DE69814858T2

DE69814858T2 - Galaktose-bindende lektine konjugate mit clostridiale neurotoxine ,wie analgetika

Info

Publication number: DE69814858T2
Application number: DE69814858T
Authority: DE
Inventors: John Michael DUGGAN; Andrew John CHADDOCK
Original assignee: Health Protection Agency; Speywood Laboratory Ltd
Current assignee: Syntaxin Ltd
Priority date: 1997-10-08
Filing date: 1998-10-07
Publication date: 2004-03-11
Anticipated expiration: 2018-10-08
Also published as: CA2306350A1; AU9357498A; EP0996468B1; ATE240747T1; US20060121056A1; DK0996468T3; DE69814858D1; JP4629225B2; GB9721189D0; PT996468E; CA2306350C; US7052702B1; US7452543B2; AU741456B2; JP2001518522A; ES2198750T3; ZA989138B; WO1999017806A1; EP0996468A1

Description

Technisches Gebiet
Diese Erfindung bezieht sich auf eine Klasse neuer Mittel, die in der Lage sind, die nozizeptive afferente Funktion zu modifizieren. Die Mittel können das Freisetzen von Neurotransmittern aus verborgenen Neuronenpopulationen inhibieren und dabei die Weiterleitung afferenter Schmerzfasern von peripheren zu zentralen Schmerzfasern reduzieren oder vorzugsweise verhindern. Das Mittel kann verwendet werden in einem oder als ein Arzneimittel für die Behandlung von Schmerz, insbesondere chronischem Schmerz.
Hintergrund
Die Empfindung von Schmerz auf Grund von Verletzung oder Krankheit wird von der Peripherie zum Gehirn über eine multineuronale Bahn getragen. Der erste Teil dieses Systems umfasst die primären, nozizeptiven afferenten Neuronen, die Synapsen mit sekundären Neuronen in dem Hinterhorn der Wirbelsäule oder den Nuklei der Hirnnerven ausbilden. Diese Synapsen geben die eingehende Information durch Freisetzen von Neurotransmittern und Neuromodulatoren, wie z. B. Glutamat und Substanz P weiter. Diese Synapsen sind demzufolge mögliche Stellen für den Eingriff, um Schmerz zu erleichtern; in der Tat ist eine der Wirkungsweisen von Opiatanalgetika, die Neurotransmitterfreisetzung dieser Synapsen herunter zu regulieren.
Unglücklicherweise, haben die Opiate eine Reihe an Einschränkungen als Arzneimittel. Erstens, gibt es eine Anzahl an chronischen Schmerzzuständen, bei denen die Opiate nicht wirksam sind. Zweitens, haben die Opiate eine Reihe an Nebenwirkungen, die sowohl peripher (Verstopfung) als auch zentral (Atemdepression und Euphorie) vermittelt werden, welche Probleme für die Langzeitverwendung darstellen.
Folglich besteht ein Bedarf für die Entwicklung neuer Arzneimittel für die Behandlung von Schmerz, insbesondere chronischem Schmerz.
Eine Annäherung an dieses Problem ist die Verwendung neuer Mittel, die Fragmente von Clostridien-Neurotoxinen enthalten (WO96/33273).
Die Clostridien-Neurotoxine sind Proteine mit molekularen Massen in der Größenordnung von 150 kDa. Sie werden erzeugt von zahlreichen Arten des Bakteriums der Art Clostridium, wobei am bedeutendsten C. tetani und zahlreiche Stämme von C. botulinum sind. Es gibt derzeit acht verschiedene Klassen an davon bekannten Neurotoxinen: Tetanustoxin und Botulinumneurotoxin in seinen Serotypen A, B, C₁, D, E, F und G, und sie alle teilen ähnliche Strukturen und Wirkungsweisen. Die Clostridien-Neurotoxine werden durch das Wirtsbakterium als einzelne Polypeptide synthetisiert, die posttranslational modifiziert werden, um zwei Polypeptidketten zu bilden, die durch eine Disulfidbrücke verbunden sind. Die beiden Ketten werden als die schwere Kette (H), die eine molekulare Masse von ungefähr 100 kDa hat, und die leichte Kette (L), welche eine Molekularmasse von ungefähr 50 kDa hat, bezeichnet.
Zwei unterschiedliche Funktionen können innerhalb der H-Kette identifiziert werden: Binden und Translokation. Die carboxyterminale Hälfte (H_C) ist an der hochaffinen, neurospezifischen Bindung des Toxins an Zelloberflächenakzeptoren beteiligt, während die aminoterminale Hälfte (H_N) zentral ist für den Transport des Toxins in die neuronale Zelle. Von Botulinum-Neurotoxin Typ A wird angenommen, dass diese Domänen innerhalb der Aminosäurereste 872–1296 für H_C, der Aminosäurereste 449–871 für H_N und der Reste 1–448 für die LC liegen. Die Domänen, die minimal erforderlich sind für die Aktivität der leichten Kette von Clostridien-Toxinen, sind beschrieben in J. Biol. Chem. Vol. 267, Nr. 21, Juli 1992, Seiten 14721–14729. Die acht unterschiedlichen leichten Ketten der Neurotoxine (L) sind hochspezifische, zinkabhängige Endopeptidasen, von denen jede unterschiedliche, aber spezifische Peptidbindungen zu einem der drei Substratproteine, Synaptobrevin, Syntaxin oder SNAP-25, hydrolysieren. Diese Substrate sind wichtige Bestandteile der neurosekretorischen Maschinerie. Die hydrolytische Aktivität der Clostridien-Toxine resultiert in einer verlängerten muskulären Paralyse. Die Funktionen von allen drei identifizierten Domänen sind notwendig für die toxische Aktivität der Clostrtdien-Endopeptidasen.
Einige der Clostrtdien-Endopeptidasen, am erwähnenswertesten ist Botulinum-Neurotoxin Typ A, wurden verwendet als pharmazeutische Wirkstoffe für die Behandlung einer Reihe an Muskeldystonien. Die erschlaffende, paralysierende Wirkung der natürlichen Botulinumtoxine macht jene für diese Verwendung geeignet.
Die Verwendung von Fragmenten von Clostridien-Neurotoxinen für das gewünschte Ziel der Analgesie ist abhängig von der Erfindung von Konjugaten oder Derivaten dieser Moleküle, mit einer spezifischen Bindungsaktivität, die die L-Ketten-Endopeptidase den nozizeptiven afferenten Neuronen bevorzugt vor anderen Neuronen an dem relevanten anatomischen Ort zuführen wird. Die Zufuhr dieser Konjugate schließt das Binden an die Zelloberfläche ein, die Aufnahme über ein endosomales Kompartiment und die Verlagerung der Clostridien-Endopeptidase-Aktivität in das Cytosol.
Das Richten von extrazellulären Spezies auf spezifische intrazelluläre Örtlichkeiten nach der Endozytose umfasst das Verständnis einer Reihe an möglichen Zielstrategien. Es ist verstanden, dass frühe Endosomen Teil des Schlüssel-Sortiermechanismus der Zelle sind, wodurch die Spezies späten Endosomen (und Lysosomen für den Abbau) zugeführt werden, und wodurch die Spezies an die Zelloberfläche oder das Trans-Golgi-Netzwerk zurück geführt werden. Intrazelluläre Routing-Determinanten wurden vorgeschlagen, die den Pfad und die endgültige Bestimmung besonderer Spezies bestimmen. (Mellman, 1996, Annu. Rev. Cell Biol., 12,575–625).
Die gegenwärtigen Daten legen nahe, dass die Verlagerung der natürlichen Clostridien-Neurotoxine aus einem saurem intrazellulären Kompartiment heraus geschieht, obwohl die genaue Örtlichkeit und Art des Kompartimentes unbekannt ist (Montecucco & Schiavo, 1994, Mol. Micro. 13, 1–8). In dem Patent WO96/33273 ist vorgeschlagen, dass das Agens, um wirksam zu sein, auf ein geeignetes Kompartiment für die Verlagerung des Toxins gerichtet sein muss. Als ein Beispiel spezifischen, intrazellulären Targetings wird die Aufnahme des NGF-Rezeptors durch spezifische Endozytose und retrogrades Routing (initiiert durch den Rezeptor-Ligand-Komplex) über saure Endosomen an den Zellkörper, und ein Agens, das NGF einbaut, bereitgestellt in Unterstützung von WO96/33273.
