DE69734913T2

DE69734913T2 - Verfahren für reverse Transkription

Info

Publication number: DE69734913T2
Application number: DE69734913T
Authority: DE
Inventors: Yoshihide Hayashizaki
Original assignee: Institute Of Physical & Chemical Research Wako; Dnaform KK; RIKEN Institute of Physical and Chemical Research
Current assignee: Institute Of Physical & Chemical Research Wak; Dnaform KK
Priority date: 1996-07-25
Filing date: 1997-07-24
Publication date: 2006-08-24
Anticipated expiration: 2017-07-25
Also published as: US20010012617A1; DE69738354D1; EP0821059A2; DE69734913D1; EP1243661A1; EP0821059B8; US6221599B1; EP0821059A3; US6013488A; US6372437B2; EP0821059B1; CA2211367C; CA2211367A1; EP1243661B1

Description

Hintergrund der Erfindung
1. Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren für die reverse Transkription, mit dem eine cDNA voller Länge aus einer mRNA hergestellt werden kann. Zudem betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Verbesserung der Wärmebeständigkeit von RNA.
2. Stand der Technik
Es ist bekannt, dass cDNAs aus mRNAs unter Verwendung einer reversen Transkriptase (RNA-abhängige DNA-Polymerase) in vitro erhalten werden können. Ein Projekt zur Aufklärung der gesamten menschlichen Gensequenzen wird vorangetrieben, und bei diesem Projekt werden mRNA-Stränge hergestellt durch Verwendung von Genen als Matrizen, und durch Verwendung der mRNA-Stränge als Matrizen werden wiederum cDNA-Stränge voller Länge hergestellt. Das heißt, die Synthese der ersten cDNA-Ketten aus mRNA-Strängen wird als erster Schritt bei der Herstellung von cDNA-Bibliotheken, bei der RT-PCR und dergleichen herangezogen.
Die reverse Transkription wird genutzt, um – wie oben beschrieben – cDNA-Stränge voller Länge aus den mRNAs zu erhalten. Allerdings ist die herkömmliche reverse Transkription nicht imstande, cDNAs voller Länge aus mRNAs zu ergeben, da das herkömmliche Verfahren der reversen Transkription die reverse Transkription nicht bis zu der ganz am Ende gelegenen Cap-Site der mRNAs vervollständigen kann.
Gemäß den Untersuchungen des hier tätigen Erfinders wurde gefunden, dass das Fehlschlagen der vollständigen reversen Transkription wie folgt verursacht wird: Eine langkettige mRNA kann nämlich eine Sekundärstruktur wie etwa die Sekundärstruktur eines Proteins bilden, und die Elongation durch reverse Transkriptase ist an der die Sekundärstruktur bildenden Stelle sterisch gehindert. Aufgrund dessen wird die reverse Transkription nicht bis zum Ende der mRNA vervollständigt.
Das heißt, bei den gängigen Techniken für die reverse Transkription besteht eine technische Einschränkung insofern, als die Reaktion wegen der stabilen Sekundärstruktur der mRNA vorzeitig beendet wird, und somit ist die Wahrscheinlichkeit vollständiger Transkription über die gesamte Transkriptionseinheit einschließlich des 5'-Endes äußerst gering. Diese technische Einschränkung beeinflusst die Qualität von Bibliotheken. Das heißt, bei den meisten klonierten cDNAs, die aus dem Poly-A am 3'-Ende unter Verwendung eines Oligo-dT als Primer synthetisiert wurden, liegt nur das 3'-Ende vor, und sie haben aufgrund der vorzeitigen Beendigung der Synthese nicht die volle Länge. Zur Behebung dieses Problems wurden etliche Versuche unternommen. Zum Beispiel wurde vorgeschlagen, die mRNAs bei 70°C vorzubehandeln, um vor der Synthese der ersten Ketten die Sekundärstruktur aufzufalten. Möglich ist auch eine Behandlung der mRNAs mit Methylquecksilberhydroxid an Stelle der Wärmebehandlung. Zwar sind diese Techniken einigermaßen wirksam zur Steigerung der Effizienz der Synthese der ersten Kette, sie sind jedoch noch nicht ausreichend, um cDNAs voller Länge effizient zu erhalten. Insbesondere zeigen sie besonders niedrigen Wirkungsgrad bei der reversen Transkription langer mRNAs mit mehreren kbp oder mehr.
Die internationale Patentanmeldung WO 91/09944 offenbart ein Verfahren zur Herstellung einer cDNA aus einer mRNA unter Verwendung einer hitzeresistenten reversen Transkriptase (z.B. Tth-Polymerase), wobei die reverse Transkription bei einer Temperatur durchgeführt wird, bei der die mRNA keine Sekundär struktur in Gegenwart von für die Aktivierung der reversen Transkriptase notwendigen Metall-Ionen und eines Chelatbildners für die Metall-Ionen annimmt.
Die deutsche Patentanmeldung DE 41 24 286 offenbart, dass RNA-Polymerasen durch Chaperon-Proteine wie etwa DnaK-Proteine aus Escherichia coli vor Wärmeinaktivierung geschützt werden können.
In "Advances in Biochemical Engineering" (Bd. 12, 1. Januar 1979, New York US, S. 55–67 "Enzyme Stabilization") wird berichtet, dass verschiedene Enzyme, zum Beispiel Glucoamylase, Ribonuclease, erhöhte Wärmebeständigkeit in Lösungen mehrwertiger Alkohole zeigen.
Thakar M. et al. ("Osmolyte mediation of T7 DNA polymerase and plasmid DNA stability", Biochemistry, Bd. 33 Nr. 40, 11. Oktober 1994, S. 12255–12259) beschreiben, dass DNA-Polymerasen vor Wärmedenaturierung und -inaktivierung geschützt werden können durch Zusetzen von Osmolyten, so dass es möglich sein könnte, dass so behandelte Polymerasen Aktivität bei hohen Temperaturen aufweisen können.
