DE69636889T2 - Öladjuvierter Impfstoff und Verfahren zu seiner Herstellung - Google Patents

Öladjuvierter Impfstoff und Verfahren zu seiner Herstellung Download PDF

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Koichi Amagasaki-shi Saito
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    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55511—Organic adjuvants
    • A61K2039/55566—Emulsions, e.g. Freund's adjuvant, MF59

Description

  • Gebiet der Erfindung
  • Die vorliegende Erfindung betrifft einen Öladjuvans-Impfstoff sowie ein Verfahren zur Herstellung des Impfstoffes.
  • Stand der Technik
  • Der Öladjuvans-Impfstoff ist seit langem als ein Impfstoff zum wirksamen Steigern der Immunität bekannt. Experimentell ist immer noch das Freundsche Adjuvans als ein klassischer Öladjuvans-Impfstoff verwendet worden, da es eine ziemlich wirksame immunsteigernde Wirkung aufweist, im Besonderen bei Verwendung in Verbindung mit einem inaktivierten Antigen. Das Öladjuvans, das ein Mineralöl als eine Hauptkomponente umfasst und das vom Freundschen Adjuvans repräsentiert wird, zeigt sicherlich eine hohe immunsteigernde Wirkung, aber es leidet unter verschiedenen Problemen, derart, dass es eine schwere Impfreaktion und Bildung von aseptischen, vereiterten Läsionen und Granulomgeschwulsten in und um die Impfstellen herum hervorruft und dass äußerlich Ödem, Anschwellen, Gewebsverhärtung und Nekrose beobachtet werden, und es besteht der Verdacht, dass es dazu neigt, an der Injektionsstelle zu verbleiben (Verbleibneigung), und demgemäß wird dies ein Hindernis für die Anwendung davon bei Impfstoffen. Falls derartige Lokalreaktionen in Haustieren verbleiben, wäre das Fleisch davon nicht zum Essen geeignet und deshalb sollte eine derartige Verbleibneigung wünschenswerterweise so weit wie möglich vermindert sein. Aus diesem Grund wären die Impfstoffe, die das Öladjuvans benutzen, das hauptsächlich ein Mineralöl umfasst, manchmal in Bezug auf die Stellen, in die sie inokuliert werden sollen, eingeschränkt.
  • Es ist unbedingt erforderlich, Wirksamkeit und Dauer des Impfstoffes zu verstärken, um die Vorbeugung gegen eine Krankheit sicherzustellen oder um eine Aufgabe des Impfstoffes zu erfüllen. Jedoch ist die Sicherheit des Impfstoffes in Anbetracht der Tatsache, dass der Impfstoff im human- oder tiermedizinischen Gebrauch angewandt wird, viel wichtiger als Wirksamkeit und Dauer.
  • Unter diesen Umständen sind verschiedene Untersuchungen durchgeführt worden, um die vorstehenden Probleme zu lösen. Beispielsweise offenbart die japanische geprüfte Patentveröffentlichung (nachstehend als „J.P. KOKOKU" bezeichnet) Nr. Hei 6-81731 ein ölbasiertes Adjuvans vom Wasser-in-Öl-Typ, wobei ein wasserfreier Mannit/Ölsäureester als grenzflächenaktives Mittel und dickflüssiges Paraffin als die Ölkomponente verwendet wird. WO91/00107 (TOKUHYO Hei 4-506521) offenbart ein nieder-viskoses, öl-basiertes Adjuvans vom Wasser-in-Öl-Typ, dessen verwendete Ölkomponente ein Gemisch aus einem metabolisierbaren Öl, wie z.B. ein Pflanzenöl, und einem nicht-metabolisierbaren Öl, wie z.B. ein Mineralöl, umfasst. Überdies offenbart die japanische ungeprüfte Patentveröffentlichung (nachstehend als „J.P. KOKAI" bezeichnet) Nr. Hei 6-172216 einen Öladjuvans-Impfstoff, der Pflanzenöl als die Ölkomponente und ein Gemisch aus einem Sorbitanfettsäureester und einem Polyoxyethylenglykol-sorbitan-alkylester als grenzflächenaktive Komponente umfasst, und J.P. KOKOKU Nr. Hei 6-39386 offenbart einen adjuvierten Lebend-Impfstoff, der hergestellt wird, indem ein lebendes Immunogen mit einer Öl-in-Wasser-Emulsion, die ein Mineralöl umfasst, gemischt wird.
  • Jedoch sind alle der vorstehenden Öladjuvans-Impfstoffe ungenügend, nicht nur hinsichtlich der nach Injektion beobachteten Lokalreaktion und der Neigung, an der Injektionsstelle zu verbleiben, sondern auch hinsichtlich der Stabilität der Zubereitungen als Impfstoffe.
  • Der Impfstoff sollte so hoch wie möglich wirksam und sicher sein, da er im human- oder tiermedizinischen Gebrauch angewandt wird und er sollte so hoch wie möglich stabil sein, indem man die Tatsache in Betracht zieht, dass es sich um ein Pharmazeutikum handelt.
  • Im Fall von Öladjuvans-Impfstoffen ist jedoch bekannt gewesen, dass nicht nur die immunsteigernde Wirkung dieser Impfstoffe sondern auch ihre Stabilität als pharmazeutische Zubereitungen von, beispielsweise, den verwendeten Emulsions-Typen und Ölkomponenten, sowie den Arten der grenzflächenaktiven Mittel, die enthalten sein sollen, beträchtlich beeinflusst wird. In Bezug auf, im Besonderen, inaktivierte Impfstoffe, ist es sehr schwierig gewesen, einen Impfstoff herzustellen, der seine Wirkung des Herbeiführens ausreichend schützender Immunität über einen langen Zeitraum in guter Reproduzierbarkeit zeigen kann.
  • Außerdem sind auch Öladjuvans-Impfstoffe vom Wasser-in-Öl-in-Wasser-Typ vorgeschlagen worden, um die Nachteile der herkömmlichen Öladjuvans-Impfstoffe vom Wasser-in-Öl-Typ, d.h. die Lokalreaktionen und die Neigung, an den Injektionsstellen zu verbleiben, zu beseitigen, aber jegliches herkömmliche Mittel hat immer noch an Problemen mit Langzeitstabilität der so erhaltenen pharmazeutischen Zubereitungen gelitten und demgemäß läge die praktische Verwendung derartiger Impfstoffe in weiter Zukunft.
  • EP-A-0135376 offenbart einen Emulgator auf Polyoxyethylen-Polyoxypropylen-Basis zusammen mit einem grenzflächenaktiven Mittel auf Glykolether-Basis und einer Öl- sowie einer wässrigen Phase als Impfstoff-Adjuvans.
  • Chem.Abs., 119, 18, Kurzreferat 80201 offenbart nicht-ionische grenzflächenaktive Mittel als Emulgatoren für Adjuvantien vom Wasser-in-Öl-Typ, die bei Verwendung in einem Impfstoff hohe Stabilität und lang anhaltende Wirkung zeigen.
  • WO94 20071.A beschreibt öl-basierte Wasser-in-Öl-Impfstoffemulsionen, die eine Antigenhaltige wässrige Phase, eine ölige Phase und Emulgatoren, die Polyglycerinester (Polyoxyethylen-Rizinusöle) sind, umfassen.
  • Zusammenfassung der Erfindung
  • Die vorliegende Erfindung betrifft einen Öladjuvans-Impfstoff, dessen Anwendungen herkömmlich wegen ihren unerwünschten Lokalreaktionen, Verbleibneigung und ungenügenden Stabilität der pharmazeutischen Zubereitungen eingeschränkt gewesen sind, und beabsichtigt folglich, die Probleme im Zusammenhang mit den derartigen herkömmlichen Impfstoffen zu lösen. Demgemäß ist eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, einen Öladjuvans-Impfstoff bereitzustellen, der die Antikörper-produzierende Fähigkeit über einen Zeitraum aufrechterhalten kann, ohne jegliche immunsteigernde Substanz in der Formulierung zu verwenden, und der für den lebenden Körper nicht schädlich ist und die Stabilität der so erhaltenen pharmazeutischen Zubereitungen bereitstellt.
  • Die Erfinder haben verschiedene Untersuchungen durchgeführt, um die vorstehende Aufgabe zu lösen. Als Ergebnis haben sie herausgefunden, dass ein Öladjuvans-Impfstoff vom Wasser-in-Öl-Typ, umfassend (i) eine Ölkomponente, die bei üblicher Temperatur in flüssigem Zustand vorliegt, (ii) einen Emulgator, der ein spezifisches, lipophiles, nicht-ionisches, grenzflächenaktives Mittel und ein Polyoxyethylen-Hydroxyfettsäuretriglycerid umfasst, und (iii) eine wässrige Phase, die eine biologisch verträgliche und wirksame Menge einer Antigen-Komponente enthält; und ein Öladjuvans-Impfstoff vom Wasser-in-Öl-in-Wasser-Typ, umfassend eine innere Phase, die durch die vorstehend erwähnte Emulsion vom Wasser-in-Öl-Typ (d.h. das vorstehend erwähnte Öladjuvans) gebildet wird, und eine äußere wässrige Phase, die einen spezifischen Emulgator umfasst, ausgezeichnete lokale Sicherheit auf Inokulation hin zeigen, und auch eine ausgezeichnete Fähigkeit zeigen, eine Antikörperproduktion über einen langen Zeitraum herbeizuführen. Weiterhin haben sie herausgefunden, dass ein Öladjuvans-Impfstoff, der hohe Stabilität sogar in einem sehr niedrigen Vikositätsbereich zeigt und dessen Fähigkeit, eine Antikörperproduktion herbeizuführen, ausgezeichnet ist und der eine Fähigkeit zeigt, hohe Antikörperproduktivität aufrechtzuerhalten, mit einem Verfahren hergestellt werden kann, welches die Schritte der Zugabe zu einer Ölkomponente, die bei üblicher Temperatur in flüssigem Zustand vorliegt, eines grenzflächenaktiven Mittels, das ein spezifisches, lipophiles, nicht-ionisches grenzflächenaktives Mittel und ein Polyoxyethylen-Hydroxyfettsäuretriglycerid umfasst, und eines gel-artigen Verbundstoffes, der durch Emulgieren eines spezifischen, lipophilen, nicht-ionischen grenzflächenaktiven Mittels und einer wässrigen Lösung, die eine Aminosäure oder ein Salz davon und einen spezifischen Zucker oder Zuckeralkohol enthält, erhalten wird; und der anschließenden Zugabe einer wässrigen Phase, die Antigene enthält, zu dem so erhaltenen Gemisch, um so eine Emulsion zu bilden, umfasst. Weiterhin haben sie herausgefunden, dass ein Öladjuvans-Impfstoff vom Wasser-in-Öl-in-Wasser-Typ, der gegenüber herkömmlichen Impfstoffen des gleichen Typs in Sicherheit und Stabilität ausgezeichnet ist und ausgezeichnete lang anhaltende Fähigkeit, eine Antikörperproduktion herbeizuführen, zeigen kann, mit einem Verfahren hergestellt werden kann, das die Schritte der Herstellung eines Öladjuvans-Impfstoffes vom Wasser-in-Öl-Typ mit dem vorstehend erwähnten Verfahren, und der anschließenden Zugabe des Öladjuvans-Impfstoffes vom Wasser-in-Öl-Typ zu einer wässrigen Phase, die einen spezifischen Emulgator enthält, um so dieselbe zu emulgieren, umfasst. Auf Basis der obigen Feststellungen haben sie die vorliegende Erfindung vollendet.
  • Gemäß einer ersten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird ein Öladjuvans-Impfstoff vom Wasser-in-Öl-Typ bereitgestellt, umfassend 20 bis 90 Gew.-% einer Ölphase A), die bei einer Temperatur im Bereich von 15 bis 25°C in flüssigem Zustand vorliegt; 0,5 bis 30 Gew.-% eines Emulgators, der ein nicht-ionisches grenzflächenaktives Mittel B), bei dem es sich um einen Teilester handelt, der von einem mehrwertigen Alkohol, der mindestens drei Hydroxylgruppen trägt, und einer Fettsäure abgeleitet ist und bei 40°C in flüssigem Zustand vorliegt, und Polyoxyethylen(20 bis 60 Mol)-Hydroxyfettsäuretriglycerid C) umfasst; 5 bis 75 Gew.-% einer wässrigen Phase D), die eine biologisch verträgliche und wirksame Menge an Antigenen enthält; und, bezogen auf das Gewicht der wässrigen Phase D), E) 0,01 bis 10 Gew.-% einer Aminosäure oder eines Salzes davon und 0,01 bis 10 Gew.-% eines nicht-reduzierenden Zuckers oder Zuckeralkohols mit mindestens 5 Hydroxylgruppen in dem Molekül.
  • Vorzugsweise enthält ein Impfstoff gemäß Anspruch 1 zusätzlich eine äußere wässrige Phase F), umfassend 0,2 bis 20 Gew.-% eines Emulgators, der ein nicht-ionisches grenzflächenaktives Mittel umfasst und der einen Gesamt-HLB-Wert von nicht weniger als 10 aufweist.
  • Ausführungsformen der Erfindung
  • Die Komponente A) des erfindungsgemäßen Öladjuvans-Impfstoffes ist eine Ölkomponente, die bei üblicher Temperatur in flüssigem Zustand vorliegt. Der hier verwendete Begriff „übliche Temperatur" bedeutet eine Temperatur, die in den Bereich von 15 bis 25°C fällt.
  • Die Ölkomponente, die bei üblicher Temperatur in flüssigem Zustand vorliegt und die in der vorliegenden Erfindung verwendet werden kann, kann verschieden aus Ölgrundlagen vom Estertyp oder Ölgrundlagen vom nicht-Estertyp, die gewöhnlich in, beispielsweise, Nahrungsmitteln, Arzneistoffen und Kosmetika verwendet worden sind und die bei üblicher Temperatur in flüssigem Zustand vorliegen, ausgewählt werden. Beispiele für Ölgrundlagen vom nicht-Estertyp, die bei üblicher Temperatur in flüssigem Zustand vorliegen, schließen dünnflüssige Paraffine, Squalen, Squalan und Polybutene ein. Außerdem schließen Beispiele für Ölgrundlagen vom Estertyp, die bei üblicher Temperatur in flüssigem Zustand vorliegen, verschiedene Ester, die sich von mittelkettigen gesättigten Fettsäuren, wie z.B. n-Caprylsäure und n-Caprinsäure, oder langkettigen ungesättigten Fettsäuren, wie z.B. Ölsäure und Linolsäure, und Alkoholen, ableiten; natürlich vorkommende Fettsäureester, beispielsweise flüssige Pflanzenöle, wie z.B. Erdnussöl, Olivenöl, Sonnenblumenkernöl, Safloröl und Jojobaöl, und flüssige Öle, die von Tieren stammen, wie z.B. Sägebauchfischöl, ein, die alleine oder in Kombination verwendet werden können, je nach den Zwecken. Öle, wie z.B. Esterderivate von Ölsäure und Pflanzenölen, weisen unter anderem verschiedene Vorteile auf, derart, dass sie verhältnismäßig hohe Stabilität gegen Oxidation aufweisen, sie hohe Affinität zu Organgeweben aufweisen und ihre lokale Stimulation und Verbleibneigung vermindert werden können, und deshalb ist es bevorzugt, mindestens einen Vertreter, ausgewählt aus nur diesen metabolisierbaren Ölen, als die Ölkomponente zu verwenden. Überdies ist es besonders bevorzugt, eine Ölgrundlage vom Estertyp zu verwenden, die einen Ester, der sich von einer Fettsäure ableitet, die nicht weniger als 85 Gew.-% cis-Δ-9-Octadecensäure und nicht weniger als 90 Gew.-% cis-Δ-9-Alkensäuren umfasst, und einen Alkohol, wie z.B. Glycerin, Diglycerin, Propylenglykol, Ethylalkohol, Decylalkohol und Oleylalkohol, der nicht weniger als 85 Gew.-% cis-Δ-9-Octadecenol und nicht weniger als 90 Gew.-% cis-Δ-9-Alkenole umfasst, umfasst. In einer anderen Ausführungsform ist es in der vorliegenden Erfindung auch möglich, ein Gemisch des/der vorstehenden Öls/Öle vom Estertyp mit Squalen zu verwenden.
