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Die vorliegende Erfindung bezieht
sich auf Vorrichtungen und Verfahren zum Nachweis mehrerer Analyten
in Proben.
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Der Nachweis von Analyten, die in
Spurenmengen in einer Probe vorhanden sind, erfordert empfindliche
und spezifische Verfahren. Anderenfalls kann der Nachweis solcher
Analyten durch das Vorliegen von Substanzen, die in höheren Konzentrationen
in der Probe gefunden werden, behindert werden. Dieses Problem ist
involviert, wenn der Analyt keine physikalischen oder chemischen
Eigenschaften hat, die ihn einfach nachzuweisen machen.
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Genosensoren sind Vorrichtungen,
die Gruppen oder Sätze
aus Sonden enthalten, die einen Nachweis von Zielnucleinsäuren in
Proben erleichtern. Beispielsweise beschreiben Beatti et al. (Clin.
Chem. 41(5): 700–706,
1995) einen Durchfluß-Genosensor,
der aus einem einschichtigen Siliciumwafer besteht, der eine 3 × 3 Matrix
aus Nucleinsonden enthält.
Eine Probe, von der angenommen wird, dass sie eine Zielnucleinsäure enthält, an die
die Sonden binden können,
wird durch Anlegen eines leichten Vakuums oder durch Saugen durch
den Genosensor geleitet.
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Eine andere Vorrichtung, die zum
Nachweis von Zielmolekülen
in Proben verwendet wird, ist ein Dipstick, der ein verlängerter
Streifen ist, der eine Sonde, z. B. einen Antikörper, enthält. Der Dipstick wird in eine Probe
eingetaucht, von der vermutet wird, dass sie ein Molekül enthält, das
an die Sonde bindet. Urnovitz, US-Patent Nr. 5 447 837 (1995), beschreibt
einen Dipstick, der getrennte Bereiche enthält, von denen jeder unterschiedliche
Antikörper
oder Antigene enthält,
zur Verwendung beim Nachweis des Vorliegens von entsprechenden Antigenen
oder Antikörpern
in einer Probe.
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Zusammenfassung
der Erfindung
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Die vorliegende Erfindung stellt
Assayvorrichtungen bereit, die jede einen Kanal oder eine Röhre aufweisen,
die eine lineare Reihe von Bindungselementen enthält, welche
jeweils einen Bindungsfaktor haben, der für einen daran gebundenen distinkten
Zielanalyten spezifisch ist. Die Vorrichtungen können in Verfahren zur gleichzeitigen
Analyse mehrerer Analyten in einer Probe eingesetzt werden. Wenn
sie in diesen Verfahren eingesetzt werden, wird in den Vorrichtungen
eine lineare Reihe von Signalen, die einem Strichcode ähneln, erzeugt.
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Folglich stellt die vorliegende Erfindung
in einem Aspekt eine Assayvorrichtung zum Nachweis einer Vielzahl
unterschiedlicher Analyten (z. B. einer Nucleinsäure, eines Polypeptids, eines
Kohlenhydrats, eines Lipids, eines Metaboliten oder eines Arzneimittels)
in einer Probe bereit. Die Assayvorrichtung besteht aus einer Röhre, z.
B. einer Kapillarröhre,
die eine lineare Reihe von Bindungselementen enthält, welche
jeweils mit einem distinkten Bindungsfaktor, an den eine entsprechende
spezifische Komponente bindet, verbunden sind, wobei jedes der Bindungselemente
eine zentrale Achse aufweist, die zu der der Röhre koinzidiert und so angeordnet
ist, dass die innere Oberfläche
der Röhre
entlang des gesamten Umfangs des Bindungselements dichtend kontaktiert
wird. Die Bindungselemente können
so konfiguriert sein, dass sie aneinander angrenzen oder sie können durch
Regionen, denen distinkte Bindungsfaktoren fehlen, getrennt sein.
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Der distinkte Bindungsfaktor mindestens
eines der Bindungselemente kann aus einer Einfangsonde bestehen,
wobei in diesem Fall die korrespondierende spezifische Komponente
ein Zielanalyt ist. Alternativ kann der distinkte Bindungsfaktor
mindestens eines der Bindungselemente aus einem Partner eines sich
spezifisch bindenden Paares, wobei in diesem Fall die korrespondierende
spezifische Komponente der andere Partner des sich spezifisch bindenden
Paares ist, und einer Einfangsonde, die an den Analyten bindet,
bestehen.
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Der distinkte Bindungsfaktor mindestens
eines der Bindungselemente kann aus einer Nucleinsäure, z. B.
aus einer Nucleinsäure,
die aus einem Teil einer autokatalytisch replizierbaren Nucleinsäure besteht,
oder aus einem Polypeptid bestehen.
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In einem zweiten Aspekt bezieht sich
die Erfindung auf ein Verfahren zum Nachweis des Vorhandenseins
eines Analyten (z. B. eine Nucleinsäure, ein Polypeptid, ein Kohlenhydrat,
ein Lipid, ein Metabolit oder ein Arzneimittel) in einer Probe.
In diesem Verfahren wird der Analyt mit einer nachweisbaren Markierung markiert
(z. B. eine nachweisbare Markierung, die durch eine Nachweissonde
bereitgestellt wird, die zum Beispiel eine Nucleinsäure oder
ein Polypeptid sein kann) und wird mit einem Bindungsfaktor, der
zum Beispiel eine Nucleinsäure
oder ein Polypeptid sein kann, zur Bildung eines Analyt-Bindungsfaktor-Komplexes
an einem spezifischen Bindungselement in einer Vorrichtung der Erfindung
in Kontakt gebracht. Eine nachweisbare Markierung, die nicht spezifisch
an den Analyt im Komplex gebunden ist, wird dann aus der Vorrichtung
entfernt, so dass die detektierbare Markierung am Bindungselement
dann als Maß für das Vorhandensein
des Analyten in der Probe nachgewiesen werden kann. Vorzugsweise
wird im Wesentlichen die gesamte nachweisbare Markierung, die nicht
spezifisch an den Analyt im Komplex gebunden ist, aus der Vorrichtung
entfernt. Beispielsweise werden vorzugsweise mindestens 50% oder
bevorzugter mindestens 70%, 80%, 90%, 95% oder 100% der ungebundenen
Markierung entfernt.
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Der distinkte Bindungsfaktor kann
aus einer Einfangsonde bestehen und der Schritt des Kontaktierens kann
durchgeführt
werden, indem der Analyt einmal oder mehrmals durch die Vorrichtung
geführt
wird. Der Analyt kann zum Beispiel durch mechanisches Pumpen oder
durch Anlegen eines elektrischen Feldes an den Analyten durch die
Vorrichtung geführt
werden. Der Markierungsschritt und der Kontaktierungsschritt können gleichzeitig
durchgeführt
werden oder alternativ kann der Kontaktierungsschritt vor dem Markierungsschritt durchgeführt werden.
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In einem Beispiel des erfindungsgemäßen Verfahrens
umfasst der Analyt eine Nucleinsäure,
umfasst die Nachweissonde einen Teil einer autokatalytisch replizierbaren
Nucleinsäure an
einem Ende und ein erstes Analytbindungselement am anderen Ende
und umfasst die Einfangsonde den Rest der autokatalytisch replizierbaren
Nucleinsäure
an einem Ende und ein zweites Analytbindungselement am anderen Ende.
Das erste und zweite Analytbindungselement binden an benachbarte
Nucleotidabschnitte im Nucleinsäureanalyten.
Dieses Verfahren umfasst die Schritte (1) Ligieren des ersten und
zweiten Analytbindungselement aneinander zur Bildung einer Replikationsmatrize
und (2) Replizieren der Matrize zur Erzeugung eines nachweisbaren
Signals.
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Eher als eine Einfangsonde kann der
distinkte Bindungsfaktor des Bindungselements ein Partner eines
sich spezifisch bindenden Paares sein; und eine getrennte Einfangsonde
kann den anderen Partner des sich spezifisch bindenden Paares sein.
Der Kontaktierungsschritt kann durchgeführt werden, indem die Probe und
die Einfangsonde durch die Vorrichtung geführt werden.
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Die Erfindung umfasst auch ein Assaysystem,
das eine Einrichtung zum aktiven Flüssigkeitstransport in Flüssigkeitsverbindung
mit der Assayvorrichtung der Erfindung beinhaltet. Von der Erfindung
mit umfasst wird auch ein Assaysystem, das einen Flüssigkeitstransporter
in Flüssigkeitsverbindung
mit der Vorrichtung der Erfindung enthält.
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Von der Erfindung mit umfasst wird
auch eine Assayvorrichtung zum Nachweis einer Vielzahl von Analyten
in einer Probe, wobei die Vorrichtung einen Kanal (z. B. eine Röhre oder
einen Kanal, der in eine Oberfläche
geätzt
ist, z. B. in eine Glasoberfläche)
mit einer inneren Lumenoberfläche
umfasst und eine lineare Reihe von Bindungselementen enthält.
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Jedes der Bindungselemente in dieser
Vorrichtung umfasst einen distinkten Bindungsfaktor, an den eine
entsprechende spezifische Komponente bindet, wobei die spezifische
Komponente mit einem der unterschiedlichen Analyten korrespondiert
und jedes der Bindungselemente der linearen Reihe aufeinander folgend von
einem Ende des Kanals zum anderen angeordnet ist und jedes der Bindungselemente
in dieser Vorrichtung die Lumenoberfläche eines distinkten Bereichs
des Kanals umfasst. Mindestens einer der distinkten Bindungsfaktoren
in dieser Vorrichtung ist durch Photolithographie oder chemischer
Kopplung (siehe unten) an mindestens eines der Bindungselemente
gebunden.
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Die Erfindung liefert verschiedene
Vorzüge,
da sie eine gleichzeitige Analyse von mehreren Analyten in einer
Probe im Mikromaßstab
mit hoher Empfindlichkeit ermöglicht.
Da nachgewiesene Analyte physikalisch an der Vorrichtung getrennt
werden, ist es nicht notwendig, distinkte Markierungen an Nachweissonden,
die für
verschiedene Analyte spezifisch sind, zu verwenden. Die Verfahren
der Erfindung erfordern nur geringe Proben- und Reagenzvolumina
(obwohl große
Volumina verwendet werden können,
wenn dies gewünscht wird)
und sind schnell und einfach an eine Automatisierung anpassbar.
Ein Schlüsselmerkmal
der Vorrichtungen ist ihr Vermögen,
einen Analyten aus einer verdünnten
Lösung
in einer kleinen Einfangzone (d. h. ein Bindungselement) in einer
erfindungsgemäßen Vorrichtung
zu isolieren und zu konzentrieren, was eine physikalische Amplifikation
darstellt. Dies sorgt für
erhöhte
Empfindlichkeit und vermeidet in einigen Anwendungen die Notwendigkeit
für eine
enzymatische Amplifikation, z. B. durch Verwendung der Polymerasekettenreaktion (PCR).
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In bestimmten Ausführungsformen
sind die Sonden, die in den Vorrichtungen und Verfahren der Erfindung
eingesetzt werden, Nucleinsäuren.
