cDNA-Einschubs hybridisiert, so dass, wenn ein(e) 200-Genprodukt/Verbindung in (c) detektiert wird, eine an das 200-Genprodukt bindende Testverbindung identifiziert wird.
  • Die Identifizierung von spezifischen Markern für die TH-Zell-Subpopulation kann bei der Behandlung einer Anzahl an Immunstörungen genutzt werden, insbesondere bei mit TH-Zell-Subpopulationen verbundenen Störungen. Zum Beispiel, können Marker für die TH2-Subpopulation verwendet werden, um Zustände zu verbessern, die an einer ungeeigneten IgE-Immunantwort beteiligt sind, einschließlich, aber nicht begrenzt auf, Symptome, die atopische Zustände wie Allergie und/oder Asthma begleiten. IgE-Typ-Antikörper werden durch stimulierte B-Zellen produziert, welche, zumindest teilweise, von der TH2-Zell-Subpopulation produziertes IL-4 benötigen. Daher wird eine Behandlung, welche die effektive Konzentration an sezerniertem IL-4, z.B. durch Verminderung der Aktivität oder der Anzahl an TH2-Zellen vermindert, eine Verminderung des Spiegels von zirkulierendem IgE herbeiführen, was dann wieder zu einer Verbesserung oder Beseitigung der atopischen Zustände führt. Jegliche der hier beschriebenen TH2-spezifischen Genprodukte kann daher als Ziel verwendet werden, um die Anzahl und/oder die Aktivität von TH2-Zell-Subpopulationszellen für die Behandlung derartiger Zustände zu vermindern oder zu beseitigen.
  • Die Identifizierung von spezifischen Markern für die TH-Zell-Subpopulation kann zusätzlich bei der Behandlung von mit der TH1-Zell-Subpopulation verbundenen Störungen genutzt werden. Zum Beispiel, können Marker für die TH1-Zell-Subpopulation verwendet werden, um Zustände zu verbessern, die an einer ungeeigneten zellvermittelten Immunantwort beteiligt sind, einschließlich, aber nicht begrenzt auf, chronische entzündliche und Autoimmunstörungen. Weiterhin können transgene Tiere, die derartige Gensequenzen überexprimieren oder fehlexprimieren, und/oder transgene „Knockout"-Tiere, welche nur eine geringe oder gar keine Expression einer derartigen Sequenz aufweisen, als Tiermodelle für mit TH-Zell-Subpopulationen verbundenen Störungen verwendet werden. Das weiter unten in Abschnitt 11 präsentierte Beispiel, beschreibt die Herstellung von 200-Gen-transgenen Tieren.
  • TH1-Zell-Subpopulations spezifische Gensequenzen und/oder Genprodukte wie das 200-Gen (dessen murines Homolog ein transmembranes Genprodukt mit 280 Aminosäuren kodiert, dessen humanes Homolog ein transmembranes Genprodukt mit 301 Aminosäuren kodiert, und von denen beide Mitglieder der Ig-Superfamilie sind) kann daher für eine Verbesserung derartiger mit TH1-Zell-Subpopulationen verbundenen Störungen geeignet sein. Das 200-Genprodukt kann insbesondere für einen solchen Zweck geeignet sein, bei dem es nicht nur auf die TH1-Zell-Subpopulation beschränkt ist, sondern das Ig-Superfamilien-200-Genprodukt ist außerdem membrangebunden. Daher können natürliche Liganden, Derivate von natürlichen Liganden und Antikörper, welche an das 200-Genprodukt binden, genutzt werden, um die Anzahl von anwesenden TH1-Zellen zu vermindern, entweder durch physikalische Trennung derartiger Zellen von anderen Zellen in einer Population, oder, alternativ, durch Lenken der spezifischen Zerstörung von TH1-Zellen oder Inhibierung der Proliferation derartiger TH1-Zellen. Zusätzlich können Verbindungen wie 200-Gensequenzen oder Genprodukte wie lösliche 200-Genprodukte genutzt werden, um den Spiegel an TH2-Zellaktivität zu vermindern und so eine Verbesserung der mit TH1-Zell-Subpopulationen verbundenen Störungen herbeizuführen. Zum Beispiel können die Verbindungen mit dem endogenen (d.h. dem natürlichen) Liganden für das 200-Genprodukt kompetitieren. Die resultierende Verminderung der Menge an Liganden gebundenem 200-Gen-Transmembranprotein wird die TH2-Zellaktivität anpassen. Lösliche Proteine oder Peptide des 200-Genprodukts, wie die extrazelluläre Domäne umfassende Peptide, oder Teile (wie, zum Beispiel, der Ig-Teil) und/oder Analoga davon, einschließlich, zum Beispiel von Fusionsproteinen wie Fusionsproteine mit einem Ig-Schwanz, können insbesondere für diesen Zweck von Nutzen sein. Das weiter unten in Abschnitt 10 präsentierte Beispiel beschreibt die Konstruktion und Expression von 200-Genprodukt-Ig-Fusionskonstrukten und -proteinen.
  • 3.1 Definitionen
  • Der Begriff „TH-Zell-Subpopulation", wie hier verwendet, bezeichnet eine Population von TH-Zellen, welche ein Genexpressionsmuster (z.B. ein einzelnes Muster von Zytokinen und/oder Rezeptoren oder anderen Zelloberflächenmolekülen) und Aktivität, die sich von dem Expressionsmuster unterscheidet, und eine Aktivität von anderen TH-Zellen aufweisen. Derartige TH-Zell-Subpopulationen können TH0-, TH1- und TH2-Subpopulationen umfassen, sind aber nicht darauf beschränkt, und diese werden, zur Verdeutlichung und als Beispiel, und nicht zur Einschränkung, hier häufig als repräsentative TH-Zell-Subpopulationen verwendet werden.
  • Der Begriff „TH-ähnliche Zell-Subpopulation", (z.B. „TH1-ähnlich" oder „TH2-ähnlich"), wie hier verwendet, soll nicht nur eine Population von CD4+-TH-Zellen mit den oben beschriebenen Eigenschaften für eine TH-Zell-Subpopulation bezeichnen, sondern auch CD4+-Zellen, einschließlich CD8+-ZTLs, bezeichnen, welche ein TH-ähnliches Zytokinexpressionsmuster aufweisen.
  • „Differenzielle Expression", wie hier verwendet, bezeichnet sowohl die quantitativen wie auch die qualitativen Unterschiede bei den temporalen und/oder zellulären Expressionsmustern der Gene.
  • „Zielgen", wie hier verwendet, bezeichnet ein differenziell exprimierte Gen, das an Immunstörungen und/oder an der Differenzierung, Aufrechterhaltung und/oder Effektorfunktion von TH-Zell-Subpopulationen beteiligt ist, so dass die Veränderung des Spiegels an Zielgenexpression oder an Gegenwart und/oder Aktivität eines Zielgenprodukts, zum Beispiel, so wirken kann, dass eine spezifische Entleerung oder Unterdrückung, oder, alternativ, die Stimulierung und Erhöhung von einer oder mehrerer TH-Zell-Subpopulationen resultiert, was dann wieder zu einer Verbesserung der Symptome der Immunstörungen, z.B. mit TH-Zell-Subpopulationen verbundenen Störungen, führt. Ein Zielgen kann auch Fingerprint- und/oder Pathwaygeneigenschaften aufweisen.
  • „Fingerprintgen", wie hier verwendet, bezeichnet ein differenziell exprimiertes Gen, dessen mRNA-Expressionsmuster, Proteinspiegel und/oder Aktivität als Teil einer prognostischen oder diagnostischen Untersuchung von Immunstörungen, z.B. mit TH-Zellen verbundene Störungen genutzt werden kann, oder das, alternativ, in Verfahren zur Identifizierung von Verbindungen verwendet werden kann, die für die Behandlung von derartigen Störungen nützlich sind, z.B. durch Untersuchung der Wirkung der Verbindung auf die Fingerprintgenexpression, die normalerweise in Verbindung mit der Störung gezeigt wird. Ein Fingerprintgen kann auch Zielgen- und/oder Pathwaygeneigenschaften aufweisen.
  • „Fingerprintmuster", wie hier verwendet, bezeichnet das Muster, dass erzeugt wird, wenn das mRNA-Expressionsmuster, der Proteinspiegel und/oder die Aktivität einer Reihe (welche zwischen zwei bis zu allen Fingerprintgenen reichen kann, die für einen gegebenen Zustand existieren) von Fingerprintgenen bestimmt wird. Ein Fingerprintmuster kann ein Teil der gleichen, weiter oben für die Expression eines einzelnen Fingerprintgens beschriebenen Verfahren sein. „Pathwaygen", wie hier verwendet, bezeichnet ein Gen, dessen Produkt eine Fähigkeit aufweist, mit Genprodukten zu wechselwirken, die an Immunstörungen, z.B. an mit TH-Zell-Subpopulationen verbundenen Störungen, beteiligt sind, und/oder mit Genprodukten zu wechselwirken, die an der Differenzierung und der Effektorfunktion von TH-Zell-Subpopulationen beteiligt sind. Pathwaygene können auch Zielgen- und/oder Fingerprintgeneigenschaften aufweisen.
  • "Negative Anpassung", wie hier verwendet, bezeichnet eine Verminderung des Spiegels und/oder der Aktivität von Zielgenprodukt in Bezug auf den Spiegel und/oder die Aktivität des Zielgenprodukts in Abwesenheit einer anpassenden Behandlung. Alternativ bezeichnet der Begriff, wie hier verwendet, eine Verminderung der Anzahl und/oder Aktivität von Zellen, die zu der TH-Zell-Subpopulation gehören, in Bezug auf die Anzahl und/oder Aktivität der TH-Zell-Subpopulation in Abwesenheit der anpassenden Behandlung.
  • "Positive Anpassung", wie hier verwendet, bezeichnet eine Steigerung des Spiegels und/oder der Aktivität von Zielgenprodukt in Bezug auf den Spiegel und/oder die Aktivität des Zielgenprodukts in Abwesenheit einer anpassenden Behandlung. Alternativ bezeichnet der Begriff, wie hier verwendet, eine Steigerung der Anzahl und/oder Aktivität von Zellen, die zu der TH-Zell-Subpopulation gehören, in Bezug auf die Anzahl und/oder Aktivität der TH-Zell-Subpopulation in Abwesenheit der anpassenden Behandlung.
  • 4. Beschreibung der Abbildungen
  • 1. Differential-Display-Analyse von RNA aus murinen TH-Zell-Subsets. Milz-T-Zellen, die aus transgenen Mäusen mit T-Zellrezeptoren stammten, wurden in vitro differenziert, um zu polarisierten Populationen vom TH1- oder TH2-Subtyp zu werden. Spur 1: TH2-Population 24 Stunden nach tertiärer Stimulierung; Spur 2: TH1-Population 24 Stunde nach tertiärer Stimulierung; Spur 3: TH2-Population 1 Woche nach sekundärer Stimulierung; Spur 4: TH1-Population 1 Woche nach sekundärer Stimulierung; Spur 5: TA3-Zelllinie, welche als eine Antigen-präsentierende Zelle (APZ) für die in vitro-Stimulierung verwendet wurde. (Diese Probe wurde als eine Negativkontrolle verwendet.) Jedes Set von Spuren besteht aus Duplikaten (a und b), in welchen cDNAs unabhängig von der gleichen RNA-Quelle erzeugt wurden. Der Pfeil zeigt auf das differentiell exprimierte Sequenzband 102. Alle Spuren sind Produkte einer Polymerasekettenreaktion (PCR), in welcher T11GG als das 3'-Oligonucleotid verwendet wurde und ein zufälliges 10mer Oligonucleotid (Oligo #4, OP-D kit, Operon, Inc.) als das 5'-Oligonucleotid verwendet wurde.
  • 17A–17D. Nucleotide und Aminosäuresequenz des murinen 200-Gens in voller Länge. Untere Reihe: murine 200-Gennucleotidsequenz (SEQ ID NO: 8); obere Reihe: murines 200-Genprodukt, das von der Aminosäuresequenz (SEQ ID NO: 10) stammt.
  • 18. Northern-Blot-Analyse von muriner 200-Genexpression in repräsentativen murinen TH-Zelllinien (TH2: CDC25, D10.G4, DAX; TH1: AE7.A, Dorris, D1.1). Klone wurden entweder für 6 Stunden mit platten-gebundenem Anti-CD3-Antikörper stimuliert (+) oder nicht stimuliert (–). Die Positionen der RNA-Marker in Kilobasen sind als Referenz abgebildet. Der Pfeil markiert die Position der 200-Gen-mRNA.
  • 24A–24D. Nucleotide und Aminosäuresequenz des humanen 200-Gens in voller Länge. Untere Reihe: humane 200-Gennucleotidsequenz (SEQ ID NO: 23); obere Reihe: humanes 200-Genprodukt, das von der Aminosäuresequenz (SEQ ID NO: 24) stammt.
  • 5. Detaillierte Beschreibung der Erfindung
  • Es werden Verfahren und Zusammensetzungen für die Behandlung und Diagnose von Immunstörungen, insbesondere von mit TH-Zell-Subpopulationen verbundenen Störungen einschließlich, aber nicht beschränkt auf, atopische Zustände wie Asthma und Allergie, einschließlich Rhinitis allergica, Psoriasis, den Wirkungen von pathogenen Infektionen, chronischen Entzündungskrankheiten, organspezifischer Autoimmunität, Transplantatabstoßungen und „graft-versus-host"-Reaktionen beschrieben. Die Erfindung basiert, zum Teil, auf der Untersuchung der Expression und der Rolle aller Gene, die innerhalb und/oder unter TH-Zell-Subpopulationen differentiell exprimiert werden in Musterbeispielen, die für TH-vermittelte Immunantworten und/oder mit TH-Subpopulationen verbundene Störungen physiologisch von Bedeutung sind. Dies ermöglicht die Definition von Krankheitsstoffwechselwegen, die sowohl für Diagnose als Therapie nützlich sind.
  • Zunächst werden in Abschnitt 5.4 Gene beschrieben, bezeichnet als „Zielgene" und/oder „Fingerprintgene", welche innerhalb und unter TH-Zellen und TH-Zell-Subpopulationen bei normalen und/oder Krankheitszuständen und/oder während der Differenzierung in derartigen gereiften Subpopulationen differenziell exprimiert werden. Zusätzlich werden in Abschnitt 5.4 Gene beschrieben, bezeichnet als „Pathwaygene", deren Genprodukte eine Fähigkeit aufweist, mit Genprodukten zu Wechselwirken, die an mit TH-Zell-Subpopulationen verbundenen Störungen beteiligt sind, und/oder mit Genprodukten, die an der Differenzierung und der Effektorfunktion der Subpopulationen beteiligt sind. Pathwaygene können zusätzlich Fingerprint- und/oder Zielgeneigenschaften aufweisen. Verfahren zur Identifizierung von derartigen Fingerprint-, Ziel- und Pathwaygenen werden auch in den Abschnitten 5.1 und 5.2 beschrieben.
  • Weiterhin werden in Abschnitt 5.5 die Genprodukte derartiger Fingerprint-, Ziel- und Pathwaygene beschrieben, in Abschnitt 5.6 werden Antikörper für derartige Genprodukte beschrieben, und in Abschnitt 5.7. werden zell- und tierbasierte Modelle für die TH-Zell-Subpopulationsdifferenzierung und mit TH-Zell-Subpopulationen verbundene Störungen, zu welchen derartige Genprodukte betragen können, beschrieben.
  • In Abschnitt 5.11 werden Verfahren zur prognostischen und diagnostischen Untersuchung von verschiedenen mit einer TH-Zell-Subpopulation verbundenen Störungen, für die Identifizierung von Patienten, die eine Prädisposition für derartige Störungen aufweisen, und zur Überwachung der Effizienz von in klinischen Studien verwendeten Verbindungen beschrieben.
  • In Abschnitt 5.8 werden Verfahren zur Identifizierung von Verbindungen beschrieben, welche die Expression von Genen oder die Aktivität von Genprodukten verändern, die an mit TH-Zell-Subpopulationen verbundenen Störungen und an der Differenzierung, und Effektorfunktion der TH-Zell-Subpopulationen beteiligt sind, und in Abschnitt 5.9 werden Verfahren zur Behandlung der Immunstörungen beschrieben.
  • 5.1 Identifizierung von differenziell exprimierten Genen
  • Hier werden Verfahren zur Identifizierung von differenziell exprimierten Genen beschrieben, die an Immunerkrankungen, z.B. mit der TH-Zellen-Subpopulation in Verbindung stehenden Erkrankungen, beteiligt sind und/oder die an der Differenzierung, dem Erhalt und der Effektorfunktion der Subpopulationen beteiligt sind. Die differenzielle Expression derartiger Gene kann sich auf zahlreichen Ebenen zeigen. Differenzielle Expression kann beispielsweise in undifferenzierten TH-Zellen gegenüber differenzierten oder differenzierenden TH-Zellen stattfinden (wenn auch nicht notwendigerweise innerhalb einer TH-Zellen-Subpopulation gegenüber einer anderen), in naiven TH-Zellen gegenüber Gedächtnis-TH-Zellen, innerhalb einer TH-Zellen-Subpopulation gegenüber einer anderen (z.B. TH1- gegenüber TH2-Subpopulationen), in reifen stimulierten Zellen gegenüber reifen unstimulierten Zellen in einer gegebenen TH-Zellen-Subpopulation oder in mit TH-Zellen-Subpopulation in Verbindung stehenden Erkrankungszuständen gegenüber ihrer Expression in normalen oder nicht mit TH-Zellen-Subpopulation in Verbindung stehenden Erkrankungszuständen. Solche differenziell exprimierten Gene können Target- und/oder Fingerabdruck-Gene wiedergeben.
  • Verfahren zur Identifizierung derartiger differenziell exprimierten Gene sind anschließend in Abschnitt 5.1.1 beschrieben. Verfahren zur weiteren Charakterisierung derartiger differenziell exprimierter Gene und ihrer Kategorisierung als Target- und/oder Fingerabdruck-Gene werden anschließend in Abschnitt 5.3 dargestellt.
  • "Differenzielle Expression" bezieht sich hier auf sowohl quantitative als auch qualitative Unterschiede in den temporären und/oder Zelltyp-Expressionsmustern der Gene. Bei einem differenziell exprimierter Gen kann seine Expression somit beispielsweise in normalen gegenüber mit TH-Zellen-Subpopulationen in Verbindung stehenden Erkrankungszuständen, in einer TH-Zellen-Subpopulation gegenüber einer anderen (z.B. TH1 gegenüber TH2), in antigen-stimulierten gegenüber unstimulierten Sets von TH-Zellen oder in undifferenzierten gegenüber differenzierten oder differenzierenden TH-Zellen aktiviert oder vollständig inaktiviert sein. Ein dermaßen qualitativ reguliertes Gen zeigt ein Expressionsmuster innerhalb eines Zustands oder Zelltyps, das nach Standardtechniken in einem derartigen Zustand oder Zelltyp detektierbar ist, jedoch nicht in beiden detektierbar ist.
  • Alternativ kann ein differenziell exprimiertes Gen ein Expressionsniveau zeigen, das sich bei normalen gegenüber mit TH-Zellen-Subpopulation in Verbindung stehenden Erkrankungszuständen, bei antigen-stimulierten gegenüber unstimulierten Sets von TH-Zellen, in einer TH-Zellen-Subpopulation gegenüber einer anderen oder in undifferenzierten gegenüber differenzierten oder differenzierenden TH-Zellen unterscheidet, d. h. quantitativ erhöht oder erniedrigt ist. Weil Differenzierung ein mehrstufiges Ereignis ist, können Gene, die differenziell exprimiert sind, auch in jedem derartigen intermediären Differenzierungszustand identifiziert werden.
  • Der Grad, bis zu dem sich die Expression unterscheidet, muss lediglich ausreichend groß sein, um sich durch Standard-Charakterisierungstechniken, wie beispielsweise die nachfolgend beschriebene Differenzialanzeigetechnik, visualisieren zu lassen. Andere derartige Standard-Charakterisierungstechniken, nach denen Expressionsunterschiede visualisiert werden können, umfassen quantitative RT (reverse Transkriptase)-PCR und Northern-Analysen und RNase-Schutztechniken, sind jedoch nicht auf diese begrenzt.
  • Differenziell exprimierte Gene können ferner als Target-Gene und/oder Fingerabdruck-Gene beschrieben werden. "Fingerabdruck-Gen" bezieht sich hier auf ein differenziell exprimiertes Gen, dessen Expressionsmuster als Teil einer prognostischen oder diagnostischen Bewertung von mit TH-Zellen-Subpopulation in Verbindung stehenden Erkrankungen verwendet werden kann, oder das alternativ in Verfahren zum Identifizieren von Verbindungen verwendet werden kann, die zur Behandlung von mit TH-Zellen-Subpopulation in Verbindung stehenden Erkrankungen brauchbar sind. Ein Fingerabdruck-Gen kann auch die Charakteristika eines Target-Gens oder eines Stoffwechsel-Gens (siehe unten in Abschnitt 5.2) haben.
  • "Fingerabdruckmuster" bezieht sich hier auf das Muster, das erzeugt wird, wenn die Expressionsmuster einer Reihe (die im Bereich von zwei bis zu allen der Fingerabdruck-Gene liegen kann, die es für einen gegebenen Zustand gibt) von Fingerabdruck-Genen bestimmt werden. Ein Fingerabdruckmuster kann auch in Verfahren zum Identifizieren von Verbindungen verwendet werden, die zur Behandlung von Immunerkrankungen brauchbar sind, z.B. durch Bewerten der Wirkung der Verbindung auf das Fingerabdruckmuster, das normalerweise im Zusammenhang mit der Erkrankung gezeigt wird.
  • "Target-Gen" (Ziel-Gen) bezieht sich hier auf ein differenziell exprimiertes Gen, das an mit TH-Zellen-Subpopulation in Verbindung stehenden Erkrankungen und/oder an Differenzierung, Erhalt und/oder Effektorfunktion der Subpopulationen in einer Weise beteiligt sind, nach der Modulation des Niveaus der Target-Gen-Expression oder der Target-Gen-Produktaktivität so wirken kann, dass Symptome der mit TH-Zellen-Subpopulation in Verbindung stehenden Erkrankungen gelindert werden. Eine derartige Modulation kann beispielsweise entweder zur Depletion oder zur Stimulation von einer oder mehreren TH-Zellen-Subpopulationen führen, was wiederum zur Linderung der Symptome der Immunerkrankung führt, z.B. der TH-Zellen-Subpopulationserkrankung.
  • "Stimulation" kann sich hier auf einen effektiven Anstieg der Anzahl der Zellen, die zu einer T-Zellen-Population gehören, wie einer TH-Zellen-Subpopulation, durch beispielsweise die Proliferation derartiger TH- Zellen-Subpopulationszellen beziehen. Der Begriff kann sich auch auf einen Anstieg der Aktivität der Zellen beziehen, die zu einer TH-Zellen-Subpopulation gehören, wie sich beispielsweise durch einen Anstieg der Expression des TH-Zellen-Subpopulations-spezifischen Cytokinmusters pro Zelle zeigen würde.
  • "Depletion" (Erschöpfung) kann sich hier auf eine effektive Reduktion der Anzahl der Zellen, die zu einer T-Zellen-Population, wie einer TH-Zellen-Subpopulation, gehören, durch beispielsweise eine Reduktion der Proliferation derartiger TH-Zellen-Subpopulationszellen beziehen. Der Begriff kann sich auch auf eine Abnahme der Aktivität der Zellen beziehen, die zu einer TH-Zellen-Subpopulation gehören, wie sich beispielsweise durch eine Abnahme der Expression des TH-Zellen-Subpopulations-spezifischen Cytokinmusters pro Zelle zeigen würde.
  • Zu mit TH-Zellen-Subpopulation in Verbindung stehenden Erkrankungen gehören beispielsweise atopische Krankheiten, wie Asthma und Allergie einschließlich allergischer Rhinitis, die Effekte pathogener einschließlich viraler Infektion, chronische entzündliche Erkrankungen, Psoriasis, Glomerunephritis, organspezifische Autoimmunität, Transplantatabstoßung und Graft-versus-Host-Erkrankung. Ein Target-Gen kann auch die Charakteristika eines Fingerabdruck-Gens oder eines Stoffwechsel-Gens (siehe unten in Abschnitt 5.2) haben.
  • 5.1.1 Verfahren zur Identifizierung von differenziell exprimierten Genen
  • Eine Vielfalt von Verfahren kann zur Identifizierung von Genen, die an Immun-Erkrankungszuständen, z.B. mit TH-Zellen-Subpopulation in Verbindung stehenden Erkrankungszuständen, beteiligt sind und/oder die an Differenzierung, Erhalt und/oder Effektorfunktion der Subpopulationen beteiligt sind, verwendet werden. In Abschnitt 5.1.1.1 sind experimentelle Paradigmen beschrieben, die zur Erzeugung von Subjekten und Proben eingesetzt werden können, die zur Identifizierung derartiger Gene verwendet werden können. In Paradigmakategorien erzeugtes Material kann nach Anwesenheit differenziell exprimierter Gensequenzen charakterisiert werden, wie anschließend in Abschnitt 5.1.1.2 erörtert wird.
  • 5.1.1.1 Paradigmen zur Identifizierung von differenziell exprimierten Genen
  • Beschrieben werden hier Paradigmen, die Modelle für normale und abnormale Immunreaktionen repräsentieren. Diese Paradigmen können zur Identifizierung von Genen verwendet werden, die innerhalb von und unter TH-Zellen-Subpopulationen einschließlich, aber nicht begrenzt auf TH1- und TH2-Subpopulationen, differenziell exprimiert sind. Solche Gene können beispielsweise an Differenzierung, Erhalt und/oder Effektorfunktion von TH-Zellen-Subpopulationen und an mit TH-Zellen-Subpopulation in Verbindung stehenden Erkrankungen beteiligt sein. TH-Zellen können beispielsweise dazu gebracht werden, sich in entweder TH1- oder TH2-Zustände zu differenzieren, können mit beispielsweise einem Fremd-Antigen stimuliert werden und können an verschiedenen Punkten während des Verfahrens zur Analyse der differenziellen Genexpression aufgefangen werden.
  • In einer Ausführungsform eines solchen Paradigmas, das hier als "transgenes T-Zellen-Paradigma" bezeichnet wird, werden transgene Tiere, vorzugsweise Mäuse, eingesetzt, die gentechnisch verändert worden sind, damit sie einen speziellen T-Zellen-Rezeptor exprimieren, so dass die überwiegende T-Zellen-Population des Immunsystems eines derartigen transgenen Tieres nur ein Antigen erkennt. Ein solches System ist bevorzugt, da es eine Quelle für eine große Population identischer T-Zellen zur Verfügung stellt, deren Naivität gewährleistet werden kann und deren Reaktion auf das einzige Antigen, das es erkennt, auch gewährleistet ist. Aus einem solchen transgenen Tier isolierte T-Helferzellen werden in vitro zum Differenzieren in TH-Zellen-Subpopulationen wie TH1-, TH2- oder TH0-Zellen-Subpopulationen gebracht. In einer speziellen Ausführungsform wird eine T-Helferzellengruppe (die TH1-Gruppe) IL-12 ausgesetzt, einem Cytokin, das bekanntermaßen Differenzierung in den TH1-Zustand induziert, eine zweite T-Helferzellengruppe (die TH2-Gruppe) wird IL-4 ausgesetzt, einem Cytokin, das bekanntermaßen Differenzierung zu dem TH2-Zustand induziert, und eine dritte Gruppe wird durch Fehlen von Cytokin-vermittelter Induktion in einen ungerichteten TH-Zustand eintreten gelassen.
  • Verwendet werden kann ein zweites Paradigma, das hier als "T-Zelllinien-Paradigma" bezeichnet wird, das reife TH-Zellklone, wie TH1 und TH2 und TH1-artige und TH2-artige Zelllinien, vorzugsweise humane Zelllinien verwendet. Zu derartigen TH-Zelllinien können die folgenden wohlbekannten Ratten-Zelllinien Doris, AE7, D10.G4, DAX, D1.1 und CDC25 gehören, sie sind jedoch nicht auf diese begrenzt. Solche T-Zelllinien können von normalen Individuen sowie von Individuen stammen, die mit TH-Zellen-Subpopulation in Verbindung stehende Erkrankungen haben, wie beispielsweise chronische entzündliche Krankheiten und Erkrankungen, wie Morbus Crohn, reaktive Arthritis einschließlich Lyme-Erkrankung, insulinabhängigen Diabetes, organspezifische Autoimmunität einschließlich multipler Sklerose, Thyroiditis Hashimoto und Morbus Basedow, Kontaktdermatitis, Psoriasis, Transplantatabstoßung, Graft-versus-Host-Erkrankung, Sarkoidose, atopische Erkrankungen wie Asthma und Allergie einschließlich allergischer Rhinitis, gastrointestinale Allergien einschließlich Nahrungsmittelallergien, Eosinophilie, Konjunktivitis, Glomerunephritis, bestimmte pathogene Empfänglichkeiten, wie Wurmerkrankungen (z.B. Leishmaniose) und bestimmte Virusinfektionen einschließlich HIV und bakterielle Infektionen einschließlich tuberkulöser und lepromatöser Lepra.
  • Die TH-Zellklone können auf vielerlei Weise stimuliert werden. Zu diesen Stimulationsverfahren gehören pharmakologische Verfahren, wie Einwirkung von Phorbolestern, Calciuimionophoren oder Lektinen (z.B. Concanavalin A), Behandlung mit Antikörpern, die gegen T-Zellen-Rezeptorepitope gerichtet sind (z.B. Anti-CD3-Antikörper) oder Einwirkung eines Antigens, das die speziellen TH-Zellen bekanntermaßen erkennen, in Gegenwart einer geeigneten Antigen-präsentierenden Zelle (APC), sie sind jedoch nicht auf diese begrenzt. Nach dieser Primärstimulation können die Zellen ohne Stimulation und beispielsweise in Gegenwart von IL-2 unter Verwendung von Standardtechniken, die Fachleuten wohl bekannt sind, in Kultur gehalten werden. Die Zellen können dann einer oder mehreren weiteren Stimulations- und Erhaltzyklen ausgesetzt werden.
  • Ein drittes Paradigma, das hier als "in vivo-Paradigma" bezeichnet wird, kann auch verwendet werden, um differenziell exprimierte Gensequenzen aufzufinden. In vivo-Stimulation von Tiermodellen bildet die Grundlage für dieses Paradigma. Die in vivo-Natur der Stimulation kann sich als besonders aussagefähig für die analogen Reaktionen bei lebenden Patienten erweisen. Die Stimulation kann nach vielerlei Verfahren bewirkt werden. Tiere, wie die zuvor in diesem Abschnitt beschriebenen transgenen Tiere, können beispielsweise passendes Antigen und passendes Cytokin als Injektion erhalten, um die gewünschte TH-Zellen-Differenzierung anzutreiben. Die Drainage von Lymphknoten kann dann zu verschiedenen Zeitpunkten nach der Stimulation verwertet werden. Die Lymphknoten von beispielsweise TH1-orientierten Tieren können mit jenen von TH2-orientiert Tieren verglichen werden.
  • Für dieses in vivo-Paradigma kann ein weiter Bereich von Tiermodellen verwendet werden, der sowohl Modelle der normalen Immundifferenzierung und -funktion als auch jene wiedergibt, die Immunerkrankungen wiedergeben. Beispielsweise können beliebige der Tiermodelle verwendet werden, sowohl rekombinante als auch nicht-rekombinante, die nachfolgend in Abschnitt 5.7.1 beschrieben sind.
  • An jedem Punkt eines derartigen Verfahrens können Zellproben aufgefangen werden. Zellen können beispielsweise nach jeder beliebigen Stimulationsperiode und/oder jeder beliebigen Erhaltperiode erhalten werden. Zellen können zudem an verschiedenen Punkten während des TH-Zellen-Differenzierungsprozesses aufgefangen werden. Aus solchen Proben aufgefangene RNA kann nach beispielsweise Verfahren verglichen und analysiert werden, die nachfolgend in Abschnitt 5.1.1.2 beschrieben sind. RNA aus TH0-, TH1- und TH2-Gruppen, die zu einem gegebenen Zeitpunkt isoliert worden sind, kann dann analysiert und verglichen werden. RNA aus stimulierten und nicht-stimulierten Zellen innerhalb einer gegebenen TH-Zellgruppe kann außerdem auch verglichen und analysiert werden. RNA, die aus undifferenzierten TH-Zellen aufgefangen wurde, kann außerdem mit RNA verglichen werden, die in verschiedenen Stadien während des Differenzierungsprozesses aus Zellen aufgefangen wurde, der letztendlich TH-Zellen-Subpopulationen ergibt.
  • 5.1.1.2 Analyse des Paradigmamaterials
  • Um differenziell exprimierte Gene zu identifizieren, kann RNA, entweder die gesamte RNA oder mRNA, aus den in Paradigmen wie in Abschnitt 5.1.1.1 beschrieben verwendeten TH-Zellen isoliert werden. Es können beliebige RNA-Isolierungstechniken zur Reinigung derartiger RNA-Proben verwendet werden, die nicht gegen die Isolierung von mRNA selektieren. Siehe beispielsweise F. M. Ausubel et al., Herausgeber, 1987–1993, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc. New York, hier vollständig zitiert zum Zweck der Bezugnahme. Es können zusätzlich leicht große Zahlen von Zellproben unter Verwendung von Techniken verarbeitet werden, die Fachleuten wohl bekannt sind, wie beispielsweise dem einstufigen RNA-Isolierungsprozess von P. Chomczynski, (1989, US-A-4,843,155), hier vollständig zitiert zum Zweck der Bezugnahme.
  • Transkripte innerhalb der aufgefangenen RNA-Proben, die RNA repräsentieren, die durch differenziell exprimierte Gene produziert worden ist, können durch Einsatz vielerlei Verfahren identifiziert werden, die Fachleuten wohl bekannt sind. Differential-Screening (T. F. Tedder, et al. 1988, Proc. Natl. Acad. Sci, USA 85: 208–212), subtraktive Hybridisierung (S. M. Hedrick et al. 1984, Nature 308: 149–153; S. W. Lee et al., 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 2825) und vorzugsweise Differenzialanzeige (P. Liang und A. B. Pardee, 1992, Science 257: 967–971; US-A-5,262,311, hier vollständig zitiert zum Zweck der Bezugnahme) können beispielsweise zur Identifizierung von Nukleinsäuresequenzen verwendet werden, die von Genen stammen, die differenziell exprimiert sind.
  • Differential-Screening beinhaltet das doppelt ausgeführte Screening einer cDNA-Bibliothek, wobei eine Kopie der Bibliothek Screening mit einer Vollzell-cDNA-Sonde unterzogen wird, die der mRNA-Population eines Zelltyps entspricht, während eine zweite Kopie der cDNA-Bibliothek Screening mit einer Voll-cDNA-Sonde unterzogen wird, die der mRNA-Population eines zweiten Zelltyps entspricht. Eine cDNA-Sonde kann beispielsweise einer Vollzell-cDNA-Sonde eines Zelltyps oder Gewebes entsprechen, der bzw. das von einem Kontrollsubjekt stammt, während die zweite cDNA-Sonde einer Vollzell-cDNA-Sonde desselben Zelltyps oder Gewebes entsprechen kann, der bzw. das von einem experimentellen Subjekt stammt. Jene Klone, die an eine Sonde hybridisieren, jedoch nicht an die andere, stehen möglicherweise für Klone, die von Genen stammen, die in dem interessierenden Zelltyp bei Kontroll- gegenüber exprimentellen Subjekten differenziell exprimiert sind.
  • Subtraktive Hybridisierungstechniken beinhalten allgemein die Isolation von mRNA, die aus zwei unterschiedlichen Quellen genommen ist, die Hybridisierung der mRNA oder einzelsträngigen cDNA, die durch reverse Transkription aus der isolierten mRNA erhalten wurde, und die Entfernung aller hybridisierten und daher doppelsträngigen Sequenzen. Die verbleibenden nicht-hybridisierten einzelsträngigen cDNAs repräsentieren potentiell Klone, die von Genen stammen, die unter den beiden mRNA-Quellen differenziell exprimiert sind. Derartige einzelsträngige cDNAs werden danach als Ausgangsmaterial zum Aufbau einer Bibliothek verwendet, die von differenziell exprimierten Genen stammende Klone umfasst.
  • Die Differenzialanzeigetechnik ist ein Verfahren, das die wohl bekannte Polymerasekettenreaktion einsetzt (PCR; die experimentelle Ausführungsform ist in K. B. Multis, 1987, US-A-4,683,202 beschrieben), das die Identifizierung von Sequenzen ermöglicht, die von Genen stammen, die differenziell exprimiert sind. Zuerst wird isolierte RNA unter Verwendung von Standardtechniken, die Fachleuten wohl bekannt sind, durch reverse Transkription in einzelsträngige cDNA überführt. Zu Primern für die reverse-Transkriptase-Reaktion können Oligo-dT-enthaltende Primer, vorzugsweise vom 3'-Primertyp des Oligonukleotids gehören, das nachfolgend beschrieben wird.
  • Diese Technik verwendet als nächstes Paare von PCR-Primern wie nachfolgend beschrieben, die die Amplifizierung von Klonen ermöglichen, die einen reproduzierbaren Subset der RNA-Transkripte repräsentieren, der innerhalb jeder gegebenen Zelle vorhanden ist. Die Verwendung unterschiedlicher Paare von Primern ermöglichen das Amplifizieren von jedem der geprimten mRNA-Transkripte, die in einer Zelle vorhanden sind. Unter derartigen amplifizierten Transkripten können jene identifiziert werden, die aus differenziell exprimierten Genen produziert worden sind.
  • Der 3'-Oligonukleotid-Primer der Primerpaare kann einen Oligo-dT-Stretch von 10–13, vorzugsweise 11 dT-Nukleotiden an seinem 5'-Ende enthalten, der zu dem Poly(A)-Schwanz von mRNA oder zu dem Komplement einer cDNA hybridisiert, die durch reverse Transkription aus einem mRNA-Poly(A)-Schwanz erhalten wurde. Der Primer kann ein oder mehrere, vorzugsweise zwei zusätzliche Nukleotide an seinem 3'-Ende enthalten, um die Spezifität des 3'-Primers zu erhöhen. Weil statistisch nur ein Subset der von mRNA stammenden Sequenzen, die in der interessierenden Probe vorhanden sind, zu solchen Primern hybridisieren wird, ermöglichen die zusätzlichen Nukleotide den Primern lediglich das Amplifizieren eines Subsets der von mRNA stammenden Sequenzen, die in der interessierenden Probe vorhanden sind. Dies ist bevorzugt, da genauere und vollständige Visualisierung und Charakterisierung von jeder der Banden ermöglicht wird, die amplifizierte Sequenzen repräsentieren.
  • Der 5'-Primer kann eine Nukleotidsequenz enthalten, von der statistisch erwartet werden kann, dass sie die Fähigkeit zur Hybridisierung an cDNA-Sequenzen hat, die von den interessierenden Zellen oder Geweben stammen. Die Nukleotidsequenz kann willkürlich sein, und die Länge des 5'-Oligonukleotid-Primers kann im Bereich von etwa 9 bis etwa 15 Nukleotiden liegen, wobei etwa 13 Nukleotide bevorzugt sind.
  • Willkürliche Primersequenzen führen dazu, dass die Längen der produzierten amplifizierten partiellen cDNAs variabel sind, wodurch das Trennen verschiedener Klone durch Verwendung von Standard-Denaturierungs-Sequenzierungs-Gelelektrophorese möglich wird.
  • Es sollten PCR-Reaktionsbedingungen gewählt werden, die die Ausbeute an amplifiziertem Produkt und Spezifität zu amplifiziertem Produkt optimieren und zusätzlich amplifizierte Produkte mit Längen produzieren, die unter Verwendung von Standard-Gelelektrophoresetechniken aufgelöst werden können. Fachleuten sind derartige Reaktionsbedingungen wohl bekannt, und zu wichtigen Reaktionsparametern gehören beispielsweise Länge und Nukleotidsequenz von Oligonukleotid-Primern wie bereits erörtert und Temperaturen und Reaktionszeiten der Annealing- und Verlängerungsstufe.
  • Das Muster der aus der reversen Transkription und Amplifizierung der mRNA von zwei verschiedenen Zelltypen resultierenden Klone wird durch Sequenzierungs-Gelelektrophorese angezeigt und verglichen. Differenziell exprimierte Gene werden durch Unterschiede der beiden Banding-Muster angezeigt.
  • Nachdem potentiell differenziell exprimierte Gensequenzen über Massentechniken wie beispielsweise die oben beschriebenen identifiziert worden sind, sollte die differenzielle Expression dieser mutmaßlich differenziell exprimierten Gele bestätigt werden. Die Bestätigung kann beispielsweise durch wohl bekannte Techniken wie Northern-Analyse, quantitative RT/PCR oder RNAse-Schutz bewirkt werden.
  • Nach der Bestätigung können die differenziell exprimierten Gele weiter charakterisiert werden und können als Target- und/oder Fingerabdruck-Gene charakterisiert werden, wie anschließend in Abschnitt 5.3 erörtert wird.
  • Die amplifizierten Sequenzen differenziell exprimierter Gene, die beispielsweise durch Differenzialanzeige erhalten wurden, können verwendet werden, um Klone des entsprechenden Gens in voller Länge zu isolieren. Der Kodierabschnitt des Gens in voller Länge kann leicht ohne unnötige Experimente durch molekularbiologische Techniken isoliert werden, die in der Technik wohl bekannt sind. Das isolierte, differenziell exprimierte, amplifizierte Fragment kann beispielsweise markiert und zum Screening einer cDNA-Bibliothek verwendet werden. Das markierte Fragment kann alternativ zum Screening einer Genombibliothek verwendet werden.
  • Zum Isolieren von cDNA-Sequenzen in voller Länge kann auch die PCR-Technologie verwendet werden. Wie oben in diesem Abschnitt beschrieben ist, haben die isolierten amplifizierten Genfragmente, die durch Differenzialanzeige erhalten worden sind, 5'-terminale Enden an einigen statistischen Punkten innerhalb des Gens und üblicherweise 3'-terminale Enden an einer Position, die dem 3'-Ende des transkribierten Abschnitts des Gens entspricht. Nachdem die Nukleotidsequenzinformationen aus einem amplifizierten Fragment erhalten worden sind, kann der Rest des Gens (d. h. das 5'-Ende des Gens, wenn Differenzialanzeige verwendet wird) beispielsweise unter Verwendung von RT-PCR erhalten werden.
