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Hintergrund der Erfindung
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Die
Erfindung betrifft Mittel, um die Wiederauskleidung eines Blutgefäßes zu verstärken, durch
die Verwendung eines Endothelzell (EC)-Mitogens insbesondere in
dem Kontext, eine Reendothelialisierung eines geschädigten Blutgefäßes zu induzieren.
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Atherosklerose,
eine häufige
Form der Arteriosklerose, resultiert aus der Entwicklung einer Läsion der Intima
und einer nachfolgenden Verengung des Gefäßlumens. Wenn die Läsionen an
Größe zunehmen,
verringern sie den Durchmesser der Arterien und behindern die Blutzirkulation.
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Für die Behandlung
von Atherosklerose sind viele therapeutische Alternativen in Betracht
gezogen worden, einschließlich
eines chirurgischen Eingriffes und einer medizinischen Behandlung.
Eine potentielle Therapie ist eine perkutane transluminale Angioplastik
(Ballonangioplastik). Bei der Ballonangioplastik wird ein mit einem
aufblasbaren Ballon ausgerüsteter
Kathether intravaskulär
zu dem Ort der atherosklerotischen Verengung des Gefäßes geschoben.
Ein Aufblasen des Ballons presst die Plaque zusammen, wodurch das
Gefäß erweitert
wird.
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Obwohl
eine derartige Angioplastik eine breitere Akzeptanz erlangt hat,
leidet sie unter zwei Hauptproblemen, d.h. einem abrupten Verschluss
und einer Restenose. Abrupter Verschluss bezieht sich auf die akute Okklusion
eines Gefäßes unmittelbar
nach oder innerhalb der ersten Stunden nach einer Dilatationsprozedur. Ein
abrupter Verschluss tritt in ungefähr einem von zwanzig Fällen auf
und führt
häufig
zu Myokardinfarkt und Tod, wenn der Blutfluss nicht rechtzeitig
wiederhergestellt wird.
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Restenose
bezieht sich auf die erneute Verengung einer Arterie nach einer
anfänglich
erfolgreichen Angioplastik. Es wird angenommen, dass eine Restenose
des Blutgefäßes auf
eine Schädigung
an den Endothelzellen des Blutgefäßes während der Angioplastik oder
während
des Aufblasens des Ballonkatheters zurückzuführen ist. Während der Heilung des Blutgefäßes nach
dem chirurgischen Eingriff vermehren sich glatte Muskelzellen schneller
als Endothelzellen, wodurch das Lumen des Blutgefäßes verengt
wird und der atherosklerotische Prozess erneut beginnt. In den letzten
Jahren ist die Vermehrung/Proliferation der glatten Muskelzellen
als ein hauptsächliches
klinisches Problem, welches die Langzeit-Effektivität einer
perkutanen transluminalen Koronarangioplastik begrenzt, erkannt
worden.
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Im
Bemühen,
eine Restenose des behandelten Blutgefäßes zu verhindern, ist die
Suche nach Mitteln, die eine übermäßige Vermehrung
von glatten Muskelzellen verringern oder verhindern können, Gegenstand von
vielen Forschungsanstregungen gewesen. (Das Auftreten und die Auswirkungen
der Vermehrung von glatten Muskelzellen nach diesen Arten von chirurgischen
Eingriffen sind im Überblick
dargestellt worden beispielsweise in Ip et al. (Juni 1990) J. Am.
College of Cardiology 15:1667-1687, und Faxon et al. (1987) Am.
J. of Cardiology 60:5B-9B).
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Eine
Alternative, um mit einer Angioplastik verbundene Probleme zu verhindern,
platziert endovaskuläre
Stents in die erweiterten Segmente, um einen abrupten Verschluss
und eine Restenose mechanisch zu blockieren. Unglücklicherweise
wird die Verwendung von solchen Stents durch direkte (subakute Thrombose) oder
indirekte (Blutung, periphere vaskuläre Komplikationen) Komplikationen
begrenzt. Nach dem Einsetzen eines Stents werden die Patienten von
Stent-Thrombose bedroht, bis die Verstrebungen des Stents durch
Endothel bedeckt sind. Dementsprechend ist während dieses Zeitraums eine
aggressive Therapie unter Verwendung von gerinnungshemmenden Mitteln
und/oder Antithrombozytenmitteln erforderlich. Obwohl diese Therapien
in der Lage sind, die Rate von Stent-Thrombose zu verringern, sind
sie die Hauptursache von indirekten Komplikationen.
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Die
Veröffentlichung
Circulation, Band 91, Juni 1995, 2793-2801 offenbart die Verwendung
des Proteins VEGF zum Beschleunigen einer Reendothelialisierung
von geschädigten
Arterien mit einer Abschwächung von
Intimahyperplasie.
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Dementsprechend
ist der Bedarf an einem einfachen und wirksamen Mittel, um Restenose
zu verringern, extrem wichtig.
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Zusammenfassung der Erfindung
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Es
ist jetzt entdeckt worden, dass überraschenderweise
Nukleinsäure
(DNA oder RNA), welche in der Lage ist, ein Endothelzell-Mitogen
zu exprimieren, wenn sie an den Ort einer Blutgefäßschädigung,
d.h. die bloßgelegte
Endothelauskleidung einer Blutgefäßwand, abgegeben wird, eine
Reendothelialisierung des geschädigten
Blutgefäßes induziert
und folglich Restenose verringert.
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Obwohl
wir nicht auf eine Theorie festgelegt werden möchten, nehmen wir an, dass
im Gegensatz zu den typischen Strategien, die entworfen worden sind,
um Restenose zu verringern, indem die Vermehrung von glatten Muskelzellen
direkt gehemmt wird, unser Verfahren die Vermehrung von glatten
Muskelzellen indirekt hemmt, indem direkt die Reendothelialisierung
des geschädigten
Gefäßes erleichtert
wird.
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Die
Erfindung betrifft dementsprechend den folgenden Gegenstand:
- (i) Verwendung einer wässrigen Lösung, welche eine Nukleinsäure enthält, bei
der Herstellung eines Arzneimittels für die Induktion einer Reendothelialisierung
der Auskleidung eines geschädigten
Blutgefäßes und
zur Verringerung von Restenose durch Abgabe der Nukleinsäure an den
geschädigten
Abschnitt des Blutgefäßes, wobei
die Nukleinsäure
ein Endothelzell-Mitogen,
ausgewählt
aus der Gruppe bestehend aus dem vaskulären endothelialen Wachstumsfaktor
(VEGF; „vascular
endothelial growth factor"),
dem sauren Fibroblastenwachstumsfaktor (a-FGF; „acidic fibroblast growth
factor"), dem basischen
Fibroblastenwachstumsfaktor (b-FGF; „basic fibroblast growth factor"), dem Hepatozytenwachstumsfaktor
(HGF; „hepatocyte growth
factor") und dem
Kolonie-stimulierenden Faktor (CSF; „colony stimulating factor"), kodiert, funktionsfähig mit
einem Promotor verknüpft;
- (ii) Verwendung einer wässrigen
Lösung,
welche eine Nukleinsäure
enthält,
bei der Herstellung eines Arzneimittels für die Induktion einer Reendothelialisierung
der Auskleidung eines geschädigten
Blutgefäßes und
zur Verringerung von Restenose durch Abgabe der Nukleinsäure an den
geschädigten
Abschnitt des Blutgefäßes unter
Verwendung eines mit einem Hydrogel beschichteten Ballonkatheters,
wobei die Nukleinsäure
ein Endothelzell-Mitogen, ausgewählt
aus der Gruppe bestehend aus dem vaskulären endothelialen Wachstumsfaktor
(VEGF; „vascular
endothelial growth factor"),
dem sauren Fibroblastenwachstumsfaktor (a-FGF; „acidic fibroblast growth
factor"), dem basischen
Fibroblastenwachstumsfaktor (b-FGF; „basic fibroblast growth factor"), dem Hepatozytenwachstumsfaktor
(HGF; „hepatocyte
growth factor")
und dem Kolonie-stimulierenden Faktor (CSF; „colony stimulating factor"), kodiert, funktionsfähig mit
einem Promotor verknüpft;
- (iii) Verwendung einer wässrigen
Lösung,
welche eine Nukleinsäure
enthält,
bei der Herstellung eines Arzneimittels für die Induktion einer Reendothelialisierung
der Auskleidung eines geschädigten
Blutgefäßes und
zur Verringerung von Restenose durch Abgabe der Nukleinsäure an den
geschädigten
Abschnitt des Blutgefäßes unter
Verwendung eines endovaskulären
Stents, wobei die Nukleinsäure
ein Endothelzell-Mitogen, ausgewählt
aus der Gruppe bestehend aus dem vaskulären endothelialen Wachstumsfaktor
(VEGF; „vascular
endothelial growth factor"),
dem sauren Fibroblastenwachstumsfaktor (a-FGF; „acidic fibroblast growth
factor"), dem basischen
Fibroblastenwachstumsfaktor (b-FGF; „basic fibroblast growth factor"), dem Hepatozytenwachstumsfaktor
(HGF; „hepatocyte
growth factor")
und dem Kolonie-stimulierenden Faktor (CSF; „colony stimulating factor"), kodiert, funktionsfähig mit
einem Promotor verknüpft;
- (iv) Verwendung einer wässrigen
Lösung,
welche eine Nukleinsäure
enthält,
bei der Herstellung eines Arzneimittels für die Induktion einer Reendothelialisierung
der Auskleidung eines geschädigten
Blutgefäßes und
zur Verringerung von Restenose durch Abgabe der Nukleinsäure an den
geschädigten
Abschnitt des Blutgefäßes unter
Verwendung einer Ballon- oder Stent-Entfaltung, wobei die Nukleinsäure ein
Endothelzell-Mitogen, ausgewählt
aus der Gruppe bestehend aus dem vaskulären endothelialen Wachstumsfaktor (VEGF; „vascular
endothelial growth factor"),
dem sauren Fibroblastenwachstumsfaktor (a-FGF; „acidic fibroblast growth
factor"), dem basischen
Fibroblastenwachstumsfaktor (b-FGF; „basic fibroblast growth factor"), dem Hepatozytenwachstumsfaktor
(HGF; „hepatocyte
growth factor")
und dem Koloniestimulierenden Faktor (CSF; „colony stimulating factor"), kodiert, funktionsfähig mit
einem Promotor verknüpft,
und wobei die Nukleinsäure
auf die Oberfläche
der Ballon- oder Stent-Entfaltung
unter Inkorporation aufgebracht ist.
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Die
Erfindung kann verwendet werden, um eine jegliche Blutgefäßschädigung zu
behandeln, die zu einem Bloßlegen
der endothelialen Auskleidung der Gefäßwand führt, einschließlich beispielsweise
jene Schädigungen,
die aus einer Ballonangioplastik und verwandten Vorrichtungen (z.B.
gerichtete Atherektomie („directional
atherectomy), Rotationsatherektomie („rotational atherectomy"), Laser-Angioplastik,
transluminale Extraktion, „pulse
spray thrombolysis")
und einer Entfaltung eines endovaskulären Stents, resultieren.
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Der
geschädigte
Abschnitt des Blutgefäßes kann
mit der Nukleinsäure
durch jegliche Verabreichungsmittel oder -maßnahmen in Kontakt gebracht
werden. Ein bevorzugtes Verabreichungsmittel ist die Verwendung
von Standard-Katheterabgabesystemen, die in diesem Fachgebiet bekannt
sind, beispielsweise eines doppelten Ballonkatheters, eines porösen Ballonkatheters
oder eines mit einem Hydrogel-Polymer beschichteten Ballonkatheters.
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In
einer anderen Ausführungsform
wird das Blutgefäß mit der
Nukleinsäure
zum Zeitpunkt der Gefäßschädigung,
beispielsweise zum Zeitpunkt der Ballonangioplastik oder der Entfaltung
des Stents, in Kontakt gebracht. Dies kann bewerkstelligt werden,
indem die Nukleinsäure
auf die Oberfläche
des Ballons oder Stents aufgebracht wird. Die Nukleinsäure kann
auf die Ballonoberfläche
mittels einer hydrophilen Polymerbeschichtung auf der Ballonoberfläche aufgebracht
werden.
