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Gebiet der Erfindung
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Die
Erfindung betrifft im allgemeinen Verfahren für die Bestimmung von Sequenzinformation
in Polynucleotiden und insbesondere für die Identifizierung von Nucleotidpolymorphismen
unter Verwendung von Massenspektrometrie.
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Hintergrund der Erfindung
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Gensondennachweise,
die von der Bindung von DNA-Sonden mit ihren komplementären Basenpaaren
auf einem Zielmolekül
abhängen,
sind unter den gebräuchlichsten
durch Molekularbiologen verwendeten Nachweisen. Derartige Nachweise
erfordern einen großen
Zeitaufwand, um die Sonde an eine Ziel-DNA zu binden, jede überschüssige unhybridisierte
Sonde zu entfernen und die hybridisierte Sonde zu analysieren.
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Die
zur Durchführung
dieser Nachweise benötigte
Zeit und die die Durchführung
dieser Nachweise begleitenden Schwierigkeiten machen solche Nachweise
bei einer Suche nach Einzelnucleotid-Polymorphismen (SNPs) ineffizient.
Ein SNP ist eine Änderung
(eine Deletion, Insertion oder Substitution) einer beliebigen einzelnen
Nucleotidbase im Bereich des interessierenden Genoms. Da SNPs so
häufig
im humanen Genom vorkommen (ungefähr einmal alle 500 Basen),
sind SNPs nützliche
Marker bei der Untersuchung des humanen Genoms.
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Der
Nachweis von SNPs wird typischerweise unter Verwendung von automatisierten
DNA-Sequenzierern durchgeführt.
Jedoch werden solche Sequenzierer zur Bestimmung einer einzelnen
Basenänderung
innerhalb einer 500-Basen-Sequenz im allgemeinen nicht gut verwendet.
Als Ergebnis ist eine SNP-Suche unter Verwendung eines Sequenzierers
langsam und teuer.
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Die
kürzliche
Entwicklung von matrixunterstützter
Laserdesorptionsionisations-Flugzeitmassenspektrometrie (MALDI-TOF MS) ermöglichte
die Analyse von geringen Mengen (ungefähr 5 Femtomol) von DNA bei extremer
Auflösung
(Genauigkeit von 1 Dalton). Die Empfindlichkeit und Massenauflösung von
MALDI-TOF-Massenspektrometrie ist bei erhöhter Masse verringert, so dass
die derzeitige obere praktische Grenze für eine Analyse von DNA zwischen
ungefähr
50 und 100 Nucleotidbasen liegt. Proben von 500 Nucleotidbasen wurden
mit MALDI-TOF, aber mit geringer Auflösung und Empfindlichkeit, analysiert.
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Die
vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur schnellen Bestimmung
von Polynucleotidsequenzen mit einer geringen Arbeitsintensität und geringen
Kosten pro SNP-Nachweis.
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Die
WO-A-94 16101 offenbart
ein Verfahren zur Sequenzierung von DNA. Das Verfahren verwendet die
Sanger-Sequenzierstrategie und fügt
die Sequenzinformation durch Analyse der durch basenspezifische Kettentermination
erhaltenen ”nested”-Fragmente über ihre
verschiedenen Molekülmassen
unter Verwendung von Massenspektrometrie, beispielsweise MALDI-
oder ES-Massenspektrometrie, zusammen. Eine weitere Erhöhung des
Durchsatzes kann durch Einführung
von Massenmodifikationen in dem Oligonucleotidprimer, Kettenterminationsnucleosidtriphosphaten
und/oder Kettenelongationsnucleosidtriphosphaten, sowie auch unter
Verwendung von integrierten Tag-Sequenzen, die eine Multiplexbildung
durch Hybridisierung von tagspezifischen Sonden mit massendifferenzierten
Molekulargewichten ermöglichen,
erhalten werden.
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Die
WO-A-96 29431 offenbart
Verfahren auf Grundlage eines Massenspektrometers zur Bestimmung einer
besonderen Nucleinsäuresequenz
in einer biologischen Probe. In Abhängigkeit von der zu bestimmenden
Sequenz können
die Verfahren beispielsweise zur Diagnose einer Erbkrankheit oder
Chromosomenanomalität,
einer Prädisposition
für eine
Krankheit oder ein Leiden, einer Infektion durch einen pathogenen
Organismus oder zur Bestimmung von Identität oder Abstammung verwendet
werden.
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Die
WO-A-96 27681 offenbart
ein Verfahren zur Analyse einer Nucleinsäure durch Massenspektrometrie,
das die Stufen: (1) Herstellen eines eine negativ-geladene nicht-Phosphat-haltige
Zucker-Zucker-Verknüpfung
enthaltenden Nucleinsäuremoleküls; (2)
Eliminieren der Ladung von allen, oder von allen bis auf zehn Zucker-Zucker-Verknüpfungen
des Nucleinsäuremoleküls; (3)
Einführen
des Nucleinsäuremoleküls, von dem
die Ladung im ganzen oder teilweise eliminiert wurde, in ein Massenspektrometer;
und (4) Bestimmen der Masse des Nucleinsäuremoleküls umfasst. Vorzugsweise hat
die Nucleinsäure
keine oder eine Ladung. Es wird dort ferner ein Verfahren zur Herstellung
eines Nucleinsäuremoleküls, das
keine oder bis zu zehn negative Ladungen und keine oder bis zu 10
positive Ladungen enthält,
beschrieben, wobei das Verfahren die Stufen (1) Synthetisieren einer
Nucleinsäure
mit einer Phosphorthioatverknüpfung
oder einer Phosphorselenoatverknüpfung
zwischen Zuckerresten und (2) Umsetzen der Nucleinsäure mit
einem Alkylierungsmittel, damit die Ladung auf der Phosphorthioatverknüpfung oder
der Phosphorselenoatverknüpfung
eliminiert wird, umfasst.
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Zusammenfassung der Erfindung
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Gemäß dem breitesten
Aspekt der Erfindung erfolgt die Bereitstellung eines Verfahrens
zur Identifizierung einer vermuteten Punktmutation in einem Polynucleotid
unter Verwendung von Massenspektrometrie nach Anspruch 1 und 2.
Weitere bevorzugte Ausführungsformen
werden in den abhängigen
Ansprüchen
3 bis 12 beschrieben.
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Eine
Ausführungsform
der Erfindung betrifft ein Verfahren zur Identifizierung einer vermuteten
Punktmutation in einem Polynucleotid unter Verwendung von Massenspektrometrie.
Das Verfahren umfasst Hybridisieren eines Primers an das Polynucleotid
mit einer vermuteten Punktmutation derart, dass das 3'-Ende des Primers
angrenzend an die vermutete Punktmutation hybridisiert wird; Verlängern des
3'-Endes des Primers durch
Addition einer einzigen Nucleotidbase, die zu der vermuteten Punktmutation
des Polynucleotids passt, wodurch ein verlängerter Primer gebildet wird,
und Identifi zieren der addierten Nucleotidbase des verlängerten Primers
unter Verwendung von Massenspektrometrie. In einer Ausführungsform
ist die verwendete Massenspektrometrie matrixunterstützte Laserdesorptionsionisations-Flugzeit(MALDI-TOF)-Massenspektrometrie.
In einer Ausführungsform
umfasst die Stufe des Hybridisierens des Primers die Stufen Bereitstellen
eines Primers mit einer Sequenz, die an eine Polynucleotidsequenz
in der Nähe
einer vermuteten Punktmutation hybridisiert; Erhitzen des Polynucleotids
auf eine zum Schmelzen des Polynucleotids ausreichende Temperatur; und
Kühlen
des Polynucleotids auf eine Temperatur, die zur Hybridisierung des
Primers an das Polynucleotid ausreicht; wodurch eine Duplex, in
der das 3'-Ende
des Primers angrenzend an die vermutete Punktmutation liegt, gebildet
wird. In einer Ausführungsform
umfasst die Stufe der Verlängerung
die Bereitstellung von mindestens einer Didesoxynucleosidtriphosphatbase
(ddNTP) und die Bereitstellung einer Polymerase. In einer Ausführungsform
ist das Polynucleotid eine DNA und die Polymerase eine DNA-Polymerase,
die aus der Gruppe von Taq-Polymerase, AmpliTaq-FS oder Thermosequenase
ausgewählt
ist. In einer weiteren Ausführungsform
ist das Polynucleotid eine RNA und die Polymerase eine reverse Transkriptase.
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Eine
weitere Ausführungsform
der Erfindung benützt
die Verwendung eines Primers mit einem Massetag am 5'-Ende des Primers.
In einer Ausführungsform
ist der Massetag eine Thymidin-DNA oder ein Polythymidylatsegment,
Tn, worin n eine ganze Zahl im Bereich von
1 bis 40 ist.
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Eine
noch weitere Ausführungsform
der Erfindung betrifft ein Multiplexverfahren zur Identifizierung
von mehrfachen vermuteten Punktmutationen in einem Polynucleotid
unter Verwendung von Massenspektrometrie. Das Verfahren umfasst
in einer Ausführungsform
das Hybridisieren einer Mehrzahl von Primern an ein Polynucleotid
mit mehreren vermuteten Punktmutationen, wobei das 3'-Ende von jedem Primer
angrenzend an jede vermutete Punktmutation hybridisiert wird; das
Verlängern
des 3'-Endes von
jedem Primer durch Addition einer einzigen Nucleotidbase an jeden
Primer, wobei jeweils eine einzige Nucleotidbase zu jeder vermuteten Punktmutation
des Polynucleotids passt, wodurch eine Mehrzahl von verlängerten
Primern gebildet wird; und das Identifizieren der addierten Nucleotidbase
an jedem verlängerten
Primer unter Verwendung von Massenspektrometrie. In einer Ausführungsform
ist das Polynucleotid eine DNA und die Polymerase ist eine DNA-Polymerase.
