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HINTERGRUND DER ERFINDUNG
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Gebiet der Erfindung
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Die vorliegende Erfindung bezieht
sich allgemein auf das Gebiet der Mikropräparation mittels Lasereinfang
(lasen capture micrordissection – LCM). Genauer gesagt bezieht
sich die Erfindung auf invertierte Mikroskope, welche eine spezielle
Vorrichtung zur Durchführung
der LCM aufweisen. Insbesondere bezieht sich eine bevorzugte Realisierung
der Erfindung auf ein invertiertes Mikroskop, das ein Teilsystem
der Kappenhandhabung, ein Teilsystem der Beleuchtung/Laseroptik,
ein Teilsystem der Vakuum-Halterung und ein Teilsystem eines manuellen Joysticks
(Betätigungshebels)
umfaßt.
Die Erfindung bezieht sich demnach auf invertierte Mikroskope von dem
Typ, die als invertierte Mikroskope mit Mikropräparation mittels Lasereinfang
bezeichnet werden können.
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Diskussion des Standes
der Technik
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Krankheiten, wie zum Beispiel Krebs,
werden schon seit langem identifiziert durch Untersuchung von Gewebebiopsien,
zur Identifizierung ungewöhnlicher
Zellen. Ein Problem besteht jedoch darin, daß es bisher im Stand der Technik
kein zufriedenstellendes Verfahren gibt, um die interessierenden
Zellen aus dem umgebenden Gewebe zu extrahieren. Derzeit müssen die
untersuchenden Personen versuchen, interessierende Zellen manuell
zu extrahieren oder zu mikropräparieren,
entweder indem man versucht, sie mechanisch mit einem Handwerkzeug
zu isolieren oder mit Hilfe eines komplizierten Verfahrens der Isolation
und Kultivierung der Zellen. Die meisten Untersucher betrachten
beide Ansätze
als umständlich,
zeitraubend und ineffizient.
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Es ist eine neue Technik entwickelt
worden, die ein kleines Cluster von Zellen aus einer Gewebeprobe
innerhalb von Sekunden extrahieren kann. Die Technik wird Mikropräparation
mit Lasereinfang (lasen capture microdissection – LCM) genannt. Die Mikropräparation
mittels Lasereinfang ist ein einstufiges Verfahren, welches ein
standardmäßiges Labormikroskop
in Einheit mit einem Niederenergielaser und einem thermoplastischen
Film aus einem durchsichtigen Ethylen-Vinyl-Acetat-Polymer verbindet, wie es für die Kunststoff-Versiegelung
bzw. Abdichtung bei der Verpackung von Lebensmittelprodukten verwendet
wird.
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Bei der Mikropräparation mittels Lasereinfang
blickt der Präparator
durch ein Mikroskop auf den Biopsieabschnitt eines Gewebes, welcher
auf einem standard-histopathologischen Glasobjektträger fixiert
ist und welcher typischerweise Gruppen unterschiedlicher Arten von
Zellen enthält.
Ein thermoplastischer Film wird über
dem Biopsiegewebeabschnitt und im Kontakt mit diesem angeordnet.
Nach dem Identifizieren einer Gruppe interessierender Zellen innerhalb
des Gewebeschnittes zentriert der Präparator sie in einem Zielbereich
des Mikroskopfeldes und erzeugt dann einen Impuls von einem Laser,
wie zum Beispiel einem Kohlendioxidlaser, der eine Intensität von etwa
50 Milliwatt (mW) und eine Impulsdauer zwischen etwa 50 und etwa
500 Millisekunden (ms) hat. Der Laserimpuls bewirkt ein lokales
Erhitzen des Kunststoffilmes, während
er durch ihn hindurch tritt und ver leiht ihm dadurch eine Klebeeigenschaft.
Die Zellen kleben dann an dem lokal klebenden Bereich des Kunststoffbands
bzw. des Filmes unmittelbar über
ihnen, woraufhin die Zellen sofort extrahiert werden und für die Analyse
bereit sind. Wegen des kleinen Durchmessers des Laserstrahles können extrem
kleine Zellcluster mittels Mikropräparation aus einem Gewebeabschnitt
herausgeschnitten werden.
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Indem nur diese Zielzellen direkt
von der Gewebeprobe genommen werden, können Wissenschaftler sofort
die Gen- und Enzymaktivität
der Tragezellen unter Verwendung weiterer Untersuchungswerkzeuge
analysieren. Derartige Vorgänge,
wie zum Beispiel die Verstärkung
von DNA und RNA mittels Polymerase-Kettenreaktion und die Enzymgewinnung
aus der Gewebeprobe sind bereits nachgewiesen worden. Es ist über keinerlei
Einschränkungen
bzgl. der Fähigkeit,
DNA oder RNA aus Tumorzellen zu verstärken, welche mittels Mikropräparation mit
Lasereinfang extrahiert wurden, berichtet worden. Die Mikropräparation
mittels Lasereinfang hat aus allen Geweben, mit welchen sie bisher
getestet worden ist, Zellen erfolgreich extrahiert. Dies umfaßt Glomeruli
der Niere, Brustkarzinome in situ, atypische duktale Hyperplasie
der Brust, intraepitheliale Neoplasie der Prostata und Lymphfollikel.
Der direkte Zugriff auf Zellenkammern, wie er durch die Mikropräparation
mit Lasereinfang gewährt
wird, wird wahrscheinlich zu einer Revolution im Verständnis der
molekularen Basis von Krebs und anderen Krankheiten führen und
hilft dabei, die Grundlage für eine
frühere
und genauere Krankheitserfassung zu legen.
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Eine weitere wahrscheinliche Rolle
dieser Technik besteht in der Aufzeichnung der Muster von Genexpression
in verschiedenen Zelltypen, was in der medizinischen Forschung ein
aufstrebendes Gebiet ist. Beispielsweise versucht das Cancer Genorne Anatomy
Project (CGAP) des nationalen Krebsinstitutes, die Muster der Genexpression
in normalen, präcancerösen und
malignen Zellen zu definieren. In Projekten, wie zum Beispiel CGAP
ist die Mikropräparation
mittels Lasereinfang ein wertvolles Werkzeug zum Gewinnen reiner
Zellproben aus Gewebeproben.
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Die LCM-Technik wird allgemein in
dem jüngst
veröffentlichten
Artikel "Laser Capture
Microdessection, Science, Band 274, Nr. 5289, Ausgabe 8, S. 998-1001", veröffentlicht
1996, beschrieben. Der Zweck der LCM-Technik besteht darin, ein
einfaches Verfahren zur Gewinnung ausgewählter menschlicher Zellen aus
einer heterogenen Population zu gewinnen, wie sie auf einem typischen
histopathologischen Biopsie-Schnitt enthalten sind.
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Eine typische Biopsie-Gewebeprobe
besteht aus einer 5 bis 10 Mikrometer dicken Scheibe des Gewebes,
welche auf einem gläsernen
Mikroskopobjektträger
angeordnet wird, wobei Techniken verwendet werden, die auf dem Gebiet
der Pathologie wohlbekannt sind. Diese Gewebescheibe ist ein Querschnitt
des untersuchten Körperorgans.
Das Gewebe besteht aus einer Vielfalt unterschiedlicher Zelltypen. Oftmals
wünscht
ein Pathologe nur einen kleinen Teil des Gewebes für eine weitere
Analyse zu entfernen.
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Die LCM verwendet einen thermoplastischen Transferfilm,
der oben auf der Gewebeprobe angeordnet wird. Dieser Film wird mit
einem Gehalt organischer Farbstoffe herstellt, die so ausgewählt werden,
daß sie
selektiv im nahen infraroten Bereich des Spektrums absorbieren,
welcher den Emissionsbereich üblicher
AlGaAs-Laserdioden überlappt.
