DE69729579T3

DE69729579T3 - Polymer-lipide mikroverkapselte gase und ihre anwendung bei bilderzeugenden mitteln

Info

Publication number: DE69729579T3
Application number: DE69729579T
Authority: DE
Inventors: Howard Bernstein; Ann Julie STRAUB; T. Henry BRUSH; C. Charles CHURCH
Original assignee: Acusphere Inc
Current assignee: Acusphere Inc
Priority date: 1996-07-29
Filing date: 1997-02-27
Publication date: 2008-11-06
Anticipated expiration: 2017-02-28
Also published as: AU720727B2; BR9711109B1; MY130324A; CN1226836A; EP0957942A2; AU3367297A; TW480176B; EP0957942B2; NO990402D0; ATE269107T1; WO1998004292A3; HUP0000392A3; JP2987212B2; CZ32899A3; DE69729579D1; KR20000029639A; JPH11505272A; NZ333864A; HK1023939A1; BR9711109A

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft allgemein das Gebiet der diagnostischen, bilderzeugenden Mittel und betrifft insbesondere mikropartikelförmige Ultraschallabbildungs-Kontrastmittel, die Lipid eingearbeitet haben, um die Echogenizität über die Zeit aufrechtzuerhalten.
Wenn Ultraschall verwendet wird, um ein Bild der inneren Organe und Strukturen eines Menschen oder Tiers zu erhalten, werden Ultraschallwellen, Wellen mit Schallenergie einer Frequenz über der, die durch das menschliche Ohr wahrnehmbar ist, reflektiert, wenn sie durch den Körper gehen. Verschiedene Typen an Körpergewebe reflektieren die Ultraschallwellen unterschiedlich und die Reflexionen, die durch die Ultraschallwellen, welche von verschiedenen inneren Struktur reflektiert werden, produziert werden, werden detektiert und elektronisch in eine visuelle Anzeige umgewandelt. Für einige medizinische Krankheitsbilder ist der Erhalt eines verwendbaren Bildes des interessierenden Organs oder der interessierenden Struktur besonders schwierig, da die Details der Struktur von dem umgebenden Gewebe in einem Ultraschallbild, das durch die Reflexion von Ultraschallwellen in Abwesenheit eines Kontrastverstärkungsmittels produziert wird, nicht adäquat unterscheidbar sind. Eine Detektion und eine Betrachtung bestimmter physiologischer und pathologischer Zustände kann wesentlich verbessert werden, indem der Kontrast in einem Ultraschallbild durch Infundieren eines Agenzes in ein Organ oder eine andere Struktur von Interesse erhöht wird. In anderen Fällen ist eine Detektion der Bewegung des Kontrastverstärkungsmittels selbst besonders wichtig. Beispielsweise kann ein unterschiedliches Blutstrommuster, das bekannterweise aus besonderen kardiovaskulären Abnormalitäten resultiert, nur durch Infundieren eines Kontrastmittels in den Blutstrom und Beobachten der Dynamik des Blutstroms erkennbar sein.
Materialien, die als Ultraschallkontrastmittel verwendbar sind, wirken dadurch, daß sie eine Wirkung auf Ultraschallwellen haben, wenn diese durch den Körper gehen und unter Erzeugung des Bildes, aus dem eine medizinische Diagnose abgeleitet wird, reflektiert werden. Verschiedene Substanztypen beeinflussen Ultraschallwellen in unterschiedlicher Weise und zu variierenden Graden. Darüber hinaus werden einige der Effekte, die durch Kontrastverstärkungsmittel verursacht werden, leichter gemessen und beobachtet als andere. Bei der Selektion einer idealen Zusammensetzung für ein Kontrastverstärkungsmittel würde man die Substanz bevorzugen, die die stärkste Wirkung auf die Ultraschallwelle hat, wenn diese durch den Körper geht. Außerdem sollte die Wirkung auf die Ultraschallwelle einfach gemessen werden. Es gibt drei Hauptkontrastverstärkungseffekte, die in einem Ultraschallbild gesehen werden können: Rückstreuung, Strahlabschwächung und Schallgeschwindigkeitdifferential.
RÜCKSTREUUNG: Wenn eine Ultraschallwelle, die durch den Körper geht, auf eine Struktur, z. B. ein Organ oder ein anderes Körpergewebe, trifft, reflektiert die Struktur einen Teil der Ultraschallwelle. Verschiedene Strukturen innerhalb des Körpers reflektieren Ultraschallenergie auf verschiedenen Wegen und in variierenden Stärken. Diese reflektierte Energie wird detektiert und verwendet, um ein Bild der Strukturen, durch die die Ultraschallwelle gegangen ist, zu erzeugen. Der Ausdruck "Rückstreuung" bezieht sich auf das Phänomen, bei dem Ultraschallenergie durch eine Substanz mit bestimmten physikalischen Eigenschaften zurück zur Quelle gestreut wird.
Es war lange bekannt, daß der in einem Ultraschallbild beobachtete Kontrast durch das Vorliegen von Substanzen verstärkt werden kann, von denen bekannt ist, daß sie eine große Menge an Rückstrahlung bewirken. Wenn eine solche Substanz einem bestimmten Teil des Körpers verabreicht wird, wird der Kontrast zwischen dem Ultraschallbild dieses Teils des Körpers und den umgebenden Geweben, die die Substanz nicht enthalten, verstärkt. Es ist einzusehen, daß verschiedene Substanzen infolge ihrer physikalischen Eigenschaften eine Rückstreuung in verschiedenen Graden bewirken. Dementsprechend wurde die Suche nach Kontrastverstärkungsmitteln auf Substanzen konzentriert, die stabil und nicht toxisch sind und die die maximale Menge an Rückstreuung aufweisen.
Die Fähigkeit einer Substanz, eine Rückstreuung von Ultraschallenergie zu bewirken, hängt von Charakteristika der Substanz wie z. B. ihrer Fähigkeit, komprimiert zu werden, ab. Wenn verschiedene Substanzen untersucht werden, ist es nützlich, ein besonderes Maß für die Fähigkeit einer Substanz, eine Rückstrahlung zu bewirken, das auch als "Streuungsquerschnitt" bekannt ist, zu vergleichen. Der Streuungsquerschnitt einer besonderen Substanz ist zum Radius der Streustrahlung proportional und hängt auch von Wellenlänge der Ultraschallenergie und von anderen physi kalischen Eigenschaften der Substanz ab. J. Ophir und K. J. Parker, Contrast Agents in Diagnostic Ultrasound, Ultrasound in Medicine & Biology, Bd. IS, Nr. 4, S. 319, 323 (1989).
Bei der Beurteilung der Verwendbarkeit verschiedener Substanzen als Bildkontrastmittel kann man berechnen, welche Mittel den höheren Streuungsquerschnitt haben sollten und entsprechend welche Mittel den größten Kontrast in einem Ultraschallbild bereitstellen sollten. Es kann angenommen werden, daß die Komprimierbarkeit eines festen Partikels viel geringer ist als die des umgebenden Mediums und daß die Dichte des Partikels viel größer ist. Unter Verwendung dieser Annahme wurde der Streuungsquerschnitt eines festen Partikels als Kontrastverstärkungsmittel als 1,75 bestimmt (Ophir und Parker, supra, bei 325). Für einen reinen flüssigen Streukörper sind die adiabatische Komprimierbarkeit und die Dichte des Streukörpers und des umgebenden Mediums wahrscheinlich annähernd gleich, was zu dem Resultat führen würde, daß Flüssigkeiten einen Streuungsquerschnitt von Null haben würden. Allerdings können Flüssigkeiten eine gewisse Rückstreuung aufweisen, wenn große Volumina eines flüssigen Mittels vorliegen. Wenn zum Beispiel ein flüssiges Mittel von einem sehr kleinem Gefäß in ein sehr großes geht, so daß die Flüssigkeit im wesentlichen das gesamte Gefäß besetzt, kann die Flüssigkeit eine meßbare Rückstreuung aufweisen. Dennoch wird dem Fachmann klar sein, daß reine Flüssigkeiten im Vergleich zu freien Gasmikrobläschen relativ ineffiziente Streukörper sind.
STRAHLABSCHWÄCHUNG: Ein anderer Effekt, der aus dem Vorliegen bestimmter fester Kontrastverstärkungsmittel beobachtet werden kann, ist die Abschwächung der Ultraschallwelle. Bildkontrast wurde bei der herkömmlichen Bilderzeugung infolge lokalisierter Abschwächungsunterschiede zwischen bestimmten Gewebetypen beobachtet. K. J. Parker und R. C. Wang, "Measurement of Ultrasonic Attenuation Within Regions selected from B-Scan Images", IEEE Trans. Biomed. Enar. BME 30(8), S. 431–37 (1983); K. J. Parker, R. C. Wang und R. M. Lerner, "Attenuation of Ultrasound Magnitude and Frequency Dependence for Tissue Characetization", Radiology 153(3), S. 785–88 (1984). Es wurde die Hypothese aufgestellt, daß Messungen der Abschwächung einer Geweberegion, die vor und nach Infundieren eines Agenzes vorgenommen wurden, zu einem verstärkten Bild führen können. Allerdings sind Techniken, die auf einem Abschwächungskontrast als Mittel zur Messung der Kontrastverstärkung eines flüssigen Mittels basieren, nicht gut entwickelt und, selbst wenn sie vollständig entwickelt sind, können sie an Beschränkungen bezüglich der inneren Organe oder Strukturen leiden, bei denen diese Technik eingesetzt werden kann. Beispielsweise ist es unwahrscheinlich, daß ein Verlust ab Abschwächung infolge flüssiger Kontrastmittel im Bild des kardiovaskulären Systems infolge des hohen Volumens an flüssigem Kontrastmittel, das in einem gegebenen Gefäß vorhanden sein müßte, bevor eine wesentliche Differenz bei der Abschwächung gemessen werden könnte, beobachtet werden könnte.
