DE69735599T2

DE69735599T2 - Ölkörper und damit assoziierte proteine als affinitätsmatrix

Info

Publication number: DE69735599T2
Application number: DE69735599T
Authority: DE
Inventors: Maurice Calgary MOLONEY; Joseph Calgary BOOTHE; Gijs Calgary VAN ROOIJEN
Original assignee: SemBioSys Genetics Inc
Current assignee: SemBioSys Genetics Inc
Priority date: 1996-12-16
Filing date: 1997-12-05
Publication date: 2006-08-31
Anticipated expiration: 2017-12-06
Also published as: TW589322B; US5856452A; WO1998027115A1; ZA9711237B; EP1007554A1; CN1245503A; US20030059910A1; HK1025977A1; KR100421935B1; AU739339B2; CN1325513C; ES2259193T3; IL130403A; US20030096320A1; JP3833719B2; NZ336558A; US7332587B2; AU5220498A; DE69735599D1; CA2275489C

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Diese Erfindung betrifft die Verwendung von Ölkörpern und ihren assoziierten Proteinen als Affinitätsmatrizes für die Abtrennung und Reinigung von Zielmolekülen aus Proben.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Im allgemeinen Gebiet der Biotechnologie ist die Befähigung, Moleküle in effektiver Weise aus komplexen Quellen, wie etwa lebenden Zellen, Blutserum oder Fermentationsbrühe, abzutrennen und zu reinigen, von entscheidender Bedeutung. Anwendungen in der Industrie und in Forschungslaboratorien (wo z.B. gereinigte oder teilweise gereinigte Proteine verwendet werden) sind zahlreich und in der bestehenden Literatur gut dokumentiert (siehe z.B. R. Meadon und G. Walsh in Biotechnological Advances 1994, 12: S. 635–646).
Die Mehrheit der derzeit verwendeten Techniken für die Auftrennung von Molekülen nutzt die innewohnenden physikalischen und chemischen Eigenschaften der Moleküle von Interesse. Auf Affinität basierende Reinigungstechniken sind insofern singulär, als sie die hochspezifische biologische Erkennung zwischen zwei Molekülspezies nutzen, die ein Affinitätspaar bilden. Die Bindung der zwei Einheiten des Affinitätspaars erfolgt in nahezu allen Fällen als Ergebnis relativ schwacher chemischer Wechselwirkungen, die als nicht-kovalente Bindungen bekannt sind. Einige in der Technik bekannte und gemeinhin verwendete Affinitätspaare beinhalten Antikörper und ihre bindenden antigenen Substanzen, Nukleinsäure-bindende Proteine und Nukleinsäuren, Lipidbindende Proteine und Lipide, Lektine und Kohlenhydrate, Streptavidin/Biotin-Komplexe, Protein A/Immunglobulin G-Komplexe und Rezeptoren und ihre bindenden Moleküle.
Im Allgemeinen erfordern auf Affinität basierende Reinigungsprozesse, dass ein Partner des Affinitätspaares auf einem festen Träger oder einer Matrix immobilisiert wird, die unlöslich in der Flüssigkeit ist, in der sich der andere Partner des Paares befindet. Die an die Matrix gebundene Molekülspezies des Affinitätspaares wird allgemein als Ligand bezeichnet, während der in der Flüssigkeit lösliche Partner allgemein als Zieleinheit bezeichnet wird. Es ist jedoch wichtig, anzumerken, dass diese Definitionen keinerlei Einschränkungen in einem strikten chemischen Sinne auferlegen. Die große Mehrheit der derzeitigen Techniken der Liganden-Immobilisierung basiert auf physikalischen oder chemischen Ansätzen. Die physikalische Immobilisierung von Liganden beinhaltet Adsorption oder das Einfangen des Liganden an einem geeigneten Träger, während die chemische Art der Immobilisierung charakterisiert ist durch die Ausbildung starker Vernetzungsstellen oder kovalenter Anbindung zwischen dem Liganden und der Matrix. Es ist ein Erfordernis, dass die Immobilisierung in einer solchen Weise erfolgt, dass die Fähigkeit der Partner des Affinitätspaares, einander zu erkennen, durch die Immobilisierungsprozedur nicht nachteilig beeinflusst wird.
Es ist ein Nachteil der derzeit verfügbaren physikalischen und chemischen Techniken zur Immobilisierung von Liganden, dass die Herstellungsprozesse oft zeitaufwändig und teuer sind. Dies ist hauptsächlich durch die Tatsache bedingt, dass Immobilisierungstechniken die separate Produktion von Matrixmaterial und Liganden erfordern, die dann in einem nachfolgenden Schritt gekoppelt werden müssen. Eine alternative Weise zur Immobilisierung von Proteinen ist in dem US-Patent Nr. 5,474,925 beschrieben, das ein biologisches Produktionssystem für die Immobilisierung von Enzymen in der Faser von Baumwollpflanzen beschreibt. Dieses Patent offenbart, was als erstes biologisch produziertes Enzym-Immobilisierungssystem angesehen wird, und es erlaubt die Herstellung von Matrix und Ligand in einem Schritt.
Nachfolgend auf die Immobilisierung des Liganden an der Matrix kann eine Vielzahl von auf Affinität basierenden Reinigungstechniken verwendet werden, um das selektive Binden zwischen dem Affinitäts-immobilisierten Liganden und dem Zielpartner zu erreichen. Auf Affinität basierende Reinigungstechniken, die im Stand der Technik bekannt sind, beinhalten Perfusions-Affinitätschromatographie, Affinitäts-Abstoßungschromatographie, Hyperdiffusions-Affinitätschromatographie, Affinitätspräzipitation, Membran-Affinitätsauftrennung, Affinitäts-Cross-Flow-Ultrafiltration und Affinitätspräzipitation. Bei der am häufigsten verwendeten, auf Affinität basierenden Reinigungstechnik, der Affinitätschromatographie, wird eine Matrix, die einen Liganden enthält, auf das Innere einer chromatographischen Säule aufgeschichtet oder gepackt. Ein komplexes Gemisch, das den Zielpartner enthält, wird dann auf die chromatographische Säule aufgetragen. Idealer Weise binden nur die Zielmoleküle, die den Liganden spezifisch erkennen, in einer nicht-kovalenten Weise an die chromatographische Säule, während alle anderen Molekülspezies, die in der Probe vorhanden sind, die Säule passieren.
Bei der Affinitätstrennung werden zwei Lösungen weitgehend verschiedener Dichte verwendet. Die komplexe Lösung, die den Zielpartner enthält, wird mit einer Lösung andersartiger Dichte gemischt, die den Affinitätsliganden enthält. Nach dem Mischen lässt man die Lösungen sich absetzen, um die Ausbildung zweier verschiedener Phasen zu erlauben. Die Moleküle neigen dazu, sich in Abhängigkeit von ihrer Größe, Ladung und spezifischen Wechselwirkungen mit den die Phasen ausbildenden Lösungen in unterschiedlicher Weise zwischen den Phasen zu verteilen. Das an den Liganden gebundene Zielprotein ordnet sich selektiv der Phase zu, die den Affinitätsliganden enthält. Beispielsweise haben Coughlin und Baclaski in Biotechnology Progress, 1990, 6: 307-309 die Verwendung der Biotin enthaltenden organischen Lösung Isooctan beschrieben, um Avidin aus einer wässrigen Lösung in die Isooctan-Lösung zu überführen. Jedoch sind Anwendungen der Affinitätsauftrennung bisher hauptsächlich aufgrund einer derzeit fehlenden Verfügbarkeit geeigneter Affinitätsmatrix-Substanzen, die bei der spezifischen Auftrennung in Zwei-Phasen-Systemen verwendet werden können, eingeschränkt gewesen.
Ein wichtiger Faktor für die kommerzielle Entwicklung der Biotechnologie ist die Reinigung von Bioprodukten, die typischerweise für 50% oder mehr der Gesamtkosten verantwortlich ist (Labrou, N und Clonis, Y.D. im Journal of Biotechnology 36: 95–119 (1994)). Viele Schritte der Proteinreinigung basieren auf Trennprozeduren des Säulentyps. Insbesondere in großem Maßstab angewandte hochauflösende Trenntechniken, wie etwa Säulenchromatographie oder Proteinreinigungstechniken auf Basis des Batch-Typs sind kostspielig. Zusätzlich ist Rohmaterial sowohl für die Säulenchromatographie als auch für Batch-Auftrennungen weniger geeignet, da Verunreinigungen sedimentierte Harze verderben und Säulen verstopfen können. Daher werden Affinitätsmatrizes oft nur in einem späteren Stadium der Reinigungsprozesse verwendet, wo weitgehende Reinheit entscheidend wichtig ist, wo die Proteine in extrem verdünnten Konzentrationen vorliegen oder wo hochwertige Proteine benötigt werden, z.B. bei diagnostischen und therapeutischen Proteinen. Diese und andere Themenfelder, die mit der Verwendung von Affinitätstechnologie bei biotechnologischen Prozessen in Zusammenhang stehen, sind übersichtsartig von Labrou, N. und Clonis, Y.D. im Journal of Biotechnology 36: 95–119 (1994) dargestellt worden.
Es gibt einen Bedarf im Stand der Technik, neue und ökonomische Verfahren zu entwickeln, um biologische Produkte von komplexen Gemischen abzutrennen und zu reinigen. Die vorliegenden Erfinder haben herausgefunden, dass subzelluläre Ölspeicherstrukturen, als Ölkörper bekannt, und deren assoziierte Proteine in dieser Hinsicht nützlich sind.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft ein neuartiges, vielseitiges biologisches System für die Herstellung von Affinitätsmatrizes. Die vorliegenden Erfinder haben herausgefunden, dass Ölkörper und ihre assoziierten Proteine als Affinitätsmatrizes für die Abtrennung einer breiten Palette an Zielmolekülen, wie etwa Proteinen, Kohlenhydraten, Lipiden, organischen Molekülen, Nukleinsäuren, Metallen, Zellen und Zellfraktionen aus einer Probe verwendet werden können.
Erfindungsgemäß wird ein Verfahren bereitgestellt, um ein Zielmolekül von einer Probe abzutrennen, umfassend:
1) Inkontaktbringen von (i) Ölkörpern, die entweder direkt oder indirekt mit dem Zielmolekül assoziieren können, mit (ii) einer Probe, welche das Zielmolekül enthält, damit sich das Zielmolekül mit den Ölkörpern assoziieren kann, wobei das Zielmolekül und die Ölkörper mittels eines Ligandenmoleküls assoziiert werden, 2) Trennen der mit dem Zielmolekül assoziierten Ölkörper von der Probe und 3) Trennen des Zielmoleküls von den Ölkörpern. Die Ölkörper und die Probe, die das Zielmolekül enthält, werden in einer Weise in Kontakt gebracht, die hinreichend ist, um es den Ölkörpern zu erlauben, mit dem Ziel zu assoziieren. Vorzugsweise werden die Ölkörper mit dem Ziel gemischt.
Es wird ein Ligandenmolekül verwendet, um das Zielmolekül mit den Ölkörpern zu assoziieren.
Bei einer Ausführungsform besitzt der Ligand natürliche Affinität für die Ölkörper oder das Ölkörperprotein. Bei einer spezifischen Ausführungsform ist der Ligand ein Antikörper, der an das Ölkörperprotein bindet. Ein solcher Antikörper kann verwendet werden, um Ziele abzutrennen, die Affinität für den Ligandenantikörper aufweisen, wie etwa anti-IgG-Antikörper oder Protein A. Es kann außerdem ein bivalenter Antikörper hergestellt werden, der Bindungsspezifitäten sowohl für das Ölkörperprotein als auch für das Ziel besitzt. Der Antikörper gegen das Ölkörperprotein kann auch mit einem zweiten Liganden fusioniert werden, der Affinität für das Ziel besitzt.
Bei einer anderen Ausführungsform ist der Ligand kovalent an die Ölkörper oder an das Ölkörperprotein gebunden. Bei einer Ausführungsform ist der Ligand ein Protein, das in chemischer Konjugation mit dem Ölkörperprotein vorliegt oder als Fusionsprotein mit diesem produziert wird (wie beschrieben in der WO 96/21029). Im letztgenannten Fall wird das Fusionsprotein zu den Ölkörpern gesteuert und an diesen exprimiert. In einem Beispiel kann der mit dem Ölkörper-Protein fusionierte Ligand Hirudin sein und verwendet werden, um Thrombin zu reinigen. In einem anderen Beispiel kann der mit dem Ölkörperprotein fusionierte Ligand Metallothionein sein und kann verwendet werden, um Cadmium aus einer Probe abzutrennen. In einem weiteren Beispiel kann der an das Ölkörperprotein fusionierte Ligand Protein A sein und verwendet werden, um Immunglobuline abzutrennen. In wiederum einem anderen Beispiel kann der an das Ölkörperprotein fusionierte Ligand Cellulose-bindendes Protein sein und verwendet werden, um Cellulose aus einer Probe abzutrennen.
Bei einer weiteren Ausführungsform kann der Ligand kovalent an die Ölkörper angeheftet sein. Beispielsweise kann der Ligand ein kleines organisches Molekül, wie etwa Biotin sein. Biotinylierte Ölkörper können verwendet werden, um Avidin aus einer Probe abzutrennen.
Die vorliegende Erfindung beinhaltet auch modifizierte Ölkörper für die Verwendung als Affinitätsmatrix.
Die vorliegende Erfindung beinhaltet auch eine Affinitätsmatrix zur Verwendung bei der Abtrennung eines Zielmoleküls von einer Probe, umfassend Ölkörper, die mit dem Zielmolekül assoziieren können. Die Affinitätsmatrix beinhaltet ein Ligandenmolekül, das mit den Ölkörpern assoziiert ist, wobei das Ligandenmolekül befähigt ist, mit dem Zielmolekül zu assoziieren.
Andere Aufgaben, Merkmale und Vorteile der vorliegenden Erfindung werden aus der folgenden detaillierten Beschreibung und den angehängten Zeichnungen ersichtlich werden. Es versteht sich jedoch, dass die detaillierte Beschreibung und die damit verbundenen Beispiele nur zur Veranschaulichung angegeben sind.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1: Nukleotid- und abgeleitete Aminosäuresequenz des 18 kDa-Oleosins aus Arabidopsis thaliana, wie in der SEQ ID NO:1 und SEQ ID NO:2 dargestellt.
2: Sequenz einer Arabidopsis-Oleosin-Hirudin-Fusion. Angezeigt ist ein Teil der genomischen Oleosin-Sequenz (von Base 1–1620, wie beschrieben in van Rooijen et al. 1992, Plant Mol. Biol. 18: 1177–1179), eine Spacer-Sequenz (Base 1621–1635, unterstrichen) und die synthetische DNA-Sequenz, die für die reife Hirudin Variante 2-Isoform codiert (Base 1636–1833, kursiv). Diese Genfusion wird durch die 5'-ständige stromaufwärtige Region von Arabidopsis-Oleosin (Basen 1–861) und der Nopalin-Synthase-Terminationssequenz (Base 1855–2109) reguliert. Die Sequenz ist auch in der SEQ ID NO:3 und SEQ ID NO:4 dargestellt.
3: Übersicht über die Schritte, die bei der Konstruktion von pCGOBHIRT, das das gesamte Oleosin-Hirudin-Konstrukt enthält, verwendet werden.
4: Schematische Diagramm-Darstellung der Konfiguration des Oleosin-Hirudin-Fusionsproteins an dem Ölkörper und Bindung von Thrombin.
5: NaCl-Elutionsprofile von Thrombin des Wildtyps und 4A4-Ölkörpermatrizes, die mit einem Konstrukt transformiert wurden, das eine Oleosin-Hirudin-Fusion exprimiert.
6: Reinigung eines mit Meerrettich-Peroxidase konjugierten Anti-IgG-Antikörpers unter Verwendung eines Anti-Oleosin-Antikörpers als Ligand. Schematisches Diagramm, das die Konfiguration des Oleosin/Anti-Oleosin/anti-IgG-Sandwich-Komplexes zeigt, der an einen Ölkörper gebunden ist.
7: Darstellung der spezifischen Bindung von anti-IgG-Antikörpern an wildtypische Ölkörper, die mit primären Anti-Oleosin-Antikörpern als Ligand komplexiert sind (links) und Bindung von anti-IgG-Antikörpern an Ölkörper, die vor der Bindung mit den sekundären Antikörpern nicht mit den primären Antikörpern komplexiert wurden (rechts).