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Das
hydrophile Polymer wird so ausgewählt, dass es die Inkorporation
der Nukleinsäure,
die an den Schädigungsort
abgegeben werden soll, und die darauf folgende Freisetzung, wenn
das hydrophile Polymer mit dem Ort in Kontakt kommt, ermöglicht.
Das hydrophile Polymer ist vorzugsweise ein Hydrogel-Polymer. Andere
hydrophile Polymere werden funktionieren, solange sie die Nukleinsäure zurückhalten
können,
so dass bei Kontakt mit dem Ort ein Transfer von genetischem Material
stattfindet.
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Das
geschädigte
Gefäß kann auch
mit dem hydrophilen Polymer, in welches die Nukleinsäure inkorporiert
ist, mittels eines Applikators, wie eines Katheters, der mit dem
die Nukleinsäure
enthaltenden hydrophilen Polymer beschichtet ist, in Kontakt gebracht
werden. Der Applikator kann vorzugsweise einen gewissen Druck gegen
die Arterienzellen ausüben,
um den Kontakt zwischen dem die Nukleinsäure enthaltenden hydrophilen
Polymer und den Arterienzellen zu verbessern. Dementsprechend ist
die Verwendung eines Ballonkatheters bevorzugt. Das hydrophile Polymer überzieht
zumindest einen Abschnitt eines aufblasbaren Ballons des Ballonkatheters.
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Wie
bereits gesagt, kann die Nukleinsäure durch andere Mittel verabreicht
werden. Sie kann beispielsweise durch ein Mikroabgabevehikel, wie
kationische Liposomen oder zielspezifische Vektoren, transportiert werden.
Solche Vektoren sind in diesem Fachgebiet beschrieben worden und
umfassen jene, welche eine die Zielgerichtetheit vermittelnde Hälfte und
eine Nukleinsäure-Hälfte umfassen.
Nukleinsäure,
welche unterschiedliche Mitogene kodiert, kann separat oder gleichzeitig
verwendet werden.
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Wie
hier verwendet, bedeutet der Begriff „Endothelzell-Mitogen" ein jegliches Protein,
Polypeptid, Mutein oder einen jeglichen Abschnitt, das bzw. der
in der Lage ist, eine Vermehrung von Endothelzellen zu induzieren.
Solche Proteine umfassen beispielsweise den vaskulären endothelialen
Wachstumsfaktor (VEGF), den sauren Fibroblastenwachstumsfaktor (aFGF), den
basischen Fibroblastenwachstumsfaktor (bFGF), den Hepatozytenwachstumsfaktor
(„j catter
factor") und den
Kolonie-stimulierenden Faktor (CSF). VEGF ist bevorzugt.
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Der
Begriff „wirksame
Menge" bedeutet
eine ausreichende Menge an Nukleinsäure, welche an die Zellen an
dem Schädigungsort
abgegeben wird, um eine adäquate
Konzentration des Endothelzell-Mitogens zu erzeugen, d.h. Konzentrationen,
die in der Lage sind, eine Vermehrung von Endothelzellen zu induzieren. Dementsprechend
ist ein wichtiger Aspekt das Ausmaß, in welchem ein Mitogen exprimiert
wird. Dementsprechend kann man eine Mehrzahl von Transkripten verwenden
oder das Gen kann unter die Kontrolle eines Promotors, der zu hohen
Expressionsniveaus führen
wird, gestellt sein. In einer alternativen Ausführungsform würde das
Gen unter der Kontrolle eines Faktors stehen, der zu extrem hohen
Expressionsniveaus führt,
z.T. des tat- und des entsprechenden tar-Elements.
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Kurze Beschreibung der Zeichnungen
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1 veranschaulicht
einen diagrammartigen Querschnitt eines Ballonkatheters, welcher
ein Endothelzell-Mitogen kodierende Nukleinsäure an einen Verschluss während einer
Ballonangioplastik abgibt.
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2 ist
ein Diagramm, welches das Versuchsprotokoll von Beispiel 1 veranschaulicht.
LacZ- oder phVEGF165-Plasmid-DNA (10 μg/μl, gesamt
= 400 μg)
wurde auf die äußerliche
Hydrogel-Polymer-Beschichtung eines mit Hydrogel beschichteten Ballonkatheters
mit einem Durchmesser von 2,0 mm und einer Länge von 2,0 cm (Slider with
Hydroplus, Boston Scientific, Watertown, MA) aufgetragen. Der Katheter
wurde über eine
5 Fr. Teflon-Schutzhülle
(Boston Scientific), die so gestaltet war, dass der Kontakt zwischen
dem Blut und dem Ballon minimiert wird, in eine Oberschenkelarterie
geschoben. Dann erfolgte ein dreimaliges Aufblasen des Ballons für jeweils
1 min mit 4 atm. Bei jedem Kaninchen wurde nach Abschluss der Transfektion
von einer Oberschenkelarterie (mit phVEGF165 oder
pGSVLacZ) die Oberschenkelarterie auf der entgegengesetzten Seite
einer Ballonschädigung
(aber ohne Transfektion) unter Verwendung eines neuen Katheters
unterzogen.
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3 zeigt
repräsentative
Angiogramme 4 Wochen nach Ballonschädigung und/oder Transfektion.
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4A und 4B veranschaulichen
das repräsentative
makroskopische Erscheinungsbild von (4A) Ballon-geschädigten,
transfizierten Arterien (LacZ-Tf und VEGF-Tf) und von (4B)
Ballon-geschädigten,
nicht-transfizierten Arterien auf der entgegengesetzten Seite (LacZ-nTf
und VEGF-nTf) an Tag 3, Tag 5, 1 Woche und 2 Wochen nach der Transfektion.
Die reendothelialisierte Fläche,
die durch Evans blue-Farbstoff nicht gefärbt wird, erscheint weiß.
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5A und 5B sind
Graphen, welche die Reendothelialisierung von geschädigten,
transfizierten Arterien (5A) und
geschädigten,
nicht-transfizierten Arterien (5B) zeigen.
(* = p < 0,01,
** = p < 0,05 gegenüber LacZ-Tf
oder -nTF).
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Die 6A und 6B sind
repräsentative
Angiogramme, aufgezeichnet vor Arzneimittel (Grundlinie) und unmittelbar
nach Serotoninkreatinsulfat (5-HT), Acetylcholinchlorid (Ach) und
Natriumnitroprussid (NP) für
LacZ-Tf- und VEGF-Tf-Arterien 2 Wochen nach der Transfektion (6A).
Der Arterienabschnitt zwischen den beiden Pfeilköpfen in jedem Angiogramm zeigt
den Ort der Ballonschädigung
an. 6B zeigt Ergebnisse 4 Wochen nach der Transfektion.
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7 ist
eine quantitative angiographische Analyse der vasomotorischen Reaktion
1 Woche, 2 Wochen und 4 Wochen nach der Transfektion. 5-HT erzeugte
eine milde Vasokonstriktion in der normalen (nicht Ballon-geschädigten)
Kaninchen-Oberschenkelarterie und eine schwere Konstriktion bei
LacZ-tf, insbesondere 1 und 2 Wochen nach der Schädigung.
Bei VEGF-Tf wurde signifikant weniger Vasokonstriktion festgestellt und
diese war tatsächlich ähnlich zu
oder geringer als jene, die in normalen (d.h. nicht geschädigten,
nicht transfizierten) Arterien beobachtet wurde. Eine Ach-Infusion
bewirkte eine geringfügige
Dilatation in nicht Ballon-geschädigten Arterien.
Nach einer Ballon-Schädigung
war Ach nicht erfolgreich, LacZ-Tf nach 1 und 2 Wochen zu dilatieren,
wohingegen Ach eine Dilatation bei VEGF-Tf induzierte. Wieder war
die vasomotorische Reaktion bei VEGF-Tf ähnlich zu jener, die bei normalen
nicht-geschädigten Arterien
beobachtet wurde. Np erzeugte eine milde Dilatation vor einer Schädigung und
eine äquivalente
Dilatation sowohl bei LacZ-Tf als auch VEGF-Tf (* = p < 0,01, ** = p < 0,05 gegenüber LacZ-Tf).
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8A und 8B sind
Graphen, welche veranschaulichen, dass LacZ-Tf-Arterien während 4
Wochen eine progressive neointimale Verdickung zeigten. Bei VEGF-Tf-Arterien
wurde signifikant weniger Intimaverdickung beobachtet, einschließlich einer
Regression der Intimaverdickung zwischen 2 und 4 Wochen (* = p < 0,01 gegenüber LacZ-Tf).
(8A) Die Ballon-geschädigte, nicht
transfizierte Arterie auf der entgegengesetzten Seite entwickelte
bei der VEGF-Gruppe (VEGF-nTf) weniger Intimaverdickung und zeigte
keine Progression während
der Wochen 2 bis 4 verglichen mit LacZ-nTf (* = p < 0,01, ** = p < 0,05 gegenüber LacZ-nTf) (8B).
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9 zeigt
die repräsentative
Wirkung einer Transfektion auf die Intimaverdickung für LacZ-Tf
und VEGF-Tf 2 Wochen und 4 Wochen nach der Transfektion.
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10 ist
ein Graph, welcher die Proliferationsaktivität in der Media von sowohl LacZ-Tf
(leerer Kreis) als auch VEGF-Tf (ausgefüllter Kreis), welche 3 Tage
nach der Schädigung
einen Spitzenwert erreicht, zeigt; über die restlichen 4 Wochen
nahm die Proliferationsaktivität
bei VEGF-Tf schneller ab als bei LacZ-Tf. In der Intima war der
zeitliche Verlauf der Proliferation für LacZ-Rf (leeres Dreieck)
stärker
verzögert
als für
VEGF-Tf (ausgefülltes
Dreieck).
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11 zeigt,
dass die EC-Proliferation bei VEGF-Tf jene von LacZ-Tf am Tag 3
und Tag 5 überstieg. Die
obere Mikrophotographie zeigt PCNA-positive Zellen auf der luminalen
Seite der internen elastischen Membran, 3 Tage nach dem Gentransfer;
BSI-Lectin identifiziert in der unteren Mikrophotographie diese
als ECs (Epithelzellen). (* = p < 0,01;
** = p < 0,05).
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12A und 12B zeigen
die VEGF-Genexpression. 12A zeigt
den zeitlichen Verlauf der VEGF-Genexpression, beobachtet durch
RT-PCR, bereits am Tag 3 mit einer andauernden Expression während zweier
Wochen und einer verringerten Expression nach drei Wochen. Pfeile
geben die Position der VEGF-Bande bei 258 bp an. Mit VEGF transfizierte
Arterien wurden hinsichtlich des Vorhandenseins einer VEGF-Genexpression
durch RT-PCR nach 3 Tagen (Bahn 6), 1 Woche (Bahn 7), 2 Wochen (Bahn
8), 3 Wochen (Bahn 9), 4 Wochen (Bahn 10) und 6 Wochen (Bahn 11)
untersucht.
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Bahn
1 = positive Kontrolle (SMC, transfiziert mit VEGF); Bahn 2 = negative
Kontrolle (keine RNA); Bahn 3 = negative Kontrolle (kein Gewebe);
Bahn 4 = negative Kontrolle (PCR der LacZ-Tf-Arterie); Bahn 5 – negative
Kontrolle (PCR einer VEGF-Tf-Arterie ohne reverse Transkriptase-Reaktion);
Bahn 12 = Molekulargewichtsmarker, pGEM3zf(–), verdaut mit Hae III.
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12B zeigt die Genexpression in Organen, welche
einem VEGF-transfizierten Kaninchen entnommen wurden. VEGF-mRNA
wurde in keinem Organ beobachtet (Bahnen 8-15 = Herz, Lunge, Leber,
Milz, Niere, Hoden, Gehirn, Skelettmuskel aus der Mitte des Oberschenkels)
mit Ausnahme des transfizierten Arteriensegments (Bahn 7). Bahn
1 = Molekulargewichtsmarker; Bahn 2 = positive Kontrolle (mit VEGF
transfizierte glatte Muskelzellen); Bahn 3 = negative Kontrolle
(keine RNA); Bahn 4 = negative Kontrolle (kein Gewebe); Bahn 5 =
negative Kontrolle (PCR einer LacZ-Tf-Arterie); Bahn 6 = negative
Kontrolle (PCR einer VEGF-Tf-Arterie ohne reverse Transkriptase-Reaktion).
