DE69737949T2 - Isolierung, Vermehrung und gezielte Differenzierung von Säugetierstammzellen des Zentralnervensystems - Google Patents

Isolierung, Vermehrung und gezielte Differenzierung von Säugetierstammzellen des Zentralnervensystems Download PDF

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Description

  • HINTERGRUND DER ERFINDUNG
  • 1. GEBIET DER ERFINDUNG
  • Die vorliegende Erfindung betrifft eine Technologie, mittels welcher Stammzellen aus embryonalem und adultem Gehirn effizient in Kultur isoliert und einer Propagierung und Differenzierung unterzogen werden, um eine große Anzahl von Nervenzellen zu erzeugen. Diese Technologie ermöglicht erstmals die Erzeugung einer großen Anzahl vieler unterschiedlicher Arten von Neuronen, welche in normalem Gehirn vorkommen, und stellt eine neue Grundlage für Gentherapie, Zelltherapie, für das Durchmustern auf neue Wachstumsfaktoren, sowie für das Durchmustern auf Arzneimittel gegen Störungen des Nervensystems bereit.
  • 2. BESCHREIBUNG DES VERWANDTEN STANDES DER TECHNIK
  • Das Gehirn besteht aus höchst unterschiedlichen Arten von Nervenzellen, welche spezifische Verbindungen ausbilden, wobei sich die Nervenzellen (Neuronen), sobald sie einmal zerstört sind, nicht regenerieren. Darüber hinaus ist das Gehirn durch eine Blut-Hirn-Schranke, welche den Zufluss großer Moleküle in das Gehirn effizient blockiert, geschützt, was eine periphere Injektion potentieller, Wachstumsfaktoren enthaltender Arzneimittel ineffektiv macht. Eine Hauptherausforderung, welcher sich die Biotechnologieindustrie derzeit gegenüber sieht, ist es folglich, einen effizienten Mechanismus für eine direkte Zuführung potentieller Gentherapieprodukte in das Gehirn zu finden, um Störungen des Nervensystems zu behandeln.
  • Darüber hinaus könnte in degenenerativen Erkrankungen wie beispielsweise Parkinson der umfassendste Ansatz zur Wiedererlangung einer verloren gegangenen Neuralfunktion eher ein Ersatz der geschädigten Zellen durch gesunde Zellen sein als lediglich ein einzelnes Genprodukt. Folglich hängt der derzeitige und zukünftige Erfolg der Gentherapie und Zelltherapie von der Entwicklung geeigneter Zellen ab, welche (1) eine gesunde Kopie eines Krankheitsgens tragen können (d. h. ein normales Gen), (2) in das Gehirn transplantiert werden können, und (3) in das neurale Netzwerk des Wirts integriert werden können. Diese Entwicklung erfordert idealerweise Zellen neuronalen Ursprungs, welche (1) in Kultur zu einer großen Anzahl proliferieren, (2) verschiedenen Verfahren des Gentransfers zugänglich sind, und sich (3) integrieren und sich wie die Zellen eines normalen Gehirns verhalten. Allerdings standen für therapeutische Zwecke bislang keine derartigen Zellen zur Verfügung, da sich Neuronen nicht teilen und aus diesem Grund in Kultur keiner Propagierung unterzogen werden können.
  • Als Alternative wurden verschiedene transformierte Zellen neuralen und nicht-neuralen Ursprungs, wie beispielsweise Gliazellen, Fibroblasten und selbst Muskelzellen, welche in Kultur proliferieren können, als mögliche Vehikel für die Zuführung eines Gens von Interesse in Gehirnzellen verwendet. Allerdings stellen derartige Zellen keine neuronalen Funktionen bereit, wobei dies von derartigen Zellen auch nicht erwartet werden kann. Ein weiterer alternativer Ansatz war es, eine neurale Zelle unbekannten Ursprungs in Kultur durch genetisches Modifizieren eines Teils ihrer Eigenschaften zur Teilung zu bringen, während sie einen Teil ihrer Fähigkeit, sich zu einem Neuron zu entwickeln und als solches zu fungieren, noch beibehält. Obwohl einige „immortalisierte" Zellen bestimmte Merkmale eines Neurons zeigen können, ist unklar, ob diese veränderten Zellen tatsächlich eine brauchbare Alternative für klinische Zwecke darstellen.
  • Ein sich entwickelndes fötales Gehirn enthält alle Zellen, welche Keime der Zellen eines adulten Gehirns darstellen, sowie alle erforderlichen Programme, um diese in Richtung des endgültigen Neuronennetzwerks zu manipulieren. In frühen Entwicklungsstufen ist das Nervensystem mit Keimzellen besiedelt, aus welchen sich alle anderen Zellen, hauptsächlich Neuronen, Astrozyten und Oligodendrozyten, im Zuge nachfolgender Entwicklungsstufen ableiten. Es ist offensichtlich, dass derartige Keimzellen, welche Vorläuferzellen der normalen Gehirnentwicklung darstellen, für alle genbasierten und zellbasierten Therapien ideal wären, wenn diese Keimzellen isoliert, einer Propagierung und einer Differenzierung zu reifen Zelltypen unterzogen werden könnten.
  • Die Zweckmäßigkeit der isolierten Primärzellen sowohl für Grundlagenforschung als auch für therapeutische Anwendungen hängt vom Ausmaß ab, in welchem die isolierten Zellen jenen des Gehirns ähneln. Wie viele unterschiedliche Arten von Vorläuferzellen im sich entwickelnden Gehirn vorkommen, ist allerdings unbekannt. Allerdings können mehrere verschiedene Zelltypen existieren:
    ein Vorläufer ausschließlich für Neuronen („vorbestimmte neuronale Vorläuferzelle" oder „Neuroblast"),
    ein Vorläufer ausschließlich für Oligodendrozyten („Oligodendroblast"),
    ein Vorläufer ausschließlich für Astrozyten („Astroblast"),
    ein bipotenter Vorläufer, welcher sich entweder zu einem Neuron oder einem Oligodendrozyten, zu einem Neuron oder einem Astrozyten, oder zu einem Oligodendrozyten oder einem Astrozyten entwickeln kann, und
    ein multipotenter Vorläufer, welcher die Fähigkeit zur Differenzierung zu einem beliebigen der drei Zelltypen beibehält.
  • Eine Fate-Mapping-Analyse und in vivo-Transplantationsstudien haben gezeigt, dass unterschiedliche neuronale Zelltypen und unterschiedliche nicht-neuronale Zellen aus den gleichen Vorläuferzellen erhalten werden können1-5. In vitro-Analysen lassen ferner darauf schließen, dass multipotente Zellen im sich entwickelnden Gehirn vorkommen6,7. Eine Linienanalyse allein identifiziert die multipotenten Zellen allerdings nicht direkt. Sie definiert auch den Mechanismus nicht, welcher die Zellen ihrem unterschiedlichen Schicksal zuführt. Vorläuferzellen aus dem zentralen Nervensystem (ZNS) wurden in vitro expandiert, wobei eine Differenzierung zu Neuronen und Gliazellen beobachtet wurde8-12 und, wie nachstehend ausführlich beschrieben ist, merklich unterschiedliche Zelltypen erhalten wurden, selbst wenn die verwendeten Kulturbedingungen anscheinend die gleichen waren.
  • Aufgrund des derzeit mangelhaften Verständnisses in Bezug auf die Histogenese während der Entwicklung des Gehirns haben zahlreiche Forscher äußerst freizügig verschiedene Begriffe verwendet, um die Zellen zu beschreiben, welche von ihnen untersucht worden waren, z. B. neuronale Vorläuferzelle, neurale Vorläuferzelle, neuroepitheliale Vorläuferzelle, multipotente Stammzelle, etc. Folglich können die Natur der bislang in der Literatur beschriebenen Zellen sowie die Kulturbedingungen zu deren Erhalt lediglich anhand ihrer beschriebenen Differenzierungsfähigkeit miteinander verglichen werden. Der vollständige Gegenstand der Isolierung, Charakterisierung und Verwendung von Stammzellen aus dem ZNS wurde vor kurzem in Übersichtsartikeln dargelegt33,34,38.
  • Zusammenfassend betrachtet wurden bis zum heutigen Tag trotz zahlreicher Berichte keine Bedingungen gefunden, multipotente Stammzellen erfolgreich zu identifizieren und einer Propagierung und Differenzierung zu unterziehen. Eine nützliche Zusammenstellung von Studien, welche über eine Kultivierung von ZNS-Vorläuferzellen berichten, findet sich in Tabelle 3, S. 172, eines vor kurzem erschienen Übersichtsartikels34 und nachstehend in ausführlicherer Form.
  • Vicario-Abejon, C., Johe, K., Hazel, T., Collazo, D. & McKay, R., Functions of basic fibroblast growth factor and neurotrophins in the differentiation of hippocampal neurons, Neuron 15, 105-114 (1995)12.
  • Die von Vicario-Abejon et al. expandierten Zellen unterscheiden sich signifikant von jenen, welche im Rahmen der vorliegenden Erfindung beschrieben sind, obwohl das Ausgangsgewebe (embryonaler Hippocampus), das Mitogen (basischer Fibroblastenwachstumsfaktor, bFGF) und das Basalmedium (N2) in beiden Berichten ähnlich sind. Nahezu alle der von Vicario-Abejon et al. expandierten Zellen differenzierten nicht zu irgendwelchen Zelltypen, sondern starben in Abwesenheit von bFGF (wie auf S. 106 des Dokuments angegeben). Dies spiegelt sich auch in 3 des Dokuments wider, in welcher die Anzahl an MAP2-positiven Neuronen außerordentlich gering ist (50-100 Zellen ausgehend von einer ursprünglichen Zellanzahl von etwa 80 000 pro Vertiefung, d. h. deutlich weniger als 1% bei allen angegebenen Bedingungen). Folglich können Unterschiede in den Kulturbedingungen, so geringfügig sie auch sein mögen, zu Zellen mit signifikant unterschiedlichen Eigenschaften führen, wobei dies in der Tat mit der Hauptbeobachtung der vorliegenden Erfindung im Einklang steht, wonach die extrazelluläre Umgebung zu einer Veränderung der Entwicklungseigenschaften der ZNS-Stammzellen führen kann.
  • Vicario-Abejon et al. verwendeten die nachfolgenden Kulturbedingungen, welche sich von jenen unterscheiden, welche im Rahmen der vorliegenden Erfindung beschrieben sind:
    • 1. Sie verwendeten enzymatische Dissoziation, 0.1-0.25% Trypsin + 0.4% DNAse I für die ursprüngliche Dissoziation des Gewebes sowie für nachfolgendes Passagieren. Im Rahmen der vorliegenden Erfindung bewirkt die enzymatische Dissoziation eine effektive Proteolyse von FGF-Rezeptoren, bewirkt, dass Zellen auf bFGF nicht weiter ansprechen, und führt zur Differenzierung.
    • 2. Sie verwendeten 10% fötales Rinderserum, um die Trypsinaktivität zu unterbinden und um die Zellen zwischen 4 Stunden bis über Nacht hinweg vor Umstellen auf serumfreies Medium zu aktivieren. Im Rahmen der vorliegenden Erfindung bewirkt Serum selbst bei einer Konzentration von weniger als 1% eine Veränderung der Stammzellen in Richtung eines astrozytischen Schicksals.
    • 3. Die Zellen wurden in einer sehr viel höheren Dichte von 45000 Zellen pro cm2 ausgesät und anschließend bis zur Konfluenz aufgezogen, bevor sie mittels Trypsin und Serum passagiert wurden. Im Rahmen der vorliegenden Erfindung hemmt eine hohe Zelldichte die Proliferation und bewirkt selbst in Gegenwart von bFGF eine spontane Differenzierung.
    • 4. bFGF wurde lediglich intermittierend alle 2-3 Tage und mit 5 ng/ml verabreicht, was weniger ist als die im Rahmen der vorliegenden Erfindung offenbarte optimale Konzentration. Diese Bedingung führt zur partiellen Differenzierung von Zellen und zu einer anschließenden Heterogenizität der Zelltypen in Kultur.
    • 5. Aus „N2"-Komponenten bestehendes Basalmedium bestand aus 5 ng/ml Insulin, was weniger ist als die im Rahmen der vorliegenden Erfindung offenbarte optimale Konzentration.
  • Ray, J., Peterson, D., Schinstine, M. & Gage, F., Proliferation, differentiation, and long-term culture of primary hippocampal neurons, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 3602-3606 (1993)10.
  • Diese Studie verwendete Kulturbedingungen, welche jenen sehr ähnlich sind, die von Vicario-Abejon et al. beschrieben wurden, mit bFGF als primärem Mitogen, serumfreiem Medium und Hippocampus des Stadiums E16. Allerdings wird eine Isolierung und Expansion einer Vorläuferpopulation (Neuroblasten) beschrieben, welche sich von den Zellen von Vicario-Abejon et al. (undefiniert) sowie von den im Rahmen der vorliegenden Erfindung beschriebenen multipotenten Stammzellen deutlich unterscheidet. Die beschriebenen Zellen wiesen die nachfolgenden Eigenschaften auf, welche sich merklich von jenen der ZNS-Stammzellen unterscheiden:
    • 1. Bei den expandierten Zellen unter den beschriebenen Bedingungen handelt es sich um mitotische Neuronen, welche eine antigene Expression von Neurofilament, Nestin, Neuron-spezifischer Enolase, Galaktocerebrosid und MAP2 zeigen (Tabelle I, S. 3604). Die im Rahmen der vorliegenden Erfindung beschriebenen expandierenden ZNS-Stammzellen exprimieren lediglich Nestin, sind in Bezug auf die vorstehend genannten Antigene negativ, und stellen daher eine Zellpopulation dar, welche sich von der von Ray et al. beschriebenen Zellpopulation auf molekularer Ebene unterscheidet.
    • 2. Eine Ultrastrukturanalyse der expandierten Zellen in Kultur „belegte ihre histotypische neuronale Morphologie". Die expandierenden ZNS-Stammzellen weisen eine vollständig unterschiedliche, nicht-neuronale Morphologie auf.
    • 3. Die mitotischen „Neuronen" wiesen eine Verdopplungszeit von 4 Tagen auf und konnten als kontinuierliche Zelllinien passagiert und aufgezogen werden. Die ZNS-Stammzellen verdoppeln sich alle 20-24 Stunden und weisen im Zeitablauf eine charakteristische Regression in Bezug auf Mitose- und Differenzierungsfähigkeit auf, so dass sie nicht auf unbestimmte Zeit als stabile Zelllinien aufrechterhalten werden können.
    • 4. Das Kultursystem gemäß Ray et al. erzeugt „fast reine neuronale Zellkulturen". Das Kultursystem der vorliegenden Erfindung erzeugt multipotente Stammzellen, welche zu allen drei bedeutenden Zelltypen des Gehirns differenzieren können, d. h. zu Neuronen, Oligodendrozyten und Astrozyten.
  • Ray et al. verwendeten die nachfolgenden Kulturbedingungen, welche sich von jenen der vorliegenden Erfindung unterscheiden.
    • 1. Embryonale Hippocampi wurden mechanisch ohne Verwendung eines Enzyms trituriert. Allerdings wurden die Zellen mit etwa 100 000 Zellen pro cm2 ausplattiert, was für das Überleben von Neuronen optimal war, jedoch eine nahezu 10-mal höhere Zelldichte darstellte, als für die Expansion von ZNS-Stammzellen optimal ist.
    • 2. bFGF wurde intermittierend alle 3-4 Tage mit 20 ng/ml verabreicht.
    • 3. Das „N2"-Basalmedium enthielt 5 μg/ml Insulin, was weniger war als optimal. Ein Austausch des Mediums wurde ebenfalls alle 3-4 Tage durchgeführt.
    • 4. Die Zellen wurden unter Verwendung von Trypsin passagiert.
  • Zusammenfassend betrachtet können selbst scheinbar kleine Unterschiede in den Kulturbedingungen zur Isolierung erheblich unterschiedlicher Zelltypen führen.
  • Ray, J. und Gage, F. H., Spinal cord neuroblasts proliferate in response to basic fibroblast growth factor, J. Neurosci. 14, 3548-3564 (1994)39.
  • Ray und Gage berichten über die Isolierung und Propagierung von Zellen, „welche bereits einen neuronalen Signalweg eingeschlagen haben und neuronale Phänotypen (Neuroblasten) exprimieren", aus der Wirbelsäule unter Verwendung von bFGF. Wiederum unterscheiden sich, obwohl das primäre Mitogen bFGF ist, ihre Kulturbedingungen, und die erhaltenen Zellen unterscheiden sich merklich von ZNS-Stammzellen.
    • 1. Es wurde Wirbelsäule des Stadiums E14-E16 verwendet, was eine sehr viel spätere Entwicklungsstufe darstellt, als sie für Stammzellen optimal ist.
    • 2. Das Gewebe wurde enzymatisch mittels Papain und DNase dissoziiert.
    • 3. Das ursprüngliche Ausplattieren wurde in 10% fötalem Rinderserum durchgeführt.
    • 4. Es wurde eine vorhergehende Anreicherung für eine nicht-anhaftende Zellpopulation durchgeführt.
    • 5. Es wurde intermittierend alle 3-4 Tage ein Austausch des Mediums und eine Ergänzung des bFGF vorgenommen.
  • Gage, F. H., Coates, P. W., Palmer, T. D., Kuhn, H. G., Fisher, L. J., Suhonen, J. O., Peterson, D. A., Suhr, S. T. & Ray, J., Survival and differentiation of adult neuronal progenitor cells transplanted to the adult brain, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92, 11879-11883 (1995)35.
  • Gage et al. berichten über die Isolierung, Propagierung und Transplantation von Zellen aus adultem Hippocampus. Diese Zellgemische wurden über mehrere Passagen hinweg für ein Jahr in Kultur aufrechterhalten. 80% hiervon weisen ziemlich ungewöhnliche Eigenschaften auf, indem sie beispielsweise gliale und neuronale Antigene co-exprimieren, während sie in mitotischem Zustand verbleiben. Stammzellen, welche aus der striatalen subventrikulären Zone eines Erwachsenen isoliert werden, weisen diese Eigenschaften nicht auf.
  • Wiederum erhielten die Autoren bei Verwendung von bFGF als primäres Mitogen merklich andere Zellen als jene ZNS-Stammzellen, welche im Rahmen der vorliegenden Erfindung beschrieben sind.
  • Gritti, A. et al., Multipotential stem cells from the adult mouse brain proliferate and self-renew in response to basic fibroblast growth factor, J. Neurosci. 16, 1091-1100 (1996)40.
  • Diese Autoren berichten über die Isolierung und Propagierung multipotenter Stammzellen aus der subventrikulären Zone von adultem Gehirn unter Verwendung von bFGF. Ein signifikanter Unterschied in den von Gritti et al. verwendeten Kulturbedingungen ist, dass die Zellen als aggregierte sphärische Gebilde ohne Anhaftung an die Plattenoberfläche einer Propagierung unterzogen werden. Die Kulturbedingungen gemäß Gritti et al. erfordern diese unter Verwendung von entweder bFGF oder epidermalem Wachstumsfaktor (EGF) durchgeführte Aggregation von Zellen zu sphärischen Gebilden als wesentlichen Schritt zur Propagierung multipotenter Zellen. Allein dieser Aggregationsschritt unterscheidet das beschriebene Kultursystem wesentlich von jenem der vorliegenden Erfindung. Die Aggregation fördert undefinierte Zell-Zell-Wechselwirkungen und führt zu einer unkontrollierbaren Differenzierung bzw. zu unkontrollierbaren Veränderungen des Zellschicksals, und alles in allem betrachtet zu einer sehr viel geringeren Expansion und Differenzierung. Darüber hinaus ist dieses Kultursystem und das von Gritti et al. erhaltene Ergebnis auf adultes Gehirn beschränkt, aus welchem eine extrem geringe Anzahl an Zellen erhalten wurde (105 Zellen pro Gehirn), und wurde auch nicht auf verschiedene Regionen des embryonalen Gehirns ausgedehnt.
  • Das Verfahren der vorliegenden Erfindung gestattet eine Propagierung von Stammzellen in allen Teilen des sich entwickelnden ZNS sowie im Striatum des adulten Gehirns. Es verwendet ferner adhärente Kulturen und vermeidet aktiv einen Zell-Zell-Kontakt und eine hohe Zelldichte. Im Ergebnis gestattet es eine sehr viel effizientere Expansion der Zellen in einem undifferenzierten multipotenten Zustand und eine sehr viel präzisere und effizientere Kontrolle der Differenzierung expandierter Zellen.
  • Reynolds, B. & Weiss, S., Generation of neurons and astrocvtes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system, Science 255, 1707-1710 (1992)15.
  • Reynolds, B., Tetzlaff, W. & Weiss, S., A multipotent EGF-responsive striatal embryonic progenitor cell produces neurons and astrocytes, J. Neurosci. 12, 4565-4574 (1992)9.
  • Vescovi, A. L., Reynolds, B. A., Fraser, D. D., und Weiss, S., bFGF regulates the proliferative fate of unipotent (neuronal) and bipotent (neuronal/astroglial) EGF-generated CNS progenitor cells, Neuron 11, 951-966 (1993)41.
  • Diese drei Studien beschreiben die ursprünglichen Sphärenkulturen neuronaler Vorläuferzellen aus adultem und embryonalem Gehirn unter Verwendung von EGF (epidermaler Wachstumsfaktor). Die expandierten Zellen differenzieren zu Neuronen und Astrozyten, jedoch nicht zu Oligodendrozyten, weshalb angenommen wird, dass sie eher eine bipotente Population darstellen als eine multipotente Population. Eine weitere charakteristische Eigenschaft der Zellen ist, dass sie lediglich auf EGF und insbesondere nicht auf bFGF ansprechen, während ZNS-Stammzellen sowohl auf EGF als auch auf bFGF in ähnlicher Weise ansprechen. Wiederum sind die für die sphärischen Gebilde verwendeten Kulturbedingungen nicht mit jenen vergleichbar, welche im Rahmen der vorliegenden Erfindung eingesetzt werden, da sie eine Zellaggregation erfordern, für welche angenommen wird, dass viele zusätzliche undefinierte Wechselwirkungen auftreten.