  • In einer Ausführungsform eines derartigen Verfahrens zur Identifizierung und zum Klonen von Gensequenzen in voller Länge kann RNA nach Standardverfahren aus einem passenden Gewebe oder einer passenden zellulären Quelle isoliert werden. Dann kann mit der RNA unter Verwendung eines Oligonukleotid-Primers, der zu der mRNA komplimentär ist, die dem amplifizierten Fragment entspricht, zum Priming der Synthese des ersten Strangs eine reverse Transkriptionsreaktion durchgeführt werden. Da der Primer zu der mRNA antiparallel ist, geht die Verlängerung in Richtung des 5'-Endes der mRNA. Der resultierende RNA/DNA-Hybrid kann dann mit Guaninen unter Verwendung einer Standard-terminalen Transferase-Reaktion "mit einem Schwanz versehen" werden, der Hybrid kann mit RNAase H verdaut werden, und die Synthese des zweiten Strangs kann danach mit Poly-C Primer geprimt werden. Unter Verwendung der beiden Primer wird der 5'-Abschnitt des Gens unter Verwendung von PCR amplifiziert. Danach können erhaltene Sequenzen isoliert und mit zuvor isolierten Sequenzen rekombiniert werden, um eine cDNA der differenziell exprimierten Gene der Erfindung in voller Länge zu erzeugen. Hinsichtlich eines Überblicks über Klonierungsstrategien und rekombinante DNA-Techniken siehe z.B. Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, (Bände 1–3) Cold Spring Harbor Press, N. Y.; und Ausubel et al., 1989, Current Protocols in Molecular Biology, Green Publishing Associates and Wiley Interscience, N. Y.
  • 5.2 Verfahren zur Identifizierung von Stoffwechsel-Genen
  • Hier werden Verfahren zur Identifizierung von Stoffwechsel-Genen beschrieben. "Stoffwechsel-Gen" bezieht sich hier auf ein Gen, dessen Genprodukt die Fähigkeit zeigt, mit Genprodukten in Wechselwirkung zu treten, die an mit TH-Zellen-Subpopulation in Verbindung stehenden Erkrankungen beteiligt sind, und/oder mit Genprodukten in Wechselwirkung zu treten, die an Differenzierung, Erhalt und/oder Effektorfunktion von TH-Zellen-Subpopulationen beteiligt sind. Ein Stoffwechsel-Gen kann differenziell exprimiert sein und daher die Charakteristika eines Target- und/oder Fingerabdruck-Gens haben, wie bereits in Abschnitt 5.1 beschrieben wurde.
  • Es kann jedes beliebige Verfahren zum Identifizieren von Stoffwechsel-Genprodukten verwendet werden, das zum Detektieren von Protein-Protein-Wechselwirkungen geeignet sind, indem Wechselwirkungen zwischen Genprodukten und Genprodukten, die bekanntermaßen an mit TH-Zellen-Subpopulationen in Verbindung stehenden Erkrankungen und/oder an Differenzierung, Erhalt und/oder Effektorfunktion der Subpopulationen beteiligt sind, identifiziert werden. Solche bekannte Genprodukte können zelluläre oder extrazelluläre Proteine sein. Diese Genprodukte, die mit derartigen bekannten Genprodukten in Wechselwirkung treten, repräsentieren Stoffwechsel-Genprodukte, und die Gene, die sie kodieren, repräsentieren Stoffwechsel-Gene.
  • Co-Immunopräzipitation, Vernetzen und Co-Reinigung durch Gradienten- oder Chromatographiesäulen sind die traditionellen Verfahren, die verwendet werden können. Die Verwendung von derartigen Verfahren ermöglicht die Identifizierung von Stoffwechsel-Genprodukten. Ein Stoffwechsel-Genprodukt kann, nachdem es identifiziert worden ist, zusammen mit Standard-Techniken verwendet werden, um sein entsprechendes Stoffwechsel-Gen zu identifizieren. Mindestens ein Abschnitt der Aminosäuresequenz des Stoffwechsel-Genprodukts kann beispielsweise unter Verwendung von Techniken ermittelt werden, die Fachleuten wohl bekannt sind, wie mittels der Abbautechnik nach Edman (siehe z.B. Creighton, 1983, "Proteins: Structures and Molecular Principles", W. H. Freeman & Co., N. Y., Seiten 34–49). Die erhaltene Aminosäuresequenz kann als Richtlinie für die Erzeugung von Oligonukleotidmischungen verwendet werden, die zum Screening auf Stoffwechsel-Gensequenzen verwendet werden können. Screening kann beispielsweise durch Standard-Hybridisierungs- oder PCR-Techniken bewirkt werden. Techniken zur Erzeugung von Oligonukleotidmischungen und zum Screening sind wohl bekannt. (Siehe z.B. Ausubel (bereits genannt) und PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, 1990, M. Innis et al., Herausgeber, Academic Press, Inc., New York).
  • Es können überdies Verfahren verwendet werden, die zur simultanen Identifizierung von Stoffwechsel-Genen führen, die Proteine kodieren, die mit einem Protein in Wechselwirkung treten, das an mit TH-Zellen-Subpopulation in Verbindung stehenden Krankheitszuständen und/oder an Differenzierung, Erhalt und/oder Effektorfunktion der Subpopulationen beteiligt ist. Zu diesen Verfahren gehören beispielsweise Sondieren von Expressionsbibliotheken mit markiertem Protein, das bekanntermaßen oder vermutlich an den Erkrankungen und/oder der Differenzierung, dem Erhalt und/oder der Effektorfunktion der Subpopulationen beteiligt ist, wobei dieses Protein in ähnlicher Weise wie in der wohl bekannten Technik der Antikörper-Sondierung von λgt11-Bibliotheken verwendet wird.
  • Ein Verfahren, das Proteinwechselwirkungen in vivo detektiert, das Zwei-Hybrid-System, wird lediglich zu Veranschaulichungszwecken und nicht als Einschränkung detailliert beschrieben. Eine Variante dieses Systems ist (Chien et al., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88: 9578–9582) beschrieben worden und im Handel von Clontech (Palo Alto, CA, USA) erhältlich.
  • Bei Verwendung eines derartigen Systems werden kurz gesagt Plasmide aufgebaut, die zwei Hybridproteine kodieren: eines besteht aus der DNA-Bindungsdomäne eines Transkriptionsaktivatorproteins, fusioniert an ein bekanntes Protein, in diesem Fall ein Protein, das bekanntermaßen an TH-Zellen-Subpopulations-Differenzierung oder -Effektorfunktion oder an mit TH-Zellen-Subpopulation in Verbindung stehenden Erkrankungen beteiligt ist, und das andere besteht aus der Aktivierungsdomäne des Aktivatorproteins, fusioniert an ein unbekanntes Protein, das durch eine cDNA kodiert ist, die als Teil einer cDNA-Bibliothek in dieses Plasmid rekombiniert worden ist. Die Plasmide werden in einen Stamm der Hefe Saccharomyces cerevisiae transformiert, der ein Reporter-Gen enthält (z.B. lacZ), dessen Regulatorbereich die Bindungsstellen des Transkriptionsaktivators enthält. Keines der Hybridproteine kann allein die Transkription des Reporter-Gens aktivieren, der DNA-Bindungsdomänen-Hybrid kann es nicht, weil er keine Aktivierungsfunktion bereitstellt, und der Aktivierungsdomänen-Hybrid kann es nicht, weil er die Bindungsstellen des Aktivators nicht lokalisieren kann. Die Wechselwirkung der beiden Hybridproteine stellt das funktionale Aktivatorprotein wieder her (Rekonstitution) und führt zur Expression des Reporter-Gens, das durch einen Assay für das Reporter-Genprodukt detektiert wird.
  • Das Zwei-Hybrid-System oder eine verwandte Methodik kann zum Screening von Aktivierungsdomänenbibliotheken auf Proteine verwendet werden, die mit einem bekannten "Köder"-Genprodukt in Wechselwirkung treten. Als die Köder-Genprodukte können beispielhaft und nicht einschränkend Genprodukte verwendet werden, die bekanntermaßen an mit TH-Zellen-Subpopulation in Verbindung stehenden Erkrankungen und/oder an Differenzierung, Erhalt und/oder Effektorfunktion der Subpopulationen beteiligt sind. Gesamtgenom- oder cDNA-Sequenzen werden an die DNA fusioniert, die eine Aktivierungsdomäne kodiert. Diese Bibliothek und ein Plasmid, das einen Hybrid des Köder-Genprodukts kodiert, das an die DNA-Bindungsdomäne fusioniert ist, werden in einen Hefe-Reporter-Stamm cotransformiert, und die resultierenden Transformanten werden einem Screening auf jene unterzogen, die das Reporter-Gen exprimieren. Das Köder-Gen kann als Beispiel und nicht einschränkend in einen Vektor kloniert werden, so dass es durch Translation an die DNA fusioniert wird, die die DNA-Bindungsdomäne des GAL4-Proteins kodiert. Diese Kolonien werden gereinigt, und die für die Reporter-Gen-Expression verantwortlichen Bibliotheksplasmide werden isoliert. Danach wird DNA-Sequenzierung zur Identifizierung der Proteine verwendet, die durch die Bibliotheksplasmide kodiert werden.
  • Eine cDNA-Bibliothek der Zelllinie, aus der Proteine detektiert werden sollen, die mit Köder-Genprodukt in Wechselwirkung treten, kann nach Verfahren hergestellt werden, die in der Technik routinemäßig durchgeführt werden. Gemäß dem hier beschriebenen speziellen System können die cDNA-Fragmente beispielsweise in einen Vektor inseriert werden, so dass sie durch Translation an die Aktivierungsdomäne von GAL4 fusioniert werden. Diese Bibliothek kann zusammen mit dem Köder-Gen-GRL4-Fusionsplasmid in einen Hefestamm co-transformiert werden, der ein lacZ-Gen enthält, das von einem Promotor angetrieben wird, der GAL4-Aktivierungssequenz enthält. Ein cDNA-kodiertes Protein, das an eine GAL4-Aktivierungsdomäne fusioniert ist, die mit Köder-Genprodukt in Wechselwirkung tritt, wird ein aktives GAL4-Protein rekonstituieren und dadurch die Expression des lacZ-Gens antreiben. Kolonien, die lacZ exprimieren, können durch ihre blaue Farbe in Gegenwart von X-gal detektiert werden. Aus diesen Stämmen kann die cDNA gereinigt und verwendet werden, um das mit Köder-Gen in Wechselwirkung tretende Protein unter Verwendung von Techniken, die in der Technik routinemäßig durchgeführt werden, zu produzieren und zu isolieren.
  • Nachdem ein Stoffwechsel-Gen identifiziert und isoliert worden ist, kann es weiter charakterisiert werden, wie beispielsweise nachfolgend in Abschnitt 5.3 erörtert wird.
  • 5.3 Charakterisierung von differenziell exprimierten und Stoffwechsel-Genen
  • Differenziell exprimierte Gene wie jene, die nach den bereits im Abschnitt 5.1 erörterten Verfahren identifiziert wurden, und Stoffwechsel-Gene wie jene, die nach den bereits im Abschnitt 5.2 erörterten Verfahren identifiziert wurden, sowie Gene, die mit alternativen Mitteln identifiziert wurden, können unter Verwendung von beispielsweise Verfahren, die hier nachfolgend erörtert werden, weiter charakterisiert werden. Derartige Gene werden hier als "identifizierte Gene" bezeichnet.
  • Analysen wie die hier beschriebenen geben Informationen über die biologische Funktion der identifizierten Gene. Eine Bewertung der biologischen Funktion der differenziell exprimierten Gene ermöglicht zusätzlich ihre Bezeichnung als Target- und/oder Fingerabdruck-Gene.
  • Jegliche der differenziell exprimierten Gene, deren weitere Charakterisierung ergibt, dass eine Modulierung der Expression des Gens oder eine Modulation der Aktivität des Genprodukts irgendwelche der mit TH-Zellen-Subpopulation in Verbindung stehenden interessierenden Erkrankungen lindern kann, werden als "Target-Gene" bezeichnet, wie bereits in Abschnitt 5.1 definiert wurde. Solche Target-Gene und Target-Genprodukte bilden zusammen mit den nachfolgend erörterten den Kern der nachfolgend in Abschnitt 5.8 erörterten Verbindungsauffindungsstrategien. Derartige Target-Gene, Target-Genprodukte und/oder Modulierungsverbindungen können ferner als Teil der nachfolgend in Abschnitt 5.9 beschriebenen Behandlungsverfahren für TH-Zellen-Subpopulations-Erkrankungen verwendet werden. Zu derartigen Verfahren können beispielsweise Verfahren gehören, durch die die interessierende TH-Zellen-Subpopulation selektiv erschöpft oder unterdrückt oder alternativ stimuliert oder verstärkt wird.
  • Jegliche der differenziell exprimierten Gene, deren weitere Charakterisierung anzeigt, dass solche Modulationen interessierende, mit TH-Zellen- Subpopulation in Verbindung stehende Erkrankungen nicht positiv beeinflussen können, deren Expressionsmuster jedoch zu einem Genexpressions-"Fingerabdruck"-Muster beitragen, das beispielsweise mit einem mit TH1/TH2 in Verbindung stehenden Krankheitszustand korreliert, werden als "Fingerabdruck-Gen" bezeichnet. "Fingerabdruckmuster" werden nachfolgend in Abschnitt 5.11.1 ausführlicher erörtert. Es sei darauf hingewiesen, dass jegliche der Target-Gene auch als Fingerabdruck-Gene wirken können, ebenso wie die gesamten oder ein Teil der Stoffwechsel-Gene.
  • Es sei ferner darauf hingewiesen, dass die Stoffwechsel-Gene auch gemäß den hier beschriebenen Techniken charakterisiert werden können. Jene Stoffwechsel-Gene, die Informationen geben, welche zeigen, dass Modulation der Expression des Gens oder Modulation der Aktivität des Genprodukts irgendeine mit TH-Zellen-Subpopulation in Verbindung stehende Erkrankung lindern kann, werden auch als "Target-Gene" bezeichnet. Solche Target-Gene und Target-Genprodukte bilden zusammen mit den bereits erörterten den Kern der nachfolgend in Abschnitt 5.8 erörterten Verbindungsauffindungsstrategien und können als Teil der in dem folgenden Abschnitt 5.9 beschriebenen Behandlungsverfahren verwendet werden.
  • In Fällen, bei denen die Charakterisierung eines Stoffwechsel-Gens zeigt, dass Modulation der Genexpression oder Aktivität des Genprodukts interessierende, mit TH-Zellen-Subpopulation in Verbindung stehende Erkrankungen nicht positiv beeinflussen kann, dessen Expression jedoch differenziell exprimiert ist und zu einem Genexpressions-Fingerabdruckmuster beiträgt, das mit beispielsweise einem mit TH1/TH2 in Verbindung stehenden Erkrankungszustand korreliert, können derartige Stoffwechsel-Gene zusätzlich als Fingerabdruck-Gene bezeichnet werden.
  • Es können viele verschiedene Techniken verwendet werden, um die identifizierten Gene weiter zu charakterisieren. Erstens kann die Nukleotidsequenz der identifizierten Gene, die unter Verwendung von Standardtechniken erhalten werden kann, die Fachleuten wohl bekannt sind, beispielsweise zum Aufzeigen von Homologien mit einem oder mehreren bekannten Sequenzmotiven verwendet werden, was Informationen hinsichtlich der biologischen Funktion des identifizierten Genprodukts geben kann.
  • Zweitens kann unter Verwendung von Standardtechniken, die Fachleuten wohl bekannt sind, eine Analyse der Gewebe- und/oder Zelltypverteilung der durch die identifizierten Gene produzierten mRNA durchgeführt werden. Zu derartigen Techniken können beispielsweise Northern, RNase-Schutz und RT-PCR-Analysen gehören. Solche Analysen liefern beispielsweise Informationen darüber, ob die identifizierten Gene in Zelltypen exprimiert werden, von denen erwartet wird, dass sie zu den speziellen, interessierenden, mit TH-Zellen-Subpopulation in Verbindung stehenden Erkrankungen beitragen. Solche Analysen können auch quantitative Informationen in Bezug auf Regulierung der mRNA im Fließgleichgewicht liefern, Daten ergeben, die sich damit befassen, welches der identifizierten Gene ein hohes Regulierungsniveau in Zelltypen zeigt, von denen erwartet werden kann, dass sie zu der interessierenden, mit TH-Zellen-Subpopulation in Verbindung stehenden Erkrankungen beitragen. Standard-in-situ-Hybridisierungstechniken können auch eingesetzt werden, um Informationen darüber zu liefern, welche Zellen innerhalb eines gegebenen Gewebes oder einer gegebenen Population von Zellen das identifizierte Gen exprimieren. Eine solche Analyse kann Informationen hinsichtlich der biologischen Funktion eines identifizierten Gens in Bezug auf eine gegebene, mit TH-Zellen-Subpopulation in Verbindung stehende Erkrankung in Fällen liefern, bei denen vermutlich nur ein Subset der Zellen innerhalb eines Gewebes oder einer Population von Zellen für die Erkrankung relevant ist.
  • Drittens können die Sequenzen der identifizierten Gene unter Verwendung von Standardtechniken verwendet werden, um die Gene auf Genkarten zu positionieren, z.B. Genomkarten der Maus (N. G. Copeland und N. A. Jenkins, 1991, Trends in Genetics 7: 113–118) und des Menschen (D. Cohen et al., 1993, Nature 366: 698–701) Derartige Kartierungsinformationen können Informationen über die Bedeutung von Genen für Erkrankungen des Menschen enthalten, indem beispielsweise Gene identifiziert werden, die auf genetische Regionen verweisen, auf die bekannte genetische, mit TH-Zellen-Subpopulation in Verbindung stehende Erkrankungen verweisen. Zu derartigen Regionen gehört beispielsweise der Locus Scl-1 der Maus, der vermutlich an Leishmaniose beteiligt ist, oder die Chromosomenregion 5g31.1 des Menschen, die ein oder mehrere Loci enthält, die vermutlich die IgE-Produktion in nicht-antigenspezifischer Weise regulieren und daher an Allergie beteiligt sein können, einer TH2-artig zusammenhängenden Erkrankung (D. Marsh et al., 1994, Science 264: 1152–1156).
  • Viertens kann die biologische Funktion der identifizierten Gene direkter durch Einsatz relevanter in vivo- und in vitro-Systeme bewertet werden. Zu in vivo-Systemen können tierische Systeme gehören, sie sind jedoch nicht darauf begrenzt, die natürlicherweise die Symptome der Immunerkrankungen zeigen, oder solche, die gentechnisch verändert worden sind, um derartige Symptome zu zeigen. Solche Systeme können zudem Systeme zur weiteren Charakterisierung der Zelltyp-Differenzierungs- und Effektorfunktion beinhalten und können transgene tierische Systeme, wie die bereits in Abschnitt 5.1.1.1. und dem folgenden Abschnitt 5.7.1 beschriebenen, umfassen, sind jedoch nicht auf diese begrenzt. In vitro-Systeme können Systeme auf Zellbasis beinhalten, die beispielsweise TH1- oder TH2-Zelltypen umfassen, sind jedoch nicht auf diese begrenzt. Die TH-Subpopulationszellen können Zellen vom Wildtyp oder Zellen sein, die nicht dem Wildtyp angehören, die Modifikationen enthalten, die bekanntermaßen oder vermutlich zu der interessierenden, mit TH-Zellen-Subpopulation in Verbindung stehenden Erkrankung beitragen. Derartige Systeme werden nachfolgend in Abschnitt 5.7.2 ausführlich erörtert.
  • Bei der weiteren Charakterisierung der biologischen Funktion der identifizierten Gene kann die Expression dieser Gene innerhalb der in vivo- und/oder in vitro-Systeme moduliert werden, d. h. in beispielsweise transgenen Tieren und/oder Zelllinien entweder überexprimiert oder unterexprimiert werden, und danach kann ihre anschließende Wirkung auf das System in Assays untersucht werden. Die Aktivität der Produkte des identifizierten Gens kann alternativ moduliert werden, indem das Aktivitätsniveau in dem interessierenden in vivo- und/oder in vitro-System erhöht oder abgesenkt wird und ihre anschließende Wirkung danach durch Assays bewertet wird.
  • Die durch solche Charakterisierung erhaltenen Informationen können relevante Verfahren zur Behandlung oder Kontrolle von Immunerkrankungen nahe legen, wie mit TH-Zellen-Subpopulation in Verbindung stehenden Erkrankungen, an denen das interessierende Gen beteiligt ist. Zu relevanten Behandlungsverfahren können beispielsweise nicht nur eine Modulation der Genexpression und/oder der Aktivität des Genprodukts gehören, sondern auch eine selektive Depletion oder Stimulation der interessierenden TH-Zellen-Subpopulation. Charakterisierungsverfahren, wie die hier beschriebenen, können zeigen, ob eine derartige Modulation positiv oder negativ wäre. "Positive Modulation" bezieht sich hier auf einen Anstieg der Genexpression oder Aktivität des interessierenden Gens oder Genprodukts, oder eine Stimulierung einer TH-Zellen-Subpopulation gegenüber derjenigen, die in Abwesenheit der Modulationsbehandlung beobachtet wird. "Negative Modulation" bezieht sich hier auf die Abnahme der Genexpression oder Aktivität oder eine Depletion einer TH-Zellen-Subpopulation relativ zu derjenigen, die in Abwesenheit der Modulationsbehandlung beobachtet wurde. "Stimulation" und "Depletion" sind wie oben in Abschnitt 3 definiert. Behandlungsverfahren werden nachfolgend in Abschnitt 5.9 erörtert.
  • 5.4 DIFFERENTIELL EXPRIMIERTE UND PATHWAY-GENE
  • Im Folgenden sind differentiell exprimierte Gene wie die oben in Abschnitt 5.1.1 identifizierten und Pathway-Gene wie die oben in Abschnitt 5.2 identifizierten beschrieben.
  • Das differentiell exprimierte und Pathway-Gen der Erfindung ist unten in Tabelle 1 aufgelistet. Differentiell exprimierte Gensequenzen sind in 17 und 24 aufgelistet. Nukleotidsequenzen, die über Differential-Display-Technik identifiziert wurden, werden im Folgenden als Band 200 bezeichnet. Das Gen, das diesen Sequenzen entspricht, wird im Folgenden als das Gen 200 bezeichnet. Tabelle 1 listet ein differentiell exprimiertes Gen auf, das beispielsweise durch die Paradigmen identifiziert wurde, welche oben in Abschnitt 5.1.1.1 und unten in den Beispielen in den Abschnitten 6–8 diskutiert werden.
  • Tabelle 1 fasst Informationen bezüglich der weiteren Charakterisierung eines solchen Gens zusammen. Tabelle 2 listet E. coli-Klone auf, die bei der Agricultural Research Service Culture Collection (NRRL) oder der American Type Culture Collection (ATCC) hinterlegt sind und die Sequenzen enthalten, die in dem Gen der Tabelle 1 gefunden wurden.
  • In Tabelle 1 gibt die Spalte mit dem Titel „Diff. Exp." das Merkmal der differentiellen Expression an, anhand dessen die Sequenz identifiziert wurde.
  • In dieser Spalte bezeichnet „TH1" eine Sequenz, die einem Gen entspricht, das bevorzugt in reifen, voll differenzierten TH1-Zellen relativ zu TH2-Zellen exprimiert ist. Bevorzugte Expression kann quantitativ oder quantitativ sein, wie oben in Abschnitt 5.1 beschrieben.
  • Gewebeexpressionsmuster sind ebenfalls in Tabelle 1 zusammengefasst. Die Spalte mit dem Titel „Gewebe-/Zelldist." listet Gewebe- und/oder Zelltypen auf, in denen die Expression des Gens getestet wurde und ob eine Expression des Gens innerhalb eines gegebenen Gewebe- bzw. Zelltyps beobachtet wurde. Im Besonderen zeigt „+" nachweisbare mRNA aus dem fraglichen Gen an. Wenn nicht anderweitig vermerkt, bezieht sich „+" auf alle Proben eines gegebenen Gewebe- bzw. Zelltyps, der getestet wurde. „Nachweisbar" hat in der vorliegenden Beschreibung die oben in Abschnitt 5.1 beschriebene Bedeutung.
  • Das Gen, das in Tabelle 1 aufgelistet ist, kann unter Benutzung von Klonverfahren gewonnen werden, die dem Fachmann gut bekannt sind und zu denen insbesondere die Benutzung von geeigneten Sonden zählt, um das Gen innerhalb einer geeigneten cDNA- oder gDNA (genomische DNA)-Bibliothek nachzuweisen. (Siehe beispielsweise Sambrook u.a., 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratories, was per Verweis in diese Patentschrift eingebunden ist.) Sonden für die Sequenzen, die in dieser Patentschrift beschrieben werden, können direkt aus den isolierten Klonen gewonnen werden, die bei der NRRL hinterlegt sind, wie unten in Tabelle 2 angegeben. Alternativ können Oligonukleotidsonden für die Gene auf der Grundlage der DNA-Sequenzen synthetisiert werden, die in dieser Patentschrift in 17 und 24 offenbart werden.
  • Die Sonden können benutzt werden, um cDNA-Bibliotheken zu durchsuchen, die aus einer geeigneten Zelle oder Zelllinie hergestellt werden, in denen das Gen transkribiert wird. Geeignete Zelllinien können u.a. Dorris-, Ae7-, D10.G4-, DAX-, D1.1- und CDC25-Zelllinien sein. Außerdem können gereinigte primäre naive T-Zellen benutzt werden, die entweder aus transgenen oder aus nicht-transgenen Stämmmen abgeleitet wurden. Alternativ können die in dieser Patentschrift beschriebenen Gene aus einer cDNA-Bibliothek kloniert werden, die beispielsweise aus NIH-3T3-Zelllinien, welche mit dem Ha-ras(EJ)-Gen transfiziert wurden, aus 5C10-Zellen und peripheren Blutlymphozyten erstellt wurde.
  • TABELLE 1 DIFFERENTIELL EXPRIMIERTE UND PATHWAY-GENE
    Figure 00510001
  • Tabelle 2 unten listet isolierte E. coli-Klone auf, die Sequenzen innerhalb des neuartigen Gens enthalten, das in Tabelle 1 aufgelistet ist.
  • TABELLE 2
    Figure 00510002
  • Figure 00520001
  • In dieser Patentschrift bezeichnet „differentiell exprimiertes Gen" (d.h. Target- oder Fingerprint-Gen) oder „Pathway-Gen" (a) ein Gen, das enthält: mindestens eine der DNA-Sequenzen, die in dieser Patentschrift offenbart werden (wie in 17 und 24 dargestellt), oder die in den in Tabelle 2 aufgelisteten Klonen enthalten sind, die bei der NRRL oder ATCC hinterlegt sind; (b) eine beliebige DNA-Sequenz, die die Aminosäurensequenz kodiert, welche kodiert ist durch: die DNA-Sequenzen, die in dieser Patentschrift offenbart werden (wie in 17 und 24 dargestellt), die in den in Tabelle 2 aufgelisteten Klonen enthalten sind, welche bei der NRRL oder ATCC hinterlegt sind, die in der Kodierregion des Gens enthalten sind, zu dem die DNA-Sequenzen gehören, in dieser Patentschrift offenbart werden (wie in 17 und 24 dargestellt) oder die in den Klonen enthalten sind, welche in den in Tabelle 2 aufgelisteten Klonen enthalten sind und welche bei der NRRL oder ATCC hinterlegt sind; (c) eine beliebige DNA-Sequenz, die zum Komplement zu: den Kodiersequenzen, die in dieser Patentschrift offenbart werden (wie in 17 und 24 dargestellt), die in den Klonen enthalten sind, welche in Tabelle 2 aufgelistet und bei der NRRL oder ATCC hinterlegt sind, oder die in der Kodierregion des Gens enthalten sind, zu dem die DNA-Sequenzen gehören, in dieser Patentschrift offenbart werden (wie in 17 und 24 dargestellt) oder die in den Klonen enthalten sind, welche in Tabelle 2 aufgelistet und bei der NRRL oder ATCC hinterlegt sind, unter hoch stringenten Bedingungen hybridisiert, z.B. Hybridisierung an filtergebundene DNA in 0,5 M NaPHO4, 7% Natriumdodecylsulfat (SDS), 1 mM EDTA bei 65°C und Waschen in 0,1 × SSC/0,1% SDS bei 68°C (Ausubel F. M. u.a., Hrsg., 1989, Current Protocols in Molecular Biology, Bd. I, Green Publishing Associates, Inc., und John Wiley & sons, Inc., New York, auf S. 2.10.3), und die ein Genprodukt kodiert, das funktional äquivalent ist zu einem Genprodukt, das kodiert ist durch ein Gen aus (a) oben; und/oder (d) einer beliebigen DNA-Sequenz, die zum Komplement zu: den Kodiersequenzen, die in dieser Patentschrift offenbart werden (wie in 17 und 24 dargestellt), die in den Klonen enthalten sind, welche in Tabelle 2 aufgelistet und bei der NRRL hinterlegt sind, oder die in der Kodierregion des Gens enthalten sind, zu dem die DNA-Sequenzen gehören, in dieser Patentschrift offenbart werden (wie in 17 und 24 dargestellt) oder die in den Klonen enthalten sind, welche in Tabelle 2 aufgelistet und bei der NRRL oder ATCC hinterlegt sind, unter weniger stringenten Bedingungen wie beispielsweise moderat stringenten Bedingungen hybridisiert, z.B. Waschen in 0,2 × SSC/0,1% SDS bei 42°C (Ausubel u.a., 1989, supra), das jedoch immer noch ein Genprodukt kodiert, das funktional äquivalent ist zu einem Genprodukt, das kodiert ist durch ein Gen aus (a) oben. Die Erfindung schließt auch degenerierte Varianten der Sequenzen (a) bis (d) ein.
  • Die Erfindung umfasst die folgenden Nukleotide, Wirtszellen, die solche Nukleotide exprimieren, und die Expressionsprodukte solcher Nukleotide: (a) Nukleotide, die ein Produkt eines differentiell exprimierten und/oder Pathway-Gens eines Säugetiers kodieren, insbesondere ein humanes oder murines Gen-200-Produkt; (b) Nukleotide, die Abschnitte eines Produktes eines differentiell exprimierten und/oder Pathway-Gens kodieren, die seinen funktionalen Domänen entsprechen, sowie die Polypeptidprodukte, die von solchen Nukleotidsequenzen kodiert werden, und bei denen, im Falle von Genprodukten des Rezeptor-Typs, zu solchen Domänen insbesondere extrazelluläre Domänen (ECD), Transmembrandomänen (TM) und zytoplasmatische Domänen (CD) gehören; (c) Nukleotide, die Mutanten eines differentiell exprimierten Gen-200-Produktes kodieren, bei dem alle Domänen oder ein Teil seiner Domänen zerstört oder verändert sind, und wobei, im Falle von Genprodukten des Rezeptor-Typs, zu solchen Mutanten insbesondere lösliche Rezeptoren, bei denen die gesamte oder ein Abschnitt der TM zerstört ist, und nicht-funktionale Rezeptoren, bei denen die gesamte oder ein Abschnitt der CD zerstört ist, gehören; und (d) Nukleotide, die Fusionsproteine kodieren, welche ein differentiell exprimiertes Gen-200-Produkt enthalten oder eine seiner Domänen, die mit einem anderen Polypeptid fusioniert ist.
  • Die Erfindung schließt auch Nukleinsäuremoleküle, vorzugsweise DNA-Moleküle, ein, die mit den DNA-Sequenzen (a) bis (d) des vorhergehenden Absatzes hybridisieren und daher deren Komplemente sind. Solche Hybridisierungsbedingungen können wie oben beschrieben hoch stringent oder weniger stringent sein. In Fällen, in denen die Nukleinsäuremoleküle Deoxyoligonukleotide („Oligos") sind, können hoch stringente Bedingungen z.B. Waschen in 6 × SSC/0,05% Natriumpyrophosphat bei 37°C (bei 14 bp Oligos), 48°C (bei 17 bp Oligos), 55°C (bei 20 bp Oligos) und 60°C (für 23 bp Oligos) bedeuten. Diese Nukleinsäuremoleküle können als Antisense-Moleküle des Target-Gen agieren, die beispielsweise nützlich sind bei der Regulierung des Target-Gens und/oder als Antisense-Primer in Amplifikationsreaktionen von Nukleinsäuresequenzen von Target-, Fingerprint- und/oder Pathway-Genen. Daneben können solche Sequenzen als Teil von Sequenzen von Ribozymen und/oder Dreifach-Helices benutzt werden, was ebenfalls nützlich bei der Regulierung des Target-Gens ist. Des Weiteren können solche Moleküle als Komponenten diagnostischer Verfahren benutzt werden, mit denen die Gegenwart oder Prädisposition zu einer Immunstörung, z.B. einer durch TH-Zell-Subpopulationen bedingten Störung, nachgewiesen werden können.
  • Die Erfindung umfasst auch (a) DNA-Vektoren, die eine/s der vorgenannten Kodiersequenzen und/oder ihrer Komplemente (d.h. Antisense) enthält; (b) DNA- Expressionsvektoren, die eine der vorgenannten Kodiersequenzen enthalten, welche operativ mit einem regulatorischen Element assoziiert sind, das die Expression der Kodiersequenzen regelt; und (c) genetisch veränderte Wirtszellen, die eine der vorgenannten Kodiersequenzen enthalten, welche operativ mit einem regulatorischen Element assoziiert sind, das die Expression der Kodiersequenzen in der Wirtszelle regelt. Im Sinne dieser Patentschrift gehören zu den regulatorischen Elementen insbesondere induzierbare und nicht-induzierbare Promotoren, Enhancer, Operatoren und andere dem Fachmann bekannte Elemente, die die Expression antreiben und regulieren. Zu solchen regulatorischen Elementen gehören insbesondere das unmittelbare frühe Gen des Zytomegalovirus hCMV, die frühen oder späten Promotoren des SV40-Adenovirus, das lac-System, das trp-System, das TAC-System, das TRC-System, die Hauptoperator- und -promotorregionen des Phagus A, die Steuerregionen des fd-Mantelproteins, der Promotor der 3-Phosphoglycerat-Kinase, die Promotoren der Säurephosphatase und die Promotoren der α-Mating-Faktoren der Hefe. Die Erfindung schließt Fragmente jeder der in dieser Patentschrift offenbarten DNA-Sequenzen ein.
  • Zusätzlich zu den oben beschriebenen Gensequenzen können Homologe dieser Gensequenzen und/oder Kodiersequenzen dieser Gene in ihrer vollen Länge, wie sie in derselben oder in anderen Spezies anwesend sein können, ohne unnötiges Experimentieren durch molekularbiologische Techniken, die auf dem Fachgebiet bekannt sind, identifiziert und isoliert werden. Daneben können Gene an anderen genetischen Loci innerhalb des Genoms derselben Spezies existieren, die Proteine kodieren, welche eine weitgehende Homologie zu einer oder mehreren Domänen solcher Genprodukte aufweisen. Diese Gene können ebenfalls über ähnliche Techniken identifiziert werden.
  • Beispielsweise kann die isolierte differentiell exprimierte Gensequenz markiert und zur Durchsuchung einer cDNA-Bibliothek benutzt werden, die aus mRNA erstellt wurde, welche aus dem fraglichen Organismus gewonnen wurde. Die Hybridisierungsbedingungen sollten von geringerer Stringenz sei, wenn die cDNA-Bibliothek von einem anderen Organismus abgeleitet wurde als dem Organismus-Typ, aus dem die markierte Sequenz abgeleitet wurde. cDNA-Screening kann auch Klone identifizieren, die aus alternativ gespleißten Transkripten in derselben oder einer anderen Spezies abgeleitet wurde. Alternativ kann das markierte Fragment benutzt werden, um eine Genombibliothek zu durchsuchen, die von dem fraglichen Organismus abgeleitet wurde, wobei wiederum angemessen stringente Bedingungen angelegt werden. Niedrige Stringenzbedingungen werden dem Fachmann gut bekannt sein und variieren vorhersehbar in Abhängigkeit von dem spezifischen Organismus, aus dem die Bibliothek und die markierten Sequenzen abgeleitet sind. Als Leitlinie bezüglich solcher Bedingungen siehe beispielsweise Sambrook u.a., 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratories, N. Y. und Ausubel u.a., 1989, Current Protocols in Molecular Biology, (Green Publishing Associates and Wiley Interscience, N. Y.).
  • Daneben kann eine bislang unbekannte Sequenz vom Typ eines differentiell exprimierten oder eines Pathway-Gens isoliert werden, indem eine PCR unter Verwendung von zwei degenerierten Oligonukleotid-Primerpoolen durchgeführt wird, welche auf der Grundlage von Aminosäuresequenzen in dem fraglichen Gen angelegt werden. Das Template für die Reaktion kann cDNA sein, die durch reverse Transkription von mRNA gewonnen wird, die aus humanen oder nicht-humanen Zelllinien oder Geweben erstellt wurde, von denen bekannt ist oder gemutmaßt wird, dass sie ein Allel eines differentiell exprimierten oder Pathway-Gens exprimieren. Das PCR- Produkt kann subkloniert und sequenziert werden um sicherzustellen, dass die amplifizierten Sequenzen die Sequenzen einer Nukleinsäuresequenz in der Art differentiell exprimierter oder Pathway-Gene abbilden.
  • Das PCR-Fragment kann dann benutzt werden, um mit verschiedenen Verfahren einen cDNA-Klon in voller Länge zu isolieren. Beispielsweise kann das amplifizierte Fragment benutzt werden, um eine Bakteriophagen-cDNA-Bibliothek zu durchsuchen. Alternative kann das markierte Fragment benutzt werden, um eine genomische Bibliothek zu durchsuchen.
  • PCR-Technik kann auch eingesetzt werden, um cDNA-Sequenzen in voller Länge zu isolieren. Beispielsweise kann RNA nach standardmäßigen Methoden aus einer geeigneten zellularen oder Gewebsquelle isoliert werden. An der RNA kann eine reverse Transriptionsreaktion durchgeführt werden, wobei ein Oligonukleotid-Primer, der spezifisch für das 5'-Ende des amplifizierten Fragments ist, als Startpunkt für die Synthese des ersten Stranges benutzt wird. Der daraus resultierende RNA/DNA-Hybrid kann dann unter Anwendung einer standardmäßigen terminalen Transferasereaktion mit einem Schweif aus Guaninen versehen werden, der Hybrid kann mit RNAase H verdaut werden, und die Zweitstrangsynthese kann dann mit einem PolyC-Primer ausgelöst werden. So können die cDNA-Sequenzen aufwärts vom amplifizierten Fragment isoliert werden. Als Review von Klonierstrategien, die benutzt werden können, siehe z.B. Sambrook u.a., 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratorien, N. Y. und Ausubel u.a., 1989, Current Protocols in Molecular Biology, (Green Publishing Associates and Wiley Interscience, N. Y.).
  • In Fällen, in denen das identifizierte differentiell exprimierte oder Pathway-Gen das normale oder Wildtyp-Gen ist, kann dieses Gen benutzt werden, um Mutantenallele des Gens zu isolieren. Solch eine Isolierung ist bei Prozessen und Störungen vorzuziehen, von denen bekannt ist oder gemutmaßt wird, dass sie eine genetischen Ursache haben. Mutantenallele können aus Individuen isoliert werden, von denen entweder bekannt ist oder gemutmaßt wird, dass sie einen Genotyp aufweisen, der zu Symptomen, die durch Störungen der T-Zell-Subpopulation bedingt sind, beiträgt. Mutantenallele und Mutantenallelprodukte können dann in den unten beschriebenen therapeutischen und diagnostischen Assay-Systemen eingesetzt werden.
  • Eine cDNA eines Mutantengens kann beispielsweise mittels PCR isoliert werden, eine Technik, die dem Fachmann gut bekannt ist. In diesem Fall kann der erste cDNA-Strang synthetisiert werden, indem ein Oligo-dT-Oligonukleotid auf mRNA hybridisiert wird, die aus Gewebe isoliert wurde, von dem bekannt ist oder gemutmaßt wird, dass es in einem Individuum exprimiert ist, das vermutlich das Mutantenallel trägt, und indem der neue Strang mit reverser Transkriptase erweitert wird. Der zweite Strang der cDNA wird dann unter Verwendung eines Oligonukleotids synthetisiert, das spezifisch an dem 5'-Ende des normalen Gens hybridisiert. Mittels dieser beiden Primer wird das Produkt dann über PCR amplifiziert, in einen geeigneten Vektor kloniert und einer DNA-Sequenzanalyse nach Verfahren unterzogen, die dem Fachmann gut bekannt sind. Durch Vergleichen der DNA-Sequenz des Mutantengens mit der des normalen Gens können Mutation(en), die für den Verlust oder die Veränderung der Funktion des Mutantengenproduktes verantwortlich ist/sind, bestimmt werden.
  • Alternativ kann aus einem Gewebe, von dem bekannt ist oder gemutmaßt wird, dass es das fragliche Gen in einem Individuum exprimiert, von dem bekannt ist oder gemutmaßt wird, dass es das Mutantenallel trägt, eine genomische oder cDNA-Bibliothek erstellt und mittels DNA bzw. RNA durchsucht werden. Das normale Gen oder ein beliebiges passendes Fragment davon kann dann markiert und als Sonde benutzt werden, um das entsprechende Mutantenallel in der Bibliothek zu identifizieren. Der Klon, der dieses Gen enthält, kann dann mit Verfahren, die auf dem Fachgebiet routinemäßig praktiziert werden, gereinigt und der Sequenzanalyse wie oben in diesem Abschnitt beschrieben unterzogen werden.
  • Außerdem kann eine Expressionsbibliothek erstellt werden mit DNA, die aus einem Gewebe, von dem bekannt ist oder gemutmaßt wird, dass es das fragliche Gen in einem Individuum exprimiert, von dem bekannt ist oder gemutmaßt wird, dass es das Mutantenallel trägt, isoliert wurde oder mit cDNA, die aus solchem Gewebe synthetisiert wurde. Auf diese Weise können Genprodukte, die von dem mutmaßlichen Mutantengewebe produziert wurden, exprimiert und mit standardmäßigen Antikörper-Screening-Techniken in Verbindung mit Antikörpern, die gegen das normale Genprodukt gezüchtet wurden, durchsucht werden wie unten in Abschnitt 5.6 beschrieben. (Zu Screening-Techniken siehe beispielsweise Harlow, E. und Lane, Hrsg., 1988, Antibodies: „A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor.) In Fällen, in denen die Mutation zu einem exprimierten Genprodukt mit veränderter Funktion führt (z.B. als Resultat einer Missense-Mutation), ist es sehr wahrscheinlich, dass Kreuzreaktionen zwischen einem multiklonalen Antikörper und dem Mutantengenprodukt auftreten. Bibliotheksklone, die über ihre Reaktion mit solchen markierten Antikörpern nachgewiesen wurden, können gereinigt und einer Sequenzanalyse wie oben in diesem Abschnitt beschrieben unterzogen werden.
  • 5.5 PRODUKTE DIFFERENTIELL EXPRIMIERTER UND PATHWAY-GENE
  • Zu den Produkten differentiell exprimierter und Pathway-Gene gehören diejenigen Proteine, die von den differentiell exprimierten und Pathway-Genen kodiert werden, welche den oben in Abschnitt 5.4 beschriebenen Gensequenzen entsprechen, wie beispielsweise die Peptide, die in 17 und 24 aufgelistete sind.
