DE69735375T3

DE69735375T3 - Genfamilie von apoptose-verwandten peptiden, dadurch kodierte peptide und verfahren zu deren herstellung

Info

Publication number: DE69735375T3
Application number: DE69735375T
Authority: DE
Inventors: Samuil Albany UMANSKY; Hovsep Albany MELKONYAN
Original assignee: Tanox Inc
Current assignee: GENTECH, INC., SAN FRANCISCO, CALIF., US
Priority date: 1996-09-24
Filing date: 1997-09-24
Publication date: 2010-09-02
Anticipated expiration: 2017-09-25
Also published as: CA2266325C; AU737323B2; ES2263181T3; EP0932678B1; JP2009050257A; PT932678E; WO1998013493A2; AU4651397A; DE69735375D1; DK0932678T4; US20030023061A1; WO1998013493A3; US20040039184A1; JP4299886B2; CA2266325A1; EP0932678B2; DK0932678T3; EP0932678A2; ATE318915T1; JP2002516564A

Description

TECHNISCHES GEBIET
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf das Gebiet des Diagnostizierens und Behandelns von Zuständen, die mit Apoptose oder programmiertem Zelltod in Beziehung stehen. Genauer bezieht sie sich auf die Identifizierung und Charakterisierung einer neuen Genfamilie, deren Expression mit Apoptose verbunden ist.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Apoptose ist ein normaler physiologischer Prozess, der zu individuellem Zelltod führt. Dieser Prozess von programmiertem Zelltods ist in eine Vielzahl von normalen und pathologischen biologischen Ereignissen verwickelt und kann durch eine Anzahl von unbezogenen Stimuli induziert werden. Änderungen bei der biologischen Regulierung von Apoptose treten auch während des Alterns auf und sind für viele der Zustände und Krankheiten verantwortlich, die mit dem Altern verbunden sind. Neue Studien zu Apoptose haben impliziert, dass ein gemeinsamer metabolitischer Übertragungsweg, der zu Zelltod führt, durch einen weiten Bereich von Signalen initiiert werden kann, wie Hormone, Serumswachstumsfaktormangel, chemotherapeutische Mittel, ionisierende Strahlung und Infektion von Menschen mit humanem Immunschwächevirus (HIV) umfassen. Wyllie (1980) Nature 284: 555–556; Kanter et al. (1984) Biochem. Biophys. Res. Commun. 118: 392–399; Duke und Cohen (1986) Lymphokine Res. 5: 289–299; Tomei et al. (1988) Biochem. Biophys. Res. Commun. 155: 324–331; Kruman et al. (1991) J. Cell. Physiol. 148: 267–273; Ameisen und Capron (1991) Immunology Today 12: 102; und Sheppard und Ascher (1992) J. AIDS 5: 143. Mittel, die die biologische Steuerung von Apoptose modulieren, haben deshalb therapeutischen Nutzen bei einem weiten Bereich von Zuständen.
Apoptotischer Zelltod ist charakterisiert durch Zellschrumpfung, Chromatinkondensation, Zytoplasmablasenbildung (engl.: cytoplasmic blebbing), erhöhte Membranpermeabilität und interchromosomale DNS-Spaltung. Kerr et al. (1992) FASEB J. 6: 2450; und Cohen und Duke (1992) Ann. Rev. Immunol. 10: 267. Die Blasen (engl.: Blebs), kleine, von Membran eingekapselte Kugeln, die von der Oberfläche der apoptotischen Zellen abgehen, können fortgesetzt Superoxidradikale produzieren, die umgebendes Zellgewebe beschädigen, und in entzündliche Prozesse verwickelt sein können.
Während Apoptose ein normales Zellereignis ist, kann sie auch durch pathologische Zustände und eine Vielzahl von Verletzungen induziert werden. Apoptose ist in einen weiten Bereich von Zuständen verwickelt, einschließlich, aber nicht beschränkt auf: Herzkreislauferkrankung; Krebsregression; Immunregulation; virale Erkrankungen; Anämie; neurologische Störungen; Magen-Darm-Störungen; einschließlich, aber nicht beschränkt auf Diarrhö und Dysenterie; Diabetes; Haarverlust; Abstoßung von Organtransplantaten; Prostatahypertrophie; Fettsucht; Augenstörungen; Stress und Altern.
Gene, von denen gezeigt wurde, dass sie den Apoptoseübertragungsweg bei Tumorzellen aktivieren, umfassen das FAS-Antigen, TNFα und TNFβ. Siehe z. B. Tomei und Cope et al. in Apoptosis II: The Molecular Basis of Apoptosis in Disease (1994) Cold Spring Harbor Laboratory Press. Bei dem Nematoden C. elegans verhindern Mutationen in den Genen ced-3 und ced-4 autonomen Zelltod während der Entwicklung. Yuan und Horvitz (1990) Dev. Biol. 138: 33. Eine Mutation, die das Nematodengen ced-9 aktiviert, verhindert Zelltod während der Entwicklung, während Mutationen, die dieses Gen inaktivieren, den programmierten Zelltod fördern. Bei Säugetierzellen wurde von dem p-53-Gen gezeigt, dass es Apoptose in einigen Zellen induziert, in anderen aber nicht.
In der Untersuchung befindliche Apoptose verhindernde Gene umfassen bcl-2, das von B-Zellenlymphomen isoliert wurde und Apoptose blockiert, ohne die Zellproliferation zu beeinträchtigen. Siehe z. B. Tsujimoto et al. Science 226: 1087; Hockenberry et al. (1990) Nature 348: 334. Der Mechanismus, durch den blc-2 Apoptose verhindert, ist nicht bekannt. Mcl-1, das in Rückenmarkszellen exprimiert wird, zeigt eine Sequenz ähnlich wie bcl-2, und es wird angenommen, dass es in die Regulierung von Apoptose verwickelt ist. Kozopas et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 3516.
Mitglieder einer großen Familie von möglichen Transmembranrezeptoren, die mit dem Drosophila melanogaster-Gewebepolaritätsgen frizzled verwandt sind, sind kürzlich geklont worden. Siehe Wang et al. (1995) J. Biol. Chem. 271: 4468. Mitglieder der frizzled-Familie werden in derart gegensätzlichen Organismen wie Nematoden und Menschen gefunden und werden in einer Vielzahl von Geweben und während der embryonalen Entwicklung exprimiert. Bei Drosophila beeinträchtigen frizzled-Mutationen die Polarität von Strukturen, wie beispielsweise von Tasthaaren an der Körperoberfläche. Die präzisen Funktionen und die klinische Signifikanz der frizzled-Familie bei anderen Arten bleibt im Wesentlichen unbekannt.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung umfasst isolierte Polynukleotide, Polypeptide und Antikörper, die von den neuen mit Apoptose in Beziehung stehenden Genen erhalten werden oder mit den Produkten der neuen mit Apoptose in Beziehung stehenden Gene reaktiv sind. Die Erfindung umfasst auch Verwendungen dieser Zusammensetzungen.
Dementsprechend sind Polynukleotide, die Polypeptide der SARP-Familie kodieren, ein Aspekt der Erfindung. Repräsentative Polypeptide sind jene, die die Aminosäuresequenzen der SEQ. ID. NO: 2, 4, 6 oder 7 aufweisen. Die Erfindung umfasst in gleicher Weise Polynukleotide, die Peptide mit wesentlicher Homologie zu den Aminosäuresequenzen der SEQ. ID. NO: 2, 4, 6 oder 7 aufweisen.
In einem anderen Aspekt stellen wir isolierte Polynukleotide bereit, die aus einer Region von mindestens 15 aufeinander folgenden Nukleotiden bestehen, wobei diese Nukleotide in der Lage sind, ein stabiles Doppel mit einem Polynukleotid auszubilden, das die Sequenz der SEQ. ID. NO: 1, 3, 5 oder 18 kodiert.
Ein anderer Aspekt der Erfindung sind Klonier- und Expressionsvektoren, die die Polynukleotide der Erfindung aufweisen. Ebenfalls eingeschlossen sind Wirtszellen, die die Polynukleotide der Erfindung aufweisen.
Wir stellen auch Polypeptide von mindestens 11 Aminosäureresten der SEQ. ID. NO: 2, 4, 6 oder 7 und Polypeptide, die im Wesentlichen homolog mit 11 Aminosäureresten der SEQ. ID. NO: 2, 4, 6 oder 7 sind, bereit. Die Erfindung stellt auch Fusionspolypeptide bereit, die ein Polypeptid der vorliegenden Erfindung aufweisen.
Die Erfindung stellt auch polyklonale oder monoklonale Antikörper bereit, die spezifisch an die Polypeptide der Erfindung anbinden. Diese werden als αSARP-Antikörper bezeichnet.
In einem anderen Aspekt werden Verfahren zum Detektieren der Polynukleotide der Erfindung bereitgestellt. Diese Verfahren weisen das Kontaktieren einer biologischen Probe unter Bedingungen auf, die die Bildung eines stabilen Komplexes erlauben, und das Detektieren jeglichen gebildeten stabilen Komplexes.
Ein anderer Aspekt der Erfindung sind Verfahren zum Detektieren der SARP-Proteinfamilie. Diese Verfahren umfassen die Schritte des Kontaktierens einer biologischen Probe, die von einem Individuum erhalten wurde, mit einem αSARP-Antikörper der Erfindung unter Bedingungen, die den stabilen Antigen-Antikörper-Komplex erlauben, und das Detektieren des gebildeten stabilen Komplexes, sofern vorhanden.
Auch bereitgestellt werden Verfahren für die Detektion einer Erkrankung durch Bereitstellen einer Testprobe aus Körperflüssigkeit; Testen der Testprobe auf die Anwesenheit eines Genprodukts eines anderen hsarp-Gens als SARP 3 und Vergleichen der Menge an in der Testprobe detektiertem Genprodukt mit der Menge an Genprodukt, die in einer nicht erkrankten Probe desselben Gewebetyps wie die Testprobe detektiert wurde. Testen umfasst, aber ist nicht beschränkt auf Nukleinsäurehybridisierung und Antikörper-Antigen-Wechselwirkungen.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung stellt die Verwendung einer Zusammensetzung, die eine Komponente aufweist, welche das Polynukleotid hSARP 2 (SEQ. ID. NO: 18) oder das Polynukleotid hSARP 2 (SEQ. ID. NO: 7) ist, bei der Herstellung eines Medikaments zur Verwendung bei der Behandlung eines mit Apoptose in Beziehung stehenden Zustands bereit, wobei der mit Apoptose in Beziehung stehende Zustand ein Krebs ist.
Die obigen und anderen Ziele der Erfindung werden dem Fachmann schnell aus der nachfolgenden detaillierten Beschreibung und den Figuren deutlich werden, wobei nur die bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung gezeigt und beschrieben werden, einfach zur Illustration der besten Art und Weise, die Erfindung auszuführen.
KURZBESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1A zeigt eine Ausrichtung der vorhergesagten bSARP2-Aminosäuresequenz gegenüber frizzled-Proteinen. [SEQ. ID. NO: 7–9].
1B zeigt einen Vergleich der Aminosäuresequenz von mSARP 1 (SEQ. ID. NO: 2) mit verschiedenen frizzled-Proteinen (SEQ. ID. NO: 10–14).
2 ist ein Northern-Blot, der die gewebespezifische Expression von msarp1 in verschiedenen Mausgeweben zeigt. Die RNS wurden von verschiedenen Geweben isoliert, auf 1,2% Formaldehyd-Agarose-Gel aufgelöst, auf Nylonmembran transferiert und mit msarp1 als Sonde unter hoch stringenten Bedingungen getestet.
3A zeigt die Resultate einer Northern-Blot-Analyse von mehreren humanen Geweben mit einer spezifischen Sonde für hsarp2.
3B ist eine Aufstellung von Northern-Blots, die die Gewebe-spezifische Expression von hsarp1 und hsarp3 in verschiedenen humanen Geweben zeigt. Mehrere Gewebe-Northern-Blots wurden unter hoch stringenten Bedingungen mit einer Sonde getestet.
4 zeigt die Resultate einer Northern-Blot-Analyse von normalen und transformierten Zelllinien mit einer für hsarp2 spezifischen Sonde.
5 ist ein Northern-Blot, der die Expression von msarp1 in in der Ruhe befindlichen 10T1/2-Zellen nach erneuter Beimpfung mit geringer Dichte zeigt.
6, Tafeln (A) bis (C) zeigen den Prozentsatz von lebensfähigen transformierten MCF7-Zelllinien nach unterschiedlichen Behandlungen. MCF7-Zellen wurden entweder mit einem Expressionsvektor (pcDNA3) oder mit pcDNA3 transformiert, die das hsarp2-Gen trägt. Tafel (A) zeigt den Prozentsatz der lebenden Zellen nach sieben Tagen Serummangel. Tafel (B) zeigt den Prozentsatz der lebenden Zellen nach 24 Stunden Behandlung mit Adriamycin zu 1 μg/ml. Tafel (C) zeigt den Prozentsatz der lebenden Zellen nach 24 Stunden Behandlung mit hTNF zu 50 ng/ml. Tafel (D) zeigt die relativen Mengen an hsarp2-Expression in jedem der MCF7-Klone, die in den Experimenten verwendet wurden, welche in den hier angegebenen Beispielen beschrieben sind.
7 ist ein Nothern-Blot von RNS, die von Rattenherzmuskelzellen isoliert wurde, nach verschiedenen Behandlungen, getestet mit msarp1-cDNS-Fragment als Sonde.
8 ist ein 2-Balkendiagramm, das die Lebensfähigkeit von Kontroll-, β-Galaktosidase- und msarp1-transfizierten Herzmuskelzellen von neugeborenen Ratten zeigt, die für 24 Stunden einer Behandlung mit serumfreiem Medium oder Adriamycin ausgesetzt waren. Die Menge an infektiösen Viruspartikeln pro Zelle ist in Klammern angegeben.
9 ist eine Reihe von Diagrammen, die (A) den Effekt von Cycloheximid auf den Zelltod von 10T1/2-log und in Ruhe befindlichen Zellen induziert durch Serummangel und (B) den Effekt von konditioniertem Medium von in Ruhe befindlichen Zellen auf Zellen, die Serummangel und Cycloheximid-Behandlung unterworfen wurden, zeigen.
10 zeigt (A) Diagramme, (B) einen Northern-Blot und (C) eine Western-Analyse. Die Diagramme zeigen die Effekte von TNF und Ceramid auf die Zelllebensfähigkeit in der Anwesenheit von SARP. Der Northern-Blot zeigt die Steuer-RNS von Zellen, die mit pcDNA3 transfiziert wurden, RNS von Zellen, die mit rekombinanten msarp1 oder hsarp2-Vektoren transfiziert wurden. Die Proteine aus serumfrei konditionierten Medien von 10T1/2- und MCF7-Zellen wurden durch Filtration konzentriert und einer Western-Analyse unter Verwendung von anti-GST-mSARP1-Antiseren (1:5000 Verdünnung) unterworfen.
11 zeigt den Vergleich von hsarp1-Expression in normalen und neoplastischen humanen Prostataepithelialzellen bei 10-facher und 40-facher Vergrößerung.
12 zeigt den Vergleich von hsarp2-Expression in normalen und neoplastischen humanen Brustepithelialzellen bei 10-facher und 40-facher Vergrößerung.
13 zeigt die Detektion von β-Catinin in MCF7-Zellen, die mit pcDNA3, msarp1 und hsarp2 transfiziert waren, durch Western-Analyse.
ART(EN) DER DURCHFÜHRUNG DER ERFINDUNG
Hier wird eine neue Genfamilie offenbart, deren Expression mit Apoptose verbunden ist. Die Gene werden ”sarp” (secreted apoptosis related Protein = sekretiertes mit Apoptose in Beziehung stehendes Protein) bezeichnet. msarp-Gene werden von Mausquellen erhalten, während hsarp-Gene aus humanen Quellen erhalten werden. Diese Gene, die msarp1, hsarp2, hsarp1 und hsarp3 umfassen, kodieren neue Proteine, die zu der Familie von Proteinen gehören, die als ”SARP” bezeichnet werden. Das hsarp2-Gen wird in einer Vielzahl von Geweben exprimiert. Wenn hsarp2 in einen Expressionsvektor eingesetzt und in humane Zelllinien transfiziert wurde, erhöhte es den Prozentsatz der Zellen, die in Kultur Apoptose durchliefen. Das hsarp2-Gen wird in exponentiell wachsenden nicht transformierten Zelllinien exprimiert, und es ist in solchen, die sich in Ruhe befinden, unterdrückt. Von erhöhter Expression von hsarp2 ist gezeigt worden, dass sie den programmierten Zelltod in Brustkarzinomzelllinien in einer dosisabhängigen Weise erhöht. Eine BLAST-Recherche der Gene Bank ergab eine signifikante Homologie zwischen der neuen Genfamilie und Mitgliedern der ”frizzled-artigen” Genfamilie (siehe 1B, SEQ. ID. NO: 10–14). Die frizzled-artige Genfamilie kodiert Zellmembranproteine, die sieben Transmembrandomänen mit unbekannten Funktionen aufweisen. Es wurde kürzlich gezeigt, dass Wnt- und frizzled-Proteine wechselwirken. Bhanot et al. (1996) Nature 382: 225–230. Mehrfache Sequenzausrichtung gegenüber humanen frizzled-artigen Proteinen zeigte, dass die neue Familie die größte Homologie bei den extrazellulären N-terminalen Domänen der frizzled-artigen Proteine aufweist, bei kleiner Homologie in der Transmembranregion. Von SARP 1 und 2 ist gezeigt worden, dass sie mit der Wnt-frizzled-Proteinwechselwirkung interferieren und Apoptose modifizieren, indem sie eine Signalisierung von Zelle zu Zelle und von Zelle zu extrazellulärer Matrix bewirken.