  • Ahmed, S., Revnolds, B. A., und Weiss, S., BDNF enhances the differentiation but not the survival of CNS stem cell-derived neuronal precursors, J. Neurosci. 15, 5765-5778 (1995)42.
  • Dieses Dokument berichtet über die Wirkung von aus Gehirn stammendem Wachstumsfaktor (BDNF) auf Sphärenkulturen embryonaler neuraler Vorläuferzellen, welche unter Verwendung von EGF einer Propagierung unterzogen wurden. Es wird keine weitere Verbesserung des Kultursystems per se beschrieben.
  • Svendsen, C. N., Fawcett, J. W., Bentlage, C. & Dunnett, S. B., Increased survival of rat EGF-generated CNS precursor cells using B27 supplemented medium, Exp. Brain Res. 102, 407-414 (1995)36.
  • Diese Studie nutzt die vorstehend beschriebene Sphärenkultur mit EGF, um ein kommerziell erhältliches, als „B27" bezeichnetes Medienergänzungsmittel zu untersuchen. Die Studie berichtet lediglich, dass die Verwendung von B27 das Überleben von Zellen (nicht das Überleben von Neuronen) in einer Mischkultur, welche Neuronen, Astrozyten und Oligodendrozyten enthält, verbessert.
  • Kilpatrick, T. J. und Bartlett, P. F., Cloning and growth of multipotential neural precursors: requirements for proliferation and differentiation, Neuron 10, 255-265 (1993)43.
  • Die Autoren berichten über das Vorkommen multipotenter Vorläuferzellen im Telencephalon des Stadiums E10 von Mäusen durch Kultivieren einzelner Zellen aus dem Gehirn in bFGF plus Serum. Die Ergebnisse basierten auf 700 Zellen, welche klonal für 10 Tage expandiert wurden, wobei einige hiervon, wenn sie in Gegenwart von bFGF, Serum und Astrozyten-konditioniertem Medium einer Differenzierung unterzogen wurden, Neuronen bilden können. Es wurde keine Expansion bezüglich der Masse der Zellen beobachtet.
  • Kilpatrick, T. J. und Bartlett, P. F., Cloned multipotential precursors from the mouse cerebrum require FGF-2, whereas glial restricted precursors are stimulated with either FGF-2 or EGF, J. Neurosci. 15, 3653-3661 (1995)44.
  • Die Autoren nutzten das in der vorstehend beschriebenen Literaturstelle43 angegebene klonale Kultursystem, um die mitogene Wirksamkeit von bFGF und EGF auf cortikale Zellen aus Embryonen des Stadiums E10 und E17 zu untersuchen. Wiederum sind die Kulturbedingungen strikt auf eine Mikrokultur in Serum-enthaltendem Medium ausgelegt, um die Existenz unterschiedlicher Vorläuferzellen im sich entwickelnden Gehirn zu belegen. Über eine Expansion bezüglich der Masse, eine Langzeitkultur oder ein systematisches Differenzierungsprotokoll wird nicht berichtet.
  • Baetge, E. E., Neural stem cells for CNS transplantation, Ann. N. Y. Acad. Sci. 695, 285 (1993)45.
  • Dieses stellt ein kurzes Übersichtsdokument dar, welches verschiedene Studien zusammenfasst, die auf eine Isolierung von Vorläuferzellen und ihren Derivaten in Kultur gerichtet sind. Es ist in gewisser Weise veraltet, wobei die meisten der als relevant erachteten zitierten Originalstudien vorstehend erläutert wurden.
  • Bartlett, P. F. et al., Regulation of neural precursor differentiation in the embryonic and adult forebrain, Clin. Exp. Pharm. Physiol. 22, 559-562 (1995)46.
  • Dieses stellt ebenfalls ein kurzes Übersichtsdokument dar, welches hauptsächlich frühere Arbeiten aus dem Laboratorium der Autoren in Bezug auf ihre Studien an Mikrokulturen zusammenfasst, wobei die Differenzierungspotentiale bestimmter Klone von Vorläuferzellen in Gegenwart von saurem FGF (aFGF), bFGF, Serum und/oder Astrozyten-konditioniertem Medium untersucht werden.
  • Darüber hinaus berichteten Sabate et al.32 über die Kultivierung eines humanen neuralen Vorläufers mit undefinierter Differenzierungsfähigkeit. Davis und Temple6 belegten die Existenz multipotenter Stammzellen im Cortex, indem sie diese für kurze Zeit mit Epithelzellen co-kultivierten (alles in allem weniger als 100 Zellen).
  • Die Zelldifferenzierung konnte allerdings in keiner der angegebenen Studien gesteuert werden, was eine Analyse ihrer linienbedingten Beziehungen sowie der Mechanismen, welche das Zellschicksal regulieren, ausschloss.
  • Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zur effizienten Propagierung der undifferenzierten Keimzellen, d. h. Stammzellen des zentralen Nervensystems (ZNS), in Kultur bereit und definiert Bedingungen, um die undifferenzierten Zellen effektiv in reife Zelltypen zu überführen. Diese undifferenzierten Zellen oder „ZNS-Stammzellen" zeigen die multipotente Fähigkeit, zu allen drei bedeutenden Zelltypen eines reifen Gehirns – Neuronen, Astrozyten und Oligodendrozyten – zu differenzieren. Darüber hinaus ermöglichen die gleichen Kulturbedingungen eine Isolierung, Expansion und Differenzierung äquivalenter multipotenter Zellen aus dem adulten Gehirn.
  • Seit dem Zeitpunkt der ursprünglichen Offenbarung sind zusätzliche Berichte erschienen. Die neuesten Forschungen in Bezug auf ZNS-Stammzellen und neurale Vorläuferzellen sowie deren Verwendung waren Gegenstand weiterer Übersichtsartikel47-52. Darüber hinaus berichteten Reynolds und Weiss53, dass embryonale striatale Vorläuferzellen, welche unter Verwendung von EGF als sphärische Gebilde erzeugt wurden, in der Lage waren, zu allen drei Zelltypen, umfassend Oligodendrozyten, Astrozyten und Neuronen, zu differenzieren. Die Häufigkeit der auf EGF ansprechenden Zellen war auf lediglich 1% der ursprünglichen Primärkultur beschränkt. Eine Subklonierung zur Etablierung der Selbsterneuerung war zweifelhaft, da bis zu 500 Zellen/Vertiefung zur Erzeugung der sekundären „Klone" verwendet wurden. Die Differenzierung der Zellen wurde durch Einbringen von 1% Serum in das Medium induziert. Allerdings wurden keinerlei Daten in Bezug auf aus einzelnen Zellen stammende Klone präsentiert, welche alle drei Zelltypen zeigen.
  • Weiss et al.54 berichteten, dass multipotente ZNS-Stammzellen aus adulter Wirbelsäule sowie aus dritten und vierten Ventrikeln unter Verwendung einer Kombination von EGF und bFGF, jedoch nicht mit jeweils ausschließlich einem hiervon, isoliert werden können.
  • Svendsen et al.55 berichteten, dass neurale Vorläuferzellen, welche aus dem Striatum und dem Mesencephalon von 16 Tage alten Rattenembryonen (E16) isoliert worden waren, nicht zu Neuronen differenzierten, wenn sie in läsioniertes Gehirn von adulten Ratten eingepflanzt wurden. Sie berichteten ferner, dass Mesencephalonzellen, welche mittels EGF erzeugt worden waren, nicht jedoch striatale Zellen, zu Tyrosinhydroxylase (TH)-positiven Neuronen differenzierten, wenn auch ihn sehr geringer Anzahl (0.002%). Es wurde keine Charakterisierung von Zellen in vitro vorgenommen, um sicher zu stellen, dass die verwendete Primärkultur keine aus dem Gewebe eingebrachten postmitotischen Neuronen enthält, insbesondere in Anbetracht dessen, dass das Ergebnis lediglich mit Geweben des Stadiums E16 erhalten werden konnte, in welchem die meisten TH-Zellen bereits geboren sind.
  • Schinstine und Iacovitti56 berichteten, dass einige der aus neuralen Vorläuferzellen, welche mittels EGF erzeugt worden waren, stammenden Astrozyten neuronale Antigene wie beispielsweise Tau und MAP2 exprimierten. Qian et al.57 berichteten, dass unterschiedliche Konzentrationen an bFGF die Proliferation stammzellähnlicher Zellen aus Cortex des Stadiums E10 von Mäusen mit variierenden Differenzierungspotentialen bewirken, welche von ausschließlich neuronal bis multipotent reichen.
  • Palmer et al.65 berichteten, dass multipotente ZNS-Stammzellen aus dem Hippocampus von adulten Ratten isoliert werden können. 84% der von ihnen expandierten Zellen zeigten allerdings eine Co-Expression von MAP2c und O4, welche Marker unreifer neuronaler und oligodendroglialer Zellen darstellen. Lediglich 0.2% waren MAP2ab-positiv, und weniger als 0.01% waren in Bezug auf andere neuronale Marker, wie beispielsweise Tau und Neurofilament 200, positiv. Derartige Eigenschaften unterscheiden sich deutlich von den in den Beispielen der vorliegenden Erfindung beschriebenen Eigenschaften.
  • Finley et al.66 berichteten, dass die aus Maus stammende embryonale Karzinomzelllinie P19 eine neuronale Polarität ausbilden und elektrophysiologisch aktiv sein kann, wenn sie mittels Retinolsäure und Serum induziert wird. Strubing et al.67 berichteten, dass embryonale Stammzellen, welche in Serum-enthaltendem Medium aufgezogen worden waren, in vitro zu elektrophysiologisch aktiven Neuronen differenzieren können. Okabe et al.68 berichteten ebenfalls von einer Differenzierung einiger embryonaler Stammzellen zu Neuronen in vitro.
  • Gritti et al.40 berichteten, dass multipotente Stammzellen mittels EGF und bFGF aus dem Subependym von adulten Mäusen isoliert werden können, welche nach Differenzierung elektrophysiologisch aktiv sein können und eine Immunreaktivität gegenüber GABA, Glutamat und ChAT, nicht jedoch gegenüber anderen Substanzen, zeigen. Die Häufigkeit derartiger Neuronen wurde allerdings nicht dokumentiert, weshalb sich eine Sicherstellung dessen, wie effizient die neuronale Reifung war, schwierig gestaltet. Darüber hinaus wurden diese aus sich teilenden Stammzellen erhaltenen neuronalen Phänotypen nicht direkt mittels BrdU-Markierung nachgewiesen. Dies ist besonders relevant, da Aggregatkulturen in Bezug auf eine Kontamination mit primären Neuronen aus dem Gewebe extrem anfällig sind, was sich über mehrere Passagen überträgt. In der Tat legten Weiss et al.49 dar, dass lediglich GABA-positive Zellen aus ihren Kulturen erhalten werden können. Die meisten der GABA-positiven Zellen können Oligodendrozyten sein.
  • Feldman et al.69 berichteten über elektrophysiologische Studien an neuralen Vorläuferzellen aus Ratten, welche mittels EGF erzeugt worden waren. Sie stellten fest, dass die meisten, wenn nicht gar alle elektrophysiologisch aktiven Zellen in der Tat nicht-neuronal sind, und dass Gliazellen keine spannungssensitiven Na-Kanäle enthalten, welche Aktionspotential-ähnliche Leitfähigkeiten hervorrufen.
  • Ergebnisse wie diese veranschaulichen, dass die Identifizierung von ZNS-Stammzellen, das Definieren von Bedingungen, welche die Eigenschaften von ZNS-Stammzellen über einen längeren Zeitraum stabil aufrechterhalten, und das Kontrollieren ihrer Differenzierung zu reifen Zelltypen für den Fachmann weder nahe liegend noch vorhersagbar ist.
  • ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
  • Die vorliegende Erfindung offenbart eine in vitro-Kultur von Stammzellen aus dem zentralen Nervensystem eines Säugers, ein Verfahren zur in vitro-Kultivierung der Stammzellen, sowie ein Verfahren zur Differenzierung der Stammzellen.
  • In der in vitro-Kultur von Stammzellen aus dem zentralen Nervensystem eines Säugers behalten die Stammzellen die multipotente Fähigkeit zur Differenzierung zu Neuronen, Astrozyten und Oligodendrozyten bei. Die Stammzellen können aus Gewebe aus dem zentralen Nervensystem eines Menschen, eines Fötus oder eines Erwachsenen, stammen. Weiterhin kann das Gewebe aus dem zentralen Nervensystem Hippocampus, Großhirnrinde, Striatum, Septum, Diencephalon, Mesencephalon, Rautenhirn oder Wirbelsäule sein.
  • Weiterhin können die Stammzellen zu reifen Neuronen differenzieren, welche eine Axon-Dendrit-Polarität, synaptische Enden, und eine Lokalisierung von Proteinen, die an der Synaptogenese und an synaptischer Aktivität beteiligt sind, umfassend Neurotransmitter-Rezeptoren, Transporter und Prozessierungsenzyme, aufweisen. Darüber hinaus behalten die Stammzellen ihre Fähigkeit zur Erzeugung neuronaler Subtypen mit molekularen Unterschieden zwischen den Subtypen bei.
  • Bereitgestellt wird ein Verfahren zur in vitro-Kultivierung von Stammzellen, wobei die Stammzellen die multipotente Fähigkeit zur Differenzierung zu Neuronen, Astrozyten und Oligodendrozyten beibehalten, wobei die Zellen aus dem zentralen Nervensystem:
    • a) durch mechanisches Triturieren dissoziiert werden,
    • b) in einer optimalen ursprünglichen Dichte von 1 × 106 Zellen (aus Hippocampus und Septum) oder 1.5 × 106 Zellen (aus anderen Regionen des ZNS) pro 10 cm-Platte, welche mit Polyornithin und Fibronektin vorbeschichtet ist, ausplattiert werden,
    • c) in vollständiger Abwesenheit von Serum kultiviert werden,
    • d) täglich mit einem Wachstumsfaktor ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus i) basischem Fibroblastenwachstumsfaktor (bFGF) in einer Konzentration von mindestens 10 ng/ml, ii) EGF in einer Konzentration von mindestens 10 ng/ml, iii) TGF-alpha in einer Konzentration von mindestens 10 ng/ml, und iv) saurem FGF (aFGF) in einer Konzentration von mindestens 10 ng/ml plus 1 μg/ml Heparin, versetzt werden,
    • e) alle zwei Tage 100% des Kulturmediums durch frisches Medium ersetzt wird,
    • f) alle vier Tage nach Ausplattieren durch Behandeln der kultivierten Zellen mit Kochsalzlösung und Abkratzen der Zellen von der Platte passagiert werden, und
    • g) passagierte Zellen mit 0.5 × 106 Zellen pro 10 cm-Platte, welche mit Polyornithin und Fibronektin vorbeschichtet ist, erneut ausplattiert werden.
  • Das Verfahren ist auf Stammzellen anwendbar, welche aus Gewebe aus dem zentralen Nervensystem eines Menschen, eines Fötus oder eines Erwachsenen, stammen. Wiederum kann das Gewebe aus dem zentralen Nervensystem Hippocampus, Großhirnrinde, Striatum, Septum, Diencephalon, Mesencephalon, Rautenhirn oder Wirbelsäule sein.
  • Das erfindungsgemäße Verfahren zur Expansion und in vitro-Kultivierung von Stammzellen aus dem zentralen Nervensystem eines Säugers, wobei die Stammzellen die multipotente Fähigkeit zur Differenzierung zu Neuronen, Astrozyten und Oligodendrozyten beibehalten, umfasst die Schritte:
    • a) Dissoziieren von Zellen aus Gewebe des zentralen Nervensystems durch mechanisches Triturieren in Abwesenheit zweiwertiger Kationen,
    • b) Kultivieren der auf einer Platte anhaftenden dissoziierten Zellen in einem chemisch definierten, serumfreien Kulturmedium,
    • c) Ausplattieren von dissoziierten Zellen in einer Dichte, welche 20 000 Zellen/cm2 nicht übersteigt, und erneutes Ausplattieren der kultivierten Zellen in nachfolgenden Passagen in einer Dichte, welche 10 000 Zellen/cm2 nicht übersteigt,
    • d) tägliches Hinzufügen eines Wachstumsfaktors ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus i) bFGF in einer Konzentration von mindestens 10 ng/ml, ii) EGF in einer Konzentration von mindestens 10 ng/ml, iii) TGF-alpha in einer Konzentration von mindestens 10 ng/ml, und iv) aFGF in einer Konzentration von mindestens 10 ng/ml plus 1 μg/ml Heparin, zu den kultivierten Zellen,
    • e) Ersetzen des Kulturmediums durch frisches Medium alle zwei Tage,
    • f) Passagieren der kultivierten Zellen innerhalb von vier Tagen nach Ausplattieren, so dass eine 50%ige Konfluenz nicht überschritten wird, und
    • g) Passagieren der kultivierten Zellen durch Behandeln der kultivierten Zellen mit Kochsalzlösung, welche frei von zweiwertigen Kationen ist, und Abkratzen der Zellen von der Platte.
  • Die Anmeldung offenbart ferner ein Verfahren zur Differenzierung einer in vitro-Kultur von Stammzellen aus dem zentralen Nervensystem eines Säugers, wobei die Stammzellen die multipotente Fähigkeit zur Differenzierung zu Neuronen, Astrozyten und Oligodendrozyten beibehalten, wobei die Zellen aus dem zentralen Nervensystem:
    • a) durch mechanisches Triturieren dissoziiert werden,
    • b) in einer optimalen ursprünglichen Dichte von × 10S Zellen (aus Hippocampus und Septum) oder 1.5 × 10S Zellen (aus anderen Regionen des ZNS) pro 10 cm-Platte, welche mit Polyornithin und Fibronektin vorbeschichtet ist, ausplattiert werden,
    • c) in vollständiger Abwesenheit von Serum kultiviert werden,
    • d) täglich mit einem Wachstumsfaktor ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus i) basischem Fibroblastenwachstumsfaktor (bFGF) in einer Konzentration von mindestens 10 ng/ml, ii) EGF in einer Konzentration von mindestens 10 ng/ml, iii) TGF-alpha in einer Konzentration von mindestens 10 ng/ml, und iv) saurem FGF (aFGF) in einer Konzentration von mindestens 10 ng/ml plus 1 μg/ml Heparin, versetzt werden,
    • e) alle zwei Tage 100% des Kulturmediums durch frisches Medium ersetzt wird,
    • f) alle vier Tage nach Ausplattieren durch Behandeln der kultivierten Zellen mit Kochsalzlösung und Abkratzen der Zellen von der Platte passagiert werden,
    • g) passagierte Zellen mit 0.5 × 106 Zellen pro 10 cm-Platte, welche mit Polyornithin und Fibronektin vorbeschichtet ist, erneut ausplattiert werden, und
    • h) der Wachstumsfaktor entweder durch Spülen der Zellen mit Kochsalzlösung oder durch Behandeln mit Trypsin und anschließend mit Trypsin-Inhibitor entfernt wird, und die Zellen anschließend in dem serumfreien Medium ohne den Wachstumsfaktor weiter kultiviert werden.
  • Weiterhin kann die Differenzierung durch Hinzufügen eines zweiten Wachstumsfaktors zu den kultivierten Zellen entweder vor oder nach Entfernen des ersten Wachstumsfaktors von den kultivierten Zellen spezifisch gesteuert werden. Der zweite oder hinzugefügte Wachstumsfaktor kann Blutplättchen-Wachstumsfaktor (PDGF), ciliärer neurotropher Faktor (CNTF), Leukämie inhibierender Faktor (LIF) oder Thyroidhormon, Iodthyronin (T3), sein.
  • Das erfindungsgemäße Verfahren zur Differenzierung einer in vitro-Kultur von Stammzellen aus dem zentralen Nervensystem eines Säugers, wobei die Stammzellen die multipotente Fähigkeit zur Differenzierung zu Neuronen, Astrozyten und Oligodendrozyten beibehalten, umfasst die Schritte:
    • a) Dissoziieren von Zellen aus Gewebe des zentralen Nervensystems durch mechanisches Triturieren in Abwesenheit zweiwertiger Kationen,
    • b) Kultivieren der auf einer Platte anhaftenden dissoziierten Zellen in einem chemisch definierten, serumfreien Kulturmedium,
    • c) Ausplattieren von dissoziierten Zellen in einer Dichte, welche 20 000 Zellen/cm2 nicht übersteigt, und erneutes Ausplattieren der kultivierten Zellen in nachfolgenden Passagen in einer Dichte, welche 10 000 Zellen/cm2 nicht übersteigt,
    • d) tägliches Hinzufügen eines ersten Wachstumsfaktors ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus i) bFGF in einer Konzentration von mindestens 10 ng/ml, ii) EGF in einer Konzentration von mindestens 10 ng/ml, iii) TGF-alpha in einer Konzentration von mindestens 10 ng/ml, und iv) aFGF in einer Konzentration von mindestens 10 ng/ml plus 1 μg/ml Heparin, zu den kultivierten Zellen,
    • e) Ersetzen des Kulturmediums durch frisches Medium alle zwei Tage,
    • f) Passagieren der kultivierten Zellen innerhalb von vier Tagen nach Ausplattieren, so dass eine 50%ige Konfluenz nicht überschritten wird,
    • g) Passagieren der kultivierten Zellen durch Behandeln der kultivierten Zellen mit Kochsalzlösung, welche frei von zweiwertigen Kationen ist, und Abkratzen der Zellen von der Platte, und
    • h) Entfernen des ersten Wachstumsfaktors von den kultivierten Zellen, wobei das Entfernen zur Differenzierung der kultivierten Zellen zu Neuronen, Astrozyten und/oder Oligodendrozyten führt.
