DE69738398T2

DE69738398T2 - Biokeramische zusammensetzung

Info

Publication number: DE69738398T2
Application number: DE69738398T
Authority: DE
Inventors: Dosuk D. Brookline LEE; Christian Rey; Maria Brookline AIOLOVA; Aliassghar Belmont TOFIGHI
Original assignee: Etex Corp
Current assignee: Etex Corp
Priority date: 1996-10-16
Filing date: 1997-10-16
Publication date: 2008-12-04
Anticipated expiration: 2017-10-17
Also published as: CA2268156A1; WO1998016209A3; US6972130B1; EP0941079B1; WO1998016209A2; ATE381314T1; EP0941079A1; AU734691B2; DE69738398D1; JP4260891B2; CA2268156C; JP2001524937A; AU4902597A; ES2299183T3

Description

Hintergrund der Erfindung
Viele Forschungsarbeiten auf dem Gebiet der Biopharmazeutika befassen sich mit der Entwicklung von wirksamen implantierbaren Trägern für die Arzneimittelabgabe und andere chirurgische Anwendungen. Solche Träger müssen biokompatibel sein und sie müssen außerdem befähigt sein, die Wirksamkeit der biologischen Wirkstoffe, die sie abgeben sollen, aufrechtzuerhalten. Viele biologisch wirksame Stoffe sind instabil und verlieren ihre Aktivität sehr leicht, wenn sie in ein Drug Delivery-System eingebracht werden. Insbesondere die Aufrechterhaltung der Proteinaktivität hat schwierige Probleme aufgeworfen.
Calciumphosphat-Keramiken wurden auf dem Gebiet Drug Delivery aufgrund ihrer bekannten Biokompatibilität und ihrer Affinität für Proteinreagentien als potentielle Delivery Vehicle untersucht. Die für die Herstellung bekannter Calciumphosphat-Keramiken durchgeführten Reaktionen erfordern jedoch typischerweise hohe Temperaturen und/oder Drücke und außerdem ist die Gegenwart von Säuren oder Basen erforderlich. Da die meisten biologisch wirksamen Stoffe durch eine oder mehrere der für die Herstellung von Keramiken benötigten Bedingungen zerstört würden, können die biologischen Wirkstoffe nur eingebracht werden, nachdem das Material gebildet ist, wodurch die Menge und die Art des Wirkstoffes, der abgegeben werden kann, eingeschränkt werden kann.
Obwohl einige Calciumphosphat-Materialien als "resorbierbar" eingestuft wurden, sind solche Stoffe, die gewöhnlich Tricalciumphosphat, Tetracalciumphosphat oder Hydroxyapatit umfassen oder davon ab geleitet sind, nur schwach resorbierbar. Es hat sich herausgestellt, dass die Tricalciumphosphate aus dieser Gruppe am besten resorbierbar sind, sie werden jedoch nach langjährigen Untersuchungen noch nicht in großem Umfang in klinischen Applikationen verwendet. Bekanntlich haben Tricalciumphosphate übermäßig lange und etwas unvorhersehbare Resorptionsprofile, sodass im Allgemeinen mehr als ein Jahr für die Resorption erforderlich ist. Wenn nicht Maßnahmen ergriffen werden, extrem poröse Calciumphosphate oder Tricalciumphosphate mit Kanälen herzustellen, werden diese Verbindungen nicht durch Knochengewebe ersetzt. Kürzlich durchgeführte Studien haben zu der Schlussfolgerung geführt, dass der "biologische Abbau von TCP, der größer ist als der von [Hydroxyapatit], nicht ausreichend ist" (Berger et al., Biomaterials, 16: 1241, 1995).
Von Tetracalciumphosphat und Hydroxyapatit abgeleitete Verbindungen sind ebenfalls nur schwach resorbierbar. Veröffentlichte Berichte von Tetracalciumphosphat-Füllmassen beschreiben im Allgemeinen eine partielle Resorption über lange Zeitspannen. Wie von Horioglu et al. berichtet wurde, ist es nicht ungewöhnlich, dass solche Materialien für 80% Resorption 30 Monate benötigen (Soc. for Biomaterials, Seite 198, 18–22, März 1995). Viele Berichte, die die "Resorption" von Calciumphosphat-Materialien schildern, zeigen genau genommen nicht die Resorption, da die Autoren beispielsweise die Migration des Trägers von der Implantationsstelle weg nicht ausschließen (siehe beispielsweise IJentema et al., supra).
Auf dem Gebiet der Chirurgie ist ein Ziel der Wiederherstellungschirurgie, geschädigtes Gewebe durch neues Gewebe ersetzen zu können, das gegebenenfalls aus den eigenen Zellen des Patienten gebildet wurde. Fachleute haben sich beispielsweise bemüht, Knorpelregenerationssysteme zu entwickeln, bei denen isolierte Chondrozyten im Rahmen eines Polymergerüsts in einen geschädigten Bereich injiziert werden (siehe beispielsweise Atala et al., J. Urol. 150: 747, 1993; Freed et al., J. Cell Biochem. 51: 257, 1993 und die darin genannten Referenzen). Ähnliche angeimpfte Gerüstsysteme wurden im Zusammenhang mit der Knochenreparatur untersucht, wobei Osteoblasten in Kombination mit Polymeren oder keramischen Trägern verwendet wurden (siehe beispielsweise Elgendy et al., Biomater. 14: 263, 1993; Ishaug et al., J. Biomed. Mater. Res. 28: 1445, 1994). Angeimpfte Zusammensetzungen wurden auch für ihre Verwendbarkeit bei der Blasenkontrolle und vesikoureteralen Anwendungen untersucht (siehe beispielsweise Griffith-Circa et al., veröffentlichte PCT-Anmeldung Nr. WO 94/25080 ).
Auf diesem Gebiet tätige Wissenschaftler haben einige Merkmale identifiziert, die für Gerüstmaterialien, die in solchen angeimpften Zusammensetzungen verwendet werden sollen, wünschenswert sind. Beispielsweise listen Freed et al. (Bio/Technology 12: 689, 1994) die folgenden sechs Faktoren als wünschenswerte Faktoren auf:

(1) Die Gerüstoberfläche sollte die Zelladhäsion und das Zellwachsturn ermöglichen;
(2) weder das Gerüstmaterial noch seine Zersetzungsprodukte sollten nach in vivo Implantation zu Entzündungen oder Toxizität führen;
(3) das Gerüstmaterial sollte reproduzierbar zu dreidimensionalen Strukturen verarbeitet werden können;
(4) das Gerüstmaterial sollte eine Porosität von mindestens 90% aufweisen, sodass es eine große Oberfläche für Zell-Gerüst-Wechselwirkungen, ausreichenden Raum für extrazelluläre Matrixregenerierung und minimale Diffusionsbeschränkungen während der in vivo Kultur bietet;
(5) das Gerüstmaterial sollte resorbiert werden, sobald es seine Aufgabe erfüllt hat, eine Vorlage für das regenerierende Gewebe zu bilden; und
(6) die Abbaurate des Gerüsts sollte so einstellbar sein, dass es zu der Rate der Geweberegenerierung des jeweiligen Zelltyps passt.