Von einem Paar Nucleinsäuremoleküle (oder
zwei Regionen innerhalb eines einzelnen Nucleinsäuremoleküls) wird gesagt, dass sie aneinander "hybridizieren", wenn sie durch Basenpaarungswechselwirkungen
zwischen ihnen einen Doppelstrang bilden. Wie es auf dem Fachgebiet
bekannt ist, erfordert eine Hybridisierung zwischen Nucleinsäurepaaren
keine vollständige
Komplementarität
zwischen den hybridisierenden Bereichen, sondern nur einen ausreichenden
Level der Basenpaarung, um den Doppelstrang unter den angewendeten
Hybridisierungsbedingungen aufrecht zu erhalten.
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Hybridisierungsreaktionen werden
typischerweise unter "stringenten
Bedingungen", z.
B. Bedingungen niedriger bis moderater Stringenz durchgeführ, bei
denen spezifische und einige nicht-spezifische Wechselwirkungen
auftreten können.
Nach der Hybridisierung kann ein Waschen unter Bedingungen höherer Stringenz
durchgeführt
werden, um eine nicht-spezifische Bindung zu eliminieren. Wie es
auf diesem Fachgebiet bekannt ist, können optimale Waschbedingungen
empirisch bestimmt werden, zum Beispiel indem die Stringenz allmählich erhöht wird.
Bedingungsparameter, die verändert
werden können,
um die Stringenz zu beeinflussen, umfassen z. B. Temperatur und
Salzkonzentration. Im Allgemeinen gilt, je niedriger die Salzkonzentration
ist und je höher
die Temperatur ist, desto höher
ist die Stringenz. Beispielsweise kann ein Waschen bei niedriger
Temperatur (z. B. Raumtemperatur) unter Verwendung einer Lösung, die
eine Salzkonzentration von einem Äquivalent oder niedriger enthält, als
Hybridisierungslösung
begonnen werden. Ein anschließendes Waschen
kann durchgeführt
werden, indem progressiv wärmere
Lösungen
mit derselben Salzkonzentration verwendet werden. Alternativ kann
die Salzkonzentration erniedrigt und die Temperatur im Waschschritt
aufrechterhalten werden oder die Salzkonzentration kann gesenkt
und die Temperatur kann erhöht
werden. Solche Standardvariationen sind auf dem Fachgebiet bekannt.
Es können
zusätzliche
Parameter verändert
werden, um die Stringenz zu beeinträchtigen; diese umfassen z.
B. die Verwendung eines destabilisierenden Mittels, z. B. von Formamid.
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In Nucleinsäurehybridisierungsreaktionen
werden die Bedingungen, die zur Erreichung eines besonderen Stringenzlevels
angewendet werden, in Abhängigkeit
von der Natur der Nucleinsäuren,
die hybridisiert werden, variieren. Beispielsweise können die
Länge,
der Komplementaritätsgrad,
die Nucleotidsequenzzusammensetzung (z. B. GC- vs. AT-Gehalt) und
Nucleinsäuretyp
(z. B. RNA vs. DNA) der hybridisierenden Regionen der Nucleinsäuren bei
der Auswahl der Hybridisierungsbedingungen in Betracht gezogen werden.
Ein weiterer Gesichtspunkt ist die Tatsache, ob eine der Nucleinsäuren zum
Beispiel an einem Filter immobilisiert ist.
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Wie es weiter unten beschrieben wird
(siehe Beispiel II) beinhaltet ein Beispiel für Hybridisierungsbedingungen,
die in den erfindungsgemäßen Verfahren
eingesetzt werden können,
eine Hybridisierung bei Raumtemperatur in 3 × SSC und anschließendes Waschen
in 3 × SSC.
Somit wird in diesem Beispiel die Stringenz von der Hybridisierung
zum Waschen nicht verändert.
In einem anderen unten beschriebenen Beispiel (siehe Beispiel II)
wird eine Hybridiserung bei Raumtemperatur in 3 × SSC durchgeführt und
anschließende Waschgänge werden
in 3 × SSC
bei den folgenden Temperaturen durchgeführ: 25°C, 42°C, 52°C, 58°C und 70°C.
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Ein anderes Beispiel für Bedingungen
mit progressiv höherer
Stringenz ist wie folgt: 2 × SSC/0,1% SDS
bei Raumtemperatur (Hybridisierungsbedingungen); 0,2 × SSC/0,1%
SDS bei etwa Raumtemperatur (Bedingungen niedriger Stringenz); 0,2 × SSC/0,1%
SDS bei etwa 42°C
(Bedingungen moderater Stringenz); und 0,1 × SSC bei etwa 68°C (Bedingungen
hoher Stringenz). Ein Waschen kann durchgeführt werden, indem nur eine
dieser Bedingungen angewendet wird, z. B. Bedingungen hoher Stringenz,
oder indem jede der Bedingungen angewendet wird, z. B. jeweils für 10 bis
15 Minuten in der oben angegebenen Reihenfolge, wobei ein genannter
Schritt oder alle genannten Schritte wiederholt werden. Wie oben
angegeben wurde, werden allerdings optimale Bedingungen in Abhängigkeit
von der besonderen involvierten Hybridisierungsreaktion variieren
und können
empirisch bestimmt werden.
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Ähnlich
wie Nucleinsäurehybridisierungen
können
Protein-Protein-Bindungsreaktionen und anschließendes Waschen zur Eliminierung
einer nicht-spezifischen Bindung unter variierenden Bedingungen
durchgeführt
werden, die von den Affinitäten
der Proteine zueinander abhängen.
Beispielsweise kann eine Bindungsreaktion in einem Puffer, der physiologische
Salzkonzentrationen hat, stattfinden und ein Waschen kann unter Verwendung
von Puffern, die steigende Salzkonzentrationen haben, durchgeführt werden.
Die Stringenz der Waschbedingungen kann auch erhöht werden, indem Detergenzien,
z. B. TWEEN 20TM und TRITON XTM in
die Waschlösung
eingeschlossen werden.
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Von den Partnern eines Molekülpaares
(z. B. eine Nachweissonde oder eine Einfangsonde und ein Zielanalyt,
oder die Partner eines sich spezifisch bindenden Paares (z. B. Antikörper-Antigen,
Nucleinsäure und
Protein-Vitamin-Bindungspaare)) wird gesagt, dass sie "spezifisch aneinander
binden", wenn sie
mit größerer Affinität aneinander
als an andere nicht-spezifische Moleküle binden. Beispielsweise kann
ein Antikörper,
der gegen ein Antigen gerichtet ist, an das er wirksamer bindet
als an ein nicht-spezifisches Antigen, als spezifisch an das Antigenbinden
beschrieben werden. Entsprechend kann eine Nucleinsäu resonde
als spezifisch an ein Nucleinsäureziel
bindend beschrieben werden, wenn sie durch Basenpaarwechselwirkungen
einen spezifischen Doppelstrang bildet.
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Alle technischen und wissenschaftlichen
Ausdrücke,
die hierin verwendet werden, haben dieselbe Bedeutung, wie sie dem
Fachmann auf diesem Gebiet, zu dem die Erfindung gehört, geläufig sind,
wenn sie nicht anders definiert sind. Obgleich Verfahren und Materialien,
die denen, die hierin beschrieben wurden, entsprechen oder äquivalent
sind, bei der Durchführung
oder beim Testen der Erfindung eingesetzt werden können, werden
nachfolgend einige Verfahren und Materialien beschrieben.
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Andere Merkmale und Vorzüge der Erfindung
werden aus der folgenden detaillierten Beschreibung und den Ansprüchen klar.
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Kurze Beschreibung
der Zeichnungen
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1 ist
eine schematische Darstellung eines automatisierten Assaysystems
zur Verwendung einer Vorrichtung der Erfindung.
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2A und 2B sind schematische Darstellungen
einer Draufsicht bzw. einer Seiten-Querschnittsansicht entlang der Linie
2B-2B in 2A eines Assaysystems
zur Verwendung einer anderen Vorrichtung der Erfindung.
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3 ist
eine schematische Darstellung eines Bindungselements, das eine Einfangsonde
daran gebunden hat.
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4A ist
ein elektronisches Bild, das das Fluoreszenzsignal von akute Lymphozytenleukämie (ALL)-spezifisches
Ziel-Nachweissonde-Komplexen, die in einer Vorrichtung der Erfindung
eingefangen sind, zeigt.
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4B ist
ein elektronisches Bild, das das Fluoreszenzsignal von akuter Lymphozytenleukämie (ALL)-spezifische
und chronische myelogischer Leukämie
(CML)-spezifisches Ziel-Nachweissonde-Komplexen in einer Vorrichtung
der Erfindung zeigt.
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5 ist
eine Reihe computererzeugter Bilder, die die Spezifität des CML-Ziel-Einfangens
in einer Vorrichtung der Erfindung zeigt.
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Detaillierte
Beschreibung
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Die Erfindung stellt Vorrichtungen
und Verfahren zum Nachweisen mehrerer Zielanalyten (z. B. bis zu 100
oder mehr verschiedene Analyten) in Proben bereit. Ein zentrales
Merkmal der erfindungsgemäßen Verfahren
ist die spezifische Bindung von Sonden an Zielanalyten. Dies kann
erreicht werden, indem zum Beispiel ein Sandwich-Hybridisierungs-Assay
verwendet wird (siehe z. B. Ranki et al., Gene 21: 77–85, 1983;
US-Patent Nr. 4 486 539 (1984)). Sandwich-Hybridisierungs-Assays
beinhalten die Verwendung einer Einfangsonde und einer Nachweissonde,
die so konzipiert sind, dass sie konkurrierend an einen Zielanalyten
binden, um einen Einfangsonde-Analyt-Nachweissonde-Komplex zu bilden.
Im Kontext der vorliegenden Erfindung enthält die Nachweissonde eine nachweisbare
Markierung und die Einfangsonde (1) enthält den ersten Partner eines sich
spezifisch bindenden Paares oder (2) ist an einem spezifischen Bindungselement
einer Vorrichtung der Erfindung immobilisiert (siehe unten). In
jedem dieser Fälle
unterstützt
die Verwendung einer Einfangsonde eine Reinigung von Analyt-Sonde-Komplexen
aus Probenkomponenten wie auch aus nichtgebundenen Nachweissonden.
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Zusätzlich zu Sandwich-Hybridisierungs-Assay,
in denen die nachweisbare Markierung als Teil einer Nachweissonde
bereitgestellt wird, können
Assays eingesetzt werden, in denen das Ziel selbst markiert wird. In
solchen Assays sind Nachweissonden nicht erforderlich. Beispielsweise
können
Ziele vor oder nach in Kontaktbringen mit einer Vorrichtung der
Erfindung durch PCR in Gegenwart von markierten Nucleotiden, z.
B. fluoreszierend oder isotopisch markierten Nucleotiden, amplifiziert
werden. In entsprechender Weise können Ziele in Primerextensionsreaktionen,
die markierte Nucleotide enthalten, markiert werden.
