DE69636824T2

DE69636824T2 - Terminal-sterilisierte osteogene Vorrichtungen und ihre Herstellung

Info

Publication number: DE69636824T2
Application number: DE69636824T
Authority: DE
Inventors: Marjorie M. Holliston Tucker; David C. Southborough Rueger; Kuber T. Medway Sampath
Original assignee: Stryker Corp
Current assignee: Stryker Corp
Priority date: 1995-06-07
Filing date: 1996-06-07
Publication date: 2007-11-08
Anticipated expiration: 2016-06-08
Also published as: EP0837701B1; US6013856A; DE69626205D1; AU6333596A; WO1996040297A1; JP3483870B2; AU714963B2; DE69636824D1; US5674292A; JP3430474B2; EP1334733A2; JPH11506360A; US6461630B1; EP0837701A1; US6028242A; ATE232401T1; DE69626205T2; US6504079B2; US20020106394A1; EP1334733A3

Description

Technisches Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft allgemein das Gebiet knochenbildender Vorrichtungen und betrifft insbesondere terminal sterilisierte knochenbildende Vorrichtungen, die dazu in der Lage sind, eine Knochenbildung im Anschluss an eine Implantation in ein Säugetier zu induzieren.
Ausgangspunkt der Erfindung
Therapeutische Vorrichtungen und insbesondere osteogene bzw. knochenbildende Vorrichtungen werden typischerweise vor ihrer Implantation in einen beabsichtigten Empfänger sterilisiert. Eine Sterilisation ist erforderlich, um sicherzustellen, dass die Vorrichtungen keine potentiellen Pathogene oder andere biologisch infektiöse Mittel in den beabsichtigten Empfänger einbringen. Knochenbildende Vorrichtungen, die ein knochenbildendes Protein in Kombination mit einem unlöslichen Trägermaterial umfassen, sind zum Induzieren einer Knochenbildung an einem vorher ausgewählten Ort von Nutzen, beispielsweise am Ort einer Knochenfraktur in einem Säugetier, von Nutzen. Bis jetzt wurde das Trägermaterial und das knochenbildende Protein typischerweise separat sterilisiert und danach zur Erzeugung einer sterilen implantierbaren Vorrichtung kombiniert. Dieses Verfahren kann jedoch die Sterilität der sich ergebenden Vorrichtung nicht garantieren.
Das am meisten erwünschte Verfahren zum Sterilisieren einer Vorrichtung, die zwei oder mehrere Bestandteile umfasst, erfolgt durch einen Prozess, der in der Technik als „terminale Sterilisation" bezeichnet wird. Durch diesen Prozess wird die Vorrichtung im Anschluss an die Formulierung sterilisiert, d. h. nachdem alle Bestandteile miteinander in der Vorrichtung kombiniert wurden. Eine Vielzahl physikalischer oder chemischer Verfahren wurden zur Verwendung in der terminalen Sterilisation entwickelt und schließen beispielsweise die Exposition gegenüber Chemikalien oder Wärme oder die Exposition gegenüber einer ionisierenden oder nicht-ionisierenden Strahlung ein. Diese Verfahren können jedoch inhärente Probleme aufweisen.
Beispielsweise können chemische Reagenzien, die in der chemischen Sterilisation von Nutzen sind, oder deren Reaktionsnebenprodukte für den beabsichtigten Empfänger gefährlich sein.
Demgemäß müssen derartige Chemikalien vor der Implantation der Vorrichtungen entfernt werden. Ethylenoxid und Formaldehyd sind Reagenzien, die üblicherweise als Sterilisationsreagenzien verwendet werden. Jedoch sind beide Alkylierungsmittel und können deswegen biologisch aktive Moleküle modifizieren und inaktivieren. Zusätzlich sind diese beiden Chemikalien Karzinogene und Mutagene (Davis et al., (1973) „Microbiology, 2. Ausg.", Harper und Row, Herausgeber). In ähnlicher Weise ist, wenn die Vorrichtung ein biologisch aktives Protein erfordert, das Exponieren der Vorrichtung gegenüber erhöhten Temperaturen nicht wünschenswert, weil die Proteine denaturiert und anschließend durch Exposition gegenüber Hitze inaktiviert werden können. Obwohl die Sterilisation der Objekte durch Exposition gegenüber ionisierender und nicht-ionisierender Strahlung die Notwendigkeit des Zusetzens potentiell toxischer Chemikalien vermeidet, sind die Strahlungsenergie und/oder ihre Nebenprodukte, einschließlich freier Sauerstoffradikale, dazu in der Lage, die Proteinkonformation zu modifizieren, und somit können sie das Protein schädigen oder inaktivieren. Zusätzlich kann die Exposition einiger medizinisch wichtiger Polymere, beispielsweise Polyurethan oder Polymethylmethacrylat, gegenüber Gammastrahlung eine physikalische Sofort- und Langzeitveränderung des Polymers zur Folge haben.
Ijiri et al., J. Orthopedic Res., 12(5), 1994, Seiten 628-636, beschreiben den Effekt der Sterilisation auf knochenmorphogenes Protein, insbesondere die Wirkung von Ethylenoxid und Gammabestrahlung. Zusätzlich wird eine Vorrichtung, die eine Collagen-basierte Matrix als Träger für knochenmorphogenes Protein umfasst, beschrieben.
Es ist deswegen eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, eine terminal sterilisierte knochenbildende Vorrichtung bereitzustellen, die, wenn sie an einem vorher ausgewählten Ort einem Säugetier implantiert wird, dazu in der Lage ist, Knochen am Ort zu erzeugen. Es ist eine weitere Aufgabe, ein allgemeines Verfahren zum terminalen Sterilisieren von knochenbildenden Vorrichtungen bereitzustellen, ohne die biologische Aktivität und/oder Biokompatibilität der Vorrichtung zu beeinträchtigen. Es ist eine weitere Aufgabe der vorliegenden Er findung, ein Verfahren zum Induzieren einer Knochenbildung an einem vorher ausgewählten Ort in einem Säugetier unter Verwendung einer terminal sterilisierten Vorrichtung der Erfindung bereitzustellen.
Diese und weitere Aufgaben und Merkmale der Erfindung werden aus der Beschreibung, den Zeichnungen und den Ansprüchen, die nunmehr folgen, offensichtlich werden.
Zusammenfassung der Erfindung
Es hat sich nunmehr herausgestellt, dass eine terminal sterilisierte therapeutische Vorrichtung, insbesondere eine knochenbildende Vorrichtung, die ein biologisch aktives Protein umfasst, beispielsweise ein knochenbildendes Protein, in Kombination mit einem unlöslichen Trägermaterial, wenn es durch Exposition gegenüber ionisierender Bestrahlung sterilisiert wird, dazu in der Lage ist, eine Knochen- und/oder Knorpelbildung zu induzieren, wenn es einem Säugetier implantiert wird. Diese Erkenntnis ist unerwartet, weil bekannt ist, dass die Exposition biologisch aktiver Proteine gegenüber einer ionisierenden Bestrahlung eine chemische Modifikation und Inaktivierung des Proteins zur Folge haben kann.
Gemäß ihres breitesten Aspektes stellt die vorliegende Erfindung eine sterilisierte knochenbildende Vorrichtung bereit, die in Kombination Folgendes umfasst: (a) Teilchen einer biokompatiblen, in vivo biologisch abbaubaren synthetischen Polymermatrix; und (b) ein isoliertes, biologisch aktives knochenbildendes Protein, das in der Polymermatrix dispergiert ist oder auf deren Oberfläche abgelagert ist und das dazu in der Lage ist, eine Ersatzknochenbildung oder Gelenkknorpelbildung zu induzieren, wenn sie einem Säugetier implantiert wird, wobei die Vorrichtung im Anschluss an eine Kombination des Polymers und des knochenbildenden Proteins durch Exposition gegenüber einer ionisierenden Bestrahlung in einer Umgebung, die keine Luft enthält, sterilisiert wird.
Der Begriff „Sterilisation", wie hierin verwendet, betrifft eine Handlung oder einen Prozess unter Verwendung entweder physikalischer oder chemischer Mittel zum Eliminieren im Wesentlichen aller lebensfähigen Organismen, insbesondere von Mikroorganismen, Viren und anderen Pathogenen, die mit einer knochenbildenden Vorrichtung assoziiert sind. Wie hierin verwendet, sollen sterilisierte Vorrichtungen Vorrichtungen einschließen, die ein Sterilitätssicherheitsniveau von 10^–6 erreichen, wie es von den FDA-(Federal Drug Administration)- Standards festgelegt ist. Der Begriff „terminale Sterilisation", wie hierin verwendet, betrifft den letzten Schritt in der Herstellung der Vorrichtung der Erfindung, wobei das unlösliche Trägermaterial sterilisiert wird, nachdem es mit dem knochenbildenden Protein kombiniert wird. Der Begriff „ionisierende Strahlung", wie hierin verwendet, betrifft Teilchen oder Photonen, die ausreichend Energie aufweisen, um eine Ionisierung direkt in ihrem Durchgang durch eine Substanz zu erzeugen, beispielsweise die hierin betrachtete therapeutische Vorrichtung.
Der Begriff „knochenbildende Vorrichtung", wie hierin verwendet, betrifft irgendeine Vorrichtung mit der Fähigkeit, wenn sie einem Säugetier implantiert wird, eine Knochenbildung zu induzieren. Die hierin beschriebene Vorrichtung ist ebenfalls dazu in der Lage, eine Gelenkknorpelbildung zu induzieren, wenn sie an einem avaskulären Ort in einem Säugetier implantiert wird, wie beispielsweise an der Oberfläche von subchondralem Knochen in einer Synovial-Gelenkumgebung. Wie hierin verwendet, betrifft der Begriff „Knochen" kalzifiziertes (mineralisiertes) Bindegewebe, das in erster Linie einen Verbundstoff aus abgelagertem Calcium und Phosphat in Form von Hydroxyapatit-Collagen (vorherrschend Typ-I-Collagen) und Knochenzellen, wie beispielsweise Osteoblasten, Osteozyten und Osteoklasten umfasst, ebenso wie das Knochenmarksgewebe, das sich im Inneren des echten Ersatzknochens bildet.
Wie hierin verwendet, betrifft der Begriff „Knorpel" einen Typ eines Bindegewebes, das Knorpelzellen bzw. Chondrozyten in einem extrazellulären Netzwerk eingebettet enthält, das Fibrillen von Collagen (in erster Linie Typ-II-Collagen zusammen mit anderen geringfügigeren Typen, beispielsweise Typen IX und XI), verschiedene Proteoglycane (beispielsweise Chondroitinsulfat-, Keratinsulfat- und Dermatansulfatproteoglycane), andere Proteine und Wasser umfasst. „Gelenkknorpel" betrifft Hyalin oder Gelenkknorpel, ein avaskuläres, nicht-mineralisiertes Gewebe, das die Gelenkoberflächen der Knochen in den Gelenken bedeckt und die Bewegung in den Gelenken ohne direkten Knochen-zu-Knochen-Kontakt ermöglicht und dabei eine Abnutzung und Schädigung gegenüberliegender Knochenoberflächen verhindert. Der normalste gesunde Gelenkknorpel wird als „Hyalin" bezeichnet, d. h. er hat die charakteristische Erscheinung von Milchglas. Unter physiologischen Bedingungen verbleibt Gelenkknorpelgewebe auf der darunterliegenden mineralisierten Knochenoberfläche, dem subchondralen Knochen, der in hohem Maße vaskularisierte Ossikeln enthält. Diese in hohem Maße vaskularisierten Ossikeln können diffundierbare Nährstoffe an den darüberliegenden Knorpel bereitstellen, jedoch nicht an mesenchymale Stammzellen.
Wie hierin verwendet, soll der Begriff „knochenbildendes Protein" jedes Protein bedeuten, das zur Erzeugung einer Entwicklungskaskade zellulärer Ereignisse in der Lage ist, wenn es einem Säugetier implantiert wird, die eine Ersatzknochenbildung zur Folge haben. Die Entwicklungskaskade tritt während der Ersatzknochendifferenzierung auf und besteht aus der Chemotaxis der mesenchymalen Zellen, der Proliferation von Vorläuferzellen zu Chondrozyten bzw. Knorpelzellen und Osteoblasten, der Differenzierung von Knorpel, der Gefäßinvasion, Knochenbildung, Remodellierung und letztendlich der Marksdifferenzierung. Echte knochenbildende Faktoren, die zum Induzieren der oben beschriebenen Kaskade von Ereignissen in der Lage sind, die eine Ersatzknochenbildung zur Folge hat, wurden nunmehr identifiziert, isoliert und kloniert. Diese Proteine, die in der Natur als Disulfid-verbrückte dimere Proteine auftreten, werden in der Technik als „knochenbildende" Proteine, „osteoinduktive" Proteine und „knochenmorphogene" Proteine bezeichnet. Knochenbildendes Protein kann beispielsweise jedes der bekannten knochenmorphogenetischen Proteine und/oder Äquivalente hiervon sein, die in der Technik und/oder hierin beschrieben sind, und Material aus natürlicher Quelle, rekombinantes Material und irgendein Material einschließen, das in anderer Weise erzeugt wurde, und das dazu in der Lage ist, eine Gewebsmorphogenese zu induzieren. Knochenbildendes Protein, wie hierin definiert, ist ebenfalls dazu in der Lage, die Gelenkknorpelbildung an einem geeigneten avaskulären Ort in vivo zu induzieren.