8: Sequenz einer Oleosin-Metallothionein-Fusion. Angegeben ist die codierende Sequenz einer B. napus-Oleosin-cDNA (Basen 1092–1652, van Rooijen, 1993, Ph.D. Thesis, University of Calgary), eine Spacer-Sequenz (Basen 1653–1670, unterstrichen) und das humane Metallothionein-Gen mt-II (Basen 1671–1876, Varshney und Gedamu, 1984, Gene, 31: 135–145)). Die Genfusion wird durch einen Arabidopsis-Oleosin-Promotor (Basen 1–1072) und Ubiquitin-Terminationssequenz (Basen 1870–2361, ubi3'; Kawallek et al., 1993, Plant Mol. Biol., 21: 673–684) reguliert. Die Sequenz ist auch in der SEQ ID NO:6 und der SEQ ID NO:7 gezeigt.
9: Übersicht über die Schritte, die bei der Herstellung von pBIOOM3' verwendet werden, das das gesamte Oleosin-Metallothionein-Konstrukt enthält.
10: Schematisches Diagramm, das die Konfiguration des Oleosin-Metallothionein-Fusionsproteins an dem Ölkörper und die Bindung von Cadmiumionen darstellt.
11: Darstellung der Bindung (A) und Elution (B) von Cadmium an einer Ölkörpermatrix aus wildtypischen B. carinatu-Samen und aus B. carinatu-Samen, die mit einem Konstrukt transformiert wurden, das eine Oleosin-Metallothionein-Genfusion exprimiert. Dargestellt ist der Prozentsatz an Cadmium, das bei einer aus transgenen und untransformierten Saaten gewonnenen Ölkörperfraktion an die Ölkörperfraktion gebunden ist. Die Balken stellen Durchschnittswerte von 5 Wiederholungsversuchen (Bindung) und 3 Wiederholungen (Elution) dar.
12: Darstellung der Bindung von Protein A exprimierenden S. aureus-Zellen an Ölkörper, die mit verschiedenen Mengen an Anti-Oleosin-IgGs behandelt wurden. Die Balken repräsentieren OD₆₀₀-Werte, die erhalten wurden, indem man den Prozeduren folgt, wie sie in Beispiel 5 und unter Verwendung verschiedener Mengen an IgGs (0 μl, 3 μl, 30 μl, 100 μl an zugegebenem IgG) beschrieben sind.
13: Oligonukleotid-Primer, die verwendet werden, um die Sequenz des S. aureus-Proteins A zu amplifizieren (Die Sequenz ist auch in der SEQ ID NO: 8 dargestellt; die Proteinsequenz ist auch in der SEQ ID NO: 9 gezeigt). Beim Primer BK266, 5'-C TCC ATG GAT CAA CGC AAT GGT TTA TC-3' (SEQ ID NO: 10), sind eine Nco I-Stelle (kursiv) und eine Sequenz, die identisch zu einem Stück des Protein A-Gens ist, wie es im Vektor pRITZ2T (Pharmacia) (unterstrichen) enthalten ist, angezeigt. Beim Primer BK267, 5'-GC AAG CTT CTA ATT TGT TAT CTG CAG GTC-3' (SEQ ID NO: 11), sind eine Hind III-Stelle (kursiv), ein Stopcodon (fett) und eine Sequenz dargestellt, die komplementär zu einem Stück des Protein A-Gens ist, wie es in pRIT2T (Pharmacia) (unterstrichen) enthalten ist. Das PCR-Produkt wurde mit Nco I und Hind III verdaut und in pCGNOBPGUSA (Van Rooijen und Moloney, 1995, Plant Physiol. 109: 1353–1361) ligiert, aus dem das Nco I-GUS-Hind III-Fragment entfernt worden war.
14: Sequenz einer Arabidopsis Oleosin-Protein A-Fusion (Die Sequenz ist auch in der SEQ ID NO: 12 dargestellt, und die Proteinsequenz ist auch in den SEQ ID NO: 13 und 14 dargestellt). Angezeigt sind ein Teil der genomischen Oleosin-Sequenz (von Base 1–1626, wie beschrieben in van Rooijen et al., 1992, Plant Mol. Biol. 18: 1177–1179), eine Spacer-Sequenz, die eine Thrombin-Spaltstelle codiert (Base 1627–1647, unterstrichen) und die DNA-Sequenz, die für Protein A codiert (Base 1648–2437, kursiv). Die Expression wird reguliert durch die stromaufwärtige 5'-ständige Region von Arabidopsis Oleosin (Base 1–867) und durch die Nopalin-Synthase-Terminatorregion (Base 2437–2700).
15: Schematische Darstellung, die die Anordnung des Oleosin-Protein A-Fusionsproteins an dem Ölkörper und die Bindung des Immunglobulins zeigt.
16: Western Blot, der die Bindung von HRP-konjugierten Maus-anti-Kaninchen-Antikörpern an Ölkörperproteinextrakte zeigt, die von transgenen B. napus-Linien erhalten wurden, die Oleosin-Protein A-Fusionsproteine exprimieren. Dargestellt auf einem Western Blot, der mit einem HRP-konjugierten Antikörper sondenmarkiert wurde, sind Ölkörperproteinextrakte aus den transgenen Linien opa 30 (Spur 3), opa 31 (Spur 4), opa 34 (Spur 5), opa 36 (Spur 6), opa 47 (Spur 7), opa 93 (Spur 8), die alle ein Oleosin-Protein A-Fusionsprotein exprimieren, sowie eine untransformierte Kontrolllinie von B. napus (Spur 9), und ebenso Lysate von E. coli DH5α, das mit pRIT2T zur Expression von Protein A transformiert wurde (Spur 2) und von untransformiertem E. coli DH5α (Spur 1).
17: Darstellung der Bindung und Elution von IgGs an Ölkörper, die aus wildtypischem B. napus (bn wt) und einer transgenen B. napus-Linie, die eine Oleosin-Protein A-Fusion exprimiert, isoliert wurden. Die Fehlerbalken entsprechen den Ergebnissen von 4 unabhängigen Versuchen.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Wie hier zuvor erwähnt, betrifft die vorliegende Erfindung ein neues biologisches Affinitätsmatrixsystem, das Ölkörper und deren assoziierte Proteine verwendet. Diese Affinitätsmatrix ist geeignet für die hocheffiziente Abtrennung spezifischer Ziele, einschließlich Proteinen, Kohlenhydraten, Lipiden, Nukleinsäuren, Zellen und subzellulären Organellen, Metallen und Ionen aus einer Probe.
Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zum Trennen eines Zielmoleküls von einer Probe bereit, welches folgendes umfasst:

1) Inkontaktbringen von (i) Ölkörpern mit (ii) einer Probe, welche das Zielmolekül enthält, damit sich das Zielmolekül mit den Ölkörpern assoziieren kann, wobei das Zielmolekül und die Ölkörper mittels eines Ligandenmoleküls assoziiert werden,
2) Trennen der mit dem Zielmolekül assoziierten Ölkörper von der Probe und
3) Trennen des Zielmoleküls von den Ölkörpern.

Die Ölkörper und die Probe, die das Zielmolekül enthält, werden in einer Weise in Kontakt gebracht, die hinreichend ist, um es den Ölkörpern zu erlauben, mit dem Ziel zu assoziieren. Bevorzugt werden die Ölkörper mit dem Ziel gemischt.. Eine indirekte Assoziation der Ölkörper mit dem Ziel kann unter Verwendung eines Ligandenmoleküls erreicht werden, das sowohl mit den Ölkörpern als auch mit dem Zielmolekül assoziieren kann. Der Ligand dient daher als Brücke oder verbindet die Ölkörper mit dem Zielmolekül.
Alle Bestandteile der Affinitätsmatrix werden wiederum unten diskutiert.
Ziele
Der Begriff „Ziel", wie er hier verwendet wird, bezeichnet ein gewünschtes Molekül, das man reinigen, isolieren oder aus einer Probe, wie etwa einem biologischen Gemisch, abtrennen will. Diese Technologie ist der Verwendung mit nahezu jedem Ziel zugänglich, für das ein Ligand erhalten werden kann, oder jedem Ziel, das direkt mit einem Ölkörper oder Ölkörperprotein binden oder damit assoziieren kann. Mögliche Liganden/Ziel-Paare beinhalten, ohne hierauf beschränkt zu sein, Proteinuntereinheiten/Assoziationen von Untereinheiten, Antikörper/Antigene, Rezeptorproteine/Signalmoleküle, Nukleinsäurebindeproteine/Nukleinsäuren, Lektine/Kohlenhydrate, Lipidbindende Proteine/Lipide, Ionenbindende Proteine/Ionen, sowie Liganden gegen Oberflächenepitope/Zellen oder subzelluläre Organellen. Das Ziel kann aus jeder natürlichen Quelle erhalten oder chemisch synthetisiert werden. Wenn das Ziel ein Makromolekül, wie etwa ein Protein oder eine Nukleinsäure, ist, so kann es auch, unter Verwendung beliebiger geeigneter Expressionssysteme, wie etwa Bakterien, Hefe, Pflanze, Insekt, Säuger, etc., in rekombinanter Form hergestellt werden.
Liganden
Der Begriff „Ligand", wie er hier verwendet wird, bezeichnet ein Molekül, das in der Lage ist, sowohl mit dem Zielmolekül als auch mit den Ölkörpern oder dem Ölkörperprotein zu assoziieren (wie unten diskutiert). Der Begriff „assoziieren mit", wie er hier verwendet wird, beinhaltet sowohl eine kovalente als auch eine nicht kovalente Bindung des Liganden an die Ölkörper oder an das Zielmolekül. Beispielsweise kann das Ligandenmolekül kovalent an die Ölkörper gebunden werden und nicht-kovalent mit dem Ziel assoziieren (und umgekehrt), oder der Ligand kann nicht-kovalent sowohl mit den Ölkörpern als auch mit dem Zielmolekül assoziieren. Der Ligand kann jedes Molekül sein, das eine Verbindung zwischen den Ölkörpern oder dem Ölkörperprotein und dem Zielmolekül herstellt und kann ein Protein, Nukleinsäure, Kohlenhydrat oder ein kleines organisches Molekül beinhalten. Der Ligand kann aus zwei Molekülen aufgebaut sein, einem ersten Molekül, das mit den Ölkörpern assoziiert, und einem zweiten Molekül, das mit dem Ziel assoziiert, wobei das erste und das zweite Molekül miteinander assoziieren.
Die für diese Methodik verwendeten Affinitäts-Ligandenproteine können von natürlich vorkommenden bekannten Ligandenpaaren, wie den oben aufgelisteten, abgeleitet werden. Alternativ können die Liganden erhalten werden durch Durchtesten von Proteinen, die aus Zellen oder Organismen extrahiert oder chemisch synthetisiert werden oder die in Bibliotheken produziert werden, die aus kombinatorischen Peptidsequenzen, Antikörpern oder exprimierten DNA-Sequenzen aufgebaut sind.
Bei einer Ausführungsform besitzt der Ligand eine natürliche Affinität für die Ölkörper oder das Ölkörperprotein. Beispielsweise kann der Ligand ein Protein, wie etwa ein Antikörper sein, der Affinität für das Ölkörperprotein besitzt. Der Ligand kann auch ein anderes Molekül als ein Protein sein, das natürliche Affinität für den Ölkörper oder das Ölkörperprotein besitzt. Derartige Liganden, die befähigt sind, an die Ölkörper oder an das Ölkörperprotein zu binden, können mit einem zweiten Molekül assoziiert sein, das das Zielmolekül binden kann. Beispielsweise kann das Ligandenmolekül ein Antikörper sein, der mit Avidin konjugiert ist und kann verwendet werden, um Biotin aus einer Probe zu reinigen.
Bei einer anderen Ausführungsform wird der Ligand durch chemische oder rekombinante Mittel kovalent mit den Ölkörpern oder dem Ölkörperprotein verbunden. Chemische Mittel zur Herstellung von Fusionen oder Konjugaten sind in der Technik bekannt und können verwendet werden, um eine Liganden-Ölkörper-Proteinfusion herzustellen. Das Verfahren, das verwendet wird, um den Liganden und den Ölkörper zu konjugieren, muss befähigt sein, den Liganden mit dem Ölkörperprotein zu verbinden, ohne dabei in die Fähigkeit des Liganden einzugreifen, an das Zielmolekül zu binden. In einem Beispiel kann der Ligand ein kleines organisches Molekül sein, wie etwa Biotin, das kovalent an die Ölkörper gebunden ist. Biotinylierte Ölkörper können verwendet werden, um Avidin aus einer Probe abzutrennen. Die vorliegende Erfindung umfasst auch modifizierte Ölkörper, wie etwa biotinylierte Ölkörper, zur Verwendung als Affinitätsmatrix. Dementsprechend beinhaltet die vorliegende Erfindung eine Zusammensetzung, umfassend Ölkörper, die an ein Molekül, wie etwa einen Liganden oder ein Zielmolekül angeheftet sind.
Bei einer bevorzugten Ausführungsform ist der Ligand ein Protein und kann unter Verwendung von Techniken an das Ölkörperprotein gekoppelt werden, die in der Technik wohlbekannt sind. Es sind mehrere hundert Vernetzungsmittel verfügbar, die zwei Proteine konjugieren können (siehe z.B. „Chemistry of Protein Conjugation and Crosslinking", 1991, Shans Wong, CRC Press, Ann Arbor). Das Vernetzungsmittel wird allgemein auf Basis der reaktiven funktionellen Gruppen ausgewählt, die am Liganden verfügbar sind oder darin eingeführt wurden. Zusätzlich, wenn keine reaktiven Gruppen vorliegen, kann ein photoaktivierbares Vernetzungsmittel verwendet werden. Unter bestimmten Umständen kann es wünschenswert sein, einen Abstandshalter (Spacer) zwischen dem Liganden und dem Ölkörperprotein einzubeziehen. In der Technik bekannte Vernetzungsmittel beinhalten die folgenden homobifunktionalen Mittel: Glutaraldehyd, Dimethyladipimidat und Bis(diazobenzidin) und die folgenden heterobifunktionalen Mittel: m-Maleimidobenzyl-N-Hydroxysuccinimid und Sulfo-m-Maleimidobenzyl-N-Hydroxysuccinimid.
Eine Ligandenprotein-Ölkörperprotein-Fusion kann auch unter Verwendung rekombinanter DNA-Techniken hergestellt werden. In einem solchen Fall wird eine DNA-Sequenz, die für den Liganden codiert, mit einer DNA-Sequenz fusioniert, die für das Ölkörperprotein codiert, was in einem chimären DNA-Molekül resultiert, das ein Liganden-Ölkörperprotein-Fusionsprotein exprimiert (in größerem Detail unten diskutiert). Um ein rekombinantes Fusionsprotein herzustellen, muss die Sequenz der DNA, die für den Liganden codiert, bekannt oder zu erhalten sein. Mit „zu erhalten" ist gemeint, dass eine DNA-Sequenz, die ausreichend ist, um für den Proteinliganden zu codieren, aus der bekannten Aminosäuresequenz abgeleitet werden kann. Es ist nicht notwendig, dass die gesamte Gensequenz des Liganden verwendet werden muss, vorausgesetzt, dass eine Subsequenz, die für die Bindungsdomäne des Proteinliganden codiert, bekannt ist. Daher kann der Ligand die vollständige Sequenz oder die Bindungsdomäne des spezifischen, fraglichen Ligandenproteins beinhalten.
Wenn die DNA-Sequenz des gewünschten Liganden bekannt ist, so kann das Gen chemisch unter Verwendung eines Oligonukleotid-Synthesegerätes synthetisiert werden. Alternativ kann der Klon, der das Ligandengen trägt, entweder aus cDNA-Bibliotheken oder genomischen Bibliotheken erhalten werden, die das Gen enthalten, indem man eine Sondenmarkierung mit einer markierten komplementären DNA-Sequenz durchführt. Das Gen kann außerdem in spezifischer Weise aus der Bibliothek amplifiziert werden, indem man genspezifische Oligonukleotid-Primer und PCR verwendet. Wenn die DNA-Sequenz des gewünschten Liganden nicht bekannt ist, so kann eine partielle Aminosäuresequenz durch N-terminales Sequenzieren des Proteins (Matsudaira 1987; J. Biol. Chem. 262: 10035–10038) erhalten werden. Es können markierte Sonden auf Basis der aus dieser Aminosäuresequenz abgeleiteten DNA-Sequenz synthetisiert werden und verwendet werden, um gemäß obiger Beschreibung cDNA-Bibliotheken oder genomische Bibliotheken durchzutesten. Der das Gen tragende Klon kann auch in einer cDNA-Expressionsbibliothek identifiziert werden, indem man eine Sondenmarkierung entweder mit Antikörpern, die gegen den Proteinliganden erzeugt wurden, oder mit dem Zielprotein durchführt.
