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Hintergrund
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1. Gebiet der Erfindung
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Die Erfindung betrifft Verfahren
und Materialien zur Wiederherstellung (Rekonstruktion), Heilung (Reparatur),
Stärkung
(Vergrößerung)
oder zum Ersatz von Geweben und insbesondere die Verwendung derartiger
Materialien.
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2. Beschreibung des Stands
der Technik
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Die Medizin hat dem Ersatz von fehlerhaften Organen
durch funktionell wirksame Ersatzorgane erhebliche Aufmerksamkeit
und Anstrengungen gewidmet. Die Ersatzorgane reichen von vollständig synthetischen
Vorrichtungen, wie künstlichen
Herzen, bis zu vollständig
natürlichen
Organen anderer Säugetierspender.
Auf dem Gebiet der Herztransplantation war man besonders erfolgreich
sowohl mit der Verwendung von Kunstherzen als auch mit natürlichen
Herzen lebender Spender. Ein ähnlicher
Erfolg wurde bei zahlreichen anderen Organen, insbesondere auf dem
Gebiet der Blasenrekonstruktion, nicht erreicht.
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Die menschliche Harnblase ist ein
muskulomembranöser
Sack, der sich im vorderen Teil des Beckenhohlraums befindet und
als Reservoir für
Urin dient, das den Urin durch die Harnleiter aufnimmt und ihn durch
die Harnröhre
abgibt. Beim Menschen befindet sich die Blase im Becken hinter dem
Beckenknochen (Symphyse). Eine als Harnröhre bezeichnete Entleerungsröhre verlässt die
Blase zur Außenseite
des Körpers
hin. Blase, Harnleiter und Harnröhre sind
in ähnlicher
Weise so aufgebaut, dass sie muskulöse Strukturen umfassen, die
mit einer Membran ausgekleidet sind, die urotheliale Zellen umfasst,
die mit Schleim, der für
die normalen löslichen
Substanzen des Urins undurchlässig
ist, überzogen
sind. Beim Blasendreieck, auch als Trigonum vesicae bezeichnet,
handelt es sich um einen glatten dreieckigen Bereich der Schleimhautmembran
am Blasengrund. Das Blasengewebe ist elastisch und nachgiebig. Dies
bedeutet, dass die Blase je nach enthaltener Urinmenge Gestalt und
Größe verändert. Eine Blase
gleicht im leeren Zustand einem entleerten Ballon, nimmt aber bei
steigender Urinmenge eine in etwa birnenförmige Gestalt an und steigt
in die Bauchhöhle.
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Die Blasenwand weist drei Hauptschichten von
Geweben auf: Mucosa, Submucosa und Detrusor. Die Mucosa, die urotheliale
Zellen umfasst, stellt die innerste Schicht dar und ist aus Übergangszellepithel zusammengesetzt.
Die Submucosa liegt unmittelbar unterhalb der Mucosa und stellt
deren Grundmembran dar. Sie ist aus Blutgefäßen, die die Mucosa mit Nährstoffen
versorgen, und den Lymphknoten zusammengesetzt, die zur Beseitigung
von Abfallprodukten beitragen. Beim Detrusor handelt es sich um
eine Schicht von glatten Muskelzellen, die sich zur Aufbewahrung
von Urin ausdehnen und zum Ausstoßen von Urin zusammenziehen.
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Bei der Blase können zahlreiche Krankheiten und
Verletzungen auftreten, die den Zustand der Patienten beeinträchtigen.
Beispielsweise kann es aufgrund von infektiösen Krankheiten, Neoplasmen
und Entwicklungsabnormalitäten
zu Blasenschädigungen kommen.
Weitere Blasenschädigungen
können
die Folge von Verletzungen sein, beispielsweise bei Verkehrsunfällen und
Sportverletzungen.
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Obgleich eine große Anzahl von biologischen
Materialien, einschließlich
synthetische und natürliche
Polymere, zur Wiederherstellung oder Stärkung von Gewebe verwendet
werden (vergl. beispielsweise "Textbook
of Tissue Engineering",
Hrsg. R. Lanza, R. Langer und W. Chick, ACM Press, Colorado (1996)
und die dort genannten Literaturstellen), hat sich bisher kein Material
für die
Blasenwiederherstellung als zufriedenstellend erwiesen. Beispielsweise
waren synthetische Biomaterialien, wie Polyvinyl- und Gelatineschwämme, Polytetrafluorethylen
(Teflon)-Filz und Silicongummi-Pflaster relativ erfolglos, was im
allgemeinen auf Fremdkörperreaktionen
zurückzuführen war
(vergl. z. B. H. G. Kudish, J. Urol., Bd. 78 (1957), S. 232; L.
Ashkar und E. Heller, J. Urol., Bd. 98 (1967), S. 91; A. Kelami
et al., J. Urol., Bd. 104 (1970), S. 693). Andere Versuche scheiterten
im allgemeinen aufgrund von mechanischen, strukturellen, funktionellen
oder die biologische Verträglichkeit
betreffenden Problemen. Bei permanenten synthetischen Materialien
traten mechanisches Versagen und Steinbildung auf.
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Ferner wurden natürliche Materialien für die Blasenwiederherstellung
vorgeschlagen, z. B. lyophilisierte Dura, desepithelisierte Darmabschnitte
und Dünndarm-Submucosa
(SIS) (bezüglich
eines allgemeinen Überblicks
wird verwiesen auf D. Mooney et al., "Tissue Engineering: Urogenital System" in "Textbook of Tissue
Engineering", Hrsg.
R. Lanza, R. Langer und W. Chick, ACM Press, Colorado (1996)). Natürliche Blasen-Submucosa wurde ebenfalls
als Gerüst
für die
Zellabscheidung verwendet (vergl. WO-98/06445 (Atala)). Es wurde
jedoch berichtet, dass sich mit Dura, Peritoneum, Placenta und Fascia verstärkte Blasen
im Laufe der Zeit zusammenziehen (A. Kelami et al., J. Urol., Bd.
105 (1971), S. 518). Desepithelisierte Darmabschnitte erwiesen sich
als geeignete urotheliale Abdeckungen zur Verwendung bei der Blasenwiederherstellung,
jedoch bleiben Schwierigkeiten mit dem Nachwachsen der Mucosa und/oder
mit einer Segmentfibrose bestehen. Es wurde gezeigt, dass die Desepithelisierung
der intestinalen Segmente zu einem Mucosa-Neuwachstum führen kann,
während
die Entfernung der Mucosa und Submucosa eine Retraktion des intestinalen Segments
bewirken kann (vergl. z. B. A. Atala, J. Urol., Bd. 156 (1996),
S. 338). Weitere Versuche zur Herstellung von Strukturen beinhalteten
die Verwendung einer Einzelzellpopulation (vergl. WO-93/07913 und WO-88/03785)
oder die Verwendung eines stromalen, zellbasierenden, dreidimensionalen
Zellkultursystems, auf dem verschiedene Zellpopulationen gezüchtet wurden
(vergl. WO-96/40175).
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Über
weitere Schwierigkeiten wurde bei der Verwendung bestimmter gastrointestinaler
Segmente für
die Blasenchirurgie berichtet, einschließlich Steinbildung, erhöhte Schleimbildung,
Neoplasien, Infektionen, Stoffwechselstörungen, Langzeitkontraktionen
und Resorptionen. Diese Versuche mit natürlichen oder synthetischen
Materialien haben gezeigt, dass Blasengewebe, das spezifische muskuläre elastische
Eigenschaften und urotheliale Permeabilitätsfunktionen aufweist, nicht
leicht ersetzt werden kann.
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Aufgrund der vielfältigen Komplikationen,
die mit der Verwendung von gastrointestinalen Segmenten für die Blasenrekonstruktion
verbunden sind, wurde nach alternativen Lösungen geforscht. Neuere chirurgische
Vorgehensweisen stützten
sich auf natives urologisches Gewebe zur Rekonstruktion, einschließlich einer
Selbststärkung
(Autoaugmentation) und Uretherozystoplastik. Jedoch war die Autoaugmentation
mit enttäuschenden
Langzeitergebnissen verbunden und die Uretherozystoplastik ist auf
die Fälle
beschränkt,
in denen bereits ein erweiterter Harnleiter vorliegt. Es wurde ein
System zur fortschreitenden Dilatation für Harnleiter und Blasen vorgeschlagen,
jedoch wurde dieses System bisher nicht klinisch erprobt. Ferner
wurden seromuskuläre Transplantate
und desepithelisierte Darmsegmente, entweder allein oder über einem
nativen Urothel erprobt. Jedoch bestand ein sich wiederholendes
Problem in einer Transplantatschrumpfung und einer Reepithelisierung
von anfänglich
desepithelisierten Darmsegmenten.
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Eine erhebliche und hartnäckige Einschränkung bei
der Blasenrekonstruktion steht im direkten Zusammenhang mit der
Verfügbarkeit von
Spendergewebe. Die begrenzte Verfügbarkeit von Blasengewebe verbietet
die häufige
routinemäßige Blasenrekonstruktion
unter Verwendung von normalem Blasengewebe. Das Blasengewebe, das
verfügbar
ist und als verwendbar betrachtet wird, kann selbst mit naturgegebenen
Unzulänglichkeiten
und Krankheiten behaftet sein. Beispielsweise kann bei einem an Blasenkrebs
leidenden Patienten das restliche Blasengewebe mit Metastasen kontaminiert
sein. Demgemäß ist der
Patient nicht für
eine perfekte Blasenfunktion geeignet.
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Zusammenfassende
Darstellung der Erfindung
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Die vorliegende Erfindung überwindet
die Schwierigkeiten und Nachteile, die mit den derzeitigen Strategien
zur Wiederherstellung (Rekonstruktion), Heilung (Reparatur), Stärkung (Vergrößerung) und
Ersatz von Hohlorganen und Gewebestrukturen verbunden sind.
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Eine Ausführungsform der Erfindung ist
auf ein Verfahren zur Wiederherstellung (Rekonstruktion), Heilung
(Reparatur) oder Stärkung
(Vergrößerung)
von schichtartig aufgebauten Hohlorganen oder Gewebestrukturen zur
Anwendung bei der Behandlung eines Patienten abgestellt. Das Verfahren beinhaltet
das Bereitstellen einer bioverträglichen synthetischen
oder natürlichen
Polymermatrix, die so geformt ist, dass sie mindestens einem Teil
des Hohlorgans oder der Gewebestruktur, die behandlungsbedürftig sind,
entspricht, das Ablagern einer ersten Zellpopulation an oder in
einem ersten Bereich der Polymermatrix und das Ablagern einer zweiten
Zellpopulation, deren Zelltyp sich von dem der ersten Zellpopulation
unterscheidet, in einem zweiten Bereich der Polymermatrix. Der geformte
Polymermatrix-Zell-Aufbau kann dem Patienten an der behandlungsbedürftigen
Stelle implantiert werden, um ein schichtartig aufgebautes Hohlorgan
oder Gewebestruktur zu bilden.
