DE69728864T2

DE69728864T2 - Direkte molekulare diagnose von friedreich ataxia

Info

Publication number: DE69728864T2
Application number: DE69728864T
Authority: DE
Inventors: Massimo Pandolfo; Laura Montermini; Maria Molto; Michael Koenig; Victoria Campuzano; Mireille Cossee
Original assignee: Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM
Current assignee: Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM
Priority date: 1996-03-06
Filing date: 1997-03-04
Publication date: 2005-07-28
Anticipated expiration: 2017-03-05
Also published as: CA2248016C; US6150091A; ATE265544T1; AU2095097A; EP0885309B1; WO1997032996A1; DE69728864D1; JP4602481B2; EP0885309A1; JP2000507093A; CA2248016A1

Description

Friedreich-Ataxie (FRDA) ist die häufigste erbliche Ataxie, mit einer geschätzten Häufigkeit von 1 auf 50 000 und einer abgeleiteten Trägerhäufigkeit von 1/120 in der europäischen Bevölkerung. FRDA ist eine autosomale rezessive degenerative Krankheit, die durch fortschreitende Gang- und Gliederataxie, fehlende Sehnenreflexe in den Beinen, Verlust des Lagesinnes, Dysarthrie und pyramidale Schwäche der Beine gekennzeichnet ist. Bei fast allen Patienten findet man hypertrophe Cardiomyopathie. In etwa 10% der Fälle wird Diabetes mellitus beobachtet, in weiteren 20% Kohlenhydrat-Intoleranz und in allen Fällen eine reduzierte Insulinreaktion auf Argininstimulation. Das Manifestationsalter liegt gewöhnlich um die Pubertät herum und fast immer vor einem Alter von fünfundzwanzig. Die meisten Patienten sind bis zum Alter von knapp dreißig an den Rollstuhl gefesselt, und zur Zeit gibt es keine Behandlung gegen das langsame Fortschreiten der Krankheit.
Die ersten pathologischen Veränderungen treten vermutlich in den Hinterwurzelganglien mit einem Verlust der großen sensorischen Neuronen auf, gefolgt von einer Verschlechterung der sensorischen Hintersäulen, spinocerebellären Trakte und corticospinalen motorischen Trakte des Rückenmarks und einer Atrophie der großen sensorischen Fasern in peripheren Nerven. Nur gelegentliche leichte degenerative Veränderungen findet man im Kleinhirn, Balken und Mark. Während die meisten Symptome eine Folge der neuronalen Degeneration sind, spiegeln Cardiomyopathie und Diabetes vermutlich unabhängige Stellen der primären Degeneration wider. Insgesamt ist die Pathologie von FRDA von derjenigen anderer vererbter Ataxien, insbesondere den dominanten Formen und Ataxia teleangiectatica, wo das Kleinhirn die primäre Stelle der Degeneration ist, sehr verschieden.
Das mutierte Gen bei FRDA wurde auf dem Chromosom 9q13–q21.1 kartiert, 5. Chamberlain et al., Nature, 334: 248 (1988); und der FRDA-Kandidatenbereich wurde auf ein 150-kb-Segment eingeengt, das vom Z0-2-Gen (distal) und dem Marker F8101 (proximal) flankiert wird, L. Montermini et al., Am. J. Hum. Genet., 57: 1061 (1995). Früher vorgeschlagene Kandidatengene wurden ausgeschlossen: das X104/CSFA1/Z0-2-Gen auf der Basis des Fehlens einer schädlichen Mutation bei Patienten und die STM7- und PRKACG-Gene, weil sie ganz auf der Centromerseite von F8101 liegen (1A).
Der Artikel von Doerflinger et al. (1995, American Journal of Human Genetics, Vol. 56: 1116–1124) bezieht sich auf diejenige Ataxie mit Vitaminmangel (AVED), die als autosomale rezessive Krankheit beschrieben wird, welche klinisch durch neurologische Symptome mit verblüffender Ähnlichkeit mit denjenigen der Friedreich-Ataxie gekennzeichnet ist. Der AVED-Locus wurde jedoch auf einem Konfidenzintervall von 5 cM auf dem Chromosom 8q kartiert.
Der Artikel von Duclos et al., (1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol. 90: 109–113) offenbart, dass das FRDA-Gen im 9q13–q21-Chromosom lokalisiert wurde.
Kurzbeschreibung der Erfindung
Es ist ein besonderes Ziel der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren zur Durchmusterung von Individuen nach einer Mutation, die zu Friedreich-Ataxie führt, bereitzustellen, wobei das Verfahren die Bestimmung der Zahl von GAA-Repeats in einem Intron des X25-Gens umfasst.
Es ist ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren zur Durchmusterung von Individuen nach einer Mutation, die zu Friedreich-Ataxie führt, bereitzustellen, wobei das Verfahren die Schritte der Messung der Expression des X25-Gens auf dem mRNA- oder Proteinniveau umfasst.
Es ist ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren zur Durchmusterung von Individuen nach einer Mutation, die zu Friedreich-Ataxie führt, bereitzustellen, wobei das Verfahren den Schritt des Nachweisens einer Größenvariation eines (GAA)_n-Repeats in einem ersten Intron eines X25-Gens, indem man die Länge des Repeats misst, umfasst, wobei n für normale Individuen im Bereich von 1–22 liegt und n für betroffene Individuen größer als etwa 120–900 ist.
Es ist ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren zur Durchmusterung von Individuen nach einer Mutation, die zu Friedreich-Ataxie führt, bereitzustellen, wobei das Verfahren die Schritte des Sequenzierens von DNA von einem Individuum und des Vergleichens der Sequenz von dem Individuum mit den SEQ ID Nr. 1–12 umfasst, um zu bestimmen, welche Unterschiede, wenn überhaupt, zwischen den beiden Sequenzen bestehen.
Es ist noch ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung, Zusammensetzungen zur Behandlung von Friedreich-Ataxie bei einem Individuum bereitzustellen, wobei die Behandlung den Schritt des Verabreichens einer effektiven pharmakologischen Dosis eines Proteins mit einer Aminosäuresequenz, die SEQ ID Nr. 4 im Wesentlichen ähnlich ist, an das Individuum umfasst.
Es ist ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung, Zusammensetzungen zur Behandlung von Friedreich-Ataxie bei einem Individuum bereitzustellen, die einen Nucleinsäurevektor, der ein expressionsfähiges X25-Gen enthält, in einem pharmakologisch annehmbaren Träger umfassen und dem Individuum verabreicht werden.
Es ist ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung, Stoffzusammensetzungen mit den SEQ ID Nr. 1–32 bereitzustellen.
Andere und weitere Ziele, Merkmale und Vorteile gehen aus der folgenden Beschreibung hervor, und anhand ihrer Lektüre unter Bezugnahme auf die Begleitzeichnungen, die einen Bestandteil davon bilden, ist die Erfindung leichter zu verstehen, wobei die Beispiele für die zur Zeit bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung zu Offenbarungszwecken angegeben sind.
Beschreibung der Zeichnungen
1(A): Transcriptionskarte des für FRDA kritischen Intervalls. Abstände sind in Kilobasenpaaren ab der ersten NotI-Stelle stromaufwärts des Z0-2-Gens angegeben. Der kritische FRDA-Bereich liegt zwischen dem F8101-Marker und dem Z0-2-Gen. M: MluI-Stelle; N: NotI-Stelle; E: EagI-Stelle; S: SacII-Stelle; B: BssHI-Stelle. 1(B): Abgleich der Exon-5a-haltigen Isoform von Frataxin mit translatierten ORFs, die in einem G.-elegans-Cosmid (CELT59G1) und einem S.-cerevisiae-EST (T38910) enthalten sind. Identische Aminosäuren sind mit Kästchen umrandet. Das mutmaßliche Signalpeptid ist unterstrichen. Aminosäuren, die von einer Punktmutation betroffen sind (L106X und I154F) sind durch senkrechte Pfeile gekennzeichnet. Die Exon-5b-haltige Isoform weicht an Position 161 ab, und ihre 11 COOH-terminalen Aminosäuren sind RLTWLLWLFHP.
2: Northern-Blot-Analyse von X25-Transcripten. Ein ³²P-markiertes 5'-RACE-Produkt, das die Exons 1–5b enthält, wurde mit einem multiplen Gewebe-Northern-Blot (Clontech), der in jeder Spur 2 μg Poly-A + RNA enthielt, hybridisiert. Die Membran wurde bei 50°C mit 0,1 × SSC, 0,1% SDS gewaschen und dann 7 Tage lang bei –70°C auf Röntgenfilm einwirken gelassen. Das untere Bild zeigt eine sukzessive Hybridisierung desselben Blots mit einer Actinsonde (von dem Blot-Hersteller zur Verfügung gestellt).
3: Southern-Blot-Analyse, die FRDA-assoziierte expandierte Restriktionsfragmente zeigt. Spuren 1 und 12: normale Kontrollen; Spuren 2–7: Individuen aus einer saudiarabischen FRDA-Familie; Spuren 8–11: Individuen aus einer akadischen (Cajun) FRDA-Familie aus Louisiana. Betroffene Personen sind in den Spuren 3–5 und 9–10, heterozygotische Träger in den Spuren 2, 6–8 und 11. Die Position von Molekulargewichtsmarkern ist auf der Seite angegeben. Die konstanten Banden entsprechen den Exons 2 und 3 (15 kb) und einer verwandten Sequenz außerhalb des FRDA-Bereichs (5 kb). Zehn μg genomische DNA von jedem Individuum wurden mit EcoRI gespalten, auf einem 0,6% Agarose-Gel laufen gelassen und auf eine Nylonmembran (Hybond+) geblottet. Der Blot wurde mit einer ³²P-markierten X25-cDNA-Sonde hybridisiert. Nach 5 min Waschen auf höchste Stringenz mit 0,1 × SSC, 0,1% SDS bei 65°C wurde der Blot zwei Tage lang bei –70°C auf Röntgenfilm einwirken gelassen.
4: Automatisierte Sequenz des FRDA-assoziierten expandierten Bereichs aus einem Cosmid-Subklon. Der CTT-Strang wurde sequenziert.
5: Automatisierte Sequenz des FRDA-assoziierten expandierten Bereichs, der das expandierte Repeat enthält, bei einem FA-Patienten. Der CTT-Strang wurde sequenziert. Es ist interessant, die Anwesenheit von zwei unvollkommenen Repeats bei dem Patienten festzustellen (das 7. und 8. im sequenzierten Strang), die auf der normalen Sequenz nicht vorhanden sind und die eine polymorphe Variante anzeigen könnten, die auf dem Chromosom vorhanden ist, in dem die ursprüngliche Expansion erfolgte.