Es besteht weiterhin ein Bedürfnis für die Entwicklung eines Trägers für die Arzneimittelabgabe (Drug Delivery Vehicle), der biokompatibel, vollständig resorbierbar und der Wirkstoffaktivität nicht abträglich ist. Es gibt auch einen Bedarf für geeignete Materialien zur Verwendung als Gerüstmaterialien bei der Gewebereparatur. Die vorliegende Erfindung erfüllt diese Bedürfnisse, indem sie Materialien und Zusammensetzungen angibt, die für die Verabreichung von Arzneimitteln und bei der Reparatur von Gewebe zweckdienlich sind.
Definitionen
"Amorph" – Unter "amorph" wird, wie dieser Ausdruck hier verwendet wird, ein Material mit signifikant amorphem Charakter verstanden. Unter einem signifikant amorphen Charakter ist mehr als 75% amorpher Gehalt, vorzugsweise mehr als 90% amorpher Gehalt zu verstehen und ein signifikanter amorpher Charakter ist durch ein breites, merkmalsloses Röntgenbeugungsbild gekennzeichnet. In dem Material kann in geringem Maße Kristallinität vorliegen. Bei den erfindungsgemäßen amorphen Precursormaterialien liegt der Kristallinitätsgrad vorzugsweise unter dem für das Produktmaterial gewünschten Kristallinitätsgrad.
"Bioaktiv" – Der Ausdruck "bioaktiv" bezieht sich auf ein Material, das in dem und um das Implantat Hartgewebebildung induziert. Bei Implantation in weiches Gewebe kann für die Bioaktivität auch die Gegenwart eines Wachstumsfaktors oder trophischen Faktors oder das Animpfen des Implantats mit einem Hartgewebe bildenden Zelltyp erforderlich sein.
"Biokompatibel" – Der Ausdruck "biokompatibel" bedeutet, wie er hier verwendet wird, dass das Material bei dem Empfänger keine erheblich schädigende Reaktion auslöst. Wenn ein fremder Gegenstand in einen lebenden Körper eingebracht wird, besteht immer die Gefahr, dass der Gegenstand eine Immunreaktion auslöst, beispielsweise eine Entzündung, die auf den Empfänger negative Auswirkungen hat. Obwohl beispielsweise Hydroxyapatit im Allgemeinen als "biokompatibel" angesehen wird, wurden in erheblichem Umfang Entzündungen und Gewebenekrosen beobachtet, wenn kristalline Hydroxyapatit-Mikrocarrier intramuskulär in Tiere eingesetzt wurden (siehe beispielsweise IJntema et al., Int. J. Pharm 112–215 (1994)).
"Bioresorbierbar" – "Bioresorbierbar" bezieht sich auf die Fähigkeit eines Materials, in vivo resorbiert zu werden. "Vollständige" Resorption bedeutet, dass keine signifikanten extrazellulären Fragmente übrigbleiben. Der Resorptionsprozess umfasst die Beseitigung des ursprünglichen Implantatmaterials durch die Einwirkung von Körperflüssigkeiten, Enzymen oder Zellen. Resorbiertes Calciumphosphat kann zum Beispiel als Knochenmineral wieder abgelagert oder in anderer Weise im Körper wiederverwendet oder ausgeschieden werden. "Stark bioresorbierbar" bedeutet, wie der Ausdruck hier verwendet wird, dass mindestens 80%, vorzugsweise 95–99% und noch bevorzugter > 99% der Gesamtmasse des intramuskulär oder subkutan implantierten Materials innerhalb eines Jahres resorbiert wird. Gemäß bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung ist das stark resorbierbare wenigkristalline apatitische (PCA poorly cristalline apatitic) Calciumphosphat dadurch gekennzeichnet, dass wenigstens 80% des Materials innerhalb eines Jahres resorbiert wird, wenn zumindest 1 g (vorzugsweise 1–5 g) PCA-Material subkutan oder intramuskulär implantiert wird. In noch bevorzugteren Ausführungsformen wird das Material innerhalb von neun Monaten, sechs Monaten, drei Monaten und idealerweise innerhalb eines Monats resorbiert. Besonders bevorzugte Materialien sind außerdem dadurch gekenn zeichnet, dass sie in den genannten Zeitabschnitten vollständig resorbiert werden können. Im Sinne dieser Offenbarung bedeutet "schwach" resorbierbar, dass weniger als 80% des Ausgangsmaterials nach einem Jahr resorbiert sind.
"Wirksame Menge" – Eine wirksame Menge eines biologisch wirksamen Stoffes ist eine Menge, die ausreichend ist, um die gewünschte biologische Reaktion hervorzurufen.
"Härtung" – "Härtung" bezieht sich auf den Vorgang, bei dem der hydratisierte Precursor in das gehärtete PCA-Material umgewandelt wird. Das PCA-Material wird als "gehärtet" angesehen, wenn es als im Wesentlichen nicht formbarer Feststoff vorliegt. Solch ein gehärtetes PCA-Material hat eine minimale Kompressibilität und neigt dazu, nicht elastisch, sondern plastisch verformt zu werden.
"Hydratisierter Precursor" – Der Ausdruck "hydratisierter Precursor" bezieht sich, wie er hier verwendet wird, auf die Paste oder Kittmasse, die durch Hydratation der trockenen PCA-Precursoren in Gegenwart einer beschränkten Menge einer wässrigen Lösung (d. h. weniger als etwa 1 ml wässrige Lösung pro Gramm pulverförmiger Precursor) gebildet wird. Der hydratisierte Precursor kann sowohl Reaktanten als auch Produkte in verschiedenen Kombinationen enthalten, die von dem Ausmaß abhängen, bis zu dem die Umwandlung stattgefunden hat. Sowohl die hier beschriebenen "injizierbaren" als auch die "formbaren" Precursorpasten sind hydratisierte Precursoren. Bevorzugte "injizierbare" hydratisierte Precursoren haben eine solche Konsistenz, dass sie durch eine Injektionsnadel Nr. 18 abgegeben werden können.
"Wenigkristallines apatitisches Calciumphosphat" – "PCA-Calciumphosphat" und "PCA-Material" beschreiben, wie diese Ausdrücke hier verwendet werden, ein synthetisches wenigkristallines apatitisches Calciumphosphat. Das PCA-Material ist nicht notwendigerweise auf eine einzige Calciumphosphatphase beschränkt, unter der Voraussetzung, dass es das charakteristische XRD- und FTIR-Muster aufweist. Ein PCA-Calciumphosphat hat im Wesentlichen das gleiche Röntgenbeugungsspektrum wie Knochenmaterial. Das Spektrum ist im Allgemeinen lediglich durch zwei breite Peaks im Bereich von 20–35° gekennzeichnet, wobei ein Peak bei 26° und der andere Peak bei 32° zentriert ist. Es ist ferner durch FTIR-Peaks bei 563 cm^–1, 1034 cm^–1, 1638 cm^–1 und 3432 cm^–1 (± 2 cm^–1) gekennzeichnet. Es werden bei 603 cm^–1 und 875 cm^–1 zwei scharfe Schultern beobachtet, mit einem Dublett, das Maxima bei 1422 cm^–1 und 1457 cm^–1 aufweist.
"Promotor" – Der Ausdruck "Promotor" beschreibt, wie er hier verwendet wird, ein Material oder eine Behandlung, die das Härten eines hydratisierten Precursors fördert und die Umwandlung von ACP in PCA-Calciumphosphat verbessert. Einige Promotoren nehmen an der Umwandlung teil und werden in das gebildete PCA-Material aufgenommen; andere, als "passive" Promotoren bekannt, nehmen nicht an der Reaktion teil.
"Reaktiv" – "Reaktiv" bezieht sich hier auf die Fähigkeit eines amorphen Calciumphosphats unter Härten der Precursormaterialien in ein erfindungsgemäßes PCA-Material umgewandelt zu werden, wenn es zur Bildung eines hydratisierten Precursors mit einer Flüssigkeit vermischt wird. Bevorzugte ACPs sind durch die Fähigkeit, vollständig umgewandelt zu werden, die Fähigkeit, unter Härten schnell umgewandelt zu werden, die Fähigkeit, mit ansonsten inerten Verbindungen umgewandelt zu werden, und/oder die Fähigkeit gekennzeichnet, in ein im Wesentlichen homogenes PCA-Material umgewandelt zu werden. Wenn das ACP mit einem zweiten Calciumphosphat umgesetzt wird, kann die "Umwandlung" die Umwandlung sowohl des ACP als auch des zweiten Calciumphosphats umfassen. Der Här tungsgrad und die Kinetik des Härtungsprozesses sind ebenso wesentliche Elemente der Reaktivität. Einige ACPs sind reaktiver als andere. Ein ACP wird als "hochreaktiv" angesehen, wenn es in Gegenwart eines schwachen Promotors, wie Dicalciumphosphat-Dihydrat ("DCPD") mit einer Korngrößenverteilung, die einen erheblichen Anteil von Körnern mit einer Größe über 100 μm aufweist, umgewandelt wird und zu einem PCA-Material aushärtet. Bevorzugte hochreaktive ACPs bilden in Gegenwart eines schwachen DCPD-Promotors und Wasser bei 37°C in weniger als zwölf Stunden ein gehärtetes PCA-Material, wobei die Härtung nach etwa ein bis fünf Stunden und idealerweise 10 bis 30 Minuten im Wesentlichen vollständig ist.
Zusammenfassung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung gibt ein synthetisches, wenigkristallines apatitisches Calciumphosphatmaterial an, das hervorragende Eigenschaften in Bezug auf die Biokompatibilität, Resorbierbarkeit und Verarbeitbarkeit aufweist und bei der Verabreichung von Arzneimitteln und dem Animpfen von Zellen (in vivo und in vitro) verwendet werden kann.
Das erfindungsgemäß verwendete synthetische PCA-Material ist mit Zellen und einer Vielzahl von biologisch wirksamen Stoffen (biologischen Wirkstoffen) kompatibel. Das Material kann dazu verwendet werden, Wirkstoffe oder Zellen an einer Vielzahl von Stellen im Körper abzugeben, oder es kann in vitro eingesetzt werden. Das Material ist durch sein charakteristisches Röntgenbeugungsbild gekennzeichnet, das zeigt, dass es wenigkristallin ist. Das Material weist vorzugsweise ein Verhältnis Calcium/Phosphat im Bereich von etwa 1,1 bis 1,9 auf. Noch bevorzugter liegt dieses Verhältnis im Bereich von etwa 1,3 bis 1,5.
Das in der vorliegenden Erfindung verwendete Material ist stark bioresorbierbar. Das bedeutet, dass mindestens etwa 80%, vorzugsweise 90–95% und noch bevorzugter > 95% des Materials innerhalb eines Jahres, vorzugsweise innerhalb von 9 Monaten, 6 Monaten, 3 Monaten und idealerweise 1 Monat resorbiert wird, wenn ein Implantat in Pelletform, das mindestens 1 g Material enthält, intramuskulär oder subkutan implantiert wird. Es ist klar, dass die Gestalt des Materials (beispielsweise als Kugel im Vergleich mit einem Stab oder einer anderen Form) die Resorptionsrate beeinflussen kann.
Die Resorptionsrate des Delivery Vehicles kann ferner durch die Art seiner Herstellung beeinflusst werden.
In bevorzugten Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung wird das synthetische PCA-Material in einer Reaktion gebildet, in der mindestens ein amorpher Calciumphosphat-(ACP)-Precursor einem Promotor ausgesetzt wird. In besonders bevorzugten Ausführungsformen umfasst der Promotor ein zweites Calciumphosphatmaterial. Die Reaktionsbedingungen, die zur Bildung des erfindungsgemäß verwendeten PCA-Materials verwendet werden, sind mäßig, sodass biologische Stoffe oder Zellen gewünschtenfalls während der Bildung in das Material eingebracht werden können.
Alternativ hierzu können die Stoffe eingebracht werden, nachdem das Delivery Vehicle gebildet wurde. Das Material des Delivery Vehicles kann in eine Vielzahl von zweckmäßigen Formen gebracht werden, entweder bevor das biologisch aktive Material oder die Zelle eingebracht wird oder danach, und es kann beispielsweise durch Injektion oder chirurgische Implantation an Ort und Stelle gebracht werden. Das Material kann in einem feuchten, nicht gehärteten Zustand (d. h. als hydratisierter Precursor) an die entsprechende Stelle gebracht und in situ härten gelassen werden. Der Träger kann alternativ dazu bei einer erhöhten Temperatur im Allgemeinen bei oder über 37°C in vitro gehärtet und danach einem Empfänger (Tier oder Mensch) chirurgisch implantiert werden.
Das erfindungsgemäße PCA-Material kann in vitro entweder in Gegenwart oder in Abwesenheit des biologischen Wirkstoffs oder der Zelle hergestellt werden. Alternativ dazu können der biologische Wirkstoff oder die Zelle nach der Härtung hinzugefügt werden, indem der vorgeformte Träger dem Stoff ausgesetzt wird.
Die vorliegende Erfindung gibt daher Träger für die Abgabe biologisch wirksamer Stoffe an, wobei die Träger ein PCA-Calciumphosphat und einen biologisch wirksamen Stoff enthalten. Die erfindungsgemäßen Träger können fakultativ auch andere bioresorbierbare Materialien, Stoffe, die die Abtragungsrate modifizieren, Zellen oder andere Faktoren enthalten, die eine oder mehrere Eigenschaften des Trägers verändern (wie seine Festigkeit, Haftung, Injizierbarkeit, Reibungseigenschaften, etc.). Ein Vorteil des erfindungsgemäßen Delivery Systems besteht darin, dass es eine hohe lokale Konzentration des Arzneimittels ermöglichen kann, was bei Arzneimitteln, die toxische Nebenwirkungen aufweisen, und außerdem bei instabilen Arzneimitteln besonders günstig ist.
Die Erfindung gibt außerdem Verfahren für die Herstellung von Delivery Vehicles, Verfahren zur Veränderung der Eigenschaften von Delivery Vehicles und Verfahren zur Abgabe von biologisch wirksamen Stoffen an einen Ort an. Bevorzugte Orte für die Abgabe umfassen sowohl Orte in vitro als auch Orte in vivo. Die Delivery Vehicles der Erfindung sind zur Abgabe beim Menschen oder Tier geeignet. Bevorzugte Orte in vivo umfassen Knochen, intramuskuläre Orte, interperitoneale Orte, subkutane Orte, das zentrale Nervensystem und Okulare Orte.
Die Implantate können ferner ergänzende Komponenten wie biologisch wirksame Stoffe oder Faktoren enthalten, die die Eigenschaften verändern (wie Resorbierbarkeit, Festigkeit, Haftung, Injizierbarkeit, Reibungseigenschaften, etc.).
Die Erfindung gibt außerdem an: Verfahren für die Herstellung solcher Implantate; Verfahren für die Bildung von Knochen oder Knorpel in vivo oder in vitro an natürlichen oder ektopischen Stellen; oder Verfahren zur Augmentation von Knochen und Verfahren zur Diagnose von Krankheitszuständen durch Testen des Gewebebildungspotentials von aus einem Wirt isolierten Zellen werden ebenfalls beschrieben.
Beschreibung der Zeichnungen
1 ist eine hochauflösende transmissionselektronenmikroskopische Aufnahme des reaktiven amorphen Calciumphosphats, die die Körner mit einer Größe im Nanometerbereich in Clustern mit relativ unscharfen Grenzen und teilweise eingebettet ohne Form (Pfeile) zeigt;
2 ist ein energiedispersives, mit der Elektronenstrahlmikrosonde aufgenommenes Spektrum des erfindungsgemäßen reaktiven amorphen Calciumphosphats nach Erwärmen im Vakuum, das zu einem Ca/P-Verhältnis von 1,58 geführt hat;
3 zeigt die Löslichkeitskurve eines wenigkristallinen apatitischen Calciumphosphats, das aus dem erfindungsgemäßen amorphen Calciumphosphat erhalten wurde, im Vergleich mit kristallinem Hydroxyapatit. Es wird auf die höhere Löslichkeit des erfindungsgemäßen Materials im Vergleich mit einer kristallineren Form von Hydroxyapatit hingewiesen, die über die Menge der bei 37°C in Lösung gegangenen Calciumionen bestimmt wurde;
4 zeigt Röntgenbeugungsbilder von (a) reaktiven amorphen Calciumphosphat und (b) Dicalciumdiphosphat, die in einer Umsetzung zur Bildung eines erfindungsgemäßen Knochenersatzmaterials verwendet werden;
5a–d sind Röntgenbeugungsbilder, die das Fortschreiten der Reaktion eines Gemisches von reaktivem amorphen Calciumphosphat und Dicalciumdiphosphat zur Bildung eines erfindungsgemäßen PCA-Materials zeigen;
6 ist ein Infrarotspektrum von (a) Dicalciumphosphat-Dihydrat, (b) erfindungsgemäß aktiviertem ACP und (c) dem erfindungsgemäßen PCA-Material;
7 ist ein Röntgenbeugungsbild von natürlichem Knochengewebe;
8 zeigt in einem Säulendiagramm die Partikelgrößenverteilung für verschiedene, in Beispiel 5 beschriebene Formulierungen;
9 zeigt die Verwendung des erfindungsgemäßen PCA-Materials in einer Vielzahl von verschiedenen Stellen in Knochen;
10 zeigt mikroskopische Aufnahmen von tibialen Defekten, die entweder unbehandelt sind (10a) oder mit einem erfindungsgemäßen PCA-Material behandelt wurden (10b); in 10a gibt der kleine Pfeil eine Grenze des Defekts an; die große Pfeilspitze befindet sich an dem noch unverbrückten Defekt. In 10b kennzeichnen große Pfeilspitzen eine Grenze des Defekts. In beiden Figuren ist der Knochen decalcifiziert, die Präparate wurden mit Hämatoxylin und Eosin behandelt, wobei die Vergrößerung in beiden Figuren 4-fach ist;
11 ist eine mikroskopische Aufnahme von caninem trabekulären Knochenwachstum in einem Defekt 8 Wochen nach dem chirurgi schen Eingriff, der mit dem erfindungsgemäßen Träger für die Abgabe eines biologisch wirksamen Stoffes behandelt wurde (Vergrößerung 10-mal; decalcifiziert; Hämatoxylin und Eosin);
12 ist eine mikroskopische Aufnahme eines caninen kortikalen Defekts 4 Wochen nach dem chirurgischen Eingriff, der mit dem erfindungsgemäßen Träger für die Abgabe eines biologisch wirksamen Stoffes behandelt wurde (Vergrößerung 4-mal; decalcifiziert, Light Green Basic Fuchsin);
13 zeigt mikroskopische Aufnahmen von unbehandelten (13a) und behandelten (13b) Tibiadefekten beim Kaninchen 4 Wochen nach dem chirurgischen Eingriff (Vergrößerung 4-mal; decalcifiziert; Masson Trichrom);
14 ist eine photographische Aufnahme eines außerhalb eines Knochens liegenden Bereichs, in dem Knorpelbildung stattgefunden hat (Hämatoxylin und Eosin);
15 ist ein Röntgenbeugungsbild von PCA-Calciumphosphat, das gemäß Beispiel 1–2 hergestellt wurde;
16 ist ein Röntgenbeugungsbild von PCA-Calciumphosphat, das gemäß Beispiel 1–4 hergestellt wurde;
17 ist ein Röntgenbeugungsbild von PCA-Calciumphosphat, das mit einem passiven Al₂O₃-Promotor hergestellt wurde, wobei die Al₂O₃-Peaks durch Linien dargestellt sind;
18 zeigt eine XRD-Analyse von Material, das von Kaninchen zurückgewonnen wurde;
19 zeigt die FTIR-Analyse von Material aus Kaninchen;
20 zeigt die Ergebnisse zur Knochenneubildung und PCA-Resorption.
Beschreibung bevorzugter Ausführungsformen
PCA-Material
Das erfindungsgemäße PCA-Material ist in den ebenfalls anhängigen Anmeldungen U. S. S. N. 08/650,764 und/oder U. S. S. N. 08/446,182 beschrieben worden, wobei auf beide hier als Referenz Bezug genommen wird. Das Material wurde ebenfalls in einem Satz von in Verbindung stehenden Anmeldungen beschrieben, mit dem Titel "Träger für die Abgabe (Delivery Vehicle)"; "Umwandlung von amorphem Calciumphosphat zur Bildung einer neuen Biokeramik" (Conversion of Amorphous Calcium Phosphate to Form a Novel Bioceramic"; "orthopädische und dentale keramische Implantate "Orthopedic and Dental Ceramic Implants"; und "bioaktive keramische Verbundwerkstoffe "Bioactive Ceramic Composites", wobei alle das gleiche Datum aufweisen und wobei hier auf diese als Referenz Bezug genommen wird. Wegen der Breite der Offenbarungen in jeder dieser in Bezug stehenden Anmeldungen werden hier die Details zu dem erfindungsgemäßen PCA-Material nicht weiter vertieft. Eine Zusammenfassung seiner Eigenschaften wird genügen.
Das erfindungsgemäß verwendete PCA-Material ist durch seine Biokompatibilität, seine biologische Resorbierbarkeit und seine minimale Kristallinität gekennzeichnet. Das Material kann sehr porös und schnell resorbierbar sein oder eine verminderte Porosität aufweisen und langsam resorbiert werden. Sein kristalliner Charakter entspricht im Wesentlichen dem von natürlichem Knochen; ihm fehlt der höhere Grad an Kristallinität, der bei dem im Stand der Technik be kannten Knochenersatzmaterial zu finden ist. Das erfinderische PCA-Material ist auch biokompatibel und für den Träger nicht schädlich.
Das erfindungsgemäße PCA-Material kann einem Patienten in der Form einer Paste oder in der Form einer Kittmasse implantiert werden, d. h. als hydratisierter Precursor. Da die erfindungsgemäße Reaktion, die zu dem gehärteten PCA-Material führt, außerhalb des Körpers initiiert werden kann und bei Raumtemperatur langsam fortschreitet, ist die Gefahr, dass das Material vor der Anwendung an der Implantationsstelle "härtet" ("set up") und unbrauchbar wird, auf ein Mindestmaß gebracht. Die Reaktion ist bei Körpertemperatur deutlich schneller und das Material härtet an Ort und Stelle. Dieses Merkmal ist in der Chirurgie besonders zweckmäßig, wo gewöhnlich eine patientenspezifische Anpassung der Einheit an die Implantationsstelle erforderlich ist. In einigen bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung wird beispielsweise ein antibiotischer Wirkstoff und/oder ein regenerativer Faktor an einer Knochenbruchstelle abgegeben. In solchen Ausführungsformen wird die erfindungsgemäße Paste, die den therapeutischen Wirkstoff enthält, aufgebracht auf und verwendet zum Füllen der Bruchstelle und zur Abgabe des gewünschten Stoffes.
Alternativ hierzu kann das erfindungsgemäße PCA-Material außerhalb des Körpers vorgehärtet, mit dem gewünschten biologischen Stoff oder der Zelle oder den Zellen beladen und später implantiert werden. Diese Vorgehensweise ist dann zweckmäßig, wenn patientenspezifische Formen nicht wesentlich sind und wenn die Herstellung einer großen Zahl von Implantaten gewünscht wird.
Im Allgemeinen wird die erfindungsgemäße Bildungsreaktion nach der Applikation an der Implantationsstelle abgeschlossen. Das Material härtet typischerweise in weniger als fünf Stunden und härtet im Wesentlichen in etwa einer bis fünf Stunden unter physiologischen Bedingungen. Vorzugsweise ist das Material innerhalb von etwa 10 bis 30 Minuten im Wesentlichen ausgehärtet. Die Konsistenz und die Formbarkeit des PCA-Materials sowie die Geschwindigkeit der Bildungsreaktion kann in Abhängigkeit von dem therapeutischen Zweck abgeändert werden, indem einige einfache Parameter modifiziert werden.
Die Resorbierbarkeit des in der vorliegenden Erfindung verwendeten PCA-Materials ist der Kombination seiner Porosität, seiner chemischen Zusammensetzung und seiner Kristallinität zuzuschreiben. Apatite haben einen verminderten kristallinen Charakter und zeigen eine etwas größere Löslichkeit in wässrigen Systemen im Vergleich mit kristallineren Arten. Es wird angenommen, dass die geringe Kristallinität des erfindungsgemäßen PCA-Materials und/oder die Gegenwart von stabilen amorphen Domänen innerhalb des Materials seine Resorbierbarkeit in biologischen Systemen fördert.
Die Resorbierbarkeit des PCA-Materials gemäß der vorliegenden Erfindung kann modifiziert werden, indem seine Dichte und/oder Porosität verändert wird. Die Porosität erleichtert die Diffusion der Substanzen in das und aus dem Inneren des Materials und bei einigen Anwendungen die Penetration von Zellen und Zellprozesse in der Materialmatrix. Drug Delivery-Materialien mit niedriger Porosität neigen dazu, in vivo langsamer resorbiert zu werden als solche mit höherer Porosität. In einer Ausführungsform der Erfindung wird die Porosität durch die Verwendung eines trockenen Gemisches von Reaktanten mit eingestellter Partikelgröße vergrößert; in anderen Ausführungsformen werden Verfahren des chemischen oder physikalischen Ätzens und Auslaugens verwendet.
Die unterschiedlichen Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung führen daher zu PCA-Materialien mit unterschiedlichen Resorptionsraten. Die Auswahl von Reaktanten, Porosität, endgültiger Kri stallinität und Mengen und Arten der Kristallisationsinhibitoren, die verwendet werden, führen zu unterschiedlichen Ausführungsformen des erfindungsgemäßen PCA-Materials, sodass in den verschiedenen Ausführungsformen 1 g Material innerhalb eines gewünschten Zeitraums von 2 Wochen bis 1, 3, 6 oder 9 Monaten und bis zu 1 Jahr resorbiert wird (d. h. zu mindestens 80%, vorzugsweise 90–95% und noch bevorzugter > 95% resorbiert wird).
Nach einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird die Reaktion, die zu dem PCA-Material führt, ausgelöst, indem eine physiologische Salzlösung zu einem Gemisch von zwei trockenen Komponenten gegeben wird, sodass eine dicke Paste gebildet wird, die in etwa einer halben Stunde härtet. Andere wässrige Agentien, wie Serum, ein Gewebekulturmedium oder andere gepufferte Lösungen oder destilliertes Wasser können anstelle der Salzlösung verwendet werden. Das resultierende resorbierbare PCA-Material zeigt meistens "Calcium-Unterschuss" mit einem Verhältnis Calcium/Phosphat von weniger als 1,5, wobei zum Vergleich der ideale stöchiometrische Wert für Hydroxyapatit bei etwa 1,67 liegt.
Die Erfindung gibt einen Test zur Identifizierung geeigneter PCA-Materialien und reaktiver Vorläufer (Precursoren) an. Insbesondere werden die Precursoren kombiniert, mit einer begrenzten Menge Wasser angefeuchtet (sodass eine Paste oder Kittmasse gebildet wird) und zu einem PCA-Material härten gelassen. Es ist wünschenswert, dass die Vorläufer in einer feuchten Umgebung bei oder bei etwa Körpertemperatur härten können. Das gehärtete Produkt wird dann intramuskulär oder subkutan in ein Versuchstier eingebracht. Es ist wünschenswert, dass die Materialien, wenn sie als Pellet von mindestens 1 g implantiert werden, zumindest zu 80%, vorzugsweise 90–95% und noch bevorzugter > 95% innerhalb 1 Jahres (oder unter einem Jahr) resorbiert werden. Vorzugsweise kann das Material vollständig resorbiert werden. Im Allgemeinen ist es einfacher, die Re sorption von Grammmengen des Materials an einer subkutanen Stelle zu testen.
Das erfindungsgemäße PCA-Material wird in einer Reaktion gebildet, bei der mindestens ein amorpher Calciumphosphat(ACP)-Precursor, vorzugsweise ein aktiviertes ACP (siehe beispielsweise Beispiele 1 bis 4) verwendet wird. In einigen Fällen kann in der Reaktion nur ein ACP-Precursor verwendet werden, der in kontrollierter Weise ganz oder teilweise zu dem erfindungsgemäßen PCA-Material umgewandelt wird. Alternativ hierzu kann in der Reaktion ein Promotor verwendet werden, der einen oder mehrere zusätzliche Precursor umfasst (vorzugsweise eine oder mehrere Calcium- und/oder Phosphatquellen), die mit dem ACP zusammen verwendet werden, um das erfindungsgemäße PCA-Material zu bilden. Es kann auch ein nicht an der Reaktion teilnehmender Promotor verwendet werden, um die Umwandlung des aktivierten ACP in das erfinderische PCA-Material zu erleichtern. Auf jeden Fall werden Reaktionen, die außerhalb des Körpers initiiert werden können, die in einer pastenartigen Konfiguration fortgesetzt werden können und die bei 37°C deutlich schneller ablaufen und zu einem gehärteten Calciumphosphat führen, besonders bevorzugt.
Die Umwandlung von ACP in ein PCA-Material wird in der Gegenwart von Wasser begünstigt. Im Allgemeinen wird das ACP in Pulverform bereitgestellt und mit anderen Reaktanten (beispielsweise einem zweiten Calciumphosphat) kombiniert und dann einer begrenzten Wassermenge ausgesetzt, sodass eine Paste oder Kittmasse gebildet wird. Der hydratisierte Precursor härtet im Anschluss daran und die Härtung ist mit der Bildung des PCA-Materials verbunden. Es ist ein Ziel der Erfindung, Verfahren anzugeben, die die Umwandlung von ACP in kontrollierter Weise in ein PCA-Material fördern, eine hydratisierte Precursor-Paste oder Precursor-Kittmasse bilden, die in vorhersehbarer Weise härtet und bei dentalen Anwendungen, orthopädischen Anwendungen, bei der Arzneimittelabgabe, Zelltherapie und/oder anderen Applikationen verwendet werden kann. Die Promotoren, die verwendet werden, um die Umwandlung zu erreichen, können selbst in PCA-Material umgewandelt werden oder sie können an anderen chemischen oder physikalischen Reaktionen teilhaben. Einige bevorzugte Promotoren können während der Umwandlung auch unverändert bleiben und so eine katalytische Funktion haben oder als Nukleationsmittel fungieren. In dieser Hinsicht sind Substanzen besonders geeignet, die reaktive Oberflächen zur Verfügung stellen, die die Kristallisation schwach fördern, um das PCA-Calciumphosphat zu bilden.
Nur ACP-Precursor:
Wenn amorphes Calciumphosphat als einziger Precursor zur Bildung eines resorbierbaren PCA-Materials verwendet wird, ist es wichtig, die natürliche Neigung von ACP zur Umwandlung in hochkristallines Hydroxyapatit zu kontrollieren. Auf der anderen Seite sollte die Zeitspanne für die Umwandlung so sein, dass die Umwandlung schnell genug ist, um für chirurgische Zwecke verwendbar zu sein. Ein Ansatz besteht darin, einen ACP-Precursor, der einen Inhibitor der Kristallbildung enthält (beispielsweise das ACP des Beispiels 1), mit einem ACP zu kombinieren, das keinen Inhibitor für die Kristallbildung enthält (beispielsweise einen Promotor). Die Reaktanten können, in trockenem Zustand mit geeigneter Partikelgröße und einem Überschuss an Inhibitor-haltigem ACP, vermischt werden. Die Reaktanten können dann kristallbildenden Bedingungen ausgesetzt werden, beispielsweise kann Wasser zugegeben werden, wonach die Temperatur erhöht wird (wie dies beispielsweise nach dem Einbringen in den Körper der Fall ist), um die Reaktanten in das erfindungsgemäße PCA-Material umzuwandeln. Weitere Verfahren der kontrollierten Umwandlung schließen die Verwendung von Katalysatoren ein.
ACP-Precursor plus weitere Calciumphosphatquellen:
ACP kann mit einer zweiten Calciumquelle (einschließlich eines zweiten ACPs) unter Anwendung aller reaktionsfördernden Verfahren umgesetzt werden. Nach bevorzugten Ausführungsformen ist die zweite Calciumquelle selbst ein Promotor. Die Reaktion, die gefördert wird, ist die Umwandlung eines amorphen Calciumphosphats zu einem gehärteten nanokristallinen oder wenigkristallinen apatitischen Calciumphosphat. Solche Reaktionen umfassen Säure/Base-, Verschiebungs-, Substitutions- und Hydrolysereaktionen und auch rein physikalische oder mechanische Reaktionen (beispielsweise Mahlen, Mischen). Es können auch katalytische Umwandlungen wie eine oberflächenkatalysierte Umwandlung von ACP in ein PCA-Material verwendet werden. Bei allen Reaktionen ist es wichtig, dass das ACP während der Reaktion seinen signifikant amorphen Charakter behält. Die Gesamtkristallinität in dem eingesetzten ACP sollte insbesondere die in dem Endprodukt gewünschte Kristallinität nicht übersteigen. Einige Reaktionen können daher die Stabilisierung der amorphen Natur des ACP während der Umsetzungsdauer erfordern. Beispiele für Inhibitoren der Kristallbildung, die im Stand der Technik für eine solche Stabilisierung zweckmäßig sind, umfassen Carbonat, Pyrophosphat und Magnesium.
In einigen bevorzugten Ausführungsformen wird die ACP-Komponente durch Wärme aktiviert, um die Umwandlung zu erleichtern, die durch den zweiten calciumhaltigen Reaktanten oder andere Promotoren gefördert wird. Beispiele für geeignete zweite Promotoren umfassen DCPD, weitere kristalline oder wenigkristalline Calciumphosphate, Calciumquellen, Phosphatquellen oder ein zweites ACP. Weitere Methoden zur Förderung der Umwandlung, wie Katalyse oder die Verwendung von ionischen Lösungsmitteln oder Promotoren für die Nukleation können ebenfalls verwendet werden, um die Reaktion zwischen den Substanzen zu fördern. Das zweite reagierende Calciumphosphat kann eine beliebige kristalline Struktur aufweisen und es sollte so sein, dass es mit dem ersten ACP entweder direkt reagiert oder über die Verwendung von reaktionsfördernden Trägern, ioni schen Lösungsmitteln oder Katalysatoren. Geeignete Reaktionsbedingungen werden ermittelt, indem eine schnelle Härtung bei 37°C nach Mischen der Reaktanten und Zugabe von Wasser gezeigt wird.
Die Bildungsreaktion des Abgabeträgers kann auch so festgelegt werden, dass ein Endprodukt gebildet wird, das porös ist. Nach einer Ausführungsform führt die Verwendung eines trockenen Gemisches von Reaktanten mit eingestellter Partikelgröße zu einem porösen Material. Weitere Verfahren zur Erhöhung der Porosität, wie chemische oder physikalische Ätzverfahren und Auslaugverfahren, können ebenfalls verwendet werden.
Die vorliegende Erfindung gibt ein neues Verfahren für die Aktivierung eines Standardpräzipitats von amorphem Calciumphosphat zu hochreaktiven amorphen Feststoffen an. Die amorphen Feststoffe können in den oben beschriebenen Reaktionen zur Bildung eines wenigkristallinen oder nanokristallinen synthetischen apatitischen Calciumphosphats verwendet werden, das Bioaktivität, Bioresorbierbarkeit und strukturelle Integrität aufweist. Das neue amorphe Material kann mit anderen Calciumphosphaten bei oder unter 37°C umgeformt werden, um ein knochenartiges Material zu bilden, das aus wenigkristallinem apatitischen Calciumphosphat besteht.
Säure-Base-Reaktionen von herkömmlichen kristallinen Calciumphosphaten des Standes der Technik führen zu kaum umgesetzten Feststoffen mit Reaktionsprodukten, die zu kristallin sind, als dass sie in lebendem Gewebe in ausreichender Weise resorbiert werden könnten. Die Reaktionen nach dem Stand der Technik sind im Allgemeinen unvollständig und die Reaktionsprodukte sind inhomogen. Erfindungsgemäßes amorphes Calciumphosphat reagiert dagegen schnell und vollständig mit einer Vielzahl von Calciumphosphaten und anderen calcium- oder phosphorhaltigen Materialien und führt zu einem homogenen Produkt.
Die Ursache für die verbesserte Reaktivität des ACP der vorliegenden Erfindung ist nicht vollständig verstanden worden; es wird jedoch angenommen, dass sie mit der Amorphizität (fehlende Kristallinität) und in einigen Ausführungsformen Ionenpaarfehlstellen in dem Material einhergeht, die durch das erfindungsgemäße Verfahren gebildet werden. Die Fehlstellen können reaktive Stellen für nachfolgende Reaktionen bilden. Diese Beobachtungen werden weiter unten ausführlicher diskutiert.
Das erfindungsgemäße Verfahren ermöglicht es, anfänglich amorphe Calciumphosphatpartikel von weniger als 1 000 Å, vorzugsweise 200 bis 500 Å und noch bevorzugter 300 Å zu bilden, wobei das weitere Wachstum der Partikel durch schnelles Fällen des Produkts aus der Lösung eingeschränkt wird. Während der Reaktion von Calcium- und Phosphationenquellen zur Bildung eines amorphen Calciumphosphats kann ein drittes Ion in die Lösung eingebracht werden, sodass dieses dritte Ion anstelle der dreiwertigen PO₄ ^3–-Gruppe(n) in die Struktur des amorphen Niederschlags eingebaut wird. Da einige PO₄ ^3–- durch das dritte Ion ersetzt werden, nimmt die Anzahl der PO₄ ^3– insgesamt ab, sodass das Ca/P-Verhältnis des amorphen Niederschlags (im Vergleich mit standardamorphem Calciumphosphat) sinkt und die Valenz oder der Ladungszustand des Calciumphosphats modifiziert wird. Die amorphen Feststoffe können im Anschluss daran schnell gefriergetrocknet werden, sodass die chemischen und physikalischen Eigenschaften des Materials erhalten bleiben. Die amorphen Feststoffe können dann unter speziell gewählten Bedingungen behandelt werden, um zumindest einige dritte Ionen zu entfernen. Wenn das dritte Ion Calciumcarbonat ist, führen spezielle Temperatur- und Druckbedingungen zur Verminderung des Gesamtkohlenstoffs wahrscheinlich als gasförmiges Kohlendioxid aus dem amorphen Feststoff, wobei die Amorphizität erhalten bleibt.
Das resultierende Material ist ein amorpher Feststoff mit einem größeren Ca/P-Verhältnis als es typischerweise in amorphen Calciumphosphaten vorliegt, wobei bei diesen das Verhältnis in der Vergangenheit im Allgemeinen mit 1,50 angegeben wurde. Das Entfernen von Kohlenstoff aus dem Material resultiert in Fehlstellen in der interstitiellen Struktur in den amorphen Feststoffen, was sie zu einem hochreaktiven Feststoff macht. Es können verschiedene mögliche Quellen für Fehlstellen vorhanden sein. Das Material besitzt eine Porosität, die die Reaktivität durch unterschiedliche Maßnahmen fördert, wie eine erhöhte Oberfläche. Das Material kann auch durch Entfernen des dritten Ions im Hinblick auf das stöchiometrische Verhältnis verändert werden. Diese stöchiometrische Veränderung kann in einem Ladungsungleichgewicht resultieren, das für die erhöhte Reaktivität des amorphen Calciumphosphats verantwortlich ist.
Es ist wünschenswert, den amorphen Charakter in dem Material während des gesamten Verfahrens im Wesentlichen aufrechtzuerhalten. Wenn insgesamt (einkristalline Bereiche) oder in lokalen Domänen (mikrokristalline Bereiche) während des Verfahrens oder in das Endprodukt übermäßig Kristallinität eingebracht wurde, war der Feststoff weniger reaktiv. Das resultierende hochreaktive Calciumphosphat ist amorph und weist ein Calcium/Phosphor-Verhältnis im Bereich von 1,55 bis 1,65 auf. Nach einer bevorzugten Ausführungsform weist das amorphe Calciumphosphat ein Ca/P-Verhältnis von etwa 1,58 auf.
Der amorphe Zustand des amorphen Calciumphosphats wird induziert, indem die Rate und Dauer des Präzipitationsprozesses kontrolliert wird. Das amorphe Calciumphosphat der vorliegenden Erfindung wird unter solchen Bedingungen aus der Lösung gefällt, bei denen die anfängliche Präzipitation schnell ist. Schnelle Präzipitation resultiert in der Bildung von vielen extrem schmalen Calciumphosphatnuclei. Ferner führt schnelles Kristallwachstum oder Kornwachstum zur Bildung von mehr Defekten in dem Korn, und so zu einer größeren Löslichkeit. Am extremen Ende des Spektrums ist das Kristall- oder Körnerwachstum so groß und die Defektdichte so signifikant, dass ein amorphes Calciumphosphat resultiert. Amorphes Calciumphosphat ist gelartig und umfasst feste Lösungen mit variablen Zusammensetzungen. Diese Gele haben keine langreichweitige Struktur, sie sind aber homogen, wenn sie im Angström-Maßstab gemessen werden. Unter physiologischen Bedingungen haben diese amorphen Verbindungen hohe Löslichkeiten, hohe Bildungsraten und hohe Umwandlungsraten zu wenigkristallinem apatitischen Calciumphosphat.
Die nach diesem Verfahren gebildeten Feststoffe aus amorphem Calciumphosphat behalten ihre amorphe Natur ausreichend lange, damit sie als im Wesentlichen amorphe Feststoffe in die Endreaktion eingebracht werden können. Sie können auch mit anderen Feststoffen oder Lösungen, die Phosphate enthalten, vermischt und umgesetzt werden, um Feststoffe zu bilden, die eine homogene Verteilung von Kristallen mit einer Größe im Nanometerbereich enthalten. Da das amorphe Calciumphosphat vollständig mit anderen Feststoffen reagiert, macht das Ca/P des resultierenden Feststoffes das gesamte Calcium und den gesamten Phosphor aus einer solchen Reaktion aus, d. h. es findet eine tatsächlich vollständige Reaktion statt. Wenn eine geeignete molare Phosphorkonzentration der Lösung oder Feststoffe mit dem neuen amorphen Calciumphosphatmaterial umgesetzt wird, erhält man ein wenigkristallines apatitisches Calciumphosphatmaterial (Ca/P 1,1–1,9). Durch die vorliegende Erfindung kann also die chemische Zusammensetzung des resultierenden Produkts festgelegt und modifiziert werden, wodurch eine weitere Methode angegeben wird, die Bioaktivität des Endprodukts zu kontrollieren, das als Träger für die Abgabe oder Zeltgerüst verwendet wird.