WO96/33273 beschreibt Mittel für die Behandlung von Schmerz, bei denen ein modifiziertes Clostridien-Toxin kovalent direkt oder über einen Spacer an eine Zielkomponente gebunden ist. Die Zielkomponente richtet das Agens auf periphere, sensorische afferente Nerven.
Streit et al., J. Histochem. Cytochem. (1985), 33(10), Seiten 1042–1052, beschreiben die intrazelluläre histochemische Lokalisierung Galactose enthaltender Glycokonjugate in sensorischen Neuronen und ihre Vorgänge in dem zentralen und peripheren Nervensystem einer Ratte.
Darstellung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Mittel, das die Weiterleitung von Schmerzsignalen aus der Peripherie an das Zentralnervensystem reduzieren und vorzugsweise verhindern kann, wodurch die Schmerzempfindung erleichtert wird. Insbesondere kann die Erfindung ein Mittel bereitstellen, das die Weiterleitung von Schmerzsignalen aus nozizeptiven afferenten Neuronen an Projektionsneuronen reduzieren und vorzugsweise verhindern kann. Noch genauer kann die Erfindung ein Mittel bereitstellen, das die Exocytose wenigstens eines Neurotransmitters oder einer Neuromodulatorsubstanz von wenigstens einer Kategorie nozizeptiver afferenter Nerven inhibieren kann.
Gemäß einem Aspekt der Erfindung, wird ein Mittel bereitgestellt, welches an die Wirbelsäule verabreicht werden kann, und welches das Freisetzen von wenigstens einem Neurotransmitter oder Neuromodulator aus den synaptischen Enden nozizeptiver afferenter Neuronen, die in diesem Bereich der Wirbelsäule enden, inhibieren kann.
Gemäß einem zweiten Aspekt der Erfindung, ist ein Mittel bereitgestellt, das spezifisch auf definierte Populationen afferenter Neuronen gerichtet sein kann, so dass die Wirkung des Mittels auf diese Zellart beschränkt ist.
Gemäß einem dritten Aspekt der Erfindung, wird die Verwendung eines, wie oben beschriebenen, Mittels bereitgestellt, für die Herstellung eines Medikamentes für die Behandlung von Schmerz.
Gemäß einem vierten Aspekt der Erfindung, kann das Mittel rekombinant exprimiert werden als ein Fusionsprotein, welches die benötigten Komponenten des Agens einschließt.
Definitionen
Ohne zu wünschen, auf die niedergelegten Definitionen beschränkt zu werden, wird in dieser Beschreibung beabsichtigt, dass die folgenden Begriffe die folgenden Bedeutungen haben:
Mit leichter Kette ist die kleinere der beiden Polypeptidbestandteile jedes Clostridien-Neurotoxins gemeint. Es wird darauf allgemein Bezug genommen durch L-Kette oder einfach L. Eine L-Kette hat eine molekulare Masse von ungefälir 50 kDa und es ist eine Metalloprotease, die eine hohe Substratspezifität für Vesikel und/oder Plasmamembran assoziierte Proteine, die in den exozytotischen Prozess involviert sind, ausübt.
Mit schwerer Kette ist die größere der beiden Polypeptidbestandteile jedes Clostridien-Neurotoxins gemeint. Es wird darauf allgemein Bezug genommen durch H-Kette oder einfach H, und hat eine molekulare Masse von ungefähr 100 kDa.
Mit H_C-Fragment ist ein Peptid gemeint, das abgeleitet ist von der H-Kette eines Clostridien-Neurotoxins, welches verantwortlich ist für die Bindung des natürlichen Gesamttoxins an Zelloberflächenakzeptor(en), die beteiligt sind an der vergiftenden Wirkung von Clostridien-Neurotoxin vor der Aufnahme des Toxins in die Zelle. Es kann ungefähr äquivalent sein mit der carboxyterminalen Hälfte der H-Kette oder der Domäne, die jenem Fragment in der intakten H-Kette entspricht.
Mit H_N-Fragment ist ein Fragment gemeint, das abgeleitet ist aus der H-Kette eines Clostridien-Neurotoxins, und das ungefähr äquivalent ist mit der aminoterminalen Hälfte der H-Kette, oder der Domäne, die jenem Fragment in der intakten H-Kette entspricht. Es ist gekennzeichnet als:
Ein Teil der H-Kette, die die Verlagerung jenes Teils des Neurotoxin-Moleküls ermöglicht, so dass eine funktionelle Expression der Aktivität der leichten Kette innerhalb einer Zielzelle erfolgt.
Die Domäne, die verantwortlich ist für die Verlagerung der Endopeptidase-Aktivität in die Zielzelle, gefolgt von der Bindung des Neurotoxins an seinen spezifischen Zelloberflächenrezeptor über die Bindedomäne.
Die Domäne, die verantwortlich ist für die Bildung von ionenpermeablen Poren in Lipidmembranen unter den Bedingungen eines niedrigen pH.
Die Domäne, die verantwortlich ist für die Erhöhung der Löslichkeit des gesamten Polypeptids, im Vergleich mit der Löslichkeit der leichten Kette alleine.
Mit LH_N ist ein Fragment gemeint, das abgeleitet ist aus einem Clostridien-Neurotoxin, das die L-Kette oder ein funktionelles Fragment davon enthält, welche gekoppelt ist an ein H_N-Fragment.
Mit BoNT/A ist Botulinum-Neurotoxin Serotyp A gemeint, und es ist ein Neurotoxin, das durch Clostridium botulinum erzeugt wird; es hat eine molekulare Masse von ungefähr 150 kDa.
LH_N/A ist LH_N, das abgeleitet ist aus Clostridium botulinum Neurotoxin Typ A.
Mit Zielkomponente (TM) ist jede chemische Struktur eines Agens gemeint, die mit einer Bindungsstelle funktionell in Wechselwirkung tritt, wodurch eine physikalische Verbindung zwischen dem Agens und der Oberfläche eines primären, sensorischen afferenten Neurons bewirkt wird.
Primäres, sensorisches afferentes Neuron ist eine Nervenzelle, die sensorische Information von der Peripherie zum Zentralnervensystem tragen kann.
Primäres, sensorisches afferentes Neuron ist eine Nervenzelle, die sensorische Information von der Peripherie zum Zentralnervensystem tragen kann, wo die Information in einer Schmerzempfindung resultieren kann.
Lectin ist jedes Protein, das an Oligosaccharidstrukturen bindet.
Galatose bindendes Lectin ist ein Lectin, das an Oligosaccharidstrukturen bindet, bei denen der terminale Rest abgeleitet ist von Galactose oder N-Acetylgalactosamin.
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
Aus dieser Beschreibung kann ersehen werden, dass ein Agens zur Reduzierung oder Verhinderung der Weiterleitung von Schmerzsignalen von peripheren, nozizeptiven afferenten Neuronen an Projektionsneuronen viele möglichen Anwendungen bei der Reduktion der Schmerzempfindung, insbesondere von schwerem, chronischem Schmerz, findet.
Lectine sind eine Proteinklasse, oftmals Glykoproteine, die an Kohlenwasserstoffstrukturen binden. Lectine werden über den gesamten Bereich an Lebensformen, von Viren bis zu Säugern gefunden. Die allgemein am häufigsten verwerteten Quellen sind die im Übeimaß vorhandenen Lectine, die in den Samen von Pflanzen gefunden werden. Lectine wurden kürzlich als Zelloberflächenmarker markiert und verwendet.
Gemäß der Erfindung wird ein Mittel bereitgestellt, das die Freisetzung von wenigstens einem Neutrotransmitter oder Neuromodulator oder von beiden aus den synaptischen Enden nozizeptiver afferenter Neuronen inhibieren kann.