6(A): Beispiel für eine PCR-Analyse normaler Allele des GAA-Repeats. Spur 1 ist der 1-kb-Leiter-DNA-Größenmarker, und die Spuren 2–6 sind normale Kontrollen, die früher als heterozygot am Repeat identifiziert wurden. Die GAA-F/GAA-R-Primer wurden zur Amplifikation verwendet. Die Größe der Fragmente variiert im Bereich von 480–520 bp.
6(B): PCR-Amplifikation des expandierten GAA-Repeats bei einem FRDA-Träger (Spur 3) und bei einem Patienten (Spur 4). Spur 1 ist der 1-kb-Leiter-DNA-Marker. Spur 2 ist eine normale Kontrolle. Für die PCR wurden die Bam/2500-Primer verwendet. Expandierte Allele haben ein etwas verschwommenes Aussehen. Instabilität des Repeats wird durch die Anwesenheit von zwei getrennten Banden in der Patientenspur angezeigt, obwohl der Patient ein Nachkomme von blutsverwandten Eltern ist. Außerdem ist der Träger in Spur 3 die Mutter des Patienten, aber das entsprechende expandierte Allel passt von der Größe her nicht genau zu einer der Banden ihres Nachwuchses.
7: Segregation der L106X-Mutation und der GAA-Expansion in einer FRDA-Familie. Das in A gezeigte SSCP-Muster zeigt den väterlichen Ursprung der Punktmutation an, während die in B gezeigte Southern-Blot-Analyse den mütterlichen Ursprung der Expansion anzeigt. NR zeigt eine nicht verwandte normale Kontrolle an.
8: RT-PCR-Analyse von X25-mRNA bei FRDA-Patienten, obligatorischen Trägern und normalen Kontrollen. Die Reaktionen wurden mit Gesamt-RNA durchgeführt, die aus Lymphoblastoid-Zelllinien extrahiert wurde. Das Transcript der Serin-Hydroxymethyltransferase (SHMT) (von einem Gen auf Chromosom 17 codiert) wurde als Kontrolle für die RNA-Menge verwendet. Scheinreaktionen ohne Reverse Transcriptase (-RT) wurden als negative Kontrolle ebenfalls durchgeführt. Im Falle von SHMT erzeugte die PCR nach den -RT-Reaktionen ein Produkt, das größer war als das aus der cDNA erwartete Produkt, da ein Fragment der genomischen DNA (das das RNA-Präparat kontaminierte), das ein kleines Intron enthielt, amplifiziert wurde. In allen drei Bildern ist die mit r. t markierte Spur eine negative Kontrolle (Wasser). Spur 9 entspricht einem normalen Kontrollindividuum, die Spuren 1 und 4 entsprechen obligatorischen Trägern von FRDA, und die Spuren 2, 3 und 5 bis 8 entsprechen Individuen mit FRDA. Zur Erzeugung von cDNA aus dem X25-Transcript wurde die RT-Reaktion mit dem Oligonucleotid E2R (SEQ ID Nr. 13) als Primer gestartet, und dann wurde eine PCR zwischen diesem Primer und dem nF-Primer (SEQ ID Nr. 14) durchgeführt.
Ausführliche Beschreibung der Erfindung
Der Fachmann wird sich darüber im Klaren sein, dass verschiedene Substitutionen und Modifikationen bei der hier offenbarten Erfindung vorgenommen werden können, ohne vom Umfang der Erfindung abzuweichen.
Der hier verwendete Ausdruck "FRDA" bezieht sich auf Friedreich-Ataxie, eine autosomale rezessive degenerative Krankheit, die das zentrale und periphere Nervensystem sowie das Herz betrifft.
Der hier verwendete Ausdruck "GAA-Expansion" bezieht sich auf multiple (GAA)_n-Repeats, die sich 1,4 kb stromabwärts von Exon 1 in einem Intron des X25-Gens befinden.
Der hier verwendete Ausdruck "X25-Gen" bezieht sich auf das Gen, das auf Chromosom 9q13 identifiziert wurde und sich im kritischen Bereich des FRDA-determinierenden Locus befindet.
Der hier verwendete Ausdruck "Polymerase-Kettenreaktion" oder "PCR" bezieht sich auf das PCR-Verfahren, das in den Patenten von Mullis et al., US-Patente Nr. 4,683,195 und 4,683,202, beschrieben ist. Das Verfahren beinhaltet grundsätzlich Folgendes: (1) Behandeln extrahierter DNA unter Bildung von einzelsträngigen komplementären Strängen; (2) Hinzufügen eines Paars von Oligonucleotidprimern, wobei ein Primer des Paars im Wesentlichen komplementär zu einem Teil der Sequenz im Sinnstrang ist und der andere Primer jedes Paars im Wesentlichen komplementär zu einem anderen Teil derselben Sequenz im komplementären Antisinnstrang ist; (3) Assoziieren der gepaarten Primer mit der komplementären Sequenz; (4) gleichzeitiges Verlängern der assoziierten Primer vom 3'-Terminus jedes Primers aus, so dass ein Verlängerungsprodukt synthetisiert wird, das zu den mit jedem Primer assoziierten Strängen komplementär ist, wobei die Verlängerungsprodukte nach der Abtrennung vom Komplement als Matrizen für die Synthese eines Verlängerungsprodukts für den anderen Primer jedes Paars dienen; (5) Abtrennen der Verlängerungsprodukte von den Matrizen unter Bildung von einzelsträngigen Molekülen; und (6) Amplifizieren der einzelsträngigen Moleküle durch wenigstens einmaliges Wiederholen der Schritte des Assoziierens, Verlängerns und Abtrennens.
Der hier verwendete Ausdruck "Pulsfeld-Gel-Elektrophorese" oder "PFGE" bezieht sich auf ein Verfahren, das von Schwartz et al., Cold Springs Harbor Symposium, Quantitative Biology, 47: 189–195 (1982), beschrieben wurde. Das Verfahren umfasst grundsätzlich das Durchführen einer Standard-Gel-Elektrophorese (Agarose, Polyacrylamid oder ein anderes Gel, das dem Fachmann bekannt ist) unter pulsierenden Bedingungen. Der Fachmann erkennt, dass die Stärke des Feldes sowie die Richtung des Feldes gepulst bzw. gedreht werden, um Megabase-DNA-Moleküle voneinander zu trennen. Derzeitige kommerzielle Systeme sind computergesteuert und wählen die Stärke, Richtung und Zeit des Pulses in Abhängigkeit vom Molekulargewicht der zu trennenden DNA aus.
Der hier verwendete Ausdruck "Gentranscript" soll das RNA-Produkt bedeuten, das aus der Transcription einer genetischen (DNA-)Matrize resultiert. "Gen" soll eine Erbeinheit bedeuten: im molekularen Sinn eine Sequenz von chromosomaler DNA, die für die Produktion eines funktionellen Produkts notwendig ist.
Der hier verwendete Ausdruck "Messenger-RNA" oder "mRNA" soll eine RNA bedeuten, die von der DNA eines Gens transcribiert wurde und die Sequenz von Aminosäuren des darin codierten Polypeptids steuert.
Der hier verwendete Ausdruck "Copy-DNA" oder "cDNA" soll DNA bedeuten, die ausgehend von einem Primer synthetisiert wurde, der mit einer mRNA-Matrize hybridisiert ist.
Der hier verwendete Ausdruck "Oligonucleotid" soll ein kurzes Nucleinsäuremolekül (gewöhnlich 8 bis 50 Basenpaare) bedeuten, das zur Verwendung als Sonde oder Primer synthetisiert wird.
Der hier verwendete Ausdruck "Primer" soll ein kurzes DNA- oder RNA-Molekül bedeuten, das mit einer komplementären DNA- oder RNA-Matrize gepaart wird, wobei das kurze DNA- oder RNA-Molekül einen freien 3'-OH-Terminus liefert, an dem eine DNA-Polymerase die Synthese einer Nucleotidkette startet.
Es ist ein besonderes Ziel der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren zur Durchmusterung von Individuen nach einer Mutation, die zu Friedreich-Ataxie führt, bereitzustellen, wobei das Verfahren die Schritte der Spaltung von DNA von einem zu testenden Individuum mit einer Restriktions-Endonuclease und das Messen der Länge eines Restriktionsfragment-Längenpolymorphismus (RFLP) durch Hybridisierung mit Sonden, die einen Bereich erkennen, der ein GAA- Repeat in einem ersten Intron eines X25-Gens umfasst, und das Durchführen einer Southern-Blot-Analyse umfasst, wobei ein RFLP, der einem GAA-Repeat entspricht, das länger als der normale Bereich von 7–22 Tripletts, gewöhnlich länger als etwa 120, ist, ein Hinweis auf die Mutation ist, die zu Friedreich-Ataxie führt.
Es ist ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren zur Durchmusterung von Individuen nach einer Mutation, die zu Friedreich-Ataxie führt, bereitzustellen, wobei das Verfahren die Schritte der Messung der Expression eines X25-Gens durch Bestimmung der Menge an exprimierter mRNA von dem X25-Gen und der mRNA von bekannten Kontrollen und Vergleichen der Menge der mRNA von dem X25-Gen mit der Menge der mRNA von den bekannten Kontrollen umfasst, wobei eine reduzierte Menge der mRNA von dem X25-Gen auf Individuen hinweist, die die Mutation haben, die zu Friedreich-Ataxie führt.
Es ist ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren zur Durchmusterung von Individuen nach einer Mutation, die zu Friedreich-Ataxie führt, bereitzustellen, wobei die Mengen an mRNA bestimmt werden durch die Schritte des Extrahierens von mRNA von zu testenden Individuen, des Herstellens von cDNA aus der mRNA, des Amplifizierens der cDNA unter Bildung von Amplifikationsprodukten und des Vergleichens der vorhandenen relativen Mengen von X25 und der Kontroll-cDNA, wobei eine reduzierte Menge der mRNA von dem X25-Gen auf Individuen hinweist, die die Mutation haben, die zu Friedreich-Ataxie führt.
Es ist ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren zur Durchmusterung von Individuen nach einer Mutation, die zu Friedreich-Ataxie führt, durch Nachweisen der Menge an spezifischen Proteinen, die von X25 codiert werden, in Zellen von Patienten unter Verwendung von für die X25-Proteine spezifischen Antikörpern bereitzustellen.