Eine Energieabsorption durch die Partikel erfolgt durch einen Mechanismus, der als "relative Bewegung" bezeichnet wird. Es kann gezeigt werden, daß die Veränderung der Abschwächung, die durch relative Bewegung verursacht wird, sich linear mit der Partikelkonzentration und als Quadrat der Dichtedifferenz zwischen den Partikel und den umgebenden Medium erhöht. K. J. Parker, et al., "A Particulate Contrast Agent with Potential for Ultrasound of Liver", Ultrasound in Medicine & Biology, Bd. 13, Nr. 9, S. 555, 561 (1987). Wenn eine wesentliche Akkumulation fester Partikel auftritt, könnte daher ein Abschwächungskontrast ein wertvoller Mechanismus zur Beobachtung einer Bildkontrastverstärkung sein, obgleich der Effekt in einer viel kleineren Größenordnung liegt als das Rückstreuungsphänomen und bei kardiovaskulären Diagnosen sehr geringe Verwendung finden würde.
SCHALLGESCHWINDIGKEITSDIFFERENZ: Es wurde eine weitere Technik zur Verstärkung des Kontrasts in einem Ultraschallbild vorgeschlagen, die auf der Tatsache basiert, daß die Schallgeschwindigkeit in Abhängigkeit von den Medien, durch die der Schall geht, variiert. Wenn daher ein ausreichend großes Volumen eines Mittels, durch das die Schallgeschwindigkeit anders ist als im umgebenden Gewebe, in einen Zielbereich infundiert werden kann, kann die Differenz in der Schallgeschwindigkeit durch den Zielbereich meßbar sein.
Insgesamt ist diagnostischer Ultraschall ein kräftiges, nichtinvasives Werkzeug, das eingesetzt werden kann, um Informationen über die inneren Organe des Körpers zu erhalten. Der Beginn der Graustufenskalaabbildung und des Farbdopplers haben den Rahmen und die Auflösung der Technik stark weiter entwickelt. Obgleich Techniken zur Durchführung von diagnostischem Ultraschall deutlich verbessert wurden, besteht zur Herstellung und Verwendung von Kontrastmitteln noch ein Bedarf zu Erhöhung der Auflösung für die Abbildung der Herzperfusion und der Herzkammern, fester Organe, Nierenperfusion, fester Organperfusion und für Dopplersignale für die Blutgeschwindigkeit und -strömungsrichtung während der Realzeitabbildung.
Es wurde eine Vielzahl natürlicher und synthetischer Polymere verwendet, um bilderzeugende Kontrastmittel, wie z. B. Luft, einzukapseln. Schneider et al., Invest. Radiol., Bd. 27, S. 134–139 (1992) beschreibt luftgefüllte Polymerpartikel mit 3 μm. Es wurde beschrieben, daß diese Partikel in Plasma und unter angewendetem Druck stabil sind. Bei 250 MHz war allerdings ihre Echogenität niedrig. Ein anderer Typ einer Mikrobläschensuspension wurde aus beschalltem Albumin erhalten. Feinstein et al., J. Am. Coll. Cardiol. Bd. 11, S. 59–65 (1988). Feinstein beschreibt die Herstellung von Mikrobläschen, die eine geeignete Größe zum transpulmonalen Durchgang haben und eine ausgezeichnete in vitro-Stabilität besitzen. Allerdings sind diese Mikrobläschen in vivo kurzlebig, haben eine Halbwertszeit in der Größenordnung von wenigen Sekunden (was etwa gleich einem Zirkulationsdurchgang ist), und zwar infolge ihrer Instabilität unter Druck. Gottlieb, S. et al. J. Am. Soc. Echo., Bd. 3, S. 328 (1990) Abstract: und Shapiro, J. R. et al., J. Am. Coll. Cardiol., Bd. 16, S. 1603–1607 (1990). Gelatine-eingekapselte Luftblasen wurden durch Carroll et al. (Carroll, B. A. et al., Invest. Radiol, Bd. 15, S. 260–266 (1980) und Carroll, B. A. et al., Radiology, Bd. 143, S. 747–750 (1982)) beschrieben, infolge ihrer großen Abmessungen (12 und 80 μm) würden sie aber wahrscheinlich nicht durch Lungenkapillaren gehen. Mit Gelatine eingekapselte Mikrobläschen wurden auch in WO 80/02365 , veröffentlicht am 13. November 1980, von Rasor Associates, Ic., beschrieben. Diese werden durch "Koaleszieren" der Gelatine gebildet.
Mikrobläschen, die durch Galactosemikrokristalle stabilisiert sind (SHU 454 und SHU 508) wurden von Fritzch et al. beschrieben. Fritzsch, T. et al., Invest. Radiol., Bd. 23 (Erg. 1), S. 302–305 (1988); und Fritzsch T. et al., Invest. Radiol., Bd. 25 (Erg. 1), 160–161 (1990). Die Mikrobläschen halten in vitro 15 Minuten, in vivo aber weniger als 20 Sekunden. Rovai, D. et al., J. Am. Coll. Cardiol., Bd. 10, S. 125–134 (1987); und Smith, M. et al., J. Am. Coll Cardiol., Bd. 13. S. 1622–1628 (1989). Gasmikrobläschen, die innerhalb einer Schale aus einem Fluor-enthaltenden Material eingekapselt sind, werden von Molecular Biosystems, Inc. in WO 96/04018 beschrieben.
Die europäische Patentanmeldung Nr. 90901933.5 von Schering Aktiengesellschaft offenbart die Herstellung und Verwendung von mikroeingekapseltem Gas oder flüchtigen Flüssigkeiten zur Ultraschallbilderzeugung, wobei die Mikrokapseln aus synthetischen Polymeren oder Polysacchariden gebildet werden. Die europäische Patentanmeldung Nr. 0 458 745 A1 , veröffentlicht am 27. November 1991, von Sintetica S. A. offenbart Luft- oder Gas-Mikroballons, die durch eine grenzflächenabgeschiedene Polymermembran gebunden sind, die in einem wäßrigen Träger zur Injektion in ein Wirtstier oder zur oralen, rektalen oder urethralen Verabreichung dispergiert werden können, zu therapeutischen oder diagnostischen Zwecken. WO 92/18164 von Delta Biotechnology Limited beschreibt die Herstellung von Mikropartikeln durch Sprühtrocknung unter sehr kontrollierten Bedingungen, wie Temperatur, Sprühgeschwindigkeit, Partikelgröße und Trocknungsbedingungen, einer wäßrigen Proteinlösung unter Bildung hohler Kügelchen, die darin Gas eingeschlossen haben, zur Verwendung bei der Bilderzeugung. WO 93/25242 beschreibt die Synthese von Mikropartikeln zur Ultraschallbilderzeugung, die aus einem Gas, welches in einer Hülle aus Polycyanoacrylat oder Polyester enthalten ist, bestehen. WO 92/21382 beschreibt die Herstellung von Mikropartikel-Kontrastmitteln, die eine kovalent gebundene Matrix enthalten, die ein Gas enthält, wobei die Matrix ein Kohlenhydrat ist. Die US-Patent Nrn. 5 334 381 , 5 123 414 und 5 352 435 von Unger beschreiben Liposome zur Verwendung als Ultraschallkontrastmittel, die Gase, Gasvorstufen, z. B. eine pH-aktivierte oder photoaktivierte gasförmige Vorstufe, enthalten, wie auch andere flüssige oder feste Kontrastverstärkungsmittel.