Das Dokument Shimomaye und Salvato ("Use of avian myeloblastosis virus reverse transcriptase at high temperature for sequence analysis of highly structured RNA", Gene Analysis Techniques, Bd. 6, Nr. 2, (1989) S. 25–28) beschreibt die Verwendung von reverser Transkriptase aus AMV zur Analyse von RNA bei Temperaturen von 37, 42, 47, 50 und 55°C. Das Dokument offenbart nicht, ob weitere und welche weiteren Substanzen in der Reaktionsmischung verwendet werden, um die Aktivität des Enzyms zu unterstützen und aufrechtzuerhalten.
US 5 407 800 betrifft ein Verfahren zur reversen Transkription einer RNA-Matrize unter Verwendung des thermostabilen und thermoaktiven Enzyms reverse Polymerase. Das jeweilige Enzym wird in einem Glycerin enthaltenden Aufbewahrungspuffer bereitgestellt.
WO 94/12657 betrifft ein PCR-Verfahren, bei dem thermostabile Enzyme, aber kein wärmelabilen Enzyme verwendet werden. Der Reaktionspuffer kann ebenfalls Glycerin enthalten.
EP 0 587 298 offenbart ein Verfahren zur Nucleinsäuresequenz-Amplifikation, das in Gegenwart von Glycerin bei 42°C durchgeführt wird. In dem Dokument wird auch erwähnt, dass die Amplifikation in Gegenwart von Zusätzen wie etwa Dimethylsulfoxid, Dimethylformamid, Ethylenglycol oder Zink durchgeführt wird. Für die Gründe des Zusetzens irgendeines dieser Additive wird keine Erklärung gegeben.
US 4 409 200 und US 5 017 492 offenbaren eine reverse Transkriptase und deren Verwendung bei Verfahren der reversen Transkription. Die Reaktionen werden in Gegenwart von BSA bei 37°C durchgeführt.
Das Dokument "Amersham international: "Catalogue 1994", (1993) Amersham International, betrifft Enzyme, zum Beispiel AMV reverse Transkriptase, die in Gegenwart von 50% Glycerin bereitgestellt und gelagert werden können.
Das Dokument Smith und Duerksen (Biochem. and Biophys. Res. Comm. Bd. 67, Nr. 3, Seite 916–923 (1975)) offenbart, dass Glycerin über 2% oder 15% eine linear anwachsende Hemmung der Enzym-Aktivität mit steigender Glycerin-Konzentration für gereinigte RNA-Polymerase II aufweist. Diese Beobachtung wurde bereits früher als eine der Ursachen der so genannten "Sternaktivität" berichtet. Bei der Verwendung wird daher die Konzentration an Glycerin in der Reaktion niedrig gehalten.
WO 94/26934 offenbart ein Verfahren für eine reverse Transkriptionsreaktion unter Verwendung der wärmelabilen AMV reversen Transkriptase, wobei das Verfahren bei 50°C in Gegenwart von 15%, 10% oder 5% Sorbit durchgeführt wird. Das Dokument beschreibt auch, dass höhere Sorbit-Konzentrationen die Enzyme schützen, so dass die Reaktion bei 50°C anstatt 42°C durchgeführt werden kann.
Eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist daher die Bereitstellung eines Verfahrens, das die reverse Transkription einer mRNA über die volle Länge ermöglicht und daher auch dann eine cDNA voller Länge ergeben kann, wenn eine langkettige mRNA als Matrize verwendet wird.
Der hier tätige Erfinder hat gefunden, dass die obige Aufgabe der vorliegenden Erfindung gelöst werden kann durch Ausführen einer reversen Transkription bei einer Temperatur, bei der die mRNA keine Sekundärstruktur bildet. Zwar kann sich der Temperaturbereich, in dem mRNAs keine Sekundärstruktur bilden, je nach der Pufferzusammensetzung und dergleichen ändern, doch ist es zum Beispiel ein Bereich von 45°C oder mehr, insbesondere 60°C oder mehr.
In einem solchen Temperaturbereich können die mRNAs in einem solchen Zustand gehalten werden, dass sie keine Sekundärstruktur einnehmen, und die Synthese der ersten Kette kann effizient durchgeführt werden. Allerdings wurde auch gefunden, dass in einem solchen Temperaturbereich wie vorstehend erwähnt (1) die reverse Transkriptase je nach Art des Enzyms unvorteilhaft inaktiviert werden kann, und (2) sich die Stabilität der mRNA in unvorteilhafter Weise verschlechtern kann (mRNA wird fragmentiert), wenn Metall-Ionen, die zur Aktivierung der reversen Transkriptase erforderlich sind, etwa Magnesium-Ionen, und ein Puffermittel wie etwa Tris [Tris(hydroxymethyl)aminomethan] gleichzeitig vorhanden sind.
Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist daher die Bereitstellung eines Verfahrens, das die reverse Transkription einer mRNA über die volle Länge der mRNA auch dann ermöglicht, wenn eine langkettige mRNA als Matrize verwendet wird, indem die reverse Transkription der mRNA bei einer Temperatur durchgeführt wird, bei der die mRNA keine Sekundärstruktur bildet, und das au ßerdem die Inaktivierung des Enzyms durch Wärme verhindern kann, d.h., es bei höherer Temperatur aktiviert, auch wenn eine wärmelabile reverse Transkriptase verwendet wird, und dadurch mit hoher Zuverlässigkeit eine cDNA mit voller Länge ergeben kann.
Kurzbeschreibung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung macht ein Verfahren zur Herstellung einer cDNA aus einer mRNA unter Verwendung einer reversen Transkriptase verfügbar, wobei die reverse Transkription bei einer Temperatur durchgeführt wird, bei der die mRNA keine Sekundärstruktur einnimmt, wobei eine wärmelabile reverse Transkriptase in Gegenwart wenigstens einer Substanz mit Chaperon-Funktion verwendet wird, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Trehalose, Glucose und Maltose.
Eine der bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung einer cDNA aus einer mRNA unter Verwendung einer reversen Transkriptase, wobei:

(1) die reverse Transkription bei einer Temperatur durchgeführt wird, bei der die mRNA keine Sekundärstruktur einnimmt,
(2) die reverse Transkription unter Verwendung einer wärmelabilen reversen Transkriptase in Gegenwart einer oder mehrerer Substanzen durchgeführt wird, die Chaperon-Funktion aufweisen, und
(3) die reverse Transkription in Gegenwart von für die Aktivierung der reversen Transkriptase notwendigen Metall-Ionen sowie eines Chelatbildners für die Metall-Ionen durchgeführt wird.

Eine weitere bevorzugte Ausführungsform der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung einer cDNA aus einer mRNA unter Verwendung einer reversen Transkriptase, wobei:

(1) die reverse Transkription bei einer Temperatur durchgeführt wird, bei der die mRNA keine Sekundärstruktur annimmt,
(2) die reverse Transkription durchgeführt wird unter Verwendung einer wärmelabilen reversen Transkriptase in Gegenwart einer oder mehrerer Substanzen mit Chaperon-Funktion sowie eines oder mehrerer Polyalkohole, und
(3) die reverse Transkription in Gegenwart von für die Aktivierung der reversen Transkriptase notwendigen Metall-Ionen sowie eines Chelatbildners für die Metall-Ionen durchgeführt wird.

Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1 ist eine Photographie, die die in Beispiel 1 erhaltenen Ergebnisse der Agarose-Gelelektrophorese zeigt.
2 ist eine Photographie, die die in Beispiel 2 erhaltenen Ergebnisse der Agarose-Gelelektrophorese zeigt.
Ausführliche Beschreibung der Erfindung
Das erfindungsgemäße Verfahren zur Herstellung einer cDNA aus einer mRNA unter Verwendung einer reversen Transkriptase ist dadurch gekennzeichnet, dass die reverse Transkription bei einer Temperatur durchgeführt wird, bei der die mRNA keine Sekundärstruktur einnimmt. Die "Temperatur, bei der die mRNA keine Sekundärstruktur einnimmt" steht zum Beispiel für eine Temperatur von 45°C oder mehr und genauer für eine Temperatur im Bereich von 45–90°C. Wird die Temperatur höher, so wird es leichter, die mRNA daran zu hindern, dass sie eine Sekundärstruktur einnimmt, doch besteht die Neigung, dass die Aktivität der reversen Transkriptase und die Stabilität der mRNA sich verschlechtern. Daher liegt die Temperatur vorzugsweise im Bereich von 50–75°C.
Die Kettenlänge der für das Verfahren der vorliegenden verwendeten mRNA unterliegt keinen speziellen Einschränkungen. Allerdings wird es als unnötig erachtet, die vorliegende Erfindung für eine kurzkettige mRNA anzuwenden, die keine Sekundärstruktur einnimmt, wogegen es schwierig ist, eine reverse Transkription zu erhalten, die eine cDNA voller Länge bezüglich einer mRNA von 4 kbp oder mehr, insbesondere 7 kbp oder mehr ergibt. Von diesem Gesichtspunkt ist das Verfahren der vorliegenden Erfindung daher besonders brauchbar für die reverse Transkription einer mRNA mit 4 kbp oder mehr, insbesondere 7 kbp oder mehr. Eine mRNA mit weniger als 4 kbp ist jedoch nicht vom Anliegen der vorliegenden Erfindung ausgeschlossen.
Das erfindungsgemäße Verfahren zur Herstellung einer cDNA aus einer mRNA unter Verwendung einer reversen Transkriptase ist dadurch gekennzeichnet, dass eine wärmelabile reverse Transkriptase verwendet wird und die reverse Transkription in Gegenwart einer Substanz durchgeführt wird, die Chaperon-Funktion aufweist.
Bei der vorliegenden Erfindung bedeutet wärmelabile reverse Transkriptase eine reverse Transkriptase, die eine optimale Temperatur von 45°C oder niedriger aufweist. Zu den Beispielen für eine solche wärmelabile reverse Transkriptase zählen Superscript II, AMV reverse Transkriptase, MuLV reverse Transkriptase und dergleichen, sind jedoch nicht auf diese beschränkt.
Eine normalerweise bei normaler Temperatur verwendete reverse Transkriptase wie Superscript II zeigt geringere Aktivität bei einer Temperatur von 45°C oder mehr im Vergleich zur Aktivität bei der optimalen Temperatur und zeigt im Wesentlichen keine Aktivität bei einer Temperatur, die über eine bestimmte Höhe hinausgeht. Wird des Weiteren eine solche reverse Transkriptase eine bestimmte Zeit lang bei einer Temperatur von 50°C oder höher gehalten, so zeigt sie keine Aktivität mehr, auch wenn sie wieder auf Raumtemperatur zurückgebracht wird.
Ist insbesondere die Kettenlänge der mRNA groß, so ist es wahrscheinlich, dass die reverse Transkription aufgrund der Enzyminaktivierung durch Wärme vorzeitig abbricht, ehe eine vollständige cDNA synthetisiert ist, und daher wird eine Transkription über die volle Länge schwierig. Gemäß vorliegender Erfindung wird daher eine Substanz, die Chaperon-Funktion aufweist, dem System der reversen Transkription zugesetzt, so dass die Aktivität der reversen Transkriptase selbst bei erhöhter Temperatur aufrechterhalten werden kann (es ist möglich, die Verringerung der Aktivität und die Inaktivierung durch Wärme zu verhindern).
Zu den Chaperon-Funktion aufweisenden Substanzen gehören Saccharide, nämlich Trehalose, Glucose und Maltose oder Mischungen derselben. "Chaperon-Funktion" bedeutet eine Funktion für die Renaturierung von Proteinen, die durch Stress wie etwa Hitzeschock denaturiert wurden, oder eine Funktion zur Verhinderung einer vollständigen Denaturierung von Proteinen durch Wärme, um die native Struktur aufrechtzuerhalten.
Zu den Beispielen für Saccharide, die Chaperon-Funktion aufweisen, zählen Oligosaccharide und Monosaccharide wie z.B. Trehalose, Maltose, Glucose, Sucrose, Lactose, Xylobiose, Agarobiose, Cellobiose, Lävanbiose, Chitobiose, 2-β-Glucuronosylglucuronsäure, Allose, Altrose, Galactose, Gulose, Idose, Mannose, Talose, Sorbit, Lävulose, Xylit und Arabit. Die Saccharide sind jedoch nicht auf diese beschränkt. Die vorstehend erwähnten Saccharide können alleine oder in einer beliebigen Kombination derselben verwendet werden. Von diesen zeigen Trehalose, Sorbit, Xylit, Lävulose und Arabit starke Chaperon-Funktion und deutliche Wirkung bei der Aktivierung von Enzymen bei höherer Temperatur.
Zu den Chaperon-Funktion aufweisenden Substanzen gehören die Polyalkohole. Auch Saccharide zählen zu den Polyalkoholen, und weitere Beispiele für Polyalkohole umfassen Glycerin, Ethylenglycol, Polyethylenglycol und dergleichen. Diese Polyalkohole können alleine oder in einer beliebigen Kombination derselben verwendet werden.
Zu den Chaperon-Funktion aufweisenden Substanzen gehören auch die Chaperon-Proteine. Zu den Beispielen für Chaperon-Proteine zählen Chaperon-Proteine von thermophilen Bakterien und Hitzeschockproteine wie etwa HSP 90, HSP 70 und HSP 60. Diese Chaperon-Proteine können alleine oder in einer beliebigen Kombination derselben verwendet werden.
Die Chaperon-Funktion aufweisenden Substanzen zeigen je nach Art des Enzyms unterschiedliche optimale Konzentrationen für die Stabilisierung des Enzyms, und die optimale Konzentration kann unter diesen Substanzen für das gleiche Enzym verschieden sein. Daher kann die Konzentration einer bestimmten Substanz, die einem speziellen Reaktionssystem zuzusetzen ist, je nach Art der Substanz und des Enzyms, etwa reverse Transkriptase, in geeigneter Weise festgelegt werden.
Zur Verstärkung der Wirkung der Chaperon-Funktion aufweisenden Substanzen, etwa Saccharide, Aminosäuren oder Chaperon-Proteine, können eine oder mehrere Arten von Polyalkoholen zusätzlich zu der einen oder den mehreren Arten der obigen Substanzen verwendet werden. Zu den Beispielen für den Polyalkohol gehören Glycerin, Ethylenglycol, Polyethylenglycol und dergleichen.
Enzyme können möglicherweise Metall-Ionen für ihre Aktivierung benötigen. Bei Superscript II, welches eine reverse Transkriptase ist, sind zum Beispiel Magnesium-Ionen für dessen Aktivierung erforderlich. In einem Magnesium-Ionen enthaltenden Puffer wie z.B. Tris-Puffer kann jedoch eine Fragmentierung der mRNAs unter den vorstehend erwähnten Temperaturbedingungen ablaufen, und es ist daher schwierig, cDNAs voller Länge zu erhalten. In ähnlicher Weise benötigt Tth-Polymerase Mangan-Ionen als Metall-Ionen für ihre Aktivierung. Auch in einem Mangan-Ionen enthaltenden Puffer wie z.B. Tris-Puffer kann jedoch eine Fragmentierung der mRNA unter den vorstehend erwähnten Temperaturbedingungen aktiv ablaufen, und es ist daher schwierig, cDNAs voller Länge zu erhalten.
Zur Lösung dieses Problems kann in einer bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens der vorliegenden Erfindung ein Chelatbildner für Metall-Ionen dem System zugesetzt werden, so dass die Aktivität der reversen Transkriptase beibehalten werden sollte und die Fragmentierung der mRNAs verhindert werden kann. Sind jedoch alle der für die Aktivierung der reversen Transkriptase erforderlichen Metall-Ionen chelatisiert, so verliert die reverse Transkriptase ihre Aktivität. In geeigneter Weise wird daher ein Chelatbildner mit vergleichsweise schwacher chelatbildender Wirkung eingesetzt.
Zu den Beispielen für solche Chelatbildner mit vergleichsweise schwacher chelatbildender Wirkung gehören die Desoxynucleotidtriphosphate (dNTPs). Der Chelatbildner mit vergleichsweise schwacher chelatbildender Wirkung wird geeigneterweise in einer etwa äquimolaren Menge bezüglich des Metall-Ions eingesetzt. Wird beispielsweise ein Desoxynucleotidtriphosphat als Chelatbildner verwendet, so wird geeigneterweise eine zum Metall-Ion etwa äquimolare Menge Desoxynucleotidtriphosphat eingesetzt. Demgemäß kann unter Berücksichtigung der chelatbildenden Wirkung gegenüber dem betreffenden Metall-Ion die Menge des Chelatbildners in geeigneter Weise festgelegt werden, so dass die Aktivität der reversen Transkriptase aufrechterhalten und die Fragmentierung der mRNAs verhindert werden kann. Die Desoxynucleotidtriphosphate dATP, dGTP, dCTP und dTTP können alleine oder in einer beliebigen Kombination derselben verwendet werden. Alle vier Arten von dNTPs, d.h., dATP, dGTP, dCTP und dTTP, können zusammen verwendet werden. Da diese auch als Substrate der reversen Transkription dienen können, werden sie normalerweise alle zusammen eingesetzt.
Eine bevorzugte, jedoch nicht einschränkende Ausführungsform des Verfahrens zur Herstellung einer cDNA aus einer mRNA unter Verwendung der reversen Transkriptase gemäß vorliegender Erfindung ist ein Verfahren, das dadurch gekennzeichnet ist, dass:

(1) die reverse Transkription bei einer Temperatur durchgeführt wird, bei der die mRNA keine Sekundärstruktur einnimmt, zum Beispiel bei einer Temperatur von 45 bis 90°C, besonders bevorzugt bei einer Temperatur um 60°C;
(2) die reverse Transkription in Gegenwart einer oder mehrerer Substanzen durchgeführt wird, die Chaperon-Funktion aufweisen und ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus Trehalose, Glucose und Maltose, und
(3) die reverse Transkription in Gegenwart von für die Aktivierung der reversen Transkriptase notwendigen Metall-Ionen sowie eines Chelatbildners für die Metall-Ionen durchgeführt wird.

Das Verfahren wird zum Beispiel unter Verwendung von Superscript II als reverse Transkriptase in einem Tris-Puffer durchgeführt, der Desoxynucleotidtriphosphate als Chelatbildner und Magnesium-Ionen enthält.
Wie vorstehend erwähnt, können Enzyme möglicherweise Metall-Ionen für ihre Aktivierung benötigen, und in einem Magnesium-Ionen enthaltenden Tris-Puffer kann eine Fragmentierung der mRNAs bei erhöhter Temperatur ablaufen. In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird zur Verbesserung der Wärmebeständigkeit ein Chelatbildner für die Metall-Ionen einer RNAs enthaltenden Lösung zugesetzt.
Ein Chelatbildner für Metall-Ionen wird der Lösung zugesetzt, so dass die Fragmentierung von mRNAs verhindert werden kann, und falls reverse Transkriptase daneben vorliegt, sollte auch die Aktivität der reversen Transkriptase aufrechterhalten werden. Sind jedoch alle der für die Aktivierung der reversen Transkriptase erforderlichen Metall-Ionen chelatisiert, so kann die reverse Transkriptase ihre Aktivität verlieren. Geeigneterweise wird daher ein Chelatbildner mit vergleichsweise schwacher chelatbildender Wirkung eingesetzt.
Zu den Beispielen für solche Chelatbildner mit vergleichsweise schwacher chelatbildender Wirkung gehören die Desoxynucleotidtriphosphate (dNTPs). Der Chelatbildner mit vergleichsweise schwacher chelatbildender Wirkung wird geeigneterweise in einer etwa äquimolaren Menge bezüglich des Metall-Ions eingesetzt. Wird beispielsweise ein Desoxynucleotidtriphosphat als Chelatbildner verwendet, so wird geeigneterweise eine zum Metall-Ion etwa äquimolare Menge Desoxynucleotidtriphosphat eingesetzt.
Demgemäß kann unter Berücksichtigung der chelatbildenden Wirkung gegenüber dem betreffenden Metall-Ion die Menge des Chelatbildners in geeigneter Weise festgelegt werden, so dass die Aktivität der reversen Transkriptase aufrechterhalten und die Fragmentierung der mRNAs verhindert werden kann. Die Desoxynucleotidtriphosphate dATP, dGTP, dCTP und dTTP können alleine oder in einer beliebigen Kombination derselben verwendet werden. Alle vier Arten von dNTPs, d.h., dATP, dGTP, dCTP und dTTP, können zusammen verwendet werden. Da diese auch als Substrate der reversen Transkription dienen können, werden sie normalerweise alle zusammen eingesetzt.
Die RNAs enthaltende Lösung kann zudem einen oder mehrere Polyalkohole wie etwa Glycerin enthalten.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird die Wärmebeständigkeit von RNAs verbessert, auch wenn die eine RNA enthaltende Lösung des Weiteren Metall-Ionen wie etwa Magnesium-Ionen oder Mangan-Ionen und/oder Tris(hydroxymethyl)aminomethan enthält. Zudem kann die obige Verbesserung zum Beispiel bei einer Temperatur von 40–100°C, vorzugsweise 45–90°C erhalten werden.
Beispiele
Die vorliegende Erfindung soll nun anhand der folgenden Beispiele ausführlich erklärt werden.
Beispiel 1
Stabilität von mRNA in Metall-Ionen enthaltendem Puffer, der wahlweise dNTP enthält
Zur Untersuchung der Stabilität von RNAs in einem mehrere Zusätze enthaltenden Puffer (50 mM Tris, pH 8,3, 3 mM MgCl₂) wurden Gesamtleber-RNAs in verschiedenen Pufferlösungen mit den nachstehend aufgeführten Zusammensetzungen inkubiert. Tabelle 1