Wenn der Film dem fokussierten Laser strahl ausgesetzt wird, so wird
der exponierte Bereich durch den Laser erhitzt und schmilzt und
haftet in dem Bereich an dem Gewebe an, welcher (dem Laser) ausgesetzt
war. Der Film wird dann von dem Gewebe abgehoben und der ausgewählte Bereich
des Gewebes wird zusammen mit dem Film entfernt.
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Thermoplastische Transferfilme – wie zum Beispiel
ein 100 Mikrometer dicker Ethyl-Vinyl-Acetat (EVA)-Film, wie er von der Electroseal
Corporation aus Pompton Lakes, New Jersey (Typ E540) erhältlich ist – ist in
LCM-Anwendungen verwendet worden. Der Film wird so ausgewählt, daß er einen
niedrigen Schmelzpunkt von etwa 90° C hat.
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Die bei LCM-Techniken verwendeten
thermoplatischen EVA-Filme sind mit Farbstoffen dotiert worden,
wie zum Beispiel mit einem infraroten Naphtalocyanin-Farbstoff,
der von der Aldrich Chemical Company (Farbstoff-Nr. 43296-2 oder
39317-7) erhältlich
ist. Diese Farbstoffe haben eine starke Absorption in dem Bereich
von 800 nm, einem Wellenlängenbereich,
der mit Laser-Emittern überlappt,
die ausgewählt
werden, um den Film gezielt aufzuschmelzen. Der Farbstoff wird bei
erhöhter
Temperatur mit dem geschmolzenen, massiven Kunststoff gemischt.
Der gefärbte
Kunststoff wird dann unter Verwendung standardmäßiger Filmherstelltechniken
zu einem Film geformt bzw. hergestellt. Die Farbstoffkonzentration
in dem Kunststoff beträgt
etwa 0,001 M.
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Während
die in LCM-Anwendungen verwendeten Filme sich für diese Aufgabe als zufriedenstellend
erwiesen haben, so haben sie doch mehrere Nachteile. Die optische
Absorption eines farbstoffimprägnierten
Filmes ist eine Funktion seiner Dicke. Diese Eigenschaft des Filmes
kann in Konflikt mit dem Wunsch stehen, die Filmdicke aus anderen Gründen auszuwählen. Die
organischen Farbstoffe, die verwendet werden, um die Absorptionseigenschaften
der Filme zu verändern,
können
in einigen Fällen
nachteilige fotochemische Effekte haben. Dies könnte zu einer Kontamination
von LCM-Proben führen.
Zusätzlich
sind die bisher verwendeten organischen Farbstoffe auf die Wellenlänge des
einfallenden Laserlicht empfindlich und demnach muß der Film
auf den verwendeten Laser angepaßt werden.
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ZUSAMMENFASSUNG
DER ERFINDUNG
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Es besteht ein besonderer Bedarf
an einem Instrument, welches für
die Mikropräparation
mittels Lasereinfang gut geeignet ist. Es besteht auch ein besonderes
Bedürfnis
an einem verbesserten Verfahren der Mikropräparation mittels Lasereinfang.
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Dementsprechend richtet sich ein
erster Aspekt der vorliegenden Erfindung auf ein Verfahren zur Mikropräparation
mittels Lasereinfang nach Anspruch 1.
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Ein zweiter Aspekt der vorliegenden
Erfindung richtet sich auf ein Instrument zur Mikropräparation
mittels Lasereinfang gemäß Anspruch
20.
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Diese und weitere Aspekte und Aufgaben der
Erfindung versteht man besser bei Betrachtung in Verbindung mit
der folgenden Beschreibung und den zugehörigen Zeichnungen. Es versteht
sich jedoch, daß die
folgende Beschreibung, während
sie bevorzugte Ausführungsformen
der Erfin dung und zahlreiche besondere Einzelheiten derselben zeigt,
nur der Anschaulichkeit halber und nicht mit Beschränkungsabsicht
erfolgt. Viele Veränderungen
und Modifikationen können
innerhalb des Schutzumfanges der Erfindung vorgenommen werden, ohne
vom Geist derselben abzuweichen, und die Erfindung umfaßt alle
derartigen Modifikationen.
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KURZBESCHREIBUNG
DER FIGUREN
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Ein klares Konzept der Vorteile und
Merkmale, welche die vorliegende Erfindung bilden sowie der Bauteile
und der Betriebsweise von Modellsystemen, wie sie durch die vorliegende
Erfindung bereit gestellt werden, wird unter Bezug auf die beispielhaften,
und damit nicht beschränkenden,
Ausführungsformen
offensichtlich, wie sie in den Figuren dargestellt sind, die diese
Beschreibung begleiten und einen Teil derselben bilden, wobei gleiche
Bezugszahlen (wenn sie in mehr als einer Ansicht auftreten) dieselben
Elemente kennzeichnen. Konsequenterweise gibt man den Ansprüchen die
breitestmögliche
Interpretation, die mit der Beschreibung und den Figuren konsistent ist.
Es versteht sich, daß die
in den Figuren dargestellten Merkmale nicht notwendigerweise maßstabsgetreu
wiedergegeben sind.
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1 zeigt
eine perspektivische Ansicht eines invertierten Mikroskops für die Mikropräparation mittels
Lasereinfang, welches eine Ausführungsform der
Erfindung repräsentiert.
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2A-2B zeigen
Aufrisse des invertierten Mikroskops für die Mikropräparation
als Lasereinfang (LCM), welches in 1 darstellt
ist.
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3 zeigt
eine teilweise Schnittansicht eines invertierten LCM-Mikroskops,
welches eine Ausführungsform
der Erfindung repräsentiert.
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4 zeigt
eine teilweise Schnittansicht eines invertierten LCM-Mikroskops,
welches eine Ausführungsform
der Erfindung repräsentiert.
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5 zeigt
eine Querschnittsansicht eines Teilaufbaus für eine Kappenhandhabung, welche eine
Ausführungsform
der Erfindung repräsentiert.
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6 zeigt
eine Draufsicht auf einen Teilaufbau zur Kappenhandhabung in einer
Beschickungsposition, welche eine Ausführungsform der Erfindung repräsentiert.
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7 zeigt
eine ebene Draufsicht von oben auf die Vorrichtung in der in 6 dargestellten Position.
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8 zeigt
eine Aufrißansicht
eines Teilaufbaus für
die Kappenhandhabung in einer Untersuchungsposition, welche eine
Ausführungsform
der Erfindung repräsentiert.
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9 zeigt
eine ebene Draufsicht von oben auf die Vorrichtung in der in 8 dargestellten Position.
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10 zeigt
einen Aufriß eines
Teilaufbaus der Kappenhandhabung in einer Entladeposition, welche
eine Ausführungsform
der Erfindung repräsentiert.
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11 zeigt
eine Draufsicht von oben auf die Vorrichtung in der in 10 dargestellten Position.
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12 zeigt
eine ebene Draufsicht von oben auf eine Vakuumhalterung, welche
eine Ausführungsform
der Erfindung repräsentiert.
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13 zeigt
eine Querschnittsansicht einer Vakuumhalteeinrichtung, welche eine
Ausführungsform
der Erfindung repräsentiert.
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14 zeigt
ein schematisches Diagramm eines kombinierten Beleuchtungslicht/Laserstrahl-Abgabesystems,
welches eine Ausführungsform
der Erfindung repräsentiert.
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15 zeigt
eine schematische Ansicht eines kombinierten Beleuchtungs/Laserstrahl-Abgabesystems mit
einem Diffusor, welche eine Ausführungsform
der Erfindung repräsentieren.
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16 zeigt
eine schematische Ansicht eines kombiniert Beleuchtungs/Laserstrahl-Abgabesystems mit
einer Kappe an ihrem Platz, welche eine Ausführungsform der Erfindung repräsentieren.
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17 zeigt
eine schematische Ansicht einer integrierten Kappe/Diffusor, welche
eine Ausführungsform
der Erfindung repräsentieren.
