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Bereich der Erfindung
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Die vorliegende Erfindung richtet
sich auf Verfahren und Zusammensetzungen, die wirkungsvoll sind, um
Transport von biologisch aktiven Mitteln, wie etwa organischen Verbindungen,
Polypeptiden, Oligosacchariden, Nukleinsäuren und Metallionen, durch
biologische Membranen zu erhöhen.
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Literaturstellen
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- Barsoum et al., PCT Pub. Nr. WO 94/04686 (1994).
- Bonifaci, N., et al., Aids 9: 995–1000.
- Brugidou, J., et al., Biochem. Biophys. Res. Comm. 214(2): 685–93 (1995).
- Derossi, D., et al., J. Biol. Chem. 269: 10444–50 (1996).
- Egholm, M. O., et al., Nature 365: 566–568 (1993).
- Eberle und Nuninger, J. Org. Chem. 57: 2689 (1992).
- Fawell, S., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 664–668 (1994).
- Fletcher, M. D., et al., Chem. Rev. 98: 763 (1998).
- Frankel et al., PCT Pub. Nr. WO 91/09958 (1991).
- Gennaro, A. R., Hrsg., REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES, 18.
- Ausgabe, Mack Publishing Co., Easton, PA (1990).
- Giannis, A., et al., Advances Drug Res. 29: 1 (1997).
- Kessler, H., Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 32: 543 (1993).
- Lam, K. S., et al., Chem. Rev. 97: 411 (1997).
- Langston, S., DDT 2: 255 (1997).
- Rivas, A., et al., J. Immunol. 154: 4423–33 (1995).
- Ruegg, C., et al., J. Immunol. 154: 4434–43 (1995).
- Ryser, H. J. P., PCT Pub. Nr. WO 79/00515 (1979).
- Simon et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 89: 9367 (1992).
- Suffness, M., Hrsg., Taxol: Science and Applications, CRC Press,
New York, NY, S. 237–239
(1995).
- Shaheen et al., J. Virology 70: 3392 (1996).
- Tavladoraki et al., Nature 366: 469 (1993).
- Thompson, L. A., und Ellman, J. A., Chem. Rev. 96: 555 (1996).
- Wong, S. S., Hrsg., Chemistry of Protein Conjugation and Cross-Linking,
CRC Press, Inc. Boca Raton, FL (1991).
- Zuckermann, R. N., Chemtracts-Macromol. Chem. 4: 80 (1993).
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Hintergrund der Erfindung
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Die Plasmamembranen von Zellen stellen
eine Barriere für
den Durchtritt bzw. die Passage vieler geeigneter therapeutischer
Mittel dar. Im Allgemeinen muss ein Arzneimittel frei löslich sein,
sowohl in den wässrigen
Kompartimenten des Körpers
als auch den Lipidschichten, durch welches es passieren muss, um
in Zellen einzutreten. Hochgeladene Moleküle erfahren insbesondere Schwierigkeiten
beim passieren von Membranen. Viele therapeutische Makromoleküle, wie
etwa Peptide und Oligonukleotide, sind ebenfalls nicht besonders
geeignet für
Transmembrantransport. Wenngleich die Biotechnologie eine größere Anzahl
potenziell wertvoller Therapeutika verfügbar gemacht hat, behindern
Bioverfügbarkeitsbetrachtungen
häufig
ihre medizinische Anwendbarkeit. Es besteht daher ein Bedarf für verlässliche
Mittel zum Transportieren von Arzneimitteln und insbesondere Makromolekülen in Zellen.
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Bisher wurde eine Vielzahl von Transportmolekülen vorgeschlagen,
um Moleküle
durch biologische Membranen zu geleiten. Ryser et al. (1979) lehren
die Verwendung von Lysinpolymeren mit hohem Molekulargewicht, zum
Erhöhen
des Transports verschiedener Moleküle durch Zellmembranen, wobei
Moleküle
mit sehr hohem Molekulargewicht bevorzugt sind. Wenngleich die Autoren
Polymere anderer positiv geladener Gruppen, wie etwa Ornithin und
Arginin, vorsahen, wurde die Wirksamkeit derartiger Polymere nicht
gezeigt.
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Frankel et al. (1991) berichteten,
dass Konjugieren ausgewählter
Moleküle
an das tat-Protein von HIV die Zellaufnahme dieser Moleküle erhöhen kann.
Jedoch hat die Verwendung des tat-Proteins gewisse Nachteile, einschließlich unvorteilhafter
Aggregation und Unlöslichkeitseigenschaften.
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Barsoum et al. (1994) und Fawell
et al. (1994) schlugen die Verwendung kürzerer Fragmente des tat-Proteins
vor, enthaltend die tat-basische Region (Reste 49–57 mit
der Sequenz RKKRRQRRR). Barsoum et al. stellten fest, dass nicht übermäßig lange
Polyargininpolymere (MG 5000–15.000
Dalton) nicht in der Lage waren, β-Galactosidase
durch Zellmembranen zu transportieren (z. B. Barsoum auf Seite 3),
im Gegensatz zu der Annahme von Ryser et al. (supra).
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Andere Studien zeigten, dass ein
16-Aminosäurenpeptid-Cholesterol-Konjugat,
das von der Antennapedia Homöodomäne stammt,
rasch durch gezüchtete
Neuronen aufgenommen wird (Brugidou et al., 1995). Jedoch werden
etwas kürzere
Versionen dieses Peptids (15 Gruppen) nicht effektiv durch Zellen
aufgenommen (Derossi et al., 1996).
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Die kanadische Patentanmeldung Nr.
2094658 beschreibt Trägerpeptide
mit positiv geladenen D-Aminosäuren,
z. B. Trägerpeptide,
die aus 8 oder 9 D-Argininresten
bestehen, zur intrazellulären
Zuführung
biochemischer Mittel.
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Die vorliegende Erfindung basiert
zum Teil auf der Entdeckung der Anmelden, dass Konjugation bestimmter
Polymere, die zusammengesetzt sind aus benachbarten, hoch-basischen
Untereinheiten, im Besonderen Untereinheiten, die Guanidyl- oder
Amidinylgruppe enthalten, an kleine Moleküle oder Makromoleküle wirksam
ist, um Transport des gebundenen Moleküls durch biologische Membranen
wesentlich zu erhöhen. Darüber hinaus
tritt der Transport mit einer Rate auf, die deutlich höher ist
als die Transportrate, die durch ein basisches HIV-tat-Peptid bereitgestellt
wird, das aus den Gruppen 49–57
besteht.
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Zusammenfassung der Erfindung
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Die vorliegende Erfindung umfasst
unter einem Aspekt ein Verfahren zum Erhöhen des Transports eines biologisch
wirksamen Mittels durch eine biologische Membran. In dem Verfahren
wird eine biologische Membran in vitro in Kontakt gebracht mit einem
Konjugat, das ein biologisch aktives Mittel enthält, das kovalent an einen polymeren
Träger
der Erfindung gebunden ist. Das Inkontaktbringen ist wirkungsvoll,
um die Zuführung
des Konjugats durch die biologische Membran im Vergleich zur Zuführung des
biologisch aktiven Mittels in nicht konjugierter Form zu erhöhen.
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In einer Hinsicht liefert die Erfindung
ein Konjugat, bestehend aus einem biologisch aktiven Mittel, das kovalent
an einen polymeren Träger
gebunden ist, der ein Nicht-Peptidgrundgerüst aufweist, worin der polymere
Träger
(a) aus 6 bis 25 Untereinheiten besteht, von welchen mindestens
50% substituiert sind mit einer Seitenkettengruppe, die eine terminale
Guanidino- oder Amidinogruppe umfasst, (b) mindestens sechs derartige
Guanidino- oder Amidinoseitenkettengruppen enthält, und (c) wirkungsvoll die
Menge biologisch aktives Mittel, die durch eine biologische Membran
transportiert wird, relativ zur Menge des Mittels erhöht, die
durch die biologische Membran in unkonjugierter Form transportiert
werden kann.
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In einer Ausführungsform besteht das Polymer
aus 6 bis 25 Untereinheiten, wovon mindestens 50% eine Guanidino-
oder Amidinoseitenkettengruppe enthalten, worin das Polymer mindestens
6 und bevorzugter mindestens 7 Guanidino- oder Amidinoseitenkettengruppen
enthält.
In einer anderen Ausführungsform
besteht das Polymer aus 6 bis 20, 7 bis 20 oder 7 bis 15 Untereinheiten.
Bevorzugter enthalten mindestens 70% der Untereinheiten in dem Polymer
Guanidino- oder Amidinoseitenkettengruppen und noch bevorzugter
mindestens 90%. Vorzugsweise ist keine Guanidino- oder Amidinoseitenkettengruppe
getrennt von einer anderen derartigen Gruppe durch mehr als eine
Nicht-Guanidino- oder Nicht-Amidinountereinheit. In einer spezifischeren
Ausführungsform
enthält
das Polymer mindestens 6 benachbarte Untereinheiten, wobei jede
entweder eine Guanidino- oder Amidinogruppe enthält und vorzugsweise mindestens
6 oder 7 benachbarte Guanidinoseitenkettengruppen.
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In einer anderen Ausführungsform
enthält
das Transportpolymer von 6 bis 25 benachbarte Untereinheiten, von
7 bis 25, von 6 bis 20 oder vorzugsweise von 7 bis 20 benachbarte
Untereinheiten, wobei jede hiervon eine Guanidino- oder Amidinoseitenkettengruppe
enthält,
und mit dem optionalen Vorbehalt, dass eine der benachbarten Untereinheiten
eine Nicht-Arginingruppe enthalten kann, an welchen das Mittel gebunden
ist.
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In einer Ausführungsform enthält jede
benachbarte Untereinheit eine Guanidinogruppe, wie beispielhaft
dargestellt durch ein Polymer, das mindestens sechs benachbarte
Arginingruppen enthält.
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Vorzugsweise ist jedes Transportpolymer
linear. In einer bevorzugten Ausführungsform ist das Mittel an
ein terminales Ende des Transportpolymers gebunden.
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In einer anderen spezifischen Ausführungsform
enthält
das Konjugat ein einzelnes Transportpolymer.
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Das Verfahren kann verwendet werden,
um Transport ausgewählter
therapeutischer Mittel durch beliebige aus einer Vielzahl biologischer
Membranen zu transportieren, einschließlich, ohne darauf begrenzt
zu sein, eukaryontische Zellmembranen, prokaryontische Zellmembranen
und Zellwände.
Beispielhafte prokaryontische Zellmembranen umfassen Bakterienmembranen.
Beispielhafte eukaryontische Zellmembranen, die von Interesse sind,
umfassen, ohne darauf begrenzt zu sein, Membranen dendritischer
Zellen, Epithelzellen, Endothelzellen, Keratinocyten, Muskelzellen,
Pilzzellen, Bakterienzellen, Pflanzenzellen und dgl.
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Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform
der Erfindung hat das Transportpolymer der Erfindung eine scheinbare
Affinität
(Km), die mindestens um das 10-fache größer ist und vorzugsweise um
mindestens das 100-fache größer ist
als die Affinität,
die für
das tat (49 bis 57) – Peptid
durch das Verfahren von Beispiel 6 gemessen wird, wenn bei Raumtemperatur
(23°C) oder
37°C gemessen
wird.
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Biologisch aktive Mittel (welche
therapeutische Mittel umfassen) umfassen, ohne darauf begrenzt zu sein,
Metallionen, welche typischerweise als Metallchelate bereitgestellt
werden; kleine organische Moleküle wie
Antikrebsmittel (z. B. Taxan) und mikrobiologische Moleküle (z. B.
gegen Bakterien oder Pilze, wie etwa Hefe); und Makromoleküle, wie
etwa Nukleinsäuren,
Peptide, Proteine und Analoga davon. In einer bevorzugten Ausführungsform
ist das Mittel eine Nukleinsäure
oder ein Nukleinsäureanaloges,
wie etwa Ribozym, welches optional eine oder mehrere 2'-Deoxynukleotiduntereinheiten
für verbesserte
Stabilität
enthält.
Alternativ ist das Mittel eine Peptidnukleinsäure (PNA). In einer anderen
bevorzugten Ausführungsform
ist das Mittel ein Polypeptid, wie etwa ein Proteinantigen, und
die biologische Membran ist eine Zellmembran einer Antigenpräsentierenden
Zelle (APC). In einer anderen Ausführungsform ist das Mittel ausgewählt, um
eine Immunantwort gegen ein ausgewähltes Tumorantigen zu fördern oder
hervorzurufen. In einer anderen bevorzugten Ausführungsform ist das Mittel eine
Taxan- oder taxoide Antikrebsverbindung. In einer anderen Ausführungsform
ist das Mittel ein Nicht-Polypeptidmittel, vorzugsweise ein therapeutisches
Nicht-Polypeptid- Mittel. In einer allgemeineren Ausführungsform
hat das Mittel vorzugsweise ein Molekulargewicht von weniger als
10 kDa.
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Das Mittel kann an das Polymer durch
einen Linkerrest gebunden sein, welcher Konformationsflexibilität innerhalb
des Konjugats verleihen und Wechselwirkungen zwischen dem Mittel
und seinem biologischen Ziel erleichtern kann. In einer Ausführungsform
ist die Linkergruppe ein spaltbarer Linker, z. B. enthaltend eine Linkergruppe,
die durch ein Enzym oder eine Lösungsmittel
vermittelte Spaltung spaltbar ist, wie etwa eine Ester-, Amid- oder
Disulfidgruppe. In einer anderen Ausführungsform enthält der spaltbare
Linker eine fotospaltbare Gruppe.
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In einer spezifischeren Ausführungsform
enthält
der spaltbare Linker eine erste spaltbare Gruppe, die distal zum
biologisch aktiven Mittel ist, und eine zweite spaltbare Gruppe,
die proximal zu dem Mittel ist, sodass Spaltung der ersten spaltbaren
Gruppe zu einem Linkermittelkonjugat führt, das eine nukleophile Gruppe
enthält,
die in der Lage ist, intramolekular zu reagieren, um die zweite
spaltbare Gruppe, zu spalten, wobei das Mittel von dem Linker und
dem Polymer freigesetzt wird.