1–6:: Bezugsbeispiele

Um die Fragmentierung der RNAs nach dem Inkubieren sichtbar zu machen, wurde mit den Proben eine Agarose-Gelelektrophorese durchgeführt, wie beschrieben von Sambrook (Molecular Cloning, Zweite Auflage S. 7.43–7.45). Das Gel wurde mit Ethidiumbromid angefärbt, und der Grad der RNA-Fragmentierung wurde durch Vergleichen der relativen Bandenintensitäten der rRNA bewertet. Die Ergebnisse der Agarose-Gelelektrophorese sind in 1 gezeigt (Bahnen 1 bis 7).
Wie in Bahn 1 gezeigt, waren die RNAs durch Glycerin in Gegenwart von Magnesium-Ionen (freies Mg²⁺) hoher Konzentration, d.h., bei Inkubieren in 50 mM Tris, pH 8,3, 3 mM MgCl₂, 15% (V/V) Glycerin, nicht ausreichend vor Fragmentierung geschützt. Tatsächlich war der Fragmentierungsgrad ähnlich dem, der in 50 mM Tris, pH 8,3, 3 mM MgCl₂ in Abwesenheit von Glycerin erhalten wurde (Bahn 2).
Wie in Bahn 3 gezeigt, wurde die Fragmentierung der RNA durch Behandlung mit 50 mM Tris, pH 8,3, 3 mM MgCl₂, 2 mM dNTP noch nicht verhindert.
Andererseits wurde die Fragmentierung von RNA unter den Bedingungen von 50 mM Tris, pH 8,3, 3 mM MgCl₂, 3 mM dNTP (gleiche molare Konzentrationen von Mg²⁺ und NTP) teilweise verhindert, wie in Bahn 4 gezeigt.
Weiterhin waren, wie in Bahn 5 gezeigt, die RNAs in 50 mM Tris, pH 8,3, 3 mM MgCl₂, 4 mM dNTP, d.h., unter der Bedingung, dass die Konzentration von NTP um 1 mM höher war als die von Mg²⁺, sehr stabil. Allerdings wurde auch gefunden, dass sich die Aktivität der reversen Transkriptase unter dieser Bedingungen verringert.
So wurden 15% Glycerin zu 50 mM Tris, pH 8,3, 3 mM MgCl₂, 3 mM dNTP (gleiche molare Konzentrationen von NTP und Mg²⁺) gegeben, und unter diesen Bedingungen erlitten die RNAs keine Fragmentierung, wie in Bahn 6 gezeigt. Auch wurde in einem getrennten Experiment gefunden, dass die Aktivität der reversen Transkriptase unter dieser Bedingungen vollständig aufrechterhalten wurde.
Unter den Bedingungen von Bahn 6 war die Stabilität der RNAs nahezu gleich der in Bahn 7 erhaltenen, d.h., in sterilisiertem Wasser.
Beispiel 2
Verbesserung des Wirkungsgrads der reversen Transkription, indem die reverse Transkriptase hitzeresistent gemacht wird
Zur Untersuchung der Aktivität der reversen Transkription unter den neuartigen Bedingungen von Bahn 6 wurden cDNAs unter Verwendung von RNAs als Matrizen synthetisiert. Die RNAs wurden – wie nachstehend erwähnt – mittels T7-RNA-Polymerase in vitro transkribiert. Die RNAs wurden hergestellt, indem pBluescript II SK, das mit dem Restriktionsenzym NotI in eine lineare Form gespalten wurde, mit T7-RNA-Polymerase in vitro transkribiert wurde. Diese Reaktion wurde vom T7-Promotor aus initiiert, der in den Anweisungen zu pBluescript II SK beschrieben ist.
Die resultierenden Produkte wurden ausgewertet. Durch Verwendung von RNAs als Matrize, die in vitro transkribiert wurden, und Auswerten der Produkte durch Elektrophorese lassen sich die Wirkungsgrade der reversen Transkription der Proben untereinander vergleichen, und dadurch kann der unspezifische Abbruch der Transkription bewertet werden, der zu vorzeitigem Abbruch der reversen Transkription und/oder zu einer Verringerung des Reaktionswirkungsgrads führt.
Als Kontrolle wurden die folgenden Standardpufferbedingungen verwendet: 50 mM Tris-HCl, pH 8,3, 75 mM KCl, 3 mM MgCl₂, 10 mM Dithiothreitol, jeweils 0,75 mM der dNTPs (dATP, dGTP, dCTP und dTTP).
Unter den obigen Standardpufferbedingungen wurden 1 μg Matrizen-RNA, 400 ng Primer (20mer SK-Primer, CGCTCTAGAACTAGTGGATC) und 200 Ein heften Superscript II präpariert, und das Endvolumen wurde auf 20 μl eingestellt. 0,2 μl [α-³²P]dGTP wurden zur Markierung der Produkte der reversen Transkription verwendet. Die RNA und die Primer wurden bei 65°C inkubiert, ehe die übrigen Substrate zugesetzt wurden. Dann wurde die Reaktion 1 Stunde lang bei 42°C durchgeführt. Mit den Reaktionsprodukten wurde eine denaturierende Agarose-Gelelektrophorese durchgeführt, und die elektrophoretischen Muster wurden mittels Autoradiographie untersucht, um die Gewinnung von cDNAs voller Länge und die Raten der aus unvollständiger Elongation erhaltenen kurzen Produkte zu bewerten. Die Ergebnisse sind in Bahn 1 von 2 gezeigt.