Es ist ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren zur Durchmusterung von Individuen nach einer Mutation, die zu Friedreich-Ataxie führt, bereitzustellen, wobei das Verfahren den Schritt des Nachweisens einer Größenvariation eines (GAA)_n-Repeats in einem ersten Intron eines X25-Gens, indem man die Länge des Repeats misst, umfasst, wobei n für normale Individuen im Bereich von 1–22 liegt und n für betroffene Individuen größer als etwa 120–900 ist.
Es ist ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren zum Nachweis eines GAA-Polymorphismus in einem ersten Intron eines X25-Gens bereitzustellen, wobei das Verfahren die Schritte der Durchführung eines PCR-Assays unter Bildung von amplifizierten Produkten des ersten Introns des X25-Gens und Messen der Länge der amplifizierten Produkte mit in der Technik bekannten molekularen Techniken umfasst.
Es ist ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren zur Durchmusterung von Individuen nach einer Mutation, die zu Friedreich-Ataxie führt, bereitzustellen, wobei das Verfahren die Schritte des Sequenzierens von DNA von einem Individuum und des Vergleichens der Sequenz von dem Individuum mit den SEQ ID Nr. 1–12 umfasst, um zu bestimmen, welche Unterschiede, wenn überhaupt, zwischen der Sequenz von dem Individuum mit den SEQ ID Nr. 1–12 bestehen.
Es ist noch ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung, Zusammensetzungen zur Behandlung von Friedreich-Ataxie bei einem Individuum bereitzustellen, die eine pharmakologisch effektive Dosis eines Proteins mit einer Aminosäuresequenz, die SEQ ID Nr. 4 entspricht, oder ein Derivat davon umfasst.
Es ist ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung, Zusammensetzungen zur Behandlung von Friedreich-Ataxie bei einem Individuum bereitzustellen, die einen Nucleinsäurevektor, der ein expressionsfähiges X25-Gen enthält, und einen pharmakologisch annehmbaren Träger umfassen.
Es ist ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung, Stoffzusammensetzungen mit den SEQ ID Nr. 1–32 bereitzustellen.
Die therapeutischen Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung können nach bekannten Verfahren zur Herstellung pharmakologisch nützlicher Zusammensetzungen zubereitet werden. Die Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung oder ihre funktionellen Derivate werden mit einem zugemischten pharmakologisch annehmbaren Träger kombiniert. Geeignete Träger und ihre Zubereitungen sind in der Technik wohlbekannt. Um eine pharmakologisch annehmbare Zusammensetzung zu bilden, die für eine effektive therapeutische Verabreichung geeignet ist, enthalten solche Zusammensetzungen eine effektive Menge des X25-Gens oder seines Äquivalents oder seines funktionellen Derivats oder des Frataxin-Proteins oder seines Äquivalents oder seines funktionellen Derivats zusammen mit der geeigneten Menge des Trägers.
Die therapeutische Nucleinsäure-Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung wird gewöhnlich in einem Vektor zubereitet. Die therapeutische Frataxin-Protein-Zusammensetzung wird gewöhnlich als gereinigtes Protein in einem pharmakologisch geeigneten Träger verabreicht. Die Zusammensetzungen können durch eine Vielzahl von Verfahren verabreicht werden, einschließlich parenteral, durch Injektion, Schnellinfusion, nasopharyngeale Resorption, dermale Resorption oder oral. Die Zusammensetzungen können alternativ dazu auch intramuskulär oder intravenös verabreicht werden. Außerdem können die Zusammensetzungen für die parenterale Verabreichung weiterhin sterile wässrige oder nichtwässrige Lösungen, Suspensionen und Emulsionen umfassen. Beispiele für bekannte nichtwässrige Lösungsmittel sind Propylenglycol, Polyethylenglycol, Pflanzenöle, wie Olivenöl, und injizierbare organische Ester, wie Ethyloleat. Träger, Zusätze oder Okklusivverbände können verwendet werden, um die Gewebepermeabilität zu erhöhen und die Resorption zu verstärken. Flüssige Darreichungsformen für die orale Verabreichung können im Allgemeinen eine Liposomenlösung umfassen. Zu den geeigneten Formen für eine Suspension gehören Emulsionen, Lösungen, Sirupe und Elixiere, die in der Technik üblicherweise verwendete inerte Verdünnungsmittel, wie gereinigtes Wasser, enthalten. Neben den inerten Verdünnungsmitteln können solche Zusammensetzungen auch Netzmittel, Emulgatoren und Suspendiermittel oder Süßungsmittel, Aromastoffe, Färbemittel oder Duftstoffe enthalten.
Außerdem können pharmazeutische Verfahren eingesetzt werden, um die Wirkungsdauer zu steuern. Diese sind in der Technik wohlbekannt und umfassen Präparate mit gesteuerter Freisetzung und können geeignete Makromoleküle, zum Beispiel Polymere, Polyester, Polyaminosäuren, Polyvinyl, Pyrrolidon, Ethylen-Vinylacetat, Methylcellulose, Carboxymethylcellulose oder Protaminsulfat, enthalten. Die Konzentration der Makromoleküle sowie die Verfahren des Einbaus können eingestellt werden, um die Freisetzung zu steuern. Außerdem könnte der Vektor in Teilchen aus polymeren Materialien, wie Polyestern, Polyaminosäuren, Hydrogelen, Polymilchsäure oder Ethylen-Vinylacetat-Copolymeren, eingebaut werden. Außer eingebaut zu werden, können diese Mittel auch verwendet werden, um die Vektoren in Mikrokapseln, einzuschließen. Diese Techniken sind in der Technik wohlbekannt.
Eine Zusammensetzung wird als "pharmakologisch annehmbar" bezeichnet, wenn ihre Verabreichung von einem Empfängerpatienten vertragen werden kann. Von einem solchen Mittel sagt man, es werde in einer "therapeutisch effektiven Menge" verabreicht, wenn die verabreichte Menge physiologisch von Bedeutung ist. Ein Mittel ist physiologisch von Bedeutung, wenn seine Gegenwart zu einer nachweisbaren Veränderung der Physiologie eines Empfängerpatienten führt.
Im Allgemeinen wird die zum Erhalten einer effektiven Menge der Zusammensetzung benötigte Dosis in Abhängigkeit von solchen Faktoren wie dem Alter, Zustand und Geschlecht des Empfängers, gegebenenfalls dem Ausmaß der Krankheit und anderen Variablen, die vom Fachmann eingestellt werden können, variieren.
Der Fachmann wird sich ohne weiteres darüber im Klaren sein, dass die vorliegende Erfindung gut angepasst ist, um die genannten sowie die ihr innewohnenden Ziele und Vorteile auszuführen. Die beschriebenen Sonden, Primer, Methoden, Verfahren und Techniken sind zur Zeit repräsentativ für die bevorzugten Ausführungsformen, sollen beispielhaft sein und sind nicht als Einschränkungen des Umfangs der Erfindung gedacht. Änderungen daran und weitere Verwendun gen werden dem Fachmann einfallen und sind im Wesen der Erfindung mitumfasst oder durch den Umfang der beigefügten Ansprüche definiert.
Beispiel 1: Lokalisierung und Sequenzierung des für FRDA kritischen Bereichs
Potentielle Exons wurden in dem für FRDA kritischen Bereich durch direkte cDNA-Selektion, Exon-Amplifikation und Computervorhersage ausgehend von zufälligen Sequenzen identifiziert. Zwölf Cosmide, die 120 kb des kritischen FRDA-Intervalls plus 80 kb unmittelbar in der Nähe des Intervalls überspannen, wurden individuell als BamHI-BgIII-Fragmente in pSPL1- und pSPL3-Exoneinfangende Vektoren subkloniert und zum Spleißen potentieller Exons in COS-7-(A6)-Zellen transfiziert. Siehe D. M. Church et al., Nature Genet. 6: 98 (1994). Dieselben Cosmide wurden für die Hybridisierung-Selektion ausgehend von unklonierten cDNAs verwendet, die aus Poly-A + RNA aus menschlichem Kleinhirn und Rückenmark synthetisiert wurden. Siehe J. G. Morgan et al., Nucl. Acids Res. 20: 5173 (1992). Schließlich wurden sieben der Cosmide als Sau3AI-, ApoI- und HaeIII-Fragmente subkloniert, und etwa 1500 zufällige Single-Pass-Sequenzen wurden erzeugt. Diese Sequenzen wurden unter Verwendung der Programme GRAIL1a und GRAIL2 (E. C. Uberbacher und R. J. Mural, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 11261 (1991)) sowie FEXH (V. V. Solovyev et al., Nucl. Acids Res. 22, 5156 (1994)) analysiert.
Diese Analysen ergaben 19, 5 bzw. 17 potentielle codierende Sequenzen, einschließlich zweien, die zu bekannten Genen passten, nämlich zu dem Gen für die katalytische Untereinheit der Protein-Kinase A gamma (erhalten durch cDNA-Selektion und zufälliges Sequenzieren) und zu dem Pseudogen einer Mitochondrien-Adenylat-Kinase 3 (erhalten durch zufälliges Sequenzieren). Ein Exon, das d26 genannt wurde, wurde durch zwei Ansätze unabhängig voneinander identifiziert. Wenn man Nested-Primer auf der Basis der d26-Sequenz bei einer schnellen Amplifikation in einem cDNA-5'-Ende-(5'-RACE)-Experiment mit einer Herz-cDNA-Matrize verwendete, ergaben sie zwei unabhängige, aber überlappende Produkte. Das 5'-RACE wurde unter Verwendung des Clontech-RACE-ready-cDNA-Kits gemäß den Anweisungen des Herstellers durchgeführt. Die ausgehend von diesen Klonen erhaltene Sequenz passte zu einem amplifizierten Exon und einem exprimierten Sequenzmarker (EST) von einer humanen Leber- und Milz-cDNA-Bibliothek (Homo-sapiens-cDNA-Klon 126314, 5'-Sequenz (GenBank-Zugriffsnummer R06470)). Dieses Gen, das X25 genannt wird, hatte anscheinend alternative Transcripte, da die Sequenzen am 3'-Ende der EST- und RACE-Produkte verschieden waren.
