DE69637242T2 - Methode und zusammensetzungen zur identifizierung von morphogen-analogen - Google Patents

Methode und zusammensetzungen zur identifizierung von morphogen-analogen Download PDF

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Description

  • Die vorliegende Erfindung betrifft allgemein das Gebiet der Morphogene.
  • Osteogenes Protein-1 menschlichen Ursprungs (hOP-1), das in der US-P-5,011,691 und 5,266,683 , und in Ozkaynak et al. (1990) EMBO J. 9: 2085-2093 beschrieben wurde, wurde kürzlich anerkannt die Fähigkeit aufzuweisen die genuine Gewebemorphogenese in Säugern, einschließlich der endochondralen Morphogenese des Knochens zu induzieren. Es wurde weiterhin wahrgenommen, dass das OP-1 der Maus (siehe US-P-5,266,683 ) und das Genprodukt 60A von Drosophila melanogaster, in Wharton et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 9214-9218 beschrieben, in ähnlicher Weise eine richtige Gewebemorphogenese in Säugern induzieren. Verwandte Proteine, einschließlich OP-2 (Ozkaynak (1992) J. Biol. Chem. 267: 25220-25227 und US-P-5,266,683 ); BMP5, BMP6 (Celeste et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 9843-9847, Vgr-1 (Lyons et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 4554-4558) und dergleichen werden in ähnlicher Weise angesehen die Fähigkeit aufzuweisen eine richtige Morphogenese von Säugergewebe zu induzieren. Als Folge wurde der Charakterisierung und Entwicklung dieser und anderer Funktionalitäten und strukturell verwandter Proteine (allgemein, Morphogenen) zur Verwendung in der regenerativen Heilung von verletzten oder erkrankten Geweben oder Organen von Säugern ein beachtliches Bemühen gewidmet. Ein besonderes Bemühen wurde der Entwicklung von auf Morphogen basierenden Therapeutika zur Behandlung von verletztem oder erkranktem Knochengewebe des Säugers gewidmet, einschließlich therapeutischer Zusammensetzungen, um eine regenerative Heilung von Knochendefekten, wie beispielsweise Brüchen zu induzieren, als auch um gesunde metabolische Eigenschaften in erkranktem Knochengewebe, beispielsweise osteogenem Knochengewebe, zu erhalten oder wiederherzustellen. Eine vollständige Beschreibung der Bemühungen auf Morphogen basierende Therapeutika zur Verwendung in Säugern, einschließlich der Menschen zu entwickeln und zu charakterisieren, werden in den anhängigen US-Patentanmeldungen 08/404,113 , 08/396,930 , 08/445,467 , 08/152,901 , 08/432,883 , 08/155,343 , 08/260,675 , 08/165,541 , 08/174,605 und 07/971,091 dargelegt.
  • Gegenwärtig begegnet man jedoch bestimmten Komplikationen, während der Produktion, Formulierung und Verwendung in vivo von therapeutischen Makromolekülen, wie beispielsweise Morphogen-Proteinen. Beispielhaft, werden derartige Proteine gewöhnlich durch eine Fermentation oder eine Kultur geeigneter Wirtszellen erzeugt. Von jeglichem biologischen Produkt, das von derartigen Wirtszellen zur Verwendung in Menschen erzeugt wird, muss gegenwärtig gezeigt werden, dass es im Wesentlichen von Bestandteilen der Wirtszelle, beispielsweise sekretierten oder abgeschiedenen Proteinen, viralen Teilchen oder Abbauprodukten davon, frei ist. Die Bereitstellung einer derartigen Sicherheit kann signifikant zu den Kosten und der technischen Schwierigkeit einer gewerblichen Herstellung von biologischen Makromolekülen beitragen. Weiterhin müssen geeignete Formulierungen entwickelt werden, so dass eine gewerblich angemessene Haltbarkeit auf das produzierte Makromolekül übertragen wird, ohne dass ein signifikanter Verlust an biologischer Aktivität auftritt. Ein zusätzlicher, komplizierender Faktor tritt auf, wenn die Umstände einen erweiterten Verlauf einer therapeutischen Behandlung mit dem produzierten und formulierten Makromolekül gewährleisten: das behandelte Säugetier kann eine immunologische Antwort auf das Makromolekül entwickeln, wobei eine beliebige derartige Antwort die Wirksamkeit davon beeinträchtigt. Unter extremen Umständen muss die Behandlung abgebrochen bzw. abgesetzt werden.
  • Dementsprechend besteht ein Bedarf zur Identifizierung von therapeutisch wirksamen Analogen der vorstehend erwähnten Morphogene, insbesondere für Analoge, die kostengünstig herzustellen, widerstandsfähig gegenüber der Lagerung sind und eine verringerte Neigung aufweisen, unerwünschte Nebenwirkungen auf eine chronische oder wiederholte Verabreichung an einen Säuger auszulösen.
  • Eine Aufgabe der hier beschriebenen Erfindung besteht darin Verfahren und Zusammensetzungen zur Identifizierung eines Morphogen-Analogs bereitzustellen, das heißt, zum Identifizieren einer Substanz, die eine biologische Wirkung eines Morphogens in lebenden Zellen oder einem Gewebe nachahmt bzw. mimt. Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht darin ein Analog bereitzustellen, das gemäß dem vorliegenden Identifikationsverfahren identifiziert wurde. Noch eine weitere Aufgabe besteht darin eine therapeutische Zusammensetzung bereitzustellen, die ein identifiziertes Analog umfasst, das für eine Verabreichung an einen dafür bedürftigen Säuger, beispielsweise einen Säuger, der an einer metabolischen Knochenerkrankung leidet, beispielsweise einer durch Osteopenie charakterisierten Erkrankung, geeignet ist.
  • Die vorliegende Erfindung stellt Säugetierzellen für eine induzierbare Expression eines Morphogens bereit, Säugerzellen für die OP-1 induzierbare Expression eines Genprodukts und DNA, die eine, wie in den beigefügten Ansprüchen festgelegt, durch Morphogen vermittelte biologische Wirkung induziert. Weiterhin werden hier Verfahren und Zusammensetzungen zum Identifizieren von Morphogen-Analogen beschrieben. Ein Morphogen-Analog ist eine Subtanz, die vorzugsweise zur Verabreichung an einen dafür bedürftigen Säuger geeignet ist, die ein durch Morphogen vermittelte biologische Wirkung induzieren kann. Das heißt, dass das Analog eine biologische Wirkung wiederholen bzw. nachbilden kann, die naturgemäß in lebenden Säugetierzellen oder Gewebe durch ein Morphogen induziert wird. Wie hier verwendet, umfasst der Begriff "Morphogen" die Klasse von Proteinen, die durch osteogenes Protein-1 des Menschen (hOP-1) verkörpert wird. hOP-1 und funktionelle Äquivalente sind dimere Proteine, die nicht festgelegte Zellen eines Säugerursprungs dazu induzieren ein Kaskade von zellulären und molekularen Ereignissen durchzumachen, die in der Bildung von funktionell, differenzierten Säugergeweben, beispielsweise Knochen, Leber, Nerven, Zahndentin, peridontalem Gewebe, den Magen-Darm-Trakt auskleidendem Gewebe und dergleichen kulminiert. Wie hier beschrieben, werden Morphogen-Analoge dadurch identifiziert, dass beurteilt wird, ob Testsubstanzen das Morphogen OP-1 nachahmen können, indem sie eine OP-1 vermittelte Expression eines Reportergens induzieren und/oder indem sie eine OP-1 vermittelte biologische Wirkung induzieren. Ebenfalls beschrieben werden Substanzen, die gemäß den hier dargelegten Verfahren als Morphogen-Analoge identifiziert wurden. Weiterhin wird die Herstellung von gewerblich signifikanten Mengen identifizierter Morphogen-Analoge, und die Herstellung und Verwendung von DNA beschrieben, die ein auf Morphogen reagierendes die Transkription aktivierendes Element umfasst. Die DNA kann verwendet werden, um die Expression eines Gens von Interesse, beispielsweise ein Reportergen, das ein nachweisbares Genprodukt kodiert, durch OP-1 oder ein funktionelles äquivalentes Morphogen oder Analog davon induzierbar zu machen. Weiterhin kann die DNA bei der Herstellung einer Zelle für die in vitro oder in vivo OP-1 oder Analog induzierbare Expression eines Genproduktes von Interesse verwendet werden.
  • Es wird ein Identifizierungsverfahren beschrieben, in dem eine Testzelle mindestens einer Testsubstanz ausgesetzt wird, von der angenommen wird, dass sie eine Aktivität als ein Morphogen-Analog aufweist. Die Testzelle umfasst DNA, die ein auf OP-1 reagierendes die Transkription aktivierendes Element festlegt und in betriebsbereiter Assoziation damit ein Reportergen, das ein nachweisbares Genprodukt kodiert. Folglich, ist die DNA in einer auf OP-1 reagierenden Zelle (beispielsweise eine Zelle, die einen OP-1-Rezeptor zeigt) vorhanden, dann kann die DNA dazu dienen, um die Transkription des Reportergens zu induzieren, wenn die auf OP-1 reagierende Zelle OP-1 ausgesetzt wird. Das Verfahren umfasst weiterhin den Schritt eines Erfassens der Expression des detektierbaren Genprodukts anschließend auf eine Aussetzung der Testzelle mit der Testsubstanz. Eine Expression des detektierbaren Genprodukts deutet an, dass die Testsubtanz befähigt ist eine durch OP-1 vermittelte biologische Wirkung zu induzieren. Eine hier durch OP-1 vermittelte biologische Wirkung von besonderem Interesse, umfasst die transkriptionelle Aktivierung von auf OP-1 reagierende Gene, das heißt, Genen mit denen das vorliegende aktivierende Element naturgemäß betriebsbereit verbunden vorliegt.
  • In bestimmten Beispielen umfasst das Verfahren weiterhin die Schritte von Kontaktieren einer auf OP-1 reagierenden Zelle mit einem vermeintlichen Morphogen-Analog, das, wie vorstehend beschrieben, identifiziert wurde und Detektieren, ob das Analog eine biologische Wirkung induzieren kann, die bekannt ist naturgemäß durch OP-1 in der auf OP-1 reagierenden Zelle vermittelt zu werden. Falls erwünscht kann dieser Bestätigungsschritt gleichzeitig mit den anfänglichen Identifizierungsschritten ausgeführt werden. In bestimmten spezifischen Beispielen ist die Testzelle eine auf OP-1 reagierende Zelle.
  • In anderen Beispielen umfasst das Verfahren weiterhin die Schritte eines Verabreichens des mutmaßlichen Morphogen-Analogs, das wie vorstehend beschrieben, identifiziert wurde, an einen morphogenetisch permissiven, gewebespezifischen Lokus in einem Säuger und Detektieren, ob das Analog an dem Lokus eine gewebespezifische Morphogenese induzieren kann. Der Bestätigungsschritt zeigt vorteilhafter Weise, ob das Analog eine gewebespezifische Morphogenese in vivo induzieren wird.
  • In einem verwandten Beispiel wird eine im Wesentlichen reine Substanz beschrieben, die befähigt ist an mindestens einen Teil des vorstehend erwähnten auf OP-1 reagierenden die Transkription aktivierende Element zu binden, so dass die Substanz, falls gebunden, die Expression eines Gens moduliert, das mit dem vorstehend erwähnten die Transkription aktivierenden Element betriebsbereit verbundenen ist. Diese Substanz wird hier als ein "Expression-Aktivator" bezeichnet. Es wird ein Verfahren beschrieben, bei dem beurteilt wird, ob eine Probe, wie beispielsweise ein Zell freies Lysat oder ein Extrakt biologischen Ursprungs einen Expression-Aktivator umfasst. Bei diesem Verfahren wird die Probe mit der vorstehend beschriebenen DNA in Kontakt gebracht, wobei die Bindung des Expressions-Aktivators an die DNA anschließend entsprechend bekannter Verfahren detektiert wird. Dieses Identifikationsverfahren kann routinemäßig zur Verwendung als ein Verfahren zur Affinitätsreinigung angepasst werden, um gereinigte Präparationen des Expressions-Aktivators zu erhalten. Es wird angenommen, dass der Expressions-Aktivator ein neues intrazelluläres Protein ist, beispielsweise ein Mitglied der fos-Familie von DNA bindenden Proteinen.
  • Als Folge des Identifizierungsverfahrens für Analoge wird die Produktion von gewerblich signifikanten Mengen mit einer Therapeutikumqualität eines identifizierten Morphogen-Analogs und die Produktion eines Derivates des Morphogen-Analogs beschrieben, in dem jegliche unerwünschten Eigenschaften des anfänglich identifizierten Analogs, gemildert bzw. abgeschwächt sind. Folglich kann ein Morphogen-Analog oder ein funktionelles äquivalentes Derivat davon in einer therapeutischen Zusammensetzung formuliert sein, die zur Verabreichung an einen dafür bedürftigen Säuger geeignet ist. Vorzugsweise ist die therapeutische Zusammensetzung zur Verabreichung an Primaten, wie beispielsweise einem Menschen geeignet. Säugetiere, die das Morphogen-Analog brauchen, das gemäß den hier dargelegten Lehren identifiziert wurde, können von einer beliebigen Erkrankung oder einem Zustand befallen sein, für die ein Herauslocken einer morphogenen biologischen Wirkung eine Verbesserung in der Gesundheit oder dem klinischen Zustand, einschließlich der Stabilisierung eines verschlechternden Zustands des Säugers, bereitstellt. Beispielsweise kann der Säuger an einer metabolischen Knochenerkrankung leiden, beispielsweise einer durch Osteopenie charakterisierten Erkrankung. Es wird vorhergesagt, dass OP-1 und verwandte Morphogene die metabolische Balance von osteopenem bzw. knochenverringertem Knochengewebe vorteilhaft ändern wird, so dass die metabolischen Eigenschaften von gesundem Knochengewebe darin wiederhergestellt sind. Alternativ kann der Säuger an Ischämie, an einer geschwürartigen oder entzündlichen Gewebeschädigung leiden, oder an einer Verletzung oder Schädigung eines auf Morphogen reagierenden Gewebes, wie beispielsweise Knochen, Leber, Nerven, Magen-Darm-Trakt-Auskleidung, Zahndentin, peridontalem Gewebe und dergleichen. Weiterhin kann die therapeutische Zusammensetzung für die Behandlung oder Erhaltung von Gewebe oder Zellen eines Säugers ex vivo geeignet sein, beispielsweise für Zwecke einer Organ- oder Gewebetransplantation.
  • Eine Ausführungsform der vorliegenden Erfindung stellt eine Zelle für die induzierbare Expression eines Morphogens bereit. Die Zelle umfasst eine erste DNA, die das Morphogen kodiert und eine zweite DNA, die damit betriebsbereit transkriptionell verbunden ist. Die Zelle kann weiterhin zelluläre Mittel umfassen, um eine intrazelluläre Substanz herzustellen, die an die zweite DNA bindet, um so die Expression des durch die erste kodierte zu stimulieren, wenn die Zelle mit einem extrazellulären induzierenden Mittel in Kontakt gebracht wird. Somit kann die Zelle beispielsweise Mittel umfassen, um einen intrazellulären Expressions-Aktivator zu erzeugen. Allerdings kann gemäß den hier dargelegten Prinzipien die Zelle der vorliegenden Erfindung eine erste DNA umfassen, die ein beliebiges Genprodukt kodiert, wobei dessen Expression durch ein Morphogen, insbesondere OP-1 vorteilhaft induziert wird oder durch ein Morphogen-Analog. In bestimmten Beispielen umfasst die erste DNA ein Reportergen, das ein detektierbares Genprodukt kodiert. Zellen, die eine derartige erste DNA umfassen sind zur Verwendung in dem vorstehend beschriebenen Verfahren zur Identifizierung von Morphogen-Analogen geeignet.
  • In einer anderen Ausführungsform umfasst die erste DNA ein Gen, das ein Genprodukt kodiert, das eine biologisch Aktivität, beispielsweise ein Enzym, einen Wachstumsfaktor, ein Lymphokin, ein Cytokin, ein Blut- oder Serumprotein, einen Gerinnungsfaktor oder dergleichen aufweist. Die erste DNA kann folglich ein Polypeptid kodieren, das naturgemäß durch das Nieren-, das Knochen-, das Leber-, das Pankreas-, das Nebennieren- oder andere Körpergewebe von Säugetieren erzeugt wird. Zellen, die eine derartige erste DNA umfassen, sind für die induzierbare Herstellung des biologisch aktiven kodierten Genprodukts entweder in vivo oder in vitro geeignet.