Nach einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird eine Lösung hergestellt, die Calcium- und Phosphationen und ein drittes Ion in einer Konzentration, bei einem pH-Wert und bei einer Temperatur enthält, die die schnelle Keimbildung und das schnelle Ausfällen von Calciumphosphat fördern. Wenn das Ausfällen ausreichend schnell ist, bildet sich ein amorphes, gelartiges Calciumphosphat. Da die thermodynamisch günstige kristalline Form des Hydroxyapatits begünstigt wird, wenn die Reaktionsrate vermindert wird, können verschiedene Verfahrensschritte zur Erhöhung der Reaktionsrate durchgeführt werden, um sicherzustellen, dass eine amorphe Verbindung erhalten wird. Die folgenden Faktoren werden unter anderem in Betracht gezogen, wenn eine Lösung für das schnelle Ausfällen des amorphen Calciumphosphats gemäß der vorliegenden Erfindung konzipiert wird.
Bevorzugte Bedingungen:
Schnelles Mischen von Calcium- und Phosphatquellen, um die Reaktionsrate zu erhöhen. Die Reaktionsrate wird erhöht, um als Produkt nicht stabile Phasen zu begünstigen. Wird jedem Ion mehr Reaktionszeit gelassen, um zur Bildung eines Feststoffes in korrekter Weise in Kontakt zu kommen, ergibt sich eine thermodynamisch günstigere, kristalline und stabile Struktur.
Bevorzugte Calcium- und Phosphatquellen:
Die Verwendung von hochkonzentrierten oder fast übersättigten Lösungen gewährleistet, dass eine schnellere Reaktion abläuft.
Bevorzugte Temperatur:
Die Reaktion kann zwar bei Raumtemperatur durchgeführt werden, Temperaturen in der Nähe des Siedepunkts zur Erhöhung der Konzentration eines Reaktanten sind jedoch ein mögliches Mittel, um die Reaktionsrate zu erhöhen.
In einer Ausführungsform wird eine wässerige Lösung von Calciumionen, Phosphationen und Carbonationen schnell vermischt, um ei nen carbonathaltigen amorphen Calciumphosphatfeststoff zu erhalten. Die relativen Konzentrationen der Ionen sind so gewählt, dass ein Niederschlag mit dem gewünschten Ca/P-Verhältnis erhalten wird. Das Carbonation ersetzt in dem amorphen Calciumphosphat ein Phosphation. Das carbonathaltige amorphe Calciumphosphat kann durch Fällen aus einer wässerigen Carbonatlösung erhalten werden. Geeignete wässerige Carbonatlösungen umfassen beispielsweise Bicarbonatlösungen, Natriumcarbonatlösungen, Kaliumcarbonatlösungen. Im Rahmen der Erfindung können außerdem nicht wässerige Lösungen verwendet werden.
Die Verwendung eines carbonathaltigen Materials ist zweckmäßig, da es die Manipulation des Ca/P-Verhältnisses durch Ersatz von PO₄ ^3– durch CO₃ ^2– ermöglicht. Außerdem ist bekannt, dass die Gegenwart von CO₃ ^2– das Auftreten der Kristallinität in dem amorphen Calciumphosphat verzögert. Es hat sich jedoch herausgestellt, dass andere Ionen oder Gemische von Ionen anstelle der Carbonationen oder zusätzlich zu den Carbonationen geeignet sind, um das Ca/P-Verhältnis zu verändern und um reaktive Leerstellen in das amorphe Calciumphosphat einzubringen, wie beispielsweise Nitrat, Nitrit, Acetat, Mg² ⁺- und P₂O₇ ^4–-Ionen.
Das gefällte amorphe Calciumphosphat kann gewonnen und vor der Aktivierung filtriert werden. Dieser Schritt wird vorzugsweise in einem Kühlraum oder bei Temperaturen unter Raumtemperatur durchgeführt, um den amorphen Zustand des gewonnen Niederschlags zu bewahren. Die Gewinnung kann üblicherweise durch geeignete herkömmliche Mittel erfolgen, beispielsweise Schwerkraftfiltration, Vakuumfiltration oder Zentrifugieren, ist jedoch nicht darauf beschränkt. Der gewonnene Niederschlag ist gelatineartig und er wird mehrmals mit destilliertem Wasser gewaschen.
Der gewaschene Niederschlag wird dann unter beliebigen Bedingungen getrocknet, die den amorphen Charakter des Materials bewahren. Gefriertrocknung ist geeignet, jedoch nicht die ausschließliche Technik. Der Niederschlag wird eingefroren und während er gefroren erhalten wird, wird er getrocknet und der Großteil der enthaltenen Flüssigkeit wird entfernt. Dies kann erreicht werden, indem der gefrorene Niederschlag für eine vorgegebene Zeitspanne in eine Vakuumkammer gegeben wird. Die Gefriertrocknung erfolgt üblicherweise bei der Temperatur von flüssigem Stickstoff für eine Zeitspanne im Bereich von 12–78 h, vorzugsweise für etwa 24 Stunden und unter Vakuum im Bereich von 10^–1–10^–4 und vorzugsweise 10^–2 Torr. Ein bevorzugtes Verfahren umfasst die Gefriertrocknung, da die üblicherweise bei der Lyophilisation eingesetzten tiefen Temperaturen die weitere Kristallisation des Materials verhindern. Das amorphe Calciumphosphat wird als Ergebnis als extrem feines, frei fließendes Pulver erhalten.
Das getrocknete ACP kann dann zu einem hochreaktiven ACP aktiviert werden. Wenn in dem ACP Carbonat vorliegt, kann das ACP-Pulver nach einer bevorzugten Ausführungsform erwärmt werden, um das verbleibende freie Wasser und Hydratwasser auszutreiben und Kohlenstoff wahrscheinlich durch Zersetzung von CO₃ ^2– zu CO₂ und Sauerstoff zu entfernen. Das Erwärmen erfolgt bei einer Temperatur unter 500 bis 600°C, jedoch über 425°C, um zu verhindern, dass amorphes Calciumphosphat in kristallinen Hydroxyapatit umgewandelt wird. Das Erwärmen erfolgt vorzugsweise bei einer Temperatur im Bereich von 450–460°C für vorzugsweise 1/2 bis 6 Stunden.
Geringe Kristallinität und Leerstellen (Porosität und/oder stöchiometrische Veränderungen) können zu der beobachteten höheren Reaktivität des erfindungsgemäßen aktivierten amorphen Calciumphosphats führen. Dies wird durch die folgenden Beobachtungen gestützt. Es hat sich gezeigt, dass ein carbonathaltiges amorphes Calcium phosphat, das auf 525°C erwärmt wurde, einen höheren kristallinen Anteil und entsprechend eine geringere Reaktivität aufweist. Amorphes Calciumphosphat, das nur auf 400°C erwärmt wurde, behält seine amorphe Charakteristik, zeigt jedoch eine geringere Reaktivität. Es wird angenommen, dass die Abnahme der Reaktivität mit dem höheren Carbonatgehalt (und weniger Fehlstellen) zusammenhängt, was an Proben, die bei dieser niedrigeren Temperatur behandelt wurden, im IR zu sehen ist. Diese Beobachtungen legen nahe, dass sowohl die Amorphizität als auch der kleinere Kohlenstoffgehalt (Leerstellen) bezüglich der Reaktivität einen Faktor darstellen. Dies soll keinesfalls eine ausschließliche Erklärung für die Reaktivität darstellen. Andere Grundlagen für die beobachtete Reaktivität werden von der Erfindung mit umfasst.
Das resultierende pulverförmige amorphe Calciumphosphat ist ein hochreaktives amorphes Calciumphosphatmaterial mit einem Ca/P-Verhältnis im Bereich von 1,1 bis 1,9, vorzugsweise 1,55 bis 1,65 und besonders bevorzugt etwa 1,58. Das Pulver wurde durch eine Vielzahl von analytischen Verfahren charakterisiert.
In 1 ist eine hochauflösende Transmissionselektronenmikroskopische Aufnahme gezeigt, um die morphologischen Eigenschaften und die Größe im Anströmbereich des bevorzugten reaktiven amorphen Calciumphosphats gemäß der Erfindung zu zeigen. Bevorzugte Partikelgrößen sind kleiner 1 000 Å, vorzugsweise liegen sie im Bereich von 300 bis 400 Å. Es wird auf die unscharfen Grenzen, die die kugelförmigen Cluster trennen, ohne klare Kanten und Oberflächen hingewiesen, im Gegensatz zu kristallinen Materialien.
Die amorphe Natur des erfindungsgemäßen reaktiven ACP ist durch ein Röntgenbeugungsbild gekennzeichnet, das an keiner Position der Beugungswinkel, die bekannten kristallinen Calciumphosphaten entsprechen, scharfe Peaks aufweist (4a). Die unter Verwendung von wellenlängendisperser Röntgenmikroanalyse an einer Elektronenmikrosonde durchgeführte Ca/P-Messung des gleichen Materials nach Wärmebehandlung ergab, dass Ca/P 1,58 beträgt (2).
Diese Eigenschaften zeigen, dass die Amorphizität während des Prozesses insgesamt erhalten bleibt, obwohl es in den amorphen Calciumphosphatfeststoffen im lokalen Mittel zu einer Veränderung bestimmter Gruppen kommt.
Nach einer weiteren bevorzugten Ausführungsform wird das hochreaktive amorphe Calciumphosphat mit einem zweiten Calciumphosphat umgesetzt, um ein PCA-Material zu bilden. Wie oben diskutiert wurde, ist kristallines Hydroxyapatit das thermodynamisch bevorzugte Reaktionsprodukt, das gewöhnlich als unter physiologischen Bedingungen nicht resorbierbar beschrieben wird. Die Verwendung eines amorphen Calciumphosphats, das schnell und vollständig unter Bildung einer apatitischen Verbindung ohne signifikante Kristallisation umgewandelt werden kann, stellt einen neuen Weg zu wenigkristallinem apatitischen Calciumphosphat dar, das unter physiologischen Bedingungen resorbierbar ist.
Das amorphe Calciumphosphatpulver der vorliegenden Erfindung kann mit einem Promotor vermischt werden und dabei unter Bildung eines PCA-Materials umgewandelt werden. Diese Reaktion kann bei Raumtemperatur beim Mischen des Pulvers mit beliebigen einer Vielzahl sowohl von sauren als auch basischen Calciumphosphaten in der Gegenwart einer begrenzten Menge eines Fluids auftreten, die beispielsweise Wasser, Salzlösung, Pufferlösung, Serum oder Gewebekulturmedium, wobei das Fluid nicht auf diese Aufzählung beschränkt ist. In Abhängigkeit von der Menge des zugegebenen Fluids resultiert das Gemisch des erfindungsgemäßen Calciumphosphats und eines zweiten Calciumphosphats in einer in hohem Maße form baren und/oder in hohem Maße injizierbaren Paste mit unterschiedlichen Konsistenzstufen der Paste.
Das Verfahren zur Herstellung des Promotors und/oder des ACP beeinflusst die Leichtigkeit, mit der der hydratisierte Precursor in das PCA-Material umgewandelt wird. Wie oben dargelegt wurde, beeinflusst das Verfahren des Mischens der pulverförmigen Reaktanten vor der Zugabe der Flüssigkeit die Reaktivität des Systems. Das Mischen mit der Hand unter Verwendung eines Mörsers und Stößels führt daher nicht zu einem so reaktiven System wie ein ausgedehntes Mahlen der pulverförmigen Reaktanten mit der Maschine. Wenn Promotoren verglichen werden, ist es daher wichtig, standardisierte Herstellungsbedingungen zu verwenden.
Es wird angenommen, dass die Umwandlung von ACP in reaktives PCA-Calciumphosphat ein oberflächenkatalysiertes Phänomen ist. Falls dies so ist, kann es günstig sein, einen speziellen Promotor mit einer reproduzierbaren Oberfläche herzustellen. Spezielle Oberflächen von ACP- und Promotor-Pulvern können eingestellt werden, um die Reaktionsbedingungen und die Eigenschaften des PCA-Materials zu kontrollieren. Es ist daher vorteilhaft, einen Promotor mit einer bekannten Korngrößenverteilung bereitzustellen, um die Reaktion reproduzierbar zu kontrollieren. Für die Selektion spezieller Korngrößen sind Standardsiebverfahren geeignet. Es wurde gezeigt, dass die Oberflächen mit der Druckfestigkeit und möglicherweise der Porosität und Resorbierbarkeit des PCA-Materials korreliert sind.
Viele calcium- oder phosphathaltige Verbindungen können bei der Härtungsreaktion als teilnehmende Promotoren verwendet werden. Ein Calciumphosphat-Promotor kann eine beliebige kristalline Struktur aufweisen und sollte so gewählt werden, dass er mit dem ACP entweder direkt oder unter Verwendung von steigernden Promotoren reagiert. Es werden die teilnehmenden Promotoren bevorzugt, die selbst über eine zwischenzeitlich gebildete PCA-Calciumphosphatphase in Hydroxyapatit umgewandelt werden können.
Geeignete Calciumphosphate für die Verwendung als Promotoren mit dem hier beschriebenen ACP umfassen neutrale, basische und saure Calciumphosphate und bevorzugt apatitische Phosphate, die die geeignete Stöchiometrie für die Reaktion liefern, damit ein apatitisches Calciumphosphat erhalten wird. Nach einer bevorzugten Ausführungsform wird ein saures (pH 5–7) Calciumphosphat verwendet. Geeignete Calciumphosphate umfassen, sind aber natürlich nicht darauf beschränkt, Calciummetaphosphat, Dicalciumphosphat-Dihydrat, Heptacalciumdecaphosphat, Tricalciumphosphate, Calciumpyrophosphat-Dihydrat, wenigkristallines apatitisches Calciumphosphat gemäß der Erfindung, Calciumpyrophosphat, Octacalciumphosphat, Tetracalciumphosphat und weitere ACPs. Andere Feststoffe, die eine Quelle für Phosphat oder Calcium sind, wie beispielsweise CaO, CaCO₃, Calciumacetat und H₃PO₄ können zur Bildung eines Endprodukts vermischt werden, damit ein gewünschtes Ca/P-Verhältnis in der Nähe von etwa 1,1–1,9 und vorzugsweise etwa 1,3 bis 1,5 erhalten wird. Es kann günstig sein, die zweite Komponente ebenfalls im amorphen oder wenigkristallinen Zustand zur Verfügung zu stellen.
Einige Calciumphosphat-Promotoren können entweder als schwache Promotoren oder als starke Promotoren hergestellt werden. Beispielsweise reagiert eine DCPD-Probe mit einer Korngröße im Bereich von 100–125 μm (oder der Verteilung B3 gemäß Beispiel 5) unter bestimmten Bedingungen (siehe Beispiel 5) kaum mit dem hochreaktiven ACP der Erfindung. DCPD mit dieser Korngröße kann als "schwach fördernd" angesehen werden. DCPD kann in dieser Form daher verwendet werden, um nach hochreaktiven ACPs zu suchen.
Gemäß einigen Ausführungsformen der Erfindung ist es nicht erforderlich, dass für die Umsetzung ein teilnehmendes Calciumphosphat zur Bildung eines PCA-Materials verwendet wird. Es gehört vielmehr zum Umfang der Erfindung, die Härtung und Umwandlung des reaktiven ACP in das PCA-Material durch Zugabe eines oder mehrerer "passiver" Promotoren (die auch "nichtreaktiv" oder "nicht teilnehmende" Promotoren genannt werden), die nicht an der Reaktion teilhaben. Geeignete passive Promotoren umfassen, sind aber nicht darauf beschränkt, Materialien oder Behandlungen, die schon dafür beschrieben wurden, dass sie die Umwandlung von Calciumphosphatmaterialien zu Hydroxyapatit fördern. Beispielsweise können Wasser, Wärme, Keimbildner und Katalysatoren als passive Promotoren eingesetzt werden. In einigen Ausführungsformen stellen Katalysatoren Oberflächen bereit, durch deren Gegenwart die Härtung und Umwandlung von ACP in wenigkristallines apatitisches Calciumphosphat begünstigt wird. Beispielsweise sind unter anderem Al₂O₃, Glimmer, Glas und Sand zweckmäßige passive Promotoren. In bevorzugten Ausführungsformen werden Promotoren eingesetzt, die in Wasser unlöslich sind oder eine geringe Wasserlöslichkeit aufweisen, wobei sie in Form von Granulat mit einem Durchmesser im Bereich von 1–200 μm hergestellt werden und in vivo resorbierbar sind. Daher sind Polymere wie Poly-L-milchsäure (PLLA) und Polyglycolsäure (PGA) besonders günstige Promotoren.
Wenn ein zweites Calciumphosphat als Promotor verwendet wird, ist es oft kristallin, wie durch die Gegenwart von scharfen Beugungspeaks im Röntgenbeugungsbild gezeigt wird, die für das jeweilige Calciumphosphat typisch sind (4b). Im Gegensatz dazu ist das reaktive ACP amorph und weist keine durch Röntgenbeugung identifizierbare Peaks auf (4a). Trotz der höheren Kristallinität legt die Röntgenbeugung jedoch nahe, das Dicalciumdiphosphat in der Reaktion mit dem reaktiven ACP verbraucht wird und das gebildete PCA-Material eine weitaus geringere Kristallinität aufweist. Wenn stöchi ometrisches HA als zweite Calciumphosphatquelle verwendet wird, wird es in ähnlicher Weise bei der Reaktion verbraucht und es wird ein PCA-Material mit verminderter Kristallinität gebildet.
Da mindestens ein Reaktant amorph und hochreaktiv ist, schreitet die erfindungsgemäße Bildungsreaktion bei oder über Raumtemperatur fort, wodurch ein gehärtetes apatitisches Material mit wenigkristalliner oder mikrokristalliner Mikrostruktur gebildet wird. Nach bevorzugten Ausführungsformen ist die Umwandlungsreaktion im Wesentlichen vollständig, wodurch sichergestellt ist, dass das gesamte Calcium und Phosphat des Gemisches von dem resultierenden PCA-Produkt verbraucht werden. Durch dieses Ergebnis ist eine verlässliche Bildung von apatitischen Produkten einfach dadurch möglich, dass die relativen Mengenanteile der anfänglich eingesetzten amorphen und sekundären Calciumphosphate ausgewählt werden. Es ist günstig, ein Calcium zu Phosphatverhältnis von etwa 1,2–1,68, vorzugsweise unter 1,5 und noch bevorzugter von etwa 1,38 beizubehalten.
Das gebildete apatitische Material umfasst metastabile Umgebungseigenschaften von natürlich vorkommenden Knochen. In natürlich vorkommenden Knochen sind Mineralien durch eine Struktur im Nanometerbereich gekennzeichnet, wodurch große Oberflächen zur Verfügung stehen, die mit dem umgebenden Gewebe Wechselwirken können, die in Resorption und Remodellierung von Gewebe resultieren. Die vorliegende Erfindung kommt natürlich vorkommenden Knochenmineralien mit seinen Kristallen im Nanometerbereich als Produkt sehr nahe. Eigenschaften wie Kristallinität und Ca/P-Verhältnisse sind gemäß der vorliegenden Erfindung genau festgelegt, um die Mineralieneigenschaften zu simulieren, die in lebendem Knochengewebe zu finden sind.
Das während der erfindungsgemäßen Reaktion gebildete PCA ist mit dem Härten des hydratisierten Precursormaterials verbunden. Es wird jedoch darauf hingewiesen, dass die Härtung des hydratisierten Precursors vor der vollständigen Umwandlung auftreten kann oder sogar bei Fehlen der kompletten Umwandlung, wobei jedoch die vollständige Umwandlung des ACP-Precursors eine bevorzugte Ausführungsform darstellt. Solche teilweisen Umwandlungsreaktionen, die jedoch gleichwohl eine Härtungsreaktion darstellen, werden als im Umfang der Erfindung liegend angesehen.
Wie oben beschrieben wurde, wird durch die Kombination von trockenem ACP mit beliebigen anderen Reaktanten und einer begrenzten Menge einer wässrigen Lösung ein hydratisierter Precursor gebildet. Durch Auswahl der geeigneten Flüssigkeitsmenge, die zu den Reaktanten gegeben werden soll, kann die Viskosität bedarfsgemäß eingestellt werden. Der hydratisierte Precursor kann entweder mit einer injizierbaren oder einer formbaren Konsistenz hergestellt werden. Eine injizierbare Konsistenz bedeutet so dick wie möglich, aber immer noch mit einer Injektionsnadel Nummer 16 bis 18 injizierbar. Meistens wird es sich um eine Konsistenz wie "Zahncreme" handeln. Formbar bezieht sich auf eine Konsistenz, bei der das Material seine Form behalten kann. Im Extremfall für eine formbare Konsistenz kann der hydratisierte Precursor die Konsistenz einer Glasurmasse oder einer Abdichtmasse aufweisen. Der hydratisierte Precursor kann auch mit einer gerade ausreichenden Menge Flüssigkeit hergestellt werden, damit er sowohl injizierbar als auch formbar ist. In Pastenform weist das Material deutlich verbesserte Fließeigenschaften im Vergleich mit Zusammensetzungen des Standes der Technik auf. Die Fließeigenschaften sind ähnlich wie bei Zahncreme, wohingegen die Materialien des Standes der Technik eine granulare oder hafermehlartige Konsistenz aufweisen. Der hydratisierte Precursor kann bei zu sieben Stunden vor der Verwendung hergestellt werden, wenn er bei Raumtemperatur aufbewahrt und der Wasserverlust minimal gehal ten wird. Die Aufbewahrungszeit kann verlängert werden, indem die Paste bei verminderten Temperaturen im Bereich von 1–10°C im Kühlschrank aufbewahrt wird, vorausgesetzt, es werden Schritte unternommen, damit der Wasserverlust durch Verdampfen minimal gehalten wird.
In einigen bevorzugten Ausführungsformen (beispielsweise nachstehende Beispiele 9 bis 14) ist die Umsetzung endotherm und verläuft bei Raumtemperatur langsam, wird jedoch bei Körpertemperatur deutlich schneller. Dies ist besonders zweckmäßig in der Chirurgie, da die Paste, die durch Mischen der Reaktanten mit Wasser gebildet wurde, für eine beachtliche Zeitspanne (bis zu mehrere Stunden) injizierbar bleibt, wenn sie bei oder unter Raumtemperatur gehalten wird. Die Paste härtet also bei Raumtemperatur (ca. 22°C) nach einer Zeitspanne über einer Stunde und bleibt mehr als 10 Minuten formbar und/oder injizierbar, vorzugsweise mehr als eine Stunde und noch bevorzugter mehr als drei Stunden. Nach der Injektion an der Implantatstelle (ca. 37°C) härtet die Paste in weniger als einer Stunde und vorzugsweise in etwa 10–30 Minuten.
Verbundmaterialien und Additive
Das erfindungsgemäße PCA-Material kann als Verbundmaterial mit andern Substanzen gebildet werden. Verbundmaterialien können günstig sein, um beliebige physikalische Parameter des Trägers zu verändern, wobei als nicht einschränkende Aufzählung Festigkeit, Resorptionszeit, Haftung, Injizierbarkeit, Reibungseigenschaften oder die Fähigkeit zur Aufnahme eines therapeutischen Wirkstoffes oder Abgabekinetiken genannt werden können. Im Allgemeinen kennen die mit der Herstellung von Verbundmaterialien befassten Fachleute die Methoden und Konzepte, die für die Bildung von Verbundmaterialien wichtig sind. Für die weiterführende Anleitung für die Herstellung von PCA-Verbundmaterialien kann auf die ebenfalls anhängige US-Patentanmeldung mit dem Titel "Bioresorbable Ceramic Composites" verwiesen werden, die den gleichen Anmeldetag wie die vorliegende Anmeldung hat und auf die hier als Referenz Bezug genommen wird.
In-vitro-Implantatbildung
Neben der chirurgischen Applikation in Pastenform können die erfindungsgemäßen Implantate außerhalb des Körpers vorgeformt, gehärtet und dann in fester Form implantiert werden. Vorgeformte Einheiten können handgeformt, formgepresst oder maschinell hergestellt sein. Das Beladen mit dem therapeutischen Wirkstoff kann erreicht werden, indem der Wirkstoff direkt zu dem Puffer oder zu dem Träger gegeben wird, der für die Herstellung des hydratisierten Precursors verwendet wird. Alternativ hierzu kann der Träger unter Verwendung von Tauch-, Walz- oder Sprühbeschichtungsverfahren nach der Härtung dem therapeutischen Wirkstoff ausgesetzt werden.
Biologisch wirksame Stoffe
Es können beliebige zweckmäßige biologisch wirksame Stoffe von dem erfindungsgemäßen PCA-Implantat abgegeben werden. Das einzige Erfordernis besteht im Allgemeinen darin, dass die Substanz in Gegenwart des Materials während der Herstellung wirksam bleibt oder nachfolgend aktiviert oder reaktiviert werden kann. Da die erfindungsgemäße Paste mit einer Vielzahl von wässrigen Trägern und Substituenten hergestellt werden kann, ist der Fachmann vertraut mit speziellen Additiven, die eingebracht werden können, um die Stabilität des Wirkstoffes zu verbessern. Die Stabilität und/oder Kompatibilität eines speziellen Wirkstoffes mit dem erfindungsgemäßen Material sowie die Konzipierung der Herstellung können empirisch in vitro getestet werden. Genauer kann der Stoff in das erfindungsgemäße Material gemäß einer oder nach mehreren der hier be schriebenen Verfahren eingebracht werden. Nach dem Härten des Trägers bei 37°C kann die Substanz aus dem Material in ein Analysemedium wie Wasser oder einen geeigneten Puffer ausgewaschen werden und die Verbindung kann aus dem Material durch Diffusion in das Analysemedium gesammelt werden. Das Analysemedium kann dann auf die Gegenwart des Wirkstoffes analysiert werden. In einigen Beispielen kann das Material aufgebrochen, pulverisiert oder in anderer Weise fragmentiert werden, bevor es mit dem Analysemedium in Kontakt gebracht wird. Weitere Analysemethoden, bei denen die Diffusion des Stoffes nicht erforderlich ist, wie beispielsweise das Wachstum von Zellen auf dem Material oder andere physikalische, chemische oder biologische Assays sind den Fachleuten für die speziellen Verbindungen bekannt.
Biologisch wirksame Stoffe, die für die Durchführung der vorliegenden Erfindung verwendet werden, sind unter den Proteinen, Peptiden, Nucleinsäuren, Nucleoproteinen, Polysacchariden, Glycoproteinen und synthetischen und biologisch manipulierten Analoga ausgewählt. Auch umfasst werden chemische Stoffe, die biologische Wirkungen haben (beispielsweise Antibiotika, Farbmittel etc.). Proteine können nach synthetischen, biochemischen oder rekombinanten Techniken hergestellt werden. Der biologische Wirkstoff ist vorzugsweise, jedoch nicht notwendigerweise ein Stoff, der von einer staatlichen Behörde oder Institution als für die Verwendung sicher und wirksam angesehen wurde. Beispielsweise werden Arzneimittel für die menschliche Verwendung in den Vereinigten Staaten von der Food an Drug Administration (FDA) unter 21 C. F. R. §§ 330.5, 331–361 und 440–460 aufgelistet; Arzneimittel für die tierärztliche Verwendung werden von der FDA in den Vereinigten Staaten unter 21 C. F. R. §§ 500–582 zugelassen.
Der Ausdruck "biologisch wirksamer Stoff" umfasst pharmakologische Wirkstoffe, die bei Tieren, Pflanzen oder Viren einen lokalen o der systemischen Effekt hervorrufen. Der Ausdruck bedeutet also alle Substanzen, die für die Verwendung bei der Diagnose, Heilung, Linderung, Behandlung oder Vorbeugung einer Krankheit oder für die Steigerung eines gewünschten physikalischen oder psychischen Ablaufs und Zuständen in einem Tier, einer Pflanze oder einem Virus vorgesehen sind. Der Ausdruck "Tier", wie er hier verwendet wird, bedeutet Säugetiere, wie Primaten (einschließlich Menschen), Schafe, Pferde, Kühe, Schweine, Hunde, Katzen, Ratten und Mäuse; Vögel; Reptilien; Fische; Insekten; Spinnentiere; Protisten (beispielsweise Protozoen) und prokaryontische Bakterien.
Klassen von biologisch wirksamen Verbindungen, die in den erfindungsgemäßen Träger für die Abgabe eingebracht werden können, können unter den folgenden Substanzen ausgewählt werden: Anti-AIDS-Wirkstoffen, Cytostatika, ACE-Hemmern, Antigenen, adrenergen Antagonisten, Antacida, Immunsuppressiva, antiviralen Substanzen, Enzyminhibitoren, Neurotoxinen, Opioiden, Hypnotika, Antihistaminika, Gleitmitteln, Tranquilizern, Anticonvulsiva, Muskelrelaxantien, Anti-Parkinson-Wirkstoffen, Antispasmotika, muskelkontrahierenden Substanzen, Antidiarrhoika, Antiemetika, Laxativa, Diuretika, Miotika, Anticholinergika, Wirkstoffen gegen Glaucome, antiparasitären und/oder antiprotozoalen Verbindungen, Antihypertensiva, Analgetika, Antipyretika, entzündungshemmenden Wirkstoffen, Antitussiva, Antivertiginosa, Wirkstoffen zur Behandlung von Schwindelanfällen, Arzneimitteln gegen Reisekrankheit, Lokalanästhetika, Ophthalmika, Prostaglandinen, Antidepressiva, Antipsychotika, Antiemetika, Imaging Agents, speziellen Targeting Agents, trophen Faktoren, Wachstumsfaktoren, Immunsuppressiva, Immunaktivatoren, antimitotischen Neurotransmittern, Proteinen, Modifikatoren der Zellantwort, Impfstoffen, Nucleinsäuren, Genen, Genfragmenten, Gen-regulierenden Sequenzen (wie Promotoren, Enhancern oder anderen regulatorischen Stellen), Antisens-Molekülen und anderen bioaktiven Einheiten oder Komponenten von biosynthetischen Wegen.
Eine vollständigere Auflistung von Gruppen von Verbindungen, die geeignet sind, um in Abgabeträger eingebracht zu werden, findet sich in Pharmazeutische Wirkstoffe (Von Kleemann et al. (Hrsg.), Stuttgart, New York. 1987) oder in einer Vielzahl von verfügbaren pharmakologischen Fachbüchern, wie beispielsweise Lippincott's Illustrated Pharmacology Reviews (Harvey et al. (Hrsg.), J. B. Lippincott Co., Philadelphia, 1992) oder Examination & Board Review Pharmacology (Katzing et al., Appleton & Lange, Connecticut, 1993), wobei auf beide hier als Referenz Bezug genommen wird. Beispiele für spezielle biologisch wirksame Substanzen werden im Folgenden angegeben:
Angiogene Faktoren sind Substanzen, die das Wachstum von Blutgefäßen stimulieren; sie umfassen Verbindungen wie VEGF und einige Wachstumsfaktoren und Mitogene.
Anti-AIDS-Wirkstoffe sind Substanzen, die für die Behandlung des Acquired Immune Deficiency Syndroms (AIDS) verwendet werden. Beispiele für solche Substanzen umfassen CD4, 3'-Azido-3'-deoxythymidin (AZT), 9-(2-Hydroxyethoxymethyl)-guanin (Aciclovir), Phosphonoameisensäure, 1-Adamantanamin, Peptid T und 2',3'-Dideoxycytidin.
Cytostatika sind Substanzen, die zur Behandlung oder Vorbeugung von Krebs eingesetzt werden. Beispiele für solche Substanzen umfassen Antimetaboliten (wie beispielsweise Methotrexat, Fluorouracil, 5-Fluorouracil, Cytarabin, Mercaptopurin, 6-Mercaptopurin, 6-Thioguanin), Antibiotika (wie beispielsweise Daunorubicin, Doxorubicin), Alkylierungsmittel (wie beispielsweise Mechlorethamin, Cyclophosphamid, Uramustin, Busulfan, Carmustin, Lomustin), Mitosehemmer (wie beispielsweise Vinblastin, Vincristin), Hormone (wie beispielsweise Hydroxyprogesteron, Medroxyprogesteronacetat, Magistral Acetate, Diethylsilbestrol, Testosteronpropionat, Fluoxymeste ron) und weitere Stoffe (wie beispielsweise Vindesin, Hydroxyharnstoff, Procarbazin, Aminoglutethimid, Melphalan, Chlorambucil, Dacarbazin (DTIC: Dimethyltriazenoimidazolcarboxamid), Cytosin-Aarabinosid).
Antibiotika sind im Stand der Technik bekannt und es handelt sich um Substanzen, die das Wachstum von Mikroorganismen inhibieren oder Mikroorganismen abtöten. Antibiotika können synthetisiert oder durch Mikroorganismen gebildet werden. Beispiele für Antibiotika umfassen bakterizide Substanzen, wie Aminoglycoside (beispielsweise Gentamicin, Tobramycin, Netilmicin, Streptomycin, Amikacin, Neomycin), Bacitracin, Carbapeneme (beispielsweise Imipenem/Cislastatin), Cephalosphorine, Colistin, Methenamin, Monobactame (beispielsweise Aztreonam), Penicilline (beispielsweise Penicillin G, Penicillin V, Methicillin, Natcillin, Oxacillin, Cloxacillin, Dicloxacillin, Ampicillin, Amoxicillin, Carbenicillin, Ticarcillin, Peperacillin, Mezlocillin, Azlocillin), Polymyxin B, Chinolone und Vancomycin; und bakteriostatische Stoffe, wie Chloramphenicol, Clindamyan, Macrolide (beispielsweise Erythromycin, Azithromycin, Clarithromycin), Lincomyan, Nitrofurantoin, Sulfonamide, Tetracycline (beispielsweise Tetracyclin, Doxycyclin, Minocyclin, Demeclocyclin), und Trimethroprim. Eingeschlossen sind auch Metronidazol, Fluorochinolone und Ritampin. Antibiotika werden gelegentlich in unlöslicher Form zur Verfügung gestellt, die verwendet werden können, wenn eine verzögerte Abgabe gewünscht wird.
Antivirale Wirkstoffe sind Substanzen, die befähigt sind, Viren zu zerstören oder die Replikation von Viren zu unterdrücken. Beispiele für antivirale Stoffe sind etwa a-Methyl-P-adamantanmethylamin, 1-D-Ribofuranosyl-1,2,4-triazol-3-carboxamid, 9-[2-Hydroxyethoxy]-methylguanin, Adamantanamin, 5-Iod-2'-deoxyuridin, Trifluorothymidin, Interferon und Adeninarabinosid. Spezielle Stoffe für die Be handlung des Herpes-Virus umfassen Aciclovir, Vidarabin, Idoxuridin und Ganciclovir.
Enzyminhibitoren sind Substanzen, die eine enzymatische Reaktion hemmen. Beispiele für Enzyminhibitoren umfassen Edrophoniumchlorid, N-Methylphysostigmin, Neostigminbromid, Physostigminsulfat, Tacrin HCl, Tacrin-1-hydroxymaleat, Iodotubercidin, p-Bromotetramisol, 10-(alpha-Diethylaminopropionyl)-phenothiazinhydrochlorid, Calmidazoliumchlorid, Hemicholinium-3, 3,5-Dinitrobrenzcatechin, Diacylglycerolkinase-Inhibitor I, Diacylglycerolkinase-Inhibitor II, 3-Phenylpropargylamin, N⁶-Monomethyl-L-argininacetat, Carbidopa, 3-Hydroxybenzylhydrazin HCl, Hydralazin HCl, Chlorgylin HCl, Deprenyl HCl, L(–)-, Deprenyl HCl, D(+)-Hydroxylamin HCl, Iproniazidphosphat, 6-MeO-tetrahydro-9H-pyridoindol, Nialamid, Pargylin HCl, Chinacrin HCl, Semicarbazid HCl, Tranylcypromin HCl, N,N-Diethylaminoethyl-2‚2-diphenylvalerat-Hydrochlorid, 3-Isobutyl-1-methylxanthen, Papavarin HCl, Indomethacind, 2-Cyclooctyl-2-hydroxyethylamin-Hydrochlorid, 2,3-Dichlor-a-methylbenzylamin (DCMB), 8,9-Dichlor-2,3,4,5-tetrahydro-1H-2-benzazepin-Hydrochlorid, p-Aminoglutethimid, p-Aminoglutethimidtartrat, R(+)-, p-Aminoglutethimidtartrat, S(–)-, 3-Iodtyrosin, alpha-Methyltyrosin, L-, alpha-Methyltyrosin, DL-, Acetazolamid, Dichlorphenamid, 6-Hydroxy-2-benzothiazolsulfonamid und Allopurinol.
Neurotoxine sind Substanzen, die wegen ihrer Wirkung auf das Nervensystem, beispielsweise Nervenzellen, einen toxischen Effekt haben. Neurotoxine umfassen adrenerge Neurotoxine, cholinerge Neurotoxine, dopaminerge Neurotoxine, Calciumkanalblocker und weitere Neurotoxine. Beispiele für adrenerge Neurotoxine sind N-(2-Chlorethyl)-N-ethyl-2-brombenzylamin-Hydrochlorid. Beispiele für cholinerge Neurotoxine umfassen Acetylethylcholin-mustard-Hydrocholorid. Beispiele für dopaminerge Neurotoxine umfassen 6-Hydroxydopamin HBr, 1-Methyl-4-(2-methylphenyl)-1,2,3,6-tetrahydro pyridin-Hhydrochlorid, 1-Methyl-4-phenyl-2,3-dihydropyridiniumperchlorat, N-Methyl-4-phenyl-1,2,5,6-tetrahydropyridin HCl, 1-Methyl-4-phenylpyridiniumiodid. Beispiele für Calciumkanalblocker sind etwa Ω-Conotoxin und Verapamil.
Opioide sind Substanzen, die Effekte wie Opiate aufweisen und nicht von Opium abgeleitet sind. Opioide umfassen Opioidagonisten und Opioidantagonisten. Opioidagonisten schließen Codeinsulfat, Fentanylcitrat, Hydrocodonbitartrat, Loperamid HCl, Morphinsulfat, Noscapin, Norcodein, Normorphin, Theabain ein. Opioidantagonisten umfassen Norbinaltorphimin HCl, Buprenorphin, Chlornaltrexamin 2HCl, Funaltrexamion HCl, Nalbuphin HCl, Nalorphin HCl, Naloxon HCl, Naloxonazin, Naltrexon HCl und Naltrindol HCl.
Hypnotika sind Stoffe, die künstlich Schlaf herbeiführen. Hypnotika umfassen Pentobarbital-Natrium, Phenobarbital, Secobarbital, Thiopental und deren Gemische, heterocyclische Hypnotika, Dioxopiperidine, Glutarimide, Diethylisovaleramid, α-Bromisovalerylharnstoff, Urethane und Disulfane.
Antihistaminika sind Substanzen, die kompetitiv die Wirkungen von Histaminen hemmen. Beispiele umfassen Pyrilamin, Chlorpheniramin, Tetrahydrazolin und dergleichen.
Schmiermittel sind Substanzen, die die Gleitfähigkeit der Umgebung, in die sie eingebracht werden, erhöhen. Beispiele für biologisch wirksame Schmiermittel sind Wasser und Salzlösung.
Tranquilizer sind Substanzen, die eine beruhigende Wirkung haben. Beispiele für Tranquilizer sind Chlorpromazin, Promazin, Fluphenazin, Reserpin, Diserpidin und Meprobamat.
Anticonvulsiva sind Substanzen, die Konvulsionen vorbeugen, vermindern oder verhindern. Beispiele für solche Stoffe sind etwa Primidon, Phenytoin, Valproat, Chk und Ethosuximid.
Entzündungshemmende Wirkstoffe sind Verbindungen, die Entzündungen hemmen. Verschiedene Arten von entzündungshemmenden Wirkstoffen blockieren verschiedene chemische Mediatoren. Beispiele für entzündungshemmende Stoffe umfassen die nichtsteroidalen Antiphlogistika (NSAIDS, nonsteriodal anti-inflammatory drugs), wie beispielsweise Aspirin, Phenylbutazon, Indomethacin, Sulindac, Tolmetin, Ibuprofin, Piroxicam, Fenamate, die entzündungshemmende, schmerzstillende und fiebersenkende Wirkungen aufweisen. Umfasst sind auch nicht-narkotische Analgetika, wie Acetaminophen und Phenacetin, wobei die entzündungshemmende Wirksamkeit dieser Arzneimittel schwächer ist. Einige langsam wirkende entzündungshemmende Stoffe, wie Goldsalze, Chlorochin, D-Penicillamin und Methotrexat sind bei der Behandlung von Arthritis zweckmäßig. Gichtspezifische entzündungshemmende Stoffe umfassen Colchicin, Allopurinol, Probenecid und Sulfinpyrazon.
Muskelrelaxantien und Anti-Parkinson-Wirkstoffe sind Wirkstoffe, die die Muskeln zum Erschlaffen bringen oder die mit der Parkinson-Erkrankung assoziierten Symptome vermindern oder eliminieren. Beispiele für solche Stoffe sind etwa Mephenesin, Methocarbomal, -Cyclobenzaprin-Hydrochlorid, Trihexylphenidyl-Hydrochlorid, Levodopa/Carbidopa und Biperiden.
Antispasmotica und muskelkontrahierende Substanzen sind Substanzen, die befähigt sind, Muskelkrämpfe oder Muskelkontraktionen zu verhindern oder zu lindern. Beispiele für solche Stoffe sind etwa Atropin, Scopolamin, Oxyphenonium oder Papaverin.
Miotica und Anticholinergika sind Verbindungen, die Bronchodilatation hervorrufen. Beispiele umfassen Echothiophat, Pilocarpin, Physostigminsalicylat, Diisopropylfluorphosphat, Epinephrin, Neostigmin, Carbachol, Methacholin, Bethanechol und dergleichen.
Wirkstoffe gegen Glaucome umfassen Betaxalol, Pilocarpin, Timolol, Timololsalze und Kombinationen von Timolol und/oder seinen Sahen mit Pilocarpin.
Antiparasitäre, antiprotozoale und antimykotische Wirkstoffe umfassen Ivermectin, Pyrimethamin, Trisulfapyrimidin, Clindamycin, Amphotericin B, Nystatin, Flucytosin, Ketocanazol, Fluconazol, Natamycin, Miconazol, Metronidazol, Diloxanidfuroat, Paromomycin, Chlorquin, Emetin, Dihydroemetin, Natriumstibugluconat (für Leishmaniasis), Melarsoprol (für Trypanosomiasis), Nifurtimox (für Trypanosomiasis), Suramin (für Trypanosomiasis), Pentamidon (für Trypanosomiasis) und Antimalariamittel (wie beispielsweise Primachin, Chlorochin, Chinin, Meflochin, Pyrimethamin und Chlorquanid).
Antihypertensiva sind Substanzen, die hohem Blutdruck entgegenwirken können. Beispiele für solche Substanzen umfassen alpha-Methyldopa und dem Pivaloyloxyethylester von alpha-Methyldopa.
Analgetika sind Substanzen, die Schmerzen vorbeugen, vermindern oder lindern können.
Antipyretika sind Substanzen, die Fieber lindern oder verringern können. Beispiele für solche Substanzen sind etwa Aspirin, Phenylbutazon, Idomethacin, Sulindac, Tolmetic, Ibuprofen, Piroxicam, Fenamate, Acetaminophen, Phenacetin, Morphinsulfat, Codeinsulfat, Meperidin und Nalorphin.
Lokalanästhetika sind Substanzen, die eine anästhesierende Wirkung in einem begrenzten Bereich aufweisen. Beispiele für solche Anästhetika sind Procain, Lidocain, Tetracain und Dibucain.
Ophthalmika umfassen diagnostische Substanzen wie Natriumfluorescein, Rose Bengal, Methacholin, Adrenalin, Cocain und Atropin. Ophthalmische chirurgische Additive umfassen alpha-Chymotrpysin und Hyaluronidase.
Prostaglandine sind im Stand der Technik bekannt und es handelt sich um eine Gruppe von natürlich vorkommenden, chemisch verwandten, langkettigen Hydroxyfettsäuren, die eine Vielzahl von biologischen Wirkungen haben.
Antidepressiva sind Substanzen, die befähigt sind, Depression vorzubeugen oder abzumildern. Beispiele für solche Antidepressiva umfassen Imipramin, Amitriptylin, Nortripylin, Protriptylin, Desipramin, Amoxapin, Doxepin, Maprotilin, Tranylcypromin, Phenelzin und Isocarboxazid.
Antipsychotika sind Substanzen, die psychotisches Verhalten verändern. Beispiele für solche Stoffe umfassen Phenothiazine, Butyrophenone und Thioxanthene.
Antiemetika sind Substanzen, die Übelkeit oder Erbrechen vorbeugen oder mildern. Ein Beispiel für eine solche Substanz ist Dramamin.