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18 zeigt
eine schematische Ansicht einer integrierten Kappe/Diffusor, welche
eine Ausführungsform
der Erfindung repräsentieren.
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BESCHREIBUNG
DER BEVORZUGTEN AUSFÜHRUNGSFORMEN
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Die Erfindung und ihre verschiedenen
Merkmale und vorteilhaften Einzelheiten werden im einzelnen unter
Bezug auf die nicht beschränkenden Ausführungsformen
erläutert,
die in den beigefügten Zeichnungen
dargestellt und in der folgenden Beschreibung im einzelnen erläutert sind.
Beschreibungen wohlbekannter Bauteile und Arbeitstechniken sind
fortgelassen worden, um die Einzelheiten der Erfindung nicht unnötigerweise
zu verschleiern.
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Weitere Dokumente nach dem Stand
der Technik: U.S. Ser. No. 60/037,864, eingereicht am 7. Februar
1997, mit dem Titel "Laser
Capture Microdissection Device" (Docket
No. ARCT-002); U.S. Ser. No. 08/797,026, eingereicht am 7. Februar
1997; U.S. Ser. No. 08/800,882, eingereicht am 14. Februar 1997;
U.S. Ser. No. 60/060,731, eingereichth am 1. Oktober 1997; U.S.
Ser. No. 60/060,732, eingereicht am 1. Oktober 1997.
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Gemäß 1 ist eine perspektivische Ansicht eines
Inversionsmikroskops 100 für die Mikropräparation
mittels Lasereinfang (LCM) dargestellt. Das Inversionsmikroskop 100 weist
eine Vielzahl von Teilsystemen auf, die insbesondere für die LCM-Technik
ausgelegt sind, welche synergetische und unerwartet gute Ergebnisse
liefern. In alternativen Ausführungsformen
muß das
Mikroskop nicht notwendigerweise ein Inversionsmikroskop sein.
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Ein mechanischer Teilaufbau 110 zur
Kappenhandhabung stellt einen Aufbau bereit für das Aufnehmen der Kappe 120 eines
Mikrozentrifugenröhrchens
von einer Zufuhr 122, und zum Anordnen der Kappe 122 des
Mikrozentrifugenröhrens
oben auf der Probe, mit welcher eine LCM durchgeführt werden
soll. In der dargestellten Ausführungsform
ist die Kappe 120 des Mikrozentrifugenröhrchens eine zylindrische,
symmetrische Plastikkappe und die Zufuhr 122 umfaßt acht
der Ver brauchsmaterialien auf einem Schwalbenschwanzobjektträger 124.
In der dargestellten Ausführungsform
ist ein Transferfilm für die
Mikropräparation
mittels Lasereinfang mit dem Boden der Kappe 120 des Mikrozentrifugenröhrens verbunden.
Der mechanische Teilaufbau 110 für die Kappenhandhabung ist
in einer von mehreren möglichen
Positionen darstellt, wobei ein Arbeitsende 112 des mechanischen
Teilaufbaus 110 für
die Kappenhandhabung in einer Phiolen-Kappungsstation 114 angeordnet
ist. Die Bewegung des mechanischen Teilaufbaus 110 für die Kappenhandhabung
wird unten noch genauer beschrieben.
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Ein Glasobjektträger 130, auf welchem
die Probe angeordnet ist, die mikropräpariert werden soll, und auf
welcher die Kappe 120 des Mikrozentrifugenröhrchens
angeordnet wird, ist in der primären optischen
Achse des Inversionsmikroskops 100 angeordnet. In alternativen
Ausführungsformen
kann der Objektträger,
welcher die Probe trägt,
aus anderen im wesentlichen durchsichtigen Materialien hergestellt
sein, beispielsweise einem Kunststoff wie zum Beispiel Polykarbonat.
Der gläserne
Objektträger 130 wird
mit Hilfe einer Vakuumhalteeinrichtung 140 unterstützt und
an seinem Platz gehalten. Die Vakuumhalterung 140 bildet
eine im wesentlichen ebene Oberfläche, die über einen Verteiler (nicht
dargestellt) mit dem Glasobjektträger 130 in Eingriff
tritt, um so den Glasobjektträger 130 an
seinem Platz zu halten, während
die Kappe 120 des Mikrozentrifugenröhrchens aufgenommen und angeordnet
wird und während
eine Translationsstufe 145 in einer XY-Ebene bewegt wird.
In alternativen Ausführungsformen
kann die Translationsstufe auch so ausgestaltet sein, daß sie die
Fähigkeit
hat, auch entlang einer Z-Achse bewegt zu werden.
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Die Translationsstufe 145 kann
unter Verwendung eines Paares von Rotationssteuerungen (in 1 nicht darstellt) manipuliert
werden. Zusätzlich kann
die Translationsstufe 145 unter Verwendung eines Joysticks
bzw. eines Betätigungshebels 150 manipuliert
werden. Der Joystick 150 ist über eine Kugelmontage 152 und
eine Klammer 154 mit der Translationsstufe 145 verbunden.
Der Joystick 150 weist eine zweite Kugelmontage 156 innerhalb
einer statischen Klammer 158 auf. Der Joystick stellt gleichzeitige
XY-Bewegungen bereit. Weiterhin kann diese gleichzeitige Bewegung
mit einer einzigen Hand bewirkt werden. Die Bereitstellung von Proben erfolgt
dadurch schneller.
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Ein mechanisches Gestänge wird
bereitgestellt durch die Tatsache, daß die Länge bzw. der Abstand zwischen
der Kugelmontage 152 und der zweiten Kugelmontage 156 weniger
als der Abstand zwischen der zweiten Kugelmontage 156 und
dem unteren Ende des Joysticks 150 beträgt. Dieses Hebelverhältnis wird
nicht für
eine Vervielfachung von Kraft benötigt, sondern für die Reduzierung
der skalaren Bewegung. Dieses Verhältnis sollte weniger als 1
: 5 und vorzugsweise etwa 1 : 7 betragen. Dieses Verhältnis kann
so eingestellt werden, daß es
im Hinblick auf die Probenbewegung als Funktion der Handbewegung
eines Präparators
die benötigte
optimale Auflösung
bereitstellt. Zusätzlich
liefert der Joystick auch eine fühlbare
Rückkoppelung,
die man mit elektronischen Steuerungen oder Getriebeverbindungen nicht
erhält.
Der Joystick 150 ermöglicht
die gleichzeitige Bewegung der Translationsstufe 145 in
zwei Richtungen (XY) als Funktion einer einzelnen Vektorbewegung
in der Hand eines Präparators.
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Dieses wichtige Merkmal liefert das
unerwartete Ergebnis, daß die
Geschwindigkeit, mit welcher Eigenschaften bzw. Gegenstände, die
mikropräpariert
werden sollen, in der optischen Hauptachse des Inversionsmikroskops 100 positioniert
werden, beträchtlich
erhöht
bzw. beschleunigt wird.
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Weiterhin weist gemäß 1 das Inversionsmikroskop 100 einen
optischen LCM-Zug bzw. Strahlengang 160 auf. Eine Weißlichtbeleuchtung 170 ist
ebenfalls auf dem Beleuchtungsarm 165 montiert. Weißes Licht
von der Beleuchtung 170 tritt nach unten durch die Kappe 120 des
Mikrozentrifugenröhrchens
durch einen dichroitischen Spiegel 180 und Fokussierlinse 190 hindurch.
Eine Laserdiode 175 mit einer Kollimatoroptik sendet einen
Strahl 177 aus, der durch einen Strahlsteuerungsspiegel 185 reflektiert
wird. Nachdem der Strahl 177 durch den Strahlsteuerspiegel 185 reflektiert
worden ist, trifft er auf den dichroitischen Spiegel 180 auf.