  • Weiter werden Verfahren zum Induzieren einer Expression, einschließlich einer autokrinen Expression eines Genprodukts, wie beispielsweise eines durch die erste DNA kodierten Morphogens, beschrieben. Die Verfahren bedingen, Bereitstellen einer der vorstehend beschriebenen Zellen und Inkontaktbringen der Zelle mit einem extrazellulären induzierenden Mittel, wie beispielsweise OP-1 oder einem Analog davon unter Bedingungen, die geeignet sind die Expression des in der ersten DNA vorliegenden Gens zu induzieren. Die induzierte Expression bezieht sich hier auf eine autokrine Expression, falls das extrazelluläre Mittel die gleiche Substanz ist wie die durch die erste DNA kodierte, so dass eine anfängliche Dosis des extrazellulären induzierenden Mittels eine anhaltende Expression der ersten DNA in einer Weise auslöst, die ähnlich zu der natürlich vorkommenden autokrinen Expression oder einer positiven Rückkopplung einer Expression in biologischen Systemen ist. Bestimmte Beispiele bedingen den zusätzlichen Schritt, Bereitstellen einem Säuger die vorstehend beschriebene Zelle für die in vivo Herstellung des durch die erste DNA kodierte Produkt. Vorteilhafter Weise kann der vorstehend beschriebene Schritt eines Inkontaktbringens durch Verabreichen des extrazellulären induzierenden Mittels an den Säuger, in dem die Zellen implantiert wurden, ausgeführt werden. Verfahren zum Verabreichen eines Morphogens oder eines anderen Genprodukts mit einer biologischen Aktivität an einen dafür bedürftigen Säuger werden folglich beschrieben. Die Verfahren bieten da bestimmte Vorteile, wo der Säuger einen langzeitigen Bedarf an dem Morphogen oder dem anderen Genprodukt aufweist, beispielsweise worin der Säuger eine metabolische Knochenerkrankung, wie beispielsweise Osteopenie aufweist. Alternativ bieten die Verfahren da Vorteile, wo der Säuger an einem klinischen akuten Verlust einer natürlichen Gewebefunktion leidet, so dass eine vermehrte Gewebefunktion für eine ausreichende Zeitdauer bereitgestellt werden muss bzw. sollte, dass sich eine Heilung oder Renegeneration des geschädigten natürlichen Gewebes ereignen kann.
  • Die vorliegenden Zellen können beispielsweise ein Produkt bereitstellen, das gewöhnlich durch Nieren- oder Lebergewebe einem Säuger bereitgestellt wird, der an einer Nieren- oder Leberfehlfunktion leidet, wobei wahlweise für jene eine Regenerationsmenge eines Morphogens, wie beispielsweise OP-1, gleichzeitig an den Säuger verabreicht wird.
  • Es ist folglich offenbar, dass die vorliegende Erfindung DNA aufweist, die ein OP-1 responsives bzw. auf OP-1 reagierendes die Transkription aktivierendes Element oder einen Teil davon festlegt, der für die Bindung eines intrazellulären Expressions-Aktivators ausreichend ist. Die vorliegende DNA liegt in betriebsbereiter Verbindung vor, deren Klonierungsstelle zum Einfügen eines Gens geeignet ist, wie beispielsweise eines Reporters, der ein detektierbares Genprodukt oder ein therapeutisches Gen kodiert, das ein Produkt mit einer biologischen Aktivität kodiert. Wird das Reportergen an der Klonierungsstelle eingefügt, dann ist das Reportergen mit dem Morphogen responsiven die Transkription aktivierenden Element betriebsbereit verbunden, so dass das detektierbare Genprodukt hergestellt wird, wenn es in einer Zelle der vorliegenden Erfindung vorliegt und die Zelle mit einem extrazellulären induzierenden Mittel, wie beispielsweise einem Morphogen, in Kontakt gebracht wird. Das heißt, dass die hier beschriebene DNA dazu dient die Transkription des eingefügten Gens zu induzieren. Bestimmte gegenwärtige bevorzugte Ausführungsformen der vorliegenden DNA umfassen ein auf OP-1 reagierendes die Transkription aktivierendes Element, das natürlicher Weise zumindest in der Promotorregion des Typ-X Kollagengens des Säuger vorkommt. Folglich umfasst in einer besonders bevorzugten Ausführungsform, die Sequenz der vorliegenden DNA die Nukleotide 697-728 von der wie hier offenbarten SEQ ID NO. 1. Die DNA der vorliegenden Erfindung kann vorteilhafter Weise in einem Behälter beinhaltet sein, um einen Kit zum Erleichtern der Praxis eines beliebigen der vorstehend beschriebenen Verfahren bereitzustellen. Wahlweise können die Kits weiterhin ein, gemäß der vorliegenden Erfindung, identifiziertes Morphogen und/oder ein Morphogen-Analog beinhalten.
  • Das Vorstehende und andere Gegenstände, Merkmale und Vorteile der vorliegenden Erfindung, als auch die Erfindung selbst werden aus der folgenden Beschreibung den Beispielen besser verstanden werden, wenn sie zusammen mit den begleitenden Zeichnungen gelesen wird, in denen:
  • 1 ist eine schematische Darstellung einer DNA der vorliegenden Erfindung, wobei deren Nützlichkeit dadurch angezeigt wird, dass eine OP-1 vermittelte biologische Wirkung vorhanden ist, wie beispielsweise Bindung einer intrazellulären Substanz an die DNA, so dass eine Transkription eines Reportergens, das damit betriebsbereit verbunden ist, induziert wird.
  • 2 ist ein Balkendiagramm, das die Wirkung von OP-1 und TGFβ auf die Proliferation von C5.18 fötalen Calvaria-Zellen unter Verwendung eines 3H-Thymidin-Einbaus als eine Erfassung der Mitogenese darstellt.
  • 3 ist ein Ergebnis einer Autoradiographie einer Blot-Analyse von RNA, die die Wirkungen von OP-1 auf die Typ-X Kollagen mRNA in C5.18 fötalen Calvaria-Zellen über eine Zeitdauer von 72 Stunden zeigt.
  • 4 ist ein Ergebnis einer Autoradiographie einer Blot-Analyse von RNA, die die Wirkungen von OP-1 auf die Phänotyp-Marker von Osteoblasten, wie beispielsweise Typ I Kollagen, alkalische Phosphatase und Osteocalcin über eine Zeitdauer von 72 Stunden zeigt.
  • 5 ist ein Ergebnis einer Autoradiographie einer Blot-Analyse von RNA, die die Wirkungen von OP-1 und TGFβ auf die Phänotyp-Marker von Osteoblasten, wie beispielsweise alkalische Phosphatase und Osteocalcin zeigt.
  • 6 ist ein Ergebnis einer Autoradiographie einer Blot-Analyse von RNA, die die Wirkungen von OP-1 und TGFβ auf die Phänotyp-Marker von Chondrozyten, wie beispielsweise Typen II und X Kollagen, zeigt.
  • 7 ist eine Vektorkarte, die einen beispielhaften Vektor zeigt, der ein Luciferase Reportergen ohne Promotor und die Klonierungsstellen der Restriktionsenzyme KpnI und MluI aufweist.
  • 8 ist ein Balkendiagramm, das die OP-1 induzierte Lumineszenz verschiedener Deletionskonstrukte des Typ X Kollagenpromotors zeigt, der mit dem Reportergen Luciferase betriebsbereit verbunden ist und in C5.18 Calvaria-Zellen transfiziert und die nachfolgend mit OP-1 in Kontakt gebracht wurden.
  • 9 ist ein Balkendiagramm, dass die OP-1 induzierte Lumineszenz von ausgewählten Deletionskonstrukten zeigt, die die Reaktionsfähigkeit bzw. Ansprechbarkeit von OP-1 auf ein minimales Segment des homologen Typ-X Kollagenpromotors übertragen.
  • 10 ist ein Balkendiagramm, das die OP-1 induzierte Lumineszenz von ausgewählten Deletionskonstrukten zeigt, die die Reaktionsfähigkeit von OP-1 auf ein minimales Segment des nicht homologen (heterologen) RSV-Promotors übertragen.
  • 11 ist ein Balkendiagramm, das die Wirkungen von OP-1 und TGFβ auf die Induktion eines Reportergens zeigt, das mit einem Teil des Typ-X Kollagenpromotors betriebsbereit verbunden vorliegt.
  • 12 ist ein Balkendiagramm, das die unterdrückenden Wirkungen einer Mutation des auf OP-1 reagierenden die Transkription aktivierenden Elements auf die OP-1 Ansprechbarkeit eines Luciferase Reportergens zeigt.
  • Die hier beschriebene Erfindung beruht auf der Feststellung, dass Morphogene, insbesondere OP-1, die Expression bestimmter Gene beeinflussen kann, die naturgemäß in dem Genom von Säugerzellen vorkommen. Das heißt, dass eine Stimulation von Säugerzellen mit OP-1 ein Spektrum von biologischen Wirkungen induziert, einschließlich, jedoch nicht beschränkt auf die transkriptionelle Aktivierung von ausgewählten zellulären Genen. Die Promotorregion von mindestens einem derartigen Gen wurde analysiert, wobei, wie hier offenbart wurde, festgestellt wurde, dass es ein auf OP-1 reagierendes die Transkription aktivierendes Element umfasst. Die vorliegende Erfindung nutzt die auf OP-1 reagierenden Eigenschaften dieses die Transkription aktivierenden Elements, um mehrere der hier dargelegten Gesichtspunkte und Ausführungsformen zu fördern. Die vorliegende Beschreibung wird noch mehr geschätzt werden, wenn sie Angesichts der schematischen Darstellung von 1 betrachtet wird, die den erwarteten Modus einer Wirkung des Transkriptions-Aktivators graphisch zusammenfasst. 1 zeigt, dass das vorliegende auf OP-1 reagierende die Transkription aktivierende Element in einer auf OP-1 reagierenden Zelle beinhaltet ist. Folgend auf den Kontakt der Zelle mit OP-1 induziert das Aktivierungs-Element spezifisch die Transkription zumindest von einem Gen(en), das/die stromabwärts angeordnet und mit dem Element betriebsbereit verbunden ist/sind. Diese spezifische transkriptionelle Aktivierung bezieht die Bindung einer intrazellulären Substanz (ein "Expressions-Aktivator") an das auf OP-1 reagierende die Transkription aktivierende Element ein. Diese intrazelluläre Substanz bindet an das bevorzugte auf OP-1 reagierende die Transkription aktivierende Element, das naturgemäß in der Promotorregion des Typ-X Kollagen-Gens des Säugetiers an einer 5'-Region des Elements angeordnet ist, das AT reich und an einer 3'-Region davon einer AP1 Bindungsstellensequenz ähnlich ist. Es wird hier gezeigt, dass eine Deletion oder Mutation des auf OP-1 reagierenden die Transkription aktivierenden Elements zu einem Verlust der auf OP-1 reagierenden transkriptionellen Aktivierung des/der stromabwärts gelegenen Gens(en) führt, das/die mit dem Element betriebsbereit verbunden ist/sind.
  • Die Verfahren und Zusammensetzungen nutzen demgemäß die OP-1 responsiven Eigenschaften des neu festgestellten die Transkription aktivierenden Elements. Allgemein stellen die Verfahren und die Zusammensetzungen dem Fachmann analytische Werkzeuge und technisches Fachwissen bereit, das geeignet ist Substanzen (Morphogen-Analoge) zu identifizieren, die eine biologische Wirkung nachahmen können, die durch ein Morphogen, wie OP-1, induziert wurde. Die hier dementsprechend bereitgestellte Anleitung wird eine Evaluierung von mehreren unterschiedlichen Substanzen für Eigenschaften von Morphogen-Analogen fördern, wodurch das Spektrum möglicher therapeutischer Kandidaten- bzw. Testsubstanzen zur Besserung und/oder Behandlung von Erkrankungen, Verletzungen und schädigenden Störungen, wie beispielsweise metabolischen Knochenerkrankungen erweitert wird, für welche von den Morphogenen erwartet wird einen klinischen Vorteil bereitzustellen.
  • Morphogene, wie hier festgelegt, induzieren oder reinduzieren Säugerzellen, insbesondere nicht festgelegte Vorläuferzellen, eine vollständig integrierte Entwicklungskaskade biologischer und molekularer Ereignisse durchzumachen, die in der Morphogenese von vollständig differenziertem, funktionellem Gewebe eines Typs kulminiert, der dem Zusammenhang oder den lokalen biologische Umgebung angemessen ist, in dem eine Morphogenese induziert wurde, einschließlich einer Vaskularisierung, Bindegewebebildung, Innervation und dergleichen, die für Gewebe charakteristisch sind, die in einem derartigen Zusammenhang naturgemäß vorkommen. Falls Zellen beispielsweise durch OP-1 in dem Zusammenhang von Nerv, Knochen oder Leber stimuliert werden, kulminiert die sich ergebende Kaskade der Morphogenese in der Bildung von neuem oder regeneriertem differenzierten Gewebe entsprechend der ausgewählten lokalen Umgebung. Die Morphogenese unterscheidet sich daher signifikant von einem einfachen reparativen Heilungsprozesses, bei dem Narbengewebe (beispielsweise fibröses Bindegewebe) gebildet wird und eine Läsion oder einen anderen Defekt in differenziertem, funktionellem Gewebe füllt.
  • Weiterhin, wie hier vorgesehen, ereignet sich Morphogenese in einer "permissiven Umgebung", was eine lokale Umgebung bedeutet, die die Morphogenese (beispielsweise eine Regeneration oder regenerative Heilung) nicht drosselt oder unterdrückt. Permissive Umgebungen existieren, beispielsweise, in embryonalem Gewebe oder in verwundetem oder erkranktem Gewebe, einschließlich eines Gewebes, das einem chirurgischen Eingriff unterworfen wird. Häufig umfasst eine permissive Umgebung eine geeignete Matrix oder ein Substrat, an dem Zellen, die eine Differenzierung durchmachen, verankert sein können. Beispielhafte Matrizes umfassen gewebespezifische Strukturbestandteile, beispielsweise Kollagen oder Glycosaminoglycane des gleichen Typs, wie sie naturgemäß in dem erwünschten Gewebe vorkommen. Andere Bestandteile einer permissiven Umgebung umfassen gewöhnlich Signale, beispielsweise Zelloberflächenmarker oder extrazellulär sekretierte Substanzen, die die Gewebespezifität einer Differenzierung leiten.
  • Morphogene sind strukturell und funktionell verwandt zu OP-1 und schließen folglich die Familie der dimeren Proteine ein, die naturgemäß durch eukaryotische Zellen erzeugt werden und eine gewebespezifische morphogene Aktivität aufweisen, beispielsweise eine Aktivität, die eine endochondrale Knochenmorphogenese induziert, wenn sie in einen Säuger im plantiert werden. Morphogene umfassen demgemäß eine Subklasse der "Super-Familie" der "TGFβ-ähnlichen" Proteine. Ein Morphogen, das von natürlichen Quellen in reifer, biologisch aktiver Form isoliert wurde, ist ein glycosyliertes Dimer, das gewöhnlich, wie durch ein SDS-PAGE bestimmt, ein offensichtliches Molekulargewicht von ungefähr 30-36 kDa aufweist. Wird es reduziert, dann ergibt das 30 kDa Protein zwei glycosylierte Peptiduntereinheiten, die offensichtliche Molekulargewichte von ungefähr 16 kDa und 18 kDa aufweisen. Die reduzierten Polypeptide selbst weisen keine nachweisbare morphogenetische Aktivität auf. Eine Glycosylierung ist jedoch für eine biologische Aktivität nicht erforderlich. Das nicht glycosylierte Protein weist ein offensichtliches Molekulargewicht von ungefähr 27 kDa auf. Wird es reduziert, dann ergibt das 27 kDa Protein zwei nicht glycosylierte Polypeptide, die Molekulargewichte von ungefähr 14 kDa und 16 kDa aufweisen. Die Polypeptide, die zusammen das biologische aktive Dimer bilden, umfassen mindestens sechs, vorzugsweise mindestens sieben, die Lage betreffende konservierte Cysteinreste, wie in der U.S.S.N. 08/396,930 dargelegt.