Imaging Agents sind Substanzen, die befähigt sind, eine gewünschte Stelle, beispielsweise einen Tumor, in vivo sichtbar zu machen. Beispiele für Imaging Agents sind Substanzen mit einem Marker, der in vivo nachweisbar ist, wie beispielsweise Antikörper, die an fluoreszierende Marker gebunden sind. Der Ausdruck Antikörper umfasst ganze Antikörper oder ihre Fragmente.
Spezifische Targeting Agents umfassen Stoffe, die befähigt sind, einen therapeutischen Wirkstoff an einer gewünschten Stelle, beispielsweise an einen Tumor, abzugeben und einen therapeutischen Effekt hervorzurufen. Beispiele für Targeting Agents sind Stoffe, die Toxine oder andere Stoffe tragen können, die zu günstigen Wirkungen führen. Bei dem Targeting Agent kann es sich um einen Antikörper, der an ein Toxin, beispielsweise Ricin A, gebunden ist, oder einen Antikörper handeln, der an ein Arzneimittel gebunden ist.
Neurotransmitter sind Substanzen, die bei Erregung von einer Nervenzelle freigesetzt werden und eine Zielzelle entweder inhibieren oder erregen. Beispiele für Neurotransmitter sind Dopamin, Serotonin, γ-Aminobuttersäure, Norepinephrin, Histamin, Acetylcholin und Epinephrin.
Trophe Faktoren, Wachstumsfaktoren und Stoffe, die die Zellantwort modifizieren, sind Faktoren, deren fortgesetzte Gegenwart die Überlebensfähigkeit oder Langlebigkeit einer Zelle verbessert. In einigen Fällen rufen sie chemotaktische Wirkungen hervor oder zeigen eine Schutzwirkung gegen Toxine oder Neurotoxine oder gegenüber Neurodegeneration. Geeignete Faktoren umfassen, sind jedoch nicht darauf beschränkt, Plättchen-entstammenden Wachstumsfaktor (PDGF), Neurophil-activating Protein, Monocyte Chemoattractant Protein, Macrophage-inflammatory Protein, Platelet Factor, Platelet Basic Protein, und mit Melanom wachstumstimulierender Wirkung; epidermalen Wachstumsfaktor, transformierenden Wachstumsfaktor (alpha), Fibroblasten-Wachstumsfaktor, Plättchen-entstammenden Endothelzellen-Wachstumsfaktor, Insulin-artigen Wachstumsfaktor, Glial Cell derived Neurotrophic Factor, Ciliary Neutrotrophic Factor, Nervenwachstumsfaktor, Knochenwachstums/Knorpelwachstumsfaktoren (alpha und beta) oder andere Knochen-morphogenetische Proteine.
Andere Modifikatoren der Zellantwort sind Interleukine, Interleukininhibitoren oder Interleukinrezeptoren einschließlich Interleukin 1 bis Interleukin 10; Interferone einschließlich Interferon-alpha, -beta und -gamma; hämatopoetische Faktoren einschließlich Erythropoietin, Granulozyten-CSF, Macrophagen-CSF und Ganulozyten/Macrophagen-CSF; Tumornecrose-Faktoren einschließlich TNF-alpha und TNF-beta; transformierende Wachstumsfaktoren (beta), einschließlich beta-1, beta-2, beta-3, Inhibin und Activin; und Knochenmorphogenese-Proteine, wie OP-1, BMP-2 und BMP-7.
Hormone umfassen Östrogene (wie beispielsweise Estradiol, Estron, Estriol, Diethylstibestrol, Quinestrol, Chlorotrianisen, Ethinylestradiol, Mestranol), Antiöstrogene (wie beispielsweise Clomiphen, Tamoxifen), Progestine (wie beispielsweise Medroxyprogesteron, Norethindron, Hydroxyprogesteron, Norgestrel), Antiprogestin (Nifepriston), Androgene (wie beispielsweise Testosteroncypionat, Fluoxymesteron, Danaxol, Testolacton), und Antiandrogene (wie beispielsweise Cyproteronacetat, Flutamid). Hormone werden gewöhnlich für Hormonersatztherapie und/oder für die Zwecke der Familienplanung eingesetzt. Steroidhormone, wie Prednison, werden auch als Immunsuppressiva und entzündungshemmende Stoffe verwendet. Die Abgabe von Steroidhormonen kann durch Veresterung verzögert werden. Schilddrüsenhormone umfassen Triiodothyron, Thyroxin, Propylthiouracil, Methimazol und Iodixod. Hypophysere Hormone sind etwa Corticotropin, Sumototropin, Oxytocin und Vasopressin.
Nucleinsäuren sind Moleküle, einschließlich DNA- oder RNA-Molekülen, die ein oder mehrere Nucleoside und/oder Nucleotide aufweisen. Da Calciumverbindungen dafür bekannt sind, Zelltransfektion und DNA-Aufnahme in einigen Systemen zu fördern, ist es absehbar, dass die Resorption des vorliegenden Abgabesystems die Effizienz der Transfektion verbessern kann. Nucleinsäuremoleküle können als Impfstoffe abgegeben werden oder beispielsweise als Anti sens-Mittel. Alternativ dazu können DNA-Moleküle für die Verwendung in der Gentherapie hergestellt werden, bei der Moleküle genetische Fehler in Zellen, in die DNA-Moleküle eingebracht werden sollen, korrigieren oder kompensieren können.
Standardvorgehensweisen oder Programme für die Abgabe der oben angegebenen Stoffe sind im Stand der Technik bekannt. In typischer Weise basieren diese Vorgehensweisen auf einer oralen oder intravenösen Abgabe. Insofern, als die vorliegende Erfindung andere Abgabearten angibt, können Abwandlungen dieser Vorgehensweisen zweckmäßig sein.
Biologisch wirksame Substanzen werden in einen Abgabeträger, der aus dem erfindungsgemäßen PCA-Material gebildet ist, während oder nach seiner Bildung eingebracht (siehe Beispiele 20–21). Die Stoffe können zweckmäßigerweise vor dem Abbinden mit der Paste vermischt werden. Alternativ hierzu kann der Träger geformt und gehärtet und dann dem therapeutischen Stoff in Lösung ausgesetzt werden. Dieser spezielle Ansatz ist besonders für Proteine gut geeignet, von denen bekannt ist, dass sie eine Affinität für apatitische Materialien aufweisen. Anstelle von Wasser kann als wässrige Lösung, in der das amorphe Calciumphosphat in das erfindungsgemäße synthetische, wenigkristalline apatitische Material umgewandelt wird, eine Pufferlösung, die den biologisch wirksamen Stoff enthält, verwendet werden. Puffer können in beliebigen pH-Bereichen eingesetzt werden, meistens wird der Bereich von 5,0 bis 8,0 verwendet; in bevorzugten Ausführungsformen ist der pH-Wert mit einer anhaltenden Stabilität und Wirksamkeit des jeweiligen therapeutischen Stoffes kompatibel und liegt in besonders bevorzugten Ausführungsformen im Bereich von 5,5 bis 7,4. Geeignete Puffer umfassen, sind jedoch nicht darauf beschränkt, Carbonate, Phosphate (beispielsweise Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung), und organische Puffer, wie Tris, HEPES und MOPS. Der Puffer wird gewöhnlich im Hinblick auf seine Biokompati bilität mit den Host-Geweben und seiner Kompatibilität mit dem therapeutischen Stoff gewählt. Für die meisten Verwendungen von Nucleinsäuren, Peptiden oder Antibiotika ist eine einfache phosphatgepufferte Kochsalzlösung ausreichend.
Biologisch wirksame Stoffe werden in den Träger in Mengen eingebracht, die die Abgabe einer geeigneten Menge des Wirkstoffes an der Implantatstelle ermöglichen. Die Dosierungen werden meistens unter Verwendung von Vorgaben erstellt, die den Fachleuten bekannt sind und auf den speziellen fraglichen Wirkstoff anwendbar sind. Im Allgemeinen wird bevorzugt, dass für Stoffe, die an einen Rezeptor binden, lokale Spiegel von etwa ein- bis zweimal größer als die Dissoziationskonstante des Rezeptor-Wirkstoff-Komplexes erreicht werden. Beladungsniveaus, Größe der Einheit und Resorptionseigenschaften können empirisch unter Verwendung von Tiermodellen und Wirksamkeitsstudien am Menschen ermittelt werden, wie dies in der pharmazeutischen Industrie üblich ist.
Im Vergleich mit keramischen Einheiten besteht ein Vorteil des vorliegenden Abgabematerials und der Calciumphosphatmaterialien im speziellen darin, dass es unter sanften Reaktionsbedingungen gebildet werden kann. Auch wenn Keramiken auf Calciumphosphatbasis (beispielsweise Hydroxyapatite) beispielsweise als potentielle Materialien für die Wirkstoffabgabe aufgrund ihrer Biokompatibilität und bekannten Affinität für Proteine untersucht wurden, werden solche Materialien typischerweise in Prozessen hergestellt, die Bedingungen erfordern, die für viele therapeutische Wirkstoffe schädlich sind. Beispielsweise erfordern einige Verfahren ein Sintern über 500°C, andere die Anwendung von sauren Bedingungen und weitere lange Zeiträume, um Kristalle, die den therapeutischen Wirkstoff enthalten, zu züchten. Der vorliegende synthetische PCA-Träger für die Wirkstoffabgabe kann dagegen bei Raumtemperatur und physiologisch relevanten pH-Werten (siehe Beispiel 4) hergestellt werden. Daher kann eine große Vielzahl von biologisch wirksamen Materialien, die bei der Herstellung von Standardcalciumphosphatmaterialien zerstört werden können, in das erfindungsgemäße Material für die Wirkstoffabgabe eingebracht werden. Speziell sind Proteine oft empfindlich gegenüber Wärme und anderen ungünstigen Bedingungen; das vorliegende synthetische PCA-Material stellt daher ein besonders vorteilhaftes Abgabesystem für Proteine dar.
Modifizierung der Abgabekinetik
Ein Vorteil des erfindungsgemäßen PCA-Materials besteht darin, dass die Resorptionsrate des Materials durch Modifikationen in den präparativen Methoden verändert werden kann. Verfahren, die zu einem dichteren gehärteten Produkt führen, ergeben im Allgemeinen genauer eine geringere Resorptionszeit für das erfindungsgemäße reine PCA-Calciumphosphat in vivo. In dieser Hinsicht gibt es eine Vielzahl von Wegen, um die Dichte oder Resorptionskinetik des gehärteten Produktes zu verändern. Diese umfassen die Anpassung des Volumens der zur Bildung der Paste verwendeten Flüchtigkeit, Abwandlung der Korngröße des Ausgangsmaterials und Kompression der Paste während der Härtung. Verbundmaterialien, bei denen auswaschbare oder biologische abbaubare Partikel oder Materialien in die Paste eingebracht und letztlich in das PCA-Material eingebracht werden, können ebenfalls hergestellt werden. Die auswaschbaren oder biologisch abbaubaren Materialien können in der Folge aus dem gehärteten Material in vivo entfernt werden (beispielsweise durch Auswaschen), sodass ein hochporöses Implantat gebildet wird. Außerdem kann das erfindungsgemäße PCA-Material mit einer Dichteverteilung innerhalb eines Implantats hergestellt werden. Ein Weg, mit dem dies bewerkstelligt werden kann, besteht darin, in vitro- gehärtetes PCA-Material mit einer Dichte herzustellen, das gehärtete Material auf die gewünschte Korngröße zu pulverisieren und das pulverisierte Material dann mit einer zweiten PCA-Paste zu vermischen, die so ausgebildet ist, dass ein PCA-Material mit einer unterschiedlichen Dichte gebildet wird. Auf diese Weise gebildete PCA-Materialien resorbieren asynchron.
Die Verwendung von Material mit insgesamt kleinerer Korngröße für die Herstellung des pulverförmigen PCA-Vorläufermaterials führt zu einer längeren Zeitspanne für die Resorption und/oder Ossifikation in vivo (siehe Beispiele 5 und 19). Da der ACP-Precursor im Allgemeinen mit einer sehr kleinen Korngröße hergestellt wird, wenn zwei Komponenten verwendet werden, um den erfindungsgemäßen Trager zu bilden, wird die Korngröße der anderen, Nicht-ACP-Komponente im Allgemeinen dazu verwendet, um die Resorptionszeit einzustellen. In dieser Hinsicht kann die Korngröße eingestellt werden, indem eine zerkleinerte und gesiebte zweite Komponente verwendet wird, um eine spezielle Korngrößenverteilung für die Zugabe zu dem Endgemisch zu wählen. Gemäß einer anderen Ausführungsform wird die zweite Komponente mit dem ACP unterschiedlich lange zerkleinert, um die Resorptionsrate zu beeinflussen.
Verbundmaterialien mit veränderter Resorptionskinetik werden hergestellt, indem in das PCA-Material ein "Erosionsraten-Modifizierer" eingebracht wird, bei dem es sich um ein Material handelt, dessen Gegenwart die Resorptionsrate der Einheit als Ganzes verändert. Erosionsraten-Modifizierer, die die Rate, mit der die Arzneimittelabgabeeinheit resorbiert wird, erhöhen, schließen beliebige auswaschbare oder biologisch abbaubare Verbindungen ein, die die Löslichkeit (beispielsweise durch Veränderung der Porosität) der Einheit im Zeitablauf in vivo beeinflussen. Erosionsraten-Modifizierer, die die Rate, bei der die Arzneimittelabgabeeinheit resorbiert wird, senken, umfassen kristalline Calciumphosphate und insbesondere Hydroxyapatit und Diphosphatverbindungen.
Eine weitere Möglichkeit, mit der die Resorptionsrate des erfindungsgemäßen PCA-Materials verändert werden kann, ist die Einwirkung von Osteoclasten und/oder Macrophagen. Osteoclasten und möglicherweise Macrophagen bauen in natürlicher Weise Knochen ab. Gemäß der vorliegenden Erfindung können Osteoclasten oder Macrophagen oder Faktoren, die ihre Entwicklung und/oder Aktivität verändern, gemeinsam mit dem erfindungsgemäßen PCA-Implantat verabreicht werden, um die Resorptionsrate des PCA-Materials zu beschleunigen oder zu verzögern.
Alle Stoffe, die direkt oder indirekt (beispielsweise durch Osteoblasten) die Aktivität oder Entwicklung der Osteoclasten stimulieren, können beispielsweise verwendet werden, um die Resorptionsrate des PCA-Implantats zu erhöhen. Alle Stoffe, die direkt oder indirekt die Osteoclastenaktivität oder Entwicklung inhibieren, können dagegen verwendet werden, um die Resorptionsrate eines Implantats herabzusetzen. Solche stimulierenden und inhibierenden Stoffe sind im Stand der Technik gut bekannt (siehe beispielsweise Athanasou, J. Bone Joint Surg., 78-A: 1096, 1966 und Roodman Endocrine Rev. 17: 308, 1966, wobei auf beide hier als Referenz Bezug genommen wird). Beispielsweise sind Interleukin-1 (IL-1), Kolonie-stimulierende Faktoren (CSF) wie Macrophagen (M)-CSF, transformierender Wachstumsfaktor-alpha (TGFα), Tumornecrosefaktor (TNF), Interleukin-6 (IL-6), Interleukin-11 (IL-11), Interleukin-3 (IL-3), Parathyroidhormon (PTH), Vitamin D3-Metaboliten (beispielsweise Calcitriol), Prostaglandine (unter bestimmten bekannten Bedingungen) und sauerstofffreie Radikale dafür bekannt, die Entwicklung und/oder Aktivität von Osteoclasten zu stimulieren. Wenn CSFs verwendet werden, kann eine nachfolgende Verabreichung von 1,25-Dihydroxyvitamin D₃ Osteoclasten weiter stimulieren; eine gleichzeitige Verabreichung von Kolonie-stimulierenden Faktoren und 1,25-Dihydroxyvitamin D₃ inhibiert dagegen Osteoclasten.
Andere Faktoren, die die Entwicklung und/oder Aktivität von Osteoclasten inhibieren, umfassen den transformierenden Wachstumsfaktor β (TGFβ), γ-Interferon, Interleukin-4 (IL-4), Stickstoffmonoxid, Antikörper, beispielsweise gegen den Osteoclast-Vitronectinrezeptor, Calcitonin und Prostaglandine (unter bestimmten bekannten Bedingungen).
Es ist natürlich auch möglich, Osteoclasten selbst (oder Osteoclast-Vorläuferzellen, vorzugsweise in Kombination mit Stoffen, die ihre Differenzierung zu Osteoclasten stimulieren) in ein PCA-Implantat einzubringen, um seine Resorption zu stimulieren.
Stoffe, die die Resorptionsrate des PCA-Materials verändern, können systemisch oder lokal verabreicht werden. Eine lokale Verabreichung erfolgt vorzugsweise dadurch, dass der Stoff in das Material selbst eingebracht oder mit dem Material kombiniert wird, vorzugsweise nach den hier beschriebenen Vorgehensweisen. Wenn eine lokale Verabreichung eingesetzt wird, wird die Diffusion des Stoffes von dem PCA-Implantat weg vorzugsweise minimiert. Beispielsweise werden relativ unlösliche Stoffe bevorzugt, weil es weniger wahrscheinlich ist, dass sie von dem Implantat weg diffundieren und auf andere Zellen im Körper unerwünschte Wirkungen ausüben.
Applikationen
Das Material kann beispielsweise verwendet werden, um die biologisch wirksamen Stoffe an beliebige einer Vielzahl von Stellen im Körper (vorzugsweise des menschlichen Körpers, wobei Anwendungen im Veterinärbereich ebenfalls möglich sind) abzugeben. Alternativ hierzu oder zusätzlich kann das Material in Knochengewebe verwendet werden oder bei Reparaturanwendungen oder der Schönheitschirurgie in vivo. Das Material kann auch als Membran oder Matrix zum Einkapseln von Zellen oder beim Aufbau oder bei der Reparatur von künstlichen Organen eingesetzt werden.
In vitro kann das Material als dreidimensionale Zellkulturmatrix und als Modell für die Analyse von Osteoclast-, Osteoplast-, Chondrocyt- und/oder Macrophagenkulturen, Vorläuferzelldifferenzierung und/oder Reossifikation und Calciumphosphat-Resorption verwendet werden. Das Material ist besonders zweckmäßig für Studien zur Gewebebildung und/oder Zersetzung, bei denen beispielsweise Zellen wie Vorläuferzellen, Stammzellen, Osteocyten, Osteoclasten, Osteoblasten, Chondrocyten, Macrophagen, Myoblasten und Fibroblasten eingesetzt werden. Das Material kann auch verwendet werden, um eine biologisch wirksame Substanz in vitro abzugeben.
Bestimmte bevorzugte Applikationen werden weiter unten detaillierter diskutiert, wobei diese Diskussion nur zur Verdeutlichung geführt wird und nicht als einschränkend zu verstehen ist.
Wenn das erfindungsgemäße PCA-Material als Träger zur Abgabe in vivo oder in vitro verwendet wird, ist vorteilhaft eine kontrollierte, lokale Abgabe möglich. Wie gut bekannt ist, sind kleinere Mengen des biologisch wirksamen Stoffes erforderlich, wenn der Stoff an einer speziellen Stelle abgegeben und nicht systemisch verabreicht wird. Potentiell toxische Nebenwirkungen des Stoffes sind ferner kleiner, wenn der Stoff aus dem erfindungsgemäßen Abgabeträger abgegeben wird. In gleicher Weise ist auch die Aktivität des Stoffes maximiert, da er in dem Abgabeträger geschützt ist, bis er an Ort und Stelle abgegeben wird.
Das erfindungsgemäße PCA-Material kann in alle annehmbaren Gewebe injiziert oder implantiert werden. Orale Formulierungen werden ebenfalls als zum Umfang der Erfindung gehörend angesehen. Bevorzugte Abgabeorte sind Orte in Knochen, Muskeln, Rückenmark, dem zentralen Nervensystem, der Bauchhöhle, subkutanen Orten und dem Humor vitreus und aquosus des Auges. Wenn das PCA-Material an einem Ort abgegeben wird und Bedenken bezüglich der Migration des Implantats bestehen, können verankernde Klammern oder Haken in den Träger eingebracht werden, sodass er in seiner Position befestigt und gehalten werden kann. Wenn dies angezeigt ist, kann das PCA-Material durch Einbringen in einen Knochen (siehe unten) verankert werden. Besondere Applikationen und bevorzugte Abgabeorte werden weiter unten detaillierter erläutert:
Abgabe von biologisch wirksamen Stoffen an Knochen
Das erfindungsgemäße PCA-Material weist besondere Vorteile hinsichtlich der Abgabe von biologisch wirksamen Stoffen an Knochen auf. Die Implantation eines aus dem erfindungsgemäßen PCA-Material gebildeten Abgabeträgers in einen Knochen kann alternativ oder zusätzlich eingesetzt werden, um einen Abgabeträger zu verankern und eine systemische Arzneimittelabgabe zu bewerkstelligen, oder kann verwendet werden, um die Abgabe an einem Ort angrenzend an, oder genau genommen "in", dem Knochen zu ermöglichen. 9 zeigt viele zweckmäßige Anwendungen des erfindungsgemäßen PCA-Materials an Knochen.
Natürlich vorkommendes Knochenmineral besteht aus wenigkristallinem Calciumphosphat mit apatitischer Struktur und einer Größe im Nanometerbereich. Zum Unterschied zu idealstöchiometrischen kristallinen Hydroxyapatit Ca₁₀(PO₄)₆(OH)₂ mit einem Atomverhältnis Ca/P von 1,67 ist die Zusammensetzung der Knochenmineralien deutlich verschieden und kann durch die folgende Formel dargestellt werden: Ca_8,3(PO₄)_4,3(HPO₄, CO₃)_1,7(OH, CO₃)_0,3.
Die Unstöchiometrie von Knochenmineralien beruht in erster Linie auf der Gegenwart von zweiwertigen Ionen wie CO₃ ^2– und HPO₄ ^2–, die die dreiwertigen PO₄ ^3–-Ionen ersetzen. Die Substitution durch HPO₄ ^2– und CO₃ ^2–-Ionen verändert das Ca/P-Verhältnis, sodass das Ca/P-Verhältnis im Bereich von 1,50 bis 1,70 liegen kann, je nach Alter und Stelle im Knochen. Das Ca/P-Verhältnis steigt im Allgemeinen während der Alterung des Knochens, was nahelegt, dass die Menge an Carbonatspezies typischerweise bei älteren Knochen ansteigt. Das Ca/P-Verhältnis zusammen mit der nanokristallinen Größe und der wenigkristallinen Natur führt zu den speziellen Löslichkeitseigenschaften von Knochenmineralien. Da Knochengewebe fortwährend repariert wird, wobei die Gewebereparatur durch Mineralresorbierende Zellen (Osteoclasten) und Mineral-produzierende Zellen (Osteoblasten) reguliert wird, ist das Löslichkeitsverhalten von Mineralien wichtig, um das schwierige Stoffwechselgleichgewicht zwischen diesen Zellaktivitäten aufrechtzuerhalten.
Das PCA-Material gemäß der vorliegenden Erfindung ist ein wenigkristalliner Feststoff mit einer Größe im Nanobereich und mit einem Ca/P-Verhältnis, das dem Verhältnis von natürlich vorkommenden Knochenmaterialien vergleichbar ist. Das Material ist bioresorbierbar, kann bei niedrigen Temperaturen gebildet werden und ist leicht formbar und injizierbar. Aus allen diesen Gründen ist das erfindungsgemäße Material besonders gut geeignet, um Arzneimittel an Orten im Knochen abzugeben. Dieses synthetische PCA-Material kann außerdem Knochenwachstum unterstützen, sodass es letztlich durch den eigenen Knochen des Patienten ersetzt wird. Es sollte jedoch berücksichtigt werden, dass das Einwachsen die Resorbierbarkeit des erfindungsgemäßen Arzneimittelabgabesystems beeinträchtigen kann. Es kann daher unter gewissen Umständen (beispielsweise wenn der biologisch wirksame Stoff nach einem genauen, vorgegebenen Verabreichungsplan abgegeben werden muss) zweckmäßig sein, das Knochenwachstum in den Arzneimittelabgabeträger beispielswei se dadurch zu vermindern, dass das Eindringen von osteozytischen oder chondrozytischen Zellen oder Precursoren verhindert wird. In den meisten Fällen kann die Ossifikation verhindert werden, indem die Einheit in einigem Abstand von einem Knochen platziert wird. Im Allgemeinen ist 1 mm ausreichend, wobei jedoch größere Abstände bevorzugt werden. Es können ferner in, an oder angrenzend zu dem Arzneimittelabgabesystem Verbindungen wie Indian Hedgehog-Gen und Genprodukten, PTHRP (parathyroid hormone-related Protein) und PTHRP-Rezeptoragonisten eingebracht werden.
Unter anderen Umständen kann es günstig sein, ein solches Einwachsen von Knochen anzuregen. Wie in den Beispielen 14, 17 und 18 gezeigt ist, kann das PCA-Calciumphosphat in Knochen eingebracht und so resorbieren gelassen werden, dass es vollständig (100%) durch neuen Knochen ersetzt wird. Wenn eine optimale Ossifikation gewünscht wird, können die Einheiten und Gegenstände mit knochenbildenden Zellen angeimpft werden (siehe unten). Diese Aufgabe ist am leichtesten zu erfüllen, indem die Einheit mit einer Quelle von patienteneigenen knochenbildenden Zellen in Kontakt gebracht wird. Solche Zellen können in Knochen-assoziiertem Blut oder Knochen-assoziierten Flüssigkeiten vorhanden sein, einschließlich exogenen Fluiden, die mit Knochengewebe oder Knochenmaterialien oder Bereichen, einschließlich Periosteum, Substantia spongiosa oder Knochenmark, in Kontakt waren. Im Falle von Vorrichtungen wie Schrauben und Stiften, bei denen das Einbringen in den Knochen mit Blutungen verbunden ist, ist kein weiteres Animpfen erforderlich. Für Platten, die lediglich dem Rindenknochen gegenüberliegen, ist die Induktion einer periostalen Läsion, die mit der Vorrichtung in Kontakt kommen wird, zu empfehlen. Es kann bei anderen Ausführungsformen zweckmäßig sein, durch Entfernen eines Teils des Rindenknochens an der Implantationsstelle chirurgisch im Knochen eine Auflage zu bilden. Es können auch andere Schritte unternommen werden, um die Ossifikation zu verbessern, einschließlich Einbringen von knochenbildenden Zellen, die am Patienten selbst gewonnen wurden, in das Transplantat oder Einbringen von trophischen Faktoren oder Wachstumsfaktoren, einschließlich Proteinen, in die Vorrichtung oder auf die Vorrichtung. Auch nicht autologe Knochenzellen werden von der Erfindung mit umfasst, falls der gewünschte Grad der Knochenregeneration auftritt, bevor der Patient die knochenbildenden Stellen abstößt. Diesbezüglich können Immunsuppressiva auf die Vorrichtung gegeben werden, in manchen Fällen durch Einbringen in die Vorrichtung. Zellen oder Gewebe aus Primärquellen, Zelllinien oder Zellbanken können bei einigen Ausführungsformen zweckdienlich sein.
Man geht davon aus, dass bestimmte Kategorien von biologisch wirksamen Stoffen für die Abgabe an Knochen besonders geeignet sind. Wenn der Arzneimittelabgabeträger beispielsweise an einem geschädigten Knochen eingesetzt wird, kann es günstig sein, Knochenregenerierende Proteine (BRPs, bone regenerative Proteins) in den Träger einzubringen. Es konnte gezeigt werden, dass BRPs die Wachstumsrate des Knochengewebes erhöhen und die Heilung des Knochens beschleunigen (siehe beispielsweise Appel et al., Exp. Opin. Ther. Patents 4: 1461, 1994). Beispiele für BRPs umfassen, sind jedoch natürlich nicht darauf beschränkt, den transformierenden Wachstumsfaktor beta (TGF-β), Cell-Attachment-Faktoren (CAFs), Endothelzellen-Wachstumsfaktoren (EGFs), OP-1 und Knochenmorphogenese-Proteine (BMPs). Derartige BRPs werden derzeit von Genetics Institute, Cambridge, MA; Genentech, Palo Alto, CA; und Creative Biomolecules, Hopkinton, MA entwickelt. Knochenregenerierende Proteine und trophische Faktoren können ferner verwendet werden, um gewünschtenfalls ektopische Knochenbildung zu stimulieren. Das PCA-Material, das BMP-7 enthält, kann subkutan verabreicht werden, die Knochenbildung wird dann innerhalb von 1 bis 2 Monaten auftreten.
Antibiotika und Antiseptika können ebenso gewünschtenfalls an Knochen abgegeben werden. Beispielsweise ist eine der großen klinischen Implikationen, die durch Knochentransplantationschirurgie auftreten, das Bedürfnis, die postoperative Entzündung oder Infektion und insbesondere eine mit Osteomyelitis verbundene Infektion zu kontrollieren. Eine Ausführungsform für eine Arzneimittelagabeeinrichtung mit Antibiotika kann als oder in Verbindung mit einem verbesserten Knochenimplantat verwendet werden, um die Gefahr von lokalen Infektionen an dem Ort der chirurgischen Behandlung zu vermindern und zu einem infektionsfreien und somit schnelleren Knochenheilungsprozess beizutragen. Die Wirksamkeit von Antibiotika wird ferner verbessert, indem die Resorption des wenigkristallinen Hydroxyapatit so eingestellt wird, dass es sich mit einer Rate auflöst, dass es antibiotische Peptide oder ihre aktiven Komponenten mit der am besten wirksamen Dosis an der Stelle der Gewebereparation freisetzt.
Beispiele für Antibiotika umfassen (sind jedoch nicht darauf beschränkt) Penicillin, Tetracyclin, Kanamycin, Gentamycin, Chlortetracyclin-Hydrochlorid (Aureomycin), Minocylin, Dosycyclin, Vanomycin, Bacitracin, Neomycin, Erythromycin, Streptomyan, Cephalosporine, Chloramphenicol, Oxytetracyclin (Terramycin) und deren Derivate. Antibiotika und knochenregenerierende Proteine können zusammen in das PCA-Material eingebracht werden, um lokal die meisten oder alle Komponenten abzugeben, die erforderlich sind, um optimale Bedingungen für die Reparation des Knochengewebes zu schaffen.
Weitere biologisch wirksame Stoffe, die möglichst an Knochen abgegeben werden sollen, umfassen Antikrebsmittel, beispielsweise für die Behandlung von Knochentumoren (siehe beispielsweise Otsuka et al., J. Pharm. Sci. 84: 733, 1995). Der erfindungsgemäße Arzneimittelabgabeträger ist beispielsweise besonders zweckmäßig, wenn bei einem Patienten ein Knochentumor chirurgisch entfernt wurde, da das erfindungsgemäße synthetische PCA-Material die mechanische Integrität des Knochens verbessern und gleichzeitig jegliche verbleibende Krebszellen behandeln kann, um Metastasen zu verhindern. Beispiele für Antikrebsmittel sind etwa Methotrexat, Cisplatin, Prednison, Hydroxyprogesteron, Medroxyprogesteronacetat, Megestrolacetat, Diethylstilbestrol, Testosteronpropionat, Fluoxymesteron, Vinblastin, Vincristin, Vindesin, Daunorubicin, Doxorubicin, Hydroxyharnstoff, Procarbazin, Aminoglutethimid, Mechlorethamin, Cyclophosphamid, Melphalan, Uracil-Mustard, Chlorambucil, Busulfan, Carmustin, Lomuslin, Dacarbazin (DTIC: Dimethyltriatenoimidazolcarboxamid), Fluorouracil, 5-Fluorouracil, Cytarabin, Cytosinarabinoxid, Mercaptopurin, 6-Mercaptopurin, Thioguanin.
Weitere biologisch wirksame Stoffe, die gewünschtenfalls in das erfindungsgemäße synthetische PCA-Arzneimittelabgabesystem zur Abgabe an Knochen eingebracht werden können, sind Stoffe, die Osteoporose lindern. Beispielsweise wurde die Wirksamkeit von amidiertem Salmon Calcitonin gegen Osteoporose gezeigt.
Vitamin D und Vitamin K werden ebenfalls günstigerweise an Knochen abgegeben, ebenso wie angiogene Faktoren, beispielsweise veg f, die verwendet werden können, wenn die Vaskularisierung verbessert werden soll.
Abgabe von biologisch wirksamen Stoffen an subkutanen Implantationsorten:
Die Applikation des vorliegenden Arzneimittelabgabesystems ist natürlich nicht auf Knochen beschränkt. An Orten, bei denen es sich nicht um Knochen handelt, wird die Vorrichtung ohne Ossifikation resorbiert.
Das Anbringen des vorliegenden Abgabesystems subkutan ist für eine weitergehende systemische Verabreichung von biologisch wirksamen Substanzen besonders zweckmäßig. Die Verabreichung von Östrogenen und/oder Progesteronen für die Verwendung zur Geburtenregelung ist ein Beispiel für eine subkutane Applikation. Die Verabreichung von Antigenen und/oder Impfstoffen kann ferner durch subkutane Implantation erreicht werden.
Abgabe von biologisch wirksamen Stoffen an das Zentralnervensystem:
Die Abgabe von therapeutischen Substanzen an das Zentralnervensystem kann mit den erfindungsgemäßen Abgabeträgern erreicht werden. Zweckmäßige therapeutische Substanzen umfassen die Abgabe von γ-Aminobuttersäure an epileptische Foci, die Abgabe von L-Dopa oder Dopamin in das Striatum oder an Substantia nigra für die Behandlung der Parkinson-Krankheit, die Abgabe von Wachstumsfaktoren für die Vorbeugung neuraler Degeneration wie GDNF in laterale Ventrikel, Striatum oder Substantia nigra für die Behandlung der Parkinson-Krankheit, die Verabreichung von NGF an kortikale Bereiche oder andere Bereiche für die Behandlung der Alzheimer-Krankheit oder die Verabreichung von CNTF an das sakrale oder lumbale Rückenmark für die Behandlung von amyelolateraler Sklerose.
Weitere: Abgabe von biologisch wirksamen Stoffen an verschiedenen Stellen.
Weitere potentielle Abgabeorte umfassen intramuskuläre, interperitoneale und okkulare Bereiche.
Beispiele
Beispiel 1: Herstellung von reaktivem amorphen Calciumphosphat
Dieses Beispiel beschreibt Schritt für Schritt die Herstellung und Verfahren, um relativ inerte amorphe Calciumphosphat-Feststoffe in erfindungsgemäße hochreaktive amorphe Calciumphosphate umzuwandeln.
Lösung A wurde bei Raumtemperatur durch schnelles Lösen von 55 g Na₂HPO₄·7H₂O (Natriumphosphat), 50 g NaOH (Natriumhydroxid), 30 g NaHCO₃ (Natriumhydrogencarbonat) und 2 g Na₄P₂O₂·10H₂O in 1,3 l destilliertem Wasser hergestellt. Lösung B wurde bei Raumtemperatur durch schnelles Lösen von 43 g Ca(NO₃)₂·4H₂O (Calciumnitrat-Tetrahydrat) und 1 g MgCl₂·6H₂O in 0,5 l destilliertem Wasser hergestellt.
Das inerte carbonathaltige amorphe Calciumphosphat wurde dann bei Umgebungstemperatur durch schnelle Zugabe von Lösung B zur stark gerührten Lösung A hergestellt. Der gebildete Niederschlag von gelartigem amorphen Calciumphosphat wird sofort unter Verwendung von Filterpapier (0,05 m²) mit einer mittleren Filtergeschwindigkeit unter Vakuum von etwa 10^–2 Torr filtriert. Das Material bildet einen dünnen Kuchen und wird mit etwa 4 Litern destilliertem Wasser gewaschen, indem das Wasser in den zum Filtrieren verwendeten Trichter gegeben wird. Das gewaschene Material wird dann mit einem Spatel gesammelt und in einem 2,5 l-Behälter in flüssigen Stickstoff getaucht. Nach der Bildung von hartgefrorenen Teilen wird der Behälter 24 h in eine Vakuumkammer (10^–1–10^–2 Torr) gebracht, bis ein feines und trockenes Pulver erhalten ist.
Das oben beschriebene Verfahren kann zwar bei Umgebungstemperatur durchgeführt werden, der gesamte Vorgang findet jedoch vor zugsweise unter Raumtemperatur (4–5°C) statt, sodass noch besser verhindert wird, das sich die amorphe Form in eine stabilere kristalline Form umwandelt. Außerdem können Elemente oder Ionen, von denen bekannt ist, dass sie als Inhibitoren für die Bildung von kristallinem Hydroxyapatit fungieren, in Spurenmengen in die Lösung gegeben werden.
Ein Infrarotspektrum des inerten amorphen Materials an diesem Punkt des Verfahrens weist Peaks auf, die für P-O-Gruppen (600 und 1 000 cm^–1), CO₃ ^2–-Gruppen (1 420 bis 1 450 cm^–1) charakteristisch sind, wobei ein relativ breiter O-H-Peak (etwa 3 550 cm^–1) vorhanden ist. Das Röntgenbeugungsbild des gleichen Materials zeigt die amorphe Natur des Materials, da keinerlei scharfe Peaks vorhanden sind, wobei die Kristallinität so ermittelt wird, dass das Verhältnis von kohärenten Peaks zum Untergrund verwendet wird.
Das oben beschriebene amorphe Material wird anschließend zur hochreaktiven Form aktiviert, indem es 60 Minuten auf 450°C (±3°C) erwärmt wird. Das IR-Spektrum des erwärmten Materials (nicht gezeigt) zeigt eine Abnahme insbesondere der O-H- und CO₃ ^2–-Gruppen, was eine signifikante Verminderung von H₂O und CO₃ ^2– in Form von CO₂ und H₂O anzeigt. In in ähnlicher Weise hergestellten Proben fiel der Kohlenstoffgehalt um etwa 60%, wobei der Carbonatgehalt insgesamt von 1,56% auf 0,5% fiel. Es wird jedoch darauf hingewiesen, dass die amorphe Natur des Materials während dieses Prozesses erhalten bleibt, wie dies durch das Röntgenbeugungsbild demonstriert wird, das in 4(a) gezeigt ist. Die Messung des Ca/P-Verhältnisses des Materials nach der Wärmebehandlung durch eine Elektronenmikrosonde ergibt einen Wert von 1,575 (2). Die morphologischen und ultrastrukturellen Eigenschaften des amorphen Materials insgesamt sind in 1 gezeigt, einer Aufnahme unter dem Transmissionselektronenmikroskop. Es wird auf die "amorphe" Erscheinung des Materials ohne scharfe Kanten zwischen den Körnern hingewiesen, wobei ein gewisser Bereich des Materials formlos ist (Pfeile). Es wurde bei dem Material eine extrem hohe spezifische Oberfläche von 120 m²/g mit einer mittleren Porengröße von etwa 130 Å in dem Material festgestellt.
Beispiel 2: Herstellung von reaktivem amorphen Calciumphosphat
Das Herstellungsverfahren wurde wie in Beispiel 1 oben durchgeführt, mit dem einzigen Unterschied, dass die Herstellung der Lösungen A und B folgendermaßen durchgeführt wurde. Lösung A wurde bei Umgebungstemperatur durch schnelles Lösen von 90,68 g Ca(NO₃)₂·4H₂O in 1,2 Liter carbonathaltigem destillierten H₂O hergestellt. Lösung B wurde hergestellt, indem 40,57 g K₂HPO₄ in 1,53 Litern destilliertem H₂O gelöst wurden, das 24 ml einer KOH-Lösung (45 Vol-%) enthielt. Die chemischen und physikalischen Eigenschaften des bei dieser Vorgehensweise entstehenden amorphen Calciumphosphat ähneln den Eigenschaften des gemäß Beispiel 1 hergestellten Materials.
Beispiel 3: Herstellung von reaktivem amorphen Calciumphosphat
Das Herstellungsverfahren wurde wie in Beispiel 1 oben beschrieben durchgeführt, mit dem Unterschied, dass die Herstellung der Lösungen A und B durch die folgenden Reaktionen erfolgte. Lösung A wird bei Raumtemperatur hergestellt, indem 10,58 g Ca(NO₃)₂·6H₂O in 0,15 Liter carbonathaltigem destilliertem H₂O bei einem pH-Wert über 9,0, der mit NaOH eingestellt wird, schnell gelöst werden. Lösung B wird hergestellt, indem 7,8 g (NH₄)₂HPO₄ in 0,35 Liter destilliertem H₂O gelöst werden. Die chemischen und physikalischen Eigenschaften des in diesem Verfahren hergestellten Calciumphosphat ähneln den Eigenschaften des gemäß der Beispiele 1 und 2 hergestellten Materials.
Beispiel 4: Herstellung von synthetischem, wenigkristallinen apatitischen Material aus reaktivem amorphen Calciumphosphat
Dieses Beispiel beschreibt die Herstellung von erfindungsgemäßem PCA-Material.
Das Calciumphosphat-Dihydrat (DCPD) wird in diesem Beispiel folgendermaßen hergestellt. Lösung A wird bei Umgebungstemperatur hergestellt, indem 10 g N₉N₂O₄P (Diammoniumhydrogenphosphat) schnell in 500 ml destilliertem Wasser bei einem pH-Wert von 4,5 bis 4,8 gelöst werden.
Lösung B wird bei Umgebungstemperatur durch schnelles Lösen von 17,1 g Ca(NO₃)₂·4H₂O (Calciumhydrat-Tetrahydrat) in 250 ml destilliertem Wasser hergestellt. Das Dicalciumphosphat-Dihydrat wird bei Umgebungstemperatur hergestellt, indem Lösung B schnell zu der gerührten Lösung A gegeben wird. Unmittelbar danach wird die Probe unter Verwendung von Filterpapier (0,05 m²) mit einer mittleren Filtergeschwindigkeit unter Vakuum von etwa 10^–2 Torr filtriert. Das Material bildet einen dünnen Kuchen, der mit etwa 2 Liter destilliertem Wasser gewaschen und anschließend 24 bis 72 h bei Raumtemperatur an Luft getrocknet wird.
Das in Beispiel 1 hergestellte reaktive amorphe Calciumphosphat wird trocken unter Verwendung von Mörser und Stößel 3 bis 5 Minuten in einer Menge von 50:50 Gew.-% mit dem Dicalciumphosphat-Dihydrat (CaHPO₄·2H₂O) physikalisch vermischt. Dann wird Wasser (1 ml/g vermischtes Material) zu dem Pulvergemisch gegeben, um eine pastenartige Konsistenz zu erzielen. Die Menge des zugegebenen H₂O variiert in Abhängigkeit davon, ob eine dicke oder dünne Paste gewünscht wird. Das Pastenmaterial wird dann in feuchtes Seidenpapier eingewickelt und durch Erwärmen auf 37°C zu einer festen Masse ausgehärtet. Die Härtung kann für einige Stunden verzögert werden, indem die Probe in Parafilm gewickelt und bei 4°C aufbewahrt wird. Die Härtung kann auch bei Raumtemperatur erfolgen, wobei dann die Aufbauzeit verlängert ist.
Das gehärtete Material besteht aus wenigkristallinem apatitischen Calciumphosphat mit einer Größe im Nanometerbereich und einer Löslichkeit, die die für ein synthetisches Hydroxyapatitmaterial angegebenen Löslichkeiten übersteigt. Dies ist in der 3 gezeigt, wobei hier die Konzentration der Calciumionen, die bei 37°C während 24 h in eine Pufferlösung mit eingestelltem pH-Wert abgegeben werden, für das erfindungsgemäße PCA-Material (Kurve 50) deutlich größer ist als bei standard-kristallinem Hydroxyapatit (Kurve 52).
Beispiel 5: Herstellung von synthetischem, wenigkristallinen Material ausgehend von Vorläufern mit gewählter Partikelgröße
In diesem Beispiel wird die Herstellung von synthetischem PCA-Material unter Verwendung von Precursoren mit speziell gewählter Partikelgröße gezeigt.

