DE69813850T2

DE69813850T2 - Homogene nachweisverfahren zur bestimmung der phosphorylierungsaktivitäten von biologischem material

Info

Publication number: DE69813850T2
Application number: DE69813850T
Authority: DE
Inventors: Gerard Mathis; Eric Trinquet; Marc Preaudat
Original assignee: CIS Bio International SA
Current assignee: CIS Bio International SA
Priority date: 1997-09-19
Filing date: 1998-09-16
Publication date: 2004-04-01
Anticipated expiration: 2018-09-17
Also published as: JP4312953B2; EP1018009B1; DE69813850D1; EP1018009A1; FR2768817B1; JP2001517796A; FR2768817A1; ES2198744T3; ATE238551T1; US6753156B1; WO1999015896A1

Description

Die Erfindung betrifft ein neues homogenes Verfahren zum Nachweisen und/oder Bestimmen der Phosphorylierungsaktivität (oder Phosphorylationsaktivität) eines biologischen Materials in bezug auf ein Substrat, das Tyrosin und/oder Serin und/oder Threonin enthält, sowie ein Kit zur Durchführung dieses Verfahrens.
Die Phosphorylierung von biologischen Molekülen, wie Peptiden oder Proteinen, durch Kinasen stellt einen wesentlichen biologischen Mechanismus bei der Regulation des Zellenmetabolismus dar.
Die meisten Enzyme mit Phosphorylierungsaktivität weisen einen sehr hohen Km-Wert (Michaeliskonstante; im allgemeinen zwischen 10^–3 und 10^–5 M) und einen sehr niedrigen Umsatzgrad (5% bis 0,001 der aktiven Stellen des Substrats sind phosphoryliert) auf.
Unter diesen Bedingungen ist der Nachweis der Phosphorylierung eines Substrats nur dann möglich, wenn diese aktiven Stellen während der Reaktion in starkem Überschuß vorliegen. Dieser starke Überschuß an aktiven Stellen läßt sich entweder dadurch erzielen, daß man erhöhte Substratkonzentrationen verwendet (wenn dieses wenige aktive Stellen aufweist) oder dadurch, daß man ein Substrat mit zahlreichen Phosphorylierungsstellen verwendet.
Bis jetzt wurden die Phosphorylierungsmechanismen allgemein mit heterogenen radioaktiven oder enzymatischen Nachweisverfahren untersucht.
Bei dieser Art von Methode wird die Phosphorylierung des an einer Festphase fixierten Substrats entweder anhand des Einbaus von 32 p in das Enzymsubstrat oder mittels eines gegen die Phosphorylierungsstelle gerichteten markierten Antikörpers (Isotopenmarker, Enzymmarker oder Fluoreszenzmarker) nachgewiesen.
Bei dieser Art von Versuch kann das Substrat in großer Menge an die feste Phase gebunden werden, und es läßt sich daher auch dann eine Phosphorylierung nachweisen, wenn das Substrat nur wenige aktive Stellen aufweist, es bestehen jedoch trotzdem bedeutende Nachteile, nämlich:

– häufige Verwendung von Isotopenmarkern,
– zwischen den verschiedenen Versuchsstadien muß ein Trennverfahren zum Entfernen der im Überschuß vorliegenden Reaktanten durchgeführt werden, und
– der Vorgang des „Einfangens" des Substrats (zum Beispiel dann, wenn man eine avidinhaltige Platte mit einem Biotinsubstrat verwendet) muß beherrscht werden.