  • Außerdem können zu den Produkten differentiell exprimierter und Pathway-Gene Proteine gehören, die funktional äquivalente Genprodukte darstellen. Zu solchen Genprodukten gehören insbesondere natürliche Varianten der Peptide, die in 17 und 24 aufgelistete sind. Solch ein äquivalentes Produkt differentiell exprimierter und Pathway-Gene kann Löschungen, Hinzufügungen oder Substitutionen von Aminosäureresten innerhalb der Aminosäuresequenz, die von den oben im Abschnitt 5.4 beschriebenen differentiell exprimierten und Pathway-Gensequenzen kodiert werden, enthalten, die aber zu einer stillen Veränderung führen und so ein funktional äquivalentes Produkt differentiell exprimierter und Pathway-Gene produzieren. Aminosäuresubstitutionen können auf der Grundlage von Ähnlichkeiten in der Polarität, Ladung, Löslichkeit, Hydrophobizität, Hydrophilizität und/oder der amphipathischen Natur der beteiligten Reste vorgenommen werden. Beispielsweise gehören zu den nicht-polaren (hydrophobischen) Aminosäuren Alanin, Leucin, Isoleucin, Valin, Proline, Phenylalanin, Tryptophan und Methionin; zu den polaren Aminosäuren gehören Glycin, Serin, Threonin, Cystein, Tyrosin, Asparagin und Glutamin; zu den positiv geladenen (basischen) Aminosäuren gehören Arginin, Lysin und Histidin; und zu den negativ geladenen (sauren) Aminosäuren gehören Aspartinsäure und Glutaminsäure. In dieser Patentschrift bezeichnet „funktional äquivalent" ein Protein, das in der Lage ist, eine im Wesentlichen ähnliche in-vivo-Aktivität zu zeigen wie die Produkte endogener differentiell exprimierter und Pathway-Gene, die von den oben in Abschnitt 5.4 beschriebenen differentiell exprimierten und Pathway-Gensequenzen kodiert werden. Alternativ, wenn sie als Abschnitt von Assays wie die oben in Abschnitt 5.3 beschriebenen eingesetzt werden, kann „funtional äquivalent" Peptide bezeichnen, die in der Lage sind, mit anderen zellulären und extrazellulären Molekülen in einer Weise zu interagieren, die im Wesentlichen ähnlich der Art und Weise ist, wie der entsprechende Abschnitt des Produktes endogener differentiell exprimierter und Pathway-Gene dies tun würde.
  • Peptide, die einer oder mehreren Domänen des differentiell exprimierten Gen-200-Produktes (z.B. TM, ECD oder CD) oder der verkürzten oder gelöschten differentiell exprimierten Gen-200-Produkte (z.B. im Fall von Genprodukten des Rezeptor-Typs) oder der Proteine, in denen die differentiell exprimierten Gen-200-Produkte in voller Länge, ein differentiell exprimiertes Gen-200-Peptid oder ein verkürztes oder gelöschtes differentiell exprimiertes Gen-200-Produkt mit einem nicht verwandten Protein fusioniert ist, entsprechen, gehören ebenfalls zum Umfang der Erfindung und können auf der Grundlage der differentiell exprimierten Gen-200-Nukleotide und Aminosäuresequenzen, die in diesem Abschnitt und oben im Abschnitt 5.4 offenbart sind, gestaltet sein. Zu solchen Fusionsproteinen gehören insbesondere IgFC-Fusionen, die das differentiell exprimierte oder Pathway-Gen stabilisieren und das Halbleben in vivo verlängern; oder Fusionen mit einer beliebigen Aminosäuresequenz, die es dem Fusionsprotein erlauben, an der Zellmembran verankert zu werden und dass Peptide an der Zelloberfläche gezeigt werden, oder Fusionen mit einem Enzym, fluoreszierenden Protein oder lumineszenten Protein, die eine Markerfunktion bereitstellen.
  • Andere Mutationen an der Kodiersequenz des Produktes differentiell exprimierter oder Pathway-Gene können produziert werden, um Polypeptide zu generieren, die besser für die Expression, das Scale-up usw. in den gewählten Wirtszellen geeignet sind. Beispielsweise können Cystein-Reste gelöscht oder durch eine andere Aminosäure ersetzt werden, um Disulfidbrücken zu eliminieren; im Falle abgesonderter oder transmembraner Proteine können N-verbundene Glykosylierungsstelle verändert oder eliminiert werden, um beispielsweise die Expression eines homogenen Produktes zu erreichen, das leichter aus Hefewirten, von denen bekannt ist, dass sie N-verbunde Stellen hyperglykosylieren, entnommen und gereinigt werden kann. Zu diesem Zweck werden verschiedene Aminosäuresubstitutionen an einer oder beiden der ersten oder dritten Aminosäurepositionen von einer oder mehreren beliebigen Erkennungssequenzen für die Glykosylierung (N-X-S oder N-X-T) und/oder eine Aminosäurendeltion an der zweiten Position einer oder mehrerer beliebiger solcher Erkennungssequenzen die Glykosylierung des Proteins an der modifizierten Tripeptidsequenz verhindern. (Siehe, z.B. Miyajima u.a., 1986, EMBO J. 5 (6): 1193–1197).
  • Die Produkte differentiell exprimierter oder Pathway-Gene können durch Synthesetechniken oder über rekombinante DNA-Technologie unter Verwendung von Techniken hergestellt werden, die auf dem Fachgebiet gut bekannt sind. So werden in dieser Patentschrift Verfahren zur Herstellung der differentiell exprimierten oder Pathway-Gen-Polypeptide und -Peptide der Erfindung beschrieben. Erstens können die Polypeptide und Peptide der Erfindung mit Techniken, die auf dem Fachgebiet gut bekannt sind, synthetisiert oder hergestellt werden. Siehe beispielsweise Creighton, 1983, Proteins: Structures and Molecular Principles, W. H. Freeman and Co., N. Y., was per Verweis in diese Patentschrift eingebunden ist. Peptide können beispielsweise auf einer festen Unterlage oder in Lösung synthetisiert werden.
  • Alternativ können rekombinante DNA-Verfahren, die dem Fachmann gut bekannt sind, benutzt werden, um Expressionsvektoren zu erstellen, die Kodiersequenzen des differentiell exprimierten oder Pathway-Genproteins und geeignete Steuersignale für Transkriptions/Translation enthalten. Zu diesen Verfahren gehören beispielsweise rekombinante in-vitro DNA-Techniken, Synthesetechniken und in-vivo Rekombination/genetische Rekombination. Siehe beispielsweise die Techniken, die bei Sambrook u.a., 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N. Y., was per Verweis in diese Patentschrift eingebunden ist, und bei Ausubel, 1989, supra beschrieben sind. Alternativ kann RNA, die zur Kodierung von Proteinsequenzen von differentiell exprimierten oder Pathway-Genen fähig ist, chemisch synthetisiert werden, beispielsweise unter Verwendung von Synthetisierern. Siehe beispielsweise die Techniken, die bei Gait, M. J., Hrsg., 1984, „Oligonukleotide Synthesis", IRL Press, Oxford, was per Verweis in diese Patentschrift eingebunden ist, beschrieben sind.
  • Es können verschiedene Wirt-Expressionsvektorsysteme genutzt werden, um die Kodiersequenzen von differentiell exprimierten oder Pathway-Genen der Erfindung zu exprimieren. Solche Wirt-Expressionssyteme stellen Vehikel dar, mit denen die fraglichen Kodiersequenzen produziert und dann gereinigt werden können, sie stellen aber auch Zellen dar, die, wenn mit den geeigneten Nukleotidkodiersequenzen transformiert oder transfiziert, das Protein des differentiell exprimierten oder Pathway-Gens der Erfindung in situ zeigen. Zu diesen gehören insbesondere Mikroorganismen wie Bakterien (z.B. E. coli, B. subtilis), die mit Expressionsvektoren aus rekombinanter Bakteriophagen-DNA, Plasmid-DNA oder Kosmid-DNA transformiert wurden, welche die Proteinkodiersequenzen des differentiell exprimierten oder Pathway-Gens enthalten; Hefen (z.B. Saccharomyces, Pichia), die mit rekombinanten Hefe Expressionsvektoren transformiert wurden, welche die Proteinkodiersequenten des differentiell exprimierten oder Pathway-Gens enthalten; Insektenzellsysteme, die mit rekombinanten Viren-Expressionsvektoren (z.B. Baculovirus) infiziert wurden, welche die Proteinkodiersequenten des differentiell exprimierten oder Pathway-Gens enthalten; Planzenzellsysteme die mit rekombinanten Viren-Expressionsvektoren (z.B. Blumenkohlmosaikvirus, CaMV; Tabakmosaikvirus, TMV) infiziert oder mit rekombinanten Plasmid-Expressionsvektoren (z.B. Ti-Plasmid) transformiert wurden, welche die Proteinkodiersequenten des differentiell exprimierten oder Pathway-Gens enthalten; oder Säugetier-Zellsysteme (z.B. COS, CHO, BHK, 293, 3T3), die rekombinante Expressionsprodukte beherbergen, welche Promotoren enthalten, die vom Genom von Säugetierzellen (z.B. Metallohioneinpromotor) oder von Säugetierviren (z.B. später Promotor des Adenovirus; der Promotor des Vacciniavirus 7.5K) abgeleitet sind.
  • In bakteriellen Systemen können eine Anzahl von Expressionsvektoren vorteilhaft ausgewählt werden, in Abhängigkeit von der beabsichtigten Verwendung des Proteins des differentiell exprimierten oder Pathway-Gens, das exprimiert wird. Wenn beispielsweise eine große Menge eines solchen Proteins produziert werden soll, beispielsweise zur Generierung von Antikörpern oder zur Überprüfung einer Peptidbibliothek, können Vektoren wünschenswert sein, die die Expression hoher Grade von Fusionsproteinprodukten, die einfach gereinigt werden, veranlassen. Zu solchen Vektoren gehören insbesondere der Expressionsvektor pUR278 des E. coli (Ruther u.a., 1983, EMBO J. 2: 1791), bei dem die Proteinkodiersequenten des differentiell exprimierten oder Pathway-Gens individuell in den Vektor im Rahmen mit der lacZ-Kodierregion ligiert werden können, so dass ein Fusionsprotein produziert wird; pIN-Vektoren (Inouye & Inouye, 1985, Nucleic Acids Res. 13: 3101–3109; Van Heeke & Schuster, 1989, J. Biol. Chem. 264: 5503–5509) und ähnliche. pGEX-Vektoren können ebenfalls benutzt werden, um fremde Polypeptide mit Gluthion-S-Transferase (GST) als Fusionsproteine zu exprimieren. Im Allgemeinen sind solche Fusionsproteine löslich und können leicht durch Anlagerung an Glutathion-Agarose-Kügelchen und nachfolgend durch Elution in Anwesenheit von freiem Gluthathion aus lysierten Zellen gereinigt werden. Die pGEX-Vektoren sind so beschaffen, dass sie Abspaltungsstellen für Thrombin oder Faktor-Xa-Protease enthalten, so dass das klonierte Target-Genprotein von der GST-Moietät gelöst werden kann.
  • In einem Insektensystem wird der Nuklearpolyhedrose-Virus Autographa californica (AcNPV) als ein Vektor zur Expression fremder Gene verwendet. Der Virus wächst in Spodoptera-frugiperda-Zellen. Die Kodiersequenz des differentiell exprimierten oder Pathway-Gens kann individuell in die nicht lebenswichtigen Regionen (beispielsweise das Polyhedrin-Gen) des Virus kloniert und unter die Kontrolle eines AcNPV-Promotors (beispielsweise des Polyhedrin-Promotors) gestellt werden. Die erfolgreiche Einsetzung der Kodiersequenz des differentiell exprimierten oder Pathway-Gens wird zur Inaktivierung des Polyhedrin-Gens und zur Produktion eines nicht-okkludierten rekombinanten Virus (d.h. eines Virus, dem der Proteinmantel fehlt, für den das Polyhedrin-Gen kodiert) führen. Diese rekombinanten Viren werden dann benutzt, um Spodoptera-frugiperda-Zellen, in denen das eingesetzte Gen exprimiert ist, zu infizieren (z.B. siehe Smith u.a., 1983, J. Viol. 46: 584; Smith US-Patentschrift 4,215,051).
  • In Säugetier-Wirtszellen kann eine Anzahl von viral-basierten Expressionssystemen benutzt werden. In Fällen, in denen ein Adenovirus als ein Expressionsvektor benutzt wird, kann die fragliche Kodiersequenz des differentiell exprimierten oder Pathway-Gens an einen Transkriptions-/Translations-Steuerkomplex, z.B. an den späten Promotor und die tripartite Leadersequenz) angelagert sein. Dieses chimärische Gen kann dann durch Rekombination in vitro oder in vivo in das Adenovirusgenom eingesetzt werden. Das Einsetzen in eine nicht-lebensnotwendige Region des viralen Genoms (z.B. Region E1 oder E3) wird zu einem rekombinanten Virus führen, der lebensfähig und in der Lage ist, ein Protein des differentiell exprimierten oder Pathway-Gens in infizierten Wirten zu exprimieren (z.B. siehe Logan & Shenk, 1984, Proc. Natl. Acad. Sci USA 81: 3655–3659). Spezifische Initiationssignale können ebenfalls zur effizienten Translation eingesetzter Kodiersequenzen des differentiell exprimierten oder Pathway-Gens notwendig sein. Zu diesen Signalen gehören das ATG-Initiationskodon und benachbarte Sequenzen. In Fällen, in denen ein gesamtes differentiell exprimiertes oder Pathway-Gen, einschließlich seines eigenen Initiationskodons und benachbarter Sequenzen, in den geeigneten Expressionsvektor einsetzt wird, können zusätzliche Translationssteuersignale unnötig sein. In Fällen jedoch, in denen nur ein Abschnitt der Kodiersequenz des differentiell exprimierten oder Pathway-Gens eingesetzt wird, müssen exogene Translationssteuersignale, einschließlich vielleicht des ATG-Initiationskodons, bereitgestellt werden. Daneben muss das Initiationskodon in Phase mit dem Leserahmen der gewünschten Kodiersequenz sein, um die Translation des gesamten Einsatzes sicherzustellen. Diese exogenen Translationssteuersignale und Initiationskodone können verschiedener Herkunft, sowohl synthetischer als auch natürlicher, sein. Die Effizienz der Expression kann durch das Einschließen von geeigneten Transkriptions-Enhancerelementen, Transkriptionsterminatoren usw. gefördert werden (siehe Bittner u.a., 1987, Methods in Enzymol. 153: 516–544).
  • Außerdem kann ein Wirtszellenstamm ausgewählt werden, der die Expression der eingesetzten Sequenzen moduliert oder das Genprodukt in der spezifisch gewünschten Weise modifiziert und verarbeitet. Solche Modifikationen (z.B. Glykosilierung) und Verarbeitung (z.B. Abspaltung) der Proteinprodukte kann für die Funktion des Proteins wichtig sein. Unterschiedliche Wirtszellen haben charakteristische und spezifische Mechanismen zur post-translationalen Verarbeitung und Modifizierung von Proteinen. Es können geeignete Zelllinien oder Wirtssysteme ausgewählt werden, um die korrekte Modifizierung und Verarbeitung des fremden exprimierten Proteins sicherzustellen. Zu diesem Zweck können eukaryotische Wirtszellen verwendet werde, die die zelluläre Maschinerie zur richtigen Verarbeitung des primären Transkripts, zur Glykosilierung und zur Phosphorylisierung der Genprodukte besitzen. Zu solchen Säugetier-Wirtszellen gehören insbesondere CHO, VERO, BHK, HeLa, COS, MDCK, 293, 3T3, WI38 usw.
  • Zur langfristigen, hochergiebigen Produktion von rekombinanten Proteinen wird stabile Expression bevorzugt. Beispielsweise können Zelllinien, die das Protein des differentiell exprimierten oder Pathway-Gens stabil exprimieren, erzeugt werden. Statt Expressionsvektoren zu benutzen, die virale Ursprünge der Replikation enthalten, können Wirtszellen mit DNA, die von geeigneten Expressionssteuerelementen (z.B. Promotoren, Enhancer, Sequenzen, Transkriptionsterminatoren, Polyadenylationsstellen usw.) gesteuert wird, und einem wählbaren Marker transformiert werden. Nach der Einführung der fremden DNA können veränderte Zellen 1–2 Tage in einem angereicherten Medium zum wachsen angesetzt und dann in ein selektives Medium versetzt werden. Der wählbare Marker im rekombinanten Plasmid gibt Widerstand bei die Selektion und ermöglicht es den Zellen, das Plasmid stabil in ihre Chromosomen zu integrieren und zu wachsen, um Foci zu bilden, die ihrerseits kloniert und zu Zelllinien erweitert werden können. Dieses Verfahren kann vorteilhaft verwendet werden, um Zelllinien zu erzeugen, die das Protein des differentiell exprimierten oder Pathway-Gens exprimieren. Solche veränderten Zelllinien können besonders nützlich bei der Überprüfung und Bewertung von Verbindungen sein, die die endogene Aktivität des Proteins des differentiell exprimierten oder Pathway-Gens beeinflussen.
  • Es kann eine Anzahl von Auswahlsystemen verwendet werden, insbesondere können die Herpes Simplex Virus-Thymidinkinase- (Wigler u.a., 1977, Cell 11: 223), die Hypoxanthin-Guanin-Phosphoribosyltransferase- (Szybalska & Szybalski, 1962, Proc: Natl. Acad. Sci. USA 48: 2026) und die Adenin-Phosphoribosyltransferase- (Lowy u.a., 1980, Cell 22: 817) Gene in tk–-, hgprt–- bzw. aprt–-Zellen eingesetzt werden. Antimetabolit-Widerstand kann ebenfalls als Grundlage benutzt werden für die Selektion von Genen für dhfr, das Widerstand gegen Methotrexat gibt (Wigler u.a., 1980, Natl. Acad. Sci. USA 77: 3567; O'Hare u.a., 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78: 1527); für gpt, das Widerstand gegen Mycophenolsäure gibt (Mulligan & Berg, 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78: 2072), für neo, das Widerstand gegen das Aminoglykosid G-418 gibt (Colberre-Garapin u.a., 1981, J. Mol. Biol. 150: 1) und für hygro, das Widerstand gegen Hygromycin gibt (Santerre u.a., 1984, Gene 30: 147).
  • Alternativ kann ein beliebiges Fusionsprotein einfach gereinigt werden, indem ein Antikörper, der spezifisch für das Fusionsprotein ist, das exprimiert wird, benutzt wird. Beispielsweise erlaubt ein von Janknecht u.a. beschriebenes System die leichte Reinigung von nicht-denaturierten Fusionsprotein, die in humanen Zelllinien exprimiert sind (Janknecht u.a., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 8972–8976). In diesem System wird das fragliche Gen so in ein Vaccinia-Rekombinationsplasmid subkloniert, dass der offene Leserahmen des Gens translational an einen Aminosäureanhang, der aus sechs Histidinresten besteht, angelagert wird. Extrakte aus Zellen, die mit einem rekombinanten Vacciniavirus infiziert sind, werden auf Ni2+-Nitriloethansäure-Agarose-Säulen geladen, und Proteine mit Histidin-Anhang werden selektiv mit Imidazol-haltigen Puffern eluiert.
  • Wenn es als Bestandteil in einem Assay-System wie den vorliegend beschriebenen benutzt wird, kann das differentiell exprimierte oder Pathway-Gen entweder direkt oder indirekt markiert werden, um den Nachweis eines Komplexes zu erleichtern, der zwischen dem Protein des differentiell exprimierten oder Pathway-Gens und der Testsubstanz gebildet wurde. Jedes beliebige von verschiedenen geeigneten Markersystemen kann benutzt werden, insbesondere Radioisotope wie 125I; Enzymmarkersysteme, die ein nachweisbares colorimetrisches Signal oder Licht generieren, wenn sie einem Substrat ausgesetzt werden; und fluoreszierende Marker.
  • Indirektes Markieren beinhaltet die Benutzung eines Proteins, wie etwa einen markierten Antikörper, das spezifisch an ein Genprodukt entweder des differentiell exprimierten oder des Pathway-Gens bindet. Zu solchen Antikörpern gehören insbesondere polyklonale, monoklonale, chimärische, einkettige, Fab-Fragmente und Fragmente, die von einer Fab-Expressionsbibliothek produziert werden.
  • Wird rekombinante DNA-Technologie benutzt, um das Protein des differentiell exprimierten oder Pathway-Gens für solche Assay-Systeme zu produzieren, kann es vorteilhaft sein, Fusionsproteine zu erzeugen, die das Markieren (entweder direkt oder indirekt), die Immobilisierung, die Löslichkeit und/oder den Nachweis erleichtern.
  • Zu den Fusionsproteinen, die die Löslichkeit und/oder Expression erleichtern können und das Halbleben des Proteins in Blut erhöhen können, können insbesondere lösliche Ig-geschweifte Fusionsproteine gehören. Verfahren zur Erzeugung solcher löslichen Ig-geschweiften Anlagerungsproteine sind dem Fachmann gut bekannt. Siehe beispielsweise US-Patentschrift 5,116, 964, die per Verweis in diese Patentschrift eingebunden ist.
  • Daneben kann zusätzlich zur Ig-Region, die durch den IgG1-Vektor kodiert wird, der Fc-Abschnitt der genutzten Ig-Region durch Aminosäurensubstitution modifiziert werden, um Komlemtaktivierung und Fc-Anlagerung zu reduzieren. (Siehe z.B. EP 239 400 B1 , 3. August 1994).
  • Unter den löslichen Ig-geschweiften Fusionsproteinen, die produziert werden können, befinden sich lösliche Ig-geschweifte Fusionsproteine, die Gen-200-Produkte enthalten. Das Gen 200, das in solchen Fusionsproteinen enthalten ist, kann beispielsweise jeweils die extrazelluläre Domäne des Gens 200 oder Abschnitte davon, vorzugsweise Ligand-bindende Abschnitte, umfassen.
  • Die Signalsequenz, extrazelluläre, transmembrane und zytoplasmatische Domänen sowohl der murinen als auch der humanen Gen-200-Produkte sind erklärt worden und können beispielsweise für die Konstruktion von Ig-Fusionsproteinen des Gen-200-Produkts genutzt werden. Insbesondere das murine Gen-200-Produkt mit 280 Aminosäuren (17A–17D; SEQ-ID-Nr.: 10) enthält eine Signalsequenz von etwa Aminosäurerest 1 bis etwa etwa Aminosäurerest 20, eine extrazelluläre Domäne von etwa Aminosäurerest 21 bis etwa Aminosäurerest 192, eine transmembrane Domäne von etwa Aminosäurerest 193 bis etwa Aminosäurerest 214 und eine zytoplasmatische Domäne von etwa Aminosäurerest 215 bis Aminosäurerest 280. Daneben enthält das humane Gen-200-Produkt mit 301 Aminosäuren (24A–24D; SEQ-ID-Nr.: 24) eine Signalsequenz von Aminosäurerest 1 bis etwa 20, eine reife extrazelluläre Domäne von etwa Aminosäurerest 21 bis 200, eine transmembrane Domäne von etwa Aminosäurerest 201 bis 224 und eine zytoplasmatische Domäne von etwa Aminosäurerest 225 bis 310. Mit der Erläuterung dieser Domänen wäre ein Fachmann ohne Weiteres in der Lage, Fusionsproteine für das lösliche Ig-geschweifte Gen-200-Produkt zu produzieren. Das unten in Abschnitt 10 präsentierte Beispiel beschreibt die Konstruktion von murinen und humanen Ig-Fusionsproteinen des Gen-200-produktes.
  • 5.6 FÜR DIFFERENTIELL EXPRIMIERTE ODER PATHWAY-GEN-PRODUKTE SPEZIFISCHE ANTIKÖRPER
  • In dieser Patentschrift sind Verfahren für die Produktion von Antikörpern beschrieben, die in der Lage sind, ein oder mehrere Epitope des Produktes differentiell exprimierter oder Pathway-Gene spezifisch zu erkennen. Zu solchen Antikörpern können insbesondere polyklonale Antikörper, monoklonale Antikörper (mAbs), humanisierte oder chimärische Antikörper, einkettige Antikörper, Fab-Fragmente, F(ab')2-Fragmente, Fragmente, die von einer Fab-Expressionsbibliothek produziert wurden, anti-idiotypische (anti-Id) Antikörper und Epitop-bindende Fragmente jedes der oben genannten Antikörper gehören. Die Ig-Schweife solcher Antikörper können modifiziert sein, um Komplemetaktivierung und Fc-Bindung zu reduzieren. (siehe beispielsweise EP 239 400 B1 , 3. August 1994).
  • Solche Antikörper können beispielsweise bei dem Nachweis eines Produktes eines Fingerprint-, Target- oder Pathway-Gens in einer biologischen Probe benutzt werden, und sie können als Teil von Diagnosetechniken benutzt werden. Alternativ können solche Antikörper als Teil eines Behandlungsverfahrens für Immunstörungen wie unten in Abschnitt 5.9 beschrieben benutzt werden. Beispielsweise können die Antikörper benutzt werden, um die Aktivität eines Target-Gens zu modulieren, um die Differenzierungs-, Erhaltungs- und/oder Effektorfunktion von TH-Zell-Subpopulationen zu modulieren oder, im Fall von Antikörpern, die auf Epitope der Zelloberfläche gerichtet sind, um eine fragliche TH-Zell-Subpopulation zu isolieren, entweder zum Zwecke des Abbaus oder der Vermehrung.
  • Zur Produktion von Antikörpern gegen ein differentiell exprimiertes oder Pathway-Gen können verschiedene Wirtstiere durch Injektion mit einem Protein des differentiell exprimierten oder Pathway-Gens oder eines Abschnitts davon immunisiert werden. Zu solchen Wirtstieren können insbesondere Kaninchen, Mäuse und Ratten gehören, um nur einige wenige zu nennen. Es können verschiedene Zusatzstoffe verwendet werden, um die Immunreaktion in Abhängigkeit von der Wirtsspezies zu erhöhen, insbesondere Freunds (komplett und inkomplett), Mineralgele wie Aluminiumhydroxid, oberflächenaktive Substanzen wie Lysolecithin, pluronische Polyole, Polyanione, Peptide, Ölemulsionen, Keyhole-Limpet-Hämocynin, Dinitrophenol und potentiell nützliche Zusatzstoffe wie BCG (Bacille Calmette-Guérin) und Corynebacterium parvum.
  • Polyklonale Antikörper sind heterogene Populationen von Antikörper-Molekülen, die aus Seren von Tieren abgeleitet werden, welche mit einem Antigen wie einem Target-Genprodukt oder einem antigenischen funktionalen Derivat davon, immunisiert wurden. Zur Produktion von polyklonalen Antikörpern können Wirtstiere wie die oben beschriebenen durch Injektion mit einem Produkt des differentiell exprimierten oder Pathway-Gens unter Zusatz von Zusatzstoffen, ebenfalls wie oben beschrieben, immunisiert werden.
  • Monoklonale Antikörper, bei denen es sich um homogene Populationen von Antikörpern gegen ein bestimmtes Antigen handelt, können mit jeder Technik gewonnen werden, die die Produktion von Antikörpermolekülen durch kontinuierliche Zelllinien-Kulturen ermöglicht. Zu diesen Techniken gehören insbesondere die Hybridoma-Technik nach Köhler und Milstein (1975, Nature 256: 495–497; und US-Patentschrift 4,376,110), die Hybridoma-Technik aus humanen B-Zellen (Kosbor u.a., 1983, Immunology Today 4: 72; Cole u.a., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci USA 80: 2026–2030) und die EBV-Hybridoma-Technik (Cole u.a., 1985, Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc, S. 77–96). Solche Antikörper können einer der Immunglobinklassen, einschließlich IgG, IgM, igE, IgA, IgD, und jeder ihrer Unterklassen angehören. Das Hybridoma, das die mAbs dieser Erfindung produziert, kann in vitro oder in vivo kultiviert werden. Die Produktion von hohen Titern von mAbs in vivo macht dies zum gegenwärtig bevorzugten Produktionsverfahren.
  • Außerdem können Techniken benutzt werden, die für die Produktion „chimärischer Antikörper" entwickelt wurden, bei denen die Gene aus einem Antikörpermolekül einer Maus mit geeigneter Antigen-Spezifität mit einem humanen Antigenmolekül mit geeigneter biologischer Aktivität gespleißt werden (Morrison u.a., 1984, Proc. Natl. Acad. Sci USA 81: 6851–6855; Neuberger u.a., 1984, Nature 312: 604–608, Takeda u.a., 1985, Nature 314: 452–454; US-Patentschrift 4,816,567). Ein chimärischer Antikörper ist ein Molekül, bei dem verschiedene Abschnitte von verschiedenen Tierspezies abgeleitet sind, wie etwa solche mit einer variablen Region, die von einem murinen mAb und einer konstanten Region humanen Immunglobins abgeleitet sind.
  • Alternativ können Techniken, die für die Produktion von einkettigen Antikörpern (US-Patentschrift 4,946,778; Bird, 1988, Science 242: 423–426; Huston u.a. 1988 Proc. Natl. Acad. Sci USA 85: 5879–5883 und Ward u.a., 1989; Nature 334: 544–546) und für die Herstellung humanisierter monoklonaler Antikörper (US-Patentschrift 5,225,539, die per Verweis in diese Patentschrift eingebunden ist) beschrieben wurden, benutzt werden, um Antikörper gegen das Produkt eines differentiell exprimierten oder Pathway-Gens zu produzieren.
  • Antikörperfragmente, die bestimmte Epitope erkennen, können durch bekannte Techniken generiert werden. Beispielsweise gehören zu solchen Fragmenten insbesondere: die F(ab')2-Fragmente, die durch Pepsinverdauung des Antikörpermoleküls produziert werden können, und die Fab-Fragmente, die durch Reduzieren der Sulfidbrücken des F(ab')2-Fragments generiert werden können. Alternativ können Fab-Expressionsbibliotheken aufgebaut werden (Huse u.a., 1989, Science 246: 1275–1281), um die schnelle und einfache Identifizierung monoklonaler Fab-Fragmente mit der gewünschten Spezifität zu ermöglichen.
  • Antikörper gegen die Produkte eines differentiell exprimierten oder Pathway-Gens können wiederum genutzt werden, um anti-idiotypische Antikörper, die solche Genprodukte „imitieren", zu generieren, wobei Techniken benutzt werden, die auf dem Fachgebiet gut bekannt sind. (Siehe, z.B. Greenspan & Bona, 1993, FASEB J. 7 (5): 437–444 und Nissinoff, 1991, J. Immunol. 147 (8): 2429–2438). Beispielsweise können im Falle von Molekülen des Rezeptortyps (z.B. Produkte der Gene 10, 103 und 200) Antikörper, die an die ECD binden und konkurrierend die Bindung von Liganden an den Rezeptor hemmen, benutzt werden, um Anti-Idiotypen zu generieren, die die ECD „imitieren" und daher den Liganden binden und neutralisieren. Solche neutralisierenden Anti-Idiotypen oder Fab-Fragmente solcher Anti-Idiotypen können in therapeutischen Kurbehandlungen bei durch TH-Zell-Subpopulationen bedingte Störungen genutzt werden.
  • ZELLBASIERTE ASSAYS
  • Zellen, die Target-Gen-Sequenzen, welche Proteine des Target-Gens kodieren, enthalten und exprimieren und die außerdem zelluläre Phänotypen zeigen, die mit einer fraglichen, durch TH-Zell-Subpopulationen bedingten Störung einhergehen, können benutzt werden, um Verbindungen zu identifizieren, die die Fähigkeit zeigen, Symptome von durch TH-Zell-Subpopulationen bedingte Störungen zu lindern. Zu den zellulären Phänotypen, die die Fähigkeit anzeigen können, Symptome von durch TH-Zell-Subpopulationen bedingte Störungen zu lindern, gehören beispielsweise eine Hemmung oder Potenzierung der Expression von Zytokin oder Zelloberflächenmarkern, die mit der fraglichen TH-Zellen-Subpopulation einhergeht, oder alternativ eine Hemmung oder Potenzierung spezifischer TH-Zellen-Subpopulationen.
  • Daneben kann das Fingerprintmuster der Genexpression fraglicher Zellen analysiert und mit dem normalen Fingerprintmuster verglichen werden, das nicht durch eine durch TH-Zell-Subpopulationen bedingte Störung gestört ist. Diejenigen Verbindungen, die Zellen, welche zelluläre Phänotypen zeigen, die ähnlich den durch TH-Zell-Subpopulationen bedingte Störungen sind, dazu veranlasst, ein Fingerprintmuster zu produzieren, das eher einem für die fragliche Zelle normalen Fingerprintmuster entspricht, können als Kandidaten betrachtet werden für weitere Tests hinsichtlich der Fähigkeit, Symptome einer durch TH-Zell-Subpopulationen bedingten Störung zu lindern.
  • Zu den Zellen, die für solche Assays benutzt werden können, können beispielsweise nicht-rekombinante Zelllinien wie Dorris-, AE7-, DAX-, D10.G4-, D1.1- und CDC25-Zelllinien gehören. Außerdem können gereinigte primäre naive T-Zellen, die entweder aus transgenischen oder nicht-transgenischen Stämmen abgeleitet sind, benutzt werden.
  • Daneben können zu den Zellen, die für solche Assays benutzt werden können, auch rekombinante, transgenische Zelllinien gehören. Beispielsweise können die Tiermodelle der Erfindung für durch TH-Zell-Subpopulationen bedingte Störungen, die oben in Abschnitt 5.7.1 diskutiert wurden, benutzt werden, um beispielsweise TH1-artige und/oder TH2-artige Zelllinien zu generieren, die als Zellkulturmodelle für die fragliche Störung benutzt werden können. Obwohl Primärkulturen, die aus transgenischen Tieren mit durch TH-Zell-Subpopulationen bedingte Störungen abgeleitet wurden, benutzt werden können, wird die Generierung von kontinuierlichen Zelllinien bevorzugt. Zu Beispielen für Techniken, die genutzt werden können, um eine kontinuierliche Zelllinie aus transgenischen Tieren abzuleiten, siehe Small u.a., 1985, Mol. Cel Biol. 5: 642–648.
  • Alternative können Zellen eines Zelltyps, von dem bekannt ist, dass er mit durch TH-Zell-Subpopulationen bedingte Störungen im Zusammenhang steht, mit Sequenzen transfiziert werden, die in der Lage sind, das Ausmaß der Expression des Target-Gens innerhalb der Zelle zu vergrößern oder zu verkleinern. Beispielsweise können Target-Gen-Sequenzen in das Genom der fraglichen Zelle eingeführt und dort überexprimiert werden, oder, falls Sequenzen eines endogenen Target-Gens vorliegen, können diese entweder überexprimiert werden oder alternativ unterbunden werden, um die Exprimierung des Target-Gens zu unterexprimieren oder zu deaktivieren.
  • Um eine Target-Gensequenz zu überexprimieren, kann der Kodierabschnitt der Target-Gensequenz an eine regulierende Sequenz angelagert werden, die in der Lage ist, die Genexpression in dem fraglichen Zelltyp anzutreiben. Solche regulierenden Sequenzen werden dem Fachmann bekannt sein und können ohne unnötiges Experimentieren benutzt werden.
  • Zur Unterexpression einer Sequenz eines endogenen Target-Gens kann eine solche Sequenz isoliert und so verändert werden, dass, wenn sie wieder in das Genom des fraglichen Zelltyps eingefügt wird, die Allele des endogenen Target-Gens deaktiviert werden. Vorzugsweise wird die veränderte Target-Gensequenz so über Gen-Targeting eingeführt, dass die endogene Target-Sequenz nach Einfügung der veränderten Target-Gensequenz in das Genom der Zelle unterbunden wird. Gen-Targeting ist oben in Abschnitt 5.7.1 beschrieben.
  • Transfektion von Nukleinsäure der Target-Gensequenz kann unter Nutzung standardmäßiger Techniken durchgeführt werden. Siehe beispielsweise Ausubel, 1989, supra. Transfizierte Zellen sollten auf das Vorhandensein der rekombinanten Target-Gensequenzen, auf Expression und Akkumulation von mRNa des Target-Gens und auf das Vorhandensein von Produktion des Proteins des Target-Gens geprüft werden. In Fällen, in denen eine Verminderung der Expression des Target-Gens gewünscht ist, können Standardtechniken benutzt werden, um zu zeigen, ob eine Verminderung der Expression des endogenen Target-Gens und/oder der Produktion eines Target-Genprodukts erreicht wird.
  • 5.8 SCREENING ASSAYS FÜR ZUSAMMENSETZUNGEN, DIE MIT DEM TARGET-GENPRODUKT INTERAGIEREN
  • Die folgenden Assays sind dafür vorgesehen, Verbindungen zu identifizieren, die an Target-Genprodukte binden, an andere zelluläre Proteine binden, die mit dem Target-Genprodukt interagieren oder an Verbindungen, die die Interaktion des Target-Genproduktes mit anderen zellulären Proteinen stören. Beispielsweise können im Fall des Gen-200-Produktes, bei dem davon ausgegangen wird, dass es sich um ein transmembranes Rezeptorprotein handelt, solche Techniken Liganden für solche Rezeptoren identifizieren. Ein Ligand für das Gen-200-Produkt kann beispielsweise als Grundlage für die Linderung von TH-spezifischen Störungen auftreten.
  • Zu den Zusammensetzungen können insbesondere andere zelluläre Proteine gehören. Daneben können zu solchen Zusammensetzungen Peptide gehören wie beispielsweise lösliche Peptide, insbesondere Ig-geschweifte Fusionspeptide, die extrazelluläre Abschnitte transmembraner Rezeptoren für das Target-Genprodukt umfassen, Angehörige von Random-Peptidbibliotheken (siehe z.B. Lam, K.S. u.a., 1991, Nature 354: 82–84; Houghton, R. u.a., 1991, Nature 354: 84–86), die aus Aminosäuren der D- und/oder L-Konfiguration aufgebaut sind, Phosphopeptide (insbesondere Mitglieder von teilweise degenerierten, gerichteten oder von Random-Phosphopeptidbibliotheken; siehe z.B. Songyang, Z. u.a., 1993, Cell 72: 767–778), Antikörper (insbesondere polyklonale, monoklonale, humanisierte, anti-idiotypische, chimärische oder einkettige Antikörper und Biblotheksfragmente von FAb-, F(ab')2- und FAb-Expressionen sowie Epitop-bindende Fragmente davon) und kleine organische und anorganische Moleküle. Im Falle von Targetmolekülen des Rezeptortyps können zu solchen Verbindungen organische Moleküle (z.B. Peptidomimetika) gehören, die an die ECD binden und die Aktivität imitieren, die von dem natürlichen Liganden (z.B. Agonisten) ausgelöst wird; sowie Peptide, Antikörper oder Fragmente davon und andere organische Verbindungen, die die ECD imitieren (oder einen Abschnitt davon) und einen natürlichen Liganden binden, um ihn zu „neutralisieren".
  • Computermodell und -durchsuchungstechnologien ermöglichen die Identifizierung von Verbindungen oder die Verbesserung bereits identifizierter Verbindungen, die die Expression oder Aktivität von Target- oder Pathway-Genen modulieren können. Ist solch eine Verbindung oder Zusammensetzung identifiziert, werden die aktiven Stellen oder Regionen identifiziert.
  • Im Falle von Verbindungen, die Rezeptormoleküle beeinflussen, könnten solche aktiven Stellen typischerweise Ligand-bindende Plätze sein wie etwa die Interaktionsdomänen zwischen Ligand und dem Rezeptor selbst. Die aktive Stelle kann mit Verfahren identifiziert werden, die auf dem Fachgebiet bekannt sind, beispielsweise aus den Aminosäuresequenzen von Peptiden, aus den Nukleotidsequenzen von Nukleinsäuren oder aus der Untersuchung von Komplexen aus der betreffenden Verbindung oder Zusammensetzung und ihrem natürlichen Liganden. In letzterem Fall können chemische oder Röntgenkristallographie-Verfahren benutzt werden, um die aktive Stelle zu finden, indem herausgefunden wird, wo auf dem Faktor sich der komplexierte Ligand befindet.
  • Danach wird die drei-dimensionale geometrische Struktur der aktiven Stelle bestimmt. Dies kann mit bekannten Verfahren geschehen, einschließlich der Röntgenkristallographie, die eine komplette molekulare Struktur bestimmen kann. Andererseits kann NMR in fester oder flüssiger Phase genutzt werden, um bestimmte intramolekulare Distanzen zu bestimmen. Es kann jedes andere experimentelle Verfahren zur Strukturbestimmung genutzt werden, um partielle oder vollständige geometrische Strukturen zu erhalten. Die geometrischen Strukturen können mit einem komplexierten Liganden, natürlich oder künstlich, vermessen werden, was die Genauigkeit der Struktur der bestimmten aktiven Stelle erhöht.
  • Wird eine unvollständige oder nicht ausreichend genaue Struktur bestimmt, können die Verfahren Computergestützter numerischer Modelle genutzt werden, um die Struktur zu vervollständigen oder ihre Genauigkeit zu erhöhen. Jedes anerkannte Modellverfahren kann genutzt werden, einschließlich parameterisierter Modelle, die spezifisch für bestimmte Biopolymere wie Proteine oder Nukleinsäuren sind, Molekulardynamik-Modelle auf der Grundlage von Computerberechnungen der Molekularbewegungen, Modelle statistischer Mechanik auf der Grundlage thermischer Ensembles, oder kombinierte Modelle. Für die meisten Modellarten sind standardmäßige molekulare Kraftfelder nötig, die die Kräfte zwischen enthaltenen Atomen und Gruppen darstellen, und können aus den Kraftfeldern, die aus der physikalischen Chemie bekannt sind, ausgewählt werden. Die unvollständigen oder weniger genauen experimentellen Strukturen können als Beschränkungen der vollständigen oder genaueren Strukturen, die mit diesen Modellverfahren berechnet werden, dienen.
  • Schließlich können, wenn die Struktur des aktiven Platzes entweder experimentell, durch Modelle oder in Kombination bestimmt ist, potentielle modulierende Verbindungen identifiziert werden über das Recherchieren von Datenbanken, welche Verbindungen sowie Informationen zu deren molekularer Struktur enthalten. Solch eine Recherche sucht nach Verbindungen mit Strukturen, die auf die bestimmte Struktur der aktiven Stelle passen und die mit den Gruppen, die die aktive Stelle definieren, interagieren. Solch eine Recherche kann manuell geschehen, ist aber vorzugsweise Computer-gestützt. Diese Verbindungen, die in dieser Recherche gefunden werden, sind potentielle modulierende Verbindungen für Target- oder Pathway-Gene.
