DE69725205T2 - Befestigung von Biomolekülen - Google Patents
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Description
- Die vorliegende Erfindung betrifft ein oxidatives Verfahren zum Binden eines Protein- oder Peptidbiomoleküls, das eine 2-Aminoalkohol-Einheit umfasst, an eine Substratoberfläche, die eine primäre Amin-Einheit umfasst, z. B. an die Oberfläche einer geeigneten medizinischen Vorrichtung, um zum Beispiel die biologischen und physikalischen Eigenschaften einer Substratoberfläche zu verbessern.
- Seit vielen Jahren wird eine Reihe medizinischer Vorrichtungen, zum Beispiel Schrittmacher, Gefäßtransplantate, Stents, Herzklappen usw., die mit Körpergewebe oder -flüssigkeiten lebender Personen oder Tiere in Kontakt kommen, entwickelt, hergestellt und klinisch verwendet. Ein Hauptproblem bei diesen Vorrichtungen ist, dass ihre Oberflächen dazu neigen, eine Schicht von Proteinen aus Geweben und Flüssigkeiten, wie Tränen, Urin, Lymphflüssigkeit, Blut, Blutprodukten und anderen aus Blut stammenden Flüssigkeiten und Feststoffen, zu adsorbieren. Es wird angenommen, dass die Zusammensetzung und der Aufbau dieser adsorbierten Proteinschicht weitere biologische Reaktionen beeinflusst, wenn nicht gar steuert. Nachteilige biologische Reaktionen, wie Thrombose und Entzündung, können die Haltbarkeitsdauer vieler Vorrichtungen verringern.
- Implantierbare medizinische Vorrichtungen können auch dazu neigen, als Fokusse für eine Infektion des Körpers durch eine Anzahl von Bakterienspezies zu dienen. Diese mit Vorrichtungen zusammenhängenden Infektionen werden durch die Neigung dieser Organismen gefördert, an der Oberfläche der Vorrichtung zu haften und diese zu besiedeln. Folglich ist es für Ärzte und die medizinische Industrie von großem Interesse, Oberflächen von in medizinischen Vorrichtungen verwendeten Materialien zu entwickeln, die weniger dafür empfänglich sind, die nachteiligen biologischen Reaktionen zu fördern, die gewöhnlich mit der Implantation einer Vorrichtung einhergehen.
- Ein Ansatz, ungewünschte biologische Reaktionen in Verbindung mit medizinischen Vorrichtungen zu minimieren, ist die Bindung verschiedener Biomoleküle an deren Oberfläche für das Anheften und das Wachstum einer Zellschicht, die der Körper annimmt. Biomoleküle, wie Wachstumsfaktoren, Zellanheftungsproteine und Zellanheftungspeptide, sind zu diesem Zweck eingesetzt worden. Außerdem wurden Biomoleküle, wie Antithrombotika, Antiplättchen-, entzündungshemmende und antimikrobielle Mittel und dgl., zur Minimierung nachteiliger, mit dem Biomaterial einhergehender Reaktionen verwendet.
- Eine Reihe von Ansätzen wurde für die Bindung solcher Biomoleküle vorgeschlagen. US-A-4 642 242 offenbart zum Beispiel ein Verfahren zur Bindung von Heparin an ein Polyurethanpolymer durch teilweise Depolymerisation des Heparins, so dass funktionelle Aldehydgruppen erhalten werden, die dann mit Amingruppen im Polyurethanpolymer-Material umgesetzt werden. Andere Ansätze erfordern gewöhnlich die Verwendung von Kupplungsmolekülen, wie Glutaraldehyd, Cyanogenbromid, p-Benzochinon, Bernsteinsäureanhydride, Carbodiimide, Diisocyanate, Ethylchlorformiat, Dipyridylsulfid, Epichlorhydrin und Azide, die als Bindungsvehikel zum Kuppeln von Biomolekülen an Substratoberflächen dienen. Zum Beispiel ist die kovalente Bindung von Biomolekülen unter Verwendung wasserlöslicher Carbodiimide von Hoffman et al., "Covalent Binding of Biomolecules to Radiation-Grafted Hydrogels on Inert Polymer Surfaces", Trans. Am. Soc. Artif. Intern. Organs 18: 10–18(1972) und Ito et al., "Materials for Enhancing Cell Adhesion by Immobilization of Cell-Adhesive Peptide", J. Biomed. Mat. Res. 25: 1325–1337 (1991) beschrieben.
- Die Addition von Kupplungsmolekülen an die Substratoberflächen medizinischer Vorrichtungen kann jedoch die Instabilität der Oberflächen verursachen und die Möglickeit vergrößern, dass das gebundene Biomolekül in der Kupplungsschicht verborgen ist. Kupplungsmoleküle können auch unerwünschte Vernetzungen zwischen den Biomolekülen herstellen oder Vernetzungen zwischen funktionellen Stellen der Oberfläche schaffen, wodurch die Bindung verhindert wird oder die biologischen Eigenschaften der Biomoleküle zerstört werden. Die Verwendung von Kupplungsmolekülen tendiert auch zu einer Verminderung der Spezifität der Bindung des Biomoleküls an die Substratoberfläche, wodurch die Konformationskontrolle über den Anheftungsvorgang verloren geht.