Wir haben eine Familie von neuen Genen von Mauszellen und von humanen Herz- und Pankreas-cDNS-Bibliotheken geklont. Wir haben gezeigt, dass die Expression von SARP 1 und SARP 2 Genen mit den frühen Stufen von Apoptose verbunden ist. Das Mausgen, msarp1 bezeichnet, enthält einen einzigen offenen Leserahmen, der ein vorhergesagtes Proteinprodukt von 295 Aminosäuren kodiert, welches sekretiert wird. msarp1 wird auf hohen Niveaus im Herz und in der Lunge exprimiert und wird in Herzmuskelzellen nach oben reguliert, die Verletzungen unterworfen sind, welche Apoptose auslösen. Die Transkription von msarp1 wird ebenso signifikant in 10T1/2-Zellen induziert, die ein Ruhestadium erreichten, ein Status von angehaltenem Zeltwachstum, der durch einen erhöhten Widerstand gegenüber apoptotischen Stimuli gekennzeichnet ist.
Die neue Genfamilie umfasst auch drei humane Gene, die als hsarp2, hsarp1 und hsarp3 bezeichnet werden. hsarp1 ist eng homolog mit msarp1 und weist einen offenen Leserahmen (open reading frame = ORF) auf, der ein Polypeptid von 212 Aminosäuren kodiert, das als hSARP1 bezeichnet wird. hsarp3 kodiert ein Protein von 316 Aminosäuren, das als hSARP3 bezeichnet wird und das homolog mit hSARP2 und mSARP1 ist. hSARP1 wird auf höchsten Niveaus im Kolon, im Dünndarm, in der Pankreas und in der Prostata exprimiert. hSARP3 wird vornehmlich in der Pankreas exprimiert.
Die hsarp2-cDNS-Sequenz enthält 1302 Nukleotide und kodiert ein Polypeptid von 314 Aminosäuren mit einem N-terminalen Methionin- und einem C-terminalen Lysinaminosäurerest. Die cDNS-Sequenz voller Länge umfasst 301 Nukleotide der nicht übersetzten 5'-Region und 62 Nukleotide der nicht übersetzten 3'-Region. Die hsarp2-cDNS enthält einen offenen Hauptleserahmen (ORF) (hSARP2). Der ATG-Startplatz wird an der Position 303 gefunden, und der Terminierungsplatz liegt an der Position 1248. Wenn hsarp2 in einen Expressionsvektor eingesetzt und in humane Zelllinien transfiziert wird, erhöht es den Prozentsatz an Zellen, die in Kultur Apoptose durchlaufen.
So wie hier verwendet, umfasst ein ”sarp” msarp1, hsarp1, hsarp2 und hsarp3 und bezieht sich auf die Nukleinsäuremoleküle, die die SARP kodieren, und Derivate und komplementäre Nukleotide davon. ”SARP” umfasst mSARP, hSARP1, hSARP2 und hSARP3 und bezieht sich auf die dadurch kodierten Proteine. Andere Mitglieder der Familie können durch die Verfahren erhalten werden, die in den hier angegebenen Beispielen beschrieben werden.
Die vorliegende Erfindung umfasst Nukleotidsequenzen der neuen Genfamilie. Die Nukleotide umfassen, sind aber nicht beschränkt auf, die cDNS, Genom-abgeleitete DNS und synthetische oder halbsynthetische DNS oder RNS. Die Nukleotidsequenz von msarp1 ist in SEQ. ID. NO: 1 enthalten; die Nukleotidsequenz von hsarp1 ist in SEQ. ID. NO: 3 enthalten; die Sequenz von hsarp3 ist in SEQ. ID. NO: 5 enthalten; und die Nukleotidsequenz von hsarp2 ist in SEQ. ID. NO: 18 enthalten. Wie hier in den Beispielen beschrieben ist, ist die mRNS dieser Genfamilie in einer Vielzahl von menschlichen Organen und Geweben durch Northern-Blot-Analyse detektiert worden. Z. B. wurde die Expression von hsarp2-mRNS in den meisten humanen Geweben detektiert, die getestet wurden; in exponentiell wachsenden nicht-transformierten humanen Brustzellen und in exponentiell wachsenden normalen diploiden humanen Fibroblastenzellen.
Der Begriff ”Polynukleotid” ist so verwendet, dass er eine polymere Form von Nukleotiden jeglicher Länge bedeutet, die Deoxyribonukleotide, Ribonukleotide und/oder deren Analoge enthalten. Die Begriffe ”Polynukleotide” und ”Nukleotide”, so wie sie hier verwendet werden, werden in austauschbarer Weise verwendet. Polynukleotide können jede dreidimensionale Struktur haben und können jegliche Funktion erfüllen, ob bekannt oder unbekannt. Der Begriff ”Polynukleotid” umfasst Doppelstrang-, Einzelstrang- und dreifach helikale Moleküle. Soweit nicht anderweitig angegeben oder erforderlich ist, umfasst jede Ausführungsform der Erfindung, die hier beschrieben wird und ein Polynukleotid ist, sowohl die Doppelstrangform als auch jede der zwei komplementären Einzelstrangformen, die bekannt sind oder von denen vorhergesagt wird, dass sie die Doppelstrangform ausbilden.
Die folgenden sind nicht beschränkende Beispiele für Polynukleotide: ein Gen oder ein Genfragment, Exons, Introns, mRNS, tRNS, rRNS, Ribozyme, cDNS, rekombinante Polynukleotide, verzweigte Polynukleotide, Plasmide, Vektoren, isolierte DNS jeglicher Sequenz, isolierte RNS jeglicher Sequenz, Nukleinsäuresonden und Primer. Ein Polynukleotid kann aus modifizierten Nukleotiden bestehen, wie beispielsweise methylierten Nukleotiden und Nukleotidanalogen. Analoge von Purinen und Pyrimidinen sind im Stand der Technik bekannt und umfassen, sind aber nicht beschränkt auf, Aziridinylcytosin, 4-Acetylcytosin, 5-Fluorouracil, 5-Bromouracil, 5-Carboxymethylaminomethyl-2-thiouracil, 5-Carboxymethylaminomethyluracil, Inosin, N6-Isopentenyladenin, 1-Methyladenin, 1-Methylpseudouracil, 1-Methylguanin, 1-Methylinosin, 2,2-Dimethylguanin, 2-Methyladenin, 2-Methylguanin, 3-Methylcytosin, 5-Methylcytosin, Pseudouracil, 5-Pentrynyluracil und 2,6-Diaminopurin. Die Verwendung von Uracil als Substitut für Thymin bei einer Deoxyribonukleinsäure wird ebenfalls als analoge Form von Pyrimidin betrachtet.
Falls vorhanden, kann eine Modifikation der Nukleotidstruktur vor oder nach dem Zusammenbau des Polymers bewirkt sein. Die Sequenz des Polynukleotids kann durch Nicht-Nukleotidkomponenten unterbrochen sein. Ein Polynukleotid kann weiter nach der Polymerisierung modifiziert werden, beispielsweise durch Konjugation mit einer markierenden Komponente. Andere Typen von Modifikationen, die in diese Definition eingeschlossen sind, sind z. B. ”Kappen” (engl.: caps), Substitution von einem oder mehreren der natürlich auftretenden Nukleotide durch ein Analogon, Internukleotidmodifikationen, wie z. B. jene mit ungeladenen Bindungen (z. B. Methylphosphonate, Phosphortriester, Phosphoramidate, Carbamate usw.) und mit geladenen Bindungen (z. B. Phosphorthioate, Phosphordithioate usw.), jene, die anhängende Einheiten umfassen, wie z. B. Proteine (z. B. Nukleasen, Toxine, Antikörper, Signalpeptide, Poly-L-Lysin usw.), jene mit Intercalatoren (z. B. Acridin, Psoralen usw.), jene, die Geliermittel enthalten (z. B. Metalle, radioaktive Metalle, Bor, oxidative Metalle usw.), jene, die Alkyliermittel enthalten, jene mit modifizierten Bindungen (z. B. α-anomere Nukleinsäuren usw.) sowie unmodifizierte Formen des Polynukleotids/der Polynukleotide.
Weiterhin kann jede der Hydroxylgruppen, die normalerweise bei den Zuckern vorliegt, durch Phosphonatgruppen, Phosphatgruppen, geschützt durch übliche Schutzgruppen oder aktiviert, um zusätzliche Bindungen an zusätzliche Nukleotide vorzubereiten, ersetzt sein oder an feste Träger konjugiert sein. Die 5'- und 3'-terminalen Hydroxygruppen können phosphoryliert oder mit Aminen oder maskierenden organischen Gruppeneinheiten von 1 bis 20 Kohlenstoffatomen substituiert sein. Andere Hydroxyle können ebenfalls zu Standardschutzgruppen abgeleitet sein.
Polynukleotide können auch analoge Formen von Ribose- oder Deoxyribosezuckern enthalten, die im Stand der Technik allgemein bekannt sind, einschließlich, nicht aber beschränkt auf 2'-O-Methyl-, 2'-O-Allyl, 2'-Fluoro- oder 2'-Azidoribose, karbozyklische Zuckeranaloge, α-anomere Zucker, epimere Zucker, wie beispielsweise Arabinose, Xylose oder Lyxose, Pyranosezucker, Furanosezucker, Sedoheptulose, azyklische Analoge und nicht-basische Nukleosidanaloge, wie beispielsweise Methylribosid.
Wie oben angemerkt wurde, können eine oder mehrere Phosphordiesterbindungen durch alternative Bindungsgruppen ersetzt werden. Diese alternativen Bindungsgruppen umfassen, sind aber nicht beschränkt auf, Ausführungsformen, bei denen Phosphat durch P(O)S (”Thioat”), P(S)S (”Dithioat”), ”{O)NR₂ (”Amidat”), P{O)R, P(O)OR', CO oder CH₂ (”Formaketal”) ersetzt ist, bei denen jedes R oder R' unabängig von den anderen H oder substituiertes oder nicht-substituiertes Alkyl (1-20 C) ist, das optional eine Ether(-O-)Bindung, Aryl, Alkenyl, Cycloalkyl, Cycloalkenyl oder Araldyl enthält. Nicht alle Bindungen in einem Polynukleotid müssen identisch sein.
Obwohl konventionelle Zucker und Basen beim Anwenden der Verfahren der Erfindung verwendet werden werden, kann die Substitution von analogen Formen von Zuckern, Purinen und Pyrimidinen vorteilhaft beim Konstruieren eines Endprodukts sein, ebenso wie alternative Grundgerüststrukturen, wie beispielsweise ein Polyamidgrundgerüst.
Ein ”Antisense”-Polynukleotid ist eine Sequenz, die komplementär zu der Gesamtheit oder eines Teils einer funktionellen RNS oder DNS ist. Z. B. ist Antisense-RNS komplementär zu Sequenzen der mRNS, die von dem Gen kopiert wird.
Ein ”Fragment” (auch als eine ”Region” bezeichnet) eines Polynukleotids (d. h. eines Polynukleotids, das ein sarp kodiert) ist ein Polynukleotid, das mindestens 10 aufeinander folgende Aminosäurereste und noch mehr bevorzugt mindestens 15 aufeinander folgende Aminosäurereste kodiert.
Der Begriff ”rekombinantes” Polynukleotid zielt, so wie er hier verwendet wird, auf ein Polynukleotid von genomischem, cDNS-, halbsynthetischem oder synthetischem Ursprung, das aufgrund seines Ursprungs oder von Manipulation nicht mit der Gesamtheit oder einem Anteil eines Polynukleotids verbunden ist, mit dem es in der Natur verbunden ist, und das das an ein anderes Polynukleotid gebunden ist, als das es in der Natur gebunden ist oder das in der Natur nicht auftritt.
Die Begriffe ”Polypeptid”, ”Oligopeptid”, ”Peptid” und ”Protein” werden hier untereinander austauschbar verwendet, um auf Polymere von Aminosäureresten Bezug zu nehmen. Das Polymer kann linear oder verzweigt sein, es kann modifizierte Aminosäurereste aufweisen, und es kann durch Nicht-Aminosäurereste unterbrochen sein. Der Begriff umfasst auch ein Aminosäurepolymer, das natürlich oder durch Eingriff modifiziert worden ist, z. B. durch Bildung von Disulfidbindungen, Glykosylierung, Lipidierung, Acetylierung, Phosphorylierung oder jegliche andere Manipulation oder Modifikation, wie beispielsweise Konjugation mit einer markierenden Komponente. Ebenfalls in die Definition eingeschlossen sind z. B. Polypeptide, die ein oder mehrere Analoge von Aminosäureresten enthalten (einschließlich z. B. unnatürliche Aminosäurereste usw.), sowie andere Modifikationen, die im Stand der Technik bekannt sind.
Ein Polypeptid-”Fragment” (auch eine ”Region” genannt) eines SARP ist ein Polypeptid, das eine Aminosäuresequenz eines SARP aufweist, die mindestens 10 aufeinander folgende Aminosäurereste aufweist. Zum Zwecke dieser Erfindung kann ein Fragment eines SARP durch jede der folgenden Funktionen identifiziert und charakterisiert werden: (a) Homologie mit einem SARP; (b) Fähigkeit, einen Prozentsatz von Zellen, die Apoptose durchlaufen, zu ändern oder (c) Zelltod zu bewirken. Ein SARP-Fragment kann irgendeine, mehr als eine oder alle der oben identifizierten Funktionen haben. Verfahren zum Bestimmen dieser Funktionen (a) bis (c) werden unten beschrieben werden.
Ein ”Fusionspolypeptid” ist ein Polypeptid, das Regionen an einer unterschiedlichen Position in der Sequenz aufweist, als sie in der Natur auftritt. Die Regionen können normalerweise in separaten Proteinen existieren, und sie werden in dem Fusionspolypeptid zusammengebracht; oder sie können normalerweise in demselben Protein existieren, aber sie werden in dem Fusionsprotein in einer neuen Anordnung platziert.
Ein ”funktionell äquivalentes Fragment” eines SARP-Polypeptids oder eines sarp-Polynukleotids behält mindestens eine Eigenschaft und/oder Funktion des SARP-Polypeptids oder sarp-Polynukleotids bei. Z. B. können die Sequenzen durch Hinzufügen zusätzlicher Nukleotide oder Peptide variiert werden, wie es im Stand der Technik bekannt ist, so dass die Funktionalität der Sequenz nicht verändert ist. Andere Beispiele sind Auslassung und/oder Substitution von Sequenzen. Alternativ können die Sequenzen durch Substituieren von Nukleotiden oder Aminosäureresten oder eine Kombination von Hinzufügung, Auslassung oder Substitution variiert werden. Es ist dem Fachmann klar, dass die Funktionalität einer Polypeptidsequenz Eigenschaften und/oder Aktivitäten der Sequenz, wie beispielsweise Antigenizität und Auswirkungen auf den apoptotischen Übertragungsweg umfasst. Es ist auch klar, dass die Funktionalität einer Polynukleotidsequenz teilweise von ihrer vorgesehenen Verwendung abhängt und dass jegliche Funktionalität, die bei einem Fragment eines Polynukleotids beibehalten wird, diese Definition erfüllt.
Z. B. kann ein ”funktionell äquivalentes Fragment” eines sarp-Polynukleotids ein solches sein, bei dem die Fähigkeit zu hybridisieren beibehalten ist, da das gewünschte Polynukleotid als Sonde verwendet werden kann. Alternativ kann ein ”funktionell äquivalentes Fragment” eines sarp-Polynukleotids bedeuten, dass das Polynukleotid ein Fragment eines SARP kodiert, das eine Funktion hat, die mit einem intakten SARP verbunden ist, und vorzugsweise eine Funktion, die mit Apoptosemodulation verbunden ist. Ein funktionell äquivalentes Fragment der neuen Polypeptide oder Polynukleotide kann dieselbe, eine verbesserte oder reduzierte Funktion aufweisen, wenn es mit den SARP-Polypeptiden oder -Polynukleotiden verglichen wird. Andere Funktionen der SARP sind oben aufgelistet worden. Ein funktionell äquivalentes Fragment weist mindestens 10 Aminosäuren auf, noch mehr bevorzugt weist es mindestens 25 Nukleotide oder mindestens 20 Aminosäuren auf.
”Stringente Bedingungen” für die Hybridisierung sowohl von DNS/DNS als auch DNS/RNS sind so, wie sie bei Sambrook et al. (1989) MOLECULAR CLONING, A LABORATORY MANUAL, 2. Auflage, Cold Spring Harbor Laboratory Press, beschrieben sind. Beispiele für relevante Bedingungen umfassen (in der Reihenfolge ansteigender Stringenz): Inkubationstemperaturen von 25°C, 37°C, 50°C und 68°C; Pufferkonzentrationen von 10 × SSC, 6 × SSC, 1 × SSC (wobei SSC 0,15 M NaCl und 15 mM Zitratpuffer ist) und deren Äquivalent bei Verwendung anderer Puffersysteme; Formamidkonzentrationen von 0%, 25%, 50% und 75%; Inkubationszeiten von 5 Minuten bis 24 Stunden; 1, 2 oder mehr Waschschritte; Waschinkubationszeiten von 1, 2 oder 15 Minuten und Waschlösungen von 6 × SSC, 1 × SSC, 0,1 × SSC oder aus entionisiertem Wasser.