Es ist bekannt, dass solch ein Mittel hergestellt werden kann, basierend auf der Verwendung von Fragmenten von Clostridien-Neurotoxin konjugiert an einen Zielliganden (WO96/33273). Ausgehend von der bekannten Komplexität des intrazellulären Transportes und der Beschränkungen von Konstrukterfordernissen, ist es überraschend, dass Konjugate aus Toxinfragmenten und einer spezifischen Unterklasse an Lectinen, die nur an Galactosylreste binden, Agenzien bilden, um Schmerzmittel herzustellen, die besonders wirksam und selektiv sind. Erfindungen, die solche Lectine einbauen, sind der Gegenstand dieser Offenbarung und zahlreiche Beispiele werden bereitgestellt.
Ein Beispiel einer Klasse an von Pflanzen abgeleiteten, Galactose bindenden Lectinen sind jene, die gereinigt werden können aus den Samen der Art Erythrina. Diese Lectine wurden charakterisiert dahingehend, dass sie vorwiegend als nicht-kovalente, dimere Proteine existieren, mit Gesamtmolekulargewichten von ungefähr 60 kDa. Lectine wurden aus zahlreichen Erythrina-Arten isoliert, einschließlich: E. corallodendron (Gilboa-Garber und Mizrahi, 1981, Can. J. Biochem. 59, 315–320), E. christagalli (Iglesias et al., 1982, Eur. J. Biochem. 123, 247–252), E. indica (Horejsi et al., 1980, Biochim. Biophys. Acta 623, 439-448), E. arborescens, E. suberosa, E. lithosperma (Bhattacharyya et al., 1981, Archiv. Biochem. Biophys. 211, 459–470) E. caffra, E. flabelliformis, E. latissima, E. lysistemon, E. humeana, E. perrieri, E. stricta und E. zeyhei (Lis et al., 1985, Phytochem. 24, 2803-2809).
Diese Lectine sind analysiert worden auf ihre Selektivität für die Bindung von Sacchariden (siehe z. B. Kaladas et al., 1982, Archiv. Biochem. Biophys. 217, 624–637). Man fand, dass sie vorzugsweise an Oligosaccharide mit einem terminalen β-D-Galactosyl-Rest binden.
Ein zweites Beispiel eines aus Pflanzen erhältlichen, Galactose bindenden Lectins mit der gewünschten Bindungsspezifität kann aus Glycine max (Soja) Bohnen gewonnen werden. Dieses Lectin (Sojabohnenagglutinin, SBA) ist ein tetrameres Protein mit einem Gesamtmolekulargewicht von ungefähr 110 kDa. Es bindet an Oligosaccharide, die Galactose- oder N-Acetylgalactosaminreste enthalten.
Ein Beispiel eines Galactose bindenden Lectins aus Bakterien ist PA-I, gewonnen von Pseudomonas aeruginosa. PA-I ist ein Lectin mit einer Affinität für D-Galactose mit einem Molekulargewicht von ungefähr 13 kDa, und es bindet an Galactose enthaltende Oligosaccharide (Gilboa-Garber und Mizrahi, 1981, Can. J. Biochem. 59, 315–320).
Diese und andere Lectine der Unterklasse der Galatose bindenden Lectine, können als Zielkomponenten (TM) für Konjugate des in WO96/33273 beschriebenen Typs verwendet werden. Die Erfordernisse für TMs in diesen Mitteln sind, dass sie eine Spezifität für die primären, sensorischen afferenten Neuronen gegenüber anderen Rückenmarksnerven zeigen und dass sie zu der Aufnahme der Mittel in ein geeignetes intrazelluläres Kompartiment führen. Die Lectine dieser Erfindung erfüllen diese Kriterien. Überraschenderweise können sie diese Kriterien im Vergleich zu anderen Lectinen aus WO96/33273 wirksamer erfüllen, und können Mittel mit gesteigerter Selektivität für die nozizeptive afferente Neurosekretion bereitstellen.
Folglich wird gemäß einem Ausführungsbeispiel der Erfindung ein Galactose bindendes Lectin unter Verwendung von Bindungen, die eine oder mehrere Spacerbereiche einschließen können, mit einem Derivat der Clostridien-Neurotoxine konjugiert.
Gemäß einem weiteren Ausführungsbeispiel der Erfindung wird das Mittel in einer rekombinanten Form als ein Fusionsprotein exprimiert. Das Fusionsprotein kann aus Nukleinsäure erhalten werden, die ein geeignetes Fragment eines Galactose bindenden Lectins kodiert, zusätzlich zu jeglichen gewünschten Spacerdomänen, wobei die Nukleinsäure alle oder einen Teil eines Polypeptids eines Serotyps des Neutrotoxins kodiert. Eine solche Nukleinsäure kann eine Chimäre sein, die aus der Nukleinsäure, die Polypeptide von mehr als einem Serotyp kodiert, erhalten wird.
In einem weiteren Ausführungsbeispiel der Erfindung wird das benötigte LH_N, das ein Hybrid aus einer L und einer H_N von unterschiedlichen Clostridien-Toxin-Serotypen sein kann, als ein rekombinantes Fusionsprotein mit dem Galactose bindenden Lectin exprimiert, und kann auch eine oder mehrere Spacerbereiche einschließen.
In einem weiteren Ausführungsbeispiel der Erfindung können die benötigten TM, L oder LH_N und Translokationsdomänen-Komponenten getrennt in einer rekombinanten Form exprimiert werden und anschließend kovalent oder nicht-kovalent gekoppelt werden, um das gewünschte Mittel bereitzustellen.
In einem weiteren Ausführungsbeispiel der Erfindung kann die benötigte Translokationsdomäne einen nicht-clostridialen Ursprung haben, und kann statt dessen ein Peptid oder eine andere Einheit, die zu ähnlicher oder gesteigerter Funktion fähig ist, enthalten. Beispiele würden einschließen, aber wären nicht beschränkt auf die Translokationsdomäne von Diphtherietoxin (O'Keefe et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1992) 89, 6202–6206; Silverman et al., J. Biol. Chem. (1993) 269, 22524–22532), die Translokationsdomäne von Pseudomonns Exotoxin Typ A (Prior et al. Biochemistry (1992) 31, 3555–3559), die Translokationsdomänen von Anthraxtoxin (Blanke et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1996) 93, 8437–8442) und eine Reihe an fusogenen oder hydrophoben Peptiden mit translozierender Funktion (Plank et al. J. Biol. Chem. (1994) 269, 12918–12924).
Industrielle Verwertung
Das in dieser Erfindung beschriebene Mittel kann in vivo, entweder direkt oder als ein pharmazeutisch annehmbares Salz, zur Behandlung von Schmerz verwendet werden.
Zum Beispiel kann ein Mittel gemäß der Erfindung durch Rückenmarksinjektion (epidural oder intrathekal) in der Höhe des Rückenmarkssegmentes verabreicht werden, das bei der Innervierung eines angegriffenen Organs für die Behandlung von Schmerz involviert ist. Dieses ist z. B. anwendbar bei der Behandlung von tiefliegendem Gewebeschmerz, wie z. B. chronischem malignem Schmerz.
Die vorliegende Erfindung wird nun durch Bezugnahme auf die folgenden Beispiele beschrieben werden, gemeinsam mit den Figuren, die das Folgende zeigen:
1: SDS-PAGE-Analyse von Fraktionen nach dem ExL-LH_N/A-Aufreinigungsschema
2: Abspaltung von SNAP-25 durch ExL-LH_N/A
3: SDS-PAGE-Analyse von Fraktionen nach dem EcL-LH_N/A-Aufreinigungsschema
4: SDS-PAGE-Analyse von Fraktionen nach dem SBA-LH_N/A-Aufreinigungsschema
5: Analyse von ExL- und SPA-LH_N/A mit nativem Gel
6: Aktivität von ExL-LH_N/A auf das Freisetzen von Neurotransmittern aus eDRG- und eSC-Neuronen
7: Aktivität von SBA-LH_N/A auf das Freisetzen von Neuiotransmittern aus eDRGund eSC-Neuronen
8: Aktivität von WGA-LH_N/A auf das Freisetzen von Neurotransmittern aus eDRGund eSC-Neuronen
9: Aktivität von ExL-LH_N/A in einem elektrophysiologischen in vivo-Analgesiemodell
10: Aktivität von ExL-LH_N/A in einem in vivo-Verhaltensmodell der Analgesie
Beispiel 1: Die Herstellung eines Konjugates aus einem Lectin aus Erythrina
cristagalli und LH_N/A
Materialien
Lectin aus E. cristagalli (ExL) wurde erhalten von Sigma Ltd. LH_N/A wurde zubereitet im Wesentlichen durch das Verfahren von Shone C.C., Hambleton, P., und Melling, J. 1987, Eur. J. Biochem. 167, 175–180.