Wie hierin verwendet, soll der Begriff „Trägermaterial" ein Material bedeuten, das Zwischenräume zur Anlagerung, Proliferation und Differenzierung infiltrierender Zellen aufweist. Es ist in vivo biodegradierbar bzw. biologisch abbaubar und ist biokompatibel. Das heißt, es ist ausreichend frei von antigenen Reizen, die eine Transplantatabstoßung zur Folge haben können. Vorzugsweise umfasst der Träger unlösliches Material und ist weiterhin so formuliert, dass er eine Formungsdimension aufweist, die, wenn sie implantiert wird, im Wesentlichen diejenige von Ersatzknochen oder erwünschtem Knorpelgewebe nachahmt. Der Träger umfasst weiterhin Reste, die für das zu ersetzende Gewebe spezifisch sind und/oder aus demselben Gewebstyp abgeleitet sind.
Das Gewichtsverhältnis von osteogenem bzw. knochenbildendem Protein zu Trägermaterial kann im Bereich von ungefähr 1 : 1 bis ungefähr 1 : 250.000 liegen (beispielsweise von ungefähr 1 mg Protein : 1 mg Träger bis ungefähr 4 ng Protein : 1 mg Träger) und liegt am meisten bevorzugt im Bereich von ungefähr 1 : 40 bis ungefähr 1 : 50.000 (beispielsweise von ungefähr 25 µg Protein : 1 mg Träger bis ungefähr 20 ng Protein : 1 mg Träger).
In einer Ausführungsform ist die ionisierende Strahlung ein Elektronenstrahl. In einer weiteren Ausführungsform ist die Gammastrahlung die bevorzugte Quelle der ionisierenden Strahlung. Es wird ins Auge gefasst, dass jegliche herkömmliche Gammastrahlungs- oder Elektronenstrahl-erzeugende Vorrichtung in der Ausübung der Erfindung verwendet werden kann. Weiterhin wird die bevorzugte Dosierung der ionisierenden Strahlung im Bereich von ungefähr 0,5 bis ungefähr 4,0 Megarad bereitgestellt und liegt am meisten bevorzugt innerhalb des Bereichs von ungefähr 2,0 bis ungefähr 3,5 Megarad, was Dosen sind, die ausreichend sind, um die Sterilitätssicherheitsniveaus von 10^–6 der FDA für die hierin beschriebenen Vorrichtungen sicherzustellen. Die zur Erzielung eines Sterilitätssicherheitsniveaus von 10^–6 für eine spezielle Vorrichtung erforderlichen Dosierungen können jedoch aus den „Association for the Advancement of Medical Instrumentation Guidelines", veröffentlicht 1992, bestimmt werden, deren Offenbarung durch diese Bezugnahme hierin mit aufgenommen ist.
Das unlösliche Trägermaterial kann ein poröses Material umfassen, das weiterhin teilchenförmig sein kann. Die Poren weisen vorzugsweise Dimensionen auf, die ausreichend sind, um den Eintritt und die anschließende Differenzierung und Proliferation migratorischer Vorläuferzellen in die Matrices zu ermöglichen. Alternativ kann das unlösliche Trägermaterial durch enges Packen des teilchenförmigen Materials in eine Form, die für die beabsichtigte Anwendung in vivo geeignet ist, beispielsweise zum Überbrücken von Knochendefekten, hergestellt sein. Die porösen Teilchen oder die gepackten Teilchen weisen vorzugsweise eine Teilchengröße im Bereich von ungefähr 70 bis ungefähr 850 µm, und am meisten bevorzugt im Bereich von ungefähr 125 bis ungefähr 450 µm auf. In einer weiteren Ausführungsform wird das Trägermaterial als Teil einer Gelenkknorpel-Vorrichtung formuliert. Die Vorrichtung kann aus devitalisiertem Knorpelgewebe gebildet werden oder aus anderem inerten, nicht-mineralisiertem Matrixmaterial und knochenbildendem Protein, und die Vorrichtung kann dann auf die subchondrale Knochenoberfläche als Blatt bzw. Folie aufgelagert werden. Alternativ kann eine formulierte Vorrichtung pulverisiert oder in anderer Weise mechanisch abgeschliffen bzw. abgeschabt werden, um Teilchen zu erzeugen, die zu einer Paste oder einem Gel formuliert werden können, wie es hierin beschrieben ist, zur Aufbringung auf die Knochenoberfläche.
Das unlösliche Trägermaterial kann ein nicht-Protein-basiertes Polymer umfassen, beispielsweise ein synthetisches Polymer, das Polymilchsäure, Polybuttersäure, Polyglycolsäure und/oder Gemische hiervon umfasst; und/oder ein oder mehrere natürlich abgeleitete Moleküle, beispielsweise Hydroxyapatit, Tricalciumphosphat, Collagen und Gemische hiervon. Collagen ist gegenwärtig ein bevorzugtes Trägermaterial. Eine Person mit durchschnittlichem Fachwissen kann durch vernünftige Auswahl natürlicher und/oder synthetischer Materialien Polymermatrices erzeugen, die die erwünschten in vivo physikalischen und chemischen Eigenschaften aufweisen. Beispielsweise kann autologes Collagen mit synthetischen Polymeren, einschließlich Copolymeren, vermischt werden, um eine Matrix mit einer verbesserten in vivo Biodegradationsrate bzw. Geschwindigkeit zu erzeugen und/oder um die bevorzugten Handhabungsqualitäten zu verbessern, die die Vorrichtung der Erfindung während der Implantation einfacher handzuhaben machen. Beispielsweise können teilchenförmiges Collagen enthaltende Vorrichtungen mit ein oder mehreren Bestandteilen kombiniert werden, die dazu dienen, die Teilchen in einer pastenartigen oder gelartigen Substanz zu binden. Bindungsmaterialien, die in der Technik wohlcharakterisiert sind, schließen beispielsweise Carboxymethylcellulose, Glycerol, Polyethylenglycol und dergleichen ein. Alternativ kann die Vorrichtung osteogenes Protein umfassen, dispergiert in einer synthetischen Matrix, die die erwünschten physikalischen Eigenschaften bereitstellt.
Das in den Verfahren und Vorrichtungen der vorliegenden Erfindung nützliche knochenbildende Protein ist, gleichgültig, ob natürlich vorkommend oder synthetisch hergestellt, dazu in der Lage, die Rekrutierung zugänglicher Vorläuferzellen und die Stimulierung ihrer Proliferation, die Induzierung der Differenzierung zu Knorpelzellen und Osteoblasten und die weitere Induzierung einer Differenzierung von intermediärem Knorpel, eine Vaskularisierung, Knochenbildung, Umformung und letztendlich Marksdifferenzierung zu induzieren, wenn sie einem Säugetier implantiert wird. Das Protein ist ebenfalls dazu in der Lage, eine neue Gelenkknorpel-Gewebsbildung auf einer subchondralen Knochenoberfläche zu induzieren, wenn sie in einer geeigneten örtlichen Umgebung bereitgestellt wird.
Bevorzugte knochenbildende Proteine schließen beispielsweise Homo- oder Heterodimere von OP-1, OP-2, BMP-2, BMP-3, BMP-4, BMP-5, BMP-6 oder funktionellen Äquivalenten hiervon ein. Diese Proteine werden in der Technik als Mitglieder der „Vg/dpp"-Proteinunterfamilie der TGF-β-Supergenfamilie bezeichnet.
In einem weiteren Aspekt stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung einer sterilisierten knochenbildenden Vorrichtung zur Implantation in ein Säugetier bereit, das die folgenden Schritte umfasst: (a) Bereitstellen einer knochenbildenden Vorrichtung in einer von Luft depletierten Umgebung, umfassend in Kombination Teilchen aus einer biokompatiblen, in vivo biologisch abbaubaren synthetischen Polymermatrix und ein isoliertes, biologisch aktives knochenbildendes Protein, das in der Polymermatrix dispergiert ist oder auf deren Oberflächen abgelagert ist und dazu in der Lage ist, eine Ersatzknochenbildung oder Gelenkknorpelbildung zu induzieren, wenn sie einem Säugetier implantiert wird, und (b) Exponieren der knochenbildenden Vorrichtung aus Schritt (a) gegenüber einer ionisierenden Strahlung in einer Menge, die ausreichend ist, um die Vorrichtung zu sterilisieren, während die biologische Aktivität des Proteins aufrechterhalten wird, um eine sterilisierte osteogene Vorrichtung zu erzeugen, die dazu in der Lage ist, eine Ersatzknochenbildung oder Gelenkknorpelbildung in einem Säugetier zu induzieren.
In einem weiteren Aspekt stellt die vorliegende Erfindung die Verwendung einer sterilisierten knochenbildenden Vorrichtung bereit, umfassend in Kombination: (a) Teilchen aus einer biokompatiblen, in vivo biologisch abbaubaren synthetischen Polymermatrix; und (b) ein isoliertes, biologisch aktives knochenbildendes Protein, das in der Polymermatrix dispergiert ist oder auf deren Oberflächen abgelagert ist und das dazu in der Lage ist, eine Ersatzknochenbildung oder Gelenkknorpelbildung zu induzieren, wenn es einem Säugetier implantiert wird, wobei die Vorrichtung im Anschluss an die Kombinierung des Polymers und des knochenbildenden Proteins durch Exposition gegenüber einer ionisierenden Strahlung in einer Umgebung sterilisiert wird, die frei von Luft ist, zur Herstellung einer Vorrichtung zum Induzieren eines Ersatzknochens oder einer Gelenkknorpelbildung in einem vorher ausgewählten Ort in einem Säugetier.
Das Verfahren ist rasch, sanft, und wird unter Verwendung herkömmlicher Strahlungsvorrichtungen durchgeführt.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
Die vorhergehenden und andere Aufgaben der Erfindung, deren verschiedene Merkmale ebenso wie die Erfindung selbst werden durch die nachfolgende Beschreibung besser verständlich, wenn sie zusammen mit der begleitenden Zeichnung gelesen werden, in der:
1 eine graphische Darstellung ist, die die Fähigkeit von Proben darstellt, die aus bestrahlten und nicht-bestrahlten knochenbildenden Vorrichtungen extrahiert wurden, um eine alkalische Phosphatase-Aktivität in einem Rattenosteoblasten-Zellassay zu stimulieren. Die Spur mit den ausgefüllten Dreiecken beschreibt eine Probe, die aus einer Kontrollmatrix extrahiert wurde, die OP-1 nicht enthält; die Spur mit den ausgefüllten Quadraten beschreibt eine Probe von unbehandeltem OP-1; die Spur, die Kreuze aufweist, beschreibt eine Probe, die aus einer ersten, nicht-bestrahltes OP-1 enthaltenden Vorrichtung extrahiert wurde; die Spur mit den Sternchen zeigt eine Probe, die aus der ersten bestrahlten OP-1 enthaltenden Vorrichtung extrahiert wurde; die Spur mit den nicht-ausgefüllten Quadraten zeigt eine Probe, die aus einer zweiten, nicht-bestrahlten OP-1 enthaltenden Vorrichtung extrahiert wurde; und die Spur mit den rotierten Kreuzen beschreibt eine Probe, die aus einer zweiten, nicht-bestrahltes OP-1 enthaltenden Vorrichtung extrahiert wurde; und die Spur mit den rotierten Kreuzen beschreibt eine Probe, die aus der zweiten, bestrahltes OP-1 enthaltenden Vorrichtung extrahiert wurde.
Ausführliche Beschreibung der Erfindung
Es hat sich nunmehr herausgestellt, dass eine osteogene Vorrichtung, die terminal durch Exposition gegenüber ionisierender Strahlung sterilisiert wurde und die ein osteogenes Protein in Kombination mit einem Trägermaterial umfasst, ihre biologische Aktivität nach Sterilisierung beibehält und dazu in der Lage ist, eine Ersatzknochenbildung und/oder Knorpelbildung zu induzieren, wenn sie einem Säugetier implantiert wird. Die Entdeckung ist unerwartet, weil eine ionisierende Strahlung die Proteinstruktur modifizieren kann, wodurch die biologische Aktivität zerstört wird.