  • Die als einer der Emulgatoren, die den erfindungsgemäßen Öladjuvans-Impfstoff bilden, verwendete Komponente B) ist ein lipophiles, nicht-ionisches, grenzflächenaktives Mittel, bei dem es sich um einen Teilester handelt, der von einem mehrwertigen Alkohol, der mindestens drei Hydroxylgruppen trägt, und einer Fettsäure abgeleitet ist und der bei 40°C in flüssigem Zustand vorliegt. Der vorstehende Teilester variiert je nach den Arten der verwendeten mehrwertigen Alkohole. Falls beispielsweise der mehrwertige Alkohol Glycerin ist, das drei Hydroxylgruppen trägt, ist der Teilester ein Gemisch, das hauptsächlich Monoester, Di-ester und eine kleine Menge an Triestern davon umfasst; falls der mehrwertige Alkohol Diglycerin oder Sorbitan ist, die 4 Hydroxylgruppen tragen, ist der Teilester ein Gemisch, das hauptsächlich Monoester, Di-ester und kleine Mengen an Triestern und Tetraestern davon umfasst. Diese Teilester können alleine oder in jeglicher Kombination verwendet werden, da sie bei einer Temperatur von 40°C in flüssigem Zustand vorliegen und lipophil sind.
  • Beispiele für derartige mehrwertige Alkohole, die mindestens drei Hydroxylgruppen tragen, die als ein Bestandteil zum Herstellen der Teilester verwendet werden, schließen Glycerin, Diglycerin, Triglycerin, Tetraglycerin, Hexaglycerin, Octaglycerin, Decaglycerin, Xylit, Sorbit, Mannit und Sorbitan ein.
  • Beispiele für Fettsäuren, die zum Herstellen der Teilester verwendet werden, sind eine Vielfalt von bekannten Fettsäuren, wie z.B. n-Caprylsäure, n-Caprinsäure, Laurinsäure, Ölsäure und Linolsäure, soweit sie mit den vorstehenden mehrwertigen Alkoholen reagieren können, um die vorstehenden Teilester zu bilden, die bei 40°C in flüssigem Zustand vorliegen. Unter diesen Fettsäuren sind die Fettsäuren besonders bevorzugt, die nicht weniger als 85 Gew.-% cis-Δ-9-Octadecensäure und nicht weniger als 90 Gew.-% cis-Δ-9-Alkensäuren umfassen.
  • Besonders geeignete Teilester, die als die Komponente B) verwendet werden, sind beispielsweise Glycerinmonooleat, Sorbitanmonooleat, Sorbitandioleat, Diglycerinmonooleat und Diglycerindioleat, die sich von der Fettsäure ableiten, die nicht weniger als 85 Gew.-% cis-Δ-9-Octadecensäure und nicht weniger als 90 Gew.-% cis-Δ-9-Alkensäuren umfasst. Da diese Teilester hochreine Ölsäure, die darin als ein Acylrest enthalten ist, enthalten, sind sie ausgezeichnet in der Stabilität gegen Oxidation, was bei Verwendung als Emulgatoren erforderlich ist, können einen hohen Grad der räumlichen Ausrichtung zwischen diesen Molekülen des grenzflächenaktiven Mittels sicherstellen und sind demgemäß ausgezeichnet in den funktionellen Kennzeichen, wie z.B. Emulsions-stabilisierende Wirkung. Deshalb erlauben diese Teilester die Verbesserung in der Stabilität der zum Schluss hergestellten Öladjuvans-Impfstoffe und eine wesentliche Verbesserung in der Sicherheit bei Inokulation, gegenüber herkömmlichen Ölsäurederivaten, die derzeit auf den Markt gebracht worden sind.
  • In dem Polyoxyethylen(20 bis 60 Mol)-Hydroxyfettsäuretriglycerid, das in dem erfindungsgemäßen Öladjuvans-Impfstoff als die Komponente C) verwendet wird, sind Rizinusöl und hydriertes Rizinusöl Beispiele für Hydroxyfettsäuretriglyceride. In dieser Beziehung erlaubt die Verwendung einer derartigen Komponente C), falls die durchschnittliche Ethylenoxidzahl weniger als 20 Mol beträgt, keine Bildung einer stabilen Emulsion in einem niedrigen Vikositätsbereich und als Folge erlaubt die Verwendung davon niemals die Herstellung eines zufrieden stellenden Öladjuvans-Impfstoffes. Andererseits neigt, falls die durchschnittliche Ethylenoxidzahl 60 Mol übersteigt, die so erhaltene Emulsion zum leichten Hervorrufen der Phasenumkehrung der Emulsion und folglich erlaubt die Verwendung davon niemals die letztliche Herstellung eines zufrieden stellenden Öladjuvans-Impfstoffes. Die Menge an Polyoxyethylen-Hydroxyfettsäuretriglycerid, die in dem Impfstoff enthalten sein soll, liegt vorzugsweise im Bereich von etwa 0,5 bis 10 Gew.-% auf der Basis des Gesamtgewichts der Formulierung (das Gesamtgewicht des Öladjuvans-Impfstoffes vom Wasser-in-Öl-Typ). Falls sie weniger als 0,5 Gew.-% beträgt, kann die Stabilität des so erhaltenen emulgierten Impfstoffes vermindert sein. Andererseits ruft, falls sie 10 Gew.-% übersteigt, die so erhaltene Emulsion leicht eine Phasenumkehrung hervor und die Stabilität des erhaltenen Impfstoffes kann demgemäß vermindert sein.
  • Eine Aminosäure oder ein Salz davon und ein nicht-reduzierender Zucker oder ein Zuckeralkohol mit mindestens 5 Hydroxylgruppen in dem Molekül, die/der in der vorliegenden Erfindung verwendet wird, wird nachstehend als „Komponente E)" bezeichnet. Die Stabilität des emulgierten erfindungsgemäßen Impfstoffes kann weiter verbessert werden durch Einarbeiten der Komponente E), das heißt, eine Aminosäure oder ein Salz davon und ein nicht-reduzierenden Zucker oder ein Zuckeralkohol mit mindestens 5 Hydroxylgruppen in dem Molekül, in den Öladjuvans-Impfstoff. Die hier verwendete Aminosäure oder das Salz davon kann aus denjenigen ausgewählt werden, die gewöhnlich in Nahrungsmitteln oder Pharmazeutika verwendet werden, und die in verschiedenen Standards, wie z.B. der „Japanischen Pharmakopöe", den „Standards für Bestandteile von Arzneistoffen, die nicht in der Japanischen Pharmakopöe sind" und „Japanische Pharmazeutische Exzipienten" spezifiziert sind. Beispiele für Aminosäuren sind Glycin, Alanin, Arginin-hydrochlorid, Asparagin, Asparaginsäure, Glutamin, Glutaminsäure, Histidin, Leucin, Isoleucin, Prolin, Hydroxyprolin, Serin, Threonin, Valin und Phenylalanin, wobei neutrale Aminosäuren unter ihnen bevorzugt sind. Überdies sind Beispiele für Aminosäuresalze monovalente Metallsalze, wie z.B. Natrium- und Kaliumsalze; und divalente Metallsalze, wie z.B. Calcium- und Magnesiumsalze. Unter diesen Aminosäuren und Salzen davon sind Natriumaspartat-monohydrat, Kaliumaspartat-dihydrat, Natriumglutamat-monohydrat und Kaliumglutamat-monohydrat besonders bevorzugt. Diese Aminosäuren liegen im Allgemeinen in den L-Formen vor, aber Isomere davon, wie z.B. die D-Form oder die DL-Formen, die ein Gemisch aus diesen Isomeren darstellen, können ebenso in der vorliegenden Erfindung verwendet werden.
  • Der hier verwendete vorstehende nicht-reduzierende Zucker oder Zuckeralkohol mit mindestens 5 Hydroxylgruppen in dem Molekül kann aus denjenigen ausgewählt werden, die gewöhnlich in Nahrungsmitteln oder Pharmazeutika verwendet werden, und die in verschiedenen Standards, wie z.B. der „Japanischen Pharmakopöe", den „Standards für Bestandteile von Arzneistoffen, die nicht in der Japanischen Pharmakopöe sind" und „Japanische Pharmazeutische Exzipienten" spezifiziert sind, wobei Trehalose, Xylit, Sorbit, Mannit, Lactit in der Erfindung besonders bevorzugt verwendet werden.
  • Die Mengen der hier verwendeten Aminosäure oder des Salzes davon und des nicht-reduzierenden Zuckers oder Zuckeralkohols mit mindestens 5 Hydroxylgruppen in dem Molekül liegt geeigneterweise jeweilig im Bereich von 0,01 bis 10 Gew.-% bezogen auf das Gesamtgewicht der Formulierung (das Gesamtgewicht des Öladjuvans-Impfstoffes).
  • In dem Öladjuvans-Impfstoff kann das Verhältnis der Ölkomponente A) zu der Komponente D), d.h. der wässrigen Phase, die Antigene enthält, geeignet ausgewählt werden, je nach den Anwendungen, den Zwecken des Adjuvans oder der Art des ausgewählten Antigens. Im Besonderen erhält der erfindungsgemäße Öladjuvans-Impfstoff seine hohe Stabilität aufrecht, bedingt durch die Verwendung einer Kombination aus einer spezifischen Ölkomponente und einem spezifischen Emulgator und entsprechend kann das Verhältnis der Ölkomponente zu der wässrigen Phase, die ein Antigen enthält, über einen großen Bereich variieren. Im Allgemeinen kann das Verhältnis geeigneterweise so ausgewählt werden, dass das Gewichtsverhältnis der Ölkomponente zu der wässrigen Phase im Bereich von 90:5 bis 20:75, vorzugsweise von 80:15 bis 30:65, liegt.
  • Bei der Herstellung des Adjuvans liegt die Gesamtmenge der vorstehenden Komponente B), d.h. das nicht-ionische grenzflächenaktive Mittel, und der Komponente C), d.h. das Polyoxyethylen(20 bis 60 Mol)-Hydroxyfettsäuretriglycerid, wünschenswerterweise im Bereich von 0,5 bis 30 Gew.-%, vorzugsweise von 3 bis 20 Gew.-%, bezogen auf das Gesamtgewicht der Formulierung. Das ist, weil kein stabiles emulgiertes System hergestellt werden kann, falls sie weniger als 0,5 Gew.-% beträgt, während die Verwendung des Emulgators in einer höheren Menge als 30 Gew.-% zu der Bildung eines Adjuvans führt, das hohe Reaktivität an der lokalen Injektonsstelle zeigt und keinen gewünschten erfindungsgemäßen Öladjuvans-Impfstoff mit hoher Stabilität bereitstellen kann.
  • Eine erste Ausführungsform des erfindungsgemäßen Öladjuvans-Impfstoffes betrifft einen Öladjuvans-Impfstoff, der die vorstehende Ölkomponente, den Emulgator und die wässrige Phase, die ein Antigen enthält, umfasst, und der Öladjuvans-Impfstoff kann beispielsweise mit dem folgenden Verfahren hergestellt werden. Das Verfahren umfasst die Zugabe, zu einer Ölkomponente als der Komponente A), eines nicht-ionischen grenzflächenaktiven Mittels [Komponente B)], das bei 40°C in flüssigem Zustand vorliegt, und eines Polyoxyethylen(20 bis 60 Mol)-Hydroxyfettsäuretriglycerids [Komponente C)], gefolgt von Mischen dieser Bestandteile unter Rühren, die anschließende Zugabe einer wässrigen Phase [Komponente D)], die eine biologisch verträgliche und wirksame Menge an Antigenen enthält, und deren Mischen unter Rühren, um eine Emulsion zu ergeben. Dieses Verfahren erlaubt die Herstellung eines Öladjuvans-Impfstoffes vom Wasser-in-Öl-Typ, der in einem guten emulgierten Zustand vorliegt.
  • In der vorliegenden Erfindung kann ein Öladjuvans-Impfstoff vom Wasser-in-Öl-Typ, der eine niedrige Viskosität und hohe Stabilität aufweist, sogar wenn er bei niedriger Temperatur gelagert wird, ohne die Sicherheit davon zu beeinträchtigen, mit einem Verfahren hergestellt werden, umfassend die Schritte der Zugabe zu einer Ölphase A), die bei üblicher Temperatur in flüssigem Zustand vorliegt, eines nicht-ionischen grenzflächenaktiven Mittels B), bei dem es sich um einen Teilester handelt, der sich von einem mehrwertigen Alkohol, der mindestens drei Hydroxylgruppen trägt, und einer Fettsäure ableitet und der bei 40°C in flüssigem Zustand vorliegt, eines Polyoxyethylen(20 bis 60 Mol)-Hydroxyfettsäuretriglycerids C) und eines Produkts, das durch Mischen des nicht-ionischen grenzflächenaktiven Mittels als der Komponente B) und einer wässrigen Lösung, die die Komponente E) enthält, erhalten wird, wobei das Gewichtsverhältnis des nicht-ionischen grenzflächenaktiven Mittels als der Komponente B) zur wässrigen Lösung der Komponente E) im Bereich von 1:1 bis 1:20 liegt, und dem anschließenden Emulgieren des Gemischs, bis ein steifer, gel-artiger Verbundstoff gebildet wird; des anschließenden Mischens dieser Bestandteile, um so eine Dispersion zu bilden; der Zugabe einer wässrigen Phase D), die eine biologisch verträgliche und wirksame Menge an Antigenen enthält, zu der so erhaltenen Dispersion; und deren Mischen unter Rühren, um so die wässrige Phase zu emulgieren. Falls die Temperatur der Bestandteile ansteigt infolge der Aktion eines Rührgerätes in dem vorstehenden Schritt zum Herstellen des steifen, gel-artigen Verbundstoffes, der die Komponente B), d.h. ein nicht-ionisches grenzflächenaktives Mittel, bei dem es sich um einen Teilester handelt, der sich von einem mehrwertigen Alkohol, der mindestens drei Hydroxylgruppen trägt, und einer Fettsäure ableitet und der bei 40°C in flüssigem Zustand vorliegt, und die wässrige Lösung, die die Komponente E) enthält, umfasst, kann der Rührvorgang ausgeführt werden, während die Bestandteile gekühlt werden, um die Temperatur auf einem Niveau zu halten, das nicht höher ist als die übliche Temperatur.