Das US-Patent Nr. 5 393 524 von Quay offenbart die Verwendung von Mitteln, die Fluorkohlenstoffe enthalten, zur Erhöhung des Kontrasts in einem Ultraschallbild. Die Mittel bestehen aus extrem kleinen Bläschen oder Mikrobläschen ausgewählter Gase, die eine lange Lebensdauer in Lösung aufweisen und klein genug sind, um durch die Lunge zu gehen, die ihre Verwendung bei der Ultraschallbilderzeugung des kardiovaskulären Systems und anderer Vitalorgane ermöglichen. WO 95/23615 von Nycomed offenbart Mikrokapseln zur Bilderzeugung, die durch Koazervierung einer Lösung, zum Beispiel einer Proteinlösung, die einen Perfluorkohlenstoff enthält, gebildet werden. WO 95/03357 vom Massachusetts Institute of Technology, veröffentlicht am 2. Februar 1995, offenbart Mikropartikel, die aus Polyethylenglykol-Poly(lactid-co-glycolid)-Blockpolymeren mit darin eingekapselten bilderzeugenden Mitteln, einschließlich Gasen wie z. B. Luft und Perfluorkohlenstoffen, gebildet werden. Wie in WO 94/16739 von Sonus Pharmaceuticals, Inc., beschrieben wird, ist es bekannt, daß, obgleich Feststoffe und Flüssigkeiten Schall zu einem ähnlichen Grad reflektieren, Gase effizienter sind und zur Verwendung als Ultraschallkontrastmittel die bevorzugten Medien sind. Wie in der Beispiel 12 der Sonus PCT-Anmeldung gezeigt wird, wurden tatsächlich Protein-Mikrokapseln aufgegeben, da Sicherheitsbedenken (wie auch aus Wirksamkeitsgründen) auftraten, als sie Minischweinen verabreicht wurden, und zwar im Vergleich zu Emulsionen oder kolloidalen Suspensionen.
Keine dieser Literaturstellen beschreibt Mikropartikel, die unter Verwendung anderer Detektionsverfahren, zum Beispiel Röntgenstrahlen, Positron- oder Photon-Emissionstomographie oder Magnetresonanzabbildung, detektiert werden können.
In all diesen Fällen ist es wünschenswert, die Echogenität des bilderzeugenden Mittels in Verbindung mit einer Verstärkung oder Aufrechterhaltung der Stabilität und der Herstellungsleichtigkeit des bilderzeugenden Mittels zu verstärken. Ein Weg zur Erhöhung der Echogenität eines Mikropartikels besteht darin, die Zeit, die eingekapselte Gase in den zirkulierenden Mikropartikeln verbleiben, zu erhöhen. In den meisten Fällen diffundieren die Gase unglücklicherweise schnell aus, und zwar ungeachtet der Natur des Gases oder des Einkapselungsmaterials, und zwar insbesondere in der wäßrigen Umgebung der vaskulären Zirkulation.
Eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht daher in der Bereitstellung von Mikropartikeln mit deutlich erhöhter Echogenität. Eine weitere Aufgabe der Erfindung besteht in der Bereitstellung von Mikropartikeln, die ein bilderzeugendes Mittel enthalten, die in vivo über mehr als wenige Zirkulationsmale beständig sind. Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht in der Bereitstellung von Mikropartikeln, die für längere Zeiträume Gas eingekapselt enthalten und dadurch die in vivo-Echogenität der Mikropartikel erhöhen.
Eine weitere Aufgabe der Erfindung besteht in der Bereitstellung von Mikropartikeln, deren Bilderzeugnismittel enthalten. Es ist weiterhin Aufgabe der vorliegenden Erfindung Mikropartikel bereitzustellen, die bilderzeugende Mittel enthalten, die auf spezifische Regionen des Körpers ausgerichtet sind. Noch eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht in der Bereitstellung von Verfahren zur Herstellung von Mikropartikeln, die bilderzeugende Mittel darin eingeschlossen haben.
Zusammenfassung der Erfindung
Es wurde festgestellt, daß die Einarbeitung von fluorierten Gasen wie z. B. Perfluorkohlenstoffen in Mikropartikel, die aus einer Kombination eines natürlichen oder synthetischen Polymers und Lipid gebildet werden, eine signifikant erhöhte Echogenität im Vergleich zu Mikropartikeln, die kein Lipid enthalten, liefert. Zur Erhöhung der Echogenität können auch andere Verbindungen als Lipide, die hydrophob sind und die Diffusion von Wasser in die Mikropartikel begrenzen, eingearbeitet werden. In der bevorzugten Ausführungsform sind Polymere biologisch abbaubare Polymere. Die Mikropartikel werden mit einem Durchmesser hergestellt, der für das abzubildende Zielgewebe geeignet ist, z. B. mit einem Durchmesser von 0,5 bis 8 μm für eine intravaskuläre Verabreichung und einem Durchmesser von 0,5 bis 5 mm zur oralen Verabreichung für die Abbildung des gastrointestinalen Trakts oder anderer Lumen. Bevorzugte Polymere sind Polyhydroxysäuren, z. B. Polymilchsäure-co-glycolsäure, Polylactid oder Polyglycolid, am bevorzugtesten konjugiert an Polyethylen oder andere Materialien, die die Aufnahme durch das retikuloendotheliale System (RES) inhibieren. Die am meisten bevorzugten Lipide sind Phospholipide, vorzugsweise Dipalmitoylphosphatdiylcholin (DPPC), Distearoylphosphatidylcholin (DSPC), Diarachidoylphosphatidylcholin (DAPC), Dibehenoylphosphatidylcholin (DBPC), Ditricosanoylphosphatidylcholin (DTPC), Dilignoceroylphosphatidylcholin (DLPC), eingearbeitet in einem Verhältnis zwischen 0,01 und 30 (G Lipid/G Polymer), am bevorzugtesten zwischen 0,1 und 10 (G Lipid/G Polymer).
Die Adhäsion dieser Mikropartikel kann durch Selektion bioadhäsiver Polymerer verstärkt oder reduziert werden. Beispielsweise kann eine Adhäsion bzw. Haftung erhöht werden, wenn das Polymer zur oralen Verabreichung verwendet wird. Ein Targeting kann auch durch Selektion des Polymers oder durch Einbau von Liganden in oder durch Koppeln von Liganden an das Polymer erreicht werden, wobei diese Liganden spezifisch an besondere Gewebetypen oder Zelloberflächenmoleküle binden. Zusätzlich können Liganden, die die Ladung, Lipophilität oder Hydrophilität des Partikels beeinflussen, an die Mikrokügelchen geheftet werden. Die polymeren Mikropartikel sind in einer Vielzahl diagnostischer Bilderzeugungsverfahren, einschließlich Ultraschallabbildung, Matnetresonanzabbildung, Fluoroskopie, Röntgenstrahl- und Computertomographie, einsetzbar. Die Mikrokügelchen können in einer Vielzahl von Bilderzeugungsanwendungen, einschließlich Anwendungen in der Kardiologie, Anwendungen bei der Blutperfusion wie auch zur Organ- und peripheren Venen-Abbildung verwendet werden.
Kurze Beschreibung der Zeichnung
1 ist ein Diagramm über die Wirkung der Kohlenstoffkettenlänge von Lipid, das in polymere Mikropartikel eingearbeitet ist, aufgetragen als Grad der Rückstrahlung über die Zeit (Minuten) für Lecithin (ausgefüllte Kreise), DPPC (offene Quadrate), DSPC (offene Rauten) und DAPC (X).
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
Es werden Verfahren zur Synthese von polymeren Abgabesystemen bereitgestellt, welche aus Polymer-Lipid-Mikropartikeln bestehen, welche fluorierte Gase, speziell Perfluorkohlenstoffe, enthalten. Die Mikropartikel sind in einer Vielzahl diagnostischer Ultraschallabbildungsanwendungen, insbesondere bei Ultraschallverfahren, z. B. Blutgefäßabbildung und Echokardiographie, einsetzbar. Der Einbau von zusätzlichem Lipid erhöht die Echogenität im Vergleich zu denselben Polymermikropartikeln ohne zusätzliches Lipid signifikant.
Verfahren und Reagenzien zur Herstellung von Mikropartikeln
Der Ausdruck Mikropartikel, wie er hier verwendet wird, umfaßt Mikrokügelchen und Mikrokapseln sowie Mikropartikel, wenn nichts anderes spezifiziert ist. Mikropartikel können eine sphärische Gestalt haben oder auch nicht. Mikrokapseln sind als Mikropartikel definiert, die eine äußere Polymerschale haben, welche einen Kern aus einem anderen Material, in diesem Fall einem Gas, umgibt. Mikrokügelchen sind im allgemeinen feste polymere Kügelchen, die eine Honigwabenstruktur besitzen können, welche durch Poren durch das Polymer, die mit einem Gas zu Bilderzeugungszwecken gefüllt sind, gebildet wird, was unten noch beschrieben wird.
Polymere
Sowohl biologisch nicht-abbaubare wie auch biologisch abbaubare Matrizes können mit Lipiden gemischt zur Abgabe von Gasen verwendet werden, obgleich biologisch abbaubare Matrizes, insbesondere zur intravenösen Injektion, bevorzugt sind. Zur oralen Verabreichung können nicht erodierbare Polymere verwendet werden. Synthetische Polymere werden infolge der reproduzierbareren Synthese und des reproduzierbareren Abbaus bevorzugt. Das Polymer wird auf der Basis, die für eine in vivo-Stabilität erforderlich ist, d. h. der Zeit, die zur Verteilung von der Stelle, an der eine Bilderzeugung gewünscht wird, und der Zeit, die zur Bildabbildung erforderlich ist, ausgewählt. In einer Ausführungsform können Mikropartikel mit einer in vivo-Stabilität zwischen etwa 20 und 30 Minuten oder mehr hergestellt werden, die z. B. zur Verwendung in Anwendungen wie Echokardiographie, Neurosonographie, Hysterosalpingographie und Diagnoseverfahren an festen Organen bestimmt sind. Die in vivo-Stabilität der Mikropartikel mit eingekapseltem Kontrastmittel kann während der Herstellung durch Verwendung von Polymeren, wie z. B. Polylactid-co-glycolid, copolymerisiert mit Polyethylenglykol (PEG), eingestellt werden. Wenn PEG an der äußeren Oberfläche frei liegt, kann es, da es hydrophil ist, die Zeit, die diese Materialien zirkulieren, verlängern.