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In einer anderen Ausführungsform
kann die Erfindung verwendet werden, um eine Vielzahl von Konjugaten
auf ausgewählte
biologische Aktivität
zu screenen, worin die Konjugate aus einer Vielzahl von Kandidatenagentien
gebildet sind. Die Konjugate werden in Kontakt gebracht mit einer
Zelle, die ein nachweisbares Signal bei Aufnahme des Konjugats in
die Zelle zeigt, sodass die Stärke
des Signals kennzeichnend für
die Wirksamkeit bzw. Effizienz des Konjugats in Bezug auf die ausgewählte biologische
Aktivität
ist. Dieses Verfahren ist besonders geeignet zum Testen der Aktivitäten von
Mitteln, die selbst nicht in der Lage oder nur geringfügig in der
Lage sind in Zellen einzutreten, um biologische Aktivität zu manifestieren.
In einer Ausführungsform
werden die Kandidatenagens ausgewählt aus einer kombinatorischen
Bibliothek.
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Die Erfindung umfasst auch eine Konjugatbibliothek,
die geeignet ist zum Screenen in dem obigen Verfahren.
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In einer anderen Hinsicht umfasst
die Erfindung eine pharmazeutische Zusammensetzung zum Zuführen eines
biologisch aktiven Mittels durch eine biologische Membran. Die Zusammensetzung
umfasst ein Konjugat, das ein biologisch aktives Mittel enthält, das
kovalent an mindestens ein Transportpolymer gebunden ist, wie oben
beschrieben, und ein pharmazeutisch verträgliches Hilfsmittel. Das Polymer
ist wirksam um dem Mittel eine Transmembrantransportrate zu verleihen,
die größer als
die Transmembrantransportrate des Mittels in nicht konjugierter
Form ist. Die Zusammensetzung kann zusätzlich mit Instruktionen zu
ihrer Verwendung verpackt sein.
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In einer anderen Hinsicht umfasst
die Erfindung eine Verwendung wie in Anspruch 30 definiert.
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Diese und andere Gegenstände und
Merkmale der Erfindung werden vollständiger ersichtlich, wenn die
folgende detaillierte Beschreibung der Erfindung in Verbindung mit
den anhängigen
Zeichnungen gelesen wird.
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Kurze Beschreibung der
Zeichnungen
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Die 1A und 1B sind Plots der zellulären Aufnahme
bestimmter Polypeptid-Fluorescein-Konjugate, enthaltend tat-basisches
Peptid (49–57,
SEQ ID Nr: 1), Poly-Lys (K9, SEQ ID Nr: 2) und Poly-Arg (R4–R9 und r4–r9, SEQ
ID Nr: 3–8
bzw. 12–17),
als eine Funktion der Peptidkonzentration; 1C ist ein Histogramm der Aufnahmegrade
der Konjugate, gemessen für
Konjugate bei einer Konzentration von 12,5 μM (Beispiele 2–3);
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Die 2A bis 2F zeigen Computer-generierte
Bilder von konfokalen Mikrofotografien (Beispiel 4), welche emittierte
Fluoreszenz (2A–2C)
und transmittiertes Licht (2D–2F)
von Jurkat-Zellen nach Inkubation bei 37°C für 10 Minuten mit 6,25 μM tat (49–57) konjugiert
mit Fluorescein (Banden A und D), einem 7-mer von Poly-L-Arginin
(R7), markiert mit Fluorescein (Banden B und E) oder einem 7-mer
von Poly-D-Arginin (r7), markiert mit Fluorescein (Banden C und
F) zeigen;
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3 zeigt
die Zellaufnahme bestimmter Poly-Arg-Fluorescein-Konjugate (r9,
R9, R15, R20 und R25, SEQ ID Nr: 17 bzw. 8–11) als eine Funktion der
Konjugatkonzentration (Beispiel 5);
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4 zeigt
ein Histogramm der zellulären
Aufnahme von Fluorescein konjugiertem tat- (49–57) und Poly-Arg-Fluorescein-Konjugaten
(R9, R8 bzw. R7) in der Abwesenheit (vier Balken auf der linken
Seite) und beim Vorliegen (vier Balken auf der rechten Seite) von
0,5% Natriumazid (Beispiel 7);
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Die 5A bis 5C zeigen Plots der Aufnahmegrade
ausgewählter
Polymerkonjugate (K9, R9, r4, r5, r6, r7, r8 und r9) durch Bakterienzellen
als eine Funktion der Konjugatkonzentration; 5A vergleicht die Aufnahmegrade, die
beobachtet werden für
R9- und r9-Konjugate als eine Funktion der Konjugatkonzentration
bei Inkubation mit E. Coli HB 101 Zellen; 5B zeigt die Aufnahmegrade, die beobachtet
werden für
K9- und r4- bis r9-Konjugate bei Inkubation mit E. Coli HB 101 Zellen; 5C vergleicht die Aufnahmegrade
von Konjugaten von r9 und K9 bei Inkubation mit Strep. Bovis Zellen;
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Die 6A bis 6E zeigen beispielhafte Konjugate
der Erfindung, welche spaltbare Linkergruppen enthalten; 6F und 6B zeigen chemische Strukturen und herkömmliches
Nummerieren von Konstituentengerundgerüstatomen für Paclitaxel und "TAXOTERE"; 6H zeigt eine allgemeine chemische Struktur
und Ringatomnummerierung für
taxoide Verbindungen; und
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7 zeigt
die Inhibierung der Sezernierung von Gamma-Interferon (γ-IFN) durch Maus-T-Zellen
als eine Funktion der Konzentration eines Sense-PNA-r7-Konjugats (SEQ
ID Nr: 18), Antisense-PNA-r7-Konjugat (SEQ ID Nr: 19) und nicht-konjugiertem
Antisense PNA (SEQ ID Nr: 20), worin die PNA-Sequenzen auf einer Sequenz
des Gens für
Gamma-Interferon basieren.
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Detaillierte Beschreibung
der Erfindung
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1. Definitionen
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Der Ausdruck "biologische Membran" bedeutet, wie er hier verwendet wird,
eine Lipid-enthaltende Barriere, die Zellen oder Gruppen von Zellen
om extrazellulären
Raum trennt. Biologische Membranen umfassen, ohne darauf begrenzt
zu sein, Plasmamembranen, Zellwände,
intrazelluläre
Organellen Membranen, wie etwa die Mitochondrienmembran, Kernmembranen
und dgl.
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Der Ausdruck "Transmembrankonzentration" betrifft die Konzentration
einer Verbindung, die auf der Seite einer Membran vorliegt, die
gegenüberliegend
oder "trans" zur Seite der Membran
ist, zu welcher eine besondere Zusammensetzung hinzugegeben worden
ist. Wenn z. B. eine Verbindung zu dem extrazellulären Fluid
einer Zelle gegeben wird, ist die Menge der Verbindung, die nachfolgend
innerhalb der Zelle gemessen wird, die Transmembrankonzentration
der Verbindung.
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"Biologisch
aktives Mittel" oder "biologisch aktive
Substanz" betrifft
eine chemische Substanz, wie etwa ein kleines Molekül, Makromolekül oder Metallion,
das eine beobachtbare Veränderung
in der Struktur, Funktion oder Zusammensetzung einer Zellaufnahme
durch die Zelle bewirkt. Beobachtbare Veränderungen umfassen erhöhte oder
erniedrigte Expression einer oder mehrerer mRNAs, erhöhte oder
erniedrigte Expression eines oder mehrerer Proteine, Phosphorylierung
eines Proteins oder einer anderen Zellkomponente, Inhibierung oder
Aktivierung eines Enzyms, Inhibierung oder Aktivierung der Bindung
zwischen Komponenten eines Bindungspaares, eine erhöhte oder
erniedrigte Syntheserate eines Metaboliten, erhöhte oder erniedrigte Zellproliferation
und dgl.
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Der Ausdruck "Makromolekül" bedeutet, wie er hier verwendet wird,
große
Moleküle
(MG größer 1000 Dalton),
wie beispielhaft dargestellt, ohne darauf begrenzt zu sein, durch
Peptide, Proteine, Oligonukleotide und Polynukleotide biologischen
oder synthetischen Ursprungs.
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"Kleines
organisches Molekül" betrifft ein Kohlenstoff-enthaltendes
Mittel mit einem Molekulargewicht (MG) von kleiner oder gleich 1000
Dalton.
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Der Ausdruck "therapeutisches Mittel", "therapeutische Zusammensetzung" und "therapeutische Substanz" betrifft, ohne darauf
begrenzt zu sein, jede Zusammensetzung, die zum Vorteil einer Säugerspezies
verwendet werden kann. Derartige Mittel können in der Form von Ionen,
kleinen organischen Molekülen,
Peptiden, Protein oder Polypeptiden, Oligonukleotiden und Oligosacchariden
z. B. sein.
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Die Ausdrücke therapeutisches "Nicht-Polypeptidmittel" und "Nicht-Polypeptidmittel" betreffen den Anteil
eines Transportpolymerkonjugats, der nicht das transporterhöhende Polymer
enthält
und der ein biologisch aktives Mittel ist, das von einem Polypeptid
verschieden ist. Ein Beispiel eines Nicht-Polypeptidmittels ist ein Antisense-Oligonukleotid,
welches konjugiert sein kann an ein Polyargininpeptid, um ein Konjugat
für verbesserte
Zuführung
durch biologische Membranen hindurch zu bilden.
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Der Ausdruck "Polymer" betrifft eine lineare Kette von zwei
oder mehr identischen oder nicht-identischen Untereinheiten, die
durch kovalente Bindungen verknüpft
sind. Ein Peptid ist ein Beispiel eines Polymers, das aus identischen
oder nichtidentischen Aminosäureuntereinheiten
aufgebaut sein kann, die durch Peptidbindungen miteinander verknüpft sind.
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Der Ausdruck "Peptid", wie er hier verwendet wird, bedeutet
eine Verbindung, die aus einer Einzelkette aus D- oder L-Aminosäuren oder
einem Gemisch von D- und
L-Aminosäuren
besteht, die durch Peptidbindungen verbunden sind. Im Allgemeinen
enthalten Peptide mindestens zwei Aminosäurereste und weisen weniger als
50 Aminosäuren
in der Länge
auf.
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Der Ausdruck "Protein", wie er hier verwendet wird, bedeutet
eine Verbindung, die aus linear angeordneten Aminosäuren besteht,
die durch Peptidbindungen verknüpft
sind, jedoch im Gegensatz zu Peptiden hat es eine gut definierte
Konformation. Proteine bestehen im Gegensatz zu Peptiden im Allgemeinen
aus Ketten von 50 oder mehr Aminosäuren.
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"Polypeptid" bedeutet, wie hier
verwendet, ein Polymer aus mindestens zwei Aminosäureresten
und welches ein oder mehrere Peptidbindungen enthält. "Polypeptid" umfasst Peptide
und Proteine, ungeachtet dessen, ob das Polypeptid eine gut definierte
Konformation hat.
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Die Ausdrücke "Guanidyl", "Guanidinyl" und "Guanidino" werden hier austauschbar
verwendet, um eine Gruppe mit der Formel -HN=C(NH2)NH
(unprotonierte Form) zu bedeuten. Als ein Beispiel enthält Arginin eine
Guanidyl(Guanidino)- Gruppe und wird ebenfalls als 2-Amino-S-Guanidinovaleriansäure oder α-Amino-δ-guanidinovaleriansäure bezeichnet. "Guanidinium" betrifft die positiv
geladene Konjugatsäureform.
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"Amidinyl" und "Amidino" bezeichnen eine
Gruppe mit der Formel -C(=NH)(NH2). "Amidinium" betrifft die positiv
geladene Konjugatsäureform.
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Der Ausdruck „Polyarginin" oder „Poly-Arg" betrifft eine Polymersequenz,
bestehend aus benachbarten Arginingruppen; Poly-L-Arginin betrifft
alle L-Arginine;
Poly-D-Arginin betrifft alle D-Arginine. Poly-L-Arginin wird auch
abgekürzt
durch ein „R" am Anfang, gefolgt
von der Anzahl von L-Argininen in dem Peptid (z. B. R8 bedeutet
ein 8-mer benachbarter L-Arginingruppen); Poly-D-Arginin wird durch ein vorausgehendes „r", gefolgt von der
Anzahl von D-Argininen
in dem Peptid abgekürzt
(r8 bedeutet ein 8-mer benachbarter D-Arginingruppen).
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Aminosäuregruppen werden hier durch
ihre vollständigen
Namen oder durch Standard-ein-Buchstaben oder drei-Buchstaben-Bezeichnungen
bezeichnet: A, Ala, Alanin; C, Cys, Cystein; D, Asp, Asparaginsäure; E,
Glu, Glutaminsäure;
F, Phe, Phenylalanin; G, Gly, Glycin; N, His, Histidin; I, Ile,
Isoleucin; K, Lys, Lysin; L, Leu, Leucin; M, Met, Methionin; N,
Asn, Asparagin; P, Pro, Prolin; Q, Gln, Glutamin; R, Arg, Arginin;
S, Ser, Serin; T, Thr, Threonin; V, Val, Valin; W, Trp, Tryptophan;
X, Hyp, Hydroxyprolin; Y, Tyr, Tyrosin.
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II. Struktur der Polymergruppe
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In einer Ausführungsform enthalten Transportpolymere
gemäß der vorliegenden
Erfindung Polymere mit kurzer Länge
von 6 bis zu 25 Untereinheiten, wie oben beschrieben. Das Konjugat
ist wirkungsvoll, um die Transportrate des Konjugats durch die biologische
Membran relativ zur Transportrate des nicht-konjugierten biologischen
Mittels alleine zu erhöhen.
Wenngleich beispielhafte Polymerzusammensetzungen Peptide sind, enthalten
Polymere der Erfindung Nicht-Peptidgrundgerüste, wie weiter unten definiert.