Die reverse Transkriptase Superscript II wurde bei einer Temperatur von 50°C unter den obigen Standardpufferbedingungen inaktiviert.
Die folgenden Pufferbedingungen wurden für die reverse Transkription angewandt, um zu verifizieren, dass die Zugabe von Oligosaccharid die Enzymreaktion stabilisiert: 50 mM Tris-HCl, pH 8,3, 75 mM KCl, 3 mM MgCl₂, 10 mM Dithiothreitol, jeweils 0,75 mM der dNTPs (dATP, dGTP, dCTP, dTTP), 20% (Gew./Vol.) Trehalose und 20% (Vol./Vol.) Glycerin.
1 μg Matrizen-RNA, 400 ng Primer (20mer SK-Primer) und 200 Einheiten Superscript II wurden in 24 μl wässriger Lösung unter den obigen Pufferbedingungen umgesetzt. 0,2 μl [α-³²P]dGTP wurden zur Markierung der Produkte der reversen Transkription verwendet. Unter diesen Bedingungen zeigte die reverse Transkriptase Superscript II höhere Aktivität als die Kontrollreaktion bei normaler Temperatur (42°C). Die Primer und die Matrizen-RNAs wurden 2 Minuten lang einem Annealing bei 37°C unterzogen, und die Enzymaktivität wurde bei 60°C gemessen.
Mit den Reaktionsprodukten wurde eine denaturierende Agarose-Gelelektrophorese durchgeführt wie vorstehend beschrieben, und die elektrophoretischen Muster wurden mittels Autoradiographie untersucht, um die Gewinnung von cDNAs voller Länge und die Raten der aus unvollständiger Elongation erhaltenen kurzen Produkte zu bewerten. Die Ergebnisse sind in 2 gezeigt.
Wie in Bahn 1 gezeigt, waren Produkte, die aus dem vorzeitigen Abbruch der reversen Transkription an spezifischen Stellen oder aus unspezifischem Abbruch der reversen Transkription resultierten, unter den Standardpufferbedingungen bei 42°C zu erkennen.
Wie in Bahn 2 gezeigt, wurden bei 42°C wie in Bahn 1 solche Produkte, die aus einem vorzeitigen Abbruch wie vorstehend erwähnt resultierten, auch dann beobachtet, wenn 20% Trehalose und 20% Glycerin zugesetzt wurden.
Wie in Bahn 3 gezeigt, war bei Anhebung der Temperatur auf 60°C die Menge der Produkte, die aus vorzeitig abgebrochener Synthese erhalten wurden, sehr gering, und es wurden Produkte voller Länge synthetisiert.
Wie in Bahn 5 gezeigt, wurde bei Zugabe von 0,125 μg/μl BSA unter den Bedingungen von Bahn 3 die Enzymaktivität weiter stabilisiert. BSA alleine ohne 20% Trehalose und 20% Glycerin war jedoch nicht imstande, das Enzym hinreichend hitzeresistent zu machen.
Wie in Bahn 4 gezeigt, wurde bei Zugabe von 0,05% Triton X100 unter den Bedingungen von Bahn 3 die Menge an Produkten aus unvollständiger reverser Transkription weiter verringert. Allerdings war die Gesamtaktivität der reversen Transkriptase leicht verringert.
Wurde die Reaktion unter den gleichen Bedingungen wie bei Bahn 3 durchgeführt, mit der Ausnahme, dass Glucose oder Maltose an Stelle von Trehalose verwendet wurde, so zeigte das elektrophoretische Muster wiederum, dass die Menge der Produkte, die aus vorzeitig abgebrochener Synthese erhalten wurden, sehr klein wurde und Produkte voller Länge synthetisiert wurden.
Synthese von cDNA aus Matrizen-mRNA
Aus den Befunden der obigen Beispiele 1 und 2 wurde klar, dass cDNAs ausgehend von mRNAs unter Anwendung der Pufferbedingungen 50 mM Tris-HCl, pH 8,3, 75 mM KCl, 3 mM MgCl₂, 10 mM Dithiothreitol, jeweils 0,75 mM der dNTPs, 20% (Gew./Vol.) Trehalose und 20% (Vol./Vol.) Glycerin mit hohem Wirkungsgrad synthetisiert werden können. Die Reaktionsbedingungen waren wie folgt: 1 μg Matrizen-RNA, 400 ng Oligo-dT(12–18)-Primer und 200 Einheiten Superscript II wurden in einem Volumen von 24 μl in Gegenwart von [α-³²P]dGTP umgesetzt, der Primer und die Matrizen-RNAs wurden 2 Minuten lang bei 37°C einem Annealing unterzogen, und die Enzymaktivität wurde bei 60°C gemessen.
Die erhaltenen ersten Ketten des cDNA-Strangs werden bei der Lang-RT-PCR oder beim Aufbau von Bibliotheken mit cDNAs voller Länge verwendet.
Beispiel 3
Die Reaktion wurde unter den gleichen Bedingungen wie bei Bahn 3 von Beispiel 2 durchgeführt, mit der Ausnahme, dass Arabit, Sorbit, Lävulose, Xylit oder Betain an Stelle von Trehalose verwendet wurden. Das elektrophoretische Muster zeigte wiederum, dass die Menge der Produkte, die aus vorzeitig abgebrochener Synthese erhalten wurden, sehr klein wurde und Produkte voller Länge synthetisiert wurden wie in Bahn 3 von Beispiel 1.