Liganden können außerdem entdeckt werden, indem man Gemische von Proteinen einem Sondentest mit dem Zielmolekül unterzieht. Das Ziel kann an einer Trägermatrix immobilisiert werden und verwendet werden, um Proteine durchzutesten, die aus Zellen und Geweben extrahiert oder chemisch synthetisiert wurden. Nach der Bindung zwischen dem Ligandenprotein und dem immobilisierten Ziel wird die Matrix von der Lösung abgetrennt und gewaschen. Der Proteinligand wird nachfolgend von der Matrix eluiert, und die Sequenz wird gemäß obiger Beschreibung bestimmt. Alternativ können rekombinante Proteinbibliotheken, die durch Phage Display produziert werden, wie etwa diejenigen, die aus kombinatorischen Peptidsequenzen (Smith, 1985, Science 228: 1315–1317) oder Antikörperrepertoires (Griffiths et al., 1994, EMBO J. 13: 3245–3260; Nissim et al., 1994, EMBO J. 13: 692–698) zusammengesetzt sind, mit dem immobilisierten Ziel durchgetestet werden. In diesem Fall würde die Bindung zwischen dem Proteinliganden und dem Ziel die Abtrennung und Gewinnung des den Liganden exprimierenden Phagen aus der großen komplexen Population der Phagen, die nicht-bindende Proteine codieren, ermöglichen. Ein Zwei-Hybrid-System, wie das aus Hefe (Fields und Sternglanz, 1994, Trends Genet. 10: 286–292) kann ebenfalls dazu verwendet werden, um einen Liganden in einer exprimierten cDNA-Bibliothek zu identifizieren. Hier wird eine Genfusion zwischen der Sequenz, die für das Zielprotein codiert, und der Sequenz eines DNA-bindenden Proteins konstruiert. Zellen, die dieses Konstrukt enthalten, werden mit Konstrukten aus einer cDNA-Bibliothek transformiert, wo die Sequenzen mit der Sequenz eines Transkriptionsaktivators fusioniert wurden. Die Bindung zwischen den aus der cDNA-Bibliothek stammenden Liganden mit dem Zielprotein erlaubt dann die Transkription eines Reportergens. Klone, die den Liganden exprimieren, werden dann gewonnen.
Um einen Liganden gegen Ölkörper in spezifischer Weise zu ermitteln, kann ein vollständiges oder partielles Oleosin-Protein als Ziel bei einem beliebigen der obigen Verfahren verwendet werden. Alternativ kann es möglich sein, intakte Ölkörper für das Durchtesten von Proteinextrakten, synthetischen Peptiden oder Phage Display-Bibliotheken zu verwenden. In diesem Fall würde der Ölkörper sowohl als Ziel als auch als Immobilisierungsmatrix dienen. Unter Verwendung dieses Ansatzes kann eine größere Vielzahl an Liganden ermittelt werden, die Affinität nicht nur gegenüber Oleosinen, sondern auch gegenüber anderen Epitopen zeigen, die auf Ölkörpern vorkommen.
Ölkörper und Ölkörperproteine
Ölkörper sind kleine, kugelige, subzelluläre Organellen, die gespeicherte Triacylglyceride einkapseln, eine Energiereserve, die von vielen Pflanzen genutzt wird. Obwohl sie in den meisten Pflanzen und in verschiedenen Geweben zu finden sind, sind sie besonders häufig in den Samen von Ölsaaten, wo sie in ihrer Größe von unter einem Mikron bis zu wenigen Mikron im Durchmesser reichen. Ölkörper setzen sich zusammen aus den Triacylglyceriden, die von einer Halbeinheit-Membran aus Phospholipiden umgeben sind und mit einem singulären Proteintyp eingebettet sind, der als ein Ölkörperprotein bekannt ist. Der Begriff „Ölkörper" (im Singular oder Plural), wie er hier verwendet wird, beinhaltet alles vom Triacylgycerid, Phospholipid oder den Proteinkomponenten, die in der vollständigen Struktur vorhanden sind. Der Begriff „Ölkörperprotein", wie hier verwendet, bezeichnet ein Protein, das natürlicher Weise in einem Ölkörper vorkommt. Bei Pflanzen werden die vorherrschenden Ölkörperproteine als Oleosine bezeichnet. Oleosine sind aus vielen pflanzlichen Quellen, einschließlich Mais, Rapssamen, Karotte und Baumwolle, kloniert und sequenziert worden. Das Oleosinprotein scheint aus drei Domänen zusammengesetzt zu sein; die beiden Enden des Proteins, N- und C-Termini, sind stark hydrophil und befinden sich an der dem Zytosol zugewandten Oberfläche des Ölkörpers, wogegen der hochgradig hydrophobe zentrale Kern des Oleosins fest innerhalb der Membran und dem Triacylglycerid verankert ist. Oleosine von unterschiedlichen Spezies stellen eine kleine Familie von Proteinen dar, die beachtliche Aminosäuresequenz-Konservierung zeigen, insbesondere in der zentralen Region des Proteins. Innerhalb einer individuellen Spezies kann eine kleine Anzahl verschiedener Isoformen vorkommen.
Ölkörper von einzelnen Spezies zeigen eine in etwa uniforme Größe und Dichte, die teilweise abhängig ist von der genauen Protein/Phospholipid/Triacylgylcerid-Zusammensetzung. Als Ergebnis hiervon können sie leicht und schnell von Flüssigkeiten andersartiger Dichte, in denen sie suspendiert sind, abgetrennt werden. In wässrigen Medien beispielsweise, deren Dichte größer ist als die der Ölkörper, werden sie unter dem Einfluss der Schwerkraft oder angewandten Zentrifugalkraft schwimmen. In 95% Ethanol, wo die Dichte kleiner ist als die der Ölkörper, werden sie unter den gleichen Bedingungen sedimentieren. Ölkörper können außerdem aus Flüssigkeiten und anderen Feststoffen, die in Lösungen oder Suspensionen vorhanden sind, mittels Verfahren abgetrennt werden, die auf der Basis von Größe fraktionieren. Beispielsweise sind die Ölkörper von B. napus mindestens etwa 0,5 μm im Durchmesser und können somit von kleineren Komponenten unter Verwendung eines Membranfilters mit einer Porengröße von weniger als diesem Durchmesser abgetrennt werden.
Die Ölkörper der vorliegenden Erfindung werden bevorzugt aus einer Saatpflanze gewonnen, und noch bevorzugter aus der Gruppe von Pflanzenspezies umfassend: Ackerschmalwand (Arabidopsis thaliana), Rapssamen (Brassica spp.), Sojabohne (Glycine max), Sonnenblume (Helianthus annuus), Ölpalme (Elaeis guineeis), Baumwollsamen (Gossypium spp.), Erdnuss (Arachis hypogaea), Kokosnuß (Cocos nucifera), Rizinus (Ricinus communis), Färberdistel (Carthamus tinctorius), Senf (Brassica spp. und Sinapis alba), Koriander (Coriandrum sativum), Leinsamen/Flachs (Linum usitatissimum) und Mais (Zea mays). Man züchtet die Pflanzen und lässt sie Samen ausbilden, wobei landwirtschaftliche Kulturverfahren verwendet werden, die dem Fachmann wohlbekannt sind. Nach der Ernte der Samen und der Entfernung von Fremdmaterial, wie etwa Steinen oder Samenhüllen, beispielsweise durch Sieben, werden die Samen vorzugsweise getrocknet und nachfolgend durch mechanisches Pressen, Mahlen oder Schroten weiterverarbeitet. Die Ölkörperfraktion kann aus der geschroteten Samenfraktion erhalten werden, indem man sich auf Trenntechniken stützt, die Unterschiede der Dichte zwischen der Ölkörperfraktion und der wässrigen Fraktion nutzen, wie etwa Zentrifugation, oder die Verwendung von auf Größenausschluss basierenden Trenntechniken, wie etwa Membranfiltration oder eine Kombination dieser beiden. Typischerweise werden die Samen sorgfältig in fünf Volumina eines kalten, wässrigen Puffers gemahlen. Es kann eine große Vielzahl an Pufferzusammensetzungen verwendet werden, vorausgesetzt, dass sie keine hohen Konzentrationen starker organischer Lösungsmittel, wie etwa Aceton oder Diethylether enthalten, da diese Lösungsmittel die Ölkörper aufbrechen können. Die Lösungsdichte des Mahlpuffers kann durch die Zugabe von 0,4–0,6 M Sucrose gesteigert werden, um das Waschen, wie unten beschrieben, zu erleichtern. Der Mahlpuffer wird typischerweise außerdem 0,5 M NaCl enthalten, um die Entfernung löslicher Proteine zu unterstützen, die nicht in integraler Weise an die Oberfläche des Ölkörpers gebunden sind.
Nach dem Mahlen wird das Homogenat zentrifugiert, was in einem Pellet aus partikulärer und unlöslicher Materie resultiert, einer wässrigen Phase, die die löslichen Komponenten des Samens enthält, und einer Oberflächenschicht, bestehend aus Ölkörpern und ihren assoziierten Proteinen. Die Ölkörperschicht wird von der Oberfläche abgeschöpft und sorgfältig in einem Volumen an frischem Mahlpuffer resuspendiert. Es ist wichtig, dass Aggregate von Ölkörpern so sorgfältig wie möglich dissoziiert werden, um eine wirksame Entfernung der Verunreinigungen in den nachfolgenden Waschschritten sicherzustellen. Die resuspendierte Ölkörperpräparation wird unter einer Schwimmlösung niedrigerer Dichte (z.B. Wasser, wässriger Puffer) geschichtet und erneut zentrifugiert, um Ölkörper und wässrige Phasen zu trennen. Diese Waschprozedur wird typischerweise wenigstens dreimal wiederholt, wonach man die Ölkörper als hinreichend frei von kontaminierenden löslichen Proteinen erachtet, wie durch Gelelektrophorese bestimmt. Es ist nicht notwendig, die gesamte wässrige Phase zu entfernen, und zu der abschließenden Präparation können Wasser oder 50 mM Tris-HCl pH 7,5 gegeben werden, und der pH kann, wenn gewünscht, bis auf pH 2 gesenkt oder bis auf pH 10 angehoben werden. Protokolle für die Isolierung von Ölkörpern aus Ölsaaten sind erhältlich von Murphy, D.J. und Cummins I., 1989, Phytochemistry, 28: 2063–2069 und in: Jacks, T.J. et al., 1990, JAOCS, 67: 353–361. Ein bevorzugtes Protokoll ist detailliert in Beispiel 1 der vorliegenden Schrift dargestellt.
Andere Ölkörper als die aus Pflanzen gewonnenen können ebenfalls bei der vorliegenden Erfindung verwendet werden. Ein System, das Pflanzenölkörpern und Oleosinen funktionell äquivalent ist, ist beschrieben worden in Bakterien (Pieper-Fürst et al., 1994, J. Bacteriol. 176: 4328), Algen (Rossler, P.G., 1988, J. Physiol. (London), 24: 394–400) und Pilzen (Ting, J.T. et al., 1997, J. Biol. Chem 272: 3699–3706). Ölkörper aus diesen Organismen, ebenso wie diejenigen, die von einem Fachmann in anderen lebenden Zellen entdeckt werden könnten, können ebenfalls gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet werden.
Affinitätsmatrizes
Wie hier zuvor erwähnt, stellt die vorliegende Erfindung ein neues Affinitätsmatrix-System für die Reinigung eines Zielmoleküls aus einer Probe bereit. Die Affinitätsmatrix umfasst Ölkörper und einen Liganden, der mit den Ölkörpern assoziiert ist und Affinität für ein Zielmolekül besitzt. Bei einer solchen Ausführungsform kann der Ligand nicht-kovalent oder kovalent an die Ölkörper gebunden sein (wie oben beschrieben).
Es ist ein Vorteil der vorliegenden Erfindung, dass Zielsubstanzen durch nicht-kovalente Assoziation mit Ölkörpern, gefolgt von Ölkörper-Abtrennung, aus Proben gereinigt oder entfernt werden können. Es ist eine Reihe verschiedener Ölkörper-Liganden-Konfigurationen möglich. Ziele mit inhärenter Affinität für ein spezifisches Ligandenprotein, wie etwa Hirudin gegenüber Thrombin oder Schwermetalle gegenüber Metallothionein, können mit Ölkörpern, die diese Liganden fusioniert an ein Oleosin enthalten, gereinigt oder abgetrennt werden. Alternativ kann ein Proteinziel auch mit einer Ölkörperaffinitätsmatrix gereinigt oder abgetrennt werden, indem man das Ziel an einen Ölkörper-spezifischen Liganden fusioniert, oder an einen Liganden, der komplementär zu demjenigen ist, der mit einem Oleosin fusioniert ist. Wenn gewünscht, kann eine Protease-Erkennungsstelle oder eine chemische Spaltstelle zwischen dem Liganden und dem Zielprotein hergestellt werden, um die proteolytische Abspaltung des Liganden von dem Zielprotein im Verlauf der Reinigung zu erlauben. Es kann auch ein multivalenter Ligand konstruiert werden, wie etwa ein bivalenter Einzelkettenantikörper, bei dem eine Domäne des Liganden Affinität für einen Ölkörper besitzt und die andere(n) Domäne(n) Affinität für das Ziel besitzt/besitzen. In diesem Fall müssen weder der Ölkörper noch das Zielmolekül kovalent an einen Liganden fusioniert werden. Außerdem können Concatamere von Liganden verwendet werden, um die Affinität einer Matrix für ein Ziel zu erhöhen, oder die Sequenz eines Liganden kann mutiert werden, um die Affinität für ein Ziel zu modulieren, wenn solche Bedingungen wünschenswert sind. Weiterhin können Gemische verschiedener Liganden fusioniert werden, um verschiedene Typen von Zielen gleichzeitig zu gewinnen bzw. zu entfernen. Fusionen zwischen verschiedenen Liganden können außerdem konstruiert werden, um Brücken zwischen verschiedenen Typen von Zielen auszubilden, oder zwischen Zielen und der Ölkörper-Affinitätsmatrix. Die Bindung an die Affinitätsmatrix kann auch erreicht werden durch die Ausbildung von Brücken zwischen Liganden oder Ligand und Zielsequenzen, wie etwa durch Zn⁺⁺-Ionen, die zwischen poly-Histidin-Sequenzen brückenbildend wirken.
Es gibt mehrere Vorteile, die mit der Verwendung von Ölkörperaffinitätsmatrizes verbunden sind, die diese attraktiv als Reinigungswerkzeuge machen. Die Flexibilität der Ausgestaltung, die durch die verschiedenen oben beschriebenen Anordnungen möglich ist, erlaubt es eine Matrix zu konstruieren, die den Erfordernissen eines bestimmten Ziels am besten entspricht. Außerdem ist die Herstellung der Matrix als Teil eines natürlichen biologischen Prozesses in Samen extrem kostengünstig, da eine Reinigung und Immobilisierung des Liganden nicht notwendig sind. Im Falle der Oleosin-Liganden-Fusionen erfolgt die Immobilisierung des Liganden am Ölkörper als Ergebnis der Oleosin-Zielsteuerung innerhalb der Zelle, während die Ölkörper-spezifischen Liganden auf natürliche Weise mit der Matrix assoziieren werden, wenn sie in komplexen Gemischen vorhanden sind. Die natürliche Immobilisierung des Liganden an der Matrix kann auch in der Weise vorteilhaft sein, als sie das Erfordernis einer chemischen Vernetzung beseitigt, die die Affinität des Liganden für das Ziel beeinträchtigen kann. Schließlich bieten Ölkörper-Affinitätsmatrizes eine einzigartige und attraktive Reinigungsoption, insbesondere für im großen Maßstab erfolgende Operationen. Die Möglichkeit, die Matrix über Flotation als lose Suspension abzutrennen, macht es möglich, sie mit Rohmaterial zu verwenden, das das enthält, was ansonsten untragbare Mengen an partikulären Verunreinigungen darstellen würde. Die Anwesenheit solcher Verunreinigungen wird konventionelle feste Matrizes, wie sie in Säulen oder Batch-Suspensionen verwendet werden, oft verderben und blockieren, was ihre Verwendung in frühen Stadien des Reinigungsprozesses begrenzt.
Wie zuvor erwähnt, werden Ligandenproteinsequenzen bei einer Ausführungsform der Erfindung genetisch an das Ölkörperprotein fusioniert. Um solche genetischen Fusionen herzustellen, wird eine chimäre DNA-Sequenz hergestellt, die für ein Ölkörperprotein-Liganden-Fusionsprotein codiert und besteht aus (a) einer DNA-Sequenz, die für einen hinreichenden Teil eines Ölkörperproteins codiert, um die Zielsteuerung des Fusionsproteins an die Ölkörper zu erlauben und (b) einer DNA-Sequenz, die für einen hinreichenden Teil des Ligandenproteins codiert, um die Bindung des Ziels zu ermöglichen. Die Erfinder haben festgestellt, dass im Allgemeinen der N-Terminus und der hydrophobe Kern eines Ölkörperproteins hinreichend sind, um eine Zielsteuerung des Fusionsproteins an die Ölkörper bereitzustellen. Insbesondere für die aus der Pflanze Arabidopsis thaliana stammenden Oleosine sind die Aminosäuren 2 bis 123 (wie gezeigt in der SEQ ID NO:1) in dieser Hinsicht ausreichend.