  • Wie vorstehend angeführt, umfasst ein repräsentatives Morphogen ein OP-1 oder ein OP-1 verwandtes Polypeptid. Sequenzen nützlicher Polypeptide sind in US-P-5,011,691 , 5,018,753 und 5,266,683 , in Ozkaynak et al. (1990) EMBO J 9: 2085-2093, und Sampath et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6004-6008 aufgeführt. Zusätzliche nützliche Sequenzen treten in den C-terminalen Domänen von DPP (von Drosophila), Vgl (von Xenopus), 60A (von Drosophila, siehe Wharton et al. (1991), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 9214-9218), Vgr-1 (von der Maus), den OP-1 und OP2 Proteinen, (siehe US-Pat.-5,011,691 durch Oppermann et al.), als auch als die Proteine, die als BMP2, BMP3, BMP4 (siehe WO 88/00205 , US-P-5,013,649 und WO 91/18098 ), BMP5 und BMP6 (siehe WO 90/11366 , PCT/US90/016 ) und BMP8 und 9 bezeichnet werden. Jedes der vorstehenden Polypeptide, wenn es oxidiert und dimerisiert wird, ist hier als ein Morphogen nützlich. Weiterhin umfasst diese Familie morphogener Proteine lange Formen eines gegebenen Proteins als auch phylogenetische, beispielsweise Spezies und allelische Varianten und biosynthetische Mutanten davon, einschließlich Additions- und Deletionsmutanten und Varianten, wie beispielsweise jene, die das konservierte C-terminale Cysteinskelett ändern können, vorausgesetzt, dass die Änderung weiterhin dem Protein gestattet eine dimere Spezies zu bilden, die eine Konformation aufweist, die eine Morphogenese induzieren kann, beispielsweise eine endochondrale Knochenbildung, wenn sie in einen Säuger in Verbindung mit einer Matrix implantiert wurde, die permissiv für eine Knochenmorphogenese ist. Außerdem können Morphogene in dieser Erfindung Formen umfassen, die verschiedene Glycosylierungsmuster und variierende N-Termini aufweisen, die natürlich vorkommen oder biosynthetisch abgeleitet sein können und die durch Expression von rekombinanter DNA in prokaryotischen oder eukaryotischen Wirtszellen, gemäß eingeführter Techniken erzeugt werden können. Die Proteine sind entweder als Homodimere oder Heterodimere aktiv.
  • Alle die folgenden biologischen Funktionen werden in einer morphgenetisch permissiven Umgebung, allgemein von Morphogenen induziert: Stimulieren einer Proliferation von Vorläuferzellen, Stimulieren der Differenzierung von Vorläuferzellen, Stimulieren der Proliferation von differenzierten Zellen und Unterstützen des Wachstums und der Erhaltung von differenzierten Zellen. Der Ausdruck "Vorläuferzellen" umfasst nicht festgelegte Zellen, die vorzugsweise einen Säugerursprung aufweisen, die kompetent bzw. befähigt sind in einen oder mehrere spezifische Typen differenzierter Zellen zu differenzieren, abhängig von deren genomischen Repertoire und der Gewebespezifität der permissiven Umgebung, in der eine Morphogenese induziert wird. Vorzugsweise kulminiert eine Morphogenese in der Bildung von differenziertem Gewebe, das strukturelle und funktionelle Eigenschaften eines Gewebes aufweist, das naturgemäß in dem Körper eines Säugers auftritt.
  • Morphogene können weiterhin den Beginn einer Seneszenz oder Quieszenz bzw. Stilllegung – ein assoziierter Verlust eines Phänotyps und/oder einer Gewebefunktion- verzögern oder abschwächen. Morphogene können weiterhin eine phänotypische Expression differenzierter Zellen, einschließlich einer Expression metabolischer und/oder funktioneller, beispielsweise sekretorischer, Eigenschaften davon, stimulieren. Außerdem können Morphogene unter geeigneten Umgebungsbedingungen eine Redifferenzierung von transformierten Zellen induzieren. Wie vorstehend angeführt, sind hier Morphogene von besonderem Interesse, die eine Proliferation und Differenzierung von zumindest Knochenvorläuferzellen eines Säugers und/oder eine Unterstützung der Bildung, des Wachstums, der Erhaltung und der funktionellen Eigenschaften von endochondralem Knochengewebe eines Säuger induzieren.
  • Dementsprechend ist ein Morphogen-Analog eine Substanz, die eine biologische Wirkung nachahmt bzw. mimt, die durch ein Morphogen, wie beispielsweise OP-1, induziert und/oder vermittelt wurde. Eine beliebige Substanz, die derartige Eigenschaften ungeachtet der chemischen oder biochemischen Beschaffenheit davon nachahmt, kann hier als ein Morphogen-Analog verwendet werden. Das Morphogen-Analog kann eine einfache oder komplexe Substanz sein, die durch ein lebendes System oder durch chemische oder biochemische Synthesetechniken erzeugt wird. Es kann eine Substanz sein, die in der Natur vorkommt oder eine neue Substanz sein, die, beispielsweise, gemäß den Prinzipien eines rationalen Arzneimitteldesigns erzeugt wird. Es kann eine Substanz sein, die einer einem Lösungsmittel ausgesetzten Oberfläche eines Morphogenepitops strukturell ähnlich ist, das bei einer Rezeptorwechselwirkung beteiligt ist, eine Substanz, die andererseits einen Morphogenrezeptor stimuliert, der auf der Oberfläche einer auf Morphogen reagierenden Zelle gezeigt wird, oder eine eine Zellmembran durchdringende Substanz, die mit einer intrazellulären Komponente der Signalweiterleitungsmaschinerie einer auf Morphogen reagierenden Zelle wechselwirkt.
  • Folglich kann, beispielsweise, ein Typ eines Morphogens durch eine kluge Anwendung der Prinzipien der Biosynthesetechnologie einer Antikörperbindungsstelle (BARS), wie in US-P-5,132,405 , 5,091,513 und 5,258,498 dargelegt, erzeugt werden. BARS Analog-Konstrukte können von Antikörpern erzeugt, vorzugsweise durch Hybridomzellen erzeugt werden, die spezifisch an einen Zelloberflächenrezeptor für Morphogen binden. Alternativ kann eine BABS-Analyse von anti-idiotypischen Antikörpern erzeugt werden, die mit der Antigenbindungsstelle eines Antikörpers spezifisch reagieren, was die biologische Aktivität des Morphogens blockiert. Vukicevic et al. (1994) Biochem. Biophys. Res. Comm. 198: 693-700 lehren die Präparation von OP-1 spezifischen monoklonalen Antikörpern. Dem Fachmann wird klar sein, dass derartige Antikörper bei der Routineherstellung von anti-idiotypischen Antikörpern, von denen die BABS-Analoge präpariert werden, als Immunogene verwendet werden können.
  • Eine strukturell unterschiedliche Klasse von Morphogen-Analogen kann durch eine kluge Anwendung der Prinzipien einer gerichteten molekularen Evolution, wie in Tuerk et al. (1990) Science 249: 505-510, Famulok et al. (1992) Angew. Chem. Anti. Ed. Engl. 31: 979-988 und Bock et al. (1992) Nature 355: 564-556 dargelegt, präpariert werden. Der gerichtete molekulare Evolutionsprozess schließt eine Isolation eines Nukleinsäuremoleküls, gewöhnlich einer RNA, ein, das/die mit hoher Affinität an einen gewählten Liganden, wie beispielsweise ein Protein, bindet. Ein derartiges Nukleinsäuremolekül wird im Stand der Technik als ein "Aptamer" bezeichnet. Das erwünschte Aptamer liegt anfänglich in einem zufälligen Pool bzw. Fundus von Nukleinsäuremolekülen vor, und wird durch Ausführen mehrerer Runden einer auf Ligandenaffinität basierenden Chromatographie, alternierend mit einer auf PCR basierenden Amplifikation von Liganden bindenden Nukleinsäuren, isoliert. Bock et al., (1992), vorstehend, zeigten die Präparationen von Aptameren, die für eine in vivo Verwendung in Säugern geeignet sind, welche den die Blutgerinnung fördernden Faktor, Thrombin, spezifisch hemmen.
  • Noch eine andere strukturell unterschiedliche Klasse von Morphogen-Analogen kann durch Auswählen geeigneter Mitglieder einer Zufalls-Peptidbibliothek (Scott et al., Science 249, (1990), 386-390) oder einer kombinatorisch synthetisierten Zufallbibliothek von organischen oder anorganischen Verbindungen (Needels et al., Proc Natl Acad. Sci. USA 90 (1993), 10700-10704; Ohlmeyer et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA 90 (1993), 10922-10926) erzeugt werden. Dem Fachmann wird klar sein, dass die Vorstehende und andere verwandte Technologien, zusammen mit lange eingeführten Prinzipien eines Durchmusterns von biologisch erzeugten Substanzen ein großes Angebot von Testsubstanzen zum Durchmustern auf eine Aktivität für ein Morphogen-Analog anbieten.
  • Folglich kann ein natürlich gewonnenes OP-1 oder Morphogen-Analog ein Polypeptid umfassen, ein Polynukleotid, ein Kohlenhydrat, ein Lipid, eine Aminosäure, eine Nukleinsäure, einen Zucker, eine Fettsäure, ein Steroid oder ein Derivat eines beliebigen eines der vorstehenden Verbindungen. Es kann ein Zwischenprodukt oder ein Endprodukt eines Metabolismus einer eukaryotischen oder prokaryotischen Zelle sein. Alternativ kann das Analog ein biologische Response-Modifier bzw. Reizantwortmodifizierer oder ein Toxin sein.
  • Folglich ist ein gemäß dem Verfahren identifiziertes Morphogen-Analog eine Substanz, die ein Morphogen nachahmt, indem es mindestens eine "durch Morphogen vermittelte biologische Wirkung" in einer auf Morphogen reagierenden bzw. responsiven Zelle oder Gewebe induziert. Die Wirkung kann eine beliebige biologische Wirkung sein, die auf eine Exposition gegenüber oder den Kontakt mit einem Morphogen, einschließlich, jedoch nicht beschränkt auf die Induktion einer gewebespezifischen Morphogenese, zurückzuführen ist. Die durch Morphogen vermittelten biologischen Wirkungen umfassen zelluläre und molekulare Antworten auf eine Aussetzung gegenüber Morphogen, wie beispielsweise in 08/115,914 , 08/155,343 , 08/260,675 , 08/165,541 and 08/174,605 beschrieben. Folglich wird klar sein, dass eine "durch OP-1 vermittelte biologische Wirkung" eine beliebige biologische Wirkung ist, die auf eine Exposition gegenüber oder den Kontakt von auf Morphogen reagierende Zellen oder Gewebe mit OP-1, ob in vitro oder in vivo, zurückzufüren sind. Eine durch OP-1 vermittelte biologische Wirkung von besonderem Interesse umfasst hier eine Stimulation der Expression von einem oder mehreren spezifischem/spezifischen Gen(en), einschließlich einer Stimulation der Bindung einer intrazellulären Substanz an DNA-Expression regulierende Elemente. Andere durch OP-1 vermittelten biologischen Wirkungen umfassen die Stimulation einer zellulären Proliferation, eine zelluläre Differenzierung, eine Erhaltung eines differenzierten Phänotyps und unter geeigneten Bedingungen eine Induktion einer Redifferenzierung. Weiter bevorzugte durch OP-1 vermittelte biologische Wirkungen sind molekulare oder biochemische Wirkungen, die mit einer gewebespezifischen Morphogenese assoziiert sind, beispielsweise einer endochondralen Knochenbildung oder einer Nervenregeneration.
  • Spezifische durch OP-1 vermittelte biologische Wirkungen, die mit einer endochondralen Knochenbildung assoziiert sind, umfassen eine Induktion einer Mitogenese und phänotypischer Marker für eine Chondrozyten- und Osteoblaten-Differenzierung in fötalen Calvaria-Zellen der Ratte. Nützlich induzierte phänotypische Marker umfassen Typen I, II und X Kollagen, alkalische Phosphatase und Osteocalcin. Folglich kann eine unter Verwendung von Verfahren und Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung als ein OP-1 Analog identifizierte Testverbindung OP-1 dadurch nachahmen, dass zumindest eine der vorstehenden biologischen Wirkungen induziert wird.
  • Dementsprechend wird hier ein Verfahren zum Identifizieren eines Morphogen-Analogs beschrieben, das eine durch OP-1 vermittelte biologische Wirkung induziert. Dieses Verfahren bezieht den Schritt eines Bereitstellens einer Testzelle ein, die DNA umfasst, die ein auf OP-1 reagierendes die Transkription aktivierendes Element festlegt und ein damit betriebsbereit assoziiertes Reportergen, das ein detektierbares Genprodukt kodiert. Das auf OP-1 (oder Morphogen) reagierende die Transkription aktivierende Element ist ein cis-acting DNA-Element, dessen Sequenz hier offenbart ist, die die Expression eines stromabwärts gelegenen Gens in einer auf OP-1 (oder Morphogen) reagierenden Zelle moduliert. Das auf OP-1 reagierende die Transkription aktivierende Element kann zwischen ungefähr 100-600 Basenpaare, vorzugsweise ungefähr 250-400 Basenpaare stromaufwärts von der Initiationsstelle der Transkription des Gens angeordnet sein. Ungeachtet von dessen genauen relativen Lokalisation liegt das auf OP-1 reagierende Element mit dem stromabwärts gelegenen Gen betriebsbereit verbunden vor, falls dessen Aktivierung die Transkription davon stimulierte. Das heißt, wenn OP-1 an die Zelloberfläche einer auf OP-1 reagierende Zelle bindet und dadurch eine intrazelluläre Kaskade von biologischen Antworten induziert, wobei eine derartige Antwort die Induktion einer Expression von diesem stromabwärts gelegenen Gen umfasst. Hier dargestellter Nachweis zeigt an, dass diese Wirkung über die Bindung einer intrazellulären Substanz (bezeichnet als ein Expressions-Aktivator) an das auf OP-1 reagierende die Transkription aktivierende Element erreicht wird.
  • Die Testzelle ist eine beliebige Zelle, die DNA umfasst, die ein auf OP-1 reagierendes die Transkription aktivierendes Element festlegt, das mit einem Reportergen betriebsbereit assoziiert ist, das ein detektierbares Genprodukt kodiert. Eine derartige DNA kann in einer Testzelle natürlich vorkommen oder kann eine transfizierte DNA sein. Folglich kann die Testzelle wahlweise eine auf OP-1 reagierende Zelle sein. Eine "auf OP-1 reagierende Zelle" ist eine beliebige Zelle, die einen Rezeptor auf deren Oberfläche zeigt, an den OP-1 bindet, um eine durch OP-1 vermittelte intrazelluläre biologische Wirkung zu induzieren. Eine auf Morphogen reagierende Zelle wird hier ähnlich definiert. Die induzierte intrazelluläre biologische Wirkung ist für die morphogene biologische Aktivität charakteristisch, wie beispielsweise eine Aktivierung einer zweiten Messengerkaskade einer intrazellulären Signalweiterleitung, die beispielsweise zyklische Nukleotide, Diacylglycerol und/oder und andere Indikatoren einer intrazellulären Signalweiterleitung, wie beispielsweise einer Aktivierung oder Unterdrückung einer Genexpression, einschließlich einer Induktion von mRNA einbezieht, was auf eine Gentranskription und/oder Induktion einer Proteinsynthese zurückzuführen ist, die auf eine Translation eines mRNA Transkripts zurückzuführen ist, was auf eine Gewebemorphogenese hinweist. Beispielhafte auf OP-1 reagierende Zellen sind vorzugsweise von einem Säugerursprung und umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf osteogene Vorläuferzellen, von der Calvaria abgeleitete Zellen, Osteoblaten, Osteoklasten, Osteosarkomzellen und Zellen mit einem Ursprung bei Leber und Nerven. Eine beliebige derartige auf OP-1 oder Morphogen reagierende Zelle kann eine geeignete Testzelle sein, um zu bewerten, ob eine induzierte Testsubstanz ein Morphogen-Analog ist.