  • In dieser Beziehung kann das optimale Mischungsverhältnis der Komponente B) zu der wässrigen Lösung der Komponente E) geeignet ausgewählt werden, je nach den Arten und Konzentrationen der Aminosäure oder des Salzes davon und des nicht-reduzierenden Zuckers oder eines Zuckeralkohols, die in der wässrigen Lösung der Komponente E) vorhanden sind. Falls die wässrige Lösung der Komponente E) beispielsweise eine wässrige Lösung ist, die 5 Gew.-% Natrium-L-glutamat-monohydrat und 5 Gew.-% Lactit enthält, wird das Gewichtsverhältnis der Komponente B) zu der wässrigen Lösung der Komponente E) geeigneterweise auf den Bereich von 1:2 bis 1:10 eingestellt. Außerdem wird, falls die wässrige Lösung 30 Gew.-% Natrium-L-glutamat-monohydrat und 20 Gew.-% Lactit umfasst, das Gewichtsverhältnis der Komponente B) zu der wässrigen Lösung der Komponente E) geeigneterweise auf den Bereich von 1:2 bis 1:15 eingestellt. In dieser Hinsicht ist es wünschenswert, dass die Konzentration der Komponente E) in der wässrigen Lösung auf ein so hoch wie mögliches Niveau innerhalb des Löslichkeitsbereichs der Aminosäure oder des Salzes davon, beziehungsweise des nicht-reduzierenden Zuckers oder Zuckeralkohols, eingestellt wird.
  • Eine weitere Ausführungsform des erfindungsgemäßen Öladjuvans-Impfstoffes betrifft einen Öladjuvans-Impfstoff vom Wasser-in-Öl-in-Wasser-Typ, der eine innere Phase, die den vorstehenden Öladjuvans-Impfstoff vom Wasser-in-Öl-Typ umfasst und eine äußere wässrige Phase, die mindestens ein nicht-ionisches grenzflächenaktives Mittel umfasst, welches einen Gesamt-HLB (Hydrophilie-Lipophilie-Balancefaktor)-Wert von nicht weniger als 10 aufweist, umfasst.
  • In dieser Beschreibung wird der „HLB" (Hydrophilie-Lipophilie-Balancefaktor)-Wert nach der von W.C. Griffin (siehe W.C. Griffin, J. Soc. Cosmetic Chemists, 1949, 1, S. 311) vorgeschlagenen Gleichung bestimmt.
  • Der Emulgator, der einen Gesamt-HLB-Wert von nicht weniger als 10 aufweist und der in der äußeren Phase verwendet wird, der den erfindungsgemäßen Öladjuvans-Impfstoff vom Wasser-in-Öl-in-Wasser-Typ bildet, kann alleine oder in jeglicher Kombination davon verwendet werden, mit der Maßgabe, dass er einen Gesamt-HLB-Wert von nicht weniger als 10 aufweist. Das nicht-ionische grenzflächenaktive Mittel, das einen Gesamt-HLB-Wert von nicht weniger als 10 aufweist, kann aus denjenigen ausgewählt werden, die normalerweise auf dem Fachgebiet der Pharmazeutika verwendet werden, beispielsweise Polyoxyethylen-Hydroxyfettsäuretriglyceride, Polyoxyethylen-Sorbitanfettsäureester, Polyoxyethylen-Alkyl(alkenyl)ether, Polyoxyethylen-Polyoxypropylenglykol, die einen Gesamt-HLB-Wert von nicht weniger als 10 aufweisen.
  • Unter diesen können Polyoxyethylen-Hydroxyfettsäuretriglyceride mit einem HLB von nicht weniger als 10 dieselben sein wie diejenigen, die als Bestandteile des Öladjuvans-Impfstoffes verwendet werden, d.h. Polyoxyethylen-Hydroxyfettsäuretriglyceride, wie z.B. Rizinusöl und/oder hydriertes Rizinusöl, die eine durchschnittliche Ethylenoxidzahl von nicht weniger als 20, vorzugsweise 20 bis 60, aufweisen. Das ist, weil die Verwendung eines Polyoxyethylen-Hydroxyfettsäuretriglycerids mit einer durchschnittlichen Ethylenoxidzahl von weniger als 20 keine stabile Dispersion des Öladjuvans vom Wasser-in-Öl-Typ, das als eine innere Phase dient, in der äußeren Phase erlaubt und demgemäß keine Bildung eines guten Öladjuvans-Impfstoffes vom Wasser-in-Öl-in-Wasser-Typ erlaubt. Andererseits neigt, falls sie 60 übersteigt, die so erhaltene innere Wasser-in-Öl-Emulsionsphase zum leichten Hervorrufen der Phasenumkehrung davon und folglich erlaubt die Verwendung davon niemals die letztliche Herstellung eines zufrieden stellenden Öladjuvans-Impfstoffes vom Wasser-in-Ol-in-Wasser-Typ.
  • Überdies können Polyoxyethylen-Sorbitanfettsäureester mit einem HLB-Wert von nicht weniger als 10 beispielsweise ungesättigte Polyoxyethylen-Sorbitanfettsäure (wie z.B. Ölsäure)-ester und gesättigte Polyoxyethylen-Sorbitanfettsäure (wie z.B. Laurinsäure und n-Caprylsäure)-ester sein, die eine durchschnittliche Ethylenoxidzahl von nicht weniger als 10 aufweisen. Im Besonderen werden vorzugsweise Polyoxyethylen-Sorbitanfettsäureester verwendet, in denen die Fettsäure nicht weniger als 85 Gew.-% cis-Δ-9-Octadecensäure und nicht weniger als 90 Gew.-% cis-Δ-9-Alkensäuren umfasst und die eine durchschnittliche Ethylenoxidzahl, die im Bereich von 10 bis 40 liegt, aufweisen. Das ist, weil das Oladjuvans vom Wasser-in-Öl-Typ, das als die innere Phase dient, nicht stabil in der äußeren wässrigen Phase dispergiert werden kann, falls die durchschnittliche Ethylenoxidzahl weniger als 10 beträgt, und demgemäß erlaubt die Verwendung davon niemals die Herstellung eines zufrieden stellenden Öladjuvans-Impfstoffes vom Wasser-in-Öl-in-Wasser-Typ. Andererseits neigt, falls sie 40 übersteigt, das Öladjuvans vom Wasser-in-Öl-Typ, das als die innere Phase dient, zum leichten Hervorrufen der Phasenumkehrung der Emulsion und folglich erlaubt die Verwendung davon niemals die letztliche Herstellung eines zufrieden stellenden Öladjuvans-Impfstoffes vom Wasser-in-Öl-in-Wasser-Typ.
  • Die Polyoxyethylen-Alkyl(Alkenyl)ether können beispielsweise allgemein bekannte grenzflächenaktive Mittel vom Alkylethertyp, wie z.B. Polyoxyethylenalkylether, beispielsweise Polyoxyethylenlaurylether und Polyoxyethylencetylether; und Polyoxyethylenalkenylether, beispielsweise Polyoxyethylenoleylether, sein. Bevorzugt sind diejenigen, die jeweils einen Alkyl(Alkenyl)rest mit 12 bis 18 Kohlenstoffatomen tragen und eine durchschnittliche Ethylenoxidzahl von nicht weniger als 10 und vorzugsweise von 10 bis 40 aufweisen. Im Besonderen Polyoxyethylenoleylether, in denen Oleylalkohole nicht weniger als 85 Gew.-% cis-Δ-9-Octadecenol und nicht weniger als 90 Gew.-% cis-Δ-9-Alkenole und 10 bis 40 Mol Ethylenoxid umfassen. In dieser Hinsicht neigt, falls die Anzahl an Kohlenstoffatomen in dem Alkyl(Alkenyl)rest weniger als 12 beträgt, das Öladjuvans vom Wasser-in-Öl-Typ, das als die innere Phase dient, zum leichten Hervorrufen der Phasenumkehrung der Emulsion und folglich erlaubt die Verwendung davon niemals die Herstellung eines zufrieden stellenden Öladjuvans-Impfstoffes vom Wasser-in-Öl-in-Wasser-Typ, während, falls sie 18 übersteigt, das Öladjuvans vom Wasser-in-Öl-Typ, das als die innere Phase dient, nicht stabil in der äußeren wässrigen Phase dispergiert werden kann und demgemäß erlaubt die Verwendung davon niemals die letztliche Herstellung eines zufrieden stellenden Öladjuvans-Impfstoffes vom Wasser-in-Öl-in-Wasser-Typ. Überdies erlaubt die Verwendung eines Polyoxyethylen-Alkyl(Alkenyl)ethers mit einer durchschnittlichen Ethylenoxidzahl von weniger als 10 keine stabile Dispersion des Öladjuvans vom Wasser-in-Öl-Typ, das als innere Phase dient, in der äußeren Phase und erlaubt demgemäß keine Bildung eines guten Öladjuvans-Impfstoffes vom Wasser-in-Öl-in-Wasser-Typ. Andererseits neigt, falls sie 40 übersteigt, das Öladjuvans vom Wasser-in-Öl-Typ, das als die innere Phase dient, zum leichten Hervorrufen der Phasenumkehrung der Emulsion und folglich erlaubt die Verwendung davon niemals die letztliche Herstellung eines zufrieden stellenden Öladjuvans-Impfstoffes vom Wasser-in-Öl-in-Wasser-Typ.
  • Das hier verwendbare Polyoxyethylen-Polyoxypropylenglykol kann aus denjenigen ausgewählt werden, die gewöhnlich in Pharmazeutika und Kosmetika verwendet werden, die einen HLB-Wert von nicht weniger als 10 aufweisen. Unter diesen sind diejenigen mit einer Ethylenoxidzahl (durchschnittlicher Grad der Polymerisation), die im Bereich von 50 bis 200 liegt, einer Propylenoxidzahl (durchschnittlicher Grad der Polymerisation), die im Bereich von 5 bis 80 liegt, und dem Verhältnis der Molzahl (durchschnittlicher Grad der Polymerisation) von Ethylenoxid zu der von Propylenoxid von nicht weniger als 2:1 bevorzugt. Das ist, weil das Öladjuvans vom Wasser-in-Öl-Typ, das als die innere Phase dient, nicht stabil in der äußeren wässrigen Phase dispergiert werden kann, falls das Molverhältnis weniger als 2:1 beträgt, und demgemäß würde die Verwendung davon keine Herstellung eines zufrieden stellenden Öladjuvans-Impfstoffes vom Wasser-in-Öl-in-Wasser-Typ erlauben.
  • Wie früher erklärt, kann der in der äußeren Phase verwendete Emulgator, der den erfindungsgemäßen Öladjuvans-Impfstoff vom Wasser-in-Öl-in-Wasser-Typ bildet, einer mit einem HLB-Wert von nicht weniger als 10 sein oder ein Gemisch aus zwei oder mehreren Emulgatoren, wobei mindestens einer der Emulgatoren ein nicht-ionisches grenzflächenaktives Mittel mit einem hohen HLB-Wert ist und mindestens einer der Emulgatoren ein nicht-ionisches grenzflächenaktives Mittel mit einem niedrigen HLB-Wert ist und wobei der Gesamt-HLB-Wert nicht weniger als 10 beträgt. In dieser Beziehung können die hier verwendbaren nicht-ionischen grenzflächenaktiven Mittel mit einem niedrigen HLB-Wert aus denjenigen ausgewählt werden, die gewöhnlich in der Pharmazie und so weiter verwendet werden, wie z.B. Sorbitanmonooleat, Sorbitansesquioleat und Glycerinmonooleat. Ein Beispiel für das Gemisch aus nicht-ionischen grenzflächenaktiven Mitteln mit einem hohen HLB-Wert und nicht-ionischen grenzflächenaktiven Mitteln mit einem niedrigen HLB-Wert schließt diejenigen ein, das Polyoxyethylen-Sorbitanmonooleat mit einem HLB-Wert von 15,0 und Sorbitansesquioleat mit einem HLB-Wert von 3,7 umfasst. In diesem Fall wird Ersteres mit Letzterem in einem Gewichtsverhältnis von 2:1 gemischt, um ein Emulgatorgemisch mit einem Gesamt-HLB-Wert von etwa 11,2 zu ergeben.
  • In der vorliegenden Erfindung kann die Stabilität des geplanten Öladjuvans-Impfstoffes vom Wasser-in-Öl-in-Wasser-Typ weiter verbessert werden, falls, als der in der äußeren Phase enthaltene Emulgator, eine Kombination des vorstehenden Emulgatorgemischs, das einen Gesamt-HLB-Wert von nicht weniger als 10 aufweist, mit einem Glycerinphospholipid verwendet wird.
  • Die mit in Verbindung dem hier verwendbaren Emulgatorgemisch, das einen Gesamt-HLB-Wert von nicht weniger als 10 aufweist, verwendeten Glycerinphospholipide, können verschieden ausgewählt werden aus natürlich vorkommenden Glycerinphospholipiden, wie z.B. denjenigen, die von der Sojabohne stammen (z.B. Sojalecithin und hydriertes Sojalecithin), denjenigen, die vom Eigelb stammen (z.B. Eigelbphospholipid und hydriertes Eigelbphospholipid); verschiedenen hochreinen Phospholipiden (z.B. Phosphatidylcholin und Phosphatidylethanolamin); und Lysophospholipiden, die alleine oder in jeglicher Kombination verwendet werden können. Bei Verwendung einer Kombination aus dem vorstehenden Emulgatorgemisch, das einen Gesamt-HLB-Wert von nicht weniger als 10 aufweist, und einem Glycerinphospholipid, wird das Mischungsverhältnis (nach Gewicht): Gemisch aus nicht-ionischen grenzflächenaktiven Mittel/Glycerinphospholipid geeigneterweise auf den Bereich von 20:1 bis 1:2 eingestellt.
  • Die Menge des in der äußeren Phase verwendeten Emulgators, der den erfindungsgemäßen Öladjuvans-Impfstoff vom Wasser-in-Öl-in-Wasser-Typ bildet, liegt im Bereich von 0,2 bis 20 Gew.-% und besonders bevorzugt von 0,5 bis 10 Gew.-% auf der Basis des Gesamtgewichts der äußeren Phase. Das ist, weil keine stabile Emulsion vom Wasser-in-Öl-in-Wasser-Typ erhalten werden kann, falls die Menge an Emulgator weniger als 0,2 Gew.-% beträgt, während, falls sie 20 Gew.-% übersteigt, die Viskosität des so erhaltenen Öladjuvans-Impfstoffes auf ein derartiges Niveau ansteigt, dass der Impfstoff nicht gut wäre für die Inokulation und die Sicherheit davon im Fall der Injektion, die Sicherheit davon ist manchmal erniedrigt.
  • Außerdem kann das Mischungsverhältnis von der Phase des Öladjuvans vom Wasser-in-Öl-Typ, das als die innere Phase dient, zu der äußeren wässrigen Phase in dem erfindungsgemäßen Öladjuvans-Impfstoff vom Wasser-in-Öl-in-Wasser-Typ geeigneterweise eingestellt werden, je nach den Zwecken, so dass es in den Bereich von 2:1 bis 1:10, als Gewichtsverhältnis ausgedrückt, fällt.
  • In den so hergestellten Öladjuvans-Impfstoff vom Wasser-in-Öl-in-Wasser-Typ können Antigene in die innere wässrige Phase effizient eingearbeitet werden, mit dem folgenden Zweistufenverfahren, in dem im Voraus ein Öladjuvans-Impfstoff vom Wasser-in-Öl-Typ unter Verwendung einer wässrigen Phase, die das Antigen enthält, hergestellt wird und der anschließenden Zugabe der so erhaltenen Wasser-in-Öl-Emulsion als eine innere Phase zu einer äußeren wässrigen Phase, die einen spezifischen Emulgator umfasst, um so eine Emulsion zu bilden.