- Was somit benötigt wird, ist ein alternatives Verfahren zur Bindung von Biomolekülen an eine Substratoberfläche, z. B. an die Oberfläche einer medizinischen Vorrichtung, insbesondere ein Verfahren, das keine Verwendung von Kupplungsmolekülen erfordert.
- Wir haben jetzt ein Verfahren zur direkten Bindung eines Protein- oder Peptidbiomoleküls, das eine 2-Aminoalkohol-Einheit umfasst, an eine Substratoberfläche, die eine primäre Amin-Einheit umfasst, entwickelt.
- Somit stellt die Erfindung unter einem Aspekt ein Verfahren zur Bindung eines Protein- oder Peptidbiomoleküls, das eine 2-Aminoalkohol-Einheit umfasst, an eine Substratoberfläche, die eine primäre Amin-Einheit umfasst, bereit, wobei das Verfahren die Schritte umfasst:
- (a) Behandeln des Proteins oder Peptids mit einem Periodat, um ein Protein oder Peptid mit Aldehydfunktion herzustellen,
- (b) Umsetzen des Proteins oder Peptids mit Aldehydfunktion mit der Substratoberfläche, um die Substratoberfläche über eine Imin-Einheit mit diesem zu verbinden, und
- (c) Behandeln des erhaltenen Materials mit einem Reduktionsmittel, um eine sekundäre Amin-Bindung herzustellen.
- Vorzugsweise umfasst das erfindungsgemäße Verfahren die Schritte: Vereinigen eines Periodats mit einem Proteinoder einem Peptidbiomolekül, das eine 2-Aminoalkohol-Einheit besitzt, unter Herstellung eines Biomoleküls mit Aldehydfunktion in einer wässrigen Lösung mit einem pH von etwa 4–9 und einer Temperatur von etwa 0–50°C, Vereinigen des Biomoleküls mit Aldehydfunktion mit einer Substratoberfläche, die eine primäre Amin-Einheit umfasst, um das Biomolekül über eine Imin-Einheit an der Substratoberfläche zu immobilisieren, und Umsetzen der Imin-Einheit mit einem Reduktionsmittel, um ein immobilisiertes Biomolekül auf der Substratoberfläche durch eine sekundäre Aminbindung herzustellen.
- Ein "Biomaterial" kann als ein Material definiert werden, das in Körperflüssigkeiten im Wesentlichen unlöslich ist und das so gestaltet und aufgebaut ist, dass es im oder auf dem Körper untergebracht werden kann, oder dass es mit Flüssigkeiten des Körpers in Kontakt tritt. Idealerweise induziert ein Biomaterial keine unerwünschten Reaktionen im Körper, wie Blutgerinnung, Gewebetod, Tumorbildung, allergische Reaktion, Fremdkörperreaktion (Abstoßung) oder Entzündungsreaktion; es hat die physikalischen Eigenschaften, wie Festigkeit, Elastizität, Durchlässigkeit und Biegsamkeit, die erforderlich sind, damit es dem beabsichtigten Zweck dienen kann; es kann leicht gereinigt, hergestellt und sterilisiert werden und behält im Wesentlichen seine physikalischen Eigenschaften und seine Funktion während der Zeit, die es im oder in Kontakt mit dem Körper implantiert bleibt. Für die Verwendung bei dem erfindungsgemäßen Verfahren geeignete Biomaterialien umfassen solche, die eine 2-Aminoalkohol- und/oder eine Amin-Einheit umfassen.
- Eine "medizinische Vorrichtung" kann als eine Vorrichtung definiert werden, die Oberflächen hat, die mit Gewebe, Blut oder anderen Körperflüssigkeiten im Verlauf ihres Betriebs in Kontakt treten, wobei die Flüssigkeiten anschließend in Patienten eingesetzt werden. Dies kann zum Beispiel extrakorporale Vorrichtungen zur Verwendung in der Chirurgie, wie Blutoxygenatoren, Blutpumpen, Blutsensoren, Schläuche zum Leiten von Blut und dgl. umfassen, die mit Blut in Kontakt treten, das dann in den Patienten zurückgeführt wird. Dies kann auch Endoprothesen umfassen, die in Blutkontakt in einen Menschen- oder Tierkörper implantiert werden, wie Gefäßtransplantate, Stents, Schrittmacherleitungen, Herzklappen und dgl., die in Blutgefäße oder in das Herz implantiert werden. Dies kann auch Vorrichtungen zur temporären intravaskulären Verwendung umfassen, wie Katheter, Leitungsdrähte und dgl., die in die Blutgefäße oder in das Herz zum Zweck der Überwachung oder Reparatur eingebracht werden.