Der dichroitische Spiegel 180 ist ein solches Dichroitikum,
welches den Strahl 170 nach unten durch die Fokussierlinse 190 in
Richtung der Kappe 120 des Mikrozentrifugenröhrchens
reflektiert. Gleichzeitig erlaubt der dichroidische Spiegel 180,
daß weißes Licht
von der Beleuchtung 170 direkt nach unten zu der Fokussierlinse 190 in
Richtung der Kappe 120 des Mikrozentrifugenröhrchens
hindurch tritt. Demnach werden der Strahl 177 und die Beleuchtung
mit weißem
Licht überlagert.
Die Fokussierlinse 190 stellt auch die Größe des Strahlfleckes
bzw. Strahlquerschnittes ein.
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Gemäß den 2A-2B sind
zwei senkrechte Aufrisse der in 1 dargestellten
Vorrichtung wiedergegeben. Man kann sowohl in 2A als auch in 2B einen Beleuchtungspfad 210 für weißes Licht als
auch einen Laserstrahlpfad 220 erkennen. Es versteht sich
gemäß 2A, daß beide Pfade optische Information
für ein
Bildgewinnungssystem 230 tiefem. In ähnlicher Weise versteht es
sich gemäß 2B, daß der Pfad des Beleuchtungsstrahls
optische Informationen für
ein Binokulargerät 240 liefert. In
alternativen Ausführungsformen
kann der Okularaufbau ein Monokular sein bzw. umfassen.
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Gemäß 3 ist ein schematisches Blockdiagramm
eines optischen Strahlungsganges gemäß der Erfindung dargestellt.
Ein Pfad 310 eines Laserstrahles beginnt bei einem Filmaktivierungslaser 320. Der
Strahl auf dem Weg 310 des Lasers wird dann durch einen
Spiegel 330 reflektiert. Dann wird der Laserstrahl durch
einen dichroidischen Spiegel 340 reflektiert. Der Strahl
auf dem Weg 310 des Lasers wird dann durch eine Linse 350 fokussiert.
Die Linse 350 kann optional eine Struktur zum Verändern des Strahldurchmessers
aufweisen, wie zum Beispiel eine variable Apertur. Der Strahlengang 310 des
Lasers verläuft
dann weiter nach unten in Richtung der Kappe 120 des Mikrozentrifugenröhrchens.
Weiter läuft
der Laserstrahlengang 310 dann durch eine Objektivlinse 360 und
wird dann reflektiert. Ein Abschneidefilter 390 ist in
dem Okular 370 installiert. Der Abschneidefilter 390 kann
die Energie des Laserstrahles reflektieren und/oder absorbieren.
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Die Position des Laserstrahlenganges 310 bzgl.
des Bereiches der Probe, die durch die Kappe 120 des Mikrozentrifugenröhrchens
gewonnen werden soll, kann von einem Präparator über das Bildgewinnungssystem 230 (in 3 nicht dargestellt) gesehen
bzw. erkannt werden, welches eine Kamera aufweisen kann. In einem
Leerlaufbetrieb stellt er Laserstrahlengang 310 ein Signal
mit einer niedrigen Amplitude bereit, das über das Erfassungs- bzw. Gewinnungs-System 230 erfaßt werden
kann. Im Pulsbetrieb gibt der Laserstrahlengang 310 Energie
an die Kappe 120 des Mikro zentrifugenröhrchens ab und die optischen
Eigenschaften des Abschneidefilters 390 schwächen den
Laserstrahl 310 ausreichend ab, so daß im wesentlichen nichts von
der Energie des Laserstrahls durch das Okular 370 austritt.
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Geeignete Laserpulsbreiten liegen
zwischen 0 und etwa 1 Sekunde, vorzugsweise zwischen etwa 0 bis
100 Millisekunden und noch bevorzugter bei etwa 50 Millisekunden.
In einer bevorzugten Ausführungsform
beträgt
die Wellenlänge
des Lasers 890 Nanometer. In einer bevorzugten Ausführungsform ist
die Größe des Laserflecks
(Strahlenquerschnitts) auf dem EVA-Material, welches auf der Kappe 120 des
Mikrozentrifugenröhrchens
angeordnet ist, variabel zwischen 0,1 bis 100 Mikrometer, vorzugsweise zwischen
1 und 60 Mikrometern und noch bevorzugter zwischen 5 und 30 Mikrometern.
Diese Bereiche sind vergleichsweise bevorzugt, wenn das optische Teilsystem
ausgelegt wird. Vom Gesichtspunkt des klinischen Präparators
ist der breiteste Fleck-Größenbereich
am vielseitigsten. Die Spitze am unteren Ende des Fleckgrößenbereiches
in der Größenordnung
von 5 Mikrometern ist für
das Übertragen
einzelner Zellen zweckmäßig.
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Geeignete Laser können aus einem weiten Leistungsbereich
ausgewählt
werden. Beispielsweise kann ein 100-Watt-Laser verwendet werden.
Andererseits kann auch ein 50 mW-Laser verwendet werden. Der Laser
kann mit dem übrigen
Teil des optischen Teilsystems über
eine faseroptische Verbindung verbunden sein. Kleinere Fleckgrößen sind
erhältlich
unter Verwendung von diffraktionsbegrenzten Laserdioden und/oder
einer single mode-Faseroptik. Einzelmodenfasern ermöglichen
einen diffraktionsbegrenzten Strahl.
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Während
die Laserdiode in einem Standardbetrieb, wie zum Beispiel einer
TEM00-Mode laufen kann, können für unterschiedliche
Arten von Anwendungen auch andere Intensitätsprofile verwendet werden.
Weiterhin könnte
der Strahlungsdurchmesser mit einer abgestuften Linse anstelle der
Linse 350 verändert
werden.
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Das Verändern des Strahldurchmessers
ermöglicht
es, daß die
Größe des Teiles
der Probe, welche gewonnen wird, eingestellt wird. Bei einem stark fokussierten
Anfangszustand kann die Strahlengröße bzw. der Strahlquerschnitt
durch Defokussierung vergrößert werden.
Bei einem gegebenen defokussierten Anfangszustand kann die Strahlgröße bzw.
der Strahlquerschnitt durch Fokussierung vermindert werden. Die Änderung
des Fokus kann in festen Beträgen
erfolgen. Die Änderung
des Fokus kann man erhalten durch Raststellen an einer bewegbaren
Linsenmontage und/oder mit Hilfe von optischen Glasstufen. In jedem
Fall ist das Erhöhen/Absenken
der optischen Weglänge
der Effekt, der erforderlich ist, um den Fokus des Strahles zu verändern und
damit auch die Fleckgröße (Größe des Laserleuchtflecks) zu
verändern.
Beispielsweise kann das Einfügen
eines abgestuften Glasprimas 380 in den Strahl in der Weise,
daß der
Strahl eine Stufe trifft, die optische Weglänge verändern und die Fleckgröße verändern.
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Gemäß 4 ist ein schematisches Blockdiagramm
einer weiteren Ausführungsform
eines Instrumentes gemäß der Erfindung
dargestellt. In dieser Ausführungsform
sendet eine Lichtquelle 410 (beispielsweise ein Fluoreszenz-Laser)
eine bestimmte Wellenlänge
oder Wellenlängenbereich
aus. Die spezielle Wellenlänge
oder der spezielle Wellenlängenbereich
eines Strahles 420, der von der Lichtquelle 410 emittiert
wird, wird so ausgewählt
oder gefiltert, daß sie
ein Fluoreszenz-System (beispielsweise chemische Marken und optische
Filtertechniken, die in der Industrie bekannt sind) anregen, das
in der zu mikropräparierenden
Probe enthalten oder auf dieser aufgebracht ist. Die Frequenz eines
Strahles 420, der durch den Fluoreszenz-Laser 410 abgegeben
wird, kann abgestimmt werden. Die Probe weist zumindest einen Teil
auf, welches aus der Gruppe ausgewählt ist, die besteht aus Chromophoren-
und Fluoreszenz-Farbstoffen (synthetisch oder organisch), und das
Verfahren zum Betrieb des Instrumentes umfaßt das Identifizieren zumindest
eines Teils der Probe mit Licht, welches das zumindest eine Teil
anregt, vor dem Schritt des Übertragens
des Abschnittes der Probe auf den Transferfilm für die Mikropräparation
mittels Lasereinfang.
