DE69732360T2 - Plasmide dna reinigung durch peg-fällung und säulen-chromatographie - Google Patents

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Description

  • Gebiet der Erfindung
  • Die vorliegende Erfindung betrifft Verfahren zur Reinigung von Plasmid-DNA während der Säulenchromatographie, insbesondere großtechnische Verarbeitung von Plasmid-DNA, die zur Verwendung als ein Biopharmazeutikum bei Gentherapie und Genimmunisierung geeignet ist.
  • Hintergrund der Erfindung
  • Alle hierin zitierten Verweise sind hiermit durch Verweis ausdrücklich aufgenommen. Herkömmliche Verfahren zur Isolierung von Plasmid-DNA aus mikrobiellen Zellen sind nur für kleintechnische Herstellung oder Herstellung im Labormaßstab geeignet. Ein weitgehend eingesetztes Verfahren umfasst alkalische Zelllyse und Acetat-Neutralisierung von Plasmid-hältigen bakteriellen Zellen, was zum Niederschlag von genomischer Wirts-DNA und Proteinen führt, die mittels Zentrifugation entfernt werden. Die verbleibende Plasmid-DNA wird mit Ethanol gefällt und Cäsiumchlorid/Ethidiumbromid-Dichtegradientenzentrifugation unterzogen. Ethidiumbromid trennt die Plasmid-DNA in superspiralisierte, unverzweigte und genickte ringförmige Formen auf, und die erwünschte Form wird gesammelt. Verbleibendes Ethidiumbromid wird durch Extraktion mit Butanol entfernt, und die DNA wird mit Ethanol gefällt. Wirtszellenproteine werden durch wiederholte Phenolextraktion entfernt, woraufhin DNA-Fällung und wiederholte Isoamylalkohol/Chloroform-Extraktionen erfolgen, um das Phenol zu entfernen.
  • Diese üblichen Laborverfahren, die verwendet werden, um Plasmid-DNA zu isolieren und reinigen, sind für Herstellungsverfahren nicht geeignet. Ebenfalls ungeeignet sind sie zur Herstellung von Plasmid-DNA zur Verwendung als ein Biopharmazeutikum in Gentherapien oder Genimmunisierung. Dichtegradientenzentrifugationen können nicht an großtechnische Anwendungen angepasst werden; Ethidiumbromid ist ein bekanntes Mutagen; Phenol ist eine starke Chemikalie; und das Verfahren ist sehr arbeitsintensiv.
  • Jüngste Anstrengungen, rekombinante Plasmid-DNA großtechnisch zu reinigen, konzentrierten sich auf differenzielles Ausfällen unter Verwendung von Polyethylenglykol (PEG), gefolgt von Ionenaustausch- und/oder Größenausschlusschromatographie. Horn et al., Hum. Gene Ther. 6, 565–573 (1995); PCT-Anmeldung Nr. WO 95/21250. Die Ausbeute von Plasmid-DNA unter Verwendung dieses Verfahrens liegt typischerweise bei etwa 50%. Die PCT-Anmeldung Nr. WO 96/02658 offenbart großtechnische Plasmid-DNA-Reinigung, umfassend Bakterienzelllyse, Anionenaustauschchromatographie und Umkehrphasen-Hochdruckflüssigchromatographie (HPLC). Ein massives Problem der Chromatographiereinigung von Plasmid-DNA ist jedoch, dass sich das erwünschte Produkt in einem breiten Schmier herauslöst und nicht in einem scharfen Peak und im Durchfluss erscheint, was die Isolierung von Lysatkomponenten unterbindet.
  • Verschiedene Mittel, umfassend Polyethylenglykol (PEG), dreiwertige Kationen (z.B. Hexammincobalt(III), Spermidin), Alkohol und Polyvinylpyrrolidon, fördern die Kondensation von DNA-Molekülen von einem gestreckten spiralförmigen Zustand zu einem verdichteten globularen Zustand. Yoshikawa et al., J. Am. Chem. Soc. 118, 929–930 (1996); Minagawa et al., Biopolymers 34, 555–558 (1994); Arscott et al., Biopolymers 30, 619–630 (1990); und Lerman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 68, 1886–1890 (1971). Die Fähigkeit von Polyethylenglykol, DNA-Moleküle zu kondensieren, scheint bei Konzentrationen von 1,9–10,0 M PEG aufzutreten (Minagawa et al.), wobei der Umwandlungspunkt bei 6,0 M liegt (Yoshikawa et al.). Das heißt, dass bei geringen Konzentrationen von PEG DNA-Moleküle im Zustand gestreckter Spiralen bleiben, während sie sich bei hohen Konzentrationen zu kleinen kugelförmigen Konformationen zusammenziehen (Minagawa et al.).