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Ziele können auch metabolisch markiert
werden, z. B. durch in Kontaktbringen mit Zellen, die das Ziel mit
einer markierten Komponente (z. B. ein Nucleotid oder eine Aminosäure) des
Ziels produzieren. Markierte Ziele sind an spezifischen Bindungselementen
einer Vorrichtung der Erfindung immobilisiert, indem sie an eine spezifische
Einfangsonde binden, wie es oben beschrieben wurde. Nachweissonden
sind auch nicht erforderlich, wenn eine Detektion von Interkalationsfarbstoffen
(z. B. Ethidiumbromid oder Propidiumiodid) eingesetzt wird, um eine
Doppelstrangbildung zwischen Nucleinsäureeinfangsonden und Analyten
zu messen.
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Ein Beispiel einer Vorrichtung, die
in der Erfindung eingeschlossen ist, besteht aus einem Kanal oder einer
Röhre,
z. B. einer Kapillarröhre,
die eine lineare Reihe von Bindungselementen aufweist, die jeweils
als Bindungsfaktor am Bindeelement eine immobilisierte, distinkte
Einfangsonde enthalten, die für
einen korrespondierenden Analyten spezifisch ist. Diese Vorrichtung
kann in verschiedenen Verfahren eingesetzt werden, in denen Einfangsonde-Analyt-Nachweissonde-Komplexe
an den Bindungselementen gebildet werden. Vorzugsweise werden der
Analyt und die Nachweissonde miteinander unter Bildung eines Analyt-Nachweissonden-Komplexes
vor einem Kontakt mit der Einfangsonde in Kontakt gebracht. Die
Bindungselemente der Vorrichtung können mit einer Probe, die den
Analyt-Detektorsonden-Komplex
enthält,
z. B. durch mechanischen oder elektrophoretischen Transport der
Probe durch eine Vorrichtung in Kontakt gebracht werden. Ein Einfangsonde-Analyt-Nachweissonde-Komplex
wird gebildet, wenn der Analyt-Nachweissonde-Komplex mit seinem korrespondierenden
Bindungselement in der Vorrichtung in Kontakt gebracht wird.
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In einer Variation dieses Verfahrens
wird eine Probe, die einen Analyten enthält, auf eine Vorrichtung der
Erfindung angewendet, so dass ein Einfangsonde-Analyt-Komplex an
einem Bindungselement der Vorrichtung gebildet wird, bevor der Analyt
mit einer Nachweissonde in Kontakt gebracht wird. Eine Nachweissonde, die
spezifisch an den Analyten bindet und eine nachweisbare Markierung
enthält,
wird dann mit dem an dem Bindungselement gebildeten Einfangsonde-Analyt-Komplex
in Kontakt gebracht. In einer anderen Variation des vorliegenden
Verfahrens werden die Probe, die den Analyt enthält, und die Nachweissonde einzeln
gleichzeitig mit der Vorrichtung in Kontakt gebracht.
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Wenn gewünscht, können Proben und Sonden mehrmals
durch die Vorrichtung geführt
werden, um die Wahrscheinlichkeit einer spezifischen Bindung zwischen
einer Einfangsonde und ihrem korrespondierenden Analyten oder Analyt-Einfangsonde-Komplex
zu erhöhen.
Wenn ein solches Verfahren verwendet wird, ist die Reihenfolge des
Kontaktes zwischen der Einfangsonde, dem Analyt und der Nachweissonde
weniger pertinent. Mehrere Durchgänge von Proben und Sonden durch
die Vorrichtung können
z. B. durch die Verwendung einer Röhre, die an beide Enden der
Vorrichtung angeschlossen ist, erleichtert werden. Die Probe und die
Sonden können
wiederholt unter Verwendung einer peristaltischen Pumpe durch die
Vorrichtung und die Röhre
gepumpt werden. Wenn die Probe und die Sonde nur einmal durch die
Vorrichtung geführt
werden, ist es vorteilhaft, Nachweissonde-Analyt-Komplexe zu bilden,
bevor diese Komponenten mit der Vorrichtung in Kontakt gebracht
werden.
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Nichtgebundene Nachweissonden und
nicht-spezifisch gebundene Probenkomponenten können aus der Vorrichtung entfernt
werden, zum Beispiel durch die Verwendung eines aktiven Flüssigkeitstransporters,
z. B. einer mechanischen Pumpe (beispielsweise einer piezoelektrischen
Pumpvorrichtung), die in Flüssigkeitsverbindung
mit der Assayvorrichtung ist, Elektrophorese, Anlegen eines Vakuums
oder Kombination dieser Verfahren, was von den Zusammensetzungen
der Vorrichtung und der gebundenen Komplexe abhängt. Ein Nachweis von Markierungen
an den Bindungselementen der Vorrichtung die zu den spezifischen
Einfangsonden korrespondierend sind, können als Maß für das Vorliegen der korrespondierenden
Analyten in der Probe verwendet werden.
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Ein zweites Beispiel einer Vorrichtung,
die im Rahmen der Erfindung liegt, besteht aus einem Kanal (z. B.
einer Röhre),
die eine lineare Reihe von Bindungselementen enthält, wobei
jedes Bindungselement als Bindungsfaktor daran einen immobilisierten
Partner eines besonderen spezifisch bindenden Paares gebunden (z. B.
durch kovalente oder nicht-kovalente
Bindung) hat. Diese Vorrichtung kann in einem Verfahren verwendet werden,
in dem die Bindungselemente der Vorrichtung mit einer Probe, Einfangsonden
(von denen jede den anderen Partner eines besonderen sich spezifisch
bindenden Paares enthält)
und markierten Nachweissonden kontaktiert werden, z. B. durch mechanischen
oder elektrophoretischen Transport der Probe und der Sonden durch
die Vorrichtung. Wenn es gewünscht
wird, können
die Proben und die Sonde mehrfach durch die Vorrichtung geführt werden,
um die Wahrscheinlichkeit einer spezifischen Komplexbildung zu erhöhen. Ungebundene
Nachweissonden und nicht-spezifisch gebundene Probenkomponente können durch
zum Beispiel die Verwendung eines Flüssigkeitstransporters, z. B.
einer mechanischen Pumpe (z. B. einer piezoelektnschen Pumpvorrichtung),
Elektrophorese, Anlegen von Vakuum oder durch Kombination dieser
Verfahren, was von den Zusammensetzungen der Vorrichtung und den
gebundenen Komplexen abhängt,
aus der Vorrichtung gewaschen werden. Ein Nachweis von Markierungen
an den Bindungselementen der Vorrichtung, die zu dem besonderen
spezifisch bindenden Paar korrespondieren, kann als Maß für das Vorliegen
der Analyten in der Probe verwendet werden. Die Probe, die Nachweissonden,
die Einfangsonden und die Vorrichtung können im erfindungsgemäßen Verfahren
in beliebiger Reihenfolge miteinander in Kontakt gebracht werden.
Vorzugsweise wird der Einfangsonde-Analyt-Nachweissonde-Komplex
vor Einführung
der Probe in die Vorrichtung gebildet.
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Ein Vorteil dieser besonderen Vorrichtung,
die eine lineare Reihe von Bindungselementen enthält, von denen
jedes einen distinkten Satz von Partnern sich spezifisch bindender
Paare enthält,
ist, dass eine einzelne Vorrichtung eingesetzt werden kann, um tatsächlich eine
unbegrenzte Zahl von Analyten nachzuweisen. Die einzigen Elemente
in diesem System, die ausgetauscht werden müssen, um dies zu erreichen,
sind die Analyt-Bindungsregionen der Einfang- und Nachweissonden.
In Fällen,
in denen die Level des Interkalationsfarbstoffs an den Bindungselementen
gemessen werden (siehe oben), ist die einzige Komponente dieses
Systems, die für
jeden Analyten ausgetauscht werden muss, die Analytenspezifische
Bindungsregion der Einfangsonde.
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Vorrichtungen
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Die Vorrichtungen der Erfindung bestehen
aus einem Kanal oder einer Röhre,
die eine Reihe von Bindungselementen enthält, welche jeweils entweder
mit (1) einer Analytenspezifischen Einfangsonde oder (2) einem Partner
eines sich spezifisch bindenden Paares verbunden sind. Wie oben
beschrieben wurde, können die
Vorrichtungen der Erfindung eine Reihe von Formaten verkörpern.
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Beispielsweise zeigt 1 ein automatisiertes Assaysystem 10,
das eine Vorrichtung 11 der Erfindung umfasst. Vorrichtung 11 beinhaltet
eine lineare Reihe 12 von Bindungselementen 14,
die im Lumen einer Röhre,
z. B. einer Kapillarröhre 18,
in einem eindimensionalen Stapel geschichtet sind. Die Bindungselemente
können
direkt aufeinander gestapelt sein oder zwischen ihnen können inerte
Schichten, die keine Einfangsonden (oder Partner von besonderen
sich spezifisch bindenden Paaren) haben, angeordnet sein. Die Bindungselemente
in einem solchen Stapel sind so konfiguriert und angeordnet, dass
sie die Innenseite der Röhre
jeweils dichtend kontaktieren, d. h. so, dass sie die Innenseite
der Röhre
entlang ihres gesamten Umfangs kontaktieren. Wenn die Röhre zum
Beispiel einen kreisförmigen
Querschnitt hat, würden
die Bindungselemente jeweils einen kreisförmigen Querschnitt und einen
Durchmesser haben, der etwas kleiner als der Innendurchmesser der
Röhre ist,
so dass sie unter Druck in die Röhre
passen. Diese Konfiguration drückt
die Flüssigkeit,
die den Analyt enthält,
fließen
durch, eher als um, jedes der Bindungselemente im Stapel.
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Die Bindungselemente können auch
aus Stapeln von Filtern oder Membranen, z. B. Nylon- oder Nitrocellulosemembranen,
bestehen, an denen die Einfangsonden (oder Partner von besonderen
sich spezifisch bindenden Paaren) immobilisiert sind. Beispielsweise
kann eine Vorrichtung hergestellt werden, indem DNA-Sonden kovalent
an einen Nylonfilter gebunden werden, dann mehrere Filter, die mehrere
distinkte Sonden enthalten, gestapelt werden, indem eine poröse, inerte,
doppelseitig klebende Folie zwischen jeden Filter gelegt wird, hergestellt
werden.
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Die Bindungselemente der Vorrichtungen
der Erfindung können
zum Beispiel 0,05 bis 1 mm dick sein und Durchmesser ähnlicher
Größe haben.
Bindungselemente, die solche Abmessungen haben, können zum Beispiel
aus Polystyrolschichten bestehen oder im Fall von Kanälen, die
in eine ebene Oberfläche
geätzt
sind, z. B. in eine Glasoberfläche
(siehe unten), können
die Bindungselemente aus einer linearen Reihe einzelner Perlen bestehen.
Alternativ können
die Innenwand von geätzten
Kanälen
mit einem Durchmesser von etwa 0,05 mm oder die Innenwände von
Kapillanöhren,
die einen ähnlichen
Durchmesser haben, durch einen Laser aktiviert werden, um Bindungselemente
zu erzeugen, die 0,02 mm bis 1 mm dick sind (siehe unten).