Bei einer homogenen Methode ist häufig eine erhöhte Substratkonzentration erforderlich, um eine genügend große Menge an phosphoryliertem Substrat, das nachgewiesen wird, bereitzustellen. Es wird daher schwierig, das gesamte Substrat einzufangen, da hierfür eine große Menge an Reaktant erforderlich wäre, was sich, wenn der Reaktant floureszierend ist, insofern nachteilig auswirkt, als ein verstärktes spezifisches Hintergrundrauschen erzeugt wird.
Es wurde nun gefunden, daß es möglich ist, die Phosphorylierung eines Substrats mit Hilfe eines homogenen Verfahrens nachzuweisen, bei dem ein lumineszierendes Trägermolekül verwendet wird, an das verschiedene Substrate kovalent gebunden sind. Nach der Enzymreaktion der Phosphorylierung wird die Menge an phosphoryliertem Substrat durch die Stärke des durch das lumineszierende Trägermolekül emittierten Signals, das durch die Übertragung von Energie eines spezifischen Rezeptors des markierten phosphorylierten Substrats durch ein lumineszierendes Molekül erzeugt wird, angezeigt.
Dieses Verfahren eignet sich insbesondere zur Bestimmung der Phosphorylierung von biologisch interessanten Molekülen wie zum Beispiel Peptiden, Polypeptiden, Proteinen oder Nukleotiden in natürlichen oder pathologischen Vorgängen oder bei Syntheseverfahren wie zum Beispiel der Synthese von Nukleinsäuren oder Proteinen.
In einem ersten Aspekt betrifft die Erfindung daher ein homogenes Verfahren zum Nachweisen und/oder Bestimmen der Phosphorylierungsaktivität eines biologischen Materials in bezug auf ein Substrat, das Tyrosin und/oder Serin und/oder Threonin enthält, dadurch gekennzeichnet, daß man das biologische Material mit mehreren Peptiden oder Polypeptiden, die Tyrosin und/oder Serin und/oder Threonin enthalten, die gleich oder verschieden sind und die kovalent an ein Trägermolekül gebunden sind, in Gegenwart einer nicht radioaktiv markierten Phosphatquelle und von spezifischen Rezeptoren dieser phosphorylierten Peptide oder Polypeptide in Kontakt bringt sowie dadurch, daß man die Phosphorylierungsaktivität dadurch nachweist und/oder bestimmt, daß man ein Emissionssignal mißt, wobei dieses Emissionssignal von einer Wechselwirkung zwischen dem aus einem lumineszierenden Molekül oder einem nicht lumineszierenden Molekül, das an mindestens einen Lumineszenzmarker oder einen Emissionssignalmodulator gebunden ist, bestehenden Trägermolekül und den am mindestens einen Lumineszenzmarker oder einen Emissionssignalmodulator gebundenen spezifischen Rezeptoren herrührt.
Unter „Lumineszenzmarker" versteht man ein lumineszierendes Molekül, das zum Nachweis der Wechselwirkung zwischen dem Trägermolekül und dem spezifischen Rezeptor verwendet wird.
Unter „Emissionssignalmodulator" versteht man ein Molekül das, wenn es in der Nähe eines lumineszierenden Moleküls präsentiert wird, die Eigenschaften des Emissionssignals dieses Moleküls modifiziert.
Je nach den entsprechenden als Trägermolekül und spezifischen Rezeptor verwendeten Molekülen und je nach dem Mechanismus ihrer Wechselwirkung kann ein und die gleiche lumineszierende Verbindung die Rolle des Lumineszenzmarkers oder des Emissionssignalmodulators spielen.
Dieser Modulator kann ein lumineszierendes Molekül, zum Beispiel ein lumineszierendes Donator- oder Akzeptormolekül, oder ein nicht lumineszierendes Molekül, zum Beispiel ein Atom mit einer höheren Atomnummer oder ein Molekül, das solch ein Atom enthält, wie dies zum Beispiel in der Anmeldung EP 0 232 348 beschrieben ist, oder auch Spin-Markerverbindungen sein.
Das Trägermolekül kann folgendes sein:

– entweder ein lumineszierendes Molekül mit einem höheren Molekulargewicht in einer Größenordnung von mehreren zig Kilodaltons, wie zum Beispiel. ein fluoreszierendes Molekül wie Allophycocyanin oder Phycocyanin C;
– oder ein nicht lumineszierendes Molekül wie zum Beispiel Thyroglobulin, das an mindestens einen Lumineszenzmarker oder an mindestens einen Emissionssignalmodulator gebunden ist;
– oder ein dispergierter lumineszierender Feststoff mit solch einer Oberfläche, daß mehrere Substratpeptide oder -polypeptide gebunden werden können;
– oder ein nicht lumineszierender dispergierter Feststoff mit solch einer Oberfläche, daß mehrere Substratpeptide oder -polypeptide gebunden werden können, der an mindestens einen Lumineszenzmarker oder mindestens einen Emissionssignalmodulator gebunden ist.

Das Trägermolekül kann daher entweder ein lumineszierendes Akzeptormolekül oder ein nicht lumineszierendes Molekül, das an mindestens einen Lumineszenzmarker oder mindestens einen Emissionssignalmodulator-gebunden ist, sein.
In der folgenden Beschreibung werden die Ausdrücke „Molekül" oder „Verbindung" gleichwertig zur Bezeichnung der Lumineszenzmarker oder Modulatoren, die an das Trägermolekül oder den spezifischen Rezeptor gebunden sind, verwendet.
In einem vorteilhaften Aspekt ist das Trägermolekül entweder ein fluoreszierendes Akzeptormolekül, ein fluoreszierendes Donatormolekül oder ein nicht fluoreszierendes Molekül, das an mindestens eine fluoreszierende Akzeptorverbindung oder an mindestens eine fluoreszierende Donatorverbindung gebunden ist.
Vorteilhafterweise kann der Lumineszenzmarker oder Emissionssignalmodulator, der an jeden der spezifischen Rezeptoren des phosphorylierten Peptids oder Polypeptids bzw. der phosphorylierten Peptide oder Polypeptide gebunden ist, ein fluoreszierendes Donatoroder Akzeptormolekül sein.
In einem bevorzugten Aspekt wird der Nachweis und/oder die Bestimmung der Phosphorylierungsaktivität dadurch durchgeführt, daß man das Emissionssignal, das sich durch den nichtstrahlenden Energietransfer zwischen dem Trägermolekül und den Lumineszenzmarkern oder den Emissionssignalmodulatoren, die an die spezifischen Rezeptoren der phosphorylierten Peptide oder Polypeptide gebunden sind, ergibt, mißt.
Das Emissionslichtsignal, das den Nachweis und/oder die Bestimmung der gesuchten Phosphorylierungsaktivität gestattet, kann also entweder durch einen nichtstrahlenden Energietransfer von den Lumineszenzmarkern oder Emissionssignalmodulatoren, die an die spezifischen Rezeptoren gebunden sind, an das Trägermolekül oder umgekehrt durch nichtstrahlenden Energietransfer von den Lumineszenzmarkern oder Emissionssignalmodulatoren des Trägermoleküls an die Lumineszenzmarker, die an die spezifischen Rezeptoren gebunden sind, erzeugt werden.
Unter „Energietransfer zwischen dem Trägermolekül und den Lumineszenzmarkermolekülen oder Emissionssignalmodulatoren, die an die spezifischen Rezeptoren der phosphorylierten Peptide oder Polypeptide gebunden sind" versteht man daher die oben genannten zwei Arten von Mechanismus.
Der nichtstrahlende Energietransfer, dessen Prinzip insbesondere bei G. Mathis et al., Clin. Chem., 1993, 39, 1953–1959, beschrieben wird, findet also dann statt, wenn die folgenden Bedingungen erfüllt sind:

– einerseits, wenn die Akzeptorverbindung ein Absorptionsspektrum aufweist, das mindestens teilweise mit dem Emissionsspektrum des Donators überlappt und in dieser Überlappungszone eine erhöhte molare Extinktion besitzt, und ein Emissionsspektrum in einem Wellenlängenbereich, wo der Donator eine intrinsisch schwache Emission aufweist;
– andererseits, wenn der Akzeptor and der Donator nahe beieinander liegen.