Das allgemeine hierin beschriebene Verfahren stellt die Sterilität der osteogenen Vorrichtung sicher, während die biologische Aktivität des osteogenen Proteins, das in der Vorrichtung enthalten ist, aufrechterhalten wird. Das Verfahren involviert die Schritte des Kombinierens eines unlöslichen Trägermaterials und eines biologisch aktiven osteogenen Proteins und danach das terminale Sterilisieren der Kombination durch Exposition gegenüber ionisierender Strahlung, wodurch eine sterile Vorrichtung erzeugt wird, die eine Knochenbildung im An schluss an die Implantation in ein Säugetier induziert. Das Verfahren kann für eine Vielzahl osteogener Proteine, Trägermatrices und Formulierungen hiervon verwendet werden. Das Verfahren kann ebenfalls dazu verwendet werden, Vorrichtungen zu erzeugen, die dazu in der Lage sind, eine Gelenkknorpelbildung an einem avaskulären Ort in vivo zu induzieren.
Die Herstellung von terminal sterilisierten osteogenen Vorrichtungen mit einer Knochen- und Gelenkknorpel bildenden Aktivität in vivo, geeignete osteogene Proteine, die Art und Eigenschaften des Trägermaterials, Behandlungen zur Minimierung einer Proteinmodifikation, Bedingungen, die eine terminale Sterilisierung ermöglichen, und weitere Materialaspekte, die die Art und Nützlichkeit der Erfindung betreffen, einschließlich wie der hierin beanspruchte Gegenstand herzustellen und zu verwenden ist, werden aus dem Folgenden klarer werden.
I. Osteogene Proteine
Wie hierin verwendet, schließen die osteogenen Proteine, die in der Zusammensetzung und in den Verfahren der Erfindung von Nutzen sind, die Familie dimerer Proteine ein, die eine Ersatzknochenaktivität aufweisen, wenn sie einem Säugetier in Verbindung mit einer Matrix implantiert werden, und die eine Unterklasse der „Superfamilie" von „TGF-β-artigen" Proteine umfassen. Osteogene Proteine aus natürlicher Quelle in ihrer reifen, nativen Form, sind ein glycosyliertes Dimer, das typischerweise ein scheinbares Molekulargewicht von ungefähr 30 bis 36 kDa aufweisen, wie es durch SDS-PAGE bestimmt wurde. Wenn es reduziert ist, lässt das 30-kDa-Protein zwei glycosylierte Peptid-Untereinheiten entstehen, die apparente bzw. scheinbare Molekulargewichte von ungefähr 16 kDa und 18 kDa aufweisen. Im reduzierten Zustand weist das Protein keine nachweisbare osteogene Aktivität auf. Das unglycosylierte Protein-Dimer, das ebenfalls eine osteogene Aktivität aufweist, weist ein apparentes Molekulargewicht von ungefähr 27 kDa auf. Wenn es reduziert ist, lässt das 27-kDA-Protein zwei unglycosylierte Polypeptide mit Molekulargewichten von ungefähr 14 kDa bis 16 kDa entstehen. Nützliche Sequenzen, einschließlich solcher, die die C-terminalen 102 Aminosäuresequenzen von DPP (von Drosophila), Vgl (von Xenopus), Vgr-1 (von der Maus), die OP-1- und OP-2-Proteine (siehe US-Patent Nr. 5011691), ebenso wie die als BMP2, BMP3, BMP4 (siehe WO88/00205, US-Patent Nr. 5013649) und WO91/18098), BMP5 und BMP6 (siehe WO90/11366, PCT/US90/01630), BMP8 und BMP9 bezeichneten Proteine umfassen.
Die Mitglieder dieser Proteinfamilie teilen ein konserviertes 6- oder 7-Cystein-Skelett im C-terminalen Bereich. Siehe beispielsweise die Reste 335-431 von SEQ ID NO:1 in US 5266683 , deren Offenbarung durch diese Bezugnahme hierin mit aufgenommen ist, die die 6-Cystein-Skelettreste definiert, die hierin als „OPS" bezeichnet werden, oder die Reste 330-431 von SEQ ID NO:1 darin, umfassend 102 Aminosäuren, die das 7-Cystein-Skelett definiert.
Diese Familie von Proteinen schließt längere Formen eines gegebenen Proteins ein, ebenso wie phylogenetische Formen hiervon, beispielsweise Spezies- und Allel-Varianten, und biosynthetische Mutanten, einschließlich Additions- und Deletionsmutanten, und Varianten, wie beispielsweise solche, die das konservierte C-terminale Cystein-Skelett verändern können, vorausgesetzt, dass die Veränderung noch ermöglicht, dass das Protein eine dimere Spezies bildet, die eine Konformation aufweist, die zum Induzieren einer Knochenbildung in einem Säugetier in der Lage ist, wenn es dem Säugetier in Verbindung mit einer Matrix implantiert wird. Zusätzlich können die osteogenen Proteine, die in den Vorrichtungen dieser Erfindung von Nutzen sind, Formen einschließen, die variierende Glycosylierungsmuster und variierende N-Termini aufweisen. Die osteogenen Proteine können natürlich vorkommend oder biosynthetisch abgeleitet sein und können durch Expression rekombinanter DNA in prokaryontischen oder eukaryontischen Wirtszellen erzeugt werden. Die Proteine sind als einzelne Spezies aktiv, beispielsweise ein Homodimer, oder kombiniert als gemischte Spezies, beispielsweise ein Heterodimer.
In einer Ausführungsform umfasst das osteogene Protein, das hierin betrachtet wird, OP-1 oder eine OP-1-verwandte Sequenz. Nützliche OP-1-Sequenzen sind in US-Patent Nr. 5011691; 5018753 und 5266683; in Ozkaynak et al. (1990) EMBO J. 9: 2085-2093; und Sampath et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6004-6008 beschrieben, deren Offenbarungen durch diese Bezugnahme hierin mit aufgenommen sind. OP-1-verwandte Sequenzen schließen xenogene Homologe ein, beispielsweise: 60A von Drosophila (Wharton et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 9214-9218) und Proteine, die mehr als 60 % Identität mit OP-1 in der C-terminalen Sieben-Cystein-Domäne teilen, vorzugsweise eine zumindest 65%ige Identität. Beispiele für OP-1-verwandte Sequenzen schließen OP-2, BMP5, BMP6 und ihr Spezies-Homolog Vgr-1 ein (Lyons et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 4554-4558; Celeste et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 9843-9847; und die internationale PCT-Anmeldung WO93/00432; Ozkaynak et al. (1992) J. Biol. Chem. 267: 13198- 13205). Wie es durch den Durchschnittsfachmann erkannt wird, können chimere Konstrukte unter Verwendung von molekularbiologischer Standardtechniken und Mutagenesetechniken erzeugt werden, die verschiedene Anteile unterschiedlicher morphogener Proteinsequenzen kombinieren, um neue Sequenzen zu erzeugen, und diese Formen des Proteins werden hierin ebenfalls betrachtet.
In einem noch weiteren bevorzugten Aspekt werden ein oder beide der Polypeptidketten-Untereinheiten des Osteogen-aktiven Dimers durch eine Nukleinsäuresequenz codiert, die unter stringenten Hybridisierungsbedingungen an DNA- oder RNA-Sequenzen hybridisieren, die mit der Nukleinsäuresequenz, die den aktiven Bereich von OP-1 codiert, komplementär sind. Wie hierin verwendet, sind stringente Hybridisierungsbedingungen als Hybridisierung in 40 % Formamid, 5 X SSPE, 5 X Denhardt's Lösung und 0,1 % SDS bei 37° C über Nacht und Waschen in 0,1 X SSPE, 0,1 % SDS bei 50° C definiert.
Gegeben die vorhergehende Aminosäure und DNA-Sequenz-Information, der durchschnittliche Grad des Fachwissens und die Offenbarungen zahlreicher Veröffentlichungen bezüglich osteogener Proteine, einschließlich US-Patent Nr. 5011691 und der veröffentlichten PCT-Beschreibung US 89/01469 (veröffentlicht am 19. Oktober 1989), können verschiedene DNAs konstruiert werden, die zumindest die aktive Domäne eines osteogenen Proteins codieren, das in den Vorrichtungen dieser Erfindung nützlich ist, und verschiedene Analoga hiervon (einschließlich von Spezies- und Allel-Varianten und solchen, die gentechnisch veränderte Mutationen enthalten), ebenso wie Fusionsproteinen, trunkierten Formen der reifen Proteine, Deletions- und Additionsmutanten und ähnliche Konstrukte, die in den Vorrichtungen und Verfahren der Erfindung verwendet werden können. Darüber hinaus können DNA-Hybridisierungssonden aus Fragmenten jedes dieser Proteine abgeleitet oder de novo aus der generischen Sequenz entwickelt werden, die oben als OPS definiert wurde. Diese Sonden können zum Screening unterschiedlicher genomischer und cDNA-Bibliotheken verwendet werden, um zusätzliche osteogene Proteine zu identifizieren, die in den Prothesevorrichtungen dieser Erfindung von Nutzen sind.
Die DNAs können vom Fachmann auf dem Gebiet unter Verwendung wohlbekannter DNA-Manipulationstechniken erzeugt werden, die eine genomische und cDNA-Isolierung, Konstruktion synthetischer DNA aus synthetisierten Oligonukleotiden und Kassettenmutagenesetechniken einschließen. 15-100mer-Oligonukleotide können auf einem DNA-Synthesegerät synthetisiert und durch Polyacrylamid-Gelelektrophorese (PAGE) in Tris-Borat-EDTA-Puffer aufgereinigt werden. Die DNA kann dann aus dem Gel elektroeluiert werden. Überlappende Oligomere können durch T4-Polynukleotidkinase phosphoryliert und in größeren Blocks ligiert werden, die ebenfalls durch PAGE aufgereinigt werden können.
Die DNA aus in geeigneter Weise identifizierten Klonen kann dann isoliert, subkloniert (vorzugsweise in einen Expressionsvektor) und sequenziert werden. Plasmide, die Sequenzen von Interesse enthalten, können dann in eine geeignete Wirtszelle zur Proteinexpression für weitere Charakterisierungen transfiziert werden. Der Wirt kann eine prokaryontische oder eukaryontische Zelle sein, weil die nicht-vorhandene Fähigkeit der Letzteren, Protein zu glycosylieren, die morphogene Aktivität des Proteins nicht zerstören wird. Nützliche Wirtszellen schließen E. coli, Saccharomyces, das Insekten/Bacuolvirus-Zellsystem, Myelomazellen, CHO-Zellen und verschiedene andere Säugetierzellen ein. Die Vektoren können zusätzlich verschiedene Sequenzen codieren, um die richtige Expression des rekombinanten Proteins zu fördern, einschließlich von Transkriptionspromotor- und Terminationssequenzen, Enhancer-Sequenzen, bevorzugten Ribosomen-Bindungsort-Sequenzen, bevorzugten mRNA-Leader-Sequenzen, bevorzugten Signalsequenzen zur Proteinsezernierung und dergleichen.
Die DNA-Sequenz, die das Gen von Interesse codiert, kann ebenfalls manipuliert werden, um potentiell hemmende Sequenzen zu entfernen oder unerwünschte sekundäre Strukturbildung zu minimieren. Das rekombinante osteogene Protein kann ebenfalls als Fusionsprotein exprimiert werden. Nach dem Translatieren kann das Protein aus den Zellen selbst aufgereinigt oder aus dem Zellkulturmedium gewonnen werden. Alle biologisch aktiven Proteinformen umfassen dimere Spezies, die durch Disulfidbrücken verbunden oder in anderer Weise assoziiert sind, erzeugt durch Falten und Oxidieren einer oder mehrerer der verschiedenen rekombinanten Polypeptidketten innerhalb einer eukaryontischen Zelle oder in vitro nach Expression von individuellen Untereinheiten. Eine ausführliche Beschreibung osteogener Proteine, exprimiert aus rekombinanter DNA in E. coli, und in zahlreichen unterschiedlichen Säugetierzellen, ist im US-Patent Nr. 5266683 offenbart.
Alternativ können osteogene Polypeptidketten chemisch unter Verwendung konventioneller Peptidsynthesetechniken synthetisiert werden, die für den Durchschnittsfachmann auf dem Gebiet wohlbekannt sind. Beispielsweise können die Proteine intakt oder in Teilen auf einem Festphasenpeptid-Synthesegerät synthetisiert werden, unter Verwendung von Standardbe triebs-Verfahren. Vollständige Ketten werden dann entschützt und durch HPLC (Hochdruckflüssigkeitschromatographie) aufgereinigt. Wenn das Protein in Teilen synthetisiert wird, können die Teile unter Verwendung von Standardmethoden zur Bildung des intakten Proteins Peptid-verbrückt werden. Im Allgemeinen ist die Art und Weise, in der die osteogenen Proteine hergestellt werden, konventionell, und bildet keinen Teil dieser Erfindung.