  • Der erfindungsgemäße Öladjuvans-Impfstoff vom Wasser-in-Öl-in-Wasser-Typ kann beispielsweise mit dem folgenden Verfahren hergestellt werden. Das Verfahren umfasst die Schritte der Herstellung, im Voraus, eines Antigen-haltigen erfindungsgemäßen Öladjuvans-Impfstoffes vom Wasser-in-Öl-Typ und der anschließenden Zugabe des Öladjuvans-Impfstoffes vom Wasser-in-Öl-Typ zu einer wässrigen Phase, die einen Mischemulgator, der mindestens ein nicht-ionisches grenzflächenaktives Mittel enthält und einen Gesamt-HLB-Wert von nicht weniger als 10 aufweist, oder eine Kombination aus einem Mischemulgator, der mindestens ein nicht-ionisches grenzflächenaktives Mittel enthält und einen Gesamt-HLB-Wert von nicht weniger als 10 aufweist, mit einem Glycerinphospholipid umfasst, um so den Antigen-haltigen Öladjuvans-Impfstoff vom Wasser-in-Öl-Typ noch einmal zu emulgieren. In der vorliegenden Erfindung erlaubt das Zweistufen-Emulgierverfahren die Bildung eines hochstabilen Öladjuvans-Impfstoffes vom Wasser-in-Öl-in-Wasser-Typ, der in der Sicherheit ausgezeichnet ist.
  • Genauer gesagt, kann ein Öladjuvans-Impfstoff vom Wasser-in-Öl-in-Wasser-Typ mit höherer Stabilität hergestellt werden, ohne Beeinträchtigen der Sicherheit davon, durch zuerst Zugeben zu einer Ölkomponente, die bei üblicher Temperatur in flüssigem Zustand vorliegt, eines lipophilen, nicht-ionischen, grenzflächenaktiven Mittels (Komponente B), bei dem es sich um einen Teilester handelt, der sich von einem mehrwertigen Alkohol, der mindestens drei Hydroxylgruppen trägt, und einer Fettsäure ableitet, und bei 40°C in flüssigem Zustand vorliegt, eines Polyoxyethylen(20 bis 60 Mol)-Hydroxyfettsäuretriglycerids (Komponente C) und eines Produkts, das durch Mischen des nicht-ionischen grenzflächenaktiven Mittels als der Komponente B und einer wässrigen Lösung, die eine Komponente E enthält, in einem Gewichtsverhältnis: Erstere zu Letzterer im Bereich von 1:1 bis 1:20, erhalten wird, und anschließendem Rühren dieser Bestandteile bis ein steifer, gel-artiger Verbundstoff gebildet wird; anschließend deren Mischen und Dispergieren; danach Zugabe einer äußeren wässrigen Phase (Komponente D), die eine biologisch verträgliche und wirksame Menge an Antigenen enthält, zu der so erhaltenen Dispersion, anschließendes Mischen unter Rühren, um die wässrige Phase in der Ölphase zu emulgieren und um so einen hochstabilen Öladjuvans-Impfstoff vom Wasser-in-Öl-Typ zu ergeben; und der anschließenden Zugabe des Öladjuvans-Impfstoffes vom Wasser-in-Öl-Typ zu einer äußeren wässrige Phase, die einen Mischemulgator, der mindestens ein nicht-ionisches grenzflächenaktives Mittel enthält und einen Gesamt-HLB-Wert von nicht weniger als 10 aufweist, oder ein Kombination aus einem Mischemulgator, der mindestens ein nicht-ionisches grenzflächenaktives Mittel enthält und einen Gesamt-HLB-Wert von nicht weniger als 10 aufweist, mit einem Glycerinphospholipid umfasst, um so den Antigen-haltigen Öladjuvans-Impfstoff vom Wasser-in-Öl-Typ in der wässrigen Phase zu re-emulgieren.
  • Die wässrige Phase des erfindungsgemäßen Öladjuvans-Impfstoffes vom Wasser-in-Öl-Typ, die innere wässrige Phase des erfindungsgemäßen Öladjuvans-Impfstoffes vom Wasser-in-Öl-in-Wasser-Typ oder die äußere wässrige Phase des erfindungsgemäßen Öladjuvans-Impfstoffes vom Wasser-in-Öl-in-Wasser-Typ, können aus denjenigen ausgewählt werden, die in herkömmlichen Impfstoffen verwendet werden, wie z.B. Phosphatpufferlösungen, physiologische Salzlösung oder Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung.
  • In dem erfindungsgemäßen Öladjuvans-Impfstoff vom Wasser-in-Öl-in-Wasser-Typ kann das Antigen je nach, beispielsweise, den Bedingungen für die Herstellung nur in der inneren wässrigen Phase innerhalb der Emulsion vom Wasser-in-Öl-Typ, die als die innere Phase dient, vorhanden sein oder in den beiden wässrigen Phasen, d.h. der inneren wässrigen Phase und der äußeren wässrigen Phase, infolge teilweisen Ausflusses davon aus der inneren wässrigen Phase, aber auf jeden Fall wäre die Wirkung des erfindungsgemäßen Öladjuvans-Impfstoffes überhaupt nicht beeinträchtigt.
  • In der vorliegenden Erfindung können die Ölphase und die innere wässrige Phase, die den Öladjuvans-Impfstoff bilden, die äußere wässrige Phase, die den Öladjuvans-Impfstoff vom Wasser-in-Öl-in-Wasser-Typ oder dergleichen bildet, selbstverständlich verschiedene Komponenten umfassen, welche nicht direkt an der Adjuvansaktivität beteiligt sind, wie z.B. ein Puffer, ein Stabilisator und/oder eine Komponente, die den osmotischen Druck reguliert, die in verschiedenen Pharmazeutika verwendet werden.
  • Überdies kann bei Herstellung des erfindungsgemäßen Öladjuvans-Impfstoffes jegliches Mittel, das generell die Emulsionsbildung erlaubt, verwendet werden, beispielsweise gegenwärtig verwendete Emulgatoren, wie z.B. ein Homogenisierungsmischer, ein Homogenisator und ein CLEARMIX (erhältlich von M TECHNIQUE Co., Ltd.) und ein Membran-Emulgator, bei dem eine poröse Glasmembrane zum Einsatz kommt.
  • Antigene, die in der wässrigen Phase, die den erfindungsgemäßen Öladjuvans-Impfstoff bildet, enthalten sein sollen, können verschiedene Arten und verschiedene Formen von Antigenen einschließen, beispielsweise abgetötete Bakterienzellen und inaktivierte Viruspartikel, die gewöhnlich in der Herstellung von Impfstoffen verwendet werden, sowie Schutz-Antigene, wie z.B. Adhäsionsproteine und Virushüllen. Jedoch kann eine große Vielfalt an geplanten Antigenen in einer biologisch verträglichen und wirksamen Menge verwendet werden, da der erfindungsgemäße Öladjuvans-Impfstoff, der sehr stabil ist, leicht durch die Verwendung einer Kombination aus einer spezifischen Ölkomponente und einem spezifischen Emulgator erhalten werden kann.
  • Darüber hinaus kann der erfindungsgemäße Öladjuvans-Impfstoff selbstverständlich in der Emulsion verschiedene Arzneistoffe, wie z.B. Antibiotika, anstelle des Antigens umfassen.
  • Wie oben im Einzelnen diskutiert worden ist, erlaubt die vorliegende Erfindung die Injektionsmittelherstellung von verschiedenen Arten von Arzneimitteln, wie z.B. Öladjuvans-Impfstoffe, durch verschiedenes Auswählen von Komponenten, die in den Mitteln enthalten sein sollen. Beispielsweise können Impfstoffe zum tiermedizinischen Gebrauch Immunsteigerung herbeiführen durch Verabreichen derselben durch subkutane Injektion oder intramuskuläre Injektion und durch Verabreichung davon auf oralem, rektalem und nasalem Weg, aber die Applikationswege können geeignet ausgewählt werden, je nach dem jeweiligen speziellen Zweck.
  • Bei Herstellung des Adjuvans müssen die zu verwendenden Konstituenten, wie z.B. die Ölgrundlage, die grenzflächenaktiven Mittel und die wässrige Phase, sterilisiert werden. Das Sterilisationsverfahren kann ausgewählt werden, indem die charakteristischen Eigenschaften dieser Verbindungen in Betracht gezogen werden.
  • Wie oben erklärt worden ist, liegt der mit der vorliegenden Erfindung hergestellte Öladjuvans-Impfstoff in einer ziemlich stabilen Emulsion von hoher Qualität vor. Deshalb ist der Impfstoff in Stabilität und Sicherheit ausgezeichnet und kann an eine Vielfalt von Organismen verabreicht werden, indem er sowohl Wirksamkeit als auch Sicherheit sicherstellt.
  • Die vorliegende Erfindung wird nachstehend mit Bezug auf die folgenden Beispiele in größeren Einzelheiten beschrieben, aber die vorliegende Erfindung ist nicht auf diese spezifischen Beispiele beschränkt. In den folgenden Beispielen bedeutet der Begriff „Teil" „Gewichtsteil", sofern nicht anders spezifiziert.
  • BEISPIELE
  • [Herstellung des Öladjuvans-Impfstoffes]
  • Die in den folgenden Beispielen verwendeten Öladjuvans-Impfstoffe wurden jeweils mit dem folgenden Verfahren hergestellt. Alle der in die Formulierungen eingeschlossenen Komponenten wurden durch Erhitzen oder Filtration sterilisiert, was ausgewählt wurde, indem die charakteristischen Eigenschaften jeder speziellen Komponente in Betracht gezogen wurden. Überdies wurden alle Arbeitsvorgänge, wie z.B. Rühren und Emulsionsbildung, innerhalb eines Reinraumarbeitstisches unter keimfreien Bedingungen ausgeführt.
  • Vergleichsbeispiel: Impfstoff a
  • In diesem Beispiel wurde Ethyloleat [„NOFABLE® EO-90", erhältlich von der NOF CORPORATION; Acylzusammensetzung: cis-Δ-9-Octadecensäuregehalt 88 Gew.-% und cis-Δ-9-Alkensäurengehalt 94 Gew.-%] als die Komponente A verwendet. Zu 12 Teilen der Ölkomponente wurden 1,6 Teile Sorbitansesquioleat [„NOFABLE® SO-992", erhältlich von der NOF CORPORATION; Acylzusammensetzung: cis-Δ-9-Octadecensäuregehalt 99 Gew.-% und cis-Δ-9-Alkensäurengehalt 99 Gew.-%] und 0,4 Teile, auf 50°C erhitztes, Polyoxyethylen(40)-hydriertes Rizinusöl zugegeben; gefolgt von ausreichendem Rühren, allmählicher Zugabe von 6 Teilen einer wässrigen Phase (Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung), die ein Antigen enthält, zu dem vorstehenden Gemisch unter Rühren und anschließendem Mischen und Emulgieren bei üblicher Temperatur und 8000 U/min für 10 Minuten unter Verwendung des CLEARMIX CLM-0.8S (erhältlich von M TECHNIQUE Co., Ltd.), um so einen Öladjuvans-Impfstoff a vom Wasser-in-Öl-Typ zu ergeben.
  • Vergleichsbeispiel: Impfstoff b
  • In diesem Beispiel umfasste die Komponente A ein Gemisch aus 6 Teilen gereinigtem Sonnenblumenkernöl und 6 Teilen Squalen. Zu der Ölkomponente wurden 1,6 Teile Sorbitansesquioleat [„NOFABLE® SO-902", erhältlich von der NOF CORPORATION; Acylzusammensetzung: cis-Δ-9-Octadecensäuregehalt 88 Gew.-% und cis-Δ-9- Alkensäurengehalt 94 Gew.-%] und 0,4 Teile, auf 50°C erhitztes, Polyoxyethylen(40)-hydriertes Rizinusöl zugegeben, gefolgt von ausreichendem Rühren, allmählicher Zugabe von 8 Teilen einer wässrigen Phase (Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung), die ein Antigen enthält, zu dem vorstehenden Gemisch unter Rühren und anschließendem Mischen und Emulgieren des so erhaltenen Gemischs mit den gleichen, in Beispiel 1 verwendeten Vorgehensweisen, um so einen Öladjuvans-Impfstoff b vom Wasser-in-Öl-Typ zu ergeben.
  • Vergleichsbeispiel: Impfstoff c
  • In diesem Beispiel wurde Oleyloleat [„NOFABLE® OO-9080", erhältlich von der NOF CORPORATION; Acylzusammensetzung: cis-Δ-9-Octadecensäuregehalt 88 Gew.-% und cis-Δ-9-Alkensäurengehalt 94 Gew.-%] als die Komponente A verwendet. Zu 12 Teilen der Ölkomponente wurden 0,8 Teile Sorbitansesquioleat [„NOFABLE® SO-902", erhältlich von der NOF CORPORATION; Acylzusammensetzung: cis-Δ-9-Octadecensäuregehalt 88 Gew.-% und cis-Δ-9-Alkensäurengehalt 94 Gew.-%], 0,7 Teile Glycerinmonooleat [„NOFABLE® GO-901 ", erhältlich von der NOF CORPORATION; Acylzusammensetzung: cis-Δ-9-Octadecensäuregehalt 88 Gew.-% und cis-Δ-9-Alkensäurengehalt 94 Gew.-%] und 0,5 Teile, auf 50°C erhitztes, Polyoxyethylen(40)-hydriertes Rizinusöl zugegeben, gefolgt von ausreichendem Rühren, allmählichem Zugeben von 8 Teilen einer wässrigen Phase (Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung), die ein Antigen enthält, zu dem vorstehenden Gemisch unter Rühren und anschließendem Mischen und Emulgieren des so erhaltenen Gemischs mit den gleichen, in Beispiel 1 verwendeten Vorgehensweisen, um so einen Öladjuvans-Impfstoff c vom Wasser-in-Öl-Typ zu ergeben.
  • Beispiel 4: Impfstoff X1
  • In diesem Beispiel wurden 5 Teile Glycerinmonooleat [„NOFABLE® GO-901", erhältlich von der NOF CORPORATION; Acylzusammensetzung: cis-Δ-9-Octadecensäuregehalt 88 Gew.-% und cis-Δ-9-Alkensäurengehalt 94 Gew.-%] als die Komponente B verwendet und eine wässrige Lösung, erhalten durch Lösen von 3 Teilen Natrium-L-glutamat-monohydrat und einem Teil Mannit in 6 Teilen destilliertem Wasser, als die Komponente E. Die Komponente B und die wässrige Lösung der Komponente E wurden gemischt und bei üblicher Temperatur und 10000 U/min für 10 Minuten im CLEARMIX® CLM-0.8S (erhältlich von M TECHNIQUE Co., Ltd.) emulgiert, um ein gel-artiges Produkt zu ergeben.
  • Dann wurden zu einem Gemisch aus 6 Teilen Oleyloleat [„NOFABLE® OO-9080", erhältlich von der NOF CORPORATION; Acylzusammensetzung: cis-Δ-9-Octadecensäuregehalt 88 Gew.-% und cis-Δ-9-Alkensäurengehalt 94 Gew.-%] und 6 Teilen Squalen als der Komponente A, 1,6 Teile Sorbitansesquioleat [„NOFABLE® SO-902", erhältlich von der NOF CORPORATION; Acylzusammensetzung: cis-Δ-9-Octadecensäuregehalt 88 Gew.-% und cis-Δ-9-Alkensäurengehalt 94 Gew.-%] als die Komponente B und 0,4 Teile, auf 50 °C erhitztes, Polyoxyethylen(40)-hydriertes Rizinusöl als die Komponente C zugegeben, gefolgt von ausreichendem Rühren, Zugabe von einem Teil des vorstehenden gel-artigen Produkts zu dem so erhaltenen Gemisch, um so Ersteres in der Ölphase zu dispergieren, allmählicher Zugabe von 8 Teilen einer wässrigen Phase, umfassend Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung, die ein Antigen enthält, zu dem vorstehenden Gemisch unter Rühren und anschließendem Mischen und Emulgieren bei üblicher Temperatur und 8000 U/min für 10 Minuten unter Verwendung des CLEARMIX® CLM-0.8S (erhältlich von M TECHNIQUE Co., Ltd.), um so einen Öladjuvans-Impfstoff X1 vom Wasser-in-Öl-Typ zu ergeben.