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In einer wichtigen Hinsicht der Erfindung
sind die Konjugate der Erfindung besonders geeignet zum Transportieren
biologisch aktiver Mittel durch Zell- oder Organellenmembranen,
wenn die Mittel des Typs sind, der Transmembrantransport erfordert,
um ihre biologischen Wirkungen zu zeigen und welche ihre biologischen Wirkungen
nicht primär
durch Binden an einen Oberflächenrezeptor
zeigen, d. h. sodass kein Eintritt des Mittels auftritt. Darüber hinaus
sind die Konjugate besonders geeignet zum Transportieren biologisch
aktiver Mittel des Typs, die Transmembrantransport erfordern, um
ihre biologischen Wirkungen zu zeigen, und die an sich selbst (ohne
Konjugation an ein Transportpolymer oder eine andere Modifikation)
nicht in der Lage sind oder nur geringfügig in der Lage sind, in Zellen
einzutreten, um biologische Aktivität zu manifestieren.
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Als allgemeine Regel umfasst das
Transportpolymer, das in dem Konjugat verwendet wird, vorzugsweise
ein lineares Grundgerüst
von Untereinheiten. Das Grundgerüst
wird üblicherweise
Heteroatome umfassen, ausgewählt
aus Kohlenstoff, Stickstoff, Sauerstoff, Schwefel und Phosphor,
wobei die Hauptmenge der Grundgerüstkettenatome im Allgemeinen
aus Kohlenstoff besteht. Jede Untereinheit enthält einen Seitenkettenrest,
der eine terminale Guanidino- oder Amidinogruppe umfasst.
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Wenngleich der Abstand zwischen benachbarten
Seitenkettengruppen im Allgemeinen von Untereinheit zu Untereinheit
konsistent sein wird, können
die Polymere, die in der Erfindung verwendet werden auch einen variablen
Abstand zwischen Seitenkettengruppen entlang des Grundgerüsts aufweisen.
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Die Seitenkettengruppen erstrecken
sich vom Grundgerüst
derart, dass das zentrale Guanidino- oder Amidinokohlenstoffatom
(an welches die NH2-Gruppen gebunden sind)
mit dem Grundgerüst
verknüpft
ist durch einen Seitenkettenlinker, der vorzugsweise mindestens
2 Linkerkettenatome, bevorzugter von 2 bis 5 Kettenatome enthält, sodass
das zentrale Kohlenstoffatom in Entfernung vom Grundgerüst das dritte
bis sechste Kettenatom ist. Die Kettenatome werden vorzugsweise
bereitgestellt als Methylenkohlenstoffatome, wenngleich ein oder
mehrere andere Atome, wie etwa Sauerstoff, Schwefel oder Stickstoff,
ebenfalls vorliegen können.
Vorzugsweise ist der Seitenkettenlinker zwischen dem Grundgerüst und dem
zentralen Kohlenstoffatom der Guanidino- oder Amidinogruppe vier
Kettenatome lang, wie beispielsweise eine Argininseitenkette.
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Die Transportpolymersequenz der Erfindung
kann flankiert sein durch ein oder mehrere Nicht-Guanidino/Nicht-Amidino-Untereinheiten
oder einen Linker, wie etwa eine Aminocapronsäuregruppe, welche die Rate
des Membrantransports des entsprechenden Polymer-enthaltenden Konjugats
nicht wesentlich nachteilig beeinflussen, wie etwa Glycin, Alanin
und Cystein z. B. Ebenfalls kann jede freie Amino-terminale Gruppe mit
einer Blockierungsgruppe gecappt sein, wie etwa einer Acetyl- oder
Benzylgruppe, um Verallgegenwärtigung
in vivo zu vermeiden.
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Das zu transportierende Mittel kann
an das Transportpolymer entsprechend einer Anzahl von Ausführungsformen
gebunden sein. In einer bevorzugten Ausführungsform ist das Mittel an
ein einzelnes Transportpolymer gebunden, entweder über eine
Bindung an ein terminales Ende des Transportpolymers oder an eine interne
Untereinheit innerhalb des Polymers über eine geeignete Verknüpfungsgruppe.
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In einer zweiten Ausführungsform
ist das Mittel an mehr als ein Polymer gebunden, auf dieselbe Art wie
oben. Diese Ausführungsform
ist etwas weniger bevorzugt, da sie zum Quervernetzen benachbarter
Zellen führen
kann.
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In einer dritten Ausführungsform
enthält
das Konjugat zwei Mittelgruppen, die an jedes terminale Ende des
Polymers gebunden sind. Für
diese Ausführungsform
ist es bevorzugt, dass das Mittel ein Molekulargewicht von weniger
als 10 kDa aufweist.
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Im Hinblick auf die ersten und dritten
Ausführungsformen,
die gerade genannt wurden, ist das Mittel im Allgemeinen nicht an
eine der Guanidino- oder Amidinoseitenketten gebunden, sodass sie
frei sind, um mit der Zielmembran zu Wechselwirken.
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Die Konjugate der Erfindung können hergestellt
werden durch einfache Syntheseschemata. Darüber hinaus sind die Konjugatprodukte üblicherweise
im Wesentlichen homogen in Bezug auf Länge und Zusammensetzung, sodass
sie eine größere Konsistenz
und Reproduzierbarkeit in ihren Wirkungen bereitstellen als heterogene
Gemische.
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Gemäß einem wichtigen Aspekt der
vorliegenden Erfindung wurde von den Anmeldern gefunden, dass die
Bindung eines einzelnen Transportpolymers an eines aus einer Vielzahl
von Typen biologisch aktiver Mittel ausreichend ist, um wesentlich
die Aufnahmerate eines Mittels durch biologische Membranen zu erhöhen, selbst
ohne das Erfordernis des Vorliegens einer großen hydrophoben Gruppe in dem
Konjugat. Tatsächlich
kann das Binden einer großen
hydrophoben Gruppe wesentlich Kreuzmembrantransport erschweren oder verhindern,
aufgrund von Adhäsion
der hydrophoben Gruppe an die Lipiddoppelschicht. Demgemäß umfasst die
vorliegende Erfindung Konjugate, die keine großen hydrophoben Gruppen enthalten,
wie etwa Lipid- und Fettsäuremoleküle. In einer
anderen Ausführungsform
wird das Verfahren verwendet, um einen Nicht-Zentralnervensystemzustand
(Nicht-ZNS-Zustand) in einem Individuum zu behandeln, das keine
Zuführung
durch die Blut-Hirn-Barriere erfordert.
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A. Polymerkomponenten
-
Aminosäuren. In einer Ausführungsform
besteht das Transportpolymer aus D- oder L-Aminosäuregruppen.
Die Verwendung natürlich
auftretender L-Aminosäurereste
in den Transportpolymeren hat den Vorteil, dass Zerfalls-Produkte relativ
nicht toxisch für
die Zelle oder den Organismus sein sollten.
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Im Allgemeineren ist es bevorzugt,
dass jede Polymeruntereinheit eine hoch basische Seitenkettengruppe
enthält,
die in (i) einen pKa von größer als
11, bevorzugter 12,5 oder größer aufweist
und (ii) in ihrem protonierten Zustand mindestens zwei geminale
Aminogruppen (NH2) enthält, die eine Resonanzstabilisierte positive
Ladung teilen, welche dem Rest einen zweizähnigen Charakter geben.
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D-Aminosäuren können auch in den Transportpolymeren
verwendet werden. Zusammensetzungen, die ausschließlich D-Aminosäuren enthalten,
haben den Vorteil, eines verringerten enzymatischen Abbaus. Jedoch
können
sie auch weitgehend intakt innerhalb der Zielzelle bleiben. Eine
derartige Stabilität
ist im Allgemeinen nicht problematisch falls das Mittel biologisch
aktiv ist, wenn das Polymer immer noch gebunden ist. Für Mittel,
die in Konjugatform inaktiv sind, sollte ein Linker innerhalb des
Konjugats enthalten sein, der an der Wirkstelle spaltbar ist (z.
B. durch Enyzm- oder Lösungsmittel-vermittelte
Spaltung innerhalb einer Zelle), um Freisetzung des Mittels in Zellen
oder Orgenellen zu fördern.
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Andere Untereinheiten. Untereinheiten,
die von Aminosäuren
verschieden sind, können
ebenfalls ausgewählt
werden zur Verwendung bei der Bildung von Transportpolymeren. Derartige
Untereinheiten können, ohne
darauf begrenzt zu sein, Hydroxyaminosäuren, N-Methylaminosäuren, Aminoaldehyde
und dgl. umfassen, welche zu Polymeren mit verringerten Peptidbindungen
führen.
Andere Untereinheitstypen können
verwendet werden in Abhängigkeit
von der Natur des ausgewählten
Grundgerüsts,
wie im nächsten
Abschnitt diskutiert.
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B. Grundgerüststyp
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Eine Vielzahl von Grundgerüsttypen
kann verwendet werden, um die Seitenkettenguanidino- und/oder Amidinogruppen
anzuordnen und zu positionieren, wie etwa Alkylgrundgerüstgruppen,
die verbunden sind durch Thioether- oder Sulfonylgruppen, Hydroxysäureester
(äquivalent
zum Ersatz von Amidbindungen durch Esterbindungen), Ersetzen des
alpha-Kohlenstoffs durch Stickstoff, um ein Aza-analoges zu bilden,
Alkylgrundgerüstgruppen,
die durch Carbamatgruppen verbunden sind, Polyethylenimine (PEIs)
und Aminoaldehyde, welche zu Polymeren führen, die aus sekundären Aminen
aufgebaut sind.
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Eine detaillierte Grundgerüstliste
umfasst N-substituiertes Amid (CONR ersetzt CONH-Bindungen), Ester
(CO2), Ketomethylen (COCH2)
reduziert oder Methylenamino (CH2NH), Thioamid
(CSNH), Phosphinat (PO2RCH2),
Phosphonamidat und Phosphonamidatester (PO2RNH),
Retropeptid (NHCO), trans-Alken (CR=CH), Fluoralken (CF=CH), Dimethylen
(CH2CH2), Thioether
(CH2S), Hydroxyethylen (CH(OH)CH2), Methylenoxy (CH2O),
Tetrazol (CN4), Retrothioamid (NHCS), retroreduziertes
(NHCH2), Sulfonamido (SO2NH), Methylensulfonamido
(CHRSO2NH), Retrosulfonamid (NHSO2) und Peptoide (N-substituierte Glycine) und Grundgerüste mit
Malonat- und/oder gem-Diaminoalkyluntereinheiten,
z. B. in der Übersicht
von Fletcher et al. (1998) dargestellt und detailliert ausgeführt durch
darin zitierte Literaturstellen. Peptoidgrundgerüste (N-substituierte Glycine)
können
ebenfalls verwendet werden (z. B. Kessler, 1993; Zuckermann et al.,
1992; und Simon et al., 1992). Viele der vorstehenden Substitutionen
führen
zu ungefähr
isosteren Polymergrundgerüsten relativ
zu Grundgerüsten,
die aus α-Aminosäuren gebildet
werden.
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Studien, die zur Unterstützung der
vorliegenden Erfindung durchgeführt
wurden, verwendeten Polypeptide (z. B. Peptidgrundgerüste). Jedoch
Nicht-Peptidgrundgerüste der
Erfindung, wie etwa diejenigen, die oben beschrieben sind, können verbesserte
biologische Stabilität
bereitstellen (z. B. Resistenz gegenüber enzymatischem Abbau in
vivo).
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c. Synthese von polymeren
Transportmolekülen
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Polymere werden durch ein Verfahren
nach dem Stand der Technik aufgebaut.
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III. Bindung von Transportpolymeren
an biologisch aktive Mittel
-
Transportpolymere der vorliegenden
Erfindung können
kovalent an biologisch aktive Mittel durch chemische Verfahren gebunden
werden.
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A. Chemische Verknüpfungen
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Biologisch aktive Mittel, wie etwa
kleine organische Moleküle
und Makromoleküle,
können
an Transportpolymere der Erfindung über eine Vielzahl von Verfahren
gebunden werden, die in der Technik bekannt sind (siehe z. B. Wong,
1991), entweder direkt (z. B. mit einem Carbodiimid) oder über eine
verbindende Gruppe. Im Besonderen sind Carbamat-, Ester-, Thioether-,
Disulfid- und Hydrazonbindungen im Allgemeinen leicht zu bilden
und für
die meisten Anwendungen geeignet. Ester- und Disulfidbindungen sind
bevorzugt falls die Bindung gleich in dem Cytosol nach Transport
der Substanz durch die Zellmembran abbaubar sein sollen.
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Verschiedene funktionelle Gruppen
(Hydroxyl, Amino, Halogen usw.) können verwendet werden, um das
biologisch aktive Mittel an das Transportpolymer zu binden. Gruppen,
von denen nicht bekannt sind, dass sie ein Teil einer aktiven Stelle
des biologisch aktiven Mittels sind, sind bevorzugt, im Besonderen
wenn das Polypeptid oder ein Teil davon auf der Substanz nach Zuführung verbleiben
soll.
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Polymere, wie etwa Peptide, die gemäß Beispiel
1 hergestellt sind, werden im Allgemeinen mit einer Amino-terminalen
Schutzgruppe erzeugt, wie etwa FMOC. Für biologisch aktive Mittel,
die die Bedingungen überstehen
können,
welche verwendet werden, um das Polypeptid von dem Syntheseharz
abzuspalten und zum Entschützen
der Seitenketten, kann das FMOC von dem N-Terminus des vollständigen Harz-gebundenen Polypeptids
abgespalten werden, sodass das Mittel an das freie N-terminale Amin
gebunden werden kann. In solchen Fällen wird das zu bindende Mittel
typischerweise durch Verfahren aktiviert, die in der Technik allgemein
dafür bekannt
sind, dass sie eine aktive Ester- oder aktive Carbonatgruppe erzeugen,
die wirkungsvoll ist, um eine Amid- bzw. Carbamatbindung mit der
Polymeraminogruppe zu bilden. Natürlich kann auch eine andere
Verknüpfungschemie
verwendet werden.