Repräsentative synthetische Polymere sind: Poly(hydroxysäuren), z. B. Poly(milchsäure), Poly(glykolsäure) und Poly(milchsäure-co-glykolsäure), Polyglycolide, Polylactide, Polylactid-co-glycolid-Copolymere und Gemische, Polyanhydride, Polyorthoester, Polyamide, Polycarbonate, Polyalkylene wie z. B. Polyethylen und Polypropylen, Polyalkylenglykole, z. B. Poly(ethylenglykol), Polyalkylenoxide, z. B. Poly(ethylenoxid), Polyalkylenterephthalate, z. B. Poly(ethylenterephthalat), Polyvinylalkohole, Polyvinylether, Polyvinylester, Polyvinylhalogenide, z. B. Poly(vinylchlorid), Polyvinylpyrrolidon, Polysiloxane, Poly(vinylalkohle), Poly(vinylacetat), Polystyrol, Polyurethane und Copolymere davon, derivatisierte Cellulosen, z. B. Alkylcellulose, Hydroxyalkylcellulosen, Celluloseether, Celluloseester, Nitrocellulosen, Methylcellulose, Ethylcellulose, Hydroxyporpylcellulose, Hydroxypropylmethylcellulose, Hydroxybutylmethylcellulose, Celluloseacetat, Cellulosepropionat, Celluloseacetatbutyrat, Celluloseacetatphthalat, Carboxyethylcellulose, Cellulosetriacetat und Cellulosesulfatnatriumsalz (hier zusammengefaßt als "synthetische Cellulosen" bezeichnet), Polymere von Acrylsäure, Methacrylsäure oder Copolymere oder Derivate davon, einschließlich Ester, Poly(methylmethacrylat), Poly(ethylmethacrylat), Poly(butylmethacrylat), Poly(isobutylmethacrylat), Poly(hexylmethacrylat), Poly(isodecylmethacrylat), Poly(laurylmethacrylat), Poly(phenylmethacrylat), Poly(methylacrylat), Poly(isopropylacrylat), Poly(isobutylacrylat) und Poly(octadecylacrylat) (hierin zusammengefaßt als "Polyacrylsäuren" bezeichnet), Poly(buttersäure), Poly(valeriansäure) und Polylactid-co-caprolacton), Copolymere und Gemische davon. Der Ausdruck "Derivate", wie er hier verwendet wird, umfaßt Polymere, die Substitutionen, Additionen chemischer Gruppe haben, zum Beispiel Alkyl, Alkylen, Hydroxylierungen, Oxidationen und andere Modifikationen aufweisen, die routinemäßig von einem Fachmann durchgeführt werden.
Beispiele für bevorzugte, biologisch nicht-abbaubare Polymere umfassen Ethylenvinylacetat, Poly(meth)acrylsäure, Polyamide, Copolymere und Gemische davon.
Beispiele für bevorzugte, biologisch abbaubare Polymere umfassen Polymere von Hydroxysäuren, z. B. Milchsäure und Glykolsäure, Polylactid, Polyglycolid, Polylactid-co-glycolid und Copolymere mit PEG, Polyanhydride, Poly(ortho)ester, Polyurethane, Poly(buttersäure), Poly(valeriansäure), Poly(lactid-co-caprolacton), Mischungen und Copolymere davon.
Beispiele für bevorzugte natürliche Polymere umfassen Proteine, z. B. Albumin und Prolamine, z. B. Zein, und Polysaccharide, z. B. Alginat, Cellulose und Polyhydroxyalkanoate, z. B. Polyhydroxybutyrat.
Bioadhäsive Polymere von besonderem Interesse zur Verwendung bei der Abbildung von mukosalen Oberflächen, wie im gastrointestinalen Trakt umfassen Polyanhydride, Polyacrylsäure, Poly(methylmethacrylate), Poly(ethylmethacrylate), Poly(butylmethacrylat), Poly(isobutylmethacrylat), Poly(hexylmethacrylat), Poly(isodecylmethacrylat), Poly(laurylmethacrylat), Poly(phenylmethacrylat), Poly(methylacrylat), Poly(isopropylacrylat), Poly(isobutylacrylat) und Poly(octadecylacrylat).
Lösungsmittel
Wie hierin definiert ist das Polymerlösungsmittel ein organisches Lösungsmittel, das flüchtig ist oder einen relativ niedrigen Siedepunkt hat oder unter Vakuum entfernt werden kann und das zur Verabreichung an Menschen in Spurenmengen akzeptabel ist, z. B. Methylenchlorid. Es können auch andere Lösungsmittel, z. B. Ethylacetat, Ethanol, Methanol, Dimethylformamid (DMF), Aceton, Acetonitril, Tetrahydrofuran (THF), Essigsäure, Dimethylsulfoxid (DMSO) und Chloroform oder Kombinationen davon verwendet werden. Im allgemeinen wird das Polymer unter Bildung einer Polymerlösung mit einer Konzentration zwischen 0,1 und 60%, Gewicht zu Volumen (G/V), bevorzugter zwischen 0,25 und 30%, gelöst.
Hydrophobe Verbindungen
Lipide
Im allgemeinen ist der Einbau von Verbindungen, die hydrophob sind und in wirksamer Menge geeignet sind, die Penetration und/oder Aufnahme von Wasser durch die Mikropartikel zu begrenzen, bei der Erhöhung der Echogenität polymerer Mikropartikel, die Gas darin eingekapselt haben, speziell fluorierte Gase wie Perfluorkohlenstoffe, wirksam. Lipide, die verwendet werden können, um Gas im Inneren der polymeren Mikropartikel zu stabilisieren, umfassen die folgenden Lipidklassen: Fettsäuren und Derivate, Mono-, Di- und Triglyceride, Phospholipide, Sphingolipide, Cholesterin- und Steroid-Derivate, Terpene und Vitamine. Fettsäuren und Derivate davon können gesättigte und ungesättigte Fettsäuren, Fettsäuren mit gerader und ungerader Kohlenstoffzahl, cis- und trans-Isomere und Fettsäurederivate, einschließlich Alkoholen, Estern, Anhydriden, Hydroxyfettsäuren und Prostaglandinen, umfassen. Gesättigte und ungesättigte Fettsäuren, die verwendet werden können, umfassen Moleküle, die zwischen 12 Kohlenstoffatomen und 22 Kohlenstoffatomen, entweder in linearer oder verzweigter Form haben. Beispiele für gesättigte Fettsäuren, die verwendet werden können, umfassen, sind aber nicht beschränkt auf, Laurin-, Myristin-, Palmitin- und Stearinsäure. Beispiele für ungesättigte Fettsäuren, die verwendet werden können, umfassen Laurin-, Phytoseterin-, Myristolein-, Palmitolein-, Petroselin- und Ölsäure. Beispiele für verzweigte Fettsäuren, die verwendet werden können, umfassen, sind aber nicht beschränkt auf, Isolaurin-, Isomyristin-, Isopalmitin- und Isostearinsäure und Isoprenoide. Fettsäure-Derivate umfassen 12-(((7'-Diethylaminocoumarin-3-yl)carbonyl)methylamino)octadecansäure; N-[12-(((7'-Diethylaminocoumarin-3-yl)carbonyl)methylamino)octadecanoyl]-2-aminopalmitinsäure, N-Succinyldioleylphosphatidylethanolamin und Palmitoyl-homocystein und/oder Kombinationen davon. Mono-, Di- und Triglyceride oder Derivate davon, die eingesetzt werden können, umfassen Moleküle, die Fettsäuren oder Gemische von Fettsäuren mit zwischen 6 und 24 Kohlenstoffatomen enthalten, wie Galactosyldiglycerid, 1,2-Dioleoyl-sn-glycerin; 1,2-c-Dipalmitoyl-sn-3-succinylglycerin und 1,3-Dipalmitoyl-2-succinylglycerin.
Phospholipide, die eingesetzt werden können, umfassen, sind aber nicht beschränkt auf, Phosphatidsäuren, Phosphatidylcholine mit sowohl gesättigten als auch ungesättigten Lipiden, Phosphatidylethanolamine, Phosphatidylglycerine, Phosphatserine, Phosphatidylinositole, Lysophosphatidyl-Derivate, Cardiolipin und β-Acyl-γ-alkylphospholipide. Beispiele für Phospholipide umfassen, sind aber nicht beschränkt auf, Phosphatidylcholine, z. B. Dioleoylphosphatidylcholin, Dimyristoylphosphatidylcholin, Dipentadecanoylphosphatidylcholin, Dilauroylphosphatidylcholin, Dipalmitoylphosphatidylcholin (DPPC), Distearoylphosphatidylcholin (DSPC), Diarachidoylphosphatidylcholin (DAPC), Dibehenoylphosphatidylcholin (DBPC), Ditricosanoylphosphatidylcholin (DTPC), Dilignoceroylphosphatidylcholin (DLPC) und Phosphatidylethanolamine wie z. B. Dioleoylphosphatidylethanolamin oder 1-Hexadecyl-2-palmitoylglycerophosphoethanolamin. Synthetische Phospholipide mit asymmetrischen Acyl-Ketten (z. B. eine Acyl-Kette mit 6 Kohlenstoffatomen und eine andere Acyl-Kette aus 12 Kohlenstoffatomen) können ebenfalls verwendet werden.