  • Das gegenwärtige Identifizierungsverfahren wird dadurch ausgeführt, dass eine Testzelle gegenüber mindestens einer Testsubstanz ausgesetzt wird, und festgestellt wird, ob eine derartige Exposition eine Expression des detektierbaren Genprodukts induziert, das mit dem auf OP-1 reagierenden die Transkription aktivierenden Element betriebsbereit assoziiert vorliegt. Die Expression von diesem Genprodukt zeigt, dass die Testsubstanz eine durch OP-1 vermittelte biologische Wirkung induzieren kann. Der Fachmann kann im Lichte der hier bereitgestellten Anleitung eine Testzelle mit einem reagierenden Element von einer auf OP-1 reagierenden Zelle und einem Reportergen nach Wahl unter Verwendung von rekombinanten Vektoren und Transfektionstechniken, die im Stand der Technik wohl bekannt sind, konstruieren. Es gibt zahlreiche wohl bekannte hier nützliche Reportergene. Diese umfassen, beispielsweise, Chloramphenicol-Acetyltransferase (CAT), Luciferase, menschliches Wachstumshormon (hGH), beta-Galactosidase, Testsysteme und Reagenzien, die durch gewerbliche Quellen verfügbar sind. Wie dem Fachmann klar sein wird, stellen die aufgelisteten Reportergene lediglich einige der möglichen Reportergene dar, die hier verwendet werden können. Beispiele derartiger Reportergene können in F.A. Ausubel et al., Eds., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, (1989) gefunden werden. Allgemein kann ein beliebiges Gen, das ein detektierbares Produkt kodiert, beispielsweise ein beliebiges Produkt, das eine detektierbare enzymatische Aktivität aufweist oder gegen dass ein spezifischer Antikörper gezüchtet werden kann, in dem vorliegenden Identifizierungs verfahren als ein Reportergen verwendet werden. Ein gegenwärtig bevorzugtes Reportergensystem ist das Luciferase Reportersystem des Glühwürmchens (Gould, S. J., and Subramani, S. (1988) Anal. Biochem., 7: 404-408.
  • Der Luciferase-Test ist schnell und empfindlich. In diesem Testsystem wird ein Lysat der Testzelle präpariert und mit ATP und dem Substrat Luciferin kombiniert. Das kodierte Enzym Luciferase katalysiert eine schnelle ATP abhängige Oxidation des Substrats, um ein Licht emittierendes Produkt zu erzeugen. Die gesamte Lichtausgabe wird erfasst und ist zu der Menge von Luciferase proportional, die über einen weiter Bereich von Enzymkonzentrationen vorhanden ist.
  • CAT ist ein häufig verwendetes Reportergensystem, wobei ein hauptsächlicher Vorteil dieses System darin besteht, dass es umfassend bestätigt wurde und als ein Maß der Promotoraktivität weithin akzeptiert wird. (Gorman C.M., Moffat, L.F., and Howard, B.H. (1982) Mol. Cell. Biol., 2: 1044-1051). In diesem System werden Testzellen mit den CAT Expressionsvektoren transfiziert und innerhalb 2-3 Tagen nach der anfänglichen Transfektion mit den Testsubstanzen inkubiert. Danach werden die Zellextrakte präpariert. Die Extrakte werden mit Acetyl-CoA und radioaktivem Chloramphenicol inkubiert. Folgend auf die Inkubation werden durch eine Dünnschichtchromatographie acetyliertes Chloramphenicol von nicht acetyliertem getrennt. In diesem Test spiegelt der Grad der Acetylierung die Aktivität des CAT-Gens mit dem bestimmten Promotor wieder.
  • Ein anderes geeignetes Reportergensystem basiert auf der immunologischen Detektion von hGH. Dieses System ist ebenfalls schnell und einfach zu verwenden. (Selden, R., Burke-Howie, K. Rowe, M.E., Goodman, H.M., and Moore, D.D. (1986), Mol. Cell Biol., 6: 3173-3179). Der Vorteil des hGH Systems besteht darin, dass das exprimierte hGH Polypeptid vielmehr in dem Medium als in einem Zellextrakt getestet wird. Folglich erfordert dieses System nicht die Zerstörung der Testzellen. Es ist klar, dass das Prinzip von diesem Reportergensystem nicht auf hGH beschränkt ist, jedoch vielmehr zur Verwendung mit einem beliebigen Polypeptid angepasst werden kann, für das ein Antikörper von annehmbarer Spezifität verfügbar ist oder präpariert werden kann.
  • Ungeachtet des verwendeten Systems eines Reportergens wird die Testsubstanz der Testzelle für eine angemessene Zeitdauer und unter geeigneten Zellkulturbedingungen ausgesetzt, um die durch OP-1 vermittelte biologische Wirkung zu induzieren. Beispielsweise, wird unter Verwendung des gegenwärtig bevorzugten auf OP-1 reagierenden die Transkription aktivierenden Elements und fötalen Calvaria-Zellen der Ratte, wie in den nachfolgenden Beispielen beschrieben, die durch OP-1 vermittelte biologische Wirkung zumindest auf bzw. nach ungefähr 24 Std. der Exposition gegenüber OP-1 induziert. Folglich wird erwartet, dass die Testsubstanz, die auf geeignete, nicht toxische, biologisch relevante Konzentrationen verdünnt wurde und die den Calvaria-Testzellen der Ratte des vorliegenden Beispiels ausgesetzt wurden, die Produktion des detektierbaren Genproduktes mindestens nach ungefähr 16 Std., vorzugsweise ungefähr 24 Std. und vor ungefähr 36 Std. einer Exposition der Zellen darauf induzieren. Geeignete Zellkulturbedingungen für den Expositionsschritt werden abhängig von der genauen Beschaffenheit der Testzelle variieren und können durch den Fachmann durch nicht mehr als ein Routineexperimentieren optimiert werden.
  • Der Fachmann kann zusätzlich bestimmte andere Beispiele des gegenwärtigen Verfahrens praktizieren, sobald ein vermeintliches Morphogen-Analog unter Verwendung des vorstehend beschriebenen Identifizierungsverfahrens identifiziert ist. Das heißt, dass ein bestätigendes Durchmustern des vermeintlichen Analogs die zusätzlichen Schritte eines Kontaktierens einer auf OP-1 reagierenden Zelle damit und Detektieren einer Induktion einer biologischen Wirkung einbezieht, die bekannt ist durch OP-1 in einer auf OP-1 reagierenden Zelle vermittelt zu werden. Eine Induktion der biologischen Wirkung bestätigt weiterhin die Identität der Substanz als ein mögliches OP-1 oder (Morphogen)-Analog. Dem Fachmann wird klar sein, dass unter bestimmten Bedingungen ein Detektieren der Expression des Reportergens als auch das Detektieren der biologischen Wirkung gleichzeitig vorkommen kann. Auf ähnliche Weise kann die Testzelle selbst auf OP-1 reagieren.
  • Bestimmte andere Beispiele des Verfahrens können ein weiteres bestätigendes Durchmustern des vorstehend identifizierten vermeintlichen Analogs gestatten. Ein derartiges Verfahren bezieht die zusätzlichen Schritte ein von, Bereitstellen des vermeintlichen Analogs einem morphogen permissiven gewebespezifischen Locus in einem Säuger und Detektieren der Induktion der gewebespezifischen Morphogenese an dem Locus, wobei die Induktion darauf hinweist, dass das Analog befähigt ist eine gewebespezifische Morphogenese in einem Säuger zu induzieren. Dieses Beispiel gestattet dem Fachmann mit angemessener Sicherheit zu bestätigen, dass eine vielversprechende Substanz tatsächlich die Nützlichkeit bzw. Brauchbarkeit als ein OP-1 oder ein Morphogen-Analog aufweist.
  • Ein Morphogen-Analog, das wie vorstehend beschrieben, entsprechend identifiziert wurde, kann in gewerblich signifikanten Quantitäten in Therapeutikumqualität hergestellt und zur Verabreichung an einen Säuger, vorzugsweise einen Menschen für eine therapeutische Wirkung, formuliert werden. Falls es, beispielsweise, wünschenswert ist die Toxizität zu verringern, die Haltbarkeit oder das biologische Potential zu verbessern, kann ein Derivat des identifizierten Morphogen-Analogs mit im Wesentlichen den gleichen das Morphogen nachahmenden Eigenschaften davon hergestellt werden.
  • Ein beliebig geeignetes Verfahren kann verwendet kann verwendet werden, um ein bestimmtes Morphogen-Analog herzustellen. Derartige Verfahren können beispielsweise Verfahren einer biologischen Produktion, wie beispielsweise von einer Wirtszelle oder von einer synthetischen Herstellung eines Peptids, umfassen, sind jedoch nicht darauf beschränkt. Außerdem können Verfahren eine nicht biologische chemische Synthese umfassen. Immer noch andere Verfahren können eine Herstellung durch Fermentation oder Zellkultur unter Verwendung einer die Analogverbindung herstellenden Zelle umfassen. Natürlich gewonnene Analoge können, beispielsweise, von intakter oder verkürzter genomischer oder cDNA oder von synthetischer DNA in prokaryotischen oder eukaryotischen Wirtszellen exprimiert und gereinigt, gespalten, umgefaltet und, wie erforderlich, oxidiert werden, um aktive Moleküle zu bilden. Nützliche Wirtszellen umfassen Prokaryoten einschließlich E. coli und B. subtilis, und eukaryotische Zellen, einschließlich Säugerzellen, wie beispielsweise Fibroblasten 3T3 Zellen, CHO, COS, Melanom- oder BSC-Zellen, HeLa- und andere Zellen des Menschen, das Insekten/Baculovirus-System, als auch Hefe und andere mikrobielle Wirtszellsysteme. Alternativ können Proteine unter Verwendung von standardisierten Peptidsyntheseverfahren chemisch synthetisiert werden, die im Stand der Technik wohl beschrieben und im Handel erhältlich sind. Auf ähnliche Weise können nicht peptidartige Moleküle unter Verwendung von standardisierten chemischen Protokollen chemisch synthetisiert werden.
  • In einer anderen Ausführungsform stellt die vorliegende Erfindung DNA zum Induzieren einer durch OP-1 vermittelten biologischen Wirkung bereit. Die vorliegende DNA definiert ein auf OP-1 reagierendes die Transkription aktivierendes Element, so dass die DNA, falls sie in einer mit OP-1 in Kontakt gebrachten auf OP-1 reagierenden Zelle vorkommt, dazu dient die Transkription eines Gens zu induzieren, das stromabwärts mit dem vorstehend erwähnten Element betriebsbereit verbunden angeordnet vorliegt. In einer Ausführungsform ist die Sequenz einer DNA, die das auf OP-1 reagierende die Transkription aktivierende Element definiert am meisten bevorzugt die, die durch die hier beschriebenen Kernnukleotide 697-728 von SEQ ID NO. 1 dargestellt werden. In einer anderen Ausführungsform wird die bevorzugte DNA durch die Nukleotide 682-696 von SEQ ID NO. 1 dargestellt, die die Kernsequenz an dem 5' Ende flankieren und Nukleotide 729-731, die die Kernsequenz an dem 3'-Ende flankieren. In noch einer anderen Ausführungsform wird die bevorzugte DNA durch die Nukleotide 682-696 von SEQ ID NO. 1 dargestellt, die die Kernsequenz an dem 5'-Ende flankieren und Nukleotiden 729-761, die die Kernsequenz an dem 3'-Ende flankieren. Ebenfalls wird DNA beschrieben, die mit einer beliebigen einen der vorstehend beschriebenen DNA-Sequenzen spezifisch hybridisiert. Wie hier verwendet, bedeutet "spezifisch hybridisieren" unter Bedingungen zu hybridisieren, die im Stand der Technik als niedrige Stringenzbedingungen definiert sind. Beispielhafte Bedingungen sind folglich: Hybridisierung in 30 % Formamid, 1M NaCl, 50 mM Tris (pH-Wert 7,5), 0,5 % SDS, 10 % Dextransulfate, 1 × Denhardts-Lösung und 1 mg/ml denaturierter Lachsspermien DNA für insgesamt 20 Stunden bei 42°C, gefolgt durch Waschen bei Raumtemperatur einmal in 2 × SSC/0,1 % SDS, und anschließend zweimal bei 55°C in 1 × SSC/0,1 % SDS für 15 Minuten jeweils. Siehe beispielsweise US-5,359,047 .
  • Das gegenwärtig bevorzugte auf OP-1 reagierende die Transkription aktivierende Element umfasst folglich die Nukleotide 697-728 von SEQ ID NO. 1. Von dieser besonderen Kernsequenz wird erwartet, dass sie mit einer DNA Bindungsstellensequenz spezifisch hybridisiert, die einer vorher in im Stand der Technik (SEQ ID NO: 2, siehe Lee et al., Cell 49 (1989), 741-752) beschriebenen, AP1-DNA-Sequenz ähnelt. Wie durch die Nukleotide an Positionen 697-712 von SEQ ID NO. 1 dargestellt, ist das 5'-Ende dieser Kernsequenz AT reich, während das 3'-Ende (Nukleotide 715-724 von SEQ ID NO. 1) eine Sequenz beinhaltet, die einer AP1 Bindungsstelle ähnlich ist.
  • Wie hier offenbart, führt eine Mutation innerhalb der Nukleotidsequenz des gegenwärtigen auf OP-1 reagierenden die Transkription aktivierenden Elements zu einem Verlust der OP-1 Ansprechbarkeit (SEQ ID NO. 3). Insbesondere beseitigt eine Mutation der 3'-Sequenz, die der API Bindungsstelle ähnelt die OP-1 Ansprechbarkeit. Das heißt, eine Mutation beseitigt die Befähigung des vorstehend erwähnten intrazellulären Aktivators an das vorliegende transkriptionelle Aktivierungselement zu binden.
  • In einem anderen Beispiel wird folglich eine im Wesentlichen reine Substanz beschrieben, die befähigt ist an das vorstehend erwähnte auf OP-1 reagierende die Transkription aktivierende Element oder einen Teilbereich davon zu binden, so dass die Substanz die Eigenschaft aufweist die Expression eines Gens zu modulieren, das ein Genprodukt kodiert, wenn die vorstehend beschriebene DNA damit betriebsbereit verbunden ist und die Substanz daran gebunden vorliegt. Diese im Wesentlichen reine Substanz, die hier als ein Expressions-Aktivator bezeichnet wird, bindet an die Kernsequenz des gegenwärtig bevorzugten auf OP-1 reagierenden Elements, beispielsweise an die Nukleotide 697-728 von SEQ ID NO. 1, wodurch die Expression eines stromabwärts gelegenen Gens moduliert wird, das ein Genprodukt kodiert, das mit dem reagierenden Element betriebsbereit verbunden ist. Wie vorstehend ausgeführt und hier beispielhaft nachfolgend dargestellt, ist eine gegenwärtig bevorzugte Substanz eine proteinöse intrazelluläre Substanz, die allgemeine immunologische Eigenschaften eines Proteins der fos-Familie aufweist. Das heißt, in einer Ausführungsform umfasst die Substanz ein Polypeptid, das eine Aminosäuresequenz aufweist, die eine Immunreaktivität mit der konservierten Domäne von menschlichem c-fos teilt, insbesondere mit den Aminosäureresten 128-152 von dem c-fos-Protein des Menschen, wie durch die Aminosäurereste 1-25 in SEQ ID NO. 4 dargestellt wird. Insbesondere umfasst eine beispielhafte Substanz ein Epitop, das durch den als "c-fos (K25)" bezeichneten Antikörper gebunden wird, welcher als Katalognr.: sc-253 von Santa Cruz Biotechnology, Inc., Santa Cruz, CA, verfügbar ist. Dieser Antikörper ist ein durch Affinität gereinigter polyklonaler Kaninchen-Antikörper, der gegen ein Peptid gezüchtet wurde, das den Aminosäuren 128-152 entspricht, die innerhalb einer hoch konservierten Domäne des menschlichen c-fos p62 kartieren. Menschliches c-fos p62 ist ein 64 kDa nukleäres Phosphoprotein, das durch eine Vielzahl biologisch aktiver Mittel induziert wird und eine Komponente des Transkriptionsregulators, AP1, ist. (Siehe beispielsweise Bohmann et al., Science 238 (1987), 1386-1392) Der Antikörper c-fos (K-25) reagiert mit c-fos von Vertebraten und den wohl bekannten funktionellen Homologen von c-fos, die als fos B, fra-1 und fra-2 durch Immunpräzipitation, Western-Blot und Zellfärbung bekannt sind. Siehe beispielsweise Cohen et al. (1989), Genes and Dev. 3: 173-184 und Nishina et al. (1990), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 3619-3623.