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Eine weitere Ausführungsform der Erfindung ist
auf eine Vorrichtung für
die Wiederherstellung, Heilung, Stärkung oder den Ersatz von schichtartig aufgebauten
Hohlorganen oder Gewebestrukturen abgestellt. Die Vorrichtung umfasst
eine implantierbare, bioverträgliche,
synthetische oder natürliche Polymermatrix
mit mindestens zwei getrennten Oberflächen. Die Polymermatrix ist
so geformt, dass sie mindestens einem Teil des Hohlorgans oder der
Gewebestruktur, die behandlungsbedürftig sind, entspricht. Mindestens
zwei verschiedene Zellpopulationen sind in im wesentlichen getrennten
Bereichen entweder an oder in der Polymermatrix so abgelagert, dass
ein schichtartig aufgebauter Matrix/Zell-Aufbau gebildet wird.
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Eine weitere Ausführungsform der Erfindung ist
auf eine Vorrichtung zur Heilung, Wiederherstellung, Stärkung oder
Ersatz von geschädigtem
oder fehlendem Blasengewebe bei einem behandlungsbedürftigen
Patienten abgestellt. Die Vorrichtung umfasst eine implantierbare,
bioverträgliche,
synthetische oder natürliche
Polymermatrix, die so geformt ist, dass sie einem Teil eines behandlungsbedürftigen
Blasengewebes entspricht. Urotheliale Zellen sind an oder in der
Nähe der
inneren Oberfläche
der Matrix abgelagert. Glatte Muskelzellen sind an oder in der Nähe der äußeren Oberfläche der
Matrix abgelagert. Wird die Vorrichtung dem Patienten implantiert,
so bildet sie eine schichtartig aufgebaute Hohlgewebestruktur, die
mit normalem Blasengewebe verträglich
ist.
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Weitere Ausführungsformen und Vorteile der Erfindung
sind teils in der nachstehenden Beschreibung dargelegt und ergeben
sich teils aus der Beschreibung und der erfindungsgemäßen Praxis.
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Beschreibung der Zeichnung
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Die Patentakte enthält mindestens
eine farbig ausgestaltete Zeichnung. Kopien dieses Patents mit der
farbigen Zeichnung werden vom Patentamt auf Antrag und nach Zahlung
der erforderlichen Gebühr
bereitgestellt.
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1 zeigt
(A) eine native Kaninchenblase vor
der das Blasendreieck aussparenden Zystektomie; (B)
ein durch Anastomose an das Blasendreieck angefügtes neues Organ; und (C) ein durch einen transurethralen und
suprapubischen Katheter dekomprimiertes Implantat, das mit Omentum
eingehüllt
ist.
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2 zeigt
(A) die Blasenkapazität und (B) die Compliance zu verschiedenen postoperativen Zeitpunkten,
relativ zu einer präoperativen
Kapazität von
100%.
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3 zeigt
radiographische Zystogramme zu einem Zeitpunkt von 11 Monaten nach
einer subtotalen Zystektomie, gefolgt von (A)
einer subtotalen Zystektomie ohne Rekonstruktion (Gruppe A); (B) nur
mit Polymerimplantaten (Gruppe B);
und (C) mit einem neuen Organ mit Gewebeaufbau
(Gruppe C).
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4 zeigt
(A und B)
eine grobe Darstellung einer subtotalen Zystektomie-Kontrolle; (C und D) nur
mit Polymerimplantat; und (E und F) mit einem mit Gewebe aufgebauten neuen
Organ bei Wiederherstellung nach 11 Monaten.
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5 zeigt
H & E-histologische
Ergebnisse 6 Monate nach einem chirurgischen Eingriff (A) einer normalen Kaninchenblase; (B) einer Blasenwölbung der mit zellfreiem Polymeren
rekonstruierten Blase (Gruppe B); (C) eines mit Gewebe aufgebauten neuen Organs
(Gruppe C).
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6 zeigt
eine positive immunozytochemische Färbung eines mit Gewebe aufgebauten
neuen Organs auf (A) Pancytokeratine
AE1/AE3; (B) mit der urothelialen Differenzierung
in Zusammenhang stehende Membranproteine; (C)
Actin der glatten Muskulatur; und (D)
5–100
Antikörper
6 Monate nach der Implantation.
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Beschreibung
der Erfindung
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Die Erfindung stellt Verfahren und
Vorrichtungen bereit, die die Geweberekonstruktion erleichtern.
In ihrer breitesten Form eignen sich die erfindungsgemäßen Verfahren
und Vorrichtungen für
die Wiederherstellung, Heilung, Stärkung oder zum Ersatz von Organen
oder Gewebestrukturen, die einen mehrschichtigen zellulären Aufbau
aufweisen und insbesondere von Organen oder Gewebestrukturen, die
eine hohle Beschaffenheit aufweisen. Insbesondere stellt die vorliegende
Erfindung Verfahren und Vorrichtungen bereit, die die Wiederherstellung,
Heilung, Stärkung
oder den Ersatz von geformten Hohlorganen oder Gewebestrukturen
erleichtern, die eine schichtartige Segregation verschiedener Zelltypen aufweisen
und bei denen die Aufrechterhaltung einer allgemeinen hohlen Form
erforderlich ist. Hohle Organe oder Gewebestrukturen, die eine Schicht
mit glatten Muskelzellen (SMC) enthalten, um dem Organ oder der
Struktur nachgiebige oder kontrahierbare Eigenschaften zu verleihen,
eignen sich insbesondere für
die erfindungsgemäßen Verfahren
und Vorrichtungen.
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In einem Beispiel einer bevorzugten
Ausführungsform
der Erfindung handelt es sich beim Hohlorgan um die Harnblase, die
eine innere Schicht aus einer ersten Zellpopulation, die uretheliale
Zellen umfasst, und eine äußere Schicht
aus einer zweiten Zellpopulation, die glatte Muskelzellen umfasst,
aufweist. Dieser Aufbau findet sich auch bei anderen Urogenitalorganen
und Gewebestrukturen, wie den Harnleitern und der Harnröhre. Der
Ausdruck "schichtartig aufgebaute
Organe oder Gewebe" bezieht
sich auf beliebige Organe oder Gewebe, die in Schichten aufgebaut
oder angeordnet sind, unter Einschluss von duktalem Gewebe. Weitere
geeignete, schichtartig aufgebaute Hohlorgane, Gewebestrukturen
oder duktale Gewebe, auf die die vorliegende Erfindung abgestellt
ist, sind Vas Deferens, Eileiter, Tränengänge, Luftröhre, Magen, Darm, Gefäße, Gallengang, Ductus
eiaculatorius, Ductus epididymidis, Ductus parotideus und chirurgisch
geschaffene Shunts.
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Das erfindungsgemäße Verfahren umfasst in seinem
breitesten Aspekt eine erste Stufe zur Bereitstellung einer bioverträglichen
synthetischen oder natürlichen
Polymermatrix, die so geformt ist, dass sie einem Teil oder der
Gesamtheit des Hohlorgans oder der Gewebestruktur, die repariert,
rekonstruiert, gestärkt
(vergrößert) oder
ersetzt werden müssen, entspricht.
Bei einem bioverträglichen
Material handelt es sich um eine beliebige Substanz, die keine toxischen
oder schädlichen
Auswirkungen auf biologische Funktionen ausübt. Die geformte Matrix ist
vorzugsweise porös,
um eine Ablagerung von Zellen auf und in den Poren der Matrix zu
ermöglichen.
Die geformte Polymermatrix wird sodann vorzugsweise nacheinander
mit mindestens zwei verschiedenen Zellpopulationen, die getrennten
Bereichen der Matrix (z. B. innen und außen) zugeführt werden, in Kontakt gebracht,
um auf und/oder in der Matrix eine Animpfung mit der Zellpopulation
vorzunehmen.
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Die angeimpfte Matrix wird sodann
in den Körper
des Empfängers
implantiert, wo die getrennten, schichtartig aufgebauten Zellpopulationen
die Bildung von neuen Organen oder Gewebestrukturen erleichtern.
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Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform eignen
sich die erfindungsgemäßen Materialien
und Verfahren zur Rekonstruktion oder Stärkung von Harnblasengewebe.
Somit stellt die Erfindung Behandlungen für Zustände, wie Blasenekstrophie,
Blasen-Volumeninsuffizienz, Rekonstruktion der Blase im Anschluss
an eine partielle oder totale Zystektomie, Reparatur von traumatisch
geschädigten
Blasen und dergl., bereit.
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Was die erfindungsgemäß erwähnte Stärkung der
Blase betrifft, so ist darauf hinzuweisen, dass sich die erfindungsgemäßen Verfahren
und Materialien zur Geweberekonstruktion oder zur Stärkung von
verschiedenen Geweben und Organen bei einem Subjekt eignen. Somit
können
beispielsweise Organe oder Gewebe, wie Blase, Harnleiter, Harnröhre, Nierenbecken
und dergl., mit Polymermatrices, die mit Zellen angeimpft sind,
gestärkt
oder repariert werden. Die erfindungsgemäßen Materialien und Verfahren
können
ferner auf die Rekonstruktion oder Stärkung von Gefäßgewebe
(vergl. z. B. R. J. Zdrahala, J. Biomater. Appl., Bd. 10(4) (1996),
S. 309–329),
Darmgewebe und Magen (vergl. z. B. C. T. Laurencin et al., J. Biomed.
Mater. Res., Bd. 30(2) (1996), S. 133–138) und dergl. angewandt
werden. Bei dem zu behandelnden Patienten kann es sich um eine beliebige Säugetierspezies,
z. B. Hunde, Katzen, Schweine, Pferde, Rinder oder Menschen, handeln,
bei denen eine Rekonstruktion, Reparatur oder Stärkung eines Gewebes erforderlich
ist.
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Polymermatrices
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Bioverträgliche Materialien und insbesondere
biologisch abbaubare Materialien werden für den Aufbau der Polymermatrix
bevorzugt. Die Polymermatrix wird beim Aufbau des rekonstruktiven
urothelialen Transplantats (RUG) verwendet. Das RUG ist eine implantierbare,
bioverträgliche,
synthetische oder natürliche
Polymermatrix mit mindestens zwei getrennten Oberflächen. Das
RUG ist so geformt, dass es zumindest einem Teil des Hohlorgans
oder der Gewebestruktur, die behandlungsbedürftig sind, entspricht, wobei
mindestens zwei verschiedene Zellpopulationen in im wesentlichen
getrennten Bereichen entweder an oder in der Polymermatrix abgelagert
sind. Somit handelt es sich beim RUG um ein schichtartig aufgebautes
Matrix/Zell-Konstrukt.
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Der Ausdruck "bioverträglich" bezieht sich auf Materialien, die keine
toxischen oder schädlichen Einflüsse auf
biologische Funktionen ausüben.
Der Ausdruck "biologisch
abbaubar" bezieht
sich auf Materialien, die im Körper
eines Patienten resorbiert oder abgebaut werden können. Zu
Beispielen für
biologisch abbaubare Materialien gehören resorbierbare Nahtmaterialien.
Zu repräsentativen
Materialien zur Bildung der biologisch abbaubaren Struktur gehören natürliche oder
synthetische Polymere, z. B. Kollagen, Poly-(alpha-ester), wie Poly-milchsäure, Poly(glykolsäure), Polyorthoester
und Polyanhydride und Copolymere davon, die durch Hydrolyse mit
kontrollierter Geschwindigkeit abgebaut und resorbiert werden. Diese
Materialien gewährleisten
die maximale Steuerung der Abbaubarkeit, Handhabbarkeit, Größe und Konfiguration.