Sphingolipide, die verwendet werden können, umfassen Ceramide, Sphingomyeline, Cerebroside, Ganglioside, Sulfatide und Lysosulfatide. Beispiele für Sphingolipide umfassen, sind aber nicht beschränkt auf, die Ganglioside GM1 und GM2.
Steroide, die verwendet werden können, umfassen, sind aber nicht beschränkt auf, Cholesterin, Cholesterinsulfat, Cholesterinhemisuccinat, 6-(5-Cholesterin-3β-yloxy)hexyl-6-amino-6-desoxy-1-thio-α-D-galactopyrariosid, 6-(5-Cholesten,3β-tloxy)hexyl-6-amino-6-desoxy-1-thio-α-D-mannopyranosid und Cholesteryl-(4'-trimethyl-35-ammonio)butanoat.
Zusätzliche Lipidverbindungen, die verwendet werden können, umfassen Tocopherol und Derivate und öle und derivatisierte öle, z. B. Stearylamin.
Eine Vielzahl kationischer Lipide wie z. B. DOTMA, N-[1-(2,3-Dioleyloxy)propyl-N,N,N-trimethylammoniumchlorid; DOTAP, 1,2-Dioleyloxy-3-(trimethylammonio)propan und DOTB, 1,2-Dioleoyl-3-(4'-trimethyl-ammonio)butanoyl-sn-glyerin, können verwendet werden.
Die am bevorzugtesten Lipide sind Phospholipide, vorzugsweise DPPC, DDSPC, DAPC, DSPC, DTPC, DBPC, DLPC und am vorteilhaftesten DPPC, DAPC und DBPC.
Der Lipidgehalt liegt im Bereich zwischen 0,01 und 30 (Gewicht des Lipids/Gewicht des Polymers), am bevorzugtesten zwischen 0,1 und 10 (Gewicht des Lipids/Gewicht des Polymers).
Andere hydrophobe Verbindungen
Andere bevorzugte hydrophobe Verbindungen umfassen Aminosäuren, z. B. Tryptophan, Tyrosin, Isoleucin, Leucin und Valin, aromatische Verbindungen wie z. B. ein Alkylparaben, beispielsweise Methylparaben und Benzoesäure.
Bilderzeugende Mittel
Gase
In den Mikropartikeln kann ein beliebiges, biologisch kompatibles oder pharmakologisch akzeptables fluoriertes Gas eingearbeitet sein. Der Ausdruck Gas bezieht sich auf eine beliebige Verbindung, die ein Gas ist oder bei der Temperatur, bei der die Abbildung durchgeführt wird, fähig ist ein Gas zu bilden. Beispiele für fluorierte Gase umfassen CF₄, C₂F₆, C₃F₈, C₄F₈, SF₆, C₂F₄ und C₃F₆. Perfluorpropan ist besonders bevorzugt, da es ein unlösliches Gas liefert, das bei der Verwendungstemperatur nicht kondensieren wird, und es ist pharmakologisch akzeptabel.
Andere bilderzeugende Mittel
In Kombination mit dem fluorierten Gas können andere bilderzeugende Mittel eingearbeitet sein. Bilderzeugende Mittel, die verwendet werden können, umfassen im Handel verfügbare Mittel, die bei der Positronemissionstomographie (PET), der computerunterstützten Tomographie (CAT), der Einzelphotonenemissions-Computertomographie, bei Röntgenstrahl-, Fluoroskopie- und Magnetresonanzabbildung (MRI) verwendet werden. Mikro partikel, die mit diesen Mitteln beladen sind, können unter Verwendung von Standardtechniken, die auf dem Fachgebiet verfügbar sind und einer im Handel erhältlichen Ausrüstung detektiert werden.
Beispiele für geeignete Materialien zur Verwendung als Kontrastmittel in MRI umfassen die derzeit verfügbaren Gataliniumchelate, z. B. Diethyentriaminpentaessigsäure (DTPA) und Gatopentotatdimeglumin, wie auch Eisen, Magnesium, Mangan, Kupfer und Chrom.
Beispiele für Materialien, die für CAT und Röntgen einsetzbar sind, umfassen Materialien auf Iodbasis zur intravenösen Verabreichung, z. B. ionische Monomere, für die Diatrizoat und Iothalamat typische Beispiele sind, nicht-ionische Monomere wie z. B. Iopamidol, Isohexol und Ioversol, nicht-ionische Dimere, z. B. Iotrol und Iodixanol, und ionische Dimere, z. B. Ioxagalte. Andere nützliche Materialien umfassen Barium zur oralen Verwendung.
Mikropartikel und Verfahren zur Herstellung derselben
In der bevorzugtesten Ausführungsform werden die Mikropartikel durch Sprühtrocknung hergestellt. Es können andere Techniken wie z. B. Lösungsmittelextraktion, Heißschmelzeinkapselung und Lösungsmittelverdampfung, wie sie nachfolgend diskutiert werden, eingesetzt werden. Ein Hauptkriterium ist das, daß das Polymer vor Bildung des Mikropartikels mit dem Lipid gelöst oder geschmolzen werden muß. Obgleich in spezifischer Weise auf eine Einarbeitung eines Lipids Bezug genommen wird, ist es selbstverständlich, daß hydrophobe Verbindungen für das Lipid eingesetzt werden könnten.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird das Gas dann durch Anwenden eines Stroms des gewünschten Gases oder durch Anlegen eines Vakuums an die Mikroteilchen zur Entfernung des eingekapselten Gases angewendet, dann wird das gewünschte Gas eingefüllt.
a. Lösungsmittelverdampfung
In diesem Verfahren werden das Polymer und Lipid in einem flüchtigen organischen Lösungsmittel, z. B. Methylenchlorid, gelöst. Ein porenbildendes Mittel können zur Verwendung bei der Bildung von Mikropartikeln, wie Gas als bilderzeugendes Mittel einarbeiten sollen, als Feststoff oder in Lösung zu der Lösung gegeben werden. Wenn andere bilderzeugende Mittel einzuarbeiten sind, kann das bilderzeugende Mittel entweder als Feststoff oder in Lösung zu der Polymerlösung gegeben werden. Das Gemisch wird beschallt oder homogenisiert und die resultierende Dispersion oder Emulsion wird zu einer wäßrigen Lösung gegeben, welche ein oberflächenaktives Mittel, z. B. TWEEN^TM 20, TWEEN^TM 80, PEG oder Poly(vinylalkohol), und unter Bildung einer Emulsion homogenisiert. Die resultierende Emulsion wird gerührt, bis das meiste des organischen Lösungsmittels verdampft, wobei Mikropartikel zurückbleiben. Es können verschiedene unterschiedliche Polymerkonzentrationen verwendet werden (0,05–0,60 g/ml). Mikropartikel mit unterschiedlichen Größen (1–1000 μm) und Morphologien können nach diesem Verfahren erhalten werden. Das Verfahren ist für relativ stabile Polymere wie Polyester verwendbar.
Eine Lösungsmittelverdampfung wird von E. Mathiowitz, et al., J. Scanning Microscopy, 4, 329 (1990); L. R. Beck et al., Fertil. Steril., 31, 545 (1979) und S. Benita et al., J. Pharm. Sci., 73, 1721 (1984) beschrieben.
Allerdings können labile Polymere, z. B. Polyanhydride, während des Herstellungsverfahrens infolge des Vorliegens von Wasser abgebaut werden. Für diese Polymere sind die folgenden zwei Verfahren, die in vollständig organischen Lösungsmitteln durchgeführt werden, verwendbarer.
b. Heißschmelze-Mikroeinkapselung.
In diesem Verfahren werden das Polymer und Lipid zuerst geschmolzen und dann mit den festen Partikeln des porenbildenden Mittels oder flüssigem oder festem diagnostischen Agens gemischt. Das Gemisch wird in einem nicht-mischbaren Lösungsmittel (wie Siliconöl) suspendiert und während des kontinuierlichen Rührens auf 5°C über dem Schmelzpunkt des Polymers erwärmt. Sobald die Emulsion stabilisiert ist, wird sie gekühlt, bis sich die Polymerpartikel verfestigen. Die resultierenden Mikropartikel werden durch Dekantieren mit einem Polymer-Nicht-Lösungsmittel z. B. Petrolether gewaschen, um ein rieselfähiges Pulver zu erhalten. Mikropartikel mit Größen zwischen 1 und 1000 μm können mit diesem Verfahren erhalten werden. Die äußeren Oberflächen von Partikeln, die mit dieser Technik hergestellt werden, sind üblicherweise glatt und dicht. Dieses Verfahren wird verwendet, um Mikropartikel aus Polyestern und Polyanhydriden herzustellen. Allerdings ist dieses Verfahren auf Polymere mit Molekulargewichten zwischen 1000 und 50 000 beschränkt.