Die Menge der kovalent an das lumineszierende Trägermolekül gebundenen Peptide oder Polypeptide kann ungefähr 2 bis 1000 pro lumineszierendes Trägermolekül betragen.
Die spezifischen Rezeptoren der phosphorylierten Peptide oder Polypeptide können zum Beispiel aus der Gruppe der monoklonalen oder polyklonalen Antikörper stammen.
In einem bevorzugten Aspekt ist die lumineszierende Verbindung, die an den spezifischen Rezeptor des phosphorylierten Peptids oder Polypeptids bzw. der phosphorylierten Peptide oder Polypeptide oder an das Trägermolekül – als Lumineszenzmarker oder Emissionssignalmodulator entsprechend dem Wechselwirkungsmechanismus zwischen dem Trägermolekül und dem spezifischen Rezeptor gebunden ist, ein Chelat, ein Kryptat oder ein makrozyklischer Komplex eines Seltene-Erde-Ions.
Im folgenden Text der Beschreibung sind die Ausdrücke „Chelat" und „Kryptat" sowie die Nomenklatur der verwendbaren Makrozyklen und Polyzyklen wie bei J. M. Lehn in Struct. Bonding (Berlin), 16, 1 1973 und in Acc. Chem. Res. 11, 49 (1979) definiert.
Die fluoreszierende Donatorverbindung ist vorzugsweise ein Seltene-Erde-Kryptat, vorzugsweise aus der Gruppe der Terbium-, Europium-, Samarium-, Dysprosium- oder Neodymiumkryptate.
In einem bevorzugten Aspekt besteht das Seltene-Erde-Kryptat aus mindestens einem durch eine makropolyzyklische Verbindung der Formel
in der Z ein Atom mit 3 oder 4 Valenzen bedeutet, R Null oder Wasserstoff, die Hydroxygruppe, eine Aminogruppe oder einen Kohlenwasserstoffrest bedeutet, die zweiwertigen Reste ®, ® und © unabhängig voneinander Kohlenhydratketten, die gegebenenfalls ein oder mehrere Heteroatome enthalten und die gegebenenfalls durch einen Heteromakrozyklus unterbrochen sind, bedeuten, wobei mindestens einer der
enthält oder im wesentlichen aus einem Molekülmotiv besteht, das über eine Triplett-Energie verfügt, die die Triplett-Energie des Emissionsniveaus des komplexierten Seltene-Erde-Ions übertrifft, komplexierten Seltene-Erde-Salz.
Vorzugsweise handelt es sich um ein Kryptat der Formel (I) oben, in dem das Molekülmotif aus der Gruppe Phenanthrolin, Anthracen, Benzol, Naphthalin, Bi- und Terphenyl, Azobenzol, Azopyridin, Pyridin, Bipyridine, Bischinoleine und den Verbindungen der folgenden Formeln: -C₂H₄-X₁-C₆H₄-X₂-C₂H₄- -C2H4-X1-CH2-C6H4-CH2-X2-C2H4-, stammt, wobei X₁ und X₂ gleich oder verschieden sein können und Sauerstoff, Stickstoff oder Schwefel bedeuten,
wobei X Sauerstoff oder Wasserstoff bedeutet.
In einem vorteilhaften Aspekt ist die fluoreszierende Verbindung ein Seltene-Erde-Kryptat, das aus dem mit einer der im folgenden genannten makrocyclischen Verbindungen komplexierten Terbium- oder Europiumion besteht:
(22)Phenanthrolin, (22)Phenanthrolinamid, (22)Anthracen, (22)Anthracenamid, (22)Bi-isochinolin, (22)Biphenyl-bis-pyridin, (22)Bipyridin, (22)Bipyridinamid, die Makropolyzyklen Tris-bipyridin, Trisphenanthrolin, Phenanthrolin-bis-bi Bipyridin, isochinolin-bis-bipyridin, Bisbipyridindiphenylbipyridin.
Eine besonders vorteilhafte fluoreszierende Verbindung ist das Europiumkryptat Eu-tris-bipyridin.
Solche Verbindungen sind zum Beispiel in dem Patent EP 180 492 beschrieben.
Makrozyklische Verbindungen, die Seltene-Erde-Ionen komplexieren und in denen das Molekülmotiv aus der Gruppe Bipyrazine, Bipyrimidine und N-oxidgruppenhaltige Stickstoffheterozyklen stammt, können ebenfalls verwendet werden.
Makrozyklische Verbindungen mit Bipyrazineinheiten sind bei F. Bodar-Houillon et al., New J. Chem., 1996, 20, 1041–1045 beschrieben.
Makrozyklische Verbindungen mit Bipyrimidineinheiten sind bei J. M. Lehn et al., Helv. Chim. Acta, 1992, 75, 1221 beschrieben.