  • Die vorliegende Anmeldung offenbart ferner eine in vitro-Kultur regionspezifischer, terminal differenzierter reifer Neuronen, welche aus Kulturen multipotenter ZNS-Stammzellen eines Säugers stammen, sowie ein in vitro-Kultivierungsverfahren zur Erzeugung der differenzierten Neuronen.
  • Im Rahmen des Verfahrens zur in vitro-Erzeugung regionspezifischer, terminal differenzierter reifer Neuronen aus Kulturen multipotenter ZNS-Stammzellen eines Säugers werden multipotente ZNS-Stammzellen aus einer spezifischen Region in einem chemisch definierten, serumfreien Kulturmedium, welches einen Wachstumsfaktor enthält, kultiviert; wird das Medium durch Wachstumsfaktor-freies Medium ersetzt; werden die Stammzellen durch Trypsinierung geerntet, in einer Dichte von zwischen 100 000 und 250 000 Zellen pro Quadratzentimeter ausplattiert, und in einem Glutaminsäure-freien, chemisch definierten, serumfreien Kulturmedium kultiviert. Die spezifische Region des ZNS, aus welcher die multipotenten Stammzellen stammen, ist aus der Gruppe bestehend aus Cortex, olfaktorisches Tuberkel, Retina, Septum, lateraler Ganglienhügel, medialer Ganglienhügel, Amygdala, Hippocampus, Thalamus, Hypothalamus, ventrales und dorsales Mesencephalon, Hirnstamm, Cerebellum und Wirbelsäule ausgewählt.
  • Darüber hinaus kann das chemisch definierte, serumfreie Kulturmedium aus N2 (DMEM/F12, Glucose, Glutamin, Natriumbicarbonat, 25 μg/ml Insulin, 100 μg/ml humanes Apotransferrin, 25 nM Progesteron, 100 μM Putrescin, 30 nM Natriumselenit, pH 7.28) oder N2-modifiziertem Medium ausgewählt sein. Der Wachstumsfaktor kann aus der Gruppe bestehend aus bFGF, EGF, TGF-alpha und aFGF ausgewählt sein.
  • Weiterhin kann das Glutaminsäure-freie, chemisch definierte, serumfreie Kulturmedium mit zwischen 10-100 ng/ml an aus Gehirn stammendem neurotrophem Faktor ergänzt sein. Das Verfahren ist auf multipotente ZNS-Stammzellen anwendbar, welche aus Gewebe aus dem zentralen Nervensystem eines beliebigen Säugers, umfassend Ratte und Mensch, stammen.
  • Die vorliegende Anmeldung offenbart ferner in vitro-Kulturen regionspezifischer, terminal differenzierter reifer Neuronen, welche aus Kulturen von multipotenten ZNS-Stammzellen eines Säugers aus einer spezifischen Region des ZNS stammen. Der spezifische Bereich, aus welchem die multipotenten Stammzellen stammen, ist aus der Gruppe bestehend aus Cortex, olfaktorisches Tuberkel, Retina, Septum, lateraler Ganglienhügel, medialer Ganglienhügel, Amygdala, Hippocampus, Thalamus, Hypothalamus, ventrales und dorsales Mesencephalon, Hirnstamm, Cerebellum und Wirbelsäule ausgewählt. Gleichermaßen kann die in vitro-Kultur regionspezifischer, differenzierter Neuronen aus beliebigen multipotenten ZNS-Stammzellen eines Säugers, umfassend Ratte und Mensch, stammen.
  • KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
  • 1A zeigt die kontrollierte Differenzierung von ZNS-Stammzellen bei hoher Dichte. Sich schnell teilende Nestin-positive Vorläuferzellen wurden während der letzten 24 Stunden der Proliferation mit BrdU markiert. Anschließend wurde die Differenzierung durch Entzug von bFGF (Tag 0) initiiert und für bis zu 6 Tage fortgeführt. Zu den angegebenen Zeitpunkten wurden die Zellen fixiert und auf BrdU sowie auf neuronale Antigene gefärbt. Die Verhältnisse der Zellen, welche auf BrdU und jedes neuronale Antigen doppelgefärbt wurden, zur Gesamtzahl an BrdU-positiven (BrdU+)-Zellen sind dargestellt. Bis zu 50% an BrdU+-Zellen exprimierten neuronale Antigene, wobei deren Expression zeitabhängig war. MAP2-positiv (MAP2+), ausgefüllter Kreis; TuJ1-positiv (TuJ1+), graue Raute; Neurofilament L-positiv (Neurofilament L+), nicht-ausgefülltes Quadrat; Neurofilament M-positiv (Neurofilament M+), ausgefülltes Dreieck.
  • 1B zeigt die Anteile von MAP2+-Neuronen (•), GalC+-Oligodendrozyten (+), und GFAP+-Astrozyten (o) in differenzierten Klonen. Klone verschiedener Größen im Bereich von 39 Zellen bis 2800 Zellen wurden für 6 Tage einer Differenzierung unterzogen und unter Verwendung von Doppelimmunhistochemie in Bezug auf zwei Zelltypen pro Klon analysiert. Eine partielle Liste ist in Tabelle I angegeben, und die Immunfärbung ist in 3 dargestellt. Die Anzahl an Neuronen erhöhte sich mit steigender Klongröße und begründete 50% des Klons.
  • 1C zeigt einen Vergleich der mitogenen Wirksamkeiten von epidermalem Wachstumsfaktor (EGF) und basischem Fibroblastenwachstumsfaktor (bFGF). Zellen (ursprüngliche Dichte von 1 × 104 pro Platte), welche aus Hippocampus (HI) des Stadiums E16, Cortex (CTX) und Striatum (ST) des Stadiums E14, und adulter subependymaler Schicht (adult) akut dissoziiert worden waren, wurden entweder mit EGF (20 ng/ml) oder mit bFGF (10 ng/ml) expandiert. Die Kolonien, welche nach 10 Tagen Expansion entstanden, wurden auf Nestin, ein als Zwischenstufe auftretendes Filamentprotein, welches für ZNS-Vorläuferzellen charakteristisch ist13,14, gefärbt. Die relative Anzahl an Kolonien, welche den Mittelwert aus mindestens zwei Experimenten für jede Region bilden, sind dargestellt (bFGF = 1). Zwanzig- bis fünfzigmal mehr Nestin+-Kolonien pro Platte waren vorhanden, wenn die embryonalen Zellen in bFGF (gepunkteter Balken) anstelle in EGF (gestrichelter Balken) aufgezogen wurden. Bei hohen Dichten (1 × 106 und 2.5 × 106) ergab die bFGF-Bedingung eine 10-mal höhere Anzahl an BrdU+/Nestin+-Zellen als EGF. Beide Wachstumsfaktoren waren für die adulten Zellen gleichermaßen mitogen. Wurden EGF- und bFGF-expandierte Klone einer Differenzierung unterzogen, wurden Neuronen und Oligodendrozyten in ähnlichen Mengen gefunden. Allerdings führten mit EGF expandierte Klone zu einer signifikant höheren Anzahl an GFAP+-Astrozyten.
  • Die 2A-D zeigen einen typischen Klon von ZNS-Stammzellen. Die Zellen wurden innerhalb von 24 Stunden nach Ausplattieren vor der ersten Mitose mittels eines Kreises auf der Platte markiert und anschließend für bis zu 10 Tage expandiert (2A). Eine vergrößerte Ansicht eines weiteren Klons vor der Differenzierung, welcher mit anti-Nestin-Antikörper immungefärbt wurde, ist in 2B dargestellt. Besonders erwähnenswert ist die homogene radiale Morphologie der Nestin-positiven Zellen, welche im Einklang mit der in vivo in Neuroepithel beobachteten Nestin-positiven Morphologie steht. 2C zeigt einen Schwesterklon bei geringer Vergrößerung, welcher für 6 Tage einer Differenzierung unterzogen und mit einem Neuronen-spezifischen Antikörper, TuJ1, immungefärbt wurde. Besonders erwähnenswert ist die weit verbreitete und nicht-lokalisierte Anwesenheit TuJ1-positiver Neuronen im gesamten Klon. Eine vergrößerte Ansicht der gleichen Zellen ist in 2D dargestellt. Die TuJ1-positiven Zellen nehmen eine typisch neuronale Morphologie an. In den nicht-neuronalen TuJ1-negativen Zellen sind heterogene Morphologien ersichtlich.
  • Die 3A-J zeigen Beispiele repräsentativer Klone embryonaler hippocampaler Zellen (3A, 3C, 3E, 3G, 3I) sowie adulter subependymaler Zellen (3B, 3D, 3F, 3H, 3J), welche mit Kombinationen von Antikörpern doppelgefärbt wurden, um unterschiedliche Zelltypen innerhalb einzelner Klone kenntlich zu machen: anti-MAP2, neuronal; anti-GalC, oligodendrozytisch; anti-GFAP, astrozytisch. Die zwei Immunreaktionen wurden aufeinander folgend entwickelt und unter Verwendung zweier verschiedener Chromogene mittels alkalische Phosphatase-Reaktion (blau, durch Pfeile gekennzeichnet) bzw. Meerrettichperoxidase-Reaktion (rot, durch Pfeilspitzen gekennzeichnet) voneinander unterschieden.
  • Die Zellen in den 3A und 3B wurden mit anti-MAP2 (neuronal, Pfeile) und anti-GFAP (astrozytisch, Pfeilspitzen) doppelgefärbt und zeigen, dass aus embryonalem oder adultem Gehirn stammende, mit bFGF expandierte Klone sowohl zu Neuronen als auch zu Astrozyten differenzieren. (Oligodendrozyten werden im Rahmen dieser Färbung nicht gefärbt).
  • Die Zellen in den 3C und 3D wurden mit anti-GalC (oligodendrozytisch, Pfeile) und anti-GFAP (astrozytisch, Pfeilspitzen) doppelgefärbt und zeigen, dass aus embryonalem oder adultem Gehirn stammende, mit bFGF expandierte Klone sowohl zu Oligodendrozyten als auch zu Astrozyten differenzieren. (Neuronen werden im Rahmen dieser Färbung nicht gefärbt).
  • Die 3E und 3F zeigen Klone, welche in Gegenwart von Blutplättchen-Wachstumsfaktor (PDGF) einer Differenzierung unterzogen wurden. Die Zellen wurden mit anti-MAP2 (neuronal, Pfeile) und anti-GFAP (astrozytisch) doppelgefärbt. Die meisten Zellen waren MAP2+, und lediglich einige wenige waren GFAP+.
  • Die 3G und 3H zeigen Klone, welche in Gegenwart von ciliärem neurotrophem Faktor (CNTF) einer Differenzierung unterzogen wurden. Die Zellen wurden mit anti-MAP2 (neuronal) und anti-GFAP (astrozytisch, Pfeilspitzen) doppelgefärbt. Alle Zellen waren intensiv GFAP+.
  • Die 3I und 3J zeigen Klone, welche in Gegenwart von Thyroidhormon, Triiodthyronin (T3), einer Differenzierung unterzogen wurden. Die Zellen wurden mit anti-GalC (oligodendrozytisch, Pfeile) und anti-GFAP (astrozytisch, Pfeilspitzen) doppelgefärbt. Die Anzahl an GFAP+- und insbesondere GalC+-Zellen erhöhte sich. Die Anzahl an MAP2+-Zellen verringerte sich (Tabelle IV).
  • 4 zeigt die Differenzierung humaner ZNS-Stammzellen zu Neuronen in einer Kultur mit hoher Dichte. Mit bFGF expandierte ZNS-Zellen in hoher Dichte wurden durch Entzug von bFGF („WD") einer Differenzierung unterzogen. Die Anzahl an Neuronen, welche Tau-Protein exprimierten, wurde in Kultur unter Verwendung von Immunzytochemie während der Expansionsphase („vor WD") sowie nach der Differenzierung („nach WD") bestimmt. Der dramatische Anstieg postmitotischer Neuronen ausschließlich nach dem Entzug von bFGF deutet darauf hin, dass sie aus den sich teilenden Stammzellen erzeugt wurden.
  • Die 5A-F zeigen humane Stammzellen, welche mit Neuronen identifizierendem, humanspezifischem anti-Tau-Antiserum (Chemicon) gefärbt wurden. Proliferierende humane ZNS-Stammzellen in Kulturen mit hoher Dichte exprimieren kein Tau-Protein, einen neuronalen Marker (5A). Nach 6 Tagen der Differenzierung exprimieren allerdings viele Zellen mit typisch neuronaler Morphologie hohe Mengen an Tau-Protein (5B). Um darüber hinaus zu belegen, dass diese Neuronen in der Tat aus sich teilenden Stammzellen stammen, wurden die Stammzellen für 24 Stunden unmittelbar vor dem Entzug von bFGF mit 10 μM Bromdesoxyuridin (BrdU), einem Mitoseindikator, markiert. Sie wurden anschließend für 6 Tage einer Differenzierung unterzogen, mit humanspezifischem anti-Tau-Antiserum (FITC, grün) und anti-BrdU-Antikörper (Rhodamin, rot) doppelgefärbt. 5C zeigt eine stark vergrößerte Ansicht nachfolgender Tau-positiver Neuronen, wie anhand der FITC-Fluoreszenz erkennbar ist. 5D zeigt das gleiche Gesichtsfeld wie 5D; allerdings wird zur Kenntlichmachung BrdU-positiver Kerne die Rhodamin-Fluoreszenz detektiert. Die meisten Tau-positiven Neuronen sind auch BrdU-positiv, was belegt, dass sie vor dem Entzug von bFGF aus mitotischen Stammzellen erhalten werden.
  • Um die Multipotenz humaner ZNS-Stammzellen weiter zu belegen, wurden sie in einer Klondichte, wie sie für Nagerzellen beschrieben ist, kultiviert. 5E zeigt einen typischen Klon bei geringer Vergrößerung, welcher für 20 Tage aus einer einzelnen Zelle expandiert, anschließend für 12 Tage einer Differenzierung unterzogen, und mit dem Neuronen-spezifischen anti-MAP2-Antikörper immungefärbt wurde. Neuronen sind in dem Klon reichlich vorhanden. 5F zeigt eine vergrößerte Ansicht des Klons gemäß 5E, um darauf aufmerksam zu machen, dass die MAP2-positive Zelle eine typisch neuronale Morphologie aufweist.
  • Die 6A-D belegen eine gesteuerte Differenzierung humaner ZNS-Stammzellen. Humane ZNS-Stammzellen wurden nach 16 Tagen Expansion für weitere 20 Tage klonal aufgezogen, und wurden anschließend in Gegenwart oder Abwesenheit einzelner Faktoren, PDGF (10 ng/ml), CNTF (10 ng/ml) oder T3 (3 ng/ml), einer Differenzierung unterzogen. 6A zeigt einen unbehandelten Kontrollklon mit etwa 50% MAP2-positiven Neuronen (Pfeile) und 2-10% GFAP-positiven Astrozyten (Pfeilspitzen). 6B zeigt einen mit PDGF behandelten Klon, in welchem 75% der Zellen MAP2-positive Neuronen (Pfeile) und 2-10% GFAP-positive Astrozyten (Pfeilspitzen) sind. 6C zeigt einen mit CNTF behandelten Klon, in welchem 85% GFAP-positive Astrozyten (Pfeilspitzen) und lediglich 9% MAP2-positive Neuronen (Pfeile) sind. 6D zeigt einen mit T3 behandelten Klon mit erhöhter Anzahl an O4- und/oder GalC-positiven Oligodendrozyten (Pfeile) und GFAP-positiven Astrozyten (Pfeilspitzen).
  • Die 7A-7I zeigen, dass eine große Anzahl an reifen Neuronen mit korrekter Axon-Dendrit-Polarität und synaptischer Aktivität routinemäßig aus ZNS- Stammzellen erhalten werden können, welche über einen längeren Zeitraum expandiert worden waren. Hippocampale Stammzellen aus Rattenembryonen des Stadiums E16 wurden in Kultur für 16 Tage und über 4 Passagen expandiert. Unmittelbar vor der letzten Passage wurden die sich schnell teilenden Zellen über Nacht mit 10 μM BrdU markiert, unter Verwendung von Trypsin passagiert, und auf Objektträgern ausplattiert. Die Zellen wurden für 21 Tage aufrechterhalten, um eine konstitutive Differenzierung und Reifung von Neuronen zu ermöglichen. Anschließend wurden das Ausmaß der Reifung sowie die erzeugten neuronalen Subtypen unter Verwendung von Immunzytochemie analysiert.
  • 7A: Neuronen, welche mit TuJ1-Antikörper gefärbt wurden, betrachtet bei geringer Vergrößerung (100×), um zu veranschaulichen, dass die Produktion von Neuronen effizient ist.
  • 7B: Typische Morphologie von Neuronen, welche mittels TuJ1-Antikörpern kenntlich gemacht wurden (400×).
  • 7C: Typische Morphologie von Neuronen, welche mittels MAP2-Antikörpern kenntlich gemacht wurden (400×).
  • 7D: Neuronen, welche mittels Synapsin-Antikörper gefärbt wurden. Ausschließlich synaptische Vesikel enthaltende reife Neuronen sind gefärbt.
  • 7E: BrdU-Färbung. Alle Zellen in der Kultur, Neuronen und Gliazellen, sind mit BrdU markiert.
  • 7F: Synapsin- und BrdU-Doppelfärbung. Reife Synapsin-positive Zellen sind auch BrdU-positiv, was belegt, dass sie in Kultur aus mitotischen Stammzellen erhalten werden.
  • 7G: Punktförmige anti-Synapsin-Antikörper-Färbungen markieren präsynaptische Axonenden insbesondere in großen, reifen Neuronen.
  • 7H: Die Synapsin-positiven Strukturen stehen in engem Zusammenhang mit dendritischen Prozessen, wie mittels MAP2-Antikörper-Färbung kenntlich gemacht wurde.
  • 7I: MAP2- und Synapsin-Proteine stehen in enger Beziehung, ohne jedoch co-lokalisiert zu sein, was auf eine präsynaptische-postsynaptische Wechselwirkung schließen lässt.
  • 8 zeigt, dass aus Stammzellen stammende Neuronen verschiedene Neurotransmitter-Rezeptoren und Transporter exprimieren, von welchen angenommen wird, dass sie an der synaptischen Transmission beteiligt sind, wie mittels RT-PCR nachgewiesen. Über einen längeren Zeitraum expandierte Stammzellen, welche aus Cortex des Stadiums E16 von Nagern stammten, wurden für 14 Tage einer Differenzierung unterzogen und zur Herstellung von RNA geerntet. Undifferenzierte Stammzellen wurden ebenfalls hergestellt, um die differenzierungsspezifische Induktion zu vergleichen. RNA aus Gesamtgehirn einer adulten Ratte wurde als Positivkontrolle verwendet. Es wurden Primer verwendet, welche für die NMDA (N-Methyl-D-aspartat)- und AMPA (α-Amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolpropionsäure)-Familien von Glutamatrezeptor-Subtypen sowie für verschiedene GABA-Transporter spezifisch sind. Besonders erwähnenswert ist die spezifische Induktion von NMDA R1-, AMPA R1- und AMPA R2-Rezeptoren in differenzierten Zellen.
  • Die 9A-F zeigen Beispiele typischer Neuronen, welche aus embryonalen hippocampalen Stammzellen von Ratten stammen und in vitro für 16 Tage expandiert (etwa 16 Zellteilungen verteilt über vier Passagen) und für eine Gesamtdauer von 21 Tagen einer Differenzierung unterzogen wurden. Mitotische ZNS-Stammzellen wurden mit Bromdesoxyuridin (BrdU) für die letzten 24 Stunden vor der Differenzierung pulsmarkiert. Die resultierenden Neuronen wurden mit Antikörpern gegen BrdU (9A), MAP2ab (9B) und Synapsin (9C) dreifach immungefärbt. Die kombinierte Ansicht der dreifach gefärbten Zelle ist in 9D dargestellt. Die BrdU-Markierung belegt, dass das differenzierte Neuron aus einer mitotischen Vorläuferzelle der Kultur stammt und dass es sich um ein terminal differenziertes Neuron handelt, da es die mitotische Markierung während der ausgedehnten Differenzierungsphase beibehielt. MAP2ab stellt ein wohlbekanntes Neuronen-spezifisches Protein dar, welches lediglich in reifen Neuronen vorkommt und hauptsächlich in Dendriten lokalisiert ist. Synapsin stellt ein wohlbekanntes synaptisches Vesikelprotein dar und ist in Axonen folglich an den synaptischen Enden lokalisiert. Die dreifach markierten Neuronen, wie sie in 9D dargestellt sind, belegten, dass über einen längeren Zeitraum expandierte mitotische ZNS-Stammzellen terminal zu reifen Neuronen mit angemessener subzellulärer Polarisation differenzieren, welche ausgeprägte dendritische (postsynaptische) und axonale (präsynaptische) Strukturen enthalten, die man für vollfunktionelle Neuronen erwartet. Auch andere synaptische Vesikelproteine lokalisieren im gleichen Muster von punktförmigen Axonenden, welche auf Soma und Dendriten aufliegen. 9E und 9F zeigen eine weitere hippocampale ZNS-Stammzelle, welche aus einem reifen Neuron stammt, das auf Synaptophysin bzw. MAP2ab doppelgefärbt ist.
  • 10 zeigt ein Feld von Neuronen aus hippocampalen ZNS-Stammzellen, betrachtet unter Verwendung von Transmissionselektronenmikroskopie. Die reichliche Anwesenheit von Synapsen, welche synaptische Vesikel und postsynaptische Dichten enthalten, ist offenkundig.
  • Die 11A-D zeigen intrazelluläre elektrophysiologische Aufnahmen von einzelnen Neuronen, welche aus septalen ZNS-Stammzellen des Stadiums E15.5 von Ratten erhalten wurden. Im Einklang mit der Morphologie zeigen diese Aufnahmen, dass die aus ZNS-Stammzellen erhaltenen neuronalen Netzwerke auch elektrophysiologisch aktiv sind. Wurden einzelne Zellen mit einer Elektrode stimuliert, übertrugen sie folglich Aktionspotentiale (11A), zeigten die Anwesenheit verschiedener spannungssensitiver Ionenkanäle (11B), und riefen in Reaktion auf eine Badapplikation des exzitatorischen Neurotransmitters Glutamat exzitatorische und inhibitorische postsynaptische Potentiale hervor (11C und D). Diese Beispiele belegen zweifelsfrei, dass ZNS-Stammzellen zu terminal differenzierten, elektrophysiologisch funktionellen neuronalen Netzwerken führen.