SPDP war von Pierce Chemical Co.
PD-10 Entsalzungssäulen waren von Pharmacia.
Dimethylsulphoxid (DMSO) wurde durch Lagerung über einem Molekularsieb wasserfrei gehalten.
Denaturierende Natriumdodecylsulphat-Polyacrylamidgelelektrophorese (SDS-PAGE) wurde durchgeführt unter Verwendung von Gelen und Reagenzien von Novex.
Immbilisierte Lactose-Agarose wurde erhalten von Sigma Ltd.
Weitere Reagenzien wurden erhalten von Sigma Ltd.
Methode
Das lyophilisierte Lectin wurde in phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) auf eine Endkonzentration von 10 mg/ml rehydriert. Aliquote dieser Lösung wurden bei –20 °C bis zur Verwendung gelagert.
Das ExL wurde mit einer identischen Konzentration an SPDP durch die Zugabe einer 10 mM Stammlösung von SPDP in DMSO unter Mischen reagiert. Nach einer Stunde bei Raumtemperatur wurde die Reaktion durch Entsalzen in PBS über einer PD-10-Säule beendet.
Die austretende Thiopyridongruppe wurde aus dem Produkt entfernt durch Reduktion mit Dithiothreitol (DTT, 5 mM, 30 min.). Das Produkt dieser Reaktion wurde spektrophotometrisch bei 280 nm und 343 nm analysiert, um den Grad der erreichten Derivatisierung zu bestimmen. Der Grad der erreichten Derivatisierung war 0,8 ± 0,06 mol/mol. Das Thiopyridon und DTT wurden durch nochmaliges Entsalzen in PBS über einer PD-10-Säule entfernt.
Das LH_N/A wurde in PBSE (PBS, das 1 mM EDTA enthält) entsalzt. Die resultierende Lösung (0,5–1,0 mg/ml) wurde mit einem 4- oder 5-fachen molaren Überschuss an SPDP durch Zugabe einer 10 mM Stammlösung von SPDP in DMSO reagiert. Nach 3 h bei Raumtemperatur wurde die Reaktion durch Entsalzen über einer PD-10-Säule in PBS beendet.
Ein Teil des derivatisierten LH_N/A wurde aus der Lösung entfernt und mit DTT (5mM, 30 min.) reduziert. Diese Probe wurde spektrophotometrisch bei 280 mm und 343 nm analysiert, um den Grad der Derivatisierung zu bestimmen. Der Grad der erreichten Derivatisierung war 2,26 ± 0,10 mol/mol.
Die Masse des derivatisierten LH_N/A und des derivatisierten ExL wurden gemischt in Verhältnissen dergestalt, dass das ExL in mehr als dreifachem molaren Überschuss war. Man ließ die Konjugationsreaktion für >16 h bei 4 °C fortschreiten.
Die Produktmischung wurde zentrifugiert, um jegliches Präzipitat, das sich entwickelt hat, zu entfernen. Der Überstand wurde durch Zentrifugation durch Eindicker (mit einer Ausschlussgrenze 10.000–50.000 Molekulargewicht) konzentriert, vor einer Zweischritt-Reinigungsstrategie. Als der erste Schritt wurde das konzentrierte Material auf eine Superose 12-Säule aufgetragen in einem FPLC-Chromotographiesystem (Pharmacia). Die Säule wurde mit PBS eluiert und das Elutionsprofil folgte bei 280 nm.
Die Fraktionen wurden analysiert durch SDS-PAGE auf 4–20% Polyacrylamidgradientengelen, gefolgt von einer Färbung mit Coomassie Blau. Die Hauptbande des Konjugates hatte eine scheinbare molekulare Masse von zwischen 130-160 kDa; dies ist gesondert von der Masse des verbleibenden unkonjugierten LH_N/A und noch vollständiger von dem unkconjugierten ExL. Die Fraktionen, die Konjugat enthalten, wurden vor dem zweiten Chromatographieschritt vereinigt; immobilisiert auf Lactose-Agarose. Ausgewählte post-Superose-12-Fraktionen wurden aufgetragen auf PBSgewaschene Lactose-Agarose und inkubiert für 2 Stunden bei 4°C, um die Bindung zu erleichtern. Lectin enthaltende Proteine (d. h. ExL- LH_N/A-Konjugate) verblieben an die Agarose gebunden während dem nachfolgenden Waschen mit PBS, um Verunreinigungen (vorwiegend unkonjugiertes LH_N/A) zu entfernen. ExL- LH_N/A-Konjugate wurden von der Säule eluiert durch die Zugabe von 0,3 M Lactose (in PBS) und das Elutionsprofil folgte bei 280 nm. Die Konjugat enthaltenden Fraktionen wurden vereinigt, gegen PBS dialysiert und bei 4°C bis zur Verwendung gelagert.
In 1 ist das SDS-PAGE-Profil während unterschiedlicher Stadien in dem Konjugataufreinigungsschema dargestellt. Die Spuren 2 und 3 zeigen ExL-Lectin bzw. LH_N/A- vor der Konjugation. Die Spuren 4, 5 und 6 repräsentieren die Konjugationsmischungs-, post-Superose-l2- bzw. post-Lactose-Affinitätschromatographieproben. Die Spur 6 ist deswegen bezeichnend für das Profil des Endkonjugatmaterials. Molekulargewichtsmarker sind wiedergegeben in den Spuren 1 und 7, mit Größen, die in der Figur angegeben sind.
Auf dem SDS-PAGE-Gel gibt es Banden, die wegen dem Lectin nur in Fraktionen vorhanden sind, die Konjugat enthalten, dieses Material ist möglicherweise der nichtkovalenten, homo-dimeren Art des ExL zu verdanken; wo nur ein Monomer von ExL kovalent an das LH_N/A geheftet ist, während das andere aus dem Komplex dissoziiert ist durch SDS während dem elektrophoretischen Vorgang, wodurch diesen Banden einen Anstieg erfuhren. Die Abwesenheit freier Lectinmonomere wurde durch native PAGE-Analyse bestätigt und ist in 5 dargestellt. ExL- LH_N/A (Spur 5) wurde durch nichtdenaturierende PAGE analysiert. Die Proben wurden unter Verwendung von 4–20 Polyacrylamidgel für 6,75 Stunden, 125 V, 4°C getrennt. Die Elektrophoreseprofile wurden mit jenen von LH_N/A (Spur 3) und nur ExL-Lectin (Spur 4) verglichen. Eine Reihe an Markenproteinen wurden seitlich analysiert; Apoferritin (Spur 6), β-Amylase (Spur 8), Alkoholdehydrogenase (Spur 7) und Albumin (Spur 9). Ungefähre Molekulargrößen sind angezeigt.
Beispiel 2: Die Herstellung eines Konjugates aus einem Lectin aus Erytlrina corallodendron und LH_N/A
Das Verfahren zur Herstellung eines Konjugates zwischen einem Lectin aus Erythrina corallodendron und LH_N/A ist im Wesentlichen, wie beschrieben im Beispiel 1, jedoch weist es die folgenden Unterschiede auf:
Materialien
Lectin aus E. corallodendron (EcL) wurde erhalten von Sigma Ltd.