  • Ebenfalls werden hier Aminosäurevarianten des vorliegenden intrazellulären Expressions-Aktivators, einschließlich allelischer und Spezies-Varianten davon oder andere natürlich vorkommende oder synthetische Aminosäuresequenzvarianten beschrieben. Wie hier verwendet umfasst "Aminosäuresequenzvariante" ein Polypeptid, das eine Aminosäuresequenz aufweist, die von der natürlich vorkommenden Sequenz unterschieden ist, folglich im Wesentlichen die gleichen funktionellen Eigenschaften beibehält, wie der Aktivator in den nachfolgend berichteten Beispielen, einschließlich der Bindungskapazität für die Nukleotide 682-761 von SEQ ID NO. 1.
  • Es ist vorgesehen, dass der im Wesentlichen reine Expressions-Aktivator unter Verwendung wohl bekannter Reinigungstechniken als solchen, jedoch nicht beschränkt auf Gelfiltrations-Chromatographie, Affinitätschromatographie und Hochdruck-Flüssigkeitschromatographie hergestellt werden kann. Insbesondere kann er durch Chromatographie der Ligandenaffinität, basierend auf dessen Bindung an das die Transkription aktivierende Element von, hier, SEQ ID NO. 1 präpariert werden. Der Fachmann benötigt lediglich ein Routineexperimentieren, um einen wesentlich reinen Aktivator gemäß der vorliegenden Erfindung zu erhalten.
  • Weiterhin wird ein Verfahren beschrieben, um zu beurteilen, ob eine Probe einen derartigen Aktivator umfasst. Dieses Verfahren umfasst, Bereitstellen der vorstehend beschriebenen Kern-DNA-Sequenz, Inkontaktbringen der DNA mit der Probe, und Detektieren einer Bindung durch den Aktivator daran. Falls erwünscht, kann ein Äquivalent der Kern-DNA-Sequenz, einschließlich allelischer, Spezies und degenerierter Sequenzen, verwendet werden. "Degenerierte Sequenzen" umfassen Nukleotidsequenzen, die sich von der vorliegenden Kernsequenz unterscheiden, die jedoch nicht die Bindungswechselwirkung zwischen dem vorstehend beschriebenen intrazellulären Expressions-Aktivator und dem intakten auf OP-1 reagierenden die Transkription aktivierenden Element ändert. Dieses Verfahren stellt beides, eine Alternative zu oder einen zusätzlichen Durchmusterungstest für ein OP-1 oder ein Morphogen-Analog, bereit, da, wie nachfolgend dargestellt, ein Morphogen, wie beispielsweise OP-1, die Bindung dieser Substanz an das reagierende Element induziert und/oder vermittelt. Folglich charakterisiert ein Durchmustern für eine durch OP-1 induzierte Wechselwirkung, beispielsweise zwischen der DNA und einer derartigen Substanz die Fähigkeit einer Verbindung weiter, beispielsweise OP-1 nachzuahmen. Beispielhafte Bedingungen unter denen eine derartige DNA-Protein Wechselwirkung detektiert werden kann, wurde kürzlich in Augereau et al. (1986), EMBO J. 5: 1791-1797, beschrieben.
  • Kurz, Protein beinhaltende nukleäre Extrakte werden auf Eis für 15 Minuten mit E. coli DNA in 10 % Glycerol, 10 mM Hepes, pH-Wert 7,9, 50 mM KCl, 5 mM MgCl2, 0,5 mM DTT inkubiert, wobei auf Zugabe der besonderen DNA-Sequenz von Interesse die Inkubation für 15 Minuten fortgesetzt wurde, um eine Protein-DNA-Komplexbildung zu ermöglichen.
  • Weiterhin wird eine Zelle für eine induzierbare Expression eines Morphogens beschrieben. Diese Zelle weist eine erste DNA auf, die ein Morphogen kodiert, eine zweite DNA, die mit der ersten DNA transkriptionell betriebsbereit verbunden vorliegt, wobei die zweite DNA das vorstehend beschriebene auf OP-1 reagierende die Transkription aktivierende Element umfasst, das beispielsweise die Nukleotide 682-761 von SEQ ID NO. 1 umfasst, oder ein funktionelles Äquivalent davon. Die Zelle umfasst weiter zelluläre Mittel, um eine intrazelluläre Substanz (einen Expressions-Aktivator) herzustellen, der die zweite DNA bindet, um so die Expression des Morphogen zu stimulieren, das durch die erste DNA kodiert wird, wenn die Zelle mit einem extrazellulären induzierenden Mittel in Kontakt gebracht wird. In bestimmten Ausführungsformen liegt das extrazelluläre induzierende Mittel als ein Morphogen oder ein Analog davon vor, das, wie hier dargelegt identifiziert wurde. In bestimmten Ausführungsformen liegt das extrazelluläre induzierende Mittel als OP-1 oder einem Analog davon vor.
  • Die vorstehend erwähnte Zelle ist eine Säugerzelle, vorzugsweise eine Primatenzelle, am meisten bevorzugt eine menschliche Zelle. In bestimmten Ausführungsformen ist die vorstehend erwähnte Zelle eine Mauszelle, wie beispielsweise eine Zelle der Maus, der Ratte oder des Hamsters. Die Zelle der vorliegenden Erfindung kann natürlich vorkommen, in Kultur immortalisiert vorkommen oder durch rekombinante oder Verfahren der Zellfusion konstruiert werden.
  • Es wird klar sein, dass die vorliegende Erfindung verwendet werden kann, um eine Zelle für eine stabile Expression eines beliebig wünschenswerten Genproduktes zu konstruieren und ist nicht auf eine Verwendung mit erster DNA beschränkt, die ein Morphogen kodiert. In immer noch einer anderen Ausführungsform werden Verfahren zum Induzieren einer Expression beschrieben, einschließlich einer autokrinen Expression eines Morphogens, beispielsweise OP-1, tatsächlich von einem Genprodukt, das durch die vorstehend beschriebenen Zellen verwendet wird. In jenen Verfahren wird eine der vorstehend beschriebenen Zellen mit OP-1, einem Morphogen oder einem Morphogen-Analog unter Bedingungen in Kontakt gebracht, die dazu geeignet sind eine Expression des Genproduktes durch die erste DNA zu induzieren.
  • Wahlweise können die vorstehenden Verfahren in vivo ausgeführt werden, indem eine beliebige eine der vorstehend beschriebenen Zellen einem Säuger bereitgestellt wird. In diesen Ausführungsformen wird der Schritt des Inkontaktbringens durch Verabreichen eines induzierenden Mittels an den Säuger ausgeführt. Dieses Verfahren ist besonders geeignet, um ein Morphogen, wie beispielsweise, jedoch nicht beschränkt auf OP-1 an einen Säuger zu verabreichen, der an einer metabolischen Knochenerkrankung oder einer anderen Verletzung, Erkrankung oder einem Zustand leidet, für den eine Langzeit-Verabreichung des Morphogens erwartet wird, um einen klinischen Vorteil bereitzustellen.
  • In noch einer anderen gegenwärtig bevorzugten Ausführungsform stellt die Erfindung DNA bereit, um eine durch ein Morphogen vermittelte biologische Wirkung zu induzieren. Diese DNA definiert ein auf ein Morphogen reagierendes die Transkription aktivierendes Element und eine Klonierungsstelle, die für eine Insertion eines Reportergens geeignet ist, das ein detektierbares Genprodukt kodiert oder ein therapeutisches bzw. Therapiegen, das ein biologisch aktives Genprodukt kodiert. Wird das Reportergen bei der Klonierungsstelle eingefügt, dann ist das Reportergen mit dem auf Morphogen reagierenden die Transkription aktivierenden Element betriebsbereit verbunden, so dass das detektierbare Genprodukt hergestellt wird, wenn die DNA in einer auf Morphogen reagierenden Zelle vorhanden ist und die Zelle mit einem Morphogen oder einem Analog davon in Kontakt gebracht wird. In bestimmten Ausführungsformen reagiert das auf Morphogen reagierende die Transkription aktivierende Element auf OP-1 oder ein Analog davon. Die Materialien und Protokolle zum Einfügen von Reportergenen in vorher vorhandene Klonierungsstellen sind leicht verfügbar und im Stand der Technik wohl bekannt. Siehe beispielsweise Molecular Cloning A Laboratory Manual (eds., Maniatis et al., Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor; 2nd edition)(1989). Der Fachmann braucht lediglich ein Routineexperimentieren auszuführen, um DNAs der vorliegenden Erfindung herzustellen.
  • Dementsprechend kann zur Erleichterung der Praxis der hier dargelegten Erfindung ein Kit zum Durchmustern von Testsubstanzen auf Morphogen nachahmende Eigenschaften bereitgestellt werden, wie es ein Kit zum Präparieren einer Zelle ist, um eine Herstellung eines Genproduktes zu induzieren. Die Kits umfassen hier einen Behälter zum Beinhalten von DNA, wobei die DNA ein auf OP-1 reagierendes die Transkription aktivierendes Element und eine Klonierungsstelle definiert, die dazu geeignet ist ein Gen, das mit dem aktivierenden Element betriebsbereit verbunden ist, eingefügt zu erhalten. Wahlweise umfasst die DNA ein Reportergen, das ein detektierbares Genprodukt, beispielsweise ein Produkt mit einer detektierbaren enzymatischen Aktivität, kodiert. In bestimmten Ausführungsformen beinhaltet der Kit weiterhin Mittel, die eine Zelle dazu induzieren die vorhandene DNA zu internalisieren bzw. zu verinnerlichen. Bestimmte andere Kits beinhalten ein Morphogen und/oder eine Verbindung, die durch die Verfahren der vorliegenden Erfindung so identifiziert wurden, dass sie die Fähigkeit aufweisen eine durch Morphogen vermittelte oder durch OP-1 vermittelte biologische Wirkung zu induzieren. Die optionalen Kit-Bestandteile sind als Kontrollsubstanzen zur praktischen Durchführung der hier offenbarten Identifizierungsverfahren nützlich.
  • Die praktische Durchführung der Erfindung wird aus den folgenden Beispielen noch vollständiger verstanden werden, die hier lediglich zur Erläuterung dargestellt werden und nicht als die Erfindung in irgendeiner Weise beschränkend verstanden werden sollten.
  • Beispiel 1: Wirkung von OP-1 auf die Proliferation und Differenzierung von C5.18-Zellen
  • Um die biologischen Wirkungen von OP-1 auf von Knochen abgeleitete Zelllinien zu charakterisieren, wurde die OP-1 Ansprechbarkeit in C5.18-Zellen und spontan immortalisierten fötalen Calvaria-Zellen der Ratte untersucht, die im Stand der Technik wohl bekannt sind und beispielsweise in Grigoriadis et al. (1990) Developmental Biology 142: 313-318 und in Von Schroeder et al. (1994) Teratology 50: 54-62, beschrieben sind. C5.18-Zellen werden in Kulturschalen mit 12-Löchern (1 × 105 Zellen/Loch) in αMEM ausplattiert, das 15 % fötales Rinderserum beinhaltet. Wie nachfolgend beschrieben, wurden verschiedene Mengen von rekombinantem OP-1 des Menschen (Creative BioMolecules, Inc., Hopkinston, MA) zu den Kulturmedien zugegeben und die Calvaria-Zellen wurden mit dem OP-1 beinhaltenden Medium für unterschiedliche Zeiten, wie nachfolgen angezeigt, inkubiert. Das OP-1 wurde allgemein so präpariert und formuliert, wie es vorstehend in US-5,258,494 ; 5,266,683 ; and 5,354,557 , beschrieben wurde.
  • Kurz, eine OP-1 Behandlung von Calvaria-Zellen fötaler Ratten induzierte eine Mitogenese und phänotypische Marker für Chondrozyten und Osteoblasten. Beispielsweise induzierte OP-1 Typ II Kollagen, einen Marker für Chondrozyten beziehungsweise Typ X Kollagen, einen spezifischen Marker für hypertrophe Chondrozyten. Nachfolgend induzierte OP-1 Typ I Kollagen und die Osteoblasten-Marker Osteocalcin und alkalische Phosphatase. Das geregelte Auftreten bzw. Erscheinungsbild dieser molekularen Marker rekapituliert die Reihenfolge von Ereignissen, die während einer, durch OP-1 in vivo induzierten, endochondralen Knochenmorphogenese beobachtet werden. Siehe US-P-4,968,590 und Sampath et al. (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 6591-6595.
  • Die Osteoblasten-Marker alkalische Phosphatase und Osteocalcin, als auch die Chondrozyten-Marker Typ II und X Kollagen wurden unter Verwendung von standardisierten Techniken für eine RNA-Blotanalyse, beispielsweise jene in Harada et al. (1994) J. Clinical Investigation 93: 2490-2496 offenbarte, untersucht. Die cDNA-Sonden für die alkalische Phosphatase und Osteocalcin wurden gemäß der im Stand der Technik anerkannten Verfahren, wie beispielsweise jenen in Yoon et al. (1987) Biochem. Biophys. Res. Commun. 148: 1129-136 offenbarten, präpariert. Die cDNA-Sonden für die Typen II und X Pro-Kollagen wurden ebenfalls gemäß der im Stand der Technik anerkannten Verfahren, wie beispielsweise jenen in Asahina et al. (1993) J. Cell Biology 123: 921-933 beziehungsweise Chen et al. (1995) J. Cell Science 108: 105-114, beschriebenen, präpariert.
  • Insbesondere induzierten 300 ng/ml OP-1 eine Mitogenese (2), wie durch Untersuchungen mit einem 3H-Thymidineinbau erfasst wurde, der allgemein gemäß der im Stand der Technik anerkannten Verfahren ausgeführt wurde. 2 erläutert, dass OP-1 (300 ng/ml) eine 3H-Tymidinaufnahme stimulierte. Dieses gleiche Ergebnis wurde nicht in Kontrollkulturen ohne OP-1 oder in Kulturen erhalten, die lediglich mit TGFβ (schweineartig, Katalog# 102-B2, R und D Systems, Inc., Minneapolis, MN) behandelt wurden.
  • Die Wirkungen von OP-1 auf die Expression von phänotypischen Marker für Chondrozyten und Osteoblasten wurden ebenfalls untersucht. Wie dargestellt, induziert OP-1 Typ 11 Kollagen, einen Marker für eine Matrix produzierende Chondrozyten, und Typ X Kollagen, einen spezifischen Marker für hypertrophe Chondrozyten bei 12 Std. bzw. 24 Std. (3). Weiterhin induziert OP-1 Typ I Kollagen bei 48 Std. und bei 72 Std. wird die Expression von Osteocalcin und alkalischer Phosphatase induziert, von denen beide als Osteoblasten-Marker gut charakterisiert sind (4).
  • Folglich induzierte OP-1 in fötalen Calvaria-Zellen eine Kaskade molekularer Ereignisse, die der Sequenz von Ereignissen ähnlich ist, die in vivo durch OP-1 induziert wurden und in der endochondralen Knochenmorphogenese kulminierten. OP-1 induziert ebenfalls eine Bildung von Knötchen, die positiv für alkalische Phosphatase sind. Im Gegensatz dazu löst TGFβ eine vernachlässigbare Wirkung auf die Expression dieser gleichen Osteoblasten-(5) und Chondrozyten-Marker (6) aus. Diese Beobachtungen legen nahe, das C5.18-Zellen ein nützliches Zellkulturmodell bereitstellen, um zu beurteilen, ob Testsubstanzen als OP-1-Analoge wirken, als auch um weiter einen oder mehrere biologische Mechanismen abzugrenzen, der/die mit einer durch OP-1 induzierten Chondrozyten- und/oder Osteoblastendifferenzierung assoziiert sind.
  • Dem Fachmann wird klar sein, dass die allgemeinen Prinzipien und Parameter des auf C5.18 basierenden in vitro Modellsystems, einschließlich der Überwachung einer Expression von phänotypischen Markern, wie beispielsweise der Typen I, II und X Kollagen, und alkalischer Phosphatase, einfach auf andere einfach verfügbare Zellkultursysteme angepasst werden können. Siehe für eine Beschreibung von einem in vitro Testsystem von Osteoblasten des Hühnerembryos Manduca et al. (1992) Cell Biology 57: 193-201; für die Beschreibung eines Sternumsystems des Hühnerembryos Reginato et al. (1993) Dev. Dvn. 198: 284-295; für eine Beschreibung für ein in vitro System, das primäre Kulturen neugeborener Rattencalvaria verwendet, Asahina et al. (1993) J. Cell Biology 123: 921-933.