  • Verschiedene neuronale Phänotypen, welche in vivo beobachtet werden, werden aus den ZNS-Stammzellkulturen erhalten. Beispiele einiger dieser neuronalen Phänotypen sind in den 12-18 und in Tabelle VII dargestellt.
  • 12 zeigt die Expression der Dopamin-Rezeptoren D1 und D2 von ZNS-Stammzellen, welche aus lateralem und medialem Ganglienhügel des Stadiums E15.5 isoliert worden waren. Gesamt-RNAs wurden aus entsprechenden ZNS-Stammzellkulturen isoliert, welche für unterschiedliche Zeiträume einer Differenzierung unterzogen worden waren (0-20 Tage). Dargestellt ist das Elektrophoresemuster der mittels RT-PCR (reverse Transkription-Polymerasekettenrektion) amplifizierten DNA. Die Ergebnisse aus fünf unabhängigen Kulturzubereitungen, welche parallel auf einem einzelnen Gel getrennt wurden, sind dargestellt. Die Nummern über den Bahnen kennzeichnen die Tage der Differenzierung. D1 = Dopamin-Rezeptor D1; D2 = Dopamin-Rezeptor D2.
  • Die 13A-D zeigen cholinerge Neuronen aus septalen ZNS-Stammzellen. ZNS-Stammzellen, welche aus Septum des Stadiums E16 stammten, wurden für 18-21 Tage einer Differenzierung unterzogen. Die cholinergen Neuronen wurden unter Verwendung von Acetylcholinesterase-Histochemie (nicht dargestellt) sowie Immunfärbung auf Acetylcholintransferase (13A) und Acetylcholintransporter (13C) bewertet. In jedem Fall wurden die ZNS-Stammzellen unmittelbar vor Wechsel auf Differenzierungsbedingungen für 24 Stunden mit der mitotischen Markierung BrdU (10 μM) inkubiert (13B und D).
  • Die 14A-F zeigen Neuropeptid-enthaltende Neuronen, welche aus ZNS-Stammzellen, die aus dem lateralen Ganglienhügel (Striatum) des Stadiums 15.5 von Ratten stammten, erhalten wurden. Sie zeigen ein Neuropeptid Y-positives (14A), BrdU-positives (14B) Neuron, ein Met-Enkephalin-positives (14C), BrdU-positives (14D) Neuron, sowie ein Leu-Enkephalin-positives (14E), BrdU-positives (14F) Neuron.
  • Die 15A-F zeigen typische Morphologien verschiedener Subtypen von Neuronen, welche aus ZNS-Stammzellen, die aus dem ventralen Mesencephalon des Stadiums E12.5 von Ratten stammten, erhalten wurden. Die 15A und B zeigen ein TH-positives und BrdU-positives Neuron (15A – TH-Färbung; 15B – BrdU-Färbung). Die 15C und D zeigen ein weiteres TH-positives und MAP2ab-positives Neuron (15C – TH-Färbung; 15D – MAP2ab- Färbung). 15E zeigt Neuronen, welche mit anti-GABA-Antikörper gefärbt sind. 15F zeigt Neuronen, welche unter Verwendung von Acetylcholinesterase-Histochemie gefärbt sind.
  • Die 16A-D zeigen Beispiele von Neuronen aus Stammzellen der Wirbelsäule. 16A zeigt ein Acetylcholinesterase-positives Neuron, welches aus ZNS-Stammzellen, die aus der Wirbelsäule des Stadiums E13.5 von Ratten stammten, erhalten wurde und darüber hinaus BrdU-positiv ist (16B). Cholinerge Neuronen sind durch Acetylcholintransferase-Färbung dargestellt (16C) und sind darüber hinaus auch BrdU-positiv (16D).
  • Die 17A und B zeigen GABAerge Neuronen, welche aus hippocampalen ZNS-Stammzellen des Stadiums E15.5 von Ratten stammten und auf Glutaminsäure-Decarboxylase (17A) und GABA (17B) doppelgefärbt wurden. 17C und D zeigen ein hippocampales, Calretinin-positives (17C), MAP2ab-positives (17D) Neuron.
  • Die 18A-F zeigen Neuronen, welche aus ZNS-Stammzellen, die aus Thalamus und Hypothalamus des Stadiums E13.5 von Ratten stammten, erhalten wurden. 18A zeigt thalamische Neuronen, welche auf Tau gefärbt wurden; 18B zeigt das gleiche Gesichtsfeld, welches auf BrdU gefärbt wurde. 18C zeigt ein hypothalamisches Neuron, welches auf Tau gefärbt wurde; 18D zeigt das gleiche Gesichtsfeld, welches auf BrdU gefärbt wurde. Die 18E und F zeigen Synapsin-positive Neuronen aus thalamischen bzw. hypothalamischen ZNS-Stammzellen.
  • AUSFÜHLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
  • In dieser Anmeldung werden Bedingungen definiert, welche in Kultur eine bis zu 109-fache Expansion bezüglich der Masse sowie eine kontrollierte Differenzierung multipotenter ZNS-Stammzellen aus dem embryonalen und adulten Gehirn von Säugern gestatten. In beiden Fällen differenzieren Klone, welche aus einzelnen Zellen stammen, zu Neuronen, Astrozyten und Oligodendrozyten. Die Zugabe einzelner Faktoren kann den Anteil an Zelltypen innerhalb eines Klons dramatisch verändern.
  • Das Verfahren zur Isolierung, Propagierung und Differenzierung von ZNS-Stammzellen ist nachstehend ausführlich dargelegt. Das Verfahren enthält vier wesentliche Schritte, welche für eine erfolgreiche Isolierung und Differenzierung der ZNS-Stammzellen übereinstimmend befolgt werden müssen. Die vier wesentlichen Schritte lauten wie folgt:
    • (1) Die ursprüngliche Dissoziation von Zellen aus Gewebe erfolgt durch mechanisches Triturieren und nicht durch enzymatischen Verdau. Bei adultem Gewebe ist es erforderlich, das Gewebe zunächst enzymatisch zu verdauen und anschließend die Zellen aus dem Gewebe durch mechanisches Triturieren zu dissoziieren.
  • Triturieren bedeutet ein behutsames Bewegen von Zellaggregaten verursacht durch eine Fluidbewegung, welche während sich wiederholender Pipettierungsvorgänge auftritt und in deren Folge sich einzelne Zellen lockern und von Nachbarzellen dissoziieren. Das Triturieren wird in einer Kochsalzlösung durchgeführt, welche frei von zweiwertigen Kationen ist, deren Abwesenheit das Aufbrechen von Wechselwirkungen zwischen Zelladhäsionsproteinen auf der Zelloberfläche unterstützt. Sich schnell teilende Stammzellen in der ventrikulären Zone zeigen lediglich eine schwache Anhaftung, wobei ein einfaches Entfernen der zweiwertigen Kationen aus dem Medium und behutsames Bewegen durch Pipettieren ausreichend sind, um eine Dissoziation des Gewebes in größtenteils einzelne Zellen zu bewirken. Die Zellen werden anschließend in vollständiger Abwesenheit von Serum kultiviert. Selbst eine kurze Exposition gegenüber Serum wirkt sich auf die Differenzierungsfähigkeit der Stammzellen schädlich aus, so dass sie nicht länger in der Lage sind, zu Neuronen und Oligodendrozyten zu differenzieren. Eine Vorbeschichtung der Platten mit Poly-L-Ornithin und Fibronektin fördert die Adhäsion der Zellen an die Platten.
    • (2) Die ZNS-Stammzellen zeigen eine immanente Eigenschaft zur spontanen Differenzierung, was einen regulatorischen Mechanismus widerspiegelt, welcher den Zellzyklus in Abhängigkeit von der freien Konzentration an Wachstumsfaktor, dem Mitogen, kontrolliert. Um die Differenzierung der Stammzellen zu anderen Zelltypen zu unterdrücken und die Homogenität aufrechtzuerhalten, muss der Wachstumsfaktor täglich in einer Konzentration von 10 ng/ml oder höher zugesetzt werden. Der Wachstumsfaktor kann aus (1) basischem Fibroblastenwachstumsfaktor (bFGF), (2) EGF, (3) TGF-alpha, oder (4) saurem FGF (aFGF) ausgewählt sein. Falls saurer Fibroblastenwachstumsfaktor ausgewählt wird, muss darüber hinaus Heparin in einer Konzentration von 1 μg/ml zugesetzt werden.
    • (3) Selbst eine kontinuierliche Zufuhr von bFGF oder einem anderen ausgewählten Wachstumsfaktor ist zur Hemmung der Differenzierung unzureichend, wenn es der Kultur ermöglicht wird, eine kritische Dichte von größer als etwa 50% zu erreichen. Dies ist höchstwahrscheinlich auf (einen) bislang undefinierte(n) endogene(n) Faktor(en) zurückzuführen, welche(r) von den sich teilenden Zellen selbst sekretiert wird/werden und die Wirkung von bFGF antagonisiert/antagonisieren. Folglich müssen die Zellen, um derartige Faktoren aus der Kultur zu entfernen und Zell-Zell-Wechselwirkungen so weit wie möglich zu verringern, alle 4 Tage nach Ausplattieren häufig passagiert werden, wobei das erneute Ausplattieren in einer geringen Dichte von 0.5 × 106 pro 10 cm-Platte, d. h. im Bereich von 1 × 102 bis 1 × 106 Zellen pro 10 cm-Platte, welche mit Polyornithin und Fibronektin vorbeschichtet ist, durchgeführt werden sollte.
    • (4) Das Passagieren der Zellen mittels Trypsin führt zur proteolytischen Entfernung einer bFGF-Rezeptorkomponente und inaktiviert den mitogenen Effekt von bFGF. Die Umsatzgeschwindigkeit des Rezeptors ist ausreichend langsam, wobei die Zellen das Mitogen während dieses Zeitraums nicht erkennen und den Differenzierungsweg aktivieren.
  • Um diesen Prozess zu umgehen, werden die Zellen mit Hank's gepufferter Kochsalzlösung (HBSS) behandelt, um zweiwertige Kationen aus der Kultur zu entfernen, wodurch die ionischen Wechselwirkungen zwischen den Cadherinen und Integrinen auf der Zelloberfläche und extrazellulären Matrixproteinen auf der Kulturplatte gestört werden und sich die Zellen zusammenballen. An diesem Punkt können die Stammzellen von der Platte mittels eines Schabers abgekratzt werden, ohne die Zellen zu beschädigen.
  • Andere in Kultur befindliche Zellen bleiben fest an die Platte gebunden und werden durch Abkratzen zerstört, was folglich eine effektive Selektion von sich schnell teilenden undifferenzierten Stammzellen ermöglicht.
  • Eine Differenzierung der ZNS-Stammzellen wird durch einfaches Entfernen des Mitogens, bFGF oder eines anderen ausgewählten Wachstumsfaktors, aus dem Medium erreicht. Die Ausprägung der Zelltypen, d. h. Neuronen, Oligodendrozyten und Astrozyten, erfolgt konstitutiv. Für eine effektive und kontrollierte Differenzierung müssen sich die Zellen in einem homogenen Zustand befinden, welcher durch Befolgen der vorstehend genannten Schritte 1-4 erreicht werden kann.
  • Diese Verfahren liefern ein Kultursystem zur Bereitstellung einer homogenen Population der ZNS-Stammzellen, welche kontrolliert und effizient einer Differenzierung zu Neuronen, Oligodendrozyten und Astrozyten unterzogen werden können. Die Höhepunkte der Merkmale dieses System sind:
    • (1) Herstellung einer großen Anzahl der ZNS-Stammzellen mit dem Potential zur Bildung vieler unterschiedlicher neuronaler Subtypen, Oligodendrozyten und Astrozyten, welche in ein Gehirn transplantiert werden können;
    • (2) kontrollierte Differenzierung in vitro unter serumfreien Bedingungen, was die Suche nach neuen Wachstumsfaktoren und Cytokinen ermöglicht;
    • (3) sich schnell teilende Zellen, welche einer genetischen Manipulation zur Einbringung fremder Gene zugänglich sind;
    • (4) Erzeugung reifer Neuronen in vitro, welche für genetisches und pharmakologisches Durchmustern geeignet sind; und
    • (5) direkter Erhalt von als Zwischenstufe auftretenden Vorläuferzellen aus den Stammzellen zur Anreicherung einer einzelnen Zellpopulation.
  • Die Isolierung der ZNS-Stammzellen auf die vorstehend beschriebene Art und Weise gestattet weiterhin eine gesteuerte Differenzierung der Zellen durch Behandeln derselben mit spezifischen Wachstumsfaktoren. Eine praktische Bedeutung dieser gesteuerten Differenzierung im Rahmen der Biotechnologie ist, dass ein einzelner Zelltyp in vitro angereichert werden kann. Folglich wäre es eine neue Anwendung der bereits früher entdeckten Wachstumsfaktoren PDGF37 (Blutplättchen-Wachstumsfaktor), CNTF (ciliärer neurotropher Faktor) und T3 (Thyroidhormon, Triiodthyronin), die ZNS-Stammzellen zur Erzeugung von Neuronen, Astrozyten bzw. Oligodendrozyten zu bringen.
  • Eine weitere praktische Bedeutung, insbesondere für PDGF, ist, dass PDGF-induzierte Neuronen scheinbar tatsächlich neuronale Vorläuferzellen darstellen, welche mittels PDGF in Kultur weiter proliferieren und expandieren können. Diese Zellen differenzieren lediglich zu Neuronen oder zu Neuronen und Oligodendrozyten und unterscheiden sich von den Stammzellen. Die Isolierung neuronaler Vorläuferzellen aus dem ZNS von Säugern mittels PDGF wurde bislang noch nicht beschrieben.
  • BEISPIELE
  • 1. Isolierung von ZNS-Stammzellen aus embryonalem Rattenhirn
  • Embryonaler Hippocampus von Ratten (Trächtigkeitstag 16; Tag der Empfängnis ist Tag 1, Taconic Farm) wurden in Hank's gepufferter Kochsalzlösung (HBSS) seziert und durch kurzes mechanisches Triturieren in HBSS dissoziiert. Die Zellen wurden mittels Zentrifugation gesammelt und in einem serumfreien Medium, welches DMEM/F12, Glucose, Glutamin, Natriumbicarbonat, 25 μg/ml Insulin, 100 μg/ml humanes Apotransferrin, 25 nM Progesteron, 100 μM Putrescin, 30 nM Natriumselenit, pH 7.28, plus 10 ng/ml rekombinanten humanen basischen Fibroblastenwachstumsfaktor12 (bFGF; R&D Inc.) enthielt, resuspendiert.
  • 1 × 106 Zellen wurden pro 10 cm-Gewebekulturplatte, welche aus Kunststoff bestand und mit 15 μg/ml Poly-L-Ornithin und 1 μg/ml Fibronektin aus Rinderplasma (Gibco) vorbeschichtet war, ausplattiert. Es wurde täglich bFGF zugesetzt und das Medium alle 2 Tage ausgetauscht. Die Zellen wurden bei 50%-iger Konfluenz (4 Tage nach dem ursprünglichen Ausplattieren) durch kurzes Inkubieren in HBSS und Abkratzen mit einem Zellschaber passagiert.
  • Zellen mit multipotenten Fähigkeiten wurden in allen Teilen des sich entwickelnden Neuroepithels gefunden. Unter identischen Kulturbedingungen konnten ähnliche Zellen aus anderen Regionen des sich entwickelnden ZNS, umfassend Großhirnrinde, Striatum, Septum, Diencephalon, Mesencephalon, Rautenhirn und Wirbelsäule, hergestellt werden. Aus Cortex und Striatum des Stadiums E14 sowie aus Hippocampus des Stadiums E16 sprachen etwa 70% der akut dissoziierten Zellen innerhalb von 2 Tagen nach Ausplattieren durch Vollzug von Mitose auf bFGF an.
  • 2. Propagierung von ZNS-Stammzellen aus embryonalem Rattenhirn
  • a) Expansion bezüglich der Masse
  • Hippocampale Zellen, welche aus embryonalen Rattenhirnen isoliert worden waren, wurden durch tägliches Hinzufügen von basischem Fibroblastenwachstumsfaktor (bFGF) in serumfreiem Medium expandiert. Der kontinuierliche Zusatz von bFGF war von Bedeutung, um die Differenzierung zu unterdrücken und um eine homogene Population von sich schnell teilenden Zellen, welche Nestin, ein als Zwischenstufe auftretendes Filamentprotein, das für ZNS-Vorläuferzellen charakteristisch ist13,14, exprimieren, aufrechtzuerhalten. Weniger als 1% der Zellen exprimierten den astroglialen Marker GFAP oder die oligidendroglialen Marker O4 und GalC.
  • Die Zellen wurden 4 Tage nach Ausplattieren passagiert, wobei sich während dieser Zeit die Zellanzahl bei einer durchschnittlichen Zellverdopplungszeit von etwa 24 Stunden schnell erhöhte. Die passagierten Zellen wurden mit 0.5 × 106 Zellen pro 10 cm-Platte erneut ausplattiert, wobei man eine weitere Propagierung ermöglichte. Die Zellen konnten auf diese Weise bis zu einer Gesamtdauer von 20 Tagen bis zu fünfmal in vitro passagiert werden, wobei während dieses Zeitraums idealerweise eine Ausbeute von 220 Zellen erwartet werden kann. Nach dieser Zeitspanne nahm die Mitoserate der Zellen schnell ab, wobei die Zellen graduell ihre multipotenten Fähigkeiten verloren, gliale Eigenschaften zeigten und nicht in der Lage waren, zu Neuronen zu differenzieren.
  • Eine große Anzahl von Zellen aus Cortex, Striatum und Septum, welche aus 12-18 Tage nach der Empfängnis alten Embryonen isoliert worden waren, konnten auf gleiche Art und Weise in Massenkultur expandiert werden. Der zeitliche Verlauf der Expansion war ähnlich jenem von hippocampalen Zellen. Eine kontinuierliche Expansion wurde wiederum durch den konstitutiven Verlust der Multipotenz nach etwa 20 Tagen der Zellteilung beschränkt. Folglich scheint dieser Rückgang eine charakteristische Eigenschaft von ZNS-Stammzellen zu sein.
  • b) Klonale Expansion
  • Es steht kein einfacher antigener Marker zur Verfügung, welcher in vitro eine spezifische Identifizierung multipotenter Stammzellen aus anderen Vorläuferzellen gestattet. Die Identität einer Vorläuferpopulation kann lediglich anhand der Differenzierungsfähigkeit der Zellen ermittelt werden. Die in dieser Anmeldung für eine Massenkultur definierten Bedingungen gestatteten darüber hinaus eine klonale Expansion, wenn die Zellen in einer extrem geringen Zelldichte ausplattiert wurden, so dass einzelne Zellen gut isoliert wurden.
  • Die Differenzierungsfähigkeit der in Massenkultur expandierten Zellen wurde in jeder Passage durch Ausplattieren von 200 Zellen pro 10 cm-Platte und Kultivieren unter den vorstehend beschriebenen Bedingungen bestimmt. Innerhalb von 24 Stunden nach Ausplattieren wurden wohlisolierte einzelne Zellen mit einem 3 mm-Ring (Nikon) auf der Unterseite der Platte markiert. Die ursprüngliche Lebensfähigkeit der markierten einzelnen Zellen betrug 5-10%, wobei jede Platte typischerweise 10-20 markierte Klone lieferte. In jedem Kreis befand sich lediglich eine einzelne Zelle. Die nachfolgende Zellpopulation innerhalb jedes Kreises stellt eine Nachkommenschaft jener einzelnen Zelle dar. Die Klone wurden für bis zu 10 Tage expandiert (500-2000 Zellen). Die durchschnittliche Verdopplungszeit betrug etwa 24 Stunden.
  • 3. Differenzierung und Analyse von ZNS-Stammzellen aus embryonalem Rattenhirn
  • Das Entwicklungspotential expandierter Zellen wurde durch direktes Differenzieren der Zellen untersucht. Der Entzug von bFGF initiierte die Differenzierung innerhalb von 24 Stunden. Um eine Differenzierung von Zellen bei hoher Dichte zu initiieren, wurden sich schnell teilende Zellen, welche sich für 12 Tage in Kultur befanden und dreimal passagiert worden waren, für die letzten 24 Stunden vor dem Passagieren mit 10 μM BrdU (Bromdesoxyuridin) inkubiert. Bei 80-85% der Zellen erfolgte ein Einbau von BrdU. Die Zellen wurden entweder durch Abkratzen oder unter Verwendung von Trypsin gefolgt von Sojabohne-Trypsin-Inhibitor in dem serumfreien Medium geerntet. Sie wurden in doppelter Ausführung mit 40 000 Zellen/cm2 auf Objektträgern mit einer Vielzahl von Vertiefungen (LabTek), welche mit Poly-L-Ornithin und Fibronektin vorbeschichtet waren, ausplattiert und in dem serumfreien Medium ohne bFGF kultiviert. Zu den angegebenen Zeitpunkten wurden die Zellen fixiert und mit verschiedenen Antikörpern gemäß Standardverfahren gefärbt.
  • Immunpositive Zellen wurden bei 400-facher Vergrößerung ausgezählt. Mindestens fünf Felder mit einer Gesamtzahl an Zellen von mehr als 1000 pro Probe wurden gezählt. Die gezeigten Ergebnisse (1A) stellen Zellzählungen dar, welche den Mittelwert zweier Experimente bilden. Als Antikörperreagenzien wurden verwendet: anti-Nestin-Antiserum; monoklonales anti-MAP2 (Klon HM-2, Sigma) und anti-Tau-Antiserum (Sigma), monoklonales anti-Neurofilament L und M (Klone NR4 und NN18, Boehringer-Mannheim), anti-beta-Tubulin Typ III (TuJ1), monoklonales anti-GFAP (ICN), A2B5 (ATCC), O4 und anti-Galactocerebrosid (GalC).