3 stellt das Aufreinigungsschema für das EcL- LH_N/A-Konjugat dar. Die Proben wurden auf 4–20% Polyacrylamidgradientengele aufgetragen und der Elektrophorese ausgesetzt vor der Färbung mit Coomassie Blau. Spur 1 = Molekulargewichtsmarker. Spur 2 repräsentiert die post-Lactose affinitätsgereinigte Probe von EcL- LH_N/A. Spur 3 ist eine Probe von prä-Lactose affinitätsgereinigtem (nur Größenaussch.lusschromatographie) EcL-LH_N/A. Spur 4 ist eine Probe von prä-Lactose affinitätsgereinigtem ExL- LH_N/A.
Beispiel 3: Die Herstellung eines Konjugates aus einem Lectin aus Glycine max und LH_N/A
Das Verfahren zu Herstellung eines Konjugates aus einem Lectin aus Glycine max und LH_N/A ist im Wesentlichen, wie beschrieben im Beispiel 1, es weist jedoch die folgenden Unterschiede auf:
Materialien
Lectin aus G. max (SBA) wurde erhalten von Sigma Ltd.
Methode
Für den Affinitätschromatographieschritt wurde eine immobilisierte N-Acetylgalactosamin (GalNAc) Säule verwendet und es wurde spezifisch SBA- LH_N/A eluiert durch die Zugabe von 0,3M Lactose. 4 stellt SDS-PAGE-Profiländerungen im Laufe des Aufreinigungsschemas für SBA- LH_N/A dar. SBA- LH_N/A wurde aufgereinigt aus der rohen Konjugatmischung durch Superose-12 Größenausschlusschromatographie und immobilisierte N-Acetylgalctosamin-Affinitätschromatographie. Die Proben wurden der SDS-PAGE auf 4–20% Polyacrylamidgelen unterzogen. Die Spuren 6–8 ließ man laufen in der Anwesenheit von 0,1 M DTT. Die Spuren 1 (&7) und 2 (&8) zeigen SBA bzw. SPDP-derivatisiertes LH_N/A vor der Konjugation. Die Spuren 3, 4 & 5 (&6) repräsentieren Konjugationsmischung, post-Superose-l2- bzw. post-Affinitätschromatographieproben. Die Spur 5 ist deswegen kennzeichnend für das Profil des endgültigen Konjugatmaterials. Molekulargewichtsmarker sind in den Spuren Mr wiedergegeben mit Größen, die in der Figur gezeigt sind.
Die Abwesenheit freier Lectinmonomere wurde durch native nicht-denaturierende PAGE-Analyse bestätigt, wie in 5 dargestellt. Die Proben wurden unter Verwendung von 4-20% Polyacrylamidgel für 6,75 Stunden, 125 V, 4°C getrennt. Das Elektrophoreseprofil von SBA- LH_N/A (Spur 1) wurde mit jenem von ausschließlich SBA-Lectin (Spur 2) und LH_N/A (Spur 3) verglichen. Eine Reihe an Markenproteinen wurde seitlich analysiert; Apoferritin (Spur 6), β-Amylase (Spur 8), Alkoholdehydrogenase (Spur 7) und Albumin (Spur 9). Ungefähre Molekulargrößen sind angezeigt.
Beispiel 4: Aktivität von ExL- LH_N/A in primären neuronalen Kulturen
Die Spinalganglien enthalten die Zellkörper von primären, nozizeptiven afferenten Neuronen. Es ist gut nachgewiesen, dass in primären in vitro Kulturen dieses Gewebes, die Neuronen viele der Eigenschaften der nozizeptiven afferenten Neuronen beibehalten. Diese Eigenschaften schließen die Fähigkeit ein, Neuropeptide wie z. B. Substanz P in Antwort auf chemische Reize, von denen bekannt ist, dass sie. in vivo Schmerz verursachen (z. B. Capsaicin), freizusetzen. Die Neuronen, die anatomisch benachbart sind zu jenen des DRG, schließen jene des Rückmarks ein. Kulturen von SC-Neuronen, die aus embryonalen Ratten präpariert wurden, können in vitro etabliert werden und die Freisetzung von Neurotransmitter (³H-Glycin) auf die Stimulation mit Kalium, kann bewertet werden. Als solche, stellen die eSC-Neuronen eine Modellzelle für die Untersuchung der Selektivität der beschriebenen Mittel dar.
Die Selektivität des ExL- LH_N/A-Agens für eDRG- gegenüber eSC-Neuronen ist deutlich dargestellt in 6. Die Dosiskurven dokumentieren die Wirksamkeit von ExL- LH_N/A in einem in vitro Zellkulturmodell durch Vergleichen der Inhibition der Neurotransmission in eDRG- mit eSC-Neuronen.
Materialien
Substanz P enzymgekoppelte Immunadsorptionsbestimmungskits waren von Cayman Chemical Company.
Western blot-Reagenzien wurden erhalten von Novex.
Monoklonaler Antikörper SMI-81 war von Sternberger Monoclonals Inc.
Methoden
Primärkulturen von Spinalgaglionneuronen und embryonalen Rückenmarksneuronen wurden etabliert nach der Dissoziation der Ganglien, die präpariert wurden aus Rattenembryonen (embryologisches Alter 12–15 Tage). Für die Präparation von eDRG-Neuronen, wurden die Zellen in 12 well-Platten in einer anfänglichen Dichte von 3 × 10⁵ Zellen/well in einem Medium, das NGF (100 ng/ml) enthält, ausplattiert. Nach einem Tag in Kultur wurde frisches Medium, das Cytosinarabinosid (10 × 10⁶ M) enthält, hinzugefügt, um nicht-neuronale Zellen abzutöten. Nach 2–4 Tagen wurde Cytosinarabinosid entfernt. Nach etlichen weiteren Tagen in Kultur wurde das Medium durch frisches Medium ersetzt, das Konjugat oder LH_N enthielt.
Für die Präparation von eSC-Neuronen wurden Zellen auf Poly-D-Lysin überzogenen 12-well-Platten (Costar) ausplattiert in einer Dichte von 2 × 10⁶ Zellen pro well (1 ml/well). „Ausplattiermedium" war MEM mit Earles-Salzen (Sigma), das 5% fötales Kälberserum (FBS), 5% hitzeinaktiviertes Pferdeserum (HS), 0,6% Dextrose, 1,5 g/l NaHCO₃ und 2 mM L-Glutamin enthielt. Die Kulturen wurden bei 37°C mit 10% CO₂ inkubiert. Das Medium wurde nach einem Tag gewechselt auf „Fütterungsmedium" (Ausplattiermedium abzüglich dem FBS mit N1 (Sigma) 1/50 Zusatz). Wenn Gliazellen nahezu konfluierend wurden, wurden antimitotische Agenzien (15 Mikrogramm/m15-Fluoro-2-deoxyuridin (FdU) und 35 Mikrogramm/ml Uridin (U)) hinzugefügt für weitere 2–3 Tage. Die Zellen wurden für wenigstens 3 Wochen vor der Verwendung kultiviert.
Die Zellen wurden mit diesen Agenzien für unterschiedliche Zeiten inkubiert und dann auf ihre Fähigkeit, die Neurotransmitter Glutamat und Substanz P (eDRG) oder Glycin (eSC) freizusetzen, untersucht. Nachdem die Freisetzungsassays durchgeführt worden waren, wurden die Zellen lysiert und die hydrophoben Proteine wurden extrahiert durch Phasentrennung mit Triton-X-114, wobei dem in Boyd, Duggan, Shone und Foster (J. Biol. Chem. 270, 18216–18218, 1995) skizzierten Verfahren gefolgt wurde.
Substanz P – Freisetzungsassay
Die Freisetzung von endogener Substanz P wurde bewirkt durch Sammeln von Zellüberständen nach Behandlung der Zellen für 5 min mit enriveder einer physiologischen balancierten Salzlösung oder einer balancierten Salzlösung, in der die Kaliumionenkonzentration angehoben worden war auf 100 mM mit sich daraus ergebender Reduktion der Natriumionenkonzentration, um die Isotonie aufrechtzuerhalten. Gesamt-Substanz P wurde nach der Extraktion in 2 M Essigsäure, 0,1% Trifluoressigsäure und anschließender Dehydrierung gemessen. Substanz P-Immunreaktivität wurde unter Verwendung eines Enzym-Immunassaykits (Cayman Chemical Company) gemessen.