Ein ”stabiles Doppel” von Polynukleotiden oder ein ”stabiler Komplex”, der zwischen jeglichen zwei oder mehr Komponenten in einer biochemischen Reaktion gebildet wird, bezieht sich auf ein Doppel oder einen Komplex, das/der zwischen der Bildung des Doppels oder des Komplexes und der nachfolgenden Detektion, einschließlich optionaler Waschschritte oder anderer Manipulationen, die in der Zwischenzeit erfolgen können, ausreichend langanhaltend besteht.
Der Begriff ”Antikörper” bezieht sich auf ein Immunglobulinprotein- oder Antigen-bindendes Fragment, das ein spezielles Antigen erkennt. Vorzugsweise sind die Antikörper der vorliegenden Erfindung (αSARP bezeichnet) nicht spezifisch für Mitglieder der Frizzled-Proteinfamilie. Antikörper können monoklonal oder polyklonal sein. Die Erzeugung und Charakterisierung von Antikörpern liegt im Fachwissen des Durchschnittsfachmanns. Der Begriff ”Antikörper” schließt weiterhin Proteine ein, die durch chemische Konjugation oder durch Mischen mit einem Hilfsstoff oder Adjuvanz an andere Verbindungen gekoppelt wurden. Der Begriff Antigen-bindendes Fragment umfasst jedes Peptid, das in einer spezifischen Weise an das SARP bindet. Typischerweise umfassen diese Derivate solche Immunglobulinfragmente wie Fab, F(ab')2, Fab', scfv (sowohl monomere als auch polymere Formen) und isolierte H- und L-Ketten. Der Begriff αSARP umschließt Antigen-bindende Fragmente. Ein Antigen-bindendes Fragment behält die Spezifizität des intakten Immunglobulins bei, seine Bindungsneigung und/oder Affinität können jedoch geändert sein.
Die Antigen-bindenden Fragmente (hier auch als ”Derivate” bezeichnet) werden typischerweise durch Gentechnik erzeugt, obwohl sie alternativ durch andere Verfahren und Kombinationen von Verfahren erhalten werden können. Diese Klassifizierung umfasst, aber ist nicht beschränkt auf, konstruierte Peptidfragmente und Fusionspeptide. Bevorzugte Verbindungen umfassen Polypeptidfragmente der CRD, Antikörperfusionsproteine, die Cytokineffektorkomponenten aufweisen, Antikörperfusionsproteine, die Adjuvanzien oder Drogen aufweisen, und Einzelketten-V-Regionproteine. Zusätzlich können die Antigen-bindenden Fragmente dieser Erfindung als diagnostische und abbildende Reagenzien verwendet werden.
Scfv kann entweder rekombinant oder synthetisch produziert werden. Für die synthetische Produktion von scfv kann ein automatischer Synthetisierer verwendet werden. Für die rekombinante Produktion von scfv kann ein geeignetes Plasmid, das ein Polynukleotid enthält, das das scfv kodiert, in eine geeignete Wirtszelle, entweder eukaryotische, wie beispielsweise Hefe-, Pflanzen-, Insekten- oder Säugetierzellen, oder prokaryotische, wie beispielsweise Escherichia coli, eingeführt werden, und das exprimierte Protein kann unter Verwendung von Proteinreinigungsstandardtechniken isoliert werden.
Ein insbesondere nützliches System für die Produktion von scfv ist das Plasmid pET-22b(+) (Novagen, Madison, WI) in E. coli. pET-22b(+) enthält eine Nickelionen-bindende Domäne, die aus 6 sequentiellen Histidinresten besteht und die es erlaubt, das exprimierte Protein auf einem geeigneten Affinitätsharz zu reinigen. Ein anderes Beispiel für einen geeigneten Vektor ist pcDNA3 (Invitrogen, San Diego, CA), wie sie oben beschrieben wurde.
Die Expressionsbedingungen sollten sicherstellen, dass das scfv eine optimale tertiäre Struktur erreicht. Abhängig von dem verwendeten Plasmid (insbesondere der Aktivität des Promotors) und der Wirtszelle, kann es notwendig sein, die Produktionsrate zu modulieren. Z. B. kann die Verwendung eines schwächeren Promotors oder die Expression bei niedrigeren Temperaturen notwendig sein, um die Produktion von ordnungsgemäß gefaltetem scfv in prokaryotischen Systemen zu optimieren; oder es mag bevorzugt sein, scfv in eukaryotischen Zellen zu exprimieren.
Wir stellen auch Antikörper bereit, die an chemisch funktionelle Einheiten konjugiert sind. Typischerweise ist die Einheit eine Markierung, die in der Lage ist, ein detektierbares Signal zu erzeugen. Diese konjugierten Antikörper sind z. B. in Detektions- und abbildenden Systemen nützlich. Solche Markierungen sind im Stand der Technik bekannt und umfassen, sind aber nicht beschränkt auf Radioisotope, Enzyme, fluoreszente Verbindungen, chemilumineszente Verbindungen, biolumineszente Verbindungen, Substratcofaktoren und Inhibitoren. Siehe z. B. von den Patenten, die die Verwendung solcher Markierungen lehren, die US-Patente 3,817,837 ; 3,850,752 ; 3,939,350 ; 3,996,345 ; 4,277,437 ; 4,275,149 und 4,366,241 . Die Einheiten können kovalent an Antikörper gebunden sein, rekombinant verknüpft oder durch ein sekundäres Reagenz zu den Antikörpern konjugiert sein, wie beispielsweise durch einen zweiten Antikörper, Protein A oder einen Biotin-Avidin-Komplex.
Verfahren zur Antikörperproduktion und -isolation sind im Stand der Technik wohl bekannt. Siehe z. B. Harlow und Lane (1988) Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York. Reinigungsverfahren umfassen Salzpräzipitationen (z. B. mit Ammoniumsulfat), Ionenaustauschchromatographie (z. B. in einer kationischen oder anionischen Austauschsäule, die bei neutralem pH-Wert läuft und mit Stufengradienten von ansteigender ionischer Stärke eluiert wird), Gelfiltrationschromatographie (einschließlich Gelfiltrations-HPLC) und Chromatographie auf Affinitätsharzen, wie beispielsweise Protein A, Protein G, Hydroxyapatit und anti-Immunoglobulin. Die Antikörper können auch auf Affinitätssäulen gereinigt werden, die ein SARP-Protein aufweisen; z. B. in der Form eines gereinigten Abt oder Ab3. Vorzugsweise können die Antikörper gereinigt werden unter Verwendung von Protein-A-CL-Sepharose^TM 4B chromatographisch gefolgt von Chromatographie auf einer DEAE-Sepharose^TM 4B-Ionenaustauschsäule.
Eine ”Zelllinie” oder ”Zellkultur” bezeichnet höhere eukaryotische Zellen, die in vitro gezogen oder gehalten werden. Es wird verstanden, dass es sein kann, dass die Abkömmlinge einer Zelle nicht komplett identisch (entweder morphologisch, genotypisch oder phänotypisch) mit den Elternzellen sind.
Eine ”Wirtszelle” umfasst eine individuelle Zelle oder eine Zellkultur, die ein Rezipient für einen Vektor oder für Vektoren oder für das Einbauen von Nukleinsäuremolekülen und/oder Proteinen ist oder gewesen ist. Wirtszellen umfassen die Nachkommen einer einzelnen Wirtszelle, und die Nachkommenschaft muss aufgrund von natürlichen, zufälligen oder willkürlichen Mutationen nicht notwendigerweise vollständig identisch (in der Morphologie oder bei dem genomischen oder Gesamt-DNS-Komplement) mit der ursprünglichen Elternzelle sein. Eine Wirtszelle umfasst Zellen, die in vivo mit einem Polynukleotid/Polynukleotiden dieser Erfindung transfiziert wurden.
Ein ”Vektor” ist ein selbstreplizierendes Nukleinsäuremolekül, das ein eingesetztes Nukleinsäuremolekül in oder zwischen Wirtszellen transferiert. Der Begriff umfasst Vektoren, die primär zur Einsetzung eines Nukleinsäuremoleküls in eine Zelle dienen, eine Replikation von Vektoren, die primär für die Replikation von Nukleinsäure dienen, und Expressionsvektoren, die für die Transkription und/oder Translation der DNS oder RNS dienen. Auch umfasst sind Vektoren, die mehr als eine oder obigen Funktionen bereitstellen. Geeignete Kloniervektoren sind im Stand der Technik bekannt, z. B. jene für die Verwendung in Bakterien-, Säugetier-, Hefe- und Insektenexpressionssystemen. Spezifische Vektoren und geeignete Wirtszellen sind z. B. bei Galesa und Ramji Vectors, John Wiley & Sons (1994) diskutiert. Beispiele für prokaryotische Wirtszellen, die für die Verwendung in dieser Erfindung geeignet sind, umfassen, sind aber nicht beschränkt auf E. coli und Bacillus subtilis. Beispiele für eukaryotische Zellen umfassen, sind aber nicht beschränkt auf Vogel-, Insekten-, Pflanzen- und Tierzellen, wie beispielsweise C057-, HeLa- und CHO-Zellen.
”Expressionsvektoren” sind als Polynukleotide definiert, die dann, wenn sie in eine geeignete Wirtszelle eingeführt werden, in ein Polypeptid/Polypeptide transkribiert und translatiert werden können. Ein ”Expressionssystem” bedeutet üblicherweise eine geeignete Wirtszelle bestehend aus einem Expressionsvektor, der dazu dienen kann, ein gewünschtes Expressionsprodukt zu ergeben.
Eine ”Signalsequenz” ist eine kurze Aminosäuresequenz, die neu synthetisierte sekretorische oder Membranproteine an Zellmembranen, wie beispielsweise das endoplasmische Retikulum, heran- und durch diese hindurchfährt. Signalsequenzen liegen typischerweise in dem N-terminalen Bereich eines Polypeptids und werden abgespalten, nachdem das Polypeptid die Membran überquert hat.
Ein ”Genprodukt” umfasst jegliches Produkt oder jegliche Produkte von Transkription oder Translation eines Gens, einschließlich, aber ohne Beschränkung hierauf mRNS, tRNS und Proteine.
”Heterolog” bedeutet abgeleitet von (d. h. erhalten von) einer genotypisch unterschiedlichen Einheit von dem Rest der Einheit, mit dem verglichen wird. Z. B. kann ein Polynukleotid durch Gentechnik in einem Plasmid oder einem Vektor angeordnet werden, der aus einer unterschiedlichen Quelle erhalten wurde, wodurch es ein heterologes Polynukleotid wird. Ein Promotor, der an eine kodierende Sequenz angehängt wird, mit der er nicht natürlicherweise verknüpft ist, ist ein heterologer Promotor.
Das heterologe Polynukleotid kann eine Sequenz von Interesse für Therapiezwecke aufweisen, und es kann optional in der Form einer Expressionskassette vorliegen. So wie hier verwendet muss ein Vektor nicht zur Replikation in der letztendlichen Zielzelle bzw. dem letztendlichen Subjekt in der Lage sein. Der Begriff umfasst Kloniervektoren für die Replikation eines Polynukleotids und Expressionsvektoren für die Translation einer Polynukleotid-kodierenden Sequenz. Auch eingeschlossen sind Virusvektoren, die ein Polynukleotid eingekapselt oder eingehüllt in einen Viruspartikel aufweisen.
Geeignete Kloniervektoren können gemäß Standardtechniken konstruiert werden, oder sie können aus einer großen Anzahl von im Stand der Technik verfügbaren Kloniervektoren ausgewählt werden. Während der ausgewählte Kloniervektor gemäß der Wirtszelle, die zur Verwendung vorgesehen ist, variieren kann, werden nützliche Kloniervektoren allgemein die Fähigkeit zur Selbstreplikation aufweisen, können ein einziges Ziel für eine bestimmte Restriktionsendonuklease aufweisen oder können Gene für einen Marker tragen, der beim Selektieren von Klonen, die den Vektor enthalten, verwendet werden kann. Geeignete Beispiele umfassen Plasmide und bakterielle Viren, z. B. pUC18, mp18, mp19, pBR322, pMB9, ColE1, pCR1, RP4, Phage-DNS und Shuttlevektoren, wie beispielsweise pSA3 und pAT28. Diese und viele andere Kloniervektoren sind von kommerziellen Händlern, wie beispielsweise BioRad, Stratagene und Invitrogen erhältlich.
Expressionsvektoren sind allgemein replizierbare Polynukleotidkonstrukte, die ein Polynukleotid enthalten, das ein Polypeptid von Interesse kodiert. Das Polynukleotid, das das Polypeptid kodiert, ist wirkend mit geeigneten Transkriptionssteuerelementen, wie beispielsweise Promotoren, Verstärkern und Terminatoren, verbunden. Für die Expression (d. h. Translation) sind üblicherweise ein oder mehrere Translationssteuerelemente, wie beispielsweise Ribosombindungsplätze, Translationsinitiierungsplätze und Stopkodons, ebenfalls erforderlich. Diese (transkriptionalen und translationalen) Steuerelemente können von den sarp-Genen abgeleitet werden, oder sie können heterolog (d. h. von anderen Genen oder anderen Organismen abgeleitet) sein. Eine Polynukleotidsequenz, die ein Signalpeptid kodiert, kann auch eingeschlossen werden, um es einem Polypeptid zu erlauben, Zellmembranen zu überwinden oder in diesen zu verweilen oder von einer Zelle sekretiert zu werden.
Eine Anzahl von Expressionsvektoren, die für die Expression in eukaryotischen Zellen, einschließlich Hefe-, Vogel- und Säugetierzellen geeignet sind, ist im Stand der Technik bekannt. Ein Beispiel für einen Expressionsvektor ist pcDNA3 (Invitrogen, San Diego, CA), bei dem die Transkription durch den frühen Cytomegalovirus (CMV) Promotor/Verstärker getrieben wird. Dieser Vektor enthält auch Erkennungsplätze für mehrere Restriktionsenzyme für das interessierende Polynukleotid. Ein anderes Beispiel für ein(en) Expressionsvektor(-system) ist das Baculovirus-/Insektensystem.
Ein Vektor dieser Erfindung kann ein oder mehrere Polynukleotide enthalten, die ein Polypeptid kodieren. Er kann auch Polynukleotidsequenzen enthalten, die andere Polypeptide kodieren, die das gewünschte Resultat verstärken, erleichtern oder modulieren, wie beispielsweise Lymphokine, einschließlich, aber nicht beschränkt auf IL-2, IL-4 und GM-CSF. Ein bevorzugtes Lymphokin ist GM-CSF. Bevorzugte GM-CSF-Konstrukte sind jene, bei denen die AU-reichen Elemente von den nicht übersetzten 3'-Regionen und Sequenzen in der nicht übersetzten 5'-Region, die in der Lage sind, eine Haarnadelschleife zu bilden, beseitigt worden sind.
Die Vektoren, die die interessierenden Polynukleotide enthalten, können durch jedes einer Anzahl von geeigneten Mitteln, einschließlich Elektroporation; Transfektion unter Verwendung von Kalziumchlorid, Rubidiumchlorid, Kalziumphosphat, DEAE-Dextran oder anderen Substanzen; Mikroprojektilbeschuss; Lipofektion und Infektion (wobei der Vektor ein infektiöses Mittel, wie beispielsweise ein Vaccinia-Virus ist, wie unten diskutiert wird) in die Wirtszelle eingeführt werden. Die Auswahl der Mittel des Einführens von Vektoren oder Polynukleotiden wird oft von den Merkmalen der Wirtszelle abhängen. Nachdem es in eine geeignete Wirtszelle eingeführt wurde, kann die Expression eines Polypeptids unter Verwendung jedes im Stand der Technik bekannten Tests bestimmt werden. Z. B. kann die Anwesenheit eines Polypeptids durch RIA oder ELISA an dem Kulturüberstand (falls das Polypeptid sekretiert wird) oder an Zelllysaten detektiert werden.
Ein ”isoliertes/r” oder ”gereinigtes/r” Polynukleotid, Polypeptid oder Antikörper ist ein solches/r, das/der im Wesentlichen frei von den Materialien ist, mit denen gemeinsam es/er in der Natur auftritt. Mit im Wesentlichen frei von den Materialien, mit denen es/er gemeinsam in der Natur auftritt, ist gemeint, mindestens 50%, vorzugsweise mindestens 70%, mehr bevorzugt mindestens 80% und noch mehr bevorzugt mindestens 90% frei.
Eine biologische ”Probe” umfasst eine Vielzahl von Probentypen, die von einem Individuum erhalten werden, und wird typischerweise in einer diagnostischen Prozedur oder einem diagnostischen Test verwendet. Die Definition umfasst Blut und andere flüssige Proben von biologischem Ursprung, feste Gewebeproben, wie beispielsweise Biopsieproben oder Gewebekulturen oder Zellen, die davon abgeleitet sind, und deren Nachkommen. Die Definition schließt auch Proben ein, die in irgendeiner Weise nach ihrer Erlangung manipuliert worden sind, wie beispielsweise durch Behandlung mit Reagenzien, Auflösung oder Anreicherung in Bezug auf bestimmte Komponenten, wie beispielsweise Proteine oder Polynukleotide. Der Begriff umfasst verschiedene Arten von klinischen Proben, die von jeglicher Gattung erhalten wurden, und umfasst auch, aber ist nicht beschränkt auf, Zellen in Kultur, Zellüberstände, Zelllysate, Serum-, Plasma-, biologische Fluid- und Gewebeproben.