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Um dabei zu helfen Nebenreaktionen
zu minimieren, können
Guanidino- und Amidinogruppen blockiert werden unter Verwendung
herkömmlicher
Schutzgruppen, wie etwa Carbobenzyloxygruppen (CBZ), di-t-BOC, PMC,
Pbf, N-NO2 und dgl.
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Kopplungsreaktionen werden durchgeführt durch
bekannte Kopplungsverfahren in einer beliebigen Reihe von Lösungsmitteln,
wie etwa N,N-Dimethylformamid (DMF), N-Methylpyrrolidinon, Dichlormethan, Wasser
und dgl. Beispielhafte Kopplungsreagenzien umfassen O-Benzotriazolyloxytetramethyluroniumhexafluorphosphat
(HATU), Dicyclohexylcarbodiimid, Brom-tris(pyrrolidino)phosphoniumbromid
(PyBroP), usw. Andere Reagenzien können enthalten sein, wie etwa
N,N-Dimethylaminopyridin
(DMAP), 4-Pyrrolidinopyridin, N-Hydroxysuccinimid, N-Hydroxybenzotriazol
und dgl.
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Für
biologisch aktive Mittel, die inaktiv sind bis das gebundene Transportpolymer
freigesetzt wird, ist der Linker vorzugsweise ein leicht spaltbarer
bzw. abspaltbarer Linker, was bedeutet, dass er für enzymatische oder
Lösungsmittelvermittelte
Spaltung in vivo zugänglich
ist. Für
diesen Zweck sind Linker, die Carbonsäureester- und Disulfidbindungen
enthalten, bevorzugt, worin die ersteren Gruppen enzymatisch oder
chemisch hydrolysiert werden und die letzteren durch Disulfidaustausch,
z. B. in der Gegenwart von Glutathion, abgetrennt werden.
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In einer bevorzugten Ausführungsform
enthält
der spaltbare Linker eine erste spaltbare Gruppe, die distal zu
dem Mittel ist, und eine zweite spaltbare Gruppe, die proximal zu
dem Mittel ist, sodass Spaltung der ersten spaltbaren Gruppe zu
einem Linker-Mittel-Konjugat führt,
das eine nukleophile Gruppe aufweist, welche in der Lage ist, zum
intramolekularen Reagieren, um die zweite spaltbare Gruppe zu spalten,
wobei das Mittel von dem Linker und dem Polymer freigesetzt wird.
Diese Ausführungsform
wird weiter veranschaulicht durch die verschiedenen kleinen Molekülkonjugate,
die unten diskutiert werden.
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IV. Erhöhter Transport
biologisch aktiver Mittel durch biologische Membranen
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A. Messen des Transports
durch biologische Membranen
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Modellsysteme zum Beurteilen der
Fähigkeit
von Polymeren der Erfindung zum Transport von Biomolekülen und
anderen therapeutischen Substanzen durch biologischen Membranen
umfassen Systeme, die die Fähigkeit
des Polymers zum Transport eines kovalent gebundenen fluoreszenten
Moleküls
durch die Membran messen. Zum Beispiel kann Fluorescein (≈ 376 MG) als
ein Modell für
den Transport kleiner organischer Moleküle dienen (Beispiel 2). Für den Transport
von Makromolekülen
kann ein Transportpolymer mit einem großen Polypeptid vereinigt werden,
wie etwa mit Ovalbumin (Molekulargewicht 45 kDa; z. B. Beispiel
14). Der Nachweis der Aufnahme von Makromolekülen kann erleichtert werden
durch Binden eines fluoreszenten tag. Zelluläre Aufnahme kann auch durch
konfokale Mikroskopie analysiert werden (Beispiel 4).
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B. Erhöhter Transport durch biologische
Membranen
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In Versuchen, die mit Unterstützung der
vorliegenden Erfindung durchgeführt
wurden, wurden Transmembrantransport und begleitende zelluläre Aufnahme
beurteilt durch Aufnahme eines Transportpeptids, das an Fluorescein
gebunden ist, gemäß den Verfahren,
die in den Beispielen 2 und 3 beschrieben sind. Kurz dargestellt
bedeutet dies, dass Suspensionen von Zellen mit fluoreszenten Konjugaten
inkubiert, suspendiert in Puffer für verschiedene Zeiten bei 37°C, 23 °C oder 3°C wurden.
Nach Inkubation wurde die Reaktion gestoppt und die Zellen wurden
durch Zentrifugation gesammelt und auf Fluoreszenz analysiert unter
Verwendung von Fluoreszenz-aktivierter Zellsanalyse (FACS).
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Unter den verwendeten Bedingungen
war die zelluläre
Aufnahme der Konjugate nicht befriedigend. Folglich konnten für die Peptide
keine ED50-Werte berechnet werden. Anstelle
dessen werden Daten als Histogramme angegeben, um direkte Vergleiche
der zellulären
Aufnahme bei einzelnen Konjugatkonzentrationen zu erlauben.
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Die 1A–1C zeigen Ergebnisse einer
Studie, worin Polymere von L-Arginin (R; 1A) oder D-Arginin (r; 1B) im Längenbereich von 4 bis 9 Argininuntereinheiten
auf ihre Fähigkeit
zum Transport von Fluorescein in Jurkat-Zellen getestet wurden. Zum Vergleich
wurde das Ausmaß des
Transports für
HIV-tat-Gruppen 49–57
("49–57") und ein Nonamer
von L-Lysin (K9) ebenfalls getestet. 1C zeigt
ein Histogramm des Aufnahmegrads für die Konjugate bei einer Konzentration
von 12,5 μM.
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Wie in den Figuren gezeigt, traten
Fluoreszenz-markierte Peptidpolymere, die aus 6 oder mehr Argininresten
bestanden, in Zellen wirkungsvoller ein als die tat-Sequenz 49–57. Im
Besonderen wurde die Aufnahme auf mindestens das zweifache des Aufnahmegrads
von tat 49–57
verstärkt
und war so hoch wie etwa das 6- bis 7-fache des Aufnahmegrads von
tat 49–57.
Die Aufnahme von Fluorescein alleine war vernachlässigbar.
Ebenfalls zeigte das Lysinnonamer (K9) sehr geringe Aufnahme, wodurch
angezeigt wurde, dass kurze Lysinpolymere als Transmembrantransportmittel
im Gegensatz zu Guanidin-enthaltenden Polymeren mit vergleichbarer
Länge ineffektiv
sind.
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Unter Bezugnahme auf 1B zeigten Homopolymere von D-Arginin
sogar größere Transportaktivität als die
L-Gegenstücke.
Jedoch war die Größenordnung
der Aufnahmegrade etwa die gleiche. Für die D-Homopolymere zeigten
die Peptide mit 7 bis 9 Argininen ungefähr gleiche Aktivität. Das Hexamer
(R6 oder r6) war etwas weniger wirkungsvoll, zeigte jedoch immer
noch mindestens etwa 2- bis 3-fach höhere Transportaktivität als tat(49–57).
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Die Fähigkeit des D- und L-Argininpolymers
zum Erhöhen
des Transmembrantransports wurde bestätigt durch konfokale Mikroskopie
( 2A–2F und
Beispiel 4). Übereinstimmend
mit den oben beschriebenen FACS-Daten,
war das Cytosol von Zellen, die inkubiert waren mit entweder R9
( 2B und 2E) oder r9 (2C und 2F)
hell fluoreszierend, wodurch hohe Grade Konjugattransport in die
Zellen angezeigt wird. Im Gegensatz hierzu zeigte tat(49– 57) bei
der gleichen Konzentration nur schwache Färbung (2A und 2D). Die
konfokalen Mikrografien heben auch den Punkt hervor, dass das D-Argininpolymer (2C) wirkungsvoller beim
Eintritt in Zellen war als das Polymer, das aus L-Arginin aufgebaut
war (2F).
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Aus dem vorhergehenden ist ersichtlich,
dass Transportpolymere der Erfindung deutlich irkungsvoller sind
als HIV-tat-Peptid 47–59
beim Transportieren von Arzneimitteln durch die Plasmamebranen von
Zellen. Darüber
hinaus war das Poly-Lys-Nonamer ineffektiv als ein Transportmittel.
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Zum Bestimmen, ob eine optimale Länge für benachbartes
Guanidinium enthaltende Homopolymere vorlag, wurde ein Satz langer
Argininhomopolymerkonjugate (R15, R20, R25 und R30) untersucht.
Zum Untersuchen der Wirkung von wesentlich längeren Polymeren wurde auch
ein Gemisch von L-Argininpolymeren mit einem mittleren Molekulargewicht
von 12.000 Dalton (≈ 100
Aminosäuren)
getestet (Beispiel 5). Jedoch musste zur Vermeidung von Präzipitationsproblemen
der Serumgehalt in dem Assay zum Testen der Konjugate mit dem ≈ 12.000 MG-Polymermaterial
verringert werden. Die Zellaufnahme wurde durch FACS wie oben analysiert
und die mittlere Fluoreszenz lebender Zellen wurde gemessen. Die
Cytotoxizität
jedes Konjugats wurde ebenfalls gemessen.
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Unter Bezugnahme auf 3 zeigte die Aufnahme von L-Argininhomopolymerkonjugaten
mit 15 oder mehr Arginen Muster der zellulären Aufnahme, die deutlich
verschieden waren von Polymeren, die neun Arginine oder mehr enthalten.
Die Kurven der längeren
Konjugate waren flacher, wobei sie diejenigen der R9- und r9-Konjugate
kreuzten. Bei höheren
Konzentrationen (> 3 μM) war die
Aufnahme von R9 und r9 deutlich besser als für die längeren Polymere. Jedoch bei
geringeren Konzentrationen zeigten Zellen, die mit den längeren Peptiden
inkubiert waren, stärkere
Fluoreszenz.
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Basierend auf diesen Daten erscheint
es, dass r9 und R9 in die Zellen mit höheren Raten eintreten als Polymere,
die 15 oder mehr benachbarte Arginine enthalten. Jedoch die biologische
Halbwertszeit von R9 (L-Peptid) war geringer als die für die längeren Konjugate,
vermutlich aufgrund dessen, dass Proteolyse der längeren Peptide
(aufgrund von Serumenzymen) Fragmente erzeugt, die Transportaktivität beibehalten.
Im Gegensatz hierzu zeigte das D-Isomer (r9) keinen Hinweis auf
proteolytischen Abbau, was übereinstimmend mit
der hohen Spezifität
von Serumproteasen für
L-Peptide ist.
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Daher scheint die Gesamttransporteffizienz
eines Transportpolymers abhängig
zu sein von einer Kombination von (i) der Rate der Transportmembranaufnahme
(Polymer mit weniger als etwa 15 benachbarten Argininen sind besser)
gegenüber
der Zugänglichkeit
für proteolytische
Inaktivierung (längere
Polymere sind besser). Demgemäß sind Polymere,
die 7 bis 20 benachbarte Guanidiniumreste und vorzugsweise 7 bis
15 enthalten, bevorzugt.
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Vor allem zeigte das Polyargininkonjugat
mit hohem Molekulargewicht (12.000 MG) keine nachweisbare Aufnahme.
Dieses Ergebnis ist übereinstimmend
mit den Beobachtungen von Barsoum et al. (1994) und legt nahe, dass
Argininpolymere Transporteigenschaften aufweisen, die deutlich verschieden
von denjenigen sind, die durch Lysinpolymere gezeigt werden können. Darüber hinaus
erwies sich das Polyargininkonjugat als stark toxisch (Beispiel
5). Im Allgemeinen erhöhte
sich die Toxizität
der Polymere mit der Länge,
sodass nur das Konjugat mit einem MG von 12.000 hohe Toxizität bei allen
getesteten Konzentrationen zeigte.
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Wenn die zelluläre Aufnahme von Polymeren von
D- und L-Arginin durch Michaelis-Menten-Kinetiken (Beispiel 6) analysiert
wurde, war die Aufnahmerate durch Jurkat-Zellen so wirkungsvoll,
dass präzise
Km-Werte nur erhalten werden konnten, wenn
die Assays bei 3°C
(auf Eis) durchgeführt
wurden. Sowohl die maximale Transportrate (Vmax)
als auch die scheinbare Affinität
der Peptide für
den mutmaßlichen
Rezeptor der Michaelis-Konstante (Km) wurden erhalten aus Lineweaver-Burk-Plots
der beobachteten Fluoreszenz von Jurkat-Zellen nach Inkubation mit
variierenden Konzentrationen von Nonameren von D- und L-Arginin für 30, 60,
120 und 240 Sekunden.
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Kinetikanalysen zeigten auch, dass
Arginin-reiche Polymere eine bessere Fähigkeit aufweisen zum Binden
an und Durchtreten durch eine mutmaßliche zelluläre Transportstelle
als z. B. das tat(49–57)-Peptid, da
die Km für
Transport des nonameren Poly-L-Arginins (44 μM) wesentlich geringer war als
die Km des tat-Peptids (722 μM). Darüber hinaus
zeigte das Nonamer von D-Arginin die kleinste Km (7 μM) der in
diesem Assay getesteten Polymere (Tabelle 1), d. h. eine ungefähr 100-fach
höhere
scheinbare Affinität.
Entsprechend einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung hat
das Transportpolymer der Erfindung eine scheinbare Affinität (Km), die mindestens 10-mal größer ist
und vorzugsweise mindestens 100-mal größer ist als die Affinität, die für tat durch
das Verfahren von Beispiel 6 gemessen wird, wenn bei Raumtemperatur
(23°C) oder
37°C gemessen
wird.
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Versuche, die im Zusammenhang mit
der vorliegenden Erfindung durchgeführt wurden, zeigten, dass Polymer-erleichterter
Transport abhängig
ist von der metabolen Integrität
von Zellen. Die Zugabe einer toxischen Menge Natriumazid (0,5% Gew./V)
zu Zellen führte
zur Inhibierung der Aufnahme von Konjugaten um etwa 90% (Beispiel
7). Die in 4 gezeigten
Ergebnisse zeigen (i) Natriumazidempfindlichkeit des Transmembrantransports,
wodurch Energieabhängigkeit
(zelluläre
Aufnahme) nahegelegt wird, und (ii) die Überlegenheit von Polyguanidiniumpolymeren
der Erfindung (R9, R8, R7) relativ zu HIV tat(49–57).