[³H]-Glutamat-Freisetzungsassay
Die Freisetzung von Glutamat wurde gemessen, nachdem die Zellen mit [³H]-Glutamin als einem Radioindikator beladen worden waren. [³H]-Glutamin wird in der Zelle zu [³H]-Glutamat konvertiert, und es ist dieses [³H]-Glutamat, das aufgenommen wird durch synaptische Vesikel und das nach der Depolarisierung des Neurons freigesetzt wird. Die Zellen werden mit dem [³H]-Glutamin (5 × 10^–6 Ci/ml in HEPES gepufferter MEM) für 2 h beladen, dann zweimal gewaschen mit HEPES gepufferter MEM und dreimal mit balancierter Salzlösung (BSS). Die basale Freisetzung wurde durch eine 3 minütige Inkubation mit BSS abgeschätzt. Die stimulierte Freisetzung wurde durch eine 3 minütige Inkubation mit BSS bestimmt, bei der die Kaliumkonzentration erhöht worden war auf 80-100 mM, mit einer sich daraus ergebenden Reduktion der Natriumkonzentration, um die Isotonie zu wahren. Alle Manipulationen wurden bei 37 °C durchgeführt. Die Zellen wurden durch die Zugabe von Triton-X-100 (0,1%, v/v) lysiert. Für die basalen und simulierten Freisetzungssuperfusate wurde das Glutamat von dem Glutamin durch Ionen-Austauschchromotographie über Dowex-1-Harz abgetrennt. Die relevanten Fraktionen wurden analysiert auf ihren ³H-Gehalt durch Flüssigkeitsszintillationsmessung.
[³H]-Glycin-Freisetzungsassay
Die Freisetzung von Glycin wurde gemessen nachdem die Zellen mit [³H]-Glycin als einem Radioindikator beladen worden waren. [³H]-Glycin wird aufgenommen durch synaptische Vesikel und wird nach der Depolarisierung des Neurons freigesetzt. Die Zellen werden mit dem [³H]-Glycin (2 × 10⁶ Ci/ml in HEPES gepufferter MEM) für 2 Stunden beladen, dann einmal mit HEPES gepufferter MEM gewaschen und dreimal mit balancierter Salzlösung (BSS). Die basale Freisetzung wurde durch eine 5 minütige Inkubation mit BSS abgeschätzt. Die stimulierte Freisetzung wurde durch eine 5 minütige Inkubation mit BSS bestimmt, bei der die Kaliuinkonzentration erhöht worden war auf 56 mM, mit einer sich daraus ergebenden Reduktion der Natriumkonzentration, um die Isotonie zu wahren. Sämtliche Manipulationen wurden bei 37°C. durchgeführt Die Zellen wurden durch die Zugabe von 2 M Essigsäure, 0,1% Trifluoressigsäure lysiert. Die Fraktionen wurden auf ihren ³H-Gehalt analysiert durch Flüssigkeitsszintillationsmessung, und die Inhibition der Freisetzung wurde bestimmt.
6 erläutert die Aktivität von E×L-LH_N/A auf die Freisetzung von Neurotransmitter aus eDRG- und eSC-Neuronen. Sowohl eDRG- als auch eSC-Kulturen wurden einem Bereich an E×L-LH_N/A-Konzentrationen (1 ml Volumina) für drei Tage ausgesetzt. Die prozentuale Inhibition der eDRG-Substanz P (n) und eSC ³H-Glycin (?) Freisetzung ergibt sich aus dem Vergleich mit unbehandelten Kontrollen. Die gezeigten Daten sind repräsentativ für =3 Bestimmungen. IC₅₀ für eDRG wurde bestimmt auf 3,66 ± 0,92 μg/ml. Eine Inhibition von 50% wurde für eSC unter Verwendung des angewandten Konzentrationsbereichs nicht erhalten.
Western blotting
ExL-LH_N/A wurde eDRG für 16 Stunden verabreicht. Nach der Bestimmung der Neurotransmitterfreisetzung wurden die Zellen durch die Zugabe von 2 M Essigsäure, 0,1 % Trifluoressigsäure lysiert und anschließend dehydriert. Um die Membranproteine von diesen Mischungen zu extrahieren, wurde Triton-X-114 (10%, v/v) hinzugefügt und bei 4 °C für 60 min inkubiert, wobei das unlösliche Material entfernt wurde durch Zentrifugation und die Überstände dann auf 37°C für 30 min erwärmt wurden. Die resultierenden zwei Phasen wurden durch Zentrifugation getrennt und die obere Phase wurde verworfen. Die Proteine in der unteren Phase wurden mit Chloroform/Methanol für die Analyse durch Western blotting gefällt.
Die extrahierten Proteinproben wurden auf 4–20% Polyacrylamidgradientengele aufgetragen und der Elektrophorese ausgesetzt vor dem Übertragen auf Nitrocellulose. Die Proteolyse von SNAP-25, einem entscheidenden Bestandteil des neurosektretorischen Vorgangs und das Substrat für die zinkabhängige Endopeptidaseaktivität von BoNT/A, wurde dann durch Sondieren mit einem Antikörper (SMI-81) detektiert, der sowohl die intakten als auch die gespaltenen Formen von SNAP-25 (2) wiedererkennt. Die auf Nitrocellulose geblotteten Proteine wurden mit Antikörper SMI-81 sondiert. Die Spuren 1– 3, 4–6, 7–9 und 10–12 repräsentieren Zellen, die mit Medium, 40 Mikrogramm/ml ExL, 20 Mikrogramm/ml ExL bzw. 40 Mikrogramm/ml LH_N/A behandelt wurden. Die densitometrische Analyse dieser Daten bestimmte die prozentuale SNAP-25-Spaltung auf 52,7% bzw. 37,0% für 40 bzw. 20 Mikrogramm/ml.
Beispiel 5: Aktivität von SBA-LH_N/A in primären neuronalen Kulturen
Unter Verwendung der in Beispiel 4 beschriebenen Methode, wurde die Aktivität von SBA-LH_N/A in primären neuronalen Kulturen abgeschätzt. Die Selektivität des SBA-LH_N/A Konjugates für eDRG- gegenüber eSC-Neuronen ist in 7 dargestellt. Sowohl eDRG- als auch eSC-Kulturen wurden einer Reihe an SBA-LH_N/A-Konzentrationen (1 ml Volumina) für drei Tage ausgesetzt. Die prozentuale Inhibition der eDRG Substanz P (n) und eSC [³H]-Glycin (0) Freisetzung ergibt sich aus dem Vergleich mit unbehandelten Kontrollen. Die Daten sind die Mittelwerte von drei Bestimmungen ± SE. Die gezeigten Kurven sind repräsentativ für zwei Experimente. Die IC₅₀-Werte für eDRG-Neuronen wurden auf 1,84 und 7,6 Mikrogramm/ml bestimmt. Es wurde beobachtet, dass SBA-LH_N/A eine deutliche Selektivität der Inhibition der Neurotransmitterfreisetzung aus eDRG- im Vergleich zu eSC-Neuronen ausübt. Diese Daten bestätigen demzufolge die für ExL-LH_N/A oben beschriebenen Beobachtungen und unterstreichen die Eigenschaften Galactose spezifischer Lectine.