  • Über eine Zeitspanne von 6 Tagen erfolgte eine fortschreitende Erhöhung der Anzahl an Zellen, welche verschiedene wohlbekannte Neuronen-spezifische Antigene, umfassend MAP2a, b und c, beta-Tubulin Typ 3 (TuJ1), Tau, sowie Neurofilamente L, M und H, exprimierten (1A). Bis zu 50% der Zellen exprimierten die neuronalen Antigene und wiesen eine komplexe neuronale Morphologie auf. Die verbleibenden Zellen exprimierten GFAP, GalC/O4 oder Nestin. Obwohl Neuronen und Gliazellen bereits früher in expandierten Kulturen beobachtet worden waren, belegen diese Beispiele erstmals, dass die Differenzierung proliferierender Vorläuferzellen zu einem konkreten Zeitpunkt initiiert werden kann, und dass rasch mehrere Zelltypen entstehen. Diese Bedingungen gestatten in vitro eine Linienanalyse in großem Maßstab.
  • Um zu bestimmen, ob die Vorläuferpopulation verschiedene vorbestimmte Vorläuferzellen enthält, welche unabhängig voneinander zu Neuronen und Gliazellen führen, wurden sich schnell teilende Zellen in klonaler Dichte (200 Zellen pro 10 cm-Platte) ausplattiert, und wurden wohlisolierte einzelne Zellen mit Kreisen, welche einen Durchmesser von 3 mm aufwiesen, markiert. 5-10% der markierten einzelnen Zellen überlebten und proliferierten mit einer Verdopplungsgeschwindigkeit von 24 Stunden unter Erzeugung von Klonen. Nach mehreren Expansionsperioden (Klongrößen im Bereich von 24 bis 210 Zellen) wurde die Differenzierung der Klone durch einmaliges Waschen der Platten mit HBSS und Kultivieren im gleichen Medium, allerdings in Abwesenheit von bFGF, initiiert (2).
  • Für eine Subklonierung (Daten in Tabelle II dargestellt) wurden die Klonplatten gewaschen und für kurze Zeit in HBSS belassen, bis sich die Zellen zusammenballten. Klone von 500-2000 Zellen wurden in 50 μl Volumen mit einer verstellbaren Pipettiervorrichtung aufgenommen, während sie durch ein Mikroskop betrachtet wurden. Jeder Klon wurde erneut in einer 10 cm-Platte ausplattiert, wobei einzelne Zellen markiert und wie zuvor beschrieben kultiviert wurden.
  • Die Zelltypen innerhalb der Klone wurden während der ersten sechs Tage der Differenzierung durch Doppelfärbung mit Kombinationen zelltypspezifischer Antikörper analysiert, welche mit sich gegenseitig ausschließenden Zellen reagieren:
    Neuronen = MAP2+, Tau+, TuJ1+, Neurofilament L+, oder Neurofilament M+;
    Astrozyten = GFAP+; und
    Oligodendrozyten = O4+ oder GalC+.
  • Eine Doppelfärbung wurde aufeinander folgend unter Verwendung eines kommerziell erhältlichen Kits (Zymed) gemäß den Anweisungen des Herstellers durchgeführt. Für eine Färbung von Oligodendrozyten wurden Zellen, welche mit 4% Paraformaldehyd fixiert worden waren, zunächst auf die Zelloberflächenantigene O4 oder GalC ohne Permeabilisierung gefärbt. Der erste Antikörper wurde mittels alkalische Phosphatase-Reaktion (blau) und der zweite mittels Peroxidase-Reaktion (rot) (Zymed) entwickelt.
  • Wie bei Kulturen mit hoher Dichte exprimierten 50% der Zellen in einem Klon nach 6 Tagen neuronale Antigene, umfassend MAP2, Tau und beta-Tubulin Typ III (Tabelle I, 3A und C). In Tabelle I wurden Klone hippocampaler Vorläuferzellen expandiert, einer Differenzierung unterzogen, und wie vorstehend beschrieben analysiert. Eine partielle Liste typischer Klone ist vorstehend angegeben. Die Gesamtzahl der Zellen (Klongröße) sowie der Zellen, welche eine positive Färbung auf zelltypspezifische Antigene zeigten, ist dargestellt. Ihr relativer Anteil in Prozent ist in Klammern angegeben. Es wurde eine Gesamtzahl von 48 Klonen aus 4 unterschiedlichen Passagen in sechs separaten Experimenten quantitativ bestimmt. Der Gesamtdurchschnitt gibt die durchschnittliche Zusammensetzung jedes Zelltyps in den 48 Klonen an.
  • Die Expression von Neurofilament erfolgte unter diesen Bedingungen verzögert. Durchschnittlich waren 8% der Zellen in einem Klon GalC+ und wiesen eine typische Oligodendrozytenmorphologie auf. Zusätzliche 8% exprimierten GFAP und zeigten eine charakteristische Astrozytenmorphologie. Die verbleibenden Zellen wurden von keinem der für die differenzierten Zelltypen spezifischen Antikörper gefärbt, reagierten jedoch mit A2B5- und/oder anti-Nestin-Antikörpern. Maximal 20% der Zellen starben während der Differenzierung. Hierbei wurde unabhängig davon, ob die Klone aus akut dissoziierten Zellen ohne vorheriges Passagieren oder aus Zellen nach vier Passagen (26 Tage in vitro) erhalten worden waren, identische Ergebnisse erhalten.
  • Zellen mit multipotenten Fähigkeiten wurden in allen Teilen des sich entwickelnden Neuroepithels gefunden. Unter identischen Kulturbedingungen konnten ähnliche Zellen aus anderen Regionen des sich entwickelnden ZNS, umfassend Großhirnrinde, Striatum, Septum, Diencephalon, Mesencephalon, Rautenhirn und Wirbelsäule, hergestellt werden. Wenn sie klonal expandiert wurden, enthielten nahezu alle Klone mehrere Zelltypen, welche sowohl über die Morphologie als auch über die Antigenexpression definiert waren, wobei Neuronen 50% des Klons bildeten.
  • Proliferierende Klone der multipotenten Zellen enthielten eine einheitliche Morphologie sowie einheitliche Antigenexpressionsmuster. Dennoch erfolgte eine rasche Trennung neuronaler und nicht-neuronaler Morphologie innerhalb von 24 Stunden und lediglich nach Entzug des Mitogens. Die frühen Neuronen waren gleichmäßig in allen Teilen des Klons ohne offensichtliche Polarität oder Lokalisierung verteilt, was auf die Abwesenheit vorbestimmter neuronaler Vorläuferzellen während der klonalen Expansion schließen lässt. Darüber hinaus stieg die Anzahl an Neuronen mit steigender Klongröße linear an und betrug in reproduzierbarer Weise 50% des Klons (1B).
  • Um weiterhin zu bestimmen, ob expandierende Klone aus proliferierenden, vorbestimmten Vorläuferzellen bestehen, wurden Klone aufgenommen und erneut ausplattiert. 10-15% der Zellen führten zu Klonen der zweiten Generation. Wiederum enthielten alle Subklone Neuronen, Astrozyten, Oligodendrozyten sowie nicht-gefärbte Zellen (Tabelle II). Insbesondere ist die Zelltypzusammensetzung von Subklonen, welche aus den drei unabhängigen Klonen HI6, HI8 und HI19 erhalten wurden, in Tabelle II dargestellt. Es wurde eine Gesamtzahl von 84 Subklonen aus 13 unabhängigen parentalen Klonen in zwei separaten Experimenten quantitativ bestimmt. Es wird lediglich eine partielle Liste präsentiert. Der Gesamtdurchschnitt gibt die durchschnittliche Zusammensetzung eines jeden Zelltyps der 84 Subklone an. Kein Subklon bestand aus lediglich einem Zelltyp. Diese Daten deuten darauf hin, dass die multipotenten Vorläuferzellen symmetrische Teilungen vollziehen, wobei Tochterzellen mit multipotenten Fähigkeiten erzeugt werden.
  • 4. Isolierung, Propagierung, Differenzierung und Analyse von ZNS-Stammzellen aus adultem Rattenhirn
  • Die subependymale Schicht aus adultem Rattenhirn enthält mitotische, Nestin-positive Zellen, welche in Gegenwart von epidermalem Wachstumsfaktor (EGF), nicht jedoch in Gegenwart von bFGF15, in Aggregatkulturen expandiert werden konnten. Einige der Zellen in den Aggregaten zeigten neuronale und astrozytische Eigenschaften. Um ihre Entwicklungsfähigkeit stärker zu definieren, wurde die mitotische Population (1% von 1 × 105 Zellen/Gehirn), welche das laterale Ventrikel des Striatums von adulten Ratten säumte, in Gegenwart von bFGF expandiert und mit den embryonalen Vorläuferzellen verglichen. Vorderhirnschnitte aus 250 g schweren adulten Rattengehirnen (10-20 pro Experiment) wurde präpariert, wobei die subependymale Region des Striatums, welche die lateralen Ventrikel säumte, unter dem Mikroskop in mit Sauerstoff angereichertem HBSS herausgeschnitten wurde. Die Zellen wurden durch 10-minütiges Inkubieren von zerkleinertem Gewebe bei Raumtemperatur mit Trypsin (1 mg/ml), Hyaluronidase (0.7 mg/ml) und Kynurensäure (0.2 mg/ml) in mit Sauerstoff angereichertem HBSS dissoziiert. Sie wurden einmal in HBSS mit 0.7 mg/ml Ovomucoid und 0.2 mg/ml Kynurensäure gewaschen, resuspendiert, und in der gleichen Lösung mechanisch trituriert. Dissoziierte Zellen wurden mittels Zentrifugation gewonnen und in dem serumfreien Medium plus bFGF (10 ng/ml) kultiviert, wie für die embryonalen Zellen beschrieben.
  • Die Morphologie und Wachstumscharakteristiken der Nestin-positiven adulten Zellen waren ähnlich jenen von embryonalen Zellen. Im Anschluss an den Entzug von bFGF differenzierten markierte Klone zu mehreren Zelltypen, welche MAP2, TuJ1, GFAP und GalC exprimierten (3B und D). Auffällig war, dass in differenzierten Klonen adulter Zellen und in den embryonalen Klonen der gleiche hohe Anteil an Neuronen gefunden wurde (Tabelle III). Insbesondere zeigt Tabelle III die Zelltypzusammensetzung differenzierter Klone, welche aus adulten subependymalen Zellen stammen. 23 Klone aus drei unabhängigen Experimenten wurden quantitativ bestimmt.
  • 5. Isolierung, Propagierung, Differenzierung und Analyse von ZNS-Stammzellen aus embryonalen und adulten Rattenhirnen
  • Akut dissoziierte Zellen aus verschiedenen Regionen des embryonalen Gehirns wurden in Gegenwart von entweder EGF (20 ng/ml) oder bFGF (10 ng/ml) unter identischen Bedingungen kultiviert, wie sie vorstehend beschrieben sind. Akut dissoziierte adulte Zellen wurden wie vorstehend beschrieben präpariert und unter identischen Bedingungen wie die embryonalen Zellen kultiviert. Der mögliche Effekt der ursprünglichen Zelldichte auf die mitogene Reaktion wurde durch Variieren der ursprünglichen Zelldichte von 1 × 104 bis 2.5 × 106 pro Platte untersucht. Bei geringer Dichte wurde die Wirksamkeit der Koloniebildung gemessen; bei hoher Dichte wurden die mitotischen Zellen pro Feld gezählt, welche BrdU+/Nestin+ waren. Mit EGF und bFGF expandierte Kolonien wurden ebenfalls durch Entzug der Mitogene einer Differenzierung unterzogen, und die Zelltypen wurden wie vorstehend beschrieben analysiert.
  • Unter den Kulturbedingungen dieser Beispiele stellte EGF ein gleichermaßen effektives Mitogen für adulte Zellen dar wie bFGF (1C), wobei Klone, wenn sie einer Differenzierung unterzogen worden waren, zu allen drei Zelltypen führten. Mit EGF expandierte embryonale Klone, ob mit oder ohne Passagieren, differenzierten ebenfalls zu allen drei Zelltypen. Im Gegensatz zu adulten Zellen war EGF als Mitogen für embryonale Zellen aus mehreren unterschiedlichen Regionen, unabhängig von der ursprünglichen Zelldichte, allerdings mindestens 10-fach weniger effektiv als bFGF (1C). Mit Ausnahme der proliferativen Effekte von EGF machen diese Daten somit deutlich, dass die multipotenten Zellen aus embryonalem und adultem ZNS auffallend ähnlich sind. TGFα (10 ng/ml) stellte für die multipotenten Zellen ebenfalls ein Mitogen dar und war von EGF nicht zu unterscheiden, während aFGF (10 ng/ml) in Gegenwart von Heparin (1 μg/ml) die Effekte von bFGF nachahmte.
  • 6. Gesteuerte Differenzierung von ZNS-Stammzellen aus embryonalem und adultem Rattenhirn
  • Die klonale Analyse lässt darauf schließen, dass die multipotenten Vorläuferzellen vor dem Entzug von Mitogen nicht vorbestimmt sind, und folglich extrazelluläre Signale die Bestimmung des Zelltyps regulieren können. Wir haben untersucht, ob der Anteil der Zelltypen, welche innerhalb eines Klons erzeugt werden, mittels Wachstumsfaktoren und Cytokinen entweder während der Proliferation oder während der Differenzierung beeinflusst werden kann.
  • Der Einfluss von Wachstumsfaktoren auf die Ausprägung des Zelltyps wurde dadurch untersucht, dass sie der Kultur 2 Tage vor dem Entzug von bFGF und während den 6 Tagen der Differenzierung hinzugefügt wurden. Die Faktoren wurden täglich hinzugefügt, und das Medium wurde alle 2 Tage ausgetauscht. Am Ende der 6 Tage wurden die Klone im Hinblick auf ihre Zelltypzusammensetzung durch Doppelfärbung, wie es vorstehend beschrieben ist, analysiert. Die Endkonzentrationen der Faktoren betrugen 10 ng/ml PDGF-AA, -AB oder -BB, 10 ng/ml CNTF, und 3 ng/ml T3.
  • In embryonalen Klonen erhöhte sich der Anteil an Neuronen in Gegenwart von PDGF (10 ng/ml, -AA, -AB oder BB) während der Differenzierung signifikant. Bis zu 80% der Zellen waren bei einer Expression von MAP2, Tau, TuJ1 oder NF-M neuronal, und eine geringere Anzahl an Zellen exprimierte O4, GalC und GFAP (3E und F, Tabelle IV). Insbesondere zeigt Tabelle IV die durchschnittliche klonale Zusammensetzung eines jeden Zelltyps, welcher erhalten wurde, wenn die Klone für 6 Tage entweder in Abwesenheit (unbehandelt) oder in Gegenwart unterschiedlicher Faktoren einer Differenzierung unterzogen worden waren. Klonplatten wurden aus Zellen nach 0-3 Passagen hergestellt. Die Klongröße lag im Bereich von 17 bis 5336 Zellen. Differenzierte Zelltypen wurden wie vorstehend beschrieben analysiert.
  • Die Zellen, welche die neuronalen Antigene exprimierten, zeigten unter diesen Bedingungen eine weniger reife Morphologie. Wenn sie mit ciliärem neurotrophem Faktor (CNTF) behandelt worden waren, führten die Klone nahezu ausschließlich zu Astrozyten (3G und H, Tabelle IV). Bemerkenswerterweise waren unter diesen Bedingungen weniger als 1% der Zellen MAP2-positiv. Die mit CNTF behandelten Zellen waren intensiv GFAP-positiv und zeigten allesamt eine flache astrozytische Morphologie. LIF zeigte identische Effekte wie CNTF.
  • Thyroidhormon, Triiodthyronin (T3), beeinflusste die Differenzierung der multipotenten Vorläuferzellen in Richtung eines gemischten glialen Schicksals (3I und J, Tabelle IV). Astrozyten und Oligodendrozyten waren beide jeweils 3-fach erhöht, wobei eine merkliche Verringerung des Anteils an Neuronen beobachtet wurde. Wie in den unbehandelten Klonen zeigten GalC- und O4-positive Zellen charakteristische Oligodendrozytenmorphologien. Die Klone wiesen in allen Experimenten eine ähnliche Größe auf, wobei eine numerische Analyse der toten Zellen zeigte, dass ein selektiver Zelltod nicht für die Veränderungen des Anteils der Zelltypen verantwortlich sein kann. Ähnliche Ergebnisse wurden mit multipotenten Stammzellen aus embryonalem Cortex und Striatum erhalten. Darüber hinaus zeigten die aus der subependymalen Schicht des adulten Gehirns stammenden multipotenten Zellen quantitativ ähnliche Differenzierungsreaktionen auf PDGF, CNTF und T3 (3, Tabelle IV). Dies unterstreicht die allgemeine Natur dieser Signalwege.
  • Andere Faktoren, welche während dieser Studie untersucht wurden und keinen aufschlussreichen signifikanten Effekt im Hinblick auf die Zelltypbestimmung zeigten, waren: NGF, NT-3, BDNF, TGFb1, IL1b, IL2-11, G-CSF, M-CSF, GM-CSF, Oncostatin M, Stammzellenfaktor, Erythropoietin, Interferon gamma, 9-cis und all-trans-Retinolsäure, Retinylacetat, Dexamethason und Corticosteron.
  • 7. Isolierung, Expansion, Differenzierung und Analyse von ZNS-Stammzellen aus humanem fötalem Gehirn
  • Gewebe aus verschiedenen Regionen von humanen fötalen Gehirnen wurden aus Föten einer Tragzeit von 45 bis 114 Tagen erhalten. Die Gewebe wurden in HBSS durch mechanisches Triturieren dissoziiert, wie vorstehend beschrieben. Die Zellen wurden mittels Zentrifugation gesammelt, resuspendiert, mit 1 × 106 Zellen pro 10 cm-Platte ausplattiert, und in dem serumfreiem Medium plus 10 ng/ml bFGF unter Bedingungen expandiert, welche identisch zu den vorstehend für fötale ZNS-Stammzellen aus Nagern beschriebenen Bedingungen waren.
  • Etwa 25-50% der humanen Zellen, abhängig vom Alter und der Region, wiesen die Morphologie von ZNS-Stammzellen auf und sprachen auf bFGF mit schneller Zellteilung an. Humane ZNS-Stammzellen wurden in Kultur für bis zu 36 Tage expandiert. Die durchschnittliche Verdopplungszeit betrug etwa 48 Stunden, welche im Gegensatz zu einer Verdopplungszeit von 24 Stunden bei den als Pendant untersuchten Nagern steht. Nach dem Entzug von bFGF erfolgte eine rasche Differenzierung humaner fötaler ZNS-Stammzellen, wobei mehrere Zelltypen entstanden. In Kulturen mit hoher Dichte wurden die Zellen für bis zu 13 Tage einer Differenzierung unterzogen, wobei die anschließend vorhandenen Zelltypen unter Verwendung von Immunzytochemie analysiert wurden, wie für Zellkulturen von Nagern beschrieben. Vor der Differenzierung durch Entzug von bFGF war in der Kultur eine geringe Anzahl an Tau-positiven Neuronen vorhanden (4). Im Gegensatz hierzu waren nach dem Entzug von bFGF bis zu 40% der mit bFGF expandierten humanen fötalen Gehirnzellen in der Massenkultur Neuronen, welche eine Immunreaktion mit humanspezifischem anti-Tau-Antiserum zeigten. Eine Mehrheit der Tau-positiven Neuronen in der Kultur konnte mit BrdU (Bromdesoxyuridin), dem Mitoseindikator, innerhalb von 24 Stunden vor dem Entzug von bFGF markiert werden (5C und D). Dieses Ergebnis belegt, dass die für ZNS-Stammzellen von Nagern definierten Kulturbedingungen gleichermaßen gut für eine effiziente Expansion und Differenzierung humaner ZNS-Stammzellen angewendet werden können, um in Kultur eine große Anzahl an Neuronen zu erzeugen.
  • Um die Multipotenz der humanen fötalen ZNS-Stammzellen in Massenkultur weiter zu analysieren, wurden sich teilende Zellen in klonaler Dichte (100-200 Zellen pro 10 cm-Platte) ausplattiert und für 20 Tage weiter expandiert (Klongröße = 210). Anschließend wurden die Klone durch Entzug von bFGF einer Differenzierung unterzogen und im Hinblick auf Zelltypen analysiert, welche eine Immunreaktion mit Neuronen-, Astrozyten-, oder Oligodendrozyten-spezifischen Antikörpern zeigen. Nahezu alle klonal expandierten humanen fötalen Zellen differenzierten, wobei alle drei Zelltypen – Neuronen, Astrozyten und Oligodendrozyten – entstanden (5E und F). Wie bei Stammzellen von Nagern umfassten MAP2-positive Neuronen etwa 50% des Klons (Tabelle V). Die verbleibenden Zellen wiesen eine stark gestreckte gliale Morphologie auf. Etwa 10% der Zellen exprimierten das reife astrozytische Antigen GFAP, und etwa 2% exprimierten die oligodendrozytischen Antigene O4 oder Galactocerebrosid (GalC) (Tabelle V). Diese klonale Analyse belegt folglich, dass das hier beschriebene Kultursystem eine effiziente Isolierung, Expansion bezüglich der Masse, sowie Differenzierung von multipotenten Stammzellen aus humanem fötalem ZNS gestattet.