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Weiterhin wird gemäß 4 der Strahl 420 durch
einen Spiegel 430 reflektiert. Der Strahl 420 wird
dann durch den dichroidischen Spiegel 340 reflektiert.
Auf diese Weise kann der Strahl 420 sowohl mit dem Laserstrahlengang 310 als
auch mit dem weißen
Licht von der Beleuchtung 170 koinzident gemacht werden.
Es versteht sich, daß der
Strahl 420 und der Laserstrahlengang 310 nur zum
Zwecke der Klarheit voneinander beabstandet dargestellt sind. Der
Strahl 420 und der Laserstrahlengang 310 können koaxial
verlaufen. Fluoreszenz-Strahlung, die von der Probe unter der Kappe 120 des
Mikrozentrifugenröhrchens
ausgesendet wird, läuft
dann durch die Objektivlinse 320 und kann so vom Präparator durch
das Okular 370 betrachtet werden.
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Gemäß 5 ist eine Querschnittsansicht des mechanischen
Teilaufbaus 110 für
die Kappenhandhabung dargestellt. Der mechanische Teilaufbau 110 für die Kappenhandhabung
weist einen Dämpfer 510 auf.
Der Dämpfer 510 ist
eine Struktur zum Dämpfen
der vertikalen Bewegung des mechanischen Teilaufbaus 110 für die Kappenhandhabung.
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Der Dämpfer 510 ist dafür ausgelegt,
die Kappe 120 des Mikrozentrifugenröhrchens in reproduzierbarer
Weise nach unten in Richtung der Translationsstufe abzusenken. Der
Dämpfer 510 kann
ein Luftdämpfer
(beispielsweise ein pneumatisches Rohr) oder ein Flüssigkeitsdämpfer (beispielsweise ein
hydraulisches Rohr) oder irgendeine andere dynamische Struktur sein,
die in der Lage ist, die vertikale Bewegung des Teilaufbaus 110 zu
verzögern, um
so keinen Stoß bzw.
keinen Impuls zu erzeugen. Wenn die Kappe 120 des Mikrozentrifugenröhrchens mit
dem Objektträger
in Kontakt kommt, auf welchem die Probe ruht (nicht dargestellt),
bewegt sich das Arbeitsende 112 eines Armes 520,
welcher mit dem Dämpfer 510 verbunden
ist, mit einer reproduzierbaren Geschwindigkeit weiter abwärts. Daher
erhebt sich die Oberseite der Kappe 120 des Mikrozentrifugenröhrchens
relativ zu dem Boden eines Gewichts 530. Man kann erkennen,
daß die
Kappe 120 mit dem Objektträger in Kontakt tritt, bevor
das Gewicht 530 mit der Kappe 120 in Kontakt tritt.
Auf diese Weise erfährt
die Kappe 120 des Mikrozentrifugenröhrchens einen Schritt bzw.
einen Verfahrensschritt der Selbstnivellierung, bevor sie durch
das Gewicht 530 kontaktiert und gegen den Objektträger gedrückt wird.
Wenn das Gewicht 530 mit der Kappe 120 des Mikrozentrifugenröhrchens
in Kontakt kommt, bewegt sich das Arbeitsende 112 des Armes 520 weiterhin
entlang seines abwärts
gerichteten Weges. Daher liegt in der Aufbringung des Gewichtes 530 auf die
Kappe 120 des Mikrozentrifugenröhrchens ebenfalls ein Selbstnivellierungsschritt.
Durch Steuern bzw. Einstellen der Masse des Gewichtes 530 kann die
Kraft pro Einheitsfläche
zwischen dem Boden der Kappe 120 des Mikrozentrifugenröhrchens
und dem Objektträger
kontrolliert bzw. eingestellt werden. Nachdem mit der Probe auf
dem Objektträger
eine LCM durchgeführt
worden ist, kann der Arm 520 angehoben werden. Durch Anheben
des Armes wird zuerst das Gewicht 530 von der Kappe 120 des
Mikrozentrifugenröhrchens
aufgenommen und dann wird die Kappe 120 des Mikrozentrifugenröhrchens von
dem Objektträger
aufgenommen. Der Dämpfer innerhalb
des Mechanismus wirkt als ein Stoßdämpfer, um die Geschwindigkeit
des Aufnahmearmes zu kontrollieren.
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Die Position der Translationsstufe
ist, bezogen auf die Position des mechanischen Teilaufbaus 110,
für die
Kappenhandhabung unabhängig.
Diese relativen Positionen können
durch das Paar von drehbaren Steuerungen 147 gesteuert
bzw. kontrolliert werden. Es sei angemerkt, daß das Paar von drehbaren Steuerungen 147 in 5 mit seinen Achsen parallel
zu der Achse der Kappe 120 des Mikrozentrifugenröhrchens
dargestellt ist. Das Paar von drehbaren Steuerungen 147 kann
jedoch auf Grund der Verwendung von mechanischen Verbindungselementen
wie zum Beispiel Getrieben irgendeine beliebige Orientierung haben.
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Gemäß 6 ist der mechanische Teilaufbau 110 für die Kappenhandhabung
in einer Beschickungsposition dargestellt. In der Beschickungsposition
liegt das Arbeitsende 112 des Armes 520 direkt über dem
Schwalbenschwanzschlitten 124. In dieser Position ergreift
das Arbeitsende 112 eine Kappe 120 eines Mikrozentrifugenröhrchens.
Nach dem Ergreifen der Kappe 120 des Mikrozentrifugenröhrchens wird
der Arm 520 angehoben und nimmt dabei die Kappe 120 des
Mikrozentrifugenröhrchens
nach oben auf.
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Gemäß 7 erkennt man eine ebene Draufsicht von
oben auf den mechanischen Teilaufbau 110 des Kappenmechanismus
in der Beschickungsposition. Bevor der Arm 520 in die Beschickungsposition
verschwenkt wird, wird eine neue Kappe eines Mikrozentrifugenröhrens unter
der Achse des Arbeitsendes 512 angeordnet. Nachdem der Arm 520 im
Uhrzeigersinn in Richtung der Vakuumhalterung 140 verschwenkt
worden ist, werden die Kappen auf dem Schwalbenschwanzschlitten 124 vorwärts bewegt,
um auf diese Weise eine neue Kappe eines Mikrozentrifugenröhrchens
in der Position für
den nächsten
Zyklus anzuordnen.
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Gemäß 8 ist der mechanische Teilaufbau 110 für die Kappenhandhabung
in einer Untersuchungsposition dargestellt. Wenn das Arbeitsende 112 des
Armes 520 in der Untersuchungsposition angeordnet ist,
so fällt
es mit der optischen Hauptachse des Instrumentes zusammen. Dies
ist die Position, in welcher der Arm 520 abgesenkt wird,
um die Selbstnivellierung der Kappe 120 des Mikrozentrifugenröhrchens
und dann die Selbstnivellierung des Gewichtes 530 oben
auf der Kappe 120 des Mikrozentrifugenröhrchens zu ermöglichen.
Nach der LCM wird der Arm 520 in diese Position angehoben,
um das Gewicht 530 von der Kappe 120 des Mikrozentrifugenröhrchens
wegzunehmen und dann die Kappe 120 des Mikrozentrifugenröhrchens
von dem Objektträger
(nicht dargestellt) wegzunehmen. Das Gewicht 530 ist ein
freischwebendes Gewicht, so daß dann, wenn
es oben auf der Kappe abgesetzt wird, die Kappe und das Gewicht
sich frei setzen können.