Eine Heißschmelze-Mikroverkapselung ist von E. Mathiowitz et al., Reactive Polymers, 6, 275 (1987) beschrieben worden. Polyanhydride, die z. B. aus Biscarboxyphenoxypropan und Sebacinsäure mit einem Molverhältnis von 20:80 (P(CPP-SA)20:80)(MG 20 000) bestehen, können durch Heißschmelze-Mikroverkapselung hergestellt werden, Poly(fumar-co-sebacinsäure)(20:80)(MG 15 000)-Mikropartikel können durch Heißschmelze-Mikroverkapselung hergestellt werden.
c. Lösungsmittelentfernung.
Diese Technik wurde hauptsächlich für Polyanhydride konzipiert. In diesem Verfahren wird das porenbildende Mittel in einer Lösung des selektierten Polymers und Lipid in einem flüchtigen organischen Lösungsmittel wie Methylenchlorid dispergiert oder gelöst. Diese Gemisch wird durch Rühren in einem organischen Öl (z. B. Siliconöl) unter Bildung einer Emulsion suspendiert. Anders die Lösungsmittelverdampfung kann dieses Verfahren zur Herstellung von Mikropartikeln aus Polymeren mit hohem Schmelzpunkten und unterschiedlichen Molekulargewichten eingesetzt werden. Die äußere Morphologie von Partikeln, die mit dieser Technik produziert werden, hängt in hohem Maße vom verwendeten Polymertyp ab.
d. Sprühtrocknung von Mikropartikeln.
Mikropartikel können durch Sprühtrocknung hergestellt werden, indem ein biologisch kompatibles Polymer und Lipid in einem geeignete Lösungsmittel gelöst werden, ein porenbildendes Mittel in der Polymerlösung dispergiert wird und die Polymerlösung unter Bildung von Mikropartikeln dann sprühgetrocknet wird. Das Verfahren der "Sprühtrocknung" einer Lösung eines Polymers und eines porenbildenden Mittels, wie es hier definiert ist, bezieht sich auf ein Verfahren, in dem die Lösung unter Bildung eines feinen Nebels atomisiert wird und durch direkten Kontakt mit heißen Trägergasen getrocknet wird. Unter Verwendung einer Sprühtrocknungsapparatur, die auf dem Fachgebiet verfügbar ist, kann die Polymerlösung durch die Einlaßöffnung des Sprühtrockners zugeführt werden, durch ein Rohr innerhalb des Trockners geführt werden und dann durch die Auslaßöffnung atomisiert werden. Die Temperatur kann in Abhängigkeit von dem verwendeten Gas oder Polymer verändert werden. Die Temperatur der Einlaß- und Auslaßöffnungen kann zur Herstellung der gewünschten Produkte kontrolliert werden.
Die Größe der Partikel aus der Polymerlösung ist eine Funktion der Düse, die zum Versprühen der Polymerlösung verwendet wird, des Düsendrucks, der Strömungsgeschwindigkeit, des verwendeten Polymers, der Polymerkonzentration, des Lösungsmitteltyps und der Sprühtemperatur (sowohl Einlaß- als auch Auslaßtemperatur) und des Molekulargewichts. Allgemein gilt, je höher das Molekulargewicht ist, desto größer die Partikelgröße, unter der Annahme, daß die Konzentration dieselbe ist. Typische Verfahrensparameter zur Sprühtrocknung sind wie folgt: Polymerkonzentration = 0,005–0,20 g/ml, Einlaßtemperatur = 30–1000°C, Auslaßtemperatur = 20–100°C, Polymerströmungsgeschwindigkeit = 5–200 ml/min und Düsendurchmesser = 0,2–4 mm Innendurchmesser. Mikropartikel im Durchmesserbereich zwischen 1 und 10 μm können mit einer Morphologie erhalten werden, die von der Auswahl des Polymers, der Konzentration, dem Molekulargewicht und dem Sprühstrom abhängt.
e. Hydrogel-Mikropartikel.
Mikropartikel, die aus Polymeren des Gel-Typs, z. B. Polyphosphazen oder Polymethylmethacrylat, hergestellt sind, werden produziert, indem das Polymer in einer wäßrigen Lösung gelöst wird, auf Wunsch ein porenbildendes Mittel suspendiert wird und ein Lipid im Gemisch suspendiert wird, das Gemisch homogenisiert wird und das Material durch eine Mikrotröpfchen-bildende Vorrichtung extrudiert wird, Mikrotröpfchen produziert werden, die in ein Härtungsbad fallen, welches aus einer Lösung entgegengesetzt geladener Ionen oder eines Polyelektrolyten besteht und das langsam gerührt wird. Der Vorteil dieser Systeme besteht in der Fähigkeit, die Oberfläche der Mikropartikel weiter zu modifizieren, indem diese mit polykationischen Polymeren wie Polylysin nach der Herstellung beschichtet werden. Mikropartikel-Partikel werden gesteuert, indem Extruder verschiedener Größe eingesetzt werden.
Additive zur Erleichterung der Mikropartikelbildung
Während der Synthese der bilderzeugendes Mittel enthaltenden Mikropartikel kann eine Vielzahl von oberflächenaktiven Mitteln zugesetzt werden. Beispiele für Emulgatoren oder oberflächenaktive Mittel, die verwendet werden können (0,15–5 Gew.%) umfassen die meisten physiologisch annehmbaren Emulgatoren. Beispiele umfassen natürliche und synthetische Formen von Gallensalzen oder Gallensäuren, beide konjugiert mit Aminosäuren und unkonjugiert, z. B. Taurodesoxycholat und Cholsäure.
Porenbildende Mittel können in einer Menge zwischen 0,01% und 90%, Gewicht zu Volumen, enthalten sein, um die Porenbildung zu verstärken. Bei der Sprühtrocknung, Lösungsmittelverdmapfung beispielsweise wird ein porenbildendes Mittel, z. B. ein flüchtiges Salz, beispielsweise Ammoniumbicarbonat, Ammoniumacetat, Ammoniumchlorid oder Ammoniumbenzoat oder ein anderes lyophilisierbares Salz, in Wasser gelöst. Die Lösung, die das porenbildende Mittel enthält, wird dann mit der Polymerlösung emulgiert, um Tröpfchen des porenbildenden Mittels im Polymer zu erzeugen. Diese Emulsion wird dann sprühgetrocknet oder durch ein Lösungsmittelverdampfungs/extraktionsverfahren geführt. Nachdem das Polymer präzipitiert ist, werden die gehärteten Mikropartikel gefroren und lyophilisiert, um die porenbildenden Mittel zu entfernen.
Mikropartikelgröße
In einer bevorzugten Ausführungsform für die Herstellung von injizierbaren Mikropartikeln, die geeignet sind, um durch das Lungenkapillarbett zu gehen, sollten die Mikropartikel einen Durchmesser zwischen etwa 1 und 10 μm haben. Größere Mikropartikel können das Lungenbett verstopfen und kleinere Mikropartikel können keine zufriedenstellende Echogenität liefern. Größere Mikropartikel sind zur Verabreichung auf anderen Wegen als Injektion, z. B. oral (zur Beurteilung des gastrointestinalen Trakts), zur Anwendung bei anderen mukosalen Oberflächen (rektal, vaginal, oral, nasal) oder durch Inhalation verwendbar. Die bevorzugte Partikelgröße zur oralen Verabreichung ist etwa 0,5 μm und 5 mm. Verwendbare pharmazeutisch annehmbare Träger umfassen Kochsalzlösung, wie Glycerin und TWEEN^TM 20 und isotonisches Mannit, das TWEEN^TM 20 enthält. Eine Partikelgrößenanalyse kann mit einem Coulter-Counter durch Lichtmikroskopie, Elektronenrastermikroskopie oder Transmissionselektronenmikroskopie durchgeführt werden.
Targeting
Die Mikropartikel können in spezifischer oder nicht-spezifischer Weise durch die Selektion des Polymers, das das Mikropartikel bildet, die Größe des Mikropartikel und/oder Einarbeitung oder Befestigung eines Liganden an den Mikropartikel targetiert werden. Beispielsweise können biologisch aktive Moleküle oder Moleküle, die die Ladung, die Lipophilität oder Hydrophilität des Partikel beeinflussen, an der Oberfläche des Mikropartikels befestigt sein. Zusätzlich können Moleküle an die Mikropartikel angeheftet werden, die eine Gewebeadhäsion minimieren oder die ein spezifisches Targeting der Mikropartikel in vivo erleichtern. Repräsentative Targeting-Moleküle umfassen Antibiotika, Lectine und andere Moleküle, die in spezifischer Weise durch Rezeptoren an der Oberflächen von Zellen eines besonderen Typs gebunden werden.