Zu bevorzugten biologisch abbaubaren polymeren Materialien gehören Polyglykolsäure und
Polyglactin, die als resorbierbare synthetische Nahtmaterialien
entwickelt worden sind. Polyglykolsäure- und Polyglactin-Fasern
können
in der vom Hersteller gelieferten Form verwendet werden. Zu weiteren
biologisch abbaubaren Materialien gehören Celluloseether, Cellulose,
Celluloseester, fluoriertes Polyethylen, phenolische Materialien,
Poly-4-methylpenten,
Polyacrylnitril, Polyamid, Polyamidimid, Polyacrylat, Polybenzoxazol,
Polycarbonat, Polycyanoarylether, Polyester, Polyestercarbonat, Polyether,
Polyetheretherketon, Polyetherimid, Polyetherketon, Polyethersulfon,
Polyethylen, Polyfluorolefin, Polyimid, Polyolefin, Polyoxadiazol,
Polyphenylenoxid, Polyphenylensulfid, Polypropylen, Polystyrol,
Polysulfid, Polysulfon, Polytetrafluorethylen, Polythioether, Polytriazol,
Polyurethan, Polyvinyl, Polyvinylidenfluorid, regenerierte Cellulose,
Silicon, Harnstoff-Formaldehyd oder Copolymere oder physikalische
Gemische dieser Materialien. Diese Materialien können mit geeigneten antimikrobiellen
Mitteln imprägniert
und durch Farbzusätze
gefärbt
werden, um die Sichtbarkeit zu verbessern und chirurgische Maßnahmen
zu unterstützen.
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Ein derzeit bevorzugtes biologisch
verträgliches
Polymeres ist Polyglactin, das als resorbierbares synthetisches
Nahtmaterial entwickelt worden ist, nämlich ein 90 : 10-Copolymeres
aus Glycolid und Lactid, das unter der Bezeichnung "Vicryl" als geflochtenes
resorbierbares Nahtmaterial vertrieben wird (Ethicon Co., Somerville,
N. J.) (P. H. Craig, J. A. Williams, K. W. Davis et al., "A Biological Comparison of
Polyglactin 910 and Polyglycolic Acid Synthetic Absorbable Sutures,
Surg., Bd. 141 (1975), S. 1010) sowie Polyglycolsäure. Polyglactin-
und Polyglycolsäure-Fasern
können
in der vom Hersteller gelieferten Form verwendet werden. Das biologisch
verträgliche
Polymere kann durch Verfahren, wie Lösungsmittelgießen, Verpressen,
Ziehen von Filamenten, Maschenbildung, Auslaugen, Weben und Beschichten,
geformt werden. Beim Lösungsmittelgießen wird eine
Lösung
von einem oder mehreren Polymeren in einem geeigneten Lösungsmittel,
wie Methylenchlorid, in Form einer Verzweigungsmuster-Reliefstruktur gegossen.
Nach Abdampfen des Lösungsmittels
erhält
man einen dünnen
Film.
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Beim Verpressen wird ein Polymeres
bei Drücken
bis zu 30 000 psi zu einem geeigneten Muster verpresst. Das Filamentziehen
umfasst das Ziehen des geschmolzenen Polymeren. Die Maschenbildung
umfasst die Bildung einer Gitterstruktur durch Verpressen von Fasern
zu einem filzartigen Material. Beim Auslaugen wird eine Lösung mit
einem Gehalt an zwei Materialien in einer Form, die der endgültigen Form
des RUG nahe kommt, verteilt. Anschließend wird ein Lösungsmittel
dazu herangezogen, eine der Komponenten herauszulösen, was
zur Porenbildung führt
(vergl. US-5 514
378, Mikos). Bei der Nukleisierung werden dünne Filme in Form eines RUG
radioaktiven Spaltungsprodukten ausgesetzt, die Spuren von strahlungsgeschädigtem Material
erzeugen. Anschließend
werden die Polycarbonatfolie mit einer Säure oder Base geätzt, wodurch
die Spuren des strahlungsgeschädigten
Materials in Poren verwandelt werden. Schließlich kann ein Laser zur Formgebung
und zum Ausbrennen von einzelnen Durchgangslöchern in zahlreichen Materialien
verwendet werden, um eine RUG-Struktur mit gleichmäßiger Porengröße zu bilden.
Der Ausdruck "Beschichtung" bezieht sich auf
das Überziehen
oder Durchdringen einer polymeren Struktur mit einem Material, z.
B. mit verflüssigten
Copolymeren (Poly-DL-lactid-co-glycolid 50 : 50, 80 mg/ml Methylenchlorid),
um dessen mechanische Eigenschaften zu verändern. Das Beschichten kann
in einer einzigen Schicht oder in mehrfachen Schichten, bis die
gewünschten
mechanischen Eigenschaften erreicht sind, vorgenommen werden. Diese
Formgebungstechniken können
in Kombination eingesetzt werden, beispielsweise kann eine Polymermatrix
durch Weben, Verpressen und Zusammenkleben hergestellt werden. Ferner
können verschiedene
polymere Materialien, die nach unterschiedlichen Verfahren geformt
worden sind, zu einer Verbundstruktur verbunden werden. Bei der
Verbundstruktur kann es sich um eine schichtartige Struktur handeln.
Beispielsweise kann eine Polymermatrix an einer oder mehreren Polymermatrices
angebracht werden, um eine mehrschichtige Polymermatrixstruktur
zu bilden. Das Anbringen kann durch Verkleben mit einem flüssigen Polymeren
oder durch Nähen
erfolgen. Ferner kann die Polymermatrix als fester Block gebildet
und mit einem Laser oder anderen üblichen maschinellen Bearbeitungstechniken
in die gewünschte
endgültige
Form gebracht werden. Die Formgebung mit einem Laser bezieht sich
auf Verfahren zur Entfernung von Materialien unter Verwendung eines
Lasers.
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Die biologisch abbaubaren Polymeren
lassen sich folgendermaßen
charakterisieren: bezüglich ihrer
mechanischen Eigenschaften, wie Zugfestigkeit unter Verwendung eines
Instron-Testgeräts,
bezüglich
ihres Polymer-Molekulargewichts durch Gelpermeationschromatographie
(GPC), bezüglich
ihrer Glasübergangstemperatur
durch Differentialscanningkalorimetrie (DSC) und bezüglich ihrer
Bindungsstruktur durch IR-Spektroskopie. Eine toxikologische Charakterisierung
erfolgt durch anfängliche Screeningtests,
einschließlich
des Ames-Tests, und durch in vitro-Tests auf die teratogene Beschaffenheit,
sowie durch Implantationsversuche bei Tieren zur Prüfung von
immunogener Beschaffenheit, Entzündungen,
Freisetzung und Abbau. Eine in vitro-Zellhaftung und -Lebensfähigkeit
kann durch Rasterelektronenmikroskopie, Histologie und quantitative Bestimmung
mit Radioisotopen geprüft
werden. Das biologisch abbaubare Material kann auch hinsichtlich der
Zeitspanne charakterisiert werden, die für einen Abbau des Materials
nach Implantation bei einem Patienten erforderlich ist. Durch Variation
der Bauweise, z. B. der Dicke und der Maschengröße, kann das biologisch abbaubare
Material innerhalb einer Zeitspanne von etwa 2 Jahren bis etwa 2
Monaten, vorzugsweise von etwa 18 Monaten bis etwa 4 Monaten, insbesondere
von etwa 15 Monaten bis etwa 8 Monaten und ganz besonders von etwa
12 Monaten bis etwa 10 Monaten im wesentlichen biologisch abgebaut
werden. Gegebenenfalls kann das biologisch abbaubare Material so
aufgebaut werden, dass es innerhalb von etwa 3 Jahren, etwa 4 Jahren
oder etwa 5 Jahren oder mehr keinem wesentlichen Abbau unterliegt.
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Die Polymermatrix kann, wie vorstehend ausgeführt, mit
kontrollierter Porenstruktur hergestellt werden. Die Größe der Poren
kann zur Festlegung der Zellverteilung herangezogen werden. Beispielsweise
können
die Poren an der Polymermatrix groß sein, um den Zellen eine
Wanderung von einer Oberfläche
zur gegenüberliegenden
Oberfläche
zu ermöglichen.
Alternativ können
die Poren klein ausgestaltet sein, so dass eine Fluidverbindung
zwischen den beiden Seiten der Polymermatrix besteht, jedoch Zellen
nicht passieren können.
Geeignete Porengrößen zur
Erreichung dieses Ziels können
etwa 0,04 μm
bis etwa 10 μm
(Durchmesser) und vorzugsweise etwa 0,4 m bis etwa 4 μm (Durchmesser)
betragen. Bei einigen Ausführungsformen
kann die Oberfläche
der Polymermatrix ausreichend große Poren umfassen, um ein Anhaften
und eine Wanderung einer ersten Population von Zellen in die Poren zu
ermöglichen.
Anschließend
kann die Porengröße im Innern
der Polymermatrix verringert werden, um eine Wanderung der Zellen
von einer Seite der Polymermatrix zur gegenüberliegenden Seite zu verhindern.
An der gegenüberliegenden
Seite der Polymermatrix können
sich die Poren erneut vergrößern, um ein
Anhaften und die Ansiedlung einer zweiten Zellpopulation zu ermöglichen.
Aufgrund der verminderten Porengröße im Innern der Polymermatrix
können sich
die erste Zellpopulation und die zweite Zellpopulation zunächst nicht
vermischen. Bei einer Ausführungsform
einer Polymermatrix mit verringerter Porengröße handelt es sich um eine
laminierte Struktur eines kleinporigen Materials, das sandwichartig
zwischen zwei großporigen
Materialien angeordnet ist. Alternativ kann ein großporiges
Material, das auf ein kleinporiges Material laminiert ist, das Zellwachstum an
beiden Seiten ohne Vermischen der Zellen ermöglichen. Polycarbonatmembranen
sind besonders geeignet, da sie mit sehr gut gesteuerten Porengrößen herstellbar
sind, z. B. mit etwa 0,01 μm,
etwa 0,05 μm,
etwa 0,1 μm,
etwa 0,2 μm,
etwa 0,45 μm,
etwa 0,6 μm,
etwa 1,0 μm,
etwa 2,0 μm
und etwa 4,0 μm. Im
Submikronbereich kann die Polymermatrix gegenüber Bakterien, Viren und anderen
Mikroorganismen undurchlässig
sein.
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Derzeit wird eine maschenartige Struktur
aus Fasern bevorzugt, die rund, gebogen, abgeflacht, sternförmig, solitär oder mit
anderen Fasern verflochten sein kann. Die Verwendung von sich verzweigenden
Fasern beruht auf den gleichen Prinzipien, derer sich die Natur
zur Lösung
des Problems einer steigenden Oberfläche proportional zum Volumenanstieg
bedient. Sämtliche
multizellulären
Organismen bedienen sich dieser wiederkehrenden Verzweigungsstruktur.