Das DCPD wird wie in Beispiel 4 beschrieben hergestellt. Das trockene Material wird 5 Minuten in einer SPEX 8510-Labormühle mit einer SPEX 8505-Mahlkammer aus Aluminiumoxidkeramik zerkleinert. Nach der Zerkleinerung wird das Material unter Verwendung einer Schüttelvorrichtung nach Tyler gesiebt, um DCPD mit 8 verschiedenen Korngrößenverteilungen herzustellen, wie in Tabelle 1 angegeben ist. Tabelle 1 DCPD-Korngrößenverteilung

Probe	Korngrößenverteilung	Grad der Härtung nach 30 min, 37°C
10-1	< 25 μm	hart
10-2	25–35 μm	hart
10-3	35–53 μm	hart
10-4	53–63 μm	hart
10-5	Verteilung B3	hart
10-6	106–125 μm	nicht vollständig gehärtet
10-7	Verteilung 62	nicht vollständig gehärtet
10-8	ungesiebt Verteilung B1	nicht vollständig gehärtet

Es hat sich herausgestellt, dass das Zerkleinern des DCPD vor dem Sieben durch ein kurzes Zerkleinern per Hand unter Verwendung von Mörser und Stößel ersetzt werden kann, ohne dass sich die Ergebnisse wesentlich ändern.
Das in den Beispielen 1, 2 oder 3 hergestellte reaktive amorphe Calciumphosphat wird 1:1 (wt/wt) 10 Minuten unter Verwendung einer SPEX 8510-Labormühle mit SPEX 8505-Mahlkammer aus Aluminiumoxidkeramik physikalisch vermischt. Wasser (1,0–0,8 ml/g trockenes Gemisch) wird anschließend zu dem Pulvergemisch gegeben, wodurch eine pastenartige Konsistenz erzielt wird. 5 der 8 in Tabelle 1 angegebenen Proben härten bei 37°C in 30 Minuten gut aus. Die Proben 6, 7 und 8 härten nicht so schnell oder nicht so fest wie die anderen Proben. Alle diese Proben weisen im Vergleich mit den anderen Proben deutlich höhere prozentuale Anteile von Partikeln > 100 μm auf. Aus diesen Beobachtungen kann geschlossen werden, dass die Verwendung von DCPD mit kleineren Korngrößen zu einer schnelleren und vollständigeren Härtung führt als DCPD mit größeren Korngrößen.
Beispiel 6: Herstellung von synthetischem PCA-Material aus reaktivem amorphen Calciumphosphat
Reaktives amorphes Calciumphosphat, wie es in Beispiel 1 hergestellt wurde, wird in trockenem Zustand mit anderen Calciumphosphaten gemäß der in Beispiel 4 beschriebenen Methode vermischt. Diese Verbindungen umfassen, sind jedoch nicht darauf beschränkt: Ca(PO₃)₂ (Calciummetaphosphate), Ca₇(P₅O₁₆)₂ (Heptacalciumdecaphosphate), Ca₂P₂O₇ (Calciumpyrophosphat), Ca₃(PO₄)₂ (Tricalciumphosphat). Das Mischverhältnis des Gemisches in trockenem Zustand wurde in Abhängigkeit von dem molaren Ca/P-Verhältnis der mit dem reaktiven amorphen Calciumphosphat vermischten Verbindung so berechnet, dass die Ca/P-Verhältnisse im Bereich von 1,5 bis 1,70 liegen. Bei dem resultierenden Material handelt es sich um wenigkristalline apatitische Calciumphosphate in Form von Feststoffen mit Löslichkeiten, wie sie in 3 gezeigt sind.
Beispiel 7: Herstellung einer injizierbaren Paste zur Bildung eines synthetischen PCA-Materials aus einem reaktiven amorphen Calciumphosphat
In diesem Beispiel wird die Herstellung einer injizierbaren Paste für die Bildung eines wenigkristallinen apatitischen Calciumphosphats in Feststoffform beschrieben.
Trockene gemischte Materialien, die nach den Beispielen 4 oder 6 hergestellt wurden, werden mit destilliertem Wasser (2,3 ml/g) vermischt. Es wird eine Paste gebildet, die per Hand leicht geformt werden oder durch eine Nadel mit einem so kleinen Durchmesser wie 0,5 mm ID injiziert werden kann. Die Fließfähigkeit steigt nach Kühlen der Paste auf 4°C für 2 bis 3 Stunden an.
Das Material kann in Pastenform etwa 12 Stunden bei 4°C in einem luftdichten Behälter ohne Aushärten aufbewahrt werden.
Beispiel 8: Eigenschaften von synthetischem wenigkristallinen apatitischen Calciumphosphat
Der kristalline Gehalt des PCA-Materials wird durch Röntgenbeugung und IR-Spektroskopie ermittelt.
Die 5a–d sind Röntgenbeugungsbilder des Reaktionsprodukts von DCPD und reaktivem amorphen Calciumphosphat gemäß Beispiel 4. Das Reaktionsgemisch wird bei 37°C in eine feuchte Umgebung eingebracht und zu unterschiedlichen Zeitpunkten durch Röntgenbeugungsanalyse untersucht. Die Bedingungen beim Röntgenscan sind (a) Kupferanode, (b) λ = 1,4540598 A und (c) Scanbereich 20–35° in Schritten von 0,02° und einem Schrittintervall von 2 Sekunden. 6 zeigt das Infrarotspektrum von Dicalciumphosphat-Dihydrat (a), erfindungsgemäß aktiviertem ACP (b) und erfindungsgemäßem PCA-Material (c).
Die in 5a–5d gezeigten Proben wurden 0 min, 20 min, 75 min und 5 Stunden inkubiert. Die Proben werden zu den angegebenen Zeitpunkten entfernt und lyophilisiert, um die chemischen Eigenschaften zu erhalten. 5a, die bei der beginnenden Reaktion aufgenommen wurde, stellt eine Kombination von Peaks dar, die dem Ausgangsmaterial ACP und Dicalciumphosphat (siehe 4 für die XRD-Aufnahmen der Komponenten) zugeordnet werden können. Die scharfen Peaks bei etwa 20,25°, 23,5°, 29,5°, 30,75° und 34,2° für kristallines Dicalciumdiphosphat sind leicht zu identifizieren. Mit steigender Reaktionszeit nehmen die scharfen kristallinen Peaks ab und breite (amorphe) Peaks tauchen mit Peakmaxima bei 26°, 28,5°, 32,0° und 33,0° auf. Es ist interessant, dass das Spektrum sich nach 75-minütiger Reaktion nicht mehr ändert, was anzeigt, dass die Re aktion in etwas mehr als einer Stunde vollständig ist. Das Röntgenbeugungsbild des erfindungsgemäßen PCA-Materials (5d) kann mit der Aufnahme von natürlich vorkommenden Knochen (in 7 gezeigt) verglichen werden. Die beiden Spektren sind nahezu identisch, was die biologische Nähe des erfindungsgemäßen apatitischen Calciumphosphats anzeigt.
Beispiele 9–12: Charakteristiken der injizierbaren Paste für die Bildung von synthetischem PCA-Material aus reaktivem, amorphen Calciumphosphat

Diese Beispiele zeigen den Einfluss des Fluidvolumens auf die Konsistenz und Reaktivität der injizierbaren Paste, die zur Bildung von synthetischem, wenigkristallinen Hydroxyapatit verwendet werden soll. Alle Pasten werden wie in Beispiel 7 beschrieben hergestellt, und es werden die Konsistenz und die Reaktionsrate bei Umgebungstemperatur und 37°C ermittelt. Die Ergebnisse sind in der Tabelle 2 angegeben.

Tabelle 2 Formbarkeit, Injizierbarkeit und Reaktivität von einem Gramm PCA-Material, hergestellt mit unterschiedlichem Wasservolumen
Beispiel Nr.	Wasservolumen (ml)	Formbarkeit	Injizierbarkeit	Härtungszeit (Minuten) (4°C/RT/37°C)
9	0,7	- bröckelig	-	-/-/-
10	0,8*	+++ einfach gebildete Paste	+	> 60/> 60/30
11	0,9*	++ Zahncreme	++	> 60/> 60/30
12	1,0	+ Flüssigzahncreme	+++	> 60/> 60/30

* Unter gewissen Umständen (beispielsweise Verdampfung) können diese Proben nach einer Zeitspanne von einer Stunde bei Umgebungstemperatur etwas austrocknen. In diesen Fällen kann Wasser eingearbeitet werden, um die ursprüngliche Konsistenz wieder herzustellen.

Beispiel 13: Infrarotspektren von Precursoren und Produkten
Dieses Beispiel vergleicht die Infrarotspektren von kristallinen und amorphen Vorläufern, die gemäß den Beispielen gebildet werden, und des fertigen PCA-Materials, das durch Umsetzung ähnlicher Precursoren gebildet wird. 7a zeigt das IR-Spektrum von Brushit (DCPD), hergestellt wie in Beispiel 4 beschrieben; 7b zeigt das Spektrum von ACP nach Wärmebehandlung, hergestellt wie in Beispiel 1 beschrieben; und 7c ist das IR-Spektrum des gemäß Beispiel 4 hergestellten PCA-Materials.
Beispiel 14. Implantation und Resorption von PCA-Calciumphosphat an einer Stelle im Knochen.
Der Zweck dieser Untersuchung bestand darin, die Resorption und Ossifikation von PCA-Calciumphosphat an einer knöchernen Implantationsstelle zu untersuchen. Dieses Verfahren ist auch zweckmäßig, um die Resorptions- und Ossifikationseigenschaften von erfindungsgemäßen PCA-Calciumphosphat-Formulierungen und -Verbundmaterialien zu testen.
Bei dem zu testenden Gegenstand handelt es sich um eine PCA-Calciumphosphat-Formulierung, die gemäß Beispiel 4 hergestellt wurde. ACP und DCPD wurden in den angegebenen Anteilen vermischt und 1 Minute, 30 Sekunden in dem SPEX-Gerät zerkleinert.
Erwachsene (> 5 Monate alt) männliche NZW-Kaninchen wurden in Quarantäne gehalten und mindestens 10 Tage vor dem Beginn der Studie akklimatisiert. Die Tiere wurden einzeln in hängenden Käfigen aus Edelstahl untergebracht. Unter den Käfigen wurden Holzspäne in Auffangwannen vorgesehen. Vor dem Beginn der Studie wurden die Tiere zufällig Gruppen oder Behandlungen zugeordnet und sie wurden durch eine am Ohr tätowierte Nummer und eine entsprechende Karte am Käfig identifiziert. Bei allen Tieren wurde ein Defekt in einem Schienbein platziert. Die Zeitpunkte für die Evaluierungen waren 2, 4 und 8 Wochen (zu jedem Zeitpunkt 2 Tiere). Der chirurgische Eingriff wurde unter Vollnarkose und aseptischen chirurgischen Bedingungen durchgeführt.
Nach geeigneter Anästhesie (beispielsweise Ketamin/Xylazin) wurde durch einen aseptischen Eingriff ein Schnitt seitlich proximal an der Tibia angebracht. Das weiche Gewebe wurde umgeschlagen und der Knochen freigelegt. Unter Verwendung eines Bohrers mit etwa 5 mm in einem bei niedriger Geschwindigkeit arbeitenden Dentalhandgriff wurde erforderlichenfalls unter Spülen (0,9% physiologische Salzlösung) ein Loch von ~5,5 mm Durchmesser durch den Kortikalbereich des Knochens gebohrt. Die Knochenscheibe wurde aus dem Kortex freigelegt und die Stelle wurde für die Implantation vorbereitet. Das hydratisierte Precursormaterial wurde in Pastenform in den Defekt eingebracht. Defekte in Kontrolltieren blieben unbehandelt. Die weichen Gewebe wurden anschließend in Schichten geschlossen, unter Anwendung dieses Verfahrens wurde pro Tier eine Probe hergestellt.
Mindestens wöchentlich wurde die allgemeine Gesundheit und das Wohl der Tiere klinisch überwacht, wobei ein spezielles Augenmerk auf ihre Bewegungsfähigkeiten gerichtet wurde. Alle Tiere schienen bei guter Gesundheit zu sein. Am Ende der Studie wurden die Tiere mit einer Überdosis Anästhetikum getötet und die Implantationsstelle wurde gewonnen. In vorgegebenen Zeitintervallen wurden nach dem chirurgischen Eingriff und bei der Autopsie Röntgenbilder der Tibiae aufgenommen.
Die Implantationsstellen wurden in Formalin fixiert und entweder mit Hämatoxylin und Eosin, Masson-Trichrom oder von Kossa-Färbung (decalcifizierte Proben) angefärbt. Es wurden auch nicht decalcifizierte histologische Proben hergestellt und mit Light Green Basic Fuchsin gefärbt. Die Präparate wurden mikroskopisch von einem Paneel zertifizierter Veterinärpathologen (ACVP) mit Erfahrung in Labortierpathologie beurteilt. Die Knochenmorphologie und die Gegenwart oder das Fehlen von organisiertem Knochengewebe und nachweisbarem PCA-Calciumphosphat wurden subjektiv bewertet.
Die histologischen Befunde weisen auf etwas Mineralisierung nach 2 Wochen hin. Nach 4–6 Wochen hatten die Tiere mit Implantaten normale Knochenbälkchen an der Implantationsstelle, wobei kein Hinweis auf verbleibendes PCA-Calciumphosphat gefunden werden konnte. Die unbehandelten Kontrolltiere waren nicht vollständig ausgeheilt, da sie kein vollständiges Einwachsen zeigten und/oder Knochen vom Nichtkortikaltyp aufwiesen. 9a und 9b zeigen mikroskopische Aufnahmen von unbehandelten und behandelten Tibiadefekten 2 Wochen nach dem chirurgischen Eingriff. Es ist ersichtlich, dass der Knochen rechts von der Defektkante in der unbehandelten Probe (9a) ein dünner trabekulärer Knochen ist; bei dem neuen Knochen rechts von der Defektkante in der behandelten Probe (9b) handelt es sich um dicken trabekulären Knochen.
Beispiel 15. Subkutane Implantation und Resorption des PCA-Calciumphosphats.
Dieses Beispiel erläutert die Resorption von erfindungsgemäßem PCA-Calciumphosphat nach subkutaner Implantation an Ratten. Es wird ferner ein Screeningverfahren erläutert, das zweckmäßig ist, um die Resorptionscharakteristiken der neuen Formulierungen für biokeramische Implantatmaterialien und Verbundmaterialien zu testen.
Acht männliche und acht weibliche Sprague-Dawley-Ratten wurden 4 ml (2–4 g) erfindungsgemäßes PCA (gemäß Beispiel 4 hergestellt) in die dorsale Subkutis implantiert (> 10 × die Menge, die für Menschen auf kg-Basis als maximal angesehen wird). Kontrolltiere wurden mit dem gleichen Volumen Salzlösung behandelt.
Die operativen Eingriffe werden in Beispiel 16 beschrieben. Die Ratten wurden nach dem in der Tabelle 3 angegebenen Zeitplan getötet; die Implantationsstelle wird wie in Beispiel 16 angegeben untersucht.