II. Trägermatrixmaterial
A. Allgemeine Matrixerwägungen
Wie für den Fachmann auf dem Gebiet erkannt werden wird, ist, vorausgesetzt dass die Matrix eine dreidimensionale Struktur aufweist, die ausreichend ist, als Gerüst zum Infiltrieren und Proliferieren von Zellen zu dienen und in vivo biokompatibel bioresorbierbar ist, die genaue Natur des Substrats per se, das für die hierin offenbarten Matrices verwendet wird, für die ultimative Fähigkeit der Vorrichtung, eine Neuknochen- oder Gelenkknorpelgewebsbildung zu induzieren, nicht bestimmend. In der vorliegenden Erfindung dient das Substrat als Gerüst, auf dem bestimmte zelluläre Ereignisse, vermittelt von einem osteogenen Protein, auftreten können. Die speziellen Reaktionen für das osteogene Protein werden letztendlich durch die endogene Mikroumgebung am implantierten Ort und durch das Entwicklungspotenzial der reagierenden Zellen diktiert. Wie es ebenfalls vom Fachmann gewürdigt werden wird, wird die präzise Auswahl des für die hierin offenbarten Matrices verwendeten Substrats teilweise von der Art des zu reparierenden Defekts, anatomischen Erwägungen, wie beispielsweise dem Umfang der Vaskularisierung am Defektort und dergleichen bestimmt werden.
Die Matrixgeometrie bzw. Abmessungen, die Teilchengröße, das Vorhandensein einer Oberflächenladung und der Grad der Porosität (zellinfiltrierende Zwischenräume) sind alle für die erfolgreiche Matrixleistung von Bedeutung. Es wird bevorzugt, die Matrix zur erwünschten Form des neuen Knochens oder Gelenkknorpelgewebes, das gebildet werden soll, auszubilden. Rattenstudien zeigen, dass der neue Knochen im Wesentlichen mit den Dimensionen der implantierten Vorrichtung ausgebildet wird.
Die Matrix kann einen die Form beibehaltenden Feststoff umfassen, der aus locker anhaftendem teilchenförmigem Material hergestellt ist, beispielsweise mit Collagen. Er kann ebenfalls einen geformten, porösen Feststoff oder einfach eine Aggregation von eng gepackten Teil chen umfassen, der durch umgebendes Gewebe am Ort gehalten wird. Die Matrix kann weiterhin einen unlöslichen, nicht-teilchenförmigen Feststoff mit Zwischenräumen umfassen, die ausreichend sind, um die Anlagerung und Proliferation infiltrierender Zellen zu ermöglichen. Verkleinertes Muskel- oder devitalisiertes biologisch inertes Gewebe kann insbesondere verwendet werden, wenn es wie hierin beschrieben hergestellt wurde. Große allogene Knochenimplantate können ebenfalls als Träger für die Matrix dienen, wenn ihre Markcavitäten gereinigt und mit Träger und dem dispergierten osteogenen Protein bepackt werden. Alternativ können Knochenimplantate per se als Träger dienen, und in solchen Fällen kann das osteogene Protein direkt auf die Oberfläche des Knochenimplantats aufgeschichtet werden.
Wenn die osteogene Vorrichtung zur Bildung von neuem Knochengewebe in einem Säugetier formuliert wurde, umfasst das gegenwärtig bevorzugte Matrixmaterial devitalisiertes, demineralisiertes xenogenes Knochengewebe, das wie hierin offenbart behandelt wurde. Die formulierten Vorrichtungen erzeugen ein implantierbares Material, das in einer Vielzahl klinischer Einstellungen von Nutzen ist. Zusätzlich zu seiner Verwendung als Matrix zur Knochenbildung in verschiedenen orthopädischen, periodontalen und rekonstruktiven Verfahren kann die Matrix ebenfalls als verzögerter Freisetzungs-Träger oder als collagene Beschichtung für Implantate verwendet werden. Die Matrix kann wie erwünscht in Vorwegnahme eines chirurgischen Eingriffes geformt werden oder kann vom Arzt oder technischen Mitarbeiter während des chirurgischen Eingriffes geformt werden. Somit kann das Material für topische, subkutane, intraperitoneale oder intramuskuläre Implantate verwendet werden; es kann zum Überbrücken nicht-gleichförmiger Frakturen oder zum Auffüllen von Knochendefekten verwendet werden.
B. Matrices aus natürlichen Quellen
Für illustrative Zwecke können allogene oder xenogene Matrices, wie hierin unten beschrieben erzeugt werden, unter Verwendung von Verfahren, die in der Technik wohlbekannt sind. Insbesondere wurden Verfahren zum Extrahieren der zellulären, nicht-strukturellen Bestandteile des Gewebes zur Devitalisierung des Gewebes entwickelt. Das sich ergebende Material umfasst eine zelluläre Matrix, die Zwischenräume definiert, die durch Zellen infiltriert werden können und die im Wesentlichen bezüglich nicht-strukturell assoziierter Bestandteile abgereichert sind.
Ein gegenwärtig bevorzugtes Verfahren zum Entvitalisieren von nicht-mineralisiertem Gewebe folgt einer Methodik wie beispielsweise derjenigen, die in der Technik zum Fixieren von Gewebe verwendet wird. Das Gewebe wird gegenüber einem nicht-polaren Lösungsmittel exponiert, wie beispielsweise 95 % Ethanol, für eine Zeit, die ausreichend ist, um den Wassergehalt des Gewebes im Wesentlichen mit Methanol zu ersetzen und die Zellstruktur des Gewebes zu zerstören. Typischerweise wird das Gewebe 100%igem Ethanol (200 Proof) für mehrere Tage bei einer Temperatur im Bereich von ungefähr 4 bis 40° C ausgesetzt, wobei Vorsicht getragen wird, die Lösung durch frischen Ethanol alle 6-12 Stunden zu ersetzen, bis zu einem derartigen Zeitpunkt, wenn der Flüssigkeitsgehalt des Gewebes 70-90 % Ethanol umfasst. Typischerweise ist eine Behandlung für 3-4 Tage angemessen. Das Volumen der Flüssigkeit, die zugesetzt wurde, sollte mehr als genug sein, um das Gewebe einzutauchen. Das behandelte Gewebe wird dann lyophilisiert bzw. gefriergetrocknet. Die sich ergebende trockene bzw. wasserfreie Matrix ist im Wesentlichen von nicht-strukturellen Bestandteilen depletiert, behält jedoch sowohl intrazelluläre als auch extrazelluläre Matrixbestandteile bei, die aus dem Gewebe abgeleitet sind.
Behandelte allogene oder xenogene Matrices weisen eine spezielle Nützlichkeit zur Erzeugung von Vorrichtungen zur Ausbildung von neuem Knochen oder Gelenkknorpel in einem Säugetier auf. Eine osteogene Vorrichtung kann aus einem allogenen Knochen zur Steigerung der Allotransplantat-Reparatur formuliert werden. Devitalisiertes allogenes oder xenogenes Trägermaterial kann ebenfalls mit osteogenem Protein zur Bereitstellung einer festen, resorbierbaren Matrix kombiniert werden, die einen strukturellen Träger für große Knochendefekte bereitstellt. In ähnlicher Weise kann eine allogene Gelenkknorpelvorrichtung aus devitalisiertem Knorpelgewebe gebildet werden oder einem anderen inerten, nicht-mineralisierten Matrixmaterial und osteogenem Protein, und die Vorrichtung kann auf subchondralen Knochenoberflächen als Folie aufgelagert werden. Alternativ kann eine formulierte Vorrichtung pulverisiert oder in anderer Weise mechanisch abgerieben werden, um Teilchen zu erzeugen, die zu einer Paste oder einem Gel wie hierin beschrieben formuliert werden, zur Aufbringung auf die Knochenoberfläche.
C. Knochen-abgeleitete Matrices
Das Nachfolgende stellt gegenwärtig bevorzugte Methodiken zur Erzeugung geeigneter Matrices aus mineralisiertem Gewebe bereit, insbesondere allogenem oder xenogenem Knochengewebe.
C.1 Demineralisierte Knochenmatrix
Demineralisierte Knochenmatrix, vorzugsweise Rinderknochenmatrix, wird durch früher offenbarte Verfahren hergestellt (Sampath et al. (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 6591-6595). Rinderdiaphysen-Knochen werden von einem ortsansässigen Schlachthaus bezogen und frisch verwendet. Von den Knochen werden Muskeln und Fett abgezogen, von Knochenhaut gereinigt, durch Druck mit kaltem Wasser entmarkt, in kaltem absoluten Ethanol eingetaucht und bei –20° C aufbewahrt. Danach werden sie getrocknet und durch Zerstoßen fragmentiert und in einer großen Mühle pulverisiert. Es wird durch Verwendung von flüssigem Stickstoff Sorge getragen, ein Erhitzen zu vermeiden. Der pulverisierte Knochen wird auf eine Teilchengröße im Bereich von 70-850 µm, vorzugsweise 150-420 µm, vermahlen und wird durch zwei Waschungen einer ungefähr zweistündigen Dauer und drei Volumina Chloroform:Methanol (3:1) entfettet. Der teilchenförmige Knochen wird dann mit einem Volumen absolutem Ethanol gewaschen und über einem Volumen wasserfreiem Ether getrocknet, was entfettetes Knochenpulver ergibt. Das entfettete Knochenpulver wird dann durch vier aufeinanderfolgende Behandlungen mit 10 Volumina 0,5 N HCl bei 4° C für 40 Minuten demineralisiert. Zuletzt wird das demineralisierte Knochenpulver durch Waschen mit einem großen Volumen Wasser neutralisiert.
C.2 Guanidin-Extraktion
Demineralisierte Knochenmatrix, die so hergestellt wurde, wird mit 5 Volumina 4 M Guanidin-HCl, 50 mM Tris-HCl, pH 7.0 für 16 Stunden bei 4° C extrahiert. Die Suspension wird filtriert. Das unlösliche Material wird gesammelt und zur Herstellung der Matrix verwendet. Das sich ergebende Material ist überwiegend Collagen, und es fehlt ihm jegliche osteogene oder chondrogene Aktivität.
C.3 Matrixbehandlungen
Der Hauptbestandteil aller Knochenmatrices ist Typ-I-Collagen. Zusätzlich zu Collagen schließt demineralisierter Knochen, der wie oben offenbart extrahiert wurde, nicht-collagene Proteine ein, die ungefähr 5 % seiner Masse ausmachen können. In einer xenogenen Matrix können diese nicht-collagenen Bestandteile selbst als potente Antigene vorliegen und können immunogene und/oder inhibitorische Bestandteile darstellen. Diese Bestandteile können ebenfalls die Osteogenese in allogenen Implantaten durch störende Entwicklungskaskade der Knochendifferenzierung hemmen. Es wurde entdeckt, dass die Behandlung der Matrixteilchen mit einem Collagen-Fibrill-modifizierenden Mittel potentiell unerwünschte Bestandteile aus der Matrix extrahiert und die Oberflächenstruktur des Matrixmaterials verändert. Nützliche Mittel schließen Säuren, organische Lösungsmittel oder erhitzte wässrige Medien ein. Verschiedene Behandlungen sind unten beschrieben. Eine ausführliche physikalische Analyse des Effektes, den diese Fibrill-modifizierenden Mittel auf demineralisierten, Guanidin-extrahierte Knochencollagen-Teilchen aufweisen, ist in der gleichzeitig anhängigen US-Patentanmeldung Serien-Nr. 483913, eingereicht am 22. Februar 1990, offenbart.
Nach Kontakt mit dem Fibrill-modifizierenden Mittel wird die behandelte Matrix gewaschen, um jegliche extrahierten Bestandteile zu entfernen. Kurz gesagt, wird die Matrix in TBS (Tris-gepufferte Salzlösung) 1 g/200 ml suspendiert und bei 4° C für 2 Stunden gerührt; oder in 6 M Urea, 50 mM Tris-HCl, 500 mM NaCl, pH 7,0 (UTBS) gerührt bei Raumtemperatur (RT) für 30 Minuten (ausreichend Zeit, um den pH zu neutralisieren). Das Material wird durch Zentrifugation geerntet, erneut unter Anwendung der vorher erwähnten Bedingungen gewaschen und erneut durch Zentrifugation geerntet. Das sich ergebende Material wird mit Wasser gewaschen und danach lyophilisiert.
C.3.1 Säurebehandlungen
C.3.1a. Trifluoressigsäure
Trifluoressigsäure (TFA) ist eine starke, nicht-oxidierende Säure, die für Proteine ein bekanntes Quellmittel ist und die Collagenfibrillen modifiziert. Rinderknochen-Rückstand, der wie oben beschrieben hergestellt wurde, wird gesiebt, und die Teilchen der geeigneten Größe werden gesammelt. Diese Teilchen werden mit verschiedenen Prozentsätzen (1 % bis 100 %) Trifluoressigsäure und Wasser (V/V) bei 0° C oder Raumtemperatur für 1-2 Stunden unter konstantem Rühren extrahiert. Die behandelte Matrix wird filtriert, lyophilisiert oder mit Wasser/Salz gewaschen und danach lyophilisiert.