  • Beispiel 2: Wirkungen von OP-1 auf den Typ X Kollagen-Promotor
  • Die vorstehend beschriebene Wirkung von OP-1 auf die Expression des Typ X Kollagens war von besonderem Interesse, da dieser Phänotypmarker allgemein als spezifisch für hypertrophe Chondrozyten und folglich einer endochondralen Knochenbildung betrachtet wird. Eine mehr in die Tiefe gehende Untersuchung der Ansprechbarkeit des Typ X Kollagengens auf OP-1 wurde wie folgt ausgeführt:
    Die Promotorregion des Typ-X Kollagengens der Maus (Nukleotide 1 bis 1067, wie durch Elima et al. (1993) Biochem. J. 289: 247-253, und durch GenBank EBML Data Bank bezeichnet: Accession#X67348; COLIOA1 Gen; Kollagen alpha 1 Typ X) (ebenfalls hier als Nukleotide 1-1067 von SEQ. ID No.1 bezeichnet) wurde gemäß wohl bekannter PCR (Polymerase-Ketten-Reaktion) Verfahren aus der genomischen DNA (Clontech, Palo Alto, CA) der Maus unter Verwendung eines 34 Basenpaare umfassenden 5' Primers, der die KpnI-Stelle trägt und eines 33 Basenpaare umfassenden 3'-Primers, der die MluI-Stelle trägt, kloniert. Diese Primersequenzen wurden unter Verwendung der Sequenz des Typ-X Kollagenpromotors der Maus, wie durch Elima et al. (1993) Biochem. J. 289: 247-253 veröffentlicht, bestätigt. Die hier verwendete Sequenz der klonierten Typ-X Kollagen Promotor-DNA, wurde durch eine Nukleotidsequenzierung, unter Verwendung des Sequenzversion 2.0 DNA Sequenzierungs-Kits, der von USB (United States Biochemical, Cleveland, OH) erhältlich ist, bestätigt.
  • Die klonierte Promotor-DNA wurde verwendet, um eine Reihe von Vektoren mit Deletionskonstrukten herzustellen, die das Luciferase Reportergen tragen und Teile des Typ-X Kollagen-Promotors der Maus tragen. Ein pGL2-Basis-Plasmid ohne Promotor, das eine Nukleotidsequenz umfasst, die das detektierbare Enzym Luciferase (Promega, Madison, WI) kodiert, wurde als Basis-Vektor (7) verwendet. Die vorstehend beschriebene intakte Typ-X Kollagen Promotorsequenz (SEQ ID NO. 1) wurde folgend auf einen Verdau mit KpnI und MluI in das pGL2-Plasmid eingefügt. Auf ähnliche Weise wurden serielle 5'-Deletionsfragmente (hergestellt wie durch vorstehend beschriebene PCR-Verfahren) in mit KpnI und MluI verdaute Präparationen des pGL2-Plasmids subkloniert. Folglich wurde die klonierte Promotor-DNA oder ein Teil davon transkriptionell mit dem Luciferase-Reportergen betriebsbereit verbunden, angeordnet.
  • Die vorstehenden Vektoren wurden unter Verwendung von Standardverfahren in Calvaria-Zellen transfiziert. C5.18-Zellen wurden in 12-Loch-Kulturschalen (1 × 105 Zellen/Loch) in αMEM, das 15 % fötales Rinderserum (Vollmedium) beinhaltete, ausplattiert. Zweiundsiebzig Stunden später wurden die vorstehend beschriebenen Vektoren unter Verwendung eines Calciumphosphat-Verfahrens in die kultivierten Zellen in Voll-Medium für 6 Stunden transfiziert. Es wurde eine 10 % DMSO-Lösung in PBS verwendet, um die Transfektion zu beenden. Danach wurden die transfizierten Zellen in Vollmedium kultiviert. Vierundzwanzig Stunden später wurden die transfizierten Zellen mit OP-1 in Kontakt gebracht und für zusätzliche 24 Stunden weiter kultiviert. Die durch die exogene Zugabe von OP-1 induzierte Luciferaseaktivität, wurde unter Verwendung des Luciferase-Testsystems von Promega (Promega, Madison, WI) erfasst.
  • Wie in 8 dargestellt, stimuliert eine Behandlung mit OP-1 die Luciferaseaktivität des intakten Konstrukts von Typ-X Kollagen, das das 1067 Basenpaarfragment von dem COLX-Promotor (Nukleotide 1 – 1067 von SEQ ID No.1) beinhaltet. Diese gleiche Menge von OP-1 stimulierte das ein 387 Basenpaarfragment (Nukleotide 682-1067 von SEQ ID NO.1) beinhaltendes Konstrukt, bis zu ungefähr 3-fach. Eine Deletion eines weiteren 42 Basenpaare umfassenden 5'-Fragments beseitigte die Ansprechbarkeit auf OP-1. Aus diesem Ergebnis wurde geschlossen, dass mindestens die Nukleotide bei Positionen 682-728 von SEQ ID NO. 1 für die OP-1 Ansprechbarkeit des Typ-X Kollagen-Gens verantwortlich sind.
  • Weitere Untersuchungen bestätigten, dass das 80 Bp umfassende Nukleinsäure-Fragment, das die Reste 682-761 von SEQ ID NO: 1 umfasst, ausreichend ist, um die OP-1 Ansprechbarkeit auf den COLX-Promotor oder auf einen heterologen (RSV)-Promotor zu übertragen. Jene Untersuchungen, deren Ergebnisse in 9 und 10 dargelegt werden, wurden unter Verwendung von sowohl dem vorstehend beschriebenen COLX-Promotor-Vektor und einem wohl bekannten RSV-Promotor getriebenen Luciferasevektors (siehe beispielsweise Towler et al., Endocrinology 136 (1995), 1089-1096) als auch der vorstehend dargelegten allgemeinen Transfektions- und Testverfahren der Luciferase, ausgeführt.
  • Immer noch weitere Untersuchungen, die auf 3'-Deletionsanalysen des RSV-Promotorkonstrukts basieren, identifizierten das auf OP-1 reagierende Element noch genauer als eine 50 Basenpaarsequenz, die die Positionen 682-731 von SEQ ID NO. 1 (10) umspannt. Weiterhin beseitigte eine Deletion von 26 Basenpaaren, dargestellt durch die Nukleotide 682-707 von SEQ ID NO: 1, die OP-1 Ansprechbarkeit, was nahe legt, dass eine 5'-AT reiche Sequenz, die die Nukleotide 697-712 von SEQ ID NO: 1 umspannt für die OP-1 Ansprechbarkeit (9) verantwortlich ist.
  • Im Gegensatz dazu weist TGFβ2 (2 ng/ml) eine geringe Wirkung auf das auf OP-1 reagierende Element (Nukleotide 682-761 von SEQ ID NO: 1) in dem RSV-Promotorkonstrukt (11) auf trotz der Bestätigung, dass die gleiche TGFβ-Präparation eine auf TGFβ reagierende Stimulation an einem p3TP-Lux-Vektorkonstrukt erfolgreich induzierte, das von C5.18-Zellen getragen wird, die gemäß den vorstehend beschriebenen Verfahren transfiziert wurden.
  • Es wurden zusätzliche Experimente ausgeführt, um weitere Merkmale des auf OP-1 reagierenden Elements in dem Typ-X Kollagen-Promotor darzustellen. Insbesondere wurde ein DNase-Footprinting entsprechend eingeführter Verfahren unter Verwendung einer Nukleinsäuresonde ausgeführt, die die Nukleotide 682-761 von SEQ ID 1 umfasst. Die Footprinting-Analyse zeigte, dass ein nuklearer Extrakt von C5.18-Zellen eine 32 Basenpaarregion vor einem Abbau durch Dnase 1 schützte, die den Nukleotiden 697-728 von SEQ ID NO. 1 entspricht. Die geschützte Region umfasst sowohl eine 5' AT reiche Sequenz als auch eine 3'-Sequenz, die eine Ähnlichkeit zu der wohl bekannten AP1-Bindungsstellensequenz aufweist, die in SEQ ID NO: 2 dargestellt ist.
  • Als nächstes wurden elektrophoretische Gelmobilitätsveränderungen entsprechend eingeführter Verfahren ausgeführt. Jene Tests zeigen, dass ein Aussetzen von C5.18-Zellen gegenüber OP-1 ungefähr einen 2-3-fachen Anstieg in der Menge oder der Aktivität eines Bestandteils eines nuklearen Extraktes, vermutlich eines Proteins induziert, das an das minimale auf OP-1 reagierende 32 Basenpaarfragment des COLX-Promotors bindet. Eine Bindung des Extraktbestandteils erzeugt einen DNA/Protein-Komplex, der relativ zu der Mobilität der nicht komplexierten DNA-Sonde eine verzögerte beziehungsweise verlangsamte elektrophoretische Mobilität aufweist. Der durch OP-1 induzierte DNA-Protein-Komplex kann durch eine Gelanalyse super-verschoben bzw. -verändert werden, falls sie mit einem Anti-c-fos-Antikörper behandelt wird. Diese Wirkung wurde unter Verwendung eines Antikörpers beobachtet, der an die konservierte Domäne der Mitglieder der fos-Genfamilie (Aminosäuren 128-152 von c-fos des Menschen; Katalog# sc-253 von Santa Cruz Biotechnology, Inc., Santa Cruz CA) SEQ ID NO. 4) bindet. Der durch OP-1 induzierte Protein-DNA-Komplex jedoch, scheint nicht durch Antikörper super-verschoben zu werden, die mit den verwandten Proteinen c-fos, fos-B, fra-1, fra-2 oder c-jun spezifisch reagieren. Es wurde unter Verwendung der Sondensequenz mit 32 Basenpaaren eine UV-Vernetzung ausgeführt, die mit dem nuklearen Extraktbestandteil komplexierte. Die Ergebnisse der Vernetzungsuntersuchungen legen nahe, dass Proteine, die eine relative Molekularmasse von ungefähr 55 kDa und 150 kDa aufweisen an dem Sondenfragment, das die Nukleotide 682-741 von SEQ ID NO. 1 umfasst, vernetzt vorliegen.
  • Schließlich beseitigt eine ortsspezifische Mutagenese der vorstehend erwähnten Domäne des Typ-X Kollagen-Promotors der Maus, der einer AP1-Bindungssstellensequenz, SEQ ID NO. 2 ähnlich ist, das heißt TGAATCATCA an Nukleotiden 715-724 von SEQ ID NO: 1 zu TTCCTCATCA (Nukleotide 1-10 von SEQ ID NO. 3) die DNA-Protein-Wechselwirkung und unterdrückt die OP-1 Ansprechbarkeit (12). Die vorstehenden Untersuchungen kulminierten in der Feststellung und Charakterisierung eines auf OP-1 reagierenden Elements in dem Promotor des Typ-X Kollagengens. Eine Kernregion (32 Bp) dies auf OP-1 reagierenden Elements wird durch eine Substanz gebunden, die in nukleären Extrakten vorhanden ist, die von mit OP-1 stimulierten C5.18-Zellen hergestellt werden. Diese Substanz weist allgemeine immunologische Eigenschaften eines Proteins der fos-Familie auf und kann ein neues Mitglied der fos-Familie sein. Folglich bietet das Erscheinungsbild und die spezifischen biologischen Wirkungen und/oder die Wechselwirkungen des fos-ähnlichen Proteins mit dem Promotor des Typ-X Kollagens einen beispiellosen Einblick in die molekulare Basis einer gewebespezifischen Morphogenese. Diese Feststellung wird gemäß der vorliegenden Erfindung für die Identifizierung von Substanzen genutzt, die die durch OP-1 induzierten spezifischen biologischen Wirkungen und/oder intrazellulären Ereignisse nachbilden können.
  • Beispiel 3: Induktion einer Expression von vaskulärem endothelialen Wachstumsfaktor durch OP-1 in vivo und in vitro
  • Angiogenese stellt eines der frühesten Ereignisse bei dem Übergang von der Chondrogenese zur Osteogenese dar. Der vaskuläre endotheliale Wachstumsfaktor (VEGF), das einzige sekretierte Mitogen, das für vaskuläre endotheliale Zellen spezifisch ist, wurde in Zusammenhang mit einer physiologischen und patho-physiologischen Angiogenese gebracht. In Berichten wurde dargestellt, dass die VEGF-Expression in Osteoblasten durch die Prostaglandine E1 und E2 erhöht wird, wobei sie durch Glucocorticoide (Harda et al., J. Clin. Invest. 93 (1994), 2490-2496) unterdrückt wird. Vorbereitende histochemische Analysen von normalen Schnitten von Rattenknochen legten nahe, dass die Expression von VEGF in der hypertrophen Zone des Knorpels lokalisiert sein könnte. Diese Beobachtung legte weiter nahe, dass VEGF bei der endochondralen Verknöcherung bzw. Ossifikation eine Rolle spielt. Folglich ist die Expression von VEGF ein Induktor einer durch die hier offenbarten OP-1 und OP-1-Analoge induzierten endochondralen Knochenbildung und kann mittels des nachfolgenden Tests in vivo erfasst werden.
  • Es wurden mit OP-1 beladene knochenspezifische Matrixpellets (Creative BioMolecules, Inc., Hopkinton, MA) gemäß der früher verwiesenen Verfahren, die in US-4,968,590 und Sampath et al. (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 6591-6595 beschrieben wurden, in vier Wochen alte männliche Ratten implantiert. Anschließend an eine geeignete Inkubationsperiode, während der eine endochondrale Knochenmorphogenese beginnt, wurde RNA aus den durch OP-1 oder einer Test-Verbindung induzierten Knötchen extrahiert. Im Falle von OP-1 war die VEGF-mRNA an Tag 11 nach der Implantation von OP-1 folgend auf die Induktion von Typ-X Kollagen mRNA (an Tag 9) hoch exprimiert. In OP-1 behandelten Tieren war die VEGF-mRNA mit hypertrophen Chondrozyten assoziiert, was mit dessen Expression an der Wachstumsplattenregion von langen Knochen im Einklang steht.
  • OP-1 kann ebenfalls VEGF-mRNA in vitro in C5.18-Zellen induzieren. Die VEGF-mRNA gipfelt bei 48 Std. nach einer Behandlung mit OP-1, die der Induktion von Knorpelmarkern folgt. Im Gegensatz dazu wies OP-1 keine Wirkung auf die VEGF-mRNA in RCT3 Osteoblastenzellen auf. RCT-3 ist eine klonale Zelllinie, die von durch Retrovirus immortalisierten embryonalen Calvaria-Zellen der Ratte abgeleitet ist, die die Charakteristika der Osteoblasten, wie durch Heath et al. (1989) Endocrinology 124:3060:3068 beschrieben, konstitutiv zeigt. Diese Beobachtung legt nahe, dass die vorstehend beschriebene Wirkung auf die VEGF-Produktion für den Zelltyp spezifisch war. Das heißt das TGFβ1 VEGF-mRNA in beiden Zelllinien, jedoch mit einem unterschiedlichen Zeitverlauf (bei 12 Std.) induziert. Diese Beobachtungen zeigen, dass VEGF-mRNA während des morphogenen Übergangs von Knorpel zu Knochen in vivo exprimiert wird und das OP-1 die VEGF-mRNA in chondroosteo bzw. Knorpel-Knochen Vorläuferzellen in vitro auf eine Zelltyp spezifischen Weise induziert. Es wird erwartet, dass Analoge ähnliche Induktionswirkungen aufweisen.
  • Beispiel 4. Induktion von Differenzierungsmarkern in Osteoblasten
  • Falls wünschenswert können andere zelluläre und molekulare Marker für die gewebespezifische durch OP-1 induzierte Morphogenese überwacht werden, um zu bestätigen, ob eine Testsubstanz, die die vorstehend beschriebenen intrazellulären Ereignisse nachbildet, die den Promotor des Typ-X Kollagengens einbezieht, tatsächlich als ein OP-1-Analog betrachtet werden sollte. Folglich offenbart die PCT/US/92/07432 , dass OP-1 vorzugsweise eine Differenzierung von nicht festgelegten Vorläuferzellen von Säugern, einschließlich embryonaler mesenchymaler Zellen und primärer Osteoblasten induziert. Dementsprechend können mögliche Analoge von OP-1 auf eine ähnliche Fähigkeit eine Differenzierung von primären Osteoblasten zu induzieren, durchmustert werden, indem die Fähigkeit jener Analoge erfasst wird, spezifische molekulare Marker, wie beispielsweise die Aktivität der alkalischen Phosphatase, durch PTH vermittelte cAMP-Produktion und eine Osteocalcinexpression zu induzieren, die alle induziert werden, falls primäre Osteoblasten Morphogenen, wie beispielsweise OP-1 des Menschen oder der Maus, dem Drosophila Homolog davon, 60A oder menschlichem BMP2 oder dem Drosophila Homolog davon, DPP, oder anderen Mitgliedern der Morphogenfamilie ausgesetzt werden.