Tabelle 3 Zeitplan der Tötung

Zeitpunkt der Tötung PCA-Calciumphosphat-Implantat

1 Woche 5 m/5 w

2 Wochen 5 m/5 w

1 Monat 5 m/5 w

3 Monate 5 m/5 w

1 Jahr 20 m/20 w
Blut für pathologische klinische Analysen wurde über retroorbitale Sinus-Punktion und kardiale Punktion (alle durch dasselbe Verfahren) gesammelt, während die Tiere mit CO₂ anästhesiert waren. Vor dem Tötungszeitpunkt wurden jeder Tiergruppe Blutproben genommen. Klinische Untersuchungen der Tiere auf allgemeine Gesundheit und allgemeines Wohlbefinden wurden bis 3 Monate mindestens wöchentlich und dann monatlich durchgeführt.
Nach 1 Woche lag an der Implantationsstelle PCA-Material vor und war wahrscheinlich in Verbindung mit dem Resorptionsprozess mit leichten bis ausgeprägten Granuloma kombiniert. In Woche 2 war immer noch eine kleine Menge PCA-Material an der Implantationsstelle vorhanden und die assoziierten Glanuloma waren leicht bis moderat. In der vierten Woche erschien das meiste Gewebe normal mit einigen wenigen leichten Granuloma an der Implantationsstelle.
In der zwölften Woche war kein Anzeichen für das Implantat mehr vorhanden.
Beispiel 16. Implantation und Resorption von PCA-Calciumphosphat intramuskulär.
In diesem Beispiel wird die Herstellung von PCA-Calciumphosphaten beschrieben, die als Ergebnis von unterschiedlichen Zerkleinerungszeiten in vivo unterschiedliche Resorptionszeiten aufweisen. Wie in Beispiel 4 beschrieben, wurden trockene Precursor, ACP und DCPD, einzeln hergestellt. Dann wurden mehrere verschiedene Formulierungen mit DCPD und ACP hergestellt durch i) Zerkleinern von DCPD während 15 s, 30 s, 1 min 2,5 min oder 5 min in einem SPEX-Zerkleinerungsgerät, ii) Vermischen des gemahlenen DCPD 1:1 mit ACP und iii) Zerkleinern des Gemisches weitere 15 s, 30 s, 1 min, 2,5 min oder 5 min. Die Zerkleinerungszeiten für die verschiedenen Präparate waren also insgesamt 30 s, 1 min, 2 min, 5 min und 10 min.
Das PCA-Calciumphosphat, das in Pulverform mit etwa 2,5 Mrad Gammastrahlung sterilisiert wurde, wurde gemäß Beispiel 4 hergestellt, indem das Material in Pulverform verwendet und mit sterilem Wasser oder steriler Salzlösung vermischt und zu etwa 1 cm-Scheiben mit 2 mm Dicke geformt und mindestens 30 min bei 37°C inkubiert wurde. Die Scheiben wurden männlichen erwachsenen New-Zealand-White-Kaninchen unmittelbar nach der Herstellung implantiert.
Die Tiere wurden Dosierungsgruppen zugeordnet, die bei insgesamt 15 Tieren 3 männliche Tiere aufwiesen. Die Implantate wurden den Kaninchen zufällig zugewiesen. 10–15 Minuten vor dem chirurgischen Eingriff wurde das Tier mit Xylazin (10 mg/kg, i. m.) behandelt. Dem Tier wurde dann Ketamin verabreicht (50 mg/kg, i. m.). Die dorsale Oberfläche des Tieres wurde geschoren und mit einer chirurgischen Betadinlösung und Alkohol gewaschen. Vor dem Eingriff wurde überprüft, dass das Tier richtig anästhesiert war. Hierzu wurde auf den Fußballen Druck ausgeübt. Wenn es zu keiner Reaktion kommt, ist das Tier richtig anästhesiert. Während des gesamten Eingriffs wurde das Tier auf Zucken der Barthaare und Zehenreflexe überwacht, die anzeigen, dass das Tier nicht aufwacht.
In einer aseptischen Operation wurde unter Verwendung eines Skalpells ein 1–2 cm langer Einschnitt in der Haut über dem M. Longissimus lumborum angebracht (der auf beiden Seiten der Wirbelsäule verläuft). Nach der Inzision wurden auch die darunter liegende Fascia und der Muskel geschnitten, um die Probe in dem Muskel anzubringen. Die Probescheibe wurde direkt in dem Muskel platziert, wobei sichergestellt wurde, dass das gesamte Implantat im Muskel eingebettet war. Der Muskel wurde mit einer einzigen absorbierbaren Naht verschlossen und die Haut subkutan vernäht. Zum Verschließen der Inzision an der äußeren Hautoberfläche wurden Metallklammern verwendet. Auf diese Weise wurden an jeder Seite fünf Proben angebracht. Jede Probe wurde am Ende einer Inzision angebracht, die in etwa 1 cm voneinander entfernt waren (siehe Diagramm). Die Proben lagen als 7 mm × 2 mm-Scheiben mit einem Gewicht von etwa 150 mg vor. Die Tiere wurden überwacht und es wurde ihnen beim Aufwachen Buprenorphin verabreicht (0,02–0,05 mg/kg, s. q.). Das Analgetikum wurde nach dem chirurgischen Eingriff drei Tage lang 2 mal pro Tag verabreicht.
Die Tiere wurden unmittelbar nach dem chirurgischen Eingriff und danach alle zwei Wochen geröntgt. Die Röntgenaufnahmen wurden verglichen, um die Resorption des Materials zu verfolgen. Für die Röntgenaufnahmen wurde ein standardisiertes Verfahren eingesetzt, um jegliche Variationen zwischen den Aufnahmezeitpunkten möglichst klein zu halten.
Nach der Tötung wurden die Implantatstellen zunächst auf makroskopischer Ebene untersucht. An den Stellen, an denen die Implantate zu sehen sind, treten sie als graue bis gelbe feste Scheiben in Erscheinung. Dort, wo das Implantat resorbiert wurde, sind Bereiche des Muskels mit rot bis bräunlicher Entfärbung zu sehen.
Das Muskelgewebe wurde mit den Implantaten entfernt, wobei darauf geachtet wurde, dass die Implantate nicht beeinträchtigt wurden. Die Gewebe und die Erkennungszeichen wurden in beschriftete Gefäße gegeben, die mit 10% gepuffertem Formalin gefüllt waren. Alle Implantatstellen wurden bearbeitet und mikroskopisch beurteilt. Die Beobachtungen umfassen fokale Fibrose, fokale granulomatöse Entzündung und das Aussehen des Implantats (in einigen Fällen). Die Fibrose tritt primär als Fibrozyten und Collagen in Erscheinung. Tiere mit makroskopischer Resorption zeigten Fibrose und minimale bis mäßige granulomatöse fokale Entzündung. Die granulomatöse Entzündung zeigte sich in Form von fokalen Aggregaten von Makrophagen und Riesenzellen, häufig mit intrazytoplasmatischen Kristallen und gelegentlich Heterophilen und Lymphozyten. Bei der Entzündung um die nicht resorbierten Implantate handelte es sich hauptsächlich um minimale bis leichte Fibrose und/oder granulomatöse Entzündung, wobei beide im für intramuskuläre Implantate akzeptablen Bereich lagen.
Nach vier Wochen waren die aus den PCA-Calciumphosphat-Implantaten hergestellten Pellets, die durch Zerkleinern während 30 Sekunden, 1 Minute oder 2 Minuten hergestellt waren, vollständig resorbiert. Die Implantate, die durch Zerkleinern für 5 Minuten oder 10 Minuten hergestellt waren, waren nicht vollständig resorbiert.
Beispiel 17: Implantation und Resorption von PCA-Material in Knochen
Der Zweck dieser Studie bestand darin, die Resorption und Ossifikation von erfindungsgemäßem PCA-Calciumphosphat an einer Knochenimplantationsstelle zu untersuchen.
Erwachsene (> 1 Jahr) Beagle wurden wegen ihrer Größe und ihrer früheren Verwendung als Modell für Knochenuntersuchungen in dieser Studie eingesetzt. Die Tibia des Hundes ist groß genug, sodass große (> 5 mm) Defekte gebildet und untersucht werden können, ohne dass die Fähigkeit des Tieres umherzugehen beeinträchtigt wird und ohne dass sekundäre Frakturen in den Knochen induziert werden.
Zehn erwachsene männliche und weibliche Beagle (6,0–15,0 kg) erhielten die gleiche Behandlung: Die Defekte wurden in der Seitenfläche des tibialen Cortex (8 mm oder 10 mm) jeder Tibia gebildet. In einer Tibia wurde PCA-Calciumphosphat in den Defekt gegeben, die andere Tibia dient als Kontrolle.
Proximal an der Tibia wurde ein Schnitt angebracht. Das weiche Gewebe wurde umgeschlagen und der Knochen freigelegt. Unter Verwendung eines Bohrers von 8 mm in einem bei niedriger Geschwindigkeit arbeitenden Dentalhandgriff wurde erforderlichenfalls unter Spülen (0,9% physiologische Salzlösung) die Knochenscheibe freigelegt und die Stelle wurde für die Implantation vorbereitet. Das erfindungsgemäße Calciumphosphat (fest oder Paste) wurde in den Defekt eingebracht. Die weichen Gewebe wurden anschließend in Schichten geschlossen. Unter Anwendung dieses Verfahrens wurden pro Tier eine bis drei Proben hergestellt. Die Wunde der Tiere konnte für vorgegebene Zeiträume heilen.
Die Defekte der Tiere wurden klinisch, röntgenographisch und mikroskopisch nach 0, 2, 4 und 8 Wochen untersucht. Insbesondere wurden Röntgenaufnahmen der Tibia während der gesamten Studie alle 2 Wochen aufgenommen. Die Röntgenaufnahmen wurden verwendet, um die Dauer der Studie zu ermitteln. Nach etwa jeweils 2 Wochen wurden 2 Tiere getötet und die Implantationsstelle wurde für die Histologie entfernt. Die Implantationsstellen wurden als nicht decalcifizierte und decalcifizierte Schnitte präpariert.
Zwei Hunde wurden als Pilottiere verwendet und erhielten kein PCA-Material. In diesen Pilottieren wurde nach 2 Wochen röntgenographisch Heilung in einem gewissen Umfang beobachtet. Nach 6 bis 8 Wochen war der Defekt vollständig geheilt. Es wurde ermittelt, dass die Größe der Defekte der Hunde optimal bei 1 cm ist. Bei den verbleibenden 8 Hunden heilten die Defekte innerhalb von 6 Wochen; behandelte Defekte heilten in 2 bis 4 Wochen. Die Qualität des Knochens in den Kontrolldefekten war dünner trabekulärer Knochen; in den behandelten Knochen handelte es sich um dicken trabekulären Knochen bis Knochen vom kortikalen Typ. Die behandelten Defekte heilten also etwa 2 Wochen schneller als die unbehandelten Defekte und sie heilten mit einer größeren Knochendicke.
11 zeigt eine stark vergrößerte (10×) mikroskopische Aufnahme von caninem trabekulären Knochenwachstum in einem mit dem erfindungsgemäßen PCA-Material behandelten Defekt 8 Wochen nach dem chirurgischen Eingriff. Die kleinen Pfeile zeigen osteoplastartige Zellen an den Knochenspitzen und deuten auf gesteigerte Zellaktivitat.
12 zeigt eine mikroskopische Aufnahme eines caninen kortikalen Knochendefekts, der mit erfindungsgemäßem PCA-Material behandelt wurde. Die großen Pfeile geben eine Kante des Defekts an. Das neue Knochenwachstum erfolgte rechts von dem Defekt; 4 Wo chen nach dem chirurgischen Eingriff ist ein dicker trabekulärer Knochen gewachsen.
Beispiel 18: Implantation und Resorption von PCA-Implantaten in Knochen
Der Zweck dieser Untersuchung bestand darin, die Resorption und Ossifikation von erfindungsgemäßem PCA-Calciumphosphat zu untersuchen und Parameter für Screening-Tests für PCA-Calciumphosphatmaterialien festzulegen.
Achtzehn erwachsene (> 3 Monate) männliche NZW-Kaninchen wurden in diesen Studien eingesetzt. Nach geeigneter Anästhesie (beispielsweise Ketamin/Xylazin) wurde durch einen aseptischen Eingriff ein Schnitt seitlich proximal an der Tibia angebracht. Das weiche Gewebe wurde umgeschlagen und der Knochen freigelegt. Unter Verwendung eines Bohrers von etwa 5 mm in einem bei niedriger Geschwindigkeit arbeitenden Dentalhandgriff wurde erforderlichenfalls unter Spülen (0,9% physiologische Salzlösung) die Knochenscheibe freigelegt und die Stelle wurde für die Implantation vorbereitet. Das erfindungsgemäße PCA-Calciumphosphat (Feststoff, Granulat oder Paste) wurde in den Defekt gegeben. Die weichen Gewebe wurden anschließend in Schichten geschlossen.
Die allgemeine Gesundheit und das Wohl der Tiere, wobei ein spezielles Augenmerk auf ihre Bewegungsfähigkeit gerichtet wurde, wurde wöchentlich und detaillierter bei den zweiwöchentlichen Röntgenaufnahmen überwacht. Röntgenaufnahmen der Tibiae wurden zu den festgesetzten Zeitpunkten aufgenommen, auch nach dem chirurgischen Eingriff und zum Zeitpunkt der Nekropsie.
Die Implantationsstellen wurden als mit Hämatoxylin & Eosin, Masson's Trichrom gefärbte, decalcifizierte Proben und als nicht decalcifizierte Schnitte hergestellt.
Die Feststellungen und klinischen Beobachtungen wurden mit dem chirurgischen Eingriff in Verbindung gebracht und nicht mit den PCA-Calciumphosphatimplantaten. Die klinischen Beobachtungen nach dem chirurgischen Eingriff lagen im Bereich von vorherigen Befunden für mit chirurgischen Eingriffen verbundenen Traumata. Röntgenbilder wurden unmittelbar nach dem chirurgischen Eingriff und zu den jeweiligen festgesetzten Tötungszeitpunkten aufgenommen.
Unmittelbar nach dem chirurgischen Eingriff waren alle Knochendefekte unterschiedlich; die Implantate schienen die gleiche Röntgendichte wie Knochen zu haben. 2 Wochen nach dem chirurgischen Eingriff hatten die Kontrolldefekte unterschiedliche Stellen und die Implantatstellen waren weniger unterschiedlich und in den umgebenden Knochen eingebettet; ähnliche Beobachtungen waren nach 4 Wochen festzustellen. Nach 7 Wochen schienen mit größerer Röntgendichte alle Stellen ähnlich. In den Kontrolltieren und den behandelten Tieren waren nach 2 Wochen die Defektstellen klar zu sehen. Nach 4 Wochen und später konnten die Implantatstellen oder Kontrollstellen nicht grob erfasst werden.
Die Röntgenbilder zeigen kaum Änderungen in den Kontrolltieren nach 7 Wochen; die mit dem erfindungsgemäßen PCA-Material behandelten Tiere hatten im Laufe der Zeit eine größere Röntgendichte. Die Defekte in den Kontrolltieren zeigten in geringem Umfang Einwachsen von neuen Knochen, vorwiegend vom dünnen trabekulären Typ, innerhalb von 4 bis 7 Wochen. Die Defekte der behandelten Tiere zeigten Einwachsen von Knochen bereits nach 2 Wochen und nach 7 Wochen waren sie mit neuem Knochen gefüllt. Die mikroskopi schen Beobachtungen sind mit einem gesteigerten Knochenersatz mit PCA-Calciumphosphatimplantaten konsistent. Insgesamt gesehen zeigt die Studie, dass 5 mm-Defekte in Tibia heilen oder neues Knochenwachstum zeigen, in den Kontrolltieren nach 7 Wochen und in den mit erfindungsgemäßem PCA-Material behandelten Tieren nach 4 Wochen. Dieses Defektmodell (unikortikal, 5 mm kritische Größe, Kaninchen) ist für die Analyse von Testgegenständen für die resorptiven und ossifikativen Eigenschaften zweckmäßig.
13 zeigt mikroskopische Aufnahmen von unbehandelten (13a) und behandelten (13b) Tibia-Defekten beim Kaninchen 4 Wochen nach dem chirurgischen Eingriff. Der große Pfeil zeigt die Defektkante. In 13a geben schmale Pfeile 100 übermäßig fibröses Bindegewebe an der Defektstelle an. Die große Pfeilspitze 102 zeigt auf den neuen trabekulären Knochen in dem Defekt. In 13b markieren die beiden kleinen Pfeile 104 das dicke trabekuläre Knochenwachstum in dem Defekt.
Beispiel 19: Änderung der Resorptionsraten von synthetischen PCA-Materialien durch Variation der Partikelgröße
PCA-Precursormaterial wird gemäß Beispiel 5 hergestellt. Zwei Precursormischungen werden hergestellt, Probe A entspricht Probe 6 und Probe B einem 2:4:3:1-Gemisch der Proben 1, 2, 3 und 4. Es wurden hydratisierte Precursorpasten von zwei Proben in Nagern in dem subkutanen Test des Beispiels 15 untersucht. Die Resorption wird zu verschiedenen Zeitpunkten überwacht.
Beispiel 20: Einbringen eines biologisch wirksamen Stoffes in ein PCA-Element und Aufrechterhaltung der in vitro Stabilität
Dieses Beispiel zeigt das Einbringen eines Proteins in einen erfindungsgemäßen Abgabeträger, sodass die in vitro Stabilität des Proteins erhalten bleibt.
Pankreatisches Rindertrypsin wird in Phosphat gepufferter Kochsalzlösung bei einer Konzentration von 100 mg/ml hergestellt. 0,8 ml dieser Lösung werden zu 1 g eines 1:1-Gemisches von aktiviertem ACP und DCPD (wie in Beispiel 17, Probe B beschrieben) gegeben. Dieses Gemisch wird zu einem Ball geformt und in einer feuchten Umgebung bei 37°C 30 min gehärtet. Der gehärtete Ball wird dann über Nacht lyophilisiert und anschließend mit Mörser und Stößel zerkleinert. Das auf diese Weise gebildete Pulver wird mit 1 ml Wasser vermischt und in die Vertiefungen einer Casein-Assay-Platte gegeben. Die ringförmige Klärung des trüben Casein um die Vertiefung wird mit der Klärung verglichen, die in einer Vertiefung zu sehen ist, die in ähnlicher Weise mit der lyophilisierten PCA-Probe gefüllt wurde, die Wärme-inaktiviertes Trypsin enthält.
Beispiel 21: Einbringen eines biologisch wirksamen Stoffes in ein PCA-Element und Aufrechterhalten der in vivo Stabilität
Dieses Beispiel zeigt das Einbringen eines Proteins in einen erfindungsgemäßen Abgabeträger in einer Weise, dass die in vivo Aktivität des Proteins erhalten bleibt.
200 mg/ml beta-Galactosidase (Worthington LS004093) wird in phosphatgepufferter Kochsalzlösung pH 7,0 präpariert. 0,8 ml dieser Lösung werden zu 1 g eines 1:1-Gemsiches von aktiviertem ACP und DCPD (wie in Beispiel 17, Probe B beschrieben hergestellt) gegeben und zu einer Kittmasse vermischt. Das formbare PCA wird dann zu einer Kugel geformt und einer Ratte subkutan implantiert. Zwei Wochen später wird die PCA-Kugel entfernt, lyophilisiert und mit Mörser und Stößel zerkleinert. Das Pulver wird anschließend auf beta-Galac tosidaseaktivität untersucht, beispielsweise unter Verwendung eines flüssigen Assays, wie er von Miller beschrieben wurde (Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1972).
Beispiel 22: Abgabe eines Antibiotikums
Dieses Beispiel zeigt die Verwendung des Abgabeträgers zur Abgabe eines Antibiotikums bei einer dentalen Anwendung.
100 μg/ml Gentamycin werden in phosphatgepufferter Salzlösung pH 7,0 gegeben. 0,8 ml dieser Lösung werden zu 1 g eines 1:1-Gemisches von aktiviertem ACP und DCPD (wie in Beispiel 17, Probe B beschrieben hergestellt) gegeben und zu einer Kittmasse vermischt. Das formbare PCA wird dann zu einer Kugel geformt und einer Ratte subkutan implantiert. Zwei Wochen später wird die PCA-Kugel entfernt, gefriergetrocknet und mit Mörser und Stößel zerkleinert. Das Pulver wird dann auf die bakterizide Aktivität unter Verwendung eines USP-bakteriziden/bakteriostatischen Bereichs eines Inhibierungstests untersucht.
Beispiel 23: Abgabe eines Impfstoffes
Dieses Beispiel zeigt die Verwendung des erfindungsgemäßen Abgabeträgers für die Abgabe eines Impfstoffes.
Keyhole Limpet-Hämocyanin wird bei einer Konzentration von 0,5 mg/ml in phosphatgepufferter Kochsalzlösung pH 7,0 präpariert. 0,8 ml dieser Lösung werden zu 1 g eines 1:1-Gemisches von aktiviertem ACP und DCPD (wie in Beispiel 17, Probe B beschrieben hergestellt) gegeben und zu einer Kittmasse vermischt. Das formbare PCA wird dann zu einer Kugel geformt und einer Ratte subkutan im plantiert. Diese Vorgehensweise wird monatlich für einen Zeitraum von vier Monaten wiederholt.
In regelmäßigen Abständen werden Blutproben genommen und die Titer für Anti-Keyhole Limpet-Hämocyanin-Antikörper durch ELISA ermittelt.
Beispiel 24: Abgabe einer Nucleinsäure
Dieses Beispiel zeigt die Verwendung des erfindungsgemäßen Abgabeträgers für die intramuskuläre Abgabe einer Nucleinsäure für die Zwecke der Zelltransfektion. Dieses Verfahren kann auch eingesetzt werden, um DNA in Gewebe, die von Muskeln verschieden sind, einzubringen.
pUC19-Plasmid-DNA wird in EDTA TRIS pH 7,4 in einer Menge von 2 mg/ml eingebracht. 0,8 ml dieser Lösung werden zu 1 g eines 1:1-Gemisches von aktiviertem ACP und DCPD (wie in Beispiel 17, Probe B beschrieben hergestellt) gegeben und zu einer Kittmasse vermischt. Das formbare PCA wird dann zur Kugel geformt und einer Ratte intramuskulär implantiert. Nach 4 Wochen wird der Muskel an der Implantationsstelle seziert und histologisch auf die Gegenwart des B-Galactosidase-Genproduktes angefärbt.
Beispiel 25: Implantation und Resorption der PCA-Einheit für die Behandlung der Parkinson-Krankheit
Dieses Beispiel zeigt die Verwendung des erfindungsgemäßen Abgabeträgers für die Abgabe eines Arzneimittels zur Behandlung der Parkinson-Krankheit.
Primaten werden mit MPTP induziert (Hemi-Parkinson) und wie von Kordower et al., Cell Transplantation 14: 155–171, 1995 beschrieben auf ihr Verhalten untersucht.
200 mg/ml GDNF wird in phosphatgepufferter Kochsalzlösung pH 7,0 hergestellt. 0,8 ml der Lösung werden zu 1 g eines 1:1-Gemisches von aktiviertem ACP und DCPD (wie in Beispiel 17, Probe B, beschrieben hergestellt) gegeben und zu einer Kittmasse vermischt. Der hydratisierte PCA-Precursor wird dann zu 3 Zylindern von je etwa 1 mm × 1 cm geformt und in einer feuchten Umgebung bei 37°C gehärtet.
Die Zylinder werden dann in die Seitenventrikel der Versuchstiere an der läsionierten Stelle angebracht und die Primaten werden weiterhin auf ihr Verhalten untersucht. Nach zwei Monaten werden die Tiere getötet und die Neuronen der Substantia nigra und des Striatum werden auf Tyrosinhydroxylase-Aktivität analysiert.
Beispiel 26: Vorgehärtetes Implantat: Augmentation und Resorption im caninen mandibularen Anlagerungsmodell
Der Zweck dieser Studie besteht darin, die Resorption, Ossifikation und Biokompatibilität von zwei Formulierungen des erfindungsgemäßen PCA-Calciumphosphats am Hundekiefer zu untersuchen. Vorgehärtetes PCA-Calciumphosphat wurde in ein canines mandibulares Anlagerungsmodell implantiert, das auch als Augmentationsmodell dienen kann.
Bei dem getesteten Gegenstand handelt es sich um PCA-Calciumphosphat in zwei Formulierungen, die den Typen 2 und 10 wie in Beispiel 16 beschrieben entsprechen. Das PCA-Calciumphosphat wurde in einer feuchten Umgebung bei etwa 40°C unmittelbar vor der Implantation vorgehärtet. Die Kontrollimplantate waren 3 mm × 4 mm Zylinder aus Silicon bzw. porösem Hydroxyapatit.
In der Studie wurden zwei weibliche erwachsene Hunde vom Jagdhundyp (20 bis 25 kg) verwendet. Beide Hunde erhielten zwei Kontrollimplantate (jeweils 1) an der rechten Seite des Unterkiefers und jeweils ein Implantat aus PCA-Calciumphosphat Typ 2 und Typ 10 auf der linken (gegenüberliegenden) Seite.
Die Implantation wurde unter voller Anästhesie und aseptischen chirurgischen Bedingungen durchgeführt. Die Tiere wurden mit Beruhigungsmitteln und Wirkstoffen vom Atropintyp ruhiggestellt, die Anästhesie wurde mit Barbituraten eingeleitet. Die Lebenszeichen der Tiere (Temperatur, Herzfrequenz, Atemfrequenz) wurden vor und während des Eingriffs überwacht. Die Tiere wurden durch Zehenkneifen und cornealem Reiz auf die Anästhesietiefe getestet. Nach geeigneter Anästhesie wurde aseptisch in der Haut über der mediolaterialen ventralen Oberfläche des Unterkiefers und proximal am Hals (über der Unterkante des Unterkiefers) ein Schnitt angebracht. Das weiche Gewebe wurde weggeschlagen und der Knochen freigelegt. Das Periost über der äußeren Unterkieferfläche wurde gehoben und die Knochenoberfläche mit einer Fräse oder einem Bohrer aufgeraut, bis sie rau und blutig und zur Aufnahme des zylindrischen Implantats bereit war. Die Kontrollgegenstände und das vorgehärtete PCA-Calciumphosphat wurden dann in die Defekte eingebracht. Zwei Proben pro Tier pro Seite wurde nach diesem Verfahren an jeder äußeren Unterkieferfläche aufgebracht (zwei PCA-Calciumphosphatproben und zwei Kontrollproben). Die Proben waren etwa 1 cm beabstandet, um zu gewährleisten, dass sie sich nicht gegenüberliegen. Das Periost wurde zunächst unter Verwendung von 3.0-Vicryl geschlossen. Dann wurden die weichen Gewebe schichtweise mit resorbierbarem Nahtmaterial aus 3-0-Vicryl geschlossen. Die Haut wurde mit einer einfachen, unterbrochenen Naht mit Nylon 5-0 geschlossen. Die Wunden der Tiere konnten für vorgegebene Zeitspannen heilen. Ein Hund wurde 3 Wochen und der andere 3 Monate danach getötet und die Teststellen wurden für die Histologie entfernt. Alle Tiere wurden getötet und die Erkennungszeichen wurden entnommen.
Die Implantationsstellen wurden als nicht decalzifizierte Sektionen präpariert. Diese Sektionen wurden auf Biointegration, Biodegradation und Biokompatibilität untersucht.
Die Ergebnisse waren die folgenden: Es wurde zu allen Zeitpunkten eine hervorragende Biokompatibilität festgestellt. Es wurden keine Riesenzellen und Makrophagen nur minimal beobachtet. Es war nur eine minimale Reaktionsschicht von nur einigen Zellen Dicke an der Basis der PCA-Calciumphosphatimplantate zu ermitteln. Dies ist signifikant besser als die mit allen Kontrollen erhaltenen Ergebnisse.
Nach drei Wochen ist der Hauptteil des Typ 2-Materials resorbiert. Nach zwölf Wochen ist das Typ 2-Material vollständig zur Oberfläche des ursprünglichen Knochens resorbiert. Zusätzlich ist der Knochen in den Alviolen nicht vollständig differenziert.
Die Typ 10-Proben zeigten Osseointegration mit Einwachsen von neuem Knochengewebe und Zellmigration in das Implantat. Das Implantat selbst war nach zwölf Wochen zu etwa 10% resorbiert.
Das Kontrollimplantat aus Silicon, das nicht resorbierbar ist, zeigte eine schwache bis moderate Fremdkörperreaktion. Die Lücken waren nach drei Wochen nicht gefüllt, nach zwölf Wochen jedoch mit einem fibrösen Gewebe gefüllt. Das Hydroxyapatit-Kontrollimplantat zeigte keine Anzeichen von Resorption oder Osseointegration innerhalb der ersten zwölf Wochen.
Dieses Experiment bestätigt die hervorragende Biokompatibilität des erfindungsgemäßen PCA-Calciumphosphat. Außerdem wurde bei den beiden PCA-Formulierungen ein Unterschied in der Resorptionszeit beobachtet, wobei die Resorptionszeit bei der Probe, in der der Precursor eine längere Zeitdauer vermischt/zerkleinert wurde (Typ B) langer war.
Die Ergebnisse zeigen ferner die langsameren Resorptions- und Ossifikationseigenschaften, die an einer nicht gewichtsbelasteten Implantationsstelle am Unterkiefer im Vergleich zu der schnelleren Ossifikation von belasteten Applikationen gemäß den Beispielen 14, 17 und 18.
Beispiel 33: In vivo Augmentation mit einem PCA/HA-Verbundmaterial
Dieses Beispiel zeigt die Verwendung eines relativ langsam resorbierenden PCA-Materials in einem PCA/HA-Verbundmaterial, um eine lang anhaltende, formerhaltende Knochenaugmentation zu erreichen.
PCA/HA-Verbundmaterialien wurden hergestellt, indem partikelförmiges HA (Korngröße < 200 μm) mit dem erfindungsgemäßen hydratisierten Precursor (Kittmasse, in Beispiel 5, Probe 5 beschrieben) in einem Verhältnis von 0,05 bis 30 Gew.-%/Vol vermischt wurde. Die durch das Mischen gebildete granulare Kittmasse wird in eine für die Implantation geeignete Form gebracht. Dann wird die granulare Kittmasse bei 37°C gehärtet.
Die Implantationsstelle wird präpariert, indem einige Millimeter des kortikalen Knochens einschließlich des Periost entfernt werden. Wenn möglich wird das Periost von der Oberfläche des kortikalen Knochens an der Implantationsstelle weggezogen, jedoch angeheftet gelassen. Das Material und Blut von dem sezierten Knochen wird be halten und mit frischer PCA-Paste (d. h. hydratisiertem Precursor) in einem Verhältnis von etwa 1:3 Vol/Vol vermischt und beiseitegelegt. Frische PCA-Paste wird als Zement verwendet, um das Implantat an der freigelegten kortikalen Knochenfläche anzubringen. Das zurückbehaltene Gemisch PCA/Gewebe wird dann als Impfkeim für das Implantat verwendet und an der Implantatoberfläche in einer möglichst großen Menge aufgebracht. Das Periost wird dann so weitgehend wie möglich über das Implantat gezogen.
Beispiel 34: Bildung von PCA-Calciumphosphat unter Verwendung von ACP und teilnehmenden Promotoren
Dieses Beispiel zeigt die Härtungseigenschaften und die Bildung von PCA-Calciumphosphat aus ACP unter Verwendung von mehreren verschiedenen teilnehmenden Promotoren. Das hochreaktive ACP wird gemäß Beispiel 1 hergestellt.
Die nanokristallinen Hydroxyapatite der Proben 1-1, 1-2 und 1-3 wurden ohne Kristallisationsinhibitoren folgendermaßen hergestellt. 218 g Dinatriumhydrogenorthophosphat (Na₂HPO₄·12H₂O) werden in 1200 ml destilliertem Wasser gelöst. Für das carbonathaltige PCA-Calciumphosphat der Proben 1-1 und 1-2 werden 80 g NaHCO₃ zu der Lösung gegeben. 70 g Calciumcitrat [Ca(NO₃)₂·4H₂O] werden in 500 ml destilliertem Wasser gelöst. Die Calciumlösung wird unter beständigem Rühren bei Raumtemperatur schnell in die Phosphatlösung gegossen. Es bildet sich sofort ein Niederschlag und die Präzipitation ist fast vollständig. Der pH-Wert des Präzipitats wird durch Zugabe einer Natriumhydroxidlösung auf 7,4 eingestellt, um die Bildung von sauren Calciumphosphaten zu unterbinden. Der Niederschlag wird sofort durch Filtrieren durch ein Buchner-Filter (mit einer Gesamtoberfläche von etwa 0,1 qm) abgetrennt und mit etwa 3 l destilliertem Wasser gewaschen. Auf dem Filterpapier wird ein gelartiger Kuchen von wenigkristallinem Calciumphosphat erhalten. Ein Teil des gelartigen Kuchens wird für die Proben 1-2 und 1-3 sofort lyophilisiert.
Für die Probe 1-1 wird der gelartige Kuchen folgendermaßen behandelt: Nach Filtrieren und Waschen wird eine geeignete Menge an destilliertem Wasser (5 bis 80 Gew.-%) zu dem gelförmigen Niederschlag gegeben. Das Gel wird homogenisiert, indem es einige Minuten kräftig geschlagen wird. Dann wird es in Polytetrafluorethylen(PTFE)-Formen (Durchmesser 60 mm; Höhe 2 mm) gegossen und einige Minuten ultraschallbehandelt, um die in dem Gel eingeschlossenen Luftblasen zu entfernen.
Die Formen werden in einer Kammer mit kontrollierter Temperatur (5 bis 37°C) und kontrollierter Feuchtigkeit (10 bis 95% RH) getrocknet. Die Proben schrumpfen beim Trocknen langsam und setzen das meiste Wasser frei. Die Rate für das Trocknen und Schrumpfen der Proben hängt von dem anfänglichen Wassergehalt ab. Das Material härtet beim Trocknen und wird glasig. Es enthält etwa 10% Restwasser.