Beispiel 7: Aktivität von WGA-LH_N/A in primären neuronalen Kulturen
Unter Verwendung der in Beispiel 4 beschriebenen Methode, wurde die Aktivität von WGA-LH_N/A in primären neuronalen Kulturen abgeschätzt. WGA repräsentiert ein Beispiel eines nicht auf Galactosyl gerichteten Lectins und dient deswegen als ein Indikator der Eigenschaften des Konjugates, das keine Galactosylanteile erkennt. Das Fehlen der Selektivität des WGA-LH_N/A-Konjugates für eDRG- gegenüber eSC-Neuronen ist in 8 dargestellt. eDRG- und eSC-Neuronen wurden einer Reihe an Konzentrationen von WGA-LH_N/A für drei Tage ausgesetzt vor dem Ansatz des stimulierten Freisetzens von Neurotransmitter (Substanz P bzw. Glycin). Jede Konjugatkonzentration wurde dreifach abgeschätzt und. die Ergebnisse sind als prozentuale Inhibition im Vergleich zu unbehandelten Kontrollen ausgedrückt. Die Diagramme A und B bilden Dosis-Wirkung-Kurven aus einem Experiment ab, die repräsentativ sind für μ 3 für eDRG- bzw. eSC-Neuronen. Jeder gezeigte Punkt ist der Mittelwert von drei Bestimmungen ± SE des Mittelwerts. IC₅₀-Daten für die Wirkungen von WGA-LH_N/A wurden bestimmt auf 0,34 ± 0,06 Mikrogramm/ml (eDRG) und 0,06 f 0,09 Mikrogramm/ml (eSC), was das Fehlen der C-Faser-Selektivität anzeigt.
Beispiel 8: Aktivität von ExL-LH_N/A in einem elektrophysologischen Schmerzmodell
Eine Dosis von 45 Mikrogramm ExL-LH_N/A in einem Vehikel-Volumen von 10 Mikroliter wurde durch die intrathekale Injektion in Ratten zwischen den lumbalen Bereichen L4–L5, 24 Stunden vor der elektrophysilogischen Analyse der neuronalen Aktivität gegeben. Den Tieren wurde ermöglicht, sich zu erholen, und die Bewegungsfreiheit wurde vor der Schlachtung und Analyse nicht eingeschränkt. Die Ergebnisse aus einer Gruppe von 3 Tieren, bei denen pro Tier 10 Neuronen aufgenommen wurden, zeigen, dass eine 73%ige Reduktion in den C-Faser-Antworten der Neuronen vorhanden war (9A), obwohl die Reizschwelle nur leicht erhöht ist (9B). Inhibition der C-Faser-Antworten würde zu einer Abnahme in der Weiterleitung der Schmerzsignale führen und diese Daten sind kennzeichnend für die analgetische Wirkung des Konjugates E×L-LH_N/A. Es gab auch eine signifikante Abnahme in der A₆-Antwort (9C). Diese Fasern sind auch an der Weiterleitung von schädlichen Reizen beteiligt und dieses Resultat betont die analgetische Wirkung von E×L-LH_N/A. A_β-Neuronen, ein Zelltyp, der nicht an der Weiterleitung von schädlichen Reizen beteiligt ist, waren im Wesentlichen unverändert in ihren Antworten auf diesen Reiz (9D). Das Fehlen der Beeinflussung der A_β-Faser-Newonen ist kennzeichnend für die Selektivität von ExL-LH_N/A für die Neuronen, die zentral sind für die Weiterleitung von Schmerzsignalen.
Beispiel 9: Aktivität von ExL-LH_N/A in Verhaltensschmerzmodellen
In einem akzeptierten in vivo Schmerzmodell, dem Maus-Hotplate-Test, wurde für ExL-LH_N/A gezeigt, dass es analgetische Eigenschaften ausübt. 10 stellt die für ExL-LH_N/A gewonnenen Daten dar, wo sie verglichen werden mit einer übermaximalen Dosis Morphin. ExL-LH_N/A wurde intrathekal (30 Mikrogramm in einem 5 Mikroliter Vehikelvolumen) an jede einer Gruppe von 10 Mäusen verabreicht und die analgetische Wirkung wurde in dem Hotplate-Test bestimmt. Die Daten sind gezeigt als die Hotplate-Latenz (Sekunden) aufgetragen gegen die Versuchsdauer (P = vor der Behandlung, 0–5 = Stunden nach der Applikation). Der Wirkungseintritt von E×L-LH_N/A erreichte offensichtlich ein Plateau nach einer Stunde, das für wenigstens 5 Stunden konstant beibehalten wurde. Das Ausmaß der Analgesie ist ähnlich dem einer übermaximalen Dosis (50 Mikrogramm, 20 × Maus-EC₅₀) Morphin in diesem Test, aber ist von wesentlich längerer Dauer. Diese Rate von Morphin erreicht eine maximale Wirkung bei einer Stunde und kehrt dann auf Kontrolldaten über eine Zeitdauer von 5 Stunden zurück. Diese Daten geben einen deutlichen Hinweis auf das analgetische Potential von Mitteln, wie z. B. ExL-LH_N/A.
Materialien
Erwachsene gekreuzte Mäuse (MF1) von beiderlei Geschlecht, mit einem Gewichtsbereich von 20–30g.
Methoden
Testmaterial wird in den intrathekalen Raum von anaesthesierten Mäusen unter Verwendung einer wegwerfbaren Injektionsnadel Nr. 30, die verbunden war mit einer 50 Mikroliter Hamiltonspritze, injiziert. Die Injektionsstelle wurde normalerweise ausgewählt, als zwischen den lumbalen Wirbeln 5 und 6 liegend. Die Nadel wird in das Gewebe auf einer Seite des Wirbels eingeführt, so dass sie in die Furche zwischen Dornfortsatz und Querfortsatz schlüpft. Die Nadel wird dann vorsichtig vorwärts zum zwischen den Wirbeln liegenden Raum bewegt. Fünf Mikroliter Testmaterial werden dann in den intrathekalen Raum injiziert und die Nadel wird zurückgezogen. Der Hauteinschnitt wird dann geschlossen mit einem einzelnen Wundverschluss und das Tier wird in eine Kiste gegeben, um die Erholung zu ermöglichen.

Claims

Mittel zur Behandlung von Schmerz, das ein Galactose bindendes Lektin umfasst, angebunden an ein Derivat eines Clostridien-Neurotoxins, worin das Derivat des Clostridien-Neutrotoxins die L-Kette oder ein Fragment derselben umfasst, welches die aktive proteolytische Enzymdomäne der leichten Kette (L-Kette) umfasst, verbunden mit einem Molekül oder einer Domäne mit Membran-translozierender Aktivität (membrane translocating activity).
Mittel gemäß Anspruch 1, worin die Membran-translozierende Domäne aus der schweren Kette eines Clostridien-Toxins abgeleitet ist.
Mittel gemäß Anspruch 1, worin die Membran-translozierende Domäne aus einer Nicht-Clostridien-Quelle abgeleitet ist.
Mittel gemäß einem der vorstehenden Ansprüche, worin das Lektin an Oligosaccharide bindet, welche endständige β-D-Galactosylreste enthalten.
Mittel gemäß einem der vorstehenden Ansprüche, worin das Lektin an Oligosaccharide bindet, die endständige α-D-Galactosylreste enthalten.
Mittel gemäß einem der vorstehenden Ansprüche, worin das Lektin an Oligosaccharide bindet, die N-Acetylgalactosamin enthalten.
Mittel gemäß einem der vorstehenden Ansprüche, worin das Lektin von einer Spezies an Pflanzen abgeleitet ist.
Mittel gemäß dem vorstehenden Anspruch, worin das Lektin von einer Spezies der Gattung Erythrina abgeleitet ist.
Mittel gemäß Anspruch 8, worin das Lektin von E. cristagalli abgeleitet ist.
Mittel gemäß Anspruch 8, worin das Lektin von E. corallodendron abgeleitet ist.
Mittel gemäß Anspruch 7, worin das Lektin aus Glycine max erhalten wird.
Mittel gemäß Anspruch 7, worin das Lektin aus Arachis hypogaea erhalten wird.
Mittel gemäß Anspruch 7, worin das Lektin aus Bandeirea simplicifolia erhalten wird.
Mittel gemäß Anspruch 1 bis 6, worin das Lektin aus einem Säuger stammt.
Mittel gemäß Anspruch 1 bis 6, worin das Lektin aus Bakterien erhalten wird.
Mittel gemäß Anspruch 15, worin das Lektin aus Pseudomonas aeruginosa erhalten wird.
Mittel gemäß einem der vorstehenden Ansprüche, worin das Lektin unter Anwendung rekombinanter Techniken erzeugt worden ist.
Mittel gemäß einem der vorstehenden Ansprüche, worin das Lektin enzymatisch modifiziert worden ist.