  • Mit Osteoblasten angereicherte primäre Kulturen von einem wohl charakterisierten Säugermodell, wie beispielsweise der Ratte, werden vorzugsweise für die gegenwärtigen bestätigenden Untersuchungen verwendet. Obwohl derartige Kulturen darin heterolog sind, dass individuelle Zellen davon sich in unterschiedlich differenzierten Stadien der Differenzierung befinden, wird von diesen Zellen angenommen, dass sie den Metabolismus und die Funktion von Osteoblasten in vivo genau widerspiegeln. Solange nicht anderweitig angezeigt, sind alle mit Bezugnahme versehenen nachfolgenden Chemikalien Standardreagenzien, die einfach von einer Anzahl gewerblicher Quellen, einschließlich Sigma Chemicals, Co, St. Louis, Calbiochem, Corp., San Diego und Aldrich Chemical Co., Milwaukee verfügbar sind.
  • Es wurden mit Osteoblasten angereicherte primäre Kulturen durch einen sequenziellen Kollagenaseverdau von Rattencalvaria von Neugeborenen ohne einer Wundnaht bzw. Naht (beispielsweise von 1-2 Tage alten Tieren, Long-Evans-Stamm, Charles River Laboratories, Wilmington, MA) den Standardverfahren folgend hergestellt, die wie beispielsweise in Wong et al. (1975) Proc. Natl. Acad. Sci. 72: 3167-3171 beschrieben werden. Einzelzellsuspensionen von Rattenosteoblasten wurden dann in eine Mehrfach-Loch-Platte (beispielsweise eine 24-Lochplatte) mit einer Konzentration von 50.000 Osteoblasten pro Loch in αMEM (modifiziertes Eagle's Medium, Gibco, Inc., Long Island) ausplattiert, das 10 % FBS (fötales Rinderserum), L-Glutamin und ein Standardantibiotikum, beispielsweise Penicillin/Streptomycin beinhaltete. Die Zellen werden für 24 Stunden bei 37°C inkubiert. Falls es unter den Umständen erforderlich ist, wird das Wachstumsmedium mit αMEM ersetzt, das 1 % FCS beinhaltet und wobei die Zellen für zusätzliche 24 Stunden inkubiert werden.
  • a) Induktion einer Aktivität von alkalischer Phosphatase in Osteoblasten
  • Die kultivierten Zellen werden mit OP-1, einem vermuteten OP-1-Analog oder einer Negativ-Kontrolle, unter Verwendung von Konzentrationsbereichen, inkubiert. Es werden gewöhnlich beispielsweise 0,1, 1,0, 10,0, 40,0 oder 80,0 ng OP-1/ml Medium verwendet. Nach einer 72 Stunden dauernden Inkubationsperiode wurde die Zellschlicht mit 0,5 ml von 1 % Triton X-100 extrahiert. Der erhaltene Zellextrakt wird dann zentrifugiert und 100 μl des Extraktes werden zu 90 μl eines Gemisches aus Paranitrosophenylphosphat (pNPP)/Glycerin zugegeben und für 30 Minuten in einem 37°C Wasserbad inkubiert und wobei die Reaktion mit 100 μl einer NaOH-Lösung gestoppt wird. Die Proben wurden dann mit einem herkömmlichen Plattenlesegerät für die Spektrophotometerie (beispielsweise der Dynatech MR700 Plattenleser) analysiert. Das Absorptionsvermögen wird bei 400 nm unter Verwendung von p-Nitrophenol als einem Standard erfasst, um die Anwesenheit und Menge der alkalischen Phosphataseaktivität zu bestimmen. Die Proteinkonzentrationen wurden durch die Biorad-Mehtode bestimmt. Die Aktivität der alkalischen Phosphatase wird in Einheiten/mg Protein berechnet, wobei 1 Einheit = 1 nmol freigesetztes p-Nitrophenol/30 Minuten bei 37°C ist. OP-1 induziert durch dieses Verfahren einen fünffachen Anstieg in der zellulären spezifischen Aktivität der alkalischen Phosphatase. Von Analogen wird erwartet ähnliche Induktionswirkungen aufzuweisen.
  • b) Induktion einer durch PTH vermittelten cAMP-Produktion in Osteoblasten
  • Es wurden primäre Kulturen von Säuger-Osteoblasten, beispielsweise Ratten, präpariert und in einer Mehr-Lochplatte, wie vorstehend beschrieben, kultiviert. Die kultivierten Zellen wurden anschließend in drei Gruppen aufgeteilt: (1) Löcher, die beispielsweise 1,0, 10,0 und 40,0 ng OP-1/ml Medium erhalten, (2) Löcher, die das Test-Analog in verschiedenen Konzentrationsbereichen erhalten, und (3) eine Kontrollgruppe, die äquivalente Volumen des zum Verdünnen des OP-1 oder Analogs davon verwendeten Mediums erhält. Die Platte wird dann für weitere 72 Stunden inkubiert. Danach werden die Zellen mit Medium, das 0,5 % Rinderserumalbumin (BSA) und 1 mM 3-Isobutyl-1-methylxanthin beinhaltet, für 20 Minuten behandelt, gefolgt durch die Zugabe in die Hälfte der Löcher von rekombinantem Nebenschilddrüsenhormon (hPTH, Sigma, St. Louis) mit einer Konzentration von 200 ng/ml für 10 Minuten. Die Zellschicht wird dann von jedem Loch mit 0,5 ml einer 1 % Triton X-100-Lösung extrahiert. Spiegel von zyklischem AMP werden dann unter Verwendung eines weithin verfügbaren Radioimmuntest-Kits (beispielsweise Amersham, Arlington Heights, Illinois) bestimmt. OP-1 verdoppelt die cAMP-Produktion in der Anwesenheit von PTH. Von Analogen wird erwartet, dass sie ähnliche Induktionswirkungen aufweisen.
  • (c) Induktion einer Produktion von Osteocalcin in Osteoblasten
  • Osteocalcin ist ein knochenspezifisches Protein, das durch Osteoblasten hergestellt und in den Kreislauf sekretiert wird. Osteocalcin spielt bei der Regulation der Rate der Knochenmineralisierung in Säugern eine Rolle. Dementsprechend können Serumspiegel von Osteocalcin als ein Indikator einer Osteoblastenaktivität und Knochenbildung in vivo überwacht werden. In ähnlicher Weise kann die Induktion einer Synthese von Osteocalcin in mit Osteoblasten angereicherten Kulturen verwendet werden, um zu bestätigen, ob ein vermutliches OP-1-Analog tatsächlich systemische Wirkungen einer OP-1 Behandlung nachbilden kann.
  • Es werden Rattenosteoblasten präpariert und, wie vorstehend, in einer Mehr-Lochplatte kultiviert. Für eine Analyse von Osteocalcin beinhaltet das Medium 10 % FBS, wobei an Tag 2 die Zellen mit frischem Medium gefüttert werden, das mit frischem 10 mM β-Glycerophosphat (Sigma, Inc.,) ergänzt ist. Beginnend an Tag 5 und zweimal wöchentlich danach, werden die Zellen mit einem Mineralisations-Vollmedium gefüttert, das alle die vorstehend erwähnten Komponenten plus frischem L(+)-Ascorbat mit einer Endkonzentration von 50 mg/ml Medium beinhaltet. OP-1 oder OP-1-Analog wird dann direkt zu den Löchern zugegeben, beispielsweise in 50 % Acetonitril (oder 50 % Ethanol), das 0,1 % Trifluoressigsäure (TFA) bei nicht mehr als 5 mg OP-1/ml Medium beinhaltet. Kontrolllöcher erhalten lediglich Lösungsmittelträger. Die Zellen können anschließend erneut gefüttert und die konditionierte Mediumprobe kann 1:1 in einem standardisierten Radioimmuntest-Puffer verdünnt werden, der standardisierte Proteasehemmstoffe beinhaltet und bis zum Test auf Osteocalcin bei –20°C gelagert wird. Die Osteocalcinsynthese wird unter Verwendung eines standardisierten Radioimmuntests mit einem im Handel erhältlichen spezifischen gegen gerichteten Osteocalcin Antikörper erfasst und kann durch eine Northern-Blot-Analyse bestätigt werden, um die Menge von Osteocalcin mRNA zu berechnen, die in der Anwesenheit oder Abwesenheit von OP-1 oder einem OP-1-Analog hergestellt wurde. OP-1 induziert einen dosisabhängigen Anstieg bei der Osteocalcinproduktion (5-facher Anstieg unter Verwendung von 25 ng von Op-1 Protein/ml) und einen 20-fachen Anstieg in der Osteocalcin mRNA. Von Analogen wird erwartet, dass sie ähnliche Induktionswirkungen aufweisen.
  • Die Mineralisierung wird an Langzeit-Kulturen (13 Tage) unter Verwendung einer modifizierten von Kossa Färbetechnik an fixierten Zellschichten bestimmt: Die Zellen werden mit frischem 4 % Paraformaldehyd bei 23°C für 10 Min. fixiert, und anschließend in kalter 0,9 % NaCl-Lösung gespült. Die fixierten Zellen werden dann auf endogene alkalische Phosphatase bei einem pH-Wert 9,5 für 10 Min. unter Verwendung eines im Handel erhältliche Kits (Sigma, Inc., St. Louis, MO) gefärbt. Purpurfarben gefärbte Zellen werden dann mit Methanol dehydriert und luftgetrocknet. Nach 30 Min. Inkubation in 3 % AgNO3 im Dunklen werden die mit H2O gespülten Proben für 30 Sek. 254 nm UV-Licht ausgesetzt, um die schwarz silbrig gefärbten Phosphatknötchen zu entwickeln. Einzeln mineralisierte Herde bzw. Foki (mindestens 20 mm in der Größe) werden unter dem Präpariermikroskop gezählt und als Knötchen/Kultur ausgedrückt. OP-1 induziert einen 20-fachen Anstieg in der anfänglichen Mineralisierungsrate. Von Analogen wird erwartet, dass sie ähnliche Induktionswirkungen aufweisen.
  • Beispiel 5: Induktion von neuronalen Markern durch Morphogen-Analoge: CAM-Expression
  • Es wird weiterhin erwartet, dass die hier betrachteten OP-1 zweiten beziehungsweise und Morphogen-Analoge eine CAM-Expression, insbesondere eine N-CAM-Expression, als Teil deren Induktion einer Morphogenese induzieren werden. CAMs sind morphoregulatorische Moleküle, die in allen Geweben, insbesondere in Nervengeweben, als ein wesentlicher Schritt bei der Gewebedifferenzierung identifiziert wurden. Die N-CAMs, die mindestens 3 Isoformen (N-CAM-180, N-CAM-140 und N-CAM-120, wobei "180", "140" und "120" die offenbaren Molekulargewichte der Isoformen anzeigen, die durch Polyacrylamid-Gel-Elektrophorese erfasst wurden) umfassen, werden mindestens vorübergehend in sich differenzierenden Geweben und dauerhaft in Nervengewebe exprimiert. Sowohl die N-CAM-180 als auch die N-CAM-140 Isoformen werden in sowohl sich differenzierendem als auch erwachsenem Gewebe exprimiert. Die N-CAM-120 Isoform wird lediglich in erwachsenem Gewebe aufgefunden. Ein anderes neurales CAM ist L1.
  • N-CAMs sind vorzugsweise als Indikatoren von neuronenspezifischen Gewebemorphogenen oder Analogen davon nützlich. Sie sind an einer angemessenen neuronalen Entwicklung, einschließlich einer geeigneten Neuroulation bzw. Neurulation, Neuronenmigration, Faszikelbildung und Synapsenbildung beteiligt. Ein Hemmung der N-CAM-Produktion, wie beispielsweise durch Komplexieren des Moleküls mit einem spezifischen N-CAM-Antikörper, hemmt die Retinaorganisation, einschließlich der retinalen Axonmigration und der Axonregeneration in dem peripheren Nervensystem, als auch einer Synapsenbildung eines Axons mit Zielmuskelzellen. Außerdem zeigen signifikante Belege, dass körperliches und chemisches Trauma an Neuronen, oncogene Transformation und einige genetische neuronale Störungen durch Änderungen bei der CAM-Expression begleitet sind, wodurch das adhäsive oder migratorische Verhalten jener Zellen geändert ist. Weiterhin wird berichtet, dass erhöhte N-CAM-Spiegel bei einer Huntington's Erkrankung im Striatum (beispielsweise striatale Basalganglien) und eine verringerte Adhäsion bei der Alzheimer Erkrankung bemerkt werden.
  • Von OP-1 zweite beziehungsweise und Morphogen-Analogen, die hier betrachtet werden, wird erwartet, dass sie eine CAM-Produktion, insbesondere eine L1 und eine N-CAM-Produktion, einschließlich aller drei Isoformen des N-CAM-Moleküls stimulieren. Die N-CAM-Expression kann beispielsweise signifikant in mit Morphogen behandelten NG108-15 Zellen, wie vorher in USSN-08/260,675 und in Perides et al. (1994) J. Biol. Chem. 269: 765-770 und (1993) J. Biol. Chem. 268: 25197-25205, beschrieben, stimuliert werden.
  • Die NG108-15 ist eine transformierte hybride Zelllinie (Neuroblastom X Gliom, American Type Culture Collection, Rockville, MD), die eine charakteristische Morphologie von transformierten embryonalen Neuronen zeigt. Unbehandelte NG108-15 Zellen zeigen eine fibroblastische oder minimal differenzierte Morphologie und exprimieren lediglich die 180 und 140 Isoformen von N-CAM, die normalerweise mit einer sich entwickelnden Zelle assoziiert sind. Folgend auf eine Morphogen-, beispielsweise OP-1, Behandlung zeigen jene Zellen eine Morphologie, die für erwachsene Neuronen charakteristisch ist und exprimieren erhöhte Spiegel von allen drei N-CAM-Isoformen. Unter Verwendung eines Protokolls, das zu dem nachfolgend beschriebenen ähnlich ist, wird die Behandlung von NG108-15 Zellen mit OP-1 oder Morphogen-Analogen zu dem gleichen Ausmaß, wie das echte OP-1, eine L1-Expression induzieren.
  • NG108-15 Zellen werden für 4 Tage in der Anwesenheit erhöhter Konzentrationen von OP-1 oder OP-1-Analogen kultiviert, wobei anschließend standardisierte Western-Blots an Gesamtzellextrakten ausgeführt werden. N-CAM Isoformen werden mit einem Antikörper, mAb H28.123, detektiert, der mit allen drei Isoformen kreuzreagiert, der von Sigma Chemical Co., St. Louis erhalten wird, wobei die unterschiedlichen Isoformen durch deren unterschiedlichen Mobilitäten auf einem Elektrophoresegel unterschieden werden. Kontrollen von NG-108-15 Zellen (unbehandelt) werden sowohl die 140 kDa als auch die 180 kDA Isoformen, jedoch nicht die 120 kDa exprimieren, wie durch Western-Blot-Analysen unter Verwendung von bis zu 100 mg Protein bestimmt wurde. Die Behandlung von NG108-15 Zellen mit OP-1 wird zu einer dosisabhängigen Zunahme in der Expression der 180 kDa und 140 kDa Isoformen, als auch zu der Induktion der 120 kDA Isoform führen. Außerdem wird ein Anstieg in der N-CAM-Expression einer dosisabhängigen Art der Morphogeninduktion von mehrzelligen Aggregaten entsprechen. Standardisierte Immunlokalisation-Untersuchungen, die mit dem mAb H28.123 an behandelten Zellen ausgeführt wurden, werden zeigen, dass eine N-CAM-Clusterbildung mit der Peripherie und Fortsätzen von behandelten Zellen assoziiert sind. Außerdem wird eine Behandlung die Zellteilung, wie durch eine Zellzählung oder durch 3H-Thymidin-Aufnahme bestimmt, nicht gehemmt. Weiterhin können jene Zellaggregationswirkungen von OP-1 oder OP-1-Analogen auf NG108-15 Zellen mit Anti-N-CAM Antikörpern oder Antisense-N-CAM Oligonukleotiden gehemmt werden. Antisense-Oligonukleotide können synthetisch an einem Nukleotid-Synthesizer unter Verwendung von im Stand der Technik bekannter standardisierter Mittel hergestellt werden. Vorzugsweise werden Phosphorothioat-Oligonukleotide ("S-Oligos") hergestellt, um einen Transport der Nukleotide über die Zellmembranen zu erhöhen. Die Konzentrationen von sowohl N-CAM Antikörpern als auch N-CAM Antisense-Oligonukleotiden, die geeignet bzw. ausreichend sind die N-CAM-Induktion zu hemmen, werden ebenfalls die Bildung mehrschichtiger Zellaggregate hemmen. Insbesondere wird eine Inkubation von NG108-115 bzw. NG108-15 Zellen mit 0,3-3 mM N-CAM Antisense S-Oligos, 5-500 mM nicht modifizierten N-CAM Antisense-Oligos, oder 10 mg/ml mAb H28.123 die Zellaggregation signifikant hemmen.