- Protein- oder Peptidbiomoleküle, die Kohlenstoff-Kohlenstoff-Bindungen mit einer Amin-Einheit in Nachbarschaft zu einer Hydroxyl-Einheit besitzen (d. h. eine 2-Aminoalkohol-Einheit), sind mit Periodat oxidierbar (siehe beispielsweise US-A-5 362 852), das als Periodsäure oder Salze davon, wie Natriumperiodat, Kaliumperiodat oder andere Alkalimetallperiodate, bereitgestellt werden kann. Gewöhnlich wird eine stöchiometrische Menge Periodat zur Oxidation der 2-Aminoalkohol-Einheit verwendet, obwohl ein Überschuss verwendet werden kann. Die Oxidation solcher Materialien bildet reaktive Aldehyd-Einheiten.
- Die Oxidation wird geeigneterweise in einer wässrigen Lösung, vorzugsweise in einer wässrigen gepufferten Lösung, bei einer Temperatur durchgeführt, die die biologischen Eigenschaften des Biomoleküls nicht zerstört. Gewöhnlich können Puffer mit einem pH im Bereich von etwa 4–9 verwendet werden, wobei ein pH von etwa 6–8 für bestimmte pH empfindliche Biomoleküle erwünscht ist. Gewöhnlich wird die Oxidation bei einer Temperatur von etwa 0–50°C und vorzugsweise bei einer Temperatur von etwa 4–37°C durchgeführt. Je nach dem Biomolekül können die Oxidationsreaktionen für nur wenige Minuten bis zu sogar mehreren Tagen durchgeführt werden. Gewöhnlich ist die Oxidation innerhalb von 24 Stunden beendet. Langzeit-Oxidationsreaktionen werden vorzugsweise im Dunkeln durchgeführt, um "Überoxidation" zu verhindern.
- Die Behandlungszeiten und die Temperaturen für das Oxidationsverfahren sind in der Regel umgekehrt proportional zueinander. D. h. höhere Behandlungstemperaturen erfordern vergleichsweise kürzere Behandlungszeiten. Die Beschränkungen von Zeit und Temperatur werden durch die Wirkung der Behandlung auf die biologische Stabilität des Biomoleküls bestimmt. Es gibt einen breiten Spielraum für die Bestimmung der richtigen Bedingungen für ein bestimmtes Proteinoder Peptidsystem, und diese Bedingungen können vom Fachmann durch Routineexperimente beim Lesen der hier dargestellten Information leicht bestimmt werden.
- Nach der Oxidation kann die Reaktionslösung vor der Bindung an eine Substratoberfläche bei einer Temperatur von etwa 4°C aufbewahrt werden. Gewöhnlich kann die Lagerungsstabilität der Reaktionslösung bei neutralem pH oder leicht saurem pH 1–14 Tage und, bei Lagerung im Dunkeln, manchmal sogar Monate dauern. Üblicherweise kann die Oxidation der 2-Aminoalkohol-Einheit zur Bildung von zwei verschiedenen Materialien mit Aldehyd-Funktionen führen. Wenn gewünscht, können diese Materialien mit Aldehyd-Funktionen durch eine Mehrzahl bekannter Techniken auf der Basis der Affinität, des Molekulargewichts usw. getrennt werden.
- Die erhaltenen Aldehyd-Einheiten können für die kovalente Bindung der Protein- oder Peptidbiomoleküle mit Stellen auf einer Substratoberfläche in Wechselwirkung treten. Diese Bindungsstellen der Substratoberfläche umfassen Amin- Einheiten, die mit Aldehyd-Einheiten unter Bildung von Iminen reagieren. Die Substratoberfläche, an die das Biomolekül gekuppelt werden soll, sollte eine für die Bindung der gewünschten Anzahl an Biomolekülen angemessene Dichte an Amin-Einheiten enthalten.
- Substrate, die keine Amine auf ihrer Oberfläche enthalten, können durch eine Reihe von dem Fachmann bekannten Verfahren leicht aminiert werden. Zum Beispiel können Amine durch Plasmabehandlung von Materialien mit Ammoniakgas bereitgestellt werden, wie von Holmes und Schwartz, "Amination of Ultra-high Strength Polyethylene using Ammonia Plasma", Composites Science and Technology 38: 1–21(1990), beschrieben. Alternativ können Amine durch Pfropfen von Acrylamid auf das Substrat, gefolgt von chemischer Modifikation zum Einbringen von Amin-Einheiten durch dem Fachmann bekannte Verfahren bereitgestellt werden. Polyvinylamine oder Polyalkylimine können ebenfalls gemäß dem in US-A-4 521 564 (Solomone et al.) beschriebenen Verfahren an Polyurethan-Oberflächen kovalent gebunden werden. Alternativ kann z. B. Aminosilan an eine Oberfläche gebunden werden, wie in US-A-5 053 048 (Pinchuk) beschrieben, ein acrylamidhaltiges Propfpolymer mittels strahlungschemischer Pfropfung, wie in US-A-3 826 678 (Hoffman et al.) beschrieben, gebunden werden oder ein N-(3-Aminopropyl)-methacrylamidhaltiges Pfropfpolymer durch Cerionen-Pfropfung, wie in US-A-5 344 455 (Keogh et al.) beschrieben, gebunden werden.