Das freischwebende bzw. schwimmende Gewicht ermöglicht eine gleichmäßige Aufbringung
von Druck. Beispielsweise kann ein Gewicht von 30 g in dem Fall
verwendet werden, bei welchem die Gesamtoberfläche des Transferfilmes für die Mikropräparation
mittels Lasereinfang näherungsweise
0,26 Quadratzoll beträgt.
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Gemäß 9 ist eine ebene Draufsicht von oben
auf den mechanischen Teilaufbau 110 für die Kappenhandhabung in der
Untersuchungsposition dargestellt. Man erkennt anhand dieser Ansicht,
daß das
Arbeitsende 112 des Armes 520 oberhalb des Glasobjektträgers 130 angeordnet
ist.
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Gemäß 10 ist der mechanische Teilaufbau der
Kappenhandhabung in einer Entladeposition dargestellt. In der Entladeposition
sind das Arbeitsende 112 des Armes 520 und die
Kappe 120 (aka-Verbrauchsmaterial) mit dem via LCM angebrachten
Gewebe allesamt oberhalb der Phiolen-Kappungsstation 114 angeordnet.
Nachdem sie axial mit der Phiolen-Kappungsstation 114 ausgerichtet
sind, wird die Kappe 120 des Mikrozentrifugenröhrchens
herabgesenkt auf und in einen Analysebehälter 1000. Nachdem
die Kappe 120 des Mikrozentrifugenröhrchens in den Analysebehälter 1000 eingesetzt
worden ist, wird das Arbeitsende 112 des Armes 520 angehoben.
Das Arbeitsende 112 des Armes 520 wird dann im
Uhrzeigersinn gedreht, bis es oberhalb eines neuen bzw. frischen
Verbrauchsobjektes (Kappe) angeordnet ist (entsprechend der in den 6-7 dargestellten Positionen).
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Gemäß 11 ist eine Draufsicht von oben auf den
mechanischen Teilaufbau 110 für die Kappenhandhabung in der
Entlade- bzw. Entnahmeposition dargestellt. In dieser Position ist
der Arm 520 weg von der Vakuumhalterung 140 angeordnet.
Der Analysebehälter 1000 (in 11 nicht sichtbar) ist nach
oben gedrückt,
um mit der Kappe 120 des Mikrozentrifugenröhrchens
in Eingriff zu treten (in 11 nicht
sichtbar). Den somit abgedichteten bzw. verschlossenen Analysebehälter 1000 läßt man dann frei
zurück
in eine Halterungsklammer 1010 fallen (siehe 10). Der verschlossene Analysebehälter 1000 zusammen
mit der Kappe 120 des Mikrozentrifugenröhrchens kann dann entweder
manuell oder automatisch aus der Klammer 1010 entnommen
werden.
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Gemäß 12 ist eine ebene Draufsicht von oben
auf die Vakuumhalterung 140 dargestellt. Eine obere Fläche 1210 der
Vakuumhalterung 140 weist ein erstes Verteilerloch 1020 und
ein zweites Verteilerloch 1030 auf. In alternativen Ausführungsformen kann
irgendeine beliebige Anzahl von Verteilerlöchern vorhanden sein. Die Vakuumhalterung 140 umfaßt ein Loch 1040 für einen
Strahlengang. Wenn das Instrument in Betrieb ist, wird der Glasobjektträger (nicht
dargestellt) oder ein anderer Probenhalter über dem Loch 1040 für den Strahlengang
und den Verteilerlöchern
1020-1030 angeordnet.
Nachdem der Glasobjektträger
in seiner Position angeordnet ist, wird über einen Verteiler, der mit
den Löchern 1020–1030 in
Verbindung steht, ein Vakuum gezogen, wodurch der Glasobjektträger über dem
Strahlengangloch 1040 in Position gehalten wird. Auch wenn
ein mittleres oder selbst hohes Vakuum angelegt werden kann, so
ist ein niedriges Vakuum dennoch ausreichend, um während des
LCM-Vorganges den Glasobjektträger
an seinem Platz zu halten. Ein ausreichendes Vakuum kann sogar mit
einer preiswerten Aquariumspumpe erzeugt werden, die in umgekehrter
Richtung betrieben wird.
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Die Haltekraft, die auf den Glasobjektträger 130 ausgeübt wird,
ist eine Funktion des angelegten Vakuums, der Größe und Form der Verteilerlöcher 1020–1030 und
des Abstandes zwischen der oberen Fläche der Translationsstufe und
der unteren Oberfläche
des Glasobjektträgers 130.
Der Abstand zwischen der Translationsstufe und dem Glasobjektträger 130 ist
eine Funktion der Ebenheit der Oberflächen und der Elastizität der entsprechenden
Strukturen.
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Das Niveau des Vakuums wird so eingestellt, daß der Glasobjektträger 130 oder
irgendein anderer Probenträger
bezüglich
der Translationsstufe verschoben bzw. bewegt werden kann. Diese
Möglichkeit
der Translation bzw. Verschiebung liegt dann vor, wenn das Vakuum
abgeschaltet ist und wenn das Vakuum eingeschaltet ist.
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Um den Umfang des Glasobjektträgers 130 herum
gibt es ein gewisses Leck, was die Kraft, welche den Glasobjektträger 130 an
seinem Platz hält, moduliert.
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Dementsprechend reicht eine mäßige Kraft (beispielsweise
2,26 kg (5 Pfund)), die auf die Kante des Glasobjektträgers ausgeübt wird,
aus, um eine Bewegung des Glasobjektträgers 130 bezüglich der Translationsstufe
zu bewirken, wenn das Vakuum anliegt.
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Gemäß 13 ist ein Querschnitt der Vakuumhalterung
mit einem Glasobjektträger 130 an
seinem Platz dargestellt. Das Vakuum, welches den Glasobjektträger 130 an
seinem Platz hält,
wird durch eine Leitung 1320 gezogen. Die Leitung 1320 ist
mit einem kreisförmigen
Verteiler 1310 verbunden. Der kreisförmige Verteiler 1310 ist
mit den Verteilerlöchern 1020–1030 verbunden.
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Man kann anhand der 13 erkennen, daß es keine Stifte oder sonstige
Strukturen gibt, die über die
obere Fläche
der Vakuumhalterung 140 hervorstehen. Dies ermöglicht es,
daß der
Glasobjektträger 130 in
irgendeiner Richtung parallel zu der oberen Fläche ohne jede Einschränkung bewegt
werden kann.
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Gemäß 14 ist eine Beleuchtung 1400 mit
großer
numerischer Apertur für
ein LCM-Gerät dargestellt.
Der Beleuchter bzw. Illuminator 1400 stellt einen großen Arbeitsabstand
bereit. Eine Faseroptik 1410 liefert eine Quelle der Weißlichtbeleuchtung.
Der divergierende Strahl 1420 von der Faseroptik 1410 kann
eine numerische Apertur von näherungsweise
0,4 haben. Eine Kollimatorlinse 1430 sammelt das Licht
von der Faseroptik 1410. Die Kollimatorlinse 1430 kann
eine asphärische
Linse sein (beispielsweise eine asphärische Linse nach Melles Griot
(01 LAG 025)). Ein kollimierter Strahl 1440 von der Kollimatorlinse 1430 verläuft dann
durch einen Strahlaufteiler 1450. Der Strahlaufteiler 1450 ermöglicht das
Indizieren eines Laserstrahles 1460. Nach der Reflexion
durch den Strahlteiler 1450 verläuft der Laserstrahl 1460 koaxial
mit der Weißlichtbeleuchtung.
Beide Arten von Licht erreichen dann eine Kondensorlinse 1470.