  • Beispiel 5: Impfstoff X2
  • In diesem Beispiel wurden 6 Teile Diglycerinmonooleat [„NOFABLE® PGO-9021L", erhältlich von der NOF CORPORATION; Acylzusammensetzung: cis-Δ-9-Octadecensäuregehalt 88 Gew.-% und cis-Δ-9-Alkensäurengehalt 94 Gew.-%) als die Komponente B verwendet und eine wässrige Lösung, erhalten durch Lösen von 4 Teilen Natrium-L-glutamat-monohydrat und einem Teil Lactit in 7 Teilen destilliertem Wasser, als die Komponente E. Die Komponente B und die wässrige Lösung der Komponente E wurden mit den gleichen, in Beispiel 4 verwendeten Vorgehensweisen gemischt und emulgiert, um ein gel-artiges Produkt zu ergeben.
  • Dann wurden zu einem Gemisch aus 6 Teilen gereinigtem Sonnenblumenkernöl und 6 Teilen Ethyloleat [„NOFABLE® EO-90", erhältlich von der NOF CORPORATION; Acylzusammensetzung: cis-Δ-9-Octadecensäuregehalt 88 Gew.-% und cis-Δ-9-Alkensäurengehalt 94 Gew.-%] als der Ölkomponente, 1,6 Teile Sorbitansesquioleat [„NONION OP-83RAT", erhältlich von der NOF CORPORATION; Acylzusammensetzung: cis-Δ-9-Octadecensäuregehalt 55 Gew.-% und cis-Δ-9-Alkensäurengehalt 78 Gew.-%] und 0,4 Teile, auf 50 °C erhitztes, Polyoxyethylen(40)-hydriertes Rizinusöl zugegeben, gefolgt von ausreichendem Rühren, Zugabe von einem Teil des vorstehenden gel-artigen Produkts zu dem so erhaltenen Gemisch, um so Ersteres in der Ölphase zu dispergieren, allmählicher Zugabe von 8 Teilen einer wässrigen Phase, umfassend Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung, die ein Antigen enthält, zu dem vorstehenden Gemisch unter Rühren und anschließendem Mischen und Emulgieren mit den gleichen, in Beispiel 4 verwendeten Vorgehensweisen, um so einen Öladjuvans-Impfstoff X2 vom Wasser-in-Öl-Typ zu ergeben.
  • Beispiel 6: Impfstoff X3
  • In diesem Beispiel wurden 4 Teile Glycerinmonooleat [„NOFABLE® GO-991P", erhältlich von der NOF CORPORATION; Acylzusammensetzung: cis-Δ-9-Octadecensäuregehalt 99 Gew.-% und cis-Δ-9-Alkensäurengehalt 99 Gew.-%] und 4 Teile Glycerindioleat [„NOFABLE® GO-902P", erhältlich von der NOF CORPORATION; Acylzusammensetzung: cis-Δ-9-Octadecensäuregehalt 88 Gew.-% und cis-Δ-9-Alkensäurengehalt 94 Gew.-%] als die Komponente B verwendet und eine wässrige Lösung, erhalten durch Lösen von 4 Teilen Natrium-L-aspartat-monohydrat und einem Teil Trehalose in 11 Teilen destilliertem Wasser, als die Komponente E. Die Komponente B und die Komponente E wurden mit den gleichen, in Beispiel 4 verwendeten Vorgehensweisen gemischt und emulgiert, um ein gel-artiges Produkt zu ergeben.
  • Dann wurden zu einem Gemisch aus 8 Teilen Decyloleat [„NOFABLE® DO-99", erhältlich von der NOF CORPORATION; Acylzusammensetzung: cis-Δ-9-Octadecensäuregehalt 99 Gew.-% und cis-Δ-9-Alkensäurengehalt 99 Gew.-%] und 4 Teilen Squalen als die Ölkomponente 0,8 Teile Sorbitansesquioleat [„NOFABLE® SO-992", erhältlich von der NOF CORPORATION; Acylzusammensetzung: cis-Δ-9-Octadecensäuregehalt 99 Gew.-% und cis-Δ-9-Alkensäurengehalt 99 Gew.-%], 1,2 Teile Glycerinmonooleat [„NOFABLE® GO-991", erhältlich von der NOF CORPORATION; Acylzusammensetzung: cis-Δ-9-Octadecensäuregehalt 99 Gew.-% und cis-Δ-9-Alkensäurengehalt 99 Gew.-%] und 0,4 Teile, auf 50 °C erhitztes, Polyoxyethylen(40)-hydriertes Rizinusöl zugegeben, gefolgt von ausreichendem Rühren, Zugabe von einem Teil des vorstehenden gel-artigen Produkts zu dem so erhaltenen Gemisch, um so Ersteres in der Ölphase zu dispergieren, allmählicher Zugabe von 10 Teilen einer wässrigen Phase, umfassend Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung, die ein Antigen enthält, zu dem vorstehenden Gemisch unter Rühren und anschließendem Mischen und Emulgieren mit den gleichen, in Beispiel 4 verwendeten Vorgehensweisen, um so einen Öladjuvans-Impfstoff X3 vom Wasser-in-Öl-Typ zu ergeben.
  • Vergleichsbeispiel: Impfstoff d
  • In diesem Beispiel wurde Ethyloleat [„NOFABLE® EO-99", erhältlich von der NOF CORPORATION; Acylzusammensetzung: cis-Δ-9-Octadecensäuregehalt 99 Gew.-% und cis-Δ-9-Alkensäurengehalt 99 Gew.-%] als die Komponente A verwendet. Zu 12 Teilen der Ölkomponente wurden 1,7 Teile Sorbitansesquioleat [„NOFABLE® SO-902", erhältlich von der NOF CORPORATION; Acylzusammensetzung: cis-Δ-9-Octadecensäuregehalt 88 Gew.-% und cis-Δ-9-Alkensäurengehalt 94 Gew.-%] und 0,3 Teile, auf 50°C erhitztes, Polyoxyethylen(40)-hydriertes Rizinusöl zugegeben, gefolgt von ausreichendem Rühren, allmählicher Zugabe von 8 Teilen einer wässrigen Phase (Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung), die ein Antigen enthält, zu dem vorstehenden Gemisch unter Rühren und anschließendem Mischen und Emulgieren mit den gleichen, in Beispiel 1 verwendeten Vorgehensweisen, um so einen Öladjuvans-Impfstoff vom Wasser-in-Öl-Typ zu ergeben.
  • Dann wurden 0,4 Teilen Polyoxyethylen(160)-polyoxypropylen(30)-glykol (mit einem HLB-Wert von 16,0) als ein grenzflächenaktives Mittel zu 10 Teilen Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung zugegeben und gleichmäßig darin gelöst, gefolgt von allmählicher Zugabe von 10 Teilen des vorstehenden Öladjuvans vom Wasser-in-Öl-Typ zu der Dispersion unter Rühren und anschließendem Mischen und Emulgieren bei üblicher Temperatur und 8000 U/min für 5 Minuten unter Verwendung des CLEARMIX® CLM-0.8S (erhältlich von M TECHNIQUE Co., Ltd.), um so einen Öladjuvans-Impfstoff d vom Wasser-in-Öl-in-Wasser-Typ zu ergeben.
  • Vergleichsbeispiel: Impfstoff e
  • In diesem Beispiel wurde ein Gemisch aus 6 Teilen gereinigtem Jojobaöl und 6 Teilen Squalen als die Komponente A verwendet. Zu der Ölkomponente wurden 1,6 Teile Sorbitansesquioleat [„NONION OP-83RAT", erhältlich von der NOF CORPORATION; Acylzusammensetzung: cis-Δ-9-Octadecensäuregehalt 55 Gew.-% und cis-Δ-9-Alkensäurengehalt 78 Gew.-%] und 0,4 Teile, auf 50°C erhitztes, Polyoxyethylen(40)-hydriertes Rizinusöl zugegeben, gefolgt von ausreichendem Rühren, allmählicher Zugabe von 8 Teilen einer wässrigen Phase (Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung), die ein Antigen enthält, zu dem vorstehenden Gemisch unter Rühren und anschließendem Mischen und Emulgieren mit den gleichen, in Beispiel 1 verwendeten Vorgehensweisen, um so einen Öladjuvans-Impfstoff vom Wasser-in-Öl-Typ zu ergeben.
  • Dann wurden 0,2 Teile Polyoxyethylen(20)-Sorbitanmonooleat („NONION OT-221" erhältlich von der NOF CORPORATION; Acylzusammensetzung: cis-Δ-9-Octadecensäuregehalt 55 Gew.-% und cis-Δ-9-Alkensäurengehalt 78 Gew.-%; HLB: 15,8) als ein grenzflächenaktives Mittel zu 10 Teilen Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung zugegeben und gleichmäßig darin gelöst, gefolgt von allmählicher Zugabe von 10 Teilen des vorstehenden Öladjuvans vom Wasser-in-Öl-Typ zu der Dispersion unter Rühren und anschließendem Mischen und Emulgieren mit dem gleichen, in Beispiel 7 verwendeten Verfahren, um so einen Öladjuvans-Impfstoff e vom Wasser-in-Öl-in-Wasser-Typ zu ergeben.
  • Vergleichsbeispiel: Impfstoff f
  • In diesem Beispiel wurde als die Komponente A ein Gemisch, umfassend 6 Teile Oleyloleat [„NOFABLE® OO-9080", erhältlich von der NOF CORPORATION; Acylzusammensetzung: cis-Δ-9-Octadecensäuregehalt 88 Gew.-% und cis-Δ-9-Alkensäurengehalt 94 Gew.-%] und 6 Teile Glycerintrioleat („NOFABLE® GO-993", erhältlich von der NOF CORPORATION; Acylzusammensetzung: cis-Δ-9-Octadecensäuregehalt 99 Gew.-% und cis-Δ-9-Alkensäurengehalt 99 Gew.-%], verwendet. Zu der Ölkomponente wurden 0,9 Teile Sorbitansesquioleat [„NOFABLE® SO-902", erhältlich von der NOF CORPORATION; Acylzusammensetzung: cis-Δ-9-Octadecensäuregehalt 88 Gew.-% und cis-Δ-9-Alkensäurengehalt 94 Gew.-%], 0,8 Teile Glycerinmonooleat [„NOFABLE® GO-991", erhältlich von der NOF CORPORATION; Acylzusammensetzung: cis-Δ-9-Octadecensäuregehalt 99 Gew.-% und cis-Δ-9-Alkensäurengehalt 99 Gew.-%] und 0,3 Teile, auf 50 °C erhitztes, Polyoxyethylen(40)-hydriertes Rizinusöl zugegeben, gefolgt von ausreichendem Rühren, allmählicher Zugabe von 8 Teilen einer wässrigen Phase (Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung), die ein Antigen enthält, zu dem vorstehenden Gemisch unter Rühren und anschließendem Mischen und Emulgieren mit den gleichen, in Beispiel 1 verwendeten Vorgehensweisen, um so einen Öladjuvans-Impfstoff vom Wasser-in-Öl-Typ zu ergeben.
  • Dann wurden 0,14 Teile Polyoxyethylen(60)-hydriertes Rizinusöl (mit einem HLB-Wert von 14,8) und 0,06 Teile hydriertes Sojalecithin („COATSOME® NC-21", erhältlich von der NOF CORPORATION) als grenzflächenaktive Mittel zu 10 Teilen Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung zugegeben und gleichmäßig darin gelöst, gefolgt von allmählicher Zugabe von 10 Teilen des vorstehenden Öladjuvans vom Wasser-in-Öl-Typ zu der Dispersion unter Rühren und anschließendem Mischen und Emulgieren mit dem gleichen, in Beispiel 7 verwendeten Verfahren, um so einen Öladjuvans-Impfstoff f vom Wasser-in-Öl-in-Wasser-Typ zu ergeben.
  • Beispiel 10: Impfstoff X4
  • In diesem Beispiel wurden 5 Teile Glycerinmonooleat [„NOFABLE® GO-901", erhältlich von der NOF CORPORATION; Acylzusammensetzung: cis-Δ-9-Octadecensäuregehalt 98 Gew.-% und cis-Δ-9-Alkensäurengehalt 94 Gew.-%] als die Komponente B verwendet und eine wässrige Lösung, erhalten durch Lösen von 3 Teilen Natrium-L-glutamat-monohydrat und einem Teil Mannit in 6 Teilen destilliertem Wasser, als die Komponente E. Die Komponente B und die Komponente E wurden mit den gleichen, in Beispiel 4 verwendeten Vorgehensweisen gemischt und emulgiert, um ein gel-artiges Produkt zu ergeben.
  • Dann wurden zu 12 Teilen Ethyloleat [„NOFABLE® EO-90", erhältlich von der NOF CORPORATION; Acylzusammensetzung: cis-Δ-9-Octadecensäuregehalt 88 Gew.-% und cis-Δ-9-Alkensäurengehalt 94 Gew.-%] als der Ölkomponente, 1,7 Teile Sorbitansesquioleat [„NOFABLE® SO-902", erhältlich von der NOF CORPORATION; Acylzusammensetzung: cis-Δ-9-Octadecensäuregehalt 88 Gew.-% und cis-Δ-9-Alkensäurengehalt 94 Gew.-%] und 0,3 Teile, auf 50°C erhitztes, Polyoxyethylen(40)-hydriertes Rizinusöl zugegeben, gefolgt von ausreichendem Rühren, Zugabe von einem Teil des vorstehenden gel-artigen Produkts zu dem so erhaltenen Gemisch, um so Ersteres in der Ölphase zu dispergieren, allmählicher Zugabe von 8 Teilen einer wässrigen Phase, umfassend Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung, die ein Antigen enthält, zu dem vorstehenden Gemisch unter Rühren und anschließendem Mischen und Emulgieren mit den gleichen, in Beispiel 4 verwendeten Vorgehensweisen, um so einen Öladjuvans-Impfstoff vom Wasser-in-Öl-Typ zu ergeben.
  • Dann wurden 0,4 Teile Polyoxyethylen(160)-polyoxypropylen(30)-glykol (mit einem HLB-Wert von 16,0) als ein grenzflächenaktives Mittel zu 10 Teilen Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung zugegeben und gleichmäßig darin gelöst, gefolgt von allmählicher Zugabe von 10 Teilen des vorstehenden Öladjuvans-Impfstoffes vom Wasser-in-Öl-Typ zu der Dispersion unter Rühren und anschließendem Mischen und Emulgieren und Mischen bei üblicher Temperatur und 8000 U/min für 5 Minuten unter Verwendung des CLEARMIX® CLM-0.8S (erhältlich von M TECHNIQUE Co., Ltd.), um so einen Öladjuvans-Impfstoff X4 vom Wasser-in-Öl-in-Wasser-Typ zu ergeben.