- Wenn eine Aldehyd-Einheit (RCH(O)) mit einer primären Amin-Einheit (-NH2) reagiert, stellt sich gewöhnlich ein Gleichgewicht mit dem Reaktionsprodukt ein, das eine relativ instabile Imin-Einheit (-N=CHR) ist. Diese Kopplungsreaktion kann unter den gleichen Bedingungen durchgeführt werden, wie vorstehend für die Oxidation beschrieben, die so ausgelegt sind, dass sie das Protein- oder Peptidbiomolekül vor Schaden schützen. Zur Stabilisierung der Bindung zwischen dem Biomolekül und der Substratoberfläche wird ei ne anschließende reduktive Alkylierung der Imin-Einheit unter Verwendung eines Reduktionsmittels (d. h. eines Stabilisierungsmittels), wie beispielsweise Natriumborhydrid, Natriumcyanoborhydrid und Aminboranen, durchgeführt, so dass ein sekundäres Amin (-NH-CH2-R) hergestellt wird. Diese Umsetzung kann ebenfalls unter den gleichen Bedingungen, wie vorstehend für die Oxidation beschrieben, durchgeführt werden. Jedoch werden gewöhnlich die Kopplungs- und Stabiliserungsreaktion in einer neutralen oder leicht basischen Lösung und bei einer Temperatur von etwa 0–50°C durchgeführt. Vorzugsweise betragen für die Kopplungs- und Stabilisierungsreaktionen der pH etwa 6–10 und die Temperatur etwa 4–37°C. Diese Umsetzungen (Kopplung und Stabilisierung) kann man für nur einige Minuten oder viele Stunden ablaufen lassen. In der Regel sind diese Umsetzungen innerhalb von 24 Stunden beendet (d. h. gekoppelt und stabilisiert).
- Gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren geeignete Protein- oder Peptidbiomoleküle können synthetisch abstammend oder natürlich vorkommend sein. Solange die Protein- oder Peptidbiomoleküle Kohlenstoff-Kohlenstoff-Bindungen umfassen, die eine Amin-Einheit in Nachbarschaft zu einer Hydroxyl-Einheit tragen, können sie durch das erfindungsgemäße Verfahren an eine aminierte Substratoberfläche gebunden werden. Spezifische Beispiele umfassen synthetische oder natürliche Proteine oder Peptide, die N-terminales Serin, N-terminales Threonin oder 5-Hydroxylysin enthalten (bekanntlich kommt 5-Hydroxylysin nur in Kollagen natürlich vor, es kann aber im Prinzip an jede Stelle in einem synthetischen Peptid oder Protein eingebracht werden).
- Einige Protein- oder Peptidbiomoleküle unterliegen Konformationsänderungen, wenn sie mit der hydrophoben Substratoberfläche in Kontakt gebracht werden. Diese Konformationsänderungen können dazu führen, dass interne unpolare Gruppen exponiert werden, was zu hydrophoben Wechselwirkun gen zwischen dem Biomolekül und der Oberfläche führen kann. Diese hydrophoben Wechselwirkungen können den Ausschluss von Wassermolekülen bewirken, die das Biomolekül in Lösung normalerweise umgeben. Dieser Ausschluss von Wassermolekülen zwischen dem Biomolekül und der Oberfläche verstärkt die hydrophobe Wechselwirkung und kann eine weitere Konformationsänderung des Biomoleküls bewirken. Der Grad der Konformationsänderung, die ein Biomolekül durchmacht, kann dessen biologische Eigenschaften zerstören oder nicht. Daher muss man die hydrophobe Natur der Substratoberfläche berücksichtigen, wenn Biomoleküle gebunden werden, die für hydrophobe Wechselwirkungen empfänglich sind. In diesen Fällen ist bevorzugt, eine hydrophile Umgebung an der Substratoberfläche zu schaffen und dadurch jegliche ungewollten hydrophoben Wechselwirkungen zwischen dem Biomolekül und der Oberfläche zu verhindern, welche die biologischen Eigenschaften des Biomoleküls zerstören könnten. Es gibt eine Anzahl von dem Fachmann bekannten Oberflächenderivatisierungstechniken, z. B. Pfropfungstechniken zur Schaffung hydrophiler Substratoberflächen. Zum Beispiel sind Techniken auf der Basis von Cerionen-Initiation, Ozonexposition, Glimmentladung, W-Bestrahlung und ionisierender Strahlung (60Co, Röntgenstrahlen, einergiereiche Elektronen, Plasmagasentladung) bekannt.