Makrozyklische Verbindungen, die N-oxidgruppenhaltige Stickstoffheterozyklen enthalten, sind bei J. M. Lehn et al., Helv. Chim. Acta, 1991, 74, 572 sowie in dem Patent EP 0 601 113 beschrieben.
Das als fluoreszierende Donatorverbindung verwendete Seltene-Erde-Kryptat kann auch aus mindestens einem durch eine makropolyzyklische Verbindung einer der folgenden Formeln II oder III
– Y eine Spacer-Gruppe bzw. einen Spacer-Arm bedeutet, der bzw. die aus einem zweiwertigen organischen Rest aus der Gruppe der geradkettigen oder verzweigten C₁- bis C₂₀-Alkylene, die gegebenenfalls eine oder mehrere Doppelbindungen oder Dreifachbindungen enthalten und/oder gegebenenfalls durch ein oder mehrere Heteroatome wie Sauerstoff, Stickstoff, Schwefel oder Phosphor unterbrochen sind, der C₅- bis C₈-Cycloalkylengruppen oder der C₆- bis C₁₄-Arylengruppen besteht, wobei die Alkylen-, Cycloalkylen- oder Arylengruppen gegebenenfalls durch Alkyl-, Aryl- oder Sulfonatgruppen substituiert sind,
- Z eine funktionelle Gruppe, die zu einer kovalenten Bindung mit einem biologischen Stoff fähig ist, bedeutet,
- R eine Methylgruppe oder die Gruppe -Y-Z darstellt,
- R' Wasserstoff oder eine Gruppe -COOR'' bedeutet, in der R'' eine C₁- bis C₁₀-Alkylgruppe, vorzugsweise die Methyl-, Ethyl- oder tert.-Butylgruppe, bedeutet, oder R' eine Gruppe -CO-NH-Y-Z bedeutet, komplexierten Seltene-Erde-Salz bestehen.
Solche Verbindungen sind zum Beispiel in dem Patent EP 321 353 beschrieben.
Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren kann die fluoreszierende Verbindung an den spezifischen Rezeptor oder an das Trägermolekül direkt oder mittels eines Spacer-Arms gebunden sein.
Dieser Spacer-Arm besteht zum Beispiel aus einem zweiwertigen organischen Rest aus der Gruppe der geradkettigen oder verzweigten C₁- bis C₂₀-Alkylene, die gegebenenfalls eine oder mehrere Doppelbindungen enthalten und/oder gegebenenfalls durch ein oder mehrere Heteroatome wie Sauerstoff, Stickstoff, Schwefel oder Phosphor unterbrochen sind, der Carbamoyl- und Carboxamidogruppen, der C₅- bis C₈-Cycloalkylengruppen oder der C6- bis C₁₄-Arylengruppen, wobei die Alkylen-, Cycloalkylen- oder Arylengruppen gegebenenfalls durch Alkyl-, Aryl- oder Sulfonatgruppen substituiert sind.
In einem bevorzugten Aspekt verwendet man als fluoreszierende Donatorverbindung, die an den spezifischen Rezeptor gebunden ist, ein Europiumkryptat und als Trägermolekül bzw. als fluoreszierende Akzeptorverbindung, die an das Trägermolekül gebunden ist, Allophycocyanin, Allophycocyanin B, ein chemisch modifiziertes Allophycocyaninderivat, Phycocyanin C, Phycocyanin R sowie die Cyanine.
In einem weiteren vorteilhaften Aspekt verwendet man als fluoreszierende Donatorverbindung, die an den spezifischen Rezeptor gebunden ist, ein Terbiumkryptat und als Trägermolekül bzw. als fluoreszierende Akzeptorverbindung, die an das Trägermolekül gebunden ist, die Rhodamine, Thionin, Phycocyanin R, Phycoerythrocyanin, Phycoerythrin C, Phycoerythrin B, Phycoerythrin R-sowie die Cyanine.
Fluoreszierende Verbindungen, die ebenfalls als Akzeptorverbindungen verwendet werden können, sind die in der Anmeldung WO96/42016 beschriebenen Phycobiliprotein-Peptid-Bindungskomplexe.
Gemäß einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung auch ein Kit zum Nachweisen und/oder Bestimmen der Phosphorylierungsaktivität eines biologischen Materials in bezug auf ein Substrat, das Tyrosin und/oder Serin und/oder Threonin enthält, dadurch gekennzeichnet, daß es mindestens ein Trägermolekül, wobei an dieses Trägermolekül mehrere Peptide oder Polypeptide, die Tyrosin und/oder Serin und/oder Threonin enthalten und gleich oder verschieden sind, kovalent gebunden sind, sowie mindestens einen spezifischen Rezeptor für diese phosphorylierten Peptide oder Polypeptide enthält, wobei der Rezeptor an mindestens einen Lumineszenzmarker oder Emissionssignalmodulator gebunden ist.