  • Alternativ können diese Verfahren genutzt werden, um verbesserte modulierende Verbindungen aus einer bereits bekannten modulierenden Verbindung oder einem modulierenden Liganden zu identifizieren. Die Zusammensetzung der bekannten Verbindung kann verändert werden und die strukturellen Auswirkungen der Veränderung können bestimmt werden, indem die oben beschriebenen experimentellen und Computermodell-Verfahren auf die neue Verbindung angewendet werden. Die veränderte Struktur wird dann mit der Struktur der aktiven Stelle der Verbindung verglichen, um zu bestimmen, ob eine bessere Passform oder Interaktion daraus resultiert. Auf diese Weise können systematische Variationen in der Zusammensetzung, wie etwa durch Variieren der Seitengruppen, schnell geprüft werden, um veränderte modulierende Verbindungen oder Liganden von verbesserter Spezifität oder Aktivität zu erhalten.
  • Weitere experimentelle und Computermodell-Verfahren, die zum Identifizieren modulierender Verbindungen auf der Grundlage der Identifikation der aktiven Stellen von Target- oder Pathway-Genen bzw. Genprodukten und der damit verbundenen Transduktions- und Transkriptionsfaktoren nützlich sind, werden dem Fachmann offensichtlich sein.
  • Beispiele für molekulare Modellsysteme sind die Programme CHARMm und QUANTA (Polygen Corporation, Waltham, MA). CHARMm führt die Funktionen der Energieminimierung und molekularer Dynamik aus. QUANTA führt die Konstruktion, graphischen Modelle und Analyse molekularer Struktur aus. QUANTA ermöglicht interaktive Konstruktion, Veränderung, Visualisierung und Analyse des Verhaltens von Molekülen miteinander.
  • Eine Anzahl von Artikeln besprechen Computermodellverfahren für Arzneistoffe, die mit spezifischen Proteinen interaktiv sind, wie Rotivinen u.a., 1988, Acta Pharmaceutical Fennica 97: 159–166; Ripka, New Scientist 54–57 (16. Juni 1988); McKinaly und Rossmann, 1989, Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 29: 111–122; Perry und Davies, OSAR: Quantitaive Structure-Activity Relationships in Drug Design, S. 189–193 (Alan R. Liss, Inc. 1989); Lewis und Dean, 1989, Proc. R. Soc. Lond. 236: 125–140 und 141–162 sowie, hinsichtlich eines Modellrezeptoren für Nukleinsäurekomponenten, Askew u.a., 1989, J. Am. Chem. Soc. 111: 1082–1090. Andere Computerprogramme, die Chemikalien durchsuchen und graphisch darstellen, sind von Firmen wie BioDesign, Inc. (Pasadena, CA.), Allelix, Inc. (Mississauga, Ontario, Kanada) und Hypercube, Inc. (Cambridge, Ontario) erhältlich. Obwohl diese vorrangig für die Anwendung auf Arzneistoffe, die für bestimmte Proteine spezifisch sind, vorgesehen sind, können sie für die Erstellung von Arzneistoffen angepasst werden, die für bestimmte Regionen von DNA oder RNA spezifisch sind, wenn erst einmal diese Region identifiziert ist.
  • Obwohl sich die Beschreibung oben im Allgemeinen auf die Gestaltung und Generierung von Verbindungen bezog, die das Bindungsverhalten verändern könnten, könnten die Bibliotheken bekannter Verbindungen, einschließlich natürlicher Produkte oder synthetischer Chemikalien, und Bibliotheken biologisch aktiver Materialien, einschließlich Proteinen, auch auf Verbindungen durchsucht werden, die Inhibitoren oder Aktivatoren sind.
  • Über Assays identifizierte Verbindungen wie die vorliegend beschriebenen können beispielsweise nützlich sein bei der Ausführung der biologischen Funktion des Target-Genproduktes und für die Linderung der Symptome von Immunstörungen. In Fällen beispielsweise, in denen die Situation einer durch TH-Zell-Subpopulationen bedingten Störung aus einem insgesamt niedrigen Grad der Expression des Target-Gens, des Target-Genproduktes und/oder der Aktivität des Target-Genproduktes in einer Zelle oder einem Gewebe resultiert, das in eine solche Störung involviert ist, können zu den Verbindungen, die mit dem Target-Genprodukt interagieren, solche gehören, die die Aktivität des gebundenen Target-Genproteins akzentuieren und verstärken. Solche Verbindungen würden eine effektive Erhöhung des Grades der Aktivität des Traget-Gens mit sich bringen und so Symptome lindern. In Fällen, in denen Mutationen in dem Target-Gen dazu führen, dass abweichende Target-Genproteine gebildet werden, die eine schädliche Wirkung haben, welche zu der durch TH-Zell-Subpopulationen bedingten Störung führt, oder alternativ in Fällen, in denen normale Aktivität des Target-Gens gegeben sein muss, damit eine durch TH-Zell-Subpopulationen bedingte Störung auftritt, können Verbindungen identifiziert werden, die Target-Genprotein binden und die Aktivität des gebundenen Target-Genproteins hemmen. In Abschnitt 5.8.4. unten werden Assays zum Identifizieren zusätzlicher Verbindungen sowie zum Testen der Wirksamkeit der Verbindungen diskutiert, die beispielsweise mit Techniken wie den in Abschnitt 5.8.1.–5.8.3 beschriebenen identifiziert werden, diskutiert.
  • 5.8.1 IN-VITRO SCEENING ASSAYS FÜR VERBINDUNGEN, DIE AN EIN TARGET-GENPRODUKT BINDEN
  • Es können in-vitro Systeme gestaltet werden, um Verbindungen zu identifizieren, die in der Lage sind, die Target-Genprodukte der Erfindung zu binden. Identifizierte Verbindungen können beispielsweise für das Modulieren der Aktivität von Produkten von Wildtypen und/oder Mutanten des Target-Gens nützlich sein, können für das Ausführen der biologischen Funktion von Target-Genprodukten nützlich sein, können in Screens zum Identifizieren von Verbindungen verwendet werden, die normale Interaktionen des Target-Genproduktes unterbinden, oder können selbst solche Interaktionen unterbinden.
  • Das Prinzip der Assays, die zum Identifizieren von Verbindungen verwendet werden, die an das Target-Genprodukt binden, umfasst das Herstellen eines Reaktionsgemischs aus dem Target-Genprodukt und der Testverbindung unter Bedingungen und für eine zeitliche Dauer, die genügen, um den beiden Komponenten die Interaktion und die Bindung zu ermöglichen und so einen Komplex zu bilden, der aus dem Reaktionsgemisch entfernt und/oder in diesem nachgewiesen werden kann. Diese Assays können auf verschiedene Weise durchgeführt werden. Beispielsweise würde ein Verfahren zur Durchführung eines solchen Assays das Verankern des Target-Genproduktes oder der Testsubstanz an einer festen Phase und das Nachweisen von Target-Genprodukt/Testverbindungs-Komplexen, die an der festen Phase verankert sind, am Ende der Reaktion umfassen. In einer Ausführungsform eines solchen Verfahrens kann das Target-Genprodukt an einer festen Fläche verankert sein, und die Testverbindung, die nicht verankert ist, kann entweder direkt oder indirekt markiert sein.
  • In der Praxis können Mikrotiterplatten praktischerweise als feste Phase benutzt werden. Die verankerte Komponente kann durch nicht-kovalente oder kovalente Anhänge immobilisiert werden. Nicht-kovalente Anhänge können einfach durch Beschichten der festen Fläche mit einer Lösung des Proteins und durch Trocknen erreicht werden. Alternativ kann ein immobilisierter Antikörper, vorzugsweise ein monoklonaler Antikörper, der für das zu immobilisierende Protein spezifisch ist, benutzt werden, um das Protein an der festen Fläche zu verankern. Diese Fläche kann vorab vorbereitet und gelagert werden.
  • Um das Assay durchzuführen, wird die nicht-immobilisierte Komponente zu der beschichteten Fläche, die die verankerte Komponente enthält, hinzugefügt. Nach Abschluss der Reaktion werden die nicht verbrauchten Komponenten unter derartigen Bedingungen entfernt (z.B. durch waschen), dass gebildete Komplexe immobilisiert an der festen Fläche zurückbleiben. Der Nachweis von Komplexen, die an der festen Fläche verankert sind, kann auf mehreren Wegen erreicht werden. Wo die vorher nicht-immobilisierte Komponente vorab markiert wird, zeigt der Nachweis von Markierung, die an der Fläche immobilisiert wurde, an, dass Komplexe gebildet wurden. Wo die vorher nicht-immobilisierte Komponente vorab nicht markiert wird, kann ein indirekter Marker genutzt werden, um an der Fläche verankerte Komplexe nachzuweisen; z.B. ein markierter Antikörper, der für die vorher nicht-immobilisierte Komponente spezifisch ist (der Antikörper kann wiederum direkt oder indirekt mit einem markierten Anti-Ig-Antikörper markiert sein).
  • Alternativ kann die Reaktion in einer flüssigen Phase durchgeführt werden, die Reaktionsprodukte können von den nicht verbrauchten Komponenten getrennt und die Komplexe nachgewiesen werden, z.B. indem ein immobilisierter Antikörper, der für das Target-Genprodukt oder die Testverbindung spezifisch ist, benutzt wird, um in Lösung gebildete Komplexe zu verankern, und ein markierter Antikörper, der für die andere Komponente des möglichen Komplexes spezifisch ist, um verankerte Komplexe nachzuweisen.
  • 5.8.2. ASSAYS FÜR ZELLULÄRE PROTEINE DIE MIT DEM TARGET-GENPROTEIN INTERAGIEREN
  • Jedes Verfahren, das zum Nachweisen von Protein-Protein-Wechselwirkungen geeignet ist, kann zum Identifizieren neuartiger zellulärer oder extrazellulärer Wechselwirkungen des Target-Proteins eingesetzt werden. Diese Verfahren sind oben in Abschnitt 5.2. für das Identifizieren von Pathway-Genen umrissen und können nach dieser Patentschrift auch im Hinblick auf die Identifizierung von Proteinen, die mit identifizierten Target-Proteinen interagieren, benutzt werden.
  • 5.8.3. ASSAYS FÜR VERBINDUNGEN, DIE DIE WECHSELWIRKUNG ZIELGENPRODUKT/ZELLULÄRES MAKROMOLEKÜL BEEINTRÄCHTIGEN
  • Die Zielgenprodukte der Erfindung können in vivo mit einem oder mehreren zellulären oder extrazellulären Makromolekülen wie Proteinen in Wechselwirkung treten. Diese Makromoleküle können enthalten, sind jedoch nicht beschränkt auf, Nukleinsäuremoleküle und die Proteine, die mit Verfahren nachgewiesen werden wie die, die zuvor in Abschnitt 5.8.2. beschrieben wurden. Im Sinne dieser Abhandlung werden diese zellulären und extrazellulären Makromoleküle hier als „Bindungspartner" bezeichnet. Verbindungen, die diese Wechselwirkungen beeinträchtigen, können bei der Regulierung der Wirksamkeit des Zielgenproteins von Nutzen sein, insbesondere von mutanten Zielgenproteinen. Diese Verbindungen können enthalten, sind jedoch nicht beschränkt auf, Moleküle wie Antikörper, Peptide und Ähnliches, wie sie zum Beispiel zuvor in Abschnitt 5.8.1. beschrieben wurden.
  • Das Grundprinzip der Assaysysteme, die zum Nachweis von Verbindungen eingesetzt werden, die die Wechselwirkung zwischen dem Zielgenprodukt und seinem bzw. seinen zellulären oder extrazellulären Bindungspartner bzw. Bindungspartnern beeinträchtigen, umfasst die Herstellung eines Reaktionsgemischs, das das Zielgenprodukt und den Bindungspartner enthält, unter Bedingungen und über einen ausreichenden Zeitraum, damit die beiden Wechselwirken und sich verbinden können und damit einen Komplex bilden. Um eine Verbindung auf ihre Hemmwirkung zu testen, wird das Reaktionsgemisch in Gegenwart und Abwesenheit der Testverbindung hergestellt. Die Testverbindung kann zu Beginn im Reaktionsgemisch enthalten sein oder kann zu einem Zeitpunkt nach der Zugabe des Zielgenprodukts und seines zellulären oder extrazellulären Bindungspartners hinzugegeben werden. Kontrollreaktionsgemische werden ohne die Testverbindung oder mit einem Placebo inkubiert. Anschließend wird die Bildung von Komplexen zwischen dem Zielgenprotein und dem zellulären oder extrazellulären Bindungspartner nachgewiesen. Die Bildung eines Komplexes in der Kontrollreaktion, jedoch nicht in dem Reaktionsgemisch, das die Testverbindung enthält, zeigt an, dass die Verbindung die Wechselwirkung zwischen dem Zielgenprotein und dem wechselwirkenden Bindungspartner beeinträchtigt. Außerdem kann die Komplexbildung in Reaktionsgemischen, die die Testverbindung und das normale Zielgenprotein enthalten, mit der Komplexbildung in Reaktionsgemischen verglichen werden, die die Testverbindung und ein mutantes Zielgenprotein enthalten. Dieser Vergleich kann in den Fällen von Bedeutung sein, in denen es wünschenswert ist, Verbindungen nachzuweisen, die die Wechselwirkungen von mutanten, jedoch nicht von normalen Zielgenproteinen beeinträchtigen.
  • Der Assay für Verbindungen, die die Wechselwirkung zwischen den Zielgenprodukten und den Bindungspartnern beeinträchtigen, kann heterogen oder homogen durchgeführt werden. Heterogene Assays umfassen die Verankerung des Zielgenprodukts oder des Bindungspartners an eine Festphase und den Nachweis von Komplexen, die an der Festphase verankert sind, am Ende der Reaktion. Bei homogenen Assays wird die gesamte Reaktion in einer Flüssigphase durchgeführt. Bei beiden Verfahren kann die Reihenfolge der Zugabe der Reaktionspartner verändert werden, um unterschiedliche Angaben über die Verbindungen zu erhalten, die getestet werden. Beispielsweise können Testverbindungen, die die Wechselwirkung zwischen den Zielgenprodukten und den Bindungspartnern beeinträchtigen, z.B. durch eine Konkurrenzreaktion, nachgewiesen werden, indem die Reaktion in Gegenwart der Testsubstanz durchgeführt wird; d.h. durch Zugabe der Testsubstanz zum Reaktionsgemisch vor oder gleichzeitig mit dem Zielgenprotein und dem wechselwirkenden zellulären oder extrazellulären Bindungspartner. Wahlweise können Testverbindungen, die vorgeformte Komplexe aufspalten, z.B. Verbindungen mit höheren Bindungskonstanten, die einen der Bestandteile aus dem Komplex verdrängen, durch Zugabe der Testverbindung zum Reaktionsgemisch getestet werden, nachdem sich Komplexe gebildet haben. Die verschiedenen Ausführungen werden im Folgenden kurz beschrieben.
  • Bei einem heterogenen Assaysystem wird entweder das Zielgenprotein oder der wechselwirkende zelluläre oder extrazelluläre Bindungspartner an einer Festkörperoberfläche verankert, während die nicht verankerte Spezies entweder direkt oder indirekt markiert wird. In der Praxis ist es günstig, wenn Mikrotiterplatten verwendet werden. Die verankerte Spezies kann durch eine nichtkovalente oder kovalente Bindung immobilisiert werden. Eine nichtkovalente Bindung kann einfach durch Beschichtung der Festkörperoberfläche mit einer Lösung des Zielgenprodukts oder des Bindungspartners und Trocknung erreicht werden. Wahlweise kann zur Verankerung der Spezies an der Festkörperoberfläche ein immobilisierter Antikörper verwendet werden, der für die Spezies spezifisch ist, die verankert werden soll. Die Flächen können im Voraus vorbereitet und gelagert werden.
  • Um den Assay durchzuführen, wird der Partner der immobilisierten Spezies mit der beschichteten Fläche mit oder ohne die Testverbindung in Berührung gebracht. Nachdem die Reaktion abgeschlossen ist, werden nicht umgesetzte Bestandteile entfernt (z.B. durch Abwaschen) und alle gebildeten Komplexe bleiben auf der Festkörperoberfläche immobilisiert. Der Nachweis von Komplexen, die auf der Festkörperoberfläche verankert sind, kann auf mehrere Arten erfolgen. Wurde die nicht-immobilisierte Spezies vorher markiert, zeigt der Nachweis der Markierung, die auf der Oberfläche immobilisiert ist, dass sich Komplexe gebildet haben. Wurde die nicht-immobilisierte Spezies vorher nicht markiert, kann eine indirekte Markierung zum Nachweis von Komplexen verwendet werden, die an der Fläche verankert sind; z.B. unter Verwendung eines markierten Antikörpers, der für die anfänglich nicht-immobilisierte Spezies spezifisch ist (der Antikörper kann wiederum direkt markiert oder mit einem markierten anti-Ig-Antikörper indirekt markiert werden). In Abhängigkeit von der Reihenfolge der Zugabe der Reaktionsbestandteile können Testverbindungen nachgewiesen werden, die die Komplexbildung hemmen oder vorgeformte Komplexe aufspalten.
  • Wahlweise kann die Reaktion in einer Flüssigphase in Gegenwart oder Abwesenheit der Testverbindung durchgeführt werden, können die Reaktionsprodukte von nicht umgesetzten Bestandteilen getrennt und Komplexe nachgewiesen werden; z.B. unter Verwendung eines immobilisierten Antikörpers, der für einen der Bindungsbestandteile spezifisch ist, zur Verankerung von Komplexen, die in der Lösung gebildet wurden, und eines markierten Antikörpers, der für den anderen Partner spezifisch ist, zum Nachweis verankerter Komplexe. Wiederum können in Abhängigkeit von der Reihenfolge der Zugabe der Reaktionspartner zur Flüssigphase Testverbindungen nachgewiesen werden, die die Komplexbildung hemmen oder vorgeformte Komplexe aufspalten.
  • Bei einer wahlweisen Ausführungsform der Erfindung kann ein homogener Assay eingesetzt werden. Bei diesem Verfahren wird ein vorgeformter Komplex aus dem Zielgenprotein und dem wechselwirkenden zellulären oder extrazellulären Bindungspartner hergestellt, in der entweder das Zielgenprodukt oder sein Bindungspartner markiert wird, jedoch wird das Signal, das durch die Markierung entsteht, durch die Komplexbildung ausgelöscht (siehe z.B. die US-Patentschrift 4,109,496 von Rubenstein, bei der dieses Verfahren für Immunoassays verwendet wird). Die Zugabe einer Testsubstanz, die mit einer der Spezies konkurriert und sie aus dem vorgeformten Komplex verdrängt, führt zur Entstehung eines Signals über dem Untergrund. Auf diese Art können Testsubstanzen nachgewiesen werden, die die Wechselwirkung Zielgenprotein/zellulärer oder extrazellulärer Bindungspartner Wechselwirkung beeinträchtigen.
  • Bei einer besonderen Ausführungsform kann das Zielgenprodukt auf die Immobilisierung unter Verwendung von DNA-Rekombinationsverfahren vorbereitet werden, die zuvor in Abschnitt 5.5 beschrieben wurden. Beispielsweise kann der kodierende Bereich des Zielgens unter Verwendung eines Fusionsvektors wie pGEX-5X-1 mit einem Glutathion-S-Transferase(GST)-Gen derart verschmolzen werden, dass seine Bindungsaktivität im entstehenden Fusionsprotein erhalten bleibt. Der wechselwirkende zelluläre oder extrazelluläre Bindungspartner kann gereinigt werden und zur Herstellung eines monoklonalen Antikörpers verwendet werden, unter Verwendung von Verfahren, die im Fachgebiet routinemäßig angewendet werden und zuvor in Abschnitt 5.6 beschrieben sind. Dieser Antikörper kann mittels Verfahren, die im Fachgebiet routinemäßig angewendet werden, beispielsweise mit dem radioaktiven Isotop 125I markiert werden. Bei einem heterogenen Assay kann z.B. das GST-Zielgen-Fusionsprotein an Glutathion-Agarose-Kügelchen verankert werden. Der wechselwirkende zelluläre oder extrazelluläre Bindungspartner kann anschließend in Gegenwart oder Abwesenheit der Testverbindung so hinzugefügt werden, dass die Wechselwirkung und Bindung erfolgen können. Am Ende des Reaktionszeitraums kann ungebundenes Material weggewaschen und der markierte monoklonale Antikörper zum System hinzugegeben werden und sich an die komplexierten Bestandteile binden. Die Wechselwirkung zwischen dem Zielgenprotein und dem wechselwirkenden zellulären oder extrazellulären Bindungspartner kann durch Messung der Menge Radioaktivität nachgewiesen werden, die weiter mit den Glutathion-Rgarose-Kügelchen verbunden ist. Eine erfolgreiche Hemmung der Wechselwirkung durch die Testverbindung führt zu einer Abnahme der gemessenen Radioaktivität.
  • Wahlweise können das GST-Zielgen-Fusionsprotein und der wechselwirkende zelluläre oder extrazelluläre Bindungspartner in einer Flüssigkeit in Abwesenheit der festen Glutathion-Agarose-Kügelchen miteinander vermischt werden. Die Testverbindung kann hinzugegeben werden entweder während oder nachdem die Spezies miteinander in Wechselwirkung treten können bzw. treten konnten. Dieses Gemisch kann anschließend zu den Glutathion-Agarose-Kügelchen hinzugegeben werden und ungebundenes Material wird weggewaschen. Wieder kann der Grad der Hemmung der Zielgenprodukt/Bindungspartner-Wechselwirkung durch Zugabe des markierten Antikörpers und Messung der Radioaktivität ermittelt werden, die mit den Kügelchen verbunden ist.
  • Bei einer weiteren Ausführungsform der Erfindung können dieselben Verfahren unter Verwendung von Peptidfragmenten eingesetzt werden, die den Bindungsdomänen des Zielgenprodukts und/oder des wechselwirkenden zellulären oder extrazellulären Bindungspartners entspricht (in den Fällen, in denen der Bindungspartner ein Protein ist), anstatt eines der vollständigen oder beider vollständiger Proteine. Jede Anzahl von Verfahren, die routinemäßig im Fachgebiet angewendet werden, können zum Nachweis und zur Isolierung der Bindungsstellen eingesetzt werden. Diese Verfahren umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf, die Mutagenese des Gens, das eins der Proteine verschlüsselt, und die Durchmusterung nach der Aufbrechung der Bindung in einer Co-Immunopräzipitation. Anschließend können kompensierende Mutationen des Gens ausgewählt werden, das die zweite Spezies des Komplexes verschlüsselt. Die Sequenzanalyse der Gene, die die jeweiligen Proteine verschlüsseln, offenbart die Mutationen, die dem Bereich des Proteins entsprechen, der an der Bindung durch Wechselwirkung beteiligt ist. Wahlweise kann ein Protein unter Verwen dung von Verfahren an einer Festkörperoberfläche verankert werden, die zuvor in diesem Abschnitt beschrieben wurden, und mit seinem markierten Bindungspartner, der mit einer Protease wie Trypsin behandelt wurde, Wechselwirken bzw. sich daran binden. Nach dem Waschen kann ein kurzes markiertes Peptid, das die Bindungsdomäne umfasst, mit dem Feststoff verbunden bleiben, das isoliert und durch Aminosäurensequenzierung nachgewiesen werden kann. Außerdem können, sobald das Gen für den zellulären oder extrazellulären Bindungspartner gewonnen wurde, kurze Genabschnitte so verändert werden, dass sie Peptidfragmente des Proteins exprimieren, die anschließend auf ihre Bindungsaktivität getestet und gereinigt oder synthetisiert werden können.
  • Beispielsweise und nicht einschränkend gemeint kann ein Zielgenprodukt an einem Feststoff verankert werden, wie es zuvor in diesem Abschnitt beschrieben wurde, indem ein GST-Zielgen-Fusionsprotein hergestellt wird und sich an Gluthation-Agarose-Kügelchen binden kann. Der wechselwirkende zelluläre oder extrazelluläre Bindungspartner kann mit einem radioaktiven Isotop wie 35S markiert und mit einer Protease wie Trypsin gespalten werden. Die Spaltprodukte können anschließend dem verankerten GST-Zielgen-Fusionsprotein zugegeben werden und können sich binden. Nach dem Wegwaschen ungebundener Peptide kann das markierte gebundene Material, das die Bindungsdomäne des zellulären oder extrazellulären Bindungspartners darstellt, mit bekannten Verfahren herausgelöst, gereinigt und auf seine Aminosäuresequenz untersucht werden. So nachgewiesene Peptide können synthetisch hergestellt oder unter Verwendung der bekannten DNA-Rekombinationstechnik mit geeigneten erleichternden Proteinen verschmolzen werden.
  • 5.8.4 ASSAYS ZUR BESSERUNG DER SYMPTOME VON IMMUNSTÖRUNGEN UND/ODER MODULATION DER FUNKTION DES ZIELGENPRODUKTS
  • Alle bindenden Verbindungen, einschließlich, jedoch nicht beschränkt auf, Verbindungen wie die, die in den vorstehenden Assaysystemen nachgewiesen wurden, können auf die Fähigkeit zur Besserung von Symptomen von Immunstörungen getestet werden, z.B. Störungen im Zusammenhang mit TH-Zellsubpopulationen. Im Folgenden sind zellbasierte Assays und Assays auf der Grundlage von Tiermodellen zum Nachweis von Verbindungen beschrieben, die diese Fähigkeit zur Besserung von Symptomen von Immunstörungen aufweisen.
  • Erstens können zellbasierte Systeme wie die, die zuvor in Abschnitt 5.7.2 beschrieben wurden, zum Nachweis von Verbindungen verwendet werden, die so wirken können, dass sie Symptome von Störungen bessern können, die im Zusammenhang mit TH-Zellsubpopulationen stehen. Beispielsweise können diese Zellsysteme in einer ausreichenden Konzentration und über einen Zeitraum, der genügt, um in den Zellen, die damit in Berührung gebracht werden, diese Besserung auszulösen, mit einer Verbindung in Berührung gebracht werden, von der vermutet wird, dass sie die Symptome der Störung bessern kann. Nach dem Kontakt werden die Zellen untersucht, um zu ermitteln, ob einer oder mehrere der der den Störungen, die mit TH-Zellsubpopulationen in Zusammenhang stehen, ähnlichen Zellphänotypen so verändert wurde bzw. wurden, dass er bzw. sie einem Phänotyp ähnelt bzw. ähneln, durch den eher eine geringere Häufigkeit oder Schwere der Symptome der Störungen entsteht. Weitere zellbasierte Assays werden im Folgenden in Abschnitt 5.8.4.1 besprochen.
  • Wird die Störung Asthma betrachtet, die in Zusammenhang mit einer TH-Zellsubpopulation steht, die insbesondere eine Störung im Zusammenhang mit TH2-Ähnlichen ist, kann jedes TH2- oder TH2-ähnliches Zellsystem verwendet werden. Unter dem Einfluss dieser Zellsysteme können Verbindungen auf ihre Fähigkeit untersucht werden, den TH2-ähnlichen Phänotyp dieser Zellen zu modulieren, sodass die Zellen einen Verlust eines TH2-ähnlichen Phänotyps aufweisen. Verbindungen mit dieser Fähigkeit zur TH2-Modulation sind Verbindungen, die möglicherweise die Fähigkeit aufweisen, asthmabezogene Symptome in vivo zu bessern.
  • Außerdem können tierbasierte Systeme wie die, die zuvor in Abschnitt 5.7.1 beschrieben wurden, zum Nachweis von Verbindungen verwendet werden, die in der Lage sind, den Störungen, die mit TH-Zellsubpopulationen in Verbindung stehen, ähnliche Symptome zu bessern. Diese Tiermodelle können als Testträger für den Nachweis von Arzneimitteln, Pharmazeutika, Behandlungen und Maßnahmen verwendet werden, die bei der Behandlung dieser Störungen wirksam sein können. Beispielsweise können Tiermodelle in einer ausreichenden Konzentration und über einen Zeitraum, der genügt, um bei den Tieren, die damit in Verbindung gebracht werden, diese Besserung auszulösen, mit einer Verbindung in Berührung gebracht werden, von der vermutet wird, dass sie die Symptome von Störungen bessern kann, die mit TH-Zellsubpopulationen in Verbindung stehen. Die Reaktion der Tiere auf den Kontakt und damit die Wirksamkeit der fraglichen Verbindung kann durch die Bewertung der Umkehrung der Störungen überwacht werden, die mit den interessierenden Störungen verbunden sind, die mit TH-Zellsubpopulationen in Verbindung stehen. Was Maßnahmen betrifft, sollte jede Behandlung, durch die ein Gesichtspunkt der den Störungen, die mit TH-Zellsubpopulationen in Verbindung stehen, ähnlichen Symptomen als Möglichkeit für eine entsprechende therapeutische Maßnahme beim Menschen für Störungen betrachtet werden, die mit TH-Zellsubpopulationen in Verbindung stehen. Die Dosierung der Teststoffe kann durch Ableitung von Dosis-Wirkungskurven ermittelt werden, wie sie im Folgenden in Abschnitt 5.10 besprochen sind.
  • In Verbindung mit den zellbasierten oder den tierbasierten Systemen können Genexpressionsmuster zur Beurteilung der Fähigkeit einer Verbindung verwendet werden, die den Störungen, die mit TH-Zellsubpopulationen in Verbindung stehen, ähnlichen Symptome zu bessern. Beispielsweise kann das Expressionsmuster eines oder mehrerer Fingerabdruckgene Teil eines Fingerabdruckprofils bilden, das anschließend bei einer solchen Beurteilung verwendet werden kann. Fingerabdruckprofile werden im Folgenden in Abschnitt 5.11 beschrieben. Fingerabdruckprofile können in den zell- und/oder tierbasierten Modellsystemen für bekannte Zustände beschrieben werden, entweder für Störungszustände, die mit TH-Zellsubpopulationen in Verbindung stehen, oder für normale TH-Zelldifferenzierungszustände.
  • 5.8.4.1. VERFAHREN ZUM NACHWEIS VON VERBINDUNGEN, DIE DIE FUNKTION DES ZIELGENPRODUKTS MODULIEREN
  • In diesem Abschnitt sind Verfahren zum Nachweis von Verbindungen beschrieben, die entweder als Agonisten oder als Antagonisten von Rezeptorzielgenprodukten dienen.
  • Die getesteten Verbindungen können beispielsweise Verbindungen sein wie die, die durch die Assays nachgewiesen werden, die zuvor in Abschnitt 5.8.1 bis 5.8.3 beschrieben wurden. Diese Verbindungen können enthalten, sind jedoch nicht beschränkt auf, Peptide wie beispielsweise lösliche Peptide, einschließlich, jedoch nicht beschränkt auf, Fusionspeptide mit Ig-Anhang, die extrazelluläre Abschnitte der Transmembranrezeptoren des Zielgenprodukts umfassen, und Mitglieder von Zufallspeptidbibliotheken (siehe z.B. Lam, K. S. et al., 1991, Nature 354: 82–84; Houghten, R. et al., 1991, Nature 354: 84–86) aus Aminosäuren mit D- und/oder L-Konfiguration, Phosphopeptide (einschließlich, jedoch nicht beschränkt auf Mitglieder von Bibliotheken von Zufalls- oder teilweise degenerierten, gerichteten Phosphopeptiden; siehe z.B. Songyang, Z. et al., 1993, Cell 72: 767–778), Antikörper (einschließlich, jedoch nicht beschränkt auf polyklonale, monoklonale, humanisierte, anti-idiotypische, chimäre oder Einkettenantikörper, und FAb-, F(ab')2- und FAb-Expressionsbibliothekfragmente sowie epitopbindende Fragmente davon) und kleine organische oder anorganische Moleküle.
  • Die hier beschriebenen Assays sind Funktionsassays, mit denen Verbindungen nachgewiesen werden, die die Wirksamkeit des Rezeptorzielgens beeinflussen, indem sie die Stärke der intrazellulären Kalziumabgabe beeinflussen. Die Modulation (d.h. Agonisierung oder Antagonisierung) der Funktion des Rezeptorzielgenprodukts würde dann zu einem unterschiedlichen intrazellulären Kalziumgehalt führen.
  • Die Assays umfassen die Kontaktierung einer Zelle, die ein Rezeptorzielgen exprimiert, mit einer Testverbindung und die Messung des Gehalts an intrazellulärem Kalzium. Die Verbindungen, die ein intrazelluläres Kalziumprofil erzeugen, das sich von dem unterscheidet, das die Zelle bei Abwesenheit der Verbindung aufweisen würde, stellen entweder Agonisten oder Antagonisten dar. Eine agonistische Verbindung würde eine Erhöhung des intrazellulären Kalziumgehalts in Bezug auf Kontrollzellen bewirken, während ein Antagonist eine Abnahme des intrazellulären Kalziumgehalts in Bezug auf Vergleichszellen bewirken würde.
  • Es ist bevorzugt, dass Zellen verwendet werden, deren intrazellulärer Kalziumgehalt einfach gemessen werden kann. Xenopus-Eizellen zählen aufgrund ihrer großen Größe zu diesen bevorzugten Zellen, da ihnen leicht intrazelluläre Kalziumreporterverbindungen eingespritzt werden können. Außerdem können Myelomzellen verwendet werden. Diese Reporterverbindungen enthalten, sind jedoch nicht beschränkt auf, kalziumbindende Stoffe wie die bekannten FURA-2 und INDO-2. FURA2/Kalzium-Komplexe und INDO-2/Kalziumkomplexe fluoreszieren und ermöglichen so die Messung von Unterschieden des intrazellulären Kalziumgehalts.
  • Im Sinne der hier beschriebenen Assays sollten die Xenopus-Eizellen mit Nukleotidsequenzen transfiziert werden, die das interessierende Zielprotein verschlüsseln. Die Zellen können mittels Verfahren, die dem Fachmann bekannt sind und die beispielsweise Verfahren wie die enthalten können, die zuvor in Abschnitt 5.5 beschrieben sind, transfiziert werden und die interessierende Sequenz exprimieren. In Xenopus-Eizellen kann RNA eingespritzt werden, die das interessierende Zielgenprodukt verschlüsselt, sodass die geimpften Eizellen das Genprodukt exprimieren.
  • Die Assays, die in diesem Abschnitt beschrieben sind, können erstens zum Nachweis von Verbindungen verwendet werden, die als Agonisten des interessierenden Zielgenprodukts dienen. „Agonist", so wie es hier verwendet ist, bezeichnet eine Verbindung, die die Wirksamkeit des Zielgenprodukts durch Steigerung der Wirksamkeit des Zielgenprodukts moduliert, beurteilt durch die Fähigkeit der Verbindung, eine Steigerung des Kalziumeinstroms zu bewirken, was zu einer Zunahme des intrazellulären Kalziumgehalts führt. Zu diesen Agonisten kann beispielsweise der natürliche Ligand für das Rezeptorzielgenprodukt zählen.
  • Agonisten, die mit diesen Assays nachgewiesen werden, können als nützliche therapeutische Wirkstoffe zur Besserung einer großen Bandbreite von Störungen dienen, die mit T-Zellen in Zusammenhang stehen, einschließlich beispielsweise Störungen, die mit TH-Zellsubpopulationen in Zusammenhang stehen, in Fällen, in denen diese Störungen durch eine verminderte oder nicht-vorhandene Wirksamkeit des Zielgenprodukts verursacht sind. Alle agonistischen Verbindungen, die hier nachgewiesen werden, können beispielsweise als Bestandteil der Behandlungsverfahren verwendet werden, die im Folgenden in Abschnitt 5.9.2 beschrieben sind. Ferner können diese Agonisten zum Nachweis von Antagonisten des interessierenden Rezeptorzielgenprodukts verwendet werden, z.B. wie im Folgenden beschrieben.
  • „Antagonist", so wie es hier verwendet ist, bezeichnet eine Verbindung, die die Wirksamkeit des Zielgenprodukts durch Senkung der Wirksamkeit des Zielgenprodukts moduliert, beurteilt durch die Fähigkeit der Verbindung, eine Abnahme des Kalziumeinstroms zu bewirken. Antagonisten, die mit diesen Assays nachgewiesen werden, können als nützliche therapeutische Wirkstoffe zur Besserung einer großen Bandbreite von Störungen dienen, die mit T-Zellen in Zusammenhang stehen, einschließlich beispielsweise Störungen, die mit TH-Zellsubpopulationen in Zusammenhang stehen, in Fällen, in denen die Störung durch eine erhöhte oder unangemessene Wirksamkeit des Zielgenprodukts verursacht ist.
  • Es kann ein Antagonisten-Siebtest durchgeführt werden, unter Verwendung von Zellen, die das Zielgenprodukt exprimieren, wie es zuvor beschrieben ist. In diesen Fällen, in denen die Störung, die mit T-Zellen in Verbindung steht, durch ein mutantes Zielgenprodukt bedingt ist, können die Zellen, die beim Antagonisten-Nachweis verwendet werden, Zellen sein, die das mutante Rezeptorzielgenprodukt exprimieren, das an der Verursachung der Störung, die mit T-Zellen in Verbindung steht, beteiligt ist.
  • Um einen Antagonisten-Siebtest durchzuführen, wird eine Zelle, die das Zielgen exprimiert, 1) mit einem Agonisten des Zielgenprodukts und 2) mit einer Testverbindung über einen bestimmten Zeitraum in Berührung ge bracht. Anschließend wird der Gehalt an intrazellulärem Kalzium in den Zellen gemessen und in Zellen, die nur mit dem Agonisten in Berührung gebracht wurden. Eine Testverbindung wird als Antagonist betrachtet, wenn die Stärke der intrazellulären Kalziumabgabe in Gegenwart der Testverbindung niedriger ist als die Stärke der intrazellulären Kalziumabgabe bei Fehlen der Testverbindung.
  • Alle antagonistischen Verbindungen, die hier nachgewiesen werden, können beispielsweise als Bestandteil der Behandlungsverfahren verwendet werden, die im Folgenden in Abschnitt 5.9.1 beschrieben sind.
  • Unter den möglichen antagonistischen Verbindungen der Rezeptorzielgenprodukte mit 7-Transmembrandomänen, die hier beschrieben sind, befinden sich Peptide, die eine der oder mehrere extrazelluläre Domänen des Rezeptorzielgenprodukts enthalten, vorzugsweise sind die Domänen Domänen, die für die Ligandenbindung zuständig sind, sodass die Peptide derart wirken, dass sie mit dem endogenen Rezeptor um den Liganden konkurrieren.
  • 5.9. VERBINDUNGEN UND VERFAHREN ZUM BEHANDELN VON IMMUNSTÖRUNGEN UND ZUM MODULIEREN DER TH-ZELLREAKTIONSFÄHIGKEIT
  • Im Folgenden sind Verfahren und Zusammensetzungen beschrieben, die zur Besserung der Symptome von Immunstörungen über beispielsweise eine Modulation der interessierenden TH-Zellsubpopulation verwendet werden können. Diese Modulation kann je nach der konkreten Situation positiver oder negativer Art sein, jedoch führt jedes Modulationsereignis zu einem Ergebnis, das die Symptome der Immunstörung bessert. Ferner sind im Folgenden Verfahren zur Modulation der Reaktionsfähigkeit von TH-Zellen auf Antigene beschrieben.
  • „Negative Modulation", so wie sie hier verwendet wird, bezeichnet eine Verringerung des Gehalts und/oder der Wirksamkeit des Zielgenprodukts bezüglich des Gehalts und/oder der Wirksamkeit des Zielgenprodukts bei Fehlen der Modulationsbehandlung. Wahlweise bezeichnet der Begriff, so wie er hier verwendet wird, eine Abnahme der T-Zellsubpopulation (z.B. über eine Verringerung der Anzahl der Zellen, die zur TH-Zellsubpopulation gehören) bezüglich zu der Anzahl, die bei Fehlen der Modulationsbehandlung vorhanden ist. „Abnahme", so wie sie hier verwendet wird, ist so gemeint, wie es zuvor in Abschnitt 3 definiert ist.
  • „Positive Modulation", so wie sie hier verwendet wird, bezeichnet eine Erhöhung des Gehalts und/oder der Wirksamkeit des Zielgenprodukts bezüglich des Gehalts und/oder der Wirksamkeit des Genprodukts bei Fehlen der Modulationsbehandlung. Wahlweise bezeichnet der Begriff, so wie er hier verwendet wird, eine Stimulation der T-Zellsubpopulation (z.B. über eine Erhöhung der Anzahl der Zellen, die zur TH-Zellsubpopulation gehören) bezüglich zu der Anzahl, die bei Fehlen der Modulationsbehandlung vorhanden ist. „Stimulation", so wie sie hier verwendet wird, ist so gemeint, wie es zuvor in Abschnitt 3 definiert ist.
  • Es ist möglich, dass eine Störung, die mit einer TH-Zellsubpopulation in Zusammenhang steht, oder eine andere Immunstörung als Folge der normalen Zielgenwirksamkeit auftreten kann, während beispielsweise der Beeinflussung durch ein bestimmtes Antigen, das eine Immunantwort auslöst, die zur Ausbildung der Störung führt. Beispielsweise kommen die Störungen Asthma und Allergie, die mit TH2-Ähnlichen in Zusammenhang stehen, möglicherweise für Störungen in Frage, die diesen Mechanismus aufweisen. Außerdem kann eine Störung, zumindest teilweise, durch einen außergewöhnlich hohen Gehalt des Zielgenprodukts oder durch die Gegenwart eines Zielgenprodukts bedingt sein, das eine außerge wöhnliche Wirksamkeit aufweist. Damit würde ein Verfahren, das eine negative Modulationswirkung hervorruft, d.h. eine Verringerung des Gehalts und/oder der Wirksamkeit des Zielgenprodukts bewirkt oder wahlweise eine Abnahme der TH-Zellsubpopulation hervorruft (z.B. über eine Verringerung der Anzahl von Zellen, die zur TH-Zellsubpopulation gehören), in beiden vorstehenden Fällen eine Besserung der Symptome von Störungen bewirken, die mit einer TH-Zellsubpopulation in Zusammenhang stehen.
  • Negative Modulationsverfahren zur Verminderung der Stärke der Zielgenexpression oder der Wirksamkeit des Zielgenprodukts (entweder gewöhnlich oder außergewöhnlich) und zur Senkung der Anzahl der Zellen einer bestimmten TH-Zellsubpopulation sind im Folgenden in Abschnitt 5.9.1 besprochen.
  • Wahlweise ist es möglich, dass eine Störung, die mit einer TH-Zellsubpopulation in Zusammenhang steht, oder andere Immunstörungen, zumindest teilweise, durch das Fehlen oder die Verringerung der Stärke der Zielgenexpression, eine Verminderung der Wirksamkeit des Zielgenprodukts oder eine Senkung der Gesamtzahl von Zellen verursacht werden kann, die zu einer bestimmten TH-Zellsubpopulation gehören. Damit würde ein Verfahren, das eine positive Modulationswirkung hervorruft, d.h. eine Zunahme der Stärke der Zielgenexpression und/oder der Wirksamkeit dieser Genprodukte bewirkt oder wahlweise eine Stimulation der TH-Zellsubpopulation hervorruft (z.B. über eine Erhöhung der Anzahl der Zellen, die zu einer TH-Zellsubpopulation gehören), eine Besserung der Symptome von Immunstörungen bewirken.