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Ohne sich auf eine spezielle Theorie
festzulegen, legen die Daten nahe, dass das Transportverfahren ein
energieabhängiger
Prozess ist, der durch spezifische Erkennung von Guanidinium- oder
Amidinium-enthaltenden Polymeren durch ein Molekültransportmittel, das in zellulären Plasmamebranen
vorliegt, vermittelt wird.
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Andere Versuche in Zusammenhang mit
der Erfindung haben gezeigt, dass die Konjugate der Erfindung effektiv
sind zum Transport biologisch aktiver Mittel durch Membranen einer
Vielzahl von Zelltypen, einschließlich humane T-Zellen (Jurkat),
B-Zellen (Maus CH27), Lymphom-T-Zellen (Maus-EL4), Mastocytomzellen
(Maus P388), mehrere Maus-T-Zell-Hybridome, neuronale Zellen (PC-12),
Fibroblasten (Maus RT), Nierenzellen (Maus-HELA), Myeloblastome
(Maus K562); und primäre
Gewebezellen, einschließlich
aller humaner Blutzellen (ausgenommen rote Blutzellen), wie etwa
T- und B-Lymphozyten,
Makrophagen, dendritische Zellen und Eiosinophile; Basophile, Mastzellen,
endotheliale Zellen, Herzgewebezellen, Leberzellen, Milzzellen,
Lymphknotenzellen und Keratinocyten.
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Die Konjugate sind ebenfalls wirkungsvoll
zum Durchqueren von sowohl gramnegativen als auch gram-positiven
Bakterienzellen, wie in Beispiel 8 und in den 5A–5C offenbart. Im Allgemeinen
erwiesen sich Polymere von D-Argininuntereinheiten
dahingehend, dass sie sowohl in gram-positive als auch gram-negative
Bakterien mit Raten eintraten, die deutlich schneller sind als die
Transportraten, die für
Polymere von L-Arginin beobachtet werden. Dies ist durch 5A dargestellt, welche viel
höhere
Aufnahmegrade für r9-Konjugat
(D-Arginine) zeigt
als für
R9-Konjugat (L-Arginine), bei Inkubation mit E. coli HB 101 (prokariontisch)
Zellen. Diese Beobachtung kann dem proteolytischen Abbau der L-Polymere
durch Bakterienenzyme zuzuschreiben sein.
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5B zeigt
Aufnahmegrade für
D-Argininkonjugate als eine Funktion der Länge (r4 bis r9) im Vergleich
mit einem Poly-L-Lysinkonjugat (K9), bei Inkubation mit E. Coli
HB 101-Zellen. Wie ersichtlich ist, zeigten die Polyargininkonjugate
einen Trend, der ähnlich
demjenigen ist, der in 2B mit
eukaryontischen Zellen beobachtet wurde, sodass Polymere, die kürzer als
r6 sind, geringe Aufnahmegrade zeigten, mit Aufnahmegraden, die
als eine Funktion der Länge
anstiegen.
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Gram-positive Bakterien, wie beispielsweise
durch Sfrep. bovis dargestellt, wurden ebenfalls wirkungsvoll mit
Polymeren von Arginin, jedoch nicht Lysin, wie in 5C gezeigt, angefärbt.
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Im Allgemeineren wurden maximale
Aufnahmegrade durch die Bakterien bei 37 °C beobachtet. Jedoch wurde deutliches
Färben
beobachtet, wenn die Inkubation entweder bei Raumtemperatur oder
bei 3°C durchgeführt wurde.
Konfokale Mikroskopie zeigte, dass Vorbehandlung der Bakterien mit
0,5% Natriumazid den Transport durch die inneren Plasmamebranen
von sowohl gram-positiven als auch gram-negativen Bakterien inhibierte,
jedoch nicht den Transport durch die Zellwand (gram-positive Bakterien)
in den periplasmatischen Raum.
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Daher umfasst die Erfindung Konjugate,
die antimikrobielle Mittel enthalten, wie etwa antimikrobielle und
Antipilzmittel, zur Verwendung bei der Vorbeugung vor oder Inhibierung
von mikrobieller Proliferation oder Infektion und zum Desinfizieren
von Oberflächen,
um die medizinische Sicherheit zu verbessern. Zusätzlich kann
die Erfindung für
den Transport in Pflanzenzellen, insbesondere in grünblättrige Pflanzen,
verwendet werden.
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Zusätzliche Studien im Zusammenhang
mit der Erfindung zeigten, dass Translokation durch Bakterienmembranen
sowohl Energie- als auch Temperaturabhängig ist, was übereinstimmend
mit der Beobachtung ist, die früher
für andere
Zelltypen gemacht wurde.
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V. Therapeutische Zusammensetzungen
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A. Kleine organische Moleküle
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Therapeutische Mittel aus kleinen
organischen Molekülen
können
vorteilhaft an lineare polymere Zusammensetzungen, wie hier beschrieben,
gebunden werden, um einen Transport durch biologische Membranen
zu erleichtern oder zu erhöhen.
Zum Beispiel kann die Zuführung
von hochgeladenen Mitteln, wie etwa Levodopa (L-3,4-Dihydroxyphenylalanin;
L-DOPA) vorteilhaft sein durch Binden an polymere Transportmoleküle, wie
hier beschrieben. Peptoide- und peptidomimetische Mittel sind ebenfalls
vorgesehen (z. B. Langston, 1997; Giannis et al., 1997). Ebenfalls
ist die Erfindung vorteilhaft zum Zuführen kleiner organischer Moleküle, die
geringe Löslichkeit
in wässrigen
Flüssigkeiten
aufweisen, wie etwa Serum oder wässrige
Salzlösungen.
So können
Verbindungen, deren therapeutische Wiksamkeiten durch ihre geringen
Löslichkeiten
begrenzt sind, in größeren Dosen
gemäß der vorliegenden
Erfindung verabreicht werden, und können wirkungsvoller auf einer
molaren Basis in Konjugatform sein, relativ zur Nicht-Konjugatform
aufgrund höherer
Aufnahmegrade durch Zellen.
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Da ein wesentlicher Teil der topologischen
Oberfläche
eines kleinen Moleküls
häufig
umfasst ist und daher erforderlich ist für biologische Aktivität, kann
es notwendig sein, dass der kleine Molekülteil des Konjugats in besonderen
Fällen
von dem gebundenen Transportpolymer und der Linkergruppe (falls überhaupt
vorliegend) für
das kleine Molekülmittel
getrennt werden muss, um biologische Wirkung nach Durchqueren der biologischen
Zielmembran zu zeigen. Für
solche Fälle
umfasst das Konjugat vorzugsweise einen spaltbaren Linker zum Freisetzen
von Arzneimitteln nach dem Durchtreten durch eine biologische Membran.
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In einer Annäherung kann das Konjugat eine
Disulfidbindung umfassen, wie in 6A dargestellt,
welche ein Konjugat (1) zeigt, das ein Transportpolymer T enthält, welches
an ein cytotoxisches Mittel, 6-Mercaptopurin, durch eine N-Acetyl-geschützte Cysteingruppe
gebunden ist, die als ein Linker dient. So ist das cytotoxische
Mittel durch eine Disulfidbindung an die 6-Mercaptogruppe gebunden
und das Transportpolymer ist an die Cysteincarbonylgruppe über eine
Amidbindung gebunden. Spaltung der Disulfidbindung durch Reduktion
oder Disulfidaustausch führt
zur Freisetzung des freien cytotoxischen Mittels.
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Ein Verfahrne zum Synthetisieren
eines Disulfid-enthaltenden Konjugats wird in Beispiel 9A bereitgestellt.
Das Produkt enthält
ein Heptamer von Arg-Resten, welches an 6-Mercaptopurin durch einen
N-Acetyl-Cys-Ala-Ala-Linker gebunden ist, worin die Ala-Reste als
ein zusätzlicher
Spacer aufgenommen sind, um das Disulfid zugänglicher für Thiole und Reduktionsmittel
zur Spaltung innerhalb einer Zelle zu machen. Der Linker in diesem
Beispiel zeigt auch die Verwendung von Amidbindungen, welche enzymatisch
innerhalb einer Zelle gespalten werden können.
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In einer anderen Annäherung umfasst
das Konjugat einen fotospaltbaren Linker, welcher bei Behandlung
mit elektromagnetischer Strahlung gespalten wird. Eine beispielhafte
Bindung ist in 6B dargestellt, welche
ein Konjugat (II) zeigt, die ein Transportpolymer T enthält, das
an 6-Mercaptopurin über
eine meta-Nitrobenzoatlinkergruppe
gebunden ist. Polymer T ist an die Ntrobenzoatgruppe durch eine
Amidbindung zur Benzoatcarbonylgruppe gebunden und das cytotoxische
Mittel ist über
seine 6-Mercaptogruppe an die p-Methylengruppe gebunden. Die Verbindung
kann gebildet werden durch Umsetzen von 6-Mercaptopurin mit p-Brommethyl-m-nitrobenzoesäure in der
Gegenwart von NaOCH3/Methanol unter Erhitzen,
gefolgt durch Koppeln der Benzoatcarbonsäure an ein Transportpolymer
wie etwa die Aminogruppe eines γ-Aminobuttersäurelinkers,
der an das Polymer gebunden ist (Beispiel 9B). Fotoilluminierung
des Konjugats bewirkt Freisetzung des 6-Mercaptopurins aufgrund
der Nitrogruppe, die ortho zu dem Mercaptomethylrest ist. Dieser
Ansatz findet Anwendung in Fototherapieverfahren, die in der Technik
bekannt sind, insbesondere zum Lokalisieren von Arzneimittelaktivierung
in einem ausgewählten
Bereichs des Körpers.
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Vorzugsweise enthält der spaltbare Linker erste
und zweite spaltbare Gruppen, die zusammenwirken können, um
das Polymer von dem biologisch wirksamen Mittel abzuspalten, wie
durch die folgenden Ansätze veranschaulicht.
Das heißt
der spaltbare Linker enthält
eine erste spaltbare Gruppe, die distal zu dem Mittel ist und eine
zweite spaltbare Gruppe, die proximal zum Mittel ist, sodass die
Spaltung der ersten spaltbaren Gruppe ein Linkermittel-Konjugat
ergibt, das einen nukleophilen Rest enthält, der in der Lage ist zum
intramolekularen Reagieren, um die zweite spaltbare Gruppe zu spalten,
wobei das Mittel von dem Linker und dem Polymer freigesetzt wird.
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6C zeigt
ein Konjugat (III), das ein Transportpolymer T enthält, das
mit dem Antikrebsmittel 5-Fluoruracil (5FU) verbunden ist. Hier
wird die Bindung bereitgestellt durch eine modifizierte Lysylgruppe.
Das Transportpolymer ist an die α-Aminogruppe
gebunden und das 5-Fluoruracil ist über das α-Carbonyl gebunden. Die Lysyl-ε-Aminogruppe
ist zu einem Carbamatester von o-Hydroxymethylnitrobenzol
modifiziert worden, umfassend eine erste fotolabile spaltbare Gruppe
in dem Konjugat. Fotoilluminierung trennt die Nitrobenzolgruppe
von dem Konjugat, wobei ein Carbamat zurückbleibt, welches sich ebenfalls
rasch zersetzt, um die freie ε-Gruppe,
ein wirkungsvolles Nukleophil, zu ergeben. Intramolekulare Reaktion
der ε-Aminogruppe
mit der Amidbindung an die 5-Fluoruracilgruppe führt zur Zyklisierung unter
Freisetzung der 5-Fluoruracilgruppe.
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6D zeigt
ein Konjugat (IV), enthaltend ein Transportpolymer T, das an den
2'-Sauerstoff des
Antikrebsmittels, Paclitaxel, gebunden ist. Die Bindung wird bereitgestellt
durch eine Linkergruppe, die umfasst (i) ein Stickstoffatom, das
an das Transportpolymer gebunden ist, (ii) einen Phosphatmonoester,
der para zu dem Stickstoffatom angeordnet ist und (iii) eine Carboxymethylgruppe,
die meta zum Stickstoffatom ist, welche mit dem 2'-Sauerstoff von Paclitaxel
durch eine Carboxylatesterbindung verbunden ist. Enzymatische Spaltung der
Phosphatgruppe von dem Konjugat ergibt eine freie Phenolhydroxylgruppe.
Diese nukleophile Gruppe reagiert dann intramolekular mit dem Carboxylatester,
um freies Paclitaxel freizusetzen, zum Binden an sein biologisches
Ziel. Beispiel 9C beschreibt ein Syntheseprotokoll zum Herstellen
dieses Konjugattyps.
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6E zeigt
eine noch weitere Annäherung,
worin ein Transportpolymer an ein biologisch aktives Mittel, z.
B. Paclitaxel, durch eine Aminoalkylcarbonsäure gebunden wird. Vorzugsweise
wird die Linkeraminogruppe an den Linkercarboxylkohlenstoff durch
3 bis 5 Kettenatome (n = 3 bis 5), vorzugsweise entweder 3 oder
4 Kettenatome, gebunden, welche vorzugsweise als Methylenkohlenstoffe
bereitgestellt werden. Wie aus 6E ersichtlich,
ist die Linkeraminogruppe an das Transportpolymer durch eine Amidbindung
gebunden und ist an die Paclitaxelgruppe durch eine Esterbindung
gebunden. Enzymatische Spaltung der Amidbindung setzt das Polymer
frei und erzeugt eine freie nukleophile Aminogruppe. Die freie Aminogruppe
kann dann intramolekular mit der Estergruppe reagieren, um den Linker
von dem Paclitaxel freizusetzen.