C.3.1b. Fluorwasserstoff
Wie Trifluoressigsäure ist Fluorwasserstoff (HF) eine starke Säure und Quellmittel, und ist ebenfalls dazu in der Lage, die intrapartikuläre Oberflächenstruktur zu verändern. Fluorwasserstoff ist ebenfalls ein bekanntes Deglycosylierungsmittel. Als solches kann Fluorwasserstoff dazu dienen, die osteogene Aktivität dieser Matrices durch Entfernen der antigenen Kohlenhydrat-Bestandteile irgendwelcher Glycoproteine zu erhöhen, die noch mit der Matrix nach Guanidin-Extraktion verbunden sind.
Rinderknochen-Rückstand, der wie oben beschrieben wurde, wird gesiebt, und die Teilchen der geeigneten Größe werden gesammelt. Die Probe wird im Vakuum über P₂O₅ getrocknet, auf das Reaktionsgefäß übertragen und gegenüber wasserfreiem Fluorwasserstoff (10-20 ml/g Matrix) durch Destillation auf die Probe bei –70° C exponiert. Das Gefäß lässt man auf 0° C sich erwärmen und danach wird das Reaktionsgemisch bei dieser Temperatur für 120 Minuten gerührt. Nach Abdampfen des Fluorwasserstoffs im Vakuum wird der Rückstand sorgfältig über KOH-Pellets im Vakuum getrocknet, um irgendwelche Säurerückstände zu entfernen. Der Umfang der Deglycosylierung kann entweder aus einer Kohlenhydratanalyse von Matrixproben bestimmt werden, die vor und nach einer Behandlung mit Fluorwasserstoff nach Waschen der Proben in geeigneter Weise zur Entfernung von nicht-covalent gebundenem Kohlenhydrat, bestimmt werden. SDS-extrahiertes Protein aus HF-behandeltem Material ist bezüglich Kohlehydrat negativ, wie es durch Con-A-Blotting bestimmt wurde. Danach wird die Knochenmatrix zweimal in TBS (Tris-gepufferte Salzlösung) oder UTBS gewaschen, danach mit Wasser gewaschen und dann lyophilisiert. Andere Säurebehandlungen werden jedoch zusätzlich zu HF und TFA ins Auge gefasst.
C.3.2 Lösungsmittelbehandlung
C.3.2a. Dichlormethan
Dichlormethan (DCM) ist ein organisches Lösungsmittel, das zum Denaturieren von Proteinen ohne Beeinträchtigung ihrer Primärstruktur in der Lage ist. Dieses Quellmittel ist ein übliches Reagens in der automatisierten Peptidsynthese und wird in Waschschritten zur Entfernung von Bestandteilen verwendet. Rinderknochen-Rückstand, hergestellt wie oben beschrieben, wird gesiebt, und Teilchen der geeigneten Größe werden in 100 % DCM oder, vorzugsweise, 99,9 % DCM/0,1 % TFA inkubiert. Die Matrix wird mit dem Quellmittel für eine oder zwei Stunden bei 0° C oder bei Raumtemperatur inkubiert. Alternativ wird die Matrix mit dem Mittel zumindest dreimal mit kurzen Waschungen (jeweils 20 Minuten) ohne Inkubation behandelt.
C.3.2b Acetonitril
Acetonitril (ACN) ist ein organisches Lösungsmittel, das dazu in der Lage ist, Proteine ohne Beeinträchtigung ihrer Primärstruktur zu denaturieren. Es ist ein übliches Reagenz, das in der Hochleistungsflüssigchromatographie verwendet wird, und wird dazu verwendet, Proteine aus Siliziumdioxid-basierten Säulen durch Stören hydrophober Wechselwirkungen zu eluieren. Rinderknochenrückstand-Teilchen der geeigneten Größe, hergestellt wie oben beschrieben, werden mit 1 % ACN (1,0 g/30 ml) oder vorzugsweise 99,9 % ACN/0,1 % TFA bei Raumtemperatur für 1-2 Stunden unter konstantem Rühren behandelt. Die behandelte Matrix wird dann mit Wasser, einem Urea-Puffer oder 4 M NaCl gewaschen und danach lyophilisiert. Alternativ kann die ACN- oder ACN/TFA-behandelte Matrix ohne Waschen lyophilisiert werden.
C.3.2c. Isopropanol
Isopropanol ist ebenfalls ein organisches Lösungsmittel, das zum Denaturieren von Proteinen ohne Beeinträchtigung ihrer Primärstruktur in der Lage ist. Es ist ein übliches Reagenz, das zum Eluieren von Proteinen aus Lithiumdioxid-HPLC-Säulen verwendet wird. Rinderknochenrückstand-Teilchen der geeigneten Größe, die wie oben beschrieben hergestellt wurden, werden mit 100 % Isopropanol (1,0 g/30 ml) oder vorzugsweise in Gegenwart von 0,1 % TFA bei Raumtemperatur für 1-2 Stunden unter konstantem Rühren behandelt. Die Matrix wird dann mit Wasser, Urea-Puffer oder 4 M NaCl vor dem Lyophilisieren gewaschen.
C.3.2d. Chloroform
Chloroform kann ebenfalls zur Erhöhung der Oberfläche der Knochenmatrix wie die oben erwähnten Reagenzien verwendet werden, entweder alleine oder angesäuert. Die wie oben dargelegte Behandlung ist zum Sicherstellen effektiv, dass das Material vor der Implantation frei von Pathogenen ist.
C.3.3 Wärmebehandlung
Das gegenwärtig am meisten bevorzugte Mittel ist ein erhitztes wässriges Fibrillmodifizierendes Medium, wie beispielsweise Wasser, zur Erhöhung der Matrixteilchen-Oberfläche und -Porosität. Das gegenwärtig am meisten bevorzugte wässrige Medium ist ein saures wässriges Medium mit einem pH von weniger als ungefähr 4,5, beispielsweise im Bereich von ungefähr pH 2 bis pH 4, der dabei helfen kann, das Collagen vor dem Erhitzen „zu quellen". 0,1 % Essigsäure, die einen pH ungefähr von 3 aufweist, wird gegenwärtig am meisten bevorzugt. 0,1 M Essigsäure kann ebenfalls verwendet werden.
Verschiedene Mengen an entfettetem, entmineralisiertem Guanidin-extrahierten Knochencollagen werden in einem wässrigen Medium (1 g Matrix/30 ml wässriges Medium) unter konstantem Rühren in einem Glaskolben mit Wassermantel erhitzt und bei einer vorgegebenen Temperatur für eine vorbestimmte Zeitspanne gehalten. Bevorzugte Behandlungszeiten sind bei ungefähr einer Stunde, obwohl die Expositionszeiten zwischen ungefähr 0,5 bis 2 Stunden als akzeptabel erscheinen. Die verwendete Temperatur wird bei einer Temperatur im Bereich von ungefähr 37° C bis 65° C konstant gehalten. Die gegenwärtig bevorzugte Hitzebehandlungstemperatur liegt im Bereich von ungefähr 45° bis 65° C.
Nach der Hitzebehandlung wird die Matrix filtriert, gewaschen, lyophilisiert und zur Implantation verwendet. Wenn ein saures, wässriges Medium verwendet wird, wird die Matrix ebenfalls vorzugsweise vor dem Waschen und Lyophilisieren neutralisiert. Ein gegenwärtig bevorzugter Neutralisierungspuffer ist ein 200-mM-Natriumphosphat-Puffer pH 7,0. Um die Matrix zu neutralisieren, lässt man die Matrix vorzugsweise zunächst im Anschluss an eine Wärmebehandlung abkühlen, das saure, wässrige Medium (beispielsweise 0,1 % Essigsäure) wird dann entfernt und mit Neutralisierungspuffer ersetzt und die Matrix für ungefähr 30 Mi nuten geschüttelt. Der Neutralisierungspuffer kann dann entfernt und die Matrix gewaschen und lyophilisiert werden.
Die Matrix kann ebenfalls zur Entfernung kontaminierender Schwermetalle behandelt werden, wie beispielsweise durch Exponieren der Matrix gegenüber einem Metallionenchelator. Beispielsweise kann im Anschluss an eine Wärmebehandlung mit 0,1 % Essigsäure die Matrix in einem Neutralisierungspuffer, der Natriumethylendiamintetraessigsäure (EDTA) enthält, beispielsweise 200 mM Natriumphosphat, 5 mM EDTA, pH 7,0, neutralisiert werden. 5 mM EDTA stellt einen ungefähr 100fachen molaren Überschuss von Chelator gegenüber rückständigen Schwermetallen bereit, die in den meisten bis jetzt getesteten kontaminierten Matrices vorliegen. Ein anschließendes Waschen der Matrix im Anschluss an die Neutralisierung scheint den Großteil der EDTA zu entfernen. Eine EDTA-Behandlung von Matrixteilchen reduziert den restlichen Schwermetallgehalt aller getesteten Metalle (Sb, As, Be, Cd, Cr, Cu, Co, Pb, Hg, Ni, Se, Ag, Zn, Ti) auf weniger als ungefähr 1 ppm. Bioassays mit EDTA-behandelten Matrices zeigen, dass eine Behandlung mit dem Metallionenchelator die Knochen-induzierende Aktivität nicht hemmt.
Die Collagenmatrixmaterialien nehmen vorzugsweise die Form eines feinen Pulvers ein, das in Wasser unlöslich ist, das nicht-adhärente Teilchen umfasst. Sie kann einfach durch Packen in das Volumen angewendet werden, in dem neues Knochenwachstum und verzögerte Freisetzung erwünscht ist, am Ort gehalten durch das umgebende Gewebe. Alternativ kann das Pulver beispielsweise in eine Gelatine- oder Polymilchsäureumhüllung eingekapselt werden, die vom Körper leicht absorbiert wird. Das Pulver kann zu einem Volumen einer vorgegebenen Dimension ausgeformt und in dieser Form durch Festhalten der Teilchen unter Verwendung beispielsweise von löslichem Spezies-biokompatiblen Collagen gehalten werden. Das Material kann ebenfalls zu Folien-, Stab-, Kügelchen- oder anderen makroskopischen Formen ausgebildet werden.
D. Synthetische Matrices
Als Alternative zu einer Matrix aus natürlicher Quelle oder als Ergänzung, die in Kombination mit einer Matrix aus natürlicher Quelle verwendet werden kann, kann eine geeignete Matrix ebenfalls de novo formuliert werden, unter Verwendung eines oder mehrerer Materialien, die zur Erzeugung einer dreidimensionalen Gerüststruktur dienen, die gebildet oder geformt werden können, um Dimensionen des erwünschten Ersatz-Gewebes einzunehmen. Vorzugsweise umfasst die Matrix ebenfalls Reste, die vom selben Gewebstyp wie das zu induzierende Gewebe abgeleitet und/oder charakteristisch oder für dieses spezifisch sind. In einigen Fällen, wie bei der Ausbildung von Gelenkknorpel auf einer subchondralen Knochenoberfläche, osteogenes Protein in Kombination mit einer Matrix, die eine dreidimensionale Gerüststruktur definiert, ausreichend um die Anlagerung infiltrierender Zellen zu ermöglichen und zusammengesetzt aus einem nicht-mineralisierten Material, ausreichend sein. Jedes oder eine Kombination von Materialien kann vorteilhaft verwendet werden, einschließlich ohne Beschränkung, Collagen; Homopolymere oder Copolymere der Glycolsäure, Milchsäure und Buttersäure, einschleßlich von Derivaten hiervon; und Keramiken, wie beispielsweise Hydroxyapatit, Tricalciumphosphat und andere Calciumphosphate und Kombinationen hiervon.
Der gewebsspezifische Bestandteil einer synthetischen Matrix kann in einfacher Weise durch Devitalisieren eines allogenen oder xenogenen Gewebes, wie oben beschrieben, und danach Pulverisieren oder in anderer Weise mechanisches Abbauen der unlöslichen Matrix, die zurückbleibt, gewonnen werden. Dieses teilchenförmige Material kann dann mit ein oder mehreren strukturellen Materialien kombiniert werden, einschließlich solcher, die hierin beschrieben sind. Alternativ können gewebsspezifische Bestandteile weiter aus der behandelten Matrix unter Verwendung von Standard-Extraktionsverfahren aufgereinigt werden, die in der Technik wohlcharakterisiert sind, und unter Verwendung von Standard-Analyseverfahren kann das extrahierte Material bei jedem Aufreinigungsschritt bezüglich seiner Gewebsspezifitäts-Fähigkeit getestet werden. Für beispielhafte Gewebsextraktionsprotokolle bzw. -vorschriften siehe beispielsweise Sampath et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci 87: 7599-7603 und US 4968590 .