  • Es besteht Bedarf an einem Verfahren zur Reinigung von Plasmid-DNA während Säulenchromatographie. Dieser Bedarf ist hinsichtlich des Erfordernisses von groß technischen Mengen an Plasmid-DNA, die ausreichende Reinheit aufweist, um als Wirkstoff oder Vakzine zur Gentherapie oder Genimmunisierung verwendet zu werden, besonders dringlich. Die vorliegende Erfindung wird diesem Bedarf gerecht.
  • Zusammenfassung der Erfindung
  • Die Erfindung stellt ein Verfahren zur Reinigung von Plasmid-DNA aus mikrobiellen Zellen, die diese Plasmid-DNA enthalten, bereit, wobei das Verfahren Folgendes umfasst:
    • (a) die Herstellung eines Zelllysats;
    • (b) die Gewinnung der Plasmid-DNA aus Zelltrümmern;
    • (c) das Resuspendieren der Plasmid-DNA in einem ein Kondensationsmittel enthaltenden Puffer;
    • (d) die Durchführung von Chromatographie zur Reinigung der Plasmid-DNA, umfassend das Auftragen des Plasmid-DNA enthaltenden Puffers auf eine mit dem Puffer äquilibrierte chromatographische Matrix, wobei die Matrix aus der aus einer Ionenaustauschchromatographie-Matrix, Größenausschlusschromatographie-Matrix, Chromatofokussierungs-Matrix, Affinitätschromatographie-Matrix, Hydrophob-chromatographie-Matrix und Umkehrphasenchromatographie-Matrix bestehenden Gruppe ausgewählt ist.
  • Detaillierte Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen
  • Die vorliegende Erfindung stellt Verfahren zur Reinigung von Plasmid-DNA während Säulenchromatographie bereit. Ein kurzkettiger polymerer Alkohol, vorzugsweise Polyethylenglykol, oder ein anderes DNA-Kondensationsmittel wird vor der Säulenchromatographie einer DNA-Probe zugesetzt. Der kurzkettige polymere Alkohol oder das Kondensationsmittel unterstützt verbesserte Isolierung von Plasmid-DNA und kann zur großtechnischen Reinigung, insbesondere zur Herstellung von Plasmid-DNA als ein Biopharmazeutikum, verwendet werden.
  • Ein zentrales Problem bei der Chromatographiereinigung von Plasmid-DNA aus Wirtszellenkontaminanten ist, dass das erwünschte Produkt in einem breiten Schmier und nicht in einem scharfen Peak eluiert und im Durchfluss erscheint, wodurch das Isolieren der Plasmid-DNA aus diesen Kontaminanten unmöglich gemacht wird. Die Verfahren der vorliegenden Erfindung stellen eine Lösung für dieses Problem bereit. In Gegenwart eines kurzkettigen polymeren Alkohols, wie beispielsweise Polyethylenglykol (PEG), oder eines anderen DNA-Kondensationsmittels eluiert Plasmid-DNA in einem scharten Peak und erscheint nicht im Durchfluss, wodurch Reinigung erleichtert und höhere Ausbeuten ermöglicht werden.
  • Ohne hier auf eine bestimmte Theorie beschränkt zu sein, kann das gleichförmige Binden von Plasmid-DNA an eine Chromatographiesäule aus der Kondensation von DNA in gestrecktem spiralisiertem Zustand zu einem verdichteten globularen Zustand resultieren. Plasmid-DNA existiert in Form eines Gemischs superspiralisierter, genickter und linearisierter Formen. Beim Auftragen einer DNA-Probe auf eine Ionenaustauschsäule können die verschiedenen Plasmid-DNA-Spezies dadurch sichtbar gemacht werden, da sie sich an die chromatographische Matrix auf heterogene Weise und mit verschiedenen relativen Bindungskonstanten binden. Die Kondensation von gestreckten Spiralen zu verdichteten Kugelformen kann für verstärktes Binden an die Anionenaustauschmatrix auf homogenere Weise und mit ähnlichen Bindungskonstanten verantwortlich sein. Von verschiedenen DNA-Kondensationsmitteln wird demgemäß angenommen, dass sie die Reinigung von Plasmid-DNA mittels der vorliegenden chromatographischen Verfahren erleichtern.