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Detaillierte Beschreibung der Erfindung
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Die
Erfindung stellt ein Mittel zum Induzieren einer Reendothelialisierung
der Auskleidung eines geschädigten
Blutgefäßes bereit,
indem der geschädigte
Abschnitt des Gefäßes in Kontakt
gebracht wird mit einer Nukleinsäure,
welche ein Endothelzell-Mitogen kodiert, welche funktionsfähig (operativ)
mit einem Promotor verknüpft
ist (Nukleinsäurekassette),
was zu einer Expression des Mitogens bei einer Abgabe an die Zellen an
dem Ort der vaskulären
Schädigung
führt.
Die resultierende Reendothelialisierung des geschädigten Blutgefäßes hemmt
die Vermehrung der glatten Muskelzellen und verringert folglich
eine Restenose. Die Erfindung kann verwendet werden, um eine jegliche
Blutgefäßschädigung,
die dazu führt,
dass die Endothelauskleidung der Gefäßwand bloßgelegt wird, einschließlich beispielsweise
jener Schädigungen,
die aus einer Ballonangioplastik und der Entfaltung von endovaskulären Stents
resultieren, zu behandeln. Speziell betrifft die Erfindung den folgenden
Gegenstand:
- (i) Verwendung einer wässrigen
Lösung,
welche eine Nukleinsäure
enthält,
bei der Herstellung eines Arzneimittels für die Induktion einer Reendothelialisierung
der Auskleidung eines geschädigten
Blutgefäßes und
zur Verringerung von Restenose durch Abgabe der Nukleinsäure an den
geschädigten
Abschnitt des Blutgefäßes, wobei
die Nukleinsäure
ein Endothelzell-Mitogen,
ausgewählt
aus der Gruppe bestehend aus dem vaskulären endothelialen Wachstumsfaktor
(VEGF; „vascular
endothelial growth factor"),
dem sauren Fibroblastenwachstums faktor (a-FGF; „acidic fibroblast growth
factor"), dem basischen
Fibroblastenwachstumsfaktor (b-FGF; „basic fibroblast growth factor"), dem Hepatozytenwachstumsfaktor
(HGF; „hepatocyte growth
factor") und dem
Kolonie-stimulierenden Faktor (CSF; „colony stimulating factor"), kodiert, funktionsfähig mit
einem Promotor verknüpft;
- (ii) Verwendung einer wässrigen
Lösung,
welche eine Nukleinsäure
enthält,
bei der Herstellung eines Arzneimittels für die Induktion einer Reendothelialisierung
der Auskleidung eines geschädigten
Blutgefäßes und
zur Verringerung von Restenose durch Abgabe der Nukleinsäure an den
geschädigten
Abschnitt des Blutgefäßes unter
Verwendung eines mit einem Hydrogel beschichteten Ballonkatheters,
wobei die Nukleinsäure
ein Endothelzell-Mitogen, ausgewählt
aus der Gruppe bestehend aus dem vaskulären endothelialen Wachstumsfaktor
(VEGF; „vascular
endothelial growth factor"),
dem sauren Fibroblastenwachstumsfaktor (a-FGF; „acidic fibroblast growth
factor"), dem basischen
Fibroblastenwachstumsfaktor (b-FGF; „basic fibroblast growth factor"), dem Hepatozytenwachstumsfaktor
(HGF; „hepatocyte
growth factor")
und dem Kolonie-stimulierenden Faktor (CSF; „colony stimulating factor"), kodiert, funktionsfähig mit
einem Promotor verknüpft;
- (iii) Verwendung einer wässrigen
Lösung,
welche eine Nukleinsäure
enthält,
bei der Herstellung eines Arzneimittels für die Induktion einer Reendothelialisierung
der Auskleidung eines geschädigten
Blutgefäßes und
zur Verringerung von Restenose durch Abgabe der Nukleinsäure an den
geschädigten
Abschnitt des Blutgefäßes unter
Verwendung eines endovaskulären
Stents, wobei die Nukleinsäure
ein Endothelzell-Mitogen, ausgewählt
aus der Gruppe bestehend aus dem vaskulären endothelialen Wachstumsfaktor
(VEGF; „vascular
endothelial growth factor"),
dem sauren Fibroblastenwachstumsfaktor (a-FGF; „acidic fibroblast growth
factor"), dem basischen
Fibroblastenwachstumsfaktor (b-FGF; „basic fibroblast growth factor"), dem Hepatozytenwachstumsfaktor
(HGF; „hepatocyte
growth factor")
und dem Kolonie-stimulierenden Faktor (CSF; „colony stimulating factor"), kodiert, funktionsfähig mit
einem Promotor verknüpft;
- (iv) Verwendung einer wässrigen
Lösung,
welche eine Nukleinsäure
enthält,
bei der Herstellung eines Arzneimittels für die Induktion einer Reendothelialisierung
der Auskleidung eines geschädigten
Blutgefäßes und
zur Verringerung von Restenose durch Abgabe der Nukleinsäure an den
geschädigten
Abschnitt des Blutgefäßes unter
Verwendung einer Ballon- oder Stent-Entfaltung, wobei die Nukleinsäure ein
Endothelzell-Mitogen, ausgewählt
aus der Gruppe bestehend aus dem vaskulären endothelialen Wachstumsfaktor (VEGF; „vascular
endothelial growth factor"),
dem sauren Fibroblastenwachstumsfaktor (a-FGF; „acidic fibroblast growth
factor"), dem basischen
Fibroblastenwachstumsfaktor (b-FGF; „basic fibroblast growth factor"), dem Hepatozytenwachstumsfaktor
(HGF; „hepatocyte
growth factor")
und dem Koloniestimulierenden Faktor (CSF; „colony stimulating factor"), kodiert, funktionsfähig mit
einem Promotor verknüpft,
und wobei die Nukleinsäure
auf die Oberfläche
der Ballon- oder Stent-Entfaltung
unter Inkorporation aufgebracht ist.
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Die
Nukleinsäure
kann eine jegliche Nukleinsäure
(DNA oder RNA) sein, einschließlich
genomischer DNA, cDNA und mRNA, welche ein Endothelzell-Mitogen
kodiert, welche verwendet werden kann, um das Mitogen, d.h. ein
Protein, Polypeptid, Mutein oder einen Abschnitt, welches bzw. welcher
in der Lage ist, die Vermehrung von Endothelzellen zu induzieren,
zu exprimieren. Solche Proteine umfassen beispielsweise den vaskulären endothelialen
Wachstumsfaktor (VEGF), den sauren Fibroblastenwachstumsfaktor (aFGF) (Bjornsson
et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88:8651-8655 (1991)), den basischen
Fibroblastenwachstumsfaktor (bFGF) (Schwarz et al., J. Vasc. Surg.,
5:280-288 (1987)), den Hepatozytenwachstumsfaktor („j catter factor") und den Kolonie-stimulierenden
Faktor (CSF). VEGF ist bevorzugt.
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Es
ist gezeigt worden, dass VEGF ein Endothelzell-spezifisches Mitogen
ist (Ferrara et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 161:851-855
(1989), Keck et al., Science, 246:1309-1312 (1989), und Plouet et al., Embo
J., 3801-3806 (1989)). VEGF wurde unabhängig davon als ein durch Tumore
sekretierter Faktor, der vaskuläre
Permeabilität
umfasste, durch den Miles-Assay gereinigt (Keck et al., a.a.O.,
und Connolly et al., J. Biol. Chem., 264:20017-20024 (1989)) und
weist dementsprechend eine alternative Bezeichnung auf, vaskulärer Permeabilitätsfaktor
(VPF; „vascular
permeability factor").
Zwei Merkmale unterscheiden VEGF von anderen Heparin-bindenden angiogenen
Wachstumsfaktoren. Als erstes geht dem NH
2-Terminus
von VEGF eine typische Signalsequenz voran; dementsprechend kann
VEGF anders als bFGF durch intakte Zellen sekretiert werden. Als
zweites sind hochaffine Bindungsstellen für diesen, von denen gezeigt
worden ist, dass sie die Tyrosinkinase-Rezeptoren Flt-1 und Flt-1/KDR
umfassen, auf Endothelzellen vorhanden. Ferrara et al., a.a.O., und
Conn et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:1323-1327 (1990). (Interaction
of VEGF with lower affinity binding sites has been shown to induce
mononuclear phagocyte chemotaxis; es ist gezeigt worden, dass eine Wechselwirkung
von VEGF mit Bindungsstellen von geringerer Affinität eine Chemotaxie
von mononukleären Phagozyten
induziert). Shen et al., Blood, 81:2767-2773 (1993) und Clauss et
al., J. Exp. Med., 172:1535-1545 (1990). DNA, welche in der Lage
ist, VEGF zu kodieren, wird in dem
U.S.-Patent
5,332,671 offenbart, dessen Offenbarung in diese Unterlagen
durch Bezugnahme aufgenommen wird.
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Die
Nukleotidsequenz von zahlreichen Peptiden und Proteinen, einschließlich Endothelzell-Mitogenen,
ist durch verschiedene Computerdatenbanken, beispielsweise GenBank,
EMBL und Swiss-Prot, leicht erhältlich.
Unter Verwendung dieser Informationen kann ein DNA- oder RNA-Segment,
welches das Gewünschte kodiert,
chemisch synthetisiert werden oder alternativ kann ein solches DNA-
oder RNA-Segment unter Verwendung von Routineprozeduren auf diesem
Gebiet, z.B. PCR-Amplifizierung, erhalten werden.
-
Um
die Manipulation und Handhabung der das Mitogen kodierenden Nukleinsäure zu vereinfachen, wird
die Nukleinsäure
vorzugsweise in eine Kassette inseriert, wo sie mit einem Promotor
funktionsfähig
verknüpft
ist. Der Promotor muss in der Lage sein, die Expression des Mitogens
in der gewünschten
Zielwirtszelle zu betreiben. Die Auswahl von geeigneten Promotoren
kann leicht bewerkstelligt werden. Man würde vorzugsweise einen Promotor
für eine
starke Expression verwenden. Ein Beispiel eines geeigneten Promotors
ist der 763 Basenpaar-Zytomegalievirus
(CMV)-Promotor. Es können
auch der Rous-Sarkom-Virus (RSV)-(Davis et al., Hum. Gene Ther.
4:151 (1993)) und der MMT-Promotor verwendet werden. Bestimmte Proteine
können unter
Verwendung ihres nativen Promotors exprimiert werden. Andere Elemente,
die die Expression verstärken
können,
können
auch mit aufgenommen werden, wie ein Enhancer oder ein System, das
zu hohen Expressionsniveaus führt,
wie ein tat-Gen und ein tar-Element.
Diese Kassette kann dann in einen Vektor, z.B. einen Plasmidvektor,
wie pUC118, pBR322 oder andere bekannte Plasmidvektoren, die beispielsweise
einen E. coli-Replikationsstartpunkt
umfassen, inseriert werden. Siehe Sambrook et al., Molecular Cloning:
A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory press, (1989).
Der Plasmidvektor kann auch einen selektierbaren Marker, wie das β-Lactamasegen
für Ampicillin-Resistenz,
umfassen, vorausgesetzt, dass das Marker-Polypeptid den Stoffwechsel
des Organismus, der behandelt wird, nicht abträglich beeinflusst. Die Kassette
kann auch an eine Nukleinsäure-Bindungseinheit
in einem synthetischen Abgabesystem gebunden werden, wie das in
WO 95/22618 offenbarte System.
-
Sofern
gewünscht,
kann die DNA auch mit einem Mikroabgabe-Vehikel, wie kationischen
Liposomen und adenoviralen Vektoren, verwendet werden. Für eine zusammenfassende Übersicht über die
Prozeduren zur Liposom-Herstellung, dem Targeting und der Abgabe
von Inhalten siehe Mannino und Gould-Fogerite, BioTechniques, 6:682
(1988). Siehe auch Felgner und Holm, Bethesda Res. Lab. Focus, 11(2):21
(1989) und Maurer, R.A., Bethesda Res. Lab. Focus, 11(2):25 (1989).
-
Replikationsdefekte
rekombinante adenovirale Vektoren können gemäß bekannten Techniken hergestellt
werden. Siehe Quantin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:2581-2584
(1992); Stratford-Perricadet et al., J. Clin. Invest., 90:626-630
(1992); und Rosenfeld et al., Cell, 68:143-155 (1992).