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6D und 6E sind veranschaulichend
für einen
anderen Aspekt der Erfindung, umfassend Taxan- und Taxoid-Antikrebskonjugate,
welche verbesserte Transmembrantransportraten relativ zu entsprechenden nicht-konjugierten
Formen aufweisen. Die Konjugate sind besonders geeignet zum Inhibieren
von Wachstum von Krebszellen. Es wird angenommen, dass Taxane und
Taxoide ihre Antikrebswirkungen durch Fördern der Polymerisation von
Mikrotubuli (und Inhibierung von Depolymerisation) zu einem Ausmaß, das nachteilig
für die
Zellfunktion ist, wodurch Zellreplikation inhibiert wird und letztendlich
Zelltod herbeigeführt
wird, manifestieren.
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Der Ausdruck "Taxan" betrifft Paclitaxel (6F, R' =
Acetyl, R'' = Benzyl), ebenfalls
bekannt unter der Marke "TAXOL") und natürlich auftretende
synthetische oder biotechnisch entwickelte Analoga, die einen Grundgerüstkern aufweisen,
der A-, B-, C- und D-Ringe von Paclitaxel enthält, wie in 6G dargestellt. 6F zeigt auch die Struktur
von "TAXOTERETM" (R' = H, R'' = BOC), welches gewissermaßen löslicheres
synthetisches Analoges von Paclitaxel ist, vertrieben von Rhone-Poulenc. "Taxoid" betrifft natürlich auftretendes, synthetisches
oder biotechnisch entwickelte Analoga von Paclitaxel, die die Basis-A-,
B- und C-Ringe von Paclitaxel enthalten, wie in 6A gezeigt. Wesentliche synthetische
und biologische Information über
die Synthese und Aktivität
einer Vielzahl von Taxane- und Taxoid-Verbindungen ist erhältlich,
wie in Suffness (1995) in einer Übersicht
dargestellt, insbesondere in den Kapiteln 12 bis 14, als auch in
der nachfolgenden Paclitaxel-Literatur. Darüber hinaus ist ein Wirt von
Zelllinien erhältlich
zum Vorhersagen von Antikrebsaktivitäten dieser Verbindung gegen
bestimmte Krebstypen, wie z. B. in Suffness in den Kapiteln 8 und
13 beschrieben.
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Das Transportpolymer ist konjugiert
an die Taxan- oder Taxoidgruppe über
eine geeignete Stelle der Bindung in dem Taxan oder Taxoid. Üblicherweise
ist das Transportpolymer über
ein C2'-Sauerstoff-,
C7-Sauerstoffatom gebunden, unter Verwendung von Bindungsstrategien,
wie oben beschrieben. Konjugation eines Transportpolymers über einen
C7-Sauerstoff führt
zu Taxan-Konjugaten, die Antikrebs- und Antitumoraktivität aufweisen,
trotz Konjugation an dieser Position. Demgemäß kann der Linker spaltbar
oder nicht spaltbar sein. Konjugation über den C2'-Sauerstoff verringert wesentlich die
Antikrebsaktivität,
sodass ein spaltbarer Linker zur Konjugation an diese Stelle bevorzugt
ist. Andere Stellen zur Bindung können ebenfalls verwendet werden, wie
etwa C10.
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Es wird ersichtlich sein, dass die
Taxan- und Taxoid-Konjugate der Erfindung verbesserte Wasserlöslichkeit
relativ zu Taxol (≈ 0,25 μg/ml) und
Taxotere (6–7 μg/ml) aufweisen.
Daher sind keine großen
Mengen Solubilisierungsmittel, wie etwa "CREMOPHOR EL" (polyoxyethyliertes Castoröl), Polysorbat
80 (Polyoxyethylensorbitanmonooleat, ebenfalls bekannt als "TWEEN 80") und Ethanol erforderlich,
sodass Nebenwirkungen, die typischerweise mit diesen Solubilisierungsmitteln
verbunden sind, wie etwa Anaphylaxe, Dyspnoe, Hypotension und Auswaschen
(Flushing) verringert werden können.
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B. Metalle
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Metalle können in eukaryontische und
prokaryontische Zellen transportiert werden unter Verwendung von
Chelatisierungsmitteln, wie etwa Texaphyrin oder Diethylentriaminpentaessigsäure (DTPA),
die konjugiert sind an eine Transportmembran der Erfindung, wie
durch Beispiel 10 veranschaulicht. Diese Konjugate sind geeignet
zum Zuführen
von Metallionen für
eine Bilddarstellung oder Therapie. Beispielhafte Metallionen umfassen
Eu. Lu, Pr, Gd, Tc99m, Ga67, In111, Y90, Cu67 und Co57. Vorausgehende
Membrantransportstudien mit Konjugatkandidaten können durchgeführt werden
unter Verwendung von Assays auf Zellbasis, wie etwa in dem unten
stehenden Beispielabschnitt beschrieben. Zum Beispiel kann unter
Verwendung von Europiumionen die zelluläre Aufnahme durch zeitaufgelöste Fluoreszenzmessungen
dargestellt werden. Für
Metallionen, die cytotoxisch sind, kann die Aufnahme durch Cytotoxizität beobachtet
werden.
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C. Markomoleküle
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Das verbesserte Transportverfahren
der Erfindung ist besonders geeignet zum Erhöhen des Transports durch biologische
Membranen für
eine Vielzahl von Makromolekülen,
einschließlich,
ohne darauf begrenzt zu sein, Proteine, Nukleinsäuren, Polysaccharide und Analoga
davon. Beispielhafte Nukleinsäuren
umfassen Oligonukleotide und Polynukleotide, die aus DNA und RNA
gebildet werden, und Analoga davon, welche ausgewählte Sequenzen
aufweisen, die zur Hybridisierung an komplementäre Targets (z. B. Antisense-Sequenzen
für einzel- und doppelsträngige Zielmoleküle) konstruiert
sind, oder zum Exprimieren von Nukleinsäuretranskripten oder Proteinen,
die durch die Sequenzen codiert sind. Analoga umfassen geladene
und vorzugsweise ungeladene Grundgerüstanaloga, wie etwa Phosphonate
(vorzugsweise Methylphosphonate), Phosphoramidate (N3' oder N5'), Thiophosphate,
ungeladene Polymere auf Morpholinobasis und Proteinnukleinsäuren (PNAs).
Derartige Moleküle
können
in einer Vielzahl therapeutischer Abläufe verwendet werden, einschließlich z.
B. Enzymaustauschtherapie, Gentherapie und Antisense-Therapie.
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Zum Beispiel sind Proteinnukleinsäuren (PNA)-Analoga
von DNA, worin das Grundgerüst
strukturell homomorph mit einem Deoxyribosegrundgerüst ist.
Es besteht aus N-(2-Aminoethyl)glycineinheiten, an welche die Nukleobasen gebunden
sind. PNAs, die alle vier natürlichen
Nukleobasen aufweisen, hybridisieren an komplementäre Oligonukleotide
unter Beachtung der Watson-Crick-Basenpaarungsregeln
und sind eine tatsächliche
DNA-Nachbildung in Bezug auf Basenpaarnachbildung (Egholm et al.,
1993). Das Grundgerüst
eines PNA wird eher durch Peptidbindungen gebildet als durch Phosphatester,
wodurch es gut geeignet für
Antisense-Anwendungen wird. Da das Grundgerüst ungeladen ist, zeigen PNA/DNA-
oder PNA/RNA-Duplexe, die sich bilden, größere thermische Stabilität als normal.
PNAs haben den zusätzlichen
Vorteil, dass sie von Nukleasen oder Proteasen nicht erkannt werden.
Zusätzlich
können
PNAs auf einem automatisierten Peptidsynthesizer synthetisiert werden,
unter Verwendung von Standard t-Boc-Chemie. Die PNA wird dann an
ein Transportpolymer der Erfindung gebunden.
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Beispiele von Antisense-Oligonukleotiden,
deren Transport in Zellen erhöht
werden kann unter Verwendung der Verfahren der Erfindung, sind z.
B. beschrieben im U.S. Patent 5,594,122. Derartige Oligonukleotide
sind darauf ausgerichtet, den humanen Immunschwächevirus (HIV) zu behandeln.
Konjugation eines Transportpolymers an ein Antisense-Oligonukleotid
kann bewirkt werden z. B. durch Bilden einer Amidbindung zwischen
dem Peptid und dem 5'-Terminus
des Oligonukleotids durch einen Succinatlinker gemäß gut etablierter
Verfahren. Die Verwendung von PNA-Konjugaten ist weiter in Beispiel
11 veranschaulicht.
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7 zeigt
Ergebnisse, die mit einem Konjugat der Erfindung erhalten werden,
das eine PNA-Sequenz zum Inhibieren der Sezernierung von γ-Interteron
(γ-IFN)
durch T-Zellen enthält,
wie in Beispiel 11 detailliert dargestellt. Wie ersichtlich ist,
war das Antisense-PNA-Konjugat wirkungsvoll zum Blockieren der γ-IFN-Sezernierung, worin
das Konjugat mit Gehalten von etwa 10 μM vorlag. Im Gegensatz hierzu
wurde keine Inhibierung beobachtet mit dem Sense-PNA-Konjugat oder dem
nicht konjugierten Antisense-PNA alleine.
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Eine andere Klasse von Makromolekülen, die
durch biologische Membranen transportiert werden können, wird
beispielhaft dargestellt durch Proteine und im Besonderen Enzyme.
Therapeutische Proteine umfassen, ohne darauf begrenzt zu sein,
Austauschenzyme. Therapeutische Enzyme umfassen, ohne darauf begrenzt
zu sein, Alglucerase zur Verwendung bei der Behandlung von lysosomaler
Glucocerebrosidasemangelerkrankung (Gaucher's Krankheit), alpha-L-Iduronidase, zur Verwendung bei der
Behandlung von Mucopolysaccharidose 1, alpha-N-Acetylglucosamidase,
zur Verwendung bei der Behandlung des Sanfilippo B Syndroms, Lipase
zur Verwendung bei der Behandlung von Pankreasinsuffizienz, Adenosideaminase,
zur Verwendung bei der Behandlung des schweren kombinierten Immundefizienzsyndroms
und Triosephosphatisomerase zur Verwendung bei der Behandlung neuromuskulärer Dysfunktion,
die mit Triosephoshatisomerasemangel verbunden ist.
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Zusätzlich und gemäß einem
weiteren wichtigen Aspekt der Erfindung können Proteinantigene dem Cytosolkompartiment
von Antigen-präsentierenden
Zellen (APCs) zugeführt
werden, worin sie in Peptide abgebaut werden. Die Peptide werden
dann in das endoplasmatische Reticulum transportiert, worin sie
mit naszierenden HLA-Klasse-1-Molekülen assoziieren und sie werden
auf der Zelloberfläche
ersichtlich. Derartige "aktivierte" APCs können als
Induktoren von Klasse-1-restringierten Antigen-spezifischen cytotoxischen T-Lymphozyten
(CTLs) dienen, welche dann fortfahren Zellen zu erkennen und zu
zerstören,
die das besondere Antigen aufweisen. APCs, die in der Lage sind,
diesen Prozess auszuführen,
umfassen, ohne darauf begrenzt zu sein, bestimmte Makrophagen, B-Zellen
und dendritische Zellen. In einer Ausführungsform ist das Proteinantigen
ein Tumorantigen zum Hervorrufen oder Fördern einer Immunantwort gegen
Tumorzellen.
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Der Transport isolierter oder löslicher
Proteine in das Cytosol von APC mit nachfolgender Aktivierung von
CTL ist außergewöhnlich,
da mit wenigen Ausnahmen die Injektion isolierter oder löslicher
Proteine weder zu einer Aktivierung von APC noch Induktion von CTLs
führt.
Daher können
Antigene, die an die transporterhöhenden Zusammensetzungen der
vorliegenden Erfindung konjugiert sind, dazu dienen, eine zelluläre Immunantwort
in vitro oder in vivo zu stimulieren.
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Beispiel 14 liefert Details von Versuchen,
die in Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung durchgeführt worden
sind, worin ein beispielhaftes Proteinantigen, Ovalbumin, APCs zugeführt wurde
nach Konjugation an ein R7-Polymer.
Nachfolgende Zugabe der APCs zu cytotoxischen T-Lymphozyten (CTLs)
führte
zu CD8 + Albumin-spezifischen cytotoxischen T-Zellen (stimulierte
CTLs). Im Gegensatz hierzu konnten APCs, die unmodifiziertem Ovalbumin
ausgesetzt waren, die CTLs nicht stimulieren.
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In parallelen Versuchen wurden histokompatible
dendritische Zellen (ein spezifischer Typ von APC) Ovalbumin-R7-Konjugaten
ausgesetzt, dann in Mäuse
injiziert. Nachfolgende Analyse von Blut dieser Mäuse zeigte
das Vorliegen von Albumin-spezifischen CTLs. Kontrollmäusen wurden
dendritische Zellen verabreicht, die unmodifiziertem Albumin ausgesetzt
waren. Die Kontrollmäuse
zeigten nicht die Albumin-spezifische CTL-Antwort. Diese Beispiele
zeigen beispielhaft eine der spezifischen Anwendbarkeiten, die mit
der Zuführung
von Makromolekülen
im Allgemeinen und Proteinen im Besonderen in Zellen verbunden sind.
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In einer anderen Ausführungsform
ist die Erfindung geeignet zum Zuführen immunspezifischer Antikörper oder
Antikörperfragmente
in das Cytosol, um mit nachteiligen biologischen Prozessen wechselzuwirken,
wie etwa einer mikrobiellen Infektion. Jüngere Versuche haben gezeigt,
dass intrazelluläre
Antikörper
effektive antivirale Mittel in Pflanzen- und Säugerzellen sein können (z.
B. Tavladoraki et al., 1993; und Shaheen et al., 1996). Diese Verfahren
verwendeten typischerweise einkettige variable Region-Fragmente
(scFv), worin die schweren und leichten Ketten des Antikörpers als
ein einzelnes Polypeptid synthetisiert werden. Die variablen schweren
und leichten Ketten werden üblicherweise
durch ein flexibles Linkerpeptid (z. B. 15 Aminosäuren) getrennt,
um ein 28 kDa Molekül
zu ergeben, das die Hochaffinitätsligandenbindungsstelle beibehält. Das prinzipielle
Hindernis für
eine weite Anwendung dieser Technologie ist die Effizienz der Aufnahme
in infizierte Zellen gewesen. Jedoch durch Binden von Transportpolymeren
an scFv-Fragmente kann das Ausmaß der zellulären Aufnahme
erhöht
werden, wobei es den immunspezifischen Fragmenten erlaubt wird,
an wichtige mikrobiellen Komponenten zu binden und diese unwirksam
zu machen, wie etwa HIV Rev, HIV reverse Transkriptase und Integrase-Proteine.