Das Trägermolekül ist wie oben definiert, das heißt, daß es intrinsisch oder durch Bindung an mindestens einen Lumineszensmarker oder einen Emissionssignalmodulator lumineszieren kann.
Vorteilhafterweise handelt es sich bei dem Trägermolekül und dem Lumineszenzmarker oder Emissionssignalmodulator, der an den spezifischen Rezeptor dieses Kits gebunden ist, um fluoreszierende Verbindungen.
In einem bevorzugten Aspekt handelt es sich bei der lumineszierenden Verbindung (Lumineszenzmarker oder Emissionssignalmodulator), die an den spezifischen Rezeptor gebunden ist, und bei dem Trägermolekül jeweils um fluoreszierende Donator- und Akzeptorverbindungen.
In dem erfindungsgemäßen Kit kann es sich bei der lumineszierenden Verbindung, die an den spezifischen Rezeptor gebunden ist, um das Europiumkryptat Eutrisbipyridin oder das Terbiumkryptat Tb-trisbipyridin handeln.
Vorteilhafterweise enthält das erfindungsgemäße Kit auch ein entsprechendes Puffermedium, eine nicht radioaktiv markierte Phosphatquelle sowie eine Gebrauchsanweisung für die Durchführung des oben beschriebenen Verfahrens zum Nachweisen und/oder Bestimmen der Phosphorylierungsaktivität eines biologischen Materials.
Die Erfindung wird durch das folgende Beispiel erläutert.
Beispiel 1: Nachweis der Phosphorylierung des Peptids SRC
Bei dem Peptid SRC handelt es sich um ein Substrat der Tyrosinkinase des Rezeptors des Epidermis-Wachstumsfaktors, auch EGF genannt („Epidermal Growth Factor"). Es handelt sich dabei um ein Peptid aus 11 Aminosäuren, das ein einziges Tyrosinmotif enthält und die folgende Struktur aufweist: [H]-Leu-lle-Glu-Asp-Ala-Glu-Tyr-Ala-Ala-Gly-[OH]
Die im folgenden verwendeten Abkürzungen bedeuten:
DTT = Dithiotreitrol
EuTBP = Europiumkryptat Eu-trisbipyridindiamin
BSA = Rinderserumalbumin
IgG = Immunglobulin G
MHS = Maleimidohexanoyl-N-hydroxysuccinimidester
SPDP = N-Succinimidyl-3(2-pyridyldithio)propionat
Sulfo-SMCC = Sulfosuccinimidyl-4-N-maleimidomethyl)cyclohexan.
1) Konjugation des lumineszierenden Trägermoleküls mit dem Substratpeptid
Man verwendet ein chemisch modifiziertes Allophycocyaninderivat (XL₆₆₅ Cis bio international), das aufgrund seines höheren Molekulargewichts mit zahlreichen Peptiden, die jeweils eine Phosphorylierungsstelle aufweisen, markiert werden kann.
a) Aktivierung von XL₆₆₅ durch SPDP
6 mg XL₆₆₅ in einer Konzentration von 3,45 mg/ml in 100 mM Phosphatpuffer pH 7,0 wird mit einer Lösung von 80 mM SPDP in absolutem Ethanol im Verhältnis 60 mol Aktivierungsmittel pro mol XL₆₆₅ versetzt.
Nach 30-minütiger Aktivierung bei Umgebungstemperatur versetzt man mit einer Lösung von 200 mM DTT in 100 mM Phosphatpuffer pH 7,0 im Verhältnis 5 mol Reduktionsmittel pro mol Aktivierungsmittel.
Nach 15 Minuten bei Raumtemperatur werden die unerwünschten Reaktionsprodukte mittels Exklusions-Diffusionschromatographie an einer ultrafeinen G25-Gelsäule mit 100 mM Phosphatpuffer pH 6,5, 5 mM EDTA entfernt.
Das Produkt wird vor der Kopplung bei 4°C aufbewahrt.
b) Aktivierung des Peptids durch MHS
4 mg Peptid (2,6 pmol) werden mit einer 220 mM MHS-Lösung in Acetonitril im Verhältnis 4 mol Aktivierungsmittel pro mol Peptid versetzt.
Nach 30 Minuten bei Raumtemperatur werden die unerwünschten Reaktionsprodukte durch Exklusions-Diffusionschromatographie an einer Superdex 30^® Gelsäule (Pharmacia) in 100 mM Phosphatpuffer pH 7,0 entfernt.