In einer weiteren Ausführungsform
das Polynucleotid eine RNA und die Polymerase eine reverse Transkriptase.
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Eine
weitere Ausführungsform
der Erfindung umfasst ein Verfahren zur Identifizierung einer vermuteten
Punktmutation in einer DNA unter Verwendung von Massenspektrometrie,
das die Stufe Hybridisieren von zwei Oligonucleotidsonden an eine
einsträngige
DNA mit einer vermuteten Punktmutation in derartiger Weise, dass
die zwei Sonden zusammen die vermutete Punktmutation überlappen,
Ligieren der zwei Sonden zu einem ligierten einzelsträngigen Oligonucleotid
nur dann, wenn die die vermutete Punktmutation überlappende Sonde die zu der
Nucleotidbase der DNA an der vermuteten Punktmutation komplementäre Nucleotidbase
hat, und Bestimmen der Identität
der zu der vermuteten Punktmutation passenden Nucleotidbase auf
dem ligierten Oligonucleotid unter Verwendung von Massenspektrometrie
umfasst. In einer Ausführungsform
wird die Massenspektrometrie unter Verwendung von matrixunterstützter Laserdesorptionsionisations-Flugzeit(MALDI-TOF)-Massenspektrometrie
durchgeführt.
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Eine
noch weitere Ausführungsform
der Erfindung betrifft ein kombinatorisches Verfahren zur Bestimmung
von Sequenz information in einem Bereich eines Polynucleotids unter
Verwendung von Massenspektrometrie. Eine Ausführungsform des Verfahrens umfasst
Hybridisieren eines Primers an ein Polynucleotid mit einem interessierenden
Bereich derartig, dass das 3'-Ende
des Primers angrenzend an den interessierenden Bereich hybridisiert
wird, und Verlängern
des 3'-Endes des Primers
durch Addition einer Mehrzahl von Nucleotidbasen, die zu dem interessierenden
Bereich des Polynucleotids passen, wodurch ein verlängerter
Primer gebildet wird. In einer Ausführungsform umfasst die Verlängerungsstufe
das Bereitstellen einer Mehrzahl von Nucleotidbasen, die aus der
aus Desoxynucleosidtriphosphat (dNTP) und Didesoxynucleosidtriphosphat (ddNTP)
bestehenden Gruppe so ausgewählt
werden, dass mindestens ein Mitglied von ddNTP vorhanden ist, und
das Bereitstellen einer Polymerase in einer Pufferlösung. Die
Identität
der addierten Nucleotidbasen auf dem verlängerten Primer wird dann unter
Verwendung von Massenspektrometrie bestimmt. In einer Ausführungsform
ist das Polynucleotid eine DNA und die Polymerase eine DNA-Polymerase.
In einer weiteren Ausführungsform
ist das Polynucleotid eine RNA und die Polymerase eine reverse Transkriptase.
Eine weitere Ausführungsform
der Erfindung umfasst das Bereitstellen einer Exonuclease für die aus
der Verlängerung
erhaltene Mischung, wodurch eine die Mischung von verlängerten
Primern definierende Leitersequenz erzeugt wird. In einer Ausführungsform
wird die Exonuclease aus der Gruppe, die aus: Phosphodiesterase
Typ 1, Exonuclease I, Exonuclease III, Exonuclease V, Exonuclease
VII und DNA-Polymerase
III besteht, ausgewählt.
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Eine
weitere Ausführungsform
der Erfindung betrifft ein kombinatorisches Multiplexverfahren zur
Bestimmung von Sequenzinformation in mehreren Bereichen eines Polynucleotids
unter Verwendung von Massenspektrometrie. Das Verfahren umfasst
das Hybridisieren einer Mehrzahl m von Primern an ein Polynucleotid
mit mehreren interessierenden Bereichen derart, dass das 3'-Ende von jedem der
Primer angrenzend an einen jeweiligen interessierenden Bereich hybridisiert
wird, und das Verlängern
des 3'-Endes von
jedem der Primer durch Addition einer Mehrzahl von Nucleotidbasen
an jeden Primer, der zu einem jeweils interessierenden Bereich des
Polynucleotids passt, wodurch eine Mehrzahl von verlängerten
Primern gebildet wird. In einer Ausführungsform umfasst die Verlängerungsstufe
das Bereitstellen einer Mehrzahl von Nucleotidbasen, die aus der
aus Desoxynucleosidtriphosphat (dNTP) und Didesoxynucleosidtriphosphat
(ddNTP) bestehenden Gruppe so ausgewählt werden, dass mindestens
ein Mitglied von ddNTP vorhanden ist, und das Bereitstellen einer
Polymerase in einer Pufferlösung.
In einer Ausführungsform
ist das Polynucleotid eine DNA und die Polymerase eine DNA-Polymerase.
In einer weiteren Ausführungsform
ist das Polynucleotid eine RNA und die Polymerase eine reverse Transkriptase.
Die Identität
der addierten Nucleotidbasen an jedem verlängerten Primer wird unter Verwendung
von Massenspektrometrie bestimmt.
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Kurze Beschreibung der Zeichnungen
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Die
obigen und anderen Aufgaben, Merkmale und Vorteile der vorliegenden
Erfindung sowie die Erfindung selbst werden aus der folgenden Beschreibung
bevorzugter Ausführungsformen
besser verstanden, wenn sie zusammen mit den begleitenden Zeichnungen
gelesen wird, wobei:
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1 ein
hoch schematisches Diagramm einer Ausführungsform des Verfahrens zur
Identifizierung einer einzigen vermuteten Punktmutation oder einer
polymorphen Stelle in einer DNA unter Verwendung von PCR ist;
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2 die
Ergebnisse eines Einzelnucleotidpolymorphis mus(SNP)-Nachweises unter
Verwendung einer Primerverlängerungsreaktion
mit: ddA, Linie A; ddC, Linie B; ddG, Linie C; ddT, Linie D; und
den vier ddNTPs, Linie E; darstellt;
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3 ein
hoch schematisches Diagramm einer Ausführungsform des Nachweises,
die zur Bestimmung von heterozygoten Einzelnucleotidpolymorphismen
verwendet wird, ist;
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4 ein
Diagramm eines Massenspektrums der Ergebnisse eines durchgeführten Einzelnucleotidpolymorphismusnachweises
in Gegenwart von allen vier ddNTPs mit einer heterozygoten Probe
mit C und T an der variablen Stelle ist;
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5 ein
hoch schematisches Diagramm einer Ausführungsform eines Nachweises,
die zur Bestimmung von mehreren Einzelnucleotidpolymorphismen verwendet
wird, unter Verwendung von Massetags ist;
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6a ein
Massenspektrum von fünf
Primern mit Massetags, die bei der Durchführung eines Multiplexnachweises
von Einzelnucleotidpolymorphismen für die BRCA1-Einzelpunktmutationen
verwendet wurden, R355, R377, R400, R421 und R447, ist;
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6b ein
Massenspektrum der Ergebnisse des Multiplexnachweises, der in der
Gegenwart der fünf Primer,
deren Massenspektrum in 6a gezeigt
ist, durchgeführt
wurde, ist;
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6c ein
Massenspektrum von sieben Primern mit Massetags, die bei der Durchführung eines
Multiplexnachweises von Einzelnucleotidpolymorphismen für die BRCA1-Einzelpunktmutationen
verwendet wurden, F320, R355, R377, R400, R421, R480 und R447, ist;
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6d ein
Massenspektrum der Ergebnisse des in Gegenwart der sieben Primer,
deren Massenspektrum in 6c gezeigt
ist, durchgeführten
Multiplexnachweises ist;
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6e ein
Massenspektrum von sieben Primern mit Massetags, die bei der Durchführung eines
Multiplexnachweises von Einzelnucleotidpolymorphismen für die BRCA1-Einzelpunktmutationen
verwendet wurden, R355, R377, R400, R421 und R447, und für die lacz-Einzelpunktmutation
verwendet wurde, (b2-1), ist;
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6f ein
Massenspektrum der Ergebnisse des in Gegenwart der sieben Primer,
deren Massenspektrum in 6f gezeigt
ist, durchgeführten
Multiplexnachweises ist;
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7 ein
hoch schematisches Diagramm einer Ausführungsform des Verfahrens zur
Identifizierung einer einzigen vermuteten Punktmutation in einer
doppelsträngigen
DNA unter Verwendung von Ligase ist;
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8 ein
Massenspektrum der Ergebnisse eines Ligasenachweises unter Verwendung
einer Oligonucleotidsonde mit einem Massetag ist;
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9a ein Massenspektrum der Ergebnisse eines
Ligasenachweises einer heterozygoten DNA unter Verwendung von mehreren
Oligonucleotidsonden mit Massetags ist;
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9b ein hoch schematisches Diagramm einer
Ausführungsform
des Verfahrens zur Identifizierung einer einzigen vermuteten Punktmutation
unter Verwendung von Ligase in einer heterozygoten DNA-Probe ist;
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10 ein
hoch schematisches Diagramm einer Ausführungsform eines kombinatorischen
Nachweises, der zur Bestimmung der Gegenwart von mehr als einer
Nucleotidmutation an einer vermuteten Mutationsstelle verwendet
wurde, ist;
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11 ein
Massenspektrum der Ergebnisse des kombinatorischen Nachweises unter
Verwendung einer Polymerase ist;
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12 ein
hoch schematisches Diagramm eines kombinatorischen Nachweises, der
zur Bestimmung der Gegenwart von mehr als einer Nucleotidmutation
an einer vermuteten Mutationsstelle, gefolgt von einer Verdauung
durch eine Exonuclease verwendet wurde, ist;
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13 ein
hoch schematisches Diagramm eines kombinatorischen Multiplexnachweises
an einer DNA, die mehrere vermutete Mutationsstellen von mehr als
einer Nucleotidbasenmutation hat, ist;
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14 ein
hoch schematisches Diagramm einer Ausführungsform eines zur Anwendung
der Erfindung in der Praxis verwendeten Instruments ist; und
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15 ein
Flussdiagramm einer Ausführungsform
eines Algorithmus, der zusammen mit dem in 14 gezeigten
Instrument verwendet wird, ist.