Eine synthetische Matrix kann erwünscht sein, wenn beispielsweise einer Ersatzknorpelbildung in einem existierenden Gelenk erwünscht ist, um beispielsweise einen Riss oder einen begrenzten oberflächlichen Defekt des Gewebes zu korrigieren oder die Höhe der Gelenkknorpeloberfläche, die aufgrund des Alters, einer Erkrankung oder einer Verletzung abgenutzt ist, zu erhöhen. Ein derartiges „Oberflächenerneuern" der Gelenknorpelschicht kann unter Verwendung der Verfahren und Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung durch, in einer Ausführungsform, Behandeln einer Folie aus allogenem oder xenogenem Gelenkknorpelgewebe, wie hierin beschrieben, Beschichten der sich ergebenden Matrix mit osteogenem Protein, Aufrollen der formulierten Vorrichtung, so dass sie in das Gelenk unter Verwendung orthoskopisch-chirurgischer Standardtechniken eingebracht werden kann und, wenn es einmal am Ort befindlich ist, Entrollen der Vorrichtung als eine Schicht auf der Gelenkknochenoberfläche erreicht werden.
In einer weiteren Ausführungsform wird die Vorrichtung als Paste oder injizierbare gelartige Substanz formuliert, die auf die Gelenkknochenoberfläche in einem Gelenk injiziert werden kann, unter Verwendung orthoskopisch-chirurgischer Standardtechniken. In dieser Ausführungsform kann die Formulierung eine pulverisierte oder in andere Weise mechanisch abgebaute Vorrichtung umfassen, die sowohl Matrix als auch osteogenes Protein umfasst und zusätzlich ein oder mehrere Bestandteile, die dazu dienen, die Teilchen in einer pastenartigen oder gelartigen Substanz zu binden. Bindende Materialien, die in der Technik wohlcharakterisiert sind, schließen beispielsweise Carboxymethylcellulose, Glycerol, Polyethylenglycol und dergleichen ein. Alternativ kann die Vorrichtung osteogenes Protein, dispergiert in einer synthetischen Matrix, umfassen, die die erwünschten physikalischen Eigenschaften bereitstellt.
Als Beispiel ist eine synthetische Matrix mit einer Gewebsspezifität für Knorpel und Knochen in WO91/18558 (veröffentlicht am 21. Dezember 1991) beschrieben. Kurz gesagt, umfasst die Matrix ein poröses vernetztes Strukturpolymer aus biokompatiblem, biodegradierbarem Collagen und geeignete, gewebsspezifische Glycosaminoglycane als gewebsspezifische Zellanlagerungsfaktoren. Collagen, das aus mehreren Quellen abgeleitet ist, kann verwendet werden, einschließlich von unlöslichem Collagen, säurelöslichem Collagen, Collagen, das in neutralen oder basischen wässrigen Lösungen löslich ist, ebenso wie solche Collagene, die kommerziell erhältlich sind.
Glycosaminoglycane (GAGs) oder Mucopolysaccharide sind Hexosamin-enthaltende Polysaccharide tierischen Ursprungs, die eine gewebsspezifische Verteilung aufweisen und deswegen dazu verwendet werden können, die Bestimmung der Gewebsspezifität der Morphogen-stimulierten differenzierenden Zellen zu unterstützen. Eine Reaktion mit den GAGs wird ebenfalls Collagen mit anderen wertvollen Eigenschaften bereitstellen, d. h. ein Unvermögen, eine Immunreaktion (Fremdkörperreaktion) aus einem Tierwirt hervorzurufen.
Chemisch gesehen, werden die GAGs aus Resten von Hexosaminen hergestellt, die glycosidisch gebunden und in einer mehr oder weniger regelmäßigen Art und Weise entweder mit Hexouronsäure- oder Hexose-Komponenten alternieren (siehe beispielsweise Dodgson et al. in „Carbohydrate Metabolism and its Disorders", Dickens et al., Hsg., Bd. 1, Academic Press (1968)). Nützliche GAGs schließen Hyaluronsäure, Heparin, Heparinsulfat, Chondroitin-6-sulfat, Chondroitin-4-sulfat, Dermatansulfat und Keratinsulfat ein. Andere GAGs können ebenfalls zur Ausbildung der hierin beschriebenen Matrix verwendet werden, und der Fachmann auf dem Gebiet wird andere geeignete GAGs kennen oder in der Lage sein, diese sicherzustellen, indem er nicht mehr als Routineexperimente anwendet. Für eine ausführlichere Beschreibung von Mucopolysacchariden siehe Aspinall, „Polysaccharides", Pergamon Press, Oxford (1970).
Das Collagen kann mit einem GAG in einer wässrigen, sauren Lösung umgesetzt werden, vorzugsweise in verdünnten Essigsäure-Lösungen. Durch Zusetzen des GAG tropfenweise in die wässrige Collagen-Dispersion bilden sich Co-Präzipitate von wirren Collagen-Fibrillen, die mit GAG beschichtet sind. Diese wirre Fasermasse kann dann zur Bildung einer homogenen Dispersion feiner Fasern homogenisiert und dann filtriert und getrocknet werden.
Die Unlöslichkeit der Collagen-GAG-Produkte kann bis auf den erwünschten Grad durch covalentes Vernetzen dieser Materialien erhöht werden, was ebenfalls zur Erhöhung der Beständigkeit gegenüber einer Resorption dieser Materialien dient. Im Allgemeinen ist jedes covalente Vernetzungsverfahren, das zum Vernetzen von Collagen geeignet ist, ebenfalls zum Vernetzen dieser Verbundmaterialien geeignet, obwohl ein Vernetzen durch einen dehydrothermischen Prozess bevorzugt wird.
Wenn sie getrocknet sind, sind die vernetzten Partikel im Wesentlichen kugelförmig mit Durchmessern von ungefähr 500 µm. Eine Rasterelektronenmikroskopie zeigt Poren von ungefähr 200 µm auf der Oberfläche und 50 µm im Inneren. Das Innere besteht aus faserartigen und folienartigen Strukturen, die Oberflächen zur Zellanlagerung bereitstellen. Die Leerräume sind miteinander verbunden und stellen einen Zugang zu den Zellen durch den gesamten Innenraum des Teilchens bereit. Das Material scheint aus einem Leervolumen von ungefähr 99,5 % zu bestehend, was das Material bezüglich der potentiellen Zellmasse, die pro Gramm Mikroträger gezüchtet werden kann, sehr effizient macht.
Eine weitere nützliche synthetische Matrix ist eine, die aus einem biokompatiblen, in vivo biodegradierbaren synthetischen Polymer formuliert wurde, wie beispielsweise solche, die aus Glycolsäure, Milchsäure und/oder Buttersäure gebildet sind, einschließlich von Copolymeren und Derivaten hiervon. Diese Polymere sind in der Technik wohlbeschrieben und sind kommerziell erhältlich. Beispielsweise sind 50:50-Gemische von Poly D, L-Lactid:Glycolid kommerziell von Boehringer Ingelheim (beispielsweise RG503, RG506, RG502H und RG503H) und von Birmingham Polymers erhältlich (beispielsweise Lactel). Zusätzlich können Polymere, die 80 % Polylactid/20 % Glycosid oder Poly3-Hydroxybuttersäure enthalten, von PolySciences Inc. bezogen werden. Die Polymerzusammensetzungen werden im Allgemeinen in teilchenförmiger Form bezogen, und die osteogenen Vorrichtungen werden vorzugsweise unter wässrigen Bedingungen in Kombination mit einem organischen Lösungsmittel hergestellt (beispielsweise in einer Ethanol-trifluoressigsäure-Lösung, ETOH/TFA). Zusätzlich kann man die Morphologie der teilchenförmigen Polymerzusammensetzungen beispielsweise zur Erhöhung der Porosität unter Verwendung irgendeiner von mehreren speziellen Lösungsmittelbehandlungen, die in der Technik bekannt sind, verändern.
III. Herstellung der knochenbildenden Vorrichtung
Die wie oben dargelegten Proteine aus natürlicher Quelle sowie die rekombinanten Proteine ebenso wie andere Konstrukte können kombiniert und in einer geeigneten Matrixzubereitung dispergiert werden, unter Verwendung jedes der hier und/oder in US 5 266 683 beschriebenen Verfahrens.
Typischerweise wird das knochenbildende Protein in einem geeigneten Lösungsmittel gelöst und mit der Matrix kombiniert. Die Bestandteile lässt man sich verbinden. Typischerweise wird das kombinierte Material danach lyophilisiert, mit dem Ergebnis, dass das knochenbildende Protein auf den Oberflächen der Matrix abgelagert oder an diese adsorbiert ist. Nützliche solubilisierende Lösungsmittel schließen ohne Einschränkung eine Ethanol/Trifluoressigsäure-Lösung (beispielsweise 47,5 EtOH/0,01 % TFA); eine Acetonitril/TFA-Lösung; Ethanol; Ethanol in Wasser; oder wässrige Puffer ein. Formulierungen in einem sauren Puffer können die Adsorption von OP-1 an die Matrixoberfläche erleichtern. Für die Vorrichtungen der Erfindung ist eine nützliche Formulierungsvorschrift eine Inkubation der Matrix und des osteogenen bzw. knochenbildenden Proteins in einer Ethanol/TFA-Lösung (beispielsweise 30-50 % EtOH/0,01-0,1 % TFA) für 24 Stunden, gefolgt von Lyophilisation. Dieses Verfahren ist ausreichend, um 70-90 % des Proteins an die Matrixoberfläche zu adsorbieren oder auf diese auszufällen.
Die Menge des osteogenen Proteins, die verwendet wird, hängt von der Größe der zu verwendenden Vorrichtung und von der speziellen Aktivität bzw. Wirksamkeit des osteogenen Proteins ab. Größere Mengen können für große Implantate verwendet werden. Klinische Zubereitungen für große Knochendefekte umfassen gegenwärtig ungefähr 2,5 mg osteogenes Protein pro g Collagenmatrix.
1. Ethanoltrifluoressigsäure-Lyophilisation
In diesem Verfahren wird das osteogene Protein in einer Ethanoltrifluoressigsäure-Lösung solubilisiert (47,5 % EtOH/0,01 % TFA) und dem Trägermaterial zugesetzt. Die Aufschlämmung wird vermischt und dann lyophilisiert. Dieses Verfahren wird gegenwärtig bevorzugt.
2. Acetonitriltrifluoressigsäure-Lyophilisation
Dies ist eine Variante des obigen Verfahrens, die eine Acetonitriltrifluoressigsäure-(ACN/TFA)-Lösung zum Solubilisieren des osteogenen Proteins verwendet, das dann dem Trägermaterial hinzugefügt wird. Die Proben werden viele Male kräftig gewirbelt und danach lyophilisiert.
3. Ethanol-Ausfällung
Die Matrix wird dem osteogenen Protein zugesetzt, das in Guanidin-HCl gelöst wurde. Proben werden gevortext, bei einer niedrigen Temperatur (beispielsweise 4° C) inkubiert und erneut gevortext. Kalter absoluter Ethanol (5 Volumina) wird dem Gemisch zugesetzt, das dann gerührt und inkubiert wird, vorzugsweise für 30 Minuten bei –20° C. Nach Zentrifugation (Mikrofuge, Hochgeschwindigkeit) wird der Überstand verworfen. Die rekonstituierte Matrix wird zweimal mit kaltem konzentrierten Ethanol in Wasser (85 % EtOH) gewaschen und danach lyophilisiert.
4. Urea-Lyophilisation
Für solche osteogenen Proteine, die in Urea-Puffer hergestellt werden, wird das Protein mit dem Matrixmaterial gemischt, viele Male gewirbelt bzw. gevortext, und dann lyophilisiert. Das lyophilisierte Material kann dann „wie es ist" für Implantate verwendet werden.
5. Puffer-Lyophilisation
Osteogene Proteinzubereitungen in einem physiologischen Puffer können ebenfalls mit der Matrix gewirbelt und lyophilisiert werden, um osteogen aktive Zubereitungen zu erzeugen.
Überdies können die hierin beschriebenen Verfahren dazu verwendet werden, andere aktive therapeutische Arzneistoffe, Hormone und verschiedene bioaktive Spezies an der Matrix für verzögerte Freisetzungszwecke zu adsorbieren. Beispielsweise können zusätzlich zu osteogenen Proteinen verschiedene Wachstumsfaktoren, Hormone, Enzyme, therapeutische Zusammensetzungen, Antibiotika oder andere bioaktive Mittel an ein Substrat adsorbier oder in dieses imprägniert werden, und über die Zeit hinweg freigesetzt werden, wenn es implantiert ist und die Matrix langsam absorbiert wird. Somit können verschiedene bekannte Wachstumsfaktoren, wie beispielsweise EGF, PDGF, IGF, FGF, TGF-α und TGF-β in vivo freigesetzt werden. Die Matrix kann ebenfalls verwendet werden, chemotherapeutische Mittel, Insulin, Enzyme, Enzym-Inhibitoren oder chemotaktisch-chemoattractans Faktoren freizusetzen.