  • Eine andere Theorie, die das verstärkte Binden von DNA an Chromatographiesäulen in Gegenwart von Polyethylenglykol erklären könnte, bezieht sich auf den Einfluss von hydrophoben Wechselwirkungen auf Konformationsformen. Die Unterbrechung von hydrophoben Wechselwirkungen durch verschiedene Mittel können es ermöglichen, dass DNA-Moleküle Konformationsformen annehmen, die das Binden an eine chromatographische Matrix auf gleichmäßigere Weise und mit ähnlichen Bindungskonstanten erleichtern. Chemische Reagenzien, die hydrophobe Wechselwirkungen vermitteln, werden demzufolge als ebenfalls nützlich für die vorliegende Erfindung erachtet.
  • Die Verwendung von kurzkettigen polymeren Alkoholen wie Polyethylenglykol und anderen Kondensationsmitteln, damit sich die Plasmid-DNA zu Reinigungszwecken homogen verhält, ist nicht auf Ionenaustauschchromatographie beschränkt. Sie erstreckt sich auch auf andere chromatographische Verfahren, umfassend Größenausschlusschromatographie, Chromatofokussierung, Affinitätschromato-graphie, Hydrophobchromatographie und Umkehrphasenchromatographie.
  • Die Verfahren der vorliegenden Erfindung sind in der Lage, zahlreiche Vorteile bereitzustellen, umfassend höhere Produktgewinnung von Plasmid-DNA. Die Ausbeute an DNA kann sich unter Verwendung dieser Verfahren bereits beim Chromatographieschritt auf bis zu 90% belaufen. Darüber hinaus kann diese Erfindung an die Herstellung großtechnischer Mengen an Plasmid-DNA mit ausreichender Reinheit zur Verwendung für Anwendung beim Menschen angepasst werden.
  • Plasmid-DNA wird aus mikrobiellen Zellen isoliert. Fachleuten wird selbstverständlich bekannt sein, dass zahlreiche verschiedene mikrobielle Zellen zur Verwendung in den Verfahren der vorliegenden Erfindung geeignet sind, umfassend Hefezellen und Bakterienzellen. Eine bevorzugte mikrobielle Fermentation ist die Bakterienfermentation. Eine bevorzugte Bakterienfermentation ist die Fermentation von E.-coli-Zellen. Die mikrobielle Fermentation kann in jedem beliebigen flüssigen Medium erfolgen, das für das Wachstum der verwendeten Bakterien geeignet ist.
  • Das durch die Verfahren der vorliegenden Erfindung zu reinigende DNA-Plasmid kann jedes beliebige extrachromosomale DNA-Molekül sein. Fachleuten wird bekannt sein, dass die Plasmide im Grunde jede beliebige Größe oder Eigenschaft aufweisen können. Die Plasmide können Plasmide mit hoher Kopienzahl, mit niedriger Kopienzahl oder Überlaufplasmide sein. Sie können eine Reihe von genetischen Elementen enthalten, die selektierbare Gene, Polylinker, Replikationsstartpunkte, Pro motoren, Enhancer, Leader-Sequenzen, Polyadenylierungsstellen und Terminationssequenzen umfassen. Die Plasmide können für menschliche Gene praktisch jeden Ursprungs sowie für Tiergene kodieren.
  • Die Plasmid-DNA enthaltenden mikrobiellen Zellen werden zuerst aus dem Fermentationsmedium geerntet, um eine Zellpaste zu bilden. Jedes herkömmliche Mittel zur Ernte von Zellen aus einem flüssigen Medium ist geeignet. Solche Mittel umfassen Zentrifugation, Filtration und Sedimentation.
  • Als nächster Schritt folgt Zelllyse. Typischerweise werden die Zellen in Puffer resuspendiert. Die Erfinder empfehlen nicht, die Zellen enzymatisch zu behandeln, um Zellwände zu schwächen, da die tierischen Enzyme, die verwendet werden müssten, Tierviren in sich tragen können, die menschliche Empfänger all der Plasmid-DNA-Produkte, die mittels dieser Verfahren gewonnen werden, infizieren würden. Die Zellen werden stattdessen vorzugsweise unter Verwendung von verdünnter Base und Detergens lysiert. Das resultierende Lysat wird dann angesäuert, um chromosomale DNA und Wirtsproteine zu fällen.