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Die Bindungselemente sind vorzugsweise
so entwickelt, dass sie Oberfläche-zu-Volumen-Verhältnisse
haben, die günstig
sind, so dass alle Zielanalyten (oder Einfangsonde, die einen Partner
eines besonderen sich spezifisch bindenden Paares enthält) durch
die Vorrichtung in enger Nachbarschaft zur korrespondierenden Einfangsonde
(oder dem konespondierenden Partner des besonderen sich spezifisch
bindenden Paars) gehen. Die Selektion von Bindungselementen, die
vorteilhafte Oberfläche-zu-Volumen-Verhältnisse
haben, liegt im Fachwissen eines Fachmanns auf diesem Gebiet. Beispielsweise
kann man ein Material auswählen, durch
das die Probe und die Sonden durchströmen werden, z. B. poröse Perlen
oder Filter. Wie es auf dem Gebiet zu verstehen ist, können in
jedem Fall zusätzlich
zu den Oberfläche-zu-Volumen-Verhältnissen
Faktoren wie zum Beispiel die potentielle Durchflussgeschwindigkeit
durch ein Material bei der Auswahl eines Materials zur Verwendung
als Bindungselement in Betracht gezogen werden.
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Die Bindungselemente in einem Stapel
können
sich durch die Einfangsonden (oder die Partner besonderer sich spezifisch
bindender Paare), die sie enthalten, die Materialien, aus denen
sie hergestellt sind, und/oder das Vorliegen von inerten Spacern
(d. h. ohne Einfangsonden) zwischen ihnen getrennt werden. Geeignete
positive und negative Kontrollen können auch in den Stapeln der
Bindungselemente der Vorrichtung enthalten sein.
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Außer dass sie an die Filter,
Membranen oder andere Matrizes, die oben beschrieben wurden, gebunden
sind, können
die Einfangsonden (oder die Partner sich spezifisch bindender Paare)
an distinkte Bindungselementregionen an der Lumenwand eines Kanals,
z. B. einer Röhre,
wie einer Kapillarröhre,
gebunden sein. Eine Befestigung von Sonden, z. B. Nucleinsäure- und
Polypeptidsonden, an eine Oberfläche
kann unter Anwendung irgendeines einer Reihe von Standardverfahren,
einschließlich
direkter Absorption oder chemischer Kupplung an reaktive Gruppen
an der Oberfläche
durchgeführt
werden. Beispielsweise kann ein Linker verwendet werden, z. B. eine
flexible Kohlenstoffkette, wie z. B. ein 3-Glycidoxypropyltrimethoxysilan-Linker
(siehe z. B. Maskos et al., Nucl. Acids Res. 20(7): 1679–1684, 1992).
Zur Herstellung dieses Vorrichtungstyps kann auch Photolithographie
angewendet werden. Bei diesem Verfahren wird die Lumenoberfläche einer
Röhre mit
einem photoempfindlichen Linker überzogen
und es wird ein Laserstrahl auf eine Region in der Röhre gerichtet,
in der die Bindung einer spezifischen Einfangsonde gewünscht wird.
Die Sonde wird dann durch die Röhre
geleitet, wo sie an die laseraktivierte Region bindet. Nach dem
Wegwaschen von überschüssiger Sonde wird
eine andere Region der Röhre
laseraktiviert und mit einer anderen Sonde kontaktiert; dieser Prozess
kann wiederholt werden, bis die gewünschte Anzahl von Bindungselementen
erreicht ist (siehe z. B. US-Patent Nr. 5 143 854; WO 92/10092 und
WO 90/15070). Ähnliche
Verfahren können
angewendet werden, um Vorrichtungen herzustellen, in denen die Bindungselemente
aus Einfangsonden bestehen, welche an Regionen der Lumenwand eines
Kanals gebunden sind, welcher in einer ebenen Oberfläche, z.
B. eine Glasplatte, geätzt
ist.
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Die neuen Vorrichtungen können in
einem automatisierten Assaysystem enthalten sein. Ein automatisiertes
Assaysystem 10, das eine Assayvorrichtung 11 umfasst,
ist zum Beispiel schematisch in 1 dargestellt.
Eine lineare Reihe 12 von Bindungselementen 14,
die jeweils durch inerte Spacer 16 getrennt sind, ist in
dieser Vorrichtung 11 in einer Kapillarröhre 18 enthalten.
Eine Probe, von der angenommen wird, dass sie einen Zielanalyten
enthält,
wird in eine Mischkammer 20 eingeführt und dann aus der Mischkammer 20 mittels eines
automatisierten Systems 10, das eine Spritzenpumpe 22,
zwei Ventile 24 und 26 und Flüssigkeitsleitungen 11a, 11b, 22a, 28a, 28b, 30a, 32a und 34a umfasst,
in die Vorrichtung 11 bewegt. Das System umfasst auch Behälter, die
Hybridisierungspuffer 30, Waschpuffer 32 und eine
oder mehrere Nachweissonden 34 enthalten. Der mechanische
Betrieb des Systems, z. B. das Öffnen
und Schließen
der Ventile 24 und 26 kann durch ei nen Computer
(nicht gezeigt) gesteuert werden. Die Schritte zum Nachweisen eines
Nucleinsäureanalyten
in einer Probe unter Verwendung dieses Assaysystems 10 werden
nachfolgend kurz beschrieben.
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Hybridisierungspuffer wird aus dem
Hybridisierungspufferbehältern 30 durch
die Flüssigkeitsleitung 30a,
Ventil 24, Flüssigkeitsleitung 22a und
in die Spritzenpumpe 22 gezogen und wird dann durch Flüssigkeitsleitung 22a,
Ventil 24, Flüssigkeitsleitung 28a und
Ventil 26 in die Mischkammer 20 gepumpt, die eine
Probe enthält,
von der angenommen wird, dass sie einen Zielanalyten enthält. Dann
wird Nachweissonde aus dem Nachweissondenbehälter 34 entnommen
und durch Flüssigkeitsleitung 34a,
Ventil 24, Flüssigkeitsleitung 28a und
Ventil 26 in die Mischkammer 20 gepumpt, wo sie
durch schnelle Pulsation durch die Spritzenpumpe 22 vermischt
wird. Das Probe-Sonde-Gemisch wird dann durch einen Heizer 36 durch
Leitung 36a zu einer Temperatur erhitzt, die eine Hybridisierung
von Zielanalyten an Nachweissonden erleichtern. Das Gemisch wird dann über Ventil 26,
Flüssigkeitsleitung 28a,
Ventil 24 und Flüssigkeitsleitung 22a zurück in die
Spritzenpumpe 22 gezogen und wird dann über Flüssigkeitsleitung 22a,
Ventil 24 und Flüssigkeitsleitung 11a durch
die Vorrichtung 11 gedrückt,
die durch den Heizer 36 über Leitung 36b vorerwärmt worden
war, und dann zurück über die
Flüssigkeitsleitung 28b in
die Mischkammer 20 gedrückt.
Während
dieses Schritts geht das Gemisch durch die lineare Reihe von Bindungselementen 12 in
der Vorrichtung 11.
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Ein beliebiger Ziel-Nachweissonde-Komplex,
der eine Sonde an einem Bindungselement 14 in der linearen
Reihe 12 von Bindungselementen 14 kontaktiert,
der eine Sequenz hat, die komplementär zu einer Zielanalytensequenz
ist, wird an dem Bindungselement 14 immobilisiert. Dieses
Verfahren kann mehrmals wiederholt werden, bis ein ausreichender prozentualer Anteil des Zielanalyten am
Bindungselement 14 in der linearen Reihe 12 von
Bindungselementen 14 eingefangen wurde.
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Das Gemisch wird dann durch Flüssigkeitsleitung 28b,
Ventil 26, Flüssigkeitsleitung 28a,
Ventil 24 und Flüssigkeitsleitung 11b zu
einer Abfallsammelkammer 38 gepumpt und Waschpuffer wird
aus dem Waschpufferbehälter 32 über Flüssigkeitsleitung 32a,
Ventil 24 und Flüssigkeitsleitung 22a in
die Spritzenpumpe 22 gezogen und dann durch Flüssigkeitsleitung 22a,
Ventil 24 und Flüssigkeitsleitung 11a durch
die Vorrichtung 11 gedrückt,
um das gesamte nicht gebundene Material, z. B. nicht gebundene Nachweissonden,
aus der Vorrichtung 11 zu entfernen. Waschpuffer wird durch
Flüssigkeitsleitung 28b,
Ventil 26, Flüssigkeitsleitung 28a, Ventil 24 und
Flüssigkeitsleitung 11b zur
Abfallkammer 38 nach jedem Zyklus gepumpt und es können mehrere Waschzyklen
durchgeführt
werden, um eine nicht-spezifische Bindung zu reduzieren. Die Assayvorrichtung 11 kann
dann beleuchtet und mit einem Abbildungssystem gescannt werden (siehe
unten).
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Ein Beispiel für ein Assaysystem, das eine
Vorrichtung umfasst, in der die Bindungselemente aus Einfangsonden
bestehen, welche an Regionen der Lumenwand eines Kanals gebunden
sind, welcher in eine planare Oberfläche geätzt ist, ist schematisch in 2A (Draufsicht) und 2B (Seiten-, Querschnittsansicht) dargestellt.
In diesem System ist die lineare Reihe 40 von Bindungselementen 42,
die jeweils durch inerte Abstandhalter 44 getrennt sind,
in die Oberfläche
eines Glasobjektträgers 46 geätzt, der
mit einem Deckglas 48 bedeckt ist. Gemische, die Nachweissonden
und Proben, von denen angenommen wird, dass sie Zielanalyten enthalten,
werden durch Injektion durch die Probeninjektionsöffnung 5O in
das Assaysystem eingeführt.
Eine Pumpe 52 wird verwendet, um das Gemisch durch die
lineare Reihe 40 von Bindungselementen 42 zu drücken. Ein
Nachweis von Ziel-Nachweissonde-Komplexen,
die an die Bindungselemente 42 in der linearen Reihe 40 gebunden
sind, kann unter Verwendung eines Lasers 54 und einer ladungsgekoppelten
Vorrichtung (CCD) 56, die sich über dem Glasdeckglas 48 befindet,
durchgeführt
werden (siehe unten).
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Zielanalyten
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Zielanalyten, die unter Verwendung
der Verfahren der Erfindung nachgewiesen werden können, umfassen
eine breite Vielfalt von Molekülen,
z. B. Nucleinsäuren,
Proteine, Kohlenhydrate, Lipide, Metaboliten, Vitamine und Arzneimittel.
Ein Nachweis solcher Moleküle
kann auf den Gebieten wie z. B. Medizin, Forensik, Landwirtschaft,
Industrie, Lebensmittelwissenschaften und Veterinärmedizin
nützlich
sein. Auf dem Gebiet der Medizin können die Verfahren der Erfindung
zum Beispiel in der Diagnose von Krankheitsbildern (z. B. Krebs), die
durch das Vorliegen oder vielen spezifischer Marker (z. B. Protein-
oder Nucleinsäuremarker)
und/oder veränderter
Spiegel von normalerweise auftretenden Proteine (z. B. Hormone,
Cytokine, Lymphokine, Antikörper oder
Enzyme) oder Nucleinsäuren
charakterisier sind, eingesetzt werden. Die Verfahren der Erfindung
können auch
verwendet werden, um Genmutationen, die zum Beispiel durch einzelne
Basenpaaraustauscher, kleine oder große Deletionen, Insertionen
oder Umlagerungen (z. B. chromosomale Translokationen) charakterisiert werden
können,
und genetische Polymorphismen nachzuweisen. Außerdem können die Verfahren der Erfindung
eingesetzt werden, um das Vorliegen eines infektiösen Pathogens
(z. B. ein Bakterium, ein Virus, ein Protozoen, ein Parasit oder
ein Pilz) oder einer seltenen Zelle (z. B. eine fetale Zelle in
mütterlichem
Blut) in einer Probe, z. B. einer Probe aus einem Patienten, nachzuweisen.