So wie hier verwendet ist ”Behandlung” ein Ansatz, um nützliche oder gewünschte klinische Resultate zu erzielen. Nützliche oder gewünschte klinische Resultate umfassen, sind aber nicht beschränkt auf, Linderung von Symptomen, Abnahme des Ausmaßes der Erkrankung, Stabilisierung (d. h. Nicht-Verschlechterung) des Zustands der Krankheit, Verhinderung des Streuens (d. h. Metastase) von Krankheit, Verzögerung oder Verlangsamung des Krankheitsfortschritts, Verbesserung oder Linderung des Krankheitszustands und Remission (entweder teilweise oder vollständig), sowohl detektierbar als auch nicht detektierbar. ”Behandlung” kann auch die Verlängerung des Überlebens verglichen mit dem erwarteten Überleben in der Abwesenheit der Behandlung bedeuten.
”In Beziehung mit Apoptose stehend” bezieht sich auf jeglichen Zustand, in den der zum Zelltod führende Apoptoseweg verwickelt ist. Diese Zustände können normale oder pathogene biologische Ereignisse sein, und sie können durch eine große Vielfalt von Signalen initiiert werden, einschließlich, aber nicht beschränkt auf, Hormone, Serumwachstumsfaktormangel, chemotherapeutische Mittel, ionisierende Strahlung und Infektionen mit humanem Immunschwächevirus (HIV).
Infarkte werden durch plötzliche Insuffizienz der arteriellen oder venösen Blutversorgung aufgrund von Embolie, Thromben oder Druck verursacht, die einen makroskopischen Bereich von Nekrose erzeugt; üblicherweise sind das Herz, das Hirn, die Milz, die Nieren, der Darm, die Lunge und die Hoden betroffen. Apoptose tritt bei Geweben auf, die den Infarkt umgeben, infolge der Reperfusion von Blut in den Bereich; so könnte eine Modulation aufgrund einer durch einen biologischen Modifizierer induzierten Änderung bei der endogenen Produktion oder bei der in vivo-Transfektion wirksam darin sein, die Ernsthaftigkeit eines Schadens zu reduzieren, der durch Herzanfälle und Schlaganfall verursacht wird.
Chemotherapeutische Mittel, ionisierende Strahlung und Infektion mit HIV initiieren auch den Apoptoseweg. Derzeit wird eine Vielzahl von Nahrungsergänzungsmitteln verwendet, um zu versuchen, die Magen-Darm-Störungen zu mildern, die Chemotherapie, Bestrahlung und AIDS begleiten. Diese Ergänzungsmittel enthalten allgemein Kohlenhydrate, Fette und Pflanzenproteinhydrolysate. Siehe z. B. Tomei und Cope et al. in Apoptosis: The Molecular Basis of Cell Death (1991) Cold Spring Harbor Laboratory Press. Die PCT-Veröffentlichung Nr. WO 95/15173 beschreibt von Pflanzen erhaltene entfettete Extrakte, die in der Lage sind, anti-apoptotische Effekte zu erzeugen. So hat das Beeinflussen der molekularen Basis von mit Apoptose verbundenen Zuständen therapeutischen Nutzen in einer Vielzahl von klinischen Situationen.
”Antisense-Therapie” ist ein Verfahren des Dämpfens der Genexpression unter Verwendung eines therapeutischen Polynukleotids. Das therapeutische Polynukleotid verwandt mit SARP 1 oder 2 weist eine Sequenz bzw. eine komplementäre Sequenz auf, die in der Lage ist, ein stabiles Hybridisierungsprodukt entweder mit dem Zielgen selbst oder noch typischer mit der heteronuklearen oder Messenger-RNS, die davon transkribiert wird, zu bilden. Typischerweise ist das therapeutische Polynukleotid wirkend mit einem geeigneten Promotor verbunden. Das Antisense-Polynukleotid muss nicht das exakte Komplement des Zielpolynukleotids sein, um wirksam zu sein, solange sich unter physiologischen Bedingungen stabile Hybridisierungsprodukte bilden. Abhängig von der Länge des Antisensepolynukleotids kann eine moderate Anzahl von Mutationen, Einsetzungen oder Auslassungen vorliegen. Das Antisense-Polynukleotid muss nicht mit der gesamten, das Zielgen kodierenden Sequenz hybridisieren, obwohl längere Hybridisierungsregionen gegenüber kürzeren bevorzugt sind.
Eine ”wirksame Menge” ist eine Menge, die ausreichend ist, um nützliche oder gewünschte klinische Resultate zu erzielen. Eine effektive Menge kann in einer oder mehreren Dosen verabreicht werden. In Bezug auf die Behandlung ist eine ”effektive Menge” an Polynukleotid und/oder Polypeptid eine Menge, die ausreichend ist, das Fortschreiten von mit Apoptose verbundenen Krankheitszuständen zu mildern, verbessern, stabilisieren, umzukehren, verlangsamen oder zu verzögern oder anderweitig die pathologischen Konsequenzen der Krankheit zu reduzieren. Detektion und Messung dieser Indikatoren der Wirksamkeit werden unten diskutiert. Die effektive Menge wird allgemein durch den Mediziner auf einer von Fall-zu-Fall-Basis bestimmt und liegt innerhalb des Fachwissens. Verschiedene Faktoren werden typischerweise berücksichtigt, wenn eine angemessene Dosierung bestimmt wird. Diese Faktoren umfassen Alter, Geschlecht und Gewicht des Patienten, den behandelten Zustand, die Ernsthaftigkeit des Zustands und die Form des verabreichten Antikörpers. Z. B. muss die Konzentration von scfv nicht so hoch sein wie die von natürlichen Antikörpern, um therapeutisch wirksam zu sein.
Ein ”Individuum” ist ein Wirbeltier, vorzugsweise ein Säugetier, mehr bevorzugt ein Mensch. Säugetiere umfassen Farm- und Sporttiere sowie Haustiere.
Die Erfindung umfasst somit isolierte Nukleotide, die Polypeptide kodieren (oder Komplemente dazu), welche im Wesentlichen identisch mit SARP sind (d. h. mindestens 90% Sequenzidentität damit aufweisen), wie sie durch SEQ. ID. NO: 2, 4, 6 und 7 belegt sind, wobei jegliche Aminosäuresubstitutionen vorzugsweise konservativ sind, oder allele Varianten davon, oder mit einem Homolog von SARP von einer anderen Art als dem Menschen. Die Erfindung umfasst deshalb z. B. jeden einzelnen oder beide Stränge einer cDNS, die ein SARP oder eine allele Variante davon kodiert; eine rekombinante DNS, die in einen Vektor, in ein autonom replizierendes Plasmid oder einen Virus oder in die genomische DNS einer prokaryotischen oder eukaryotischen Zelle eingebaut ist; oder genomische DNS-Fragmente (z. B. produziert durch PKR oder Restriktionsendonukleasebehandlung von humaner oder anderer genomischer DNS). Sie umfasst auch eine rekombinante DNS, die Teil eines Hybridgens ist, das zusätzliche Polypeptide kodiert.
Die isolierte DNS kann in einen Vektor (z. B. einen Virus, eine Phage oder ein Plasmid) eingebaut werden, der durch Transfektion oder Infektion in eine Zelle eingeführt werden kann. Geeignete Vektoren umfassen jedwede, die im Stand der Technik bekannt sind, einschließlich, aber nicht beschränkt auf jene für die Verwendung in Bakterien-, Säugetier-, Hefe- und Insektenexpressionssystemen. Spezifische Vektoren sind im Stand der Technik bekannt und müssen hier nicht im Detail beschrieben werden. Der Vektor kann eine oder mehrere Expressionssteuersequenzen umfassen, in welchem Fall die mit dem Vektor transfizierte Zelle in der Lage ist, das Polypeptid zu exprimieren. Die Vektoren können auch induzierbare Promotoren für die Expression von sarp bereitstellen. Induzierbare Promotoren sind jene, die keine konstitutive Expression des Gens erlauben, aber stattdessen eine Expression nur unter bestimmten Umständen. Solche Promotoren können durch eine Vielzahl von Stimuli induziert werden, einschließlich, nicht aber beschränkt auf Aussetzung einer Zelle, die den Vektor enthält, gegenüber einem Liganden, einem Metallion, anderen Chemikalien oder einer Änderung in der Temperatur.
Diese Promotoren können auch zellspezifisch sein, d. h. nur in einem bestimmten Zelltyp induzierbar und oft nur während eines bestimmten Zeitraums. Der Promotor kann weiterhin Zellzyklus-spezifisch sein, d. h. nur während einer bestimmten Stufe während des Zellzyklus induziert werden oder induzierbar sein. Der Promotor kann sowohl Zelltyp-spezifisch als auch Zellzyklus-spezifisch sein. Jeder induzierbare Promotor, der im Stand der Technik bekannt ist, ist für die Verwendung bei der vorliegenden Erfindung geeignet.
Polynukleotide, die eine gewünschte Sequenz aufweisen, können in einen geeigneten Vektor eingesetzt werden, und der Vektor kann für die Replikation und Verstärkung seinerseits in eine geeignete Wirtszelle eingeführt werden. Polynukleotide können durch jedwedes im Stand der Technik bekannte Mittel in Wirtszellen eingesetzt werden. Zellen werden durch Einführen eines exogenen Polynukleotids mittels direkter Aufnahme, Endocytose, Transfektion, f-Mating oder Elektroporation transformiert. Nachdem es eingeführt ist, kann das exogene Polynukleotid in der Zelle als nicht-integrierter Vektor (wie beispielsweise ein Plasmid) verbleiben oder in das Wirtszellengenom integriert werden. Verstärkte DNS kann von der Wirtszelle durch Standardverfahren isoliert werden. Siehe z. B. Sambrook et al. (1989). RNS kann auch von transformierten Wirtszellen erhalten werden, sie kann durch Verwendung einer DNS-abhängigen RNS-Polymerase erhalten werden.
Die Erfindung umfasst Modifikationen der sarp-DNS-Sequenzen, wie beispielsweise Auslassungen, Substitutionen und Zusätze, insbesondere in den nicht-kodierenden Regionen von genomischer DNS. Solche Änderungen sind nützlich, um das Klonieren zu erleichtern und die Genexpression zu modifizieren. Verschiedene Substitutionen können innerhalb der kodierenden Region gemacht werden, die entweder die kodierten Aminosäurereste nicht ändern oder in konservativ substituierte Aminosäurereste resultieren. Nukleotidsubstitutionen, die die kodierten Aminosäurereste nicht ändern, sind nützlich für das Optimieren der Genexpression in unterschiedlichen Systemen. Geeignete Substitutionen sind dem Fachmann bekannt und werden z. B. gemacht, um die bevorzugte Kodonverwendung in den speziellen Expressionssystemen widerzuspiegeln.
Die Erfindung umfasst funktionell äquivalente Varianten und Derivate von sarp, die die Eigenschaften von SARP verstärken, reduzieren oder nicht signifikant beeinträchtigen. Z. B. sind Änderungen bei der DNS-Sequenz, die die kodierte Aminosäuresequenz nicht ändern, sowie jene, die in konservative Substitutionen der Aminosäurereste, eine oder wenige Aminosäureauslassungen oder Zusätze resultieren und Substitutionen von Aminosäureresten durch Aminosäureanaloge solche, die ihre Eigenschaften nicht signifikant beeinträchtigen werden.
Aminosäurereste, die konservativ durch eine andere substituiert werden können, umfassen jene, sind aber nicht beschränkt auf: Glycin/Alanin; Valin/Isoleucin/Leucin; Asparagin/Glutamin; Aspartansäure/Glutaminsäure; Serin/Threonin; Lysin/Arginin und Phenylalanin/Tyrosin. Jegliche konservative Aminosäuresubstitution, die die Eigenschaften von SARP nicht wesentlich beeinträchtigt, ist von der vorliegenden Erfindung umfasst.
Techniken zur Nukleinsäuremanipulation, die nützlich für die Praxis der vorliegenden Erfindung sind, sind in einer Vielzahl von Quellen beschrieben, einschließlich, aber nicht beschränkt auf Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Auflage, Vol. 1–3, Hrsg. Sambrook et al. Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989); und Current Protocols in Molecular Biology, Hrsg. Ausubel et al., Greene Publishing and Wiley-Interscience: New York (1987) und laufende Aktualisierungen.
Ebenfalls innerhalb der Erfindung liegt ein isoliertes Polynukleotid von mindestens 15 Nukleotiden Länge, vorzugsweise mindestens 30, mehr bevorzugt mindestens 100 und am meisten bevorzugt mindestens 500, einschließlich (a) DNS, die ein SARP kodiert, (b) das Komplement davon; oder eine Doppelstrang-DNS, die sowohl (a) als auch (b) umfasst. Mehrfache Kopien dieser isolierten DNS (nützlich z. B. als Hybridisierungssonde oder PKR-Primer) können synthetisch oder durch rekombinante Mittel produziert werden, indem eine Zelle mit einem Vektor transfiziert wird, der diese DNS enthält.
Die Erfindung umfasst auch gereinigte Präparationen von SARP-Peptiden oder Fragmenten dieser Peptide, die ein antigenes Polypeptid aufweisen, das mindestens 10 Aminosäurereste des Peptids (vorzugsweise mindestens 11, mehr bevorzugt mindestens 14 und am meisten bevorzugt mindestens 18) enthält, welches Polypeptidfragment ein Epitop des Peptids enthält, so dass ein gegen das Fragment (oder gegen ein Konjugat des Polypeptids und, falls nötig, eines Trägermoleküls) gezogener Antikörper einen Immunkomplex mit dem Peptid selbst bildet. Reinigung oder Isolation von SARP, die entweder von der rekombinanten DNS oder von biologischen Quellen exprimiert wurden, können durch jedwedes im Stand der Technik bekannte Verfahren erreicht werden. Allgemein sind im Wesentlichen gereinigte Proteine jene, die frei von anderen verunreinigenden zellulären Substanzen, insbesondere Proteinen, sind. Vorzugsweise sind die gereinigten Peptide zu mehr als 80% rein und mehr bevorzugt zu mehr als 95%.
Geeignete Verfahren der Proteinreinigung sind im Stand der Technik bekannt und umfassen, sind aber nicht beschränkt auf, Affinitätschromatographie, Immunaffinitätschromatographie, Größenausschlusschromatographie, HPLC und FPLC. Jegliches Reinigungsschema, das nicht in eine wesentliche Verschlechterung des Proteins resultiert, ist zur Verwendung bei der vorliegenden Erfindung geeignet.
Die Erfindung weist weiterhin geeignete Antikörper auf, die durch Verwendung eines SARP als Antigen oder vorzugsweise von Peptiden, die Regionen von SARP umfassen, denen wesentliche Homologie mit den anderen Genprodukten, wie beispielsweise den Frizzled-Proteinen, fehlt, erzeugt werden. Solch ein Antikörper kann entweder polyklonal oder monoklonal sein, und er wird durch Standardverfahren einschließlich des Schritts des Immunisierens eines Tiers mit einem Antigen, das einen antigenen Anteil mindestens eines SARP enthält, erzeugt.
Auch eingeschlossen in die Erfindung sind Hybridpolypeptide, die enthalten: (1) SARP oder ein antigenes Fragment davon, das kovalent an (2) ein zweites Polypeptid befestigt ist. Solche Hybridpolypeptide können durch eine Anzahl von Standardtechniken hergestellt werden, die dem Durchschnittsfachmann wohl bekannt sind, einschließlich rekombinanter Verfahren, in welchem Fall die kovalente Befestigung eine Peptidbindung ist, oder chemischer Konjugation, in welchem Fall die kovalente Befestigung ein anderer Typ von Bindung ist, wie beispielsweise eine Disulfidbindung. Verbinden von SARP oder eines antigenen Fragments davon mit einem zweiten Polypeptid stellt ein Mittel zum schnellen Isolieren des Hybrids von einer Mischung von Proteinen durch die Verwendung einer Affinitätssäule bereit, an die das zweite Polypeptid (z. B. Glutathiontransferase) direkt anbindet. Solche Hybridpolypeptide können auch den Vorteil einer erhöhten Immunogenizität gegenüber SARP oder einem Fragments davon haben, so dass Antikörper schneller erhalten werden.
Sowohl die isolierten Nukleotide der Erfindung als auch die Antikörper der Erfindung beim Detektieren von SARP-Expression sind nützlich. Jegliches Verfahren zum Detektieren bestimmter mRNS-Arten ist für die Verwendung bei diesem Verfahren geeignet. Dies wird leicht unter Verwendung von PKR bewirkt. Vorzugsweise entsprechen die Primer, die für die PKR ausgewählt werden, den Regionen der sarp- Gene, denen wesentliche Homologie mit anderen Genen fehlt. Alternativ können Northern-Blots verwendet werden, um sarp-mRNS unter Verwendung von Sonden, die für diese Gene spezifisch sind, zu detektieren. Verfahren zum Verwenden von PKR und Northern-Blots sind im Stand der Technik bekannt und werden hier nicht detailliert beschrieben.
Transgene Tiere außer Menschen, die die sarp-Nukleotide enthalten, können ebenfalls hergestellt werden. Verfahren zum Herstellen transgener Tiere sind im Stand der Technik bekannt und müssen hier nicht detailliert beschrieben werden. Für eine Übersicht über Verfahren, die verwendet werden, um transgene Tiere herzustellen, siehe z. B. die PCT-Publikation Nr. WO 93/04169 . Vorzugsweise exprimieren solche Tiere rekombinante sarp unter der Steuerung eines zellspezifischen und noch mehr bevorzugt eines Zellzyklus-spezifischen Promotors.