-
Der
geschädigte
Abschnitt des Blutgefäßes wird
mit der ein Endothelzell-Mitogen kodierenden DNA in Kontakt gebracht
durch ein jegliches Mittel, welches dem Fachmann auf diesem Gebiet
geläufig
ist, einschließlich
beispielsweise von doppelten Ballonkathetern, porösen Ballonkathetern
oder hydrophilen beschichteten Ballonkathetern. Siehe Jorgensen
et al., Lancet 1:1106-1108 (1989); Wolinsky et al., J. Am. Coll.
Cardiol., 15:475-485 (1990); March et al., Cardio Intervention,
2:11-26 (1992));
WO 93/00051 und
WO 93/00052 ;
U.S.-Patent Nr. 5,304,121 . Siehe auch
Dichek, Textbook of Interventional Cardiology, Band 2, 61:989-1005.
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Ein
hydrophiler beschichteter Ballonkatheter ist in bestimmten Situationen
bevorzugt. Ein hydrophiler beschichteter Ballonkatheter weist ein
hydrophiles Polymer auf der äußeren Oberfläche des
Ballons auf, welches erlaubt, dass der Kontakt zwischen dem hydrophilen
Polymer, welches die zu transferierende Nukleinsäure enthält, und den Zellen des geschädigten Abschnittes
des Blutgefäßes mit
einem gewissen Druck erfolgt, wodurch der Transfer der Nukleinsäure zu den
Zellen erleichtert wird. Jedoch sind auch andere Träger für das hydrophile
Polymer nützlich,
wie Katheter oder feste Stäbe
mit einer Oberfläche
aus hydrophilem Polymer. Vorzugsweise sind die Katheter oder Stäbe oder
anderen Substrate flexibel, um das Schieben durch die Arterien,
um die Stelle der beabsichtigten Anwendung zu erreichen, zu vereinfachen.
-
Das
hydrophile Polymer ist vorzugsweise ein Hydrogel-Polymer, ein vernetztes
Polymermaterial, welches aus der Kombination eines Kolloids und
von Wasser gebildet wird. Das Vernetzen verringert die Löslichkeit
und erzeugt ein geleeartiges Polymer, das gekennzeichnet ist durch
die Fähigkeit,
zu quellen und Flüssigkeit,
z.B. jene, die die DNA enthält,
zu absorbieren. Geeignete Hydrogel-Polymere umfassen beispielsweise jene,
die aus der Gruppe bestehend aus Polycarbonsäuren, cellulosischen Polymeren,
Gelatine, Polyvinylpyrrolidon, Maleinsäureanhydrid-Polymeren, Polyamiden,
Polyvinylalkoholen und Polyethylenoxiden ausgewählt werden. Bevorzugte Hydrogele
sind Polyacrylsäure-Polymere,
die als HYDROPLUS (Mansfield Boston Scientific Corp., Watertown,
MA) erhältlich
sind und in dem
U.S.-Patent Nr.
5,091,205 beschrieben werden.
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Wenn
ein hydrophiler arterieller Ballonkatheter verwendet wird, ist es
nicht erforderlich, den Ballon vor dem Aufblasen zu schützen, da
relativ wenig von der Nukleinsäure
beim Transit bis zur Behandlungsstelle verloren geht, bis der Ballon
aufgeblasen wird und das die Nukleinsäure enthaltende hydrophile
Polymer gegen die geschädigte
Stelle gedrückt
wird. Wenn mit hydrophilem Polymer oberflächenbeschichtete Katheter oder Stäbe als Vehikel
oder Substrat verwendet werden, kann die Oberfläche geschützt werden, z.B. durch eine Hülle, bis
die Stelle der beabsichtigten Anwendung erreicht ist, und dann der
Schutz entfernt werden, um es dem hydrophilen Polymer, welches die
Nukleinsäure
enthält,
zu erlauben, die geschädigte
Stelle zu kontaktieren.
-
Die
Nukleinsäure
in wässriger
Lösung
wird in das hydrophile Polymer inkorporiert unter Bildung einer Nukleinsäure-hydrophiles
Polymer-Zusammensetzung. Die Nukleinsäure wird ohne Komplexierung
oder chemische Reaktion mit dem hydrophilen Polymer inkorporiert
und wird vorzugsweise relativ frei daraus freigesetzt, wenn dieses
in Kontakt mit den Zellen am Ort einer Schädigung gebracht wird. Die resultierende
Struktur umfasst einen Träger,
z.B. den Ballon des Ballonkatheters, auf welchen das Hydrogel aufgebracht
ist, in oder auf welches die gewünschte
DNA und der mit dieser assoziierte Träger, z.B. ein Phagen- oder
Plasmidvektor, inkorporiert wird. Das hydrophile Polymer ist vorzugsweise
an den Träger
derart angeheftet, dass nach einer Abgabe der DNA an die Zielzellen
das hydrophile Polymer mit dem Träger entfernt wird.
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Die
Nukleinsäure-hydrophiles
Polymer-Zusammensetzung kontaktiert die Arterienwand vorzugsweise mittels
eines Katheters. Der Katheter ist vorzugsweise ein Ballonkatheter,
der für eine
Insertion in ein Blutgefäß konstruiert
ist, und weist einen Katheterschaft und einen expandierbaren Dilatationsballon,
welcher auf dem Katheterschaft montiert ist, auf. Wenigstens ein
Teil der äußeren Oberfläche des
expandierbaren Abschnitts wird durch eine Beschichtung eines fest
anhaftenden hydrophilen Polymers definiert. Inkorporiert in das
hydrophile Polymer ist eine wässrige
Lösung
der DNA, die an die Zellen des geschädigten Abschnitts des Blutgefäßes abgegeben
werden soll. Die Mittel zum Abgeben der Nukleinsäure, z.B. ein Katheter, und
die Nukleinsäure in
einer wässrigen
Lösung
können
zusammen in einem Kit enthalten sein.
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Im
Allgemeinen weist die Beschichtung aus hydrophilem Polymer (vorzugsweise
Hydrogel) im trockenen Zustand vorzugsweise eine Dicke in der Größenordnung
von etwa 1 bis 10 μm
auf, wobei eine 2 bis 5 μm-Beschichtung
typisch ist. Sehr dünne
Hydrogel-Beschichtungen, z.B. von etwa 0,2-0,3 μm (trocken), und viel dickere
Hydrogel-Beschichtungen, z.B. mehr als 10 μm (trocken), sind ebenfalls
möglich.
Typischerweise kann die Dicke der Hydrogel-Beschichtung um einen Faktor von etwa
2 bis 10 oder mehr quellen, wenn die Hydrogel-Beschichtung hydratisiert wird.
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Vorgehensweisen
zum Herstellen und Verwenden eines Ballons mit einer Hydrogel-Beschichtung werden
in dem
U.S.-Patent 5,304,121 ,
deren Offenbarung in diese Unterlagen durch Bezugnahme aufgenommen wird,
erläutert.
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Ein
repräsentativer
Katheter ist in 1 dargestellt. Unter Bezugnahme
auf 1 ist 1 die Wand des Blutgefäßes. Die
Figur zeigt den Katheterkörper 2,
der durch das Aufblasen eines Ballons 3, der an dem Ort des
Verschlusses 6 aufgeblasen wird, an Ort und Stelle gehalten
wird. Der Ballon umfasst eine Hydrogel-Beschichtung 4,
welche DNA 5 inkorporiert enthält.
-
Wenn
ein hydrophiler beschichteter Ballon verwendet wird, um das Verfahren
der Erfindung auszuführen,
wird die Nukleinsäure,
z.B. DNA, ex vivo auf die hydrophile Polymer-Beschichtung des Ballons aufgetragen.
Um das Auftragen zu vereinfachen, kann der Ballon aufgeblasen werden.
Sofern erforderlich, kann das Polymer mit warmer Luft getrocknet
und das Auftragen der DNA wiederholt werden. Die DNA-Menge, die
an die Arterienoberfläche
abgegeben werden muss, hängt
von der Fähigkeit
der DNA, in den Arterienzellen exprimiert zu werden, ab. Im Allgemeinen
beträgt
die Menge an nackter DNA, die auf den Ballonkatheter aufgetragen
wird, zwischen etwa 0,1 und 100 μg/mm2, mehr bevorzugt zwischen etwa 0,5 und etwa
20 μg/mm2, am meisten bevorzugt zwischen etwa 1,5
und etwa 8 μg/mm2. Vorzugsweise werden zwischen 0,5 mg und
5 mg DNA auf die Hydrogel-Beschichtung eines Ballonkatheters mit
einer aufgeblasenen Seitenfläche
von etwa 630 mm2 (z.B. ein Ballonkatheter
mit einem aufgeblasenen Durchmesser von etwa 5 mm und einer Länge von
etwa 40 mm) aufgetragen, wodurch eine Oberfläche mit etwa 0,8 bis etwa 8 μg/mm2 DNA bereitgestellt wird, wenn der Ballon
aufgeblasen ist und das Innere der Arterie kontaktiert. Mehr bevorzugt
werden zwischen 1 mg und 3 mg DNA auf das Polymer aufgetragen, wodurch
eine DNA-Beladung von etwa 1,6 bis etwa 4,8 μg/mm2 bereitgestellt
wird.
-
Der
Katheter wird eingeführt
unter Verwendung von perkutanen Standard-Anwendungstechniken und an
die gewünschte
Stelle, z.B. einen Verschluss oder einen Stent, dirigiert. Beispielsweise
wird bei der Behandlung von Atherosklerose der Ballon zu einem Arterienverschluss
dirigiert. Hat der Ballon, beispielsweise ein mit Hydrogel beschichteter
Ballon, seinen gewünschten
Ort einmal erreicht, wird er aufgeblasen, so dass die Hydrogel-Beschichtung
des Ballons den Verschluss kontaktiert, wodurch eine Freisetzung
der DNA direkt in das arterielle Gewebe bewirkt wird. Die Einführung der
DNA in die Plaque und umgebendes Gewebe tritt gleichzeitig mit der Öffnung des
Verschlusses des Dilatationsballons auf. Dementsprechend wird, wenn
ein Zerreißen
der Plaque und eine Stimulation von glatten Muskelzellen unterhalb
der Plaque und entlang von gesundem Gewebe der Gefäßwand durch
die Dilatation bewirkt werden, die DNA, welche das Endothelzell-Mitogen
kodiert, gleichzeitig an die bloßgelegte Endothel-Auskleidung
des Blutgefäßes abgegeben,
wo sie exprimiert wird, was die Reendothelialisierung vereinfacht,
wodurch eine Restenose verringert wird. Bevorzugte Zeitspannen für das Aufblasen
des Ballons reichen von 30 s bis 30 min, mehr bevorzugt 1 min bis
5 min.
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Einmal
transferiert, wird die DNA durch die Zellen am Schädigungsort
für einen
Zeitraum, welcher für eine
Reendothelialisierung ausreichend ist, exprimiert. Da die Vektoren,
welche die DNA enthalten, normalerweise nicht in das Genom der Zellen
inkorporiert werden, findet die Expression des Proteins von Interesse
nur für
einen begrenzten Zeitraum statt. Typischerweise wird das Endothelzell-Mitogen
in therapeutischen Konzentrationen nur etwa zwei Tage bis mehrere
Wochen, vorzugsweise etwa 1–2
Wochen, exprimiert. Es kann eine erneute Abgabe der DNA eingesetzt
werden, um zusätzliche
Zeitspannen einer Expression des therapeutischen Polypeptids bereitzustellen.
-
Das
Vehikel, sei es ein arterieller Ballon, ein Katheter, ein flexibler
Stab oder ein anderes geformtes Vehikel, kann mit Mitteln versehen
werden, die bei einer genauen Platzierung innerhalb des beabsichtigten Körperhohlraums
assistieren sollen. Es kann beispielsweise mit einem radioaktiven
Element ausgestattet werden oder strahlungsundurchlässig gemacht
werden, mit Mitteln, welche eine leichte Lokalisierung unter Verwendung
von Ultraschall erlauben, u.s.w. ausgestattet werden.
-
Die
Erfindung kann im Prinzip verwendet werden, um andere Blutgefäßschädigungen,
die zu einem Bloßlegen
der endothelialen Auskleidung der Gefäßwand führen, zu behandeln. Beispielsweise
wird eine primäre
Angioplastik zunehmend häufiger
für die
Behandlung eines akuten Myokardinfarkts verwendet. Eine Beschleunigung
der Reendothelialisierung unter Verwendung der Mittel der Erfindung
kann eine instabile Plaque stabilisieren und einen erneuten Verschluss
verhindern.