Die Genstruktur von X25 (1A) wurde aufgelöst, indem man durch inverse PCR intronische Sequenzen, die die identifizierten Exons flankierten, erhielt, und durch direktes Sequenzieren von Cosmiden. Der EST-Klon enthielt 4 Exons, und das längere RACE-Produkt enthielt ein zusätzliches 5'-Exon. Dieses Exon stimmte mit der CpG-Insel auf Position 100 auf der genomischen Karte überein. Ein Transcriptionsstartpunkt wurde 388 bp stromaufwärts der Exon-I-Donorspleißstelle vorhergesagt, und eine TATA-Box wurde vom TSSG-Programm 28 bp weiter stromaufwärts gefunden. Fünf Exons (1 bis 5a, wobei Exon 5a dem 3'-Ende des EST entspricht) wurden gefunden, die über 40 kb verteilt waren. Sie enthalten ein offenes Leseraster (ORF), das ein 210-Aminosäuren-Protein codiert, welches Frataxin genannt wurde (1B). Ein alternatives Exon (5b), das d26 entsprach, wurde etwa 40 kb von Exon 5a entfernt in der telomerischen Richtung lokalisiert. Exon 5b weist auch ein in-frame-Stopcodon auf, so dass das alternative Transcript ein kürzeres, 171 Aminosäure langes Protein codiert, dessen 11 COOH-terminalen Reste sich von denen der Hauptisoform unterscheiden. Die Nucleotidsequenzen der X25-Exons wurden in der Datenbank GenBank unter den Zugriffsnummern U43748 bis U43753 hinterlegt. Das 3'-Ende des Transcripts, das die alternative Form codiert, wurde durch 3'-RACE untersucht (siehe Froman und Martin, Technique 1: 165 (1989)), 2 μg Gesamt-RNA von HeLa-Zellen wurden mit Nested-Primern in Exon 5b₃ verwendet und zeigten, dass je nach der alternativen Verwendung der 3'-Donorspleißstelle in Exon 5b entweder ein Transcript, das mit diesem Exon endet, oder ein längeres Transcript, das ein zusätzliches nichtcodierendes Exon 6 enthält, erzeugt werden konnte. Dieses längere 3'-RACE-Produkt endete mit dem Poly-A-Schwanz einer stromabwärts gelegenen Alu-Sequenz. Die genomische Sequenz von Exon 6 zeigte, dass es 3-Alu-Sequenzen hintereinander enthält, gefolgt von einem Poly adenylierungssignal 1050 bp weg von der Akzeptorspleißstelle. Exon 6 wurde 13 kb in telomerischer Richtung zu Exon 5b kartiert (1A). Die Spleißstellen aller 7 Exons (1 bis 4, 5a, 5b und 6) entsprechen dem kanonischen Consensus.
Beispiel 2: Expression des X25-Transcripts
Poly-A+-Northern-Blots von verschiedenen humanen Geweben zeigten die höchste Expression von X25 in Herz, mittlere Werte in Leber, Skelettmuskulatur und Pancreas und eine minimale Expression in anderen Geweben einschließlich des Vollhirns (2). Ein intensives 1,3-kb-Transcript wurde im Einklang mit der vorhergesagten Größe einer Exon-5a-haltigen mRNA identifiziert. Schwächere Banden von 1,05, 2,0, 2,8 und 7,3 kb wurden ebenfalls nachgewiesen. Weitere Hybridisierungen des Northern-Blots mit Exon-5a- und -5b-spezifischen Sonden zeigten, dass die 1,05- und 2,0-kb-Banden das Exon 5b enthielten, während Sequenzen, die zu dem Exon 5a passten, in den 1,8- und 7,3-kb-Banden neben der stärksten 1,3-kb-Bande gefunden wurden. Ein Northern-Blot der Gesamt-RNA aus ausgewählten Teilen des Zentralnervensystems (ZNS) zeigte eine hohe Expression des 1,3-kb-Transcripts im Rückenmark, mit weniger Expression im Kleinhirn und sehr wenig in der Hirnrinde (nicht gezeigt). Insgesamt schien die Expression von X25 an den primären Stellen der Degeneration bei FRDA sowohl innerhalb als auch außerhalb des ZNS am höchsten zu sein.
Um die Natur der größeren Transcripte zu untersuchen, wurde eine fetale Hirn-cDNA-Bibliothek einem Screening mit dem EST-Klon (Exons 2–5a) unterzogen. Unter neun Positiven wurden vier Klone isoliert, deren Sequenz sich über die Grenzen der zuvor identifizierten X25-mRNAs hinaus erstreckte. Die Sequenzanalyse dieser Klone zeigte an, dass sie von einem verwandten Gen stammten, sich an mehreren Positionen von X25 unterschieden und Stopcodons in der Sequenz aufweisen, die dem X25-Exon 1 entsprachen. Drei der cDNAs, die in dem sequenzierten Teil identisch waren, erstrecken sich 0,5, 1 bzw. 2 kb stromaufwärts von Exon 1. Ihre Sequenz zeigt zahlreiche Divergenzen gegenüber X25 in dem Teil, der Exon 1 entspricht, meistens CpG-Dinucleotide, die zu TG oder CA geändert waren, wobei sie dann in dem Teil, der den Exons 2 bis 4 entspricht, fast identisch waren.
Eine weitere 1,6-kb-cDNA beginnt mit einer Sequenz, die eng mit Exon 5a übereinstimmt, selbst in seinem UTR, mit nur gelegentlichen Änderungen einzelner Basen und kurzen Insertionen/Deletionen. Das X25-verwandte Gen wurde aus dem kritischen FRDA-Bereich ausgeschlossen, und wenigstens eine intronlose Kopie existiert in dem Genom, was durch Southern-Blot- und PCR-Analyse angezeigt wird. Eine Southern-Blot-Analyse mit einer X25-Exon-1-5a-cDNA-Sonde zeigte eine herausragende 5-kb-Eco-RI-Bande in der genomischen DNA, die keinem Exon entsprach und in YC und Cosmid-DNA aus dem kritischen FRDA-Bereich fehlte. Mehrere zusätzliche Banden, die ebenfalls in klonierter DNA aus dem FRDA-Bereich fehlten, erschienen, wenn Blots mit geringerer Stringenz gewaschen wurden (1 × SSC bei Raumtemperatur). Die Primer nF2 (5'-TCCCGCGGCCGGCAGAGTT-3') [SEQ ID Nr. 14] und E2R (5'-CCAAAGTTCCAGATTTCCTCA-3') [SEQ ID Nr. 13], die ein 173-bp-Fragment, das die Exons 1 und 2 der X25-cDNA überspannt, amplifizieren können, erzeugte ein PCR-Produkt entsprechender Größe aus genomischer DNA, aber nicht aus klonierter DNA aus dem FRDA-Bereich, was auf die Anwesenheit von Sequenzen mit hoher Ähnlichkeit mit einem verarbeiteten X25-Transcript an anderer Stelle im Genom hinweist.
Beispiel 3: Computer-Datenbank-Recherche
Eine BLASTN-DNA-Datenbankrecherche mit der X25-DNA-Sequenz und eine BLASTP-Recherche mit der translatierten Sequenz zeigte keine wesentliche Übereinstimmung. Eine TBLASTN-Recherche, bei der die Proteinsequenz mit der sechs-Raster-Translation der DNA-Datenbanken verglichen wurde, ergab jedoch wesentliche Übereinstimmungen mit einem offenen Leseraster, das in einem C.-elegans-Cosmid enthalten war (P = 7,6 × 10^–13), und mit einem S.-cerevisiae-EST (P = 2,0 × 10^–10) (1B). In beiden Fällen beinhaltete die beste Übereinstimmung ein 27-Aminosäure-Segment des Proteins (Positionen 141–167), das in den Exons 4 und 5a codiert ist, und zeigte eine Aminosäureidentität von 25/28 bzw. 22/27 mit der C.-elegans- bzw. S.-cerevisiae-Sequenz und eine Identität von 65% auf dem DNA-Niveau. Sekundärstruktur-Voraussagen für das X25-codierte Protein ließen eine α-helikale Struktur für die NH₂-terminalen 30 Aminosäuren und die Bereiche zwischen den Resten 90–110 und 185–195 vermuten, mit möglichen dazwischen eingestreuten β-Faltblatt-Bereichen um die Reste 125–145 und 175–180 herum. Die Sekundärstruktur-Voraussage wurde mit den Programmen SSP und NNSSP durchgeführt, die so gestaltet sind, dass sie Sekundärstrukturelemente lokalisieren (V. V. Solovyev und A. A. Salamov., CABIOS 10: 661 (1994)). Das Programm TMpred wurde verwendet, um mutmaßliche Transmembran-Domänen vorherzusagen (K. Hoffmann und W. Stoffel, Biol. Chem. Hoppe-Seyler, 374: 166 (1993)). PSORT-wurde verwendet, um mögliche Proteinsortiersignale vorherzusagen (K. Nakai und M. Kanehisa, Proteins: Structure, Function, and Genetics 11: 95 (1991)). Es wurde keine Transmembran-Domäne identifiziert. Da die Computeranalyse der Aminosäuresequenz vermuten lässt, dass das Frataxin-Protein ein N-terminales hydrophobes Signal enthält, kann es ein Vorläufer eines sezernierten Protein mit einer Wachstumsfaktor- oder hormonartigen Wirkung sein, so dass Frataxin ein ideales Protein für die Expression in Bakterien, Hefe und Säugerzellen ist.
Beispiel 4: Bestimmen der Natur der Mutation, die zu FRDA führt
Alle sechs codierenden Exons von X25 bei 184 FRDA-Patienten wurden mit flankierenden Primern amplifiziert und auf Mutationen hin durchmustert. Die folgenden intronischen Primer wurden verwendet, um die X25-Exons zu amplifizieren: Exon 1 (240 bp), F: 5'-AGCACCCAGCGCTGGAGG-3' [SEQ ID Nr. 15];
R: 5'-CCGCGGCTGTTCCCGG-3' [SEQ ID Nr. 16]; Exon 2 (168 bp),
F: 5'-AGTAACGTACTTCTTAACTTTGGC-3' [SEQ ID Nr. 17];
R: 5'-AGAGGAAGATACCTATCACGTG'-3' [SEQ ID Nr. 18], Exon 3 (227 bp),
F: 5'-AAAATGGAAGCATTTGGTAATCA-3' [SEQ ID Nr. 19];
R: 5'-AGTGAACTAAAATTCTTAGAGGG-3' [SEQ ID Nr. 20]; Exon 4 (250 bp),
F: 5'-AAGCAATGATGACAAAGTGCTAAC-3' [SEQ ID Nr. 21];
R: 5'-TGGTCCACAATGTCACATTTCGG-3' [SEQ ID Nr. 22]; Exon 5a (223 bp),
F: 5'-CTGAAGGGCTGTGCTGTGGA-3' [SEQ ID Nr. 23];
R: 5'-TGTCCTTACAAACGGGGCT-3' [SEQ ID Nr. 24], Exon 5b (224 bp),
F: 5'-CCCATGCTCAAGACATACTCC-3' [SEQ ID Nr. 25];
R: 5'-ACAGTAAGGAAAAAACAAACAGCC-3' [SEQ ID NO 26]. Die Amplifikationen für die Exons 2, 3, 4, 5a und 5b bestanden aus 30 Cyclen unter Verwendung der folgenden Bedingungen: 1 min bei 94°C, 2 min bei 55°C, 1 min bei 72°C. Um das hochgradig GC-reiche Exon 1 zu amplifizieren, wurde die Assoziationstemperatur auf 68°C erhöht, und 10% DMSO wurden zu der Reaktion gegeben. Die Suche nach Mutationen wurde unter Verwendung einer SSCP-Analyse (SSCP: single-strand conformation polymorphism) (siehe M. Orita et al., Genomics 5: 874 (1989)) bei 168 FRDA-Patienten und von chemischer Spaltung (siehe J. A. Saleeba et al., Hum. Mutat. 1: 63 (1992)) bei 16 durchgeführt. Dreipunktmutationen, die Veränderungen in das X25-Genprodukt einführen, wurden identifiziert.