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Genaue Beschreibung der Erfindung
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Gemäß dem breitesten
Aspekt der Erfindung erfolgt die Bereitstellung einer Familie von
Verfahren zur Bestimmung von Sequenzinformation in Polynucleotiden
durch Kombination der jungen, ungleichen Verfahren von Massenspektrometrie
und Polynucleotidhybridisierungs-, -amplifizierungs-, -verlängerungs-
und/oder -ligationsverfahren. Im allgemeinen umfasst das Verfahren
zur Bestimmung von Sequenzinformation in einem Probenpolynucleotid
in einer ersten Stufe das Hybridisieren eines Probenpolynucleotids
mit einer oder einer Mischung von Oligonucleotidsonden mit einer
zu einem Teil des Probenpolynucleotids komplementären Nucleotidsequenz,
wodurch ein Komplex gebildet wird. Dann wird in einer zweiten Stufe
der Komplex in Kontakt mit einem Mitglied, das aus der aus Nucleosiden,
Didesoxynucleosiden, Polymerasen, Nucleasen, Transkriptasen, Ligasen
und Restriktionsenzymen bestehenden Gruppe ausgewählt wird,
gebracht, damit mindestens eine Untergruppe der Oligonucleotidsonden
verändert
wird. In einer dritten Stufe liefert das Verfahren die Bestimmung
des Molekulargewichts von mindestens der Untergruppe von veränderten
Sonden durch Massenspektrometrie und die Folgerung der Sequenzinformation
des Probenpolynucleotids aus demselben.
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Die
Erfindung betrifft auch Verfahren zur Identifizierung von Nucleotidpolymorphismen
unter Verwendung von Massenspektrometrie. In der folgenden detaillierten
Beschreibung der Erfindung werden die Ausdrücke ”vermutete Punktmutation” oder ”Einzelnucleotidpolymorphismus” austauschbar
verwendet und sollen eine beliebige Modifikation in einer Polynucleotidsequenz,
die zu einer einzigen Nucleotidbasenmutation wie einer Insertion,
Deletion oder Substitution einer einzigen Nucleotidbase führt, bedeuten.
Es ist beabsichtigt, dass der Ausdruck ”vermutete Mutationsstelle” eine beliebige
Modifikation in einer Polynucleotidsequenz, die zu einer Mutation
von mehreren Nucleotidbasen aufgrund einer Insertion, Deletion oder
Substitution von mehreren Nucleotidbasen oder einer Kombination
derselben führt,
bedeutet. Es ist beabsichtigt, dass der Ausdruck ”Bereich” einen
Teil der Sequenz eines Polynucleotids bedeutet.
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In
einem kurzen Überblick
und unter Bezug auf 1 umfasst das Verfahren zur
Identifizierung einer vermuteten Einzelpunktmutation 10 in
einer DNA 20 in einer Ausfüh rungsform zuerst (Stufe 1)
das Trennen der Stränge
der doppelsträngigen
DNA in zwei einzelne Stränge,
von denen einer der Zielstrang 22 mit der interessierenden
vermuteten Punktmutation 10 ist. Als nächstes (Stufe 2) wird eine
Primersequenz 30 mit einer Sequenz von Basen, die komplementär zu den
Basen des Zielstrangs 22 bis einschließlich der Base 24,
die an die vermutete Punktmutation 10 angrenzt, ist, mit
dem Zielstrang 22 assoziiert.
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Jede
der möglichen
komplementären
Basen 36, 36',
in der Form von Didesoxynucleotiden, wird (Stufe 3) zusammen mit
einer DNA-Polymerase zu dem Primer-Target-DNA-Komplex gegeben. Die
Didesoxynucleotidbase 36, die komplementär zu der
vermuteten Punktmutation 10 ist, wird in die Primersequenz 30 unter Bildung
eines verlängerten
Primers 30' eingebaut
(Stufe 4). Da der Primer 30' nun
eine Didesoxynucleotidbase 36 am Ende hat, sind keine weiteren
Additionen möglich.
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Die
Primersequenz
30' mit
der addierten Didesoxynucleotidbase
36 wird als nächstes mit
einem Massenspektrometer analysiert (Stufe 5). Es wird festgestellt,
dass bei Verwendung von MALDI-TOF-Massenspektrometrie der Primer-Target-DNA-Komplex bei dem
Laserdesorptionsionisationsverfahren der MALDI-TOF-Massenmessung
vollständig
dissoziiert wird. Die Masse des Primers
30' mit der zusätzlichen Masse der Didesoxynucleotidbase
36 wird
bestimmt (Vergleichsmasse in Tabelle 1 gezeigt), und durch Subtraktion der
ursprünglichen
Masse des Primers
30 wird die Masse der Didesoxynucleotidbase
36 und
damit die Art der Didesoxynucleotidbase
36 bestimmt. Dadurch,
dass die Identität
der addierten Didesoxynucleotidbase
36 bekannt ist, wird
die Identität
der komplementären
vermuteten Punktmutation
10 gemäß den Regeln der Watson-Crick-Basenpaarung
daraus abgeleitet. Tabelle 1: Didesoxy- und Desoxynucleotidbasen
Didesoxybase | Formel | Masse | Desoxybase | Formel | Masse |
-ddC | C9H12N3O5P | 273,155 | -dC | C9H12N3O6P | 289,184 |
-ddT | C10H13N2O6P | 288,196 | -dT | C10H13N2O7P | 304,195 |
-ddA | C10H12N5O4P | 297,210 | -dA | C10H12N5O5P | 313,209 |
-ddG | C10H12N5O5P | 313,209 | -dG | C10H12N5O6P | 329,208 |
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Genauer
gesagt, werden die DNA 20 denaturiert (Stufe 1) und die
zwei Stränge
der DNA 20, beispielsweise durch Erhitzen der nativen DNA
auf ungefähr
90–99°C während 10
bis 60 s, getrennt. Der Primer 30 wird dann mit einer Konzentration
im Bereich von ungefähr
beispielsweise 0,1 μM
bis ungefähr
10 μM, vorzugsweise
1 μM, zugegeben.
Der Primer 30 enthält
vorzugsweise 15–50
Nucleotidbasen und ist so ausgerichtet, dass die Base 26,
die komplementär
zu der an die vermutete Punktmutation 10 auf dem Zielstrang
der DNA 22 angrenzenden Base 24 ist, an dem 3'-Ende des Primers 30 lokalisiert
ist. Das Gemisch von Primer 30 und Ziel-DNA 22 wird
auf zwischen 37 und 72°C
gekühlt,
damit der Primer 30 an die Ziel-DNA 22 assoziiert
und hybridisiert werden kann (Stufe 2). Die nächste Stufe (Stufe 3) besteht
aus der Zugabe von Didesoxynucleotidbasen 36, 36', einer Polymerase
und einem geeigneten Puffer zu dem Gemisch, um das 3'-Ende des Primers 30,
der an die Ziel-DNA 22 gebunden ist, zu verlängern. Diese
Stufe wird unter Verwendung von Standard-DNA-Polymerasetechnologie ausgeführt. Die
an den Primer 30 addierte Base 36 ist komplementär zu der vermuteten
Punktmutation 10 (Stufe 4).
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In
bestimmten Ausführungsformen
wird die Addition einer Didesoxynucleotidbase 36 an den
Primer 30 unter Verwendung einer thermostabilen DNA-Polymerase,
die aus der Gruppe von Taq-Polymerase, AmpliTaq-FS oder Thermosequenase
ausgewählt ist,
durchgeführt.
Vorzugsweise wird Thermosequenase verwendet. Bei Verwendung einer
thermostabilen Polymerase umfasst der Nachweis, in einer Ausführungsform,
eine Primerverlängerungsamplifikation
durch wiederholte Zyklen von: 1) DNA-Denaturierung durch Erhitzen über den
Schmelzpunkt der DNA-Probe; 2) Binden oder Hybridisieren des Primers
an die DNA durch Abkühlen
auf eine geeignete Temperatur; und 3) Verlängern des Primers durch Addition
einer Nucleotidbase. Eine derartige Amplifikation erhöht das Molekülverhältnis von
dem verlängerten
Primer 30' zu
der DNA-Probe. Dieses führt auch
zu einer Erhöhung
der Empfindlichkeit des Nachweises, was den Nachweis einer polymorphen
Stelle in einer DNA-Probe mit einer pikomolaren Konzentration (pM)
ermöglicht.