- Substrate, die durch das erfindungsgemäße Verfahren modifiziert werden können, umfassen Metalle, wie Titan/Titanlegierungen, TiNi (mit Formgedächtnis, superelastisch), Aluminiumoxid, Platin/Platinlegierungen, rostfreie Stähle, MP35N, Elgiloy, Haynes 25, Stellit, Pyrokohlenstoff, Silber- oder Glaskohlenstoff, Polymere, wie Polyamide, Polycarbonate, Polyether, Polyester, Polyolefine einschließlich Polyethylenen oder Polypropylenen, Polystyrolen, Polyurethanen, Polyvinylchloriden, Polyvinylpyrrolidonen, Silikonelastomeren, Fluorpolymeren, Polyacrylaten, Polyisoprenen, Polytetrafluorethylenen und Gummi, Minera lien oder Keramiken, wie Hydroxyapathit, menschliches oder tierisches Protein oder Gewebe, wie Knochen, Haut, Zähne, Kollagen, Laminin, Elastin oder Fibrin, organische Materialien, wie Holz, Cellulose oder Presskohle, und andere Materialien, wie Glas oder dgl.. Substrate, die diese Materialien umfassen, können beschichtet oder unbeschichtet und derivatisiert oder underivatisiert sein.
- Das erfindungsgemäße Verfahren kann zur Modifikation von Substraten jeder Gestalt oder Form einschließlich röhren-, schicht-, stabförmiger Gegenstände und Gegenständen der richtigen Form verwendet werden. Vorzugsweise ist das Substrat ein Biomaterial für die Verwendung in einer Reihe von medizinischen Vorrichtungen, wie Gefäßtransplantaten, Aortentransplantaten, arteriellen, venösen oder Gefäßschläuchen, Gefäßstents, Dialysemembranen, -schläuchen oder -verbindungsstücken, Blutoxygenatorschläuchen oder -membranen, Ultrafiltrationsmembranen, intraaortale Ballons, Blutbeuteln, Kathetern, Nähten, Weich- oder Hartgewebeprothesen, synthetischen Prothesen, prothetischen Herzklappen, Gewebeklebern, Herzschrittmacherleitungen, künstlichen Organen, Endotrachealröhren, Linsen für das Augen, wie Kontakt- oder Intraokularlinsen, Ausrüstung zur Verarbeitung von Blut, Rphereseausrüstung, Diagnose- und Überwachungskathetern und -sensoren, Biosensoren, Dentalvorrichtungen, Medikamentenzufuhrsystemen oder Körperimplantaten irgendeiner Art.
- Ein Beispiel für ein Biomolekül, das bei der vorliegenden Erfindung verwendet werden kann, ist Kollagen. Kol- lagen, das im Bindegewebe vorhanden ist, hat spezielle Aminosäuren, darunter 5-Hydroxylysin, die mit einer Quelle für Periodat unter Bildung einer anhängenden Aldehyd-Einheit oxidiert werden können.
- Die mittels Oxidation von Kollagen hergestellten Aldehyd-Einheiten können zur kovalenten Bindung des Aldehydfunktionalisierten Kollagens an aminhaltige Substratober flächen verwendet werden. Diese Kollagen-beschichteten Substratoberflächen können zum Beispiel als Zellbesiedlungsoberflächen, Zellbindungsoberflächen, Gewebefixierung, Kol- lagen-beschichtete Stents oder Kollagen-beschichtete Gefäßtransplantate verwendet werden.
- Somit bewältigt die vorliegende Erfindung eine Reihe von Problemen in Verbindung mit der Verwendung medizinischer Vorrichtungen. Die Erfindung stellt ein oxidatives Verfahren zur kovalenten Bindung von Protein- oder Peptidbiomolekülen, die eine 2-Aminoalkohol-Einheit umfassen, an Substratoberflächen, die eine primäre Amin-Einheit umfassen, wie die Oberfläche eines Biomaterials, z. B. für die Verwendung in medizinischen Vorrichtungen bereit.
- Unter einem weiteren Aspekt stellt die Erfindung ein Produkt, d. h. ein Substrat, das ein Protein- oder Peptidbiomolekül trägt, bereit, das vorzugsweise durch das erfindungsgemäße Verfahren herstellbar ist.
- Beispiel 1
- Periodat-Oxidation eines Peptids mit N-terminalem Serin
- Ein Tripeptid aus drei Serin-Aminosäuren und ein Dipeptid aus zwei Lysin-Aminosäuren, die beide von Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO) erhalten wurden, wurden mit Natriummetaperiodat (NaIO4), das ebenfalls von Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO) erhalten wurde, inkubiert. Das Tripeptid (0,90 mmol) wurde im Dunkeln unter Schütteln bei Umgebungstemperatur für 3 Stunden in 10 ml deionisiertem Waser, das 1,2 mmol NaIO4 enthielt, inkubiert. Die erhaltene Lösung (2,5 μl) wurde zu 2 ml einer Lösung hinzugefügt, die 0,8 g NaOH, 0,2 g 4-Amino-3-hydrazino-5-mercapto-1,2,4-triazol (erhältlich als PURPALD von Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) in 20 ml deionisiertem Wasser enthielt, und 15 Minuten bei Umgebungstemperatur heftig geschüttelt. Das Dipeptid (0,72 mmol) wurde im Dunkeln unter Schütteln bei Umgebungstemperatur für 3 Stunden in 10 ml deionisiertem Wa ser, das 1,2 mmol NaIO4 enthielt, inkubiert. Die erhaltene Lösung (10 μl) (man beachte, dass diese Menge das Vierfache der für das Tripeptid verwendeten Menge ist) wurde dann zu 2 ml PURPALD -Lösung hinzugefügt und 15 Minuten bei Umgebungstemperatur heftig geschüttelt. Die erhaltenen Lösungen wurden dann spektralphotometrisch bei 550 nm analysiert.