Punktmutationen. Die erste Veränderung, in einer französischen Familie mit zwei betroffenen Geschwistern, bestand aus einer T → G-Transversion in Exon 3, die ein Leucin-Codon (TTA) zu einem Stopcodon (TGA) änderte (L106X). Der zweite Fall, in einer spanischen Familie mit einem betroffenen Mitglied, war ein A → G-Übergang, der die Akzeptorspleißstelle am Ende des dritten Introns zerstörte, indem er das Invariante AG zu einem GG änderte. Schließlich wurde eine Änderung von Isoleucin nach Phenylalanin (I154F) in Exon 4 bei fünf Patienten aus drei süditalienischen Familien gefunden. Diese konservative Änderung einer hydrophoben Aminosäure beeinflusst eine invariante Position innerhalb der hochgradig konservierten Domäne, die Mensch, Wurm und Hefe gemeinsam haben. In allen drei Fällen waren die betroffenen Individuen heterozygot in Bezug auf die Punktmutation. Die I154F-Mutation wurde auch bei 1 von 417 Chromosomen aus 210 Kontrollindividuen aus derselben süditalienischen Population gefunden, was mit der Möglichkeit verträglich ist, dass dies eine krankheitsauslösende Mutation ist. (Nimmt man eine FRDA-Trägerhäufigkeit in Italien von 1/120 Individuen und eine Häufigkeit von I154F von 1/40 FRDA-Chromosomen bei Süditalienern an, so erwartet man, dass ein Individuum auf 3300 in dieser Population ein Träger von I154F ist. Dass man ein solches Individuum in einer zufälligen Probe von 210 Personen findet, kann mit einer Wahrscheinlichkeit von > 6% vorkommen.) Intron-1-Expansion. Die Southern-Blot-Analyse zeigte keinen Unterschied zwischen FRDA-Patienten und normalen Kontrollen, wenn mit MspI, TaqI oder BstXI gespaltene DNAs mit einer X25-cDNA-Sonde hybridisiert wurden, wodurch größere Umlagerungen ausgeschlossen sind. Die Hybridisierung von mit EcoRI gespaltenen DNAs von FRDA-Patienten zeigte jedoch, dass das Fragment, das Exon 1 enthält, im Durchschnitt 2,5 kb größer war als bei normalen Kontrollen, ohne nachweisbare normale Bande. FRDA-Träger waren heterozygot in Bezug auf ein vergrößertes Fragment und ein Fragment normaler Größe. Die Größe des vergrößerten Fragments war eindeutig variabel, selbst unter FRDA-Trägern, die miteinander verwandt waren (3). Der vergrößerte Bereich wurde weiterhin auf ein 5,2-kb-EcoRI/NotI-Fragment innerhalb des ersten Introns von X25 lokalisiert, das aus einem Cosmid subkloniert und sequenziert wurde.
Es wurden Oligonucleotidprimer entworfen, um dieses Fragment zu amplifizieren, wobei man eine langreichweitige PCR-Technik verwendete, und seine erhöhte Größe in FRDA-Patienten wurde bestätigt. Der Perkin-Elmer-XL-lang-PCR-Reagenskit wurde verwendet, um die Reaktionen durchzuführen, wobei man Standardbedingungen, wie sie vom Hersteller vorgeschlagen werden, und die Primer 5200Eco (5'-GGGCTGGCAGATTCCTCCAG-3') [SEQ ID Nr. 27] und 5200Not (5'-GTAAGTATCCGCGCCGGGAAC-3') [SEQ ID Nr. 28] verwendete. Amplifikationen wurden mit einer Perkin-Elmer-9600-Maschine durchgeführt und bestanden aus 20 Cyclen der folgenden Schritte: 94°C während 20 s, 68°C während 8 min, gefolgt von weiteren 17 Cyclen, in denen die Länge des Schritts bei 68°C um 15 s/Cyclus erhöht wurde. Das erzeugte Amplifikationsprodukt hat 5 kb von normalen Chromosomen und etwa 7,5 kb von FRDA-Chromosomen.
Die Cosmid-Sequenzanalyse zeigte einen (GAA)₉-Repeat, der anscheinend von einer Poly-A-Expansion der kanonischen A₅TACA₅-Sequenz abgeleitet war, die die beiden Hälften eines Alu-Repeats miteinander verknüpft (wobei 4 die umgekehrte komplementäre Sequenz zeigt). Das (GAA)₉-Repeat befindet sich 1,4 kb stromabwärts von Exon 1, und die Restriktionsanalyse von Fragmenten aus der langreichweitigen PCR von FRDA-Patienten lokalisierte die abnorme Größenzunahme innerhalb von 100 bp von diesem Triplett-Repeat. Die Spaltung derselben Fragmente mit MboII, dessen Erkennungsstelle GAAGA ist, unterdrückte den Größenunterschied zwischen Patienten und Kontrollen, was darauf hinweist, dass das GAA-Repeat vielleicht beteiligt ist. Eine direkte Sequenzierung bewies, dass die Mutation aus einer fast reinen GAA-Repeat-Expansion besteht (5). Dann wurden PCR-Primer entworfen, um die Anwesenheit und Größe der FRDA-Patienten mit der GAA-Repeat-Expansion und jede Variabilität des Repeats bei normalen Individuen zu bewerten (6).
Die Primer GAA-F(5'-GGGATTGGTTGCCAGTGCTTAAAAGTTAG-3') [SEQ ID Nr. 29] und GAA-R(5'-ATCTAAGGACCATCATGGCCACACTTGCC-3') [SEQ ID Nr. 30] flankieren das GAA-Repeat und erzeugen ein PCR-Produkt von 457 + 3n bp (n = Zahl der GAA-Tripletts). Mit diesen Primern konnte eine effiziente Amplifikation von normalen Allelen bei Verwendung des herkömmlichen PCR-Verfahrens mit Taq-Polymerase nach 30 Cyclen erhalten werden, die aus den folgenden Schritten bestanden: 94°C während 45 s, 68°C während 30 s, 72°C während 2 min. Vergrößerte Allele wurden viel weniger effizient amplifiziert, insbesondere wenn sie zusammen mit einem normalen Allel vorhanden waren; daher ist die Verwendung dieser Primer für den Nachweis von FRDA-Trägern nicht angezeigt. Eine effizientere Amplifikation von expandierten Allelen, auch bei FRDA-Trägern, wird erhalten, wenn man die Primer Bam (5'-GGAGGGATCCGTCTGGGCAAAGG-3') [SEQ ID Nr. 31] und 2500 (5'-CAATCCAGGACAGTCAGGGCTTT-3') [SEQ ID Nr. 32] verwendet. Diese Primer erzeugten ein ca. 1,5 kb (1398 bp) großes normales Fragment. Eine Amplifikation wurde unter Verwendung der lang-PCR-Vorschrift in 20 Cyclen durchgeführt, die aus den folgenden Schritten bestanden: 94°C während 20 s, 68°C während 2 min und 30 s, gefolgt von weiteren 17 Cyclen, in denen die Länge des Schritts bei 68°C um 15 s/Cyclus erhöht wurde.
Neunundsiebzig nicht miteinander verwandte FRDA-Patienten mit typischer Krankheit einschließlich von fünf Patienten, von denen man wusste, dass sie X25-Punktmutationen tragen, wurden durch Southern-Analyse und/oder PCR auf GAA-Expansion getestet. Die Patienten, von denen zuvor bekannt war, dass sie Punktmutationen tragen, waren alle heterozygot in Bezug auf die Expansion.
Eine Segregationsanalyse innerhalb von Familien wies darauf hin, dass die Punktmutation und die GAA-Expansion einen unterschiedlichen Ursprung bei den Vorfahren hatten (7), was zeigt, dass die Punktmutationen einschließlich der konservativen Fehlsinn-Mutation I154F krankheitsverursachend sind. Homozygotie in bezug auf expandierte Allele wurde in 71 der 74 Patienten ohne zuvor nachgewiesene X25-Punktmutationen gezeigt, und bei dreien wurde Heterozygotie gezeigt.
Insgesamt war gemäß diesen Daten die GAA-Expansion für etwa 98% des FRDA-Phänotyps verantwortlich. Es zeigte sich, dass die Größen der vergrößerten Allele zwischen 200 und mehr als 900 GAA-Einheiten varijerten, wobei die meisten Allele 700–800 Repeats enthielten. Die Instabilität von expandierten Repeats bei der Weitergabe von Vorfahren auf Nachkommen wurde eindeutig bewiesen, sowohl direkt durch Analyse der Vorfahr-Nachkommen-Paare als auch indirekt durch den Nachweis von zwei unterschiedlichen Allelen bei betroffenen Kindern von blutsverwandten Eltern, von denen man erwartet, dass sie am FRDA-Locus homozygot durch Abstammung sind. PCR-Produkte, die expandierten Repeats entsprachen, erschienen als leicht verschwommene Banden, was das Auftreten von nur einem begrenzten Grad an somatischem Mosaik für Repeats verschiedener Größe aufgrund von mitotischer Instabilität vermuten ließ, zumindest bei Lymphocyten-DNA (6B). Siebenundsiebzig normale Individuen, die durch Southern-Analyse getestet wurden, waren homozygot in bezug auf ein normales Allel. Die PCR-Analyse von zusätzlichen 98 normalen Kontrollen zeigte ebenfalls keine Expansion und zeigte, dass das GAA-Repeat polymorph ist, wobei seine Länge von 7 bis 22 Einheiten variiert (6A). Kleinere Allele waren vorherrschend.
GAA-Repeats mit bis zu 30–40 Einheiten sind in vielen Organismen nichts Ungewöhnliches und sind zuweilen polymorph, wie im 3'-UTR des polymeren Ratten-Ig-Rezeptors; sie wurden jedoch bisher noch nicht mit Krankheiten assoziiert. Ein vor kurzem vorgeschlagenes theoretisches Modell schlägt vor, dass die Fähigkeit zur Bildung einer Haarnadelstruktur entscheidend für die Eigenschaft von Trinucleotid-Repeats ist, große Expansionen zu bilden (siehe A. M. Gray et al., Cell 81: 533 (1995)). Gemäß diesem Modell wird vorhergesagt, dass CAG/CTG- oder CGG/CCG-Repeats der Expansion unterliegen, während das GAA/CCT-Repeat die geringste Neigung zum Expandieren hat, so dass die FRDA-Expansion ein unerwartetes Ergebnis ist. Ein verblüffendes Kopplungs-Ungleichgewicht zwischen FRDA und einem Polymorphismus in einem neu identifizierten Exon des Z0-2-Gens (etwa 120 kb in telomerischer Richtung von dem expandierten Triplett-Repeat) in französischen und spanischen Familien lässt einen einzigen Ursprung der FRDA-Expansion vermuten, ist aber auch mit einer mehrstufigen oder rekurrierenden Expansion auf einem gefährdeten Allel vereinbar (siehe Imbert et al., Nature Genet. 4: 72 (1993), wo das absolute Kopplungs-Ungleichgewicht bei myotonischer Dystrophie durch rekurrierende Mutationen auf einem solchen gefährdeten Allel expandiert wird). Da RDA autosomal rezessiv ist, ist die natürliche Geschichte der Mutation auf dem Populationsniveau aufgrund von Trinucleotidexpansionen verblüffend anders als bei jeder anderen bekannten Krankheit.