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Die
zur Primerverlängerungsamplifikation
benötigte
Zahl von Thermozyklen bei einem beliebigen Nachweis hängt von
der Anfangskonzentration der DNA-Probe und der Empfindlichkeitsschwelle
des Massenspektrometers ab. Bei einem beliebigen Thermozyklus ist
der maximale Anstieg der molaren Konzentration des verlängerten
Primers gleich der molaren Konzentration der DNA-Probe unter der
Annahme, dass alle anderen Komponenten, d. h. der Primer 30 und
die Nucleotidbasen 36, 36', im Überschuss vorhanden sind. Die Konzentration
des verlängerten
Primers wird bei jedem Thermozyklus um eine Menge erhöht (die
Mengeneinheit ist die Konzentration der DNA-Probe). In bestimmten
Ausführungsformen,
bei denen die Konzentration der DNA-Probe unter der Empfindlichkeitsschwelle
des Massenspektrometers ist, wird ein großer Überschuss von Primer gegenüber der
DNA-Probe in Kombination mit mehreren Thermozyklen verwendet, um
das Niveau der Konzentration des verlängerten Primers über die
Empfindlichkeitsschwelle des Massenspektrometers zu bringen. In
diesem Fall ist das Molekülverhältnis des
Primers 30 zu der DNA 20 im Bereich von ungefähr 1:1 bis ungefähr 50:1,
wenn bis zu 50 Thermozyklen verwendet werden, und vorzugsweise von
ungefähr
1:1 bis ungefähr
25:1, wenn bis zu 25 Thermozyklen verwendet werden.
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Der
in Kombination mit der Polymerase verwendete Puffer ist ein Puffer,
der kompatibel mit einem Primerverlängerungsverfahren ist. Jedoch
erzeugt die Verwendung eines ein Alkalimetall enthaltenden Puffers DNA-Addukte,
die die Interpretation der Massenspektren kompliziert machen, und
derart die Identifizierung des Polymorphismus schwieriger machen.
In einer bevorzugten Ausführungsform
ist der Puffer eine flüchtige Säure-Base-Kombination,
die keine DNA-Addukte bildet. In bevorzugten Ausführungsformen
ist der Puffer Ammoniumacetat oder Ammoniumformiat. In einer weiteren
bevorzugten Ausführungsform
ist der Puffer Ammoniumacetat in einer Konzentration im Bereich
von 25 mM bis 100 mM. In anderen bevorzugten Ausführungsformen
ist in dem Puffer ein Polymerase-Cofaktor, wie Magnesiumchlorid
oder Magnesiumacetat, enthalten. In einer am stärksten bevorzugten Ausführungsform
besteht der Puffer aus 25–100
mM Ammoniumacetat mit 1,5 mM Magnesiumacetat.
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Nachdem
der Primer verlängert
wurde, wird die Identität
der addierten Nucleotidbase 36 dann durch Massenspektrometrie
durch Vergleich der Massen des verlängerten Primers 30' und des Primers 30 bestimmt (Stufe
5). Die Massendifferenz zwischen den zwei Primern kennzeichnet die
spezifische Nucleotidbase 36, die an den Primer 30' addiert wurde
(siehe Tabelle 1). Nachdem die Identität der Nucleotidbase 36 an
dem verlängerten
Primer 30' bestimmt
wurde, wird die Identität
der Nucleotidbase an der vermuteten Punktmutation 10 auf
der DNA 22 gemäß den Regeln
der Watson-Crick-Basenpaarung leicht abgeleitet. In einer Ausführungsform
wird die Massenspektrometrieanalyse unter Verwendung von Elektrospray-,
matrixunterstützte
Laserdesorptionsionisation (MALDI), Fast-Atom-Bombardment-Ionisation
(FAB) oder Plasmadesorptionsionisation durchgeführt. In weiteren Ausführungsformen
wird die Massenspektrometrieanalyse unter Verwendung von Flugzeit
(TOF)-, Quadrupol-, Ionenfalle- und Sektoranalysemoden durchgeführt. In
einer bevorzugten Ausführungsform
wird die Massenspektrometrieanalyse unter Verwendung von MALDI-TOF-Massenspektrometrie ausgeführt.
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In
Bezug auf 2 werden die Ergebnisse eines
Einzelnucleotidpolymorphismus(SNP)-Nachweises unter Verwendung einer
Primerverlängerungsreaktion
mit einer Polymerase gezeigt. Für
dieses Experiment bestand die Ziel-DNA aus der Sequenz lacI (Wildtyp ”C”) 5'-CTGAATTACA TTCCCAACCG
CGTGGCACAA CAACTGGCGG GCAAACAGTC
GTTGCTGATT-3' (SEQ
ID NO: 1), in der C für die vermutete
Punktmutation 10 steht. Zum Zweck einer Primerverlängerungsamplifikation
wurde Thermosequenase, eine genetisch veränderte Form von T7-DNA-Polymerase, von Amersham
Life Science (Arlington Heights, Illinois, USA) zur wiederholten
Verlängerung
des Primers 3'-TTGACCGCCC
GTTTGTCAGC-5' (SEQ
ID NO: 2) verwendet. Der Primer war in 2,5× molarem Überschuss über die Ziel-DNA vorhanden
und es wurde bestimmt, dass ungefähr eine Hälfte des Primers in einem einzigen
Thermozyklus von 95°C
während
10 s, 37°C
während
60 s und 72°C während 60
s umgewandelt wurde. Im wesentlichen der gesamte Primer wurde in
drei Zyklen verlängert. Wenn,
wie in 2 gezeigt, Didesoxyadenosintriphosphat (ddATP)
(Linie A) und Didesoxycytidintriphosphat (ddCTP) (Linie B) individuell
als Base 36' zugegeben
wurden, wurde im wesentlichen keine der zugegebenen Didesoxynucleotidbasen
in den Primer 30 eingebaut. Wenn Didesoxyguanosintriphosphat
(ddGTP) (Linie C) als Base zugegeben wurde, wurde der gesamte Primer 30 zu
dem verlängerten
Primer 30' mit
einer zusätzlichen
Didesoxyguanylat(ddG)-Base umgewandelt. Wenn Didesoxythymidintriphosphat
(ddTTP) als Base zugegeben wurde (Linie D), wurde ein kleiner Anteil
der Didesoxythymidylatbase (ddT) nicht-spezifisch an den Primer
addiert. Wenn jedoch alle vier Didesoxynucleotide (Linie E) zusammen
zugegeben wurden, wurde wieder nur das Didesoxyguanylat in den Primer
eingebaut.
-
Unter
Bezugnahme auf 3 enthalten, wenn das Verfahren
zur Untersuchung von Einzelnucleotidpolymorphismen in einer heterozygoten
Probe verwendet wird, die DNA-Stränge 22, 22' der heterozygoten Probe
jeweils eine unterschiedliche Nucleotidbase 10 bzw. 10' an der vermuteten
Punktmutation. In dem gezeigten Beispiel enthält die Probe ein 1:1-Gemisch
der Ziel-DNA mit Cytosin oder Thymin an den vermuteten Punktmutationen 10 bzw. 10'. Wie oben beschrieben
wird die DNA denaturiert und jeder der Ziel-Stränge 22, 22' mit dem Primer 30 hybridisiert
(Stufe 1). Die vier Didesoxynucleotidbasen werden dann zusammen
mit der Polymerase und einem Puffer, wie oben beschrieben, zugegeben.
Die Didesoxynucleotidbasen 36, 36'',
die zu den vermuteten Punktmutationen 10 bzw. 10' komplementär sind,
verlängern
dadurch den Primer 30 (Stufe 2). In dem gezeigten Beispiel
wird der Primer 30, der an die Ziel-DNA 22 bzw. 22' hybridisiert
ist, durch Didesoxyguanylat (ddG) 36 bzw. Didesoxyadenylat
(ddA) 36'' verlängert. Unter
Bezug auf 4 ist bei einer wie oben beschriebenen
Analyse durch Massenspektroskopie das Ergebnis ein Massenspektrum
mit zwei Peaks, die sich um eine Masse von 16,050 Da unterscheiden,
was nahe der erwarteten Molekulargewichtsdifferenz von 15,999 Da
zwischen den zwei Didesoxynucleotidbasen dG und dA, die jeweils
Primer 30' und 30'' verlängern, ist, und was innerhalb
des experimentellen Fehlers des Massenspektrometers ist.
-
In
einer weiteren Ausführungsform
und unter Bezug auf 5 enthält der Primer 56 ein
Massetag 54. Das Massetag 54 ist vorzugsweise
eine beliebige Form einer Masseverlänge rung des Primers 56,
die nicht mit der Ziel-DNA 60 hybridisiert und die auch
nicht die Stabilität
des Hybrids oder die Verlängerung
des Primers unter Verwendung von DNA-Polymerase stört. Daher
ist in einer Ausführungsform
das Massetag 54 aus zwei oder mehreren an das 5'-Ende des Primers 56 addierten
Nucleotidbasen 54, die nicht komplementär zu der Ziel-DNA 60 sind,
aufgebaut. Für
eine bequeme Synthese kann das Massetag 54 aus einem Homopolymerschwanz 54,
der an das 5'-Ende
des Primers 56 synthetisiert ist, aufgebaut sein. In einer
Ausführungsform
ist der Homopolymerschwanz 54 ein Polydesoxythymidylat,
Tn, worin n eine ganze Zahl im Bereich von
1 bis 40 ist.
-
Der
Zweck des Massetags ist, die Primer und die verlängerten Primer, die sonst durch
Massenspektrometrie unauflösbar
sein könnten,
zu trennen. Da zwei Primer oder verlängerte Primer dieselbe Anzahl
von Basen und daher ungefähr
das gleiche Molekulargewicht haben können und daher durch Massenspektrometrie
unauflösbar
sein können,
fügt die
Addition eines Massetags an einen der Primer genügend Masse zur Ermöglichung
ihrer Auflösung
zu. Das ermöglicht
die Verwendung von zwei oder mehreren Primern in demselben Nachweis
zur gleichzeitigen Sondierung von mehreren Einzelnucleotidpolymorphismen.