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Verschiedene Bindungselemente in
einer linearen Reihe einer Vorrichtung der Erfindung können, außer dass
sie distinkte Analyten binden, so konzipiert sein, dass sie an verschiedene
Regionen eines einzelnen Analytenmoleküls binden. Eine Vorrichtung,
die eine solche lineare Reihe enthält, kann zum Beispiel verwendet
werden, um Sequenzvariationen in einer Nucleinsäure nachzuweisen. Zum Beispiel
können
Sequenzvariationen zwischen verschiedenen Gruppen von Organismen
unter Verwendung dieses Vorrichtungstyps nachgewiesen werden. In
dieser Vorrichtung ist die Sammlung von Bindungselementen so gewählt, dass
ein Bindungsmuster oder mehrere Bindungsmuster, die kollektiv einer
Sequenzvariation entsprechen, welche in einer besonderen Organismengruppe
gefunden wird, und andere Muster anderen Organismengruppen entsprechen.
Zum Beispiel können
Sonden, die auf verschiedene Teile von rRNA-Molekülen zielen,
in Sätzen
eingesetzt werden (z. B. 6 oder 7 Sätze}, um vollständig die
mehr als 2.000 bekannten Salmonella-Stämme zu umfassen. Als weiteres
Beispiel werden Shigella flexneri- und Escherichia coli-rRNAs genannt,
die so eng verwandt sind, dass eine Verwendung einer einzelnen Sonde
wahrscheinlich nicht alle Shigella von allen E. coli unterscheiden
würde,
allerdings könnte
eine Gruppe aus 7 oder 8 Sonden zusammen verwendet werden, um diese
Organismen zu unterscheiden.
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Proben, die unter Verwendung der
erfindungsgemäßen Verfahren
getestet werden können,
umfassen zum Beispiel biologische Flüssigkeiten wie Blut, Serum,
Plasma, Urin und Speichel, wie auch Pflanzenextrakte, Zell- oder
Gewebeextrakte, Zellkulturenmedien, Umweltproben und Fermentationsgemische.
Wenn notwendig, können
Protein- und/oder Nucleinsäure-Präparationen
unter Anwendung von Standardverfahren extrahiert werden, bevor die
vorliegende Erfindung angewendet wird. Infolge der Empfindlichkeit
der Verfahren der Erfindung sind nur kleine Probenmengen erforderlich.
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Sonden
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Die Typen spezifischer Sonden, die
in den erfindungsgemäßen Verfahren
verwendet werden, hängen vom
besonderen Zielanalytentyp, der nachgewiesen werden soll, ab, und
sind auf dem Fachgebiet gut bekannt. Im Fall eines Nucleinsäureziels
(ein DNA- oder ein RNA-Ziel) zum Beispiel können Nucleinsäuresonden eingesetzt
werden. Die Nucleinsäuresonden
können
Desoxyribonucleotide, Ribonucleotide oder Kombinationen oder Modifikationen
davon enthalten. Die optimalen Sequenzen, Längen und Level an Komplementarität mit dem
Zielanalyten, um eine spezifische Bindung zu erreichen, sind Parameter,
die vom Fachmann leicht bestimmt werden können. Beispielsweise können die
Sonden mindestens 8, vorzugsweise 16 bis 100 oder am vorteilhaftesten
18 bis 40 aufeinander folgende Nucleotide enthalten, die zu dem
Zielnucleinsäureanalyten komplementär sind.
Der Aufbau solcher Sonden kann erleichtert werden, indem auf Standardprotokoll,
Handbücher
und allgemein verfügbare
Computerprogramme zurückgegriffen
wird (siehe z. B. Ausubel et al. Herausg. Current Protocols in Molecular
Biology, Wiley & Sons,
New York, 1989). Eine Synthese von Nucleinsäuresonden kann unter Verwendung
von chemischen Standardverfahren und Standardrekombinationsverfahren durchgeführt werden.
Außer
durch Nucleinsäuresonden
können
Nucleinsäurezielanalyten
unter Verwendung anderer Sonden, z. B. Polypeptidsonden, z. B. Polypeptidsonden,
die Nucleotidsequenz-spezifische Nucleinsäure bindende Domänen enthalten,
nachgewiesen werden.
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Im Fall von Proteinzielen (z. B.
Antikörper,
Hormone, Enzyme, Pathogenproteine, Cytokine und Lymphokine) können Antikörper, z.
B. monoklonale Antikörper,
die spezifisch an einen Analyten binden, in den erfindungsgemäßen Verfahren
eingesetzt werden. Techniken zur Herstellung von Antikörpern sind
auf dem Fachgebiet gut bekannt (siehe z. B. Harlow et al., Antibodies,
A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring
Harbor, New York, 1988). Besonders nützliche Antikörpermoleküle umfassen Fab-Fragmente von Immunglobulinen,
wie auch rekombinant hergestellte einzelkettige Antikörper (siehe
z. B. Huston et al., US-Patent Nr. 5 091 513 (1992) und 5 132 405
(1992); und Ladner et al., US-Patent Nr. 4 704 692 (1987) und 4
946 778 (1990)). Zusätzlich
zu Antikörpern,
können
Nichtantikörperproteine,
Nucleinsäuren und
andere Moleküle,
die spezifisch an Zielproteinanalyte binden, verwendet werden.
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Die Detektorsonden können z.
B. mit fluoreszierenden Markierungen (z. B. Fluorescein, Rhodamin oder
Texasrot), Enzymmarkierungen (z. B. alkalischer Phosphatase, Glucoseoxidase,
Meerrettichperoxidase, Urease, Luciferase oder Galactosidase), Chromophoren,
phosporeszierenden Mitteln, lumineszierenden Mitteln, radioaktiven
Markierungen, gefärbten
Markierungen oder Kombinationen davon markiert sein. Ein Vorteil der
vorliegenden Erfindung besteht darin, dass infolge der physikalischen
Trennung der verschiedenen spezifischen Detektorsonden an der Vorrichtung
eine einzelne Markierung an mehreren, distinkten Detektorsonden in
derselben Vorrichtung verwendet werden kann.
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Obgleich die Verwendung einer Nachweissonde
die Spezifität
des Assays erhöht,
wie es oben beschrieben wurde, sind Nachweissonden nicht für alle Verfahren,
die in der Erfindung enthalten sind, notwendig. Beispielsweise sind
Nachweissonden in Fällen,
in denen das Ziel selbst markiert wird (z. B. durch PCR-, Primerextension-
oder metabolische Markierung), und zwar entweder vor oder nach Kontaktieren
mit einer Einfangsonde, nicht erforderlich. Nachweissonden sind
auch nicht erforderlich, wenn eine Einfangsonde-Analyt-Bindung durch Nachweis der Level
eines Interkalationsfarbstoffs, z. B. Ethidiumbromid oder Propidiumiodid,
das an einem Bindungselement eingefangen ist, durch Doppelstrangbildung
zwischen einer Nucleinsäureeinfangsonde
und Analyt überwacht
wird. Entsprechend können
Nachweissonden, die keine Markierungen enthalten, verwendet werden,
wenn eine Nachweissonde-Analyt-Bindung durch Nachweis der Level
eines Interkala tionsfarbstoffs, der in einem Bindungselement eingefangen
ist, durch Doppelstrangbildung zwischen einer Nucleinsäurenachweissonde
und einem Analyt überwacht
wird.
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Wie oben beschrieben wurde, können Einfangsonden,
die im Verfahren der Erfindung verwendet werden, z. B. (1) einen
Partner eines spezifisch bindenden Paars enthalten, oder (2) an
einem spezifischen Bindungselement einer Vorrichtung der Erfindung
immobilisiert sein. Bindungspaare können verwendet werden, um spezifische
Zielanalyten an ihre korrekten, vorbestimmten Bindungselemente zu
steuern, eher als eine direkte Anheflung von Einfangsonden an Bindungselemente
zu steuern. Zum Beispiel kann eine Einfangsonde für einen
spezifischen Zielanalyten einen Partner eines sich spezifisch bindenden
Paares enthalten und der andere Partner des Bindungspaars kann an
einem besonderen Bindungselement in der linearen Reihe befestigt
sein. Bei Kontaktieren der Probe mit der linearen Reihe werden die
Zielanalyten durch die wechselseitige Erkennung der zwei Partner
des Bindungspaares in spezifischer Weise an besondere Bindungselemente
lokalisiert. Bindungspaare (sich bindende Paare), die mit Einfangsonden
verwendet werden können,
umfassen zum Beispiel Vitamin-Vitamin-Bindungsproteine (z. B. Avidin-Biotin
und Streptavidin-Biotin)
wie auch Antikörper-Hapten
(z. B. Digoxigenin-Anti-Digoxigenin, FITC (Flurescein-Isothicyanat)-Anti-FITC
und ein beliebiger anderer Hapten-Anti-Haptenantikörper, von
denen viele im Handel verfügbar
sind), Enzym-Substrat, Enzym-Enzymbindungsprotein (z. B. β-Galactosidase
und APTG (Para-Aminophenyl-β-D-Thiogalactopyranosid), Rezeptor-Ligand
(oder Antagonist) (z. B. ein Hormon, das an einen Hormonrezeptor
bindet, z. B. hIL-Ira bindet an humanes Interleukinrezeptor-artiges
Interleukin-1), Nucleinsäure-Nucleinsäurebindungsprotein,
Nucleinsäure-Nucleinsäurebindungspaare
und andere spezifische Bindungspaare, die auf dem Fachgebiet bekannt sind.
Der andere Partner des sich spezifisch bindenden Paares oder die
Einfangsonde kann an einem Bindungselement der Vorrichtung unter
Verwendung von Standardverfahren gebunden werden. Beispielsweise können Sonden
an einer Oberfläche
(z. B. einer glatten oder porösen
Oberfläche,
hergestellt aus beispielsweise Glas, Kunststoff (z. B. Polypropylen),
Silicium, Gold oder Platin) durch Verwendung eines Linkers, z. B.
ein Epoxysilanlinker, z. B. ein 3-Glycidoxypropyltrimethoxysilan-Linker
(siehe z. B. Maskos et al., supra; Beattie et al., supra) gebunden
werden. Es kann auch Photolithographie verwendet werden (siehe oben).
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Ein Beispiel eines sich spezifisch
bindenden Paares, das in der Erfindung verwendet werden kann, ist ein
Paar komplementärer
Oligonucleotide. Optimale Längen,
Sequenzen und Komplementaritätslevel
von Oligonucleotiden zur Verwendung als spezifische Bindungspaare
können
in einfacher Weise vom Fachmann auf dem Gebiet bestimmt werden und
können
in Abhängigkeit
von Faktoren, einschließlich
Sequenzzusammensetzung, Probenkomplexität und Assaybedingungen (z.