Der Ligand kann entweder an das N- und/oder an das C-terminale Ende des Oleosins fusioniert werden. Es kann auch möglich sein, eine interne Fusion zwischen dem Liganden und dem Oleosin herzustellen, oder den Liganden zwischen zwei Oleosinproteine zu fusionieren. Die chimäre DNA-Sequenz, die für ein Ölkörperprotein codiert, das mit einem Liganden fusioniert ist, kann in einen geeigneten Vektor transfiziert werden und verwendet werden, um eine Pflanze zu transformieren. Es werden routinemäßig zwei Typen von Vektoren verwendet. Der erste Typ des Vektors wird für die genetische Manipulation und den Zusammenbau von Konstrukten verwendet und besteht typischerweise aus einem Rückgrat, wie es etwa in der Familie der pUC-Vektoren zu finden ist, was die Replikation in leicht manipulierbaren und züchtbaren gramnegativen Bakterien, wie etwa E. coli erlaubt. Der zweite Typ von Vektor, der typisch durch die Ti- und Ri-Plasmide vertreten ist, spezifiziert Funktionen der DNA-Übertragung und wird verwendet, wenn es erwünscht ist, dass die Konstrukte über Agrobacterium-vermittelte Transformation in die Pflanze eingeführt und stabil in deren Genom integriert werden.
Ein typisches Konstrukt besteht, in der 5' nach 3'-Richtung, aus einer regulatorischen Region, die vollständig ist mit einem Promotor, der befähigt ist, die Expression in Pflanzen anzutreiben (bevorzugt Samen-spezifische Expression), einer Protein-codierenden Region und einer Sequenz, die ein Transkriptionsterminationssignal enthält, das in Pflanzen funktionell ist. Die Sequenzen, die das Konstrukt umfassen, können entweder natürlich oder synthetisch sein oder eine beliebige Kombination hiervon.
Es können sowohl nicht-samenspezifische Promotoren, wie etwa der 35-S-CaMV-Promotor (Rothstein et al., 1987, Gene 53: 153–161) als auch samenspezifische Promotoren, wie etwa der Phaseolin-Promotor (Sengupta-Gopalan et al., 1985; PNAS USA 82: 3320–3324) oder der Arabidopsis 18 kDa-Oleosin-Promotor (Van Rooijen et al., 1992; Plant Mol. Biol. 18: 1177–1179) verwendet werden. Zusätzlich zu dem Promotor enthält die regulatorische Region eine Ribosomenbindungsstelle, die die Translation der Transkripte in Pflanzen ermöglicht, und sie kann außerdem eine oder mehrere Enhancer-Sequenzen beinhalten, wie etwa den AMV-Leader (Jobling und Gehrke 1987; Nature 325: 622–625), um die Expression des Produkts zu steigern.
Die codierende Region des Konstrukts wird typischerweise aus Sequenzen zusammengesetzt sein, die für einen Liganden codieren, der im Leseraster an ein Oleosin fusioniert ist und mit einem Translationsterminationscodon endet. Die Sequenz des Oleosins kann aus einer beliebigen DNA-Sequenz oder einem Teil hiervon, natürlicher oder synthetischer Herkunft, zusammengesetzt sein, wobei diese hinreichend ist, für ein Protein zu codieren, das in korrekter Weise an einen Ölkörper zielgesteuert und stabil dort exprimiert werden kann. Eine detaillierte Beschreibung der Eigenschaften einer solchen Sequenz ist zuvor in Moloney," 1993, PCT-Patentanmeldung WO 93/21320 beschrieben worden. Die Sequenz kann auch Introns beinhalten. Die für den Liganden codierende Region kann wiederum zusammengesetzt sein aus jeder einzelnen oder beliebigen Kombinationen von Ligandensequenzen, die gemäß obiger Beschreibung identifiziert wurden. Wenn gewünscht, kann eine Protease-Erkennungsstelle oder chemische Erkennungsstelle zwischen dem Liganden und dem Zielprotein erzeugt werden, um im Verlauf der Reinigung die proteolytische Entfernung des Liganden von dem Zielprotein zu ermöglichen.
Die Region, die das Transkriptionsterminationssignal enthält, kann eine jede dieser Sequenzen, die in Pflanzen funktionell sind, enthalten, wie etwa die Nopalinsynthase-Terminationssequenz, und sie kann zusätzlich Enhancer-Sequenzen beinhalten, um die Expression des Produkts zu steigern.
Die verschiedenen Komponenten des Konstrukts werden unter Verwendung konventioneller Verfahren zusammenligiert, typischerweise in einen pUC-basierten Vektor. Dieses Konstrukt kann dann in einen Agrobacterium-Vektor eingeführt werden und nachfolgend in Wirtspflanzen, wobei man eines der unten dargestellten Transformationsverfahren verwendet.
Es ist eine Vielzahl von Techniken für die Einführung von DNA in Wirtszellen verfügbar. Beispielsweise können die chimären DNA-Konstrukte in Wirtszellen eingeführt werden, die von dikotylen Pflanzen erhalten werden, wie etwa von Tabak, und von ölerzeugenden Spezies, wie etwa B. napus, unter Verwendung von Standard-Agrobacterium-Vektoren; mittels eines Transformationsprotokolls, wie etwa demjenigen, das beschrieben wurde von Moloney et al., 1989, (Plant Cell Rep., 8: 238–242) oder von Hinchee et al., 1988 (Bio/Technol., 6: 915–922); oder mittels weiterer Techniken, die Fachleuten bekannt sind. Beispielsweise hat die Verwendung von T-DNA zur Transformation von Pflanzenzellen ausgedehnte Erforschung erfahren und ist ausführlich beschrieben in EPA Seriennummer 120,516; Hoekema et al., 1985, (Kapitel V, In: The Binary Plant Vector System, Offset-Druckerei Kanters B.V., Alblasserdam); Knauf et al., 1983, (Genetic Analysis of Host Range Expression by Agrobacterium, S. 245, In: Molecular Genetics of the Bacteria-Plant Interaction, Puhler, A. Herausgeber, Springer-Verlag, NY); und An et al., 1985, (EMBO J., 4: 277–284). Üblicherweise können Explantate mit A. tumefaciens oder A. rhizogenes kultiviert werden, um den Transfer des Transkriptionskonstrukts zu den Pflanzenzellen zu erlauben. Nach der Transformation unter Verwendung von Agrobacterium werden die Pflanzenzellen in einem geeigneten Selektionsmedium dispergiert, und nachfolgend werden Kalli, Schösslinge und schließlich Pflänzchen regeneriert. Der Agrobacterium-Wirt wird ein Plasmid beinhalten, das die vir-Gene enthält, die für den Transfer der T-DNA auf die Pflanzenzelle notwendig sind. Für die Injektion und Elektroporation (siehe unten) können entschärfte Ti-Plasmide (ohne die Tumorgene, insbesondere die T-DNA-Region) in die Pflanzenzelle eingeführt werden.
Die Verwendung von nicht auf Agrobacterium gestützten Techniken erlaubt die Verwendung der hier beschriebenen Konstrukte, um Transformanten zu erhalten und die Expression in einer großen Vielfalt monokotyler und dikotyler Pflanzen und anderer Organismen. Diese Techniken sind besonders nützlich für Spezies, die mit einem Agrobacterium-Transformationssystem schwer zu bearbeiten sind. Andere Techniken für die Genübertragung beinhalten Biolistik (Sanford, 1988, Trends in Biotech., 6: 299–302), Elektroporation (Fromm et al., 1985, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82: 5824–5828; Riggs und Bates, 1986, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83: 5602–5606) oder PEG-vermittelte DNA-Aufnahme (Potrykus et al., 1985, Mol. Gen. Genet., 199: 169–177).
Bei einer spezifischen Anwendung, wie etwa bei B. napus, werden die Wirtszellen, auf die man abzielt, um rekombinante DNA-Konstrukte zu erhalten, typischerweise von kotyledonen Blattstielen stammen, wie beschrieben von Moloney et al., (1989, Plant Cell Rep., 8: 238–242). Andere Beispiele unter Verwendung kommerzieller Ölsaaten beinhalten die Transformation von Kotyledonen in Explantaten der Sojabohne (Hinchee et al., 1988, Bio/Technology, 6: 915–922) und die Stieltransformation bei Baumwolle (Umbeck et al., 1981, Bio/Technology, 5: 263–266).
Nach der Transformation werden die Zellen, beispielsweise als Blattscheiben, in Selektionsmedium herangezüchtet. Sobald sich Sprosse zu bilden beginnen, werden diese ausgeschnitten und auf Bewurzelungsmedium gebracht. Nachdem sich genügend Wurzeln gebildet haben, werden die Pflanzen auf Erde überführt. Mutmaßlich transformierte Pflanzen werden dann auf die Anwesenheit eines Markers hin getestet. Southern Blots werden unter Verwendung einer geeigneten Sonde, z.B. eines A. thaliana-Oleosingens, an genomischer DNA durchgeführt, um zu zeigen, dass die Integration der gewünschten Sequenzen in das Wirtszellgenom stattgefunden hat.
Die Expressionskassette wird normalerweise mit einem Marker zur Selektion in Pflanzenzellen verbunden. Praktischer Weise kann der Marker die Resistenz gegenüber einem Herbizid sein, z.B. Phosphinotricin oder Glyphosat, oder, in spezifischerer Weise, ein Antibiotikum, wie etwa Kanamycin, G418, Bleomycin, Hygromycin, Chloramphenicol oder dergleichen. Der speziell verwendete Marker wird ein Marker sein, der die Selektion transformierter Zellen im Vergleich zu Zellen, denen die eingeführte rekombinante DNA fehlt, erlauben wird.
Das Fusionspeptid in der Expressionskassette, die gemäß obiger Beschreibung konstruiert wurde, wird wenigstens bevorzugt in sich entwickelnden Samen exprimiert. Dementsprechend lässt man transformierte Pflanzen, die gemäß konventioneller Weise herangezogen wurden, Samen ansetzten (siehe z.B. McCormick et al., 1986, Plant Cell Reports, 5: 81–84). Northern Blotting kann unter Verwendung einer geeigneten Gensonde mit RNA durchgeführt werden, die aus Gewebe isoliert wurde, bei dem man erwartet, dass Transkription stattfindet, wie etwa bei einem Embryo im Samen. Die Größe der Transkripte kann dann mit der vorhergesagten Größe für das Fusionsproteintranskript verglichen werden.
Es werden dann Ölkörperproteine aus dem Samen isoliert, und Analysen werden durchgeführt, um zu bestimmen, ob das Fusionspeptid exprimiert wurde. Die Analysen können z.B. mittels SDS-PAGE erfolgen. Das Fusionspeptid kann unter Verwendung eines Antikörpers gegen den Oleosinanteil des Fusionspeptids detektiert werden. Die Größe des erhaltenen Fusionspeptids kann dann mit der vorhergesagten Größe des Fusionsproteins verglichen werden.
Zwei oder mehr Generationen transgener Pflanzen können herangezogen und entweder gekreuzt oder einer Selbstung unterzogen werden, um die Identifikation von Pflanzen und Stämmen zu erlauben, die die gewünschten phänotypischen Eigenschaften, einschließlich der Produktion der rekombinanten Proteine, aufweisen. Es kann erstrebenswert sein, die Homozygotie der Pflanzen, Stämme oder Linien sicherzustellen, die die rekombinanten Proteine produzieren, um eine fortgesetzte Vererbung des rekombinanten Merkmals zu sichern. Verfahren zur Selektion homozygoter Pflanzen sind Fachleuten auf dem Gebiet der Pflanzenzucht wohlbekannt und beinhalten wiederholte Selbstung und Selektion und Antheren- und Mikrosporenkultur. Homozygote Pflanzen können außerdem erhalten werden durch die Transformation haploider Zellen oder Gewebe, gefolgt von der Regeneration haploider Pflänzchen, die nachfolgend durch eine beliebige Anzahl bekannter Mittel (z.B. Behandlung mit Colchicin oder anderen, die Mikrotubuli aufbrechenden Mitteln) in diploide Pflanzen umgewandelt werden.
Verfahren zur Abtrennung von Zielmolekülen unter Verwendung von Affinitätsmatrizes
Wie hier zuvor erwähnt, betrifft die vorliegende Erfindung Verfahren zur Abtrennung eines Zielmoleküls aus einer Probe unter Verwendung der oben beschriebenen Ölkörperproteine und, in einigen Fällen, Liganden. Bei den Verfahren der Erfindung werden die Ölkörper mit einer Probe gemischt, die das gewünschte Ziel enthält, und die Wechselwirkung zwischen dem Liganden und dem Ziel resultiert in der nicht-kovalenten Assoziation des Ziels mit dem Ölkörper. Nach der Zentrifugation werden die Ölkörper und das affinitätsgebundene Ziel von der wässrigen Phase getrennt, wodurch das Ziel wirksam von allen Verunreinigungen in der ursprünglichen Probe gereinigt wird. Eine Wiederholung des Waschschritts stellt sicher, dass alle verbleibenden Verunreinigungen entfernt werden.
Nach ihrer Anheftung an die Ölkörper können die Ziele unter Bedingungen eluiert werden, die empirisch für jedes einzelne Liganden-Ziel-Paar bestimmt werden. Die Behandlung der gebundenen Matrix mit dem geeigneten Elutionsmittel und Zentrifugation ermöglichen die Wiedergewinnung des gereinigten Ziels in der wässrigen Phase. Wenn das Ziel eine Liganden-Protein-Fusion ist, die eine Protease-Erkennungsstelle enthält, so kann es mit der geeigneten Protease behandelt werden, um den Liganden zu entfernen. Der freie Ligand kann dann von dem Zielprotein durch erneute Anwendung der Ölkörper-Affinitätsmatrix oder durch konventionelle Proteinreinigungsverfahren getrennt werden.
Die chemischen und physikalischen Eigenschaften der Affinitätsmatrix können auf wenigstens zwei Weisen variiert werden. Zum ersten enthalten verschiedene Pflanzenarten Ölkörper mit unterschiedlichen Ölzusammensetzungen. Beispielsweise ist die Kokosnuss reich an Laurinsäure-Ölen (C12), während Erucasäureöle (C22) reichlich bei einigen Brassica spp. vorkommen. Weiterhin werden die Proteine, die mit den Ölkörpern assoziiert sind, sich zwischen den Spezies unterscheiden. Zweitens können die relativen Mengen an Ölen in einer bestimmten Pflanzenart modifiziert werden, indem man Zuchtverfahren und Techniken der Genmanipulation oder eine Kombination hiervon, wie sie dem begabten Fachmann bekannt ist, anwendet. Diese Techniken zielen darauf ab, die relativen Enzymaktivitäten zu verändern, die die an der Ölsynthese beteiligten metabolischen Wege kontrollieren. Durch die Anwendung dieser Techniken sind Samen mit einem verfeinerten Set verschiedener Öle erhältlich. Beispielsweise haben Zuchtanstrengungen zur Entwicklung einer Rapssaat geführt, die einen niedrigen Gehalt an Erucasäure aufweist (Canola) (Bestor, T.H., 1994, Dev. Genet. 15: 458), und Pflanzenlinien, die Öle mit Veränderungen bei der Position und Anzahl von Doppelbindungen aufweisen, sowie Variationen bei der Länge der Fettsäurekette und eine Einführung wünschenswerter funktioneller Gruppen, sind alle über gentechnische Ansätze hergestellt worden (Töpfer et al., 1995, Science, 268: 681–685).
Unter Verwendung ähnlicher Ansätze wird ein Fachmann in der Lage sein, die derzeit verfügbaren Quellen von Ölkörpern weiter auszuweiten. Abweichende Ölzusammensetzungen werden in abweichenden physikalischen und chemischen Eigenschaften der Ölkörperfraktion resultieren. Somit kann durch die Auswahl von Ölsaaten oder Gemischen hiervon von unterschiedlichen Spezies oder Pflanzenlinien als Quelle für Ölkörper ein breites Repertoire an Ölkörpermatrizes mit verschiedenen Texturen und Viskositäten erhalten werden.
Anwendungen von Ölkörper-Affinitätsmatrizes
Wenn die Möglichkeit gegeben ist, Ölkörper-Affinitätsmatrizes für verschiedene Klassen von Proteinen herzustellen, so lassen sich zahlreiche Verwendungen für auf Ölkörpern basierende Affinitätsmatrizes ins Auge fassen. Bakterien, Pilze, Pflanzen und Tiere enthalten alle Proteine, die in der Lage sind, in spezifischer Weise mit Mitteln, wie etwa Ionen, Metallen, Nukleinsäuren, Zuckern, Lipiden und anderen Proteinen, zu interagieren. Diese Mittel können unter Verwendung der Ölkörper-Technologie immobilisiert werden.