-
Zusätzlich werden
weithin endovaskuläre
Stents zunehmend häufiger
als eine Hilfsmaßnahme
bei einer Ballon-Angioplastik verwendet. Stents sind nützlich,
um ein suboptimales primäres
Ergebnis zu retten, wie auch, um eine Restenose zu verringern. Bislang
ist jedoch der Nachteil der endovaskulären Prothese ihre Empfindlichkeit
gegenüber
einem thrombotischen Verschluss bei ungefähr 3% der Patienten mit Arterien
von 3,3 mm oder größer gewesen.
Wenn Patienten sich einer Stent-Entfaltung in Arterien, welche kleiner
als das sind, unterziehen, ist die Inzidenz einer subakuten Thrombose
sogar noch höher.
Eine subakute Thrombose wird gegenwärtig nur durch den aggressiven
Einsatz von Antikoagulation verhindert. Die Kombination von vaskulärer Intervention
und intensiver Antikoagulation erzeugt signifikante Risiken in Hinblick
auf periphere vaskuläre
Traumata zu dem Zeitpunkt der Stent/Angioplastik-Prozedur. Eine
Reendothelialisierung des Abschnittes des Gefäßes, der durch das Entfalten
des Stents verletzt wird, kann diese Nachteile beseitigen, wodurch die
Thrombogenität
der mit einem Stent versehene Stelle abgeschwächt und auch die Vermehrung
von glatten Muskelzellen, welche für eine Stenose bei 10 bis 15%
der Patienten, die sich einer Stent-Therapie unterziehen, verantwortlich
ist, verringern. Die Eliminierung eines aggressiven Antikoagulations-Therapieplans
stellt eine signifikante Verbesserung beim Einsatz der Stent-Technologie
dar. Bei einer Mehrzahl von Stents gibt es eine höhere Rate
von subakuter Thrombose und Restenose, die durch die Verwendung
der Verfahren der Erfindung verringert werden kann. Darüber hinaus
kann durch die Verwendung des Verfahrens der Erfindung das Entfalten
von Stents auf Patienten mit Arterien, die kleiner als 3,0 mm im
Durchmesser sind, angewendet werden.
-
Die
Erfindung wird durch die folgenden Beispiele veranschaulicht. Diese
Beispiele werden bereitgestellt, um das Verständnis der Erfindung zu unterstützen, und
sollen nicht als eine Beschränkung
von dieser ausgelegt werden. Innerhalb der Beispiele werden die
folgenden Abkürzungen
verwendet: Ach, Acetylcholinchlorid; EC, Endothelzelle; LacZ, Gen,
welches β-Galactosidase mit
nuklearem Targeting kodiert; nTf, nicht-transfiziert; rET, Reendothelialisierung;
und Tf, transfiziert.
-
Beispiel 1
-
Reendothelialisierung eines Ballon-geschädigten Arteriensegments
-
Tiere
-
Für alle Experimente
wurden männliche
New Zealand White-Kaninchen (3,5–4,0 kg) (Pine Acre Rabbitry,
Norton, MA) gemäß von dem
St. Elizabeth's
Institutional Animal Care and Use Committee genehmigten Protokollen
verwendet. Bei 32 Kaninchen wurde eine Oberschenkelarterie einer
gleichzeitigen Ballon-Schädigung
und Transfektion mit phVEGF165 (VEGF-Tf)
unterzogen, während
die Oberschenkelarterie auf der entgegengesetzten Seite einer identischen
Ballon-Schädigung,
aber keinem Gentransfer (VEGF-nTf) unterzogen wurde, während die
Oberschenkelarterie auf der entgegengesetzten Seite einer identischen
Ballon-Schädigung,
aber keinem Gentransfer (VEGF-nTf) unterzogen wurde (2).
Eine andere Gruppe von 32 Kaninchen unterzog sich einer gleichzeitigen
Ballon-Schädigung
und Transfektion von einer Oberschenkelarterie mit β-Gal (LacZ-Tf),
während
die Oberschenkelarterie auf der entgegenge setzten Seite einer identischen
Angioplastik-Ballon-Schädigung,
aber keinem Gentransfer (LacZ-nTf) unterzogen wurde. Die angiographischen
und histologischen Konsequenzen des VEGF-Gentransfers gegenüber dem
LacZ-Gentransfer wurden bei diesen 64 Tieren systematisch zu den
folgenden Zeitpunkten untersucht: Tag 3 (n = 4 jede Gruppe), Tag
5 (n = jeweils 4), 1 Woche (n = jeweils 8), 2 Wochen (n = jeweils
8) und 4 Wochen (n = jeweils 8). Zusätzliche 18 Kaninchen wurden
mit phVEGF165 transfiziert und zusammen
mit 3 normalen, nicht mit diesen Instrumenten behandelten Kaninchen
verwendet, um den zeitlichen Verlauf der VEGF-Genexpression am Tag 0 (vor der Angioplastik), am
Tag 3, am Tag 5, nach 1 Woche, 2 Wochen und 4 Wochen (3 Tiere zu
jedem Zeitpunkt) zu bestimmen. Schließlich wurden vier Kaninchen
mit β-Gal
transfiziert und 5 Tage später
getötet,
um die Transfektionseffizienz in diesem Modell zu bestimmen.
-
Plasmid-DNA
-
Der
in diesen Experimenten eingesetzte Saugetier-Expressionsvektor enthält einen
Zytomegalievirus-Promotor und die cDNA für rekombinanten humanen VEGF165; die Letztgenannte wurde zu Beginn aus ausgehend
von HL60-Leukämiezellen
hergestellten cDNA-Bibliotheken isoliert (Leung et al., Science, 246:1306-1309
(1989)). Eine Expression dieses Plasmids in vaskulären glatten
Muskelzellen von Kaninchen war zuvor in vitro durch einen Immunabsorptionsassay
für das
VEGF-Protein am Tag 3 nach der Transfektion dokumentiert worden
(Isner et al., Circulation, 91:2687-2692 (1995)). Die biologische
Aktivität
von VEGF165, der aus mit diesem Konstrukt
(phVEGF165) transfizierten Zellen sekretiert
wurde, war zuvor bestätigt
worden durch die Feststellung, dass durch transfizierte humane 293-Zellen
konditionierte Medien die Vermehrung von Kapillarzellen in vitro
förderten
(Leung et al., a.a.O.); und durch einen angiographischen und histochemischen Nachweis
einer Angiogenese nach einer Katheter-Verabreichung des Vektors in vivo (Isner
et al., a.a.O.).
-
Das
Plasmid pGSVLacZ (freundlicherweise von Dr. Claire Bonnerot zur
Verfügung
gestellt), welches eine β-Galactosidase-Sequenz
mit nukleärem
Targeting gekoppelt an den frühen
Promotor des Simian-Virus 40 enthält (Bonnerot et al., Proc.
Natl. Acad. Sci. USA, 84:6795-6799 (1987)), wurde für alle Kontrolltransfektionen
verwendet, wie zuvor beschrieben (Takeshita et al., J. Clin. Invest.,
93:652-661 (1994)).
-
Perkutane arterielle Gen- und Ballon-Angioplastik
in vivo
-
Jedes
Kaninchen wurde mit Ketamin (10 mg/kg) und Acepromazin (0,2 mg/kg)
nach einer Vormedikation mit Xylazin (2 mg/kg) anästhesiert.
Es wurde keine ergänzenden
Anästhetika-Dosen
benötigt.
Während des
gesamten Eingriffs wurde selbständige
Atmung beibehalten. Der Zugang zu der rechten gemeinsamen Kopfschlagader
wurde über
einen kleinen Medianschnitt im Nacken erhalten. Bei jedem Kaninchen
wurde ein mit Hydrogel beschichteter Ballonkatheter von 2,0 mm Durchmesser
und 2,0 cm Länge
(Slider with Hydroplus, Boston Scientific, Watertown, MA) verwendet,
um eine Ballon-Angioplastik und einen arteriellen Gentransfer auszuführen (Riessen
et al., Hum Gene Ther., 4:749-758 (1993)). Der Angioplastik-Ballon
wurde ex vivo vorbereitet, indem zuerst der zusammengefaltete Ballon
durch eine 5 Fr.-Schutzhülle
aus Teflon (Boston Scientific), welche gestaltet war, um den Kontakt
zwischen dem Blut und dem Ballon beim Einführen des Katheters in die Kopfschlagader
zu minimieren, geschoben wurde. Um Plasmid-DNA auf die äußerliche
Hydrogel-Polymer-Beschichtung des Angioplastik-Ballons aufzutragen,
wurde der Ballon auf 3 atm. Druck aufgeblasen. Dann wurde eine herkömmliche
Pipette verwendet, um 400 μg
phVEGF165 auf die 20 μm dicke Seitenfläche („later") von Hydrogel-Polymer,
welches die äußere Oberfläche des
aufgeblasenen Ballons überzog,
aufzutragen. Die Plasmid-DNA wurde in einer Konzentration von 10 μg/μl aufgetragen.
Einmal getrocknet, verleiht die aufgetragene Plasmid-Lösung der
Ballonoberfläche
eine deutlich sichtbare weiße
Glasur. Aus dem Ballon wurde als nächstes der Druck abgelassen,
er wurde in die Schutzhülle
zurückgezogen
und innerhalb der Schutzhülle
erneut auf 3 atm aufgeblasen, um wieder den Blutfluss entlang der
Ballonoberfläche
zu minimieren. Die Hülle
und der Angioplastik-Katheter wurden dann über die rechte gemeinsame Kopfschlagader
eingeführt
und bis zu der unteren Bauchschlagader unter Verwendung eines 0,014
Zoll-Führungsdrahts
(Hi-Torque Floppy II, Advanced Cardiovascular Systems, Temecula,
CA) unter Orientierung mittels eines Fluoroskops vorgeschoben. Aus
dem Ballonkatheter wurde dann der Druck abgelassen und er wurde
in eine Oberschenkelarterie geschoben, wo er unter Verwendung von
angiographischen Orientierungspunkten positioniert wurde. Dann erfolgte
ein dreimaliges Aufblasen des Ballons für jeweils 1 min mit 4 atm.
Nach dem abschließenden
Ablassen des Drucks wurden der Ballon und die Hülle herausgezogen. Ein identisches
Protokoll wurde eingesetzt, um die Oberschenkelarterie von Kontrolltieren
mit dem Plasmid pGSVLac, welches eine β-Galactosidase-Sequenz mit nukleärem Targeting
enthält,
zu transfizieren.
-
Für jedes
Kaninchen wurde nach Abschluss der Transfektion von einer Oberschenkelarterie
(mit phVEGF165 oder pGSVLacZ) die Oberschenkelarterie
auf der entgegengesetzten Seite einer Ballon-Schädigung (aber ohne Transfektion)
unter Verwendung eines neuen mit Hydrogel beschichteten Angioplastik-Ballons
von 2,0 mm Durchmesser und 2,0 cm Länge unterzogen. Die Ballon-Schädigung mit
oder ohne Gentransfer wurde durch eine Person, die über die
Behandlung keine Kenntnis hatte, ausgeführt. Nach Abschluss der gesamten
Prozedur wurden Nitroglycerin (0,25 mg, SoloPak Laboratories, Franklin
Park, IL) und Natriumheparin (200 USP-Einheiten, Elkins-sinn, Cherry Hill,
NJ) intraarteriell verabreicht, um einen akuten Verschluss der Ballon-geschädigten Stellen
zu verhindern.
-
Vasomotorische Reaktivität in vivo
-
Die
vasomotorische Reaktivität
des Arteriensegments, das der Ballon-Angioplastik und dem arteriellen Gentransfer
unterworfen worden war, wurde an dem Tag der Tötung ausgewertet. Ein 3 Fr.-Infusionskatheter mit
endständigem
Loch (Tracker-18TM, Target Therapeutics,
San Jose, CA) wurde in die linke Kopfschlagader eingeführt und
bis zu dem Beginn der transfizierten Hüftarterie unter Verwendung
eines 0,018 Zoll-Führungsdrahts
(Hi-Torque Floppy II) unter Orientierung mittels eines Fluoroskops
vorgeschoben. Dieser Katheter wurde sowohl für die Infusion von vasoaktiven
Arzneimitteln als auch eine selektive Angiographie der Oberschenkelarterie
verwendet. Unmittelbar nach einer Arzneimittelverabreichung wurde
unter Verwendung von 1 ml nicht-ionischem Kontrastmittel (Isovue-370,
Squibb Diagnostics, New Brunswick, NJ) eine Angiographie ausgeführt. Angiographische
Serienbilder wurden auf einem 105 mm-„spot film" mit einer Rate von 2 Filmen pro Sekunde
für 4 s
aufgezeichnet.