B. Ionenstärke,
verwendete Salztypen, Vorliegen organischer Lösungsmittel und/oder Hybridisierungstemperatur)
variiert werden. Zum Beispiel kann eine Nucleinsäure, die alternierende Wiederholungen,
z. B. (AGTC)n (worin n = Anzahl der Wiederholungen) enthält, als ein
Partner eines spezifischen Bindungspaares verwendet werden, und
ihr Komplement, das alternierende Wiederholungen (GACT)n enthält, kann
als der andere Partner des Bindungspaares verwendet werden. Zusätzlich zu
Nucleinsäuren,
die wiederholte Sequenzen enthalten, können Nucleinsäurepaare,
die komplementäre
statistische Sequenzen enthalten, als Bindungspaare in der Erfindung
verwendet werden. Beispielsweise können Nucleinsäurepaare,
die jeweils z. B. 16 Nucleotide (z. B. mindestens 20 Nucleotide)
enthalten, verwendet werden. Solche statistischen Sequenzen, die
im humanen Genom statistisch einzigartig wären, liefern größere Spezifität. Es ist
möglich,
dass kürzere
Sequenzen komplementäre
Nichtzielsequenzen in Analytengemischen mit hoher Komplexität finden
können.
Paare aus homopolymeren Oligonucleotiden (z. B. Poly-A/Poly-T und
Poly-G/Poly-C) können
in der Erfindung auch als Bindungspaare eingesetzt werden.
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Enzymatische
Amplifikation von Nachweissonden
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Zusätzlich zu Nachweissonden, die
nachweisbare Markierungen daran gebunden haben, zum Beispiel die
oben beschriebenen Sonden, können
die Verfahren der Erfindung Nachweissonden verwenden, die eine ganze
Nucleinsäure
oder einen Teil davon enthalten, die/der enzymatisch unter Erzeugung
eines nachweisbaren Signals amplifiziert werden kann. Beispielsweise
kann eine Nachweissonde, die eine ganze Nucleinsäure oder einen Teil davon enthält, z. B.
Midi-Varianten-1 (MDV-1)-RNA, die/der autokatalytisch in Gegenwart
eines Enzyms, z. B. Qβ-Replikase,
replizierbar ist, verwendet werden.
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Autokatalytisch replizierbare Nucleinsäuren und
entsprechende Enzyme, die sie replizieren, sind auf dem Fachgebiet
bekannt und können
in einfacher Weise an eine Verwendung in den Verfahren der Erfindung angepasst
werden. Beispielsweise können
MDV-1-RNA, Nanovarianten-RNA, Minivarianten-RNA und Mikrovarianten-RNA,
die alle durch Qβ-Replikase replizierbar
sind, verwendet werden (siehe z. B. Kramer et al., US-Patent Nr.
4 786 600; Burg et al., Molecular and Cellular Probes 10: 257–271, 1996;
Munishikin et al., J. Molecular Biology 221: 463–472, 1991; Mills et al., Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 72(11): 4252–4256, 1975; Schaffner et al.,
J. Mol. Biol. 117: 877–907,
1977; Zamora et al., Biochemistry 34: 1261–1266, 1995).
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Zusätzlich zu Nucleinsäuren, die
durch Qβ-Replikase
replizierbar sind, können
in der Erfindung andere Nucleinsäuren,
z. B. Nucleinsäuren,
die aus Bakteriophagen-RNA-Genomen
stammen, die durch andere RNA-abhängige RNA-Polymerasen replizierbar
sind, verwendet werden. Beispielsweise können verwendet werden: Nucleinsäure, die
aus dem SP-Phagen (Fukami et al., Molec. Gen. Genet. 169: 173–181, 1979),
MS2, R17 und F2 (Inokuchi et al., Virology 96: 323–326, 1979;
Inokuchi et al., J. Mol. Biol. 158: 711–730, 1982) stammen; Nucleinsäuren, die
vom Brom-Mosaikvirus-RNA abgeleitet sind (Quadt et al., Proc. Natl.
Acad. Sci, USA 90: 1498–1502,
1993).
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Eine Nachweissonde, die die gesamte
Sequenz einer autokatalytisch replizierbaren Nucleinsäure enthält, z. B.
MDV-1, wobei ein Analyten-spezifisches Sondensegment an einem Ende
der replizierbaren Sequenz platziert oder darin eingebettet ist,
kann in den erfindungsgemäßen Verfahren
eingesetzt werden. Eine Entfernung von nicht-spezifisch gebundenen
Sonden aus Bindungselementen ist in Verfahren von Bedeutung, die diesen
Sondentyp verwenden, da eine nicht-spezifisch gebundene Sonde ebenso
einfach unter Erzeugung eines Signals amplifiziert werden kann wie
eine spezifisch gebundene Sonde. Somit kann die Verwendung dieses
Sondentyps zur Erzeugung von Hintergrundsignalen führen oder
alternativ zusätzliche
Maßnahmen
(Assayschritte) erfordern, um den Hintergrund auf akzeptable Level
zu reduzieren.
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Binäre Sondenpaare, die aus zwei
Nucleinsäuremolekülen bestehen,
die zusammen die gesamte Sequenz einer enzymatisch replizierbaren
Nucleinsäure
umfassen, können
verwendet werden, um die potentiellen Hintergrundprobleme zu vermeiden,
die mit den oben beschriebenen replizierbaren Sonden verbunden sind
(siehe z. B. Tyagi et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 5395–5400, 1996;
Martinelli et al., US-Patent Nr. 5 407 798). Die Verwendung von
binären
Sondenpaaren ist schematisch in 3 dargestellt.
In diesem Beispiel enthält
eine Nachweissonde 68 einen 3'-Teil einer autokatalytisch replizierbaren
Nucleinsäure 70 an
ihrem 3'-Ende und
eine Analyten-spezifische Sonde 72 an ihrem 5'-Ende. Die Einfangsonde 60,
die in diesem Beispiel an das Bindungselement 58 gebunden
ist (die Einfangsonde kann auch einen Partner eines sich spezifisch
bindenden Paares sein, siehe oben), enthält den 5'-Teil der autokatalytisch replizierbaren
Nucleinsäure 62 mit
einer Analyten-spezifischen Sonde 64 an ihrem 3'-Ende. Die Sonden
können
so aufgebaut sein, dass, wenn sie an einen Analyten 66 gebunden
sind, das 3'-Ende
der Sonde 60 zu dem 5'-Ende der Sonde 68 benachbart
ist. Die gebundene Sonde 60 und Sonde 68 können miteinander
legiert werden (d. h. kovalent verknüpft werden), um eine Matrize
zur autokatalytischen Replikation zu bilden. Die Verwendung von
derartigen binären
Sonden verringert die Möglichkeit
einer Signalerzeugung in Abwesenheit einer spezifischen Bindung zwischen
der Einfangsonde, dem Analyten und der Nachweissonde, da eine kovalente
Verknüpfung
der Einfang- und Nachweissonden erforderlich ist, um das autokatalytisch
replizierbare Templat zu erzeugen.
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Die in solchen binären Sondenpaaren
verwendeten Nachweis- und Einfangsonden können beide aus DNA bestehen,
beide aus RNA bestehen oder es kann eine der Sonden aus DNA und
die andere Sonde aus RNA bestehen. Außerdem kann eine Sonde oder
können
beide Sonden aus einer gemischten DNA/RNA-Zusammensetzung bestehen.
Die Sonden können
z. B. unter Verwendung von Standardverfahren der Molekülchemie
oder Standardphosphoramidchemie hergestellt werden. Die Verwendung
von 5'- und 3'-Teil-Sonden, die
beide aus RNA bestehen, kann zur Erzeugung von Hintergrundsignalen
führen,
da solche Sonden RNA-Rekombinationsreaktionen in Gegenwart von Qβ-Replikase
begünstigen
können,
was zur Produktion eines replizierbaren RNA-Templats in Abwesenheit
einer Analyten-abhängigen
Ligation führt.
Die Verwendung einer 5'-Teil-Sonde,
hergestellt aus DNA und einer 3'-Teilsonde,
hergestellt aus RNA, in einem derartigen binären Sondensystem liefert einen
wichtigen Vorteil, das solche RNA-Rekombinationsreaktionen unterdrückt. Als
Folge können
viel höhere
Level an nicht legierten, freien Sonden während der Qβ-Amplifikationreaktion vorliegen,
was die Assayanforderungen bezüglich
der Entfernung von nicht hybridisierten Sonden stark verringert.
Außerdem
ermöglicht
die Verwendung eines DNA-5'-Fragments
mit einem RNA-3'-Fragment,
das das chimäre
Ligationsprodukt mit ähnlicher
Effizienz wie eine Gesamt-RNA-Matrize repliziert, die deutlich effizienter
repliziert wird als eine Gesamt-DNA-Matrize. Ein allgemeines Beispiel
für eine
derartige chimäre,
binäre Sonde
wird nachfolgend beschrieben.
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Eine 5'-Sonde kann aus einer DNA-Version eines
Teils von MDV-1 (oder einer anderen autokatalytisch replizierbaren
Matrize), gebunden an ein Sondenelement, das zu einem Teil einer
Analytennucleinsäure
an ihrem 3'-Ende
komplementär
ist. Eine 3'-Sonde
kann aus einer RNA bestehen, die eine Sondensequenz enthält, welche
komplementär
zu der Analytenregion angrenzend zu der, die durch die 5'-Sonde an ihrem 5'-Ende gebunden ist,
komplementär
ist, und dem Rest der replizierbaren RNA-Sequenz an ihrem 3'-Ende bestehen. Die Sondensequenzelemente
jeder der Sonden können
von den replizierbaren Sequenzen durch ein oder mehrerer Spacerelemente
getrennt sein, um die Replizierbarkeit des chimären gebundenen DNA : RNA-Produktes zu
verbessern.
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Die zwei Sonden werden an eine Zielnucleinsäure hybridisiert
und legiert, wobei z. B. T4-DNA-Lipase, oder
eine Reihe chemischer Reagenzien, z. B. Cyanogenbrodmid, Cyanoimidazol,
1-Methylcyanoimidazol, Carbonyldiimidazol oder ein wasserlösliches
Carbodiimid verwendet werden. Das Ligationsprodukt wird mit einem
Enzym, z. B. Qβ-Replikase,
und Nucleosidtriphosphat kontaktiert, um eine Replikation und die
Erzeugung nachweisbarer Mengen eines Replikationsproduktes zu begünstigen.
Das Replikationsprodukt wird zum Beispiel durch Färben mit
einem Farbstoff, der sich in das Replikationsprodukt einlagert,
z. B. Ethidiumbromid oder Propidiumiodid) oder durch Hybridisierung
mit einer Sonde, die spezifisch an das Replikationsprodukt bindet,
nachgewiesen.
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Kapillarelektrophorese
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Wie oben beschrieben wurde, kann
eine Bindung von Analyten und Sonden an die Bindungselemente der
Vorrichtung zum Beispiel durch elektrophoretisches und/oder mechanisches
Pumpen der Probe und der Sonden durch die Vorrichtung begünstigt werden.