-
Um
einen derartigen Nachweis, beispielsweise ein Sondieren für zwei Einzelnucleotidpolymorphismen,
durchzuführen,
werden zwei Primer 30, 56, die jeweils entsprechend
komplementär
zu den Basen, die an die auf dem Einzelstrang von DNA 60 vorhandenen
unterschiedlichen Einzelnucleotidpolymorphismen 10, 50 angrenzen,
sind, bereitgestellt (Stufe 1). Die Primer 30, 56 haben
durch mindestens die Addition eines Massetags 54 an einen
der Primer 30, 56 eine unterschiedliche Masse.
Wie im vorhergehenden beschrieben, wird jeder Primer 30, 56 an
seinem komplementären
Bereich der Ziel-DNA 60 hybridisiert und die Didesoxynucleotidbasen 36,
Polymerase und Puffer (nicht gezeigt) werden dem Gemisch zugesetzt
(Stufe 2). Jede Didesoxynucleotidbase 64, 68,
die komplementär
zu ihrem entsprechenden Einzelnucleotidpolymorphismus 10, 50 ist,
verlängert
dann, wie oben beschrieben, die Primer 30 bzw. 56 (Stufe
3). Die Ziel-DNA 60 und die Primer 30, 56,
die durch die Basen 64 bzw. 68 verlängert wurden,
werden, wie im vorhergehenden beschrieben, durch Massenspektrometrie
analysiert.
-
Der
Nachweis für
mehrfache SNPs ist gleich gut anwendbar, wenn sich die SNPs auf
demselben DNA-Segment, aber an verschiedenen Orten, oder auf zwei
oder mehreren DNA-Segmenten befinden. Die mehreren DNA-Segmente
können
komplementäre
Stränge
sein oder völlig
verschiedene Nucleotidsequenzen haben. Einige Nachweise können so
gestaltet werden, dass die Primer entweder an einem oder dem anderen der
zwei zu sondierenden komplementären
DNA-Stränge
hybridisieren. Dieses ist besonders gut geeignet für Multiplexnachweisexperimente,
bei denen zwei SNPs voneinander durch eine Zahl von Nucleotidbasen,
die kleiner ist als die Zahl der Nucleotidbasen der stromabwärtigen Primer,
getrennt sind, wodurch eine Überlappung
ihrer Bindestelle auf der DNA vermieden wird. Da die 3'-Enden der Sequenzen
von zwei komplementären DNA-Strängen zueinander
gegensätzlich
angeordnet sind, ist es möglich,
zwei Primer zum Sondieren von zwei nahe beieinander gelegenen SNPs
derartig zu entwerfen, dass ein Primer an einem Strang einer DNA bindet
und der stromabwärtige
an den anderen Strang bindet, wobei jeweils ihre 5'-Enden von den zwei
vermuteten Punktmutationen weggerichtet sind und ihre 3'-Enden an eine vermutete
Punktmutation angrenzen, und dass die Primer keine komplementären Segmente
in ihren Sequenzen haben.
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Die
Ergebnisse von derartigen Nachweisen für mehrfache Ein zelnucleotidpolymorphismen
werden in 6a, 6b, 6c, 6d, 6e und 6f gezeigt.
In 6a und 6b werden
fünf Primer
des Experiments (R377, R400, R421, R447, R355), die zur Untersuchung
von fünf
Orten des Brustkrebsempfindlichkeitsgens BRCA1 entworfen wurden,
gezeigt. Wie es unten in Tabelle 2 gezeigt ist, sind die fünf Primer
jeweils zu einem unterschiedlichen Bereich des Gens komplementär. Jeder
Primer hat dieselbe Basislänge
von 18 komplementären
Basen, aber jeder Primer, bis auf einen, hat ein von den anderen
unterschiedliches Massetag; ein Primer hat kein Massetag. Daher
hat jeder Primer eine von allen anderen Primern deutlich unterschiedliche
Masse. Das Massenspektrum der fünf
Primer vor einer Verlängerung
wird in 6a gezeigt. Wenn die Primer
unter Verwendung des oben beschriebenen Verfahrens mit 25 Thermozyklen
verlängert
werden und die Massenspektren aufgenommen werden, ist die Masse
von jedem Primer um die Masse des addierten Nucleotids erhöht. Es wird
angemerkt, dass der Primer R355 durch die Addition von Didesoxyguanin
vollständig umgesetzt
wurde und deshalb ist kein dem unverlängerten Primer entsprechender
Peak in 6b vorhanden. Unerwarteterweise
störte
die Addition eines Decadesoxythymidylat-Rests (dT10)
an dem 5'-Ende von
R355 offensichtlicherweise nicht die Verlängerung von Primer R377, obwohl
die zwei Primer an die DNA innerhalb weniger Nucleotidbasen binden.
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Die 6c und 6d zeigen
ein Experiment mit sieben Primern, die zur Untersuchung von sieben Orten
auf dem Brustkrebsempfindlichkeitsgen BRCA1 entworfen wurden (R355,
R377, R400, R421, R447, R480 auf einem Strang und F320 auf dem anderen
Strang). Alle der in 6c gezeigten Primer wurden durch die
erwarteten Nucleotidbasen innerhalb 25 Thermozyklen verlängert. In 6d sind
alle 14 Peaks der sieben Primer und der sieben verlängerten
Primer aufgelöst,
aber zwei Primer, R355 und F320, wurden fast quantitativ verlängert. Es
wird angemerkt, dass der Primer F320 zu zwei Produkten führte: eines,
das der Addition von ddT entspricht, und das andere, das der Addition
von dT und ddC entspricht. T und C passen zu den zwei Nucleotidbasen,
die stromabwärts
der Bindestelle von Primer F320 auf BRCA1 liegen. Diese Zweibasenverlängerung
geschieht aufgrund eines Übertrags
von restlichen Desoxynucleotidbasen aus der PCR-Amplifikation von der Ziel-DNA BRCA1.
Restliche Desoxynucleotidbasen können
durch eine Reinigung der Ziel-DNA nach PCR-Amplifikation durch Präzipitierung
mit Ethanol, Gelfiltration oder Inkubation mit alkalischer Phosphatase aus
Krabben eliminiert werden.
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Tabelle
2: SNP-Primer für
Multiplex-Nachweise
-
-
Die 6e und 6f zeigen
sieben Primer des Experiments, die zur Untersuchung von fünf Orten auf
dem Brustkrebsempfindlichkeitsgen BRCA1 (R355, R377, R400, R421,
R447) und einem Ort auf einer synthetischen Sequenz von 60 Basen
des lacz-Gens (b2-1 mit einem 15-mer und einem 20-mer) entworfen
wurden. Zwei Primer, die an dieselbe Stelle hybridisieren (b2-1),
aber eine um fünf
Basen unterschiedliche Länge haben,
werden zur Bestimmung der Wirkung der Grundlänge der Primer auf ihre Fähigkeit,
mit ihrer Zielstelle zu hybridisieren, und daher ihre Fähigkeit
zum Erfahren einer Nucleotidbasenverlängerung, einbezogen. Alle sieben
in 6e gezeigten Primer wurden durch die erwartete
Nucleotidbase verlängert.
Drei der Primer wurden quantitativ innerhalb 25 Thermozyklen verlängert. In 6f sind
alle 14 Peaks der sieben Primer und der sieben verlängerten
Primer aufgelöst,
jedoch werden drei Primer (beide b2-1 und R355) quantitativ verlängert, während bei
zwei Primern, R400 und R421, deutlich geringere Mengen der verlängerten
Primer als bei den anderen Primern erzeugt wurden. Es wird angemerkt,
dass beide Primer b2-1 ferner zu jeweils zwei verlängerten
Primern führten:
die erwartete Nucleotidbase ddG und eine Zweibasenverlängerung,
dGddT, die der stromabwärts
der Bindestelle der Primer b2-1 gelegenen Sequenz des lacz-Gens
entspricht.
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In
einer weiteren Ausführungsform
betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Identifizierung eines
Einzelnucleotidpolymorphismus unter Verwendung eines Ligase-Kettenreaktionsnachweises
(LCR) an entweder einer einzelsträngigen oder einer doppelsträngigen DNA.
Unter Bezug auf 7 wurde eine Gruppe von 10 Oligonucleotidsonden 70, 71, 71', 71'', 71''', 72, 73, 73', 73'' und 73''' für die zwei
Stränge
einer DNA 20, 22 mit einer einzigen vermuteten
Punktmutation 9, 10 bereitgestellt. In dem ersten
Zyklus werden die Oligonucleotidsonden an der vermuteten Punktmutation 9, 10 an
jedem Strang von DNA 20, 22 so hybridisiert, dass
die Sonden 70 und 71 zusammen die vermutete Mutationsstelle 9 auf
dem DNA-Strang 20 und die Sonden 72 und 73 zusammen
die vermutete Mutationsstelle 10 auf dem DNA-Strang 22 überlappen
(Stufe 1). Jede Gruppe von Sonden 70, 71 und 72, 73 auf
jedem DNA-Strang 20, 22 wird dann unter Verwendung
einer Ligase und eines geeigneten Puffers ligiert (Stufe 2). In
den Folgezyklen dienen die ligierten Sonden 80 und 81 als Templat
zusammen mit den DNA-Strängen 20 und 22,
um die Sonden 70, 71, 72 und 73 zu
ligieren, was zu einer Amplifikation der im DNA-Segment 20, 22 enthaltenen,
in den ligierten Sonden 80 und 81 exprimierten, genetischen
Information führt.