Mittel gemäß einem der vorstehenden Ansprüche, worin das Lektin chemisch modifiziert worden ist.
Mittel gemäß einem der vorstehenden Ansprüche, worin dann, wenn die schwere Kette (H-Kette) des Clostridien-Neurotoxins vorhanden ist, die H_C-Domände der H-Kette entfernt oder modifiziert ist.
Mittel gemäß einem der vorstehenden Ansprüche, worin die H-Kette, falls vorhanden, mittels chemischer Derivatisierung zur Verringerung oder Entfernung ihrer nativen Bindungsaffinität für motorische Neuronen modifiziert ist.
Mittel gemäß einem der Ansprüche 1 bis 20, worin die H-Kette, falls vorhanden, mittels Mutation zur Verringerung oder Entfernung ihrer nativen Bindungsaffinität für motorische Neuronen modifiziert worden ist.
Mittel gemäß einem der Ansprüche 1 bis 20, worin die H-Kette, falls vorhanden, mittels Proteolyse modifiziert worden ist.
Mittel gemäß Anspruch 20, worin dann, wenn die H-Kette vorhanden ist, die H_C-Domäne vollständig entfernt worden ist, um nur das H_N-Fragment eines Clostridien-Neurotoxins zu belassen.
Mittel gemäß einem der vorstehenden Ansprüche, worin das Derivat des Clostridien-Neurotoxins oder Fragment desselben aus einem Botulinus-Neurotoxin erhalten wird.
Mittel gemäß einem der vorstehenden Ansprüche, worin das Derivat des Clostridien-Neurotoxins oder Fragment desselben aus dem Botulinus-Neurotoxin Typ A erhalten wird.
Mittel gemäß einem der Ansprüche 1 bis 25, worin das Derivat des Clostridium-Neurotoxins oder Fragment desselben aus dem Botulinus-Neurotoxin Typ B erhalten wird.
Mittel nach einem der Ansprüche 1, 2 oder 4–25 (ausgenommen dann, wenn diese von Anspruch 3 abhängen), das durch Kuppeln eines Galactose bindenden Lektins an das LH_N-Fragment des Botulinus-Neurotoxins Typ A gebildet wird.
Mittel gemäß Anspruch 28, das durch Kuppeln des Galactose bindenden Lektins aus Erythrina cristagalli an das LH_N-Fragment des Botulinus-Neurotoxins Typ A gebildet wird.
Mittel gemäß Anspruch 28, das durch Kuppeln des Galactose bindenden Lektins aus Erythrina corallodendron an das LH_N-Fragment von Botulinus-Neurotoxin Typ A erhalten wird.
Mittel gemäß Anspruch 28, das durch das Kuppeln des Galactose bindenden Lektins aus Glycine max an das LH_N-Fragment des Botulinus-Neurotoxins Typ A erhalten wird.
Mittel gemäß einem der vorstehenden Ansprüche, worin die H-Kette, falls vorhanden, aus einem anderen Clostridien-Neurotoxin als demjenigen erhalten wird, aus dem die L-Kette erhalten wird.
Mittel gemäß Anspruch 32, worin die H-Kette aus dem Botulinus-Neurotoxin Typ A und die L-Kette aus dem Botulinus-Neurotoxin Typ 13 erhalten wird.
Mittel gemäß Anspruch 32, worin die H-Kette aus dem Botulinus-Neurotoxin Typ A und die L-Kette aus dem Tetanus-Neurotoxin erhalten wird.
Mittel gemäß Anspruch 33 und 34, worin die H-Kette als Komponente das H_N-Fragment des Botulinus-Neurotoxins Typ A ist.
Mittel gemäß einem der vorstehenden Ansprüche, worin die L-Kette oder das L-Ketten-Fragment an die H-Kette, falls vorhanden, über eine direkte kovalente Bindung angebunden ist.
Mittel gemäß einem der Ansprüche 1–35, worin die L-Kette oder das L-Ketten-Fragment an die H-Kette, falls vorhanden, über eine kovalente Bindung angebunden ist, die einen oder mehrere Spacer-Bereiche umfasst.
Mittel gemäß einem der vorstehenden Ansprüche, worin das Derivat des Clostridien-Neurotoxins Polypeptide umfasst, erzeugt über rekombinante Techniken.
Mittel gemäß einem der vorstehenden Ansprüche, worin das Lektin an die von dem Clostridien-Neurotoxin abgeleitete Komponente über eine direkte kovalente Bindung angebunden ist.
Mittel gemäß einem der Ansprüche 1 bis 38, worin das Lektin an die von dem Clostridien-Neurotoxin abgeleitete Komponente über eine kovalente Bindung angebunden ist, die eine oder mehrere Spacer-Bereiche umfasst.
Mittel gemäß einem der vorstehenden Ansprüche, worin das Lektin und die Clostridien-Neurotoxin-Komponenten als ein rekombinantes Fusionsprotein erzeugt werden.
Mittel gemäß einem der vorstehenden Ansprüche, worin das Lektinprotein aus seiner nativen Polypeptidsequenz modifiziert worden ist, während eine Fähigkeit des Proteins, an Oligosaccharidstrukturen zu binden, erhalten wurde, worin der endständige Rest von Galactose oder N-Acetylgalactosamin abgeleitet ist.
Mittel gemäß Anspruch 42, worin die Proteinmodifikation aus der Modifikation der Nukleinsäure herrührt, welche für das Lektinprotein in seiner nativen Sequenz kodiert.
Verfahren zum Erhalt eines Mittels gemäß einem der vorstehenden Ansprüche, das die kovalente Anbindung eines Galactose bindenden Lektins an ein Derivat eines Clostridien-Neurotoxins umfasst, worin das Derivat des Clostridien-Neurotoxins die L-Kette oder ein L-Ketten-Fragment umfasst, welches die aktive proteolytische Domäne der leichten Kette (L-Kette), angebunden an ein Molekül oder eine Domäne mit Membran-translozierender Aktivität, umfasst.
Verfahren zum Erhalt eines Mittels gemäß einem der Ansprüche 1 – 43, welches die kovalente Anbindung eines Galactose bindenden Lektins an ein Derivat eines Clostridien-Neurotoxins unter Einschluß einer oder mehrerer Spacer-Bereiche umfasst, worin das Derivat des Clostridien-Neurotoxins die L-Kette oder ein L-Ketten-Fragment umfasst, welches die aktive proteolytische Enzymdomäne der leichten Kette (L-Kette), angebunden an ein Molekül oder eine Domäne mit Membran-translozierender Aktivität, umfasst.
Verfahren gemäß Anspruch 44 oder 45, worin die Membran-translozierende Domäne aus der schweren Kette eines Clostridien-Toxins abgeleitet ist.
Verfahren gemäß Anspruch 44 oder 45, worin die Membran-translozierende Domäne aus einer Nicht-Clostridien-Quelle abgeleitet ist.
Verfahren zum Erhalt eines Mittels gemäß einem der Ansprüche 1–43, das das Konstruieren eines genetischen Konstrukts, welches für das Mittel kodiert, das Inkorporieren des Konstrukts in einen Wirtsorganismus und das Exprimieren des Konstrukts zum Erzeugen des Mittels umfasst.
Verwendung des Mittels nach einem der Ansprüche 1 bis 43 bei der Herstellung eines Medikaments zum Steuern der Transmission sensorischer Information aus einer primären sensorischen Afferenz an ein Projektionsneuron.
Verwendung des Mittels nach einem der Ansprüche 1–43 bei der Herstellung eines Medikaments zum Steuern der Transmission sensorischer Information aus einer primären nocirezeptiven Afferenz an ein Projektionsneuron.
Verwendung gemäß Anspruch 49 oder Anspruch 50, worin die Transmission die Freisetzung eines Neurotransmitters oder Neuromodulators darstellt.
Verwendung des Mittels nach einem der Ansprüche 1–43 bei der Herstellung eines Medikaments zur Steuerung des Schmerzempfindens.
Verwendung des Mittels gemäß einem der Ansprüche 1–43 bei der Herstellung eines Medikaments zur Erleichterung und/oder Vorbeugung von Schmerz.