Inhibierung der Aufnahme durch RES
Die Aufnahme und die Entfernung der Mikropartikel kann durch die Selektion des Polymers und/oder den Einbau oder die Kopplung von Molekülen, die eine Adhäsion oder Aufnahme minimieren, ebenfalls minimiert werden. Beispielsweise kann die Gewebeadhäsion durch das Mikropartikel minimiert werden, indem Poly(alkylenglykol)-Gruppierung an die Oberfläche der Mikropartikel kovalent gebunden werden. Die Oberflächen-Poly(alkylenglykol)-Gruppierungen haben eine hohe Affinität für Wasser, das eine Proteinadsorption an der Oberfläche des Partikels verringert. Die Erkennung und Aufnahme des Mikropartikels durch das retikulo-endotheliale System (RES) wird daher verringert.
Beispielsweise kann die terminale Hydroxyl-Gruppe des Poly(alkylenglykols) verwendet werden, um biologisch aktive Moleküle oder Moleküle, die die Ladung, die Lipophilität oder Hydrophilität des Partikels beeinflussen, kovalent an die Oberfläche des Mikropartikels zu binden. Auf dem Fachgebiet verfügbare Verfahren können verwendet werden, um einen beliebigen eines weiten Bereichs von Liganden an die Mikropartikel zu binden, um so die Abgabeeigenschaften, die Stabilität oder andere Eigenschaften der Mikropartikel in vivo zu verstärken.
Diagnostische Anwendungen
Mikropartikel werden typischerweise mit einem pharmazeutisch annehmbaren Träger, zum Beispiel Phosphat-gepufferter Salzlösung oder Salzlösung oder Mannit kombiniert, dann wird eine wirksame Menge zur Detektion einem Patienten verabreicht, wobei ein geeigneter Weg, typischerweise durch Injektion in ein Blutgefäß (i. v.) oder oral, verwendet wird. Mikropartikel, die das eingekapselte, fluorierte Gas-Bilderzeugungsmittel enthalten, können bei der Gefäßabbildung sowie in Anwendungen, um Leber- und Nierenerkrankungen zu detektieren, in kardiologischen Anwendungen, beim Detektieren und Charakterisieren von Tumormassen und -gewebe und bei der Messung der peripheren Blutgeschwindigkeit eingesetzt werden. Die Mikropartikel können auch mit Liganden verknüpft werden, die eine Gewebeadhäsion minimieren oder die die Mikropartikel in vivo in spezifische Regionen des Körpers lenken.
Die Verfahren und die Zusammensetzungen, die oben beschrieben wurden, werden anhand der folgenden Beispiele besser verständlich werden.
Beispiel 1: Herstellung von Octafluorpropan-PEG-PLGA/PLGA-Mikropartikeln mit Lecithin
3,2 g PEG-PLGA (75:25) (IV = 0,75 dl/g Birmingham Polymers), 6,4 g PLGA (50:50) (IV = 4 dl/g, Henley Chemicals), 23 mg Lecithin (Spectrum Chemicals) und 193 mg Palmitinsäure (Spectrum Chemicals) wurden in 190 ml Methylenchlorid gelöst. 10,8 ml 0,70 g/ml Ammoniumacetat wurden zu der Polymerlösung gegeben und das Polymer/Ammoniumacetat wurde der Polymerlösung zugesetzt und das Polymer/Ammoniumacetat-Gemisch wurde mit 10 000 Upm für 1 Minute homogenisiert, wobei ein Virtis-Homogenisator verwendet wurde. Die Lösung wurde mit einer Strömungsgeschwindigkeit von 20 ml/min gepumpt und unter Verwendung eines Bucchi Lab-Sprühtrockners sprühgetrocknet. Die Einlaßtemperatur war 40°C. Das Mikropartikelpulver wurde gesammelt und 120 Stunden lang mit einem FTS-Platten-Lyophilisators lyophilisiert. Die Mikropartikel wurden in 5 ml Purform-Phiolen verteilt und mit Butylstöpsel versiegelt und gekräuselt. Die Phiolen wurden mit einem Druck von 10 psig mit Octofluorpropan gefüllt und kontinuierlich für 3 Minuten unter dem Gas gespült. Nach diesem Zeitpunkt wurden die Phiolen bis zur Verwendung bei 4°C gelagert. Die Partikeldurchmesser lagen im Bereich von 1 bis 10 μm, wenn eine Klassierung mit einem Coulter-Counter erfolgte, wobei der durchschnittliche Mittelwert 2,0 μm war. Durch Elektronenrastermikroskopie wurden bewiesen, daß die Partikel im allgemeinen sphärisch sind und glatte Oberflächen mit gelegentlichen Oberflächenspitzen haben.
Beispiel 2: Herstellung von Octafluorpropan-PEG-PLGA/PLGA-Mikropartikeln mit Dipalmitoylphosphatdidylcholin (DPPC)
Mikropartikel wurden wie in Beispiel 1 hergestellt, außer daß 29,6 mg Dipalmitoylphosphatidylcholin (Avanti, Birmingham, Al) anstelle von Lecithin verwendet wurden.
Beispiel 3: Herstellung von Octafluorpropan-PEG-PLGA/PLGA-Mikropartikeln mit Distearylphosphatidylcholin (DSPC)
Mikropartikel wurden wie in Beispiel 2 hergestellt, außer daß 29,9 mg Distearoylphosphatidylcholin (Avanti, Birmingham, Al) anstelle von Lecithin verwendet wurden.
Beispiel 4: Herstellung von Octafluorpropan-PEG-PLGA/PLGA-Mikropartikeln mit Diarachidoylphosphatidylcholin (DAPC)
Mikropartikel wurden wie in Beispiel 2 hergestellt, außer daß 29,9 mg Diarachidoylphosphatidylcholin (Avanti, Birmingham, Al) anstelle von Lecithin verwendet wurden.
Beispiel 5: In vitro-Messung von Mikropartikel-Rückstreuung
Die Rückstreuung verschiedener Octafluorpropan-enthaltender Polymermikropartikel, die in den Beispielen 1 bis 4 produziert worden waren, wurde erhalten, indem 10 μl Suspension der Mikropartikel einem fokussierten Ultraschallstrahl ausgesetzt wurden. Die rückgestreute akustische Energie wurde als Funktion der Tiefe in die Probe wie folgt bestimmt. Ein Pulsgeber-Empfänger (Panametrics^® Modell 5800) wurde verwendet, um einen fokussierten Ultraschallwandler (2,25 MHz) stoßzuerregen, der dann einen Ultraschallimpuls in die Suspension von Mikropartikel in physiologischer Salzlösung sendete.
Die Suspension war in einer zylindrischen Probenkammer (55 ml Kochsalzlösung) enthalten, die sich in einem temperaturkontrollierten Wasserbad, das auf 37°C eingestellt war, befand. Die Kammer wurde 1,5 Inch vom Wandler positioniert, so daß der Wandler auf das akustische Fenster der Kammer fokussiert war. Die Kammern wurden mit 15 Upm gedreht, um die Mikropartikel in Suspension zu halten. Der Gehalt an gelösten Gas wurde bei der Kochsalzlösung bei etwa 90% Luftsättigung gehalten, was durch ein Meßgerät für den nächsten Sauerstoff (Orion^® Modell 840) bestimmt wurde. Der Betrieb des akustischen Testsystems wird durch einen PC-kontrolliert, der mit einem eigenem Programm, geschrieben unter LabVIEW^® (National Instruments^®) betrieben wird. Der Computer löst den Pulsgeber-Empfänger aus, um den Ultraschallwandler Schock zu erregen.
Das rückgestreute Signal wurde durch denselben Wandler aufgenommen und das zurückgekehrte Signal wurde durch die Pulsgeber-Empfänger-Einheit verstärkt. Das verstärkte Signal wurde zu einem digitalen Oszilloskop (LeCroy^®, Modell 9310AM) für Digitalisierung mit 100 MSa/s geführt. Das digitalisierte Signal wurde weiter verarbeitet. Das Signal wurde quadriert, durch FFT analysiert und über die 6 dB-Bandbreite des Wandlers integriert. Die vom System gesammelten akustischen Daten wurden in die integrierte rückgestreute Energie (IBP), in willkürlichen Einheiten, als Funktion der Tiefe in die Mikropartikelsuspension integriert. Die IBP-vs-Tiefe-Daten aus 50 Impulsen wurden gemittelt, die am besten passende gerade Linie durch die gemittelten IBP-Daten bestimmt und es wurde der Y-Achsenabschnitt bestimmt, der proportional zum Rückstreuungskoeffizienten ist. Jede Probe wurde in 2,5 Minuten-Intervallen über einen Gesamtzeitraum von 10 Minuten untersucht.
Die Rückstreuung als Funktion der Zeit für die vier verschiedenen Mikropartikelchargen ist in 1 gezeigt. Lecithin ist ein Gemisch von Phospholipiden unterschiedlicher Kettenlänge. Wenn die Kettenlänge der Fettsäure, die an das Phosphocholin gebunden ist, erhöht wird, wird die Größenordnung der Rückstreuung über einen längeren Zeitraum aufrechterhalten, was eine erhöhte Löslichkeit des Octafluorpropans in den Mikropartikeln anzeigt. Die Verwendung der hochgereinigten Phospholipide ist bei der Stabilisierung des Gases im Vergleich zu Phospholipid-Gemischen, die im Lecitin enthalten sind, wirksamer.