-
Um
die Endothel-abhängige
vasomotorische Reaktivität
zu bestimmen, wurden Acetylcholinchlorid (Ach) und Serotoninkreatinsulfat
(5-HT) von einer konstanten Infusionspumpe (1 ml/min) über den
3 Fr.-Katheter in Dosen von 0,15, 1,5 und 15 μg/kg/min jeweils für 2 min
abgegeben. Zwischen jeder Dosis von Mittel ließ man 5 min verstreichen, um
Grundlinien-Blutflussbedingungen
wieder herzustellen. Nachdem die Verabreichung von Ach bzw. 5-HT
abgeschlossen war, wurde eine zweiminütige intraarterielle Infusion
von Natriumnitroprussid (Np) (1,5 μg/kg/min) verabreicht, um die
Endothel-unabhängige
vasomotorische Reaktivität
zu bestimmen. Schließlich
wurde ein identisches Protokoll eingesetzt, um die geschädigte, aber
nicht-transfizierte Oberschenkelarterie auf der entgegengesetzten
Seite auszuwerten.
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Quantitative Angiographie
-
Der
angiographische luminale Durchmesser der Oberschenkelarterie vor
und nach Arzneimittelinfusion wurde unter Verwendung eines automatisierten
Kanten-Detektionssystems („Edge-Detection
System") (LaFree
et al., Proc. SPIE, 626:334-341 (1986) und Mancini et al., Circulation,
75:452-460 (1987)) bestimmt. Jede Ballon-geschädigte Stelle wurde definiert
und die Grenzlinien wurden gemäß dem Pilot-Angiogramm
der Angioplastik-Ballon-Schädigung
gezeichnet. Das für
die Analyse ausgewählte
Angiogramm wurde mit einer hochauflösenden Videokamera abgetastet;
das durch die Videokamera erzeugte Signal wurde digitalisiert und auf
einem Videomonitor dargestellt. Mittellinien wurden manuell für ein 20
mm langes Segment, das durch die zuvor gezeichneten Grenzlinien
definiert wurde, eingezeichnet. Konturen wurden automatisch auf
der Grundlage der gewichteten Summe der ersten und zweiten Ableitungsfunktionen,
die auf die digitalisierte Helligkeitsinformation angewendet wurden,
detektiert. Der durchschnittliche angiographische luminale Durchmesser und
der minimale luminale Durchmesser wurden dann für das definierte 20 mm lange
Segment von jeder transfizierten wie auch nicht-transfizierten Ballon-geschädigten Arterie
bestimmt.
-
Arzneimittel
-
Ach,
5-HT und Np wurden von Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, erhalten.
Unmittelbar vor jedem Experiment wurden frische Stammlösungen von
jedem hergestellt.
-
Tötung
der Tiere
-
Dreißig Minuten
vor der Tötung
erhielten alle Kaninchen eine intravenöse Injektion von 6 ml 0,5% Evans
blue-Farbstoff (Sigma) (3), abgegeben über die Ohrvene, um die verbleibende
nicht-endothelialisierte Fläche
zu identifizieren. Unter Ketamin- (10 mg/kg) und Acepromazin (0,2
mg/kg)-Anästhesie
wurde eine Kanüle
in die untere Bauchschlagader eingeführt und verwendet, um insgesamt
100 ml 0,9%-ige Kochsalzlösung mit
10 Einheiten/ml Heparin in situ, gefolgt von 100 ml 100% Methanol,
zu perfundieren. Das Grundlinien-Angiogramm, welches vor der Ballon-Schädigung aufgezeichnet
worden war, und die radiographische Pilot-Aufzeichnung des Angioplastik-Ballons
wurden verwendet, um das Arteriensegment, welches gewonnen werden musste,
zu identifizieren. Das anfänglich
geschädigte
2 cm lange Segment der Oberschenkelarterie wurde dann frei präpariert
und längs
eingeschnitten. Das gewonnene Arteriensegment wurde auf einer Korkplatte festgesteckt,
in 100% Methanol weiter fixiert und unter Verwendung eines Präpariermikroskops
(STEMI SR, Zeiss, Deutschland) in Vorbereitung einer planimetrischen
Analyse der rET (siehe unten) photographiert. Gewebe wurden weiter
durch Eintauchen in 100% Methanol fixiert, auf der Längskante
in Paraffin eingebettet und in 5 μm-Schnitte auf Objektträger, die
mit 3-Aminopropyltriethoxysilan beschichtet worden waren, geschnitten.
-
Planimetrische Analyse der Reendothelialisierung
-
Eine
planimetrische Analyse wurde ausgeführt unter Verwendung der Photographie
des gewonnenen Arteriensegments, die durch das Präpariermikroskop
aufgenommen worden war. Der Bereich der Intimaoberfläche, der
nach Anwendung von Evans blue-Farbstoff blau gefärbt worden war, wurde so interpretiert,
dass er den Abschnitt des Arteriensegments identifizierte, der Endothel-defizient
geblieben war; diese makroskopischen Analysen wurden bestätigt durch
Immunfärbung
von lichtmikroskopischen Schnitten unter Verwendung eines Endothelzellspezifischen
Markers (siehe unten). Ein computergestütztes Skizzierprogramm (MacMeasure
Version 1.9; NIMH, Bethesda, MD), welches mit einer Digitalisiertafel
(„digitizing
board") (Summagraphics,
Fairfield, CT) verbunden war, wurde durch eine Person, die über keine
Kenntnisse bezüglich
des Behandlungsprotokolls verfügte,
verwendet, um die Evans blue-positiven bzw. -negativen Flächen zu
umreißen. Speziell
wurde das Ausmaß der
endothelialisierten Fläche
berechnet als ein Prozentsatz der gesamten Intimafläche, die
in dem 2 cm langen Arterienabschnitt enthalten war.
-
Auswertung von Intima-Hyperplasie
-
Histologische
Längsschnitte,
die ausgehend von dem 20 mm langen Abschnitt von geschädigter Arterie
erhalten worden waren und mit einem „Trichrome"-Farbstoff für das elastische Bindegewebe
gefärbt
worden waren, wurden auf die Digitalisiertafel projiziert und die
Flächen
der Intima bzw. der Media wurden gemessen unter Verwendung des oben
beschriebenen computergestützten
Skizzierprogramms durch einen Techniker, der über keinerlei Kenntnisse bezüglich des
Behandlungsprotokolls verfügte.
-
Die
Dicke der nativen Media der Arterienwand ist variabel, was teilweise
die Abmessungen (Durchmesser) der individuellen Kaninchen-Oberschenkelarterie
wiederspiegelt. Dementsprechend wurde die Dicke der Media verwendet,
um das Ausmaß an
neointimaler Verdickung zu indizieren, und wird dementsprechend als
das Verhältnis
der Intima- zu der Mediafläche
(I/M) angegeben.
-
Auswertung der Proliferationsaktivität in geschädigten Arterien
-
Die
Proliferationsaktivität
in dem geschädigten
Arteriensegment, das zum Zeitpunkt der Tötung gewonnen worden war, wurde
ausgewertet durch Immunfärbungsanalyse
auf das „proliferating
cell nuclear antigen" (PCNA),
wie zuvor beschrieben (Pickering et al., J. Clin. Invest., 91:1469-1480
(1993)). Endogene Peroxid-Aktivität wurde mit 3,0% Wasserstoffperoxid
in PBS blockiert. Nicht-spezifische Proteinbindung wurde mit 10%
normalem Pferde-Serum blockiert. Schnitte wurden über Nacht
bei 4°C
mit einem monoklonalen Mäuse-Antikörper gegen
PCNA (Klon PC10, Signet, Dedham, MA) in einer Verdünnung von
1:40 in 1% BSA (Rinderserumalbumin)/PBS inkubiert. Negative Kontrollen
wurden mit MOPC-21, einem gereinigten nicht spezifischen monoklonalen
Mäuse-Antikörper (Sigma),
inkubiert. Gebundener primärer
Antikörper
wurde detektiert unter Verwendung einer Avidin-Biotin-Immunperoxidase-Methode
(Elite Avidin-Biotin Detection System, Signet). Schnitte wurden
mit Bandeiraea simplicifolia I (BSI)-Lectin, 5 μg/ml, Vector Laboratories, Burlingame,
CA) (25) leicht gegengefärbt.
Für die
Lectin-Färbung wurden
Schnitte, die mit 0,3% Wasserstoffperoxidase vorbehandelt worden
waren, mit 5 μg/ml
biotinyliertem Lectin (Vector) über
Nacht bei 4°C
inkubiert. Nach Waschen wurden Objektträger mit mit Peroxidase konjugiertem
Streptavidin (BioGenex Laboratories, San Ramon, CA) 1 h inkubiert;
dann wurde 3-Amino-9-ethylcarbazol (AEC, Signet) als ein Substrat
für das
Enzym aufgetragen, was zu einem braunen Reaktionsprodukt führte.
-
Das
Ausmaß an
Proliferationsaktivität
wurde für
jeden Längsschnitt
durch eine Person, welche über keine
Kenntnisse bezüglich
des Behandlungsplans verfügte,
als die Anzahl von positiven Zellen in der Intima pro Länge des
20 mm langen Längsschnitts,
d.h. Zellen/mm, gemessen. Die PCNA-Färbung des Kaninchen-Ileums
diente als die positive Kontrolle für diese Untersuchung.
-
Analyse der Genexpression
-
Die
Expression von phVEGF165 wurde ausgewertet
unter Verwendung der reverse Transkriptions-Polymerasekettenreaktion
(RT-PCR). Gesamte zelluläre
RNA wurde aus transfizierten Arteriensegmenten unter Verwendung
von TRI REAGENT (Molecular Research Center, Cincinnati, OH) isoliert.
Extrahierte RNA wurde mit DNase (0,5 μl, 10 U/μl, RNase-frei, Message Clean-Kit,
GenHunter, Boston, MA) bei 37°C
30 min behandelt, um DNA-Verunreinigungen zu beseitigen. Die Ausbeute
an extrahierter RNA wurde spektrophotometrisch durch Ultraviolett-Absorption bei 260
nm bestimmt. Um zu bestimmen, dass RNA nicht abgebaut worden war und
dass ribosomale Banden intakt waren, wurde 1 mg von jeder RNA-Probe
hitzedenaturiert und einer Elektrophorese durch ein 1%-iges nicht-denaturierendes
Mini-Agarosegel unterworfen. Wir verwendeten 0,5 μg von jeder
RNA-Probe, um cDNA herzustellen in einem Reaktionsvolumen von 20 μl, enthaltend
jeweils 0,5 mM Desoxynukleotidtriphosphat (Pharmacia, Piscataway,
NJ), 10 mM Dithiothreitol, 10 Einheiten RNasin (Promega, Madison,
WI), 50 mM Tris-HCl [pH 8,3], 75 mM KCl, 3 mM MgCl2,
1 mg zufällige
(„random") Hexanukleotid-Primer
(Promega) und 200 Einheiten reverse Transkriptase von M-MLV (Gibco
BRL, Gaithersburg, MD). Für
größere Genauigkeit
und Reproduzierbarkeit wurden Referenzmischungen („master
mixes") für eine Anzahl
von Reaktionen erstellt und in RNA enthaltende Röhrchen aliquotiert. Reaktionen
wurden bei 42°C
1 h inkubiert, dann bei 95°C
5 min, um die Reaktion zu beenden. Zwanzig ml Diethylpyrocarbonat
(DEPC)-Wasser wurden dann zugegeben und 5 ml der verdünnten Reaktion
(1/8) wurden in der PCR-Analyse verwendet. Die optimierte Reaktion
in einem Gesamtvolumen von 20 μl
enthielt 0,2 mM von jedem Desoxynukleotidtriphosphat, 3 mM MgCl2, 2 ml PCR II-Puffer (Perkin-Elmer, Norwalk,
CT; Endkonzentrationen: 50 mM KCl, 10 mM Tris-HCl), 5 ng/ml (13,77
pmol) von jedem Primer und 0,5 Einheiten AmpliTaq-DNA-Polymerase
(Perkin-Elmer).