In einer anderen Ausführungsform werden diagnostische Verfahren bereitgestellt, um die Expression der neuen Genfamilie außer SARP 3 entweder auf dem Proteinniveau oder dem mRNS-Niveau zu detektieren. Abnorme Niveaus von SARP werden wahrscheinlich in den Geweben von Patienten mit Erkrankungen gefunden, die mit einer unüblichen Apoptose verbunden sind; Diagnoseverfahren sind deshalb nützlich zum Detektieren und Überwachen biologischer Zustände, die mit solchen Apoptosedefekten verbunden sind.
Detektionsverfahren sind auch nützlich zum Überwachen des Erfolgs von mit SARP in Beziehung stehenden Therapien. Sowohl die isolierten sarp-Nukleotide als auch die Antikörper der Erfindung sind in diagnostischen Verfahren nützlich. Ein solches diagnostisches Verfahren umfasst die Schritte des Bereitstellens einer Testzelle (z. B. in der Form einer Gewebesektion oder einer Zellpräparation) von einem gegebenen Gewebetyp; des Kontaktierens der mRNS der Testzelle mit einer Nukleinsäuresonde, die eine Sequenz im Antisense zu (d. h. komplementär zu dem Sense-Strang eines) Segments eines sarp-Gens enthält. Das Segment ist mindestens 15 Nukleotide lang, vorzugsweise mindestens 20, mehr bevorzugt mindestens 30, noch mehr bevorzugt mindestens 40 und am meisten bevorzugt mindestens 100 Nukleotide lang. Die Menge an Hybridisierung der Sonde an die mRNS der Testzelle wird mit der Menge an Hybridisierung der Sonde an die mRNS einer normalen Kontroll-(d. h. nicht-apoptotischen)Zelle von demselben Gewebetyp verglichen. Eine erhöhte Menge an Hybridisierung bei der Testzelle ist ein Hinweis darauf, dass die Testzelle ein erhöhtes Auftreten an Apoptose haben wird. Der Test kann bequemerweise unter Verwendung von Standardtechniken der in situ-Hybridisierung oder Northern-Analyse durchgeführt werden.
Die Antikörper-basierten Tests der Erfindung sind vergleichbar mit dem obigen. Die Proteine der Testzellen oder von einem Fluid, in dem die Testzellen schwimmen, werden mit einem Antikörper (polyklonal oder monoklonal) kontaktiert, der spezifisch für ein SARP ist, und die Menge an Immunkomplex, der mit solchen Proteinen geformt wird, wird mit der Menge verglichen, die von demselben Antikörper mit den Proteinen einer normalen Kontrollzelle von demselben Gewebetyp wie die Testzelle (oder einem Fluid, in dem die normalen Zellen schwimmen) gebildet werden.
Obwohl nicht Teil der Erfindung wird eine Behandlung von mit Apoptose verbundenen Zuständen bereitgestellt, einschließlich ex vivo-Tranfektion mit der sarp-Genfamilie, wobei Zellen, die von Tieren, einschließlich Menschen, entfernt wurden, mit Vektoren transfiziert werden, die SARP oder sarp kodieren, und in die Tiere wieder eingeführt werden. Geeignete transfizierte Zellen umfassen individuelle Zellen oder Zellen, die innerhalb ganzer Gewebe enthalten sind. Zusätzlich kann die ex vivo-Transfektion die Transfektion von Zellen umfassen, die von einem anderen Tier als dem tierischen oder humanen Subjekt, in das die Zellen letztlich eingeführt werden, abgeleitet sind. Solche Transplantate umfassen, sind aber nicht beschränkt auf Allotransplantate, Xenotransplantate und Transplantationen von fötalem Gewebe.
Wir stellen auch eine Antisense-Therapie bereit, um die Niveaus an SARP zu dämpfen. Antisense-Polynukleotide müssen nicht das exakte Komplement des Zielpolynukleotids sein, um wirksam zu sein, so lange wie unter physiologischen Bedingungen stabile Hybridisierungsprodukte gebildet werden. Eine moderate Anzahl von Mutationen, Einsetzungen oder Auslassungen kann vorliegen, abhängig von der Länge des Antisense-Polynukleotids. Vorzugsweise ist die komplementäre Sequenz des Antisense-Polynukleotids einschließlich Basenunterschieden, -einsetzungen und -auslassungen zu 50% identisch mit derjenigen des Targets. Mehr bevorzugt sind die Sequenzen ungefähr 75% identisch, noch mehr bevorzugt sind sie ungefähr 85% identisch, noch weiter bevorzugt sind sie ungefähr 95% identisch, und am meisten bevorzugt sind sie vollständig identisch. Das Antisense-Polynukleotid muss nicht mit der gesamten SARP-kodierenden Sequenz hybridisieren, obwohl längere hybridisierende Regionen gegenüber kürzeren bevorzugt sind. Vorzugsweise ist die hybridisierende Region mindestens ungefähr 30 Basen lang, mehr bevorzugt beträgt sie mindestens etwa 60 Basen, noch mehr bevorzugt beträgt sie mindestens etwa 100 Basen, und am meisten bevorzugt beträgt sie mindestens etwa 200 Basen oder mehr.
Im Wesentlichen jeder Zell- oder Gewebetyp kann auf diese Weise behandelt werden. Geeignete Zellen umfassen, sind aber nicht beschränkt auf Herzmuskelzellen und Lymphozyten. Z. B. werden bei der Behandlung von HIV-infizierten Patienten durch das oben beschriebene Verfahren die weißen Blutzellen von dem Patienten entfernt und sortiert, um die CD4⁺-Zellen zu erhalten. Die CD4⁺-Zellen werden dann mit einem Vektor transfiziert, der entweder SARP oder Antisense zu sarp kodiert, und wieder in den Patienten eingeführt. Alternativ können die unsortierten Lymphozyten mit einem rekombinanten Vektor transfiziert werden, der mindestens einen sarp-Modulator unter der Kontrolle eines zellspezifischen Promotors aufweist, so dass nur CD4⁺-Zellen die sarp-Gene exprimieren oder nach unten regulieren. In diesem Fall wäre der CD4-Promotor ein idealer Promotor; jedoch kann jeder geeignete CD4⁺-T-Zellen-spezifische Promotor verwendet werden.
Die Praxis der vorliegenden Erfindung verwendet, soweit nichts anderes angegeben ist, konventionelle molekularbiologische Techniken, die innerhalb des Fachwissens liegen. Siehe z. B. ”Molecular Cloning: A Laboratory Manual”, 2. Auflage (Sambrook et al., 1989); ”Oligonucleotide Synthesis” (M. J. Gait, Hrsg., 1984); ”Animal Cell Culture” (R. J. Freshney, Hrsg., 1987); ”Methods in Enzymology” (Academic Press, Inc.); ”Handbook of Experimental Immunology” (D. M. Wei & C. C. Blackwell, Hrsg.); ”Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells” (J. M. Miller & M. P. Calos, Hrsg., 1987); ”Current Protocols in Molecular Biology (F. M. Ausubel et al., Hrsg., 1987); ”PCR: The Polymerase Chain Reaction”, ”Mullis et al., Hrsg., 1994); ”Current Protocols in Immunology”, J. E. Coligan et al., Hrsg., 1991).
Die folgenden Beispiele werden bereitgestellt, um die vorliegende Erfindung zu illustrieren, aber nicht zu beschränken.
Beispiel 1
Identifikation und Klonieren der cDNS der sarp-Familie
Zellen und Gewebe
Alle Zelllinien wurden von der American Type Culture Collection (ATCC) erhalten und gemäß den Empfehlungen des Lieferanten gezogen und gehalten.
Gewebeproben für eine RNS-Isolation wurden von männlichen 20 g BALB/c-Mäusen (Babko) genommen. Die primären Herzmuskelzellen wurden von Herzen von einen Tag alten Sprague Dawley-Ratten gemäß einer Technik präpariert, die von Simpson (1985) beschrieben wird. Die Ischämie wurde in einem serum- und glukosefreien RPMI-Medium durch Inkubieren der Zellen über 8 Stunden bei 37°C in einer Atmosphäre von 95% N₂/5%Co₂ durchgeführt. Die Reperfusion nach der Ischämie wurde durch Zugeben von fötalem bovinem Serum (FBS) bis auf 10%, Glukose bis auf 2 g/l und Anordnen der Zellen in 5% CO₂ bei 37°C für 16 Stunden stimuliert. Für Virusinfektionen wurden die Zellen mit der angemessenen Menge der infektiösen Partikel in serumfreiem Medium bei 37°C für 2 stunden inkubiert. Dann wurde das Medium durch das reguläre Wachstumsmedium (RPMI/10% FBS) ersetzt. Die Adenovirustiter wurden durch beschränkende Verdünnung und Plaquetests unter Verwendung von 293-Zellen bestimmt, die den Virusverdünnungen ausgesetzt wurden. Die Anzahl der Viren, die in der Lage waren, 80–90% der Zellen zu infizieren, wurde mit den β-Galaktosidase-Virus-infizierten Zellen und X-Gal-(5-Brom-4-chlor-3-indolyl-β-D-galaktosid)-Färbung bestimmt.
Oligonukleotidsynthese
Primer für das DNS-Sequenzieren und PKR-Adapter wurden auf einem Applied Biosystems Modell 394 synthetisiert sowie unter Verwendung von Sep-Pak C18-Patronen (Water Associates) gelgereinigt und entsalzt. Ein 14-mer (5' CCTGTAGATCTCCC 3', SEQ. ID. NO: 15) und ein 18-mer (5' ATTTCGGAGATCTACAGG 3', SEQ. ID. NO: 16) Oligonukleotid wurden mit dem EcoRI-BglII-Adapter verwendet. Für differentielle Anzeigereaktionen wurden ein freies d(N10) und ein verankertes Oligo(T), wie beispielsweise TTTTTTTTTTTTTTTNS (SEQ. ID. NO: 17) verwendet.
RNS-Isolation
RNS von unterschiedlichen Zelllinien und Geweben wurde unter Anwendung des Guanidin-Isothiocyanat-Verfahrens von Chomezinski und Sacchi (1987) isoliert. Die RNS-Konzentration wurde durch Spektrophotometrie bestimmt (Sambrook et al., 1989). 20 μg Proben der Gesamt-RNS wurden Elektrophorese in einem 1,2% Agarose-Formaldehyd-Gel unterworfen (Sambrook et al., 1989) und unter Verwendung von Ehtidiumbromid sichtbar gemacht. RNS wurde dann unter Verwendung von 10 × SSC (1 × SSC ist 0,15 M NaCl/0,015 M Na-Zitrat) durch Diffusion auf eine Nylonmembran (Hybond N+, Amersham) gemäß dem Verfahren von Lichtenstein et al. (1990) transferiert. Membran-gebundene RNS wurde durch UV-Bestrahlung vernetzt, wie von den Herstellern empfohlen wird.
Differentielle Anzeige
Zum differentiellen Anzeigen von Reaktionen des ersten Strangs wurde cDNS unter Verwendung von 2 μg Gesamt-RNS synthetisiert, die entweder von logarithmisch wachsenden oder in Ruhe befindlichen 10T1/2-Zellen isoliert wurde. Die Strangsynthese wurde unter Verwendung eines verankerten Oligo(dT) mit Superscript Reverse Transcriptase (Gibco) gemäß dem Protokoll des Herstellers gestartet. In PKR-Reaktionen wurden freie d(N10)- und verankerte Oligo(dT)-Primer verwendet. Die PKR-Bedingungen waren im Wesentlichen dieselben wie ursprünglich bei Lang & Pardee, 1992, publiziert. Die PKR-verstärkten cDNS-Produkte wurden auf einem 6% DNS-Sequenziergel aufgelöst (Sambrook et al., 1989). Differentiell angezeigte Bänder wurden aus dem Gel ausgeschnitten, erneut unter Verwendung derselben Primer und Bedingungen verstärkt und in pCRScript (Stratagene) eingesetzt.
Konstruktion der cDNS-Bibliothek
Die 10T1/2-Fibroblasten-λZAP II-basierte Maus-cDNS-Bibliothek wurde im Wesentlichen so konstruiert, wie bei (Zapf et al. 1990) beschrieben ist, aber mit einigen Modifikationen. Zwei 40 μl Reaktionsmischungen wurden präpariert, die 10 μg hitzedenaturierte Poly(A+)RNS, 1x First Strand Buffer (Gibco BRL), 10 mM DTT, 50 U RNase Block (Stratagene), jeweils 2 mM dATP, dCTP, dGTP und dTTP, 10 μCi [a-³²P]dCTP, 400 U Superscript Reverse Transcriptase II (Gibco) enthielten. 2,5 μg Oligo(dT) wurde zu einer Reaktionsmischung zugegeben und 25 μg d(N6) zu der anderen Mischung. Beide Reaktionsmischungen wurden für 1 Stunde bei 42°C inkubiert und durch Aufheizen auf 65°C für 10 min gestoppt. Eine Synthese des zweiten Strangs wurde durchgeführt, indem zuerst 362 μl H₂O, 80 μl 5x Reaktionspuffer für den zweiten Strang (100 mM Tris-HCl, pH(7,5), 500 mM KCl, 25 mM MgCl₂, 50 mM DTT) und 1,5 μl 15 mg/ml BSA zu den Reaktionen des ersten Strangs hinzu gegeben wurden. Die Synthese des zweiten Strangs wurde durch Zugeben von 12 μl 10 U/μl E. coli-DNS-Polymerase I (NEB) und 2,5 μl 1 U/μl RNase H (Pharmacia) gestartet. Die Reaktionen wurden für 1 Stunde bei 15°C und 1 Stunde bei Raumtemperatur inkubiert. Die beiden Reaktionen, bei denen es sich jetzt um Doppelstrang-c-DNS handelte, wurden kombiniert und an die EcoRI-BglII-Adapter ligatiert (Zapf et al. 1990). Niedrigmolekulargewichtige cDNS-Spezies und nicht-ligatierte Adapter wurden unter Verwendung von Bio-Gel A-15m Chromatographie (Bio Rad) separiert. Die Ligation der cDNS an λZAP II/EcoRi/ClAP (Stratagene) wurde gemäß den Anweisungen des Herstellers durchgeführt. Die Konfektionierung und die Titration wurden im Wesentlichen gemäß den Instruktionen des Lieferanten (Stratagene) durchgeführt. Eine Bibliothek von 8 × 10⁶ unabhängigen rekombinanten Klonen wurde erhalten.
Klonieren der differentiell angezeigten Gene von Mauszellen.
Um msarp1-cDNS zu isolieren, wurde die Bibliothek der in Ruhe befindlichen 10T1/2-Zellen unter Verwendung des PKR-Einsatzes als Sonde gescreened. Ungefähr 2,5 × 10⁵ bis 3,0 × 10⁵ rekombinante Phagen wurden in E. coli-XL-BIue (Stratagene) plattiert und gemäß den Anweisungen des Herstellers auf Nitrozellulosefilter (Millipore) transferiert. Die DNS-Fragmente wurden gemäß dem Verfahren, das in Feinberg und Vogelstein (1984) Anal. Biochem. 137: 266–267 beschrieben ist, ³²P-markiert und verwendet, um die Bibliothek gemäß dem Verfahren zu screenen, das bei Keifer et al. (1991) beschrieben ist.
Der größte Klon, msarp1, wurde dann für weitere Analysen ausgewählt. DNS-Sequenzieren von msarp1 wurde unter Verwendung von M13-vorwärts- und internen spezifischen Primern durch das Sanger & Nicholson-Dideoxynukleotidverfahren durchgeführt.
Das msarp1-Gen enthält einen einzigen ausgedehnten offenen Leserahmen, der ein vorhergesagtes Proteinprodukt von 295 Aminosäuren (mSARP1), 252 bp an nicht übersetzter 5'-Sequenz und 891 bp an nicht übersetzter 3'-Sequenz mit zwei putativen Polyadenylierungssignalen, die 637 bp und 234 bp von dem 3'-Ende positioniert. Interessanterweise enthält die nicht übersetzte 3'-Region elf konservierte 3'-UTR/HMG-Motive, von denen angenommen wird, dass sie in einen posttranskriptionalen Abbau von mRNS verwickelt sind (Reeves et al., 1987). Globale Ausrichtung der msarp1-Sequenz gegenüber Entrez (14:0) unter Verwendung des MacVector-Pakets ergab Homologie mit Genen, die die sieben transmembranen Rattenproteinhomologe des Drosophila melanogaster frizzled (fz)-Genprodukts kodieren.
Das msarp1-Gen hat keine Transmembranregionen, und die C-terminale Region ist reich an basischen Aminosäuren. msarp1 weist einen hydrophoben Abschnitt auf, der eine Signalsequenz darstellen mag.
Mehrfache Ausrichtung unter Verwendung von Entrez und der NCBI-Gensequenzdatenbanken zeigte starke Homologie zwischen der N-terminalen Region von mSARP1 und den extrazellulären Teilen von Maus- (1B), Ratten- und humanen Genprodukten. Die C-terminale Region von mSARP1 enthält mehrere kurze Polypeptidabschnitte, die Homologie zu den Plätzen von frizzled-Proteinen zeigen, welche zwischen den Transmembranregionen positioniert sind. Die EST-Datenbank ergab eine 400 bp DNS-Sequenz isoliert von einer humanen Brust-cDNS-Bibliothek, die 75% Identität mit msarp1 zeigte.