  • Beispiel 11: Impfstoff X5
  • In diesem Beispiel wurden 6 Teile Sorbitanmonooleat [„NOFABLE® SO-901", erhältlich von der NOF CORPORATION; Acylzusammensetzung: cis-Δ-9-Octadecensäuregehalt 88 Gew.-% und cis-Δ-9-Alkensäurengehalt 94 Gew.-%] als die Komponente B verwendet und eine wässrige Lösung, erhalten durch Lösen von 4 Teilen Natrium-L-glutamat-monohydrat und einem Teil Lactit in 7 Teilen destilliertem Wasser, als die Komponente E. Die Komponente B und die Komponente E wurden mit den gleichen, in Beispiel 4 verwendeten Vorgehensweisen gemischt und emulgiert, um ein gel-artiges Produkt zu ergeben.
  • Dann wurden zu einem Gemisch, umfassend 10 Teile gereinigtes Sonnenblumenkernöl und 2 Teile Squalan, als der Ölkomponente, 1,7 Teile Sorbitansesquioleat [„NOFABLE® SO-902", erhältlich von der NOF CORPORATION; Acylzusammensetzung: cis-Δ-9-Octadecensäuregehalt 88 Gew.-% und cis-Δ-9-Alkensäurengehalt 94 Gew.-%] und 0,3 Teile, auf 50°C erhitztes, Polyoxyethylen(40)-hydriertes Rizinusöl zugegeben, gefolgt von ausreichendem Rühren, Zugabe von einem Teil des vorstehenden gel-artigen Produkts zu dem so erhaltenen Gemisch, um so Ersteres in der Ölphase zu dispergieren, allmählicher Zugabe von 8 Teilen einer wässrigen Phase, umfassend Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung, die ein Antigen enthält, zu dem vorstehenden Gemisch unter Rühren und anschließendem Mischen und Emulgieren mit den gleichen, in Beispiel 1 verwendeten Vorgehensweisen, um so einen Öladjuvans-Impfstoff vom Wasser-in-Öl-Typ zu ergeben.
  • Dann wurden 0,14 Teile Polyoxyethylen(20)-Sorbitanmonooleat („NONION OT-221" erhältlich von der NOF CORPORATION; Acylzusammensetzung: cis-Δ-9-Octadecensäuregehalt 55 Gew.-% und cis-Δ-9-Alkensäurengehalt 78 Gew.-%; HLB: 15,8) und 0,06 Teile hydriertes Sojalecithin („COATSOME® NC-21" erhältlich von der NOF CORPORATION) als grenzflächenaktive Mittel zu 10 Teilen Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung zugegeben und gleichmäßig darin dispergiert, gefolgt von allmählicher Zugabe von 10 Teilen des vorstehenden Öladjuvans-Impfstoffes vom Wasser-in-Öl-Typ zu der Dispersion unter Rühren und anschließendem Mischen und Emulgieren mit dem gleichen, in Beispiel 7 verwendeten Verfahren, um so einen Öladjuvans-Impfstoff X5 vom Wasser-in-Öl-in-Wasser-Typ zu ergeben.
  • Vergleichsbeispiel 1: Impfstoff g
  • Zu 6 Teilen dünnflüssigem Paraffin („CRYSTOL® 52" erhältlich von der ESSO Corporation) als der Ölkomponente, wurden 0,8 Teile Sorbitansesquioleat („NONION OP-83RAT", erhältlich von der NOF CORPORATION; Acylzusammensetzung: cis-Δ-9-Octadecensäuregehalt 55 Gew.-% und cis-Δ-9-Alkensäurengehalt 83 Gew.-%) und 0,2 Teile Polyoxyethylen(20)-Sorbitanmonooleat („NONION OT-221", erhältlich von der NOF CORPORATION; Acylzusammensetzung: cis-Δ-9-Octadecensäuregehalt 55 Gew.-% und cis-Δ-9-Alkensäurengehalt 78 Gew.-%) zugegeben, gefolgt von allmählicher Zugabe von 3 Teilen einer wässrigen Phase (Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung), die ein Antigen enthält, unter ausreichendem Rühren und anschließendem Mischen und Emulgieren mit dem gleichen, in Beispiel 1 verwendeten Verfahren, um einen Vergleichs-Öladjuvans-Impfstoff g vom Wasser-in-Öl-Typ zu ergeben.
  • Vergleichsbeispiel 2: Impfstoff h
  • Zu einem Gemisch, umfassend 6 Teile Oleyloleat („NOFABLE® OO-9080", erhältlich von der NOF CORPORATION; Acylzusammensetzung: cis-Δ-9-Octadecensäuregehalt 88 Gew.-% und cis-Δ-9-Alkensäurengehalt 94 Gew.-%) und 6 Teile Squalan, als die Komponente A, wurden 1,6 Teile Sorbitansesquioleat („NONION OP-83RAT", erhältlich von der NOF CORPORATION; Acylzusammensetzung: cis-Δ-9-Octadecensäuregehalt 55 Gew.-% und cis-Δ-9-Alkensäurengehalt 78 Gew.-%) und 0,4 Teile Polyoxyethylen(20)-Sorbitanmonooleat („NONION OT-221 ", erhältlich von der NOF CORPORATION; Acylzusammensetzung: cis-Δ-9-Octadecensäuregehalt 55 Gew.-% und cis-Δ-9-Alkensäurengehalt 78 Gew.-%) zugegeben, gefolgt von ausreichendem Rühren, allmählicher Zugabe von 8 Teilen einer wässrigen Phase (Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung), die ein Antigen enthält, unter Rühren und anschließendem Mischen und Emulgieren mit dem gleichen, in Beispiel 1 verwendeten Verfahren, um einen Vergleichs-Öladjuvans-Impfstoff h vom Wasser-in-Öl-Typ zu ergeben.
  • Vergleichsbeispiel 3: Impfstoff i
  • Zu einem Gemisch, umfassend 6 Teile Oleyloleat („NOFABLE® OO-9080", erhältlich von der NOF CORPORATION; Acylzusammensetzung: cis-Δ-9-Octadecensäuregehalt 88 Gew.-% und cis-Δ-9-Alkensäurengehalt 94 Gew.-%) und 6 Teile Squalan, als die Komponente A, wurden 1,6 Teile Sorbitansesquioleat („NONION OP-83RAT", erhältlich von der NOF CORPORATION; Acylzusammensetzung: cis-Δ-9-Octadecensäuregehalt 55 Gew.-% und cis-Δ-9-Alkensäurengehalt 78 Gew.-%) und 0,4 Teile Polyoxyethylen(20)-Sorbitanmonooleat („NONION OT-221 ", erhältlich von der NOF CORPORATION; Acylzusammensetzung: cis-Δ-9-Octadecensäuregehalt 55 Gew.-% und cis-Δ-9-Alkensäurengehalt 78 Gew.-%) zugegeben, gefolgt von ausreichendem Rühren, allmählicher Zugabe von 8 Teilen einer wässrigen Phase (Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung), die ein Antigen enthält, unter Rühren und anschließendem Mischen und Emulgieren mit dem gleichen, in Beispiel 1 verwendeten Verfahren, um einen Öladjuvans-Impfstoff vom Wasser-in-Öl-Typ zu ergeben.
  • Dann wurden 0,14 Teile Polyoxyethylen(60)-hydriertes Rizinusöl (HLB: 14,8) und 0,06 Teile hydriertes Sojalecithin („COATSOME® NC-21" erhältlich von der NOF CORPORATION) als grenzflächenaktive Mittel zu 10 Teilen Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung zugegeben und gleichmäßig darin dispergiert, gefolgt von allmählicher Zugabe von 10 Teilen des vorstehenden Öladjuvans vom Wasser-in-Öl-Typ zu der Dispersion unter Rühren und anschließendem Mischen und Emulgieren mit dem gleichen, in Beispiel 7 verwendeten Verfahren, um so einen Vergleichs-Öladjuvans-Impfstoff i vom Wasser-in-Öl-in-Wasser-Typ zu ergeben.
  • Vergleichsbeispiel 4: Impfstoff Y1
  • Ein gel-artiges Produkt wurde durch Emulgieren von 5 Teilen Sorbitanmonooleat [„NOFABLE® SO-901", erhältlich von der NOF CORPORATION; Acylzusammensetzung: cis-Δ-9-Octadecensäuregehalt 88 Gew.-% und cis-Δ-9-Alkensäurengehalt 94 Gew.-%] und einer wässrigen Lösung, erhalten durch Lösen von 4 Teilen Lactit in 6 Teilen destilliertem Wasser, mit dem gleichen, in Beispiel 4 verwendeten Verfahren hergestellt.
  • Dann wurden zu 12 Teilen Glycerintrioleat [„NOFABLE® GO-903", erhältlich von der NOF CORPORATION; Acylzusammensetzung: cis-Δ-9-Octadecensäuregehalt 88 Gew.-% und cis-Δ-9-Alkensäurengehalt 94 Gew.-%], ein Teil Sorbitansesquioleat [„NOFABLE® SO-902", erhältlich von der NOF CORPORATION; Acylzusammensetzung: cis-Δ-9-Octadecensäuregehalt 88 Gew.-% und cis-Δ-9-Alkensäurengehalt 94 Gew.-%] und 0,5 Teile Polyoxyethylen(20)-Sorbitanmonooleat („NONION OT-221 ", erhältlich von der NOF CORPORATION; Acylzusammensetzung: cis-Δ-9-Octadecensäuregehalt 55 Gew.-% und cis-Δ-9-Alkensäurengehalt 78 Gew.-%) zugegeben, gefolgt von ausreichendem Rühren, Zugabe von einem Teil des vorstehenden gel-artigen Produkts zu dem so erhaltenen Gemisch, um so Ersteres in der Ölphase zu dispergieren, allmählicher Zugabe von 6 Teilen einer wässrigen Phase, umfassend Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung, die ein Antigen enthält, zu dem vorstehenden Gemisch unter Rühren und anschließendem Mischen und Emulgieren mit den gleichen, in Beispiel 4 verwendeten Vorgehensweisen, um so einen Vergleichs-Öladjuvans-Impfstoff Y1 vom Wasser-in-Öl-Typ zu ergeben.
  • Vergleichsbeispiel 5: Impfstoff Y2
  • Zu 6 Teilen dünnflüssigem Paraffin („CRYSTOL® 52" erhältlich von der ESSO Corporation) als der Ölkomponente, wurden 0,8 Teile Sorbitansesquioleat („NONION OP-83RAT", erhältlich von der NOF CORPORATION; Acylzusammensetzung: cis-Δ-9-Octadecensäuregehalt 55 Gew.-% und cis-Δ-9-Alkensäurengehalt 78 Gew.-%) und 0,2 Teile Polyoxyethylen(20)-Sorbitanmonooleat („NONION OT-221", erhältlich von der NOF CORPORATION; Acylzusammensetzung: cis-Δ-9-Octadecensäuregehalt 55 Gew.-% und cis-Δ-9-Alkensäurengehalt 78 Gew.-%) zugegeben, gefolgt von allmählicher Zugabe von 3 Teilen einer wässrigen Phase, umfassend Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung, die ein Antigen enthält, unter ausreichendem Rühren und anschließendem Mischen und Emulgieren mit dem gleichen, in Beispiel 1 verwendeten Verfahren, um einen Öladjuvans-Impfstoff vom Wasser-in-Öl-Typ zu ergeben.
  • Dann wurden 0,2 Teile Polyoxyethylen(60)-hydriertes Rizinusöl (HLB: 14,8) als ein grenzflächenaktives Mittel zu 10 Teilen Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung zugegeben und gleichmäßig darin dispergiert, gefolgt von allmählicher Zugabe von 10 Teilen des vorstehenden Öladjuvans-Impfstoffes vom Wasser-in-Öl-Typ zu der Dispersion unter Rühren und anschließendem Mischen und Emulgieren mit dem gleichen, in Beispiel 10 verwendeten Verfahren, um so einen Vergleichs-Öladjuvans-Impfstoff Y2 vom Wasser-in-Öl-in-Wasser-Typ zu ergeben.
  • Immunisierungstests
  • Dann wurden mit spezifischen Öladjuvans-Impfstoffen, die verschiedene Antigene enthalten, Immunisierungtests ausgeführt. Bei der Kennzeichnung der einzelnen Impfstoffe zeigt das jeweils an einem spezifischen Impfstoff angebrachte Symbol an, dass der entsprechende Impfstoff ein Impfstoff ist, der auf der Basis der in einem Beispiel oder Vergleichsbeispiel offenbarten Formulierung hergestellt wurde und durch das jeweilige entsprechende Symbol spezifiziert wird.
  • Testbeispiel 1: Inaktivierter Impfstoff gegen Schweine-Actinobacillus-Infektionskrankheit
  • Actinobacillus pleuropneumoniae, Stamm NG-22 (Serotyp 2), wurde in ein Medium inokuliert, gefolgt von Belüftungs-Rotations-Kultur bei 37°C, Inaktivierung des so erhaltenen Kulturmediums mit Formalin, Gewinnung der Bakterienzellen durch Zentrifugation und Waschen der Zellen. Die so erhaltenen Zellen wurden als Antigen verwendet. Das Antigen wurde mit einer Konzentration von 1010 KBE (Kolonie-bildende Einheit) (vor Inaktivierung) pro Dosis in Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung dispergiert und die so erhaltene Dispersion wurde als eine Antigen-haltige wässrige Phase verwendet.
  • In Bezug auf immunisierte Gruppen (jede Gruppe umfasste fünf 4-Wochen-alte SPF (spezifisch pathogenfreie)-Schweine) wurde zweimal in Abständen von 4 Wochen 1 ml/Schwein des Impfstoffes a, c oder X2 oder 2 ml/Schwein des Impfstoffes d, f oder X4 intramuskulär injiziert. Wohingegen 1 ml/Schwein des Impfstoffes g oder h oder 2 ml/Schwein des Impfstoffes i oder Y2, jedem Schwein, das zu immunisierten Vergleichsgruppen (jede Gruppe umfasste fünf 4-Wochen-alte SPF-Schweine) gehörte, zweimal in Abständen von 4 Wochen intramuskulär injiziert wurde. Überdies umfasste die nicht-immunisierte Kontrollgruppe fünf Schweine und die Kontrollgruppe wurde mit jeder der immunisierten Gruppen zusammen untergebracht. Jedes Tier wurde auf die klinischen Symptome hin untersucht, einschließlich der Beobachtung der Injektionsstelle für 2 Wochen nach jeder Schutzimpfung, das Serum jeden Tieres wurde in passenden Abständen während des gesamten Testzeitraumes gewonnen und die Seren wurden auf die Antikörpertiter untersucht, wie mit dem Komplementbindungs (CF)-test bestimmt. Die Injektionsstelle wurde nach 16 Wochen ab der Anfangsinjektion des Impfstoffes durch Autopsie untersucht, um so die Größe und Verteilung der gebildeten Knötchen zu bestimmen, die auf der Basis des Läsions-Scores (keine: 0; ~ schwer: 3) beurteilt wurden, gefolgt von Berechnung des Durchschnitts von 5 Tieren in jeder Gruppe.
  • Die Ergebnisse der Sicherheit werden in Tabelle 1 aufgeführt. Die immunisierten Gruppen bekamen kein Fieber und zeigten keine Anomalie in den klinischen Symptomen. In den immunisierten Vergleichsgruppen wurde vorübergehender Anstieg der Körpertemperatur beobachtet und wurde unterdrückt. Bei der Autopsie nach 16 Wochen ab der Anfangs-Impfstoffinjektion, wurde für die immunisierten Gruppen keine spezielle Läsion beobachtet, aber bei den immunisierten Vergleichsgruppen wurden Knötchen beobachtet, die infolge der injizierten Substanzen gebildet würden. Tabelle 1: Sicherheit des inaktivierten Impfstoffes gegen Schweine-Actinobacillus-Infektionskrankheit
    Figure 00320001
    • 1) Klinisches Symptom;
    • 2) Körpertemperatur;
    • 3) (Anzahl an Tieren, an denen irgendeine Anomalie erkannt wurde)/(Anzahl an getesteten Tieren).