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D. Peptide
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Peptide, die durch die verbesserten
Transportverfahren, die hier beschrieben sind, zugeführt werden sollen,
umfassen, ohne dass sie darauf begrenzt werden sollen, Effektorpolypeptide,
Rezeptorfragmente und dgl. Beispiele umfassen Peptide mit Phosphorylierungsstellen,
die durch Protein-vermittelnde intrazelluläre Signale verwendet werden.
Beispiele derartiger Proteine umfassen, ohne darauf begrenzt zu
sein, Proteinkinase C, RAF-1, p21Ras, NF-κB, C-JUN und cytoplasmatische
Schwänze
von Membranrezeptoren, wie etwa IL-4-Rezeptor, CD28, CTLA-4, V7 und MHC-Klasse
1 und Klasse II-Antigene.
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In Versuchen, die in Zusammenhang
mit der vorliegenden Erfindung durchgeführt wurden (Beispiel 15) wurde
ein 10-Aminosäuresegment
der Cytoplasmaschwanzregion des Transmembranproteins V7 (ebenfalls
bekannt als CD101) mit einer R7-Polymersequenz an seinem C-Terminus
synthetisiert. Diese Schwanzregion ist dafür bekannt, dass sie physikalisch
assoziiert mit und die Inaktivierung von RAF-1-Kinase vermittelt, ein
kritisches Enzym in dem MAP-Kinaseweg
der zellulären
Aktivierung. Das V7-R7-Konjugat wurde zu T-Zellen gegeben, welche
nachfolgend mit Detergens lysiert wurden. Die lösliche Fraktion wurde auf Immunpräzipitation
durch Anti-V7-Antikörper
aus Maus in Verbindung mit Ziegen-Anti-Maus IgG getestet.
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In der Abwesenheit einer Peptidbehandlung
kopräzipitierte
RAF-1, eine Kinase, von der bekannt ist, dass sie mit V7 assoziiert
und inaktiviert wird durch Assoziierung, mit V7. In Peptid-behandelten
Zellen wurde RAF-1-Protein von dem V7-Immunokomplex eliminiert.
Die gleiche Peptidbehandlung störte
einen Komplex nicht, der aus RAF-1 und p21 Ras bestand, wodurch
nichtspezifische Modifikation von RAF-1 durch die V7-Peptide ausgeschlossen
wird. Diese Ergebnisse zeigten, dass ein Cytoplasmaschwanzregion-V7-Peptid bei
Konjugation an ein membrantransporterhöhendes Peptid der vorliegenden
Erfindung in eine Zielzelle eintritt und spezifisch mit einem physiologischen
Effektormolekül,
RAF-1, assoziiert. Eine derartige Assoziation kann verwendet werden,
um intrazelluläre
Prozesse abzubrechen.
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In einem zweiten Satz von Untersuchungen
wurde der V7-Teil des Konjugats in vitro phosphoryliert, unter Verwendung
von Proteinkinase C. Anti-RAF-1-Präzipitate
von T-Zellen, die phosphorylierten V7-Schwanzpeptiden ausgesetzt
wurden, jedoch nicht dem unphosphoryliertem V7-Schwanzpeptid, zeigten potente
Inhibierung der RAF-Kinaseaktivität. Diese Untersuchungen zeigen
zwei Prinzipien. Erstens, dass die Transportpolymere der Erfindung
den Transport eines hochgeladenen (phosphorylierten) Moleküls durch
die Zellmembran bewirken können.
Zweitens, während
sowohl phosphorylierte als auch unphosphorylierte V7-Schwanzpeptide
an RAF-1 binden können,
modifizierte nur das phosphorylierte Peptid RAF-1-Kinaseaktivität.
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VI. Screeningassawerfahren
und Bibliothek
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In einer anderen Ausführungsform
kann die Erfindung verwendet werden, um ein oder mehrere Konjugate
auf eine ausgewählte
biologische Aktivität
zu screenen, worin das bzw. die Konjugate gebildet wird bzw. gebildet
werden aus einem oder mehreren Kandidatenagentien. Konjugate) wird
(werden) in Kontakt gebracht mit einer Zelle, die ein nachweisbares
Signal bei Aufnahme des Konjugats in die Zelle zeigt, sodass die
Stärke des
Signals kennzeichnend für
die Effizienz des Konjugats in Bezug auf die ausgewählte biologische
Aktivität ist.
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Ein Vorteil dieser Ausführungsform
ist, dass es besonders geeignet ist zum Testen der Aktivitäten von Mitteln,
die selbst nicht in der Lage sind oder nur geringfügig in der
Lage sind, in Zellen einzutreten, um biologische Aktivität zu manifestieren.
Daher liefert die Erfindung einen besonders wirkungsvollen Weg zum
Identifizieren aktiver Mittel, die ansonsten auf anderem Weg nicht
zugänglich
wären durch
Screening-Programme im großen
Maßstab,
aufgrund des Fehlens eines wirkungsvollen und geeigneten Weges zum
Transportieren des Mittels in die Zelle oder Organelle.
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Vorzugsweise wird das mindestens
eine Kandidatenagens bereitgestellt als eine Kombinationsbibliothek
von Konjugaten, welche hergestellt werden unter Verwendung eines
kombinatorischen synthetischen Verfahrens, das in der Technik bekannt
ist. Zum Beispiel erkannten Thompson und Ellman (1996) mindestens
fünf verschiedene
allgemeine Ansätze
zum Herstellen kombinatorischer Bibliotheken auf festen Trägern, nämlich (1)
Synthese diskreter Verbindungen, (2) Splitsynthese (Split und Pool),
(3) lösliche
Bibliotheksdekonvolution, (4) Strukturbestimmung durch analytische
Verfahren und (5) Decodierungsstrategien, worin die chemischen Zusammensetzungen
aktiver Kandidaten bestimmt werden durch einzigartige Markierungen,
nach positivem Testen auf biologische Aktivität in dem Assay. Synthese von
Bibliotheken in Lösung
umfasst mindestens (1) räumlich
getrennte Synthesen und (2) Synthese von Pools (Thompson, supra).
Darüber
hinaus kann eine Beschreibung kombinatorischer Syntheseverfahren
gefunden werden in Lam et al (1997), welche im Besonderen den Einkügelchen-eine-Verbindung-Ansatz
beschreibt.
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Diese Ansätze werden leicht angepasst,
um Konjugate gemäß der vorliegenden
Erfindung herzustellen, einschließlich geeigneter Schutzschemata,
falls erforderlich. Zum Beispiel kann für eine Bibliothek, die auf einem
oder mehreren festen Trägern
aufgebaut ist, zuerst eine Transportgruppe an den (die) Träger gebunden werden,
gefolgt durch kombinatorisches Aufbauen oder Anhängen von Kandidatenagentien,
auf Polymere über
geeignete reaktive Funktionalitäten.
In einem alternativen Beispiel wird zuerst eine kombinatorische
Bibliothek von Mitteln auf einem oder mehreren festen Trägern gebildet,
gefolgt durch Hinzufügen
eines Transportpolymers an jedes immobilisierte Kandidatenagens.
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Ähnliche
oder verschiedene Ansätze
können
verwendet werden für
Lösungsphasensynthesen.
Bibliotheken, die auf einem festen Träger gebildet werden, werden
bevorzugt von dem Träger
durch eine spaltbare Linkergruppe durch bekannte Verfahren (Thompson
et al. Und Lam et al., supra) abgetrennt.
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Der mindestens eine Konjugatkandidat
kann mit einer Vielzahl von Assays auf Zellbasis getestet werden,
die nachweisbare Signale im Verhältnis
zu der irksamkeit des Konjugats ergeben. Herkömmlicherweise werden die Kandidaten
mit Zellen in Platten mit mehrfachen Vertiefungen inkubiert und
die biologischen Wirkungen werden über ein Signal gemessen (z.
B. Fluoreszenz, Reflexion, Absorption oder Chemielumineszenz) das
unter Verwendung eines Plattenlesegeräts quantifiziert werden kann.
Alternativ können
die Inkubationsgemische aus den Vertiefungen für ein weiteres Bearbeiten und/oder
weitere Analyse entnommen werden. Die Strukturen aktiver und optional
inaktiver Verbindungen, wenn nicht bereits bekannt, werden dann
bestimmt und diese Information kann verwendet werden, um Leitverbindungen
zu identifizieren und weitere Synthese- und Screeninganstrengungen
zu konzentrieren.
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Zum Beispiel wird der in Beispiel
11 detailliert dargestellte γ-Interferon-Sezernierungsassay
leicht angepasst auf das Multivertiefungsformat, sodass aktive Sezernierungsinhibitoren
durch Fluoreszenzdetektion auf Europiumbasis unter Verwendung eines
Plattenlesegeräts
nachgewiesen werden können.
Antikrebsmittel können
gescreent werden unter Verwendung etablierter Krebszelllinien (z.
B. bereitgestellt durch die National Institutes of Health (NIH)
und das National Cancer Institute (NCl)). Cytotoxische Wirkungen
von Antikrebsmitteln können
durch Trypanfarbstoffausschluss z. B. bestimmt werden.
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Andere Beispiele umfassen Assays,
die auf die Inhibierung der Zellsignalisierung ausgerichtet sind, wie
etwa IL-4-Rezeptorinhibierung; Assays zum Blockieren zellulärer Proliferation
und Genexpressionsassays. In einem typischen Genexpressionsassay
wird ein Gen, das von Interesse ist, unter der Kontrolle eines geeigneten
Promotors angeordnet und wird abstromig von einem Gen gefolgt, zum
Herstellen einer Reporterspezies, wie etwa β-Galactosidase oder Glühwürmchenluciferase.
Eine Inhibitionswirkung kann basierend auf einer Abnahme des Reportersignals
nachgewiesen werden.
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Die Erfindung umfasst auch eine Konjugatbibliothek,
welche geeignet ist zum Screenen in dem obigen Verfahren. Die Bibliothek
umfasst eine Vielzahl von Kandidatenagentien für ein oder mehrere ausgewählte biologische
Aktivitäten,
von welchen jede konjugiert ist mit mindestens einem Transportpolymer
gemäß der Erfindung.
Vorzugsweise ist die Konjugatbibliothek eine kombinatorische Bibliothek.
In einer anderen Ausführungsform
umfasst die Erfindung eine regelmäßige Anordnung verschiedener
Polymermittelkonjugate, die verteilt sind in einer mit Indices versehenen
oder mit Indices versehbaren Vielzahl von Probenvertiefungen, zum Testen
und Identifizieren aktiver Mittel, die von Interesse sind.
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VI. Anwendbarkeit
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Zusammensetzungen und Verfahren der
vorliegenden Erfindung haben besondere Anwendbarkeit im Bereich
der Human- und Veterinärtherapie.
Im Allgemeinen werden verabreichte Dosen effektiv sein, um picomolare
bis mikromolare Konzentrationen der therapeutischen Zusammensetzung
der Effektorstelle zuzuführen.
Geeignete Dosen und Konzentrationen werden von Faktoren abhängen, wie
etwa der therapeutischen Zusammensetzung oder dem Arzneimittel,
dem Ort der vorgesehenen Zuführung
und dem Verabreichungsweg, welche alle empirisch gemäß im Stand
der Technik allgemein bekannter Verfahren erhalten werden können. Eine
weitere Anleitung kann erhalten werden aus Studien unter Verwendung
experimenteller Tiermodelle zum Beurteilen der Dosis, wie im Stand
der Technik bekannt.
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Die Verabreichung der Verbindungen
der Erfindung mit einem geeigneten pharmazeutischen Hilfsmittel,
falls erforderlich, kann durch eine der anerkannten Arten der Verabreichung
durchgeführt
werden. Daher kann die Verabreichung z. B. intravenös, topikal,
subkutan, transkutan, intramuskulär, oral, in ein Gelenk, parenteral,
peritoneal, intranasal oder durch Inhalation erfolgen. Die Formulierungen
können
fest, halbfest, lyophilisiertes Pulver oder flüssige Dosisformen sein, wie
etwa z. B. Tabletten, Pillen, Kapseln, Pulver, Lösungen, Suspensionen, Emulsionen,
Suppositorien, Retentionseinlauf, Cremes, Salben, Lotionen, Aerosole
oder dgl. vorzugsweise in Dosisformen, die geeignet für eine einfache
Verabreichung von genauen Dosen sind.
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Die Zusammensetzungen umfassen typischerweise
einen herkömmlichen
pharmazeutischen Träger oder
ein Hilfsmittel und können
zusätzlich
andere medizinische Mittel, Träger,
Hilfsmittel und dgl. enthalten. Vorzugsweise wird die Zusammensetzung
etwa 5% bis 75% bezüglich
des Gewichts einer Verbindung oder Verbindungen der Erfindung enthalten,
wobei der Rest aus geeigneten pharmazeutischen Hilfsmitteln besteht. Geeignete
Hilfsmittel können
auf die spezielle Zusammensetzung und den Verabreichungsweg durch
in der Technik allgemein bekannte Verfahren z. B zugeschnitten werden
(Gennaro, 1990).
-
Zur oralen Verabreichung umfassen
derartige Hilfsmittel pharmazeutische Qualitäten von Mannitol, Lactose,
Stärke,
Magnesiumstearat, Natriumsaccharin, Talk, Cellulose, Glucose, Gelatine,
Sucrose, Magnesiumcarbonat und dgl. Die Zusammensetzung kann die
Form einer Lösung,
Suspension, Tablette, Pille, Kapsel, Pulver, Formulierung mit verzögerter Freisetzung
und dgl. annehmen.