Die Ölkörper-Protein-Affinitätsmatrizes können verwendet werden, um jedes beliebige Zielmolekül zu isolieren, das an das Ölkörperprotein binden kann, entweder direkt oder indirekt über ein Ligandenmolekül. Beispiele von Zielmolekülen, die unter Verwendung der Methodik der vorliegenden Erfindung aus einer Probe isoliert werden können, beinhalten Proteine, Peptide, organische Moleküle, Lipide, Kohlenhydrate, Nukleinsäuren, Zellen, Zellfragmente, Viren und Metalle. Insbesondere haben die Erfinder gezeigt, dass die Affinitätsmatrix der vorliegenden Erfindung verwendet werden kann, um therapeutische Proteine (wie etwa Thrombin), Antikörper, Metalle (wie etwa Cadmium), Kohlenhydrate (wie etwa Cellulose), organische Moleküle (wie etwa Biotin) und Zellen (wie etwa Bakterienzellen) abzutrennen.
Ölkörperaffinitätsmatrizes können auch verwendet werden, um Zellen von industriellem oder medizinischem Interesse aus einer gemischten Population von Zellen abzutrennen. Beispielsweise können hämatopoetische Stammzellen, die eine Subpopulation von Blutzellen darstellen und bei Knochenmarkstransplantationen und Stammzellgentherapien verwendet werden, unter Verwendung von auf Ölkörpern basierender Affinitätstechnologie von anderen Blutzellen getrennt werden. Bei der rekombinanten DNA-Technologie ist es oft erforderlich, dass Zellen, in die erfolgreich rekombinante DNA eingeführt wurde, bekannt als transformierte Zellen, von Zellen unterschieden und abgetrennt werden, die keine rekombinante DNA angenommen haben. Vorausgesetzt, dass ein Teil der rekombinanten DNA ein Zelloberflächenprotein exprimiert, das komplementär zu einem Ölkörperbasierten Affinitätsliganden ist, ist es möglich, Ölkörper dazu zu verwenden, transformierte Zellen von untransformierten Zellen zu trennen. Ölkörper-Affinitätstechnologie kann auch dazu verwendet werden, um zelluläre Organellen, wie etwa Chloroplasten und Mitochondrien, von anderem Zellmaterial zu trennen. Virale Partikel können ebenfalls von komplexen Gemischen getrennt werden.
Es ist auch möglich, eine Klasse von Proteinen zu immobilisieren, die als Metalloproteine bekannt sind, die prosthetische Gruppen enthalten, die spezifisch Ionen binden. Beispiele für Metalloproteine sind Hämoglobin, das Eisen bindet, Parvalbumin, das Calcium bindet, und Metallothionein, ein Protein, das Zink und andere Metallionen bindet. Es wird ins Auge gefasst, dass Ölkörper dafür verwendet werden könnten, um Metalle aus Strömen von fließendem Material abzufangen, die, mit dem Metallabfällen aus Laboratorien und Industrieprozessen, wasserverunreinigend sein können. Das unten angegebene Beispiel 4 veranschaulicht diese Anwendung weiter. Andere Beispiele, bei denen Proteine biologisch immobilisiert und in einer biologischen Sanierungsstrategie angewendet werden können, beinhalten die Entfernung von Phosphaten, Nitraten und Phenolen aus Abwasserströmen. Teilweise könnte dieser Ansatz die realen oder wahrgenommenen Grenzen bakterieller biologischer Sanierung überwinden. Unter bestimmten Umständen ist es möglicherweise nicht praktisch oder notwendig, sich auf eine Affinitätstrenntechnik zu stützen, um die Ölkörpermatrix von der Zielverbindung zu trennen. Unter diesen Umständen wird ins Auge gefasst, dass die Ölkörper auf einer festen inerten Oberfläche immobilisiert werden könnten, die eine flache Oberfläche oder die Oberfläche einer Säule sein kann. Eine Lösung, die den Affinitätsliganden enthält, kann dann über die Oberfläche geleitet werden, die mit den immobilisierten Ölkörpern beschichtet ist, wobei eine selektive Affinitätsbindung erfolgt. Es wird ins Auge gefasst, dass immobilisierte Ölkörper in Rohren und Teichen verwendet werden können, um die biologische Sanierung zu unterstützen.
Die folgenden Beispiele zeigen verschiedene Systeme, bei denen Ölkörper als Affinitätsmatrizes verwendet werden können. Es versteht sich, dass die unten angegebenen Beispiele nur zur Veranschaulichung und nicht als Einschränkung gedacht sind.
BEISPIELE
Beispiel 1
Reinigung von Thrombin
Das folgende Beispiel zeigt die Nützlichkeit einer Ölkörper-Affinitätsmatrix für die Reinigung von Thrombin. Thrombin ist eine Serinprotease, die eine zentrale Rolle bei der Blutgerinnung spielt. Sie spaltet Fibrinogen, um Fibrinmonomere zu produzieren, die polymerisieren, um die Basis eines Blutgerinnsels zu bilden (Fenton 1981; Ann. N. Y. Acad Sci. 370: 468–495). Alfa-Thrombin besteht aus zwei Polypeptidketten von 36 (A-Kette) und 259 (B-Kette) Resten, die über eine Disulfidbrücke verbunden sind (Degen et al., 1983; Biochemistry 22: 2087–2097). Hirudin, das sich in den Speicheldrüsen des medizinischen Blutegels Hirudo medicinalis findet, ist ein sehr spezifischer und potenter Inhibitor von Thrombin. Diese Inhibition ist ein Ergebnis der nicht-kovalenten Bindung von Hirudin an bestimmte Teile der alpha-Thrombinkette (Stone und Hofsteenge 1986; Biochemistry 25: 4622–4628).
Der immobilisierte Ligand besteht aus einer Isoform von Hirudin, die an das 18 kDa Arabidopsis-Oleosin (Ölkörperprotein) (Van Rooijen et al., 1992; Plant Mol. Biol., 18: 1177–1179) fusioniert ist. Die Expression des Konstrukts wird über den Arabidopsis 18 kDa-Oleosin-Promotor (Van Rooijen et al., 1994; Plant Mol. Biol. 18: 1177–1179) reguliert. Die Sequenz der Oleosin-Hirudin-Fusion ist in 2 und in der SEQ ID NO:3 dargestellt.
Oleosin-Hirudin-Konstrukt
Es wurden Oligonukleotid-Primer auf Basis der für ein Brassica napus-Oleosingen beschriebenen Sequenz (Murphy et al., 1991, Biochim. Biophys. Acta 1088: 86–94) entworfen und verwendet, um ein Fragment der genomischen DNA von B. napus durch PCR zu amplifizieren. Unter Verwendung dieses Fragments als Sonde wurde ein Klon, der ein 15 kbp-Insert trägt, aus einer genomischen EMBL3 Arabidopsis-Bibliothek identifiziert und isoliert. Es wurden Oligonukleotid-Primer verwendet, um ein Fragment aus diesem Insert zu amplifizieren, das die gesamte codierende Oleosinsequenz und Intron zusammen mit 840 Basenpaaren der 5'-stromaufwärtigen Region enthält. Die Primer wurden so gestaltet, dass sie das translationale Stopcodon eliminieren und eine PstI-Restriktionsendonuklease-Erkennungsstelle am 5'-Ende und eine SalI-Stelle, gefolgt von einer PvuI-Stelle am 3'-Ende des Fragments einführen. Das Fragment wurde an den Enden aufgefüllt und in die SmaI-Stelle des Plasmidvektors pUC19 ligiert. Ein SalI-EcoRI-Fragment aus dem Plasmid pBl121 (Clontech), umfassend die Nopalin-Synthetase-Terminatorsequenz, wurde dann inseriert, um pOBILT zu erzeugen.
Eine synthetische Hirudinvariante 2 (HV2)-Sequenz wurde auf Basis beschriebener Sequenzinformation (Harvey et al., 1986, Proc Natl. Acad. Sci. USA 83: 1084–1088) synthetisiert, wobei jedoch die Codon-Nutzung von B. napus und Arabidopsis verwendet wurde. Die Sequenz wurde unter Verwendung von vier überlappenden Oligonukleotid-Primern amplifiziert, die so gestaltet waren, dass das resultierende Fragment PvuI- bzw. SalI-Stellen am 5'-Ende bzw. 3'-Ende besaß. Dieses Fragment wurde in die SmaI-Stelle des Plasmidvektors pUC19 ligiert, um pHIR zu erzeugen. Das PvuI-SalI-Fragment aus pHIR wurde dann in pUCOBILT zwischen das Oleosin und die Terminatorsequenzen inseriert, um eine im Leseraster befindliche Fusion mit der codierenden Region von Oleosin herzustellen, was pUCOBHIRT ergab. Das gesamte Konstrukt wurde in pBluescript KS+ (pBIOBHIRT) und dann in die PstI-Stelle des Plasmids pCGN1559 (McBride und Summerfelt, 1990, Plant Mol. Biol. 14: 269–276), das ein Neomycin-Phosphotransferasegen unter der Kontrolle des 35-S-CaMV-Promotors trägt, subkloniert (pCGOBHIRT). Dieses Plasmid wurde in Agrobacterium tumefaciens eingeführt. Die Präparation dieses Plasmids ist in 3 dargestellt.
Transformation und Regeneration
Verfahren zur Transformation von Agrobacterium und Pflanzen sind zuvor beschrieben worden. Agrobacterium tumefaciens wurde mittels Elektroporation (Dower et al., 1988; Nucl. Acids Res. 16: 6127–6145) mit dem obigen Konstrukt transformiert. Die transformierten Bakterien wurden dann verwendet, um kotyledone Explantate von Brassica napus zu transformieren, gefolgt von Pflanzenregeneration gemäß den Verfahren von Moloney et al., (1989; Plant Cell Reports 8: 238–242). Die transgenen Pflanzen wurden anfänglich dadurch identifiziert, dass man einen Neomycin-Phosphotransferase-Assay verwendete, gefolgt von der Bestätigung der Expression der Oleosin-Hirudin-Fusion, bestimmt über Northern Blot und Immuno-Blot-Analyse.
Präparation von Ölkörpern
Samen entweder von Kontrollpflanzen (nicht transgen) oder transgenen Pflanzen, die die Oleosin-Hirudin-Fusion exprimieren, wurden in fünf Volumina kaltem Mahlpuffer (50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 0,4 M Sucrose und 0,5 M NaCl) unter Verwendung eines bei Hochgeschwindigkeit betriebenen Polytrons homogenisiert. Das Homogenisat wurde bei etwa 10 × g für 30 min zentrifugiert, um partikuläre Materie zu entfernen und um die Ölkörper von der wässrigen Phase, die die Hauptmasse an löslichem Samenprotein enthält, abzutrennen. Die Ölkörper wurden mit einem Metallspatel von der Oberfläche des Überstandes abgeschöpft und in ein Volumen an frischem Mahlpuffer gegeben. Um ein wirkungsvolles Waschen in den nachfolgenden Schritten zu erreichen, war es wichtig, sicherzustellen, dass die Ölkörper sorgfältig erneut dispergiert wurden. Dies wurde erreicht durch sanftes erneutes Homogenisieren der Ölkörper in Mahlpuffer mit dem bei niedriger Geschwindigkeit betriebenen Polytron. Unter Verwendung einer Spritze wurden die resuspendierten Ölkörper vorsichtig unter fünf Volumina an kaltem 50 mM Tris-HCl, pH 7,5 geschichtet und wie oben zentrifugiert. Nach der Zentrifugation wurden die Ölkörper erneut entfernt, und die Waschprozedur wurde dreimal wiederholt, um verbliebene, kontaminierende lösliche Samenproteine zu entfernen. Die letzte gewaschene Ölkörperpräparation wurde in einem Volumen an kaltem 50 mM Tris-HCl, pH 7,5 resuspendiert, erneut mit dem Polytron dispergiert und war dann bereit für die Verwendung als Affinitätsmatrix.
Affinitätsreinigung von Thrombin
Die Reinigung von Thrombin unter Verwendung des Oleosin-Hirudin-Fusionsproteins ist schematisch in 4 dargestellt. Um die Bindung von Thrombin zu bewerten, wurden Affinitäts-Matrizes aus transgenen Brassica napus-Samen, die das Oleosin-Hirudin-Fusionsprotein exprimieren (4A4-Samen) (Parmenter et al., Plant Molecular Biology (1995), 29: 1167–1180) und aus Samen von wildtypischem Brassica napus, Kultivar Westar, hergestellt. Es wurde die Bindung von Thrombin an beide Matrizes bewertet. Die Prozeduren für die Herstellung gewaschener Ölkörper aus Samen waren dieselben wie die oben beschriebenen.
Lösungen, die eine Reihe von Thrombinaktivitäten zwischen 0 und 1 Einheiten enthalten, wurden mit 10 μl einer festgelegten Menge an Affinitätsmatrix (hergestellt aus einer Gesamtheit von 10 mg an getrockneten Samen; entsprechend etwa 100 μg an Gesamt-Ölkörperprotein) in 500 μl Bindepuffer (50 mM Tris-HCl pH 7,5; 0,1% (Gew./Vol.) BSA) gemischt. Die Ölkörpersuspension wurde dann für 30 Minuten auf Eis inkubiert und bei 14.000 rpm für 15 Minuten bei 4°C zentrifugiert. Der Puffer unter den Ölkörpern (als „Unterstand" bezeichnet), der das nicht gebundene, freie Thrombin enthielt, wurde unter Verwendung einer Hypoderm-Nadel wiedergewonnen und wie folgt auf Thrombinaktivität hin getestet. Eine Gesamtheit von 250 μl Unterstand wurde zu 700 μl Bindepuffer gegeben und auf 37°C vorgewärmt. Nach der Addition von 50 μl 1 mM Thrombinsubstrat N-p-Tosyl-Gly-Pro-Arg-p-Nitroanilid (Sigma) zu dem Unterstand wurde die Änderung der optischen Dichte bei 405 nm spektrophotometrisch für 3 Minuten überwacht. Die Konzentration an Thrombin im Testgemisch wurde bestimmt, indem man eine Standardkurve verwendete, die unter Verwendung eines Satzes von Thrombinproben, enthaltend bekannte Konzentrationen an Thrombin, erstellt worden war. Die anhand dieser Tests erhaltenen Werte wurden verwendet, um die Konzentration an gebundenem Thrombin unter folgender Vorgabe zu berechnen: [gebundenes Thrombin] = [Gesamt-Thrombin] – [freies Thrombin]
Das Verhältnis der Konzentration an gebundenem Thrombin gegenüber der Konzentration an freiem Thrombin wurde als Funktion der Konzentration an gebundenem Thrombin (Scatchard-Auftragung) aufgetragen. Anhand dieser Auftragungen wurden die Dissoziationskonstanten der Affinitätsmatrix gemäß Standardprozeduren (Scatchard, G. Ann. N. Y. Acad. Sci. (1949) 57: 660–672) und unter der Annahme K_a = 1/K_d berechnet. Die Dissoziationskonstanten der Affinitätsmatrizes waren 3,22 × 10^–7 m für den Wildtyp und 2,60 × 10^–8 m für die 4A4-Ölkörper.
Um die Ausbeute an gebundenem Thrombin aus den Matrizes zu bewerten, wurde ein NaCl-Gradient verwendet. Das Elutionsprofil von Thrombin, das an die Oleosin-Hirudin-Ölkörpermatrizes gebunden war, wurde mit dem Profil von Thrombin verglichen, das an die wildtypischen Ölkörpermatrizes gebunden hatte. Die Verfahren für die Herstellung von wildtypischen Ölkörpern aus Samen von wildtypischem Brassica napus, Kultivar Westar, und für die Herstellung von Oleosin-Hirudin-Ölkörpern aus Brassica napus 4A4-Samen (Parmenter et al., Plant Molecular Biology (1995) 29: 1167–1180) waren identisch zu den oben beschriebenen. Die Verfahren für die Bindung von Thrombin an die Matrizes waren wie oben beschrieben, mit der Ausnahme, dass 100 μl-Aliquots von Ölkörpern verwendet wurden, um 0,5 Einheiten an Thrombin zu binden. Man ließ die Ölkörpersuspensionen für 30 Minuten auf Eis, bevor sie für 15 Minuten bei 4°C und 14.000 rpm zentrifugiert wurden. Der Unterstand wurde auf (nicht gebundene) Thrombinaktivität hin getestet. Die Ölkörpermatrix wurde dann in Bindepuffer, dem NaCl in einer Endkonzentration von 0,05 M zugesetzt worden war, resuspendiert. Ausgehend von der 30 Minuten-Inkubation der Ölkörpersuspension auf Eis wurde die Prozedur fünfmal unter schrittweiser Erhöhung der NaCl-Konzentration wiederholt. Die verwendeten Endkonzentrationen von NaCl waren 0,05 M, 0,1 M, 0,2 M, 0,3 M, 0,4 M und 0,6 M. Die NaCl-Konzentration bei dem Thrombin-Assay wurde konstant auf 150 mM gehalten. 5 zeigt die Elutionsprofile, die erhalten wurden, wenn wildtypische Ölkörper und wenn 4A4-Ölkörper verwendet wurden.