  • Zelltrümmer und andere Verunreinigungen werden in einem nächsten Schritt mittels Standardverfahren wie beispielsweise Zentrifugation, Filtration oder Sedimentation entfernt. Die Erfinder klären den resultierenden Überstand durch Filtration mit Diatomeenerde. Filtration mit Diatomeenerde reduziert gleichzeitig auch die Konzentration von Wirts-RNA bezogen auf den Überstand.
  • Hiernach kann Plasmid-DNA aus dem geklärten Filtrat mittels eines Fällmittels unter geeigneten Bedingungen gefällt, gesammelt und in einem Puffer resuspendiert werden. Weiters werden Wirts-RNA, Proteine und Lipopolysaccharide im Gegensatz zur Plasmid-DNA mit einem Fällmittel unter für diesen Zweck geeigneten Bedingungen gefällt. Schließlich wird das Filtrat gesammelt und die Plasmid-DNA neuerlich unter Verwendung eines Fällmittels unter dafür geeigneten Bedingungen gefällt. Daraufhin folgt Säulenchromatographie.
  • Das DNA-Pellet wird vor der Säulenchromatographie in Säulenpuffer resuspendiert. Dieser Puffer enthält Polyethylenglykol oder andere DNA-Kondensationsmittel entweder alleine oder in Kombination. Typischerweise liegt die Konzentration von PEG in der DNA-Lösung im Bereich von oder von etwa 0,1% (Gew./Vol.) bis oder bis etwa 4% (Gew./Vol.), vorzugsweise bei etwa 1% (Gew./Vol.). Beträgt die PEG-Konzentration weniger als etwa 0,1% (Gew./Vol.), so tritt keine Verstärkung der Plasmid-DNA-Bindung auf. Beträgt die PEG-Konzentration mehr als etwa 4% (Gew./Vol.), so beginnt die DNA aus der Lösung auszufallen. Für PEG-8000 entspricht dieser Bereich von oder von etwa 0,1% bis oder bis etwa 4% einer molaren Konzentration von 1,7 × 10–4 M und 6,7 × 10–3 M.
  • Plasmid-DNA wird auf eine Anionenaustauschsäule aufgetragen, die in demselben Puffer wie die DNA-Probe äquilibriert ist. Zahlreiche verschiedene erhältliche Anionenaustausch-Matrizen sind für die Verwendung in der vorliegenden Erfindung geeignet, umfassend jene, die bei POROS Anion Exchange Resins, Qiagen, Toso Haas, Sterogene, Spherodex, Nucleopac und Pharmacia erhältlich sind, jedoch nicht darauf beschränkt. Die Säule wird mit mehreren Bettvolumina des Puffers gewaschen. Der Durchfluss-Peak enthält praktisch keine Plasmid-DNA, was auf beinahe vollständige DNA-Bindung an die Säulenmatrix hinweist. Im Gegensatz dazu ist Plasmid-DNA im Durchfluss vorhanden, wenn Puffer ohne Polyethylenglykol verwendet wird.
  • Plasmid-DNA wird mit einem einzigen Verfahrensschritt der Salzelution in einem Polyethylenglykol-hältigen Puffer aus der Säule herausgelöst. Säulenfraktionen werden auf Plasmid-DNA mittels Agarosegel-Elektrophorese analysiert. Fraktionen, die Plasmid-DNA enthalten, werden gesammelt, gefällt, resuspendiert und auf eine Gelfiltrationssäule zur weiteren Verarbeitung aufgetragen. Schließlich wird die mittels einer Säule gereinigte DNA auf Endformulierung, Sterilfüllung und Endbearbeitung vorbereitet.
  • Das Elutionsprofil aus der Ionenaustauschsäule stimmt für verschiedene DNA-Präparate überein. Dieser Erfolg erstreckt sich auf großtechnische DNA-Präparate, wie sie im nachstehenden Beispiel 4 beschrieben werden. Somit werden reproduzierbare Chromatographiereinigungen erreicht, wenn ein DNA-Kondensationsmittel im Säulenpuffer vorhanden ist.