  • Zum Beispiel kann eine Senkung der Gesamtzahl TH1-ähnlicher Zellen bezüglich TH2-ähnlicher Zellen bei einer HIV-infizierten Person mit der Entwicklung hin zu AIDS in einer Wechselbeziehung stehen (Clerci, M. et al., 1993, J. Clin. Invest. 91: 759; Clerci, M. et al., 1993, Science 262: 1721; Maggi, E. et al., 1994, Science 265: 244). Eine Behandlung, die in der Lage ist, die Anzahl TH1-ähnlicher Zellen bezüglich TH2-ähnlicher Zellen bei einer HIV-infizierten Person zu erhöhen, kann daher zur Verhinderung oder Verlangsamung der Entwicklung hin zur Krankheit dienen.
  • Positive Modulationsverfahren zur Erhöhung der Stärke der Zielgenexpression oder der Wirksamkeit des Zielgenprodukts und zur Erhöhung des Gehalts an Zellen einer bestimmten TH-Zellsubpopulation sind im Folgenden in Abschnitt 5.9.2 besprochen.
  • Zu den Immunstörungen, deren Symptome bessert werden können, zählen Immunstörungen, die mit TH1 oder TH1-Ähnlichen in Zusammenhang stehen und Immunstörungen, die mit TH2 oder TH2-Ähnlichen in Zusammenhang stehen. Zu Beispielen für Störungen, die mit TH1 oder TH1-Ähnlichen in Zusammenhang stehen, zählen chronische Entzündungserkrankungen und Störungen wie Morbus Crohn, reaktive Arthritis einschließlich der Lyme-Borreliose, insulinabhängige Diabetes, organspezifische Autoimmunität einschließlich multipler Sklerose, Hashimoto-Thyroiditis und Basedow-Krankheit, Kontaktdermatitis, Psoriasis, Transplantatabstoßung, Transplantat-gegen-Empfänger-Krankheit und Sarkoidose. Zu Beispielen für Störungen, die mit TH2 oder TH2-Ähnlichen in Zusammenhang stehen, zählen atopische Erkrankungen wie Asthma und Allergie einschließlich Rhinitis allergica, gastrointestinale Allergien einschließlich Lebensmittelallergien, Eosinophilie, Bindehautentzündung, Nierenglomerulumentzündung, bestimmte Anfälligkeiten gegenüber Krankheitserregern wie Wurmbefall (z.B. Leishmaniase) und bestimmte Virusinfektionen einschließlich HIV, und Bakterieninfektionen einschließlich Tuberkulose und lepromatöser Lepra.
  • Die Verfahren, die hier beschrieben sind, können außerdem zur Modulation der Stärke der Reaktionsfähigkeit einer TH-Zellsubpopulation verwendet werden, beispielsweise der Reaktionsfähigkeit auf Antigene. Diese Verfahren sind insoweit von Bedeutung, da viele Immunstörungen vielmehr mit einer unangemessenen als einer unzureichenden Immunantwort verbunden sind. Beispielsweise sind Störungen wie atopische, IgE-vermittelte allergische Erkrankungen einschließlich Asthma, Anfälligkeiten gegenüber Krankheitserregern und chronische Entzündungserkrankungen mit starken TH2-vermittelten Immunantworten verbunden, die jedoch das Gegenteil bewirken. Ferner sind unangemessene TH1-vermittelte Immunantworten auf Selbstantigene ein sehr wichtiger Punkt bei der Ausbildung von Störungen wie multipler Sklerose, Psoriasis, insulinabhängiger Diabetes, Hashimoto-Thyroiditis und Morbus Crohn.
  • Verfahren zur Modulation der Reaktionsfähigkeit von TH-Zellen können beispielsweise die Kontaktierung einer Verbindung mit einer TH-Zelle umfassen, sodass die Reaktionsfähigkeit der T-Helferzelle bezüglich der Reaktionsfähigkeit der T-Helferzelle bei Fehlen der Verbindung moduliert ist. Durch die Modulation kann die Reaktionsfähigkeit der TH-Zelle erhöht oder gesenkt werden. Alle Verfahren, die im Folgenden in Abschnitt 5.9.1 bis 5.9.3.2 beschrieben sind, können zum Bewirken einer entsprechenden Modulation der Reaktionsfähigkeit von TH-Zellen verwendet werden.
  • 5.9.1 NEGATIVE MODULATIONSVERFAHREN
  • Wie zuvor besprochen wurde, kann die erfolgreiche Behandlung bestimmter Immunstörungen durch Verfahren bewirkt werden, die der Hemmung der Expression oder der Wirksamkeit der Zielgenprodukte dienen oder die wahlweise der Senkung der Gesamtzahl von Zellen dienen, die zu einer bestimmten TH-Zellsubpopulation gehören.
  • Beispielsweise können Verbindungen wie die, die durch die Assays nachgewiesen werden, die zuvor in Abschnitt 5.8 beschrieben wurden, die eine negative Modulationswirkung aufweisen, in Übereinstimmung mit der Erfindung zur Besserung bestimmter Symptome von Störungen verwendet werden, die mit TH-Zellsubpopulationen in Zusammenhang stehen. Wie zuvor in Abschnitt 5.8 besprochen wurde, können diese Moleküle enthalten, sind jedoch nicht beschränkt auf, Peptide (wie beispielsweise Peptide, die lösliche extrazelluläre Abschnitte der Transmembranrezeptoren des Zielgenprodukts darstellen), Phosphopeptide, kleine organische oder anorganische Moleküle oder Antikörper (einschließlich beispielsweise polyklonale, monoklonale, humanisierte, anti-idiotypische, chimäre oder Einkettenantikörper und FAb-, F(ab')2- und FAb-Expressionsbibliothekfragmente sowie epitopbindende Fragmente davon). Verfahren zur Bestimmung der Wirkdosis und zur Verabreichung dieser Verbindungen sind im Folgenden in Abschnitt 5.10 beschrieben.
  • Ferner können in Übereinstimmung mit der Erfindung zur Senkung der Stärke der Zielgenexpression und damit zur wirksamen Senkung der Stärke der Zielgenwirksamkeit auch Antisense- und Ribozymmoleküle verwendet werden, die die Expression des Zielgens hemmen. Ferner können Moleküle mit dreisträngiger Helix bei der Senkung der Stärke der Zielgenwirksamkeit verwendet werden. Diese Verfahren sind im Folgenden in Abschnitt 5.9.1.1 beschrieben.
  • Außerdem sind im Folgenden in Abschnitt 5.9.3 Verfahren zur Abnahme bestimmter TH-Zellsubpopulationen besprochen. Bei diesen Verfahren können beispielsweise neuartige Oberflächenmarker genutzt werden, die spezifisch für die TH-Zellsubpopulation sind, die verringert werden soll, und können die gezielte Zerstörung in vivo oder in vitro oder wahlweise die gezielte Entfernung der interessierenden TH-Zellsubpopulation durch Reinigung umfassen.
  • Das neuartige 200-Gen, das ein Rezeptorzielgenprodukt verschlüsselt, das ein Mitglied der Ig-Superfamilie ist, weist ein TH1-spezifisches Muster der Genexpression auf. Das 200-Gen, insbesondere das menschliche 200-Gen, und seine Produkte können daher bei der Behandlung von Störungen eingesetzt werden, die mit der TH1-Zellsubpopulation in Zusammenhang stehen, beispielsweise bei chronischen Entzündungskrankheiten, Psoriasis, Transplantatabstoßung und der Transplantatgegen-Empfänger-Krankheit.
  • Die Behandlung einer derartigen Störung kann eine Verringerung der Wirksamkeit und/oder der wirksamen Konzentration der TH1-Zellsubpopulation erfordern, die an der interessierenden Störung beteiligt ist. So ist eine Reihe von Verfahren vorhanden, bei denen die TH1-spezifischen 200-Gen-Produkte verwendet werden können, um diese Verringerung der Wirksamkeit und/oder der wirksamen Konzentration von TH1-Zellen zu bewirken. Beispielsweise können natürliche Liganden, Abkömmlinge natürlicher Liganden und Antikörper, die sich an das 200-Genprodukt binden, zur Senkung der Anzahl der vorhandenen TH1-Zellen verwendet werden, indem diese Zellen entweder physisch von anderen Zellen in einer Population getrennt werden, wodurch die TH1-Zellsubpopulation ausgelöscht wird, oder wahlweise indem auf die spezifische Zerstörung von TH1-Zellen abgezielt wird. Diese Verfahren werden im Folgenden in Abschnitt 5.9.3 beschrieben. Ferner können diese Verbindungen zur Hemmung der Vermehrung von TH1-Zellen verwendet werden.
  • Außerdem können Verbindungen verabreicht werden, die mit dem endogenen Liganden für das 200-Genprodukt konkurrieren. Diese Verbindungen würden sich an den zirkulierenden Liganden binden und ihn „neutralisieren". Der sich daraus ergebende Rückgang der Menge an 200-Gen-Transmembranprotein, das an den Liganden gebunden ist, moduliert die Wirksamkeit der TH1-Zellen. Verbindungen, die besonders nützlich für diesen Zweck sein können, enthalten beispielsweise lösliche Proteine oder Peptide, zum Beispiel Peptide, die vom 200-Genprodukt die extrazelluläre Domäne oder Abschnitte und/oder Analoga davon umfassen, einschließlich beispielsweise lösliche Fusionsproteine wie Fusionsproteine mit Ig-Anhang oder Antikörper.
  • (Zu einer Erörterung der Herstellung von Fusionsproteinen mit Ig-Anhang siehe zum Beispiel die US-Patentschrift 5,116,964.)
  • Zu diesem Zweck können Peptide, die der extrazellulären Domäne des 200-Genprodukts entsprechen, lösliche Deletionsmutanten des 200-Genprodukts oder jede dieser 200-Genproduktdomänen oder -mutanten, die mit einem anderen Polypeptid verschmolzen sind (z.B. ein IgFc-Polypeptid) verwendet werden. Wahlweise können anti-idiotypische Antikörper oder Fab-Fragmente anti-idiotypischer Antikörper verwendet werden, die die extrazelluläre Domäne des 200-Genprodukts nachahmen und den Liganden für das 200-Genprodukt neutralisieren. Diese Peptide, Proteine, Fusionsproteine, anti-idiotypischen Antikörper oder Fab des 200-Genprodukts werden einer Person in ausreichender Menge verabreicht, um Ob zu neutralisieren und eine Besserung einer Störung zu bewirken, die mit einer T-Zellen-Subpopulation in Zusammenhang steht.
  • Es können Peptide des 200-Genprodukts verwendet werden, die der extrazellulären Domäne entsprechen, die die Aminosäuresequenz aufweist, die in 17 dargestellt ist, von etwa Aminosäurerest Nummer 21 bis etwa 192. Peptide des menschlichen 200-Genprodukts, die der extrazellulären Domäne entsprechen, die die Aminosäureabfolge aufweist, die in 24 dargestellt ist, von etwa Aminosäurerest Nummer 21 bis etwa 200. Es könnten auch Mutanten verwendet werden, in denen die gesamte oder ein Teil der hydrophoben Verankerungssequenz (z.B. etwa Aminosäurerest Nummer 193 bis 214 in 17 oder etwa 201 bis etwa 224 in 24). Die Verschmelzung dieser Peptide mit einem IgFc-Polypeptid sollte nicht nur die Stabilität der Zubereitung erhöhen, sondern erhöht auch die Halbwertszeit und Wirksamkeit des Fusionsproteins in vivo. Der Fc-Bereich des Ig-Abschnitts des Fusionsproteins kann weiter verändert werden, um die Effektorfunktion des Immunoglobulins herabzusetzen. Beispielsweise können Nukleotidsequenzen, die das Fusionsprotein verschlüsseln, derart verändert werden, dass sie Fusionsproteine verschlüsseln, die Cysteinreste in der Gelenkregion durch Serinreste und/oder Aminosäuren in der CH2-Domäne ersetzen, die vermutlich für die Bindung von IgG an FC-Rezeptoren und die Komplementaktivierung erforderlich sind.
  • Bei einer wahlweisen Ausführungsform zur Neutralisierung des zirkulierenden Liganden des 200-Genprodukts können einem Patienten Zellen verabreicht werden, die derart genetisch verändert sind, dass sie diese löslichen oder abgesonderten Formen des 200-Genprodukts exprimieren, woraufhin sie in vivo als „Bioreaktoren" dienen, um eine ständige Zufuhr des Proteins bereitzustellen, das den Liganden des 200-Genprodukts neutralisiert. Diese Zellen können von dem Patienten oder einem HLA-kompatiblen Spender gewonnen werden und können enthalten, sind jedoch nicht beschränkt auf, Fibroblasten, Blutzellen (z.B. Lymphozyten), Fettzellen, Muskelzellen, Endothelzellen usw. Die Zellen werden in vitro unter Verwendung von DNA-Rekombinationsverfahren genetisch verändert, um die kodierende Sequenz für das Peptid des 200-Genprodukts oder für Fusionsproteine des 200-Genprodukts (zuvor erörtert) in die Zellen einzubringen, z.B. durch Transduktions- (unter Verwendung viraler Vektoren und vorzugsweise von Vektoren, die das Transgen in das Zellgenom einbauen) oder Transfektionsvorgänge, einschließlich, jedoch nicht beschränkt auf, die Verwendung von Plasmiden, Cosmiden, YACs, Elektroporation, Liposomen usw. Die kodierende Sequenz für das 200-Genprodukt kann unter die Kontrolle eines starken konstitutiven oder induzierbaren Promotors/Enhancers gestellt werden, damit die Expression und Absonderung des Peptids oder Fusionsproteins des 200-Gens erreicht wird. Die veränderten Zellen, die das gewünschte 200-Genprodukt exprimieren und absondern, können systemisch in den Patienten eingebracht werden, z.B. in den Kreislauf, oder intraperitoneal. Wahlweise können die Zellen in eine Matrix eingearbeitet und in den Körper eingepflanzt werden, z.B. können genetisch veränderte Fibroblasten als Teil eines Hauttransplantats eingepflanzt werden; genetisch veränderte Endothelzellen können als Teil eines Gefäßtransplantats eingepflanzt werden. (Siehe beispielsweise Anderson et al. US-Patentschrift 5,399,349; und Mulligan & Wilson, US-Patentschrift 5,460,959, von denen jede hier durch Literaturhinweis in ihrer Gesamtheit aufgenommen ist).
  • Wenn die Zellen, die verabreicht werden sollen, keine Zellen des Empfängers sind, können sie unter Verwendung bekannter Verfahren verabreicht werden, mit denen die Ausbildung einer Immunantwort des Empfängers gegen die eingebrachten Zellen verhindert wird. Beispielsweise können die Zellen in verkapselter Form eingebracht werden, durch die, obwohl sie einen Austausch der Bestandteile mit der unmittelbaren extrazellulären Umgebung ermöglicht, die eingebrachten Zellen vom Immunsystem des Empfängers nicht erkannt werden können.
  • Es versteht sich, dass, obwohl diese Vorgehensweisen und Verfahren der Klarheit halber unter Verwendung des 200-Genprodukts als Beispiel beschrieben sind, sie auf alle Ziel- und/oder Pathway-Genprodukte angewendet werden können, die diesen rezeptorartigen Aufbau aufweisen.
  • 5.9.1.1. NEGATIVE MODULATIONSVERFAHREN UNTER VERWENDUNG VON RIBOZYMEN UND MOLEKÜLEN MIT DREISTRÄNGIGER HELIX
  • Unter den Verbindungen, die die Fähigkeit aufweisen können, die Symptome von Störungen zu bessern, die mit TH-Zellsubpopulationen in Zusammenhang stehen, befinden sich Ribozymmoleküle und Moleküle mit dreisträngiger Helix. Diese Moleküle können derart ausgestaltet sein, dass sie Wirksamkeit von Wildtypzielgenen oder gegebenenfalls von mutanten Zielgenen senken oder hemmen. Dem Fachmann sind die Verfahren zur Herstellung und Verwendung dieser Moleküle bekannt.
  • Ribozyme sind enzymatische RNA-Moleküle, die in der Lage sind, die spezifische Spaltung von RNA zu katalysieren (als Überblick siehe zum Beispiel Rossi, J., 1994, Current Biology 4: 469–471). Der Ablauf der Ribozymwirkung umfasst die sequenzspezifische Hybridisierung des Ribozymmoleküls an komplementäre Ziel-RNA, gefolgt von einer endonukleolytischen Spaltung. Der Aufbau der Ribozymmoleküle muss eine oder mehrere Sequenzen enthalten, die komplementär zur Zielgen-mRNA ist bzw. sind und muss die bekannte katalytische Sequenz enthalten, die für die Spaltung der mRNA zuständig ist. Zu dieser Sequenz siehe US-Patentschrift 5,093,246, die hier durch Literaturhinweis in ihrer Gesamtheit aufgenommen ist. Damit sind im Schutzumfang der Erfindung veränderte Hammerkopf-Ribozymmoleküle enthalten, die die endonukleolytische Spaltung von RNA-Sequenzen, die Zielgenproteine verschlüsseln, spezifisch und wirksam katalysieren.
  • Ribozymmoleküle, die so ausgestaltet sind, dass sie die mRNA-Transkripte von Ziel- oder Pathway-Genen katalytisch spalten, können auch dafür verwendet werden, die Translation von Ziel- oder Pathway-Gen-mRNA und die Expression von Ziel- oder Pathway-Genen zu verhindern. (Siehe z.B. die internationale PCT-Veröffentlichung WO 90/11364, veröffentlicht am 4. Oktober 1990; Sarver et al., 1990, Science 247: 1222–1225). Obwohl Ribozyme, die die mRNA an regiospezifischen Erkennungsregionen spalten, zur Zerstörung der mRNA von Ziel- oder Pathway-Genen verwendet werden kann, ist die Verwendung von Hammerkopfribozymen bevorzugt. Hammerkopfribozyme spalten mRNAs an Stellen, die durch flankierende Bereiche vorgeschrieben werden, die mit der Ziel-mRNA komplementäre Basenpaare bilden. Die einzige Anforderung ist, dass die Ziel-mRNA die folgende Sequenz aus zwei Basen aufweist: 5'-UG-3'. Der Aufbau und die Herstellung von Hammerkopfribozymen sind im Fachgebiet bekannt und ausführlicher beschrieben in Haseloff und Gerlach, 1988, Nature, 334: 585–591. Vorzugsweise wird das Ribozym derart verändert, dass die Erkennungsregion für die Spaltung nahe dem 5'-Ende der mRNA des Ziel- oder Pathway-Gens liegt; d.h. zur Erhöhung der Wirksamkeit und Verringerung der intrazellulären Ansammlung von funktionsuntüchtigen mRNA-Transkripten auf ein Mindestmaß.
  • Die Ribozyme der vorliegenden Erfindung enthalten auch RNA-Endoribonukleasen (im Folgenden „Cech-Ribozyme") wie die, die natürlich in Tetrahymena Thermophila vorkommt (bekannt als IVS- oder L-19 IVS-RNA) und eingehend von Thomas Cech und seinen Mitarbeitern beschrieben wurde (Zaug et al., 1984, Science, 224: 574–578; Zaug und Cech, 1986, Science, 231: 470–475; Zaug et al., 1986, Nature, 324: 429–433; veröffentlichte internationale Patentanmeldung WO 88/04300 von University Patents Inc.; Been und Cech, 1986, Cell, 47: 207–216). Die Cech-Ribozyme weisen ein aktives Zentrum von acht Basenpaaren auf, das an eine Ziel-RNA-Sequenz hybridisiert, wonach die Spaltung der Ziel-RNA stattfindet. Die Erfindung umfasst die Cech-Ribozyme, die auf die Sequenzen des aktiven Zentrums von acht Basenpaaren abzielen, die in Ziel- oder Pathway-Genen vorhanden sind.
  • Die Ribozyme können aus modifizierten Oligonukleotiden bestehen (z.B. für eine verbesserte Stabilität, Targe ting usw.) und sollten zu Zellen gebracht werden, die das Ziel- oder Pathway-Gen in vivo exprimieren. Ein bevorzugtes Einbringungsverfahren umfasst die Verwendung eines DNA-Konstrukts, das das Ribozym unter der Kontrolle eines starken konstitutiven pol III- oder pol II-Promotors „verschlüsselt", sodass transfizierte Zellen ausreichende Mengen des Ribozyms erzeugen, damit endogene Ziel- oder Pathway-Genbotschaften zerstört werden und die Translation gehemmt wird. Da Ribozyme katalytisch wirksam sind, ist eine geringere intrazelluläre Konzentration erforderlich, damit sie wirksam werden.
  • In Fällen, in denen die Ribozymmoleküle und/oder Moleküle mit dreisträngiger Helix, die hier beschrieben sind, zur Hemmung der Expression mutanter Gene verwendet werden, ist es möglich, dass durch das Verfahren auch die Transkription (dreisträngige Helix) und/oder die Translation (Antisense, Ribozym) von mRNA wirksam vermindert oder gehemmt wird, die von normalen Zielgenallelen gebildet wird, sodass es möglich sein kann, dass die Konzentration des vorhandenen normalen Zielgenprodukts geringer sein kann, als es für einen normalen Phänotyp notwendig ist. In diesen Fällen können daher zur Sicherstellung, dass eine im Wesentlichen normale Stärke der Zielgenwirksamkeit erhalten bleibt, Nukleinsäuremoleküle, die Zielgenpolypeptide verschlüsseln und exprimieren, die eine normale Zielgenwirksamkeit aufweisen, mittels gentherapeutischer Verfahren wie denen, die im Folgenden in Abschnitt 5.9.2 beschrieben sind, in Zellen eingebracht werden, die keine Sequenzen enthalten, die empfindlich gegenüber Behandlungen mit Ribozymen oder Molekülen mit dreisträngiger Helix sind, unabhängig davon, welche eingesetzt werden. Wahlweise kann es in Fällen, in denen das Zielgen ein extrazelluläres Protein verschlüsselt, bevorzugt sein, das normale Zielgenprotein mit zu verabreichen, um die erforderliche Stärke der Zielgenwirksamkeit zu erhalten.
  • Ribozymmoleküle der Erfindung und Moleküle der Erfindung mit dreisträngiger Helix können mit jedem Verfahren hergestellt werden, das im Fachgebiet zur Synthese von DNA- und RNA-Molekülen bekannt ist. Dazu gehören Verfahren zur chemischen Synthese von Oligodesoxyribonukleotiden und Oligoribonukleotiden, die im Fachgebiet bekannt sind, beispielsweise die chemische Phosphoramidit-Festphasensynthese. Wahlweise können RNA-Moleküle durch in vitro und in vivo Transkription von DNA-Sequenzen erzeugt werden, die das Antisense-RNA-Molekül verschlüsseln. Diese DNA-Sequenzen können in eine große Vielfalt von Vektoren eingebaut werden, die geeignete RNA-Polymerasepromotoren wie die T7- oder SP6-Polymerasepromotoren enthalten.
  • Als Mittel zur Erhöhung der intrazellulären Stabilität und der Halbwertszeit können verschiedene bekannte Modifikationen der DNA-Moleküle eingebracht werden. Mögliche Modifikationen enthalten, sind jedoch nicht beschränkt auf, die Zugabe von flankierenden Sequenzen von Ribo- oder Desoxynukleotiden zum 5'- und/oder 3'-Ende des Moleküls oder die Verwendung von Phosphorothioat- oder 2'-O-Methyl- anstatt Phosphodiesterasebindungen in der Hauptkette des Oligodesoxyribonukleotids.
  • Die endogene Ziel- und/oder Pathway-Genexpression kann auch durch Unwirksammachen oder „Ausschalten" des Ziel- und/oder Pathway-Gens oder seines Promotors unter Verwendung der gezielten homologen Rekombination vermindert werden. (Siehe z.B. Smithies et al., 1985, Nature 317: 230–234; Thomas & Capecchi, 1987, Cell 51: 503–512; Thompson et al., 1989 Cell 5: 313–321; von denen alle hier durch Literaturhinweis in ihrer Gesamtheit aufgenommen sind). Zum Beispiel kann ein mutantes, funktionsuntüchtiges Ziel- und/oder Pathway-Gen (oder eine ganz und gar nicht verwandte DNA-Sequenz), flankiert von DNA, die zum endogenen Ziel- und/oder Pathway-Gen homolog ist (entweder die kodierenden oder die regulatorischen Bereiche des Ziel- und/oder Pathway-Gens) zur Transfektion von Zellen, die in vivo das Ziel- und/oder Pathway-Gen exprimieren, verwendet werden, mit oder ohne einen wählbaren Marker und/oder einen negativen Marker. Das Einsetzen des DNA-Konstrukts mittels der gezielten homologen Rekombination führt zum Unwirksammachen des Ziel- und/oder Pathway-Gens. Diese Verfahren sind besonders geeignet in der Landwirtschaft, wo Modifikationen von ES (embryonale Stamm-)-Zellen zur Zeugung von Tiernachwuchs mit einem unwirksamen Ziel- und/oder Pathway-Gen eingesetzt werden können (siehe z.B. Thomas & Capecchi 1987 und Thompson 1989, siehe oben). Diese Verfahren können auch zur Schaffung von Tiermodellen für Störungen verwendet werden, die mit T-Zellsubpopulationen in Zusammenhang stehen. Es sollte festgehalten werden, dass dieses Verfahren für die Verwendung beim Menschen unter der Voraussetzung angepasst werden kann, dass die rekombinierten DNA-Konstrukte unmittelbar verabreicht oder unter Verwendung von geeigneten viralen Vektoren an die erforderliche Stelle in vivo gebracht werden, z.B. von Herpesvirusvektoren.
  • Wahlweise kann die endogene Ziel- und/oder Pathway-Genexpression durch Targeting von Desoxyribonukleotidsequenzen, die zum regulatorischen Bereich des Ziel- und/oder Pathway-Gens komplementär sind (d.h. der Promotor des Ziel- und/oder Pathway-Gens und/oder Enhancer), vermindert werden, sodass dreisträngige Helixstrukturen gebildet werden, die die Transkription des Ziel- oder Pathway-Gens in Zielzellen im Körper verhindern. (Siehe ganz allgemein Helene, C. 1991, Anticancer Drug Des., 6 (6): 569–84; Helene, C. et al., 1992, Ann, N. Y. Accad. Sci., 660: 27–36; und Maher, L. J., 1992, Bioassays 14 (12): 807–15). Bei noch einer weiteren Ausführungsform der Erfindung kann die Wirksamkeit des Ziel- und/oder Pathway-Gens unter Verwendung eines „dominant-negativen" Verfahrens vermindert werden. Zu diesem Zweck können in gentherapeutischen Verfahren zur Verminderung der Wirksamkeit des Ziel- und/oder Pathway-Genprodukts in entsprechenden Zielzellen Konstrukte verwendet werden, die fehlerhafte Ziel- und/oder Pathway-Genprodukte verschlüsseln.
  • 5.9.2. POSITIVE MODULATIONSVERFAHREN
  • Wie zuvor besprochen wurde, kann die erfolgreiche Behandlung bestimmter Immunstörungen durch Verfahren bewirkt werden, die der Erhöhung der Stärke der Zielgenexpression oder der Erhöhung der Wirksamkeit des Zielgenprodukts dienen oder die wahlweise, der wirksamen Erhöhung der Gesamtzahl von Zellen dienen, die zu einer bestimmten TH-Zellsubpopulation gehören.
  • Beispielsweise können Verbindungen wie die, die durch die Assays nachgewiesen werden, die zuvor in Abschnitt 5.8 beschrieben wurden, die eine positive Modulationswirkung aufweisen, in Übereinstimmung mit der Erfindung zur Besserung bestimmter Symptome von Störungen verwendet werden, die mit TH-Zellsubpopulationen in Zusammenhang stehen. Wie zuvor in Abschnitt 5.8 besprochen wurde, können diese Moleküle enthalten, sind jedoch nicht beschränkt auf, Peptide, die lösliche extrazelluläre Abschnitte der Transmembranrezeptoren des Zielgenprodukts darstellen, Phosphopeptide, kleine organische oder anorganische Moleküle oder Antikörper (einschließlich beispielsweise polyklonale, monoklonale, humanisierte, anti-idiotypische, chimäre oder Einkettenantikörper und FAb-, F(ab')2- und FAb-Expressionsbibliothekfragmente sowie epitopbindende Fragmente davon).
  • Zum Beispiel kann eine Verbindung wie ein Zielgenprotein in einer Menge, die ausreicht, die Symptome von Immunstörungen zu bessern, einem Patienten verabreicht werden, der diese Symptome zeigt. Alle Verfahren, die im Folgenden in Abschnitt 5.10 besprochen sind, können für diese Verabreichung eingesetzt werden. Ein Fachmann wird ohne Weiteres wissen, wie die Konzentration der ungiftigen Wirkdosis der Verbindung bestimmt wird, wobei er Verfahren wie die verwendet, die im Folgenden in Abschnitt 5.10.1 beschrieben sind.
  • In den Fällen, in denen die Verbindung, die verabreicht werden soll, eine Peptidverbindung ist, können einem Patienten, der Symptome von Immunstörungen zeigt, unmittelbar DNA-Sequenzen, die die Peptidverbindung verschlüsseln, in einer Konzentration verabreicht werden, die ausreicht, einen Gehalt der Peptidverbindung zu erzeugen, der ausreicht, die Symptome der Störung zu bessern. Alle Verfahren, die im Folgenden in Abschnitt 5.10 besprochen sind, die eine intrazelluläre Verabreichung von Verbindungen bewirken, beispielsweise die Verabreichung von Liposomen, können für die Verabreichung dieser DNA-Moleküle verwendet werden. Die DNA-Moleküle können beispielsweise mit bekannten Rekombinationsverfahren hergestellt werden.
  • Im Fall von Peptidverbindungen, die extrazellulär wirken, können die DNA-Moleküle, die diese Peptide verschlüsseln, solange von jedem Zelltyp aufgenommen und exprimiert werden, wie sich eine ausreichende Konzentration zirkulierenden Peptids zur Auslösung einer Verminderung der Symptome von Immunstörungen ergibt. Bei Verbindungen, die intrazellulär wirken, müssen die DNA-Moleküle, die diese Peptide verschlüsseln, von der interessierenden TH-Zellsubpopulation in ausreichendem Maße aufgenommen und exprimiert werden, damit sie die Verminderung von Immunstörungen bewirken.
  • Daher ist bei den DNA-Molekülen, die Peptide verschlüsseln, die intrazellulär wirken, jedes Verfahren bevorzugt, das dazu dient, DNA-Moleküle gezielt der interessierenden TH-Zellsubpopulation zu verabreichen. Bei Asthma zum Beispiel werden Verfahren bevorzugt, mit denen gezielt den TH-Zellsubpopulationen Moleküle verabreicht werden, die sich im Lungengewebe befinden.
  • Ferner können Patienten in Fällen, in denen die Störung, die mit der TH-Zellsubpopulation in Zusammenhang steht, ein abweichendes Gen umfasst, mit einer Genersatztherapie behandelt werden. Eine oder mehrere Kopien eines normalen Zielgens oder ein Abschnitt des Gens, das die Herstellung eines normalen Zielgenproteins mit Zielgenfunktion bestimmt, kann in Zellen eingesetzt werden, unter Verwendung von Vektoren, die enthalten, jedoch nicht beschränkt sind auf, Adenovirus-, adeno-assoziierte Virus- und Retrovirusvektoren, zusätzlich zu anderen Teilchen, die DNA in Zellen einbringen, beispielsweise Liposome.
  • Diese Genersatzverfahren können entweder in vivo oder in vitro durchgeführt werden. Wie zuvor ist bei Genen, die extrazelluläre Moleküle verschlüsseln, der Zelltyp, der das Zielgen exprimiert, für die Besserung von Immunstörungen weniger wichtig, als dass eine ausreichende Konzentration des zirkulierenden extrazellulären Moleküls erreicht wird. Ferner muss wie zuvor das Gen bei dem interessierenden Zelltyp der TH-Zellsubpopulation exprimiert werden, wenn das Gen eine Zelle verschlüsselt, die intrazellulär wirkt oder als Transmembranmolekül dient. Daher sind Verfahren, bei denen die Expression im interessierenden Zelltyp gewählt wird, bei dieser letzten Klasse von Zielgenen bevorzugt. In vivo kann zu diesen Verfahren beispielsweise die geeignete örtliche Verabreichung von Zielgensequenzen gehören.
  • Weitere Verfahren, die zur Erhöhung der Gesamtstärke der Ziel- und/oder Pathway-Genexpression und oder der Ziel- und/oder Pathway-Genwirksamkeit eingesetzt werden können, umfassen die Einbringung geeigneter Zellen, die das Ziel- und/oder Pathway-Gen exprimieren, vorzugsweise autologe Zellen, in einen Patienten an Stellen und in einer Zahl, die ausreichend ist für die Besserung der Symptome von Störungen, die mit T-Zellsubpopulationen in Verbindung stehen. Diese Zellen können entweder rekombinant oder nicht-rekombinant sein. Unter den Zellen, die zur Erhöhung der Gesamtstärke der Ziel- und/oder Pathway-Genexpression bei einem Patienten verabreicht werden können, befinden sich normale Zellen, die das Ziel- und/oder Pathway-Gen exprimieren. Die Zellen können an der anatomischen Stelle der Expression oder als Teil eines Gewebetransplantats verabreicht werden, das sich an einer anderen Stelle im Körper befindet. Diese zellbasierten gentherapeutischen Verfahren sind dem Fachmann bekannt, siehe z.B. Anderson et al., US-Patentschrift 5,399,349; Mulligan & Wilson, US-Patentschrift 5,460,959.
  • In vitro können Zielgensequenzen in autologe Zellen eingebracht werden. Diese Zellen, die die interessierende Zielgensequenz exprimieren, können, vorzugsweise mittels intravenöser Verabreichung, wieder in den Patienten eingebracht werden, damit dadurch eine Besserung der Symptome der Störung bewirkt wird.
  • Wahlweise können TH-Zellen, die zu einer bestimmten TH-Zellsubpopulation gehören, derart einem Patienten verabreicht werden, dass die Gesamtzahl der Zellen, die zu dieser TH-Zellsubpopulation gehört, bezüglich der Zellen anderer TH-Zellsubpopulationen erhöht wird, was zu einer Besserung einer Störung führt, die mit einer TH-Zellsubpopulation in Verbindung steht. Verfahren für diese Vermehrung einer TH-Zellsubpopulation sind im Folgenden in Abschnitt 5.9.3.2 beschrieben.
  • 5.9.3 NEGATIVE ODER POSITIVE MODULATIONSVERFAHREN
  • Hier sind Modulationsverfahren beschrieben, die je nach der besonderen Anwendung, für die sie eingesetzt werden, entweder positive oder negative Reaktionen ergeben können, die zur Besserung von Immunstörungen führen, einschließlich Störungen, die mit TH-Zellsubpopulationen in Zusammenhang stehen. Damit können in entsprechenden Fällen die Verfahren aus diesem Abschnitt in Verbindung mit den negativen Modulationsverfahren verwendet werden, die zuvor in Abschnitt 5.9.1 beschrieben sind, oder wahlweise in Verbindung mit den positiven Modulationsverfahren, die zuvor in Abschnitt 5.9.2 beschrieben sind.
  • 5.9.3.1. VERFAHREN UNTER VERWENDUNG VON ANTIKÖRPERN
  • Antikörper, die zur Modulation in der Lage sind, können zur Besserung von Immunstörungen wie von Störungen eingesetzt werden, die mit TH-Zellsubpopulationen in Zusammenhang stehen. In Abhängigkeit von dem jeweiligen Antikörper kann die Modulationswirkung negativ sein und kann daher als Teil der Verfahren verwendet werden, die zuvor in Abschnitt 5.9.1 beschrieben sind, oder kann positiv sein und kann daher in Verbindung mit den Verfahren verwendet werden, die zuvor in Abschnitt 5.9.2 beschrieben sind.
  • Ein Antikörper, der zur negativen Modulation in der Lage ist, bezeichnet einen Antikörper, der sich spezifisch an ein Protein bindet und die Wirkung dieses Proteins beeinträchtigt. Im Falle eines extrazellulären Rezeptors würde dieser Antikörper beispielsweise die extrazelluläre Domäne des Rezeptors auf eine Art und Weise spezifisch binden, durch die der Rezeptor nicht aktiviert wird, durch die jedoch die Fähigkeit des Rezeptors beeinträchtigt wird, seinen natürlichen Liganden zu binden. Zum Beispiel können Antikörper, die gegen die extrazelluläre Domäne des 200-Genprodukts gerichtet sind, als derartige negative Modulatoren dienen. Diese Antikörper können unter Verwendung der gängigen Verfahren, die zuvor in Abschnitt 5.6 beschrieben sind, gegen vollständige Wildtyp- oder mut ante Proteine oder gegen Peptide erzeugt werden, die Abschnitten der Proteine entsprechen. Die Antikörper enthalten, sind jedoch nicht beschränkt auf, polyklonale, monoklonale, Fab-Fragmente, Einkettenantikörper, chimäre Antikörper und Ähnliches.
  • Ein Antikörper, der zur positiven Modulation in der Lage ist, bezeichnet einen Antikörper, der sich spezifisch an ein Protein bindet und durch die Bindung dazu dient, die Funktion des Proteins, das es erkennt, entweder direkt oder indirekt zu aktivieren. Beispielsweise kann sich ein Antikörper derart an den extrazellulären Abschnitt eines Transmembranproteins binden, dass das Transmembranprotein dazu veranlasst wird, so zu arbeiten, als ob sein endogener Ligand sich daran binden würde, wodurch zum Beispiel ein Signalwandlungsablauf in Gang gebracht wird. Antikörper können unter Verwendung der gängigen Verfahren, die zuvor in Abschnitt 5.6 beschrieben wurden, gegen vollständige Wildtyp- oder mutante Proteine oder gegen Peptide erzeugt werden, die Abschnitten der Proteine entsprechen. Die Antikörper enthalten, sind jedoch nicht beschränkt auf, polyklonale, monoklonale, FAb-Fragmente, Einkettenantikörper, chimäre Antikörper und Ähnliches.
  • In Fällen, in denen das Protein, zum Beispiel ein Zielgenprotein, auf das der Antikörper gerichtet ist, intrazellulär ist und ganze Antikörper verwendet werden, können „verinnerlichte" Antikörper bevorzugt werden. Jedoch kann Lipofectin oder können Liposome verwendet werden, um den Antikörper oder ein Bruchstück der Fab-Region, das sich an das Epitop des Genprodukts bindet, in Zellen hineinzubringen. Wenn Bruchstücke des Antikörpers verwendet werden, wird das kleinste inhibitorische Bruchstück bevorzugt, das sich an die Bindungsdomäne des Proteins bindet. Zum Beispiel können Peptide verwendet werden, die eine Aminosäuresequenz aufweisen, die der Domäne der variablen Region des Antikörpers entspricht, der sich an das Protein bindet. Diese Peptide können chemisch synthetisiert oder über die DNA-Rekombinationstechnik unter Verwendung von Verfahren hergestellt werden, die im Fachgebiet bekannt sind (siehe z.B. Creighton, 1983, siehe oben; und Sambrook et al., 1989, oben). Wahlweise können auch Einkettenantikörper verabreicht werden, zum Beispiel neutralisierende Antikörper, die sich an intrazelluläre Epitope binden. Diese Einkettenantikörper können zum Beispiel verabreicht werden, indem Nukleotidsequenzen exprimiert werden, die Einkettenantikörper in der Zielzellpopulation verschlüsseln, zum Beispiel unter Verwendung von Verfahren wie denen, die in Marasco et al. (Marasco, W. et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 7889–7893) beschrieben sind.
  • In Fällen, in denen das Protein, auf das der Antikörper gerichtet ist, extrazellulär oder ein Transmembranprotein ist, kann jedes Verabreichungsverfahren, das im Folgenden in Abschnitt 5.10 beschrieben ist und für die Verabreichung von Peptiden geeignet ist, zur wirksamen Verabreichung der Antikörper an ihre Wirkort eingesetzt werden.
  • 5.9.3.2 VERFAHREN ZUR ERHÖHUNG ODER VERMINDERUNG DER KONZENTRATION EINER BESTIMMTEN TH-ZELLSUBPOPULATION
  • Die Verfahren, die hier beschrieben sind, können entweder zur Verminderung oder zur Erhöhung der Gesamtzahl der Zellen verwendet werden, die zu einer bestimmten TH-Zellsubpopulation gehören, wodurch das Verhältnis der interessierenden TH-Zellsubpopulation zu anderen TH-Zellsubpopulationen wirksam erhöht oder vermindert wird. Insbesondere sind Trennverfahren beschrieben, die entweder zur Verringerung oder zur Vermehrung der Gesamtzahl der Zellen verwendet werden, die in einer TH-Zellsubpopulation vorliegt, und ferner sind Targeting-Verfahren beschrieben, die zur Verringerung be stimmter TH-Zellsubpopulationen eingesetzt werden können.
  • In Abhängigkeit von der jeweiligen Anwendung kann die Änderung der Anzahl von Zellen, die zu einer TH-Zell-subpopulation gehören, entweder fördernde oder hemmende Reaktionen hervorrufen, die zur Besserung von Störungen führen, die mit TH-Zellsubpopulationen verbunden sind. Damit können die Verfahren aus diesem Abschnitt in entsprechenden Fällen in Verbindung mit den hemmenden Verfahren eingesetzt werden, die zuvor in Abschnitt 5.9.1 beschrieben sind, oder wahlweise in Verbindung mit den fördernden Verfahren, die zuvor in Abschnitt 5.9.2 beschrieben sind.
  • Die Trennverfahren, die hier beschrieben sind, beruhen auf der Gegenwart oder dem Fehlen von bestimmten Oberflächenmarkern, vorzugsweise Transmembranmarkern. Diese Marker können enthalten, sind jedoch nicht beschränkt auf, die Marker der extrazellulären Domäne des TH1-spezifischen 200-Genprodukts.
  • In Fällen, in denen das Ziel der Trennung die Erhöhung oder Vermehrung der Anzahl von Zellen ist, die zu einer bestimmten TH-Zellsubpopulation gehören, kann der verwendete Antikörper auch spezifisch für Oberflächenmarker sein, die auf undifferenzierten oder teilweise undifferenzierten TH-Zellen vorliegen. Nach der Trennung und Reinigung dieser undifferenzierten oder teilweise undifferenzierten TH-Zellen können die Zellen in physiologischem Puffer oder Nährmedium gezüchtet werden und durch Züchtung in Gegenwart von geeigneten Größen zur Differenzierung veranlasst werden. Zum Beispiel kann IL-4 hinzugegeben werden, damit die TH-Zellen zur Differenzierung zu TH2-Zellen veranlasst werden, während das Zytokin IL-12 hinzugegeben werden kann, um TH-Zellen zur Differenzierung zu TH1-Zellen zu veranlassen. Nach der Differenzierung können die Zellen gewaschen, wieder in zum Beispiel gepufferter physio logischer Kochsalzlösung suspendiert und, vorzugsweise intravenös, wieder in einen Patienten eingebracht werden.