Beispiel 2
Verwendung von Antikörpern als bivalente Liganden
Antikörper können aufgrund ihrer Affinität sowohl für spezifische Epitope als auch für andere Antikörper oder Proteine (z.B. das Staphylococcus aureus-Protein A), die Affinität für Immunglobuline (IgGs) haben, als bivalente Liganden verwendet werden. In diesem Beispiel dienen polyklonale Anti-Oleosin-Antikörper als bivalenter Ligand, und Antikörper, die in Kaninchen gegen die Anti-Oleosin-Antikörper erzeugt wurden, dienen als Ziel. Dieses Beispiel ist schematisch in 6 dargestellt.
Es wurden Ölkörper aus 5 g Samen von wildtypischem Brassica napus, Kultivar Westar, gemäß dem in Beispiel 1 beschriebenen Verfahren hergestellt. Nachfolgend wurden die Ölkörper zweimal mit 100 mM Glycin (pH 2,5) gewaschen, über zwei Waschungen in Bindungspuffer (50 mM Tris-HCl, pH 7,5) neutralisiert und in 5 ml Bindungspuffer resuspendiert. Ein 150 μl-Aliquot der gewaschenen Ölkörperpräparation wurde mit 500 μl Kaninchenserum zusammengebracht, das Anti-Oleosin-Antikörper (Ligandenantikörper), 1:10 mit Bindungspuffer verdünnt, enthielt. Die Ölkörpersuspension wurde gründlich gemischt und für 1 h bei 4°C unter Bewegung inkubiert. Nach der Inkubation wurden nicht gebundene Ligandenantikörper über drei Waschungen mit 1 ml Bindepuffer aus der Ölkörpersuspension entfernt. Die Ölkörper wurden dann mit 500 μl Serum zusammengebracht, das 1:500 in Bindepuffer verdünnt war und Anti-Kaninchen-IgG-Antikörper (die Ziel-Antikörper) enthielt, die mit Meerrettichperoxidase (HRP) als Detektionsmarkierung konjugiert waren (Sigma). Diese Suspension wurde gemischt und unter Bedingungen inkubiert, die identisch zu denen waren, die für die Anti-Oleosin-Antikörperbindung verwendet wurden. Als Kontrolle wurden Zielantikörper mit Ölkörpern inkubiert, die nicht zuvor an Ligandenantikörper gebunden hatten. Beide Proben wurden nachfolgend viermal mit 1 ml Bindungspuffer gewaschen, um nicht gebundene Antikörper zu entfernen. Unter Verwendung von Bindungspuffer erfolgte eine Angleichung der Proben im Hinblick auf die Konzentration an Ölkörpern, wie sie durch spektrophotometrische Messung der Trübung der Proben bei 600 nm bestimmt wurde. Um auf gebundenen Zielantikörper hin zu testen, wurden Proben, die 5 μl an Ölkörpern enthielten, mit 1 ml des colorimetrischen HRP- Substrats Tetramethylbenzidin in 0,01% Wasserstoffperoxid gemischt und für 10 Minuten bei Raumtemperatur umgesetzt. Die Reaktionen wurden durch Zugabe von 500 μl 1 M H₂SO₄ abgestoppt, und die Extinktion bei 450 nm wurde bestimmt. Korrekturen bezüglich des Vorhandenseins von nach dem Waschen verbliebenem ungebundenem Zielantikörper erfolgten, indem man 5 μl der endgültigen Waschfraktion testete. Die Ergebnisse, die für die Kontrolle und die Liganden-gebundenen Ölkörperpräparationen erhalten wurden, sind in 7 dargestellt.
Beispiel 3
Verwendung Oleosin-spezifischer Liganden
Die Verwendung eines Oleosin-spezifischen Liganden stellt eine Alternative zur Verwendung eines Antikörpers oder genetisch erzeugten Oleosin-Fusionsproteins für die Reinigung von rekombinanten Zielproteinen dar. In diesem Fall wird das Zielprotein an den Oleosin-spezifischen Liganden fusioniert, und die endogenen Oleosine, die an den Ölkörpern nicht-transgener Samen vorhanden sind, dienen als komplementäre Ligandenaffinitätsmatrix. Zusätzlich zur Beseitigung der Notwendigkeit, dass eine transgene Linie eine Oleosin-Fusion exprimiert, erhöht dieser Ansatz die allgemeine Kapazität der Affinitäts-Matrix, da alle endogenen Oleosine nun an der Bindung teilnehmen können.
Oleosin-spezifische Liganden können aus einer Peptid Phage Display-Bibliothek mittels Testen mit einem Oleosin-Protein identifiziert und isoliert werden. Da die extreme Hydrophobizität der zentralen Domäne von Oleosin zu der Aggregation und Präzipitation des Proteins führen kann, wenn dieses von den Ölkörpern gelöst wird, kann ein mutantes Protein, dem diese Domäne fehlt, für den Screen verwendet werden. Dies hat wenig Einfluss auf die Wirksamkeit des Liganden, da nur die hydrophilen Abschnitte des Oleosins dem Zytoplasma zugewandt sind (d.h. die N- und C-Termini). Somit sind dies die einzigen Regionen, die für die Bindung an einen Liganden verfügbar sind. Sobald er isoliert ist, kann der Ligand an ein gewöhnliches Reporterprotein, wie etwa grünes Fluoreszenzprotein (GFP) (Prasher, 1995, Trends Genet. 11: 320–323), fusioniert werden, um die Reinigung zu demonstrieren.
Entfernung der zentralen Oleosin-Domäne
Oligonukleotid-Primer, die spezifisch für das oben beschriebene Arabidopsis Oleosingen sind, können verwendet werden, um ein Oleosingen aus einer B. napus cDNA-Bibliothek (van Rooijen 1993, Ph.D. Thesis, University of Calgary) zu amplifizieren. Primer, die Sequenzen flankieren, die für die N-terminalen 62 Aminosäuren und die C-terminalen 55 Aminosäuren codieren, können verwendet werden, um Sequenzen für die entsprechenden N- und C-terminalen Oleosindomänen in getrennten Reaktionen zu amplifizieren. Zusätzlich enthält der Primer für das 5'-Ende der N-terminalen Domäne eine Sequenz für eine Thrombinerkennungsstelle, um eine Spaltung des Fusionsproteins, wie unten beschrieben, zu ermöglichen. Das resultierende Fragment wurde in die SmaI-Stelle des bakteriellen Expressionsvektors pEZZ 18 (Pharmacia) ligiert. Dieser Vektor enthält Sequenzen, die ein Signalpeptid für die Proteinsekretion in das Periplasma codieren, sowie aus Protein A stammende synthetische IgG-Bindungsdomänen, um die Proteinreinigung zu erleichtern, und zwar stromabwärts von der multiplen Klonierungsstelle.
Expression und Reinigung des Oleosin-Deletionskonstrukts
Der Vektor, der das Konstrukt der Deletionsmutante trägt, wird unter Verwendung von Standardverfahren in E. coli eingeführt, und Transformanten werden selektiert. Eine Kultur der transformierten Bakterien kann induziert werden, um das synthetische Protein A-mutante Oleosin-Fusionsprotein durch Zugabe von 1 mM IPTG zu exprimieren. Die induzierten Zellen können pelletiert und in 5 mM MgSO₄ resuspendiert werden, was eine Lyse der periplasmatischen Membran durch osmotischen Schock bewirkt. Die lysierten Zellen werden zentrifugiert, und der Überstand, der das sekretierte Protein enthält, wird auf eine Säule geladen, die IgG-gekoppelte Sepharose enthält. Nach dem Waschen zur Entfernung nicht-gebundener Proteine wird die Säule mit einem Puffer beladen, der 50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 150 mM NaCl und 1,0 U/ml an gereinigtem Rinder-Thrombin (Sigma) enthält, um das mutante Oleosin von dem synthetischen Protein A abzuspalten. Nach der Inkubation bei 37°C für 4 h wird die Flüssigkeit aus der Säule abgelassen, und das Eluat wird durch eine Säule mit Heparin-gekoppelter Sepharose geleitet, um Thrombin zu entfernen. Das Eluat aus dieser Säule, das das mutante Oleosin-Protein enthält, wird zurückgewonnen, und die Reinheit des Proteins wird durch Gelelektrophorese, gefolgt von der Färbung mit Coomassie Blau R250, überprüft.
Erzeugung einer kombinatorischen Peptid-Bibliothek
Eine nach dem Zufallsprinzip angelegte kombinatorische Peptidbibliothek kann gemäß den Verfahren von Scott und Smith (1990; Science 249: 386–390) erzeugt werden. Kurz dargestellt, wird PCR verwendet, um ein synthetisches DNA-Fragment zu amplifizieren, das die degenerierte Sequenz (NNK)₆ enthält, wobei „N" ein gleichwertiges Gemisch der Desoxynukleotide G, A, T und C darstellt und K ein gleichwertiges Gemisch der Desoxynukleotide G und T darstellt. Die degenerierte Sequenz codiert für hexamere Peptide, unter denen alle möglichen Kombinationen der 20 Aminosäuren und das Amber-Stopcodon repräsentiert sind. Das PCR-Produkt wird in die Gen III-Sequenz des filamentösen Bakteriophagen fUSE ligiert, und das resultierende Phagemid wird mittels Elektroporation in E. coli eingeführt.
Identifizierung und Isolierung Oleosin-spezifischer Liganden
Die Peptid Phage Display-Bibliotheken werden amplifiziert, konzentriert und in Aliquots von 10¹² tdu/ml gelagert. Gereinigtes mutantes Oleosin-Protein wird unter Verwendung eines Thiolspaltbaren Linkers (S-S-Biotin, Pierce) biotinyliert und mittels Größenausschlusschromatographie gereinigt. Aliquots der Peptid Phage Display-Bibliothek, enthaltend 5 × 10¹¹ tdu in zwei ml, werden mit dem biotinylierten Protein bei einer Konzentration von 50 nM durchgetestet. Phagen, die an das mutante Oleosin-Protein binden, werden unter Verwendung von Streptavidin-beschichteten paramagnetischen Beads gewonnen. Nach dem Waschen werden die Phagen durch die Zugabe von 50 mM Dithiothreitol eluiert, das die Disulfidbindung spaltet. Die eluierten Phagen werden dann mit einem Überschuss an log-Phase F+ E. coli inkubiert. Aliquots der infizierten Zellen werden ausplattiert, um den Phagentiter zu bestimmen, und die verbleibenden Zellen werden in nachfolgenden Runden der Amplifikation und Durchtestung verwendet. Nach der Anreicherung der eluierten Phagen um 3–4 Größenordnungen werden einzelne Phagen selektiert und über direkten ELISA auf ihre Bindung an mutantes Oleosin getestet. Die Bindung durch den Phagen wird unter Verwendung von Anti-Phagen-Antikörpern (Crosby und Schorr, 1995, In: Annual Review of Cell Biology) detektiert. Aus den Phagen, die Bindung zeigen, wird Einzelstrang-DNA isoliert, und die Peptid-codierende Sequenz wird bestimmt.
Affinitätsreinigung mit Oleosin-spezifischen Liganden
Die Sequenz eines Oleosin-Liganden, der gemäß obiger Beschreibung isoliert wurde, wird im Leseraster stromaufwärts an die Sequenz für gfp10 (Prasher et al., 1992, Gene 111: 229–233), die für GFP codiert, fusioniert, und das Konstrukt wird in den bakteriellen Expressionsvektor pKK233 (Pharmacia) ligiert. Das lösliche Protein wird durch die Ultraschallbehandlung von Zellen extrahiert, die zur Expression der Liganden-GFP-Fusion induziert worden waren, und es wird auf eine Konzentration von 10 mg/ml in 50 mM Tris-HCl, pH 7,5, eingestellt.
Zwanzig ml der Proteinlösung werden mit 2 ml der Ölkörper gemischt, die gemäß obiger Beschreibung aus Samen nicht-transgener Pflanzen präpariert wurden. Das Gemisch wird unter Bewegung für 30 min bei 4°C inkubiert, um Bindung zu ermöglichen, und dann zentrifugiert, um die Ölkörper und die lösliche Fraktion voneinander zu trennen. Die Menge an GFP, die nach der Entfernung der Ölkörper in der löslichen Fraktion verbleibt, wird durch Fluoreszenz-Spektrofluorometrie bei einer Wellenlänge von 508 nm bestimmt und mit derjenigen von Original-Bakterienextrakt verglichen. Die Menge an gebundenem GFP wird berechnet, um die Kapazität der Matrix zu bestimmen.
Die Ölkörper werden zweimal in 20 ml 50 mM Tris-HCl, pH 7,5 gewaschen, in 2 ml des gleichen Puffers resuspendiert und in 20 Aliquots von 100 μl aufgeteilt. Die Bedingungen für die Elution von Liganden-GFP-Fusionsprotein werden durch die Zugabe von 1 ml Lösung in einem pH-Bereich, reichend von 2–10, und mit einer NaCl-Konzentration von 0–1 M zu verschiedenen Aliquots bestimmt. Nach dem Mischen und der Inkubation bei 4°C für 30 min werden die Ölkörper entfernt und die löslichen Fraktionen gesammelt. Die Menge an Liganden-GFP-Fusionsprotein in der löslichen Fraktion wird mittels Fluoreszenz-Spektrophotometrie bestimmt.
Beispiel 4
Entfernung von Schwermetallionen
Das folgende Beispiel zeigt die Nützlichkeit von Ölkörperaffinitätsmatrizes für die Gewinnung/Entfernung von Nicht-Proteinzielen aus komplexen Lösungen. Für den Zweck dieses Beispiels wurde das Metallothionein/Cd⁺⁺-Ligandenpaar verwendet. Jedoch können andere metallbindende Proteine, wie etwa Phytochelatine (Rauser, 1990, Ann. Rev. Biochem., 59: 61–86) und andere Metallionen, einschließlich Cu⁺⁺ und Zn⁺⁺, ebenfalls verwendet werden.
Oleosin-Metallothionein-Fusion
Ein Oleosingen aus einer B. napus-cDNA-Bibliothek (Van Rooijen, 1993, Ph.D. Thesis, University of Calgary) wurde mittels PCR mit Oligonukleotid-Primern amplifiziert, die so gestaltet waren, dass sie NotI- und NcoI-Stellen am 5'-Ende bzw. 3'-Ende des Gens erzeugen. Das resultierende Fragment wurde verdaut und in die NotI/NcoI-Stellen von pGN eingesetzt, um das Plasmid poleGN zu erhalten. Das humane Metallothioneingen, mt-II (Varshney und Gedamu, 1984, Gene, 31: 135–145) wurde unter Verwendung von Oligonukleotid-Primern amplifiziert, die so gestaltet waren, dass sie eine einzelne NotI-Stelle am 3'-Ende des Gens erzeugen. Das resultierende PCR-Produkt wurde in die ein glattes Ende aufweisende EcoRV-Stelle von pBluescript KS+ subkloniert, um pBSMTC zu erzeugen. Das mt-II-Gen wurde dann aus diesem Plasmid ausgeschnitten und in die NcoI/KpnI-Stellen von poleGN subkloniert, um die GUS-NOS-Region zu ersetzen und pOLEMTC zu erzeugen. Die 773 Basen große Oleosin-MT-Fusion von pOLEMTC wurde mittels NotI-Verdau ausgeschnitten und in die singuläre NotI-Stelle von polePN3' zwischen den Oleosin-Promotor (oleP, van Rooijen et al., 1992, Plant Mol. Biol. 18: 1177–1179) und den P. crispum ubi4-2-Genterminator (ubi3'; Kawalleck et al., 1993, Plant Mol. Biol. 21: 673–684) inseriert, um pOOM3' zu erzeugen. Nachdem man bestätigt hatte, dass die Fusion in der korrekten Orientierung vorlag, wurde pOOM3' mit KpnI verdaut, um das oleP-oleMT-ubi3'-Insert freizusetzen. Diese Expressionskassette wurde an der KpnI-Stelle des binären Vektors pCGN1559 eingesetzt, um das endgültige Konstrukt pBIOOM3' zu erhalten. Die Sequenz der Oleosin-Metallothionein-Fusion ist in 8 und in der SEQ ID NO: 6 dargestellt. Die Konstruktion des Plasmids pB100M3' ist in 9 dargestellt.