- Dickinson und Jacobsen (Chem. Commun. 1719(1970)) beschreiben die spezifische und empfindliche Reaktion von Al- dehyden mit PURPALD unter Bildung violett bis dunkelrot gefärbter 6-Mercapto-5-triazolo-(4,3-b)-s-tetrazine, die spektralphotometrisch bei 550 nm gemessen werden können. Die bei 550 nm erhaltenen Probenabsorptionen waren 0,04 für das Dipeptid und 1,81 für das Tripeptid, was zeigt, dass nur das Tripeptid, das ein N-terminales Serin enthielt, erfolgreich unter Verwendung von Periodat oxidiert worden war. Das Dipeptid aus den beiden Lysin-Aminosäuren hat keine Einheit mit Kohlenstoff-Kohlenstoff-Bindungen, die eine Amin-Einheit in Nachbarschaft zu einer Hydroxyl-Einheit tragen.
- Beispiel 2
- Periodat-Oxidation eines Peptids mit N-terminalem Threonin
- Ein Dipeptid aus einer N-terminalen Threonin- und einer Leucin-Aminosäure, das von Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO) erhalten wurde, wurde mit Natriummetaperiodat (NaIO4), das ebenfalls von Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO) erhalten wurde, inkubiert. Das Dipeptid (4,3 mmol) wurde im Dunkeln unter Schütteln bei Umgebungstemperatur für 3 Stunden in 10 ml deionisiertem Wasser, das 1,2 mmol NaIO4 enthielt, inkubiert. Die erhaltene Lösung (10 μl) wurde zu 2 ml der im Beispiel 1 beschriebenen PURPALD-Lösung hinzugefügt und 15 Minuten bei Umgebungstemperatur heftig geschüttelt. Nach diesen 15 Minuten Schütteln bei Umgebungstemperatur wurde die erhaltene Lösung spektralphotometrisch bei 550 nm analysiert. Die bei 550 nm erhaltene Probenab sorption war 0,62, was zeigt, dass das Periodat die in dem Dipeptid vorliegende N-terminale Threonin-Aminosäure erfolgreich oxidieren konnte.
- Beispiel 3
- Periodat-Oxidation eines Peptids mit N-terminalem Serin
- Ein Pentapeptid aus einer N-terminalen Serin-, Asparaginsäure-, Glycin-, Arginin- und einer Glycin-Aminosäure, das von Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO) erhalten wurde, wurde mit Natriummetaperiodat (NaIO4), das ebenfalls von Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO) erhalten wurde, inkubiert. Das Pentapeptid (0,01 mmol) wurde im Dunkeln unter Schütteln bei Umgebungstemperatur für 3 Stunden in 2 ml deionisiertem Waser, das 0,23 mmol NaIO4 enthielt, inkubiert. Die erhaltene Lösung (10 μl) wurde zu 2 ml der im Beispiel 1 beschriebenen PURPALD-Lösung hinzugefügt und 15 Minuten bei Umgebungstemperatur heftig geschüttelt. Nach diesen 15 Minuten Schütteln bei Umgebungstemperatur, wurde die erhaltene Lösung spektralphotometrisch bei 550 nm analysiert. Die bei 550 nm erhaltene Probenabsorption war 0,74, was wiederum zeigt, dass Periodat die in dem Pentapeptid vorliegende N-terminale Serin-Aminosäure erfolgreich oxidiert hatte.
- Beispiel 4
- Oxidation von Kollagen
- Mäusekollagen Typ IV, das von Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO) erhalten wurde, wurde mit Natriummetaperiodat (NaIO4) oxidiert. Es ist bekannt, dass Kollagen Typ IV die Anheftung von Epithel-, Endothelzellen, Myoblasten und Nervenzellen in vivo und in vitro vermittelt. Zwei Kollagenlösungen wurden durch (i) Mischen eines halben Gefäßes Kollagen mit 56 mg NaIO4 in 5 ml deionisiertem Wasser und (ii) Mischen eines halben Gefäßes Kollagen in 5 ml deionisiertem Wasser hergestellt. Beide Lösungen wurden im Dunkeln für 2 Stunden unter Schütteln bei Raumtemperatur inkubiert. Die erhaltenen Lösungen (jeweils 100 μl) wurden zu 2 ml der im Beispiel 1 beschriebenen PURPALD-Lösung hinzugefügt und 30 Minuten bei Umgebungstemperatur heftig geschüttelt. Nach diesen 30 Minuten Schütteln bei Umgebungstemperatur wurden die erhaltenen Lösungen spektralphotometrisch bei 550 nm analysiert. Die PURPALD-Lösung wurde als Leerwert verwendet. Die bei 550 nm erhaltenen Probenabsorptionen war 0,03 für nicht oxidiertes Kollagen und 0,25 für oxidiertes Kol- lagen, was zeigt, dass das Kollagen unter Bildung von Aldehyd-Einheiten oxidiert wurde.