Die erhaltenen zwei ligierten Oligonucleotidsonden 80, 81 werden
durch Massenspektrometrie analysiert. Die Ligationsstufe erzeugt
die ligierten Sonden 80 und 81 nur dann, wenn
die zu der vermuteten Punktmutation 9, 10 passenden
Sonden 71 und 73 an ihren entsprechenden DNA-Strang
hybridisiert sind. Wenn eine der Sonden, beispielsweise 71', 71'', 71''', 73', 73'' und 73''', nur teilweise
an die DNA im Bereich der vermuteten Mutation hybridisiert ist,
wird dann die Ligase keine ligierte Sonde erzeugen. Daher wird die
Identität
der Basen 76 und 78 der ligierten Sonden 80 oder 81,
die zu der vermuteten Punktmutation 9, 10 passen,
durch Ermitteln ihrer Masse und Vergleichen derselben mit der Summe
der Massen von 70 und 71, 70 und 71', 70 und 71'' und 70 und 71''' für die ligierte
Sonde 80 und der Summe der Massen von 72 und 73, 72 und 73', 72 und 73'' und 72 und 73''' für die ligierte
Sonde 81 abgeleitet. Nachdem die Identität der Basen 76, 78 in
den ligierten Sonden 80, 81 bestimmt wurde, wird
die Identität
der Basen an der vermuteten Punktmutation 9, 10 gemäß den Regeln
der Watson-Crick-Basenpaarung abgeleitet. Es wird angemerkt, dass die
durch die ligierte Sonde 81 bereitgestellte Information
in Bezug auf die durch die ligierte Sonde 80 bereitgestellte
Information redundant ist, was die Ableitung der Identität der Base
an der vermuteten Mutationsstelle des DNA-Strangs 20 ermöglicht.
Die Identität
der Base an dem zweiten Strang 22 kann auch aus der Identität der Base
an dem Strang 20 gemäß den Regeln
der Watson-Crick-Basenpaarung abgeleitet werden. Diese Redundanz
stellt eine größere Zuverlässigkeit
bei der Bestimmung durch den Nachweis durch Bereitstellung einer
zweiten analysierbaren Datengruppe bereit.
-
Unter
Verwendung einer einzelsträngigen
DNA 20 mit LCR wird in dem ersten Zyklus nur eine ligierte Sonde 80 aus
den Sonden 70 und 71 mit einer komplementären Sequenz
erzeugt. Dann werden in den anschließenden Zyklen jeweils die ligierte
Sonde 80 und der Einzelstrang 20 als Templat für die Ligation
der Sonden 70, 71, 72 und 73 dienen,
wodurch die ligierten Sonden 80 und 81 erzeugt
werden. Die anschließenden Zyklen
werden eine Amplifikation der genetischen Information durch Erzeugen
von großen
Mengen von jeweils den ligierten Sonden 80 und 81 bewirken,
als ob eine doppelsträn gige
DNA ursprünglich
verwendet wurde.
-
In
einer Ausführungsform
wird ein Massetag an eine der Sonden angefügt, beispielsweise um eine Sonde
mit Tag zu bilden (nicht gezeigt). Das Massetag kann entweder an
das 3'-Ende oder das 5'-Ende einer Sonde
angefügt
werden, sofern es an das Ende, das nicht an der Ligation zwischen
zwei Sonden teilnimmt, angefügt
wird. Die Zahl der Basen in der erhaltenen ligierten Sonde (nicht
gezeigt) ist nun durch die Zahl der Basen, die in dem Tag des Primers
angefügt
sind, erhöht.
Dieses Anfügen
eines Massetags erhöht
den Unterschied der Massen von ligierten Sonden und ermöglicht derartig
eine größere Auflösung der
Ergebnisse eines Ligationsnachweises, in dem sonst die Massen von
ligierten Sonden für
ein Erreichen einer guten Auflösung ihrer
entsprechenden Peaks durch Massenspektrometrie zu nahe sein würden. Dieses
Anfügen
eines Massetags kann auch zur Erleichterung der Interpretation des
Nachweisexperiments durch Differenzierung zwischen den Primern 71, 71', 71'' und 71''' oder zwischen
den Primern 73, 73', 73'' und 73''' verwendet werden.
-
In
Bezug auf
8 werden die Ergebnisse eines
Einzelnucleotid(SNP)-Nachweises unter Verwendung einer Ligasereaktion
an einer homozygoten DNA-Probe durch Analyse mit Massenspektrometrie
gezeigt. Für
dieses Experiment hatte die Ziel-DNA die folgende Nucleotidsequenz:
5'-CTGAATTACA TTCCCAACCG
CGTGGCACAA CAA
CTGGCGG GCAAACAGTC
GTTGCTGATT-3' (SEQ ID
NO: 1),
worin
C die Punktmutation
ist. Zwei konstante Sonden und acht variable Sonden wurden hergestellt.
Die Sequenzen der Sonden (in Tabelle 3 gezeigt) wurden so entworfen,
dass eine Sonde von 19 Basen mit einer Sonde von 21 Basen unter
Bildung einer ligierten Oligonucleotidsonde von 40 Basen und eine
Sonde von 20 Basen mit einer Sonde von 21 Basen unter Bildung einer
ligierten Sonde von 41 Basen ligiert wurde. Tabelle
3: Sonden für
einen Ligasenachweis
- (1) N steht für A, T, C oder G, (2) mx steht für
die Masse des Nucleotids N.
-
Die
erwartete Masse für
jede ligierte Sonde (mit G/C an der variablen Base) ist 12326,93
Da und 12574,15 Da. Wie aus 8 ersehen
werden kann, werden die ligierte Sonde von 40 Basen und die von
41 Basen leicht voneinander mit einer Massendifferenz von ungefähr 248 Da
unterschieden. Unter Bezugnahme auf 9a werden
die Ergebnisse eines SNP-Nachweises
unter Verwendung einer Ligase an einer heterozygoten DNA-Probe,
die sowohl C/T als auch T/A an der Punktmutation hat, durch Analyse
mit Massenspektrometrie gezeigt. Dieser erzeugte zwei ligierte Sonden
von 41 Basen mit einer Massendifferenz von 15,999 Da aufgrund von
G und A, und zwei ligierte Sonden von 40 Basen mit einer Massendifferenz
von 15,011 Da aufgrund von C und T. Unter Bezug auf 9b wird
ein hoch schematisches Diagramm eines SNP-Nachweises unter Verwendung einer Ligase
an einer heterozygoten DNA-Probe gezeigt.
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In
einer weiteren Ausführungsform
betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Identifizierung eines
Einzelnucleotidpolymorphismus unter Verwendung eines Oligonucleo tidligationsnachweises
(OLA) an nur einem DNA-Strang 20 mit einer vermuteten Punktmutation 9.
Das Verfahren umfasst Bereitstellen einer Gruppe von fünf Sonden 70, 71, 71', 71'' und 71''', einer konstanten
Sonde 70 und vier variablen Sonden 71–71''',
wobei die konstante Sonde und nur eine der vier variablen Sonden
an der DNA 20 so hybridisieren, dass die zwei hybridisierenden
Sonden die vermutete Mutationsstelle überlappen und mit der Base
an der vermuteten Punktmutation 9 der DNA 20 perfekt
zusammenpassen; Ligieren der zwei hybridisierten Sonden unter Verwendung
eines Oligonucleotidligationsnachweises; Identifizieren der ligierten
Sonden durch Massenspektrometrie in ähnlicher Weise wie in dem Nachweis
unter Verwendung einer Ligationskettenreaktion mit der doppelsträngigen DNA.
-
Eine
noch weitere Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung umfasst kombinatorische Verfahren für die Identifizierung
der Nucleotidbasen an einer vermuteten Mutationsstelle, die von
einer Deletion, Insertion oder einer Substitution von mehreren Nucleotidbasen
herrührt,
durch Sondieren von mehr als einer Nucleotidbase an der vermuteten
Mutationsstelle. Im allgemeinen umfasst das kombinatorische Verfahren
die Stufen Herstellen einer Kombination von verlängerten Primern von verschiedener
Länge,
wobei die Kombination von verlängerten
Primern ein eine Leitersequenz definierendes Gemisch von kurzen
DNA-Segmenten ist, wobei jede Stufe der Leitersequenz eine Base
an der vermuteten Mutationsstelle darstellt, und Analysieren der
Kombination von verlängerten
Primern durch Massenspektrometrie (wobei die Masse von jedem verlängerten
Primer von spezifischer Länge
eine Stufe der Leitersequenz definiert). Die Identität der Sequenz
an der vermuteten Mutationsstelle wird durch die aufeinanderfolgende
Bestimmung der Massenunterschiede zwischen jeder Stufe der Leitersequenz
abgeleitet, wobei entweder mit dem längsten verlängerten Primer begon nen und zu
dem in dem Nachweis verwendeten ursprünglichen Primer weitergegangen
wird oder mit dem ursprünglichen
Primer begonnen und zu dem längsten
verlängerten
Primer weitergegangen wird.
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Genauer
und unter Bezug auf 10 umfasst eine Ausführungsform
der kombinatorischen Verfahren zuerst das Hybridisieren eines Primers 30 mit
einer Sequenz, die komplementär
zu einem Ziel-DNA-Segment 22 mit einer vermuteten Mutationsstelle 11 ist
(Stufe 1). Das 3'-Ende
des Primers 30 wird angrenzend an die vermutete Mutationsstelle 11 positioniert.