  • Ergebnisse der Wirksamkeiten der Impfstoffe werden in Tabellen 2-1 und 2-2 zusammengefasst. In den Gruppen unter den immunisierten Gruppen, in denen die Impfstoffe a, c oder X2 injiziert worden waren, begann der CF-Antikörpertiter nach 4 Wochen ab der Impfstoff-Injektion anzusteigen und es wurde nach 8 Wochen ab der Impfstoff-Injektion eine gute Antikörperantwort (1:128 bis 1:256) beobachtet, wobei die Antwort fast identisch war mit der, die für die immunisierten Vergleichsgruppen, in denen der Impfstoff g als Kontrolle injiziert worden war, beobachtet wurde und offensichtlich höher war als die für die Impfstoff h-injizierte Gruppe beobachtete. Der Impfstoff X4, der ein erfindungsgemäßer Öladjuvans-Impfstoff vom Wasser-in-Öl-in-Wasser-Typ war, konnte in guten Emulsionen vorgelegt werden und zeigte gute Antikörperantworten, die fast mit den für den oben erwähnten Öladjuvans-Impfstoff vom Wasser-in-Öl-Emulsionstyp beobachteten identisch waren. Die oben hergestellten Impfstoffe i und Y2 und in den immunisierten Vergleichsgruppen als Kontrolle verwendeten, lagen in instabilen Emusionen vor und diese Impfstoff-injizierten Gruppen zeigten klar eine niedrigere Antikörperantwort als die für jene mit den Impfstoffen d und f injizierten beobachtete.
  • Die vorstehenden Ergebnisse beweisen deutlich, dass der erfindungsgemäße Öladjuvans-Impfstoff eine immunsteigernde Wirkung zeigt, die annähernd identisch ist mit den für die Impfstoffe, die ein nicht-metabolisierbares Mineralöl enthalten, beobachteten, sogar wenn Ersterer nur ein metabolisierbares Öl umfasst, und dass Ersterer gegenüber den Mineralölhaltigen Impfstoffen in der lokalen Reativität ausgezeichnet ist.
  • Überdies weisen diese Ergebnisse auch nach, dass der mit dem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellte Öladjuvans-Impfstoff hohe Stabilität aufweist, sogar wenn er nur ein metabolisierbares Öl umfasst, dass der Impfstoff eine Immunisierungswirkung, die annähernd identisch ist mit der mit den herkömmlichen Öladjuvans-Impfstoffen, die nur nicht-metabolisierbare Mineralöle umfassen, erreichten, über einen langen Zeitraum zeigt und dass Ersterer in der lokalen Reaktivität gegenüber den herkömmlichen Impfstoffen, die nur Mineralöle umfassen, ausgezeichnet ist. Tabelle 2-1: Wirksamkeit des inaktivierten Impfstoffes gegen Schweine-Actinobacillus-Infektionskrankheit
    Figure 00340001
    • 1) Geometrisches Mittel des reziproken Wertes der höchsten Verdünnung, die ≥ 50% Bindung zeigt, unter Verwendung von App (Typ 2).
    Tabelle 2-2: Wirksamkeit des inaktivierten Impfstoffes gegen Schweine-Actinobacillus-Infektionskrankheit
    Figure 00340002
    • 1) Geometrisches Mittel des reziproken Wertes der höchsten Verdünnung, die ≥ 50% Bindung zeigt, unter Verwendung von App (Typ 2).
  • Testbeispiel 2: Inaktivierter Impfstoff gegen Newcastle-Krankheit (ND)
  • Der Newcastle-Krankheit-Virus, Stamm Ishii, wurde in die Allantoishöhle von 10-Tage-alten embryonierten Eiern inokuliert (108,0 EID50/Ei), gefolgt von Kultivierung bei 37°C für 4 Tage und Gewinnung der Allantoisflüssigkeit. Die Flüssigkeit wurde mit einer wässrigen Formalinlösung inaktiviert und als das Antigen verwendet. Als die wässrige Phase wurde eine Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung verwendet, zu der Formalin zugegeben wurde und deren Virusgehalt vor der Inaktivierung auf 108,0 EID50/Dosis eingestellt wurde.
  • Was immunisierte Gruppen (jede Gruppe umfasste zehn 5-Wochen-alte SPF-Hühnchen) anbetrifft, wurden 0,5 ml/Hühnchen des Impfstoffes a oder b oder 1 ml/Hühnchen des Impfstoffes d oder e intramuskulär injiziert, und was andere immunisierte Gruppen (jede Gruppe umfasste zwanzig 5-Wochen-alte SPF-Hühnchen) anbetrifft, wurden 0,5 ml/Hühnchen des Impfstoffes X1 oder X2 oder 1,5 ml/Hühnchen des Impfstoffes X5 intramuskulär injiziert. Was immunisierte Vergleichsgruppen (jede Gruppe umfasste zehn 5-Wochen-alte SPF-Hühnchen) anbetrifft, wurden 0,5 ml/Hühnchen des Impfstoffes g oder 1 ml/Hühnchen des Impfstoffes i intramuskulär injiziert, und was andere immunisierte Vergleichsgruppen (umfassten zwanzig 5-Wochen-alte SPF-Hühnchen) anbetrifft, wurden 0,5 ml/Hühnchen des Impfstoffes Y2 intramuskulär injiziert. Überdies wurden nicht-immunisierte Kontrollgruppen, die jeweils zehn oder zwanzig Hühnchen umfassten, zusammen mit den immunisierten Gruppen, die jeweils zehn oder beziehungsweise zwanzig Hühnchen umfassten, untergebracht.
  • Was die Impfstoffe a, b, d und e anbetrifft, wurde jedes Tier auf die klinischen Symptome hin untersucht, einschließlich der Beobachtung der Injektionsstelle für 10 Wochen nach der Schutzimpfung, wurde das Serum jeden Tieres nach 10 Wochen ab der Schutzimpfung gewonnen und die Sera wurden auf den Hämagglutinationshemmung (HI)-Antikörpertiter untersucht. Die Injektionsstelle wurde nach 10 Wochen ab der Schutzimpfung durch Autopsie untersucht (5 Tiere pro Gruppe), um so den Grad und die Verteilung der Rückstände zu bestimmen, wobei die Rückstände auf der Basis des Läsions-Scores (keine: 0; ~ schwer: 3) beurteilt wurden, gefolgt von Berechnung des Durchschnitts für jede Gruppe. Die übrigen 5 Tiere in jeder Gruppe wurden durch intramuskuläre Injektion des ND-Virus, Stamm Sato, in einer Menge von 104 MLD (Minimale letale Dosis)/Hühnchen belastet, gefolgt von Beobachtung der klinischen Symptome über 2 Wochen nach der Belastung und gleichzeitiger Gewinnung der Blutproben nach 2 Wochen ab der Belastung, Untersuchung des gewonnenen Blutes auf den HI-Antikörpertiter, um so zu bestimmen, ob die Tiere mit dem Virus infiziert waren oder nicht.
  • Was die Impfstoffe X1, X2, X5 und Y2 anbetrifft, wurde jedes Tier auf die klinischen Symptome hin untersucht, einschließlich der Beobachtung der Injektionsstelle für 20 Wochen nach der Schutzimpfung, wurde das Serum jeden Tieres gewonnen und auf den Hämagglutinationshemmung (HI)-Antikörpertiter untersucht. Die Injektionsstelle wurde nach 10 Wochen ab der Schutzimpfung durch Autopsie untersucht (10 Tiere pro Gruppe), um so den Grad und die Verteilung der Rückstände zu bestimmen, wobei die Rückstände auf der Basis des Läsions-Scores (keine: 0; ~ schwer: 3) beurteilt wurden, gefolgt von Berechnung des Durchschnitts für jede Gruppe. Die übrigen 10 Tiere in jeder Gruppe wurden durch intramuskuläre Injektion des ND-Virus, Stamm Sato, in einer Menge von 104 MLD (Minimale letale Dosis)/Hühnchen nach 20 Wochen ab der Injektion belastet, gefolgt von Beobachtung der klinischen Symptome über 2 Wochen nach der Belastung und gleichzeitiger Gewinnung der Blutproben nach 2 Wochen ab der Belastung, Untersuchung des gewonnenen Blutes auf den HI-Antikörpertiter, um so zu bestimmen, ob die Tiere mit dem Virus infiziert waren oder nicht.
  • Die Ergebnisse der Sicherheit werden in Tabellen 5-1 und 5-2 aufgeführt. Die immunisierten Vergleichsgruppen, in denen die Impfstoffe g, i und Y2 injiziert wunden, hinkten vorübergehend unmittelbar nach der Schutzimpfung. Andererseits zeigten alle der immunisierten Gruppen, in denen die erfindungsgemäßen Impfstoffe injiziert worden waren, keine Anomalie während des Testzeitraums. Bei der Autopsie nach 10 Wochen ab der Schutzimpfung wurde eine kleine Menge einer öligen Substanz bei zwei von fünf Tieren, die zu der Gruppe gehörten, der der Impfstoff b injiziert worden war, beobachtet, bei drei von fünf, die zu der Gruppe gehörten, der der Impfstoff X2 injiziert worden war, aber in den anderen immunisierten Gruppen trat keine Läsion auf. In allen immunisierten Vergleichsgruppen, in denen die Impfstoffe g, i und Y2 injiziert wurden, jedoch, wurde das Vorhandensein von mittleren bis schweren Rückständen beobachtet. Tabelle 5-1: Sicherheit des inaktivierten Impfstoffes gegen Newcastle-Krankheit
    Figure 00370001
    • 1) (Anzahl an Tieren, an denen irgendeine Anomalie, erkannt wurde)/(Anzahl an getesteten Tieren).
    Tabelle 5-2: Sicherheit des inaktivierten Impfstoffes gegen Newcastle-Krankheit
    Figure 00370002
    • 1) (Anzahl an Tieren, an denen irgendeine Anomalie erkannt wurde)/(Anzahl an getesteten Tieren).
  • Tabelle 5-2 (Fortsetzung)
    Figure 00380001
  • Ergebnisse der Untersuchung der Impfstoffe auf Wirksamkeit werden in Tabellen 6-1 und 6-2 zusammengefasst. Bei Vergleich der für die Impfstoffe a, b, X1 und X2, die Öladjuvans-Impfstoffe vom Wasser-in-Öl-Typ waren, die in den immunisierten Gruppen injiziert wurden, beobachteten Ergebnisse mit jenen für den Impfstoff g, der in der immunisierten Vergleichsgruppe injiziert wurde, beobachteten, wurde keinerlei Unterschied dazwischen beobachtet und folglich wurden sie als identisch miteinander betrachtet. Andererseits waren bei Vergleich der für die Impfstoffe d, e und X5, die Öladjuvans-Impfstoffe vom Wasser-in-Öl-in-Wasser-Typ waren, die in den immunisierten Gruppen injiziert wurden, beobachteten Ergebnisse mit jenen für die Impfstoffe i und Y2, die in den immunisierten Vergleichsgruppen injiziert wurden, beobachteten, die für Letztere beobachteten HI-Antikörpertiter klar niedriger als jene für Erstere beobachteten.
  • Die vorstehenden Ergebnisse beweisen deutlich, dass der erfindungsgemäße Öladjuvans-Impfstoff eine immunsteigernde Wirkung zeigt, die annähernd identisch ist mit den für die Impfstoffe, die ein nicht-metabolisierbares Mineralöl enthalten, beobachteten, sogar wenn Ersterer nur ein metabolisierbares Öl umfasst, und dass Ersterer gegenüber den Mineralölhaltigen Impfstoffen in der lokalen Reativität beträchtlich ausgezeichnet ist.
  • Überdies weisen diese Ergebnisse auch nach, dass der mit dem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellte Öladjuvans-Impfstoff hohe Stabilität aufweist, dass der Impfstoff eine Immunisierungswirkung zeigt, die annähernd identisch ist mit der mit den herkömmlichen Öladjuvans-Impfstoffen, die nur nicht-metabolisierbare Mineralöle umfassen, erreichten, und dass Ersterer in der lokalen Reaktivität gegenüber den herkömmlichen Öladjuvans-Impfstoffen ausgezeichnet ist. Außerdem beweisen sie auch, dass der mit der vorliegenden Erfindung hergestellte Öladjuvans-Impfstoff vom Wasser-in-Öl-in-Wasser-Typ ebenso hohe Stabilität aufweist und ausgezeichnete Wirksamkeit über einen langen Zeitraum zeigt, während er auch in der lokalen Reaktivität ausgezeichnet ist. Tabelle 6-1: Wirksamkeit des inaktivierten Impfstoffes gegen Newcastle-Krankheit
    Figure 00390001
    • 1) Reziproker Wert des geometrischen Mittels des Hämagglutinationshemmung-Titers.
    • 2) (Anzahl an asymptomatisch zulässigen Tieren)/(Gesamtzahl der getesteten Tiere).
    Tabelle 6-2: Wirksamkeit des inaktivierten Impfstoffes gegen Newcastle-Krankheit
    Figure 00400001
    • 1) Reziproker Wert des geometrischen Mittels des Hämagglutinationshemmung-Titers.
    • 2) (Anzahl an asymptomatisch zulässigen Tieren)/(Gesamtzahl der getesteten Tiere).
  • Testbeispiel 3: Inaktivierter Impfstoff gegen bovines Ephemeralfieber
  • HmLu-1-Zellen in einzelliger Schicht wurden mit dem bovines Ephemeralfieber (BEF)-Virus, Stamm YHL, inokuliert, so dass die MOI (Multiplizität der Infektion) auf 0,01 eingestellt wurde, gefolgt von Adsorption des Virus' auf die Schicht bei 37°C für 60 Minuten, dann Kultivierung davon bei 34°C für 3 Tage, um ein Medium zuzugeben, und Inaktivierung des Überstands mit Formalin. Als die wässrige Phase wurde eine Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung verwendet, zu der Formalin zugegeben wurde und deren Virusgehalt vor der Inaktivierung auf 108,0 TCID50/Dosis eingestellt wurde.
  • Bezüglich immunisierter Gruppen (jede Gruppe umfasste zwei Rinder mit jeweils einem Körpergewicht von etwa 150 kg) wurde 1 ml/Rind des Impfstoffes a, X1 oder X3 oder 3 ml/Rind des Impfstoffes d intramuskulär injiziert, wohingegen 1 ml/Rind des Impfstoffes g oder Y1 jedem Rind, das zu immunisierten Vergleichsgruppen (jede Gruppe umfasste zwei Rinder mit einem Körpergewicht von 150 kg) gehörte, intramuskulär injiziert wurde. Überdies umfasste die nicht-immunisierte Kontrollgruppe zwei Rinder und die Kontrollgruppe wurde zusammen mit einer der immunisierten Gruppen untergebracht. Jedes Tier wurde auf die klinischen Symptome hin untersucht, einschließlich der Beobachtung der Injektionsstelle und der Körpertemperatur davon über 2 Wochen nach der Schutzimpfung. Überdies wurde das Serum jeden Tieres in konstanten Abständen nach der Impfstoff-Injektion gewonnen und die Seren wurden auf den Titer des neutralisierenden Antikörpers untersucht. Die Injektionsstelle wurde nach 20 Wochen ab der Impfstoff-Injektion durch Autopsie untersucht.