  • Es wird die Verwendungen von zahlreichen DNA-Kondensationsmitteln im vorliegenden Verfahren erwogen. Solche Mittel umfassen kurzkettige polymere Alkohole mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen (z.B. Polyethylenglykol), dreiwertige Kationen (z.B. Hexammincobalt(III), Spermidin), kurzkettige Alkohole (z.B. Methanol, Ethanol, Isopropanol) und andere Polymere (z.B. Polyvinylpyrrolidon), sind jedoch nicht darauf beschränkt. Obwohl Polyethylenglykol mit einem mittleren Molekulargewicht von etwa 7.000 bis 9.000 für die Verwendung in der vorliegenden Erfindung bevorzugt ist und PEG-8000, ein Polyethylenglykol mit einem mittleren Molekulargewicht von 8.000, besonders bevorzugt ist, werden auch Polyethylenglykole mit einem anderen mittleren Molekulargewicht erwogen. Diese umfassen beispielsweise PEG-200, PEG-500, PEG-1000, PEG-8000 und PEG 10.000. Geeignete Auswahl und Mengen eines bestimmten DNA-Kondensationsmittels zur Verwendung in den hierin beschriebenen Verfahren kann von durchschnittlichen Fachleuten leicht bestimmt werden, beispielsweise durch Durchführen der in den Beispielen 1–5 beschriebenen Experimente und Anwenden wissenschaftlicher Verfahren zum Testen von Variablen während der Durchführung von Kontrollen.
  • Plasmid-DNA wurde mittels Bakterienzelllyse und Säulenchromatographie wie in den folgenden Beispielen beschrieben isoliert.
  • Beispiel 1
  • Kleintechnische Bakterienzelllyse und Plasmidgewinnung
  • Etwa 50 g VCL-1005G/A enthaltende E.-coli-Zellen wurden verwendet. Die Plasmid-DNA VCL-1005G/A war von einem pBR322-Plasmid abgeleitet. Sie wies eine Größe von etwa 5.000 bp auf. Sie exprimierte das Gen, das für das Kanamycin-Resistenzprotein (Tn903) kodierte. Es kodierte auch für die schweren (menschliche HLA-B7-cDNA) und leichten (Schimpansen-β-2-Mikroglobulin-cDNA) Proteine eines Haupthistokompatibilitätskomplexes der Klasse 1 mit der Bezeichnung HLA-B7. Diese zwei Proteine wurden in einer bi-cistronischen mRNA exprimiert. Eukaryotische Zelltranskription dieser mRNA hing von einer Rous-Sarkomvirus-Promotorsequenz, abgeleitet von der langen terminalen 3'-Wiederholung, und von einer Transkriptionsterminations/Polyadenylierungs-Signalsequenz, abgeleitet vom Rinder-Wachstumshormongen, ab. Eukaryotische Zellexpression der Schwerkette wurde durch den 5'-Cap-abhängigen Proteintranslationsausgangspunkt reguliert. Expression der Leichtkette wurde durch eine Cap-unabhängige Translations-Enhancer(CITE-)Sequenz, abgeleitet vom Encephalomyocarditis-Virus, reguliert. Replikation des Plasmids in Bakterienzellen wurde durch die Gegenwart eines bakteriellen Replikationsstartpunkts gesteuert.
  • Die Plasmid-DNA enthaltenden Zellen wurden in 300 ml 10 mM Tris-HCl, pH 8,0, 61 mM Glucose, 50 mM EDTA resuspendiert. Lyse trat nach dem Zusatz von 600 ml 0,2 N NaOH, 1% SDS und 8-minütiger Inkubation ein. Zelltrümmer wurden mit 450 ml 3 M Kaliumacetat, pH 5,0, gefällt, woraufhin 8-minütige Inkubation folgte. Im Lysat zurückgebliebene Zelltrümmer wurden durch Zusatz von 130 g Celite Hyflo Super Cel (mit Flussmittel kalziniert) (Celite Corp., Lompoc, CA) gefolgt von Durchführen durch eine mit Celite vorbeschichtete A/E-Filterscheibe (Gelman Sciences, Ann Arbor, MI) in einem Büchner-Filter unter Vakuum entfernt. Das Filtrat wurde durch eine Whatman-Filterschale Nr. 4 durchgeführt, um jegliche Feinstoffe zu entfernen, woraufhin 30% PEG in 1,6 M NaCl zu einer Endkonzentration von 8% PEG zugesetzt wurde, um Plasmid-DNA zu fällen. Die Probe wurde über Nacht bei 4–8°C gerührt.