  • Es können Trennverfahren eingesetzt werden, mit denen Zellen in vitro aus einer Population von Zellen wie blutbildenden Zellen getrennt und gereinigt werden, die aus dem Körper des behandelten Patienten stammen. Eine Startpopulation von Zellen, die eine TH-Zellsubpopulation enthält, beispielsweise blutbildende Zellen, kann unter Verwendung von gängigen Verfahren gewonnen werden, die dem Fachmann bekannt sind. Als eine mögliche Ausgangsquelle für diese Verfahren kann peripheres Blut verwendet werden und kann beispielsweise über Venenpunktion und Auffangen in heparinisierten Röhrchen gewonnen werden.
  • Sobald die Ausgangsquelle für autologe Zellen gewonnen wurde, können die T-Zellen wie TH1- oder TH2-Zellen entfernt werden, und damit durch verschiedene Verfahren gezielt getrennt und gereinigt werden, bei denen Antikörper verwendet werden, die bestimmte Marker binden, die auf der interessierenden T-Zellpopulation vorhanden sind, während sie auf anderen Zellen in der Ausgangsquelle nicht vorhanden sind. Diese Verfahren können zum Beispiel die Durchflusszytometrie unter Verwendung eines fluoreszenzaktivierten Zellsortierers (FACS) und bestimmter Fluoreszenzfarbstoffe umfassen, Biotin-Avidin- oder Biotin-Streptavidin-Trennverfahren unter Verwendung von Biotin, das an Antikörpern gekoppelt ist, die spezifisch für Oberflächenmarker sind, und Avidin oder Streptavidin, das an einen festen Träger gebunden ist, beispielsweise die Matrix einer Affinitätssäule oder Kunststoffoberflächen, oder magnetische Trennverfahren unter Verwendung von magnetischen Kügelchen, die mit einem Antikörper beschichtet sind.
  • Die Trennung über Antikörper für bestimmte Marker kann durch negative oder positive Auswahlverfahren erfolgen.
  • Bei der negativen Trennung werden Antikörper verwendet, die spezifisch für Marker sind, die sich auf unerwünschten Zellen befinden. Zum Beispiel könnten im Fall einer Störung, die mit der TH1-Zellsubpopulation in Zusammenhang steht, bei der es wünschenswert wäre, die Anzahl der TH1-Zellen zu verringern, diese Antikörper auf die extrazelluläre Domäne des 200-Genprodukts gerichtet sein.
  • Bei der positiven Trennung werden Antikörper verwendet, die spezifisch für Marker sind, die sich auf den erwünschten interessierenden Zellen befinden. Zum Beispiel könnten im Fall einer Störung, die mit der TH1-Zellsubpopulation in Zusammenhang steht, bei der es wünschenswert wäre, die Anzahl der TH1-Zellen zu erhöhen, diese Antikörper auf die extrazelluläre Domäne des 200-Genprodukts gerichtet sein. Zellen, die vom Antikörper gebunden werden, werden getrennt und zurückgehalten. Es versteht sich, dass positive und negative Trennverfahren im Wesentlichen gleichzeitig oder aufeinander folgend verwendet werden können.
  • Ein übliches Verfahren der Trennung auf der Grundlage von Antikörpern ist die Verwendung der Durchflusszytometrie, beispielsweise mit einem fluoreszenzaktivierten Zellsortierer (FACS). Üblicherweise erfolgt die Trennung durch Durchflusszytometrie folgendermaßen. Das suspendierte Zellgemisch wird zentrifugiert und in Medien erneut suspendiert. Es werden Antikörper, die an einen Fluoreszenzfarbstoff gekoppelt sind, hinzugegeben, damit sich die Antikörper an bestimmte Oberflächenmarker binden können. Das Zellgemisch wird anschließend in einem oder mehreren Zentrifugations- und Resuspensionsschritten gewaschen. Das Gemisch durchläuft anschließend einen FACS, der die Zellen auf der Grundlage verschiedener Fluoreszenzeigenschaften trennt. FACS-Systeme sind in verschiedenen Leistungsstufen erhältlich, einschließlich Mehrfarbanalyse. Die „facilitating" Zelle kann mittels eines kennzeichnenden Profils aus Vorwärts- und Seitwärtsstreuung nachgewiesen werden, das durch Größe und Granularität sowie durch positive und/oder negative Expression bestimmter Oberflächenmarker beeinflusst wird.
  • Weitere Trennverfahren neben der Durchflusszytometrie können ebenfalls für eine schnelle Trennung sorgen. Ein solches Verfahren ist die Trennung auf der Grundlage von Biotin und Avidin mittels Affinitätschromatographie. Üblicherweise wird dieses Verfahren durch Inkubation von Zellen mit an Biotin gekoppelten Antikörpern für bestimmte Marker durchgeführt, mit anschließendem Durchlauf durch eine Avidinsäule. Biotin-Antikörper-Zellkomplexe binden sich über die Biotin-Avidin-Wechselwirkung an die Säule, während andere Zellen durch die Säule durchlaufen. Die Spezifität des Biotin-Avidin-Systems ist gut geeignet für schnelle positive Trennungen. Mehrere Durchläufe können die Trennung einer ausreichenden Menge der interessierenden TH-Zellsubpopulation gewährleisten.
  • In Fällen, in denen das Ziel des Trennverfahrens darin besteht, die Gesamtzahl der Zellen zu verringern, die zu einer TH-Zellsubpopulation gehören, können die Zellen, die aus der Ausgangsquelle von Zellen gewonnen wurden, der jetzt wirksam die Zellen der TH-Zellsubpopulation entzogen wurden, wieder in den Patienten eingebracht werden. Diese Abnahme der TH-Zellsubpopulation führt zur Besserung von Störungen, die mit TH-Zellsubpopulationen in Zusammenhang stehen und mit der Wirksamkeit oder übermäßigen Wirksamkeit der TH-Zell-subpopulation verbunden sind. Das erneute Einbringen der Zellen, denen die TH-Zellsubpopulation entzogen wurde, kann erfolgen, indem die Zellen gewaschen, in zum Beispiel gepufferter physiologischer Kochsalzlösung erneut suspendiert und die Zellen intravenös einem Patienten verabreicht werden.
  • Wenn die Lebensfähigkeit und die Ausbeute der Zellen ausreichen, können Zellen, denen die TH-Zellsubpopulation entzogen wurde, sofort nach der Trennung wieder in Patienten eingebracht werden. Wahlweise können Zellen, denen die TH-Zellsubpopulation entzogen wurde, ex vivo gezüchtet und vervielfältigt werden, bevor sie einem Patienten verabreicht werden. Die Vervielfältigung kann über bekannte Verfahren erfolgen, bei denen physiologische Puffer oder Nährmedien in der Gegenwart geeigneter Faktoren zur Vervielfältigung wie Interleukinen und anderen bekannten Wachstumsfaktoren verwendet werden.
  • In Fällen, in denen das Ziel des Trennverfahrens darin besteht, die Gesamtzahl der Zellen zu vermehren oder erhöhen, die zu einer TH-Zellsubpopulation gehören, können Zellen, die aus den gereinigten Zellen der TH-Zellsubpopulation wieder in den Patienten eingebracht werden, was zur Besserung von Störungen führt, die mit TH-Zellsubpopulationen in Zusammenhang stehen und mit einer zu geringen Wirksamkeit der TH-Zellsubpopulation verbunden sind.
  • Die Zellen, die wieder eingebracht werden sollen, werden vor dem erneuten Einbringen ex vivo gezüchtet und vervielfältigt. Gereinigte Zellen der TH-Zellsubpopulation können gewaschen, in zum Beispiel gepufferter physiologischer Kochsalzlösung suspendiert und über intravenöse Verabreichung, wieder in den Patienten eingebracht werden.
  • Die Zellen, die vervielfältigt werden sollen, können unter Verwendung gängiger Verfahren in Gegenwart eines geeigneten Mittels zur Vervielfältigung gezüchtet werden, das die Vermehrung der gereinigten TH-Zell-subpopulation auslöst. Ein solches Mittel zur Vervielfältigung können beispielsweise alle geeigneten Zytokine, Antigene oder Antikörper sein. Bei TH2-Zellen kann das Mittel zur Vervielfältigung IL-4 sein, während das Mittel zur Vervielfältigung bei TH1-Zellen beispielsweise IL-12 sein kann.
  • Bevor sie wieder in einen Patienten eingebracht werden, können die gereinigten Zellen beispielsweise durch Transformation mit Gensequenzen verändert werden, die interessierende Genprodukte verschlüsseln. Diese Genprodukte sollten Produkte sein, die die Wirksamkeit der gereinigten TH-Zellsubpopulation verstärken, oder wahlweise Produkte sein, die die Wirksamkeit einer oder mehrerer der anderen TH-Zellsubpopulationen unterdrücken. Zelltransformations- und Genexpressionsverfahren sind dem Fachmann bekannt und können wie die sein, die zuvor in Abschnitt 5.5 beschrieben sind.
  • Bekannte Targetingverfahren können außerdem in Fällen verwendet werden, in denen das Ziel darin besteht, die Anzahl der Zellen zu verringern, die zu einer bestimmten TH-Zellsubpopulation gehören. Diese Targetingverfahren können in vivo oder in vitro erfolgen und können das Einbringen von Targetingmitteln in eine Zellpopulation umfassen, sodass die Targetingmittel eine bestimmte Untergruppe der Zellen in der Population gezielt zerstören. Die Verfahren zur in vivo-Verabreichung, die bei diesen Targetingmitteln durchgeführt werden können, sind im Folgenden in Abschnitt 5.10 beschrieben.
  • Targetingmittel umfassen im Allgemeinen erstens einen Targetinganteil, der im vorliegenden Fall das Targetingmittel dazu veranlasst, sich gezielt mit einer bestimmten TH-Zellsubpopulation zu verbinden. Die Targetingmittel umfassen im Allgemeinen zweitens einen Anteil, der in der Lage ist, eine Zelle zu zerstören, mit der sich das Targetingmittel verbunden hat.
  • Targetinganteile können enthalten, sind jedoch nicht beschränkt auf, Antikörper, die auf Oberflächenmarker gerichtet sind, die insbesondere auf der TH-Zellsub population zu finden sind, auf die abgezielt wird, oder die wahlweise auf Liganden wie Wachstumsfaktoren gerichtet sind, die rezeptorartige Moleküle binden, die ausschließlich auf der TH-Zellsubpopulation zu finden sind, auf die abgezielt wird.
  • Bei TH1-Zellen kann ein solcher Targetinganteil zum Beispiel einen Antikörper darstellen, der gegen den extrazellulären Abschnitt des 200-Genprodukts gerichtet ist, das hier beschrieben ist, oder kann wahlweise einen Liganden darstellen, der kennzeichnend für dieses rezeptorartige TH1-spezifische Molekül ist.
  • Zerstörende Anteile enthalten alle Anteile, die in der Lage sind, eine Zelle unwirksam zu machen oder zu zerstören, an die sich das Targetingmittel gebunden hat. Beispielsweise kann ein zerstörender Anteil enthalten, ist jedoch nicht beschränkt auf, Zellgifte oder radioaktive Stoffe. Zellgifte enthalten beispielsweise Giftstoffe, die aus Pflanzen, Pilzen oder Bakterien gewonnen wurden, wobei Giftstoffe mit deglykosylierter Ricin-A-Kette im Allgemeinen wegen ihrer Wirksamkeit und sehr langen Halbwertszeit bevorzugt sind.
  • 5.10. PHARMAZEUTISCHE PRÄPARATE UND VERFAHREN ZU IHRER VERABREICHNUNG
  • Die Verbindungen, Nukleinsäuresequenzen und Zellen der TH-Zellsubpopulation, die hier beschrieben sind, können einem Patienten in einer therapeutisch wirksamen Dosis verabreicht werden, um Immunstörungen, z.B. Störungen, die mit einer TH-Zellsubpopulation in Verbindung stehen, zu behandeln oder zu bessern. Eine therapeutisch wirksame Dosis bezeichnet die Menge einer Verbindung oder TH-Zellsubpopulation, die ausreicht, um zur Besserung der Symptome von Immunstörungen zu führen, oder wahlweise, die Menge einer Nukleinsäuresequenz, die ausreicht, um eine Konzentration eines Genprodukts zu exprimieren, die zur Besserung der Störungen führt, die mit TH-Zellsubpopulationen in Zusammenhang stehen, oder anderer Immunstörungen.
  • 5.10.1. WIRKDOSIS
  • Die Giftigkeit und therapeutische Wirksamkeit von Verbindungen können mittels gängiger pharmazeutischer Verfahren in Zellkulturen oder Versuchstieren ermittelt werden, z.B. zur Bestimmung von LD50 (die Dosis, die für 50% des Bestands tödlich ist) und ED50 (die Dosis, die bei 50% des Bestands therapeutisch wirksam ist). Das Dosisverhältnis zwischen toxischer und therapeutischer Wirkung ist die therapeutische Breite und kann als das Verhältnis LD50/ED50 ausgedrückt werden. Es werden Verbindungen bevorzugt, die eine große therapeutische Breite aufweisen. Obwohl Verbindungen verwendet werden können, die giftige Nebenwirkungen aufweisen, sollte darauf geachtet werden, dass ein Eingabesystem ausgestaltet wird, das diese Verbindungen zur Stelle des betroffenen Gewebes bringt, um eine mögliche Beschädigung nicht-infizierter Zellen auf ein Mindestmaß herabzusetzen und dadurch die Nebenwirkungen zu verringern.
  • Die Daten, die aus den Zellkultur-Assays und den Tierversuchen gewonnen werden, können bei der Formulierung eines Dosisbereichs zur Verwendung beim Menschen verwendet werden. Die Dosierung dieser Verbindungen liegt vorzugsweise in einem Bereich der zirkulierenden Konzentration, der die ED50 bei geringer oder ohne Giftigkeit umfasst. Die Dosierung kann innerhalb dieses Bereichs schwanken, je nach verwendeter Darreichungsform und dem verwendeten Verabreichungsweg. Für jede Verbindung, die im Verfahren der Erfindung verwendet wird, kann die therapeutisch wirksame Dosis zuerst aus Zellkultur-Assays abgeschätzt werden. In Tiermodellen kann eine Dosis erstellt werden, um einen Bereich der zirkulierenden Plasmakonzentration zu erreichen, der die IC50 umfasst (d.h. die Konzentration der Testverbindung, bei der die halbmaximale Hemmung der Symptome erreicht ist), wie sie in Zellkulturen bestimmt wurde. Diese Angaben können für die genauere Ermittlung der nützlichen Dosis beim Menschen verwendet werden. Der Gehalt im Plasma kann beispielsweise mit der Hocheistungsflüssigkeitschromatographie gemessen werden.
  • 5.10.2. ZUBEREITUNGEN UND VERWENDUNG
  • Pharmazeutische Zusammensetzungen zur Verwendung in Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung können auf herkömmliche Weise unter Verwendung eines oder mehrerer physiologisch akzeptabler Träger oder Hilfsstoffe zubereitet werden.
  • Damit können die Verbindungen und ihre physiologisch akzeptablen Salze und Lösungsmittel zur Verabreichung durch Einatmung oder Einblasen (entweder durch den Mund oder die Nase) oder zur oralen, bukkalen, parenteralen oder rektalen Verabreichung zubereitet werden.
  • Zur oralen Verabreichung können die pharmazeutischen Zusammensetzungen die Form von zum Beispiel Tabletten oder Kapseln erhalten, die mit herkömmlichen Mitteln mit pharmazeutisch akzeptablen Hilfsstoffen wie Bindemitteln (z.B. vorverkleisterte Maisstärke, Polyvinylpyrrolidon oder Hydroxypropylmethylzellulose); Füllstoffen (z.B. Laktose, mikrokristalline Zellulose oder Kalziumhydrogenphosphat), Gleitmitteln (z.B. Magnesiumstearat, Talkum oder Siliciumdioxid); Sprengmittel (z.B. Kartoffelstärke oder Natriumstärkeglykolat); oder Netzmitteln (z.B. Natriumlaurylsulfat) hergestellt werden. Die Tabletten können durch Verfahren beschichtet werden, die im Fachgebiet bekannt sind. Flüssige Zubereitungen zur oralen Verabreichung können die Form von zum Beispiel Lösungen, Sirups oder Suspensionen erhalten oder können als Trockenprodukt angeboten werden, das vor Gebrauch mit Wasser oder einem anderen geeigneten Träger gemischt wird. Diese flüssigen Zubereitungen können mit herkömmlichen Mitteln mit pharmazeutisch akzeptablen Zusatzstoffen wie Suspensionsmitteln (z.B. Sorbitolsirup, Zelluloseabkömmlinge oder gehärtete Speisefette); Emulgatoren (z.B. Lecithin oder Gummi arabicum); nichtwässrigen Trägern (z.B. Mandelöl, Ölester, Ethylalkohol oder fraktionierte pflanzliche Öle) und Konservierungsstoffen (z.B. Methyl- oder Propyl-p-hydroxybenzoate oder Sorbinsäure) hergestellt werden. Die Zubereitungen können gegebenenfalls auch Puffersalze, Geschmacks-, Farb- und Süßstoffe enthalten.
  • Zubereitungen zur oralen Verabreichung können entsprechend derart zubereitet sein, dass die die wirksame Verbindung kontrolliert abgeben.
  • Zur bukkalen Verabreichung können die Zusammensetzungen die Form von Tabletten oder Pastillen erhalten, die auf herkömmliche Weise zubereitet werden.
  • Es ist günstig, wenn die Verbindungen, die zur Verwendung gemäß der vorliegenden Erfindung bestimmt sind, zur Verabreichung durch Einatmen in Form von Aerosolsprays aus unter Druck stehenden Verpackungen oder einem Zerstäuber geliefert werden, wobei ein geeignetes Treibgas z.B. Dichlordifluormethan, Trichlorfluormethan, Dichlortetrafluorethan, Kohlendioxid oder ein anderes geeignetes Gas verwendet wird. Bei einem unter Druck stehenden Aerosol kann die Dosierungseinheit durch Bereitstellen eines Ventils bestimmt werden, mit dem eine gemessene Menge abgegeben wird. Es können Kapseln und Patronen aus z.B. Gelatine, zur Verwendung in einem Inhalator oder Insufflator so zubereitet werden, dass sie ein Pulvergemisch aus der Verbindung und einer geeigneten Pulvergrundlage wie Laktose oder Stärke enthalten.
  • Die Verbindungen können zur parenteralen Verabreichung (d.h. intravenös oder intramuskulär) durch Einspritzen zum Beispiel über Bolusinjektion oder Dauerinfusion zubereitet werden. Zubereitungen zum Einspritzen können in Form einer Einzeldosis angeboten werden, z.B. in Ampullen oder in Behältern für mehrere Dosen, mit Zugabe eines Konservierungsmittels. Die Zusammensetzungen können Formen wie Suspensionen, Lösungen oder Emulsionen in öligen oder wässrigen Trägerstoffen erhalten und können Hilfsmittel wie Suspensions-, Stabilisierungs- und/oder Dispersionsmittel enthalten. Wahlweise kann der Wirkstoff in Pulverform vorliegen, der vor Gebrauch mit einem geeigneten Träger, z.B. sterilem pyrogenfreiem Wasser, gemischt wird. Es wird bevorzugt, dass die Zellen der TH-Zellsubpopulation intravenös in Patienten eingebracht werden.
  • Die Verbindungen können auch als Zusammensetzungen zur rektalen Verabreichung wie Zäpfchen oder Retentionseinläufen zubereitet werden, die z.B. herkömmliche Zäpfchengrundbestandteile wie Kakaobutter oder andere Glyceride enthalten.
  • Zusätzlich zu den Zubereitungen, die zuvor beschrieben sind, können die Verbindungen auch als Depotpräparat zubereitet werden. Diese Langzeitpräparate können durch Einpflanzung (beispielsweise subkutan oder intramuskulär) oder durch intramuskuläre Einspritzung verabreicht werden. Damit können die Verbindungen zum Beispiel mit geeigneten polymeren oder hydrophoben Stoffen (beispielsweise als Emulsion in einem akzeptablen Öl) oder Ionenaustauschharzen zubereitet werden, oder als schwerlösliche Abkömmlinge, zum Beispiel als schwerlösliches Salz.
  • Die Zusammensetzungen können, wenn es erwünscht ist, in einer Verpackung oder einem Spender angeboten werden, die bzw. der eine oder mehrere Einzeldosen enthalten können, die den Wirkstoff enthalten. Die Verpackung kann zum Beispiel eine Metall- oder Kunststofffolie aufweisen, beispielsweise eine Durchdrückverpackung. Der Verpackung oder dem Spender können Hinweise zur Verabreichung beigelegt sein.
  • 5.11 DIAGNOSE- UND ÜBERWACHUNGSTECHNIKEN
  • Verschiedene Verfahren können zur Diagnose von Immunstörungen, zum Beispiel Störungen, die die TH-Zellensubpopulation betreffen, und die Veranlagung zu solchen Immunstörungen, zum Überwachen der Wirksamkeit von Verbindungen für anti-immunologische Störungen während zum Beispiel klinischer Versuche und zum Überwachen von Patienten, die sich zur Behandlung solcher Störungen einer klinische Beurteilung unterziehen, angewendet werden. Ferner können mehrere Verfahren zur Erkennung aktivierter Immunzellen, zum Beispiel aktivierter Glieder der TH-Zellensubpopulationen, benutzt werden.
  • Diese Verfahren können zum Beispiel Reagenzien wie die Fingerabdruck-200-Gen-Nukleotidsequenzen benutzen, die in Abschnitt 5.1 beschrieben worden sind, und Antikörper, die gegen differentiell ausgeprägte 200-Genpeptide gerichtet sind und in Abschnitt 5.5 (Peptide) und 5.6 (Antikörper) beschrieben worden sind. Insbesondere wenn das Zielgen das 200-Gen ist, können diese Reagenzien benutzt werden, zum Beispiel für: 1) die Erkennung der Gegenwart einer Zielgenausprägung, Zielgenmutationen, die Erkennung von Über- oder Unterausprägung einer Zielgen-mRNA bezüglich des nicht immunologischen Störungszustands oder bezüglich einer nicht aktivierten TH-Zellensubpopulation; 2) die Erkennung von entweder einer übermäßigen oder zu geringen Häufigkeit eines Zielgenprodukts bezüglich des nicht immunologischen Störungszustandes oder bezüglich des Zustands der nicht aktivierten TH-Zellenpopulation; und 3) die Identifizierung von spezifischen Zellen der TH-Zellensubpopulation (zum Beispiel TH-Zellen, die an einer immunologischen Störung beteiligt sind oder aktivierte TH-Zellen) innerhalb einer gemischten Zellpopulation.
  • Die hier beschriebenen Verfahren können zum Beispiel durch Benutzung von fertig verpackten Diagnosesätzen durchgeführt werden, die mindestens eine spezifische Fingerabdruck-200-Gen-Nukleinsäure oder eine hier beschriebene Anti-Fingerabdruck-200-Gen-Antikörperreagenz umfassen und die zweckmäßig zum Beispiel in klinischen Umgebungen verwendet werden können, um bei Patienten eine Diagnose zu stellen, die TH1- oder TH2-bezogene Abnormalitäten zeigen.
  • Jeder Zelltyp oder jedes Zellgewebe, vorzugsweise TH-Zellen, in denen das Fingerabdruck-200-Gen ausgeprägt ist, kann in den unten beschriebenen Diagnoseverfahren verwendet werden.
  • Unter den Verfahren, die hier benutzt werden können, befinden sich Verfahren zum Überwachen der Wirksamkeit von Verbindungen in klinischen Untersuchungen zur Behandlung von Immunstörungen. Solche Verbindungen können zum Beispiel Verbindungen wie die oben in Abschnitt 5.9 beschriebenen sein. Solch ein Verfahren umfasst in einer Patientenprobe das Erkennen einer 200-Gen-Transkription oder eines 200-Genprodukts, das in einer TH-Zellensubpopulation in einem immunologischen Störungszustand bezüglich seiner Ausprägung in der TH-Zellensubpopulation differentiell ausgeprägt ist, wenn sich die Zellensubpopulation in einem normalen Zustand oder nicht immunologischen Störungszustand befindet.
  • Alle der unten in Abschnitt 5.11.1 beschriebenen Nukleinsäure-Erkennungstechniken oder alle der unten in Abschnitt 5.11.2 beschriebenen Peptid-Erkennungstechniken können zur Erkennung der Gentranskription oder des Genprodukts benutzt werden, das in der immunologisch gestörten TH-Zellensubpopulation bezüglich seiner Ausprägung im Normalzustand oder im nicht immunologischen Störungszustand differentiell ausgeprägt ist.
  • Während klinischer Untersuchungen können zum Beispiel die Ausprägung eines einzigen Fingerabdruck-Gens oder alternativ das Fingerabdruckmuster einer TH-Zellensubpopulation für die TH-Zellensubpopulation in Gegenwart oder Abwesenheit der zu testenden Verbindung bestimmt werden. Die Wirksamkeit der Verbindung kann durch Vergleichen der Ausprägungsdaten nachvollzogen werden, die für die entsprechenden bekannten Ausprägungsmuster für die TH-Zellensubpopulation in einem normalen, nicht immunologisch gestörten Zustand erhalten werden. Verbindungen, die eine Wirksamkeit zeigen, sind diejenigen, die die einzige Fingerabdruck-200-Genausprägung und/oder das Fingerabdruckmuster der immunologisch gestörten TH-Zellensubpopulation derart verändern, dass sie mehr derjenigen der normalen, nicht immunologisch gestörten TH-Zellensubpopulation ähneln.
  • Die Erkennung des Produkts oder der Produkte von Genen, die in einer TH-Zellensubpopulation in einem immunologischen Störungszustand bezüglich ihrer Ausprägung in der TH-Zellensubpopulation differentiell ausgeprägt sind, wenn sich die Zellsubpopulation in einem normalen, nicht immunologisch gestörten Zustand befindet, kann während klinischer Untersuchungen auch zum Überwachen der Wirksamkeit von potentiellen Anti-Immunstörungs-Verbindungen benutzt werden. Während klinischer Testuntersuchungen können zum Beispiel der Pegel und/oder die Aktivität der Produkte eines oder mehrerer solcher differentiell ausgeprägten Gene für die TH-Zellenpopulation in Gegenwart oder Abwesenheit der zu testenden Verbindung bestimmt werden. Die Wirksamkeit der Verbindung kann durch Vergleichen der Daten bezüglich Proteinpegel und/oder -aktivitäten nachvollzogen werden, die für die entsprechenden bekannten Pegel/Aktivitäten für die TH-Zellensubpopulation in einem normalen, nicht immunologisch gestörten Zustand erhalten werden. Wirksame Verbindungen sind solche, die das Muster der immunologisch gestörten TH-Zellensubpopulation derart verändern, dass sie mehr demjenigen der normalen, nicht immunologisch gestörten TH-Zellensubpopulation ähneln.
  • Die Ausprägungsmuster des 200-Gens in TH1-Zellensubpopulationen bezüglich TH2-Zellensubpopulationen kann die Erkennung von Transkriptionen und/oder Produkten dieser Gene zur Überwachung der Wirksamkeit von Verbindungen in klinischen Testuntersuchungen für die Behandlung von Immunstörungen besonders geeignet machen, die die TH1-Zellensubpopulation betreffen, wie zum Beispiel Multiple Sklerose, Psoriasis oder insulin-abhängige Diabetes.
  • Unter den zusätzlichen Verfahren, die hier benutzt werden können, befinden sich Verfahren zum Erkennen der TH-Zellenreaktionsfähigkeit, zum Beispiel der Reaktionsfähigkeit auf Antigene, und zum Erkennen von aktivierten Immunzellen, zum Beispiel aktivierten Gliedern der TH-Zellensubpopulation. Diese Erkennungsverfahren sind insofern bedeutend, als viele Immunstörungen mit unangemessenen, eher als mit unzureichenden Immunreaktionen in Verbindung stehen. Solche Erkennungsverfahren können zum Beispiel zum Erkennen einer Veranlagung zu einer Immunstörung angewendet werden.
  • Verfahren zum Erkennen von TH-Zellenreaktionsfähigkeit und/oder -aktivierung können zum Beispiel das Erkennen einer Gentranskription oder eines Produkts in einer TH-Zellenprobe umfassen, das in der TH-Zellensubpopulation differentiell ausgeprägt ist, die sich bezüglich einer TH-Zellensubpopulation, die sich in einem nicht aktivierten oder nicht reaktionsfähigen Zustand befindet, in einem aktivierten oder reaktionsfähigen Zustand befindet (zum Beispiel einem Zustand, in dem die TH-Zellensubpopulation einem Antigen ausgesetzt worden ist).
  • Alle unten in Abschnitt 5.11.1 beschriebenen Nukleinsäure-Erkennungstechniken oder alle unten in Abschnitt 5.11.2 beschriebenen Peptid-Erkennungstechniken können verwendet werden, um solch eine differentiell ausgeprägte Gentranskription oder Genprodukt zu erkennen.
  • Die Erkennung der Gentranskriptionen und/oder Produkte, die zum Erkennen der Aktivierung und/oder der TH1-spezifischen Wesensart des 200-Gens besonders geeignet sind, kann die Erkennung von Transkriptionen und/oder Produkten dieses Gens besonders geeignet machen, um die TH1-Aktivierung und/oder -Reaktionsfähigkeit zu erkennen.
  • 5.11.1 ERKENNUNG VON FINGERABDRUCK-GEN-NUKLEINSÄUREN
  • DNA oder RNA aus dem zu analysierenden Zelltyp oder -gewebe kann leicht unter Verwendung von Verfahrensweisen isoliert werden, die dem Fachmann gut bekannt sind. Diagnoseverfahren können ebenfalls „in situ" direkt auf zum Beispiel Gewebesektionen (fixierte und/oder gefrorene) von Patientengewebe ausgeführt werden, das aus Biopsien oder Resektionen erhalten worden ist, so dass keine Nukleinsäurereinigung notwendig ist. Nukleinsäurereagenzien wie die in Abschnitt 5.4 beschriebenen können als Sonden und/oder Primer für solche In-Situ-Verfahrensweisen benutzt werden (siehe zum Beispiel Nuovo, G. J., 1992, „PCR In Siut Hybridization: Protocols and Applications", Raven Press, NY). Die Ausprägung von spezifischen Zellen innerhalb einer Zellenpopulation kann ebenfalls durch zum Beispiel die oben beschriebenen In-Situ-Techniken oder durch standardmäßige flusszytometrische Techniken bestimmt werden.
  • Fingerabdruck-200-Gen-Nukleotidsequenzen, entweder RNA oder DNA, können zum Beispiel in Hybridisierungs- oder Amplifikationsuntersuchungen von biologischen Proben benutzt werden, um die Störungsgenstrukturen und die Ausprägung zu erkennen, die mit der TH-Zellensubpopulation in Verbindung stehen. Solche Untersuchungen können umfassen, sind aber nicht beschränkt auf Southern- oder Northern-Analysen, einsträngige Konformationspolymorphismusanalysen, In-Situ-Hybridisierungsuntersuchungen und Polymerasekettenreaktionsanalysen. Solche Analysen können sowohl quantitative Aspekte von Ausprägungsmustern des Fingerabdruck-200-Gens als auch qualitative Aspekte der Fingerabdruck-Genausprägung und/oder Genzusammensetzung enthüllen. Das heißt, solche Techniken können nicht nur die Gegenwart der 200-Gen-Ausprägung, sondern auch die Ausprägungsmenge erkennen und insbesondere erkennen, welche spezifischen Zellen das 200-Gen ausprägen und ferner zum Beispiel Punktmutationen, Insertionen, Deletionen, Chromosom-Neuanordnungen und/oder die Aktivierung oder Deaktivierung der 200-Gen-Ausprägung erkennen können.
  • Diagnoseverfahren zur Erkennung von Fingerabdruck-Gen-spezifischen Nukleinsäuremolekülen können zum Beispiel das Kontaktieren und Inkubieren von Nukleinsäuren, die aus dem analysierten Zelltyp oder -gewebe abgeleitet werden, mit einer oder mehreren markierten Nukleinsäurereagenzien, die in Abschnitt 5.4 beschrieben sind, betreffen, und zwar unter Bedingungen, die das spezifische Annealing dieser Reagenzien an ihre komplementären Sequenzen innerhalb des betreffenden Nukleinsäuremoleküls begünstigen. Vorzugsweise betragen die Längen dieser Nukleinsäurereagenzien mindestens 15 bis 30 Nukleotide. Nach der Inkubation werden alle nicht durch Annealing hybridisierten Säuren aus der Nukleinsäure entfernt: Fingerabdruckmolekülhybrid. Die Gegenwart von Nukleinsäuren aus dem Zelltyp oder -gewebe, das hybridisiert worden ist, wenn solche Moleküle existieren, wird dann erkannt. Unter Benutzung dieses Erkennungsschemas kann die Nukleinsäure aus dem betreffenden Gewebe oder Zelltyp zum Beispiel an einem festen Träger wie einer Membran oder einer Kunststoff fläche wie der auf einer Microtiter-Platte oder Polystyrolkugeln immobilisiert werden. In diesem Fall werden die nicht durch Annealing hybridisierten, markierten Nukleinsäurereagenzien des in Abschnitt 5.4 beschriebenen Typs nach der Inkubation leicht entfernt. Die Erkennung der verbleibenden, durch Annealing hybridisierten, markierten Fingerabdruck-Nukleinsäurereagenzien wird durch Anwenden von Standardtechniken erreicht, die dem Fachmann gut bekannt sind.
  • Alternative Diagnoseverfahren zur Erkennung von Fingerabdruck-Gen-spezifischen Nukleinsäuremolekülen können ihre Amplifikation umfassen, zum Beispiel durch PCR (die experimentelle Ausführungsform ist in Mullis, K. B., 1987, US-Patentschrift Nr. 4,683,202 dargelegt), Ligasekettenreaktion (Barany, F., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 189–193), selbst erhaltende Sequenzreplikation (Guatelli, J. C. et al., 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 1874–1878), Transkriptionsamplifikationssystem (Kwoh, D. Y et al., 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 1173–1177), Q-Beta-Replikase (Lizardi, P. M. et al., 1988, Bio/Technology 6: 1197), oder durch jedes andere Nukleinsäure-Amplifikationsverfahren, gefolgt von der Erkennung der erweiterten Moleküle unter Benutzung von Techniken, die dem Fachmann gut bekannt sind. Diese Erkennungsschemata sind insbesondere für die Erkennung von Nukleinsäuremolekülen nützlich, wenn solche Moleküle in einer sehr geringen Anzahl vorliegen.
  • In einer Ausführungsform eines solchen Erkennungsschemas wird ein cDNA-Molekül aus einem bestimmten RNA-Molekül erhalten (zum Beispiel durch die umgekehrte Transkription des RNA-Moleküls in cDNA). Zelltypen oder Gewebe, aus denen solch eine RNA isoliert werden kann, umfassen alle Gewebe, in denen das Wildtyp-Fingerabdruck-200-Gen ausgeprägt sein kann, einschließlich, aber nicht beschränkt auf TH0-, TH1- und/oder TH2-Zelltyp enthaltende Gewebe. Eine Sequenz innerhalb der cDNA wird dann als Schablone für eine Nukleinsäure-Amplifikationsreaktion wie einer PCR-Amplifikationsreakion oder dergleichen benutzt. Die Nukleinsäurereagenzien, die in den Schritten der umgekehrten Transkription und Nukleinsäure-Amplifikation dieses Verfahrens als Synthese-Initiationsreagenzien (zum Beispiel Primer) benutzt werden, werden aus den Fingerabdruck-200-Gen-Nukleinsäurereagenzien ausgewählt, die in Abschnitt 5.4 beschrieben sind. Die bevorzugten Längen solcher Nukleinsäurereagenzien betragen mindestens 9 bis 30 Nukleotide. Zur Erkennung des amplifizierten Produkts kann die Nukleinsäure-Amplifikation unter Verwendung von radioaktiv oder nicht radioaktiv markierten Nukleotiden ausgeführt werden. Alternativ kann genug amplifiziertes Produkt hergestellt werden, so dass das Produkt durch eine standardmäßige Ethidiumbromidfärbung oder durch Anwendung irgendeines anderen Nukleinsäure-Färbeverfahrens sichtbar gemacht werden kann.
  • Außer Verfahren, die den Schwerpunkt primär auf die Erkennung einer Fingerabdruck-Nukleinsäuresequenz legen, können Fingerabdruckmuster in solchen Erkennungsschemata auch bewertet werden. Fingerabdruckmuster enthalten in diesem Kontext das Muster der mRNA-Ausprägung einer Serie (das heißt, mindestens zwei) Fingerabdruck-Gene, die für ein gegebenes Gewebe oder einen Zelltyp unter gegebenen Bedingungen erhalten werden. Solche Bedingungen können zum Beispiel Störungen umfassen, die die TH-Zellensubpopulation betreffen, und Bedingungen, die für Prozesse relevant sind, die mit der Differenzierung, Beibehaltung und der Effektorfunktion der TH-Zellensubpopulation in Verbindung stehen.
  • TH1-bezogene Störungen können zum Beispiel chronische Entzündungskrankheiten und -störungen umfassen wie die Crohn-Krankheit, reaktive Arthritis umfassend die Lyme-Krankheit, insulinabhängige Diabetes, organspezifische Autoimmunität umfassend Multiple Sklerose, Hashimoto-Thyreoiditis und die Basedow-Krankheit, Kontaktdermatitis, Psoriasis, Abstoßung, Graft-versushost-Krankheit und Sarkoidose. TH2-bezogene Störungen können zum Beispiel atopische Zustände wie Asthma und Allergie umfassen, allergische Rhinitis, gastrointestinale Allergien umfassend Lebensmittelallergien, Eosinophilie, Konjunktivitis, glomeruläre Nephritis, bestimmte pathogene Disponiertheiten wie Helminth-Infektionen (zum Beispiel Leishmaniase) und bestimmte Virusinfektionen einschließlich HIV, und bakterielle Infektionen einschließlich Tuberkulose und lepromatöse Lepra.
  • Fingerabdruckmuster können zum Beispiel durch Anwenden eines differentiellen Anzeigeverfahrens wie die oben in Abschnitt 5.1.1.2 beschriebene Northern-Analyse und/oder RT-PCR erzeugt werden. Alle der oben in Abschnitt 3.2.1 beschriebenen 200-Gen-Sequenzen können als Sonden und/oder RT-PCR-Primer für die Erzeugung und Bekräftigung solcher Fingerabdruckmuster benutzt werden.
  • 5.11.2 ERKENNUNG VON ZIELGENPEPTIDEN
  • Antikörper, die gegen Wildtyp- oder mutierte Fingerabdruck-Genpeptide gerichtet und oben in Abschnitt 5.6 beschrieben sind, können ebenfalls als TH-Zellensubpopulation-bezogene Störungsdiagnoseverfahren und Prognoseverfahren benutzt werden, wie zum Beispiel hier beschrieben ist. Solche Diagnoseverfahren können benutzt werden, um das Fingerabdruck-Gen-Produkt, Abnormalitäten im Niveau der Fingerabdruck-Genproteinausprägung oder Abnormalitäten in der Struktur und/oder der temporären, das Gewebe betreffenden, zellulären oder subzellulären Position des Fingerabdruck-Genproteins zu erkennen. Strukturelle Unterschiede können zum Beispiel die Unterschiede in der Größe, Elektronegativität oder Antigenizität des mutierten Fingerabdruck-200-Gensproteins bezüglich des normalen Fingerabdruck-200-Genproteins umfassen.
  • Ein aus dem Gewebe oder Zelltyp zu analysierendes Protein kann unter Anwendung von Verfahren leicht isoliert werden, die dem Fachmann gut bekannt sind. Die hier angewendeten Proteinisolierungsverfahren können zum Beispiel diejenigen sein, die in Harlow und Lane (Harlow, E. und Lane, D., 1988, „Antibodies: A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York) beschrieben sind.
  • Bevorzugte Diagnoseverfahren zur Erkennung von Wildtyp- oder mutierten Fingerabdruck-Genpeptidmolekülen können zum Beispiel Immunassays umfassen, wobei Fingerabdruck-Genpeptide durch ihre Interaktion mit einem Anti-Fingerabdruck-Genprodukt-spezifischen Antikörper erkannt werden.
  • Zum Beispiel können Antikörper oder Fragmente von Antikörpern benutzt werden, wie solche, die in Abschnitt 5.6 beschrieben und in der vorliegenden Erfindung nützlich sind, um die Gegenwart von Wildtyp- oder mutierten Fingerabdruck-200-Genpeptiden quantitativ oder qualitativ zu erkennen. Dies kann zum Beispiel durch Immunofluoreszenztechniken unter Verwendung eines fluoreszent markierten Antikörpers (siehe unten in diesem Abschnitt) in Verbindung mit einer lichtmikroskopischen, flusszytometrischen oder fluormetrischen Erkennung erreicht werden. Solche Techniken werden besonders bevorzugt, wenn die Fingerabdruck-Genpeptide auf der Zelloberfläche ausgeprägt sind, wie es zum Beispiel der Fall bei dem 200-Genprodukt ist. Folglich können die hier beschriebenen Techniken benutzt werden, um spezifische Zellen innerhalb einer Zellenpopulation zu erkennen, die das betreffende Fingerabdruck-200-Genprodukt ausprägen.
  • Die Antikörper (oder Fragmente davon), die in der vorliegenden Erfindung nützlich sind, können zur In-Situ-Erkennung von Fingerabdruck-Genpeptiden außerdem histologisch, wie in der Immunfluoreszenz- oder Immunelektronenmikroskopie verwendet werden. Die In-Situ-Erkennung kann durch Entfernen einer histologischen Probe aus einem Patienten und durch Aufbringen eines markierten Antikörpers der vorliegenden Erfindung darauf erreicht werden. Der Antikörper (oder das Fragment) wird vorzugsweise durch Überdecken des markierten Antikörpers (oder Fragments) auf eine biologische Probe aufgebracht. Durch die Anwendung dieser Verfahrensweise ist es möglich, nicht nur die Gegenwart der Fingerabdruck-200-Genpeptide zu bestimmen, sondern auch ihre Aufteilung in dem untersuchten Gewebe. Durch die Benutzung der vorliegenden Erfindung wird der Durchschnittsfachmann leicht erkennen, dass alle der zahlreichen histologischen Verfahren (wie das Färbungsverfahren) modifiziert werden können, um solche eine In-Situ-Erkennung zu erreichen.