  • Die Ergebnisse der Sicherheit werden in Tabelle 7 aufgeführt. Die immunisierten Gruppen und immunisierten Vergleichsgruppen zeigten keinerlei Anomalie in klinischen Symptomen und Körpertemperatur. Bei der Autopsie der Impfstoff-Injektionsstellen wurde der an den Stellen verbleibende Impfstoff nur für die immunisierten Vergleichsgruppen beobachtet. Tabelle 7: Sicherheit des inaktivierten Impfstoffes gegen bovines Ephemeralfieber
    Figure 00410001
    • 1) Klinisches Symptom;
    • 2) Körpertemperatur;
    • 3) (Anzahl an Tieren, an denen irgendeine Anomalie erkannt wurde)/(Anzahl an getesteten Tieren).
  • Ergebnisse der Untersuchung der Impfstoffe auf Wirksamkeit werden in Tabellen 8-1 und 8-2 zusammengefasst. Die Antikörpertiter der immunisierten Gruppen begannen nach 4 Wochen ab der Schutzimpfung anzusteigen und zeigten eine mit der für die immunisierten Vergleichsgruppen beobachteten identische Veränderung im Antikörpertiter, die immunisierten Gruppen, in denen die Impfstoffe X1 und X3 injiziert worden waren, zeigten Veränderungen in den Antikörpertitern, die jenen für die immunisierte Vergleichsgruppe, in der der Impfstoff Y1 injiziert worden war, beobachteten überlegen waren und diese Tendenz wurde bis zu 20 Wochen nach der Schutzimpfung aufrechterhalten. Tabelle 8-1: Wirksamkeit des inaktivierten Impfstoffes gegen bovines Ephemeralfieber
    Figure 00420001
    • 1) Titer des BEF-neutralisierenden Antikörpers.
    Tabelle 8-2: Wirksamkeit des inaktivierten Impfstoffes gegen bovines Ephemeralfieber
    Figure 00420002
    • 1) Titer des BEF-neutralisierenden Antikörpers.
  • Die vorstehenden Ergebnisse weisen deutlich darauf hin, dass der erfindungsgemäße Öladjuvans-Impfstoff eine Immunisierungswirkung zeigt, die fast identisch ist mit der für ein nicht-metabolisierbares Mineralöl beobachteten, sogar wenn der erfindungsgemäße Öladjuvans-Impfstoff nur ein metabolisierbares Öl umfasste, und dass Ersterer in der lokalen Reaktivität gegenüber dem Mineralöl-haltigen Adjuvans-Impfstoff beträchtlich ausgezeichnet ist.
  • Diese Ergebnisse beweisen auch, dass der mit dem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellte Öladjuvans-Impfstoff hohe Stabilität aufweist, eine Immunisierungswirkung über einen langen Zeitraum zeigt und auch in der lokalen Reaktivität ausgezeichnet ist.
  • Stabilität
  • Dann wurden die in Beispielen 4 bis 6 und 7 bis 11 hergestellten Öladjuvans-Impfstoffe und Vergleichsbeispiele 4 bis 5 unmittelbar nach der Herstellung davon gemäß der folgenden Vorgehensweisen auf ihre Stabilität untersucht. Diese Ergebnisse werden in der folgenden Tabelle 9 zusammengefasst.
  • Testbeispiel 4: Adjuvans-Impfstoff vom Wasser-in-Öl-Typ
  • Jeder Öladjuvans-Impfstoff vom Wasser-in-Öl-Typ (5 ml) wurde in ein 15 ml-Polypropylen-Spitz-Röhrchen (sterilisiert), ausgestattet mit einem Deckel, gegeben, um so die Stabilität davon unter verschiedenen Temperaturbedingungen zu beurteilen. Jedes Röhrchen wurde nach einem Tag, 3 Monaten und 12 Monaten ab der Herstellung visuell beobachtet, gefolgt von Beobachtung jeder Probe mit einem Phasenkontrastmikroskop (Vergrößerung: x 1000) (jeweils 5 Blickfelder) und die somit erhaltenen Ergebnisse wurden auf der Basis der folgenden Beurteilungskriterien beurteilt:
    • R: Keine (oder wenig) Phasentrennung und keine (oder wenig) Veränderung der Tröpfchengröße wurden beobachtet.
    • O: Geringfügige Trennung von nur der Ölphase und/oder geringfügige Veränderung der Tröpfchengröße wurde beobachtet.
    • Δ: Trennung der wässrigen Phase wurde beobachtet und/oder „Brechen*" der Tröpfchen wurde teilweise beobachtet.
    • x: Trennung von sowohl der Ölphase als auch der wässrigen Phase wurde beobachtet und/oder „Brechen*" der Tröpfchen wurde deutlich beobachtet.
    • xx: Die Phasentrennung wurde deutlich beobachtet und/oder das Antigen in der inneren Phase wurde kaum gehalten.
    • *) „Brechen" ist das spontane Vereinigen der kleinen Tröpfchen in der Emulsion, um größere zu bilden (Koaleszenz).
  • Testbeispiel 5: Öladjuvans-Impfstoff vom Wasser-in-Öl-in-Wasser-Typ
  • Jeder Öladjuvans-Impfstoff vom Wasser-in-Öl-in-Wasser-Typ (10 ml) wurde in ein 20 ml-Glas-Schraubröhrchen (sterilisiert), ausgestattet mit einem Deckel, eingeführt, um so die Stabilität davon unter verschiedenen Temperaturbedingungen zu beurteilen. Jedes Röhrchen wurde nach einem Tag, 3 Monaten und 12 Monaten ab der Herstellung visuell beobachtet, gefolgt von Beobachtung jeder Probe mit einem Phasenkontrastmikroskop (Vergrößerung: x 1000) (jeweils 5 Blickfelder) und die somit erhaltenen Ergebnisse wurden auf der Basis der folgenden Beurteilungskriterien beurteilt:
    • R: Keine (oder wenig) Phasentrennung und keine (oder wenig) Veränderung der Tröpfchengröße wurden beobachtet.
    • O: Geringfügige Veränderung der Tröpfchengröße wurde beobachtet, aber die Wasser-in-Öl-in-Wasser-Form blieb.
    • Δ: Koaleszenz der Tröpfchen wurde deutlich beobachtet, aber die Wasser-in-Öl-in-Wasser-Form blieb.
    • x: „Brechen" der Tröpfchen wurde deutlich derart beobachtet, dass die Wasser-in-Öl-in-Wasser-Form nicht zufrieden stellend blieb.
    • xx: Die Wasser-in-Öl-in-Wasser-Form brach fast und die Phasentrennung wurde deutlich beobachtet.
    • Figure 00450001
      „Brechen" ist das spontane Vereinigen der kleinen Tröpfchen in der Emulsion, um größere zu bilden (Koaleszenz).
  • Tabelle 9: Stabilität des Öladjuvans-Impfstoffes
    Figure 00450002
  • Die in den Tabellen aufgeführten Ergebnisse weisen deutlich darauf hin, dass Öladjuvans-Impfstoffe, die sowohl in der Sicherheit als auch der Fähigkeit eine Antikörperproduktion herbeizuführen, ausgezeichnet sind, mit der vorliegenden Erfindung hergestellt werden können, dass Öladjuvans-Impfstoffe, die niedrige Viskositäten aufweisen und sowohl in der Langzeit-Stabilität als auch der verlängerten Fähigkeit, eine Antikörperproduktion herbeizuführen, ausgezeichnet sind, mit dem Verfahren hergestellt werden können, wobei das Verfahren die Schritte der Zugabe, zu einer Ölkomponente, eines Polyoxyethylen-Hydroxyfettsäuretriglycerids und einer gel-artigen Substanz, umfassend eine wässrige Lösung der erfindungsgemäßen Komponenten B und E, des Mischens dieser Bestandteile und der anschließenden Zugabe einer wässrigen Phase, die eine biologisch verträgliche und wirksame Menge an Antigenen enthält, um so die wässrige Phase in der Ölphase zu emulgieren, umfasst, und dass ein Öladjuvans-Impfstoff vom Wasser-in-Öl-in-Wasser-Typ, der sowohl in der Sicherheit als auch der Fähigkeit der Antikörperproduktion ausgezeichnet ist, mit dem Verfahren erhalten kann, welches den Schritt der Zugabe des Öladjuvans-Impfstoffes vom Wasser-in-Öl-Typ, hergestellt mit dem vorstehenden Verfahren, zu einer wässrigen Phase, die den erfindungsgemäßen Mischemulgator enthält, um so den Impfstoff noch einmal in der wässrigen Phase zu emulgieren, umfasst.
  • Wirkungen der Erfindung
  • Wie oben im Einzelnen diskutiert worden ist, erlaubt die vorliegende Erfindung die Herstellung von nützlichen Öladjuvans-Impfstoffen, die eine Fähigkeit zeigen, Antikörperproduktion über einen Zeitraum herbeizuführen, ohne Verwendung von, in Pharmazeutika, jeglichen Immunstimulators, wie z.B. Pflanzenlektinen, und die die Anforderungen für Medikamente, wie z.B. Stabilität und Sicherheit, erfüllen.

Claims (10)

  1. Öladjuvans-Impfstoff vom Wasser-in-Öl-Typ, umfassend 20 bis 90 Gew.-% einer Ölphase A), die bei einer Temperatur im Bereich von 15 bis 25°C in flüssigem Zustand vorliegt; 0,5 bis 30 Gew.-% eines Emulgators, der ein nicht-ionisches grenzflächenaktives Mittel B), bei dem es sich um einen Teilester handelt, der von einem mehrwertigen Alkohol, der mindestens drei Hydroxylgruppen trägt, und Fettsäure abgeleitet ist und bei 40°C in flüssigem Zustand vorliegt, und Polyoxyethylen(20 bis 60 Mol)-Hydroxyfettsäuretriglycerid C) umfasst; 5 bis 75 Gew.-% einer wässrigen Phase D), die eine biologisch verträgliche und wirksame Menge an Antigenen enthält; und, bezogen auf das Gewicht der wässrigen Phase D), E) 0,01 bis 10 Gew.-% einer Aminosäure oder eines Salzes davon und 0,01 bis 10 Gew.-% eines nicht-reduzierenden Zuckers oder Zuckeralkohols mit mindestens 5 Hydroxylgruppen in dem Molekül.
  2. Impfstoff nach Anspruch 1, welcher zusätzlich eine äußere wässrige Phase F) umfasst, die 0,2 bis 20 Gew.-% Emulgator umfasst, welcher ein nicht-ionisches grenzflächenaktives Mittel umfasst und einen Gesamt-HLB-Wert von nicht weniger als 10 aufweist.
  3. Impfstoff nach Anspruch 2, wobei die äußere wässrige Phase F) Glycerinphospholipid beinhaltet.
  4. Impfstoff nach Anspruch 2 oder 3, welcher 30 bis 90 Gew.-% der Ölphase A) enthält.
  5. Impfstoff nach Anspruch 2 oder 3 oder 4, welcher 5 bis 65 Gew.-% der wässrigen Phase D) enthält.
  6. Impfstoff nach einem vorhergehenden Anspruch, wobei die Ölphase A), die bei einer Temperatur im Bereich von 15 bis 25°C in flüssigem Zustand vorliegt, Fettsäureester, gegebenenfalls gemischt mit Squalen, ist.
  7. Impfstoff nach einem vorhergehenden Anspruch, wobei die Ölphase A), die bei einer Temperatur im Bereich von 15 bis 25°C in flüssigem Zustand vorliegt, von Fettsäure abgeleiteten Ester umfasst, welcher nicht weniger als 85 Gew.-% cis-Δ-9-Octadecensäure und nicht weniger als 90 Gew.-% cis-Δ-9-Alkensäure und Alkohol umfasst.
  8. Impfstoff nach einem vorhergehenden Anspruch, wobei die Fettsäurekomponente des nicht-ionischen grenzflächenaktiven Mittels B) nicht weniger als 85 Gew.-% cis-Δ-9-Octadecensäure und nicht weniger als 90 Gew.-% cis-Δ-9-Alkensäure umfasst.
  9. Verfahren zur Herstellung eines Öladjuvans-Impfstoffes vom Wasser-in-Öl-Typ nach Anspruch 1, umfassend die Schritte der Zugabe zu einer Ölphase A), die bei einer Temperatur im Bereich von 15 bis 25°C in flüssigem Zustand vorliegt, eines nicht-ionischen grenzflächenaktiven Mittels B), bei dem es sich um einen Teilester handelt, der von einem mehrwertigen Alkohol, der mindestens drei Hydroxylgruppen trägt, und Fettsäure abgeleitet ist und bei 40°C in flüssigem Zustand vorliegt, und eines Polyoxyethylen(20 bis 60 Mol)-Hydroxyfettsäuretriglycerids C) und eines Produkts, das durch Mischen und Emulgieren des nicht-ionischen grenzflächenaktiven Mittels B) und einer wässrigen Lösung erhalten wird, die E) Aminosäure oder ein Salz davon und nicht-reduzierenden Zucker oder Zuckeralkohol mit mindestens 5 Hydroxylgruppen in dem Molekül enthält, wobei das Gewichtsverhältnis des nicht-ionischen grenzflächenaktiven Mittels B) zur wässrigen Lösung der Komponente E) im Bereich von 1:1 bis 1:20 liegt; und der anschließenden Zugabe einer wässrigen Phase D), die eine biologisch verträgliche und wirksame Menge an Antigenen enthält, um so die wässrige Phase in der Ölphase zu emulgieren.
  10. Verfahren zur Herstellung eines Öladjuvans-Impfstoffes vom Wasser-in-Öl-in-Wasser-Typ nach Anspruch 2, umfassend die Schritte der Zugabe zu einer Ölphase A), die bei einer Temperatur im Bereich von 15 bis 25°C in flüssigem Zustand vorliegt, eines nicht-ionischen grenzflächenaktiven Mittels B), bei dem es sich um einen Teilester handelt, der von einem mehrwertigen Alkohol, der mindestens drei Hydroxylgruppen trägt, und Fettsäure abgeleitet ist und bei 40°C in flüssigem Zustand vorliegt, und eines Polyoxyethylen(20 bis 60 Mol)-Hydroxyfettsäuretriglycerids C) und eines Produkts, das durch Mischen und Emulgieren des nicht-ionischen grenzflächenaktiven Mittels B) und einer wässrigen Lösung erhalten wird, die E) Aminosäure oder ein Salz davon und nicht-reduzierenden Zucker oder Zuckeralkohol mit mindestens 5 Hydroxylgruppen in dem Molekül enthält, wobei das Gewichtsverhältnis des nicht-ionischen grenzflächenaktiven Mittels B) zu der wässrigen Lösung der Komponente E) im Bereich von 1:1 bis 1:20 liegt; der anschließenden Zugabe einer wässrigen Phase D), die eine biologisch verträgliche und wirksame Menge an Antigenen enthält, um so einen Öladjuvans-Impfstoff vom Wasser-in-Öl-Typ zu bilden; und der Zugabe des Öladjuvans-Impfstoffes vom Wasser-in-Öl-Typ zu einer wässrigen Phase F), die 0,2 bis 20 Gew.-% Emulgator enthält, welcher ein nicht-ionisches grenzflächenaktives Mittel umfasst und einen Gesamt-HLB-Wert von nicht weniger als 10 aufweist.
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