  • Plasmid-DNA wurde durch 40-minütige Zentrifugation bei 6.000 × g gesammelt. Das Pellet wurde 10 Minuten lang getrocknet und in 50 ml TE-Puffer (10 mM Tris-HCl, pH 8,0, 1 mM EDTA) resuspendiert. Ein gleiches Volumen 5 M Ammoniumacetat wurde der Probe zugesetzt, woraufhin 15 Minuten lang Inkubation auf Eis folgte. Die Probe wurde bei 2.000 × g 30 Minuten lang zentrifugiert. Plasmid-DNA im Überstand wurde durch Zusatz von 0,6 Volumina von –20°C kaltem Isopropanol gefällt. Nach einer 2-stündigen Inkubation bei –20°C wurde die Probe bei 2.000 × g 30 Minuten lang zentrifugiert. Das DNA-Pellet wurde 10 Minuten lang getrocknet und in 30 ml TE, das 0,15 M NaCl enthielt, resuspendiert.
  • Plasmid-DNA wurde sowohl in Anwesenheit als auch in Abwesenheit von PEG wie nachstehend beschrieben Anionenaustauschchromatographie unterzogen.
  • Beispiel 2
  • Anionenaustauschchromatographie
  • Die 30-ml-Plasmid-DNA-Probe, die gemäß Beispiel 1 hergestellt worden war, wurde geteilt. Einer der beiden Proben wurde festes PEG-8000 zu einer Endkonzentration von 1% (Gew./Vol.) zugesetzt. PEG-8000 wurde der anderen 15-ml-Probe nicht zugesetzt. Eine Q-SEPHAROSETM-Fast-Flow-Anionenaustauschsäule (Pharmacia, Piscataway, NJ) (5,0 × 5,0 cm) wurde unter Verwendung des Pharmacia-BioPilotTM-Systems unter Druck gepackt. Die Säule wurde entweder mit Puffer A (10 mM Tris-HCl, pH 8,0, 0,7 M NaCl, 1 mM EDTA), der 1% PEG-8000 enthielt, oder mit Puffer A äquilibriert. Beide 15-ml-Aliquoten wurden einzeln auf die BioPilot-Superloop geladen. Nachdem die PEG-hältige Probe geladen worden war, wurde eine Waschung mit 4 Bettvolumina PEG-hältigen Puffer A durchgeführt. Nachdem die Kontrollprobe (ohne PEG) geladen worden war, wurde ein Waschschritt mit 4 Bettvolumina Puffer A durchgeführt. Der Durchfluss-Peak wurde gesammelt und zur Analyse auf einem Agarosegel aufbewahrt. Anschließend wurde die DNA mit vier Bettvolumina von 100% Puffer B (10 mM Tris-HCl, pH 8,0, 1 mM EDTA), der 1% PEG-8000 enthielt, für die PEG-hältige DNA-Probe oder mit Puffer B (ohne PEG) für die Kontroll-DNA-Probe eluiert. 50-ml-Fraktionen wurden gesammelt. Sowohl der Durchfluss als auch die Fraktionen, die nach dem Waschen mit Puffer B eluierten, wurden mittels Elek trophorese auf einem 0,8%igen Agarosegel in Gegenwart von Ethidiumbromid analysiert.
  • Die Resultate wiesen darauf hin, dass in Gegenwart von 1% PEG-8000 beinahe die gesamte DNA-Probe an der Säule zurückgehalten wurde und praktisch keine DNA im Durchfluss vorhanden war. Im Gegensatz dazu trat in Abwesenheit von PEG-8000 signifikantes Austreten von Plasmid-DNA von der Säule auf, worin Plasmid-DNA im Durchfluss mit verschiedenen Kontaminanten eluierte, was darauf hinwies, dass keine vollständige Bindung von DNA erreicht worden war. Die Gegenwart von PEG-8000 verbesserte die Gewinnung von Plasmid-DNA von nur 20% auf im Allgemeinen 80%.
  • Großtechnische Plasmid-Reinigung wurde wie nachstehend beschrieben durchgeführt.