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Im Fall eines elektrophoretischen
Transfers kann die lineare Reihe von Bindungselementen der Vorrichtung
in einem verlängerten
Kanal, z. B. einer Kapillarröhre,
die aus Glas, Kunststoff oder anderem Material besteht, und einen
Innendurchmesser von zum Beispiel weniger als 1 bis 2 Millimeter,
beispielsweise weniger als 500 μm
hat, enthalten sein. Es kann zum Beispiel eine Kapillarröhre mit
einem Innendurchmesser von 100 μm
und einer Länge
von 50 Millimeter verwendet werden. Höhere Oberfläche-zu-Volumen-Verhältnisse
können
erreicht werden, indem dünnere
Kapillanöhren
verwendet werden, wodurch eine schnellere Hybridisierungsgenetik
begünstigt
wird. Die Verwendung einer Kapillarröhre mit einem hohen Oberfläche-zu-Volumen-Verhältnis und
damit einer hohen Kapazität
für Wärmedissipation
ermöglicht
die Anwendung hoher Spannungen, wodurch eine Beschleunigung der
Assays erreicht wird. Außerdem
erleichtert das hohe Oberfläche-zu-Volumen-Verhältnis von
Kapillarröhren
eine Zielanalytenhybridisierung an die Sonden, da ein beliebiges
Zielmolekül,
das durch die Kapillarröhre
geht, in enger Nachbarschaft zu den Sonden ist.
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Eine weitere Folge des hohen Oberfläche-zu-Volumen-Verhältnisses
von Kapillarröhren
ist im Hinblick auf die vorliegende Erfindung die, dass nur sehr
geringe Mengen an Reagenzien und Analyten erforderlich sind, wobei
die letztgenannten in einem kleinen oder großen Probenvolumen sind. Da
nur einige hundert Fluorophore zum Nachweis durch eine CCD-Vorrichtung
(siehe z. B. Mackay et al., US-Patent Nr. 4 874 492 (1989)) nach
Fluoreszenzinduktion durch einen Laser benötigt werden, wird ein einziger
Milliliter Blut, der etwa 106 bis 107 weiße
Blutzellen enthält,
eine ausreichende Zielmenge zum Nachweis unter Verwendung der erfindungsgemäßen Verfahren
bereitstellen. Wenn bakterielle rRNAs die Zielanalyten sind, sollte
ein einzelnes Bakterium in einem Milliliter Probe unter Anwendung
der erfindungsgemäßen Verfahren
nachweisbar sein.
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Verfahren zur Durchführung einer
Kapillarelektrophorese sind auf dem Fachgebiet gut bekannt und werden
z. B. von Novotny et al. (Electrophoresis, 11: 735–749, 1990)
beschrieben. Zur Durchführung
des erfindungsgemäßen Verfahrens
kann irgendeines verschiedener Standardkapillarelektrophoresesysteme
verwendet werden. Beispielsweise kann das Beckman P/ACE-System 2050
(Beckman Instruments, Columbia, MD) verwendet werden. Außerdem können Systeme,
die eine gleichzeitige Bearbeitung verschiedener Kapillarröhren erleichtern,
verwendet werden (siehe z. B. Yeung et al., US-Patent Nr. 5 324
401 (1994).
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Zusätzlich zur Kapillarelektrophorese
können
andere elektrophoretische Verfahren in dem Verfahren der Erfindung
eingesetzt werden. Beispielsweise kann eine Elektrophorese in einem
Kanal durchgeführt
werden, der in eine Platte, z. B. eine Glas- oder Kunststoffplatte,
geätzt
wurde und eine lineare Reihe von Bindungselementen enthält. In diesen
Verfahren steht jedes Endes des Kanals mit einer Vertiefung in Kontakt,
in eine von denen die Probe (und die Sonden) angewendet werden.
Dieser Systemtyp ermöglicht
die Analyse größerer Probenvolumina.
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Nachweis von
Markierungen die an Bindungselemente gebunden sind
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Emission, Extinktion oder ein anderes
nachweisbares Signal der Markierungen, die an die spezifischen Bindungselemente
der erfindungsgemäßen Vorrichtungen
gebunden sind, können
unter Verwendung eines beliebigen verschiedener Standardverfahren
nachgewiesen werden, und zwar in Abhängigkeit von der Natur der
Markierung. Zum Beispiel können
Chromophormarkierungen durch Messung der Lichtabsorption bei einer
spezifischen Wellenlänge
mit einem Spektralphotometer gemessen werden, während Licht, das durch eine
chemilumineszierende Markierung erzeugt wird, unter Verwendung eines
Luminometers oder einer CCD-Vorrichtung nachgewiesen werden kann.
Eine CCD-Vorrichtung kann auch verwendet werden, um eine elektromagnetische
Strahlung höherer
Frequenz (z. B. Strahlung aus einer radioisotopen Markierung) oder Fluoreszenz,
die von einem Fluorophor erzeugt wird, der bei einer geeigneten
Wellenlänge
mit einer Standardquecksilber lichtquelle oder einem Laserstrahl
angeregt wurde, nachzuweisen. Um mehrere Zielzonen nachzuweisen,
kann die Kapillanöhre
mit einer optischen Faser durchgescannt werden oder es kann eine
CCD-Reihe angrenzend an die Kapillanöhre, aber senkrecht zum Anregungsstrahl
angeordnet werden. Der Anregungsstrahl kann Teil der Scanningvorrichtung
sein, zum Beispiel kann eine Innenfaser das Laserlicht tragen, während umgebende
Fasern das Fluoreszenzlicht zurück
zum Abbildungssystem transportieren können. Nach einem anderen Modus
kann der Laserstrahl durch ein Ende der Kapillanöhre gerichtet werden, entweder
durch das Lumen, wodurch die Innenseite der Kapillanöhre als
Lichttunnel wirkt, oder durch die Wand, die dann als Wellenleiter
wirkt. Im letztgenannten Fall würden
nur Fluorophormarkierungen sehr nah an der Innenwand durch ein gut
bekanntes Verfahren, das als Oberflächenplasmonresonanz bezeichnet
wird, angeregt werden. Dem Fachmann wird klar sein, dass geeignete
Filter zur Entfernung von Streulicht oder reflektiertem Licht mit einer
Detektorvorrichtung, z. B. einer CCD-Vorrichtung oder einer Photomultiplierröhre, verwendet
werden können.
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Der Detektor kann so positioniert
werden, dass er die genaue Stelle in der Vorrichtung, die einem
spezifischen Bindungselement entspricht, überwacht und, wenn es erforderlich
ist, kann die lineare Reihe von Bindungspaaren so bewegt werden,
dass verschiedene spezifische Bindungselemente vom Detektor gelesen werden.
Alternativ kann der Detektor entlang der Vorrichtung bewegt werden.
In einem anderen Beispiel, das die Verwendung einer Kapillanöhre beinhaltet,
wird weder die Kapillanöhre,
die die lineare Reihe von Bindungselementen enthält, noch der Detektor bewegt.
Sobald Komplexe an den Bindungselementen gebildet sind, werden diese
innerhalb der Kapillanöhre
transportiert, so dass sie sich hinter einen Detektor bewegen. Ein
derartiger Transport kann zum Beispiel induziert werden, indem Flüssigkeit
durch die Kapillanöhre
gepumpt wird, um die lineare Reihe konvektiv zu bewegen. In einer
Vorrichtung, in der die ganze lineare Reihe bewegt wird, die entweder
in einer Kapillanöhre
enthalten ist oder nicht, kann der Detektor so programmiert werden,
dass eine Ablesung nur zu einer vorbestimmten Zeit nach Strömungsbeginn
vorgenommen wird, zum Beispiel zu der Zeit, von der bestimmt wurde,
dass sie mit dem Durchgang der Markierung übereinstimmt. Es kann auch
eine lineare CCD-Vorrichtung,
die sich über
die Länge
der Vorrichtung erstreckt, verwendet werden. Geeig nete Systeme,
die eine Signalinduktion integrieren (z. B. Laser) und Detektionsvorrichtungen
(z. B. CCD-Vorrichtungen) sind auf dem Fachgebiet gut bekannt (siehe
z. B. Fujimiya et al., US-Patent-Nr. 5 069 769 (1991); Pentoney,
US-Patent-Nr. 5 208 466 (1993).
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Um eine quantitative Analyse von
Zielanalyten durchzuführen,
kann zuerst eine Standardkurve erstellt werden, wobei Standardverfahren
angewendet werden. Beispielsweise kann die Menge an Markierung,
die unter Verwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens nachgewiesen
wird, für
verschiedene Proben bestimmt werden, die bekannte Mengen der Analyten
enthalten. Standardkurven, die durch diese Ablesungen erzeugt werden,
können
dann verwendet werden, um die Konzentrationen der Analyten in einer
Probe, die unbekannte Analytenkonzentrationen hat, zu bestimmen,
indem die Level der detektierten Signale mit den Standardkurven verglichen
werden.
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BEISPIELE
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Beispiel I-Nachweis
von Salmonella in einer biologischen Probe
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Die neuen Verfahren und Vorrichtungen
(z. B. die in 1 dargestellte
Vorrichtung) kann verwendet werden, um das Vorliegen von pathogenen
Organismen in einer Probe, zum Beispiel zum Nachweis von Salmonella
in einer Lebensmittelprobe nachzuweisen. Reagenzien und Verfahren,
die zur Durchführung
dieses Assays anpassbar sind, werden im GENE-TRAK Salmonella Assay
Kit (GENE-TRAK Industrial Diagnostics, Hopkinton, MA) bereitgestellt.
Kurz ausgedrückt,
es wird eine Vorrichtung der Erfindung hergestellt, die ein Bindungselement,
welches eine Poly-A-Sonde daran gebunden hat, enthält. Eine
Probe, eine Einfangsonde, die für
eine Salmonella-Nucleinsäure
spezifisch ist und einen Poly-T-Schwanz enthält, und eine Nachweissonde, die
für dieselbe
Salmonella-Nucleinsäure spezifisch
ist, werden dann auf eine Öffnung
dieser Vorrichtung angewendet.
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Wenn es gewünscht wird, können die
Sonden und die Proben mehrmals durch die Vorrichtung transportiert
werden, z. B. durch Elektrophorese oder durch Verwendung eines Flüssigkeitstransporters,
z. B. einer mechanischen Pumpe. Nach Entfernung von nicht-spezi fisch
gebundenem Material, z. B. ungebundene Nachweissonde, wird das Bindungselement
der Vorrichtung, die die Poly-A-Sonde enthält, auf Vorliegen der Nachweissondenmarkierung überwacht,
wobei ein Verfahren verwendet wird, das für den Markierungstyp geeignet ist
(siehe z. B. oben).