  • Die Wirksamkeit einer Behandlung mit Morphogen-Analog auf die N-CAM-Expression in vivo kann durch eine Gewebebiopsie unter Verwendung von Routineverfahren und Immunhistochemie durch Detektieren von N-CAM-Molekülen mit einem N-CAM spezifischen Antikörper, wie beispielsweise mAb H28.123, bewertet werden. Alternativ können der Spiegel von N-CAM-Proteinen oder Proteinfragmenten, die in der zerebrospinalen Flüssigkeit oder im Serum vorhanden sind, ebenfalls verwendet werden, um die Wirkung einer Behandlung zu beurteilen. N-CAM-Moleküle sind bekannt sich von den Zelloberflächen abzulösen und wurden sowohl im Serum und der zerebrospinal Flüssigkeit detektiert. Außerdem sind geänderte Spiegel der löslichen Form von N-CAM mit dem normalen Wasserkopf-(Hydrozephalus)-Druck und Typ II Schizophrenie assoziiert. Die Flüssigkeitsspiegel von N-CAM können unter Verwendung eines spezifischen Antikörpers gegen N-CAM, wie beispielsweise mAbH28.123, unter Verwendung von routinemäßigen Immuntestverfahren detektiert werden.
  • Beispiel 6: Allgemeine Betrachtungen zur Formulierung und Verabreichung
  • Morphogen-Analoge, einschließlich OP-1-Analogen, können zur Verabreichung an einen Säuger, vorzugsweise einen dafür bedürftigen Menschen als Teil einer pharmazeutischen Zusammensetzung formuliert sein. Die Zusammensetzung kann durch geeignete Mittel, beispielsweise parenteral, oral, oder lokal verabreicht werden. Dort wo das Morphogen-Analog lokal, wie durch Injektion, an eine erwünschte Gewebestelle zu verabreichen ist, oder systemisch, wie beispielsweise durch intravenöse, subkutane, intramuskuläre, intraorbitale, ophthalmische, intraventrikuläre, intrakraniale, intrakapsuläre, intraspinale, intracisternale, intraperitoneale, bukkale, rektale, vaginale, intranasale oder durch eine Aerosol-Verabreichung erfolgt, umfasst die Zusammensetzung vorzugsweise eine wässrige Lösung. Die Lösung liegt vorzugsweise physiologisch verträglich vor, so dass eine Verabreichung davon an einen Säuger das normale Gleichgewicht der Elektrolyte und das Flüssigkeitsvolumen nicht nachteilig beeinflusst. Die wässrige Lösung kann folglich beispielsweise eine normale physiologische Salzlösung (0,9 % NaCl; 0,15 M), pH-Wert 7-7,4 umfassen.
  • Nützliche Lösungen für eine orale oder parenterale systemische Verabreichung können durch im pharmazeutischen Fachgebiet wohl bekannte beliebige Verfahren, die beispielsweise in Remington's Pharmaceutical Sciences, (Gennaro, A., ed., Mack Pub., 1990) beschrieben sind, hergestellt werden. Die Formulierungen können, beispielsweise, Polyalkylenglycole, wie beispielsweise Polyethylenglycol, Öle pflanzlichen Ursprungs, hydrogenierte Naphthaline und dergleichen einschließen. Die Formulierungen für eine direkte Verabreichung können insbesondere Glycerol und andere Zusammensetzungen einer hohen Viskosität einschließen. Biologisch verträgliche, vorzugsweise biologisch resorbierbare Polymere, einschließlich beispielsweise, Hyaluronsäure, Kollagen, Tricalciumphosphat, Polybutyrat, Polylactid, Polyglycolid und Lactid/Glycolid-Kopolymere können nützliche Arzneistoffträger sein, um die Freisetzung des Morphogen-Analogs in vivo zu steuern.
  • Andere nützliche parenterale Zuführungssysteme für die vorliegenden Analogen können Ethylenvinylacetat-Kopolymer-Teilchen, osmotische Pumpen, implantierbare Systeme und Liposomen einschließen. Formulierungen für eine Inhalationsverabreichung kann als Arznei stoffträger, beispielsweise Laktose beinhalten, oder kann wässrige Lösungen, beispielsweise Polyoxyethylen-9-laurylether, Glycocholat oder Desoxycholat beinhalten oder ölhaltige Lösungen zu einer Verabreichung in der Form von Nasentropfen oder als ein Gel, das intranasal aufgetragen werden soll.
  • Alternativ können die Morphogen-Analoge, einschließlich die OP-1-Analoge, die hier als identifiziert beschrieben sind, oral verabreicht werden. Flüssige Formulierungen von Morphogen-Analogen können gemäß standardisierter Praktiken, wie beispielsweise jenen in Remington's Pharmaceutical Sciences, (Gennaro, A., ed., Mack Pub., 1990) beschriebenen, hergestellt werden. Derartige flüssige Formulierungen können zu einem Getränk oder einer anderen Lebensmittelergänzung zur Verabreichung zugegeben werden. Alternativ können feste Formulierungen unter Verwendung von im Stand der Technik anerkannten Emulgatoren in Tabletten, Kapseln oder Pastillen hergestellt werden, die zur oralen Verabreichung geeignet sind.
  • Wahlweise können die Analoge in Zusammensetzungen formuliert sein, die Mittel zur erhöhten bzw. verstärkten Aufnahme des Analogs durch ein erwünschtes Gewebe umfassen. Tetrazyklin und Diphosphonat (Bisphosphonate) sind beispielsweise bekannt an Knochenmineralien, insbesondere an Zonen eines Knochenumbaus, zu binden, wenn sie in einem Säuger systemisch bereitgestellt werden. Dementsprechend können derartige Komponenten verwendet werden, um eine Zuführung der vorliegenden Analoge durch das Knochengewebe zu erhöhen. Alternativ können ein Antikörper oder ein Teil davon, der an eine zugängliche Substanz spezifisch bindet, die mit einem erwünschten Zielgewebe, wie beispielsweise einem Zelloberflächen-Antigen assoziiert vorliegt, ebenfalls verwendet werden. Falls erwünscht, können derartige spezifische zielende bzw. Target-Moleküle an die vorliegenden Analoge, beispielsweise durch chemisches Vernetzen, oder unter Verwendung standardisierter Gentechnikverfahren, kovalent gebunden werden, um beispielsweise eine säureempfindliche Bindung, wie beispielsweise eine Asp-Pro-Bindung zu erzeugen. Nützliche Target-Moleküle können beispielsweise gemäß den Lehren von US-5,091,513 gestaltet werden.
  • Die vorliegenden Analoge können immer noch weiter an den dafür bedürftigen Säuger entweder alleine oder in Kombination mit einer anderen Substanz verabreicht werden, die bekannt ist eine vorteilhafte Wirkung auf die Gewebemorphogenese aufzuweisen. Beispiele derartiger Substanzen, (hier, Kofaktoren) schließen Substanzen ein, die eine Gewebereparatur und Regeneration und/oder eine Hemmung einer Entzündung fördern. Beispiele nützlicher Kofaktoren zur Stimulation eines Wachstums von Knochengewebe in osteoporotischen Individuen, umfassen beispielsweise, sind jedoch nicht beschränkt auf Vitamin D3, Calcitonin, Prostaglandine, Nebennierenhormon, Dexamethason, Östrogen und IGF-I oder IGF-II. Nützliche Kofaktoren für eine Nervengewebereparatur und Regeneration kann Nerven-Wachstumsfaktoren einschließen. Andere nützliche Kofaktoren umfassen die die Symptome lindernden Kofaktoren, einschließlich Antiseptika, Antibiotika, Antivirusmitteln und Anti-Pilz-Mitteln und Analgetika und Anästhetika.
  • Analoge werden vorzugsweise in pharmazeutischen Zusammensetzungen durch Beimischung von pharmazeutisch verträglichen, nicht toxischen Arzneistoffträgern und Trägern formuliert. Wie vorstehend angemerkt, können derartige Zusammensetzungen zur systemischen, beispielsweise parenteralen, Verabreichung, insbesondere in der Form von flüssigen Lösungen oder Suspensionen, zur oralen Verabreichung, insbesondere in der Form von Tabletten oder Kapseln, oder intranasal, insbesondere in der Form von Pulvern, Nasentropfen oder Aerosolen hergestellt werden. Wird eine Adhäsion an einer Gewebeoberfläche erwünscht, dann kann die Zusammensetzung ein Fibrinogen-Thrombin-Dispergiermittel oder ein anderes biologisches Haftmittel, wie beispielsweise in der PCT/US91/09275 offenbart, umfassen. Die Zusammensetzung kann anschließend aufgemalt, gesprüht oder auf andere Weise auf die erwünschte Gewebeoberfläche aufgebracht werden.
  • Die Zusammensetzungen können für eine parenterale oder orale Verabreichung an Menschen oder andere Säuger in therapeutisch wirksamen Mengen, beispielsweise Mengen, formuliert sein, die dem Zielgewebe für eine angemessene Zeit eine geeignete Konzentrationen des Morphogen-Analogs bereitstellt, um die erwünschte Wirkung zu induzieren. Vorzugsweise lindern bzw. milder oder schwächen die vorliegenden Zusammensetzungen den Bedarf des Säugers für eine Morphogen assoziierte biologische Antwort ab, wie beispielsweise eine Aufrechterhaltung einer gewebespezifischen Funktion oder Wiederherstellung eines gewebe spezifischen Phänotyps gegenüber seneszenten Geweben (beispielsweise osteoporotischen Knochengewebe).
  • Dem Fachmann wird klar sein, dass die Konzentrationen der vorliegenden Morphogen-Analoge in den Zusammensetzungen, die zur Verabreichung an Säuger formuliert sind, von einer Anzahl von Faktoren abhängig variieren werden, die die Dosierung des zu verabreichenden bestimmten Analogs, den chemischen Eigenschaften (beispielsweise Hydrophobizität) des verwendeten Analogs, der Verabreichungsroute und der Häufigkeit oder Dauer der Verabreichung einschließen. Die bevorzugte Dosierung eines zu verabreichenden Analogs wird wahrscheinlich ebenfalls von derartigen Variablen, wie dem Typ und dem Ausmaß eines Gewebeverlustes oder Defektes, dem allgemeinen Gesundheitszustand des bestimmten Säugers, der relativen biologischen Wirksamkeit oder Toxizität des gewählten Analogs, der Formulierung der Verbindung und der Anwesenheit und den Typen von Arzneistoffträgern in der Formulierung abhängig sein
  • SEQUENCE LISTING
    Figure 00480001
  • Figure 00490001
  • Figure 00500001

Claims (15)

  1. Säugerzelle zur induzierbaren Expression eines Morphogens, umfassend: (a) eine erste DNA, die das Morphogen codiert; (b) eine zweite DNA, die in operativer Transkriptionsbeziehung mit der ersten DNA steht, worin die Sequenz der zweiten DNA die Nukleotide 697-728 des Maus Kollagen Typ X Promotors (SEQ. ID. Nr. 1) umfaßt; worin die Zelle eine proteinartige intrazelluläre Substanz produziert, die allgemeine immunologische Eigenschaften eines Proteins der fos-Familie aufweist, worin die proteinartige intrazelluläre Substanz an die zweite DNA bindet, um die Expression des Morphogens, das durch die erste DNA codiert wird, zu stimulieren, wenn die Zelle mit OP-1 in Kontakt gebracht wird.
  2. Zelle nach Anspruch 1, worin die Sequenz der zweiten DNA weiter die Nukleotide 682-696 und 729-731 des Maus Kollagen Typ X Promotors (SEQ. ID. Nr. 1) aufweist.
  3. Zelle nach Anspruch 2, worin die Sequenz der zweiten DNA weiter die Nukleotide 732-761 des Maus Kollagen Typ X Promotors (SEQ. ID. Nr. 1) aufweist.
  4. Zelle nach einem der Ansprüche 1 bis 3, worin das Morphogen OP-1 ist.
  5. Säugerzelle für die OP-1 induzierbare Expression eines Genprodukts, umfassend: (a) eine erste DNA, die das Genprodukt codiert, worin das Genprodukt ein Enzym, ein Wachstumsfaktor, ein Lymphokin, ein Cytokin oder ein Gerinnungsfaktor ist; (b) eine zweite DNA in operativer Transkriptionsbeziehung mit der ersten DNA, worin die Sequenz der zweiten DNA die Nukleotide 697-728 des Maus Kollagen Typ X Promotors (SEQ. ID. Nr. 1) umfaßt; worin die Zelle eine proteinartige intrazelluläre Substanz produziert, die allgemeine immunologische Eigenschaften eines Proteins der fos-Familie aufweist, worin die proteinartige intrazelluläre Substanz an die zweite DNA bindet, um die Expression des Genprodukts, das durch die erste DNA codiert wird, zu stimulieren, wenn die Zelle mit OP-1 in Kontakt gebracht wird.
  6. Zelle nach Anspruch 5, worin die Sequenz der zweiten DNA weiter die Nukleotide 682-696 und 729-731 des Maus Kollagen Typ X Promotors (SEQ. ID. Nr. 1) aufweist.
  7. Zelle nach Anspruch 6, worin die Sequenz der zweiten DNA weiter die Nukleotide 732-761 des Maus Kollagen Typ X Promotors (SEQ. ID. Nr. 1) aufweist.
  8. Verwendung der Zelle nach Anspruch 4 zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung einer Stoffwechselerkrankung des Knochens in einem Säuger.
  9. Verwendung nach Anspruch 8, worin die Stoffwechselerkrankung des Knochens durch Osteopenie gekennzeichnet ist.
  10. DNA, die einen Morphogen-vermittelten biologischen Effekt induziert, und eine DNA umfaßt, welche definiert (a) ein auf ein Morphogen ansprechendes, die Transkription aktivierendes Element des Maus Kollagen Typ X Promotors, das die Nukleotide 697-728 (SEQ. ID. Nr. 1) umfaßt und eine AP-1 Bindungsstelle aufweist, und mit einem Promotor operativ verknüpft ist, der zu dem Maus Kollagen Typ X Promotor heterolog ist, und (b) eine Klonierungsstelle, die zur Insertion eines Gens geeignet ist, das ein Genprodukt mit einer biologischen Aktivität codiert, worin, wenn das Gen in die Klonierungsstelle inseriert ist, das Gen operativ mit dem auf das Morphogen ansprechenden, die Transkription aktivierenden Element assoziiert ist, so dass das biologisch aktive Genprodukt hergestellt wird; worin die DNA, wenn sie in einer auf das Morphogen ansprechenden, die mit einem Morphogen in Kontakt gebrachten Zelle, vorhanden ist, dazu dient, die Transkription des inserierten Gens zu induzieren.
  11. DNA nach Anspruch 10, worin das Genprodukt ein Polypeptid ist, das durch Gewebe, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Niere, Knochen, Leber und Nervengewebe natürlich hergestellt wird.
  12. DNA nach Anspruch 11, worin das Genprodukt ein Morphogen-Polypeptid ist.
  13. DNA nach Anspruch 12, worin das Morphogen-Polypeptid ein OP-1-Polypeptid ist.
  14. DNA nach Anspruch 10, worin das auf das Morphogen ansprechende, die Transkription aktivierende Element ein auf OP-1-ansprechendes, die Transkription aktivierendes Element ist.
  15. DNA nach Anspruch 10, worin die AP-1-Bindungsstelle die Sequenzen der SEQ. ID. Nr. 2 und der SEQ. ID. Nr. 3 umfassen.
DE69637242T 1995-07-26 1996-07-22 Methode und zusammensetzungen zur identifizierung von morphogen-analogen Expired - Lifetime DE69637242T2 (de)

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