Bei Fragile-X-Syndrom und myotonischer Dystrophie, wo Expansionen von vergleichbarer Größe in nichtcodierenden Sequenzen vorkommen, haben die Träger eine schwere, sich früh manifestierende Krankheit und einen starken Reproduktionsnachteil. Große Expansionen bei diesen Krankheiten werden aus instabilen Allelen von mittlerer Größe neu gebildet, was zu dem Phänomen der Antizipation führt. Bei FRDA werden große expandierte Allele durch asymptomatische Träger weitergegeben, und neue Expansionsereignisse bei Heterozygotischen würden auf dem Phänotypniveau unerkannt bleiben. Das Fehlen einer negativen Selektion gegen Heterozygotische spielt eine entscheidende Rolle beim Aufrechterhalten der Häufigkeit großer FRDA-expandierter Allele in der Höhe von 1 pro 250 Chromosomen, also wenigstens eine Größenordnung höher als bei jeder anderen charakterisierten Trinucleotidexpansion.
Umgekehrt wurden Deletionen von CTG-Repeats bei myotonischer Dystrophie mit Reversion zu Allelen normaler Größe beobachtet (siehe Imbert et al., Nature Genet. 4: 72 (1993)), wobei das absolute Kopplungs-Ungleichgewicht bei myotonischer Dystrophie durch rückgebildete Mutationen in einem, solchen gefährdeten Allel erklärt wird. In der Stichprobe von FRDA-Familien in der Studie der vorliegenden Erfindung waren bei allen getesteten symptomatischen Trägern große expandierte Allele vorhanden, und trotz ihrer Größeninstabilität wurden weder neue Expansionen, die von einem mittelgroßen Allel abgeleitet sind, noch Reversionen zur Normalität nachgewiesen. Obwohl das gelegentliche Auftreten solcher Ereignisse in der allgemeinen Population in Anbetracht der großen Zahl von heterozygotischen Individuen nicht ausgeschlossen werden kann, ist die Häufigkeit anscheinend gering genug, um keine nachweisbaren Verzerrungen in das Muster der FRDA-Vererbung, insbesondere keine Inkonsistenzen bei Kopplungsergebnissen, einzuführen.
Beispiel 5: Quantifizierung des FRDA-Transcripts
Wenn das X25-Transcript mit Primern, die die Exons 1 und 2 miteinander verbinden, amplifiziert wurde, zeigten FRDA-Patienten im Vergleich zu Trägern und nicht verwandten Kontrollen entweder nicht nachweisbare oder äußerst niedrige mRNA-Niveaus.
RT-PCR. RT-PCR wurde mit Lymphoblasten-RNA von zwei normalen Kontrollen, zwei obligatorischen Trägern und sechs Patienten durchgeführt, wobei der Exon-2-Rückwärtsprimer E2R (5'-CCAAAGTTCCAGATTTCCTGA-3') [SEQ ID Nr. 13] und der Exon-1-Vorwärtsprimer nF (5'-CAGGCCAGACCCTCAC-3') [SEQ ID Nr. 14] verwendet wurden. Als Vorsichtsmaßnahme, um die Amplifikation von X25-verwandten Sequenzen, die nicht von dem Transcript des FRDA-Bereichs abgeleitet sind, zu vermeiden, wurde der nF-Primer so gewählt, dass er keine Übereinstimmung mit dem nicht-9q13-verwandten Gen aufwies. PCR-Reaktionen wurden über 25 Cyclen durchgeführt, um die Linearität zwischen den Ausgangs- und Endkonzentrationen von DNA-Fragmenten aufrechtzuerhalten. PCR-Produkte wurden auf Nylonmembranen geblottet und mit dem ³²P-endmarkierten internen Oligonucleotid nF2 (5'-TCCCGCGGCCGGCAGAGTT-3') [SEQ ID Nr. 15] hybridisiert. Diese Beobachtung lässt vermuten, dass infolge der intronischen GAA-Expansion entweder eine Abnormität bei der RNA-Verarbeitung oder eine Interferenz mit der Transcriptionsmaschinerie auftritt.
Patienten mit schädlichen Punktmutationen, die X25 betreffen, zeigen deutlich, dass kein anderes Gen in dem Bereich, das im Prinzip von einer GAA-Expansion betroffen sein könnte, an der Verursachung von FRDA beteiligt ist. Die eingeschränkte Expression von X25 in den Stellen der Degeneration oder Fehlfunktion unterscheidet FRDA von den dominanten Ataxien und von Ataxia teleangiectatica, wo die Expression des verursachenden Gens ubiquitär ist. Es wird erwartet, dass eine stark reduzierte reife X25-mRNA zu einem ähnlich niedrigen Niveau von Frataxin führt. Reduziertes Frataxin im Rückenmark, Herz und Pancreas ist wahrscheinlich die primäre Ursache von neuronaler Degeneration, Cardiomyopathie und erhöhtem Diabetesrisiko.
RNase-Schutz. Um Antisense-Ribosonden zu synthetisieren, wurden zwei Bereiche der X25-cDNA in einem Plasmidvektor subkloniert, der den T7-RNA-Polymerase-Promotor enthielt. Zwei getrennte Segmente der X25-cDNA, von denen eines die Exons 1 und 2 (partiell) enthielt und das andere die Exons 4 (partiell) und 5b enthielt, wurden entsprechend subkloniert. 1 μg linearisiertes Plasmid wurde in einer Reaktion, die 3 μM α-³²P-UTP enthielt, als Matrize für eine in-vitro-Transcription (unter Verwendung des Ambion-Maxiscript-Kits) verwendet. Die Reaktion wurde eine Stunde lang bei 37°C durchgeführt, und danach wurde die DNA-Matrize vollständig durch RNase-freie DNase-Behandlung abgebaut. Dann wurden markierte Transcripte der vollen Länge unter Befolgung einer präparativen denaturierenden Polyacrylamid-Gel-Elektrophorese gereinigt. Als Kontrolle wurde auch eine humane GAPDH-Ribosonde (pTRI-GAPDH human, Ambion) erzeugt.
Der RNase-Schutzassay wurde unter Verwendung des RPAII-Ribonuclease-Schutzassay-Kits von Ambion unter Befolgung der Empfehlungen des Herstellers durchgeführt. Kurz gesagt, 20 μg Gesamt-RNA, die von Lymphoblastoid-Zelllinien von Patienten und Kontrollen extrahiert wurde, wurden mit einer mit 8 × 10⁴ cpm markierten Ribosonde in einer 20-μl-Reaktion gemischt, denaturiert und 16 Stunden lang bei 45°C inkubiert. 2 μg RNA wurden für die Kontroll-GAPDH-Reaktion verwendet. Für jede Ribosonde wurden auch Kontrollhybridisierungen mit Hefe-RNA durchgeführt. Die Behandlung mit RNase (Gemisch von RNase A/RNase T1) erfolgte 30 Minuten lang bei 37°C. Die Reaktionsprodukte wurden mit Ethanol ausgefällt und in Formamid-Beladungsfarbstoff resuspendiert. Diese Produkte wurden auf einem vorgeheizten Gel aus 5% Polyacrylamid/8 M Harnstoff in 1 × Tris-Borat-Puffer mit 35 Watt Gleichstrom denaturiert und einer Elektrophorese unterzogen. Das Gel wurde getrocknet und 6 Tage lang bei –70°C unter Verwendung von Verstärkerschirmen auf einen Röntgenfilm einwirken gelassen. Die Größen der geschützten Fragmente wurden unter Verwendung einer Sequenzleiter, die zusammen mit der Probe der Elektrophorese unterzogen wurde, genau abgeschätzt.
Beispiel 6: Therapeutika
FRDA wird durch Abnormitäten im X25-Gen verursacht, die zu einem Mangel an seinem Proteinprodukt Frataxin führt, gelegentlich aufgrund von Punktmutationen, die ein verkürztes Protein erzeugen, aber am häufigsten zu einer GAA-Expansion im ersten Intron, die eine Unterdrückung der Genexpression verursacht. Therapeutische Zusammensetzungen, die Frataxin enthalten, für FRDA-Patienten sind daher ein Aspekt der vorliegenden Erfindung. Große Mengen an rekombinantem Frataxin werden erzeugt, indem man X25-cDNA in einen Expressionsvektor kloniert, der in einen geeigneten Organismus transformiert wird. Expressionsvektoren, die zur Erzeugung großer Mengen von rekombinantem Protein führen, können mit mehreren Techniken gereinigt und für die systemische oder lokale Verabreichung an Patienten präpariert werden. Eine Computeranalyse der Frataxin-Sequenz lässt vermuten, dass Frataxin kein Membranprotein ist und wahrscheinlich sezerniert wird. Aufgrund dieser beiden Merkmale ist Frataxin ein ideales Protein für die Verabreichung.
Ein anderer Ansatz besteht in der Untersuchung der Funktion des Frataxin-Proteins und der Identifizierung von Verbindungen, die eine zelluläre Reaktion oder Modifikation im Zellstoffwechsel bei Zellen, die Frataxin erzeugen und/oder darauf reagieren, induzieren können. Solche Verbindungen überwinden die Folge des Fehlens von Frataxin-Protein in FRDA.
Außerdem kann man das murine X25-Homologe über eine homologe Rekombination inaktivieren, so dass man ein Tiermodell für die Friedreich-Ataxie erhält, um verschiedene therapeutische Strategien zu testen.
Schließlich wird die codierende Sequenz für Frataxin in einen geeigneten Expressionsvektor eingesetzt, der FRDA-Patienten verabreicht wird. Die codierende Sequenz von Frataxin wird in das Genom eines modifizierten RNA- oder DNA-Virus eingesetzt, das Patienten systemisch oder lokal verabreicht wird, oder es wird verwendet, um kultivierte Zellen von Patienten zu transduzieren, die dann in den Körper des Patienten reimplantiert werden. Alternativ dazu werden nichtvirale Vektoren verwendet und den Patienten direkt oder den kultivierten Zellen des Patienten, die in den Patienten reimplantiert werden, verabreicht.
Sequenzen Sequenz ID (SEQ ID Nr. 1)
Sequenz ID 2 (SEQ ID Nr. 2)
Sequenz ID Nr. 3 (SEQ ID Nr. 3)
Sequenz ID Nr. 4 (SEQ ID Nr. 4)
Sequenz ID Nr. 5 (SEQ ID Nr. 5)
Sequenz ID Nr. 6 (SEQ ID Nr. 6)
Sequenz ID Nr. 7 (SEQ ID Nr. 7)
Sequenz ID Nr. 8 (SEQ ID Nr. 8)
Sequenz ID Nr. 9 (SEQ ID Nr. 9)
Sequenz ID Nr. 10 (SEQ ID Nr. 10)
Sequenz ID Nr. 11 (SEQ ID Nr. 11)
Sequenz ID Nr. 12 (SEQ ID Nr. 12)
Sequenz ID Nr. 13 (SEQ ID Nr. 13)