  • Immunassays für Wildtyp- oder mutierte Fingerabdruck-Genpeptide umfassen typischerweise das Inkubieren einer biologischen Probe wie eines biologischen Fluids, eines Gewebeauszugs, frisch geernteter Zellen oder Zellen, die in einer Gewebekultur inkubiert worden sind, in Gegenwart eines erkennbar markierten Antikörpers, der in der Lage ist, Fingerabdruck-200-Genpeptide zu identifizieren, und das Erkennen des gebundenen Antikörpers durch irgendeine der zahlreichen, auf dem Fachgebiet gut bekannten Techniken.
  • Die biologische Probe kann mit einem Festphasenhalter oder -träger wie Nitrozellulose oder einem anderen Festträger, der dazu fähig ist, Zellen, Zellpartikel oder lösliche Proteine zu immobilisieren, in Kontakt gebracht und darauf immobilisiert werden. Der Träger kann dann mit geeigneten Puffern gewaschen und danach mit dem erkennbar markierten genspezifischen Fingerab druck-Antikörper behandelt werden. Der Festphasenträger kann dann mit dem Puffer ein zweites Mal gewaschen werden, um den ungebundenen Antikörper zu entfernen. Die Menge der gebundenen Markierung auf dem Festträger kann dann durch herkömmliche Mittel erkannt werden.
  • Mit „Festphasenhalter oder -träger" ist jeglicher Träger gemeint, der ein Antigen oder einen Antikörper binden kann. Gut bekannte Halter oder Träger enthalten Glas, Polystyrol, Polypropylen, Polyethylen, Dextran, Nylon, Amylasen, natürliche und modifizierte Zellulosen, Polyacrylamide, Gabbros und Magnetit. Die Art des Trägers kann entweder bis zu einem gewissen Maße löslich oder zum Zwecke der vorliegenden Erfindung nicht löslich sein. Das Trägermaterial kann praktisch jede mögliche strukturelle Konfiguration aufweisen, solange das verbundene Molekül dazu in der Lage ist, sich an ein Antigen oder einen Antikörper zu binden. Somit kann die Trägerkonfiguration kugelförmig wie bei einer Kugel oder zylindrisch wie die Innenfläche eines Reagenzglases oder die Außenfläche einer Stange sein. Alternativ kann die Oberfläche flach wie ein Blatt, Teststreifen usw. sein. Bevorzugte Träger umfassen Polystyrolkugeln. Der Fachmann kennt viele andere geeignete Träger zum Binden eines Antikörpers oder Antigens oder ermittelt diese durch Routineexperimente.
  • Die Bindeaktivität einer gegebenen Gruppe von Anti-Wildtyp- oder mutierten Fingerabdruck-Genprodukt-Antikörpern kann gemäß gut bekannten Verfahren bestimmt werden. Der Fachmann kann die betrieblichen und optimalen Untersuchungsbedingungen für jede Bestimmung durch routinemäßiges Experimentieren bestimmen.
  • Eine Art und Weise, auf die der Fingerabdruck-200-Genpeptid-spezifische Antikörper erkennbar markiert werden kann, ist durch das Binden desselben an ein Enzym und durch die Benutzung in einem Enzymimmunassay (EIA) (Voller, A., "The Enzyme Linked Immunosorbent Assay (ELISA)", 1978, Diagnostic Horizons 2: 1–7, Microbiolgical Associates Quarterly Publication, Walkersville, MD); Voller, A. et al., 1978, J. Clin. Pathol. 31: 507–520; Butler, J. E., 1981, Meth. Enzymol. 73: 482–523; Maggio, E. (ed.), 1980, ENZYME IMMUNOASSAY, CRC Press, Boca Raton, FL; Ishikawa, E. et al., (eds.), 1981, ENZYME IMMUNOASSAY, Kgaku Shoin, Tokyo). Das Enzym, das an den Antikörper gebunden ist, reagiert mit einem geeigneten Substrat, vorzugsweise einem chromogenen Substrat derart, dass es einen chemischen Anteil herstellt, der zum Beispiel durch spektrometrische, fluorimetrische oder visuelle Mittel erkannt werden kann. Enzyme, die benutzt werden können, um den Antikörper erkennbar zu markieren, enthalten, sind aber nicht beschränkt auf Malatdehydrogenase, Staphylococcalnuklease, Delta-5-Steroidisomerase, Hefe-Alkohol-Dehydrogenase, Alpha-Glycerophosphat, Dehydrogenase, Triosephosphatisomerase, Meerrettichperoxidase, Alkalinphosphatase, Asparaginase, Glukoseoxidase, Beta-Galactosidase, Ribonuklease, Urease, Katalase, Glukose-6-Phosphatdehydrogenase, Glukoamylase und Acetylcholinesterase. Die Erkennung kann durch colorimetrische Verfahren erreicht werden, die ein chromogenes Substrat für das Enzym benutzen. Die Erkennung kann auch durch den visuellen Vergleich des Ausmaßes der Enzymreaktion eines Substrats im Vergleich zu ähnlich hergestellten Maßstäben erreicht werden.
  • Die Erkennung kann auch durch eines von vielen anderen Immunassays erreicht werden. Zum Beispiel ist es durch die radioaktive Markierung der Antikörper oder Antikörperfragmente möglich, die Fingerabdruck-200-Gen-Wildtyp- oder -mutierten Peptide durch die Verwendung eines Radioimmunassays (RIA) zu erkennen (siehe zum Beispiel Weintraub, B., Principles of Radioimmunoassays, Seventh Training Course on Radioligand Assay Techniques, The Endocrine Society, März, 1986). Das radioaktive Isotop kann durch diese Mittel wie die Benutzung eines Gammazählers oder eines Szintillationszählers oder durch Autoradiographie erkannt werden.
  • Es ist ebenfalls möglich, den Antikörper mit einer fluoreszenten Verbindung zu markieren. Wenn der fluoreszent markierte Antikörper Licht mit einer geeigneten Wellenlänge ausgesetzt wird, kann seine Gegenwart aufgrund der Fluoreszenz erkannt werden. Unter den am meisten verwendeten fluoreszent markierten Verbindungen befinden sich Fluoresceinisothiocyanat, Rhodamin, Phycoerythrin, Phycocyanin, Allophycocyanin, o-Phthaladehyd und Fluorescamin.
  • Der Antikörper kann auch mit Hilfe von Fluoreszenz ausstrahlenden Metallen wie 152Eu oder anderen Metallen aus der Lanthanid-Serie erkennbar markiert werden. Diese Metalle können an dem Antikörper mit Hilfe solcher Metall-Komplexbildner-Gruppen wie Diethylentriaminpentaessigsäure (DTPA) oder Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) befestigt werden.
  • Der Antikörper kann ebenfalls durch Verbinden mit einer chemilumineszenten Verbindung erkennbar markiert werden. Die Gegenwart des chemilumineszent markierten Antikörpers wird dann durch Erkennen der Gegenwart von Lumineszenz erkannt, die im Laufe einer chemischen Reaktion entsteht. Beispiele von besonders nützlichen chemilumineszent markierten Verbindungen sind Luminol, Isoluminol, theromatisches Acridiniumester, Imidazol, Acridiniumsalz und Oxalatester.
  • Gleichermaßen kann eine biolumineszente Verbindung verwendet werden, um den Antikörper der vorliegenden Erfindung zu markieren. Die Biolumineszenz ist eine Art Chemilumineszenz, die in biologischen Systemen auftritt, in denen ein katalytisches Protein die Effizienz der chemilumineszenten Reaktion erhöht. Die Gegenwart eines biolumineszenten Proteins wird durch Erkennen der Gegenwart von Lumineszenz bestimmt. Wichtige biolumineszente Verbindungen für Markierungszwecke sind Luciferin, Luciferase und Aequorin.
  • 6. BEISPIEL: IDENTIFIZIERUNG UND CHARAKTERISIERUNG EINES GENS, DAS IN TH1- und TH2-ZELLEN DIFFERENTIELL AUSGEPRÄGT IST
  • Die Nützlichkeit des Paradigmenansatzes der Erfindung zur Identifizierung von Genen, die in TH-Zellensubpopulationen differentiell ausgeprägt sind, wird nachgewiesen.
  • 6.1 MATERIALIEN UND VERFAHREN
  • Transgene Mäuse:
  • Naive CD4'-Zellen wurden aus Milz und/oder Lymphknoten von nicht initiierten transgenen Mausstämmen erhalten, die einen T-Zellenrezeptor (TCR) beherbergen, der Ovalbumin (Murphy et al., 1990, Science 250: 1720) erkennt.
  • OVA-spezifische transgene T-Zellen:
  • Suspensionen von OVA-spezifischen T-Zellen wurden mit einem stimulierenden Peptidantigen und Zellen, die ein Antigen aufweisen, im Wesentlichen wie in Murphy et al. (Murphy et al., 1990, Science 250: 1720) beschrieben zusammen kultiviert. Die T-Zellen mit 2–4 × 106 wurden mit etwa zweimal soviel TA3-Zellen, die ein Antigen aufweisen, zusammen mit 0,3 μM OVA-Peptid inkubiert. TH1-Kulturen enthielten etwa 10 ng/ml rekombinantes mIL-12. Umgekehrt erhielten die TH2-Zellen IL-4 (1.000 μ/ml). Die Kulturen wurden zu verschiedenen Zeitpunkten nach der Initiierung der Kultur geerntet. Die T-Zellen wurden von den TA3-Zellen unter Verwendung von anti-CD4 beschichteten magnetischen Kugeln (Dynal, Inc.) gereinigt. Die T-Zellen wurden durch sanftes Zentrifugieren pelletiert und in das geeignete RNAzolTM-Volumen (Tel-Test, Friendswood, TX) lysiert.
  • Gewebesammlung und RNA-Isolierung:
  • Die Zellen wurden auf Trockeneis schnell gefroren. Die Proben wurden dann zusammen mit einem Mörser und Stößel unter flüssigem Nitrogen homogenisiert.
  • Die gesamte zelluläre RNA wurde aus dem Gewebe entweder mit RNAzolTM oder RNAzolBTM (Tel-Test, Friendswood, TX) gemäß den Anweisungen des Herstellers extrahiert. Das Gewebe wurde kurz in einer angemessenen Menge RNAzolTM oder RNAzolETM löslich gemacht und RNA wurde durch Zugabe von 1/10 v/v Chloroform zu der löslich gemachten Probe extrahiert, die danach etwa 15 Sekunden lang kräftig geschüttelt wurde. Die Mischung wurde dann 15 Minuten bei 12.000 g zentrifugiert und die wässrige Phase wurde in ein anderes Reagenzglas entfernt. Die RNA wurde mit Isopropanol gefällt. Das resultierende RNA-Granulat wurde in Wasser aufgelöst und mit einem gleichen Chloroformvolumen reextrahiert, um jegliche Phenolreste zu entfernen. Das extrahierte Volumen wurde mit 2 Ethanolvolumina zusammen mit 150 mM Natriumacetat gefällt. Die gefällte RNA wurde in Wasser aufgelöst und die Konzentration wurde spektroskopisch bestimmt (A260).
  • Differentielle Anzeige:
  • Die gesamte zelluläre RNA (10 bis 50 μg) wurde mit 20 Einheiten DNase I (Boehringer Mannheim, Deutschland) zusammen mit 40 Einheiten Ribonuklease-Inhibitor (Boehringer Mannheim, Deutschland) behandelt. Nach der Extraktion mit einer Phenol-/Chloroform- und Ethanolfällung wurde die RNA in mit DEPC (Diethylpyrocarbonat) behandeltem Wasser aufgelöst.
  • Die differentielle mRNA-Anzeige wurde wie oben in Abschnitt 5.1.1.2 beschrieben ausgeführt. Die RNA (0,4 bis 2 μg) wurde unter Anwendung der Superscript Reverse Transcriptase (GIBCO/BRL) umgekehrt transkribiert. Die cDNA wurden dann durch PCR auf einem Thermocycler 9600 von Perkin-Elmer erweitert. Die Reaktionsmischungen (20 μl) enthielten willkürliche Decanukleotide und eine von zwölf möglichen T11VN-Sequenzen, wobei V entweder dG, dC oder dA darstellt und N entweder dG, dT, dA oder dC darstellt. Die Parameter für die 40-Zyklen-PCR waren wie folgt: Halten 94°C für 2 Minuten; Zyklus 94°C für 15 Sekunden, 40°C für 2 Minuten; Rampe bis 72°C für 30 Sekunden; Halten 72°C für 5 Minuten; Halten 4°C.
  • Die radiomarkierten PCR-Amplifikationsprodukte wurden durch Elektrophorese auf 6% denaturierende Polyacrylamidgele analysiert.
  • Reamplifikation und Subklonierung:
  • Die betreffenden PCR-Bänder wurden aus Sequenzgelen wiederhergestellt und reamplifiziert.
  • Die Autoradiogramme wurden mit dem getrockneten Gel gebildet und der Bereich, der die betreffenden Bänder enthält, wurde mit einem Skalpell ausgeschnitten. Das ausgeschnittene Gelfragment wurde durch Einweichen in einem TE- (Tris-EDTA) Puffer von 100 μl bei etwa 100°C 15 Minuten lang eluiert. Die Gelscheibe wurde dann durch kurzes Zentrifugieren pelletiert und der Überstand wurde in ein neues Mikrozentrifugen-Reagenzglas gegeben. Die DNA wurde zusammen mit 100 mM Natriumacetat und 30 μg Glycogen (Boehringer Mannheim, Deutschland) mit Ethanol kombiniert und etwa 10 Minuten auf Trockeneis gefällt. Die Proben wurden 10 Minuten zentrifugiert und das Granulat wurde mit 80% Ethanol gewaschen. Das Granulat wurde in 10 μl destillierten Wassers erneut löslich gemacht.
  • 5 μl der eluierten DNA wurden in einer 100-μl-Reaktion reamplifiziert, die enthält: einen standardmäßigen Cetus-Taq-Polymerasepuffer, 20 μM dNTPs, 1 μM jedes der Oligonukleotidprimer, die in der anfänglichen Generation der amplifizierten DNA benutzt wurden. Die verwendeten Durchlaufbedingungen waren die gleichen wie die anfänglichen Bedingungen, die benutzt wurden, um das amplifizierte Band wie oben beschrieben zu erzeugen. Die eine Hälfte der Amplifikationsreaktion wurde auf einem Agarosegel von 2% gefahren und unter Verwendung von DE-81-Papier (Whatman Paper, Ltd., England) eluiert, wie in Sambrook et al., supra, beschrieben. Wiederhergestellte Fragmente wurden in den Klonierungsvektor pCRTMII (Invitrogen, Inc., San Diego CA) gebunden und in den kompetenten E. coli-Stamm DH5α (Gibco/BRL, Gaitherburg, MD) transformiert. Die Kolonien wurden auf LB-Agarplatten gezüchtet, die Ampicillin (100 μg/ml) und X-Gal (40 μg/ml) enthielten, um die Auswahl blau/weiß zu ermöglichen.
  • Sequenzanalyse:
  • Nach der Subklonierung wurden die reamplifizierten cDNA-Fragmente auf einem automatischen Sequenzierer von Applied Biosystems (Applied Biosystems, Inc. Seattle, WA) sequentialisiert. Eine Sequenz wurde von vier oder mehr unabhängigen Transformanten erhalten, die den gleichen Einsatz enthielten. Die hier gezeigte Nukleotidsequenz stellt entweder den Konsens der Information dar, die aus den vier Sequenzen erhalten wurde, oder die Sequenz, die, wie angegeben, aus einem repräsentativen Klon erhalten wurde. Diese primären Sequenzdaten wurden bezüglich Vektorsequenzen und sich oft wiederholenden Sequenzen bearbeitet und getrimmt, und zum Durchsuchen der Genbank-Datenbanken unter Verwendung des BLAST- (Altschul, S. F. et al., 1990, J. Mol. Biol. 215: 403–410) Programms benutzt.
  • Northern-Analyse:
  • RNA-Proben wurden in einem denaturierenden Agarosegel elektrophoretisch bearbeitet, das 1 bis 1,5% Agarose enthielt (SeaKem LE, FMC BioProducts, Rockland, ME) und 6,3% Formaldehyd enthielt. Die Proben, die 5 bis 20 μg der gesamten RNA enthielten, wurden mit einer denaturierenden Ladungslösung (72% entionisiertes Formamid und Bromphenolblau) vermischt und 5 Minuten auf 70°C erwärmt. Die Proben wurden auf Eis angeordnet und sofort auf Gele geladen. Die Gele wurden in einem 1 × MOPS-Puffer gefahren (100 mM MOPS, 25 mM Natriumacetat, 5 mM EDTA). Nach der Elektrophorese wurden die Gele mit Ethidiumbromid gefärbt und mit UV-Licht sichtbar gemacht.
  • Nach der Vollendung der Elektrophorese wurden die Gele in 50 mM Natriumhydroxid unter sanftem Schütteln etwa 30 Minuten getränkt, um die RNA leicht zu spalten. Die Gele wurden zweimal in Wasser gespült und dann durch Tränken in 0,1 M Tris-HCl (pH 7,5) für etwa 30 Minuten neutralisiert. Die Gele wurden kurz mit 20 × SSC (3 M Natriumchlorid, 0,3 M Natriumzitrat) ausgeglichen und dann über Nacht in 20 × SSC zu Nylonmembranen wie HybondTM, -N, (Amersham, Inc., Arlington Heights, IL) oder Zeta-Probe (Bio-Rad, Inc., Hercules, CA) transferiert. Die Membranen, die transferierte RNA enthielten, wurden 2 Stunden bei 80°C gebacken, um die RNA zu immobilisieren.
  • Die DNA-Fragmente, die als Sonden benutzt werden sollten, wiesen unterschiedliche Größen auf und wurden mit Hilfe einer Random-Hexamer-Markierungstechnik markiert. Zusammenfassend wurden 25 ng eines gereinigten DNA-Fragments benutzt, um jede Sonde zu erzeugen. Die Fragmente wurden zu einer Markierungsreaktion von 20 μl zufälliger Hexanukleotide (Boehringer Mannheim, Inc., Indianapolis, IN) hinzugefügt, die zufällige Hexamere und ein Gemisch der Nukleotide dCTP, dGTP und dTTP (bei einer Endkonzentration von jeweils 25 μM) enthielten. Das Reaktionsgemisch wurde 10 Minuten bei 100°C durch Wärme denaturiert und dann auf Eis abgekühlt. 5 μl α-32P-dATP (50 μ [unleserlich]; Amersham, Inc., Arlington Heights, IL) und Klenow-DNA-Polymerase (2 Einheiten; Boehringer Mannheim, Inc., Indianapolis, IN) wurden hinzugegeben. Die Reaktionen wurden 30 Minuten bei 37° inkubiert. Nach der Inkubation wurden 30 μl Wasser zu der Markierungsreaktion hinzugegeben und nicht aufgenommene Nukleotide wurden durch Passieren der Reaktionen durch eine BioSpin-6TM-Chromatographiespalte (Bio-Rad, Inc., Hercules, CA) entfernt. Die spezifische Aufnahme wurde mit Hilfe eines Szillationszählers bestimmt. 1–5 × 106 cpm wurden pro ml Hybridisierungsmischung benutzt.
  • Die Nylonmembranen, die die immobilisierte RNA enthalten, wurden gemäß den Anweisungen des Herstellers prehybridisiert. Die radiomarkierten Sonden wurden unter Wärme 10 Minuten bei 70°C in 50% entionisiertem Formamid denaturiert und dann zu der Hybridisierungsmischung (enthaltend 50% Formamid, 10% Dextransulfat, 0,1% SDS, 100 μg/ml gescherte Lachssperma-DNA, 5 × SSC, 5 × Denhardt-Lösung, 30 mM Tris-HCl (pH 8,5), 50 mM NaPO4 (pH 6,5)) hinzugegeben. Die Hybridisierungen wurden bei 42°C über Nacht ausgeführt. Die Nylonmembranen wurden dann 2 Minuten in einer Waschlösung aus 0,2 × SSC und 0,1% SDS bei Raumtemperatur gebadet, um das meiste der verbleibenden Hybridisierungslösung zu entfernen. Die Membran wurden dann zweimal 20 Minuten in einer frischen, auf 42°C vorgewärmten Waschlösung gebadet. Die Filter wurden in einer Kunststoffumhüllung abgedeckt und einem autoradiografischen Film ausgesetzt, um die Ergebnisse sichtbar zu machen.
  • 6.2 ERGEBNISSE
  • Ein transgenes T-Zellenparadigma (wie oben in Abschnitt 6.1 beschrieben) wurde verwendet, um Gene zu identifizieren, die zwischen TH1- und TH2-Zellen differentiell ausgeprägt sind.
  • RNA-Proben wurden von TH1- und TH2-Zellenpopulationen nach entweder einer sekundären oder tertiären Antigenstimulierung isoliert. Die Proben wurden dann durch differentielle Anzeigetechniken analysiert. 1 zeigt die amplifizierten Fragmente, die aus diesen Proben erhalten wurden, wobei der Pfeil einen PCR anzeigt, bei dem angenommen wird, dass er eine cDNA repräsentiert, die aus einer RNA abgeleitet ist, die durch ein Gen hergestellt wurde, das in den TH2-Zellensubpopulationen bezüglich den TH1-Zellensubpopulationen auf einer höheren Ebene ausgeprägt ist.
  • 7. BEISPIEL: IDENTIFIZIERUNG UND CHARAKTERISIERUNG EINES GENS, DAS IN TH2-ZELLEN DIFFERENTIELL AUSGEPRÄGT IST
  • In dem Beispiel, das in diesem Abschnitt vorgestellt wird, wurde das transgene T-Zellenparadigma, das oben in Abschnitt 5.1.1.1 und 6 beschrieben worden ist, verwendet, um ein Gen zu identifizieren, dass in TH2-Zellen differentiell ausgeprägt ist.
  • 7.1 MATERIALIEN UND VERFAHREN
  • RT-PCR-Analyse:
  • Die quantitative RT-PCR wurde wie folgt ausgeführt. 1 bis 2 μg der gesamten RNA, die wie oben in Abschnitt 6.1 beschrieben hergestellt wurde, wurde mit oligo-dT Primern und der SuperscriptTM-RNAase-H-Reverse-Transkriptase (Gibco-BRL, Gaithersburg, MD) umgekehrt transkribiert. Die RNA wurde mit 1 μl oligo-dT (500 μg/ml) in einem Gesamtvolumen von 11 μl kombiniert. Die Mischung wurde 10 Minuten auf 70°C erwärmt und auf Eis abgekühlt. Nach kurzem Zentrifugieren wurde die RNA 1 Stunde umgekehrt transkribiert. Die Aliquoten des ersten Strangs cDNA wurden bis kurz vor der Benutzung bei –20°C gelagert.
  • Die Ausprägungsstufen wurden durch die PCR-Amplifikation der seriellen Verdünnungen des ersten Stranges cDNA bestimmt. In diesem Verfahren wird die cDNA seriell in Wasser verdünnt. Die Verdünnungen werden dann durch PCR mit Hilfe von sequenzspezifischen Primern mengenmäßig amplifiziert. Alle PCR-Reaktionen werden unter identischen Bedingungen amplifiziert. Aus diesem Grund sollte die Menge des erzeugten Produkts die Menge der Sequenzvorlage reflektieren, die anfangs gegenwärtig war. 5- bis 10-fache cDNA-Verdünnungen und genug Verdünnungen wurden benutzt, so dass die Menge des nacheinander hergestellten Produkts durch UV-Illumination von Ethidiumbromid gefärbten Gelen von klar sichtbar bis unter Erkennungsstufen reichte. Das hier beschriebene Verfahren kann 10-fache Unterschiede in den Ausprägungsstufen unterscheiden.
  • Die Primer wurden für die Amplifikation der sequentialisierten amplifizierten Bänder entwickelt, die unter Benutzung des Programms OLIGO (National Biosciences, Plymouth, MN) gewählt wurden.
  • Alle quantitativen PCR-Reaktionen wurden in einer 9600-Perkin-Elmer-PCR-Maschine (Perkin-Elmer) ausgeführt. Im Allgemeinen waren die Amplifikationsbedingungen wie folgt: 30 bis 40 Zyklen bestehend aus 30 Sekunden bei 95°C Denaturierung, 30 Sekunden Annealing bei 50 bis 60°C und 1 Minute Ausdehnung bei 72°C. Nach dem Durchlaufen wurden die Reaktionen für 10 Minuten bei 72°C verlängert.
  • RNase Schutzprüfungen:
  • Die RNAse-Schutzprüfungen wurden gemäß den Anweisungen des Herstellers unter Benutzung eines bei Ambion, Inc. erworbenen Sets ausgeführt. Die RNA-Sonden, die von der GenBank Zugangsnr. Y07519 abgeleitet wurden, wurden in den RNAse Schutzprüfungen benutzt. Diese Sonden wurden ebenfalls gemäß den Anweisungen des Herstellers unter Benutzung eines bei Ambion, Inc. erworbenen Sets erzeugt. Die Sequenz dieser RNA-Sonden entspricht dem 5'-Ende des Gens und weist sowohl die Kodierung als auch die 5'-unübersetzten Sequenzen auf.
  • Anti-CD-3-Stimulierung:
  • Die Bedingungen waren wie unten in Abschnitt 8.1 beschrieben.
  • Andere Verfahrensweisen:
  • Alle anderen Zellprobensammlungen, RNA-Isolierung, differentielle Anzeige, Sequenzanalyse und Northern-Verfahren, die in den in diesem Beispiel beschriebenen Experimenten angewendet werden, waren wie oben in Abschnitt 6.1 beschrieben.
  • 7.2 ERGEBNISSE
  • Eine differentielle Anzeigenanalyse von RNA, die aus TH1- und TH2-Zellenproben isoliert worden ist, wurde aus einer transgenen T-Zellenparadigmenstudie wie oben in Abschnitt 6.1 beschrieben erhalten. Insbesondere wurden von den transgenen Mäusen TH-Zellen erhalten, die einen T-Zellenrezeptor beherbergen, der Ovalbumin erkennt (Murphy et al., 1990, Science 250: 1720), wurden drei Mal stimuliert, wobei RNA aus den TH1- und TH2-Zellen erhalten wurde. Die differentielle Anzeigenanalyse der RNA-Proben führte zu der Identifizierung von Bands, die in den TH1- und TH2-Zellen differentiell ausgedrückt sind.
  • 8. BEISPIEL: IDENTIFIZIERUNG VON NEUARTIGEN GENEN, DIE IN EINER TH-ZELLENSUBPOPULATION DIFFERENTIELL AUSGEPRÄGT SIND
  • In dem Beispiel, das in diesem Abschnitt vorgestellt wird, werden neuartige Gensequenzen beschrieben, die Gene repräsentieren, die in den TH-Zellensubpopulationen und/oder während der Differenzierung dieser Subpopulationen differentiell ausgeprägt sind.
  • 8.1 MATERIALIEN UND VERFAHREN
  • T-Zellenklonparadigma:
  • T-Zellenklonparadigmasuchen wurden durchgeführt, die oben in Abschnitt 5.1.1.1 beschrieben worden sind. Insbesondere wählten die TH-Zellenklonparadigmen drei verschiedene Klone: D10.G4 (TH2), AE7 (TH1) und D1.1 (TH1). Vor der Stimulierung wurden die Zellkulturen durch Zentrifugieren durch einen Ficoll-Gradient mit lebenden Zellen angereichert. Wiederhergestellte Zellen wurden gezählt und ihre Lebensfähigkeit wurde mit Hilfe der Trypanblauexklusion untersucht. Die Zellen wurden jeweils bei etwa 5 × 106 Zellen in 5 mls oder bei 1,5 × 106 Zellen in 10 mls Kulturmedium entweder in ihre T25- oder T75-Flaschen erneut ausplattiert.
  • Die Beschichtung wurde im Allgemeinen gemäß der Current Protocols in Immunology, 1992, Coligan, J. E. et al., John Wiley & Sons, NY, pp. 3.12.4–3.12.6) durchgeführt. Insbesondere wurden die Flaschen vor dem Ausplattieren mit Anti-CD3-E Antikörpern (Hybridoma-Überstand von dem 145-C11-Hybridoma; Parmingen, Inc., San Diego CA) beschichtet. Zum Beschichten wurden die Antikörper in PBS bei 1 bis 2 μg/ml bei einem Volumen resuspendiert, das ausreicht, um den Boden der Flaschen zu beschichten. Die Beschichtungslösung wurde mindestens eine Stunde bei 37°C auf den Flaschen inkubiert.
  • Nach der Inkubation wurde die Antikörperbeschichtungslösung durch Absaugen entfernt und die Zellen wurden sofort hinzugegeben. Die Flaschen wurden 6 Stunden in einem 37-°C-Inkubator angeordnet. Die Zellen wurden zum Beispiel durch Entfernung von Überstand aus der Kultur geerntet, wonach die Zellen durch Zugabe einer RNAzolTM-Lösung direkt lysiert wurden. Die cDNA wurde wie unten beschrieben hergestellt.
  • cDNA-Isolierung:
  • Die RNA wurde aus Zellen unter Verwendung von Techniken geerntet, die oben in Abschnitt 6.1 beschrieben sind. Die mRNA wurde unter Benutzung eines QuickPepTM-mRNA-Reinigungssets (Pharmacia) gemäß den Anweisungen des Herstellers direkt gereinigt.
  • Die TH1-cDNA-Genbank wurde unter Benutzung eines SuperScriptTM-Lambda-System-Sets von Gibco BRL gemäß den Anweisungen des Herstellers konstruiert. 4,5 μg gereinigter mRNA wurden als Startmaterial für die Synthese einer poly-A-iniziierten Erst-Strang-cDNA, die eine Not-1-Klonierungsstelle enthält. Eine Zweit-Strang-cDNA-Synthese wurde mit einer RNAse-H-Behandlung durch geführt, gefolgt von einem beliebigen Priming. Sal-1-Adapter wurden an das 5'-Ende der resultierenden doppelsträngigen cDNA gebunden. Die gebundene cDNA wurde mit Not-1 zersetzt und bezüglich der Größe fraktioniert. Die Fraktionen, die cDNA in einem Größenbereich von 0,5 bis 8,0 kb Länge enthielten, wurden in Sal-1/Not-1-λZipLoxTM-Arme geklont. Die rekombinante Phage wurde dann unter Benutzung des Stratagene GigpackTM II Extraktverpackungssets gemäß den Anweisungen des Herstellers verpackt. Die Zellen des E. coli-Stamms Y 1090 (ZL)TM (Gibco BRL) wurden mit der verpackten, rekombinanten Phage transformiert und bei einer Dichte von 50.000 pfu pro 150 mm Schale ausplattiert. Die Plaques wurden durch Hybridisierung zu einer radiomarkierten Sonde gescreent, die aus einem subklonierten Band-200-cDNA-Fragment erzeugt wurde. Die Exzision der cDNA-Einsätze aus den Lambdaklonen und die Einführung der rekombinanten Plasmid-DNA in E. coli DH10B(ZIP)TM (Gibco BRL) wurde gemäß den Anweisungen des Herstellers ausgeführt.
  • Zur Isolierung von 200-Gen-cDNA wurde die cDNA-Genbank mit einer Sonde gescreent, die durch Markieren der gesamten Sequenz des Band-200-Subklons O erzeugt wurde, der unter Benutzung amplifizierter DNA konstruiert wurde, die aus der differentiellen Anzeigenanalyse erhalten wurde. Die Band-200-Sequenz wurde aus dem Klonierungsvektor pCRII Cloning VectorTM (Invitrogen) durch Zersetzung mit EcoRI herausgeschnitten. Mehrere Klone, einschließlich 200-P und 200AF, wurden für weitere Analysen ausgewählt.
  • Weitere Verfahrensweisen:
  • Alle Verfahrenweisen der transgenen T-Zellenmanipulationen, Zellenprobensammlung, zusätzlichen RNA-Isolierung, differentiellen Anzeige, Sequenzanalyse und Northern-Analyse, die in den in diesem Beispiel beschriebenen Experimenten angewendet werden, waren wie oben in Abschnitt 6.1 beschrieben.
  • 8.2 ERGEBNISSE
  • Transgene T-Zellenparadigma- und T-Zellen-Klonparadigmasuchen wurden durchgeführt, um die Gensequenzen zu identifizieren, die Gene repräsentieren, die innerhalb und/oder unter den TH-Zellensubpopulationen und/oder während der Differenzierung solcher Subpopulationen differentiell ausgeprägt sind. Hier wird eines der mehreren neuartigen Gene beschrieben, die durch diese Paradigmasuchen identifiziert worden sind. Insbesondere ist das hier beschriebene Gen als das 200-Gen bezeichnet worden. Eine Zusammenfassung der differentiellen Ausprägungseigenschaften der hier beschriebenen, neuartigen Gensequenz ist oben in Tabelle 1 dargestellt.
  • Wie oben in Tabelle 1 dargestellt, ist das 200-Gen auf einer höheren Stufe innerhalb der TH1-Zellensubpopulation ausgeprägt, wie durch die differentielle TH1-Erscheinung des amplifizierten Bandes 200 offenbart wird. Wie weiter unten analysiert werden wird, wird die Sequenz des murinen 200-Gens in 17A bis 17D (SEQ ID NO: 8) dargestellt, erscheint jedoch nicht in den veröffentlichten Datenbanken. Aufgrund des TH1-spezifischen Ausprägungsmusters zeigt jede dieser Sequenzen das 200-Gen und seine Genprodukte können potentiell als Behandlungen für TH1-bezogene Störungen, als Diagnoseverfahren für solche Störungen und/oder als Verfahrensteil zur Identifizierung von Verbindungen, die TH1-bezogene Störungen lindern können, benutzt werden.
  • Das Band 200 wurde als eine Sonde benutzt, um die murinen 200-Gen-cDNA-Klone zu identifizieren und zu isolieren, einschließlich der Klone, die als 200-P, 200-AF und 200-O bezeichnet werden und mit der NRRL abgeschieden worden sind, wie in Abschnitt 10 unten zusammengefasst wird. Die cDNA-Klone wurden charakteri siert und zeigten die Nukleotidsequenz (SEQ ID NO: 8) des murinen 200-Gen-Kodierungsbereichs in voller Länge, wie in 17A bis 17D dargestellt. 17A bis 17D stellen das murine 200-Genprodukt ebenfalls dar, das aus einer Aminosäurensequenz (SEQ ID NO: 10) abgeleitet ist.
  • Datenbanksuchen zeigen, dass das 200-Genprodukt ein neuer Rezeptor ist, der eine extrazelluläre Ig-Domäne enthält und somit innerhalb der Ig-Rezeptorsuperfamilie angeordnet werden kann. Die Klonierung und die Charakterisierung des 200-Genhumanhomologs werden in dem unten in Abschnitt 9 vorgestellten Beispiel beschrieben.
  • Die Ergebnisse einer murinen 200-Gen-mRNA-Northern-Blotting-Analyse sind in 18 dargestellt. Die in 18 dargestellten Daten zeigen erstens, dass das 200-Gen eine Transkribierung von etwa 1,2 kb Länge erzeugt und veranschaulichen zweitens die TH1-Spezifizität der 200-Genausprägung.
  • Für die Studie wurden drei TH1-Klone (D1.1, Dorris, AE7) und drei TH2-Klone (D10G.4, DAX, CDC25) benutzt und RNA-Proben wurden von entweder nicht stimulierten Zellen (–) oder von Zellen isoliert, die für 6 Stunden mit einem plattengebundenen Anti-CD3-Antikörper (+) stimuliert worden waren. Die Proben wurden mit 200-Gensequenzen getestet und, wie in 18 dargestellt, die RNA aus sowohl den stimulierten als auch den nicht stimulierten TH1-Zellen enthielt 200-Gen-mRNA, während keine der aus den TH2-Zellen erhaltenen Proben 200-Gen-mRNA enthielt. Es sollte auch darauf hingewiesen werden, dass die 200-Genausprägung in jeder der stimulierten TH1-Zellen bezüglich der entsprechenden nicht stimulierten TH1-Zellen höher war.
  • 9. BEISPIEL: IDENTIFIZIERUNG UND CHARAKTERISIERUNG DES HUMANEN 200-GENS
  • In dem hier vorgestellten Beispiel wird die Klonierung, Identifizierung und Charakterisierung des humanen 200-Gens entsprechend des humanen Homologs des murinen 200-Gens beschrieben.
  • 9.1 MATERIALIEN UND VERFAHREN
  • Murine 200-Gen-Sonde:
  • Ein etwa 800 pb EcoRI-Einsatz, der etwa 90% der murinen 200-Gen-cDNA (femt200) ORF enthielt, wurde mit Gel gereinigt, 32p-markiert und benutzt, um die λgt11 humane Lymphozyten-cDNA-Genbank wie unten beschrieben zu sondieren.
  • Humane 200-Gensonde:
  • Der etwa 500-bp-Einsatz des humanen 200-Gens feht200a-cDNA-Klon wurde mit 32p markiert und benutzt, um die unten beschriebene, humane, fetale Milz-cDNA-Genbank zu sondieren.
  • Screening-Verfahren:
  • Etwa 106 Plaques einer λgt11 humanen Lymphozyten-cDNA-Genbank (Katalog Nr. HL 1031B); Clontech) wurden mit der oben beschriebenen murinen 200-Gensonde doppelt gescreent. Die Filter wurden über Nacht bei 65°C in einem Church-Puffer (7% DSD, 250 mM NaHPO4, 2 μM EDTA, 1% BSA) mit der Sonde hybridisiert. Am nächsten Tag wurden die Filter 30 Minuten in 2 × SSC/1% SDS bei 50°C gewaschen. Die Filter wurden dann bei –80°C einem Kodak-Film ausgesetzt. Positive Plaques wurden unter den gleichen Bedingungen erneut gescreent.
  • Eine humane fetale Milz-cDNA-Genbank wurde mit Hilfe des Klonierungssystems Stratagene Uni-Zap cloning System unter Verwendung der oben beschriebenen humanen feht200a-Gensonde gescreent. Etwa 10 Plaques wurden über Nacht bei 65°C in einem Church-Puffer doppelt hybridisiert. Die Filter wurden dann 30 Minuten bei 65°C in 0.1 × SSC,0,1% SDS ausgewaschen und einem Film ausgesetzt. Positive Plaques wurden durch ein sekundäres Screening unter den gleichen Bedingungen bestätigt.
  • Subklonieren/Sequenzierungsverfahren:
  • DNA aus den positiven Klonen, die aus der λgt11 cDNA-Genbank erhalten wurden, wurde durch ein Plattenlysierungsverfahren erzeugt. Die gereinigte DNA wurde zersetzt, um cDNA-Einsätze zu erhalten, die in das pBluescript-Plasmid (Stratagene) subkloniert wurden.
  • Positive Klone, die aus der humanen fetalen Milz-cDNA-Genbank erhalten wurden, wurden mit einer ExAssist-Helferphage, XL1-Blue-Zellen und SOLR-Zellen, wie von Stratagene beschrieben, herausgeschnitten. Die Exzisionsprodukte wurden dann auf LB/Amp-Platten ausplattiert und über Nacht bei 37°C inkubiert. Weiße Kolonien wurden ausgewählt und DNA wurde zur Sequenzierung präpariert.
  • Die DNA-Sequenzierung wurde gemäß Standardtechniken durchgeführt.
  • Northern-Blotting-Analyse der humanen Gen-200-Ausprägung:
  • Das Northern-Blotting wurde wie oben in Abschnitt 6.1 beschrieben durchgeführt. 15 μg einer vollständigen RNA aus mehreren menschlichen Organen wurden analysiert (Clontech, CA). Die benutzte, mit 32p markierte Sonde war der oben beschriebene feht200a-Klon, der das 5'-ORF des humanen Gens 200 enthält.
  • 9.2 ERGEBNISSE
  • Die Sequenz des humanen 200-Gens wurde in voller Länge erfolgreich geklont und charakterisiert, wie hier beschrieben.
  • Um das humane 200-Gen zu klonen, wurde ein 800-pb-EcoRI-Einsatz, der etwa 90% der murinen 200-Gen-cDNA (femt200) ORF enthält, mit Gel gereinigt, mit 32p markiert und verwendet, um eine λgt11 humane Lymphozyten-cDNA-Genbank zu sondieren. Etwa 106 Plaques wurden doppelt gescreent, wie oben in Abschnitt 9.1 beschrieben ist. Ein positiver Plaque wurde erhalten und unter den gleichen Bedingungen erneut gescreent. Nachdem er gereinigt worden ist, wurde dieser Klon benutzt, um durch ein Plattenlysierungsverfahren eine Lambda-DNA zu erzeugen, und die Lambda-DNa wurde zersetzt, um einen 500-bp-Einsatz (feht200a) zu erhalten, wobei nach der Sequenzierung herausgefunden wurde, dass dieser ein humanes Homolog des murinen 200-Gens ist.
  • Um einen Klon zu erhalten, der den gesamten ORF des humanen 200-Gens verschlüsselt, wurde eine humane 200-Gensonde benutzt, um eine humane fetale Milz-cDNA-Genbank zu screenen, wie oben in Abschnitt 9.1 beschrieben. Drei positive Klone wurden erhalten, von denen zwei nach einem sekundären Screening unter den gleichen Bedingungen positiv waren. Die zwei positiven Klone wurden subkloniert und ihre cDNA-Einsätz wurden einer Sequenzierung unterzogen. Diese zwei Klone, die mit feht200b und feht200c markiert waren, wiesen jeweils eine Länge von etwa 1,56 kb und 2,0 kb auf, wobei feht200c die gesamte Kodierungssequenz enthielt. Der Klon feht200c wurde mit der in Abschnitt 12 beschriebenen ATCC abgeschieden.
  • Die Nukleotidsequenz, die den gesamten humanen 200-Gen-ORF (Open Reading Frame) enthält, ist in 24 (SEQ ID NO: 23) dargestellt. Die abgeleitete Aminosäurensequenz des humanen 200-Genprodukts ist ebenfalls in 24 (SEQ ID NO: 24) dargestellt.
  • Die 301-Aminosäuren-Restsequenz des humanen 200-Genprodukts offenbart, dass sie ein Zelloberflächenrezeptor ist, der verschiedene Domänen zeigt, die eine Signalsequenz von Aminosäurerest 1 bis etwa 20, eine extrazelluläre Domäne von etwa Aminosäurerest 21 bis 200 und eine transmembrane Domäne von etwa Aminosäurerest 201 bis 224 und eine cytoplasmatische Domäne von etwa Aminosäure 225 bis 301 aufweist. Die extrazelluläre Domäne enthält eine Ig-artige, variable Satzdomäne von etwa Aminosäurerest 30 bis etwa Aminosäurerest 128, so dass das 200-Genprodukt innerhalb der Ig-Rezeptorsuperfamilie angeordnet wird.
  • Eine Northern-Analyse der Gewebeverteilung von 200-Gen-Transkriptionen wurde durchgeführt. 15 μg RNA aus Gehirn, Niere, Leber, Lunge, Muskel, Prostata, Milz, Thymus und Trachea wurden isoliert und auf eine humane 200-Genausprägung untersucht. Diese Analyse offenbarte in Geweben wie Gehirn, Lunge, Trachea, Milz und Thymus humane 200-Gentranskriptionen von etwa 2,2 kb.