Transformation und Regeneration
Transgene B. carinata-Pflanzen, die die Oleosin-Metallothionein-Fusion exprimieren, wurden unter Verwendung von Transformations- und Regenerationsprotokollen gemäß der Beschreibung in Beispiel 1 erzeugt.
Ölkörperpräparation
Gewaschene Ölkörper wurden gemäß der Beschreibung in Beispiel 1 aus B. carinata-Samen von transgenen Pflanzen und Kontrollpflanzen hergestellt.
Entfernung von Cd⁺⁺ aus einer Lösung unter Verwendung einer Ölkörper-Affinitätsmatrix
Die Verwendung der Oleosin-Metallothionein-Fusion zur Bindung von Cadmium-Ionen in Lösung ist schematisch in 10 dargestellt.
Es wurde eine Lösung von 10 μM CdCl₂ in 10 mM Tris-HCl, pH 7,2, enthaltend 0,01 μCi/ml ¹⁰⁹Cd hergestellt. Ein 1 ml-Aliquot dieser CdCl₂-Lösung wurde mit 100 μl an gewaschenen Ölkörpern (1,6 mg an Ölkörperprotein), hergestellt aus Samen, die das Oleosin-Metallothionein-Fusionsprotein exprimieren, gründlich gemischt und für 1 h bei 22°C inkubiert. Nach der Zentrifugation für 5' bei 10.000 × g zur Abtrennung der Ölkörper von der der wässrigen Phase und 2 Waschungen in 1 ml an 10 mM Tris-Cl, pH 7,2, wurde die Menge an ¹⁰⁹Cd⁺⁺, die an die Ölkörperfraktion gebunden geblieben war, unter Verwendung eines Gamma-Zählers (Cobra Auto-Gamma, Canberra Packard, Canada) bestimmt. Ein identisches Experiment wurde mit Ölkörpern aus nicht-transgenen Samen durchgeführt, um hinsichtlich der unspezifischen Bindung von Cd-Ionen an die Matrix zu detektieren und zu korrigieren.
Die Cd⁺⁺-Ionen wurden von der Ölkörper-Metallothionein-Affinitätsmatrix eluiert, indem man die Ölkörperfraktion mit 1 ml an 100 mM Glycin-Puffer (pH = 3,0) (Pazirandeh et al., 1995, Appl. Microbiol. Biotechn. 43: 1112–1117) mischte. Nach der Zentrifugation für 5 min bei 10.000 × g wurde die Ölkörperfraktion entfernt und wie oben auf gebundene Cd⁺⁺-Ionen hin getestet. 11 zeigt die Cd-Bindung und Elution von der Affinitätsmatrix.
Beispiel 5
Abtrennung ganzer Zellen
Das folgende Beispiel zeigt die Kapazität von Ölkörpern, ganze Zellen zu immobilisieren. Ein Potential für die Verwendung von Bakterienzellen-Abtrennung liegt in der Anwendbarkeit für die Diagnostik. Es ist ebenfalls erstrebenswert, singuläre eukaryotische Zellen, wie etwa Lymphozyten und Stammzelten aus komplexen Gemischen von Zellen abzutrennen, wenn der Zelltyp von Interesse in relativ geringer Anzahl vorliegt.
Bindung von Staphylococcus aureus an Ölkörper via Protein A
Für den Zweck dieses Beispiels wurden S. aureus-Zellen, die Protein A als Oberflächenantigen exprimieren, mit Ölkörpern mit variierenden Mengen an polyklonalen Anti-Oleosin-Antikörpern gemischt.
Herstellung der Ölkörper
Samen von B. napus, Kultivar Westar, wurden in Bleiche oberflächensterilisiert, abgespült und mit Mörser und Stößel in Mahlpuffer (50 mM Tris pH 7,5, 0,4 M Sucrose und 100 mM Glycin) gemahlen. Das Homogenisat wurde durch Miracloth in sterile 15 ml Corex-Röhrchen abgefiltert. Das gefilterte Homogenisat wurde dann bei 4°C für 10 min bei 10.000 × g zentrifugiert. Die Ölkörperfraktion wurde entnommen und in 50 mM Tris pH 7,5 und 0,4 M Sucrose resuspendiert und zweimal unter Verwendung des gleichen Puffers gewaschen. Aliquots von 1 ml Ölkörpern wurden auf 1,5 ml Eppendorf-Röhrchen überführt und bei Raumtemperatur für 10 min bei 16.000 × g zentrifugiert. Die Ölkörper wurden in 50 mM Tris pH 7,5 und 0,4 M Sucrose 5–6 weitere Male gewaschen, bis kein sichtbares Pellet mehr zu sehen war.
Bindung von S. aureus-Zellen an Anti-Oleosin-beschichtete Ölkörper
In Formalin fixierte S. aureus-Zellen (Sigma, P-7155) wurden 3–4mal in 50 mM Tris-Cl pH 7,5 gewaschen und resuspendiert. Gewaschene Ölkörper (300 μl) und S. aureus-Zellen wurden mit variierenden Mengen an Anti-Oleosin-IgGs (50 μl) gemischt. Nach dem Mischen und Inkubieren bei Raumtemperatur für 2 h wurden die Gemische bei Raumtemperatur bei 16.000 × g für 5 min zentrifugiert. Die Ölkörperfraktion und der Unterstand wurden vorsichtig entnommen, und das Zellpellet wurde zweimal in 1 ml 50 mM Tris-Cl pH 7,5 gewaschen. Die Wände des Röhrchens wurden mit einem Gewebe abgeputzt, um Spuren von Öl zu entfernen. Nachfolgend wurden die abgetropften Zellpellets in 1 ml Wasser resuspendiert, und die OD₆₀₀ wurde bestimmt. 12 ist ein repräsentativer Versuch, der die Abnahme der Menge an Zellen zeigt, die in dem Zellpellet vorhanden sind, wenn die Konzentration an Anti-IgGs, die in dem Ölkörper/S.aureus-Gemisch vorhanden sind, zunimmt.
Differentielle Bindung von zwei Stämmen von Staphylococcus aureus
Bei diesem Versuch wird eine Ölkörperaffinitätsmatrix verwendet, um die differentielle Bindung von zwei Stämmen von Staphylococcus aureus zu demonstrieren. In Formalin fixierte S. aureus- Stämme, von denen einer das IgG-bindende Oberflächenantigen Protein A exprimiert, während dem anderen das Protein A fehlt, sind kommerziell bei Sigma erhältlich. Von beiden S. aureus-Stämmen können verdünnte Aliquots mit gleicher OD₅₅₀ hergestellt werden. Zu jedem dieser Aliquots können Kontrollölkörper aus untransformierten Pflanzen oder Ölkörper, die mit Anti-Oleosin-Antikörpern gemischt sind, hinzugegeben werden. Nach der Inkubation für eine geeignete Zeitspanne und bei einer geeigneten Temperatur können die Proben zentrifugiert werden, um nicht gebundene Bakterienzellen zu pelletieren und um die Ölkörperfraktion abzutrennen. Die Ölkörper können dekantiert, gevortext und die OD₅₅₀ kann bestimmt werden. Die Pellets können resuspendiert werden, und die OD₅₅₀ des Unterstandes kann bestimmt werden. Es wird angenommen, dass eine Fraktionierung dieser Zellen mit der Ölkörperfraktion nur bei der Probe, die den S. aureus-Stamm mit Protein A-Expression enthält und den Ölkörpern, die mit den Anti-Oleosin-Antikörpern komplexiert sind, zu beobachten sein wird. Die Bindung dieser Zellen an den Ölkörper kann weiter demonstriert werden durch eine Verringerung des pH der Ölkörperfraktion. Nach der Zentrifugation kann die Freisetzung der Zellen von den Ölkörpern durch die Anwesenheit eines Pellets und/oder durch einen Anstieg der OD₅₅₀ beim Resuspendieren des Pellets nachgewiesen werden.
Trennung von Staphylococcus aureus von E. coli
Ein lebensfähiger S. aureus-Stamm kann mit variierenden Mengen an Zellen eines E. coli-Stamms mit einer spezifischen Antibiotikaresistenz gemischt werden. Die gemischte bakterielle Probe kann mit Kontrollantikörpern und mit Ölkörpern, die mit Anti-Oleosin-Antikörpern komplexiert wurden, gevortext werden. Nach der Inkubation für eine geeignete Zeitspanne und bei einer geeigneten Temperatur können die Ölkörper gewaschen werden, und der Unterstand und die Ölkörper können direkt titriert und selektiv auf Blutagar für S. aureus-Wachstum und auf LB-Platten für E. coli-Wachstum ausplattiert werden. Die Anreicherung oder tatsächlich erhaltene Abtrennung kann durch eine Abschätzung der Kolonie-bildenden Einheiten bestimmt werden.
Identifizierung von Pathogenen, die in niedrigen Konzentrationen in einem komplexen Gemisch vorhanden sind
Für diagnostische Zwecke ist es oft wünschenswert, bakterielle oder virale Pathogene, die in geringer Zahl in menschliche oder tierische Gewebe einwandern, zu konzentrieren. Es kann eine Ölkörperaffinitätsmatrix verwendet werden, um diese Pathogene anzureichern, sodass sie nachfolgend identifiziert und charakterisiert werden können.
Pathogene binden durch die Interaktion mit einem Rezeptor oder einem Oberflächenprotein oft spezifisch an menschliche oder tierische Zellen. Oleosin kann mit dem humanen oder tierischen Proteinliganden fusioniert werden, und rekombinante Ölkörper können verwendet werden, um die Pathogene zu immobilisieren. Beispiele für die Ausbildung von Proteinkomplexen, die zwischen Proteinen humanen und pathogenen Ursprungs ausgebildet werden und im Stand der Technik bekannt sind, beinhalten: humanes Fibrinogen oder Fibrin-spezifische Domänen, die an den aus S. aureus stammenden Protein-Verklumpungsfaktor A (clf-A) binden (McDevitt et al., 1995, Mol. Microbiol. 16: 895–907), humanen „Decay accelerating Faktor" (DAF), an den pathogenes E. coli aus dem Harntrakt und dem Intestinaltrakt bindet (Nowicki et al., 1993, J. of Experim. Med., 178: 2115–2121), einen humanen Zellliganden, der in der Carcinom-Zelllinie Caco-2 exprimiert wird und der in singulärer Weise an das 28 kD Fimbrienprotein KPF-28 aus Klebsiella pneumoniae bindet (Di Maretino et al., 1996, Infect. and Immun. 64: 2263–2266), und Fibronectin-spezifische Domänen aus der extrazellulären Matrix von Humanzellen, die spezifisch mit Streptococcus pyrogenes-Adhäsin (Protein F) (Ozeri et al., 1996, EMBO J. 15: 989–998) komplexieren.
Beispiel 6
Abtrennung kleiner organischer Moleküle
Dieses Beispiel beschreibt, wie eine Ölkörper-Affinitätsmatrix für die Gewinnung/Entfernung kleiner organischer Moleküle aus einer Lösung verwendet werden kann. Beispielhaft wird das kleine organische Molekül Biotin unter Verwendung von Avidin als Ligand gereinigt.
Konstruktion von Avidin-Liganden
Avidin ist ein Protein, das von Vogelspezies synthetisiert wird und das eine extrem hohe Affinität für Biotin, einen natürlichen Cofaktor für viele Carboxylasen, zeigt. Präparationen von gereinigtem Avidin (kommerziell erhältlich von Sigma) können chemisch unter Verwendung von Standardprozeduren, die Fachleuten bekannt sind, an Anti-Oleosin-Antikörper konjugiert werden. Dieser Ansatz würde einen bivalenten Avidin-Liganden ergeben, der geeignet ist, um die Affinitätsbasierte Abtrennung von Biotin zu demonstrieren. Alternativ kann eine Oleosin-Avidin-Genfusion verwendet werden. Das Gen, das Avidin im Huhn (Gallus gallus) codiert, ist identifiziert und seine Sequenz bestimmt worden (Beattie et al., 1987, Nucl. Acids Res. 15: 3595–3606). Basierend auf der Sequenz kann das Gen für Avidin chemisch oder mittels PCR synthetisiert werden und mit dem Oleosin aus B. napus (van Rooijen, 1993, Ph.D. Thesis, University of Calgary) gemäß der Beschreibung in Beispiel 4 fusioniert werden. Streptavidin, ein analoges bakterielles Biotinbindendes Protein, kann ebenfalls verwendet werden.
Ölkörper-Präparation
Gewaschene Ölkörper können aus Samen von transgenen Pflanzen und/oder Kontrollpflanzen gemäß der Beschreibung in Beispiel 1 hergestellt werden.
Bindung von bivalentem Avidin-Oleosin-Liganden
Die Bindung von Anti-Oleosin-Antikörpern und die Entfernung von ungebundenem Liganden wird so sein, wie in Beispiel 3 detailliert beschrieben.
Abtrennen von Biotin aus der Lösung
Lösungen, die bekannte Konzentrationen an Biotin enthalten, können mit einer festen Menge an Ölkörpern zusammengebracht werden, die mit einem Anti-Oleosin-Antikörper komplexiert sind, der wiederum mit Avidin konjugiert ist. Nach der Bindung wird das Gemisch zentrifugiert, um die Ölkörper und die wässrige Fraktion zu trennen. Die Menge an Biotin, die in der wässrigen Fraktion verbleibt, wird durch kompetitiven ELISA unter Verwendung von Antibiotin-Antikörpern, die mit Meerrettich-Peroxidase (HRP) konjugiert sind, bestimmt. Die Menge an gebundenem Biotin kann unter folgender Annahme berechnet werden: [gebundenes Biotin] = [Gesamt-Biotin] – [freies Biotin]
Aus den erhaltenen Werten können die Dissoziationskonstanten gemäß der Beschreibung in Beispiel 2 berechnet werden. Als Kontrolle kann ein identischer Versuch mit Ölkörpern durchgeführt werden, die an Anti-Oleosin-Antikörper gebunden sind, die nicht mit Avidin konjugiert wurden. Wenn gewünscht, kann Biotin durch kompetitive Elution unter Verwendung eines Überschusses an 2-(4'-Hydroxybenzol)-benzoesäure (HABA) von der Ölkörper-Avidin-Matrix freigesetzt werden. Die Elution kann außerdem unterstützt werden durch Verwendung einer gentechnisch hergestellten Mutante von Avidin, die eine niedrigere Affinität für Biotin zeigt. Derartige Mutanten sind für das analoge Biotin-Bindeprotein aus Bakterien, Streptavidin, beschrieben worden (Chilkoti et al., 1995, Bio/Technol. 13: 1198–1204).
Beispiel 7
Abtrennung von Kohlenhydraten
Das folgende Beispiel beschreibt die Nützlichkeit von Ölkörpermatrizes für die Rückgewinnung von Kohlenhydraten aus komplexen biologischen Gemischen. In diesem Beispiel zeigen die Erfinder, dass eine Ölkörper-immobilisierte Cellulase befähigt ist, Cellulose zu binden.
Oleosin-Cellulose-Bindungsdomänen-Fusion
Mehrere der von dem Bakterium Cellulomonas fimi produzierten Cellulasen enthalten getrennte Cellulose-bindende Domänen (CBDs). Diese CBDs binden unabhängig an Cellulose, selbst wenn sie durch proteolytische Spaltung oder genetische Manipulation von der katalytischen Domäne des Enzyms getrennt werden. Das Plasmid pUC18-CBDPT enthält ein Fragment, das für die CBD der beta-1,4-Glucanase codiert (Gilkes et al., 1992, Journal of Biol. Chem. 267: 6743–6749) und verwendet werden kann, um eine Oleosin-CBD-Genfusion herzustellen. Ein DNA-Fragment, das für die CBD-Domäne codiert, kann unter Verwendung geeigneter Restriktionsenzyme oder unter Verwendung von PCR aus pUC18-CBDPT isoliert werden. Alternativ können die CBDs anderer Cellulasen von C. fimi oder Cellulasen aus anderen Quellen verwendet werden. Ein Oleosingen von B. napus, isoliert aus einer cDNA-Bibliothek (van Rooijen, 1993, Ph.D. Thesis, University of Calgary) wurde unter Verwendung von PCR in pGN kloniert und erbrachte das Plasmid pOLEGN, wie in Beispiel 4 beschrieben. Eine im Leseraster liegende Genfusion zwischen dem Oleosingen und dem CBD-Gen kann unter Verwendung molekularer Standardverfahren, die Fachleuten bekannt sind, erzeugt werden. Das endgültige Konstrukt wird die CBD-Domäne enthalten, die translational unmittelbar stromabwärts des Oleosins fusioniert ist.
Transformation und Regeneration
Um das Fusionsgenkonstrukt in Pflanzen einzuführen, wird man es in einen binären Vektor, wie etwa pCGN1559 subklonieren. Transgene Pflanzen, die die Oleosin-CBD-Fusion exprimieren, können dann, wie in Beispiel 1 beschrieben, erzeugt werden.