1 CCAAAGTTCC AGATTTCCTC A

Sequenz ID Nr. 14 (SEQ ID Nr. 14)

1 TCCCGCGGCC GGCAGAGTT

Sequenz ID Nr. 15 (SEQ ID Nr. 15)

1 AGCACCCAGC GCTGGAGG

Sequenz ID Nr. 16 (SEQ ID Nr. 16)

1 CCGCGGCTGT TCCCGG

Sequenz ID Nr. 17 (SEQ ID Nr. 17)

1 AGTAACGTAC TTCTTAACTT TGGC

Sequenz ID Nr. 18 (SEQ ID Nr. 18)

1 AGAGGAAGAT ACCTATCACG TG

Sequenz ID Nr. 19 (SEQ ID Nr. 19)

1 AAAATGGAAG CATTTGGTAA TCA

Sequenz ID Nr. 20 (SEQ ID Nr. 20)

1 AGTGAACTAA AATTCTTAGA GGG

Sequenz ID Nr. 21 (SEQ ID Nr. 21)

1 AAGCAATGAT GACAAAGTGC TAAC

Sequenz ID Nr. 22 (SEQ ID Nr. 22)

1 TGGTCCACAA TGTCACATTT CGG

Sequenz ID Nr. 23 (SEQ ID Nr. 23)

1 CTGAAGGGCT GTGCTGTGGA

Sequenz ID Nr. 24 (SEQ ID Nr. 24)

1 TGTCCTTACA AACGGGGCT

Sequenz ID Nr. 25 (SEQ ID Nr. 25)

1 CCCATGCTCA AGACATACTC C

Sequenz ID Nr. 26 (SEQ ID Nr. 26)

1 ACAGTAAGGA AAAAACAAAC AGCC

Sequenz ID Nr. 27 (SEQ ID Nr. 27)