Verzweigungssysteme stellen Kommunikationsnetzwerke zwischen Organen,
sowie funktionelle Einheiten von einzelnen Organen dar. Das Beimpfen
und Implantieren dieser Konfiguration mit Zellen ermöglicht die
Implantation einer großen Anzahl
an Zellen, die jeweils der Umgebung des Wirts ausgesetzt sind, wodurch
ein freier Austausch von Nährstoffen
und Abfallprodukten gewährleistet wird,
während
eine Gefäßneubildung
erreicht wird. Die Polymermatrix kann flexibel oder starr ausgestaltet
sein, je nach der angestrebten endgültigen Form, Struktur und Funktion.
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In einer bevorzugten Ausführungsform
wird die Polymermatrix mit einer Polyglykolsäure mit einem durchschnittlichen
Faserdurchmesser von 15 μm
gebildet und in einer blasenförmigen
Form unter Verwendung von 4-0-Polyglactin-910-Nahtmaterial geformt.
Die erhaltene Struktur wird mit einem verflüssigten Copolymeren, z. B.
Poly-DL-lactid-co-glycolid 50 : 50, 80 mg/ml Methylenchlorid, beschichtet, um
angemessene mechanische Eigenschaften zu erreichen und die Gestalt
zu verfestigen.
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Polymergemische lassen sich vor der
Implantation (vor und nach Beimpfen der Polymermatrix mit Zellen,
wenn fakultative Animpfzellen verwendet werden) mit Additiven oder
Arzneistoffen behandeln, um beispielsweise die Bildung von neuem
Gewebe nach der Implantation zu fördern. Somit kann beispielsweise
die Polymermatrix mit Wachstumsfaktoren, Cytokinen, extrazellulären Matrixkomponenten und
anderen biologisch aktiven Materialien versetzt werden, um die Transplantatheilung
und Bildung von neuem Gewebe zu fördern. Derartige Additive werden
im allgemeinen entsprechend dem zu rekonstruierenden oder zu stärkenden
Gewebe oder Organ ausgewählt,
um zu gewährleisten,
dass geeignetes neues Gewebe im transplantierten Organ oder Gewebe
gebildet wird (bezüglich
Additiven zur Verwendung bei der Förderung der Knochenheilung
wird beispielsweise verwiesen auf C. A. Kirker-Head, Vet. Surg.,
Bd. 24(5) (1995), S. 408–419).
Wenn beispielsweise Polymermatrices (gegebenenfalls mit Endothelzellen
angeimpft) zur Stärkung
von Gefäßgewebe
verwendet werden, kann vaskulärer
endothelialer Wachstumsfaktor (VEGF) (vergl. z. B. US-Patent 5 654
273) verwendet werden, um die Bildung von neuem Gefäßgewebe
zu fördern.
Wachstumsfaktoren und andere Additive (z. B. epidermaler Wachstumsfaktor
(EGF), heparinbindender, epidermalartiger Wachstumsfaktor (HBGF),
Fibroblasten-Wachstumsfaktor (FGF), Cytokine, Gene, Proteine und
dergl.) können
in Mengen im Überschuss
im Vergleich zu beliebigen Mengen derartiger Wachstumsfaktoren (soweit
vorhanden), die von den auf die Polymermatrix überimpften Zellen (sofern zugesetzte Zellen
verwendet werden) gebildet werden, zugesetzt werden. Derartige Additive
werden vorzugsweise in einer ausreichenden Menge bereitgestellt,
um die Bildung von neuem Gewebe eines für das Gewebe oder das Organ
geeigneten Typs, das zu reparieren oder zu stärken (vergrößern) ist, zu fördern (z.
B. indem man eine Infiltration von Wirtszellen in das Transplantat
herbeiführt
oder beschleunigt). Zu weiteren geeigneten Additiven gehören antibakterielle Mittel,
wie Antibiotika.
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Eine bevorzugte Trägermatrix
besteht aus sich kreuzenden Filamenten, die ein Überleben der Zellen durch Diffusion
von Nährstoffen über kurze Abstände hinweg,
nachdem die Zellträgermatrix
implantiert worden ist, ermöglichen.
Die Zellträgermatrix unterliegt
zusammen mit der Expansion der Zellmasse im Anschluss an die Implantation
einer Vaskularisation.
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Der vor der Implantation vorgenommene
in vitro-Aufbau einer dreidimensionalen Struktur erleichtert die
eventuelle terminale Differenzierung der Zellen nach in vivo-Implantation
und verringert die Gefahr einer entzündlichen Reaktion gegenüber der Matrix
auf ein Minimum, wodurch ein Zusammenziehen und Schrumpfen von Transplantaten
vermieden wird.
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Die Polymermatrix kann zu einer beliebigen Anzahl
von erwünschten
Konfigurationen geformt werden, um einer Anzahl von Größen des
Gesamtsystems, der Geometrie oder räumlicher Beschränkungen
zu entsprechen. Beispielsweise kann im Fall der Verwendung der Polymermatrix
für die
Blasenrekonstruktion die Matrix so geformt werden, dass sie den
Abmessungen und der Gestalt der Gesamtheit oder eines Teils einer
Blase entspricht. Natürlicherweise
kann die Polymermatrix zu verschiedenen Größen und Gestalten geformt werden,
um eine Anpassung an unterschiedlich große Blasen von Patienten vorzunehmen.
Gegebenenfalls sollte die Polymermatrix so geformt werden, dass
nach ihrem biologischem Abbau die sich ergebende rekonstruierte Blase
in leerem Zustand kollabieren kann, ähnlich wie eine natürliche Blase.
Die Polymermatrix kann auch auf andere Weise geformt werden, um
den speziellen Bedürfnissen
des Patienten zu entsprechen. Beispielsweise kann ein Patient mit
einer früheren Verletzung
oder Behinderung einen veränderten
abdominalen Hohlraum aufweisen, so dass es erforderlich sein kann,
eine rekonstruierte Blase daran anzupassen. Bei anderen Ausführungsformen
der Erfindung wird die Polymermatrix zur Behandlung von schichtartigen
Strukturen im Körper
verwendet, z. B. von Harnröhre,
Vas Deferens, Eileitern und Tränengängen. Bei
diesen Anwendungsmöglichkeiten
kann die Polymermatrix in Form eines hohlen Rohrs gebildet werden.
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Die Polymermatrix kann vor der Verwendung unter
Heranziehung bekannter Verfahren sterilisiert werden. Das angewandte
Verfahren hängt
von dem in der Polymermatrix eingesetzten Material ab. Zu Beispielen
für Sterilisationsverfahren
gehören
die Sterilisation durch Dampf, Erwärmen in trockenem Zustand,
Bestrahlen, Gase, wie Ethylenoxidgas, und Siedebehandlung.
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Ernten von Zellen für das rekonstruktive
urotheliale Transplantat (RUG)
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Das RUG wird zum Teil unter Verwendung von
urothelialen Zellen und glatten Muskelzellen eines Spenders aufgebaut.
Ein Vorteil der erfindungsgemäßen Verfahren
besteht darin, dass aufgrund des raschen Wachstums der urothelialen
und glatten Muskelzellen eine ausreichende Zellmenge für den Aufbau
eines RUG in weniger als 5 Wochen gezüchtet werden kann. In einem
autologen RUG können die
Zellen vom eigenen Gewebe des Patienten, z. B. von Blase, Harnröhre, Harnleiter
und anderen Urogenitalgeweben abgeleitet sein. Bei einem allogenen RUG
können
die Zellen von einem anderen Mitglied der Spezies des Patienten
abgeleitet sein. Bei einem xenogenen RUG können die Zellen von einer Spezies,
die sich von der des Patienten unterscheidet, abgeleitet sein. Spenderzellen
können
aus beliebigen urothelialen Zellen und glatten Muskelzellen und
aus beliebigen Säugetierquellen,
z. B. von Menschen, Rindern, Schweinen, Pferden, Ziegen und Schafen, stammen.
Urotheliale Zellen und glatte Muskelzellen können in Biopsien oder Autopsien
isoliert werden. Zusätzlich
können
die Zellen vor der Verwendung eingefroren oder vermehrt werden.
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Zur Herstellung eines RUG-Aufbaus
wird Gewebe mit einem Gehalt an urothelialen und glatten Muskelzellen
getrennt in zwei Zellsuspensionen aufgeteilt. Verfahren zur Isolierung
und Züchtung
von Zellen sind im US-Patent
5 567 612 erörtert.
Eine Dissoziation der Zellen in ein Einzelzellstadium ist für die anfängliche
primäre
Kultur nicht wesentlich, da nach einem Zeitraum von beispielsweise
1 Woche einer in vitro-Kultur eine Einzelzellsuspension erreicht werden
kann. Eine Gewebedissoziation kann durch mechanisches und enzymatisches
Aufbrechen der extrazellulären
Matrix und der interzellulären
Verbindungen, die die Zellen zusammenhalten, erreicht werden. Urotheliale
Zellen und glatte Muskelzellen sämtlicher
Entwicklungsstufen, z. B. fötale,
neonatale, sowie juvenile bis erwachsene Zellen, können verwendet
werden.
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Zellen (z. B. autologe Zellen) können gegebenenfalls
in vitro gezüchtet
werden, um die Anzahl der für
das Animpfen auf dem Polymermatrix-"Gerüst" verfügbaren Zellen
zu erhöhen.
Die Verwendung von allogenen Zellen und insbesondere von autologen
Zellen wird bevorzugt, um eine Gewebeabstoßung zu verhindern. Wenn jedoch
bei dem Subjekt nach der Implantation des RUG eine immunologische
Reaktion auftritt, kann das Subjekt mit immunosuppressiven Mitteln,
z. B. mit Cyclosporin oder FKS06, behandelt werden, um die Wahrscheinlichkeit
einer Abstoßung
des RUG zu verringern. Bei bestimmten Ausführungsformen können chimäre Zellen oder
Zellen aus einem transgenen Tier auf die Polymermatrix geimpft werden.
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Zellen können vor dem Impfvorgang mit
genetischem Material transfiziert worden sein. Bei einem geeigneten
genetischen Material kann es sich beispielsweise um genetische Sequenzen
handeln, die dazu befähigt
sind, eine Immunantwort beim Wirt zu verringern oder zu beseitigen.
Beispielsweise kann die Expression von Zelloberflächen-Antigenen, wie
der Histokompatibilitätsantigene
der Klassen I und II, unterdrückt
werden. Dadurch kann die Möglichkeit
eröffnet
werden, die transplantierten Zellen einer verminderten Abstoßungsgefahr
durch den Wirt auszusetzen. Außerdem
kann eine Transfektion auch zur Genübertragung verwendet werden.
Urotheliale Zellen und Muskelzellen können vor dem Beimpfen des Polymeren
mit speziellen Genen transfiziert werden. Der Zell-Polymer-Aufbau
kann genetische Informationen tragen, die für ein Langzeitüberleben
des Wirts oder des gewebetechnisch hergestellten neuen Organs erforderlich
sind. Beispielsweise können
die Zellen so transfiziert sein, dass sie Insulin zur Behandlung
von Diabetes exprimieren.