Ölkörperpräparation
Gewaschene Ölkörper können aus den Samen transgener und wildtypischer Kontrollpflanzen gemäß der Beschreibung in Beispiel 1 hergestellt werden.
Abtrennung von Cellulose aus einer Lösung unter Verwendung einer Ölkörper-Affinitätsmatrix
Um die Bindung von Cellulose an die Ölkörperaffinitätsmatrix zu bewerten, werden die Bindungskapazitäten von Ölkörpern aus wildtypischen und transgenen Pflanzen verglichen. Ölkörper können mit geeignet gepufferten Lösungen gemischt werden, die eine Reihe von Cellulosekonzentrationen enthalten. Die Ölkörpersuspension kann dann für eine geeignete Zeitspanne und bei einer geeigneten Temperatur inkubiert werden. Bei der Zentrifugation kann der Unterstand rückgewonnen und auf die Cellulosekonzentrationen hin getestet werden. Die Konzentrationen an gebundener und freier Cellulose können unter folgender Annahme berechnet werden: [gebundene Cellulose] = [Gesamt-Cellulose] – [freie Cellulose]
Das Verhältnis der Konzentration gebundener Cellulose gegenüber der Konzentration freier Cellulose kann als Funktion der Konzentration gebundener Cellulose aufgetragen werden. Aus diesen Auftragungen können Dissoziationskonstanten gemäß Standardverfahren berechnet werden (Scatchard, G. Ann. N.Y. Acad Sci. (1949) 57: 660–672), wie in Beispiel 2 detailliert dargestellt.
Beispiel 8
Abtrennung von Nukleinsäuren
Das folgende Beispiel beschreibt ein Verfahren, bei dem Ölkörper verwendet werden, um einzelsträngige (SS) Nukleinsäuren zu binden.
Isolierung einzelsträngiger Nukleinsäuren
Ein Verfahren zum Einfangen von SS-Nukleinsäuren kann in der Diagnostik verwendet werden, wie etwa bei viralen Pflanzenerkrankungen, oder bei Forschungsanwendungen, wo nicht erneut gepaarte SS-Nukleinsäuren selektiv aus Lösungen abgetrennt werden müssen, wie etwa bei Hybridisierungsreaktionen für differenzielles Screening auf exprimierte Gene. Oleosine können mit SS-DNA- oder RNA-bindenden Proteinen oder spezifischen Domänen hiervon fusioniert werden und verwendet werden, um SS-Nukleinsäuren für die Identifizierung oder weitere Amplifikation einzufangen. Gut charakterisierte SS-Nukleinsäure-Bindeproteine beinhalten: das agrobakterielle Ti-Plasmid Vir E2-Protein (Zupan et al., 1995, Plant Physiol. 107: 1041–das Tabak-Mosaikvirus (TMV) Bewegungsprotein P30 (Citovsky et al., 1990; Cell 60: 637–647; Waigmann et al., 1994, Proc. Natl. Acad. Sci USA 91: 1433–1437); das Cauliflower Mosaik-Virus Hüllprotein (Thompson et al., 1993; J. Gen. Virol 74: 1141–1148) und E. coli RecA und einzelstrangbindende Proteine (SSB-Proteine) (Radding, 1991, J. Biol. Chem. 266: 5355–5358).
Beispiel 9
Abtrennung rekombinanter Proteine
Das folgende Beispiel demonstriert weiterhin die Nützlichkeit einer Ölkörperaffinitätsmatrix für die Reinigung von rekombinanten Zielproteinen. Für den Zweck dieses Beispiels wurde das IgG/Protein A-Ligandenpaar ausgewählt. Das verwendete Konstrukt besteht aus einer Protein A-Domäne, die an das 18 kDa-Oleosin von Arabidopsis (van Rooijen et al., 1992, Plant Mol. Biol. 18: 1177–1179) fusioniert wurde. Ölkörper, die Oleosin-Protein A-Fusionsproteine enthalten, wurden isoliert und verwendet, um die spezifische Bindung von Kaninchen-anti-Maus-IgGs, die mit Meerrettichperoxidase (HRP) gekoppelt waren, zu demonstrieren. Die Konfiguration der Oleosin-Protein A-Fusion an dem Ölkörper und die Bindung von IgG an die Fusion sind in 15 dargestellt.
Die Oleosin-Protein A-Fusion
Eine synthetische Protein A-Sequenz, die für ein Protein codiert, das befähigt ist, an IgG zu binden, wurde auf Basis beschriebener Sequenzinformation (pRIT2T, Protein A-Genfusionsvektor, Pharmacia) synthetisiert und mittels PCR amplifiziert. Jeder bei der PCR verwendete Primer enthielt Restriktionsstellen 5' zu der Protein A-spezifischen Sequenz, um die Klonierung zu erleichtern. Der reverse Primer (d.h. der Primer in der Antisense-Richtung) enthielt außerdem ein translationales Stopcodon, das der codierenden Sequenz folgte. 13 zeigt die Position der PCR-Primer relativ zu der Protein A-Sequenz (Die Protein A-Sequenz und die Primer-Sequenzen sind ebenfalls separat in der SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO:10 bzw. SEQ ID NO: 11 dargestellt). Das resultierende Fragment wurde in ein pUC19-Plasmid ligiert, das das Arabidopsis-Oleosingen trägt, das zusammengesetzt ist aus einer 867 bp großen stromaufwärtigen Promotorregion, gefolgt von der codierenden Region (mit dem zugehörigen Intron), aus der das translationale Stopcodon entfernt worden war. Das 3'-Ende des Konstrukts enthält den Transkriptionsterminator der Nopalin-Synthase. Eine Spacer-Sequenz, die eine Erkennungssequenz für die Endoprotease Thrombin codiert, wurde unmittelbar stromabwärts der codierenden Sequenz von Oleosin eingebaut. Die Gensequenz von Protein A wurde zwischen dieser Spacer-Sequenz und der Terminatorsequenz eingeführt. Im endgültigen Expressionskonstrukt waren die codierenden Regionen von Oleosin und Protein A im selben Leseraster fusioniert. Das gesamte Konstrukt (14 und SEQ ID NO: 12) wurde dann aus dem pUC19-Plasmid ausgeschnitten und in den Pflanzen-Transformationsvektor pCGN1559 (McBride und Summerfelt, 1990, Plant Mol. Biol. 14: 269–276), der ein Neomycin-Phosphotransferasegen unter der Kontrolle des 35S-CaMV-Promotors trägt, subkloniert. Das resultierende Plasmid wurde in Agrobacterium (Stamm EHA101) eingeführt.
Transformation und Regeneration
Die Pflanzen wurden gemäß der Beschreibung in Beispiel 1 transformiert und regeneriert. Die transgenen Pflanzen wurden zunächst unter Verwendung eines Neomycin-Phosphotransferase-Assays identifiziert, gefolgt von einer Bestätigung der Expression der Protein A-Fusionen durch Immunoblot-Analyse.
Herstellung von Ölkörpern
Ölkörper aus den transgenen Linien von B. napus und B. carinata, die die Oleosin-Protein A-Fusion exprimieren, wurden unter Verfolgung der in Beispiel 1 beschriebenen Prozedur hergestellt.
Bindung von Oleosin-Protein A-Fusionen an IgG
Ölkörperprotein-Extrakte (20 μg/Aliquot) von verschiedenen transgenen B. napus-Linien, die Oleosin-Protein A-Fusionsproteine exprimieren, wurden der Polyacrylamid-Gelelektrophorese unterzogen, und nachfolgend unter Verwendung von Standardprozeduren auf eine PVDF-Membran übertragen. Die Membran wurde dann mit einem HRP-konjugierten Maus-anti-Kaninchen-Antikörper sondenmarkiert, und die Sichtbarmachung erfolgte gemäß dem Verfahren, wie es in „Antibodies – a laboratory manual" (Harlow und Lane, 1988, Cold Spring Harbor) dargestellt ist. In 16 ist die angefärbte PVDF-Membran dargestellt. Ein 50 kDa-Protein (vorhergesagte molekulare Masse des Oleosin-Protein A-Fusionsproteins: 48.801 Da) wurde spezifisch in den Proteinextrakten aller sechs getesteten transgenen B. napus-Linien detektiert. Untransformierte Kontrollpflanzen zeigten keine HRP-Aktivität, während ein 30 kDa-Protein (vorhergesagte molekulare Masse: 29.652 Da) in einem Lysat von Bakterien vorlag, die mit pRIT2T, codierend Protein A, transformiert worden waren, während dieses im „untransformierten Lysat" nicht detektierbar war.
Bindung und Elution von IgGs bei Ölkörpern, die Oleosin-Protein A-Fusionsproteine enthalten
Gewaschene Ölkörper (10 mg/ml Protein) wurden aus wildtypischem B. napus und einer transgenen B. napus-Linie hergestellt, die mit einem Konstrukt transformiert worden war, das ein Oleosin-Protein A-Fusionsprotein exprimiert, wie in Beispiel 1 beschrieben, und in 10 mM Tris-Cl pH 8,0 suspendiert. Ein Volumen von 2 μl (± 34 μg) an HRP-konjugierten Kaninchen-anti-Maus-Antikörpern (Sigma, Katalognummer A9044) wurden zu 500 μl der gewaschenen Ölkörperpräparation hinzugegeben, und die Suspension wurde für 1 h bei Raumtemperatur oder über Nacht bei 4°C inkubiert. Die Proben wurden dann für 15 min bei 16.000 × g zentrifugiert, und der Unterstand wurde entfernt. Nachfolgend wurden die Ölkörper sorgfältig unter Verwendung eines Stößels in 500 μl 10 mM Tris-Cl pH 8,0 resuspendiert. Dieser Waschschritt in Tris-Cl wurde 4mal wiederholt (hier im Folgenden als gewaschene Ölkörperpräparation bezeichnet). Ein 5 μl-Aliquot der gewaschenen Ölkörperpräparation wurde ein fünftes Mal gewaschen und dann auf HRP-Aktivität hin getestet.
Die HRP-Assays erfolgten durch Zugeben von 1 μl der gewaschenen Ölkörperpräparation zu 1 ml des HRP-Testgemischs (9,8 ml an 0,1 M NaOAc, 0,2 ml an 2,5 mg/ml Trimethylbenzidin in DMSO, 4 μl H₂O₂) und Inkubieren des Gemischs für 5 min bei Raumtemperatur. Die Reaktion wurde dann durch Zugeben von 0,5 ml 1 M H₂SO₄ abgestoppt. Die Proben wurden durch einen 0,22 μm-Filter filtriert, und nachfolgend wurden die OD₄₅₀-Werte spektrophotometrisch bestimmt.
Um die IgGs von den Ölkörpern zu eluieren, wurde die gewaschene Ölkörperpräparation in 100 mM Glycin pH 3,0 resuspendiert, für 15 min bei 16.000 × g zentrifugiert und für 30' bei Raumtemperatur inkubiert. Nach der Neutralisation in 500 μl an 100 mM Tris-Cl pH 8,0, wurden sowohl die Ölkörperfraktion als auch das Eluat wie oben auf HRP-Aktivität hin getestet. Die Bindung und die Elution von IgGs an Ölkörpern aus wildtypischem B. napus und transgenem B. napus, der eine Oleosin-Protein A-Fusion exprimiert, sind in 17 dargestellt.
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Verfahren zum Trennen eines Zielmoleküls von einer Probe, welches folgendes umfaßt: 1) Inkontaktbringen von (i) Ölkörpern mit (ii) einer Probe, welche das Zielmolekül enthält, damit sich das Zielmolekül mit den Ölkörpern assoziieren kann, wobei das Zielmolekül und die Ölkörper mittels eines Ligandenmoleküls assoziiert werden, 2) Trennen der mit dem Zielmolekül assoziierten Ölkörper von der Probe und 3) Trennen des Zielmoleküls von den Ölkörpern.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Ligandenmolekül kovalent an die Ölkörper gebunden wird.
Verfahren nach Anspruch 2, wobei das Ligandenmolekül kovalent an das Ölkörperprotein in den Ölkörpern gebunden wird.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei der Ligand aus zwei Molekülen besteht, und zwar einem ersten Molekül, welches sich mit den Ölkörpern assoziiert, und einem zweiten Molekül, welches sich mit dem Ziel assoziiert, wobei das erste Molekül und das zweite Molekül sich miteinander assoziieren.
Verfahren nach Anspruch 4, wobei das erste und das zweite Ligandenmolekül miteinander konjugiert sind.
Verfahren nach Anspruch 3, wobei das Ligandenmolekül ein Protein ist.
Verfahren nach Anspruch 6, wobei der Proteinligand ein Fusionsprotein mit dem Ölkörperprotein ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei das Zielmolekül aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus Proteinen, Peptiden, organischen Molekülen, Lipiden, Kohlenhydraten, Nukleinsäuren, Zellen, Zellorganellen, Zellbestandteilen, Viren, Metallen, Metallionen und Ionen.
Verfahren nach Anspruch 7, wobei das Ligandenmolekül Hirudin und das Zielmolekül Thrombin ist.
Verfahren nach Anspruch 7, wobei das Ligandenmolekül Protein A und das Zielmolekül ein Immunglobulin ist.
Verfahren nach Anspruch 7, wobei das Ligandenmolekül ein Metallothionein und das Zielmolekül Cadmium ist.
Verfahren nach Anspruch 7, wobei das Ligandenmolekül ein Zellulose bindendes Protein und das Zielmolekül Zellulose ist.
Verfahren nach Anspruch 7, wobei das Ligandenmolekül ein Nukleinsäure bindendes Protein und das Zielmolekül eine Nukleinsäure ist.
Verfahren nach Anspruch 13, wobei der Ligand ein einzelstrangige DNA bindendes Protein oder ein RNA bindendes Protein und das Zielmolekül ein einzelstrangiges Nukleinsäuremolekül ist.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei der Ligand ein Antikörper ist, der an den Ölkörper oder an ein Ölkörperprotein bindet.
Verfahren nach Anspruch 15, wobei das Ziel eine Zelle, eine Zellorganelle oder ein Zellbestandteil ist, die bzw. der in der Lage ist, den Ligandenantikörper zu binden.
Verfahren nach Anspruch 16, wobei die Zelle Staphylococcus aureus ist.
Verfahren nach Anspruch 15, wobei der Ligand ein bivalenter Antikörper ist, der sowohl den Ölkörper als auch das Ziel bindet.
Verfahren nach Anspruch 5, wobei der Ligand ein mit Avidin konjugierter Antikörper und das Zielmolekül Biotin ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 3, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, wobei das Ölkörperprotein ein Oleosin ist.
Verfahren nach Anspruch 20, wobei das Oleosin von einer Pflanze abgeleitet ist, die aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus Rapssamen (Brassica spp.), Sojabohne (Glycine max), Sonnenblume (Helianthus annuus), Ölpalme (Elaeis guineeis), Kokosnuß (Cocos nucifera), Rizinus (Ricinus communis), Färberdistel (Carthamus tinctorius), Senf (Brassica spp. und Sinapis alba), Koriander (Coriandrum sativum), Leinsamen/Flachs (Linum usitatissimum), Ackerschmalwand (Arabidopsis thaliana) und Mais (Zea mays).
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 21, wobei in Stufe 1) die Ölkörper und die Probe gemischt und anschließend für etwa 1 Minute bis etwa 24 Stunden inkubiert werden.
Verfahren nach Anspruch 22, wobei das Gemisch aus Ölkörpern und Probe bei einer Temperatur im Bereich von etwa 4°C bis etwa Raumtemperatur inkubiert wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 23, wobei die mit dem Zielmolekül assoziierten Ölkörper in Stufe 2) mittels Zentrifugation, Flotation oder Größenausschluß von der Probe getrennt werden.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 24, wobei das Zielmolekül mittels Elution unter geeigneten Bedingungen abgetrennt wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 25, wobei die Ölkörper aus der Gruppe von Pflanzen erhalten werden, bestehend aus Rapssamen (Brassica spp.), Sojabohne (Glycine max), Sonnenblume (Helianthus annuus), Ölpalme (Elaeis guineeis), Kokosnuß (Cocus nucifera), Rizinus (Ricinus communis), Färberdistel (Carthamus tinctorius), Senf (Brassica spp. und Sinapis alba), Koriander (Coriandrum sativum), Leinsamen/Flachs (Linum usitatissimum), Ackerschmalwand (Arabidopsis thaliana) und Mais (Zea mays).
Verwendung von Ölkörpern, die mit einem Ligandenmolekül assoziiert sind, als Affinitätsmatrizen für das Trennen eines Zielmoleküls von einer Probe, wobei das Ligandenmolekül in der Lage ist, sich mit dem Zielmolekül zu assoziieren.