IV. Sterilisation
Im Anschluss an die Formulierung werden die sich ergebenden osteogenen Vorrichtungen durch Exposition gegenüber ionisierender Strahlung sterilisiert, beispielsweise durch Exposition gegenüber einem Elektronenstrahl oder gegenüber Gammastrahlung. Weil energiereiche Sauerstoffionen und Radikale aus Sauerstoffatomen erzeugt werden können, die mit der Vorrichtung in Verbindung stehen, sollte Restluft aus der Vorrichtung vor der Bestrahlung entfernt werden.
Jegliche Form der Verpackung kann verwendet werden, um die osteogene Vorrichtung der Erfindung aufzunehmen, vorausgesetzt, dass die Verpackung mit dem Sterilisationsprozess und der Aufrechterhaltung der Sterilität unter Speicherbedingungen kompatibel ist. Verschlossene Vials werden vorzugsweise dazu verwendet, die Vorrichtungen der Erfindung zu verpacken.
Eine Sterilisation wird routinemäßig durchgeführt, nachdem die Vorrichtung in einem Vial verschlossen wurde. Im gegenwärtig bevorzugten Ansatz wird die Luft aus dem Vial mittels eines Vakuums vor dem Verschließen evakuiert. Als zusätzliche Vorsorge jedoch kann das evakuierte Vial mit Inertgas befüllt werden, beispielsweise Helium, Neon, Argon oder Stickstoff, bevor es verschlossen wird. Alternativ kann das Vial einfach mit einem Inertgas vor dem Verschließen gespült werden.
Die verschlossenen Vorrichtungen werden anschließend durch Exposition gegenüber beispielsweise einem Elektronenstrahl oder Gammabestrahlung terminal sterilisiert. Die Vorrichtungen können während der Herstellung sterilisiert werden, d. h. als integraler Schritt im Herstellungsprozess, oder alternativ können die Vorrichtungen, wenn sie einmal hergestellt sind, an kommerzielle Sterilisierungsdienste zur Bestrahlung geschickt werden, beispielsweise Isomedix (Northboro, MA) oder RTI-Process Technology (Rockaway, NJ).
Die Vorrichtungen der Erfindung werden typischerweise mit einer Dosis bestrahlt, die ausreichend ist, um ein Sterilitätssicherheitsniveau von ungefähr 10^–6 bereitzustellen, wie es von der Federal Drug Administration zum Sterilisieren biomechanischer Vorrichtungen gefordert wird. Die tatsächlichen Dosierungen, die zum Sterilisieren einer speziellen Vorrichtung notwendig sind, können in einfacher Weise durch Konsultieren des Referenztextes bestimmt werden „Association for the Advancement of Medical Instrumentation Guidelines", veröffentlicht 1992. Die Richtlinien werden darin zur Bestimmung der Strahlungsdosis bereitgestellt, die notwendig ist, um ein vorgegebenes Sterilitätssicherheitsniveau für eine spezielle Biobelastung der Vorrichtung zu erreichen. Dosierungen zum Sterilisieren von Vorrichtungen der Erfindung liegen vorzugsweise innerhalb des Bereichs von ungefähr 0,5 bis ungefähr 4,0 Megarad und liegen am meisten bevorzugt im Bereich von ungefähr 2,5 bis ungefähr 3,5 Megarad.
Beispiele
Die Mittel zur Herstellung und Verwendung der osteogenen Vorrichtungen der Erfindung ebenso wie andere Materialaspekte, die die Natur und Nützlichkeit dieser Zusammensetzungen betreffen, einschließlich wie diese herzustellen und wie der beanspruchte Gegenstand zu verwenden ist, werden durch das Nachfolgende besser verständlich werden, das die beste Art und Weise darstellt, die gegenwärtig zur Ausübung der Erfindung ins Auge gefasst wird. Es wird klar sein, dass die Erfindung nicht auf derartige beispielhafte Arbeiten beschränkt ist oder auf die speziellen Details, die in diesen Beispielen dargelegt sind.
Beispiel 1: Bioaktivität einer terminal sterilisierten osteogenen Vorrichtung, die OP-1 und Rindercollagen-Trägermaterial umfasst.
Demineralisierte, Guanidin-extrahierte Rindermatrix wurde mit zunehmenden Mengen OP-1 unter Verwendung des hierin beschriebenen Ethanol/TFA-Protokolls formuliert. Kurz gesagt, wurde OP-1, solubilisiert in Ethanol/TFA, mit Rindercollagen-Trägermatrixmaterial für 3 Stunden inkubiert. Das Gemisch wurde als eine OP-1-Matrixaufschlämmung eingefroren und unter Vakuum getrocknet. Nach der Formulierung wurde jede Vorrichtung auf Glas-Vials übertragen und Wasser wurde zu einigen der Vorrichtungen hinzugefügt. Danach wurden die Vorrichtungen mit Helium für 5 Minuten vor dem Versiegeln gespült. Die Vials wurden mit Kunststoffsepta verschlossen und versiegelt. Die Proben wurden mit 2,5 Megarad Gammastrahlung unter einer der nachfolgenden Bedingungen bestrahlt: trocken auf Trockeneis, nass auf Trockeneis, trocken bei Raumtemperatur.
Die sich ergebenden Vorrichtungen wurden bezüglich ihres knochenproduzierenden Potentials im subkutanen Rattenassay evaluiert. Die in vivo Knocheninduktion wurde wie von Sampath et al. (siehe oben) beschrieben untersucht. Kurz gesagt, wurden terminal sterilisierte Vorrichtungen subkutan in Empfängerratten unter Ether-Anästhesie implantiert. Männliche Long-Evans-Ratten im Alter von 28-32 Tagen wurden verwendet. Ein vertikaler Einschnitt (1 cm) wurde unter sterilen Bedingungen in der Haut oberhalb der Thoraxregion durchgeführt und eine Tasche durch stumpfe Dissektion hergestellt. Ungefähr 25 mg der Testvorrichtung wurden tief in die Tasche implantiert und der Einschnitt mit einem metallischen Hautclip geschlossen. Der Implantationstag wurde als Tag Null des Experimentes bezeichnet. Die Implantate wurden am Tag 12 entfernt. Die heterotrope Stelle ermöglicht die Studie einer Knocheninduktion ohne möglicher Zweideutigkeiten, die sich aus der Verwendung orthotroper Stellen ergeben.
Die knocheninduzierende Aktivität wurde biochemisch mittels eines alkalischen Phosphatase-Assays und des Calcium-Gehaltes des Implantats am Tag 12 bestimmt. Die Alkalische-Phosphatase-Aktivität wurde spektrophotometrisch nach der Homogenisierung des Implantats bestimmt. Die Implantate, die keine Knochenentwicklung durch histologische Ermittlung zeigten, weisen eine geringe oder keine alkalische Phosphatase-Aktivität unter diesen Assay-Bedingungen auf. Das Assay ist zur Quantifizierung und zur Gewinnung einer Einschätzung der Knochenbildung, rasch nachdem die Implantate aus der Ratte entfernt wurden, von Nutzen. Der Calcium-Gehalt ist andererseits zur Menge des Knochens, die im Implantat gebildet wird, proportional. Die Knochenbildung wird deswegen durch Bestimmung des Calcium-Gehaltes des Implantats am Tag 12 in Ratten berechnet.
Erfolgreiche Implantate sind insofern charakterisiert, als sie einen kontrollierten Fortschritt durch die Stadien der proteininduzierten Ersatzknochenentwicklung zeigen, einschließlich: (1) eine vorübergehende Infiltration durch polymorphkernige Leukozyten am Tag 1; (2) mesenchymale Zellmigration und Proliferation an den Tagen 2 und 3; (3) Auftreten von Knorpelzellen am Tag 5 und 6; (4) Knorpelmatrixbildung am Tag 7; (5) Knorpelkalzifikation am Tag 8; (6) vaskuläre Invasion, Auftreten von Osteoblasten und Bildung von neuem Knochen an den Tagen 9 und 10; (7) Auftreten von Osteoklasten, Knochenumformung und Auflösung der implantierten Matrix an den Tagen 12 bis 18; und (8) hämatopoietische Knochenmarksdifferenzierung in den Ossikeln am Tag 21.
Ein histologischer Schnitt und eine Färbung wurden durchgeführt, um den Umfang der Osteogenese in den Implantaten zu bestimmen. Die Implantate wurden in Bor-Lösung fixiert, in Paraffin eingebettet und in 6-8 µm Schnitte geschnitten. Eine Anfärbung mit Toluidin-Blau oder Hämotoxylin/Eosin zeigt klar die letztendliche Entwicklung von Ersatzknochen. 12-Tages-Implantate sind üblicherweise ausreichend, um zu bestimmen, ob die Implantate neu induzierten Knochen enthalten. Die Ergebnisse der Assays werden in den Tabelle 1 bis 4 unten zusammengefasst.
Tabelle 1: Vorrichtung, formuliert ohne OP-1/25 mg Collagen.
Tabelle 2: Vorrichtung, formuliert mit 500 ng OP-1/25 mg Collagenmatrix.
Tabelle 3: Vorrichtung formuliert mit 100 ng OP-1/25 mg Collagenmatrix.
Tabelle 4: Vorrichtung formuliert mit 2500 ng OP-1/25 mg Collagenmatrix.
Die in den Tabellen 1 bis 4 dargelegten Daten zeigen, dass die osteogene Vorrichtung durch Gammastrahlung sterilisiert werden kann, wie es durch eine Beibehaltung der biologischen Aktivität der OP-1-enthaltenden Vorrichtungen bewiesen werden konnte. Eine Abnahme des osteogenen Potentials war in einigen Gruppen ersichtlich. Im Allgemeinen wurde die höchste Beibehaltung der Aktivität in den nassen Proben erwähnt, die auf Trockeneis bestrahlt wurden.
Beispiel 2: Alternative Verfahren zur Entfernung von Luft aus den osteogenen Vorrichtungen
Beispiel 1 zeigt, dass unter speziellen Umständen eine Gammastrahlung die Bioaktivität der bestrahlten Vorrichtung reduzieren kann. Diese Ergebnisse können sich aus einer unvollständigen Entfernung von Luft aus den Vorrichtungen vor der Bestrahlung ergeben. In einem Versuch, die Reduktion der Bioaktivität zu minimieren, wurden verschiedene Ansätze verwendet, um Luft aus den Vorrichtungen vor der Bestrahlung zu entfernen.
In einem ersten Verfahren wurde die Vorrichtung, die die Vials enthielt, auf weniger als 100 µm Hg unter Verwendung eines Lyophilisators und unter Halten der Vials unter diesen Bedingungen für 5 Minuten vor dem Versiegeln evakuiert. In einem zweiten Verfahren wurde die Vorrichtung, die die Vials enthielt, auf weniger als 100 µm Hg in einem Lyophilisator evakuiert, und indem die Proben für 5 Minuten unter diesen Bedingungen gehalten wurden, und danach wurden die Vials mit Helium für 2 Minuten vor dem Versiegeln gespült. Die sich ergebenden Proben wurden mit 2,5 Megarad Gammastrahlung bestrahlt und anschließend bezüglich ihrer biologischen Aktivität unter Verwendung der wie in Beispiel 1 beschriebenen subkutanen Rattenassays analysiert. Die Ergebnisse sind in Tabelle 5 zusammengefasst.
Eine Schädigung des Trägermatrixmaterials wurde durch Extrahieren der Matrix mit PBS untersucht, und die Absorption der sich ergebenden Lösung wurden gemessen, um die Menge des solubilisierten Proteins zu bestimmen. Ausgewählte Extrakte wurden bezüglich ihrer Aminosäure-Zusammensetzung analysiert, was nahelegte, dass die solubilisierten Proteine aus Collagen abgeleitet waren, und repräsentierten zwischen 1-2 % des Ausgangsträgermatrixmaterials. Tabelle 5: Effekt unterschiedlicher Ansätze zur Entfernung von Luft aus den Vorrichtungen vor der Strahlung.

¹Alle Vorrichtungen außer der Kontrolle wurden mit 2,5 Megarad Gammastrahlung sterilisiert

Die Ergebnisse zeigen, dass die auf Trockeneis nach dem Spülen mit Helium bestrahlten Vorrichtungen den höchsten Bioaktivitätsgrad beibehielten. Die Ergebnisse zeigen jedoch, dass die Vorrichtungen, die unter Vakuum bei Raumtemperatur bestrahlt wurden, ebenfalls signifikante Bioaktivitätsniveaus zeigen.