Die Kondensorlinse 1470 kann eine Melles Griot (01 LAG
025) oder (01 LAG 010) oder irgendeine andere ähnliche asphärische Linse oder
dergleichen sein. Die gesammelten koaxialen Strahlen fallen dann
auf die Kappe 120 des Mikrozentrifugenröhrchens und verlaufen durch
diese hindurch. Der Fokussierungsstrahl, der von der Kondensorlinse 1470 herrührt, kann
eine numerische Apertur von etwa 0,8 haben. Dies kann als ein Fokussierstrahl
charakterisiert werden. Die Kappe 120 des Mikrozentrifugenröhrchens
wird auf der Oberseite eines Objektträgers mit als Probe zu entnehmenden
Zellen (nicht dargestellt) angeordnet.
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Gemäß 15 ist eine weitere Ausführungsform
des Beleuchters bzw. Illuminators mit hoher numerischer Apertur
dargestellt. In dieser Ausführungsform
ist ein Diffusor 1500 unter der Kondensorlinse 1470 an
einer Position oberhalb des Glasobjektträgers 130 angeordnet,
welcher die probeweise zu nehmenden Zellen enthält.
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Allgemeiner gesprochen kann irgendein
geeignetes Streumedium verwendet werden, um die Funktionen des Diffusors 1500 bereit
zu stellen. Das Bereitstellen eines solchen Streumediums in der Nähe des Gewebes,
um das Licht zu streuen, führt
zu einer dramatisch verbesserten Beleuchtung der Probe und einer
viel besseren Visualisierung bzw. Sichtbarmachtung. Ein Streumedium
dieser Art beseitigt das Erfordernis nach einer Anpassung des Brechnungsindex
der Probe. Ein solches Streumedium kann eine Sichtbarmachung des
Zellkernes und anderer subzellulärer
Strukturen ermöglichen,
die durch normale Beleuchtungstechniken normalerweise verborgen
bleiben.
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Die Streumedien können ein Diffusormaterial sein.
Ein Diffusormaterial, welches für
die Verwendung als Streumedium geeignet ist, ist Milch- oder Opalglas,
welches ein sehr dichtes Feindiffusor-Material ist. Beispielsweise
ist ein geeignetes Milchglas bei Edmund Scientific als Teil-Nr.
P43,717 erhältlich. Es
kann sogar ein standardmäßiges Laserdrucker/Fotokopier-Papier
als Streumedium verwendet werden. Andere Arten transparenter Streumedien können verwendet
werden, wie zum Beispiel Mattglas, ein linsenförmiger Bogen, ein Volumendiffusor und/oder
ein Oberflächendiffusor.
In jeden Fall sollte das Streumedium ein Material sein, welches
das Beleuchtungslicht in aggressiver Weise streut. Eine einzelne
Scheibe eines typischen geschliffenen Glases ist im allgemeinen
unzureichend und muß in
mehreren Schichten als ein Serienstapel von drei oder vier Glasscheiben
aus geschliffenem Glas kombiniert werden, um das Beleuchtungslicht
ausreichend diffus zu machen.
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Gemäß 16 können,
nachdem der Diffusor 1500 durch eine Kappe 120 eines
Mikrozentrifugenröhrchens
ersetzt worden ist, die gewünschten Zellen
unter der Verwendung des Bildes lokalisiert werden, welches während des
in 15 wiedergegebenen
Schrittes erfaßt
wurde. Dann kann der Laserstrahl 1460 eingeführt werden,
der von dem Strahlteiler 1450 reflektiert und in die Kappe 120 des Mikrozentrifugenröhrchens
gerichtet wird, um die gewünschte
Probe zu beschaffen.
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Der Zweck der Beleuchtungsausstattung
besteht darin, einen Beleuchter bzw. Illuminator für ein LCM-Gerät mit sehr
hoher bzw. großer
numerischer Apertur bereit zu stellen. Ein solches LCM-Gerät erfordert
einen großen
Arbeitsabstand. Während
ein Beleuchter, der ein 40-fach-Objektiv mit einer numerischen Apertur
von 0,8 verwendet, möglicherweise eine
bessere Sichtbarmachung zu liefern scheint, hat eine solche Auslegung
Probleme, da der Arbeitsabstand für das 40-fach-Objektiv sehr
klein ist (beispielsweise weniger als 1 Millimeter). Demnach ist
es für
ein Modell, das einen dicken Kuppelträger verwendet, kritisch bzw.
entscheidend, eine Beleuchtungsausstattung mit einem viel größeren Arbeitsabstand
zu haben. Ein dicker Kuppelträger
ist ein Probenträger,
dessen Oberseite und Boden um mehr als einen kleinen Abstand voneinander
entfernt sind. Dieses ist wichtig, weil die Probe sich neben dem
Boden des Probenträgers
befindet und das Objektiv sich nicht näher an die Probe heranbewegen
kann als bis zu der Oberseite des Probenträgers.
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Die Fokussierlinse 190 kann
durch eine asphärische
Melles Griot Kondensorlinse, wie zum Beispiel eine 01 LAG 010 ersetzt
werden. Eine solche Linse hat eine numerischer Apertur von etwa
0,75 und einen Arbeitsabstand von etwa 25 Millimetern. Eine solche
Linse ist nicht wie das 40-fach-Objektiv bezüglich chromatischer
Aberrationen korrigiert. Experimente, die unter Verwendung einer
sphärischen Linse
als Kondensor durchgeführt
wurden, lieferten eine starke Verbesserung bei der Sichtbarmachung. Diese
sphärische
Linse hatte eindeutig nicht die Aberrationskorrekturen, die in das
40-fach-Objektiv eingebaut sind.
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Der Laserstrahl kann durch diese
Kondensorlinse wie durch die Fokussierlinse 190 fokussiert werden.
Diese Kondensorlinse hat in etwa die Hälfte der Brennweite der aktuellen
Linse, so daß der
Laserstrahl bis herab auf 15 Mikrometer fokussiert wird.
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In einer alternativen Ausführungsform
könnte
das Modell eine Verbundlinse wie die Linse in einem Barcode-Scanner
verwenden. Eine solche Verbundlinse hat einen zentralen Bereich
für den
Laser und einen Umgebungsbereich, der als große numerische Apertur bezüglich der
Weißlichtbeleuchtung
wirken würde.
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Gemäß 17 kann in einer Ausführungsform der Diffusor 1500 neben
der Kappe 120 des Mikrozentrifugenröhrchens angeordnet werden.
In dieser Ausführungsform
ist die Kappe 120 des Mikrozentrifugenröhrchens unmittelbar oberhalb
des Glasobjektträgers 130 angeordnet.
Gebündeltes
bzw. kollimiertes Licht 1700 fällt auf den Diffusor 1500.
Der Diffusor 1500 bewirkt, daß das gebündelte Licht mit einer unzähligen Vielfalt
von Winkeln in die Kappe eintritt und durch diese hindurchläuft. Auf
diese Weise werden Schatten vermindert und die Qualität der Abbildung
wird verbessert.
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Der Diffusor 1500 kann ein
volumetrischer Diffusor oder ein Oberflächendiffusor sein. Im Falle eines
volumetrischen Diffusors kann der Diffusor 1500 Mattglas
sein, ein holograpischer Diffusor auf Speckle-Basis oder gar ein
Stück Papier.
Im Falle eines Oberflächen-Diffusors
kann der Diffusor 1500 ein linsenförmiges Blatt bzw. Bogen oder
Scheibe, ein holographischer Oberflächen-Diffusor vom Speckle-Typ oder irgendeine
andere geeignete topologische Oberfläche sein.
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Gemäß 18 ist der Diffusor 1500 in
dieser Ausführungsform
neben dem Boden der Kappe 120 des Mikrozentrifugenröhrchens
angeordnet. Das gebündelte
Licht 1700 läuft
durch die Kappe 120 des Mikrozentrifugenröhrchens
und fällt
auf den Diffusor 1500. Wie das zuvor gebündelte Licht
aus dem Diffusor 1500 austritt, so wird es in einen weiten
Winkelbereich gestreut. In dieser Ausführungsform ist der Diffusor 1500 von
dem Glasobjektträger 130 beabstandet.