c) Kopplung Peptid-Maleimid/XL₆₆₅-SH
Ähnlich wie oben beschrieben setzt man die Maleimid-Funktionen mit den am XL₆₆₅ fixierten Thiolfunktionen im Molverhältnis von 100 Peptid pro XL₆₆₅ um Nach 18-stundiger Inkubation bei 40°C und Blockung der Thiogruppen (die möglicherweise frei geblieben sind) mittels N-Ethylmaleimid wird das nicht gekoppelte Peptid durch Exklusions-Diffusionschromatographie an einer TSK 3000 SW-Säule (Merck) in 100 mM Phosphatpuffer pH 7,0 entfernt.
Man erhält ein Konjugat mit 20–40 Peptiden pro Molekül XL₆₆₅
2) Herstellung des Konjugats Anti-Phosphotyrosin-Antikörper/Europiumkryptat Eu-trisbipyridin
a) Aktivierung von IgG PY20 durch SPDP
5 mg IgG PY20 (Transduction Laboratories) in einer Konzentration von 10 mg/ml in 100 mM Phosphatpuffer, pH 7,0, werden durch Zugabe einer SPDP-Lösung (Pierce, USA) in einer Konzentration von 6,4 mM in Dioxan in einem molaren Verhältnis von 7,5 SPDP pro IgG PY20 aktiviert.
Nach 35-minütiger Aktivierung bei Umgebungstemperatur wird das IgG-Pyridin-2-thion an einer ultrafeinen G25-Säule mit 100 mM Phosphatpuffer, 5mM EDTA, pH 6,5, gereinigt.
Die Proteine werden konzentriert und die 2-Pyridyldisulfidgruppen werden mit einer DTT-Lösung (Sigma, USA) in einer Endkonzentration von 19 mM 15 Minuten lang bei Raumtemperatur reduziert. DTT und Pyridin-2-thion werden durch Reinigung an einer ultrafeinen G25-Säule mit 100 mM Phosphatpuffer, 5 mM EDTA, pH 6,5 entfernt. Die IgG-SH-Konzentration wird bei 280 nm als ε_280nm-Wert von 210 000 M^–1 cm^–1 bestimmt.
b) Herstellung der IgG PY20-EuTBP-Konjugate
5 mg (5·10^–6 mol) EU-TBP (Europiumkryptat Eutrisbipyridindiamin, Herstellung wie in dem Patent EP 321 353 , Beispiele 3 und 4 beschrieben) wird mit einer 25 mM Sulfo-SMCC-Lösung in 20 mM Phosphatpuffer, 10% Dimethylformamid (v/v pH 7,0) im Verhältnis von 2,5 mol Aktivierungsmittel pro mol Eu-TBP versetzt.
Nach 45-minütiger Aktivierung bei Raumtemperatur wird das Reaktionsmedium über 0,8 μm filtriert, um den gegebenenfalls gebildeten Niederschlag zu entfernen. Die unerwünschten Reaktionsprodukte (Sulfo-SMCC, N-Hydroxysuccinimid, (N-Maleimidomethyl)carbonsäure) werden durch Ionenaustauschchromatographie an einer Mono-Q-Säule (Pharmacia, Schweden) in 20 mM Phosphatpuffer, 10% (v/v) Dimethylformamid, pH 7,0, unter NaCl-Schock entfernt. Die Eu-TBP-Maleimidkonzentration wird bei 307 nm als ε₃₀₇nm,-Wert Wert von 25 000 M^–1 cm^–1 sowie dem A_307nm/A_280nm Verhältnis bestimmt .
Ähnlich wie oben beschrieben wurden die Maleimidfunktionen mit den am Antikörper gebundenen Thiolfunktionen in Molverhältnissen von 10 bis 30 Eu-TBPmaleimid pro IgG PY20-SH umgesetzt.
Nach 18-ständiger Inkubation bei 4°C und Blockierung der Thiogruppen (die möglicherweise frei geblieben sind) durch N-Ethylmaleimid wird das nicht gekoppelte Eu-TBP durch Dialyse in 100 mM Phosphatpuffer pH 7,0 bei 4°C bis zur vollständigen Abreicherung (keine Fluoreszenz mehr in den Dialyseflüssigkeiten) entfernt.
Die Charakteristiken des Konjugats werden aufgrund der Extinktion bei 307 nm und 280 nm unter Berücksichtigung der mit dem A_307nm/A₃₀₇nm-Verhältnis bestimmten Eigenextinktion des Kryptats unter Verwendung der folgenden Werte bestimmt.
Eu-TBP-Maleimid:
ε_307nm = 25 000 M^–1 cm^–1
A_307nm/A_280nm = experimentell bestimmt
IgG PY20-SH
ε_280nm = 210 000 M^–1 cm^–1
3) Phosphorylierung
A431-Zellen (Sigma), die einen EGF-Rezeptor enthalten, werden 10 Minuten bei Raumtemperatur mit EGF voraktiviert. Bei dem Phosporylierungspuffer handelt es sich um einen 60 mM TRIS/MES-Puffer, pH 7,4, der 30 μM ATP, 50 mM Mg** und 10 mM Mn** enthält.
In die „Versuchs"-Näpfchen einer 96-Well-Mikrotiterplatte gibt man der Reihe nach:

– 10 μl voraktivierte A431-Zellen,
– 10 μl XL₆₆₅-SRC-Peptid-Konjugat,
– 30 μl Phosphorylierungspuffer.

In die als Kontrolle dienenden „Blind"-Näpfchen gibt man 10 μl XL₆₆₅-Peptid-Konjugat und 40 μl Phosphorylierungspuffer. Anschließend wird 30 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubiert.
4) Visualisierung
In jedes Näpfchen der Mikroplatte gibt man der Reihe nach:

– 50 μl mit Kryptat Eu-trisbipyridin markierten Anti-Phosphotyrosin-Antikörper
– 100 μl 0,1 M Phosphatpuffer pH 7, KF 0,4 M, BSA 0,1%.

Nach 30-minütiger Inkubation bei Umgebungstemperatur wird die Fluoreszenz bei 620 nm und 665 nm mit Hilfe eines wie unten beschriebenen Prototyp-Laserfluorimeters bestimmt:
Ein pulsierter Stickstofflaser (Laser Science Inc., Modell LS1-337ND) wird als Anregungsquelle verwendet (Wellenlänge 337,1 nm). Die Impulsdauer wird mit 3 Nanosekunden angegeben und wird mit einer Frequenz von 10 Hertz wiederholt. Der Strahl durchquert ein Filter (Corning), um alles Störlicht, das eine Anregung unter oder über 337 nm aufweist, zu eliminieren.
Nach Rückkehr in die Meßkammer wird der Strahl von einem dichroitischen Filter, das in einem Winkel von 45 Grad vorliegt, das Ultraviolett reflektiert und das sichtbares Licht durchzulassen vermag, reflektiert.
Der von dem dichroitischen Filter reflektierte Strahl wird mittels einer Quarzglaslinse auf das zu messende Mikrotiterplattennäpfchen fokussiert. Die Fluoreszenzemission wird an einen Festwinkel von 20 Grad, der von der gleichen Linse kollimatiert wird, aufgefangen und durchquert direkt das dichroitische Filter (Fluoreszenz im sichtbaren Licht).
Mittels eines Interferenzfilters, dessen Eigenschaften entsprechend der Wellenlänge der zu detektierenden Fluoreszenz definiert sind, kann man Licht, das das Signal stören kann, entfernen; dessen Intensität wird anschließend mit einem Photomultiplikator bestimmt (Hamamatsu R2949).
Bei den verwendeten Photonenzählgerät handelt es sich um ein SR-400-Gerät (Stanford Research Systems), dessen Betriebsweise und Synchronisation mit dem Laser mit einem Computer des Typs IBM PC-AT über eine RS-232-Ausgabe kontrolliert werden. Die vom Photomultiplikator stammenden Impulse werden während eines Zeitfensters (t_g) registriert und nach einer Wartedauer (t_d) bestimmt, und zwar unter der Bedingung, daß sie über einem vom Photonenzähler gewählten diskriminierenden Niveau liegen, um das Signal-Hintergrund-Verhältnis des Photomultiplikators zu optimieren.
Mit einem vom IBM PC-AT gesteuerten X-Y-Tisch kann die Mikrotiterplatte schrittweise mittels Motoren in unterschiedliche Meßpositionen gebracht werden, darunter Befüllvorgänge, Vorgänge der Positionierung in den Anregungsstrahl, Vorgänge des automatischen Ablesens der 96 Näpfchen der Reihe nach sowie Austragvorgänge.
Die von dem XL₆₆₅-SRC-Peptid-Konjugat emittierte Fluoreszenz wird mit Hilfe des mit einem 665-nm-Filter mit einer in der Mitte gemessenen Weite von 10 nm ausgestatteten Prototyp-Fluorimeters 400 μs lang mit einer Wartezeit von 50 μs gemessen.
Die Ergebnisse sind auf der Kurve in 1 dargestellt, in der die x-Achse das Phorphorylierungsniveau und die y-Achse die Konzentration an XL₆₆₅-SRC-Peptid-Konjugat angibt.
Das Phorphorylierungsniveau wird durch die Variable DR = R_Probe – R_Blind ausgedrückt, wobei R das Verhältnis der Emissionssignale bei 665 nm und 620 nm bedeutet.
Die Konzentration an XL₆₆₅-SRC-Peptid-Konjugat wird in nM XL₆₆₅ ausgedrückt .
Die Ergebnisse zeigen, daß das Phosphorylierungsniveau mit der Erhöhung der Konzentration an XL₆₆₅-SRC-Peptid-Konjugat korreliert ist.