Klonieren von humanen cDNS
Eine humane Pankreas- und eine humane Herz-cDNS-Bibliothek wurden von Clontech erhalten und unter Verwendung von msarp1-cDNS als Sonde gescreened. Zwei cDNS-Klone, hsarp1 und hsarp3, wurden aus der Pankreas-Bibliothek geborgen und weiterer Analyse unterworfen. Ein Klon, hsarp2, wurde von der humanen Herz-cDNS erhalten. Die hsarp2-cDNS-Sequenz [SEQ. ID. NO: 18] enthält 1302 Nukleotide. Die Sequenz voller Länge umfasst 301 Nukleotide der nicht übersetzten 5'-Region und 62 Nukleotide der nicht übersetzten 3'-Region. Die hsarp2-cDNS enthält ein Haupt-ORF (hSARP2). Der ATG-Startplatz wird bei Position 303 gefunden, und der Terminierungsplatz liegt bei Position 1248. Das hsarp2-Gen kodiert ein Polypeptid von 314 Aminosäureresten mit einem N-terminalen Methionin und einem C-terminalen Lysin. Der Klon hsarp1 ist 890 Nukleotide lang und kodiert ein Polypeptid mit ungefähr 95% Homologie zu msarp1. Das ATG von hsarp1 liegt bei Position 203, und es gibt einen putativen Signalpeptiderkennungsplatz 23 Aminosäuren stromab des N-Terminus. Der hsarp3-Klon umfasst 1923 Nukleotide und kodiert ein Polypeptid von 316 Aminosäuren einschließlich eines putativen 28 Aminosäuren-Sekretionssignals an dem N-Terminus.
Beispiel 2
Expression von neuen Genen in Gewebetypen
Isolierte DNS-Fragmente wurden mit [³²P]dCTP (3000 Ci/mmol, Amersham) in einer zufallsgesteuerten Anlassreaktion gemäß Feinberg und Vogelstein (1982), supra, markiert. Hybridisierung wurde gemäß dem Standardprotokoll durchgeführt, das bei Sambrook et al. (1989), supra, beschrieben ist. Die Membranen wurden zweimal mit 2 × SSC bei Raumtemperatur für 30 Minuten gewaschen. Nach zwei zusätzlichen Waschungen bei 56°C in 0,1 × SSC, 0,1% SDS, wurden die Membranen auf Kodak X-Omat-Filme autoradiographiert.
Expression von msarp1 in Mausgewebe
Um die msarp1-Expression in Mausgeweben zu analysieren, wurden Northern-Blots von verschiedenen Mausgeweben gemäß dem Standardprotokoll präpariert. Die Resultate sind in 2 gezeigt. Hohe Niveaus an Expression wurden im Mäuseherz und der Mäuselunge detektiert. Detektierbare Mengen an Transkript traten auch in der Niere auf. Keine anderen Mausgewebe exprimierten die RNS, welche msarp1 entspricht. Keine Expression von msarp1 wurde in transformierten Zelllinien FL5.12; WI-L2; S49; HT29; MCF7 detektiert.
Expression von neuen Genen in humanem Gewebe
Um die Expression der sarp-Genfamilie in humanen Geweben zu bestimmen, wurden mehrere humane Clontech-Gewebe-Northern-Blots mit markiertem hsarp1, hsarp2 und hsarp3 als Sonde, wie oben beschrieben wurde, getestet. Die 3A (hsarp2) und 3B (hsarp1 und hsarp3) zeigen die gewebespezifische Expression von hsarp1, hsarp2 und hsarp3.
Die Resultate weisen darauf hin, dass hsarp2 in nahezu allen analysierten Gewebetypen exprimiert wird (3A). Hybridisierung zeigte ein RNS-Band der Größe von ungefähr 5,0 kb. Die höchsten Niveaus an hsarp1-Expression wurden in der Pankreas, dem Kolon, der Prostata und dem Dünndarm gefunden. 3B. Niedrigere Niveaus der Expression wurden im Herzen, dem Hirn, der Lunge, der Skelettmuskulatur und der Prostata gefunden. Thymusdrüse, Niere, periphere Blutleukozyten, Hoden, Eierstock, Plazenta, Leber, Niere und alle fötalen humanen Gewebe weisen schwache oder keine Signale auf. Hybridisierung an allen Gewebetypen außer Hirn ergab zwei Transkripte von 2,1 kb und 1,6 kb in der Länge, was wahrscheinlich eine alternative Verwendung der zwei Polyadenylierungssignale widerspiegelt, die in 3'-UTR identifiziert wurden.
hsarp3 wird vornehmlich in der Pankreas exprimiert und weist nur ein RNS-Transkript einer Größe von 2,1 kb auf (3B).
Die Expression von hsarp2 in verschiedenen transformierten und nicht-transformierten Zelllinien wurde analysiert. Keine hsarp2-Expression wurde in allen analysierten transformierten Zelllinien beobachtet. Die Expression von hsarp2 ist bei exponentiell wachsenden humanen nicht-transformierten Brustzellen detektierbar und wird unterdrückt, wenn die Zellen einen Zustand in Ruhe erreichen (4). Dasselbe Expressionsmuster von hsarp2 wurde bei normalen humanen diploiden Fibroblastenzellen gesehen.
Beispiel 3
Expression von msarp1 in 10T1/2-Zellen
Um die differentielle Expression von msarp1 zu bestimmen, wurde die Transkription des Gens in 10T1/2-Zellen ausgewertet. Signifikante Induktion von msarp1-Transkription wurde gesehen, als die 10T1/2-Zellen einen Zustand in Ruhe erreichten (siehe 5). Zellen gewachsen bis auf einen Zustand in Ruhe wurden mit niedriger Dichte erneut in drei Platten geimpft. Zu unterschiedlichen Zeitpunkten nach dem erneuten Impfen wurden Zellen von einer der Platte für eine RNS-Isolation extrahiert, wobei die Zellen der zweiten Platte für eine Zellzyklusanalyse verwendet wurden, und die dritte Platte von Zellen für 24 Stunden ohne Serum blieb, um die Anzahl der toten Zellen abzuschätzen.
5 gibt die Northem-Hybridisierung des differentiell vorgeführten DNS-Fragments an die RNS-Proben wieder, die von den 10T1/2-Zellen in unterschiedlichen Wachstumsphasen isoliert wurden: 1–3 – exponentiell wachsende, 90 bis 95% zusammenfließende bzw. in Ruhe befindliche (G₀) Zellen; 4–6 – die in Ruhe befindlichen Zellen wurden erneut in niedrigerer Dichte plattiert und nach 0, 2 bzw. 6 Stunden geerntet. 5 weist darauf hin, dass die msarp1 entsprechende Nachricht kurz nach dem erneuten Impfen verschwindet. Analyse der zweiten Platte wies darauf hin, dass die erneut geimpften Zellen 16 Stunden nach dem erneuten Impfen in den Zellzyklus eintreten. Keine signifikante Änderung in der Anzahl der toten Zellen wurde bei den Serum-entzogenen Platten beobachtet. Diese Resultate weisen darauf hin, dass in den ersten 2–3 Stunden nach dem erneuten Impfen in niedriger Dichte in Ruhe befindliche Zellen einen antiapoptotischen Faktor oder antiapoptotische Faktoren in ausreichenden Mengen produzierten, um eine für in Ruhe befindliche Zellen typische Beständigkeit gegenüber Serumentzug beizubehalten.
Da kürzlich gezeigt wurde, dass Medien, die mit exponentiell wachsenden 10T1/2-Zellen konditioniert waren, auch Apoptose verhindern, analysierten wir auch die msarp1-Expression in Serum-entzogenen exponentiell wachsenden Zellen. RNS wurde zu unterschiedlichen Zeitpunkten nach der Serumentfernung isoliert. Hybridisierung ergab signifikante Induktion der msarp1-Nachricht um 16 Stunden nach der Serumentfernung. Keine Induktion von msarp1 wurde in Zellen beobachtet, die in serumfreiem Medium angereichtert mit TPA gezogen wurden.
Beispiel 4
Expression von msarp1 nach ischämischer Verletzung von Herzmuskelzellen
Wir hatten zuvor gezeigt, dass ischämische Verletzung von Myokardialzellen Apoptose während der Reperfusion auslöst. Weiterhin hatten wir auch gezeigt, dass der humane Klon, hsarp1, in adultem Herzgewebe, aber nicht in fötalem Herzgewebe exprimiert wird. Um die msarp1-Expression zu bestimmen, die sich auf ischämische Verletzung und Apoptose bezieht, wurden Herzmuskelzellen einer Bandbreite von stressauslösenden Stimuli ausgesetzt. RNS isoliert von diesen Zellen wurden elektrophorisiert und auf eine Hybridisierungsmembran transferiert. Mit msarp1 als Sonde getestete Blots zeigten eine Aufwärtsregulation von msarp1 bei allen gestressten Zellen. Wie in dem Fall von humanem fötalen Herzgewebe wurden keine RNS-Arten, die msarp1 entsprechen, in ungestressten primären Herzmuskelzellen gefunden, die von neugeborenen Ratten erhalten wurden.
Beispiel 5
mSARP1-Peptid wechselwirkt mit Zelloberflächenproteinen
mSARP1 wurde stabil in MCF7-Zellen tranfiziert, indem zunächst ein Sac1-Fragment von msarp1 in die EcoRV/Not1-Plätze in pcDNA3 eingeführt wurde. Das pcDNA3-Konstrukt wurde dann unter Verwendung von LipofectAMINE-Reagenz (Gibco BRL) gemäß den Anweisungen des Herstellers in MCF7-Zellen transfiziert.
Zur indirekten Immunfärbung wurden trypsinisierte Zellen mit Kaninchen-anti-mSARP1-Antiseren in einer Verdünnung von 1:100 für 1 Stunde bei 4°C inkubiert. Die Zellen wurden dreimal mit mit 1% BSA angereichertem PBS gewaschen und dann mit 20 μg/ml FITC-markierten sekundären Antikörpern (Boehringer Mannheim) inkubiert. Die Zellen wurden auf einem Becton-Dickinson-FACS-System analysiert, und die resultierenden Daten wurden unter Verwendung der CellQuest^TM-Software (Becton Dickinson) analysiert.
Beispiel 6
Apoptotische Effekte von hSARP2
Das NotI/XbaI-Fragment von hsarp2 wurde in die NotI/XbaI-Plätze des Säugetierexpressionsvektors pcDNA3 (Invitrogen) eingesetzt. MCF7-Brustkarzinomzellen wurden mit diesem Konstrukt unter Verwendung von LipofectAMINE-Reagenz (Gibco BRL) gemäß dem Protokoll des Herstellers transfiziert. Der Prozentsatz der lebenden Zellen wurden durch Zählen der relativen Menge an anhängenden Zellen unter Verwendung eines Coulter Counter (NZ) abgeschätzt. Wir in 6 gezeigt ist, verursacht hsarp2-Expression eine Abnahme bei dem Prozentsatz der lebensfähigen Zellen. Die Zellen wurden auch mit hTNF (50 ng/ml) und Adriamycin (1 μg/ml) behandelt. Die erhaltenen Resultate sind in 6 dargestellt.
Beispiel 7
Effekt von mSARP1 auf Herzmuskelzellentod
RNS von primären Herzmuskelzellen neugeborener Ratten wurde nach Behandlungen, die Zelltod induzieren, wie beispielsweise Glukose-, Serum- oder Serum-und-Glukose-Entzug, isoliert. Ischämie wurde durch Anordnen der Zellen für 8 Stunden in Sauerstoff- und Wachstumsfaktor-entzogene Bedingungen simuliert, gefolgt von 16 Stunden Inkubation in normaler Umgebung (worauf mit ”Reperfusion” Bezug genommen wird). Die Northern-Hybridisierung, die in 7 vorgestellt wird, zeigt, dass sarp1-Expression in den Zellen, die diese Behandlungen überleben, nach oben geregelt ist.
In einem zweiten Experiment wurden in hoher Dichte plattierte Herzmuskelzellen mit rekombinanten Viren in einer vielfachen Überzahl von 50 bis 100 infektiösen Partikeln pro Zelle infiziert. Der msarp1- enthaltende rekombinante Adenovirus wurde durch Unterklonieren des entsprechenden cDNS-SacI-Fragments in den NotI/EcoRV-Platz eines Replikations-defizienten pAdLXR-1-Adenovirusvektors konstruiert. Der Virus, der das β-Galaktosidase-Gen trägt, wurde als Kontrolle verwendet. Nach der Infektion wurden die Zellen für 24 Stunden einem Serumentzug oder einer Behandlung mit Adriamycin unterworfen. Die Zelllebensfähigkeit wurde als Prozentsatz der unter experimentellen Bedingungen, die von jenen der Kontrollproben genommen wurden, anhaftenden Zellen berechnet. Die Resultate, die in 8 dargestellt werden, zeigen, dass nach Serumentzug oder Adriamycin-Behandlung die Menge an lebensfähigen msarp1-virusinfizierten Zellen signifikant höher ist als bei β-Galaktosidase-infizierten oder nicht infizierten Kontroll-Zellen.
Beispiel 8
Effekt von SARP-Expression auf Apoptose
C3H/10T1/2-Zellen wurden in basalem Eagle-Medium (BME) angereichert mit 10% hitzeinaktiviertem fötalen bovinen Serum (FBS) bei 37°C in einer angefeuchteten 5% CO₂-Atmosphäre ohne Antibiotika gezogen. Die Zellen wurden in 2 × 10³ Zellen/ml ausplattiert und alle 3–4 Tage gefüttert. Ungefähr 2 Wochen nach der anfänglichen Impfung waren die Zellen vollständig in Ruhe, und wenige mitotische Zellen, falls überhaupt, lagen vor. Um den Effekt des Serumentzugs oder der Cycloheximidbehandlung zu analysieren, wurden die sich exponentiell vermehrenden (ungefähr 75% Zusammenfluss) oder in Ruhe befindlichen Kulturen in serumfreies Medium oder Medium, das mit 10 μg/ml Cycloheximid angereichert war, transferiert. Nach 24 Stunden wurden die apoptotischen (d. h. nicht anhaftenden) Zellen und die nicht-apoptotischen (d. h. anhaftenden) Zellen separat gesammelt, und ihre Mengen wurden unter Verwendung eines Zellzählers (Coulter Counter ZM) ausgewertet. Serumfrei konditioniertes Medium wurde nach 24 Stunden Inkubation der in Ruhe befindlichen 10T1/2-Zellen in BME erhalten. Die RNS wurde durch das Guanidin-Isothiocyanat-Verfahren isoliert, das bei Chomezinskil und Sacchi (1987) Anal. Biochem. 162: 156–59 beschrieben ist. 20 μg Proben der Gesamt-RNS wurden Elektrophorese in 1,2% Agarose-Formaldehyd-Gel unterworfen. Sambrook et al. (Hrsg.) (1989).
Es ist kürzlich gezeigt worden, dass sich exponentiell vermehrende 10T1/2-Zellen besonders empfindlich gegenüber Serumentzug sind und durch Apoptose sterben. Tomei et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 853–857. 9A zeigt, dass nach 24 Stunden in einem serumfreien Medium ungefähr 50% der Zellen ablösen und als apoptotisch befunden werden. Wenn die Kulturen ihren dichteabhängigen Ruhezustand erreichen, werden die Zellen resistent gegenüber dem Entziehen von Wachstumsfaktoren und anderen Serumkomponenten.
In gleicher Weise sind in Ruhe befindlichen Zellen signifikant widerstandsfähiger gegenüber zytotoxischen Effekten von Staurosporin, Menadion und cis-Platin. Dies sind pro-apoptotische Mittel mit unterschiedlichen Wirkungsmechanismen. Während der exponentiellen Vermehrung wird Apoptose durch die Zugabe von Cycloheximid verzögert. Im Gegensatz dazu induziert die Inhibierung der Proteinsynthese sehr schnell Tod bei festgehaltenen in Ruhe befindlichen Zellen bei G₀ (9A). Apoptose von G₀ wird auch durch Puromycin induziert sowie Inhibition von RNS-Synthese durch Actinomycin D oder α-Amanitin. Diese Resultate implizieren, dass bei in Ruhe befindlichen 10T1/2-Kulturen die Zellen alle Komponenten des apoptotischen Übertragungswegs besitzen, aber die Aktivierung durch ein Protein/durch Proteine unterdrückt wird, das/die für den Zustand in Ruhe spezifisch ist/sind. Dieser Standpunkt ist konsistent mit der Beobachtung, dass konditioniertes Medium von in Ruhe befindlichen 10T1/2-Zellen apoptotischen Tod sowohl von Serum-entzogenen exponentiell wachsenden als auch Cycloheximid-behandelten in Ruhe befindlichen 10T1/2-Zellen inhibieren kann (9B). Diese Resultate weisen stark darauf hin, dass das anti-apoptotische Protein/die anti-apoptotischen Proteine von 10T1/2-Zellen in Ruhe sekretiert wird/werden und die Antwort von benachbarten Zellen beeinflusst/beeinflussen.
Um cDNS, die dieser mRNS-Spezies entspricht, zu klonieren, wurden die in Ruhe befindlichen 10T1/2-Zellen, humane Herz- und Pankreas-cDNS-Bibliotheken unter Verwendung des differentiell dargebotenen DNS-Fragments als Sonde gescreened. Vier unterschiedliche Rekombinanten wurden identifiziert. Zwei von diesen, die von 10T1/2 und humaner Pankreas gescreened wurden, waren ortholog und wurden als msarp1 und hsarp1 bezeichnet. Die anderen beiden Klone, hsarp2 und hsarp3, wurden von der humanen Herz- bzw. Pankreas-Bibliothek erhalten. Mit der Ausnahme von hsarp1 haben diese cDNS-Klone einen ausgedehnten offenen Leserahmen, der Proteine voller Länge vorhersagt, welche verschiedene gemeinsame strukturelle Eigenschaften teilen. Ausgehend von dem N-Terminus folgen den hydrophoben putativen Signalpeptiden die reifen Proteinsequenzen, 270–300 Aminosäuren lang, mit 16 invarianten Cysteinen. Von diesen sind 10 Cysteine in den N-terminalen 110 bis 130 Aminosäurensegmenten lokalisiert, die 25–30% identisch mit der extrazellulären Cystein-reichen Domäne (”CRD”) von frizzled-artigen Proteinen sind. Keine der hsarp-Gruppe enthält Transmembranregionen, die charakteristisch für frizzled-artige Proteine sind. Wang et al. (1996) J. Biol. Chem. 271: 4468–4476. Das partielle Polypetidsequenzieren von hSARP1 ergab ungefähr 95% Identität mit dem mSARP1.