Als nächstes
wird der Primer 30 durch Addition einer Mehrzahl von Nucleotidbasen 36, 38 an
den Primer 30 verlängert
(Stufe 2). Dafür
wird jede der möglichen
komplementären Basen
in Form von Desoxynucleotiden 38 und Didesoxynucleotiden 36 dem
Gemisch zusammen mit einer DNA-Polymerase und einer geeigneten Pufferlösung zugesetzt
(nicht gezeigt). Der verlängerte
Primer 30', 42, 42' oder 42'' wird dann von der DNA 22 geschmolzen
(Stufe 3) und die DNA 22 wird dann mit überschüssigem Primer 30 in
den Kreislauf bei Stufe 1 wieder eingeführt. In jedem Thermozyklus
(Stufen 1, 2 und 3) verlängert die
Polymerase den Primer 30 mit den verfügbaren Nucleosidbasen 38 und 36 durch
Anpassen der zugegebenen Basen an die Basen der vermuteten Mutationsstelle 11,
wobei die DNA 22 als Templat dient, bis die Polymerase
entweder in den wachsenden Primer eine Stoppbase (Didesoxynucleotid 36)
einbaut oder die Polymerase die verfügbaren Nucleotidbasen 38 verbraucht
hat. Durch Bereitstellung eines Gemischs von allen Nucleotidbasen 36 und 38 wird
das Verfahren derartig bei jedem Thermozyklus einen verlängerten
Primer 42 mit einer Zufallslänge erzeugen. Durch mehrmaliges
Wiederholen des Thermozyklus erzeugt das Verfahren eine Kombination
von verlängerten
Primern 30', 42, 42' und 42'' von verschiedenen Längen, wobei
die Sequenz des verlängerten
Teils 15 der verlängerten
Primer aus Desoxynucleotidbasen plus der terminalen Didesoxynucleotidbase,
die alle zu der Sequenz der vermuteten Mutationsstelle 11 von
DNA 22 passen, besteht.
-
Vorzugsweise
wird eine thermostabile DNA-Polymerase verwendet, jedoch kann eine
beliebige DNA-Polymerase unter der Voraussetzung, dass, falls eine
Amplifikation erforderlich ist, eine zusätzliche Menge der Polymerase
vor jedem Thermozyklus zugegeben wird, verwendet werden. Ein Thermozyklus
umfasst eine Hybridisierungsstufe, die vorzugsweise bei 37°C während 60
s durchgeführt
wird, eine Primerverlängerungsstufe;
und eine Denaturierungsstufe, bei der die DNA-Probe auf eine Temperatur von vorzugsweise
95°C während 10
s erhitzt wird, was ausreichend ist, dass jede DNA/DNA(20, 22)-Helix,
jedes DNA/Primer-Hybrid (22, 30) oder jede der
DNA/verlängerter
Primer(22, 42)-Duplexe geschmolzen wird. Das Verhältnis von
Didesoxynucleotidbasen 36 zu Desoxynucleotidbasen 38 (ddNTP:dNTP)
für jede
Base kann von 1000:1 bis 0,025:1 variiert werden. Der bevorzugte
Bereich beträgt
ungefähr
2:1 bis 0,05:1, wenn Thermosequenase verwendet wird.
-
Die
Kombination von verlängerten
Primern 30', 42, 42' und 42'' erzeugt ein eine Leitersequenz
definierendes Gemisch, worin jeder der verlängerten Primer 30', 42, 42' und 42'' für eine Stufe der Leitersequenz steht.
Jeder der verlängerten
Primer 30', 42, 42' und 42'' hat eine der vier Didesoxynucleotidbasen 36 am
Ende. Die Massendifferenz zwischen jeder Stufe der Leitersequenz
entspricht daher der Masse von einer der vier Didesoxynucleotidbasen 36.
Die Identität
der Sequenz an der polymorphen Stelle wird dann durch Messung der
Massendifferenz zwischen zwei aufeinanderfolgenden Stufen der Leitersequenz,
Korrelieren der Masse mit einer der vier Didesoxynucleotidbasen
und Wiederholen desselben für
jede Stufe der Leitersequenz bestimmt (Stufe 4). Nachdem die addierte
Sequenz 15 an den verlängerten
Primern identifiziert wurde, wird die Identität der Sequenz an der vermuteten
Mutationsstelle 11 durch Befolgung der Regeln der Watson-Crick-Basenpaarung
abgeleitet.
-
Unter
Bezugnahme auf 11 werden die Ergebnisse eines
kombinatorischen Nachweises, der an der Oligonucleotidzielsequenz:
5'-CTGAATTACA TTCCCAACCG
CGTGGCACAA CAACTGGCGG GCAAACAGTC GTTGCTGATT-3' (SEQ ID NO: 1),
worin GTGGCACAAC (Teil der
SEQ ID NO: 1) die vermutete Mutationsstelle 11 darstellt,
durchgeführt
wurde, gezeigt. Die zwanzig Basen lange Sequenz: 3'-TTGACCGCCC GTTTGTCAGC-5' (SEQ ID NO: 2) wird
als Primer verwendet.
-
Die
Thermozyklen wurden an 0,4 μM
einer Oligonucleotidzielsequenz in Gegenwart von 2 μM von Primer 30,
20 μM von
jeder Triphosphatbase (einer Kombination von Didesoxy und Desoxy)
in einem Verhältnis von
ddNTP:dNTP von 0,1 und 30 Units/ml von Thermosequenase in 25 mM
Ammoniumacetat bei pH 9,3 und 2 mM Magnesiumchlorid-Pufferlösung durchgeführt. Der
Thermozyklus wurde mit dem Reaktionsgemisch bei 95°C während 10
s, 37°C
während
30 s und 72°C
während
60 s in 20 Zyklen in einem Perkin Elmer 9600 DNA Thermal Cycler
durchgeführt.
Eine Menge von 10 μl
der Reaktionsmischung wurde als Probe entnommen und durch eine Pipettenspitze,
die mit ein paar Mikrolitern von POROS® R1
gepackt war, appliziert, mit 100 mM Triethylammoniumacetatlösung gewaschen
und in ungefähr
2 μl einer
Acetonitril:Wasser(80:20)-Lösung eluiert.
Die erhaltene Lösung
wurde dann durch MALDI-TOF-Massenspektrometrie analysiert. Wie in 11 gezeigt,
wurde der gesamte ursprüngliche
Primer 30 innerhalb der 20 Zyklen verlängert, und kein Peak, der dem ursprünglichen
Primer 30 entspricht, wurde in dem Massenspektrum beobachtet.
Das Massenspektrum zeigt die Masse von zehn verlängerten Primern ausgehend von
einem Primer mit einundzwanzig Basen bis zu einem Primer mit dreißig Basen.
Die Sequenz des addierten Teils 15 wird durch Messung der
Massendifferenz zwischen jeder Stufe der Leitersequenz abgeleitet
und als 5'-GTTGTGCCAC-3' (SEQ ID NO: 15)
dargestellt. Daher wird die Sequenz der vermuteten Mutationsstelle 11 als
die komplementäre
Sequenz abgeleitet: 3'-CAACACGGTG-5' (Teil von SEQ ID
NO: 1).
-
In
einer weiteren Ausführungsform
und unter Bezugnahme auf 12 umfasst
das kombinatorische Verfahren Hybridisieren eines Primers 30,
der eine komplementäre
Sequenz aufweist, an ein Ziel-DNA 22-Segment mit einer
vermuteten Mutationsstelle 11 (Stufe 1). Das 3'-Ende des Primers 30 grenzt
an die vermutete Mutationsstelle 11 an. Der Primer 30 wird
durch Zugabe einer vollständigen
Gruppe von Desoxynucleotidbasen 38 mit nur einer der vier
Didesoxynucleotidbasen 36, beispielsweise ddG, zusammen
mit einer DNA-Polymerase und einer geeigneten Pufferlösung (nicht
gezeigt) verlängert
(Stufe 2). Mit dem Gemisch wird ein Thermozyklus zur Amplifikation
des Primers 30 zu messbaren Mengen von verlängerten
Primern 43, 43' und 43'' durchgeführt. Wieder ist die letzte
Base von jedem verlängerten
Primer die Didesoxynucleotidbase 36. Da die Massendifferenz
zwischen jedem der verlängerten
Primer 43, 43' und 43'' wahrscheinlich größer als
die Masse einer Didesoxynucleotidbase 36 sein wird, können keine
Sequenzdaten an diesem Punkt des Verfahrens extrahiert werden. Das
Gemisch der verlängerten
Primer 43, 43' und 43'' wird einer Verdauung durch eine
Exonuclease unterworfen (Stufe 4), damit ein eine Leitersequenz
definierendes Gemisch von verlängerten
Primern von verschiedenen Längen,
das die verlängerten
Primer 43, 43' und 43'' und die neu gebildeten verdauten
Primer 44, 44', 44'', 45, 45', 45'', 46 und 46' umfasst, erzeugt
wird. Die Addition einer Base 36 wird zur Steuerung der
Länge der
verlängerten
Primer durchgeführt,
andernfalls würde
der Primer 30 zu einer langen und undefinierten Länge verlängert werden
und seine molare Konzentration würde
für eine
Detektion durch Massenspektrometrie zu gering werden. Durch Beschränken der
Primerverlängerung
auf eine relativ geringe Länge
kann eine hohe molare Konzentration der verlängerten Primer erhalten werden.