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Zellkulturen können mit oder ohne eine Zellfraktionierungsstufe
hergestellt werden. Eine Zellfraktionierung kann unter Anwendung
von Techniken, z. B. durch fluoreszierend-aktiviertes Zellsortieren, die
dem Fachmann geläufig
sind, durchgeführt
werden. Die Zellfraktionierung kann auf der Grundlage der Zellgröße, des
DNA-Gehalts, der Zelloberflächenantigene
und der Lebensfähigkeit
vorgenommen werden. Beispielsweise können urotheliale Zellen angereichert
und glatte Muskelzellen und Fibroblastenzellen in Bezug auf den
Gehalt an urothelialen Zellen verringert werden. Gleichermaßen können glatte
Muskelzellen angereichert und der Anteil an urothelialen Zellen
und Fibroblastenzellen bei der Gewinnung der glatten Muskelzellen
verringert werden. Obgleich eine Zellfraktionierung herangezogen werden
kann, ist diese für
die erfindungsgemäße Praxis
nicht erforderlich.
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Eine Zellfraktionierung kann beispielsweise erwünscht sein,
wenn der Spender Krankheiten, z. B. Blasenkrebs oder Metastasen
anderer Tumoren an der Blase, hat. Eine Blasen-Zellpopulation kann
einer Sortierung unterzogen werden, um maligne Blasenzellen oder
andere Tumorzellen von normalen Nichtkrebs-Blasenzellen abzutrennen.
Diese normalen Nichtkrebs-Blasenzellen,
die durch eine oder mehrere Sortierungstechniken isoliert worden
sind, können sodann
für die
Blasenrekonstruktion verwendet werden.
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Eine weitere fakultative Vorgehensweise
bei dem Verfahren ist die Kryokonservierung. Eine kryogene Konservierung
kann sich beispielsweise als wertvoll erweisen, um die Notwendigkeit
von mehrfachen invasiven chirurgischen Eingriffen zu verringern.
Aus einer Blase entnommene Zellen können vermehrt werden. Ein Teil
der vermehrten Zellen kann verwendet und ein weiterer Teil kann
kryogen konserviert werden. Die Eignung zur Amplifikation und Konservierung
von Zellen ermöglicht
eine erhebliche Flexibilität
bei der Wahl der Spenderzellen. Beispielsweise können Zellen eines histologisch
verträglichen
Spenders vermehrt und bei mehr als einem Empfänger eingesetzt werden.
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Ein weiteres Beispiel für die Eignung
der kryogenen Konservierung besteht in Gewebebanken. Spenderzellen
können
unter Zuordnung der entsprechenden Histokompatibilitätsdaten
kryokonserviert werden. Spenderzellen können beispielsweise in einer
Spendergewebebank aufbewahrt werden. Wenn Gewebe für eine Blasenrekonstruktion
benötigt
wird, können
die Zellen ausgewählt
werden, bei denen die beste histologische Verträglichkeit für den Patienten gegeben ist.
Bei Patienten, die Krankheiten aufweisen oder Behandlungen unterliegen,
bei denen eine Gefährdung
der Blase gegeben ist, kann eine Biopsieprobe der Blase kryogen
konserviert werden. Wenn dann später
die eigene Blase des Patienten ausfällt, können die kryogen konservierten
Blasenzellen aufgetaut und für
die Behandlung eingesetzt werden. Wenn beispielsweise nach einer
Blasenrekonstruktion erneut Blasenkrebs auftritt, können kryogen
konservierte Zellen für
die Blasenrekonstruktion verwendet werden, ohne dass es erforderlich
ist, weiteres Gewebe des Patienten für die Kultur zu isolieren.
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Beimpfen
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Das Überimpfen der Zellen auf die
Polymermatrix kann beispielsweise gemäß der im Beispielteil beschriebenen
Verfahrensweise oder nach üblichen Verfahren
vorgenommen werden. Beispielsweise wurde ein Überimpfen von Zellen auf polymere
Substrate zur Verwendung bei der Gewebereparatur von A. Atala et
al., J. Urol., Bd. 148 (2 Pt 2) (1992), S. 658–662, und von A. Atala et al.,
J. Urol., Bd. 150 (2 Pt 2) (1993), S. 608–612, beschrieben. In Kultur
gezüchtete
Zellen können
zur Auftrennung der Zellen trypsiniert werden. Die getrennten Zellen
können
auf die Polymermatrix überimpft
werden. Alternativ können
aus einer Zellkultur erhaltene Zellen von einer Kulturplatte als
Zellschicht abgehoben werden. Die Zellschicht kann direkt auf die
Polymermatrix ohne vorherige Abtrennung der Zellen überimpft
werden.
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In einer bevorzugten Ausführungsform
werden mindestens 50 Millionen Zellen im Medium suspendiert und
pro cm2 einer Oberfläche einer Polymermatrix aufgetragen.
Die Polymermatrix wird unter üblichen
Züchtungsbedingungen,
z. B. 37°C
und 5% CO2, für eine Zeitspanne, bis die
Zellen anhaften, inkubiert. Es ist jedoch ersichtlich, dass die
Dichte der auf das Polymersubstrat überimpften Zellen variiert werden
kann. Beispielsweise fördern
höhere
Zelldichten eine stärkere
Gewebebildung durch die überimpften
Zellen, während
geringere Dichten eine relativ größere Bildung von Gewebe durch
Zellen, die vom Wirt stammen und das Transplantat infiltrieren, ermöglichen.
Weitere Animpftechniken können
je nach der Polymermatrix und den Zellen herangezogen werden. Beispielsweise
können
die Zellen auf die Polymermatrix durch Vakuumfiltration aufgetragen
werden. Die Wahl der Zelltypen und das Überimpfen von Zellen auf eine
Polymermatrix sind für den
Fachmann angesichts der hier vermittelten Lehre routinemäßige Vorgänge.
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Bei einer erfindungsgemäßen Ausführungsform
wird eine Polymermatrix auf zwei Seiten mit unterschiedlichen Populationen
von Zellen beimpft. Dies kann durchgeführt werden, indem man zunächst eine
Seite der Polymermatrix und anschließend die andere Seite beimpft.
Beispielsweise kann die Polymermatrix mit einer Seite nach oben
abgelegt und beimpft werden. Sodann kann die Polymermatrix so umgedreht
werden, dass die zweite Seite oben liegt. Sodann kann die zweite
Seite mit einer zweiten Population von Zellen beimpft werden. Alternativ können beide
Seiten der Polymermatrix gleichzeitig beimpft werden. Beispielsweise
können
zwei Zellkammern auf beiden Seiten (d. h. sandwichartig) der Polymermatrix
positioniert werden. Die beiden Kammern können mit unterschiedlichen
Zellpopulationen gefüllt
werden, um beide Seiten der Polymermatrix gleichzeitig zu beimpfen.
Die sandwichartige Polymermatrix kann gedreht oder häufig gewendet
werden, um beiden Zellpopulationen die Möglichkeit zum gleichmäßigen Anhaften
zu geben. Eine gleichmäßige Beimpfung
kann bevorzugt sein, wenn die Poren der Polymermatrix für eine Zellpassage
von einer Seite zur anderen Seite groß genug sind. Durch gleichzeitiges
Beimpfen der Polymermatrix auf beiden Seiten wird die Wahrscheinlichkeit
verringert, dass die Zellen zur gegenüberliegenden Seite wandern.
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Bei einer weiteren Ausführungsform
der Erfindung können
zwei getrennte Polymermatrices mit unterschiedlichen Zellpopulationen
beimpft werden. Nach dem Beimpfen können die beiden Matrices verbunden
werden, um eine einzige Polymermatrix mit zwei verschiedenen Zellpopulationen
auf den beiden Seiten zu bilden. Ein Anbringen der Matrices aneinander
kann unter Anwendung üblicher
Verfahren, z. B. mit Fibrin-Klebstoff, flüssigen Copolymeren, Nahtmaterial
und dergl., durchgeführt
werden.
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Chirurgische
Rekonstruktion
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Das Transplantieren von polymeren
Matrices auf ein Organ oder Gewebe zur Erzielung einer Verstärkung kann
nach in den Beispielen beschriebenen Verfahren oder nach aus dem
Stand der Technik bekannten Verfahren vorgenommen werden. Wie in den
Beispielen dargelegt, kann die Polymermatrix auf ein Organ oder
Gewebe eines Subjekts transplantiert werden, indem man das Transplantationsmaterial
an das Zielorgan annäht.
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Die erfindungsgemäßen Techniken können auch
zur Behandlung von Blasenkrebs herangezogen werden. Beispielsweise
kann eine Probe von normalem Blasengewebe bei einem an Blasenkrebs leidenden
Patienten herausgeschnitten werden. Urotheliale Zellen und glatte
Muskelzellen aus der Gewebeprobe können in vitro für eine bestimmte
Zeitspanne gezüchtet
und vermehrt werden. Die Zellen können unter Verwendung eines
fluoreszierend-aktivierten Zellsortiergeräts zur Entfernung von kanzerösen oder
präkanzerösen Zellen
sortiert werden. Die sortierten Zellen können sodann zum Aufbau eines
RUG verwendet werden. Gleichzeitig kann der Patient auf Krebs behandelt
werden. Die Krebsbehandlung kann das Herausschneiden des kanzerösen Blasenteils neben
einer Chemotherapie oder Strahlungsbehandlung beinhalten. Nach der
Krebsbehandlung kann der RUG zur Rekonstruktion der Blase verwendet werden.
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Obgleich im Beispielteil ein Verfahren
zur Blasenrekonstruktion beschrieben ist, können auch andere Verfahren
zum Anheften eines Transplantats an ein Organ oder Gewebe des Subjekts
(z. B. unter Verwendung von chirurgischen Klammern) herangezogen
werden. Derartige chirurgische Verfahren können vom Fachmann gemäß bekannten
Verfahren durchgeführt
werden.
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Infolge dieser vorteilhaften Merkmale
eignet sich das vorliegende Verfahren der rekonstruktiven Blasenchirurgie
für eine
Reparatur von Blasengewebe unter zahlreichen Umständen. Wie
vorstehend beschrieben, kann das Blasentransplantat zur Reparatur
einer geschädigten
Blase herangezogen werden.
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Weitere Ausführungsformen und Vorteile der Erfindung
ergeben sich teils aus der nachstehenden Beschreibung und werden
teils durch die Beschreibung nahegelegt und lassen sich bei der
praktischen Ausführung
der Erfindung realisieren.
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Beispiele
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Beispiel 1
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Herstellung
von blasenförmigen
Polymeren
-
Eine synthetische Polymermatrix aus
Polyglykolsäure
mit einem durchschnittlichen Faserdurchmesser von etwa 15 μm, einem
Abstand zwischen den Fasern von etwa 0 bis etwa 200 μm und Abmessungen
von etwa 10 cm × etwa
10 cm wurde unter Verwendung von biologisch abbaubarem 4-0-Polyglactin-910-Nahtmaterial
zu einer Blasenform geformt. Das erhaltene flexible Gerüst wurde
mit einem verflüssigten
Copolymeren, einem Gemisch aus etwa 50% Poly-DL-lactid-co-glycolid
und etwa 50% 80 mg/ml Methylenchlorid beschichtet, um angemessene
mechanische Eigenschaften zu erreichen. Nach Sterilisation mit Ethylenoxid
wurden die Polymeren in einem Exsikkator aufbewahrt.