Claims

Homogenes Verfahren zum Nachweisen und/oder Bestimmen der Phosphorylierungsaktivität eines biologischen Materials in bezug auf ein Substrat, das Tyrosin und/oder Serin und/oder Threonin enthält, dadurch gekennzeichnet, daß man das biologische Material mit mehreren Peptiden oder Polypeptiden, die Tyrosin und/oder Serin und/oder Threonin enthalten, die gleich oder verschieden sind und die kovalent an ein Trägermolekül gebunden sind, in Gegenwart einer nicht radioaktiv markierten Phosphatquelle und von spezifischen Rezeptoren dieser phosphorylierten Peptide oder Polypeptide in Kontakt bringt sowie dadurch, daß man die Phosphorylierungsaktivität dadurch nachweist und/oder bestimmt, daß man ein Emissionssignal mißt, wobei dieses Emissionssignal von einer Wechselwirkung zwischen dem aus einem lumineszierenden Molekül oder einem nicht lumineszierenden Molekül, das an mindestens einen Lumineszenzmarker oder einen Emissionssignalmodulator gebunden ist, bestehenden Trägermolekül und den am mindestens einen Lumineszenzmarker oder einen Emissionssignalmodulator gebundenen spezifischen Rezeptoren herrührt.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Nachweis und/oder die Bestimmung der Phosphorylierungsaktivität dadurch durchgeführt wird, daß man das Emissionssignal, das durch den Energietransfer zwischen den Lumineszenzmarkern oder den Emissionssignalmodulatoren, die an die spezifischen Rezeptoren der phosphorylierten Peptide oder Polypeptide gebunden sind, und dem Trägermolekül entsteht, mißt.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei dem lumineszierenden Trägermolekül um ein fluoreszierendes Molekül oder ein nicht fluoreszierendes Molekül, das an mindestens einen Fluoreszenzmarker oder an mindestens einen Emissionssignalmodulator gebunden ist, handelt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei dem Lumineszenzmarker oder dem Emissionssignalmodulator, der an den spezifischen Rezeptor gebunden ist, um eine fluoreszierende Verbindung handelt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß der spezifische Rezeptor an eine fluoreszierende Donatorverbindung gebunden ist und das Trägermolekül ein fluoreszierendes Akzeptormolekül ist oder an eine fluoreszierende Akzeptorverbindung gebunden ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß der spezifische Rezeptor an eine fluoreszierende Akzeptorverbindung gebunden ist und das lumineszierende Trägermolekül ein fluoreszierendes Donatormolekül ist oder an eine fluoreszierende Donatorverbindung gebunden ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß die Menge der kovalent an das lumineszierende Trägermolekül gebundenen Peptide oder Polypeptide 2 bis 1000 beträgt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß der spezifische Rezeptor an ein Chelat, ein Kryptat oder einen makrozyklischen Komplex eines Seltene-Erde-Ions gebunden ist.
Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß der spezifische Rezeptor an ein Chelat, ein Kryptat oder einen makrozyklischen Komplex des Europiums, Terbiums, Dysprosiums, Samariums oder Neodymiums gebunden ist.
Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß der spezifische Rezeptor an ein Seltene-Erde-Kryptat gebunden ist, das aus mindestens einem durch eine makropolyzyklische Verbindung der Formel
in der Z ein Atom mit 3 oder 4 Valenzen bedeutet, R Null oder Wasserstoff, die Hydroxygruppe, eine Aminogruppe oder einen Kohlenwasserstoffrest bedeutet, die zweiwertigen Reste ©, ® und unabhängig voneinander Kohlenhydratketten, die gegebenenfalls ein oder mehrere Heteroatome enthalten und die gegebenenfalls durch einen Heteromakrozyklus unterbrochen sind, bedeuten, wobei mindestens einer der Reste ®, ® und außerdem mindestens ein Molekülmotiv enthält oder im wesentlichen aus einem Molekülmotiv besteht, das über eine Triplett-Energie verfügt, die die Triplett-Energie des Emissionsniveaus des komplexierten Seltene-Erde-Ions übertrifft, komplexierten Seltene-Erde-Salz besteht.
Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß die an den spezifischen Rezeptor gebundene fluoreszierende Verbindung ein Seltene-Erde-Kryptat ist, das aus dem mit einer der im folgenden genannten makrocyclischen Verbindungen komplexierten Terbium- oder Europiumion besteht: (22)Phenanthrolin, (22)Phenanthrolinamid, (22)Anthracen, (22)Anthracenamid, (22)Biisochinolin, (22)Biphenyl-bis-pyridin, (22)Bipyridin, (22)Bipyridinamid, die Makropolyzyklen Tris-bipyridin, Trisphenanthrolin, Phenanthrolin-bis-bipyridin, Biisochinolin-bis-bipyridin, Bis-bipyridindiphenylbipyridin.
Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei der fluoreszierenden Verbindung um das Europiumkryptat Eu-trisbipyridin handelt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 12, dadurch gekennzeichnet, daß man ein Europiumkryptat als fluoreszierende Donatorverbindung, die an den spezifischen Rezeptor gebunden ist, und Allophycocyanin, Allophycocyanin B, die chemisch modifizierten Allophycocyaninderivate, Phycocyanin C, Phycocyanin R sowie die Cyanine als Trägermolekül bzw. als fluoreszierende Akzeptorverbindung, die an das Trägermolekül gebunden ist, verwendet.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 12, dadurch gekennzeichnet, daß man ein Terbiumkryptat als fluoreszierende Donatorverbindung, die an den spezifischen Rezeptor gebunden ist, und die Rhodamine, Thionin, Phycocyanin R, Phycoerythrocyanin, Phycoerythrin C, Phycoerythrin B, Phycoerythrin R sowie die Cyanine als Trägermolekül bzw. als fluoreszierende Akzeptorverbindung, die an das Trägermolekül gebunden ist, verwendet.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 14, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei der fluoreszierenden Donatorverbindung, die an den spezifischen Rezeptor gebunden ist, um das Europiumkryptat Eu-trisbipyridin oder das Terbiumkryptat Tb-trisbipyridin handelt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 15, dadurch gekennzeichnet, daß die spezifischen Rezeptoren aus der Gruppe der polyklonalen und monoklonalen Antikörper stammen.
Kit zum Nachweisen und/oder Bestimmen der Phosphorylierungsaktivität eines biologischen Materials in bezug auf ein Substrat, das Tyrosin und/oder Serin und/oder Threonin enthält, dadurch gekennzeichnet, daß es mindestens ein aus einem lumineszierenden Molekül oder einem nicht lumineszierenden Molekül, das an mindestens einen Lumineszenzmarker oder einen Emissionssignalmodulator gebunden ist, bestehendes Trägermolekül, wobei an dieses Trägermolekül mehrere Peptide oder Polypeptide, die Tyrosin und/oder Serin und/oder Threonin enthalten und gleich oder verschieden sind, kovalent gebunden sind, sowie mindestens einen spezifischen Rezeptor für diese phosphorylierten Peptide oder Polypeptide enthält, wobei der Rezeptor an mindestens einen Macker oder Emissionssignalmodulator gebunden ist.
Kit nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei dem Trägermolekül und dem lumineszierenden Molekül als Macker für den spezifischen Rezeptor um fluoreszierende Moleküle handelt.
Kit nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei dem Lumineszenzmarker oder dem Emissionssignalmodulator, der an den spezifischen Rezeptor gebunden ist, und dem Trägermolekül um fluoreszierende Donator- bzw. Akzeptormoleküle handelt.
Kit nach einem der Ansprüche 17 bis 19, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei der lumineszierenden Verbindung, die an den spezifischen Rezeptor gebunden ist, um das Europiumkryptat Eutrisbipyridin oder das Terbiumkryptat Tbtrisbipyridin handelt.
Kit nach einem der Ansprüche 17 bis 20, dadurch gekennzeichnet, daß es auch ein entsprechendes Puffermedium, eine nicht radioaktiv markierte Phosphatquelle sowie eine Gebrauchsanweisung für die Durchführung des Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 16 enthält.