Claims

Ein Verfahren zur Herstellung einer cDNA aus mRNA unter Verwendung einer hitzelabilen reversen Transkriptase, wobei die reverse Transkription bei einer Temperatur durchgeführt wird, bei der die mRNA keine Sekundärstruktur bildet, und in Anwesenheit von zumindest einer Substanz mit Chaperon-Funktion ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Trehalose, Glukose und Maltose.
Das Verfahren nach Anspruch 1, wobei die reverse Transkription bei einer Temperatur von 45°C oder mehr durchgeführt wird.
Das Verfahren nach Anspruch 2, wobei die reverse Transkription bei einer Temperatur von 45 bis 90°C durchgeführt wird.
Das Verfahren nach Anspruch 1, wobei ein weiteres Chaperon-Protein anwesend ist, ausgewählt von solchen die von thermophilen Bakterien stammen oder ausgewählt aus Hitzeschockproteinen.
Das Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 4, wobei die reverse Transkription in Gegenwart einer oder mehrerer Substanzen mit Chaperon-Funktion und einem oder mehreren Polyalkoholen durchgeführt wird.
Das Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 5, wobei die reverse Transkription in Gegenwart von für die Aktivierung der reversen Transkriptase notwendigen Metallionen und einem chelatisierenden Agens für die Metallionen durchgeführt wird.
Das Verfahren nach Anspruch 6, wobei die Metallionen Magnesiumionen oder Manganionen sind.
Das Verfahren nach Anspruch 6, wobei das chelatisierende Agens ein oder mehrere von Desoxynukleotidtriphosphaten ist.