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Beispiel 2
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Ernten und
Züchten
von Zellen
-
Insgesamt 14 Beagle-Hunde wurden
einer Zystektomie unter Aussparung des Trigonums unterzogen. Die
Tiere wurden willkürlich
einer von drei Gruppen zugeordnet. Zwei Tiere wurden der Gruppe A
zugeordnet. Bei ihnen wurde das Trigonum ohne eine rekonstruktive
Maßnahme
geschlossen. 6 Tiere wurden der Gruppe B zugeordnet. Bei ihnen wurde eine
Blasenrekonstruktion mit einem zellfreien, blasenförmigen,
biologisch abbaubaren Polymeren durchgeführt. 6 Tiere wurden der Gruppe
C zugeordnet. Bei ihnen wurde eine Blasenrekonstruktion unter Verwendung
eines vorgefertigten, mit Gewebe hergestellten Neuorgans durchgeführt. Das
Neuorgan umfasste ein blasenförmiges,
biologisch abbaubares Polymeres mit autologen urothelialen Zellen,
die an der Hohlraumoberfläche
hafteten, und mit glatten Muskelzellen, die an der äußeren Oberfläche hafteten.
Die Zellpopulationen waren getrennt voneinander aus einer vorher
gewonnenen, autologen, transmuralen Blasenprobe vermehrt worden.
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Die 6 Tiere der Gruppe C, bei denen
eine Rekonstruktion mit einem mit Gewebe verarbeiteten, neuen Organ
vorgenommen wurde, wurden einer transmuralen Blasenbiopsie von etwa
1 cm2 unterzogen, die aus der Blasenwölbung über einen
minimalen suprapubischen Mittellinienschnitt unter Vollnarkose gewonnen
wurde. Der Defekt wurde mit 4-0-Polyglactin-910-Nahtmaterial geschlossen. Die Blasenproben
wurden in einem vorgewärmten
Keratinozyten-Medium gehalten. Die Zellernte für in vitro-Kulturen wurde unmittelbar nach der
Gewebeentnahme eingeleitet.
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Urotheliale Zellpopulationen und
glatte Muskelzellpopulationen, die aus den 1 cm2-Blasenbiopsien
dissoziiert worden waren, konnten routinemäßig vermehrt und getrennt Passagen
unterzogen werden. Die durchschnittliche Zeitspanne von der anfänglichen
Blasenbiopsie bis zur endgültigen
Implantation der mit Gewebe verarbeiteten neuen Organe betrug 32 ± 2,8 Tage
(Mittelwert ± SD).
Etwa 32 25 cm-Platten von jedem Zelltyp, nämlich Muskelzellen und urotheliale
Zellen, die etwa 10% Zellen pro Platte enthielten, wurden zur Herstellung
eines mit Gewebe verarbeiteten neuen Organs verwendet.
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Die geernteten Zellen wurden nach
den Verfahren von Atala et al. (J. Urol., Bd. 150 (1993), S. 608)
und Cilento et al. (J. Urol., Bd. 152 (1994), S. 655) gezüchtet. Die
urothelialen Zellen und die Muskelzellen der Blasenbiopsie wurden
mikrochirurgisch voneinander gelöst
und getrennt verarbeitet. Kurz zusammengefasst, das ausgeschnittene
glatte Muskelgewebe wurde in Würfel
von etwa 1 mm Kantenlänge zerschnitten
und zunächst
auf einer 10 cm-Gewebekultur-Petri-Schale ausgestrichen. Die Kulturen
der glatten Muskelzellen wurden mit Dulbecco-modifiziertem Eagle-Medium
(DMEM, Sigma, St. Louis, MO), das mit 10% fötalem Kälberserum (Biowhittaker Inc.,
Walkersville, MD) ergänzt
war, gehalten und vermehrt. Die urothelialen Zellen wurden ebenfalls
in Würfel
von 1 mm Kantenlänge
zerschnitten und auf Platten mit 24 Vertiefungen ausgestrichen.
Die urothelialen Kulturen wurden in serumfreien Keratinozyten-Wachstumsmedium,
das mit etwa 5 ng/ml epidermalem Wachstumsfaktor und etwa 50 μg/ml Rinder-Hypophysenextrakt
ergänzt
war (Gibco BRL, Life Technologies, Grand Island, NY), gehalten und
vermehrt. Sämtliche
Zellkulturen wurden bei 37°C
in einer befeuchteten Atmosphäre
mit etwa 5% Kohlendioxid inkubiert. Das Medium wurde 2-mal wöchentlich ausgetauscht.
Für die
Zellpassage wurden Kulturen mit einer Konfluenz von etwa 80% durch
5-minütige Inkubation
in 0,05% Trypsin in 1 mmol Ethylendiamintetraessigsäure trypsiniert.
Nach dieser Zeitspanne wurde die Zellsuspension mit Sojabohnen-Trypsininhibitor
in einer Menge von 2 Einheiten pro 1 Einheit Trypsin versetzt. Sowohl
die urothelialen Zellen als auch die glatten Muskelzellen wurden
getrennt vermehrt, bis ausreichende Zellmengen für eine Animpfdichte von etwa
1 Million Zellen pro cm2 Polymeroberfläche verfügbar waren.
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Beispiel 3
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Überimpfen
von Zellen auf ein Polymergerüst
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Für
jedes mit Gewebe verarbeitete neue Organ wurden etwa 32 konfluente
25 cm-Platten der einzelnen Zelltypen, nämlich Muskel und Urothel, für das Überimpfen
bearbeitet. Muskelzellkulturen wurden trypsiniert, gewonnen, gewaschen
und in einem Röhrchen
vereinigt. Die äußere Oberfläche der
vorgeformten, blasenförmigen
Polymermatrix wurde mit der resuspendierten Population der glatten
Muskelzellen beimpft. Die mit Zellen beimpften Polymeren wurden
in Dulbecco-modifiziertem Eagle-Medium (DMEM,
Sigma, St. Louis, MO), das mit 10% fötalem Kälberserum (Biowhittaker Inc.,
Walkersville, MD) ergänzt
war, inkubiert. Das Medium wurde im Abstand von 12 Stunden ausgetauscht,
um eine ausreichende Nährstoffzufuhr
zu gewährleisten.
Nach 48-stündiger Inkubation
wurden die urothelialen Zellen auf ähnliche Weise bearbeitet und
auf die Hohlraumoberfläche
des Polymeren geimpft.
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Beispiel 4
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Blasenrekonstruktion
-
Im Anschluss an die Vorbehandlung
durch eine intramuskuläre
Injektion von 0,1 mg Acepromazin pro kg Körpergewicht wurde ein chirurgischer
Eingriff unter intravenöser
Pentobarbital-Anästhesie
mit etwa 25 bis etwa 35 mg pro kg Körpergewicht unter endotrachialer
Luftzufuhr durchgeführt.
Etwa 500 mg Cefazolin-natrium wurden intravenös sowohl präoperativ als auch intraoperativ
verabreicht. Eine zusätzliche
subkutane Behandlung mit Cefazolin-natrium erfolgte an 5 postoperativen
Tagen in einer Dosis von etwa 30 mg pro kg Körpergewicht pro Tag. Eine postoperative
analgetische Behandlung wurde durch subkutane Injektionen von etwa
0,1 bis etwa 0,6 mg Butorphanol pro kg Körpergewicht durchgeführt.
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Wie in 1A gezeigt,
wurde eine Mittellinien-Laparotomie durchgeführt. Die Blasenwand wurde freigelegt
(1A) und beide Harnleiter
wurden identifiziert. Die Blasenwand wurde ventral eingeschnitten.
Beide Harnleiteranschlüsse
wurden sichtbar gemacht und zeitweise mit 4 F-Stents intubiert. Eine
subtotale Zystektomie wurde durchgeführt, wobei der Trigonumbereich,
der die Harnröhren-
und Harnleiter-Anschlüsse
trägt,
ausgespart wurde. Es wurde dafür
gesorgt, dass die Harnleiter nicht beeinträchtigt oder verstopft wurden.
Bei zwei Tieren wurde das Trigonum ohne jegliches Polymertransplantat mit
zwei Lagen 4-0-Vicryl geschlossen. Wie in 1B dargestellt, wurde bei 12 Tieren eine
Anastomose zwischen der blasenförmigen
Polymermatrix und dem Trigonum mit laufender Interlock-Naht aus 4-0-Vicryl
durchgeführt.
Von den 12 Tieren erhielten 6 Tiere nur ein blasenförmiges Polymeres
und 6 Tiere ein mit Zellen beschichtetes, blasenförmiges Polymeres.
Ein 10 F-Silicon-Katheter
wurde in die Harnröhre
ausgehend vom Trigonum in retrograder Weise eingesetzt. Ein suprapubischer
8 F-Katheter wurde in den Blasenhohlraum unter Passage durch einen
kurzen submukosalen Tunnel im Trigonumbereich eingebracht. Der suprapubische
Katheter wurde an der Blasen-Serosa mit einem Pursestring-Nahtmaterial aus
4-0-Chromic befestigt. Die Anastomose zwischen dem Trigonum und
dem Transplantat wurde an jedem Quadranten mit dauerhaftem Polypropylen-Nahtmaterial
markiert, um eine zukünftige
Identifikation der Transplantationsstelle zu gewährleisten. Die neue Blase wurde
mit Fibrin-Klebstoff (Vitex Technologies Inc., New York, NY) bedeckt.
Wie in 1C dargestellt,
wurde um das neue Reservoir Omentum gewickelt und befestigt. Das
Abdomen wurde mit drei Lagen 3-0-Vicryl geschlossen. Nach Erholung
von der Anästhesie
trugen sämtliche
Tiere Krägen,
um eine Manipulation an der Wunde und am Katheter während der
frühen
postoperativen Phase zu verhindern. Die transurethralen Katheter
wurden zwischen den postoperativen Tagen 4 und 7 entfernt. Zystogramme
wurden etwa 4 Wochen postoperativ aufgenommen, und zwar unmittelbar
vor der Entfernung des suprapubischen Katheters. Zystogramme und
urodynamische Untersuchungen wurden seriell nach dem chirugischen
Eingriff nach etwa 1, etwa 2, etwa 3, etwa 4, etwa 6 und etwa 11
Monaten vorgenommen.
-
Beispiel 5
-
Analyse der
rekonstruierten Blase
-
Urodynamische Untersuchungen und
radiographische Zystogramme wurden präoperativ und postoperativ etwa
1, etwa 2, etwa 3, etwa 4, etwa 6 und etwa 11 Monate nach dem chirurgischen
Eingriff durchgeführt.
Die 2 Tiere, bei denen das Trigonum ohne eine rekonstruktive Maßnahme geschlossen worden
war, wurden nach etwa 11 Monaten getötet. Tiere aus den restlichen
beiden Versuchsgruppen wurden etwa 1, etwa 2, etwa 3, etwa 4, etwa
6 und etwa 11 Monate nach dem chirurgischen Eingriff getötet. Die
Blasen wurden einer groben histologischen und immunozytochemischen
Analyse unterzogen.