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Außer Salmonella kann auch das
Vorliegen von anderen Pathogenen in der Probe gleichzeitig überwacht
werden, wobei dieselbe Vorrichtung verwendet wird, vorausgesetzt,
die Vorrichtung enthält
Bindungselemente, die für
jedes zusätzliche
Pathogen (1) eine Sonde, die für
das andere Pathogen spezifisch ist, oder (2) eine Sonde, die einen
Parmer eines Bindungspaares enthält,
wobei der andere Partner eine Komponente einer Sonde ist, die für das andere
Pathogen spezifisch ist, enthalten (es wird betont, dass das Poly-A/Poly-7-Bindungspaar, das
zum Nachweis von Salmonella eingesetzt wird, nicht verwendet werden
könnte,
um im gleichen Assay andere Pathogene nachzuweisen). Gemäß der obigen
Beschreibung können
die Sonden für die
anderen Pathogene entweder direkt an ein Bindungselement befestigt
werden oder können
Einfangsonden sein, die zusätzlich
zur Bindung an den pathogenspezifischen Analyt. an eine Sonde binden,
die (1) an ein Bindungselement gebunden ist, und (2) von der oben
beschriebenen Poly-A-Sonde distinkt sind.
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Beispiel II – Nachweis
von chromosomalen Translokationen
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Die Erfindung kann verwendet werden,
um chromosomale Translokationen nachzuweisen. Als spezifisches Beispiel
kann die Erfindung eingesetzt werden, um das sog. "Philadelphia"-Chromosom nachzuweisen,
dessen Vorliegen häufig
die akute lymphozytische Leukämie
(ALL) und chronischer myelogischer Leukämie (CML) zugrunde liegende
Ursache ist. Das Philadelphia-Chromosom ist dadurch gekennzeichnet,
dass es eine ausgewogene Translokation der terminalen Region von
Chromosom 9 zur terminalen Region von Chromosom 22 hat. Dies führt zu einer
Genfusion zwischen dem abl-Onkogen an Chromosom 9 und dem bcr-Gen
an Chromosom 22. Diese Genfusion wird in einer Message transkribiert,
der Regionen enthält,
die beiden Genen entsprechen.
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Die vorliegende Erfindung kann verwendet
werden, um solche Translokationen wie folgt nachzuweisen. Es kann
eine Einfangsonde entwickelt werden, um an die bcr-Region der Fusion
(entweder das Gen selbst oder ein RNA (pre-mRNA oder mRNA)-Transkript
davon) zu hybridisieren, während
eine Nachweissonde entwickelt wird, um an die abl-Region zu hybridisieren.
Es kann eine Vorrichtung der Erfindung hergestellt werden, in der
die Einfangsonde an ein spezifisches Bindungselement gebunden ist.
Alternativ kann ein Bindungselement der Vorrichtung einen Partner
eines spezifischen Bindungspaares (bzw. eines sich spezifisch bindenden
Paares) enthalten (z. B. Avidin) und die Einfangsonde kann den anderen
Partner des sich spezifisch bindenden Paares enthalten (z. B. Biotin).
In beiden Fällen
werden die Probe, die Einfangsonde und die Nachweissonde mit dem
Bindungselement in Kontakt gebracht und nach Entfernung von nicht
gebundenen Komponenten (z. B. ungebundene Nachweissonde) durch z.
B. Elektrophorese oder mechanisches Pumpen wird das Vorliegen der
abl-Nachweissonde an dem bcr-Bindungselement überwacht. Ein Einfangen der
abl-Nachweissonde durch die bcr-Einfangsonde zeigt das Vorliegen
der Philadelphia-Translokation in der Probe an.
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Eine Diagnose von CML und ALL unter
Verwendung der erfindungsgemäßen Verfahren
kann auch unter Verwendung mehrerer Einfangsonden, die verschiedene
Sequenzen im bcr-Gen erkennen, durchgeführt werden. Diese Sonden können verwendet
werden, um Translokationen zu unterscheiden, die verschiedene Durchbruchpunkte
enthalten, am Chromosom 22 zu unterscheiden. Dieses Verfahren
wird nachfolgend erläutert.
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Synthetische
Oligonucleotide als Modellziele, Einfangsonden und Nachweissonden
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Modellziele
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Zwei Modellziele wurden entwickelt,
um chimäre
ALL- und CML-mRNAs nachzuahmen. Das ALL-Modellziel (40 mer) enthält 20 Nucleotide
der bcr-Sequenz (Nucleotide 1594– 1613) und 20 Nucleotide der
abl-Sequenz (Nucleotide 463–482).
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Das CML-Modellziel (40 mer) enthält 20 Nucleotide
der CML-spezifischen bcr-Sequenz (Nucleotide 3349–3368) und
20 Nucleotide derselben abl-Sequenz als ALL-Modellziel (Nucleotide
463–482).
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Einfansonden
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Die ALL-Einfangsonde, deren 18 mer
ist, 5'-carboxyliert
ist und zur bcr-Region des ALL-Ziels
komplementär
ist, hat die folgende Sequenz.
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Die CML-Einfangsonde, die ein 18
mer ist, 5'-carboxyliert
ist und zu der bcr-Region der CML-Zielsonde komplementär ist, hat
die folgende Sequenz.
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Zwei unvollständig komplementäre (2 und
4 Fehlpaarungen) CML-Einfangsonden wurden hergestellt, um die Spezifität der Hybridisierung
zu untersuchen. Sonde 2 MS, die 2 Fehlpaarungen (unterstrichen)
enthält, hat
die folgende Sequenz.
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Sonde 4 MS, die die 4 Fehlpaarungen
enthält,
hat die folgende Sequenz.
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Nachweissonde
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Die Nachweissonde (DP, 20 mer), die
mit FITC markiert ist, ist zu der abl-Sequenz, die den ALL- und CML-Modellzielen
gemeinsam ist. Die Nachweissonde hat die folgende Sequenz.
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Vergleichsbeispiel
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Herstellung
einer Vorrichtung zum Nachweisen und Unterscheiden von Philadelphia-Translokationen
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Eine Kupplungsreaktion, die 1-Ethyl-3-(3-Dimethyl-Aminopropyl)
Carbodiimid (EDAC) verwendet, wurde eingesetzt, um Einfangsonden
an Affi-Gel 102-Perlen zur Verwendung als Bindungselemente wie folgt zu
heften.
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Eine Affi-Gel 102-Gelaufschlämmung (0,5
ml) wurde mit 500 nMol DNA-Oligomer (ALL- oder CML-spezifischer
Einfangsonde) in 0,5 ml Wasser vermischt und der pH wurde mit 50 μl 0,2 N HCl
auf 4,8 bis 5,0 eingestellt. Nach Zugabe von 0,5 mg EDAC wurde der
pH erneut mit 30 μl
0,2 N HCl auf einen pH von 5,0 eingestellt und das Gemisch wurde
für 3 Stunden
bei Raumtemperatur geschüttelt.
Es wurde eine Kupplungseffizienz von 70% erreicht, 350 nMol DNA-Oligomer
wurden an 400 μl
feuchte Gelperlen gebunden. Eine Glaskapillarröhre mit einem Innendurchmesser
von etwa 2,5 mm wurde an einem Ende mit Glaswolle zugestöpselt und
dann mit abwechselnden Schichten aus Gelperlen mit oder ohne angeheftete
Einfangsonden beschickt.
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Vergleichsbeispiel
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Demonstration eines Einfangens
mehrerer Ziele an der Vorrichtung
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Synthetische Modellziele (ALL oder
CML) wurden mit Nachweissonde in 3 x SSC (1 × SSC = 150 mM NaCl, 15 mM
Natriumcitrat) vermischt, so dass alle Sonden in einer Konzentration
von 1 μM
vorlagen. Nach 5-minütigem
Erwärmen
auf 70°C
wurden Modellziele und Nachweissonden bei Raumtemperatur für 1 Stunde hybridisiert.
Aliquots dieses Gemisches wurden mit 3 × SSC verdünnt, um eine Endkonzentration
von 25 pMol Hybrid in einem Gesamtvolumen von 300 μl zu erhalten.
Das ALL-Ziel-Nachweissonden-Hybrid wurde durch eine Kapillarröhre geleitet,
die alternierende Schichten von Perlen, die entweder ALL, CML oder
keine Einfangssonden enthielten (siehe oben) mit einer Durchflussrate von
75 μl/Minute
geführt.
Die Kapillarröhre
wurde dann zweimal mit 1 ml 3 × SSC
gewaschen. Der Bereich der Kapillarröhre, die das Gelbett enthielt,
wurde mit einer CCD-Vorrichtung
abgebildet, wobei ein geeignetes System zur Anregung des FITC-Fluorophor
und zum Einfangen des FITC-spezifischen fluoreszierenden Lichts
verwendet wurde.
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4A zeigt
alle drei Bereiche, die ALL-spezifische Einfangsonden enthalten,
die einiges vom Modellziel-Nachweissonde-Komplex eingefangen haben.
Der CML-spezifisches Ziel-Nachweissonden-Komplex
wurde dann unter denselben Bedingungen auf die Kapillarsäule angebracht
und nachdem die Kapillarröhre
von nicht gebundenem Material frei gewaschen worden war, wurde die
Kapillarröhre
erneut abgebildet. 4B zeigt
ein Einfangen der CML-spezifischen Zielkomplexe in Gelzonen, die
CML-spezifische Einfangsonden enthalten. Die Bereiche des Gels zwischen
dem CML- und ALL-spezifischen Gelbetten enthielten keine Einfangsonden
und blieben daher nicht-fluoreszierend. Der Glaswollstopfen zeigt
eine gewisse nicht-spezifische Autofluoreszenz.
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Vergleichsbeispiel
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Demonstration
der Zielspezifität
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Eine Glaskapillarröhre wurde
mit einer einzelnen Schicht aus CML-spezifischem Einfanggel und
je einer Schicht Gel, das 2 Fehlpaarungs (2 MS) – oder 4 Fehlpaarungs (4 MS)-Einfangsonden enthielt,
beabstandet durch eine Gelschicht ohne Einfangsonden, beschickt.
Das CML-spezifische Modellziel-Nachweissonde-Hybrid (5 pMol in 100 μl) wurde
mit einer Strömmunsgeschwindigkeit
von 0,013 ml/Minute auf die Kapillarröhre aufgebracht. Die Kapillarröhre wurde
dann mit je 1 ml 3 × SSC
mit 25°C,
42°C, 52°C, 58°C und 70°C gewaschen.
Die Kapillarröhre
wurde vor Aufbringen von Ziel-Nachweissonden-Komplexen und nach jedem Waschen abgebildet.
Für jedes
Bild wurden verschiedene Belichtungszeitch gewählt, um eine Über- oder
Unterbelichtung kritischer Bereiche zu vermeiden. 5 zeigt die Autofluoreszenz lediglich
der Glaswolle (nach verlängerter
Belichtung) vor Aufbringen des CML-Ziels. Nach Aufbringen des CML-Modellziels
bei Raumtemperatur (etwa 23°C)
trat an der 2 MS-Fehlpaarungszone und der CML- spezifischen Einfangzone, nicht aber
an der 4 MS-Fehlpaarungszone eine Bindung auf. Nach Temperaturerhöhung auf
42°C wird
das Modellziel von der 2 MS-Fehlpaarungszone, nicht aber aus der
CML-Modellzielzone freigesetzt, was anzeigt, dass ein zielspezifisches
Einfangen in spezifischen Zonen der Vorrichtung bei der entsprechenden
Temperatur erreicht werden kann.
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