  • Zusammenfassend ist das hier beschriebene humane 200-Gen entsprechend dem humanen Analog des murinen 200-Gens erfolgreich geklont und charakterisiert worden. Wie durch seine Aminosäuresequenzen offenbart, ist das humane 200-Genprodukt ein Rezeptor der Ig-Superfamilie-Molekülklasse.
  • 10. BEISPIEL: KONSTRUKTION UND AUSPRÄGUNG VON IgG1-FUSIONSPROTEINEN
  • In diesem Beispiel wird die Konstruktion und Ausprägung von IgG1-Fusionsproteinen beschrieben. Insbesondere wird die Konstruktion des humanen und murinen 200-Gen-IgG1-Fusionsproteins untersucht.
  • 10.1 MATERIALIEN UND VERFAHREN
  • Rekombinante Plasmide, die IgG1-Fusionsproteine verschlüsseln:
  • Generation des Vektors, der das murine 200-Gen-hIgG1-Fusionsprotein verschlüsselt:
  • Das Fragment, das die Signalsequenz und die extrazelluläre Domäne des murinen 200-Gens verschlüsselt, wurde von einem cDNA-Klon amplifiziert, der den ORF des murinen 200-Gens unter Verwendung der folgenden Oligonukleotide enthält:
    Vorwärts-Oligo: 5'-AAA-TTT-ATT-CTC-GAG-GAC-CCA-CGC-GTC-CGG-ATT-TCC-C-3' (SEQ ID NO: 25);
    Umgekehrt-Oligo: 5'-TTA-ATT-TGG-ATC-CCC-AGT-TCT-GAT-CGT-TTC-TCC-AGA-GTC-3' (SEQ ID NO: 26).
  • Die Oligonukleotid-Primer führen auch XhoI- und BamHI-Restriktionsstellen an den jeweiligen 5'- und 3'-Enden der PCR-Produkte ein, um die nachfolgende Insertion in die IgG1-Ausprägungsvektoren (pCD5-CD44-IgG1; siehe Aruffo, A. et al., 1991, Cell 61: 1303–1313) zu ermöglichen. Der pCD5-CD44-IgG1-Vektor verschlüsselt ein Protein, das eine CD5-Signalsequenz, eine extrazelluläre CD44-Domäne und einen Fc-Bereich einer humanen IgG1 schweren Ketten enthält. Zur Konstruktion des murinen 200-Gen-hIgG1-Fusionsproteinvektors wurden die CD5- und CD44-Abschnitte von pCD5-CD44-IgG1 durch Sequenzen ersetzt, die die murine 200 Genprodukt-Signalfrequenz und extrazelluläre Domäne verschlüsseln.
  • Die PCR-Reaktionen bestanden aus 25 Amplifikationszyklen bei einer Annealing-Temperatur von 60°C. Die VentTM thermostabile DNA-Polymerase (New England BioLabs, Inc.; Beverly, Massachusetts) wurde in der Amplifikation benutzt. Das PCR-Produkt (etwa 600 bp) wurde mit XhoI und BamHI zersetzt und in pCD5-CD44-IgG1 eingesetzt, das vorher mit XhoI und BamHI zersetzt worden ist, um die Sequenzen zu entfernen, die die CD5-Signalsequenz und die CD44-Ectodomäne verschlüsseln.
  • Generation des Vektors, der das humane 200-Gen-hIgG1-Fusionsprotein verschlüsselt:
  • Das Fragment, das die Signalsequenz und die extrazelluläre Domäne des humanen 200-Gens verschlüsselt, wird von einem cDNA-Klon amplifiziert, der den ORF des humanen 200-Gens enthält, unter Verwendung der folgenden Oligonukleotide:
    Vorwärts-Oligo: 5'-AAA-TTT-ATT-CTC-GAG-CGC-TAA-CAG-AGG-TGT-CC-3' (SEQ ID NO: 27);
    Umgekehrt-Oligo: 5'-TTA-ATT-TGG-ATC-CCC-TCT-GAT-GGT-TGC-TCC-AGA-GTC-CCG-3' (SEQ ID NO: 28).
  • Die Amplifikation und die pCD5-CD44-IgG1-Subklonierungsverfahren sind für das murine 200-Gen-hIgG1-Fusionsprotein wie oben beschrieben.
  • Metabolische Markierung von rekombinanten Fusionsproteinen:
  • 36 Stunden nach der transienten Transfektion von COS-7-Kulturen wurden die Zellen mit Ersatzwachstumsmedium [DMEM-Methionin und Cystein abgereichert (ICN, Inc., CA)] gespült. Nach dem Spülen wurden 150 μCI/ml Medium einer Mischung aus 35S-Cystein und 35S-Methion (Express 35S35STM Dupont, MA) zu dem Ersatzmedium hinzugegeben und die Zellen wurden über Nacht gezüchtet.
  • Analyse der rekombinanten Proteine durch SDS-PAGE:
  • hIgG1-Fusionsproteine wurden durch eine LipfectAMINETM (Gibco, Inc., MD) -vermittelte transiente Transfektion von COS-7-Zellen gemäß den Vorschlägen des Herstellers für 200-Gen-hIgG1-Fusionsproteine erzeugt, 1 ml eines 5-tägigen Überstandes wurde über Nacht mit 20 μl Protein-A-Trisacryl-Perlen (Pierce, Inc., IL) in Gegenwart von 20 mM HEPES (pH 7,0) bei 4°C und bei konstantem Schütteln gemischt. Die Perlen wurden dann vor der Zugabe zu dem Ladepuffer 3 Mal mit PBS gewaschen. Die Perlen wurden entweder mit reduzierenden oder nicht reduzierenden Ladepuffern (beschrieben in Molecular Cloning, Sambrook, Fritsch und Maniatis, 2. Ausgabe, 1989, mit der Ausnahme, dass DTT durch 2,5% β-Mercaptoethanol ersetzt wurde) gemischt.
  • 10.2 ERGEBNISSE
  • Die Konstruktion und Ausprägung der rekombinanten IgG-Fusionsproteine wird hier beschrieben. Insbesondere werden die 200-Genprodukt-IgG1-Fusionsproteine beschrieben. Das murine und humane 200-Genprodukt-IgG1-Fusionsprotein enthält eine 200-Genprodukt-Signalsequenz und extrazelluläre Domänenfusion mit einem Fc-Bereich einer humanen IgG1 schweren Kette.
  • 200-Gen-hIgG1-Fusionsproteine wurden durch die transiente Transfektion von COS-7-Zellen hergestellt, wie oben in Abschnitt 10.1 beschrieben worden ist. Die Protein-A-Immunfällung der COS-7-Überstände und ihre Analyse durch SDS-PAGE zeigten erstens, dass das korrekte IgG-1-Peptid als Teil der Fusion hergestellt worden war (wie durch die Protein-A-Immunfällung nachgewiesen), und zeigten zweitens eine wesentliche Ausprägung des 200-Gen-IgG1-Fusionsproteins bei einer Konzentration von etwa 1 μg pro ml des Kulturüberstands. Wenn ferner die immungefällten Überstände analysiert und unter reduzierenden und nicht reduzierenden Bedingungen verglichen werden, ist klar, dass das 200-Gen-IgG1-Fusionsprotein, wie erwartet, aufgrund der in dem Fusionsprotein gegenwärtigen Peptidsequenz der humanen IgG1 schweren Kette eine Oligomerisierung durchmacht. Ferner zeigen die Größe (das heißt, größer als von der Aminosäuresequenz allein erwartet) und die Erscheinung der Fusionsproteine bei der Wanderung durch die Gele (das heißt, diffuse eher als feste Bänder) an, dass die Fusionsproteine wie erwartet glykosyliert worden sind.
  • 12. HINTERLEGUNG VON MIKROORGANISMEN
  • Die folgenden Mikroorganismen wurden am 19. Januar 1995 (200-O), am 2. März 1995 (E. coli DH10B(Zip)TM enthaltend 200-P) und am 1. Juni 1995 (200-AF) bei der Agricultural Research Service Culture Collection (NRRL), Peoria, Illinois, hinterlegt, wobei ihnen die folgenden Zugangsnummern zugewiesen wurden:
    Mikroorganismus NRRL-Zugangsnr.
    200-O B-21395
    E. coli DH10B(Zip)TM enthaltend 200-P cDNA B-21415
    200-AF B-21457
  • Die folgenden Mikroorganismen wurden am 12. Dezember 1995 bei der American Type Culture Collection (ATCC), Rockville, Maryland, hinterlegt, wobei ihnen die folgenden Zugangsnummern zugewiesen wurden:
    Mikroorganismus ATCC-Zugangsnr.
    E. coli, feht 200C 69967
  • Die hier beschriebenen, spezifischen Ausführungsformen sind für einzelne Erläuterungen individueller Aspekte innerhalb des Schutzbereichs der Erfindung bestimmt.
  • SEQUENZPROTOKOLL
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  • Figure 01680001
  • Figure 01690001
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  • Figure 02020001

Claims (54)

  1. Isoliertes Nucleinsäuremolekül, umfassend: (a) die Nucleotidsequenz von SEQ ID NO: 8 oder SEQ ID NO: 23; (b) eine Nucleotidsequenz, welche ein Polypeptid kodiert, umfassend die Aminosäuresequenz, die durch den cDNA-Einschub des Klons codiert wird, der in den Klonen von E. coli enthalten ist, die unter der American Type Culture Collection (ATCC) Accession Number 69967, der Agricultural Research Service Culture Collection (NRRL) Accession Number B-21395, der NRRL Accession Number B-21415, oder der NRRL Accession Number B-21457 hinterlegt sind, wobei genannter cDNA-Einschub unter stringenten Bedingungen an ein Nucleinsäuremolekül hybridisiert, das ein Komplement einer Nucleinsäure mit der Nucleotidsequenz SEQ ID NO: 8 oder SEQ ID NO: 23 ist, und wobei genannte stringente Bedingungen die Hybridisierung an filtergebundene DNA in 0,5 M NaHPO4, 7% Natriumlaurylsulfat (SDS), 1 mM EDTA bei 65°C, und waschen in 0,1 × SSC/0,1% SDS bei 68°C umfassen; oder (c) eine Nucleotidsequenz welche ein Polypeptid kodiert, umfassend die Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 10 oder SEQ ID NO: 24.
  2. Isoliertes Nucleinsäuremolekül, umfassend eine Nucleotidsequenz, welche mindestens eine der folgenden Peptiddomänen kodiert, die in 17 (SEQ ID NO: 10) oder 24 (SEQ ID NO: 24) abgebildet sind: (a) Signalsequenzdomäne; (b) extrazelluläre Domäne; (c) gereifte extrazelluläre Domäne; (d) variable SET-Domäne vom Ig-Typ; (e) transmembrane Domäne; oder (f) cytoplasmatische Domäne.
  3. Isoliertes Nucleinsäuremolekül nach Anspruch 2, umfassend eine Nucleotidsequenz, die ein Polypeptid kodiert, umfassend: (a) Aminosäurereste 1 bis 20 von SEQ ID NO: 10; (b) Aminosäurereste 21 bis 192 von SEQ ID NO: 10; (c) Aminosäurereste 1 bis 192 von SEQ ID NO: 10; (d) Aminosäurereste 193 bis 214 von SEQ ID NO: 10; (e) Aminosäurereste 215 bis 280 von SEQ ID NO: 10; (f) Aminosäurereste 1 bis 20 von SEQ ID NO: 24; (g) Aminosäurereste 21 bis 200 von SEQ ID NO: 24; (h) Aminosäurereste 1 bis 200 von SEQ ID NO: 24; (i) Aminosäurereste 201 bis 224 von SEQ ID NO: 24; (j) Aminosäurereste 225 bis 301 von SEQ ID NO: 24; oder (k) Aminosäurereste 30 bis 128 von SEQ ID NO: 24.
  4. Isoliertes Nucleinsäuremolekül nach Anspruch 2, umfassend: (a) Nucleotide 40 bis 99 von SEQ ID NO: 8; (b) Nucleotide 40 bis 615 von SEQ ID NO: 8; (c) Nucleotide 40 bis 882 von SEQ ID NO: 8; (d) Nucleotide 100 bis 615 von SEQ ID NO: 8; (e) Nucleotide 616 bis 681 von SEQ ID NO: 8; (f) Nucleotide 682 bis 882 von SEQ ID NO: 8; (g) Nucleotide 1 bis 60 von SEQ ID NO: 23; (h) Nucleotide 1 bis 600 von SEQ ID NO: 23; (i) Nucleotide 1 bis 903 von SEQ ID NO: 23; (j) Nucleotide 61 bis 600 von SEQ ID NO: 23; (k) Nucleotide 90 bis 384 von SEQ ID NO: 23; (l) Nucleotide 601 bis 672 von SEQ ID NO: 23; oder (m) Nucleotide 675 bis 903 von SEQ ID NO: 23.
  5. Isoliertes Nucleinsäuremolekül, welches unter stringenten Bedingungen an das Nucleinsäuremolekül nach Anspruch 1 (a) oder Anspruch 1 (b) oder an sein Komplement hybridisiert, wobei die genannten stringenten Bedingungen die Hybridisierung an filtergebundene DNA in 0,5 M NaHPO4, 7% Natriumlaurylsulfat (SDS), 1 mM EDTA bei 65°C, und Waschen in 0,1 × SSC/0,1 × SDS bei 68°C oder Waschen in 0,2 × SSC/0,1% SDS bei 42°C umfassen.
  6. Isoliertes Nucleinsäuremolekül, umfassend eine Nucleotidsequenz, welche ein Polypeptid kodiert, dem mindestens eine der folgenden Peptiddomänen fehlt, die in 17 (SEQ ID NO: 10) oder 24 (SEQ ID NO: 24) gezeigt sind: (a) Signalsequenzdomäne; (b) extrazelluläre Domäne; (c) gereifte extrazelluläre Domäne; (d) extrazelluläre Ig-Domäne; (e) transmembrane Domäne; oder (f) cytoplasmatische Domäne; wobei das Polypeptid durch die Nucleinsäure von Anspruch 1 oder einem Teil davon codiert wird.
  7. Isoliertes Nucleinsäuremolekül nach Anspruch 6, welches ein Polypeptid kodiert, dem mindestens eine der folgenden Aminosäuresequenzen fehlt: (a) Aminosäurereste 1 bis 20 von SEQ ID NO: 10; (b) Aminosäurereste 1 bis 192 von SEQ ID NO: 10; (c) Aminosäurereste 1 bis 214 von SEQ ID NO: 10; (d) Aminosäurereste 21 bis 192 von SEQ ID NO: 10; (e) Aminosäurereste 21 bis 214 von SEQ ID NO: 10; (f) Aminosäurereste 21 bis 281 von SEQ ID NO: 10; (g) Aminosäurereste 193 bis 214 von SEQ ID NO: 10; (h) Aminosäurereste 193 bis 281 von SEQ ID NO: 10; (i) Aminosäurereste 215 bis 281 von SEQ ID NO: 10; (j) Aminosäurereste 1 bis 20 von SEQ ID NO: 24; (k) Aminosäurereste 1 bis 200 von SEQ ID NO: 24; (l) Aminosäurereste 1 bis 224 von SEQ ID NO: 24; (m) Aminosäurereste 21 bis 200 von SEQ ID NO: 24; (n) Aminosäurereste 21 bis 224 von SEQ ID NO: 24; (o) Aminosäurereste 21 bis 301 von SEQ ID NO: 24; (p) Aminosäurereste 30 bis 128 von SEQ ID NO: 24; (q) Aminosäurereste 201 bis 224 von SEQ ID NO: 24; (r) Aminosäurereste 201 bis 301 von SEQ ID NO: 24; und/oder (s) Aminosäurereste 225 bis 301 von SEQ ID NO: 24;
  8. Isoliertes Nucleinsäuremolekül nach Anspruch 6, welchem mindestens eine der folgenden Nucleotidsequenzen fehlt: (a) Nucleotide 40 bis 99 von SEQ ID NO: 8; (b) Nucleotide 40 bis 615 von SEQ ID NO: 8; (c) Nucleotide 40 bis 882 von SEQ ID NO: 8; (d) Nucleotide 100 bis 615 von SEQ ID NO: 8; (e) Nucleotide 616 bis 681 von SEQ ID NO: 8; (f) Nucleotide 682 bis 882 von SEQ ID NO: 8; (g) Nucleotide 1 bis 60 von SEQ ID NO: 23; (h) Nucleotide 1 bis 600 von SEQ ID NO: 23; (i) Nucleotide 1 bis 903 von SEQ ID NO: 23; (j) Nucleotide 61 bis 600 von SEQ ID NO: 23; (k) Nucleotide 90 bis 384 von SEQ ID NO: 23; (l) Nucleotide 601 bis 672 von SEQ ID NO: 23; und/oder (m) Nucleotide 675 bis 903 von SEQ ID NO: 23.
  9. Nucleinsäuremolekül, umfassend eine Nucleotidsequenz, die ein Fusionsprotein kodiert, welches das Nucleinsäuremolekül aus einem der Ansprüche 1–8 und ein heterologes Polypeptid umfasst.
  10. Nucleinsäuremolekül nach Anspruch 9, in welchem das heterologe Polypeptid ein Immunglobulin-Fc-Fragment umfasst.
  11. Vektor, umfassend das Nucleinsäuremolekül nach einem der Ansprüche 1–10.
  12. Vector nach Anspruch 11, weiterhin umfassend eine Nucleotidsequenz, welche die Expression eines Genprodukts reguliert, das durch das Nucleinsäuremolekül kodiert wird.
  13. Wirtszelle, umfassend den Vektor nach Anspruch 11 oder 12.
  14. Genetisch veränderte Wirtszelle, enthaltend das Nucleinsäuremolekül nach einem der Ansprüche 1–10.
  15. Genetisch veränderte Wirtszelle, enthaltend das Nucleinsäuremolekül nach einem der Ansprüche 1–10 in operativer Einheit mit einem Regulierungselement für die Nucleotidsequenz, welche die Expression der Nucleotidsequenz in der Wirtszelle kontrolliert.
  16. Verfahren zur Herstellung eines Polypeptids, das durch ein Nucleinsäuremolekül nach einem der Ansprüche 1 bis 10 kodiert wird, umfassend: Kultivieren der Wirtszelle nach Anspruch 13, 14 oder 15, so dass genanntes Polypeptid in der Zellkultur exprimiert wird, und Gewinnung des Polypeptids aus genannter Zellkultur.
  17. Isoliertes Polypeptid, umfassend: (a) die Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 10 oder SEQ ID NO: 24; (b) die Aminosäuresequenz, die durch die Nucleotidsequenz von SEQ ID NO: 8 oder SEQ ID NO: 23 kodiert wird; oder (c) die Aminosäuresequenz, die durch den cDNA-Einschub des Klons codiert wird, der in den Klonen von E. coli enthalten ist, die unter der ATCC Accession Number 69967, der NRRL Accession Number B-21395, der NRRL Accession Number B-21415, oder der NRRL Accession Number B-21457 hinterlegt sind, wobei genannter cDNA-Einschub unter stringenten Bedingungen an ein Nucleinsäuremolekül hybridisiert, das ein Komplement einer Nucleinsäure ist mit der Nucleotidsequenz SEQ ID NO: 8 oder SEQ ID NO: 23, und wobei genannte stringente Bedingungen die Hybridisierung an filtergebundene DNA in 0,5 M NaHPO4, 7% Natriumlaurylsulfat (SDS), 1 mM EDTA bei 65°C, und Waschen in 0,1 × SSC/0,1% SDS bei 68°C umfassen.
  18. Isoliertes Polypeptid, umfassend: (a) Aminosäurereste 1 bis 20 von SEQ ID NO: 10; (b) Aminosäurereste 1 bis 192 von SEQ ID NO: 10; (c) Aminosäurereste 1 bis 214 von SEQ ID NO: 10; (d) Aminosäurereste 21 bis 192 von SEQ ID NO: 10; (e) Aminosäurereste 21 bis 214 von SEQ ID NO: 10; (f) Aminosäurereste 21 bis 281 von SEQ ID NO: 10; (g) Aminosäurereste 193 bis 214 von SEQ ID NO: 10; (h) Aminosäurereste 193 bis 281 von SEQ ID NO: 10; (i) Aminosäurereste 215 bis 281 von SEQ ID NO: 10; (j) Aminosäurereste 1 bis 20 von SEQ ID NO: 24; (k) Aminosäurereste 1 bis 200 von SEQ ID NO: 24; (l) Aminosäurereste 1 bis 224 von SEQ ID NO: 24; (m) Aminosäurereste 21 bis 200 von SEQ ID NO: 24; (n) Aminosäurereste 21 bis 224 von SEQ ID NO: 24; (o) Aminosäurereste 21 bis 301 von SEQ ID NO: 24; (p) Aminosäurereste 30 bis 128 von SEQ ID NO: 24; (q) Aminosäurereste 201 bis 224 von SEQ ID NO: 24; (r) Aminosäurereste 201 bis 301 von SEQ ID NO: 24; und/oder (s) Aminosäurereste 225 bis 301 von SEQ ID NO: 24.
  19. Isoliertes Polypeptid nach Anspruch 17 mit einer Aminosäuresequenz, der mindestens eine, aber nicht alle, der folgenden Peptiddomänen von SEQ ID NO: 10 oder SEQ ID NO: 24 fehlen: eine Signalsequenzdomäne, extrazelluläre Domäne, extrazelluläre Ig-Domäne, transmembrane Domäne oder cytoplasmatische Domäne.
  20. Isoliertes Polypeptid nach Anspruch 19 mit einer Aminosäuresequenz, der mindestens eine, aber nicht alle, der folgenden Aminosäuresequenzen von SEQ ID NO: 10 oder SEQ ID NO: 24 fehlt: (a) Aminosäurereste 1 bis 20 von SEQ ID NO: 10; (b) Aminosäurereste 1 bis 192 von SEQ ID NO: 10; (c) Aminosäurereste 1 bis 214 von SEQ ID NO: 10; (d) Aminosäurereste 21 bis 192 von SEQ ID NO: 10; (e) Aminosäurereste 21 bis 214 von SEQ ID NO: 10; (f) Aminosäurereste 21 bis 281 von SEQ ID NO: 10; (g) Aminosäurereste 193 bis 214 von SEQ ID NO: 10; (h) Aminosäurereste 193 bis 281 von SEQ ID NO: 10; (i) Aminosäurereste 215 bis 281 von SEQ ID NO: 10; (j) Aminosäurereste 1 bis 20 von SEQ ID NO: 24; (k) Aminosäurereste 1 bis 200 von SEQ ID NO: 24; (l) Aminosäurereste 1 bis 224 von SEQ ID NO: 24; (m) Aminosäurereste 21 bis 200 von SEQ ID 24; (n) Aminosäurereste 21 bis 224 von SEQ ID NO: 24; (o) Aminosäurereste 21 bis 301 von SEQ ID NO: 24; (p) Aminosäurereste 30 bis 128 von SEQ ID NO: 24; (q) Aminosäurereste 201 bis 224 von SEQ ID NO: 24; (r) Aminosäurereste 201 bis 301 von SEQ ID NO: 24; und/oder (s) Aminosäurereste 225 bis 301 von SEQ ID NO: 24;
  21. Isoliertes Polypeptid, welches durch ein Nucleinsäuremolekül kodiert wird, das unter stringenten Bedingungen an das Komplement der Nucleinsäuresequenz hybridisiert, welche die Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 10 oder SEQ ID NO: 24 kodiert, wobei die genannten stringenten Bedingungen die Hybridisierung an filtergebundene DNA in 0,5 M NaHPO4, 7% Natriumlaurylsulfat (SDS), 1 mM EDTA bei 65°C, und Waschen in 0,2 × SSC/0,1% SDS bei 42°C oder Waschen in 0,1 × SSC/0,1% SDS bei 68°C umfassen.
  22. Fusionsprotein, umfassend ein Polypeptid nach einem der Ansprüche 17–21 und ein unverbundenes Polypeptid.
  23. Fusionsprotein nach Anspruch 22, in welchem das unverbundene Polypeptid Glutathion-S-transferase (GST), eine IgFc-Domäne oder die DNA-bindende Domäne des GAL4-Proteins ist.
  24. Antikörper oder Epitop-bindendes Fragment davon, welches spezifisch an das Polypeptid nach einem der Ansprüche 17–21 bindet.
  25. Antikörper oder Epitop-bindendes Fragment davon nach Anspruch 24, welches ein polyklonaler Antikörper, ein monoklonaler Antikörper, ein chimärer Antikörper und/oder ein humanisierter Antikörper ist.
  26. Antikörper oder Epitop-bindendes Fragment davon nach Anspruch 24, welches mit einer destruktiven Einheit und/oder einer detektierbaren Substanz verknüpft ist.
  27. Antikörper oder Epitop-bindendes Fragment davon nach Anspruch 26, wobei die destruktive Einheit ein Zytotoxin oder ein radioaktives Mittel ist.
  28. Antikörper oder Epitop-bindendes Fragment davon nach Anspruch 27, wobei das Zytotoxin ein von einer Pflanze stammendes Toxin, ein von einem Pilz stammendes Toxin, ein von Bakterien stammendes Toxin oder deglycosyliertes Ricin-A-Kettentoxin ist.
  29. Antikörper oder Epitop-bindendes Fragment davon nach Anspruch 26, wobei die detektierbare Substanz ausgewählt wird aus der Gruppe bestehend aus einem Enzym, einem fluoreszierenden Material, einem chemilumineszierenden Material, einem biolumineszierenden Material und einem radioaktiven Material.
  30. Pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend den Antikörper oder das Epitop-bindende Fragment davon nach Anspruch 24 und einen physiologisch zulässigen Träger.
  31. Fusionspolypeptid der Antikörper-Fc-Domäne, umfassend eine Antikörper-Fc-Domäne, verknüpft mit: (a) der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 10 oder SEQ ID NO: 24 oder der Aminosäuresequenz, die durch den cDNA-Einschub des Klons codiert wird, der in der ATCC Accession Number 69967, der NRRL Accession Number B-21395, der NRRL Accession Number B-21415, oder der NRRL Accession Number B-21457 enthalten ist, wobei genannter cDNA-Einschub unter stringenten Bedingungen an ein Nucleinsäuremolekül hybridisiert, das ein Komplement einer Nucleinsäure mit der Nucleotidsequenz von SEQ ID NO: 8 oder SEQ ID NO: 23 ist, und wobei genannte stringente Bedingungen die Hybridisierung an filtergebundene DNA in 0,5 M NaHPO4, 7% Natriumlaurylsulfat (SDS), 1 mM EDTA bei 65°C, und Waschen in 0,1 × SSC/0,1% SDS bei 68°C umfassen; (b) Aminosäurereste 1–20, 1–200, 1–224, 30–128, 21–200, 21–224, 21–301, 201–224, 201–301 und/oder 225–301 von SEQ ID NO: 24; oder (c) Aminosäurereste 1–20, 1–192, 1–214, 21–192, 21–214, 21–281, 193–214, 193–281 und/oder 215–281 von SEQ ID NO: 10.
  32. Antikörper-Fc-Fusionspolypeptid, umfassend eine Antikörper-Fc-Domäne, verknüpft mit einer Aminosäuresequenz, welche durch ein Nucleinsäuremolekül kodiert wird, das unter stringenten Bedingungen an das Komplement des Nucleinsäuremoleküls bestehend aus SEQ ID NO: 8 oder SEQ ID NO: 23 hybridisiert, wobei die genannten stringenten Bedingungen die Hybridisierung an filtergebundene DNA in 0,5 M NaHPO4, 7% Natriumlaurylsulfat (SDS), 1 mM EDTA bei 65°C, und Waschen in 0,1 × SSC/0,1% SDS bei 65°C umfassen.
  33. Antikörper-Fc-Fusionspolypeptid nach Anspruch 31, in welchem die Aminosäuresequenz eine extrazelluläre Domäne der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 10 oder 24 umfasst.
  34. Antikörper-Fc-Fusionspolypeptid nach Anspruch 33, in welchem die extrazelluläre Domäne Aminosäurereste 21–192 von SEQ ID NO: 10 oder 21–200 von SEQ ID NO: 24 umfasst.
  35. Verfahren zur Detektion der 200-Genexpression in einer Probe, umfassend: Detektion der Anwesenheit eines 200-Genprodukt oder eines RNA-Moleküls, welches das 200-Genprodukt kodiert, wobei das 200-Genprodukt umfasst: (a) die Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 10 oder SEQ ID NO: 24; (b) die Aminosäuresequenz, die durch die Nucleotidsequenz von SEQ ID NO: 8 oder SEQ ID NO: 23 kodiert wird; (c) die Aminosäuresequenz, die durch den cDNA-Einschub des Klons codiert wird, der in den Klonen von E. coli enthalten ist, die unter der ATCC Accession Number 69967, der NRRL Accession Number B-21395, der NRRL Accession Number B-21415, oder der NRRL Accession Number B-21457 hinterlegt sind, wobei genannter cDNA-Einschub unter stringenten Bedingungen an ein Nucleinsäuremolekül hybridisiert, das ein Komplement einer Nucleinsäure mit der Nucleotidsequenz SEQ ID NO: 8 oder SEQ ID NO: 23 ist, und wobei genannte stringente Bedingungen die Hybridisierung an filtergebundene DNA in 0,5 M NaHPO4, 7% Natriumlaurylsulfat (SDS), 1 mM EDTA bei 65°C, und waschen in 0,1 × SSC/0,1% SDS bei 68°C umfassen; (d) Aminosäurereste 1 bis 20 von SEQ ID NO: 10; (e) Aminosäurereste 1 bis 192 von SEQ ID NO: 10; (f) Aminosäurereste 1 bis 214 von SEQ ID NO: 10; (g) Aminosäurereste 21 bis 192 von SEQ ID NO: 10; (h) Aminosäurereste 21 bis 214 von SEQ ID NO: 10; (i) Aminosäurereste 21 bis 281 von SEQ ID NO: 10; (j) Aminosäurereste 193 bis 214 von SEQ ID NO: 10; (k) Aminosäurereste 193 bis 281 von SEQ ID NO: 10; (l) Aminosäurereste 215 bis 281 von SEQ ID NO: 10; (m) Aminosäurereste 1 bis 20 von SEQ ID NO: 24; (n) Aminosäurereste 1 bis 200 von SEQ ID NO: 24; (o) Aminosäurereste 1 bis 224 von SEQ ID NO: 24; (p) Aminosäurereste 21 bis 200 von SEQ ID NO: 24; (q) Aminosäurereste 21 bis 224 von SEQ ID NO: 24; (r) Aminosäurereste 21 bis 301 von SEQ ID NO: 24; (s) Aminosäurereste 30 bis 128 von SEQ ID NO: 24; (t) Aminosäurereste 201 bis 224 von SEQ ID NO: 24; (u) Aminosäurereste 201 bis 301 von SEQ ID NO: 24; (v) Aminosäurereste 225 bis 301 von SEQ ID NO: 24; (w) eine Aminosäuresequenz, welche durch eine Nucleotidsequenz kodiert wird, die unter stringenten Bedingungen an das Komplement der Nucleinsäuresequenz von SEQ ID NO: 8 oder einem Teil davon hybridisiert, wobei die genannten stringenten Bedingungen die Hybridisierung an filtergebundene DNA in 0,5 M NaHPO4, 7% Natriumlaurylsulfat (SDS), 1 mM EDTA bei 65°C, und Waschen in 0,1 × SSC/0,1% SDS bei 68°C umfassen; oder (x) eine Aminosäuresequenz, welche durch eine Nucleotidsequenz kodiert wird, die unter stringenten Bedingungen an das Komplement der Nucleinsäuresequenz von SEQ ID NO: 23 oder einem Teil davon hybridisiert, wobei die genannten stringenten Bedingungen die Hybridisierung an filtergebundene DNA in 0,5 M NaHPO4, 7% Natriumlaurylsulfat (SDS), 1 mM EDTA bei 65°C, und Waschen in 0,1 × SSC/0,1% SDS bei 68°C umfassen.
  36. Verfahren nach Anspruch 35, in welchem die Probe auf einem Festphasenträger immobilisiert wird.
  37. Verfahren nach Anspruch 35, in welchem das 200-Genprodukt in der Probe durch Bindung des Genprodukts an einen Antikörper detektiert wird, der gegen das 200-Genprodukt gerichtet ist.
  38. Verfahren nach Anspruch 37, in welchem der Antikörper direkt oder indirekt markiert ist.
  39. Verfahren nach Anspruch 35, in welchem die Probe RNA-Moleküle umfasst, und das Verfahren weiterhin umfasst: (a) Doppelstrangbildung von Nucleinsäuremolekülprimern mit RNA-Molekülen in der Probe unter Bedingungen, bei denen Primer mit RNA-Molekülen, die das 200-Genprodukt kodieren, selektiv einen Doppelstrang bilden und in einer reversen Transkription der RNA-Moleküle in cDNA-Moleküle resultieren; und (b) Bestimmung, ob die cDNA-Moleküle amplifiziert wurden; oder (a) Hybridisierung der Nucleinsäuremolekülsonden mit den RNA-Molekülen in der Probe unter Bedingungen, die selektiv die Sonden an die Nucleinsäuremoleküle binden, welche das 200-Genprodukt kodieren; (b) Abtrennen der nicht hybridisierten Nucleinsäuresonden von den RNA-Molekülen in der Probe; und (c) Detektion der Anwesenheit von Nucleinsäuresonden, die an die RNA-Moleküle in der Probe hybridisiert sind.
  40. Verfahren zur Diagnose einer mit einer TH-Zell-Subpopulation verbundenen Immunstörung, umfassend die Detektion des Spiegels an 200-Genprodukt oder an RNA-Molekülen, welche das 200-Genprodukt kodieren, in einer Probe von einem Patienten, bei dem eine derartige Störung vermutet wird, so dass, wenn das detektierte Spiegel sich von dem der Kontrollprobe unterscheidet, eine mit einer TH-Zell-Subpopulation verbundene Störung diagnostiziert wird, wobei das 200-Genprodukt ist: (a) die Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 24; (b) die Aminosäuresequenz, die durch die Nucleotidsequenz von SEQ ID NO: 23 kodiert wird; (c) die Aminosäuresequenz, die durch den cDNA-Einschub des Klons codiert wird, der in den Klonen von E. coli enthalten ist, die unter der ATCC Accession Number 69967, wobei genannter cDNA-Einschub unter stringenten Bedingungen an ein Nucleinsäuremolekül hybridisiert, das ein Komplement einer Nucleinsäure ist mit der Nucleotidsequenz SEQ ID NO: 8 oder SEQ ID NO: 23, und wobei genannte stringente Bedingungen die Hybridisierung an filtergebundene DNA in 0,5 M NaHPO4, 7% Natriumlaurylsulfat (SDS), 1 mM EDTA bei 65°C, und waschen in 0,1 × SSC/0,1% SDS bei 68°C umfassen; (d) Aminosäurereste 1 bis 20 von SEQ ID NO: 24; (e) Aminosäurereste 1 bis 200 von SEQ ID NO: 24; (f) Aminosäurereste 201 bis 224 von SEQ ID NO: 24; (g) Aminosäurereste 225 bis 301 von SEQ ID NO: 24; (h) Aminosäurereste 30 bis 128 von SEQ ID NO: 24; oder (i) eine Aminosäuresequenz, welche durch eine Nucleotidsequenz kodiert wird, die unter stringenten Bedingungen an das Komplement der Nucleotidsequenz von SEQ ID NO: 23 oder einem Teil davon hybridisiert, wobei die genannten stringenten Bedingungen die Hybridisierung an filtergebundene DNA in 0,5 M NaHPO4, 7% Natriumlaurylsulfat (SDS), 1 mM EDTA bei 65°C, und Waschen in 0,1 × SSC/0,1% SDS bei 68°C umfassen.
  41. Verfahren nach Anspruch 40, in welchem die mit einer TH-Zell-Subpopulation verbundene Immunstörung eine mit einer TH1-Zell-Subpopulation verbundene Immunstörung ist.
  42. Verfahren nach Anspruch 41, in welchem die mit einer TH1-Zell-Subpopulation verbundene Immunstörung Multiple Sklerose, Psoriasis oder eine Insulin-abhängige Diabetes ist.
  43. Verfahren nach Anspruch 41, in welchem das Spiegel an 200-Genprodukt in der Patientenprobe durch Bindung des Genprodukts an einen Antikörper detektiert wird, der gegen das 200-Genprodukt gerichtet ist.
  44. Verfahren nach Anspruch 43, in welchem der Antikörper direkt oder indirekt markiert ist.
  45. Verfahren nach Anspruch 41, in welchem die Patientenprobe RNA-Moleküle umfasst, und das Verfahren weiterhin umfasst: (a) Doppelstrangbildung von Nucleinsäuremolekülprimern mit RNA-Molekülen in der Probe unter Bedingungen, bei denen die Primer mit RNA-Molekülen, die das 200-Genprodukt kodieren, selektiv einen Doppelstrang bilden und in einer reversen Transkription der RNA-Moleküle in cDNA-Moleküle resultieren; (b) Doppelstrangbildung der Nucleinsäuremolekülprimer mit cDNA-Molekülen unter Bedingungen, die selektiv cDNA-Moleküle amplifizieren; und (c) Detektion des Spiegels an cDNA-Molekülen, die das 200-Genprodukt kodieren, das amplifiziert wurde, so dass, wenn sich der Spiegel der cDNA, der aus der Patientenprobe amplifiziert wurde, im Vergleich zum Spiegel, der aus einer Kontrollprobe amplifiziert wurde, unterscheidet, eine mit einer TH-Zell-Subpopulation verbundene Immunstörung diagnostiziert wird; oder (a) Hybridisierung der Nucleinsäuremolekülsonden mit den RNA-Molekülen in der Probe unter Bedingungen, die selektiv die Sonden an die Nucleinsäuremoleküle binden, welche das 200-Genprodukt kodieren; und (b) Detektion des Spiegels an Nucleinsäuresonden, die an die RNA-Moleküle der Probe hybridisiert wurden, so dass, wenn sich der Spiegel der RNA in der Patientenprobe im Vergleich zum in der Kontrollprobe detektierten Spiegel unterscheidet, eine mit einer TH-Zell-Subpopulation verbundene Immunstörung diagnostiziert wird.
  46. Verfahren zur Identifizierung einer Testverbindung, die an das 200-Genprodukt bindet und/oder die Aktivität des 200-Genprodukts anpasst, umfassend: (a) In-Kontakt-Bringen einer Testverbindung mit einem 200-Genprodukt für eine Zeit, die für eine Bindung an das Produkt und die Bildung eines 200-Genprodukt/Verbindungs-Komplexes ausreicht; (b) Entfernen ungebundener Testverbindung; und (c) Detektion des Komplexes; wobei das 200-Genprodukt umfasst: (i) die Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 10 oder SEQ ID NO: 24; (ii) die Aminosäuresequenz, die durch die Nucleotidsequenz von SEQ ID NO: 8 oder SEQ ID NO: 23 kodiert wird; (iii) die Aminosäuresequenz, die durch den cDNA-Einschub kodiert wird, der in den Klonen von E. coli enthalten ist, die unter der NRRL Accession Number B-21415, der NRRL Accession Number B-21457, der NRRL Accession Number B-21395, oder der ATCC Accession Number 69967 hinterlegt sind, wobei genannter cDNA-Einschub unter stringenten Bedingungen an ein Nucleinsäuremolekül hybridisiert, das ein Komplement einer Nucleinsäure mit der Nucleotidsequenz SEQ ID NO: 8 oder SEQ ID NO: 23 ist, und wobei genannte stringente Bedingungen die Hybridisierung an filtergebundene DNA in 0,5 M NaHPO4, 7% Natriumlaurylsulfat (SDS), 1 mM EDTA bei 65°C, und Waschen in 0,1 × SSC/0,1% SDS bei 68°C umfassen; (iv) eine Aminosäuresequenz, welche durch eine Nucleotidsequenz kodiert wird, die unter stringenten Bedingungen an das Komplement der Nucleotidsequenz von SEQ ID NO: 8 oder SEQ ID NO: 23 hybridisiert, wobei die genannten stringenten Bedingungen die Hybridisierung an filtergebundene DNA in 0,5 M NaHPO4, 7% Natriumlaurylsulfat (SDS), 1 mM EDTA bei 65°C, und Waschen in 0,1 × SSC/0,1% SDS bei 68°C umfassen; oder (v) die Aminosäuresequenz, die durch die Nucleotidsequenz kodiert wird, die unter stringenten Bedingungen mit dem Komplement des cDNA-Einschubs der Klone von E. coli hybridisiert wird, die unter der NRRL Accession Number B-21415, der NRRL Accession Number B-21457, der NRRL Accession Number B-21395, oder der ATCC Accession Number 69967 hinterlegt sind, wobei genannter cDNA-Einschub unter stringenten Bedingungen mit einem Nucleinsäuremolekül hybridisiert, das ein Komplement einer Nucleinsäure mit der Nucleotidsequenz SEQ ID NO: 8 oder SEQ ID NO: 23 ist, und wobei genannte stringente Bedingungen die Hybridisierung an filtergebundene DNA in 0,5 M NaHPO4, 7% Natriumlaurylsulfat (SDS), 1 mM EDTA bei 65°C, und Waschen in 0,1 × SSC/0,1% SDS bei 68°C umfassen; so dass, wenn ein 200-Genprodukt/Verbindungs-Komplex in (c) detektiert wird, eine Testverbindung, die an ein 200-Genprodukt bindet, identifiziert wird.
  47. Verfahren nach Anspruch 46, in welchem das 200-Genprodukt ein isoliertes 200-Genprodukt, ein 200-Genprodukt, das in einer Zelle exprimiert wird, die für die Expression eines 200-Genprodukt verändert wurde, oder ein 200-Genprodukt, das in einer Zelle exprimiert wird, die natürlicherweise ein 200-Genprodukt exprimiert.
  48. Verfahren nach Anspruch 46, in welchem das 200-Genprodukt und eine Testverbindung über einen für eine Komplexbildung ausreichenden Zeitraum in einer Zelle co-exprimiert werden.
  49. Verfahren nach Anspruch 46, in welchem das 200-Genprodukt und/oder die Testverbindung auf einer festen Oberfläche immobilisiert werden.
  50. Verfahren nach Anspruch 46, in welchem das 200-Genprodukt und/oder die Testverbindung direkt oder indirekt markiert werden.
  51. Verfahren nach Anspruch 46, in welchem der 200-Genprodukt/Verbindungs-Komplex auf einer festen Oberfläche immobilisiert werden.
  52. Verfahren nach Anspruch 46, in welchem die Testverbindung ein Antikörper oder ein Epitop-bindendes Fragment davon ist.
  53. Verfahren nach Anspruch 46, in welchem die Testverbindung ein kleines organisches Molekül ist.
  54. Verfahren nach Anspruch 48, in welchem der Komplex die Expression einer Reportergensequenz in der rekombinanten Zelle antreibt, und der Komplex durch Detektion der Reportergensequenzexpression detektiert wird.
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