Die PCR wurde an einem 9600 PCR-System (Perkin-Elmer) unter Verwendung
von dünnwandigen
0,2 ml-microamp-Röhrchen
ausgeführt.
Eine Amplifizierung wurde ausgeführt
für 35–45 Zyklen
von 94°C
für 20
s, 55°C
für 20
s und 72°C
für 20
s, endend mit 5 min bei 72°C.
Um auf falsche Positive zu testen, wurden Kontrollen ohne RNA und
ohne reverse Transkriptase mit aufgenommen. Ein Paar von Oligonukleotid-Primern (22-mere)
wurde gestaltet, um eine 258 bp-Sequenz ausgehend von der mRNA von
humanem VEGF zu amplifizieren. Um Spezifität sicherzustellen und eine
Amplifizierung von endogenem Kaninchen-VEGF zu vermeiden, wurde
jeder Primer aus einer Region ausgewählt, die unter verschiedenen
Spezies nicht konserviert ist. Die Sequenzen der verwendeten Primer
waren: 5'-GAGGGCAGAATCATCACGAAGT-3' (SEQ ID NO: 1) (Sinn);
und 5'-TCCTATGTGCTGGCCTTGGTGA-3' (SEQ ID NO: 2) (Antisinn).
Vorläufige
Experimente zeigten, dass kultivierte glatte Muskelzellen vom Kaninchen
mit diesem Primer nur hybridisierten, wenn sie mit einem Plasmid,
welches die cDNA für
humanen VEGF enthielt, transfiziert waren. Kulturen von normalen
(nicht-transfizierten) oder mit β-Galactosidase
transfizierten glatten Muskelzellen vom Kaninchen zeigten keine
Hybridisierung. RT-PCR-Produkte wurden durch 2%-Agarose-Gelelektrophorese analysiert.
DNA-Banden wurden unter UV-Beleuchtung nach Anfärbung mit Ethidiumbromid sichtbar
gemacht.
-
Um
die Effizienz eines auf diese Weise in vivo erfolgten arteriellen
Gentransfers zu bestimmen, wurden LacZ-Tf-Arterien am Tag 5 gewonnen
und die β-Galactosidase-Aktivität wurde
durch Inkubation mit 5-Brom-4-chlor-3-indolyl-β-D-galactosid-Chromogen (X-Gal,
Sigma) bestimmt, wie zuvor beschrieben (Riessen et al., a.a.O.).
Nach Anfärbung
mit X-Gal-Lösung
wurden Gewebe in Paraffin eingebettet, zu Schnitten geschnitten
und mit „Nuclear
Fast Red" gegengefärbt. Eine
nukleär
lokalisierte β-Galactosidase-Expression
des Plasmids pGSVLacZ konnte nicht aus einer endogenen β-Galactosidase-Aktivität resultieren;
dementsprechend wurde eine histochemische Identifizierung von β-Galactosidase
innerhalb des Zellkerns als Beweis für einen erfolgreichen Gentransfer
und eine erfolgreiche Genexpression interpretiert. Eine zytoplasmatische
oder andere Anfärbung
wurde für
den Zweck der vorliegenden Untersuchung als nicht-spezifisch angesehen.
-
Statistische Analyse
-
Alle
Ergebnisse sind ausgedrückt
als Mittelwert ± Standardfehler
(m ± SE).
Die statistische Signifikanz wurde ausgewertet unter Verwendung
eines ungepaarten Student's
t-Test für
Vergleiche zwischen zwei Mittelwerten oder einer Kontingenztafel-Analyse
für Häufigkeitsvergleiche.
Ein Wert von p < 0,05
wurde so interpretiert, dass er statistische Signifikanz bezeichnet.
-
ERGEBNISSE
-
Reendothelialisierung
-
Eine
mit Evans blue-Farbstoff-Färbung
ausgeführte
planimetrische Analyse offenbarte eine nahezu vollständige rET
des 20 mm langen Segments von Ballon-geschädigter Kaninchen-Oberschenkelarterie
unter den VEGF-transfizierten Arterien am Tag 7, während das
Ausmaß der
rET in LacZ-transfizierten Arterien am Tag 7 < 50% vollständig war und nach 4 Wochen
in einem Ausmaß von
nahezu 20% unvollständig
blieb (4A, 4C).
Bei 10 VEGF-Tf-Arterien war die rET nach 4 Wochen tatsächlich zu
100% komplett, eine Feststellung, die bei keiner der LacZ-Tf-Arterien
beobachtet wurde. Die Reendothelialisierung war nicht nur bei mit phVEGF165 transfizierten Arterien (VEGF-Tf), sondern
auch bei den Ballon-geschädigten,
nicht-transfizierten Arterien
auf der entgegengesetzten Seite (VEGF-nTf) beschleunigt (4B, 4C).
-
Vasomotorische Aktivität
-
Frühere Untersuchungen
der rET haben gezeigt, dass eine Wiederherstellung von anatomischer
Unversehrtheit und eine Wiedererlangung von physiologischer Funktion
nicht gleichzeitig erfolgen (Tanaka et al., Circulation, 33:1788-1803
(1993); Shimokawa et al., Circ. Res., 61:256-270 (1987) und Weidinger
et al., Circulation, 81:1667-1679 (1990)). Dementsprechend haben
wir die vasomotorische Reaktion auf Endothel-abhängige Agonisten unter Verwendung
einer quantitativen Angiographie bestimmt. Konsistent mit den früheren Erfahrungen
von Weidinger et al. (a.a.O.) zeigten mit LacZ transfizierte Kontroll-Kaninchen
eine anhaltende Beeinträchtigung
der vasomotorischen Reaktion auf Endothel-abhängige Mittel 4 Wochen nach
einer Schädigung
(Tabelle 1). Im Gegensatz dazu zeigten mit phVEGF
165 transfizierte
Arterien eine Wiedererlangung einer nahezu normalen Endothel-abhängigen Vasoreaktivität innerhalb
von 1 Woche (
6 und
7).
Ein ähnlicher
Nutzen wurde für
die Ballon-geschädigte
nicht-transfizierte Extremität
auf der entgegengesetzten Seite beobachtet (Tabelle 1). TABELLE 1 Vasokonstriktion (+) oder Vasodilatation
(–) in
Reaktion auf Endothel-abhängige
und -unabhängige
Agonisten nach einer phVEGF
165-Gentherapie
| | 1
Woche 5-HT | Ach | Np |
| LacZ-T ∫ | (+)48.6 ± 5.4 | (+)4.2 ± 2.8 | (–)4.2 ± 2.8 |
| VEGF-T ∫ | (+)24.2 ± 4.1* | (–)6.8 ± 2.2* | (–)6.6 ± 1.7 |
| LacZ-nT ∫ | (+)53.6 ± 5.0 | (+)12.8 ± 6.6 | (–)5.8 ± 3.8 |
| VEGF-nTF | (+)29.3 ± 3.4* | (–)0.5 ± 3.0 ✝ | (–)8.0 ± 2.2 |
| | | | |
| | 2 Wochen 5-HT | Ach | Np |
| LacZ-T ∫ | (+)56.3 ± 8.0 | (+)15.1 ± 4.8 | (–)0.9 ± 2.9 |
| VEGF-T ∫ | (+)24.2 ± 4.5* | (–)3.3 ± 2.8* | (–)5.4 ± 2.2 |
| LacZ-nT ∫ | (+)48.4 ± 5.6 | (+)10.8 ± 5.0 | (+)0.7 ± 2.0 |
| VEGF-nTF | (+)28.3 ± 2.6* | (–)1.3 ± 2.6* | (–)2.1 ± 1.4 |
| | | | |
| | 4 Wochen 5-HT | Ach | Np |
| LacZ-T ∫ | (+)35.5 ± 9.1 | (–)1.1 ± 5.1 | (–)6.0 ± 4.5 |
| VEGF-T ∫ | (+)10.6 ± 2.3 ✝ | (–)4.6 ± 2.9 | (–)3.1 ± 1.3 |
| LacZ-nT ∫ | (+)29.0 ± 4.2 | (–)4.6 ± 2.7 | (–)6.5 ± 3.1 |
| VEGF-nTF | (+)13.6 ± 3.1 ✝ | (–)2.7 ± 2.5 | (–)6.6 ± 4.7 |
Werte repräsentieren
die Veränderung
als prozentuale luminale Verengung:
* = p < 0,01 gegenüber Kontrolle; ✝ =
p < 0,05 gegenüber Kontrolle.
-
Neointimale Verdickung
-
Der
Einfluss einer beschleunigten rET auf die neointimale Verdickung
wurde durch lichtmikroskopische Untersuchung als das Verhältnis der
Intimafläche
zur Mediafläche
(I/M-Verhältnis) in
längs geschnittenen Schnitten
ausgewertet (8). LacZ-Tf-Arterien
zeigten 4 Wochen lang eine fortschreitende neointimale Verdickung
(1 Woche = I/M = 0,11 ± 0,02;
2 Wochen = 0,59 ± 0,04;
4 Wochen = 0,69 ± 0,10).
Im Gegensatz dazu zeigten VEGF-Tf-Arterien signifikant weniger Intimaverdickung,
einschließlich
einer Regression der Intimaverdickung zwischen Woche 2 und 4 (1
Woche = 0,06 ± 0,02;
2 Wochen = 0,20 ± 0,05,
p < 0,1; 4 Wochen
= 0,14 ± 0,02,
p < 0,01).
-
Darüber hinaus
entwickelte das I/M-Verhältnis
der Ballon-geschädigten
Arterie auf der entgegengesetzten Seite in der VEGF-Gentransfer-Gruppe
(VEGF-nTf) weniger Intimaverdickung und zeigte kein Fortschreiten
während
Woche 2 bis 4 verglichen mit der Arterie auf der entgegengesetzten
Seite der LacZ-Kontrollen (LacZ-nTf, 1 Woche = 0,05 ± 0,03;
2 Wochen = 0,54 ± 0,06;
4 Wochen = 0,84 ± 0,09;
VEGF-nTf, 1 Woche = 0,09 ± 0,02;
2 Wochen = 0,29 ± 0,08,
p < 0,05; 4 Wochen
= 0,31 ± 0,09,
p < 0,01.
-
Proliferationsaktivität
-
Die
Verringerung der neointimalen Verdickung, die mit der durch phVEGF165 beschleunigten rET beobachtet wurde,
war mit einer begleitenden Verringerung der Proliferationsaktivität sowohl
in der Media als auch der Neointima verbunden (10).
Die Zellproliferation in der Media von LacZ-Tf erreichte einen Spitzenwert 3
Tage nach der Schädigung
und nahm dann über
die verbleibenden 4 Wochen nach und nach ab (Tag 3 = 32,5 ± 4,7 PCNA-positive
Zellen/mm; Tag 5 = 27,1 ± 2,9;
1 Woche = 10,5 ± 2,0;
2 Wochen = 6,2 ± 2,7;
4 Wochen = 0,3 ± 0,2).
Die Proliferationsaktivität
in der Media von VEGF-Tf zeigte ebenfalls einen Spitzenwert 3 Tage
nach dem Gentransfer (24,7 ± 6,8
Zellen/mm), nahm dann aber schnell ab (Tag 5 = 12,2 ± 4,2 Zellen/mm; 1
Woche = 2,6 ± 1,0;
2 Wochen = 1,6 ± 0,5;
4 Wochen = 0,1 ± 0,0).
Eine selektive Immunfärbung
von aneinander grenzenden Schnitten ermittelte, dass proliferierende
Zellen überwiegend
glatte Muskelzellen waren.