Die MCF7-Brustadenokarzinomzelllinie wurde als Modell ausgewählt, um die Verwicklung von SARP-Proteinen in die Apoptoseprozesse zu studieren. Der programmierte Zelltod dieser Zellen, der durch unterschiedliche Mittel induziert wird, ist gut charakterisiert worden. Zyed et al. (1994) Cancer Res. 54: 825–831. Dieser Zelltyp exprimiert weder sarp1 noch sarp2. MCF7-Zellen wurden stabil mit einem pcDNA3-Säugetierexpressionsvektor transfiziert, der msarp1 oder hsarp2 voller Länge trägt. Die Transfektanten, die msarp1 und hsarp2 exprimieren, wurden durch Northern-Hybridisierung selektiert. Die Wachstumsrate und der Zellzyklus von transfizierten MCF7-Zellen unterschieden sich nicht signifikant von denjenigen der Elternzellen; die Resultate, die in 10(A) dargestellt sind, demonstrieren jedoch, dass die Expression von mSARP1 und hSARP2 gegenteilige Effekte auf die Zellempfindlichkeit gegenüber zytotoxischen Stimuli hatte. Die Expression von mSARP1 resultierte in einem höheren Widerstand, die Expression von hSARP2 machte die Zellen empfindlich gegenüber Apoptose induziert durch TNF und durch Ceramid, ein sekundärer Botenstoff bei dem apoptotischen Übertragungsweg, welcher durch verschiedene Mittel verursacht wird. Hannun und Obeid (1995) T. Biochem. Sci. 20: 73–7; und Kolesnik und Fuks (1995) J. Exp. Med. 181: 1949–52.
Aufgrund der Tatsache, dass SARP die Signalsequenzen, aber keine Transmembrandomänen aufweisen, wurde geglaubt, dass sie sekretierte Proteine sind. Diese Theorie wurde wie folgt getestet. Polyklonale anti-mSARP1-Antikörper wurden gegen das rekombinante GST-mSARP1-Protein gezogen und unter Verwendung einer MBP-mSARP1-Affinitätssäule affinitätsgereinigt. Bakterielle Expression von GST-mSARP1- und MBP-mSARP1-Fusionsproteinen wurde unter Verwendung des pGEX-5X-2-(Pharmacia) bzw. pMAL-(NEB)-vektors durchgeführt. Für anti-hSARP2-Antikörper wurde ein Polypeptid, das von der nicht-Frizzled-artigen C-terminalen Domäne (167–185aa) (SEQ. ID. NO: 19) des Proteins erhalten wurde, als Immunogen verwendet. Unter Verwendung der resultierenden affinitätsgereinigten anti-mSARP1- oder anti-hSARP2-Antikörper wurden die sekretierten Proteine in den konditionierten Medien sowohl von den transformierten MCF7-Zellen als auch den nicht-transformierten, in Ruhe befindlichen 10T1/2 detektiert (10(C)). Namentlich Wechselwirken die mSARP-Antikörper nicht mit hSARP2.
Die Experimente beschrieben die Identität einer neuen Familie von Genen, die in der Lage sind, eine zelluläre apoptotische Antwort auf zytotoxische Signale zu modulieren. Es ist wichtig, das hohe Maß an Sequenzähnlichkeit zwischen SARP-CRD und den ähnlichen Regionen der frizzled-Proteine festzustellen, einer Klasse von Zellmembranrezeptoren mit sieben Transmembrandomänen. Bei Drosophila melanogaster sind frizzled-Proteine in die Regulation der Borsten- und Haarpolarität verwickelt. Adler (1192) Cell 69: 1073–1087. Kürzlich wurde die Fähigkeit von Dfz2, einem Mitglied der frizzled-Proteinfamilie, berichtet, als Rezeptor für Wingless-Protein zu dienen. Bhanot et al. (1996) Nature 382: 225–230. Wingless ist ein Mitglied der Wnt-Genfamilie, deren Produkte in die Zellen-Zellen- und Zellen-extrazelluläre Matrix-Wechselwirkung verwickelt sind. Nusse und Varmus (1992) Cell 69: 1073–1087. Sekretierte Proteine SARP sind in die Regulierung der Wnt-frizzled-Protein-Wechselwirkung verwickelt. Aus diesem Gesichtspunkt ist es interessant, dass die Expression der Mitglieder aller drei Genfamilien, frizzled, Wnt und sarp, gewebespezifisch ist. Wang et al. (1996); Nusse und Varmus (1992); Gavin et al. (1990) Genes and Devel 4: 2319–2332; und Chan et al. (1992) J. Biol. Chem. 267: 25202–25207. Die Rolle der Zellen-Zellen- und Zellen-extrazelluläre Matrix-Wechselwirkung bei der Regulierung von Apoptose ist wohl dokumentiert. Rouslahti und Reed (1994) Cell 77: 477–478; Bates et al. (1994) Cell. Biol. 125: 403–415; und Boudreau et al. (1995) Science 267: 891–893. So sind unter anderen Funktionen alle drei Genfamilien in die Regulation des programmierten Zelltods verwickelt.
Beispiel 9
Vergleich der hsarp-Expression in normalen und neoplastischen humanen Zellen
In diesem Beispiel wurden normale und neoplastische humane Gewebe bezüglich ihrer Expression von hsarp-Genen ausgewertet. Normale und neoplastische Prostata-Epithelialgewebe wurden auf hsarp1-Expression getestet, und normale und neoplastische Brustgewebe wurden auf hsarp2-Expression getestet.
Die Experimente wurden wie folgt durchgeführt: zuerst wurden Digoxigenin-(DIG)-markierte hsarp-RNS-Sonden unter Verwendung des RNS-DIG-Markierkits (Boehringer Mannheim GmbH, Concord, CA) gemäß dem Protokoll erhalten, das in Nonradioactive in Situ Hybridization Application Manual, 2. Auflage, 1996, Seite 44, angegeben ist. Dann wurden 5 μm Formalin-fixierte, Paraffin-eingebettete Krebsgewebe(-Prostataepithelial- oder Brust-)-Sektionen mit der entsprechenden DIG-markierten hsarp1- oder hsarp2-RNS-Sonde hybridisiert. Letztlich wurde die Detektion von mRNS unter Verwendung eines Genius-Kits (Boehringer Mannehim GmbH, Concord, CA) gemäß dem Protokoll durchgeführt, das in Nonradioactive in Situ Hybridization Application Manual, 2. Auflage, 1996, Seite 127, angegeben ist.
11 (Prostataepithelialgewebe) und 12 (Brustgewebe) zeigen die Resultate. Die Expression von hsarp1 ist in Prostatatumorzellen verglichen mit der Normalgewebekontrolle erhöht, wie durch die überall vorhandenen dunklen Bereiche in den 10x- und 40x-Krebsproben verglichen mit der normalen Probe deutlich wird. Die Expression von hsarp2 wird in Brustkrebszellen verglichen mit der Normalgewebekontrolle unterdrückt. Diese Resultate unterstützen die anti- und proapoptotische Aktivität von hSARP1 bzw. hSARP2. Dieses Beispiel zeigt, dass die Detektion von sarp-Genprodukten in Geweben verwendet werden kann, um eine Vielzahl von Krankheiten zu diagnostizieren, die in die Modulation von hsarp-Expression verwickelt sind, einschließlich Krebse. Weiterhin können Körperfluidproben ebenfalls für solche diagnostische Zwecke verwendet werden, weil hSARP sekretierte Proteine sind.
Während dieses Beispiel speziell die Verwendung von in situ Hybridisierung unter Verwendung einer mRNS-Sonde für die Detektion von sarp-Genprodukten demonstriert, sind alternative Verfahren zum Detektieren der Anwesenheit von Aminosäuren oder Nukleinsäuren sowohl im Gewebe als auch im Körperfluid im Stand der Technik wohl bekannt. Weiterhin ist ein Fachmann auf diesem Gebiet in der Lage, basierend auf den hier offenbarten oder durch Bezugnahme eingeschlossenen Referenzen geeignete Sonden für die Verwendung in den Verfahren der vorliegenden Erfindung auszuwählen.
Beispiel 10
Expression von SARP modifiziert die intrazellulären Niveaus an β-Catenin
In den vorangegangenen Beispielen wurde gezeigt, dass die sarp-Gene sekretierte Proteine kodieren, die in der Lage sind, die Zellantwort auf pro-apoptotische Stimuli zu modifizieren. Dieses Experiment wertet die Fähigkeit von SARP-Proteinen aus, in den Wnt-frizzled-Proteinsignalübertragungsweg einzugreifen. Kürzlich wurde gezeigt, dass frizzled-Proteine als Rezeptoren für Mitglieder der Wnt-Proteinfamilie dienen. Yang-Snyder et al. (1996) Curr Biol. 6: 1302–6; Bhanot et al. (1996) Nature 382: 225–30; Orsulic et al. (1996) Current Biology 6: 1363–11267; und Perrimon (1996) Cell 86: 513–516.
Wechselwirkung von Wnt-Familienmitgliedern mit ihrem jeweiligen frizzled-Rezeptor verursacht Inaktivierung von Glykogensynthasekinase 3β (GSK-3) oder ihres Drosophila-Homologs Zw-3. Pai et al. (1997) Development 124: 2255–66; Cook et al. (1996) EMBO J. 15: 4526–4536; und Siegfried et al. (1994) Nature 367: 76–80. In der Abwesenheit von Wnt phosphoryliert GSK-3β β-Catenin (Armadillo ist sein Drosophila-Homolog). Phosphoryliertes β-Catenin oder Armadillo wird schneller als die nicht-phosphorylierte Form des Proteins abgebaut. Perrimon (1996) Cell 86: 513–516; Siegfried et al. (1994) Nature 367: 76–80; Rubinfeld et al. (1996) Science 272: 1023–6; und Yost et al. (1996) Genes and Development 10: 1443–1454. Als Resultat verursacht die Wnt-Signalisierung Änderungen bei der extrazellulären Konzentration von β-Catenin oder Armadillo, und dieser Parameter ist verwendet worden, um Wnt-frizzled-Proteinwechselwirkung und -Signalübertragung zu registrieren. Bhanot et al. (1996) Nature 382: 225–30. Weil SARP lösliche Proteine sind, die eine Domäne besitzen, die homolog zu CRD von frizzled-Proteinen ist, wurde die Hypothese aufgestellt, dass sie durch Interferenz mit der Wnt-frizzled-Proteinwechselwirkung funktionieren.
Kürzlich wurde gezeigt, dass β-Catenin in Kolonkrebs (Korinek et al. (1997) Science 275: 1784–7; und Morin et al. (1997) Science 275: 1787–90); und Melanomen (Rubinfeld et al. (1997) Science 275: 1790–2) akkumulierte, die Mutationen bei Tumorsuppressor-APC aufwiesen. Darüber hinaus ist die Regulation von β-Catenin kritisch für den tumorsuppressiven Effekt von APC. Morin et al. (1997) Science 275: 1787–90. Die hier beschriebenen Resultate zeigen eine Korrelation zwischen den Niveaus an β-Catenin und der Expression der SARP-Familienmitglieder, die pro- oder anti-apoptotische Aktivität besitzen. Ein höheres Niveau an β-Catenin in Tumoren ist mit einer Reduktion beim apoptotischen Zelltod verbunden, ein charakteristisches Merkmal von Karzinogenese. Thompson (1995) Science 267: 1456–1462.
Um zu bestimmen, ob SARP mit Wnt-frizzled-Proteinwechselwirkung interferieren, wurde die Expression von β-Catenin in MCF7-Transfektanten verglichen. Die Experimente wurden wie folgt durchgeführt. Zellkulturen. MCF7-humane Brustadenokarzinomzellen wurden zu 2 × 10⁵ Zellen/ml plattiert und in modifiziertem Eagle-Medium (MEM) angereichert mit 10% FBS kultiviert. Serumfreies konditioniertes Medium wurde nach 24 Stunden Inkubation von in Ruhe befindlichen MCF7-Zellen in MEM erhalten.
Transfektion von MCF7. MCF7-Zellen wurden unter Verwendung von LipofectAMINE-Reagenz (Gibco) gemäß dem Protokoll des Herstellers mit dem pcDNA3-Säugetierexpressionsvektor (Invitrogen) transfiziert, der entweder keinen Einsatz, msarp1- oder hsarp2-cDNS enthielt. Stabile Transfektanten und drei Wochen später Klone, die von einzelnen Zellen abstammten, wurden mit 1 mg/ml G418 selektiert, und die Expression der jeweiligen Gene wurde durch Northern-Hybridisierung bestätigt.
Immunhistochemie. Paraformaldehyd-fixierte transfizierte MCF7-Zellen, gezogen auf 4 Loch-Lab-Tek-Kammerprobenträgern wurden mit monoklonalem anti-β-Catenin-IgG (Transduction Laboratories) als Sonde getestet. Färben wurde durch das Avidin-Biotin-Perodydase-System (Vector Laboratories) unter Verwendung von Diaminobenzidin als Substrat durchgeführt. IgG isoliert von präimmunem Serum wurde als negative Kontrolle verwendet.
Western-Immunblot. Für die Western-Analyse wurden die Proben von konditionierten Medien unter Verwendung des CENTRIPREP-10-Konzentrators (AMICON) konzentriert. Zellen wurden in Extraktionspuffer geerntet, der aus 20 mM tris-HCl (pH 7,8), 5 mM MgCl₂, 250 mM Sucrose, 1% NP40 bestand. Nach 1 Stunde Inkubation auf Eis wurden die Extrakte durch Zentrifugation geklärt. Proteinkonzentrationen der Zellextrakte wurden unter Verwendung des DC Protein Assay Kits (Bio Rad) bestimmt. Gleiche Mengen an Proteinen wurden SDS/PAGE unterworfen (Sambrook, J., et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2. Auflage) (CSHL Press), auf Nitrocellulosemembranen überführt und mit dem polyklonalen affinitätsgereinigten anti-GST-mSARP1-IgG (1 μg/ml) oder monoklonalem anti-β-Catenin-IgG (Transduction Laboratories) als Sonde getestet.
Die Resultate erscheinen in 13, ein Bild eines Western-Immunblots, das zeigt, dass die Expression von SARP2 die intrazelluläre Konzentration von β-Catenin senkt. Der Effekt von SARP1 auf die Niveaus an β-Catenin ist komplizierter. Der Western-Blot war nicht empfindlich genug, um eine signifikante Differenz zwischen SARP1 und der Kontrolle zu erkennen, aber immunhistochemische Daten ergaben eine höhere Konzentration an β-Catenin in den SARP1-Transfektanten. Aus diesen Ergebnissen heraus ist klar, dass die Expression von SARP die intrazellulären Niveaus an β-Catenin modifiziert, was unterstützt, dass SARP mit dem Wnt-frizzled-Proteinsignalübertragungsweg interferieren.
Dieses Beispiel unterstützt, dass sarp 1- und 2-Gene und ihre Produkte nicht nur verwendet werden können, um eine Vielzahl von Krankheiten, die mit der Modulation von hsarp-Expression verbunden sind, einschließlich Krebsen, zu diagnostizieren, sondern auch aktiv in die Aktion dieser Krankheiten auf einem intrazellulären Niveau einzugreifen und diese Krankheiten dadurch zu behandeln.
Weiterhin umfasst die vorliegende Erfindung Verfahren zum Screenen nach potentiell therapeutischen Mitteln, die die Wechselwirkung zwischen SARP und Wnt-frizzled-Proteinen modulieren, durch Vergleichen der Effekte von SARP auf die Wnt-frizzled-Signalübertragung in der Anwesenheit oder Abwesenheit des fraglichen therapeutischen Mittels. Allgemein kann solch ein Drogenscreeningtest durchgeführt werden durch (a) Kombinieren eines Wnt-Proteins und eines SARP 1- oder 2-Proteins unter Bedingungen, bei denen sie Wechselwirken, um eine Testprobe auszubilden; (b) Aussetzen der Testprobe gegenüber einem potentiell therapeutischen Mittel und (c) Überwachen der Wechselwirkung des SARP-Proteins und des frizzled-Proteins, wobei ein potentiell therapeutisches Mittel für weitere Studien ausgewählt wird, wenn es die Wechselwirkung verglichen mit einer Kontrolltestprobe, zu der kein potentiell therapeutisches Mittel zugegeben wurde, modifiziert.
SEQUENCE LISTING

Claims

Isoliertes Polynukleotid ausgewählt aus der Gruppe, die besteht aus: (a) einem Polynukleotid, das ein Polypeptid codiert, welches eine Aminosäuresequenz mit mindestens 90% Identität zu SEQ. ID. NO: 2, SEQ. ID. NO: 4, SEQ. ID. NO: 6 oder SEQ. ID. NO: 7 über die gesamte Länge der genannten SEQ. ID. NO: 2, SEQ. ID. NO: 4, SEQ. ID. NO: 6 oder SEQ. ID. NO: 7 aufweist; (b) einem Polynukleotid, das ein Fragment einer Nukleinsäuresequenz ist, welche SEQ. ID. NO: 6 codiert, wobei das Fragment ein Polypeptid codiert, das aus mindestens zehn aufeinander folgenden Aminosäureresten von SEQ. ID. NO: 6 besteht; und (c) einem Polynukleotid, das ein Fragment einer Nukleinsäuresequenz ist, welche SEQ. ID. NO: 7 codiert, wobei das Fragment ein Polypeptid codiert, das aus mindestens zehn aufeinander folgenden Aminosäureresten von SEQ. ID. NO: 7 besteht.