  • Beispiel 3
  • Großtechnische Bakterienzelllyse und Plasmidgewinnung
  • 500 g VCL-1005G/A enthaltende Zellen wurden in einem elektrolytisch polierten ASME-316T-Druckgefäß mit 8 Gallonen Volumen lysiert. Die Zellen wurden in 3 l 10 mM Tris-HCl, pH 8,0, 61 mM Glucose, 50 mM EDTA resuspendiert. Lyse trat nach Zusatz von 6 l 0,2 N NaOH, 1% SDS und 8-minütiger Inkubation ein. Zelltrümmer wurden mit 4,5 l 3 M Kaliumacetat, pH 5,0, gefällt, woraufhin 8-minütige Inkubation folgte. Zelltrümmer im Lysat wurden durch Zusatz von 675 g Celite Hyflo Super Cel (mit Flussmittel kalziniert), gefolgt von Druckfiltration durch einen korrosionsbeständigen Cuno-8ZP1P-316T-Patronenhalter, der eine 7-Zell-SP50-Patrone (CUNO, Inc., Meriden, CT) enthielt, entfernt. Das geklärte Lysat wurde eingeengt, und Pufferaustausch erfolgte unter Verwendung einer 6-FT2-PTQK-TFF-Patrone (Millipore Corp., Bedford, MA). Eine 701S-Pumpe (Watson Marlow, Inc., Wilmington, MA) wurde bei einer Durchflussgeschwindigkeit von 4 l/min (wobei der Schlauch ein 3/8'' ID Masterflex Pharmed war) verwendet. Einer sechsfachen Volumenreduktion folgte Diafiltration mit zwei Volumina 10 mM Tris, pH 8,0, 0,1 mM EDTA.
  • Plasmid-DNA wurde durch Zusatz von 30% PEG-8000 in 1,6 M NaCl zu einer Endkonzentration von 8% über Nacht bei 4°C unter sanftem Rühren aus dem geklärten Lysat gefällt. Plasmid-DNA wurde durch 40-minütige Zentrifugation bei 6.000 × g unter Verwendung einer Jouan-KR4-22-Zentrifuge gesammelt. Die pelletierte Plasmid-DNA wurde in 400 ml TE resuspendiert, woraufhin Zusatz eines gleichen Volumens an 5 M Ammoniumacetat folgte. Die Lösung wurde sorgfältig vermischt und auf Eis 15 Minuten lang inkubiert, woraufhin 20-minütige Zentrifugation bei 6.000 × g folgte. Plasmid-DNA wurde aus dem Überstand durch Zusatz von 0,6 Volumina –20°C kaltem 2-Propanol (Optima-Grade) (Fisher) gefällt. Nach mindestens 2 Stunden Inkubation bei –20°C wurde die gefällte DNA bei 6.000 × g 20 Minuten lang unter Verwendung einer Jouan-KR4-22-Zentrifuge pelletiert. Das Pellet wurde in 300 ml Puffer A, der 1% PEG-8000 enthielt, resuspendiert. Die End-Plasmid-DNA-Konzentration, die durch Absorption bei 260 nm bestimmt wurde, belief sich auf etwa 4 mg/ml, und die Gesamtmenge an Nucleinsäure betrug 1,3 g.
  • Plasmid-DNA wurde Anionenaustauschchromatographie wie nachstehend beschrieben unterzogen.
  • Beispiel 4
  • Anionenaustauschchromatographie
  • Eine Pharmacia-BPG-100/500-Säule wurde unter Verwendung des Pharmacia-BioPilotTM-Systems gemäß den Anweisungen des Herstellers unter Druck gepackt. Die Endsäulendimensionen beliefen sich auf 10 × 13 cm, was ein Bettvolumen von etwa 1.000 ml ergab. Die Säule wurde mit vier Volumina von Puffer A, der 1% PEG-8000 enthielt, bei einer Durchflussgeschwindigkeit von 35 ml/min äquilibriert. Die partiell gereinigte Plasmid-DNA, hergestellt gemäß Beispiel 3, wurde durch ein steriles 0,45-μm-Acrodisc-Spritzenfilter (Gelman Sciences) durchgeführt und in die BioPilot- Superloop geladen. Nachdem die Probe auf die Säule geladen worden war, wurde ein Waschschritt mit 3 Bettvolumina Puffer A durchgeführt. Der Durchfluss-Peak wurde in einer 2-l-Rollflasche gesammelt und zur Gelanalyse aufbewahrt. Die DNA wurde anschließend mit zwei Bettvolumina von 100% Puffer B, der 1% PEG-8000 enthielt, für zwei zusätzliche Bettvolumina aus der Säule eluiert. Fraktionen (45 ml) wurden nach dem Schritt mit 100% Puffer B gesammelt. Nach der Chromatographie wurde die Säule mit einem Säulenvolumen 2 M NaCl, gefolgt von zwei Säulenvolumina 1 M NaOH gewaschen. Fraktionen und Durchfluss wurden durch Elektrophorese auf einem 0,8%igen Agarosegel analysiert, und Fraktionen, die Plasmid-DNA enthielten, wurden gesammelt und mit 0,6 Volumina kaltem 2-Propanol gefällt.