- Beispiel 5
- Bindung von mit Periodat oxidierten Biomolekülen an aminierte Substrate
- Eine Technik zur Herstellung von Aminen auf Substratoberflächen umfasst das Pfropfen von Substratoberflächen mit Acrylamid-(AAm-) und N-(3-Aminopropyl)methacrylamid(APMA-) Monomeren unter Verwendung von Cer-(CeIV) Ionen. Die CeIV-Ionen bilden freie Radikale auf ozonbehandelten Silikon- und Polystyroloberflächen und unbehandelten Polyurethanoberflächen, welche die Pfropfcopolymerisation der Acrylamide starten. Das Ausmaß der Oberflächenaminierung (der Pfropfcopolymerisation von APMA und AAm), die auf der Substratoberfläche stattfindet, kann mittels Färbung mit Ponceau-S-Farbstoff, einem negativ geladenen Farbstoffmolekül, gemessen werden. Dieser Farbstoff lagert sich ionisch an die primären Amine auf der aminierten Oberfläche an. Nach der Pfropfung kann ein Periodat-oxidiertes Biomolekül an die aminhaltige derivatisierte Substratoberfläche gekuppelt werden. Das 2-Aminoalkohol-haltige Biomolekül wird zuerst mit Natriummetaperiodat (NaIO4) unter Bildung von reaktiven Aldehyd-Einheiten oxidiert. Diese Aldehyd-Einheiten werden dann zur kovalenten Bindung von Fibronectin an die auf der Substratoberfläche vorhandenen primären Amino- Einheiten verwendet. Natriumcyanoborhydrid (NaCNBH3) wird dann zur Stabilisierung der Imin-Bindungen verwendet. Spezifische Verfahren, die für jeden dieser Schritte erforderlich sind, sind nachstehend beschrieben.
- Polystyrol-Gewebekulturplatten mit 24 Vertiefungen wurden ozonbehandelt, indem die Kulturplatten 30 Minuten in ein Ozonreaktionsgefäß gestellt wurden, während Sauerstoff, der das Ozon enthielt, in einer Rate von 1,3 cm3/min strömte. Das sauerstoffhaltige Ozon wurden erzeugt, indem man den Sauerstoff durch eine Glimmentladungsapparatur strömen ließ, welche den strömenden Sauerstoff einer elektrischen Spannung von 8000 V aussetzte. Nach der Ozonbehandlung wurden die Platten 30 Minuten bei Umgebungstemperatur in deionisiertes Wasser, das von Stickstoff durchspült wurde, getaucht. Nach dem 30 minütigen Eintauchen in mit Stickstoff durchspültes deionisiertes Wasser wurden die Platten unter Verwendung von CeIV-Ionen mit Acrylamid-(AAm-) und N-(3-Aminopropyl)-methacrylamid-(APMA-) Monomeren gepfropft. Die Pfropflösungen bestanden aus einer Lösung aus 40 g AAm, 10 g APMA, 50 g deionisiertem Wasser und einer Lösung mit 20 g CeIV-Ion. Die CeIV-Ionen-Lösung bestand aus 2,74 g Cerammoniumnitrat und 3,15 g Salpetersäure in 50 ml deionisiertem Wasser. Man ließ die Platten 3 Stunden in einem mit Stickstoff durchspülten Ofen bei 65°C pfropfen. Nach dem Pfropfen wurden die Platten gründlich mit deionisiertem Wasser gespült. Die gepfropften Platten wurden dann mit Ponceau-S-Farbstoff getestet. Nach der Färbung wurde der Ponceau-S-Farbstoff unter Verwendung einer 1%igen Natriumdodecylsulfat-(SDS-) Lösung freigesetzt und spektralphotometrisch bei 520 nm quantifiziert. Die bei 520 nm erhaltenen Probenabsorptionen waren 0,00 für nicht derivatisierte Platten und 1,44 für Oberflächen-derivatisierte Platten. Wie die Ergebnisse zeigen, enthielten die Oberflächenderivatisierten Platten primäre Amine auf ihren Oberflächen.
- Die 2-Aminoalkohol-Einheit eines Peptids kann unter Verwendung des Verfahrens des Beispiels 1 oxidiert werden. Natriumcyanoborhydrid (1 mg/ml) wird dann zu der oxidierten Peptidlösung gegeben. Die erhaltene Lösung wird dann sofort in jede der aminhaltigen Oberflächen-derivatisierten Vertiefungen der Gewebekulturplatten (etwa 1 ml Lösung/Vertiefung) gegeben. Das oxidierte Peptid wird dann in den derivatisierten Vertiefungen der Gewebekulturplatten über Nacht bei Umgebungstemperatur inkubiert. Nach der Inkubation werden die Vertiefungen mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) gründlich gespült.