Isoliertes Polynukleotid nach Anspruch 1, wobei das Polynukleotid ein Fragment einer Nukleinsäuresequenz ist, welche SEQ. ID. NO: 6 oder SEQ. ID. NO: 7 codiert, wobei das Fragment ein Polypeptid codiert, das aus mindestens 15 aufeinander folgenden Aminosäureresten von SEQ. ID. NO: 6 oder SEQ. ID. NO: 7 besteht.
Isoliertes Polynukleotid nach Anspruch 1, wobei das Polynukleotid ein Polypeptid codiert, das eine Aminosäuresequenz aufweist, die aus der Gruppe ausgewählt ist, welche aus SEQ. ID. NO: 2, SEQ. ID. NO: 4, SEQ. ID. NO: 6 und SEQ. ID. NO: 7 besteht.
Isoliertes Polynukleotid ausgewählt aus der Gruppe, die besteht aus: (a) einem Polynukleotid, das eine Nukleinsäuresequenz aufweist, die aus der Gruppe ausgewählt ist, welche besteht aus SEQ. ID. NO: 1, SEQ. ID. NO: 3, SEQ. ID. NO: 5 und SEQ. ID. NO: 18; (b) einem Polynukleotidfragment von SEQ. ID. NO: 5, das aus mindestens 25 aufeinander folgenden Nukleotiden der codierenden Region von SEQ. ID. NO: 5 besteht; (c) einem Polynukleotidfragment, das aus mindestens 500 aufeinander folgenden Nukleotiden einer Nukleinsäuresequenz besteht, die aus der Gruppe ausgewählt ist, welche besteht aus: SEQ. ID. NO: 1 und SEQ. ID. NO: 3; (d) einem Polynukleotidfragement von SEQ. ID. NO: 18, das aus mindestens 30 aufeinander folgenden Nukleotiden der codierenden Region von SEQ. ID. NO: 13 besteht; (e) einem Polynukleotid, das eine Nukleinsäuresequenz aufweist, die vollständig komplementär zu einer Nukleinsäuresequenz von (a), (b) oder (c) ist; und (f) einem Polynukleotid, das eine Nukleinsäuresequenz aufweist, die vollständig komplementär zu mindestens 200 aufeinander folgenden Nukleotiden des codierenden Strangs von SEQ. ID. NO: 18 ist.
Isoliertes Polynukleotid nach Anspruch 4, wobei das Polynukleotid ein Fragment einer Nukleinsäuresequenz ist, die aus der Gruppe ausgewählt ist, welche besteht aus SEQ. ID. NO: 5 und SEQ. ID. NO: 18, wobei das Fragment aus mindestens 100 aufeinander folgenden Nukleotiden der codierenden Region der SEQ. ID. NO: 5 oder SEQ. ID. NO: 18 besteht.
Isoliertes Polynukleotid nach Anspruch 4 wobei das Polynukleotid ein Fragment einer Nukleinsäuresequenz ist, die aus der Gruppe ausgewählt ist, welche besteht aus SEQ. ID. NO: 1, SEQ. ID. NO: 3, SEQ. ID. NO: 5 und SEQ. ID. NO: 18, wobei das Fragment aus mindestens 500 aufeinander folgenden Nukleotiden der codierenden Region der genannten SEQ. ID. NO: 1, SEQ. ID. NO: 3, SEQ. ID. NO: 5 oder SEQ. ID. NO: 18 besteht.
Isoliertes Polynukleotid nach Anspruch 4, wobei das Polynukleotid eine Nukleinsäuresequenz aufweist, die aus der Gruppe ausgewählt ist, welche besteht aus SEQ. ID. NO: 1, SEQ. ID. NO: 3, SEQ. ID. NO: 5 und SEQ. ID. NO: 18.
Isoliertes Polypeptid codiert durch das Polynukleotid nach einem der Ansprüche 1 bis 3.
Fusionspolypeptid, das (1) das isolierte Polypeptid nach Anspruch 8 kovalent angehängt an (2) ein zweites Polypeptid aufweist.
Rekombinanter Expressionsvektor, der eine Polynukleotidsequenz nach einem der Ansprüche 1 bis 3 aufweist.
Rekombinanter Klonvektor, der eine Polynukleotidsequenz nach einem der Ansprüche 1 bis 7 aufweist.
Wirtszelle transformiert durch das Polynukleotid nach einem der Ansprüche 1 bis 3 oder durch den Vektor nach einem der Ansprüche 10 oder 11.
Monoklonaler oder isolierter polyklonaler Antikörper, der spezifisch für ein Protein ist, welches durch das Polynukleotid nach einem der Ansprüche 1 bis 3 codiert ist.
Antikörper nach Anspruch 13, der ein monoklonalen Antikörper ist.
Verfahren zum Detektieren von SARP-Proteinexpression, wobei das SARP-Protein eine Aminosäuresequenz aufweist, die aus der Gruppe ausgewählt ist, welche besteht aus SEQ. ID. NO: 2, SEQ. ID. NO: 4, SEQ. ID. NO: 6 und SEQ. ID. NO: 7, wobei das Verfahren die Schritte aufweist: (a) Kontaktieren der Proteine einer Testzelle mit dem Antikörper nach einem der Ansprüche 13 oder 14 unter Bedingungen, die die Bildung eines stabilen Komplexes zwischen den Proteinen der Testzelle und dem Antikörper erlauben; und (b) Vergleichen der Menge an Immunkomplex, der mit den Proteinen der Testzelle gebildet wird, mit der Menge an Immunkomplex, der mit den Proteinen einer nicht apoptotischen Zelle von demselben Gewebetyp wie die Testzelle gebildet wird.
Verfahren zum Erkennen von SARP-Proteinexpression, wobei das SARP Protein eine Aminosäuresequenz aufweist, die aus der Gruppe ausgewählt ist, welche besteht aus SEQ. ID. NO: 2, SEQ. ID. NO: 4, SEQ. ID. NO: 6 und SEQ. ID. NO: 7, wobei das Verfahren die Schritte aufweist: (a) Kontaktieren der mRNS einer Testzelle mit einer Nukleinsäuresonde, die eine Antisensesequenz zu einem Segment von mindestens 15 Nukleotiden Länge von SEQ. ID. NO: 1, SEQ. ID. NO: 3, SEQ. ID. NO: 5 oder SEQ. ID. NO: 18 aufweist, unter Bedingungen, die die Bildung eines stabilen Komplexes zwischen der mRNS der Testzelle und der Nukleinsäuresonde erlauben; und (b) Vergleichen der Menge an Hybridisierung der Sonde an die mRNS der Testzelle mit der Menge an Hybridisierung der Sonde an die mRNS einer nicht apoptotischen Zelle desselben Gewebetyps wie die Testzelle.
Verfahren zum Diagnostizieren einer Krankheit, die mit der Modulation von SARP-Expression verbunden ist, wobei das SARP-Protein eine Aminosäuresequenz aufweist, die aus der Gruppe ausgewählt ist, welche besteht aus SEQ. ID. NO: 4 und SEQ. ID. NO: 7, wobei das Verfahren aufweist: (a) Testen einer Gewebetestprobe auf die Anwesenheit eines Genprodukts eine hsarp-Gens, wobei das hsarp-Gen eine Aminosäuresequenz codiert, die aus der Gruppe ausgewählt ist, welche besteht aus SEQ. ID. NO: 4 und SEQ. ID. NO: 7; und (b) Vergleichen der Menge an Genprodukt, das in der Testprobe detektiert wird, mit der Menge an Genprodukt, das in einer nicht erkrankten Probe desselben Gewebetyps wie die Testprobe detektiert wird.
Verfahren nach Anspruch 17, wobei das Genprodukt eine hsarp-mRNS, die eine Nukleinsäuresequenz aufweist, die aus der Gruppe ausgewählt ist, welche besteht aus SEQ. ID. NO: 3 und SEQ. ID. NO: 18, oder ein Protein ist, das eine Aminosäuresequenz aufweist, die aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus SEQ. ID. NO: 4 und SEQ. ID. NO: 7 ausgewählt ist.
Verfahren nach Anspruch 17, wobei das Genprodukt eine hsarp-mRNS ist, die eine Nukleinsäuresequenz aufweist, die aus der Gruppe ausgewählt ist, welche aus SEQ. ID. NO: 3 und SEQ. ID. NO: 18 besteht, und wobei das Testen das Kontaktieren der Testprobe mit einer Nukleinsäuresonde aufweist, die eine Antisensesequenz zu einem Segment von mindestens fünfzehn Nukleotiden Länge der genannten hsarp-mRNS unter Bedingungen aufweist, die die Bildung eines stabilen Komplexes zwischen der Nukleinsäuresonde und irgendeiner komplementären mRNS, die in der Testprobe vorliegt, erlauben.
Verfahren nach Anspruch 17, wobei das hsarp-Gen hsarp1 (SEQ. ID. NO: 4 codierend) oder hsarp2 (SEQ. ID. NO: 7 codierend) ist.
Verfahren nach Anspruch 17, wobei das hsarp-Gen hsarp1 (SEQ. ID. NO: 4 codierend) und die Krankheit ein Krebs des Prostataepithelgewebes ist.
Verfahren nach Anspruch 17, wobei das hsarp-Gen hsarp2 (SEQ. ID. NO: 7 codierend) und die Krankheit ein Krebs des Brustgewebes ist.
Verfahren zum Diagnostizieren einer Krankheit, die mit der Modulation von SARP-Expression verbunden ist, wobei das SARP-Protein eine Aminosäuresequenz aufweist, die aus der Gruppe ausgewählt ist, welche besteht aus SEQ. ID. NO: 2, SEQ. ID. NO: 4 und SEQ. ID. NO: 7, wobei das Verfahren aufweist: (a) Testen einer Körperflüssigkeitstestprobe auf die Anwesenheit eines SARP-Proteins mit einer Aminosäuresequenz, die aus der Gruppe ausgewählt ist, welche besteht aus SEQ. ID. NO: 2, SEQ. ID. NO: 4 und SEQ. ID. NO: 7; (b) Vergleichen der Menge an SARP-Protein, die in der Testprobe detektiert wird, mit der Menge an SARP-Protein, die in einer nicht erkrankten Probe desselben Fluidtyps wie die Testprobe detektiert wird.
Verfahren nach Anspruch 23, wobei das Testen das Kontaktieren der Testprobe mit einem Antikörper gegen das Protein unter Bedingungen aufweist, die die Bildung eines stabilen Komplexes zwischen dem Antikörper und dem gesamten genannten Protein, das in der Testprobe vorliegt, erlauben.
Verfahren nach Anspruch 23, wobei das SARP-Protein hSARP1 (SEQ. ID. NO: 4) oder hSARP2 (SEQ. ID. NO: 7) ist.
Verfahren nach Anspruch 25, wobei das SARP-Protein hSARP1 und die Krankheit ein Krebs des Prostataepithelgewebes ist.
Verfahren nach Anspruch 25, wobei das SARP-Protein hSARP2 und die Krankheit ein Krebs des Brustgewebes ist.
Zusammensetzung zur Verwendung in der Medizin mit einer Komponente, die aus der Gruppe ausgewählt ist, welche besteht aus: i) einem isolierten Polynukleotid ausgewählt aus der Gruppe, die besteht aus: (a) einem Polynukleotid, das ein Polypeptid codiert, welches eine Aminosäuresequenz mit mindestens 90% Identität zu SEQ. ID. NO: 2, SEQ. ID. NO: 4 oder SEQ. ID. NO: 7 über die gesamte Länge der genannten SEQ. ID. NO: 2, SEQ. ID. NO: 4 oder SEQ. ID. NO: 7 aufweist; (b) einem Polynukleotid, das ein Fragment einer Nukleinsäuresequenz ist, welche SEQ. ID. NO: 7 codiert, wobei das Fragment ein Polypeptid codiert, das aus mindestens zehn aufeinander folgenden Aminosäureresten von SEQ. ID. NO: 7 besteht; ii) dem isolierten Polynukleotid nach (i) dieses Anspruchs, wobei das Polynukleotid ein Fragment einer Nukleinsäuresequenz ist, welche SEQ. ID. NO: 7 codiert, wobei das Fragment ein Polypeptid codiert, das aus mindestens 15 aufeinander folgenden Aminosäureresten von SEQ. ID. NO: 7 besteht; iii) dem isolierten Polynukleotid nach (i) dieses Anspruchs, wobei das Polynukleotid ein Polypeptid codiert, das eine Aminosäuresequenz aufweist, die aus der Gruppe ausgewählt ist, welche aus SEQ. ID. NO: 2, SEQ. ID. NO: 4 und SEQ. ID. NO: 7 besteht; iv) einem isolierten Polynukleotid ausgewählt aus der Gruppe, die besteht aus: (a) einem Polynukleotid, das eine Nukleinsäuresequenz aufweist, die aus der Gruppe ausgewählt ist, welche besteht aus SEQ. ID. NO: 1, SEQ. ID. NO: 3 und SEQ. ID. NO: 18; (b) einem Polynukleotidfragment, das aus mindestens 500 aufeinander folgenden Nukleotiden einer Nukleinsäuresequenz besteht, die aus der Gruppe ausgewählt ist, welche besteht aus: SEQ. ID. NO: 1 und SEQ. ID. NO: 3; (c) einem Polynukleotidfragement von SEQ. ID. NO: 18, das aus mindestens 30 aufeinander folgenden Nukleotiden der codierenden Region von SEQ. ID. NO: 13 besteht; (d) einem Polynukleotid, das eine Nukleinsäuresequenz aufweist, die vollständig komplementär zu einer Nukleinsäuresequenz von (a) oder (b) ist; und (e) einem Polynukleotid, das eine Nukleinsäuresequenz aufweist, die vollständig komplementär zu mindestens 200 aufeinander folgenden Nukleotiden des codierenden Strangs von SEQ. ID. NO: 18 ist; v) dem isolierten Polynukleotid nach (iv) dieses Anspruchs, wobei das Polynukleotid ein Fragment einer Nukleinsäuresequenz ist, die aus der Gruppe ausgewählt ist, welche besteht aus SEQ. ID. NO: 18, wobei das Fragment aus mindestens 100 aufeinander folgenden Nukleotiden der codierenden Region der SEQ. ID. NO: 18 besteht; vi) dem isolierten Polynukleotid nach (iv) dieses Anspruchs, wobei das Polynukleotid ein Fragment einer Nukleinsäuresequenz ist, die aus der Gruppe ausgewählt ist, welche besteht aus SEQ. ID. NO: 1, SEQ. ID. NO: 3 und SEQ. ID. NO: 18, wobei das Fragment aus mindestens 500 aufeinander folgenden Nukleotiden der codierenden Region der genannten SEQ. ID. NO: 1, SEQ. ID. NO: 3 oder SEQ. ID. NO: 18 besteht; vii) dem ilsolierten Polynukleotid nach (iv) dieses Anspruchs, wobei das Polynukleotid eine Nukleinsäuresequenz aufweist, die aus der Gruppe ausgewählt ist, welche besteht aus SEQ. ID. NO: 1, SEQ. ID. NO: 3 und SEQ. ID. NO: 18; viii) einem Polynukleotid, das gegensinnig zu dem Polynukleotid nach einem von (i) bis (vii) dieses Anspruchs ist; ix) einem isolierten Polypeptid codiert durch das Polynukleotid nach einem von (i) bis (iii) dieses Anspruchs; x) einem monoklonalen oder isolierten polyklonalen Antikörper, der spezifisch für ein Protein ist, das durch das Polynukleotid nach einem von (i) bis (iii) dieses Anspruchs codiert ist.
Verwendung einer Zusammensetzung wie in Anspruch 28 definiert für die Herstellung eines Medikaments zur Verwendung bei der Behandlung des Zustands, der mit Apoptose in Beziehung steht, wobei der in Beziehung zu Apoptose stehende Zustand Krebs ist und wobei die Komponente rs das Polynukleotid hsarp2 (SEQ. ID. NO: 18) ist oder wobei die Komponente rs das Polypeptid hSARP2 (SEQ. ID. NO: 7) ist.
Verfahren zum Screenen von potenziell therapeutischen Mitteln, die den Effekt von SARP-Proteinen auf die Wnt-frizzled-Proteinwechselwirkung modulieren, mit den Schritten: (a) Kombinieren eines Wnt-frizzled-Proteins und eines SARP-Proteins, wobei das SARP-Protein eine Aminosäuresequenz aufweist, die aus der Gruppe ausgewählt ist, welche besteht aus SEQ. ID. NO: 2, SEQ. ID. NO: 4 und SEQ. ID. NO: 7, unter Bedingungen, unter denen sie Wechselwirken, um eine Testprobe auszubilden; (b) Aussetzen der Testprobe gegenüber einem potentiell therapeutischen Mittel und (c) Aufzeichnen der Wechselwirkung des SARP-Proteins und des Wnt-frizzled-Proteins, wobei ein potenziell therapeutisches Mittel ausgewählt wird, wenn es die Wechselwirkung verglichen mit einer Kontrolltestprobe modifiziert, zu der kein therapeutisches Mittel hinzugefügt worden ist.