  • Ähnlich den in Beispiel 2 erhaltenen Ergebnissen war im Grunde keine Plasmid-DNA im Durchfluss vorhanden. Plasmid-DNA eluierte nur nach Anwendung des Salzgradienten-Schritts (Puffer B).
  • Die Plasmid-DNA, die durch Anionenaustauschchromatographie in Gegenwart von 1% PEG-8000 erhalten worden war, wurde durch Gelfiltrationschromatographie wie nachstehend beschrieben gereinigt.
  • Beispiel 5
  • Gelfiltrationschromatographie
  • Eine Pharmacia-BPG-100/950-Gelfiltrationssäule wurde mit SEPHACRYLTM S-1000 unter Verwendung des BioPilot-Systems unter Druck gepackt. Die Endsäulendimensionen betrugen 10 × 85 cm bei einem Bettvolumen von etwa 6,5 l. Die mit Isopropanol gefällte Plasmid-DNA aus Beispiel 4 wurde mittels 20-minütiger Zentrifugation bei 6.000 × g gesammelt, in 10 mM Tris, pH 8,0, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA resuspendiert und durch ein steriles 0,22-μm-Celluloseacetat-Acrodisc-Spritzenfilter durchgeführt. Die DNA wurde auf die Säule geladen. Der Säulen-Laufpuffer war 10 mM Tris, pH 8,0, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, und die Durchflussgeschwindigkeit betrug 8 ml/min. Fraktionen (45 ml) wurden gesammelt und durch 0,8%ige Agarosegel- Elektrophorese analysiert. Fraktionen, die vorwiegend superspiralisierte DNA enthielten, wurden gesammelt und mit zwei Volumina kaltem Ethanol gefällt.
  • Es gilt anzumerken, dass die vorliegende Erfindung nicht auf jene in der detaillierten Beschreibung erläuterten Ausführungsformen beschränkt ist. Jede Ausführungsform, die die der Erfindung zugrunde liegende Idee in sich trägt, sollte als eine im Rahmen des Schutzumfangs liegende Umsetzung erachtet werden. Die Erfindung ist daher ausschließlich durch den Schutzumfang der beiliegenden Ansprüche eingeschränkt.

Claims (10)

  1. Verfahren zur Reinigung von Plasmid-DNA aus diese Plasmid-DNA enthaltenden mikrobiellen Zellen, umfassend: (a) die Herstellung eines Zelllysats; (b) die Gewinnung der Plasmid-DNA aus Zelltrümmern; (c) das Resuspendieren der Plasmid-DNA in einem ein Kondensationsmittel enthaltenden Puffer; (d) die Durchführung von Chromatographie zur Reinigung der Plasmid-DNA, umfassend das Auftragen des Plasmid-DNA enthaltenden Puffers auf eine mit dem Puffer äquilibrierte chromatographische Matrix, wobei die Matrix aus der aus einer Ionenaustauschchromatographie-Matrix, Größenausschlusschromatographie-Matrix, Chromatofokussierungs-Matrix, Affinitätschromatographie-Matrix, Hydrophobchromatographie-Matrix und Umkehrphasenchromatographie-Matrix bestehenden Gruppe ausgewählt wird.
  2. Verfahren nach Anspruch 1, worin die chromatographische Matrix eine Anionenaustauschchromatographie-Matrix ist.
  3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, worin das Lysat mit verdünnter Base und Detergens hergestellt wird.
  4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, worin das Lysat durch Filtration mit Diatomeenerde geklärt wird.
  5. Verfahren nach Anspruch 4, worin Plasmid-DNA vor der Chromatographie aus dem geklärten Lysat ausgefällt wird.
  6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, worin das Kondensationsmittel Polyethylenglykol ist.
  7. Verfahren nach Anspruch 6, worin das Polyethylenglykol in einer Menge zwischen 0,1% und 4% (Gew./Vol.) zugesetzt wird.
  8. Verfahren nach Anspruch 7, worin das Polyethylenglykol in einer Menge von etwa 1% (Gew./Vol.) zugesetzt wird.
  9. Verfahren nach einem der Ansprüche 6 bis 8, worin das Polyethylenglykol ein mittleres Molekulargewicht von 7.000 bis 9.000 aufweist.
  10. Verfahren nach Anspruch 9, worin das Polyethylenglykol PEG-8000 ist.
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