  • 8. Gesteuerte Differenzierung von ZNS-Stammzellen aus humanem fötalem Gehirn
  • Zusätzlich zur Multipotenz und den selbsterneuernden Eigenschaften von ZNS-Stammzellen stellt die Fähigkeit zur Differenzierung zu einem Zelltyp in Reaktion auf ein extrazelluläres Signal die wesentliche definierende Eigenschaft der ZNS-Stammzellen von Nagern dar, wie vorstehend gezeigt. Die drei extrazellulären Faktoren PDGF, CNTF und T3 steuerten auch die Differenzierung der humanen ZNS-Zellklone in identischer Art und Weise (Tabelle V; 6A-D). Folglich erhöhte sich die Anzahl der MAP2-positiven neuronalen Zellen in Gegenwart von PDGF auf 71% eines Klons, was einen signifikant höheren Wert darstellt als die 46% in der unbehandelten Kontrollkultur. Im Gegensatz hierzu verringerte sich die Anzahl der MAP2-positiven Zellen in Gegenwart von CNTF, und die Anzahl der GFAP-positiven Astrozyten erhöhte sich dramatisch auf 85% der Klone. T3 erhöhte die Anzahl an O4- oder GalC-positiven oligodendroglialen Zellen sowie an GFAP-positiven astroglialen Zellen, während sich die Anzahl der MAP2-positiven Neuronen verringerte (Tabelle V). Diese Ergebnisse belegen quantitativ die Ähnlichkeit zwischen humanen ZNS-Stammzellen und den ZNS-Stammzellen von Nagern sowie die allgemeine Anwendbarkeit des vorliegenden Kultursystems für eine effiziente Expansion und Differenzierung der ZNS-Stammzellen von Säugern.
  • 9. Reifung, Synaptogenese und Diversität von aus Stammzellen stammenden Neuronen in vitro
  • Die Multipotenz von ZNS-Stammzellen und ihre gesteuerte Differenzierung durch definierte extrazelluläre Signale belegten zweifelsfrei, dass Neuronen direkt aus Stammzellen stammen. Folglich liegt der Ursprung neuronaler Diversität, welche in reifem Gehirn beobachtet wird, in den ZNS-Stammzellen. Können die in Kultur expandierten ZNS-Stammzellen für einen längeren Zeitraum die Fähigkeit zur Reifung aufrechterhalten, um eine axonal-dendritische Polarität auszubilden, um mit anderen Zellen wechselzuwirken und um Synapsen zu bilden? Um das Ausmaß zu untersuchen, in welchem aus ZNS-Stammzellen stammende Neuronen in vitro unter serumfreien Bedingungen reifen können, ließ man aus embryonalem Hippocampus von Ratten stammende Stammzellen für bis zu 21 Tage bei hoher Dichte differenzieren.
  • Anschließend wurden die Neuronen mit verschiedenen Antikörpern, welche entweder Axon- oder Dendriten-spezifische Proteine erkennen, gefärbt. Synapsin, Synaptophysin, Synaptobrevin und Syntaxin stellen Proteine dar, welche in den synaptischen Vesikeln reifer Neuronen an den Axonenden vorkommen und an der Exozytose von Neurotransmittern beteiligt sind. Alle vier Proteine waren in den aus Stammzellen stammenden Neuronen in punktförmigen Mustern, welche höchstwahrscheinlich die Axonenden beschreiben, in hohem Maße co-lokalisiert. Die die synaptischen Vesikelproteine tragenden Fortsätze waren dünn, hoch kompliziert, überwanden eine große Entfernung, und zierten den Perimeter benachbarter Neuronen (7G). Sie enthielten Axon-spezifische Proteine wie beispielsweise Tau und Neurofilament und waren frei von Dendriten-spezifischen Proteinen wie beispielsweise MAP2a und MAP2b (7H und 7I).
  • Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass die aus Stammzellen stammenden Neuronen, ähnlich wie in vivo erzeugte Neuronen, eine angemessene Axon-Dendrit-Polarität zeigen und eine synaptische Aktivität aufweisen. Die aus Stammzellen stammenden Neuronen exprimierten darüber hinaus bedeutende Neurotransmitter-Rezeptoren, Transporter sowie Prozessierungsenzyme, welche für die Funktionen der Neurotransmitter von Bedeutung sind. Diese umfassten Mitglieder von Glutamat-Rezeptoren, GABA-Rezeptoren und Dopamin-Rezeptoren (8). Darüber hinaus behalten die Stammzellen ihre Fähigkeit zur Erzeugung von Neuronensubtypen mit molekularen Unterschieden zwischen den Subtypen bei.
  • 10. In vitro-Erzeugung von allen in reifem Gehirn vorkommenden neuronalen Subtypen durch Differenzierung von ZNS-Stammzellen
  • Das Verständnis der molekularen Programme, welche die Organisation der komplexen neuronalen Diversität im adulten Gehirn von Säugern steuern, stellt ein bedeutendes Ziel der Entwicklungsneurobiologie dar. Die meisten der strukturellen Domänen im adulten Gehirn und Subpopulationen postmitotischer Neuronen, welche diese umfassen, werden während der Embryonalentwicklung erzeugt. Die Entwicklungseigenschaften der unmittelbaren Vorläuferzellen, welche zu spezifischen Neuronen führen, sind allerdings größtenteils unbekannt. Darüber hinaus sind auch das genaue Differenzierungsstadium sowie das allgemeine molekulare Prinzip, mittels welchem Neuronen ihre Neurotransmitterphänotypen erlangen, unklar.
  • Eine sich herausbildende Beweisführung ist, dass von frühen Entwicklungstadien an dem Neuralrohr und den Gehirnvesikeln durch räumliche und zeitliche Expression einer Reihe nukleärer und sekretierter Proteine ein Muster zukommt58,59. Dieser Beweis steht im Einklang mit der Hypothese, dass das frühe Neuroepithel aus vorbestimmten Vorläuferzellen besteht und dass die Organisation von reifem Cortex beispielsweise von einem vorbestimmten frühen „Proto-Cortex" herrührt60. Die Vorstellung von einem vorbestimmten Neuroepithel steht allerdings im Konflikt mit anderen Beobachtungen aus in vivo durchgeführten Fate-Mapping-Studien und Transplantationsstudien5,61-63. Eine Haupterkenntnis aus diesen Experimenten ist, dass (eine) bestimmte Vorläuferpopulation(en) in Bezug auf neuronale Linien im Vergleich zu glialen Linien sowie in Bezug auf neuronale Phänotypen wie beispielsweise Neurotransmitter-Phänotypen und laminare oder regionale Bestimmung multipotent und/oder weitestgehend plastisch ist/sind. Um diese zwei Gruppen scheinbar unvereinbarer Beobachtungen in Einklang zu bringen, müssen mehrere bedeutende Gesichtpunkte berücksichtigt werden. Was ist die Differenzierungsfähigkeit der Vorläuferzelle, welche direkt zu terminal differenzierten Neuronen führt? Welche Information, sofern vorhanden, enthält die Vorläuferzelle in Bezug auf den spezifischen Phänotyp der Neuronen?
  • Um diese Fragen zu beantworten, haben wir erfolgreich multipotente Vorläuferzellen, ZNS-Stammzellen, aus dem frühen Neuroepithel von Ratten isoliert und quantitativ deren Differenzierungsfähigkeit in vitro64 untersucht (siehe auch Beispiele 1-3, 5 und 6). Unter konstitutiven Bedingungen ohne exogenen Einfluss differenzierten ZNS-Stammzellklone zu allen drei bedeutenden Zelltypen – Neuronen, Astrozyten und Oligodendrozyten. In Gegenwart einzelner extrazellulärer Faktoren konnte ihr Schicksal allerdings in Richtung einzelner Zelltypen gesteuert werden. Darüber hinaus stellten derartige multipotente Stammzellen in Kultur bei weitem die Mehrheit expandierbarer Populationen dar, was darauf schließen lässt, dass sie im Neuroepithel reichlich vorhanden sind. Diese Eigenschaften werden auch von ZNS-Stammzellen aus humanem fötalem Gehirn geteilt. Folglich stellen dies die definierenden Eigenschaften der ZNS-Stammzellen von Säugern dar, welche die Mehrheit des embryonalen ZNS bilden und die direkten Vorläuferzellen von Neuronen des adulten Gehirns darstellen.
  • Was ist dann die Entwicklungsfähigkeit multipotenter ZNS-Stammzellen in Bezug auf neuronale Phänotypen? In diesem Beispiel untersuchten wir das Ausmaß an Information, welche in die isolierten ZNS-Stammzellen eingebettet ist, um die terminale Differenzierung und Reifung von Neuronen zu steuern und um spezifische Subpopulationen von Neuronen zu erzeugen. Wir stellten fest, dass aus einer bestimmten Region stammende ZNS-Stammzellen, obwohl ZNS-Stammzellen in großer Anzahl in allen Teilen des Neuroepithels weit verbreitet und in Bezug auf die drei wesentlichen Zelltypen gleichermaßen multipotent sind, zu neuronalen Phänotypen führen, welche lediglich für jene Region zweckmäßig sind. Wir schließen hieraus, dass die Information, welche regionspezifische neuronale Phänotypen spezifiziert, im multipotenten Stammzellzustand vorhanden ist, dass diese Information durch viele Zellteilungen in vitro stabil vererbt wird, und dass ZNS-Stammzellen, wenn sie unter konstitutiven Bedingungen in Abwesenheit äußerer Einflusse einer Differenzierung unterzogen werden, nicht äquivalent sind und jede von ihnen lediglich zu begrenzten Gruppen von Neuronen führt, welche für die Region zweckmäßig sind, in welcher die ZNS-Stammzellen ihren Ursprung haben.
  • In den Beispielen 1-3, 5 und 6 beschränkten wir die Differenzierung von ZNS-Stammzellklonen ausschließlich auf den frühesten Reifungszeitpunkt, bei welchem alle drei zellulären Phänotypen, d. h. Neuronen, Astrozyten und Oligodendrozyten, ohne signifikante Ausmaße an Zelltod erprobt werden konnten. Daher wurde die neuronale Differenzierung ausschließlich auf Frühstadien der Differenzierung beschränkt. Wir entschieden uns, zu untersuchen, in welchem Ausmaß aus ZNS-Stammzellen stammende Neuronen in vitro unter konstitutiven Bedingungen, d. h. in serumfreiem, definiertem Minimalmedium in Abwesenheit exogener Faktoren, differenzieren können.
  • Die neuronale Differenzierung umfasst viele verschiedene Phasen der zellulären Reifung. Eine der frühesten Eigenschaften eines zu erwartenden funktionsfähigen Neurons ist die Polarisation eines Neurons in verschiedene Kompartimente, d. h. Soma, Dendrit und Axon. Wir untersuchten verschiedene definierte Kulturbedingungen, um die Differenzierung von Klonen multipotenter ZNS-Stammzellen zu polarisierten Neuronen zu fördern. Unter klonalen Bedingungen stellten wir fest, dass die Überlebensfähigkeit von Neuronen zu beschränkt ist, um eine systematische Charakterisierung später Phänotypen der neuronalen Differenzierung zu gestatten. Interessanterweise konnte die Zugabe verschiedener kommerziell erhältlicher neurotropher Faktoren, umfassend NGF- und FGF-Familien, dieses Hindernis nicht überwinden.
  • Allerdings war eine einfache Erhöhung der Zelldichte differenzierender ZNS-Stammzellen für ein effektives Überleben der Neuronen ausreichend, wobei polarisierte Neuronen mit reifer Morphologie nach 14-21 Tagen in N2-Medium in Abwesenheit von Glutamat und jeglichen anderen exogenen Faktoren in reproduzierbarer Weise erhalten werden konnten. Obwohl es nicht unbedingt notwendig war, begünstigte eine gelegentliche Ergänzung der Kultur mit aus Gehirn stammendem neurotrophen Faktor (BDNF) das Langzeitüberleben der Neuronen im Allgemeinen zusätzlich und wurde daher in diesem Beispiel verwendet.
  • Insbesondere wurden ZNS-Stammzellen unter definierten Bedingungen, wie sie vorstehend in den Beispielen 1-3, 5 und 6 beschrieben sind, isoliert und expandiert. Unterschiedliche Neuronen wurden durch Isolieren von ZNS-Stammzellen aus unterschiedlichen Regionen des zentralen Nervensystems und aus unterschiedlichen Entwicklungsstadien des ZNS erhalten. Die Differenzierungsbedingungen zur Erlangung aller neuronalen Phänotypen waren identisch, wobei unterschiedliche Neuronen lediglich dadurch erhalten wurden, dass man die Expression inhärenter Informationen ermöglichte, welche bereits in den expandierten ZNS-Stammzellen eingebettet waren.
  • Insbesondere wurde die Differenzierung im letzten Mitosezyklus offen durch Entzug des Mitogens, z. B. bFGF, ausgelöst, indem das Wachstumsmedium durch mitogenfreies Medium ersetzt wurde. Gleichzeitig, oder einige Tage später ohne jegliche unterschiedliche Auswirkungen, wurden die Zellen durch Trypsinierung und Zentrifugation gemäß herkömmlichen Verfahren geerntet. Trypsin wurde durch Hinzufügen von Trypsin-Inhibitor inaktiviert. Das resultierende Zellpellet wurde ohne bFGF oder irgendeinen anderen Faktor in dem gleichen N2-Wachstumsmedium resuspendiert und bei hoher Zelldichte, optimalerweise mit 125 000 Zellen pro Quadratzentimeter, auf Gewebekulturplatten, welche mit Poly-L-Ornithin (15 μg/ml) und Fibronektin (1 μg/ml) oder Laminin (1 μg/ml) vorbeschichtet waren, ausplattiert. Zwei bis vier Tagen später wurde das N2-Medium durch N2-Medium ohne Glutaminsäure ersetzt. Die hohe Zelldichte war für eine effiziente Differenzierung der Neuronen erforderlich, wobei die Abwesenheit von Glutaminsäure erforderlich war, um ein Langzeitüberleben der reifen Neuronen zu ermöglichen.
  • Die Neuronen wurden für längere Zeiträume (bis zu 30 Tage) unter diesen Bedingungen gehalten, wobei das Medium alle 3-4 Tage ausgetauscht wurde. Eine Ergänzung des Mediums mit 20 ng/ml an rekombinantem humanem BDNF begünstigte das Überleben und die Reifung der Neuronen zusätzlich. Nach 12-30 Tagen der Differenzierung wurden die Zellen mit 4% Paraformaldehyd fixiert, und wurden die neuronalen Phänotypen unter Verwendung von Immunzytochemie mittels Markerproteinen identifiziert.
  • Um direkt zu belegen, dass die reifen Neuronen und verschiedene Subtypen von Neuronen in Kultur direkt von den mitotischen ZNS-Stammzellen produziert worden waren, wurden ZNS-Stammzellen aus verschiedenen Regionen des embryonalen Gehirns (siehe unten für Beispiele), welche in vitro über einen längeren Zeitraum expandiert worden waren (etwa 16 Tage und 16 Zellteilungen verteilt über 4 Passagen), für eine Gesamtdauer von 21 Tagen offen einer Differenzierung unterzogen, wie vorstehend beschrieben ist. Mitotische ZNS-Stammzellen wurden mit Bromdesoxyuridin (BrdU) für die letzten 24 bis 48 Stunden vor der Differenzierung pulsmarkiert. Aus allen Regionen waren bis zu 86% der MAP2ab-positiven Neuronen auch BrdU-positiv. Durch 24-stündiges Markieren mit BrdU waren etwa 50%-75% der Neuronen, welche in Bezug auf die für unterschiedliche neuronale Subtypen spezifischen Antigene immunpositiv waren, auch BrdU-positiv. Vor dem offenen Differenzierungsschritt wurden keine Neuronen, welche MAP2ab oder irgendwelche anderen Subtypen-spezifischen Antigene exprimierten, in einer der ZNS-Stammzellkulturen beobachtet. Im Einklang mit den vorhergehenden Beispielen (Beispiele 1-8) wurden folglich alle nachstehend angegebenen Neuronen und neuronalen Subtypen ausschließlich von mitotischen ZNS-Stammzellen produziert, welche über einen längeren Zeitraum expandiert worden waren.
  • Auf diese Weise erhaltene Neuronen zeigten eine unterschiedliche Lokalisierung dendritischer Proteine wie beispielsweise MAP2ab aus axonalen Proteinen, wie beispielsweise Tau, Neurofilamenten und mehreren synaptischen Vesikelproteinen. In 9 sind typische Neuronen dargestellt, welche aus embryonalen hippocampalen Stammzellen von Ratten stammen. Reife Neuronen wurden mit Antikörpern gegen BrdU (9a), MAP2ab (9B) und Synapsin (9C) dreifach immungefärbt. Eine kombinierte Färbung ist in 9D dargestellt.
  • Die 9E und F zeigen ein weiteres typisches Beispiel von Neuronen, welche aus hippocampalen Stammzellen stammen und auf Synaptophysin (9E), ein Axonenden markierendes synaptisches Vesikelprotein, sowie auf MAP2ab (9F), das dendritische Prozesse markiert, doppelgefärbt sind. Diese mittels Immunfärbung erhaltenen Ergebnisse belegen eine Polarisation von Neuronen zu Axonen und Dendriten und lassen in signifikanter Weise auf zahlreiche synaptische Verbindungen schließen. Eine weitere Untersuchung dieser Morphologien unter Verwendung von Elektronenmikroskopie bestätigte die reichliche Anwesenheit von Synapsen, welche synaptische Vesikel und synaptische Dichten enthalten (10).
  • Diese neuronalen Netzwerke waren auch elektrophysiologisch funktionsfähig. Sie übertrugen Aktionspotentiale (11A), enthielten verschiedene spannungssensitive Ionenkanäle (11B), und übertrugen exzitatorische und inhibitorische postsynaptische Potentiale, wenn sie durch Badapplikation des exzitatorischen Neurotransmitters Glutamat hervorgerufen worden waren (11C und D).
  • Folglich belegen diese Ergebnisse zweifelsfrei, dass die gesamte zur Ausbildung reifer Neuronen sowie zur Synaptogenese aus dem mitotischen Zustand erforderliche und ausreichende Information innerhalb der über einen längeren Zeitraum expandierten ZNS-Stammzellen selbst enthalten und stabil ist.
  • Die über einen längeren Zeitraum expandierten ZNS-Stammzellen, welche aus mehreren unterschiedlichen Regionen des Neuroepithels stammen, führten zu verschiedenen Subpopulationen von Neuronen. Folglich wurden die ZNS-Stammzellen aus mehreren unterschiedlichen Regionen des embryonalen ZNS von Ratten zu Zeitpunkten isoliert, von welchen bekannt ist, dass sie am Beginn oder inmitten der Neurogenese stehen – Cortex (CTX), Septum (SEP), lateraler Ganglienhügel (LGE), medialer Ganglienhügel (MGE) und Hippocampus des embryonalen Reifetags 15.5 (E15.5), Thalamus, Hypothalamus des Stadiums E13.5, ventrales und dorsales Mesencephalon des Stadiums E12.5, sowie Wirbelsäulen der Stadien E11.5-E13.5. Aus jeder dieser Regionen konnten nahezu homogene Kulturen von ZNS-Stammzellen für einen längeren Zeitraum (typischerweise für 16 Tage bei einer durchschnittlichen Verdopplungszeit von 24 Stunden) gemäß den vorher beschriebenen Kulturbedingungen expandiert werden.
  • Die allgemeinen Eigenschaften der expandierenden ZNS-Stammzellen, wie beispielsweise Morphologie, Mitoserate und Differenzierungseigenschaften, waren zwischen unterschiedlichen Regionen, umfassend Hippocampus, nicht zu unterscheiden, wie vorstehend ausführlich beschrieben wurde64. Gemäß einer klonalen Analyse enthält jede dieser Regionen viele ZNS-Stammzellklone mit multipotenter Fähigkeit zur Differenzierung zu Neuronen, Astrozyten und Oligodendrozyten in relativen Anteilen, welche mit den vorher ausführlich für hippocampale Stammzellklone64 beschriebenen Anteilen identisch sind.
  • Die zwingende Frage ist nunmehr, ob es lediglich eine Art von Stammzellen gibt, welche das gesamte Neuroepithel bilden, und die regionale Ausprägung und neuronale Diversität in nachfolgenden Entwicklungsstadien erfolgt, oder ob die ZNS-Stammzellen im multipotenten Stadium die Information für regional verschiedene neuronale Phänotypen enthalten.
  • Lateraler und medialer Ganglienhügel stellen zwei eng benachbarte Strukturen dar, welche sich parallel in das Striatum und den Globus Pallidus des adulten Gehirns hineinentwickeln. Die Dopamin-Rezeptoren D1 und D2 werden im Striatum exprimiert; im Pallidus ist jedoch lediglich D2 vorhanden. Die Expression von D1- und D2-Rezeptoren in ZNS-Stammzellen, welche aus lateralem und medialem Ganglienhügel des Stadiums E16 isoliert worden waren, wurden unter Verwendung von RT-PCR untersucht (12). Vor der Differenzierung exprimierten ZNS-Stammzellen aus jeder der Regionen keine Dopamin-Rezeptoren. Nach 9 Tagen der Differenzierung wurden D1- und D2-Rezeptoren in aus LGE stammenden Stammzellen exprimiert; in Zellen aus dem MGE wurde jedoch lediglich D2-Rezeptor exprimiert. Dieses Differenzierungsmuster war während des gesamten Differenzierungsverlaufs bis zu einer untersuchten Dauer von 21 Tagen stabil (12).
  • Cholinerge Neuronen des Septums sind mit dem Auftreten von Alzheimer in kritischer Art und Weise in Verbindung gebracht worden. Diese Neuronen treten in Ratten während der Stadien E15-E18 in Erscheinung. ZNS-Stammzellen, welche aus Septum des Stadiums E16 stammten, wurden für 18-21 Tage unter den vorstehend beschriebenen definierten Bedingungen einer Differenzierung unterzogen, und die Anwesenheit cholinerger Neuronen wurde unter Verwendung von Acetylcholinesterase-Histochemie sowie mittels Immunfärbung auf Acetylcholintransferase und vesikulären Acetylcholintransporter bestimmt. 13A zeigt ein septales, aus ZNS-Stammzellen stammendes cholinerges Neuron, welches auf Acetylcholintransferase immungefärbt wurde. 13B zeigt das gleiche Gesichtsfeld wie 13A, welches auf die mitotische Markierung BrdU gefärbt wurde. Die 13C und D zeigen ein weiteres Beispiel eines cholinergen Neurons, welches auf vesikulären Acetylcholintransporter bzw. auf BrdU doppelgefärbt wurde.