- Proben von Polyurethanfolie wurden in Scheiben von 1,4 cm Durchmesser geschnitten. Probenscheiben wurden mit AAmund APMA-Monomeren unter Verwendung von CeIV-Ion gepfropft. Man ließ die Probenscheiben für 1 Stunde bei Umgebungstemperatur pfropfen. Nach der Pfropfung wurden die Probenscheiben mit deionisertem Wasser gründlich gespült. Die 2-Aminoalkohol-Einheit des Peptids kann wiederum wie vorstehend beschrieben oxidiert werden. Dann werden die Probenscheiben der oxidierten Peptidlösung ausgesetzt. Natriumcyanoborhydrid wird anschließend zugegeben (1 mg/ml), und die erhaltene Lösung und die Probenscheiben werden über Nacht bei Umgebungstemperatur inkubiert. Nach der Inkubation werden die Polyurethan-Probenscheiben gründlich mit PBS gespült.
Claims (14)
- Verfahren zum Binden eines Proteins oder eines Peptidbiomoleküls, das eine 2-Aminoalkohol-Einheit umfaßt, an eine Substratoberfläche, die eine primäre Amin-Einheit umfaßt, wobei das Verfahren die Schritte umfaßt: (a) Behandeln des Proteins oder Peptids mit einem Periodat, um ein Protein oder Peptid mit Aldehydfunktion herzustellen, (b) Umsetzen des Proteins oder Peptids mit Aldehydfunktion mit der Substratoberfläche, um die Substratoberfläche über eine Imin-Einheit mit diesem zu verbinden, und (c) Behandeln des erhaltenen Materials mit einem Reduktionsmittel, um eine sekundäre Amin-Bindung herzustellen.
- Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Substrat aus der Gruppe ausgewählt ist, die Titan/Titanlegierungen, TiNi (mit Formgedächtnis/superelastisch), Aluminiumoxid, Platin/Platinlegierungen, rostfreie Stähle, MP35N, Elgiloy, Haynes 25, Stellit, Pyrokohlenstoff, Silber- oder Glaskohlenstoff, Polyamide, Polycarbonate, Polyether, Polyester, Polyethylene oder Polypropylene, Polystyrole, Polyurethane, Polyvinylchloride, Polyvinylpyrrolidone, Silikonelastomere, Fluorpolymere, Polyacrylate, Polyisoprene, Polytetrafluorethylene und Gummi, Hydroxyapathit, Knochen, Haut, Zähne, Kollagen, Laminin, Elastin oder Fibrin, Holz, Cellulose oder Preßkohle und Glas umfaßt.
- Verfahren nach Anspruch 2, wobei das Substrat in Röhren-, Schicht- oder Stabform vorliegt.
- Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei die Substratoberfläche die Oberfläche einer medizinischen Vorrichtung umfaßt.
- Verfahren nach Anspruch 4, wobei die medizinische Vorrichtung aus der Gruppe ausgewählt ist, die Gefäßtransplantate, Aortentransplantate, arterielle, venöse oder Gefäßschläuche, Gefäßstents, Dialysemembranen, -schläuche oder -verbindungsstücke, Blutoxygenatorschläuche oder -membranen, Ultrafiltrationsmembranen, intraaortale Ballons, Blutbeutel, Katheter, Nähte, Weich- oder Hartgewebeprothesen, synthetische Prothesen, prothetische Herzklappen, Gewebekleber, Herzschrittmacherableitungen, künstliche Organe, Endotrachealröhren, Kontakt- oder Intraokularlinsen, Ausrüstung zur Verarbeitung von Blut, Aphereseausrüstung, Diagnose- und Überwachungskatheter und -sensoren, Biosensoren, Dentalvorrichtungen, Medikamentenzufuhrsysteme oder Körperimplantate irgendeiner Art umfaßt.
- Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei das Protein oder Peptid natürlich vorkommt.
- Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei das Protein oder Peptid eine N-terminale Serin-, eine N-terminale Threonin- oder eine 5-Hydroxylysingruppe umfaßt.
- Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei das Substrat ein Metall, Polymer, Keramik oder Glas umfaßt.
- Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Periodat Periodsäure, Natriumperiodat oder Kaliumperiodat ist.
- Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Reduktionsmittel Natriumborhydrid, Natriumcyanoborhydrid oder ein Aminboran ist.
- Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei Schritt (a) in einer wässrigen Lösung bei einem pH von 4 bis 9 durchgeführt wird.
- Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei Schritt (a) in einer wässrigen Lösung bei einer Temperatur von 0 bis 50°C durchgeführt wird.
- Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei Schritt (b) in einer wässrigen Lösung bei einem pH-Wert von 6 bis 10 durchgeführt wird.
- Produkt, das durch ein Verfahren nach einem vorhergehenden Anspruch erhältlich ist.
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