Ferner kann eine gesteuerte Längenverteilung
der verdauten Primer mit nachweisbaren molaren Konzentrationen durch
Erzeugen einer gesteuerten Längenverteilung
der verlängerten
Primer vor der Verdauungsstufe erhalten werden. Die Kombination
von verlängerten
Primern und verdauten Primern definiert eine Leitersequenz, bei der
die Massendifferenz zwischen beispielsweise dem verlängerten
Primer 43 und dem ersten verdauten Primer 44 die
Masse der Didesoxynucleotidbase 36 ist und die Massendifferenz
zwischen jeder aufeinanderfolgenden Stufe der Leitersequenz, die
durch die verdauten Primer, beispielsweise 44 und 44' oder 44' und 44'', gebildet wird, die Masse einer
der vier Desoxynucleotidbasen 38 ist. Um das Lesen des
aus der Verdauung resultierenden Massenspektrums zu erleichtern,
wird vorzugsweise ein Massenspektrum des Gemischs von den verlängerten
Primern 43, 43' und 43'' als Hilfe zur Lokalisierung ihrer
Peaks in dem aus der Verdauung resultierenden Massenspektrum aufgenommen,
bevor die Verdauung durchgeführt
wird. Nachdem jede Stufe der Leitersequenz entweder einer Base 36 oder 38 zugeordnet
wurde (Stufe 5), wird die Sequenz der vermuteten Mutationsstelle
durch Befolgung der Regeln der Watson-Crick-Basenpaarung abgeleitet.
Dieses Verfahren ist besonders gut geeignet, wenn die zu bestimmende
Zahl von Basen an der vermuteten Mutationsstelle 11 größer als
10 ist.
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Die
Verdauung des Gemischs der verlängerten
Primer 43, 43' und 43'' kann mit einer beliebigen bekannten
Exonuclease, wie Phosphodiesterase Typ I, Exonuclease I, Exonuclease
III, Exonuclease V, Exonuclease VII und DNA-Polymerase III, durchgeführt werden.
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In
einer noch weiteren Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung erfolgt die Bereitstellung eines kombinatorischen
Multiplexverfahrens zur Identifizierung von mehrfachen vermuteten
Mutationsstellen, die von einer Deletion, Insertion oder einer mehrfachen
Substitution einer Nucleotidbase herrühren. Unter Bezugnahme auf 13 umfassen
die Verfahren das Hybridisieren einer Mehrzahl m von Primern 30 und 57,
die jeweils eine Sequenz, die komplementär zu einer DNA 62 ist,
an eine vermutete Mutationsstelle 11 bzw. 11' einer DNA 62,
die mehr als eine vermutete Mutationsstelle hat (Stufe 1). Als nächstes wird
in dem Verfahren die Mehrzahl m von Primern in Gegenwart einer Mehrzahl
von Nucleotidbasen 36 und 38 mit einer DNA-Polymerase
und einer geeigneten Pufferlösung
(nicht gezeigt) so verlängert,
dass jeder Primer durch mehr als eine Nucleotidbase verlängert wird
(Stufe 2). Die Mehrzahl von verlängerten
Primern 30' und 58 wird
von der DNA 62 (Stufe 3) geschmolzen und die DNA 62 wird
in den Kreislauf wieder eingeführt
(Stufe 1), damit sie mit den überschüssigen Primern 30 und 57 hybridisiert.
In jedem Zyklus verlängert
die Polymerase die Mehrzahl der Primer 30 und 57 mit
den verfügbaren
Nucleotidbasen 36 und 38 durch Anpassen der zugesetzten
Basen an den polymorphen Stellen 11 und 11', wobei die
DNA 62 als ein Templat dient, wodurch eine Vielzahl von
verlängerten
Primern 53', 42, 42'', 58, 58', 58'' und 58''' erzeugt wird.
Schließlich
wird die Kombination von verlängerten
Primern durch Massenspektrometrie identifiziert (Stufe 4). Die Kombination
von verlängerten
Primern definiert eine Reihe von Leitersequenzen, wobei jede Leitersequenz
ein Abdruck von jeder vermuteten Mutationsstelle 11 und 11' ist. Die Sequenz
von jeder vermuteten Mutationsstelle wird dann duch Subtrahieren der
Massen zwischen zwei angrenzenden Stufen von jeder Leitersequenz
und Zuordnen der Massendifferenz zu einer Nucleo tidbase bestimmt.
Die Base an der vermuteten Mutationsstelle wird dann gemäß den Regeln der
Watson-Crick-Basenpaarung abgeleitet. Dieses wird für jede Stufe
einer Leitersequenz wiederholt.
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In
einer noch weiteren Ausführungsform
umfasst das kombinatorische Multiplexverfahren die Kombination von
Primerverlängerung
und Verdauung. Zuerst wird eine Mehrzahl m von Primern, die jeweils
eine komplementäre
und an eine vermutete Mutationsstelle einer DNA aus einer Probe,
die mehr als eine vermutete Mutationsstelle hat, angrenzende Sequenz
haben, an die DNA hybridisiert. Als nächstes wird die Mehrzahl m von
Primern in Gegenwart einer Mehrzahl von Desoxynucleotidbasen und
mindestens einer Didesoxynucleotidbase mit einer Polymerase und
einer geeigneten Pufferlösung
so amplifiziert, dass jeder Primer durch mehr als eine Nucleotidbase
verlängert
wird. Drittens wird mit der Mehrzahl von verlängerten Primern eine Verdauung
unter Verwendung einer Exonuclease durchgeführt. Schließlich wird die Kombination
von verlängerten und
verdauten Primern durch Massenspektrometrie analysiert. Die Sequenz
von jeder vermuteten Mutationsstelle wird dann wie früher beschrieben
bestimmt. Um eine gute Auflösung
des Massenspektrums, das von der Kombination von verlängerten
Primern erhalten wurde, zu erreichen, wird vorzugsweise eine Mehrzahl
m von Primern verwendet, wobei (m – 1) Primer ein Massetag an
ihrem 5'-Ende haben.
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In
noch weiteren Ausführungsformen
betreffen die Verfahren der vorliegenden Erfindung die Identifizierung
von Nucleotidpolymorphismen in RNA-Zielsequenzen. Jedes der oben
beschriebenen Verfahren kann zur Bestimmung von einem Polymorphismus
in einer RNA durch Substitution einer Ziel-DNA durch eine Ziel-RNA
und von DNA-Polymerase durch eine reverse Transkriptase angewendet
werden. In einer bevorzugten Ausführungsform werden Thermozyklen
unter Verwendung einer thermostabilen reversen Transkriptase, wie
beispielsweise von Thermus termophilus(rTth)-DNA-Polymerase, durchgeführt.
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Ein
hoch schematisches Diagramm eines Instruments, das zur Durchführung der
verschiedenen Verfahren der Erfindung verwendet wurde, wird in 14 gezeigt.
Jeder der zu verwendenden Primer wird getrennt zu einer Probenplatte 90,
die eine Reihe von Probenorten enthält, einen für jeden Primer, gegeben. Die Probenplatte 90 wird
in ein MALDI-TOF-Spektrometer 100, das die Masse von jedem
der individuellen Primer, die beim Sequenzieren verwendet wurden,
bestimmt, gegeben. Als nächstes
werden der hybridisierte modifizierte Primer und ein Zielpolynucleotid
zu der Probenplatte 90 gegeben und diese Probenplatte 90 wird
in das MALDI-TOF-Spektrometer 100 gegeben. Die Masse des
modifizierten Primers und die Masse des Zielpolynucleotids werden
dann bestimmt; die Hybridisierung wird durch das Laserlicht während des
Desorption-Ionisationsprozesses, der innerhalb des MALDI-TOF 100 geschieht,
zerstört.
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Ein
Prozessor 120, der ein Computer für einen allgemeinen Zweck oder
ein spezialisierter Prozessor sein kann, sammelt die Massendaten
von dem MALDI-TOF 100 und gibt die Daten zu einem Speicher 124 und optional
auf eine Diskette oder eine andere Offline-Speichereinheit 126.
Der Prozessor 120 bestimmt dann die Massendifferenz zwischen
jedem Primer und seinem entsprechenden modifizierten Primer. Der
Prozessor 120 vergleicht dann die Massendifferenz für jeden
Primer mit einer Tabelle von Nucleotidmassen, die auf der Diskette 126 gespeichert
sind und in den Speicher 124 eingelesen wurden. Von diesem
Vergleich der Massendifferenz des Primers und des modifizierten
Primers mit den Massen der Nucleotidbasen in der Tabelle werden die
an den Primer addierten Nucleotide dann bestimmt. Die Ergebnisse
werden entweder einem Anwender 130 angezeigt oder auf einer
Diskette 126 für
eine spätere
Analyse abgespeichert.
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In
Kürze und
unter Bezug auf 15 umfasst eine Ausführungsform
eines Algorithmus zur Bestimmung von Sequenzdaten die Stufe Aufnehmen
der Massendaten von dem MALDI-TOF 100 (Stufe 150) und aufgrund
der Daten Bestimmen der Masse von jedem verwendeten Primer (Stufe
154) und jedem gebildeten modifizierten Primer (Stufe 158). Die
im Speicher 124 befindliche Tabelle von Nucleotidmassen
wird mit den in der vorhergehenden Stufe bestimmten Massenunterschieden
verglichen (Stufe 162). Durch Kenntnis der individuellen Massen
der Nucleotide wird die Nucleotidsequenz erzeugt (Stufe 166). Nachdem
die Daten und die Sequenz bestimmt wurden, werden die Daten und/oder
die Sequenz an der I/O-Vorrichtung des Anwenders, wie ein Endgerät 130,
angezeigt oder offline in der Speichervorrichtung 126 gespeichert.
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Nachdem
die bevorzugten Ausführungsformen
der Erfindung beschrieben wurden, ist es einem Fachmann nun klar,
dass andere, die hier offenbarten Konzepte umfassenden Ausführungsformen
verwendet werden können.
Es wird daher angenommen, dass diese Ausführungsformen nicht durch die
offenbarten Ausführungsformen
beschränkt
werden sollen, sondern nur durch die Idee und Umfang der folgenden
Ansprüche
beschränkt
sein sollen.
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