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Urodynamische Untersuchungen wurden
unter Verwendung eines transurethralen 7 F-Doppelhohlraum-Katheters
vorgenommen. Die Blasen wurden entleert. Der intravesikale Druck
wurde während des
Einträufelns
einer vorgewärmten
Kochsalzlösung
mit konstanter Geschwindigkeit aufgezeichnet. Die Aufzeichnungen
wurden fortgesetzt, bis Leckagepunktdrücke (LPP) erreicht wurden.
Das maximale Blasenfassungsvermögen
(Volmax), der LPP-Wert und die Blasen-Compliance
(Volmax/LPP) wurden dokumentiert. Die Blasen-Compliance,
auch als Blasennachgiebigkeit bezeichnet, gibt die Fähigkeit
gegenüber
Druck- oder Krafteinwirkungen ohne Zerreißen nachzugeben, wieder. Die
Blasen-Compliance
stellt auch ein Maß für die Fähigkeit,
gegenüber
Druck- oder Krafteinwirkungen ohne Reißen nachzugeben, dar, als Ausdruck
der Dehnbarkeit der Blase. Sie wird üblicherweise in Einheiten der
Volumenänderung
pro Einheit der Druckänderung
gemessen. Anschließend wurden
radiographische Zystogramme aufgenommen. Die Blasen wurden entleert
und Kontrastmedium wurde intravesikal unter fluoroskopischer Kontrolle
eingeträufelt.
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Urodynamische
Ergebnisse
-
Vor der Zystektomie unter Aussparung
des Trigonums unterschieden sich die Tiere der Gruppen A, B und
C hinsichtlich des durchschnittlichen präoperativen Blasenfassungsvermögens (78 ± 16 ml,
63 ± 22
ml, 69 ± 8
ml, p = 0,44), (Mittelwert ± SD)
oder hinsichtlich der präoperativen
Blasen-Compliance (2,6 ± 0,2 ml/cm
H2O, 2,2 ± 1,2 ml/cm H2O,
2,1 ± 1,1 ml/cm
H2O, p = 0,85), (Mittelwert ± SD) nicht
signifikant.
-
Die beiden Kontrolltiere, die nach
der subtotalen Zystektomie keiner Rekonstruktion unterzogen wurden,
konnten während
des Beobachtungszeitraums nur 22% (± 2%) des nativen Fassungsvermögens aufrechterhalten.
Bei diesen Tieren ergab sich offensichtlich ein häufiges Entleerungsverhalten.
Die mit den zellfreien Polymeren rekonstruierten Tiere entwickelten
durchschnittliche Blasenkapazitäten von
46% (± 20%)
der präoperativen
Werte. Eine durchschnittliche Blasenkapazität von 95% (± 9%) des ursprünglichen
Volumens vor der Zystektomie wurde bei den mit gewebebehandelten
Ersatzblasen erreicht (2A).
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Die Blasen mit subtotaler Zystektomie,
bei denen keine Rekonstruktion vorgenommen worden war, zeigten eine
ausgeprägte
Verringerung der Blasen-Compliance auf Mittelwerte von 10% (± 3%) der präoperativen
Werte. Sämtliche
Implantate, die ausschließlich
das Polymere ohne Zellen umfassten, zeigten einen erheblichen Compliance-Verlust. Zu den verschiedenen
Tötungszeitpunkten
war die Blasen-Compliance
auf einen Mittelwert von 42% (± 21%)
der präoperativen
Werte verringert. Die Compliance der mit Gewebe behandelten Blasen
ergab fast keinen Unterschied zu den präoperativen Werten, die an der
nativen Blase gemessen worden waren (106% ± 16%, 2B).
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Klinisch zeigten sämtliche
Tiere einen stabilen Verlauf nach der Blasenrekonstruktion, konnten nach
Katheterentfernung spontan entleeren und überlebten während der vorgesehenen Untersuchungsdauer.
1 Monat nach dem chirurgischen Eingriff ergaben radiographische
Zystogramme bei sämtlichen
Tieren ein wasserdichtes Reservoir. Zystogramme der nur der subtotalen
Zystektomie unterzogenen Tiere ergaben, dass die unverstärkten Trigonum-Bereiche
während
der gesamten Versuchsdauer nur zur Regeneration minimaler Reservoirkapazitäten befähigt waren.
Die Implantate mit dem Polymeren allein zeigten Anzeichen eines
partiellen Transplantatkollapses. Die mit Gewebe behandelten Blasen
waren vollständig
dehnbar. Ihre Umrisse konnten aus dem nativen Trigonum gezeichnet
werden. Während
der anschließenden
Zystogramme zeigten die Implantate mit dem Polymeren allein fortlaufend
kleiner bemessene Reservoirs, während
die mit Gewebe behandelten Blasen in Bezug auf Größe und Aufbau
einen normalen Eindruck machten (3).
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Beispiel 6
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Grobe Befunde
-
Zu den vorgesehenen Zeitpunkten wurden die
Tiere durch intravenöse
Verabreichung von Pentobarbital getötet. Die inneren Organe und
der Urogenitaltrakt wurden auf grobe Abnormalitäten untersucht. Die Blase wurde
entnommen. Die Markierungsnähte,
die die Übergangszone
zwischen dem nativen Trigonum und dem Transplantat identifizierten,
wurden freigelegt.
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Schnitte wurden innerhalb des nativen
Trigonums, der gekennzeichneten Übergangszone
und dem proximalen Bereich der neuen Blase genommen.
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Zystektomie unter Aussparung nur
des Trigonums (Gruppe A): Die Reservoirs waren klein, zeigten aber
ein normales Aussehen (4A und
B).
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Blasen nur mit Polymerem (Gruppe
B): Eine grobe Inspektion des nach 1 Monat entnommenen zellfreien
Polymerimplantats ergab, dass der ursprüngliche kugelförmige Aufbau
des Polymeren partiell kollabiert war. Nach 2 Monaten wurde ein
solitärer,
asymptomatischer Blasenstein von 11 mm gefunden, der bei dieser
Untersuchung der einzige Fall von Lithogenese war. Nach 2 Monaten
ergab sich bei der Nekropsie makroskopisch eine Transplantatschrumpfung
von etwa 50. Die nach 4, 6 und 11 Monaten entnommenen Blasen enthielten
zunehmende Bildungen von dickem Narbengewebe an der Kuppel und waren
stark mit anhaftendem Omentum bedeckt (4C und D).
Nach 11 Monaten ergab sich makroskopisch eine Transplantatschrumpfung von
mehr als 90%. Die ursprünglich
angebrachten Polypropylen-Markierungsnähte wurden im Bereich des Trigonums
neben dem Narbengewebe festgestellt. Etwa 10% der gesamten Blasenfläche befand sich
oberhalb der Markierungsnähte.
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Mit Gewebe behandelte neue Organe
(Gruppe C): Die Autopsieuntersuchung ergab keine Anzeichen in Bezug
auf Obstruktion des oberen Trakts, Lithogenese, Verkrustung oder
andere Abnormalitäten zu
sämtlichen
Untersuchungszeitpunkten. Nach 1 Monat blieb das Polymergerüst im Innern
der mit Omentum umwickelten, mit Gewebe behandelten neuen Blase
sichtbar und durch Palpation identifizierbar. Die neuen Blasen wiesen
einen flexiblen und dehnbaren Aufbau auf. Nach 6 und 11 Monaten konnten
omentale Anhaftungen stumpf von der Blasenkuppel abgetrennt werden.
Eine Serosa-artige Schicht hatte sich über dem mit Gewebe behandelten neuen
Organ regeneriert (4E).
Die zu Beginn angebrachten Polypropylen-Markierungsnähte wurden im distalen Bereich
der Blase auf der Höhe
des Trigonums festgestellt. Etwa 70% des gesamten Blasenbereichs
befanden sich oberhalb der Markierungsnähte. Beim ventralen Eintritt
in die Blase wurde eine glatte Schleimhautoberfläche ohne jegliche Unterschiede
zwischen der nativen und der mit Gewebe behandelten Blase festgestellt
(4F).
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Während
der Dauer der Untersuchung zeigte keiner der Hunde irgendwelche
ungünstige
Effekte. Sämtliche
Tiere überlebten
bis zu dem Zeitpunkt, an dem sie getötet wurden, ohne merkliche
Komplikationen, wie einer Infektion des Harntraktes oder der Bildung
von Steinen. Eine fluoroskopische Zystographie sämtlicher verstärkten Blasen
ergab einen normalen Blasenaufbau ohne jegliche Leckagen nach 1, 2
und 3 Monaten im Anschluss an die Behandlung.
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Bei der Entnahme erwiesen sich die
verstärkten
Blasen als weitgehend normal ohne jegliche Anzeichen einer Divertikelbildung
im Transplantatbereich. Die Dicke des transplantierten Segments
war ähnlich
der Dicke des nativen Blasengewebes. Es gab keine Anzeichen für Anhaftungen
oder Fibrose. Histologisch enthielten sämtliche entnommenen Blasen
einen normalen Zellaufbau aus einem mit Urothelzellen verkleideten
Hohlraum, der von submukosalem Gewebe und glatter Muskulatur umgeben
war. Bei sämtlichen
Proben war eine angiogene Reaktion ersichtlich.
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Beispiel 7
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Histologische
und immunozytochemische Befunde
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Proben wurden mit 10% gepuffertem
Formalin fixiert und bearbeitet. Gewebeschnitte von etwa 4 bis etwa
6 μm wurden
für die
routinemäßige Färbung mit
Hematoxylin und Eosin (H&E)
und Masson-Trichrome hergestellt. Immunozytochemische Färbeverfahren
wurden mit mehreren spezifischen primären Antikörpern durchgeführt, um
die Differenzierung von urothelialen Zellen und glatten Muskelzellen
in den entnommenen Blasen zu charakterisieren. Anti-Desmin-Antikörper (monoklonales
NCL-DES-DERII, Klon DE-R-11, Novocastra®, Newcastle,
UK), der mit Teilen des Zwischenfilament-Muskelzellproteins Desmin
reagiert, und Anti-Alpha Smooth Muscle Actin-Antikörper (monoklonales
NCL-SMA, Klon asm-1, Novocastra®, Newcastle,
UK), der Actin der glatten Muskelzellen der Blase markiert, wurden
als allgemeine Marker für
die Differenzierung der glatten Muskulatur verwendet. Anti-Pancytokeratine-AE1/AE3-Antikörper (monoklonal,
Katalog Nr. 1124 161, Boehringer Mannheim®) und
Anti-Zytokeratin
7-Antikörper
(NCL-CK7, Klon LP5K, IgG2b, NovocastraR, Newcastle, UK), die mit
Zwischenfilamenten, die einen Teil des zytoskeletalen Komplexes
in Epithelgeweben bilden, reagieren, wurden zur Identifizierung
von Urothel verwendet. Eine Anti-Asymmetric Unit Membrane (AUM)-Färbung unter
Verwendung von polyklonalen Antikörpern wurde zur Untersuchung
des Vorliegens von Säugetier-Uroplakinen, die
apikale Plaques in Säugetier-Urothel
bilden und eine wichtige funktionelle Rolle während der fortgeschrittenen
Stadien der Urothel-Differenzierung darstellen, verwendet. Anti-S-100-Antikörper (Sigma®, St.