-
Es
wurden auch zeitliche Unterschiede bei der Proliferationsaktivität für die Neointima
von durch LacZ gegenüber
durch VEGF transfizierten Tieren beobachtet. Die Neointima-Proliferation in
LacZ-Tf-Arterien stieg bis zu 2 Wochen nach der Transfektion weiterhin
an (Tag 3 = 0,2 ± 0,1
Zellen/mm; Tags = 4,1 ± 1,9;
1 Woche = 8,6 ± 2,0;
2 Wochen = 10,7 ± 2,0;
4 Wochen = 2,3. Für
VEGF-Tf erreichte die neointimale Proliferationsaktivität einen
Spitzenwert am Tag 5 und fiel dann steil ab (Tag 3 = 2,4 ± 0,6 Zellen/mm;
Tag 5 = 7,0 ± 3,4;
1 Woche = 0,8 ± 0,3;
2 Wochen = 2,0 ± 0,7;
4 Wochen = 0,1 ± 0,1).
-
PCNA-positive
Zellen wurden durch positive BSI-Lectin-Färbung von offensichtlich identischen
Zellen, die entlang der luminalen Kante von aneinander angrenzenden
(in einer Serie geschnittenen) histologischen Schnitten lokalisiert
waren, als ECs identifiziert. Die Proliferationsaktivität von ECs
war während
der gesamten 4 Wochen nach der Ballon-Schädigung in LacATf konstant.
Im Gegensatz dazu zeigte die EC-Proliferation in VEGF-Tf-Arterien
einen hervorstechenden Spitzenwert am Tag 3 und war dann 1 Woche
nach der Transfektion verringert (11).
-
Thromboresistenz
-
Die
Thromboresistenz stellt eine wichtige Erwägung in der unmittelbaren Situation
nach einer Angioplastik dar. Dies trifft insbesondere zu, wenn eine
Angioplastik aufgrund eines akuten Myokardinfarkts ausgeführt wird,
in welchem Falle das Risiko eines subakuten Neuverschlusses erhöht ist.
In der vorliegenden Untersuchung führte eine durch phVEGF165 beschleunigte rET zu einer erhöhten Thromboresistenz
(Widerstandsfähigkeit
gegen Thrombose). Speziell entwickelte sich ein thrombotischer Verschluss
weniger häufig
bei Tieren, die mit ph VEGF165 transfiziert
waren (2/64) als bei jenen, die mit LacZ transfiziert waren (14/64)
(p < 0,001).
-
Genexpression
-
VEGF-Genexpression,
bestimmt durch RT-PCR in 3 normalen, keinem instrumentellen Eingriff
unterzogenen Kaninchen und Kaninchen, die mit phVEGF165 transfiziert
worden waren, am Tag 0 (vor Angioplastik), Tag 3, Tag 5, nach 1
Woche, 2 Wochen und 4 Wochen (n = jeweils 3). Die Genexpression
wurde bereits nach 3 Tagen beobachtet, hielt bis Woche 2 an und
war in Woche 3 verringert (12).
-
RT-PCR
wurde auch an Schnitten aus anderen Organen ausgeführt und
offenbarte keine mRNA-Expression von VEGF an irgendeiner Stelle
entfernt von dem VEGF-transfizierten Arteriensegment (12).
-
Vier
Kaninchen wurden mit LacZ transfiziert und 5 Tage später getötet; eine
quantitative Untersuchung, welche alle Zellen umfasste, in ausgewählten lichtmikroskopischen
Gebieten zeigte an, dass die Transfektion effektiv < 0,1% war, was mit
früheren
Berichten konsistent war (Isner et al., a.a.O., und Mancini et al., a.a.O.).
-
Frühere Untersuchungen
der rET an verschiedenen Tiermodellen haben gezeigt, dass die Wiederherstellung
von anatomischer Unversehrtheit und die Wiedererlangung von physiologischer
Funktion nicht gleichzeitig erfolgen (Tanaka et al., a.a.O.; Shimokawa
et al., a.a.O., und Weidinger et al., a.a.O.). Dementsprechend haben
wir versucht, das funktionale Verhalten einer VEGF-induzierten Reendothelialisierung
auf drei Weisen zu charakterisieren. Als erstes be stimmten wir die
vasomotorische Reaktion auf Endothel-abhängige Agonisten. Konsistent
mit den früheren
Erfahrungen von Weidinger et al. (a.a.O.) zeigten mit LacZ transfizierte
Kontroll-Kaninchen
eine anhaltende Beeinträchtigung
der Reaktion auf Ach und 5-HT 4 Wochen nach einer Schädigung.
Im Gegensatz dazu zeigten mit phVEGF165 transfizierte
Arterien eine Wiedererlangung einer nahezu normalen Endothel-abhängigen Reaktion
innerhalb von 1 Woche. Eingeschoben sei, dass angenommen werden
kann, dass die physiologische Reaktion unter VEGF-Tf-Kaninchen nach
vier Wochen die Reaktion von wiederhergestelltem Endothel in Abwesenheit
einer andauernden VEGF165-Sekretion darstellt,
da Analysen unter Verwendung von RT-PCR in den gegenwärtigen und
früheren
(Isner et al., a.a.O.) Untersuchungen konsistent keinerlei Hinweis
auf eine Transgen-Expression jenseits von 3 Wochen gezeigt haben.
-
Die
verringerte Proliferationsaktivität unter glatten Muskelzellen
und die damit verbundene Verringerung bei der Intimaverdickung,
die in Arteriensegmenten, die an Stellen eines VEGF-Gentransfers
angrenzen, beobachtet werden, bilden einen zweiten Nachweis für schnell
wiederhergestellte EC-Funktion. Der genaue Mechanismus, durch welchen
das Neo-Endothel Intimahyperplasie moduliert, muss noch aufgeklärt werden (siehe
unten), reflektiert aber mutmaßlich
eine schnelle Wiederherstellung von antiproliferativen Merkmalen, die
für gesunde
ECs charakteristisch sind.
-
Eine
VEGF-induzierte rET schien zu einer verbesserten Thromboresistenz
zu führen,
eine Funktion von besonderer Bedeutung in der Situation nach einer
Angioplastik. Tatsächlich
könnte
angesichts des gegenwärtigen
Trends, welcher eine verstärkte
Anwendung von Angioplastik bei der Behandlung des akuten Myokardinfarkts
favorisiert, ein VEGF-Gentransfer für den Zweck, eine akut zerrissene
Plaque zu stabilisieren, zusätzlichen
Nutzen bringen.
-
Beispiel 2
-
Reendothelialisierung eines Arteriensegments
nach Ballon-Deendothelialisierung und Stent-Implantation
-
Plasmide
-
Der
pGSVLacZ-Vektor wird oben beschrieben.
-
Die
cDNA, die in diesem Beispiel verwendet werden soll, kodiert die
165 Aminosäuren-Isoform von VEGF
und ist zuvor beschrieben worden. Das Plasmid, in welches die VEGF-cDNA
inseriert worden ist, phVEGF165SR, ist ein
einfaches eukaryotisches Expressionsplasmid, welches den Zytomegalievirus (CMV)-Promotor/Enhancer
einsetzt, um die VEGF-Expression zu steuern. Dieses Plasmid ist
ein Derivat von pCG (Tanaka et al., Cell, 60:375-386 (1990)). Der
das Gerüst
bildende Plasmid-Vektor ist von pBSM13+ abgeleitet. Eine Kassette,
welche das Kanamycinresistenzgen kodiert, ist inseriert worden und
der SV40-Replikationsstartpunkt, der in dem ursprünglichen
Vektor (phVEGF165) vorhanden war, ist zum
großen
Teil entfernt worden. Der CMV-Promotor befindet sich an den Positionen –522 bis
+72 bezogen auf die CMV-cap- Stelle. Strangaufwärts von
der kodierenden Sequenz von phVEGF165SR
befindet sich die 5'-Leader-Sequenz des HSV-Thymidinkinasegens
von Position +51 bis +114 bezogen auf die Thymidinkinase-cap-Stelle.
Strangabwärts
von der kodierenden Sequenz von VEGF liegt die Kaninchen-b-Globin-Gensequenz
von Position +905 bis +2080 bezogen auf die b-Globin-cap-Stelle.
-
Um
die Plasmid-Identität
zu bestätigen,
ist die vollständige
phVEGF165SR-Sequenz (6609 bp) unter Verwendung
von 30 Sequenzprimern bestimmt worden. Die Struktur der doppelsträngigen DNA
wurde durch die „cycle
sequencing"-Methode
unter Verwendung von fluoreszierenden Didesoxy-Kettenabbruchnukleotiden mit
einem Applied Biosystem 373A Automated Sequencer bestimmt. Sequenzen
wurden an Macintosh Quadra-Computern mit MacVector- und Sequence Navigator-Software
analysiert. Die Qualitätskontrolle
für diese Sequenzierungsanalyse
besteht aus parallelen Sequenzanalysen von Bluescript- und M13-Kontrollen.
Diese Analyse enthüllte
eine 99,1%-ige Sequenzhomologie zwischen unserer bestimmten Sequenz
und der vorhergesagten Sequenz des 6609 bp-Plasmids.
-
Die
Sequenz der kodierenden Region von VEGF wurde auf beiden Strängen bestimmt
und sie stand in 100%-iger Übereinstimmung
mit der vorhergesagten Sequenz.
-
METHODEN
-
Verfahren
wurden ausgeführt
unter Verwendung von New Zealand-Kaninchen (3,5–4,0 kg). Alle Tiere erhielten
Aspirin (100 mg/Tag) für
1 Woche vor dem Eingriff und die Behandlung wurde bis zur Tötung fortgesetzt.
Alle erhielten Heparin (1000 Einheiten) und Antibiotika (2,5 mg/kg)
zum Zeitpunkt des Eingriffs. Das Protokoll war so gestaltet, dass
sowohl die lokale als auch die systemische Wirkung der Therapie
unterschieden werden konnte.
-
- A) Gruppe A: Mit VEGF behandelte Gruppe
1)
Erste Seite – Mit
VEGF behandelt:
– Fogarty-Ballon-Deendothelialisierung
der äußeren Hüftarterie.
– Stent
(Johnson and Johnson PS 204C)-Implantation in äußere Hüftarterie unter Verwendung
eines 3,0 mm-PTCA-Ballons mit 8 atm-Aufblasdruck.
– Lokale
Applikation von 800 μg
phVEGF165SR-Plasmid-DNA unter Verwendung
eines mit Hydrogel beschichteten PTCA-Ballons von 3,5 mm Durchmesser
bei 6 atm.
- 2) Zweite Seite – keine
Behandlung
– Fogarty-Ballon-Deendothelialisierung
der äußeren Hüftarterie.
– Stent
(Johnson and Johnson PS 204C)-Implantation in äußere Hüftarterie unter Verwendung
eines 3,0 mm-PTCA-Ballons mit 8 atm-Aufblasdruck.
- B) Gruppe B: Mit β-Galactosidase
behandelte Gruppe
1) Erste Seite – Mit β-Galactosidase behandelt:
– Fogarty-Ballon-Deendothelialisierung
der äußeren Hüftarterie.
– Stent
(Johnson and Johnson PS 204C)-Implantation in äußere Hüftarterie unter Verwendung
eines 3,0 mm-PTCA-Ballons mit 8 atm-Aufblasdruck.
– Lokale
Applikation von 800 μg
des Plasmids pGSVLacZ, enthaltend eine β-Galactosidase-Sequenz mit nukleärem Targeting,
unter Verwendung eines mit Hydrogel beschichteten PTCA-Ballons von 3,5 mm Durchmesser
bei 6 atm.
2) Zweite Seite – keine Behandlung:
– Fogarty-Ballon-Deendothelialisierung
der äußeren Hüftarterie.
– Stent
(Johnson and Johnson PS 204C)-Implantation in äußere Hüftarterie unter Verwendung
eines 3,0 mm-PTCA-Ballons mit 8 atm-Aufblasdruck.
-
Alle
Tiere wurden 7 Tage nach der Stent-Implantation getötet. Der
Prozentsatz der Endothel-Bedeckung der Stentoberfläche wurde
durch Lichtmikroskopie und durch Rasterelektronenmikroskopie ausgewertet.
-
Ergebnisse:
-
- Gruppe A = 6 Kaninchen.
- Gruppe B = 4 Kaninchen.
-
– Prozentsatz
der Reendothelialisierung:
| Gruppe A (VEGF) | behandelte Seite = 87,0
+/– 5,0
Kontrollseite
= 42,2 +/– 11,3 |
| Gruppe B (β-Galactosidase) | behandelte Seite = 2,1
+/– 1,1
Kontrollseite
= 21,6 +/– 14,8 |
-
Die
behandelte Seite der VEGF-Gruppe wies eine signifikant bessere Endothelbedeckung
am Tag 7 als alle anderen Seiten auf (p < 005).
-
-