Claims

Verfahren zur Herstellung von Mikropartikeln für die diagnostische Bilderzeugung, bei der Mikropartikel aus einem biokompatiblen Polymer gebildet werden und ein fluoriertes Gas eingeschlossen enthalten, wobei die Verbesserung folgendes umfasst (a) Einlagerung einer hydrophoben Verbindung in das Polymer entweder durch Lösen des Polymers und der hydrophoben Verbindung in einem organischen Lösungsmittel oder durch Schmelzen des Polymers mit der hydrophoben Verbindung vor der Bildung der Mikropartikel und (b) Bildung von Mikropartikeln entweder durch Entfernen des Polymerlösungsmittels oder Kühlen des Polymers, wobei die hydrophobe Verbindung mit dem Polymer im Mikropartikel in einer Menge gemischt wird, die eine Zunahme der Echogenität des Mikropartikels im Vergleich zur Echogenität des Mikropartikels ohne die hydrophobe Verbindung bewirkt, und wobei die hydrophobe Verbindung aus der Gruppe Fettsäuren, Fettsäurealkohole, Fettsäureanhydride, Hydroxyfettsäuren, Prostaglandine, Phospholipide, Sphingolipide, Cholesterin- und Steroidderivate, Vitamine, Terpene, Tryptophan, Tyrosin, Isoleucin, Leucin, Valin, Alkylparaben und Benzoesäure ausgewählt wird.
Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei die hydrophobe Verbindung mit dem Polymer in einem Verhältnis zwischen 0,01 und 30 des Gewichts der hydrophoben Verbindung zum Gewicht des Polymers gemischt wird.
Verfahren gemäß Anspruch 2, wobei die hydrophobe Verbindung ein Lipid ist und mit dem Polymer in einem Verhältnis zwischen 0,01 und 30 (Gewicht des Lipids/Gewicht des Polymers) gemischt wird.
Verfahren gemäß Anspruch 3, wobei das Lipid ein Phospholipid ist, das aus der Gruppe der Phosphatidsäuren, Phosphatidylcholinen mit sowohl gesättigten als auch ungesättigten Lipiden, Phosphatidylethanolaminen, Phosphatidylglyzerinen, Phosphatidylserinen, Phosphatidylinositolen, Lysophosphatidyl-Derivaten, Cardiolipin und β-Acyl-γ-Alkyl-Phospholipiden ausgewählt wird.
Verfahren gemäß Anspruch 4, wobei das Phospholipid aus der Gruppe Dioleoylphosphatidylcholine, Dimyristoylphosphatidylcholine, Dipentadecanoylphosphatidylcholine, Dilauroylphosphatidylcholine, Dipalmitoylphosphatidylcholine, Distearoylphosphatidylcholine, Diarachidoylphosphatidylcholine, Dibehenoylphosphatidylcholine, Ditricosanoylphosphatidylcholine, Dilignoceroylphatidylcholine und Phosphatidylethanolamine ausgewählt wird.
Verfahren gemäß Anspruch 5, wobei das Gas aus der Gruppe bestehend aus CF₄, C₂F₆, C₃F₈, C₄F₈, SF₆, C₂F₄ und C₃F₆ gewählt wird.
Verfahren gemäß Anspruch 6, wobei das Gas Octafluorpropan ist.
Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei die Mikropartikel aus einem synthetischen Polymer gebildet werden.
Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei die Mikropartikel aus einem natürlichen Polymer gebildet werden.
Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei die Mikropartikel aus einem bioadhesiven Polymer gebildet werden.
Verfahren gemäß Anspruch 8, wobei die Mikropartikel aus einem synthetischen Polymer gebildet werden, das aus der Gruppe Poly(hydroxysäuren), Polyanhydride, Polyorthoester, Polyamide, Polycarbonate, Polyalkylenterephthalate, Polyvinylester, Polyvinylhalogenide, Polysiloxane, Poly(Vinylacetate), Polystyrol, Polyurethane und deren Copolymeren, synthetische Zellulosen, Polyacrylsäuren, Poly(Buttersäure), Poly(Valeriansäure) und Poly(Lactid-Co-Caprolacton), Ethylenvinylacetat, Copolymere und Gemischen davon ausgewählt wird.
Zusammensetzung für die diagnostische Bilderzeugung, umfassend biokompatible Polymer-Mikropartikel in Form von Mikrokugeln, die ein fluoriertes Gas einschließen und durch folgende Schritte gebildet werden: (a) Lösen des Polymers und der hydrophoben Verbindung in einem organischen Lösungsmittel oder Schmelzen des Polymers und der hydrophoben Verbindung vor der Bildung der Mikropartikel, (b) Bildung der Mikropartikel durch Entfernen des Lösungsmittels oder Kühlen des Polymers, wobei die hydrophobe Verbindung mit dem Polymer im Mikropartikel in einer Menge gemischt wird, die eine Zunahme der Echogenität des Mikropartikels im Vergleich zur Echogenität des Mikropartikels ohne die hydrophobe Verbindung bewirkt, und wobei die hydrophobe Verbindung aus der Gruppe Fettsäuren, Fettsäurealkoholen, Fettsäureanhydride, Hydroxyfettsäuren, Prostaglandine, Phospholipide, Sphingolipide, Cholesterin- und Steroidderivate, Vitamine, Terpene, Tryptophan, Tyrosin, Isoleucin, Leucin, Valin, Alkylparaben und Benzoesäure ausgewählt wird.
Mikropartikel gemäß Anspruch 12, wobei die hydrophobe Verbindung mit dem Polymer in einem Verhältnis zwischen 0,01 und 30 des Gewichts der hydrophoben Verbindung zum Gewicht des Polymers gemischt ist.
Mikropartikel gemäß Anspruch 13, wobei die hydrophobe Verbindung ein Lipid ist und mit dem Polymer in einem Verhältnis zwischen 0,01 und 30 (Gewicht des Lipids/Gewicht des Polymers) gemischt ist.
Mikropartikel gemäß Anspruch 12, wobei das Lipid ein Phospholipid ist, das aus der Gruppe Phosphatidsäuren, Phosphatidylcholine mit sowohl gesättigten als auch ungesättigten Lipiden, Phosphatidylethanolamine, Phosphatidylglyzerine, Phosphatidylserine, Phosphatidylinositole, Lysophosphatidyl-Derivate, Cardiolipin und β-Acyl-γ-Alkyl-Phospholipiden ausgewählt ist.
Mikropartikel gemäß Anspruch 15, wobei das Phospholipid aus der Gruppe Dioleoylphosphatidylcholin, Dimyristoylphosphatidylcholin, Dipentadecanoylphosphatidylcholin, Dilauroylphosphatidylcholin, Dipalmitoylphosphatidylcholin, Distearoylphosphatidylcholin, Diarachidoylphosphatidylcholin, Dibehenoylphosphatidylcholin, Ditricosanoylphosphatidylcholin, Dilignoceroylphatidylcholin und Phosphatidylethanolamine ausgewählt ist.
Mikropartikel gemäß Anspruch 12, wobei das Gas aus der Gruppe bestehend aus CF₄, C₂F₆, C₃F₈, C₄F₈, SF₆, C₂F₄ und C₃F₆ ausgewählt ist.
Mikropartikel gemäß Anspruch 17, wobei das Gas Octafluorpropan ist.
Mikropartikel gemäß Anspruch 12, wobei die Mikropartikel aus einem synthetischen Polymer gebildet sind.
Mikropartikel gemäß Anspruch 19, wobei das Polymer aus der aus Poly(hydroxysäuren), Polyanhydride, Polyorthoester, Polyamide, Polycarbonate, Polyalkylenterephthalate, Polyvinylalkohole, Polyvinylether, Polyvinylester, Polyvinylhalogenide, Polysiloxane, Poly(Vinylacetat), Polystyrol, Polyurethan und deren Copolymere, synthetischen Zellulosen, Polyacrylsäuren, Poly(Buttersäure), Poly(Valeriansäure) und Poly(Lactid-Co-Caprolacton), Ethylenvinylacetat, Copolymere und Gemische davon bestehenden Gruppe ausgewählt ist.
Mikropartikel gemäß Anspruch 14, wobei das Lipid zur Bildung der Mikropartikel mit dem Polymer verflüssigt ist.
Mikropartikel gemäß Anspruch 21, wobei das Lipid und das Polymer in einem für beide geeigneten Lösungsmittel gelöst und dann zu Mikropartikeln geformt sind.
Mikropartikel gemäß Anspruch 21, wobei das Gas mit dem Mikropartikel gemischt wird, nachdem das Polymer und das Lipid sich verfestigt haben.
Mikropartikel gemäß Anspruch 12, wobei das Polymer ein natürliches Polymer ist und aus der Gruppe Proteine und Polysaccharide ausgewählt wird.