Beispiel 3: Reproduzierbarkeit terminal sterilisierter Vorrichtungen
Fünf Chargen von Vorrichtungen wurden unter Verwendung des Standardformulierungsprotokolls hergestellt. Kurz gesagt, wurde OP-1, solubilisiert in 47,5 % Ethanol/0,01 % TFA mit Rindercollagen-Trägermatrixmaterial für 3 Stunden inkubiert, das Gemisch wurde als eine OP-1/Matrixaufschlämmung eingefroren und unter einem Vakuum getrocknet. Nach der Formulierung wurde jede Vorrichtung auf Glasserum-Vials übertragen, wobei die Vials unter Vakuum versiegelt und mit 2,5-3,0 Megarad Gammastrahlung sterilisiert wurden. Alle Vorrichtungen wurden bei 4° C in Glasformulierungsgefäßen formuliert. Die Ergebnisse, die den Umfang der Bindung von OP-1 an die Matrices und die Wiedergewinnung von OP-1 aus bestrahlten und nicht-bestrahlten Vorrichtungen zeigen, sind in Tabelle 6 angegeben.
Die Menge an OP-1, die in Lösung nach 3 Stunden Inkubation zurückbliebt (vor einer Lyophilisation der Vorrichtung), war vom Verhältnis von OP-1 zu Trägermatrix, die in der Formulierung verwendet wurde, abhängig; je höher die Konzentration von OP-1 desto kleiner die Fraktion von OP-1, die an die Matrix gebunden war. Wenn 2,5 mg OP-1 mit 1 g Matrix formuliert wurden, das Verhältnis, das zur Formulierung einer Vorrichtung für die klinischen Tests verwendet wurde, wurden zwischen 53 und 64 % des OP-1 nach dreistündiger Inkubation an die Matrix gebunden. Die Menge an OP-1, die aus der Vorrichtung vor und nach der Sterilisation wiedergewonnen wurde, ist von Charge zu Charge der Vorrichtung konsistent, was erneut die Reproduzierbarkeit einer Vorrichtungs-Produktion zeigt. Tabelle 6: Vorrichtung, die mit OP-1 formuliert ist.

¹Proben jeder der Vorrichtungen wurden mit 8 M Urea, 0,3 % Tween 80, 0,1 M NaCl und 50 mM Tris, pH 8,0 für 30 Minuten bei Raumtemperatur extrahiert. Teilmengen der Extrakte wurden bezüglich des OP-1-Gehalts unter Verwendung einer HPLC analysiert.

Die in den Beispielen 1 bis 2 dargelegten Daten legen nahe, dass unter bestimmten Bedingungen eine Bestrahlung die biologische Wirksamkeit der Vorrichtung senken kann. Diese Experimente wurden ausgedehnt, um Vorrichtungen auszuwerten, die bei höheren Gewichtsverhältnissen von OP-1 an Collagenmatrix-Trägermaterial formuliert wurden. Die Effekte der Bestrahlung auf die biologische Aktivität der formulierten Vorrichtungen wurden im Rattensubkutanen Assay evaluiert. Diese Vorrichtungen wurden mit Matrix verdünnt, insbesondere wurde bestrahlte Vorrichtung mit bestrahlter Matrix und nicht-bestrahlte Vorrichtung mit nicht-bestrahlter Matrix verdünnt, so dass 3,12 mg OP-1 und 25 mg Matrix in die Ratten implantiert wurden. Die Vorrichtungen wurden verdünnt, um eine Sättigung der Assays zu vermeiden. Die Ergebnisse jedes der Assays sind in Tabelle 7 dargestellt. Kein signifikanter Un terschied in der biologischen Aktivität bestrahlter und nicht-bestrahlter Vorrichtung wurde beobachtet. Tabelle 7: Biologische Wirksamkeit einer bestrahlten und nicht-bestrahlten Vorrichtung.

¹Die bestrahlten OP-Vorrichtungen wurden mit bestrahlter Matrix derart verdünnt, dass 3,12 µg OP-1 und 25 mg Matrix implantiert wurden. Die nicht-bestrahlte Vorrichtung wurde mit nicht-bestrahlter Matrix verdünnt. Diese Proben wurden in den subkutanen Rattenassays evaluiert. Die Anzahl von Proben pro Assay ist in Klammern angegeben.
²Die Histologieergebnisse sind als Anzahl von Implantaten mit histologischer Evidenz einer Knochenbildung/Gesamtanzahl von Implantaten, die evaluiert wird, präsentiert.

Beispiel 4: Verdünnung von Formulierungen mit zusätzlichem Trägermaterial.
Um weiterhin jegliche Veränderungen der biologischen Aktivität der Vorrichtung zu bestimmen, die eine Bestrahlung begleitet, wurden zusätzliche Studien durchgeführt, bei denen bestrahlte und nicht-bestrahlte Vorrichtungen mit bestrahlter Matrix und nicht-bestrahlter Matrix verdünnt wurden, um endgültige Formulierungskonzentrationen von 3,1 µg OP-1/25 mg Matrix und 1,5 µg OP-1/25 mg Matrix zu erzeugen.
Die Proben der bestrahlten und nicht-bestrahlten Vorrichtungen wurden sowohl mit bestrahlter Matrix als auch mit nicht-bestrahlter Matrix verdünnt. Die Proben wurden unter Verwendung des subkutanen Rattenassays ausgewertet, und die Ergebnisse sind in Tabelle 8 zusammengefasst. Die Daten veranschaulichen erneut die biologische Wirksamkeit der bestrahlten Vorrichtung.
Ein zusätzliches Verfahren zum Messen von Änderungen, die eine Bestrahlung der Vorrichtung begleitet, bestand darin, OP-1 aus einer bestrahlten Vorrichtung zu eluieren und diese durch HPLC, Immunblot und zelluläre Assays zu analysieren. Die Ergebnisse zeigen, dass eine Bestrahlung der Vorrichtung die Menge an OP-1 um 30-50 % senkt, die durch HPLC eluiert und nachgewiesen wird. Fraktionen aus der HPLC wurden gesammelt und durch Immunblot analysiert. Das nach-bestrahlte OP-1 eluiert in derselben Position aus der HPLC wie die Vorbestrahlungs-Probe, somit ist die Abnahme der Wiedergewinnung nicht auf eine Veränderung der Elutionsposition von bestrahlter OP-1 zurückzuführen. Die Proben von Vorrichtungen wurden ebenfalls mit 2 % SDS extrahiert und diese Extrakte durch Immunblot und in einem zellulären Assay analysiert. Auf Grundlage einer Immunblot-Analyse von OP-1, eluiert aus einer Vorrichtung mit SDS vor und nach der Strahlung, sieht das Proteinmuster der Immunblots vor und nach der Strahlung im Wesentlichen gleich aus, was demonstriert, dass keine signifikante physikalische Veränderung des Großteils des eluierten OP-1 im Anschluss an eine terminale Sterilisierung vorhanden ist.
Das OP-1 aus zwei Chargen von Collagen-enthaltenden Vorrichtungen, Chargennummern POO2-3M13D1 (erste Vorrichtung) und POO2-4,SM13D4 (zweite Vorrichtung) wurde mit 2 % SDS extrahiert. Diese Extrakte wurden in einem Rattenosteoblasten-angereicherten Zellassay untersucht, wobei der Zusatz von OP-1 eine Zunahme der Alkalische-Phosphatase-Aktivität verursacht (1). In beiden Fällen war die Aktivität der Extrakte aus der bestrahlten Vorrichtung ungefähr 70 % der Extrakte aus nicht-bestrahlten Kontrollen. Zusätzlich wurde die Wiedergewinnung von OP-1 aus einer bestrahlten Vorrichtung gegen eine nicht bestrahlte, wie durch HPLC analysiert, für die Vorrichtungs-Chargennummern POO2-3M13D1 und POO2-4,5M13D4 jeweils als 75 % und 68 % analysiert. Tabelle 8: Biologische Wirksamkeit der Vorrichtungs-Chargennummer 1 vor und nach der Bestrahlung.

¹Die Vorrichtung wurde mit Matrix bis zu den endgültigen OP-1-Konzentrationen verdünnt, die in dieser Tabelle dargelegt sind. Die Vorrichtung, die für dieses Experiment verwendet wurde, Charge POO2-3,4M15D1, wurde mit 3,12 mg OP-1/g Matrix formuliert.
²Acht Replikate jeder Kombination wurden im subkutanen Rattenassay evaluiert. Ein Anteil jedes Implantats wurde zur histologischen Auswertung versandt und der Rest wurde zur Ca²⁺-Analyse aufgearbeitet. Alle Implantate (64 von 64) zeigten einen histologischen Beweis für eine Knochenbildung.

Claims

Sterilisierte osteogene Vorrichtung, umfassend in Kombination: (a) Partikel einer biologisch verträglichen, in vivo biologisch abbaubaren synthetischen Polymermatrix; und (b) ein abgeschiedenes biologisch aktives osteogenes Protein, dispergiert in der Polymermatrix oder angeordnet auf der Oberfläche der Polymermatrix, das in der Lage ist, endochondrale Knochenformationen oder artikuläre Knorpelformationen zu bilden, wenn es in ein Säugetier eingepflanzt wird, wobei die Vorrichtung durch Aussetzen in einer Ionisierungsstrahlung in einer luftverdünnten Umgebung ausgesetzt wird, nachdem die Kombination von Polymer und osteogenem Protein erfolgt ist.
Verfahren zur Erzeugung einer sterilisierten osteogenen Vorrichtung zum Einpflanzen in ein Säugetier mit den folgenden Schritten: (a) es wird in einer luftverdünnten Umgebung eine osteogene Vorrichtung angeordnet, die in Kombination Partikel einer biologisch verträglichen, in vivo biologisch abbaubaren synthetischen Polymermatrix und ein abgeschiedenes biologisch aktives osteogenes Protein aufweist, das in der Polymermatrix dispergiert oder auf der Oberfläche der Polymermatrix angeordnet und in der Lage ist, eine endochondrale Knochenbildung oder eine artikuläre Knorpelbildung beim Einpflanzen in ein Säugetier zu erzeugen, und (b) es wird die osteogene Vorrichtung im Schritt (a) einer Ionisierungsstrahlung so lange ausgesetzt, bis die Vorrichtung sterilisiert ist, während die biologische Aktivität des Proteins aufrecht erhalten bleibt, um eine sterilisierte osteogene Vorrichtung zu erzeugen, die in der Lage ist, eine endochondrale Knochenbildung oder artikuläre Knorpelbildung im Säugetier zu erzeugen.
Vorrichtung, Verfahren oder Benutzung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Ionisierungsstrahlung aus (a) einer Gammastrahlung oder einer Elektronenstrahlung besteht; und/oder (b) die Strahlung mit einer Dosis vorgesehen wird, die in dem Bereich zwischen 0,5 bis 4,0 Megarad (optional innerhalb eines Bereiches zwischen 2,0 bis 3,5 Megarad) liegt.
Vorrichtung, Verfahren oder Benutzung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die sterilisierte osteogene Vorrichtung einen Sterilitätssicherheitspegel von etwa 10^–6 aufweist.
Vorrichtung, Verfahren oder Benutzung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die sterilisierte osteogene Vorrichtung befähigt ist, einen artikulären Knorpel zu erzeugen.
Vorrichtung, Verfahren oder Benutzung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das osteogene Protein ein Mitglied der Vg/dpp-Unterfamilie der TGF-β-Superfamilie ist.
Vorrichtung, Verfahren oder Benutzung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das osteogene Protein zu einem konservierten Sechs- oder Sieben-Cystein-Knochengerüst im C-Terminalbereich mit anderen Mitgliedern der Vg/dpp-Unterfamilie beiträgt.
Vorrichtung, Verfahren oder Benutzung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Vorrichtung außerdem Heparin oder Heparinsulfat aufweist.
Vorrichtung, Verfahren oder Benutzung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Ionisierungsstrahlung aus (a) einer Gammastrahlung oder einer Elektronenstrahlung besteht; und/oder (b) die Strahlung mit einer Dosis vorgesehen wird, die in dem Bereich zwischen 0,5 bis 4,0 Megarad (optional innerhalb eines Bereiches zwischen 2,0 bis 3,5 Megarad) liegt.
Vorrichtung, Verfahren oder Benutzung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die sterilisierte osteogene Vorrichtung einen Sterilitätssicherheitspegel von etwa 10^–6 aufweist.
Vorrichtung, Verfahren oder Benutzung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die sterilisierte osteogene Vorrichtung befähigt ist, einen artikulären Knorpel zu erzeugen.
Vorrichtung, Verfahren oder Benutzung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das osteogene Protein ein Mitglied der Vg/dpp-Unterfamilie der TGF-β-Superfamilie ist.
Vorrichtung, Verfahren oder Benutzung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das osteogene Protein zu einem konservierten Sechs- oder Sieben-Cystein-Knochengerüst im C-Terminalbereich mit anderen Mitgliedern der Vg/dpp-Unterfamilie beiträgt.
Vorrichtung, Verfahren oder Benutzung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Vorrichtung außerdem Heparin oder Heparinsulfat aufweist.