  • Tabelle VII fasst die Anzahl der MAP2ab-positiven Neuronen pro Quadratzentimeter sowie die Anteile unterschiedlicher neuraler Phänotypen in Bezug auf die Gesamtzahl an MAP2ab-positiven Neuronen, welche aus ZNS-Stammzellen mehrerer unterschiedlicher Regionen und unterschiedlichen Alters stammten, zusammen. Etwa 4-5% der MAP2-positiven Neuronen waren cholinerg. Im Gegensatz hierzu führten hippocampale und cortikale ZNS-Stammzellen zu keinen cholinergen Neuronen.
  • Etwa 0.4% der Neuronen, welche aus ZNS-Stammzellen des LGE und MGE stammten, exprimierten auch vesikulären Acetylcholintransporter, einen spezifischen Marker für cholinerge Neuronen (Tabelle VII). Etwa 2.8% bis 10.7% der aus LGE und MGE stammenden Neuronen enthielten mehrere unterschiedliche Neuropeptide, wie beispielsweise Neuropeptid Y, Met-Enkephalin und Leu-Enkephalin (14; Tabelle VII). Die 14A, C und D zeigen typische, aus ZNS-Stammzellen des LGE stammende Neuronen, welche auf Neuropeptid Y, Met-Enkephalin und Leu-Enkephalin gefärbt wurden. Die 14B, D und F zeigen die Immunfärbung der gleichen Felder wie jene in den 14A, C bzw. E auf BrdU.
  • Wurden ZNS-Stammzellen, welche aus ventralem Mesencephalon des Stadiums E12.5 expandiert worden waren, einer Differenzierung unterzogen, so exprimierten etwa 2.6 ± 0.3% der MAP2-positiven Neuronen Tyrosinhydroxylase, das Schlüsselenzym der Dopaminsynthese und ein wohlbekannter Marker für dopaminerge Neuronen (Tabelle VII). 15A zeigt ein typisches, aus einer ZNS-Stammzelle stammendes TH-positives Neuron, und 15B zeigt die korrespondierende BrdU-Färbung des gleichen Felds. Alle TH-positiven Zellen sind Neuronen, wie mittels Doppelfärbung auf TH und MAP2ab gezeigt wurde (15C bzw. D). Die meisten der verbleibenden Neuronen waren in Bezug auf den Marker GABAerger Neuronen, Glutaminsäuredecarboxylase (GAD), sowie in Bezug auf GABA selbst (15E) und/oder in Bezug auf Acetylcholinesterase (15F, Tabelle VII), von welcher bekannt ist, dass sie in monoaminergen Neuronen in diesem Bereich exprimiert wird, positiv.
  • Im Gegensatz hierzu erzeugten ZNS-Stammzellen, welche aus dorsalem Mesencephalon stammten, keine TH-positiven Neuronen (Tabelle VII). Nahezu alle Neuronen in diesem Bereich (100.9 ± 9.1%) exprimierten Acetylcholinesterase (Tabelle VII). Sie stellen höchstwahrscheinlich monoaminerge Neuronen dar, was im Einklang mit dem in vivo beobachteten Muster steht. Signifikanterweise entstanden aus ZNS-Stammzellen, welche aus Cortex, Septum, Hippocampus, Striatum und Wirbelsäule stammten, keine TH-positiven Neuronen (Tabelle VII). Neben dem bekannten in vivo-Expressionsmuster war folglich die Erzeugung TH-positiver Neuronen in ZNS-Stammzellen, welche aus dem ventralen Mesencephalon stammten, in vitro einzigartig.
  • ZNS-Stammzellen, welche aus zervikaler und thorakaler Wirbelsäule des Stadiums E13.5 stammten, wurden expandiert und einer Differenzierung unterzogen. 1.2 ± 0.1% der MAP2-positiven Neuronen waren cholinerg und enthielten vesikulären Acetylcholintransporter (Tabelle VII). Cholinerge Neuronen, welche auch Acetylcholintransferase exprimierten und BrdU-positiv waren, sind in den 16C bzw. D dargestellt. 39.3 ± 2.5% der Neuronen exprimierten Acetylcholinesterase (Tabelle VII), wobei angenommen wird, dass die meisten von ihnen monoaminerg sind. Ein typisches Acetylcholinesterase-positives und BrdU-positives Neuron ist in 16A bzw. B dargestellt.
  • Neuronen, welche aus hippocampalen und cortikalen ZNS-Stammzellen des Stadiums E15.5 stammten, exprimierten keine Tyrosinhydroxylase, keine Acetylcholinesterase, keine Acetylcholintransferase und keinen vesikulären Acetylcholintransporter (Tabelle VII). Dies ist für die in vivo bekannte Abwesenheit dieser Marker im Hippocampus angemessen. Etwa 30% der MAP2ab-positiven Neuronen waren GABAerg, was durch die Expression von GAD und GABA angezeigt wurde. Die 17A und B zeigen typische Beispiele einer GAD- bzw. GABA-positiven Färbung, welche vollständig überlappt. Ein typisches hippocampales, Calretinin- und MAP2ab-positives Neuron ist in den 17C bzw. D dargestellt.
  • Reife Neuronen können mit gleicher Effizienz auch aus Thalamus und Hypothalamus des Stadiums E13.5 erhalten werden. Diese Neuronen enthalten außerordentlich lange axonale Fortsätze. Ein typisches thalamisches Neuron, welches auf das axonale Protein Tau und auf BrdU gefärbt wurde, ist in den 18A bzw. B dargestellt. Ein typisches hypothalamisches Neuron, welches auf Tau und BrdU gefärbt wurde, ist in den 18C bzw. D dargestellt. Eine Synapsin-Färbung thalamischer und hypothalamischer Neuronen ist in den 18E bzw. F dargestellt.
  • Die vorstehend angegebenen Beispiele wurden auf Grundlage ausschließlich wohlbekannter in vivo-Populationen, welche in der Literatur verfügbar waren, sowie auch auf Grundlage kommerziell erhältlicher, wohldefinierter Marker ausgewählt. Eine Zusammenfassung der Anteile unterschiedlicher neuronaler Phänotypen, welche aus ZNS-Stammzellen unterschiedlicher Regionen erhalten wurden, ist in Tabelle VII dargestellt. Diese Beispiele stellen lediglich einen Teil der neuronalen Diversität dar, welche in den aus ZNS-Stammzellen stammenden Kulturen vorhanden ist.
  • Zusammenfassend belegen diese Beispiele in schlüssiger Art und Weise, dass in Kultur verschiedene Subpopulationen von Neuronen aus expandierten ZNS-Stammzellen erzeugt werden, und dass die erzeugten Arten von Neuronen in einer regionspezifischen Art und Weise beschränkt sind, welche in etwa den in vivo-Expressionsmustern entspricht. Die Information, welche die Ausprägung des neuronalen Phänotyps bestimmt, ist daher in den multipotenten Stammzellzustand eingebettet. Darüber hinaus ist diese spezifizierende Information über viele Zellteilungen hinweg erblich stabil und erlangt während des nachfolgenden Differenzierungsprozesses Wirkung. Diese Ergebnisse belegen direkt, dass das Neuroepithel von Säugern tatsächlich in ein mosaikartiges Muster unterschiedlicher Arten multipotenter ZNS-Stammzellen mit erblich beschränkten Informationen aufgeteilt ist, welche in Abwesenheit jeglicher anderer Wechselwirkungen die Ausprägung der neuronalen Phänotypen bestimmen. Folglich können alle neuronalen Subtypen, welche im reifen Gehirn von Säugern vorkommen, in vitro durch Differenzieren geeigneter ZNS-Stammzellen erzeugt werden.
  • Diese Neuronen und die zur Differenzierung in derartige Neuronen befähigten ZNS-Stammzellen stellen das Schlüsselelement für Gentherapie, Zelltherapie und die Identifizierung neuer therapeutischer Moleküle (Proteine, Peptide, DNA, Oligonukleotide, synthetische und natürliche organische Verbindungen) bereit, welche auf Störungen des Nervensystems gerichtet sind.
  • SIGNIFIKANZ DER ZNS-STAMMZELLTECHNOLOGIE
  • Das in vitro-Verhalten der Stammzellen stellt bedeutende Einsichten in die Entwicklung des ZNS bereit. Eine effiziente Proliferation und kontrollierte Differenzierung der Vorläuferzellen gestattete eine quantitative Analyse ihrer Entwicklungsfähigkeit. Sie zeigen Eigenschaften, welche man für Stammzellen erwartet: schnelle Proliferation, Multipotenz und Selbstregeneration. Darüber hinaus waren die Zellen aus adultem Gehirn den embryonalen Zellen quantitativ gleichwertig, was darauf hindeutet, dass Stammzellen in einem Erwachsenen fortbestehen.
  • Die multipotenten Zellen konnten aus vielen Regionen des sich entwickelnden ZNS effizient isoliert werden, was darauf hindeutet, dass sie in allen Teilen des Neuroepithels reichlich vorhanden sind. Dies steht im Widerspruch zu der weit verbreiteten Vorstellung, dass Stammzellen selten sind. Eine Differenzierung der Stammzellen kann effektiv mittels extrazellulärer Faktoren gesteuert werden, von welchen bekannt ist, dass sie während der Entwicklung des ZNS vorhanden sind16-23. Dies lässt darauf schließen, dass unterschiedliche extrazelluläre Faktoren auf eine einzelne Klasse von Stammzellen wirken können, wobei unterschiedliche Zelltypen erzeugt werden. Ein ähnlich aufschlussreicher Mechanismus wurde in vitro auch bei Stammzellen beobachtet, welche aus dem peripheren Nervensystem isoliert worden waren24.
  • Mehrere Zelltypen treten rasch in Erscheinung, wenn die Stammzellen in vitro einer Differenzierung unterzogen werden. Im Gegensatz hierzu treten Neuronen, Astrozyten und Oligodendrozyten in vivo zu verschiedenen Zeitpunkten in Erscheinung. Es ist offensichtlich, dass in vivo zusätzliche Mechanismen das Zellschicksal regulieren müssen. Eine zeitliche und räumliche Expression extrazellulärer Faktoren und ihrer Rezeptoren kann ein Teil des Mechanismus sein.
  • Ein weiterer Mechanismus in Bezug auf die Regulierung des Zellschicksals in vivo kann Zwischenstadien der Differenzierung umfassen. Die Identifizierung der bipotenten Oligodendrozyten-Vorläuferzelle O-2A aus postnatalen Sehnerven belegte direkt, dass während der Entwicklung beschränkte Vorläuferzellen produziert werden25,26. Die Stammzellen unterscheiden sich von den O-2A-Zellen. Ihr Ursprung, ihre Eigenschaften sowie ihre Entwicklungsfähigkeit unterscheiden sich. Wenn man bedenkt, dass die Stammzellen zu Oligodendrozyten differenzieren, kann der Differenzierungsweg eine obligatorische Zwischenstufe, einen vorbestimmten Vorläuferzellenzustand wie beispielsweise die O-2A-Zelle, umfassen. Die ähnliche Reaktion beider Zellen auf T3 und CNTF27,28 spiegelt diesen gemeinsamen Schritt möglicherweise wider.
  • Aus in vivo und in vitro durchgeführten Linienanalysen gibt es darüber hinaus Beweise für das Vorliegen anderer linienbedingter Beschränkungen, umfassend bipotente neuronale Vorläuferzellen und Oligodendrozyten-Vorläuferzellen sowie vorbestimmte neuronale Vorläuferzellen6,7,29,30. Diese können auch aus differenzierenden Stammzellen entstehen. Der hier beschriebene Klonierungsassay gestattet eine quantitative Definition der relativen Beiträge einer linienbedingten Vorbestimmung sowie aufschlussreicher und selektiver Faktoren für diese als Zwischenstufen auftretenden Zellen.
  • Zusammenfassend macht die vorliegende Anmeldung deutlich, dass:
    • (1) die meisten Regionen des fötalen Gehirns und der Wirbelsäule dazu gebracht werden können, sich in Kultur unter vollständig definierten Kulturbedingungen zu vervielfältigen, wobei eine bis zu 1 000 000 000-fache Erhöhung der Zellanzahl erhalten wird;
    • (2) die homogene Stammzellkultur dazu gebracht werden kann, unter genau kontrollierten Bedingungen zu differenzieren, wobei bis zu 50% der Zellen zu Neuronen differenzieren, während sich die verbleibenden Zellen zu Astrozyten und Oligodendrozyten entwickeln;
    • (3) viele unterschiedliche Arten von Neuronen in Kultur erzeugt werden;
    • (4) Wachstumsfaktoren identifiziert wurden, welche eine effektive Steuerung der Stammzellen im Hinblick auf die Differenzierung zu einem einzelnen Zelltyp, d. h. Neuron, Astrozyt oder Oligodendrozyt, bewirken; und
    • (5) äquivalente Stammzellen aus adulter subependymaler Schicht unter Verwendung eines ähnlichen Verfahrens isoliert und expandiert wurden.
  • Diese aufgezählten Ergebnisse stellen die nachfolgenden Vorteile gegenüber dem derzeitigen Stand der Technik bereit. Erstens gestattet diese ZNS-Stammzelltechnologie in großem Maßstab die Kultivierung homogener Stammzellen in einem undifferenzierten Zustand. Je länger die Zellen im Stammzellzustand gehalten werden können, desto höher ist die Ausbeute an Neuronen, welche aus der Kultur erhalten werden können, wodurch ein effizienterer Gentransfer und eine Selektion jener Zellen, welche das Gen von Interesse tragen, in großem Maßstab ermöglicht werden.
  • Zweitens gestattet dieses Kultursystem eine kontrollierte Differenzierung der Stammzellen, wobei sich nunmehr 50% der expandierten Zellen in Neuronen umwandeln. Diese effiziente Differenzierung, kombiniert mit einer effizienten Proliferation, liefert in einem Zeitraum von zwei Wochen routinemäßig mehr als 100 Millionen Neuronen aus dem Neocortex eines fötalen Rattengehirns.
  • Drittens erfolgt die Differenzierung der Stammzellen zu Neuronen, Astrozyten und Oligodendrozyten konstitutiv, wobei alle drei Zelltypen in Kultur weiterhin reifen, was höchstwahrscheinlich eine Folge begünstigender Wechselwirkungen untereinander ist, wie während der normalen Entwicklung des Gehirns. Es entstehen viele unterschiedliche Arten von Neuronen, welche auf viele Wachstumsfaktoren ansprechen und Neurotransmitter und deren Rezeptoren enthalten. Folglich kann ein signifikanter Teil der Entwicklung des Gehirns in einer beeinflussbaren Umgebung wiederholt werden, wodurch das Potential hervorgehoben wird, neue neurotrophe Faktoren, welche normalerweise von diesen Zellen sekretiert werden, zu extrahieren und zu untersuchen.
  • Schließlich gestatten diese Ergebnisse die Etablierung von Bedingungen, mittels welchen sich teilende unreife Neuronen direkt aus den Stammzellen erhalten und weiter expandiert werden können, um in Kultur in großem Maßstab die Isolierung spezifischer Arten von Neuronen zu ermöglichen.
  • POTENTIELLE KOMMERZIELLE ANWENDUNGEN
  • Die Stammzelltechnologie der vorliegenden Erfindung kann für direkte Anwendungen im Hinblick auf viele unterschiedliche Aspekte betreffend die Therapie und Entdeckung von Arzneimitteln gegen Störungen des Nervensystems entwickelt werden. Umrissen werden nachstehend vier Beispiele für potentielle kommerzielle Anwendungen, d. h. Gentherapie für Parkinson, Zelltherapie, Suche nach neuen Wachstumsfaktoren, sowie Assays für ein Durchmustern auf Arzneimittel.
  • Die ZNS-Stammzellen werden den technischen Kriterien als Vehikel für Gentherapie und Zelltherapie im Allgemeinen mehr als gerecht. Die Stammzellen können unter genau kontrollierten, reproduzierbaren Bedingungen rasch expandiert werden. Darüber hinaus sind diese Zellen allen Standard-Gentransferprotokollen, wie beispielsweise unter Verwendung von Retroviren, Adenoviren, Liposomen und Calciumphosphat-Behandlung, sowie nachfolgenden Selektions- und Expansionsprotokollen leicht zugänglich. Die expandierten Stammzellen differenzieren in effizienter Art und Weise en masse zu Neuronen.
  • Darüber hinaus sollte betont werden, dass zwei zusätzliche Eigenschaften der Stammzellen letztere als fundamentale Grundlage einer auf das humane Nervensystem gerichteten therapeutischen Entwicklung einzigartig machen. Erstens sind alle molekularen Wechselwirkungen, welche der Erzeugung, Reifung und dem Überleben einer Vielzahl unterschiedlicher Zelltypen und neuronaler Subtypen dienen, innerhalb des Kultursystems etabliert, sobald die Stammzellen dazu gebracht werden, zu reifen Zelltypen zu differenzieren. Diese Wechselwirkungen rekapitulieren einen signifikanten Anteil des natürlichen Gehirnentwicklungsprozesses. Daher stellen die Stammzellen als Vehikel für Gentherapie und Zelltherapie nicht nur ein einzelnes zuzuführendes potentielles Gen oder einen einzelnen zuzuführenden potentiellen Faktor bereit, sondern auch die gesamte Infrastruktur für eine Regeneration von Nerven.
  • Zweitens werden die Stammzellen in Kultur aus den multipotenten Vorläuferkeimzellen der normalen Gehirnentwicklung expandiert. Daher behalten diese Stammzellen die Fähigkeit bei, sich nicht nur zu drei unterschiedlichen Zelltypen, sondern in Abhängigkeit von Signalen aus der Umgebung, welchen sie ausgesetzt sind, auch zu vielen unterschiedlichen Arten von Neuronen zu entwickeln. Diese breite Plastizität, welche eine inhärente Eigenschaft von Stammzellen darstellt, lässt eindeutig darauf schließen, dass die Zellen, sobald sie einmal transplantiert wurden, die Fähigkeit beibehalten, sich an viele unterschiedliche Wirtsregionen eines Gehirns anzupassen und zu Neuronen zu differenzieren, welche für diese besondere Wirtsregion spezifisch sind. Diese intrinsischen Eigenschaften der primären Stammzellen unterscheiden sich deutlich von den existierenden tumorigenen Zelllinien, in welchen unter künstlichen Bedingungen eine gewisse neuronale Differenzierung induziert werden kann. Aufgrund dieser einzigartigen Eigenschaften besitzen die expandierbaren humanen ZNS-Stammzellen bei geringer Weiterentwicklung daher von sich aus ein signifikantes kommerzielles Potential.
  • 1. Gentherapie für Parkinson
  • Parkinson resultiert hauptsächlich aus einer Degeneration Dopamin-freisetzender Neuronen in der Substantia nigra des Gehirns und der resultierenden Depletion von Dopamin-Neurotransmittern im Striatum. Die Ursache dieser Degeneration ist unbekannt; allerdings können die motorischen Degenerationssymptome der Erkrankung durch periphere Verabreichung des Dopaminvorläufers L-Dopa bei frühem Ausbruch der Erkrankung gelindert werden. Wenn sich die Erkrankung verschlimmert, ist L-Dopa nicht mehr effektiv, wobei derzeit keine andere Behandlung zur Verfügung steht. Eine vielversprechende Behandlung, welche entwickelt wird, ist die Transplantation dopaminreicher Neuronen der Substantia nigra aus fötalem Gehirn in das Striatum des Gehirns des Patienten. Ergebnisse, welche aus verschiedenen klinischen Zentren erhalten wurden, erscheinen äußerst optimistisch. Allerdings wird geschätzt, dass bis zu 10 fötale Gehirne benötigt werden, um eine ausreichende Anzahl an Zellen für eine Transplantationsoperation zu erhalten. Dieses Erfordernis macht die breite Anwendung der Transplantation primärer Neuronen als therapeutische Realität unmöglich. Dies stellt exakt die Art von Problem dar, welche mittels der ZNS-Stammzelltechnologie der vorliegenden Erfindung gelöst wird, wobei eine geringe Anzahl an Zellen in Kultur bis zu 1 000 000 000-fach expandiert werden kann.
  • Es ist nunmehr weithin anerkannt, dass die Transplantation Dopamin-produzierender Zellen die vielversprechendste Therapie für schwere Formen von Parkinson darstellt, und dass eine stabile Zellpopulation oder Zelllinie, welche zur Herstellung von Dopamin genetisch verändert wurde, für eine effektive Therapie wesentlich ist. Tyrosinhydroxylase (TH) stellt das Schlüsselenzym der Dopaminsynthese dar. Es können humane ZNS-Stammzellen, welche aus fötalen Basalganglien stammen, hergestellt werden, welche das Tyrosinhydroxylase (TH)-Gen exprimieren. Diese Zellen können expandiert, einer Differenzierung unterzogen und in das Striatum des Patienten transplantiert werden. Da die Zellen ursprünglich aus dem primordialen Striatum stammen, besteht die höchste Wahrscheinlichkeit dafür, dass sie sich in diese Region des Gehirns integrieren. Die Herstellung derartiger Zellen und ihre erfolgreiche Transplantation in Tiermodelle führt zur vielversprechendsten Anwendung der Gentherapie bis zum heutigen Tag.