Die weiteren Hydroxyapatite und Calciumquellen stammen aus kommerziellen Quellen. Tabelle 4 ACP-Umwandlung unter Verwendung von teilnehmenden Promotoren

Probe	teilnehmender Promotor	Inkubation bei 37°C	Grad der Härtung	PCA* mit FTIR	PCA* mit XRD
1-1	carbonathaltiger nanokristalliner Hydroxyapatit, luftgetrocknet	30 min 2 h	beginnendes Abbinden hart	ja	ND
1-2	carbonathaltiger nanokristalliner Hydroxyapatit, gefriergetrocknet	30 min 2 h	hart hart	ja	ja
1-3	nicht carbonathaltiger nanokristalliner Hydroxyapatit, gefriergetrocknet	30 min 2 h	beginnendes Abbinden hart	ja	ND
1-4	Hydroxyapatit Aldrich, Korngröße < 15–30 μm	30 min	hart	ja	ja
1-5	Hydroxyapatit Clarkson, Korngröße > 250 μm	30 min	beginnendes Abbinden	ja	ND
1-6	Monetit – nicht calciniert Korngröße	30 min 15 h	weich beginnendes Abbinden	ja	ND
1-7	CaCO₃	30 min 15 h	beginnendes Abbinden	ja	ND
1-8	Ca(OH)₂	30 min 15 h	weich beginnendes Abbinden	ja und Ca(OH)₂	ND
1-9	Ca(CH₃COO)₂	30 min 15 h	weich weich	ja	ND

*PCA = wenigkristallines apatitisches Calciumphosphat
ND = Analyse nicht durchgeführt

Das ACP wurde mit dem jeweiligen Promotor in einem Verhältnis (wt/wt) von etwa 50:50 (siehe Tabelle 1) 5 Minuten in einer SPEX-Labormühle vermischt. Es wurden etwa 0,8 ml H₂O/g trockene Pulver zu dem trockenen Precursorgemisch gegeben und zu einer Paste vermischt. Das Gemisch wurde dann zu einer Kugel geformt, in ein feuchtes Seidenpapier gewickelt und mindestens 30 min auf 37°C erwärmt. Nach 30 Minuten und zu verschiedenen Zeitpunkten danach wurde die Paste auf ihre Härte überprüft. Die 15 und 16 sind repräsentative XRD-Ergebnisse für die Reaktionen 1-2 und 1-4.
Die Verwendung von Hydroxyapatiten mit zwei verschiedenen Korngrößen als teilnehmende Promotoren führte zu ähnlichen Ergebnissen wie die Verwendung von DCPDs mit unterschiedlicher Korngröße (siehe Beispiel 5). Das bedeutet, dass der Hydroxyapatit mit größerer Korngröße langsamer und weniger vollständig härtet als der Hydroxyapatit mit kleinerer Korngröße.
Beispiel 35: Verwendung von neutralem apatitischen Calciumphosphat als Promotor
Dieses Beispiel zeigt die Verwendung von neutralem apatitischen Calciumphosphat als Promotor für die Umwandlung von ACP in das erfindungsgemäße PCA Calciumphosphat zur Förderung von Knochenwachstum in vivo Stöchiometrischer Hydroxyapatit wird mit reaktivem ACP, wie in Beispiel 34–37 beschrieben, vermischt. Die hydratisierte Precursorpaste wird, wie in den Beispielen 14, 15 oder 16 beschrieben, bei Tieren angewandt. Die Heilung des Knochens und die Biokompatibilität wird wie beschriebenen zu den angegebenen Zeitpunkten überwacht.
Beispiel 36: PCA-Bildung unter Verwendung von Promotoren
Dieses Beispiel zeigt die Bildung von PCA-Calciumphosphat, ausgehend von ACP unter Verwendung mehrerer verschiedener passiver Promotoren.

Das hochreaktive ACP wird gemäß Beispiel 5 hergestellt. Das ACP wird mit dem jeweiligen Promotor in einem Verhältnis (wt/wt) von etwa 5:1 oder 1:1 (siehe Tabelle 2) 5 Minuten in einer SPEX-Labormühle vermischt. Wasser (0,75–0,85 ml) wird hinzugefügt und es wird vermischt, um eine Kittmasse zu bilden. Das Gemisch wird dann zu einer Kugel geformt, mit einem feuchten Seidenpapier umwickelt und mindestens 30 min auf 37°C erwärmt. Nach 30 Minuten und zu verschiedenen Zeitpunkten danach wird die Paste auf ihre Härte untersucht. 17 ist eine repräsentative XRD-Messung von Beispiel 2–4 unter Verwendung eines Aluminiumoxid-Promotors. In dieser Figur sind die Aluminiumoxidpeaks zu sehen, die das Standard-PCA-Calciumphosphat-Profil überlagern. Tabelle 5 ACP-Umwandlung unter Verwendung von passiven Promotoren

Untersuchung #	Passiver Promotor (ACP: Promotor)	Inkubationszeit bei 37°C	Grad der Härtung	PCA* mit FTIR	PCA* mit XRD
2-1	SiO₂ (5:1)	30 min 3 h	weich sehr hart	ja	ja
2-2	Glimmer (5:1)	30 min 12 h	weich sehr hart	ja	ja
2-3	Al₂O₃ (1:1)	30 min 12 h	weich sehr hart	ja	ja
2-4	Al₂O₃ (5:1)	30 min 12 h	weich sehr hart	ja	ja

*PCA = wenigkristallines apatitisches Calciumphosphat

Beispiel 37: Reaktionsprofil
Dieses Beispiel zeigt den Einsatz eines DSC-Geräts (Dynamic Scanning Calorimetry) zur Überwachung der Temperaturempfindlichkeit und der insgesamt endothermen Natur in einer bevorzugten Ausführungsform, bei der aktiviertes ACP und DCPD-Precursoren verwendet werden.
Das trockene Precursorgemisch mit gleichen Gewichtsanteilen von ACP und DCPD wird (ACP und DCPD wie in Beispiel 4 beschrieben) durch Mischen unter Verwendung einer SPEX 8510-Labormühle mit SPEX 8505-Mahlkammer aus Aluminiumoxidkeramik hergestellt, wobei 2 min vermischt wird. Die Herstellung des hydratisierten Pre cursors erfolgt, indem 0,7 bis 1,5 ml Wasser auf ein Gramm der vermischten trockenen Precursoren hinzugefügt wird. Wasser (0,05 ml), das vorab auf etwa 4°C abgekühlt wurde, wird zu 47,27 mg des trockenen Precursorgemisches gegeben, worauf es sofort in das Kalorimeter eingebracht wird. Das DSC (Perkin Elmer 7 Series Thermal Analysis System) wird auf eine Starttemperatur von 0°C und eine Rampe von 5°C/min eingestellt. Die Ergebnisse sind in 16 dargestellt. Die grafische Darstellung zeigt die ersten 7 Minuten; es ist zwischen 0,0°C und etwa 20°C kein wesentlicher Wärmestrom zu sehen, wobei an diesem Punkt ein endothermer Wärmestrom einsetzt. Die Eigenschaften des Wärmestroms zeigen, dass die Reaktion bei 37°C im Wesentlichen endotherm ist und die Reaktion unter diesen Bedingungen bei Temperaturen unter 20°C nur sehr langsam oder sogar gar nicht abläuft. Die Nettoreaktivität in dem System, d. h. die Summe des endothermen und exothermen Wärmestroms des Systems, ist endotherm.
Beispiel 38: Fehlende Härtung bei bestimmten Zusammensetzungen
In diesem Beispiel wird die Umwandlung von ACP in PCA-Calciumphosphat in Abwesenheit eines Promotors beschrieben und es wird gezeigt, dass das neu gebildete PCA-Calciumphosphat nicht härtet. In gleicher Weise härtet der Promotor DCPD nicht oder wandelt sich nicht selbst um.

DCPD und mehrere ACPs und andere Calciumphosphate werden mit Wasser gemischt und auf ihre Fähigkeit getestet, bei 37°C zu härten. In Tabelle 8 sind die Ergebnisse und die Identifizierung der Reaktionsprodukte, falls diese anfielen, nach dem Testzeitraum angegeben. In keinem Fall wurde in einem Zeitraum von 3 Tagen ein Härten beobachtet. Daraus wurde geschlossen, dass die Gegenwart eines Promotors für das Abbinden und Härten günstig ist, wenn auch eine Umwandlung von ACP in PCA-Calciumphosphat stattfinden kann. Tabelle 6 ACP-Umwandlung bei Abwesenheit eines Promotors

ACP	H₂0 (g)	Inkubation	Härten	FTIR	XRD
ACP (Beispiel 5)	0,8	30 min 12 h	weich weich	ACP PCA*	ACP PCA*
DCPD (Beispiel 8) 35–53 μm	0,7	30 min 12 h	weich weich	DCPD DCPD	ND
ACP (Beispiel 7) nicht wärmeaktiviert	1,5	30 min 12 h	weich weich	PCA* Hydroxyapatit	ND
ACP (Beispiel 5) nicht carbonathaltig	1,5	30 min	weich	ACP	ND
ACP (Beispiel 6) nicht wärmeaktiviert	1,5	30 min	weich	ACP	ND
ACP (Beispiel 5) nicht carbonathaltig, wärmeaktiviert	1,5	30 min	weich	PCA*	ND

Beispiel 39: Einfluss von verschiedenen Hydratisierungsmitteln auf das Härten und das Endprodukt.
Ein hydratisierter Precursor (ACP und DCPD) wurde, wie in den Beispielen 4, 5 oder 37 oder 10 beschrieben, hergestellt, mit dem Unterschied, dass mehrere Hydratisierungsmedien verwendet wurden. Die Proben wurden anschließend zu verschiedenen Zeitpunkten auf Härte und vollständige Reaktion getestet. In allen Fällen wurde 1 g der gemischten Precursoren mit 0,75–1,0 ml Hydratisierungsmedium vermischt, um eine Paste herzustellen. In Tabelle 7 sind die Ergebnisse zusammengefasst worden; die Tabelle zeigt, dass eine Vielzahl von Flüssigkeiten auf Wasserbasis und insbesondere physiologisch akzeptable Medien für die Herstellung des PCA-Calciumphosphat verwendet werden können. Tabelle 7 Effekt von Hydratisierungsmitteln

Hydratisierungsmedium Inkubationszeit Härtung

Tris 30 min hart

0,9 M NaCl 30 min hart

MEM 30 min hart

MOPS 30 min hart

HEPES 30 min hart

BUFFERALL 30 min hart

PBS 30 min hart
Beispiel 40: Analyse der Härtung
Es wurde die Porosität an einer gehärteten PCA-Calciumphosphatprobe ermittelt, die gemäß Beispiel 5 hergestellt wurde.
Eine gehärtete Probe von PCA-Calciumphosphat (1 g) wurde unmittelbar nach der Entnahme aus dem feuchten Inkubator gewogen und dann bei Raumtemperatur 12 h luftgetrocknet. Die getrocknete Probe wurde sorgfältig gewogen, worauf das Volumen berechnet wurde. Die Probe wurde in 20 ml Wasser gegeben. Nach einer Minute wurde das ungefähre Verdrängungsvolumen notiert. Es wurde festgestellt, dass die trockene Probe H₂O in einer Menge von bis zu 50–60% ihres Trockengewichts absorbiert. Diese Ergebnisse wurden dahingehend interpretiert, dass die Probe bis zu 50–60% porös ist. Die Dichte wurde zu etwa 1,65 g/cm³ bestimmt.
Beispiel 41: Verwendung eines resorbierbaren Polymers zur Förderung der Umwandlung
Dieses Beispiel zeigt die Verwendung eines resorbierbaren Polymers zur Förderung der Umwandlung von ACP in PCA-Calciumphosphat.
Körniges PLLA wurde hergestellt und auf eine Größe von 100 μm gesiebt. Das so erhaltene Pulver wurde mit ACP (5:1 ACP:PLLA) aus Beispiel 37 vermischt und 5 Minuten in einer SPEX-Labormühle zerkleinert. Zu 1 g Gemisch wurde Wasser gegeben, um eine verarbeitbare Paste herzustellen. Die Paste wird zu einer Kugel geformt und in einer feuchten Umgebung 1 h auf 37°C erwärmt. Die gehärtete Probe wird mit FTIR und XRD analysiert.
Beispiel 42: Härtungseigenschaften bei Temperaturen unter Raumtemperatur
In diesem Beispiel werden die Härtungseigenschaften des hydratisierten Precursors bei Temperaturen unter Raumtemperatur ermittelt.
Der hydratisierte Precursor wurde wie in Beispiel 37 beschrieben mit Wasser hergestellt und dann entweder in Parafilm oder einem Aluminiumröhrchen dicht verschlossen, um Verluste durch Verdampfung zu vermeiden. Die Proben wurden dann 1 h, 24 h und 6 Tage aufbewahrt. Zu den angegebenen Zeitpunkten wurden die hydratisierten Proben aus dem Kühlschrank in eine feuchte Umgebung von 37°C gebracht. In allen Fällen härteten die Proben innerhalb von 30 Minuten.
Beispiel 43: Härtung bei Raumtemperatur
Dieses Beispiel demonstriert den Effekt der Aufbewahrung des hydratisierten Precursors unbedeckt bei Raumtemperatur.

Der trockene Precursor wird wie in Beispiel 6(c) beschrieben hergestellt. Der trockene Precursor wird mit der angegebenen Wassermenge vermischt und auf Härten und Injizierbarkeit durch eine Injektionsnadel Nr. 16 getestet, nachdem er verschiedene Zeitspannen unbedeckt bei Raumtemperatur aufbewahrt wurde. Die Ergebnisse sind in der Tabelle 8 angegeben. Tabelle 8 Injizierbarkeit der Paste nach Aufbewahren bei Raumtemperatur

Probengewicht (g)	Wasser zugegeben (ml)	Mischdauer (s)	Standzeit (min)	Temperatur (°C)	Injizierbarkeit mit Nadel Nr. 16	Härtung 30 min/37°C
1	0,8	20	10	25	sehr gut	sehr gut
1	0,8	20	20	24	sehr gut	sehr gut
1	0,8	20	30	25	sehr gut	sehr gut
1	0,8	20	40	25	gut	sehr gut
1	0,8	20	50	24	schlecht	sehr gut
5	4,2	40	10	24	sehr gut	sehr gut
5	4,2	40	20	25	sehr gut	sehr gut
5	4,2	40	30	25	gut	sehr gut
5	4,2	40	40	25	schlecht	sehr gut

Die Ergebnisse zeigen, dass ein Gramm Probe als injizierbare Paste bei Umgebungsbedingungen bei zu 45 Minuten stabil bleibt und 5 Gramm Probe bis zu 30 Minuten bei Umgebungsbedingungen (an Luft, 25°C) als injizierbare Paste stabil sind.
Beispiel 44: Komprimieren von Precursoren unter Verwendung einer hydraulischen Presse.
Dieses Beispiel erläutert das Verfahren zur Herstellung eines Pellets mit einer hydraulischen Presse.
Es wird eine Carver Laborpresse verwendet. Das Gewicht einer spezifischen Pulvermenge wird ermittelt. Das Pulver wird dann in die Pressform gegeben. Die Höhe und Dicke wird zum Teil durch die in der Form verwendete Materialmenge vorgegeben. Nach Einbringen des Materials in die Pressform wird die Form unter der hydraulischen Presse angebracht. An der Presse wird die gewünschte Last eingestellt. Das Material wird dann für eine vorgegebene Zeitspanne komprimiert. Nach dem Ablauf der Zeitspanne wird das resultierende Pellet aus der Pressform in einen Aufbewahrungsbehälter überführt.
Eine 0,5 g-Probe (ID = AB com1, aus Lot AB971002) wurde bei 500 psi (pounds per square inch) in der Carver-Laborpresse 5 Minuten komprimiert. Die physikalischen Eigenschaften des resultierenden Pellets waren: Durchmesser = 13 mm, Höhe = 3 mm, die Dichte betrug 1,27 g/cm³. Die mechanische Festigkeit wurde als hart und mit der Hand zu zerbrechen beschrieben. Durch FTIR-Analyse ergab sich am Pellet: 70% PCA in feuchtem Gewebe, 90% PCA in 20 ml destilliertem Wasser und 100% PCA in carbonathaltiger Pufferlösung (CO₃ –2 0,2 Mol). Eine zweite Probe von 0,5 g (ID = ABcom2, aus Lot AB971002) wurde bei 4700 psi in der Carver-Laborpresse 5 Minuten komprimiert. An dem Pellet wurden die folgenden Ergebnisse erhalten: Durchmesser = 13 mm, Höhe = 2 mm und Dichte = 1,99 g/cm³. Die mechanische Festigkeit wurde als sehr hart und mit der Hand zu zerbrechen beschrieben. Nach Inkubation bei 37°C für 60 Stunden und Analyse mit FTIR wurden die folgenden Ergebnisse erhalten: 60% PCA in nassem Gewebe, 60% PCA in 20 ml destilliertem Wasser und 60% PCA in carbonathaltiger Pufferlösung (CO₃ –2 0,2 Mol).
Beispiel 45: Komprimieren von Precursoren unter Verwendung einer Handpresse.
Dieses Beispiel zeigt das Verfahren zur Herstellung eines Pellets mit einer Handpresse.
Es wurde eine Perkin Elmer Quick Press verwendet. Pellets von 7 mm Durchmesser wurden hergestellt, indem in Verbindung mit der Quick Press vorgewählte Formensets verwendet wurden. In Abhängigkeit von den gewünschten Untersuchungen können auch andere Formensets mit unterschiedlichen Durchmessern verwendet werden. Die Oberfläche des Pellets kann flach oder rund sein und hängt von der Form des Formwerkzeugs ab. Die Probe wird in die gewählte Form gegeben. Mit steigender Probenmenge steigt auch die Dicke des Pellets. Als Nächstes wird aus den verschiedenen manuellen Positionen im oberen Teil der Quick Press eine Referenzposition ausgewählt. Die Form wird in die Quick Press eingebracht. Für eine vorgewählte Zeitspanne wird mit dem Handgriff der Quick Press ein konstanter Druck ausgeübt. Nach Ablauf dieser Zeitspanne wird das Pellet aus der Form entfernt, indem der untere Deckel von der Form entfernt und zum Ausstoßen des Pellets von oben an der Form Druck ausgeübt wird.
Eine 0,08 g Probe (ID: AB com3, aus Lot AB971002) wurde in der Form mit 7 mm Durchmesser untersucht. Die manuelle Position der Quick Press wurde auf 20 eingestellt, man komprimiert 1 Minute. Das resultierende Pellet weist einen Durchmesser von 7 mm und eine Höhe von 1,5 mm auf; die Dichte beträgt 1,39 g/cm³. Eine zweite Probe (ID: AB com4, 0,1 g, aus Lot 971002) wurde in die 7-mm-Durchmesser-Form eingebracht. Die manuelle Position wurde auf 20 eingestellt, es wurde 30 Sekunden in der Quick Press komprimiert. Der resultierende Pellet hat einen Durchmesser von 7,0 mm und eine Höhe von 2,0 mm, die Dichte ist 1,23 g/cm³.
Beispiel 46: Verhalten von PCA-Pellets in verschiedenen Medien.
Dieses Beispiel beschreibt das Verhalten von PCA-Calciumphosphat-Pellets in verschiedenen Medien.
Es wurden vier Arten von Medien ausgewählt: (–MEM (Minimum Essential Medium); TBS (Tris Bovine Serum: 50 mM Tris + 150 mM NaCl); (–MEM + FBS (fetales Rinderserum 10%) und Vollmedium (Eintauchen in TBS bei 37°C für 2 h und anschließend Eintauchen in (–MEM + FBS).
Eine 0,3-g-Probe des Precursorgemisches ACP/DCPD wurde eine Minute mit 7 Tonnen unter Verwendung der Carver Laborpresse komprimiert. Der resultierende Pressling (a) hat einen Durchmesser von 12 mm und eine Höhe von 1 mm. Das Pellet wurde 30 min bei 37°C in 10 ml destilliertes Wasser eingebracht. Nach dem Inkubieren wurde der Pressling 24 und 48 Stunden bei 37°C in 6 ml der verschiedenen Medien eingebracht.
Eine zweite 1-g-Probe des Precursorgemisches ACP/DCPD wurde mit 0,8 ml destilliertem Wasser vermischt. Das Gemisch wurde zum Ball geformt und 30 min bei 37°C in 10 ml destilliertes Wasser getaucht. Der Ball wurde anschließend mit Mörser und Stößel zu einem feinen Pulver zermahlen. Das Pulver wurde dann eine Minute mit 7 Tonnen in der Carver-Laborpresse gepresst. Der resultierende Pressling (b) hat einen Durchmesser von 12 mm und eine Höhe von 1 mm. Anschließend wurde der Pressling 24 und 48 Stunden bei 37°C in verschiedene Medien eingebracht.
Es wurde der pH-Wert der Lösungen (bei 25°C) zu verschiedenen Zeitpunkten (nach 0, 24 und 48 Stunden) nach der Inkubation bei 37°C gemessen. Die Ergebnisse dieser Studie sind in der Tabelle 9 dargestellt. Tabelle 9. pH-Wert der Lösungen