1 GGGCTGGCAG ATTCCTCCAG

Sequenz ID Nr. 28 (SEQ ID Nr. 28)

1 GTAAGTATCC GCGCCGGGAA C

Sequenz ID Nr. 29 (SEQ ID Nr. 29)

1 GGGATTGGTT GCCAGTGCTT AAAAGTTAG

Sequenz ID Nr. 30 (SEQ ID Nr. 30)

1 GATCTAAGGA CCATCATGGC CACACTTGCC

Sequenz ID Nr. 31 (SEQ ID Nr. 31)

1 GGAGGGATCC GTCTGGGCAA AGG

Sequenz ID Nr. 32 (SEQ ID Nr. 32)

1 CAATCCAGGA CAGTCAGGGC TTT

Sequenz ID Nr. 33 (SEQ ID Nr. 33)

1 TCCCGCGGCC GGCAGAGTT

Claims

Verfahren zur Durchmusterung von Individuen nach einer Mutation, die zu Friedreich-Ataxie führt, umfassend den Schritt des Nachweisens einer Größenvariation eines (GAA)_n-Repeats, das sich zwischen Nucleotiden befindet, die dem Nucleotid auf Position 4451 und dem Nucleotid auf Position 4501 der Sequenz SEQ ID Nr. 1 entsprechen, indem man die Länge des Repeats misst, wobei n für betroffene Individuen größer als etwa 120 ist.
Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei die Größe des Repeats durch Verdau von Proben-DNA durch Restriktionsendonuclease und Southern-Blot-Analyse gemessen wird.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 und 2, wobei die Länge des Repeats durch Hybridisierung mit Sonden, die einen Bereich, der das (GAA)-Repeat umfasst, erkennen, und Durchführung einer Southern-Blot-Analyse gemessen wird.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei es sich bei der Restriktionsendonuclease um EcoRI handelt.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei es sich bei der Sonde, die zur Durchführung des Southern Blot verwendet wird, um SEQ ID Nr. 2 handelt.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei es sich bei der Sonde, die zur Durchführung des Southern Blot verwendet wird, um ein Amplifikationsprodukt handelt, das man erhält, indem man eine PCR mit der DNA mit SEQ ID Nr. 16 und SEQ ID Nr. 15 durchführt.
Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei die Größe des Repeats durch Pulsfeld-Gel-Elektrophorese bestimmt wird.
Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei in dem Nachweisschritt SEQ ID Nr. 29 und SEQ ID Nr. 30 verwendet werden.
Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei in dem Nachweisschritt SEQ ID Nr. 31 und SEQ ID Nr. 32 verwendet werden.
Verfahren zur Durchmusterung von Individuen nach einer Mutation, die zu Friedreich-Ataxie führt, durch Bestimmung der Menge an exprimierter mRNA, die der durch die Sequenz SEQ ID Nr. 2 definierten cDNA entspricht, und der mRNA von bekannten Kontrollen und durch Vergleichen der Menge der mRNA, die der durch die Sequenz SEQ ID Nr. 2 definierten cDNA entspricht, mit der Menge der mRNA von den bekannten Kontrollen, wobei eine reduzierte Menge der mRNA, die der durch die Sequenz SEQ ID Nr. 2 definierten cDNA entspricht, auf Individuen hinweist, die die Mutation haben, die zu Friedreich-Ataxie führt.
Verfahren gemäß Anspruch 10, wobei die mRNA durch die folgenden Schritte bestimmt wird: Entnehmen von mRNA aus zu testenden Individuen; Herstellen von cDNA aus der mRNA; Amplifizieren der cDNA unter Bildung von Amplifikationsprodukten; und Vergleichen der relativen Mengen der durch die Sequenz SEQ ID Nr. 2 definierten cDNA und der vorhandenen Kontrollamplifikationsprodukte, wobei eine reduzierte Menge der mRNA, die der durch die Sequenz SEQ ID Nr. 2 definierten cDNA entspricht, auf Individuen hinweist, die die Mutation haben, die zu Friedreich-Ataxie führt.
Verfahren gemäß Anspruch 10, wobei der Schritt des Vergleichens folgendes beinhaltet: die Elektrophorese der Amplifikationsprodukte; das Übertragen der Amplifikationsprodukte auf einen festen Träger; das Hybridisieren der Amplifikationsprodukte mit einer Sonde; und das Quantifizieren der Amplifikationsprodukte, die der durch die Sequenz SEQ ID Nr. 2 definierten cDNA entsprechen, gegenüber Kontroll-Gen-Amplifikationsprodukten.
Verfahren gemäß Anspruch 12, wobei es sich bei der Sonde um SEQ ID Nr. 14 handelt.
Verfahren gemäß Anspruch 10, wobei es sich bei dem Kontrollgen um Serin-Hydroxymethyltransferase (SHMT) handelt.
Verfahren zum Nachweis eines GAA-Polymorphismus, der sich zwischen Nucleotiden befindet, die dem Nucleotid auf Position 4451 und dem Nucleotid auf Position 4501 der Sequenz SEQ ID Nr. 1 entsprechen, umfassend die Schritte der Durchführung eines PCR-Assays unter Bildung von amplifizierten Produkten des GAA-Polymorphismus und Messen der Länge der amplifizierten Produkte.
Verfahren gemäß Anspruch 15, wobei in dem PCR-Assay SEQ ID Nr. 29 und SEQ ID Nr. 30 verwendet werden.
Verfahren gemäß Anspruch 15, wobei in dem PCR-Assay SEQ ID Nr. 31 und SEQ ID Nr. 32 verwendet werden.
Stoffzusammensetzung, die das Molekül mit der SEQ ID Nr. 1 umfasst.
Stoffzusammensetzung, die das Molekül mit der SEQ ID Nr. 2 umfasst.
Stoffzusammensetzung, die das Molekül mit der SEQ ID Nr. 3 umfasst.
Stoffzusammensetzung, die das Molekül mit der SEQ ID Nr. 4 umfasst.
Stoffzusammensetzung, die das Molekül mit der SEQ ID Nr. 5 umfasst.
Stoffzusammensetzung, die das Molekül mit der SEQ ID Nr. 6 umfasst.
Stoffzusammensetzung, die das Molekül mit der SEQ ID Nr. 7 umfasst.
Stoffzusammensetzung, die das Molekül mit der SEQ ID Nr. 8 umfasst.
Stoffzusammensetzung, die das Molekül mit der SEQ ID Nr. 9 umfasst.
Stoffzusammensetzung, die das Molekül mit der SEQ ID Nr. 10 umfasst.
Stoffzusammensetzung, die das Molekül mit der SEQ ID Nr. 11 umfasst.
Stoffzusammensetzung, die das Molekül mit der SEQ ID Nr. 12 umfasst.
Stoffzusammensetzung, die das Molekül mit der SEQ ID Nr. 13 umfasst.
Stoffzusammensetzung, die das Molekül mit der SEQ ID Nr. 14 umfasst.
Stoffzusammensetzung, die das Molekül mit der SEQ ID Nr. 15 umfasst.
Stoffzusammensetzung, die das Molekül mit der SEQ ID Nr. 16 umfasst.
Stoffzusammensetzung, die das Molekül mit der SEQ ID Nr. 17 umfasst.
Stoffzusammensetzung, die das Molekül mit der SEQ ID Nr. 18 umfasst.
Stoffzusammensetzung, die das Molekül mit der SEQ ID Nr. 19 umfasst.
Stoffzusammensetzung, die das Molekül mit der SEQ ID Nr. 20 umfasst.
Stoffzusammensetzung, die das Molekül mit der SEQ ID Nr. 21 umfasst.
Stoffzusammensetzung, die das Molekül mit der SEQ ID Nr. 22 umfasst.
Stoffzusammensetzung, die das Molekül mit der SEQ ID Nr. 23 umfasst.
Stoffzusammensetzung, die das Molekül mit der SEQ ID Nr. 24 umfasst.
Stoffzusammensetzung, die das Molekül mit der SEQ ID Nr. 25 umfasst.
Stoffzusammensetzung, die das Molekül mit der SEQ ID Nr. 26 umfasst.
Stoffzusammensetzung, die das Molekül mit der SEQ ID Nr. 27 umfasst.
Stoffzusammensetzung, die das Molekül mit der SEQ ID Nr. 28 umfasst.
Stoffzusammensetzung, die das Molekül mit der SEQ ID Nr. 29 umfasst.
Stoffzusammensetzung, die das Molekül mit der SEQ ID Nr. 30 umfasst.
Stoffzusammensetzung, die das Molekül mit der SEQ ID Nr. 31 umfasst.
Stoffzusammensetzung, die das Molekül mit der SEQ ID Nr. 32 umfasst.
Therapeutische Zusammensetzung, die eine pharmakologische Dosis eines Proteins mit der Aminosäuresequenz SEQ ID Nr. 4 oder eines funktionellen Derivats davon umfasst.
Therapeutische Zusammensetzung, die einen Nucleinsäurevektor umfasst, der die Sequenz SEQ ID Nr. 2 enthält und in der Lage ist, diese Sequenz zu exprimieren.
Verwendung eines Proteins mit der Aminosäuresequenz SEQ ID Nr. 4 oder eines funktionellen Derivats davon zur Herstellung einer therapeutischen Zusammensetzung zur Behandlung der Friedreich-Ataxie.
Verwendung eines Nucleinsäurevektors, der die Sequenz SEQ ID Nr. 2 enthält und in der Lage ist, diese Sequenz zu exprimieren, zur Herstellung einer therapeutischen Zusammensetzung zur Behandlung der Friedreich-Ataxie.