Louis MO, Nr. IMMH-9), der mit dem sauren, calciumbindenden Protein
5–100
reagiert, die hauptsächlich
in Schwann-Zellen und glialen Elementen im Nervensystem vorhanden
sind, wurde zur Identifizierung von neuralen Geweben verwendet.
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Proben wurden in Carnoy-Lösung fixiert
und routinemäßig für die Immunofärbung bearbeitet.
Eine Hochtemperatur-Antigen-Demaskierungsvorbehandlung
mit etwa 0,1% Trypsin wurde unter Verwendung einer handelsüblichen
Testpackung entsprechend den Empfehlungen des Herstellers eingesetzt
(Sigma®,
St. Louis MO, T-8 128). Antigenspezifische, primäre Antikörper wurden auf deparaffinierte
und hydratisierte Gewebeschnitte aufgebracht. Negative Kontrollen
wurden mit reinem Serum anstelle des primären Antikörpers behandelt. Positive Kontrollen
bestanden aus normalem Blasengewebe. Nach Waschen mit phosphatgepufferter
Kochsalzlösung
wurden die Gewebeschnitte mit einem biotinylierten sekundären Antikörper inkubiert
und erneut gewaschen. Ein Peroxidase-Reagenz wurde zugegeben. Bei
Substratzugabe wurden die Stellen der Ablagerung von Antikörper durch
einen braunen Niederschlag sichtbar gemacht. Eine Gegenfärbung wurde mit
Gill-Hematoxylin durchgeführt.
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Nur Zystektomie unter Aussparung
des Trigonums (Gruppe A): Die einer Zystektomie unter Aussparung
des Trigonums unterworfenen Organe zeigten einen normalen histologischen
Aufbau, was durch immunozytochemische Färbung bestätigt wurde.
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Blasen nur mit Polymerem (Gruppe
B): Es wurde festgestellt, dass die implantierten Polymeren ohne
Zellen einer fibrovaskulären
Reaktion unterlagen, die aus einer Fibroblasten-Ablagerung und einer ausgedehnten
Ansammlung von entzündlichen
Zellen, einschließlich
Makrophagen, bestanden, wobei nach 1 Monat überall Anzeichen von Angiogenese vorlagen.
Die Epithelbedeckung war am gesamten Polymeren sichtbar. Das Epithel
zeigte eine positive Färbung
auf die breit reagierenden anti-Panzytokeratine
AE1/AE3, auf anti-Zytokeratin 7 und das urothelspezifische anti-AUM.
An den Stellen von Polymerabbau wurde fibrotisches Gewebe festgestellt.
2, 3 und 4 Monate später
zeigte sich eine Ausdehnung der nativen submukosalen und muskulären Schicht des
Trigonums auf den fibrotischen Polymerbereich an der Übergangszone.
Bei den Proben nach 6 und 11 Monaten hatte eine reichliche Bildung
von Bindegewebe die vollständig
abgebauten Polymerfasern der proximalen Region der neuen Blase ersetzt.
In diesem Bereich waren die alpha-Actinpositiven glatten Muskelzellen
nur spärlich
sichtbar.
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Mit Gewebe behandelte neue Organe
(Gruppe C): Das nach 1 Monat gewonnene, mit Gewebe behandelte neue
Organ zeigte eine vollständige Hohlraumbedeckung
mit Urothel. Das Epithel ergab eine positive Färbung auf die breit reagierenden
anti-Panzytokeratine AE1/AE3, auf anti-Zytokeratin 7 und auf das urothelspezifische
anti-AUM. Die Polymerfasern trugen Zellbildungen, die auf alpha-Actin der
glatten Muskeln eine positive Färbung
ergaben. Es war eine angemessene angiogenetische Reaktion ersichtlich.
Nach 2 Monaten (bevor die Polymeren vollständig biologisch abgebaut waren)
wiesen die Muskelfasern eine räumliche
Anordnung auf, wobei Bündel
von variabler Größe entstanden
waren. Nach 3 Monaten ergab sich ein vollständiger Polymerabbau und eine
dreischichtige Struktur war im proximalen Bereich der neuen Blase
sichtbar, die aus einer morphologisch normalen Uroepithel-Verkleidung über einer
Submucosa-Hülle bestand,
gefolgt von einer Schicht mit einem Gehalt an multiformen glatten Muskelbündel. 6
Monate nach der Operation ergab sich erstmals ein Einwachsen von
neuralem Gewebe, wie durch 5-100-Färbung nachgewiesen wurde. Es
wurde festgestellt, dass die Blasen zu einer normalen histologischen
und phänotypischen
Struktur gereift waren, wie sich durch ihre Färbung mit Hematoxylin und Eosin,
Trichrome, alpha-Actin der glatten Muskeln, Desmin, Panzytokeratine
AE1/AE3, Zytokeratin 7 und AUM-Antikörper ergab
(5 und 6). Histologisch und immunozytochemisch
gab es keine ausgeprägten
Unterschiede zwischen den Blasen nach 6 und 11 Monaten.
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Beispiel 8
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Statistische Befunde
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Statistische Bewertungen wurden an
den Messungen unter Anwendung eines zweiseitigen Student-t-Tests
durchgeführt,
wobei p-Werte von weniger oder gleich 0,05 als signifikant angesehen
wurden. Bei den Kontrollen nur mit Zystektomie und bei den Transplantaten
nur mit dem Polymeren wurden durchschnittliche Kapazitäten von
22% bzw. 46% der präoperativen
Werte aufrechterhalten. Eine durchschnittliche Blasenkapazität von 95%
des ursprünglichen
Volumens vor der Zystektomie wurde bei den mit Gewebe behandelten
Blasenersatzprodukten erreicht. Die Reservoirs mit subtotaler Zystektomie,
die nicht rekonstruiert worden waren, und die Blasen, die nur mit
dem Polymeren rekonstruiert worden waren, zeigten eine ausgeprägte Abnahme
der Blasen-Compliance (10% und 42%). Die Compliance der mit Gewebe
behandelten Blasen ergab fast keinen Unterschied zu den präoperativen
Werten, die bei Vorliegen der nativen Blase gemessen wurden (106%).
Histologisch zeigten die Blasen nur mit dem Polymeren ein Muster
von normalen Urothelzellen mit einer verdickten fibrotischen Submucosa
und einer dünnen
Schicht an Muskelfasern. Die entnommenen Blasen, die mit Gewebe
behandelt worden waren, zeigten einen normalen zellulären Aufbau,
der aus den drei Schichten Urothel, Submucosa und Muskeln bestand.
Immunozytochemische Analysen auf Desmin, alpha-Actin, Zytokeratin 7, Panzytokeratine
AE1/AE3 und Uroplakin III bestätigten
den Muskel- und Urothel-Phänotyp.
Eine Färbung
mit 5–100 ergab
das Vorliegen von neuralen Strukturen.
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Die Tiere, die einer Zystektomie
unter Aussparung des Trigonums unterzogen worden waren und bei denen
ein Verschluss vorgenommen worden war, gewannen zunächst im
Laufe der Zeit eine minimale Menge des Reservoirvolumens, erreichten
aber nicht die Werte vor der Zystektomie. Die Blasen, die das bloße Polymere
als Transplantat aufwiesen, zeigten eine geringfügige Zunahme des Volumens und
entwickelten fibrotische neue Blasen, die eine gut entwickelte urotheliale
Schicht, jedoch einen deutlich defizitären muskulären Aufbau zeigten. Sie wiesen
eine verringerte Compliance-Kurve auf. Die mit Gewebe behandelten,
keine Flüssigkeit
enthaltenden neuen Blasen waren dazu befähigt, die Blasenkapazitäten vor
der Zystektomie zu erreichen und zu überschreiten. Die Compliance
dieser Blasen erreichte zu jedem Zeitpunkt den Wert vor der Zystektomie,
einschließlich
der 4-wöchigen
postoperativen Prüfung.
Die entnommenen, mit Gewebe behandelten Blasen zeigten einen normalen
zellulären
Aufbau, bestehend aus den drei Schichten Urothel, Submucosa und
Muskel. Eine immunozytochemische Analyse mit Desmin und alpha-Actin
des glatten Muskels bestätigte
den Muskel-Phänotyp.
Panzytokeratine AE1/AE3, Zytokeratin 7 und Uroplakin III konnten immunohistochemisch
nachgewiesen werden, was den urothelialen Phänotyp bestätigte. Eine positive S-100-Färbung ließ darauf
schließen,
dass ein Einwachsen von neuralen Strukturen in die mit Gewebe behandelten
Blasen möglich
war. Die mit Gewebe behandelten neuen Blasen konnten bald nach der Implantation
ihre normale Funktion aufnehmen. Strukturell und funktionell waren
sie von nativen Blasen nicht unterscheidbar. Unsere Ergebnisse zeigen erstmals,
dass die Herstellung einer dreischichtigen Struktur, die in vitro
aus Muskel und Urothel der Blase zusammengesetzt ist, für die letztendlichen
funktionellen Ergebnisse des neu hergestellten Blasengewebes günstig ist.
Unsere Ergebnisse beim Ersatz der Blase mit dem zellfreien Polymertransplantat stimmen
mit früheren
Berichten in der Literatur der letzten Jahrzehnte bezüglich freien
Transplantaten überein.
Wenn andere Materialien als freie Transplantate ohne Zellen verwendet werden,
können
die verschiedenen histologischen Komponenten zwar vorhanden sein,
sind jedoch nicht notwendigerweise vollständig entwickelt oder funktionsfähig. Ferner stimmen
die Ergebnisse der Kontrollgruppe mit der zellfreien Polymerblase
mit den Ergebnissen der Literatur in Bezug auf die im Laufe der
Zeit eintretende Kontraktion und Schrumpfung des Transplantats überein.
Die zweite Kontrollgruppe, bei der nach der Zystektomie ein Primärverschluss
vorgenommen wurde, zeigte klar, dass die Zunahme der Kapazität der mit
Gewebe behandelten neuen Blasen vorwiegend auf das Implantat und
nicht auf die natürliche Regeneration
und elastische Merkmale der nativen Hundeblasen zurückzuführen war.
Die Ergebnisse zeigen, dass Blasen-Submucosa, die mit urothelialen Zellen
und Muskelzellen beimpft sind, neues Blasengewebe bilden kann, das
histologisch und funktionell von der nativen Blase nicht unterscheidbar
ist. Dieses Ergebnis kann auf eine mögliche Aufrechterhaltung der
Aufbauform der Blase durch die extrazelluläre Matrix, die durch die überimpften
Zellen regeneriert worden ist, zurückzuführen sein. Die auf die Polymermatrix überimpften
urothelialen Zellen und Muskelzellen verhindern anscheinend die
Resorption des Transplantats. Diese Technik ist zur Bildung von neuem
Blasengewebe geeignet, das anatomisch und funktionell ähnlich dem
Gewebe von normalen Blasen ist.
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Weitere Ausführungsformen und Anwendungsmöglichkeiten
der Erfindung ergeben sich für den
Fachmann beim Studium der Beschreibung und bei der praktischen Durchführung der
hier beschriebenen Erfindung. Die Beschreibung und die Beispiele
sind lediglich als beispielhafte Erläuterungen des durch die nachstehenden
Ansprüche
angegebenen Schutzumfangs der Erfindung anzusehen.