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Das Streumedium (beispielsweise der
Diffusor 1500) kann direkt oder indirekt mit dem Träger für den Transferfilm
und/oder den LCM-Transferfilm verbunden sein. Alternativ können Streumedien
auf einer Oberfläche
oder im Inneren des Transfer-Film-Trägers und/oder des LCM-Transferfilmes gebildet
werden. Die Streumedien können
so hergestellt werden, daß sie
den LCM-Strahl und/oder
den Beleuchtungsstrahl formen. Das Streumedium muß innerhalb
einiger weniger Millimeter der Probe liegen, um effektiv zu sein.
Einige wenige Millimeter bedeutet weniger als 1 Zentimeter, vorzugsweise
weniger als 5 Millimeter. Der Vorgang des Betreibens des Instrumentes
beginnt mit der Visualisierung bzw. Betrachtung des Gewebes, aus
welchem die Probe gewonnen werden soll. Das Gewebe wird dann so
bewegt, daß der
Abschnitt, der gewonnen werden soll, unmittelbar unter der Hauptachse
des Instrumentes liegt. Ein Transferfilm für die Mikropräparation
mittels Lasereinfang wird dann über
dem gewünschten
Bereich angeordnet. In einer bevorzugten Ausführungsform hat der Film einen
Abstand innerhalb weniger Mikrometer zur oberen Fläche der
Probe. Alternativ kann der Film in Kontakt mit dem oberen Teil der
Probe angeordnet werden, mit einem Druck, der ausreicht, um die Übertragung
ohne Erzwingung einer nichtspezifischen Übertragung zu ermöglichen. Schließlich wird
der Laser impulsbetrieben, um den Film aufzuheizen und das Gewebe zu
entfernen. Der Film muß schnell
von der Probe weggezogen werden. Dennoch sollte die Geschwindigkeit
so sein, daß die
Probe thixotrop geschert wird.
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Praktische Anwendungen
der Erfindung
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Eine praktische Anwendung der Erfindung, welche
auf dem technischen Gebiet ihren Wert hat, besteht in der Sammlung
einer großen
Datenbasis von Genexpressionsmustern sowohl für gesundes als auch für krankes
Gewebe, und zwar in unterschiedlichen Stufen der Krankheit. Diese
Datenbank wird verwendet, um die Pathogenese von Krebs und infektiösen Krankheiten
besser zu verstehen. Die Erfindung setzt einen Wissenschaftler in
die Lage, Genmuster zu identifizieren und diese Information in eine effektive
Diagnose für
die Krankheit aufzunehmen. Die Erfindung ermöglicht es Medizinern, aktuelle
Proben von Patientengewebe mit archivierten Daten von Patientenproben
zu unterschiedlichen Krankheitsstadien zu vergleichen und ihm damit
zu ermöglichen, effizientere
Therapien für
die jeweilige Stufe zu bestimmen, unnötige Prozeduren zu beseitigen
und das Leiden das Patienten zu mindern. Andere Forschungsbereiche,
in welchen die Erfindung Verwendung finden wird, sind die Drogenentdeckung,
die Entwicklung von Biologie, Forensik, Botanik und das Studium
infektiöser
Krankheiten, wie zum Beispiel einer medikamentenunempfindlichen
Tuberkulose. Es gibt geradezu unzählige Anwendungen für die Erfindung,
die hier nicht alle im einzelnen beschrieben werden müssen.
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Vorteile der Erfindung
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Ein Mikropräparationsinstrument und/oder ein
entsprechendes Verfahren mittels Lasereinfang, welche eine Ausführungsform
der Erfindung repräsentieren,
können
kosteneffizient und zumindest aus den folgenden Gründen vorteilhaft
sein: Die Erfindung ersetzt derzeitige Verfahren durch eine bessere Technologie,
welche genauere und reproduzierbarere Ergebnisse ermöglicht.
Die Erfindung kann verwendet werden, um ein preiswertes spritzgußgeformtes
Wegwerfpolymer bereit zu stellen, welches einen Transferfilm für eine Mikropräparation
mittels Lasereinfang in die Innenoberfläche eines Analysebehälters wie
zum Beispiel eines Mikrozentrifugenröhrchens (beispielsweise eine
EppendorfTM-Röhre)
integriert.
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Alle Veröffentlichungen, Patentanmeldungen und
erteilten Patente, die in dieser Anmeldung erwähnt worden sind, werden hier
durch diese Bezugsnahme insgesamt in demselben Ausmaß aufgenommen,
als wenn jede einzelne Veröffentlichung,
Anwendung oder Patent speziell und individuell als eines gekennzeichnet
wäre, das
insgesamt durch die Bezugsnahme aufgenommen werden soll.
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Alle offenbarten Ausführungsformen
der Erfindung, die hier beschrieben worden sind, können ohne übermäßige Experimentierung
realisiert und praktiziert werden. Auch wenn die beste Art und Weise
der Ausführung
der Erfindung, welche die Erfinder sich vorstellen, oben offenbart
worden ist, ist die praktische Ausführung der Erfindung nicht darauf
beschränkt.
Es steht fest, daß verschiedene
Hinzufügungen,
Modifikationen und Neuanordnungen der Merkmale der Erfindung ohne
Abweichung von dem Geist und dem Schutzumfang des zugrundeliegenden
erfinderischen Konzeptes vorgenommen werden können. Dementsprechend versteht
es sich für
Fachleute, daß die
Erfindung auch anders als hier speziell beschrieben ausgeführt werden
kann.
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Beispielsweise müssen die individuellen Bauteile
nicht in den offenbarten Formen ausgebildet werden oder in der offenbarten
Konfiguration zusammengebaut werden, sondern sie könnten in
nahezu jeder beliebigen Form bereit gestellt und in praktisch jeder
Konfiguration zusammenmontiert werden. Weiterhin müssen die
einzelnen Bauteile nicht aus den offenbarten Materialien hergestellt
werden, sondern sie könnten
im wesentlichen auch aus jedem beliebigen anderen geeigneten Material
herstellt sein. Weiterhin ist klar, auch wenn das hier offenbarte
LCM-Instrument als ein physikalisch getrenntes Modul beschrieben
worden ist, daß das
LCM-Instrument in eine andere Vorrichtung integriert sein kann,
welcher es zugeordnet ist. Weiterhin können alle offenbarten Elemente
und Merkmale der offenbarten Ausführungsform mit offenbarten
Elementen und Merkmalen jeder anderen offenbarten Ausführungsform
kombiniert oder durch solche ersetzt werden, mit Ausnahme derjenigen,
bei welchen solche Elemente oder Merkmale sich wechselseitig ausschließen. Es
steht fest, daß verschiedene
Hinzufügungen,
Modifikationen, Neuanordnungen der Merkmale der Erfindungen ohne
Abweichen von dem Geist des zugrundeliegenden erfinderischen Konzeptes,
wie es beansprucht wurde, vorgenommen werden können. Der Schutzumfang der
Erfindung, wie er in den anhängenden
Ansprüchen
definiert ist, und deren Äquivalenzbereich
soll alle derartigen Hinzufügungen,
Modifikationen und Neuanordnungen abdecken. Die anhängenden
Ansprüche
sollen nicht so interpretiert werden, als würden sie Einschränkungen
hinsichtlich Mitteln und Funktionen (meansplus-function) enthalten,
es sei denn, eine solche Einschränkung
wird in einem gegebenen Anspruch ausdrücklich unter Verwendung des
Begriffes "means-for" (Einrichtungen für) wiedergegeben.
Brauchbare Ausführungsformen der
Erfindung werden durch die anhängenden
Unteransprüche
im einzelnen aufgeschlüsselt.