Probe α-MEM TBS α-MEM + FBS Vollmedium

0h 24h 48h 0h 24h 48h 0h 24h 48h 0h 24h 48h

a 7,6 8,1 7,9 7,5 7,0 6,8 7,5 7,7 8,2 7,6 7,9 7,9

b 7,3 7,3 7,1 7,3 6,5 6,0 7,4 7,5 7,5 7,5 7,5 7,3
Beispiel 47: Umsetzung von Precursoren, Gefriertrocknung, Zerbröckeln und Pressen.
In diesem Beispiel wird beschrieben, wie ein Pellet aus einer PCA-Calciumphosphatpaste hergestellt wird.
PCA wird unter Verwendung von ACP und DCPD als Promotor hergestellt. Als biologisch geeignetes wässeriges Medium wird eine Salzlösung verwendet. Die hergestellte PCA-Paste wird dann in vitro bei 37°C Lyophol-gehärtet und anschließend lyophilisiert. Das erhaltene PCA-Material wird anschließend mit der Hand zerkrümelt. Nach dem Zerbröckeln wird das PCA-Material gemäß den in den Beispielen 34 und 35 beschriebenen Verfahren zu einem Pellet geformt.
Beispiel 48: Formen, Härten und Lyophilisieren ohne Vermahlen.
Dieses Beispiel zeigt, wie ein Pellet aus einer PCA-Calciumphosphatpaste hergestellt wird. ACP und DCPD werden als Precursoren gewählt. Zur Herstellung der PCA-Paste wird eine geeignete Menge Salzlösung verwendet. Die PCA-Paste wird dann in die gewünschte Form gebracht. Sie wird anschließend in vitro 30 min bei 37°C inkubiert. Der gehärtete Gegenstand wird dann gefriergetrocknet.
Beispiel 49: In vivo Experimente, in denen die Verfahren verglichen werden.
In diesem Beispiel werden die Verfahren zur Herstellung der Pellets über in vivo Experimente verglichen.
Die Pellets werden gemäß Beispiel 32 hergestellt. Zwei Pellets werden in einen Hunde-Oberschenkelknochen implantiert. Die Tiere werden getötet und die Implantationsstellen nach 3, 4 und 6 Wochen auf verbleibende Materialreste analysiert. Zu jedem Zeitpunkt werden decalcifizierte und nicht decalcifizierte Präparate der Implantationsstelle hergestellt und angefärbt. Die Präparate werden histomorphometrisch analysiert, um die Ähnlichkeit der hergestellten Pellets mit der PCA-Calciumphosphatpaste zu ermitteln.
Beispiel 50: Einbringen eines Füllmaterials oder Binders.
Dieses Beispiel demonstriert die Verwendung eines Füllmaterials zur Untersuchung des plastischen Fließens, wobei ein besonderes Augenmerk auf die Wirkung auf die Bruchfestigkeit im Pellet gerichtet wurde.
Ein komprimierbarer Zucker wird bei der Pelletherstellung als Füllmaterial verwendet. Der Zucker wird vor der Verdichtung mit den Precursoren ACP und DCPD in einem Verhältnis von 1:1:1 vermischt. Das Pellet wird gemäß Beispiel 1 hergestellt, wobei Veränderungen hinsichtlich der Dauer des gesamten Kompressionszyklus und der Dauer der maximalen Druckkraft vorgenommen wurden. Die Wirksamkeit des Füllmaterials aus Zucker wird ermittelt, indem die Bruchfestigkeit der Pellets verglichen wird. Zur Berechnung der Bruchfestigkeit wurde die folgende Gleichung verwendet: σ0 = 2F/Πdt,wobei σ₀ die Bruchfestigkeit bedeutet, F die Kraft ist, die erforderlich ist, um den tablettenförmigen Pressling zu spalten, d der Durchmesser des Pellets ist und t die Dicke der Tablette oder Höhe angibt.
Beispiel 51: Abgabe eines Impfstoffes aus einem Pellet.
Dieses Beispiel zeigt, in welcher Weise das Pellet als Arzneimittelabgabesystem für einen Impfstoff verwendet wird.
Keyhole Limpet-Hämocyanin wird bei einer Konzentration von 0,5 mg/ml in Phosphat-gepufferter Salzlösung, pH 7,0, hergestellt. 0,8 ml dieser Lösung werden zu 1 g eines 1:1-Gemisches von aktiviertem ACP und DCPD gegeben und zu einer Kittmasse vermischt. Die hergestellte PCA-Kittmasse wird dann lyophilisiert. Das trockene Material wird unter Verwendung einer SPEX 8510-Labormühle mit SPEX 8505-Mahlkammer aus Aluminiumoxidkeramik 10 Minuten zermahlen. Das pulverige PCA wird dann, wie in Beispiel 32 beschrieben, zu einem Pellet geformt. Das gemäß Beispiel 32 hergestellte Pellet wird anschließend einer Ratte subkutan implantiert. Das Verfahren wird vier Monate lang monatlich wiederholt. Es wurden regelmäßig Blutproben entnommen und Anti-Keyhole Limpet-Hämocyanin-Antikörpertiter mit ELISA ermittelt.
Beispiel 52: Lumbale interkorporelle Wirbelsäulenfusion am Hund.
In diesem Beispiel wird die Verwendung von PCA-Calciumphosphat bei der Fusion von spinalen Vertebrae am Hund beschrieben.
Die Tiere wurden anästhesiert, auf die rechte Seite gelegt und, von vorne nach hinten auf der Mittellinie von der Thoraxmitte zum Becken geschoren. Nach dem sterilen Abdecken wurde ein retroperito nealer Eingriff zur vorderen Lendenwirbelsäule durchgeführt, wobei die L3-L6-Vertebrae freigelegt wurden. Die segmentären Gefäße über L4 und L5 wurden abgebunden und geteilt, so dass die L3-4-, L4-5- und L5-6-Bandscheiben anterolateral freigelegt wurden. Nach der Diskektomie wurde ein zylindrischer Titankäfig in jede Bandscheibenlücke eingebracht, der entweder PCA-Calciumphosphat oder autologes Knochengewebe enthielt oder leer war. Aus dem linken vorderen Beckenkamm wurde ein autogener Beckenkammknochenspan über einen getrennten Schnitt gewonnen, kurz bevor er in den Käfig gegeben und in die Bandscheibenlücke eingebracht wurde. Nachdem alle drei Käfige eingebracht waren, wurde unter Verwendung von 4,5-mm-Vertebralkörperschrauben und einem Draht (6 mm Durchmesser) von L3 nach L6 fixiert. Anschließend wurde die abdominale Wunde und die Stelle der Entnahme am Beckenkamm schichtweise unter Verwendung von absorbierbarem Nahtmaterial und Hautklammern geschlossen.
Die Hunde wurden zwei und zwölf Wochen später getötet und die Histologie der nicht decalcifizierten Sektionen wurde auf neues Knochenwachstum und vertebrale Fusion untersucht. Durch visuelle Inspektion schien bei Verwendung des erfindungsgemäßen PCA-Calciumphosphat eine Fusion des Rückenmarks vorhanden zu sein.
Beispiel 53: Knochenheilung in Gegenwart von PCA-Material
Dieser Studie lag die Aufgabe zugrunde, Knochenheilung in Gegenwart des erfindungsgemäßen PCA-Materials zu untersuchen.
In dieser Studie wurden 30 adulte NZW-Kaninchen verwendet. Während der gesamten Studie standen Leitungswasser und zertifiziertes Kaninchenfutter ad libitum zur Verfügung. Der chirurgische Eingriff wurde aseptisch unter voller Anästhesie durchgeführt. 30 Minuten vor dem chirurgischen Eingriff wurde Cefazolin verabreicht (22 mg/kg). Als Anästhetikum wurden 10 ml (100 mg/ml) Ketamin, 1 ml (100 mg/ml) Xylazin und 5 ml 0,9%-ige physiologische Kochsalzlösung (87,5 mg/kg Ketamin, 8,75 mg/kg Xylazin) verwendet. Das Gemisch wurde in einer Dosis von 1,5 ml/kg i. m. verabreicht. Der Hinterlauf des Tieres wurde dann geschoren und mit einer chirurgischen Betadine-Lösung und Alkohol gewaschen. Vor dem Eingriff wurde überprüft, dass das Tier richtig anästhesiert war. Hierzu wurde auf den Fußballen Druck ausgeübt. Wenn es zu keiner Reaktion kommt, ist das Tier richtig anästhesiert. Während des gesamten Eingriffs wurde das Tier auf Zucken der Barthaare und Zehenreflexe überwacht, die anzeigen, dass das Tier nicht aufwacht. Bei Anwendung einer aseptischen Technik wurde über der proximalen Tibia ein Einschnitt gelegt. Das weiche Gewebe wurde weggeschlagen und der Knochen freigelegt. Es wurde ein 8 mm-Bohrer in einem bei niedriger Geschwindigkeit arbeitenden Dentalhandgriff erforderlichenfalls unter Spülen (0,9% physiologische Kochsalzlösung) verwendet. Die Knochenscheibe wurde freigelegt, dann wurde die Stelle für die Implantation vorbereitet. Anschließend wurde das PCA-Material in den Defekt eingebracht. Die weichen Gewebe wurden in Schichten unter Verwendung von 3-0 Dexon^TM-Nahtmaterial geschlossen. Bei Anwendung dieses Verfahren wurde pro Tier eine Probe hergestellt. Die Tiere wurden überwacht und es wurde ihnen beim Aufwachen Buprenorphin (0,02 bis 0,05 mg/kg, s. c.) und ein Breitbandantibiotikum verabreicht. Das Analgetikum und Antibiotikum wurden zweimal täglich über drei Tage nach dem chirurgischen Eingriff verabreicht. Vor der Tötung wurde jedem Tier Blut abgenommen. Das zur Blutabnahme angewandet Verfahren war das folgende: Acepromazin (1 mg/kg s. c.) wurde jedem Tier zur Entspannung und Erweiterung der Gefäße etwa 15 bis 20 Minuten vor der Blutabnahme verabreicht. Danach wurde eine 23 g-Butterflynadel in der zentralen Ohrarterie angebracht.
Es wurde ein Vacutainer mit 2 cc Glasrohren verwendet, um nicht mehr als 2 ml Blut des Tiers zu entnehmen. Nach der Blutabnahme wurde die Nadel entfernt und für eine geeignete Gerinnung wurde in dem Gefäß Druck angewandt. Außerdem wurden intramuskuläre Injektionen während des chirurgischen Eingriffs verabreicht, während das Tier voll anästhesiert war. Dann wurde das Weichgewebe rasiert und für Injektionen vom Typ 10.0 des PCA-Materials vorbereitet. 3 bis 5 Injektionen in den Lendenmuskel wurden unter Verwendung einer Kanüle Nr. 16 verabreicht. Die Kaninchen erhielten zu Zeitpunkten von 4, 7 und 14 Tagen 4 oder 5 Injektionen, um die Entnahme des PCA-Materials für die chemische Analyse zu ermöglichen. Zu den weiteren Zeitpunkten erfolgten nur 3 Injektionen. Jede Injektion enthielt etwa 0,2 g PCA-Material. Auf der gegenüberliegenden Seite wurden 3 Injektionen eines resorbierbaren Nahtmaterials gesetzt, das als positive Kontrolle fungierte. Die Tiere wurden durch intravenöse Anästhesie mit Natriumpentobarbital getötet und anschließend durch Schnitte der Achselschlagader ausbluten gelassen. Für die FTIR und XRD-Analyse wurde das PCA-Material aus den Weichgewebeimplantationsstellen entfernt, in Isopentan schockgefroren und vor dem Versand zur ETEX Corporation auf Trockeneis in einem –70°C-Gefriergerät aufbewahrt. Die Teststellen aus dem Weich- und Hartgewebe wurden entfernt und für die Histologie vorbereitet.
Nach Euthanasie und Exsanguination wurden die Gewebe aus den Tieren entnommen, in Paraffin eingebettet, unterteilt und mit Hämatoxylin und Eosin für histopathologische Schnitte angefärbt. Danach wurden 300 mg des gewonnenen PCA-Materials in einem Röntgenbeugungsmessgerät Rigaku RU300 mit rotierender Anode im Zentrum für Material Science an Engineering facilities am Massachusetts Institute of Technology in Cambridge, MA am 22, Januar 2997 analysiert. Ein homogenes Gemisch von 300 mg KBr und 1,5 ml des gewonnenen PCA-Materials wurde mit einem Spektrum 1000 Perkin Elmer FTIR untersucht. Gewebeschnitte wurden außerdem auf einer Skala von 0 bis +3 für endosteale Knochenbildung bewertet. Gebiete mit neutrophilen Infiltraten zeigten im Allgemeinen wenig Osteoprogenitor-Bildung oder Knochenneubildung. Auf einer Skala von 0 bis +3, wobei 0 keine neue endosteale Knochenbildung und +3 umfassende neue endosteale Knochenbildung bedeutet, wiesen die Tiere am Tag 4 0 bis +1, am Tag 7 +1 und am Tag 14 +2 auf.
Am Tag 4 und 7 war eine sichtbare, leichte Schwellung über der Defektstelle zu sehen. Insgesamt zeigte sich am Tag 14 ein kuppelförmig ausgebildeter Knochenkallus über der Bohrstelle. Bei der Beurteilung am Tag 21 wurde für alle Testgruppen eine größere Reife des Knochenkallus an der Defektstelle festgestellt, wobei keine signifikante pereosteale Reaktion am übrigen Cortex festzustellen war. Unter dem Mikroskop war die Defektstelle mit trabekulärem und kortikalem Knochen gefüllt. Es gab etwas endosteale trabekuläre Knochenbildung um und in das PCA-Material hinein. Am Tag 21 gab es keinen Hinweis auf irgendeine negative Reaktion auf das implantierte PCA-Material. An den Tagen 4, 7 und 14 wurden Proben entnommen und unter Verwendung von XRD analysiert. Siehe Figur _. Die Spektren bestätigen das Folgende: Die kristalline Struktur des PCA-Materials ist mindestens 14 Tage in vivo stabil und entspricht im Wesentlichen dem in vitro hergestellten PCA-Material. Ferner wurden Proben am Tag 4, 7 und 14 den Tieren entnommen und mit FTIR analysiert. Siehe Figur _. Das Testmaterial war chemisch stabil und die Reaktion war in vivo abgeschlossen. Das PCA-Material verursachte keine nicht zu akzeptierende Entzündung, wenn es entweder intramuskulär oder in einem Knochendefekt implantiert wurde. Durch die XRD und FTIR-Analyse wurde ermittelt, dass das PCA-Material in vivo bis zu 21 Tage nach der Implantation chemisch stabil ist.
Beispiel 54: Quantitative Bestimmung der Knochenheilung mit PCA-Material
Das Ziel dieser Studie bestand darin, den Heilungsprozess in der Gegenwart des erfindungsgemäßen PCA zu quantifizieren und die Resorption des implantierten PCA-Materials zu überwachen.
Das Protokoll wurde am 14. Februar 1996 unterzeichnet und die Studie wurde an den Bio-Research Laboratories Ltd., 87 Senneville Rd., Senneville, Quebec, Canaca, H9X 3R3 in Übereinstimmung mit den Vorgaben in United States FDA Good Laboratory Practise Regulations (21 CFR Teil 58) durchgeführt. Die chirurgischen Eingriffe wurden am 15., 16., 22., 23., 29. Februar und März 1996 (in Bezug auf die sechsmonatige Studie) und 11. und 12. April 1996 (für die einjährige Studie) durchgeführt.
Beagles (Canis familiaris) wurden von HRP INc., 6321 South 6th Street, Kalamazoo, MI 49009 U. S. A. erhalten. Die Tiere wurden in vier verschiedenen Räumen in Käfigen aus Edelstahl untergebracht, die jeweils einen balkenartigen Boden und ein automatisches Ventil für die Wasserversorgung hatten. Die Tiere hatten einmal täglich Zugang zu einem standard-zertifizierten, im Handel erhältlichen Hundefutter in Pelletform (400 g – PMI Cerfitied DogChow 5007: PMI Feeds Inc.). Die Fressnäpfe blieben etwa 24 Stunden in den Käfigen (außer während den festgelegten Prozeduren). Einige Tiere erhielten ferner gelegentlich zusätzlich Dosenfutter, Mixit oder Canine ID (Hill's Science Diet). Leitungswasser stand ad libitum zur Verfügung.
Das PCA-Material wurde als steriles Pulver in vorabgemessenen Packungen zur Verfügung gestellt. Das Material wurde am Tag des chirurgischen Eingriffs für die Implantation hergestellt. Das Material wurde mit geeigneten Mengen an sterilem Wasser hydratisiert und vor der Implantation bei Raumtemperatur aufbewahrt. Jeder Hund erhielt eine Dosis Penlog-XL (Benzathine Penicillin G und Procaine Penicillin G) (1 ml) intramuskulär mindestens 1 Stunde vor dem Ein griff und ferner 2 Tage nach dem chirurgischen Eingriff. Jedes Tier wurde mit Hilfe einer intramuskulären Injektion von AC-Promacin (0,05 mg/kg), Butorphanol (0,2 mg/kg) und Glycopyrrolat (0,01 mg/kg) mindestens 10 Minuten vor der Operationsvorbereitung voranästhesiert. Die Tiere wurden dann für den chirurgischen Eingriff vorbereitet, indem ein (Gruppe 1 und 2) oder beide (Gruppe 3 und 4) Hinterbeine vom Becken bis zum Unterschenkel rasiert wurde. Der rasierte Bereich wurde mit Hibitane^TM (Chlorhexidingluconat 4%) und anschließend mit 70% Isopropanol und Betadine^TM (Povidoniod 10%) gewaschen. Die Tiere wurden mit einer intravenösen Injektion von Thiopentonnatrium 2,5% anästhesiert, die subkutane Injektionsstelle (mittdorsaler Brustbereich) für Gruppe 2 wurde in gleiche Weise vorbereitet. Vor dem chirurgischen Eingriff wurde an jedem Auge die Salbe Duratears^TM verabreicht. Alle Tiere wurden intubiert und während des chirurgischen Eingriffs unter Isofluran-Narkose gehalten. Lactated Ringer (mit einer Rate von 10 ml/kg/Stunde) wurde perioperativ verabreicht.
An der Seitenfläche des Hinterbeins wurde ein Längsschnitt angebracht, um etwa 8 bis 10 cm des Femurs freizulegen. Die Knochenhaut über dem Oberschenkelknochen wurde von dem Knochen entfernt. Die Schablone (etwa 6 cm) wurde angebracht, um die Stellen für die Löcher zu identifizieren, die an beiden Enden des Schafts gebohrt wurden. Unter Verwendung eines Bohrers mit geeigneter Größe wurde ein Stück Knochen von etwa 3 bis 5 mm Tiefe an jedem Ende des Schaftes entfernt und unter Verwendung einer oszillierenden Säge wurde das Loch etwa 4 bis 5 cm distal vergrößert. Das Knochenmark wurde entfernt und jegliche deutliche Blutung wurde geeignet eingedämmt. Bei den Tieren der Gruppe 1 wurde der entfernte Knochen nach Bildung der Defektstelle in kleine Stücke zerschnitten, mit Salzlösung gespült und als autologes Knochenimplantat in die Defektstelle gepackt. Bei den Tieren der Gruppe 2 wurde nach der Bildung der Defektstelle das Knochenersatzmaterial in die Defektstelle gegeben, wobei sichergestellt wurde, dass kein überschüssiges Material im umgebenden Gewebe zurückblieb. Nach dieser Prozedur wurde eine Menge von _-_ BSMTM (für 25 g Gesamtdosis) subkutan im mittdorsalen Brustbereich injiziert. Im Falle der Tiere der Gruppe 3 und 4 wurde nach der Bildung der Defektstelle am ersten Hinterbein das Knochenersatzmaterial in die Defektstelle gegeben, wobei sichergestellt wurde, dass kein überschüssiges Material in dem umgebenden Gewebe zurückblieb. Der entfernte Knochen wurde in kleine Stücke geschnitten und mit Salzlösung gespült. Im zweiten Bein wurde eine Defektstelle geschaffen und der präparierte Knochen wurde in diese Stelle gegeben. Jede Defektstelle wurde markiert, indem ein 1 cm langes Stück von K-Draht an jedem Ende der Rille angebracht wurde. Die Fascia wurde dann mit resorbierbarem Nahtmaterial genäht, um sicherzustellen, dass das Material an Ort und Stelle bleibt. Die Operationsstelle wurde mit chirurgischen Klammern geschlossen und die Klammern wurden etwa 10 Tage nach dem Eingriff entfernt.
Beide Hinterbeine jedes Tiers aus Gruppe 3 wurden am Tage der Tötung für Woche 0 und allen weiteren Tieren der Gruppe 3 in Woche 3, 12 und 26 geröntgt. Die Tiere wurden für diese Prozedur betäubt. Die Tiere wurden durch intravenöse Anästhesie mit Natriumpentobarbital getötet, gefolgt von einer Exsanguination durch Einschneiden der Achselarterien. Die oben angegebenen Gewebe wurden präpariert, indem sie in Paraffinwachs eingebettet, unterteilt und mit Hämatoxylin und Eosin gefärbt wurden. Die Hälfte jeder femoralen Implantationsstelle (Gruppen 1, 2 und 4) wurde als decalcifizierter Schnitt präpariert und in Form von mit Hämatoxylin und Eosin und Massons's Trichrom gefärbten Objektträgern präpariert. Die verbleibende Hälfte jeder Stelle wurde in 70% Alkohol aufbewahrt und als nicht decalcifizierter Schnitt (in geeigneten Einbettungsmedien) präpariert und mit Kossa und Goldner's Trichrom gefärbt und in Zenker's Fluid fixiert.
Im Anschluss an die histopathologische Analyse wurde eine histomorphometrische Analyse durchgeführt. Die Defektgrenzen wurden subjektiv ermittelt und die Gesamtknochenfläche und das vorliegende PCA-Material wurde für den Defektbereich tabellarisch erfasst. Die Histomorphometrie bestätigt und erweitert die Histopathologie. Die histomorphometrischen Daten aller von Kossa gefärbten, nicht decalzifizierten Sektionen für alle verfügbaren experimentellen Gruppen wurden zu jedem Zeitpunkt gemäß dem Implantattyp zusammengefasst, unabhängig davon, ob die Tiere zu Gruppe 1, 2 oder 4 gehörten. Die Ergebnisse bezüglich neuer Knochenbildung in Defekten, die mit PCA-Material oder auch solche mit Eigenimplantaten behandelt wurden, wie auch die PCA-Resorption sind in Figur _ gezeigt. Neue Knochenbildung bei Selbstimplantaten scheint etwas schneller als neue Knochenbildung bei PCA-Empfängern. Nach 4 Wochen erreicht der neue Knochen in Eigenimplantatempfängern nahezu einen Maximalwert von 74,7% +/–20 (sem; n = 8). In Woche 26 sind die Eigenimplantatwerte auf 56,78% +/–20,9 (sem; n = 4) gefallen, was nahelegt, dass möglicherweise aufgrund des Ausfalls einiger Implantatbereiche gesteigerte Umformung stattgefunden hat. Neue Knochenbildung erreicht bis Woche 12 bei PCA-Empfängern nicht den Maximalwert (77,18% +/–11,2, sem; n = 8), wobei die in Eigenimplantaten beobachtete Umformung nach 26 Wochen bei den PCA-Empfängern nicht beobachtet wurde. Die PCA-Werte der Woche 26 (78% +/+21,5; sem: n = 4) waren mit den Werten für Woche 12 vergleichbar. Nachweisbares restliches PCA-Material machte weniger als 95% der Gesamtoberfläche in dem Defekt für Woche 4 und weniger als 0,3% bei Woche 26 aus. Da der Defekt ursprünglich zu 100% mit PCA-Material gefüllt war, war die Resorption für Woche 26 größer als 99%.

Claims

Träger für die Abgabe eines biologisch wirksamen Stoffes, enthaltend: (A) einen biologisch wirksamen Stoff, der ausgewählt ist unter: Polypeptiden, Polynucleotiden, Nucleoproteinen, Polysacchariden, Glycoproteinen, Anti-AIDS-Wirkstoffen, Cytostatika, Antiseptika, ACE-Hemmern, Antigenen, adrenergen Antagonisten, Antacida, Immunsuppressiva oder Immunmodulatoren, antiviralen Substanzen, Enzyminhibitoren, Neurotoxinen, Opioiden, Hypnotika, Antihistaminika, Gleitmitteln, Tranquilizern, Anticonvulsiva, Muskelrelaxantien, Anti-Parkinson-Wirkstoffen, Antispasmotika, muskelkontrahierenden Substanzen, Antidiarrhoika, Antiemetika, Laxativa, Diuretika, Miotika, Anticholinergika, Wirkstoffen gegen Glaucome, antiparasitären Verbindungen, antiprotozoalen Verbindungen, Antihypertensiva, Analgetika, Antipyretika, entzündungshemmenden Wirkstoffen, Antitussiva, Antivertiginosa, Wirkstoffen zur Behandlung von Schwindelanfällen, Arzneimitteln gegen Reisekrankheit, Lokalanästhetika, Ophthalmika, Prostaglandinen, Antidepressiva, Antipsychotika, Imaging Agents, speziellen Targeting Agents, trophen Faktoren, Wachstumsfaktoren, Neurotransmittern, Modifikatoren der Zellantwort und Impfstoffen, und (B) ein synthetisches wenigkristallines apatitisches (poorly crystalline apatitic, PCA) Calciumphosphat, erhältlich nach einem Verfahren, das umfasst: Inkontaktbringen eines amorphen Calciumphosphats (ACP) mit einem Promotor, der unter den sauren Calciumphosphaten ausgewählt ist, in der Gegenwart einer begrenzten Menge einer wässrigen Lösung, wodurch ein hydratisierter Precursor mit der Konsistenz einer Paste oder eines Kitts gebildet wird.
Träger für die Abgabe eines biologisch wirksamen Stoffes, der enthält: (A) einen biologisch wirksamen Stoff, der ausgewählt ist unter: Polypeptiden, Polynucleotiden, Nucleoproteinen, Polysacchariden, Glycoproteinen, Anti-AIDS-Wirkstoffen, Cytostatika, Antiseptika, ACE-Hemmern, Antigenen, adrenergen Antagonisten, Antacida, Immunsuppressiva oder Immunmodulatoren, antiviralen Substanzen, Enzyminhibitoren, Neurotoxinen, Opioiden, Hypnotika, Antihistaminika, Gleitmitteln, Tranquilizern, Anticonvulsiva, Muskelrelaxantien, Anti-Parkinson-Wirkstoffen, Antispasmotika, muskelkontrahierenden Substanzen, Antidiarrhoika, Antiemetika, Laxativa, Diuretika, Miotika, Anticholinergika, Wirkstoffen gegen Glaucome, antiparasitären Verbindungen, antiprotozoalen Verbindungen, Antihypertensiva, Analgetika, Antipyretika, entzündungshemmenden Wirkstoffen, Antitussiva, Antivertiginosa, Wirkstoffen zur Behandlung von Schwindelanfällen, Arzneimitteln gegen Reisekrankheit, Lokalanästhetika, Ophthalmika, Prostaglandinen, Antidepressiva, Antipsychotika, Imaging Agents, speziellen Targeting Agents, trophen Faktoren, Wachstumsfaktoren, Neurotransmittern, Modifikatoren der Zellantwort und Impfstoffen, und (B) ein gehärtetes synthetisches wenigkristallines apatitisches (poorly crystalline apatitic, PCA) Calciumphosphat, das nach einem Verfahren erhältlich ist, das umfasst: Inkontaktbringen eines amorphen Calciumphosphats (ACP) mit einem Promotor, der unter den sauren Calciumphosphaten ausgewählt ist, in der Gegenwart einer begrenzten Menge einer wässrigen Lösung, wodurch ein hydratisierter Precur sor mit der Konsistenz einer Paste oder eines Kitts gebildet wird, und Aushärtenlassen des hydratisierten Precursors.
Träger nach Anspruch 2, wobei das PCA Calciumphosphat aus einem hydratisierten Precursor gebildet wird, der bei 22°C nach einer Zeitdauer von mehr als einer Stunde oder bei 37°C nach einer Zeitdauer von kleiner einer Stunde und vorzugsweise im Bereich von 10 bis 30 Minuten gehärtet wurde.
Träger nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei der saure Calciumphosphat-Promotor so ausgewählt ist, dass in Kombination mit dem ACP ein PCA Calciumphosphat mit einem Ca/P-Verhältnis im Bereich von etwa 1,1 bis 1,9 gebildet wird.
Träger nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei der saure Calciumphosphat-Promotor unter Dicalciumphosphat-Dihydrat, Calciummetaphosphat, Heptacalciumdecaphosphat, wenigkristallinem apatitischen Calciumphosphat, Calciumpyrophosphat, Octacalciumphosphat und Tricalciumphosphaten ausgewählt ist.
Träger nach einem der Ansprüche 1 bis 5, der ein ergänzendes Material enthält, das so gewählt ist, dass ein physikalischer Parameter des Trägers verändert wird, wobei der physikalische Parameter unter Festigkeit, Resorptionszeit, Haftung, Injizierbarkeit, Reibungseigenschaften und Abgabekinetik ausgewählt ist.
Träger nach Anspruch 4, wobei das PCA Calciumphosphat ein Ca/P-Verhältnis unter 1,5 aufweist.
Verfahren zur Herstellung eines Trägers für die Abgabe einer biologisch wirksamen Substanz, das die folgenden Schritte umfasst: – Mischen eines amorphen Calciumphosphats (ACP) mit einer wässrigen Lösung in beliebiger Reihenfolge, Zugabe einer biologisch wirksamen Substanz, die ausgewählt ist unter: Polypeptiden, Polynucleotiden, Nucleoproteinen, Polysacchariden, Glycoproteinen, Anti-AIDS-Wirkstoffen, Cytostatika, Antiseptika, ACE-Hemmern, Antigenen, adrenergen Antagonisten, Antacida, Immunsuppressiva oder Immunmodulatoren, antiviralen Substanzen, Enzyminhibitoren, Neurotoxinen, Opioiden, Hypnotika, Antihistaminika, Gleitmitteln, Tranquilizern, Anticonvulsiva, Muskelrelaxantien, Anti-Parkinson-Wirkstoffen, Antispasmotika, muskelkontrahierenden Substanzen, Antidiarrhoika, Antiemetika, Laxativa, Diuretika, Miotika, Anticholinergika, Wirkstoffen gegen Glaucome, antiparasitären Verbindungen, antiprotozoalen Verbindungen, Antihypertensiva, Analgetika, Antipyretika, entzündungshemmenden Wirkstoffen, Antitussiva, Wirkstoffen zur Behandlung von Schwindelanfällen, Antivertiginosa, Arzneimitteln gegen Reisekrankheit, Lokalanästhetika, Ophthalmika, Prostaglandinen, Antidepressiva, Antipsychotika, Imaging Agents, speziellen Targeting Agents, trophen Faktoren, Wachstumsfaktoren, Neurotransmittern, Modifikatoren der Zellantwort und Impfstoffen ausgewählt ist, und Inkontaktbringen des reaktiven ACP mit einem Promotor, der unter den sauren Calciumphosphaten ausgewählt ist, vor, während oder nach den Schritten des Mischens und der Zugabe, sodass ein hydratisierter Precursor mit der Konsistenz einer Paste oder eines Kitts gebildet wird.
Verfahren zur Herstellung eines Trägers für die Abgabe eines biologisch wirksamen Stoffes, das die folgenden Schritte umfasst: – Mischen eines amorphen Calciumphosphats (ACP) mit einer wässrigen Lösung in einer beliebigen Reihenfolge, Zugabe einer biologisch wirksamen Substanz, die ausgewählt ist unter: Polypeptiden, Polynucleotiden, Nucleoproteinen, Polysacchariden, Glycoproteinen, Anti-AIDS-Wirkstoffen, Cytostatika, Antiseptika, ACE-Hemmern, Antigenen, adrenergen Antagonisten, Antacida, Immunsuppressiva oder Immunmodulatoren, antiviralen Substanzen, Enzyminhibitoren, Neurotoxinen, Opioiden, Hypnotika, Antihistaminika, Gleitmitteln, Tranquilizern, Anticonvulsiva, Muskelrelaxantien, Anti-Parkinson-Wirkstoffen, Antispasmotika, muskelkontrahierenden Substanzen, Antidiarrhoika, Antiemetika, Laxativa, Diuretika, Miotika, Anticholinergika, Wirkstoffen gegen Glaucome, antiparasitären Verbindungen, antiprotozoalen Verbindungen, Antihypertensiva, Analgetika, Antipyretika, entzündungshemmenden Wirkstoffen, Antitussiva, Wirkstoffen zur Behandlung von Schwindelanfällen, Antivertiginosa, Arzneimitteln gegen Reisekrankheit, Lokalanästhetika, Ophthalmika, Prostaglandinen, Antidepressiva, Antipsychotika, Imaging Agents, speziellen Targeting Agents, trophen Faktoren, Wachstumsfaktoren, Neurotransmittern, Modifikatoren der Zellantwort und Impfstoffen ausgewählt ist, und Inkontaktbringen des reaktiven ACP mit einem Promotor, der unter den sauren Calciumphosphaten ausgewählt ist, vor, während oder nach den Schritten des Mischens und der Zugabe, sodass ein hydratisierter Precursor gebildet wird, und – Härtenlassen des Gemisches, wodurch ein synthetisches wenigkristallines apatitisches (poorly crystalline apatitic, PCA) Calciumphosphat gebildet wird.
Verfahren zur Herstellung eines Trägers für die Abgabe einer biologisch wirksamen Stoffes, das die folgenden Schritte aufweist: – Mischen eines amorphen Calciumphosphats (ACP) mit einer wässrigen Lösung in einer beliebigen Reihenfolge, und Inkontaktbringen des ACP mit einem Promotor, der unter den sauren Calciumphosphaten ausgewählt ist, vor, während oder nach den Schritten des Mischens und der Zugabe, sodass ein hydratisierter Precursor mit der Konsistenz einer Paste oder eines Kitts gebildet wird, – Härtenlassen des Gemisches, wodurch ein synthetisches, wenigkristallines apatitisches (poorly crystalline apatitic, PCA) Calciumphosphat gebildet wird, und – Zugabe der biologisch wirksamen Substanz, die ausgewählt ist unter: Polypeptiden, Polynucleotiden, Nucleoproteinen, Polysacchariden, Glycoproteinen, Anti-AIDS-Wirkstoffen, Cytostatika, Antiseptika, ACE-Hemmern, Antigenen, adrenergen Antagonisten, Antacida, Immunsuppressiva oder Immunmodulatoren, antiviralen Substanzen, Enzyminhibitoren, Neurotoxinen, Opioiden, Hypnotika, Antihistaminika, Gleitmitteln, Tranquilizern, Anticonvulsiva, Muskelrelaxantien, Anti-Parkinson-Wirkstoffen, Antispasmotika, muskelkontrahierenden Substanzen, Antidiarrhoika, Antiemetika, Laxativa, Diuretika, Miotika, Anticholinergika, Wirkstoffen gegen Glaucome, antiparasitären Verbindungen, antiprotozoalen Verbindungen, Antihypertensiva, Analgetika, Antipyretika, entzündungshemmenden Wirkstoffen, Antitussiva, Wirkstoffen zur Behandlung von Schwindelanfällen, Antivertiginosa, Arzneimitteln gegen Reisekrankheit, Lokalanästhetika, Ophthalmika, Prostaglandinen, Antidepressiva, Antipsychotika, Imaging Agents, speziellen Targeting Agents, trophen Faktoren, Wachstumsfaktoren, Neurotransmittern, Modifikatoren der Zellantwort und Impfstoffen.
Verfahren nach einem der Ansprüche 8 bis 10, wobei der saure Calciumphosphat-Promotor so ausgewählt ist, dass in Kombination mit dem ACP ein PCA-Calciumphosphat mit einem Ca/P-Verhältnis im Bereich von etwa 1,1 bis 1,9 gebildet wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 8 bist 11, wobei der saure Calciumphosphat-Promotor ausgewählt ist unter Dicalciumphosphat-Dihydrat, Calciummetaphosphat, Heptacalciumdecaphosphat, wenigkristallinem apatitischen Calciumphosphat, Calciumpyrophosphat, Octacalciumphosphat und Tricalciumphosphaten.
Verfahren nach einem der Ansprüche 8 bis 12, wobei die wässrige Lösung eine Pufflösung ist, die auf der Basis ihrer Kompatibilität mit der biologisch wirksamen Substanz ausgewählt wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 9 bis 13, wobei die Härtung von einer endothermen Reaktion begleitet ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 9 bis 14, das ferner einen Schritt umfasst, in dem das PCA Calciumphosphat in die vorgegebene Form gebracht wird.
Verfahren nach Anspruch 11, wobei das PCA Calciumphosphat ein Ca/P-Verhältnis kleiner 1,5 aufweist.