  • 2. Zelltherapie
  • Im Gegensatz zu Parkinson können die den Symptomen zugrunde liegenden Ursachen bei den meisten neurologischen Erkrankungen nicht einem einzelnen Faktor zugeordnet werden. Dieser Zustand macht den therapeutischen Ansatz der Einbringung eines einzelnen Gens unter Verwendung von Gentherapie ineffektiv. Vielmehr ist ein Ersatz des neuronalen Wirtskomplexes durch gesunde Zellen erforderlich. Da ZNS-Stammzellen die natürlichen Keimzellen des sich entwickelnden Gehirns darstellen, welche die Fähigkeit besitzen, sich zu den Zellen des reifen Gehirns zu entwickeln, können die Stammzellen aus der Wirbelsäule und anderen Regionen des Gehirns direkt dazu verwendet werden, degenerierte Nerven in verschiedenen Neuropathien neu zu besiedeln.
  • Es werden mehrere spezifische Stammzelllinien entwickelt, welche verschiedene derzeit klinisch getestete Wachstumsfaktoren überexprimieren. Diese Anwendung kombiniert die einzigartige Plastizität der Stammzellen und der Wachstumsfaktor-vermittelten Gentherapie, um nicht nur den Nutzen einer gezielten Zuführung des Proteins, sondern auch eine umfangreichere neuronale Regeneration in spezifischen Bereichen bereitzustellen.
  • Primäre Beispiele für Wachstumsfaktoren, welche derzeit klinisch getestet oder gegenwärtig von verschiedenen Unternehmen entwickelt werden, sind nachstehend in Tabelle VI31 aufgelistet. Bislang war die Überprüfung von Wachstumsfaktoren auf eine direkte periphere Injektion hoher Dosen beschränkt, was signifikante Risiken in Bezug auf Nebenwirken mit sich bringt, da die meisten Wachstumsfaktoren viele unterschiedliche Populationen von Neuronen sowie nicht-neurale Gewebe beeinflussen und eine geringe Halbwertszeit aufweisen. Diese Probleme können überwunden werden, indem aus den ZNS-Stammzellen mehrere Zellpopulationen oder Zelllinien erzeugt werden, welche diese Wachstumsfaktoren stabil exprimieren und ihre Fähigkeit demonstrieren, zu Neuronen zu differenzieren und die Wachstumsfaktoren in spezifischen peripheren und zentralen Regionen zu sekretieren.
  • 3. Suche nach neuen Wachstumsfaktoren
  • Eines der zentralen Prinzipien der modernen Neurobiologie ist, dass jedes der bedeutenden Projektionsneuronen, wenn nicht gar alle Neuronen, spezifische Signale (trophische Faktoren) benötigen, um ihre Zielzellen zu erreichen und um zu überleben. Neuropathien in einer Vielzahl von Erkrankungen werden möglicherweise durch einen Mangel an diesen Wachstumsfaktoren verursacht oder umfassen einen Mangel an diesen Wachstumsfaktoren. Diese Wachstumsfaktoren repräsentieren die nächste Generation präventiv wirkender oder therapeutischer Arzneimittel gegen Störungen des Nervensystems, und damit die enorme Kapitalisierung, welche von Seiten der Biotechnologieindustrie in die Suche und Entwicklung neuer Wachstumsfaktoren investiert wurde.
  • Aus der Beobachtung, dass eine Vielzahl an reifen Neuronen aus ZNS-Stammzellen hergestellt werden kann, ergibt sich implizit, dass von den differenzierenden Zellen im Hinblick auf die Bestimmung der Zelltypen, die Reifung sowie eine fortwährende Unterstützung ihres Überlebens verschiedene Wachstumsfaktoren sekretiert werden, und dass die Zellen die erforderliche Rezeptormaschinerie enthalten, um auf jene Wachstumsfaktoren und möglicherweise andere anzusprechen. Die meisten der bislang im Nervensystem bekannten Wachstumsfaktoren wurden anhand ihrer Effekte auf periphere Nerven entdeckt, wobei sie höchstwahrscheinlich einen sehr geringen Anteil der im Gehirn vorkommenden Wachstumsfaktoren darstellen.
  • Die Suche nach neuen Wachstumsfaktoren aus dem Gehirn war hauptsächlich deshalb mit Schwierigkeiten verbunden, da die Isolierung bestimmter neuronaler Zelltypen aus dem Gehirn und deren Aufrechterhaltung unter definierten Kulturbedingungen Schwierigkeiten bereitet. Eine Differenzierung der Stammzellen zu Neuronen überwindet dieses Problem und eröffnet neue Assays zum Durchmustern auf potentielle Wachstumsfaktoren.
  • 4. Assays zum Durchmustern auf Arzneimittel
  • Indem immer mehr Neurotransmitter-Rezeptoren und signaltransduzierende Proteine aus dem Gehirn identifiziert werden, wird deutlich, dass das Dogma, wonach ein Neurotransmitter einen Rezeptor aktiviert, eine zu starke Vereinfachung darstellt. Die meisten Rezeptorkomplexe in Neuronen bestehen aus Proteinuntereinheiten, welche durch mehrere Gene kodiert sind, wobei jedes Gen viele unterschiedliche Variationen des Proteins synthetisiert. Diese Variationen führen zu einer breiten Vielfalt an möglichen Rezeptorkombinationen, und nicht zu einem einzelnen Rezeptor, welcher mit einem Neurotransmitter Wechselwirken kann. Folglich kann durch eine einzelne Neurotransmitteraktion eine Vielzahl an Signalausstößen erzeugt werden. Das spezifische Signal, welches mittels eines Neurotransmitters auf einem Neuron hervorgerufen wird, hängt sodann davon ab, welcher Rezeptorkomplex von der Zelle produziert wird. Folglich muss die zelluläre Diversität parallel zur molekularen Diversität laufen und ein bedeutendes, der Komplexität der Gehirnfunktion zugrunde liegendes Strukturelement darstellen.
  • Die Entdeckung von Arzneimitteln mittels traditioneller Pharmakologie wurde ohne das Wissen in Bezug auf eine derartige Komplexität unter Verwendung von Gesamthirnhomogenisat und Tieren durchgeführt, wobei meistens Analoga von Neurotransmittern mit breiter Wirkung und umfassenden Nebenwirkungen produziert wurden. Die nächste Generation pharmazeutischer Arzneimittel, welche auf die Modifizierung spezifischer Gehirnfunktionen abzielt, kann durch Durchmustern potentieller Chemikalien gegenüber Neuronen, welche ein spezifisches Profil von Neurotransmittern, Rezeptorkomplexen und Ionenkanälen zeigen, erhalten werden.
  • ZNS-Stammzellen, welche in Kultur expandiert und einer Differenzierung zu Neuronen unterzogen wurden, exprimieren mehrere Neurotransmitter und Rezeptorkomplexe. Es kann eine Vielzahl an Zelllinien entwickelt werden, welche aus Stammzellen und neuronalen Vorläuferzellen aus unterschiedlichen Regionen des Gehirns stammen, und welche, wenn sie einer Differenzierung zu reifen Neuronen unterzogen werden, ein einzigartiges Profil von Neurotransmitter-Rezeptorkomplexen zeigen. Derartige neuronale Zelllinien stellen wertvolle Instrumente im Rahmen der Konzipierung von und des Durchmusterns auf potentielle Arzneimittel dar.
  • Zusammenfassend bietet die ZNS-Stammzelltechnologie dieser Anmeldung umfassende und signifikante Möglichkeiten zur Behandlung von Störungen des Nervensystems.
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  • Obwohl die Erfindung in Verbindung mit jenen Ausführungsformen beschrieben wurde, welche gegenwärtig als am zweckmäßigsten und am stärksten bevorzugt angesehen werden, versteht es sich, dass die Erfindung nicht auf die offenbarten Ausführungsformen beschränkt ist. TABELLE I ZELLTYPZUSAMMENSETZUNG DIFFERENZIERTER KLONE Klone embryonaler hippocampaler Vorläuferzellen
    Passage Klongröße MAP2+ (%) GalC+ (%) GFAP+ (%)
    1 319 145 (45) 41 (13)
    1 451 245 (54) 0 (0)
    1 1237 634 (51) 9 (1)
    1 2197 956 (44) 42 (2)
    1 2779 1617 (58) 336 (12)
    4 71 10 (14) 5 (7)
    4 139 14 (10) 4 (3)
    4 296 21 (7) 139 (47)
    4 341 54 (16) 38 (11)
    4 420 39 (9) 25 (6)
    4 600 35 (6) 60 (10)
    4 662 66 (10) 62 (9)
    4 141 42 (30) 4 (3)
    4 427 220 (52) 15 (4)
    4 610 306 (50) 29 (5)
    Gesamtdurchschnitt 48.6 ± 1.6% 8.4 ± 1.0% 7.8 ± 2.3%
    TABELLE II ZELLTYPZUSAMMENSETZUNG DIFFERENZIERTER KLONE Subklone aus Klonen embryonaler hippocampaler Vorläuferzellen
    Subklon Klongröße MAP2+ (%) GalC+ (%) GFAP+ (%)
    HI6.1 337 22 (7) 99 (29)
    HI6.2 338 13 (4) 157 (46)
    HI6.3 537 132 (25) 48 (9)
    HI6.4 565 98 (17) 28 (5)
    HI6.5 831 96 (12) 107 (13)
    HI6.6 886 158 (18) 134 (15)
    HI6.7 893 135 (15) 66 (7)
    HI6.8 950 154 (16) 53 (6)
    HI6.9 951 112 (12) 120 (13)
    HI6.10 970 105 (11) 95 (10)
    HI19.1 84 11 (13) 0 (0)
    HI19.2 211 45 (21) 0 (0)
    HI19.3 363 61 (17) 18 (5)
    HI19.4 697 172 (25) 5 (1)
    HI19.5 861 135 (16) 57 (7)
    HI19.6 1469 401 (27) 123 (8)
    HI19.7 1841 486 (26) 179 (10)
    HI8.1 88 4 (5) 0 (0)
    HI8.2 104 3 (3) 0 (0)
    HI8.3 193 16 (8) 28 (15)
    HI8.4 237 14 (6) 39 (16)
    HI8.5 384 65 (17) 119 (31)
    HI8.6 402 26 (6) 75 (19)
    HI8.7 554 49 (9) 45 (8)
    HI8.8 571 23 (4) 49 (9)
    HI8.9 662 41 (6) 118 (18)
    HI8.10 669 46 (7) 46 (7)
    HI8.11 827 57 (7) 18 (2)
    HI8.12 836 92 (11) 97 (12)
    HI8.13 1084 104 (10) 53 (5)
    HI8.14 1268 124 (10) 163 (13)
    HI8.15 1284 75 (6) 193 (15)
    Gesamtdurchschnitt: 20.1 ± 1.4% 8.9 ± 1.1% 10.0 ± 0.7%
    TABELLE III ZELLTYPZUSAMMENSETZUNG DIFFERENZIERTER KLONE Klone adulter subependymaler Zellen
    Passage Klongröße MAP2+ (%) GalC+ (%) GFAP+ (%)
    1 73 6 (8) 37 (51)
    1 159 56 (35) 42 (26)
    1 173 57 (33) 26 (15)
    1 185 71 (38) 32 (17)
    1 230 97 (42) 39 (17)
    1 273 139 (51) 56 (21)
    1 387 117 (30) 45 (12)
    1 554 237 (43) 84 (15)
    1 675 280 (41) 74 (11)
    1 847 399 (47) 155 (18)
    1 496 23 (5) 92 (19)
    1 526 7 (1) 115 (22)
    1 644 19 (3) 26 (4)
    1 713 22 (3) 179 (25)
    1 1112 56 (5) 235 (21)
    0 278 153 (55) 6 (2)
    0 305 145 (48) 19 (6)
    1 411 156 (38) 68 (17)
    0 513 242 (47) 3 (1)
    0 532 246 (46) 26 (5)
    0 538 283 (53) 10 (2)
    0 584 277 (47) 32 (5)
    0 1012 498 (49) 5 (0)
    Gesamtdurchschnitt: 41.7 ± 2.6% 4.2 ± 1.2% 19.6 ± 2.7%
    TABELLE IV EFFEKT EXTRAZELLULÄRER FAKTOREN AUF DIE ZELLTYPBESTIMMUNG
    (Antikörper) unbehandelt (%) +PDGF (%) +CNTF (%) +T3 (%)
    A. Embryonisch
    Neuron (MAP2) 45.9 81.0 0.9 11.5
    Neuron (TuJ1) 9.9 72.4 N.D. N.D.
    Neuron (NF-M) 1.0 53.0 N.D. N.D.
    Oligodendrozyt (GalC) 7.4 2.8 4.5 21.2
    Astrozyt (GFAP) 6.3 2.0 97.3 20.7
    B. Adult
    Neuron (MAP2) 36.8 73.9 11.8 35.2
    Neuron (TuJ1) 47.9 72.4 N.D. N.D.
    Oligodendrozyt (GalC) 4.8 N.D. N.D. 47.4
    Astrozyt (GFAP) 20.3 2.2 72.9 32.4
    TABELLE V GESTEUERTE DIFFERENZIERUNG VON HUMANEN ZNS-STAMMZELLEN; WELCHE MIT bFGF EXPANDIERT WORDEN WAREN
    unbehandelt (%) +PDGF (%) +CNTF (%) +T3 (%)
    Neuron (MAP2+) 45.9 ± 2.3 71.4 ± 1.9 9.4 ± 1.6 16.9 ± 2.4
    Oligodendrozyten (O4+/GalC+) 2.6 ± 0.8 0.8 ± 0.3 0.9 ± 0.1 25.3 ± 2.8
    Astrozyten (GFAP+) 10.7 ± 1.8 7.1 ± 1.2 85.2 ± 1.9 37.1 ± 3.4
    tot 5.9 ± 0.7 3.5 ± 0.4 2.0 ± 0.5 8.2 ± 0.6
    TABELLE VI NEUROTROPHE FAKTOREN UND ERKRANKUNGEN
    Neurotropher Faktor: Erkrankung
    Nervenwachstumsfaktor: Alzheimer diabetische Neuropathie Taxol-Neuropathie kompressive Neuropathie AIDS-bezogene Neuropathie
    aus Gehirn-stammender Wachstumsfaktor: amyotrophe Lateralsklerose
    Neurotrophin 3: Large Fiber-Neuropathie
    Insulin-ähnlicher Wachstumsfaktor: amyotrophe Lateralsklerose Vincristin-Neuropathie Taxol-Neuropathie
    ciliärer neurotropher Faktor: amyotrophe Lateralsklerose
    aus Gliazellen stammender neurotropher Faktor: Parkinson
    Figure 00740001
  • TABELLE VII LEGENDE
    • 1Die Anzahl der unterschiedlichen neuronalen Phänotypen ist für jede Region als prozentualer Wert der MAP2ab-positiven Neuronen pro Quadratzentimeter angegeben. MAP2, Mikrotubuli-assoziiertes Protein a und b; TH, Tyrosinhydroxylase; AchE, Acetylcholinesterase; VAT, vesikulärer Acetylcholintransporter; ChAT, Cholinacetyltransferase; GAD, Glutaminsäuredecarboxylase; NPY, Neuropeptid Y; L-Enk, Leu-Enkephalin; M-Enk, Met-Enkephalin.
    • 2Regionen, aus welchen die ZNS-Stammzellen erhalten wurden. SEPT, Septum des Stadiums E15.5; LGE, lateraler Ganglienhügel des Stadiums E15.5; MGE, medialer Ganglienhügel des Stadiums E15.5; HI, Hippocampus des Stadiums E15.5, VM, ventrales Mesencephalon des Stadiums E12.5; DM, dorsales Mesencephalon des Stadiums E12.5; SPC, Wirbelsäule des Stadiums E13.5.
    • 3Dargestellt ist die durchschnittliche Anzahl an MAP2ab-positiven Zellen pro Quadratzentimeter. Die ursprüngliche Anzahl an ausplattierten Zellen betrug für alle Regionen 125 000 Zellen pro Quadratzentimeter. ± mittlerer Standardfehler.

Claims (12)

  1. Verfahren zur Expansion und in vitro-Kultivierung von Stammzellen aus dem zentralen Nervensystem eines Säugers, wobei die Stammzellen die multipotente Fähigkeit zur Differenzierung zu Neuronen, Astrozyten und Oligodendrozyten beibehalten, umfassend die Schritte: a) Dissoziieren von Zellen aus Gewebe des zentralen Nervensystems durch mechanisches Triturieren in Abwesenheit zweiwertiger Kationen, b) Kultivieren der auf einer Platte anhaftenden dissoziierten Zellen in einem serumfreien Kulturmedium, c) Ausplattieren von dissoziierten Zellen in einer Dichte, welche 20 000 Zellen/cm2 nicht übersteigt, und erneutes Ausplattieren der kultivierten Zellen in nachfolgenden Passagen in einer Dichte, welche 10 000 Zellen/cm2 nicht übersteigt, d) tägliches Hinzufügen eines Wachstumsfaktors ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus i) bFGF in einer Konzentration von mindestens 10 ng/ml, ii) EGF in einer Konzentration von mindestens 10 ng/ml, iii) TGF-alpha in einer Konzentration von mindestens 10 ng/ml, und iv) aFGF in einer Konzentration von mindestens 10 ng/ml plus 1 μg/ml Heparin, zu den kultivierten Zellen, e) Passagieren der kultivierten Zellen innerhalb von vier Tagen nach Ausplattieren, so dass eine 50%ige Konfluenz nicht überschritten wird, und f) Passagieren der kultivierten Zellen durch Behandeln der kultivierten Zellen mit Kochsalzlösung.
  2. In vitro-Adhäsionskultur von Stammzellen aus dem zentralen Nervensystem eines Säugers, wobei die Kultur mittels des Verfahrens nach Anspruch 1 erhältlich ist, und wobei die Stammzellen a) Nestin exprimieren, b) die multipotente Fähigkeit zur Differenzierung zu Neuronen, Astrozyten und Oligodendrozyten beibehalten, und c) bei Entzug von Mitogen differenzieren.
  3. Verfahren zur Differenzierung einer in vitro-Kultur von Stammzellen aus dem zentralen Nervensystem eines Säugers, wobei die Stammzellen die multipotente Fähigkeit zur Differenzierung zu Neuronen, Astrozyten und Oligodendrozyten beibehalten, umfassend die Schritte a) Dissoziieren von Zellen aus Gewebe des zentralen Nervensystems durch mechanisches Triturieren in Abwesenheit zweiwertiger Kationen, b) Kultivieren der auf einer Platte anhaftenden dissoziierten Zellen in einem serumfreien Kulturmedium, c) Ausplattieren von dissoziierten Zellen in einer Dichte, welche 20 000 Zellen/cm2 nicht übersteigt, und erneutes Ausplattieren der kultivierten Zellen in nachfolgenden Passagen in einer Dichte, welche 10 000 Zellen/cm2 nicht übersteigt, d) tägliches Hinzufügen eines ersten Wachstumsfaktors ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus i) bFGF in einer Konzentration von mindestens 10 ng/ml, ii) EGF in einer Konzentration von mindestens 10 ng/ml, iii) TGF-alpha in einer Konzentration von mindestens 10 ng/ml, und iv) aFGF in einer Konzentration von mindestens 10 ng/ml plus 1 μg/ml Heparin, zu den kultivierten Zellen, e) Passagieren der kultivierten Zellen innerhalb von vier Tagen nach Ausplattieren, so dass eine 50%ige Konfluenz nicht überschritten wird, f) Passagieren der kultivierten Zellen durch Behandeln der kultivierten Zellen mit Kochsalzlösung, und g) Entfernen des ersten Wachstumsfaktors von den kultivierten Zellen, wobei das Entfernen zur Differenzierung der kultivierten Zellen zu Neuronen, Astrozyten und/oder Oligodendrozyten führt.
  4. Verfahren nach Anspruch 1 oder Anspruch 3, wobei in Schritt (b) das Kulturmedium chemisch definiert ist und das Kulturmedium alle zwei Tage durch frisches Medium ersetzt wird, und wobei in Schritt (f) die Kochsalzlösung frei von zweiwertigen Kationen ist und die Zellen von der Platte abgekratzt werden.
  5. Verfahren oder in vitro-Kultur nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei die Stammzellen aus Gewebe aus dem zentralen Nervensystem eines Menschen stammen.
  6. Verfahren oder in vitro-Kultur nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei die Stammzellen aus Gewebe aus dem zentralen Nervensystem eines nicht-menschlichen Fötus stammen.
  7. Verfahren oder in vitro-Kultur nach Anspruch 5, wobei die Stammzellen aus Gewebe aus dem zentralen Nervensystem eines Erwachsenen stammen.
  8. Verfahren oder in vitro-Kultur nach Anspruch 5, 6 oder 7, wobei die Stammzellen aus Gewebe aus dem zentralen Nervensystem stammen, welches aus der Gruppe bestehend aus Hippocampus, Großhirnrinde, Striatum, Septum, Diencephalon, Mesencephalon, Rautenhirn und Wirbelsäule ausgewählt ist.
  9. In vitro-Kultur nach Anspruch 2, wobei die Stammzellen zu reifen Neuronen differenzieren, welche aufweisen: a) eine Axon-Dendrit-Polarität, b) synaptische Enden, und c) eine Lokalisierung von Proteinen, welche an Synaptogenese und synaptischer Aktivität beteiligt sind, umfassend i) Neurotransmitter-Rezeptoren, ii) Transporter, und iii) Prozessierungsenzyme.
  10. In vitro-Kultur nach Anspruch 2, wobei die Stammzellen ihre Fähigkeit zur Erzeugung neuronaler Subtypen mit molekularen Unterschieden zwischen den Subtypen beibehalten.
  11. Verfahren nach Anspruch 3, weiterhin umfassend das Hinzufügen eines zweiten Wachstumsfaktors zu den kultivierten Zellen nach Entfernen des ersten Wachstumsfaktors von den kultivierten Zellen, wobei sich der zweite Wachstumsfaktor von dem ersten Wachstumsfaktor unterscheidet.
  12. Verfahren nach Anspruch 11, wobei der zweite Wachstumsfaktor aus der Gruppe bestehend aus Blutplättchen-Wachstumsfaktor (PDGF), ciliärer neurotropher Faktor (CNTF), Leukämie inhibierender Faktor (LIF), und Thyroidhormon, Iodthyronin (T3) ausgewählt ist.
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