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In einigen Ausführungsformen nehmen die pharmazeutischen
Zusammensetzungen die Form einer Pille, Tablette oder Kapsel an
und daher kann die Zusammensetzung zusammen mit dem biologisch aktiven Konjugat
eines der folgenden enthalten: ein Verdünnungsmittel, wie etwa Lactose,
Sucrose, Dicalciumphosphat und dgl.; ein Desintegrationsmittel,
wie etwa Stärke
oder Derivate davon; ein Gleitmittel, wie etwa Magnesiumstearat
und dgl.; und ein Bindemittel, wie etwa Stärke, Gummiarabicum, Polyvinylpyrrolidon,
Gelatine, Cellulose und Derivate davon.
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Die aktiven Verbindungen der Formeln
können
in ein Zäpfchen
gemischt werden, umfassend z. B. etwa 0,5% bis etwa 50% einer Verbindung
der Erfindung, angeordnet in einem Polyethylenglykol (PEG)-Träger (z.
B. PEG 1000 [96%] und PEG 4000 [4%]).
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Flüssige Zussammensetzungen können hergestellt
werden durch Lösen
oder Dispergieren einer Verbindung (etwa 0,5% bis etwa 20%) und
optional pharmazeutischer Hilfsmittel in einem Träger, wie
etwa z. B. wässriger
Salzlösung
(z. B. 0,9% Gew.-%/V Natriumchlorid), wässrige Dextrose, Glycerol,
Ethanol und dgl., um eine Lösung
oder Suspension zu bilden, z. B. zur intravenösen Verabreichung. Die aktiven
Verbindungen können
auch zu einem Retentionseinlauf formuliert werden.
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Falls es gewünscht ist, kann die zu verabreichende
Zusammensetzung auch kleinere Mengen nichttoxischer Hilfssubstanzen
enthalten, wie etwa Benetzungsoder Emulgiermittel, pH-Puffermittel,
wie etwa z. B. Natriumacetat, Sorbitanmonolaurat oder Triethanolaminoleat.
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Zur topischen Verabreichung wird
die Zusammensetzung in einer geeigneten Form verabreicht, wie etwa
als eine Lösung
oder ein transdermales Pflaster. Zur Verabreichung durch Inhalation
kann die Zusammensetzung als ein trockenes Pulver (z. B. Inhale
Therapeutics) oder in flüssiger
Form über
einen Vernebler verabreicht werden.
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Verfahren zum Herstellen derartiger
Dosisformen sind bekannt und werden für den Fachmann in der Technik
ersichtlich werden; siehe z. B. Remington's Pharmaceutical Sciences (1980). Die
zu verabreichende Zusammensetzung wird in jedem Fall eine Menge
des Proarzneimittels und/oder der aktiven Verbindungen) in einer
pharmazeutisch wirksamen Menge zum Lindern des zu behandelnden Zustands
enthalten, wenn sie gemäß den Lehren
dieser Erfindung verabreicht wird.
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Im Allgemeinen werden die Verbindungen
der Erfindung in einer therapeutisch wirksamen Menge verabreicht,
d. h. in einer Dosis, die ausreichend ist, um eine Behandlung zu
bewirken, welche in Abhängigkeit von
dem Individuum und dem Zustand, der zu behandeln ist, variieren
wird. Typischerweise ist eine therapeutisch wirksame Tagesdosis
von 0,1 bis 100 mg/kg Körpergewicht
Arzneimittel pro Tag. Die meisten Zustände reagieren bei einer Verabreichung
von einer Gesamtdosis zwischen etwa 1 und etwa 30 mg/kg Körpergewicht pro
Tag oder zwischen etwa 70 mg und 2100 mg pro Tag für eine Person
mit 70 kg.
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Die Stabilität des Konjugats kann weiterhin
kontrolliert werden durch die Zusammensetzung und die Stereochemie
des Grundgerüsts
und der Seitenketten des Polymers. Für Polypeptidpolymere sind im
Allgemeinen D-Isomere
resistent gegenüber
endogenen Proteasen und haben daher längere Halbwertszeiten im Serum
und innerhalb von Zellen. D-Polypeptidpolymere sind daher geeignet
wenn eine längere
Wirkungsdauer gewünscht
ist. L-Polypeptidpolymere
haben kürzere
Halbwertszeiten aufgrund ihrer Suszeptibilität für Proteasen und werden daher
ausgewählt,
um kürzere
Wirkungseffekte zu vermitteln. Dies erlaubt es, dass Nebenwirkungen
leichter verhindert werden durch Beenden der Therapie sobald Nebenwirkungen
beobachtet werden. Polypeptide, die Gemische von D- und L-Resten
umfassen, haben dazwischenliegende Stabilitäten. Homo-D-Polymere sind im
Allgemeinen bevorzugt.
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Die folgenden Beispiele sollen die
vorliegende Erfindung veranschaulichen, jedoch nicht begrenzen.
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Beispiel 1
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Pegtidsynthese
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Peptide wurden synthetisiert unter
Verwendung von Festphasentechniken auf einem Applied Biosystems
Peptid-Synthesizer unter Verwendung der FastMOCTM-Chemie und kommerziell
erhältlicher
Wang-Harze und Fmoc-geschützter Aminosäuren, entsprechend
den in der Technik allgemein bekannten Verfahren (Bonifaci). Peptide
wurden gereinigt unter Verwendung von C4- oder C18-Reversphase HPLC-Säulen und
ihre Strukturen wurden unter Verwendung von Amiosäureanalyse
und Massenspektrometrie bestätigt.
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Beispiel 2
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Fluoreszenzassays
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Fluoreszente Peptide wurden synthetisiert
durch Modifizieren des Aminoterminus des Peptids mit Aminocapronsäure, gefolgt
durch Reaktion mit Fluoresceinisothiocyanat in der Gegenwart von
(2-1H-Benzotriazol-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluroniumhexafluorphosphat/N-Hydroxybenzotriazol,
gelöst
in N-Methylpyrrolidon. Die
Produkte wurden durch Gelfiltration gereinigt.
-
Suspensionszellen (106/ml)
wurden für
verschiedene Zeiten inkubiert bei 37°C, 23°C oder 4°C, in einem Konzentrationsbereich
von Peptiden oder Konjugaten in PBS bei einem pH-Wert von 7,2, enthaltend
2% fötales
Kalbsserum (PBS/FCS) auf Platten mit 96 Vertiefungen. Nach einer
15-minütigen
Inkubation wurden die Zellen durch Zentrifugieren pelletiert, dreimal
mit PBS/FCS-enthaltendem
1%-igem Natriumazid gewaschen, inkubiert mit Trypsin/EDTA (Gibco)
bei 37°C
für fünf Minuten,
dann noch zweimal mit PBS/FCS/NaN3 gewaschen.
Die pelletierten Zellen wurden in PBS, enthaltend 2% FCS und 0,1
% Propidiumjodid, resuspendiert und auf einem FACScan (Becton Dickenson,
Mountain View, CA) analysiert. Zellen, die positiv für Propidiumjodid
waren, wurden aus der Analyse ausgeschlossen. Zur Analyse von Polymeren
von Arginin wurde die Spannung des Fotomultipliers um eine Größenordnung
verringert, um eine genauere Messung zu erlauben.
-
Beispiel 3
-
tat-Basispeptid gegenüber Poly-Arg-Peptiden
-
Aufnahmegrade der folgenden Polypeptide
wurden gemessen durch das Verfahren in Beispiel 2: (1) Ein Polypeptid,
umfassend HIV-tat-Reste 49–57
(Arg-Lys-Lys-Arg-Arg-Gln-Arg-Arg-Arg
= SEQ ID Nr: 1), (2) ein Nonamer von L-Lys-Resten (K9, SEQ ID Nr: 2) und (3) Homo-L
oder Homo-Polypeptide, enthaltend vier bis neun Arg-Reste (SEQ ID
Nr: 3–8
und 12–17).
Ergebnisse sind in den
2A bis 2C gezeigt.
-
Beispiel 4
-
Konfokale Zellmikroskopie
-
Zellen, die inkubiert sind mit fluoreszenten
Polyargininpeptiden wurden wie oben beschrieben für Bindungsassays
hergestellt und bei der Cell Sciences Imaging Facility analysiert
(Stanford University, Stanford, CA), unter Verwendung eines konfokalen
Einstrahl-Laser-Scanningmikroskops, mit einer Anregungswellenlänge von
488 nm (Argon-Ionen-Laser) und einer Emissionsbandbreite von 510–550, unter
Verwendung eines Banddurchgangsfilters. Konjugate (6,25 μM), enthaltend
tat(49–57),
R7 oder r7, gekoppelt an Fluorescein, wurden mit Jurkat-Zellen bei
37 °C für 10 Minuten
inkubiert. Die 2A bis 2F zeigen Ergebnisse für emittierte Fluoreszenz
(2A–2C)
und transmittiertes Licht (2D–2F)
für tat(49–57) (2A und 2C), R7 (2B und 2E) und r7 (2C und 2F).
-
Beispiel 5
-
Längenbereichsstudien
-
Die folgenden Homopolymere von Polyarginin
wurden auf Fluoreszenz durch den Fluoreszenzassay in Beispiel 2
getestet, unter Inkubation bei 37°C
für 15
Minuten vor dem Zellpelletieren: r9, R9, R15, R20, R25 und R30.
Zusätzlich
wurde auch ein Gemisch von L-Argininpolymeren mit einem mittleren
Molekulargewicht von 12.000 Dalton (ungefähr 100 Aminosäuren) ebenfalls
getestet (Sigma Chem. Co.) nachdem sie mit Fluoresceinisothiocyanat
markiert und durch Gelfiltration („SEPHADEX" G-25) gereinigt wurden. Die Zellen
wurden durch FACS analysiert und die mittlere Fluoreszenz der lebenden
Zellen wurde gemessen. Die Cytotoxizität jedes Konjugats wurde ebenfalls
gemessen durch Berechnen des Prozentanteils von Zellen, die mit
Propidiumjodid färbten,
was charakteristisch für
Zelltod ist. Aufnahmeergebnisse für die r9-, R9-, R15-, R20- und R25-Konjugate
sind in 3 gezeigt.
-
Das kommerziell erhältliche
Polyarginin (12.000 MG) präzipitierte
Proteine in Serum, am wahrscheinlichsten α1-Säuregylcoprotein. Daher wurde
der Gehalt an fötalem
Kälberserum
um das 10-fache in dem Assay für
Konjugate, die aus diesem Material hergestellt sind, verringert.
-
Die Poly-Arg-Zusammensetzung mit
12.000 MG war bei Konzentrationen von 800 nM bis 50 μM toxisch
und ist aus 3 ausgenommen.
Poly-L-Arg-Konjugate, die 20 Argininreste oder mehr enthalten, waren bei
Konzentrationen von höher
als 12 μM
toxisch, sodass die Toxizität
mit der Länge
anstieg.
-
Beispiel 6
-
Kinetiken der Aufnahme
-
Zum Messen von Vmax und Km-Parametern
der zellulären
Aufnahme wurde das Assayverfahren von Beispiel 2 mit den folgenden
Modifikationen verwendet. Peptide wurden mit Zellen für 0,5, 1,
2 und 4 Minuten bei 4°C
dreifach in 50 μl
PBS/FCS auf Platten mit 96 Vertiefungen inkubiert. Am Ende der Inkubation
wurde die Reaktion durch Verdünnen
der Proben in 5 ml PBS/FCS gequencht, es wurde zentrifugiert und
einmal mit PBS/FCS, Trypsin/EDTA gewaschen und schließlich nochmals
mit PBS/FCS und die Pellets wurden in PBS/FCS-enthaltendem Propidiumjodid zur Analyse
auf einem FACScan aufgenommen. FACS-Daten wurden der Lineweaver-Burk-Gleichung
für Michaelis-Menten-Kinetiken angepasst.
Kinetikdaten für
fluoreszente Konjugate von tat(49–57), R9 und r9 sind in Tabelle
1 gezeigt.
-
Beispiel 7
-
Metabolinhibitorwirkungen
auf den Transport
-
Suspensionszellen (106/ml)
wurden für
30 Minuten mit 0,5% Natriumazid in PBSenthaltendem 2%-igem FCS inkubiert.
Am Ende der Inkubation wurden fluoreszente Peptide (tat(49–57), R7,
R8 oder R9) bis zu einer Endkonzentration von 12,5 μM zugegeben.
Nach Inkubation für
30 Minuten wurden die Zellen wie in Beispiel 2 gewaschen, ausgenommen,
dass alle Waschpuffer 0,1% Natriumazid enthielten. Die Ergebnisse sind
in 5 gezeigt.
-
Beispiel 8
-
Transport in Bakterienzellen
-
Gram-negative Bakterien (E. coli
Stamm HB101) und gram-positive Bakterien (Strep. bovis) wurden in einem
geeigneten Medium in logarithmischer Phase gezüchtet. Zellkulturen (4 × 108 pro ml) wurden für 30 Minuten bei 37°C mit variierenden
Konzentrationen fluoreszenter Konjugate inkubiert, die lineare Polymere
von L-Arginin (R4 bis R9), D-Arginin (r4 bis r9) oder L-Lysin (K9)
bei Konjugatkonzentration von 3 bis 50 μM enthielten. Die Zellen wurden
gewaschen, in PBS-enthaltendem Propidiumjodid aufgenommen (um tote
Zellen zu unterscheiden) und durch FACS und Fluoreszenzmikroskopie
analysiert. Ergebnisse sind in den 5A–5C wie oben diskutiert, gezeigt.
-
Beispiel 9
-
Konjugate mit beispielhaften
spaltbaren Linkern
-
A. 6-Mercaptopurincysteindisulfidkonjugat
-
- A.1 Thiolaktivierung. N-Acetyl-Cys(SH)-Ala-Ala-(Arg)-7-CO2H (12,2 mg, 0,0083 mmol) wurde in 3 ml 3
: 1 AcOH : H2O unter Rühren bei Raumtemperatur gelöst. Zu dieser
Lösung
wurde Dithio-bis-(5-nitropyridin) (DTNP) (12,9 mg, 0,0415 mmol,
5 Äg.)
gegeben. Man ließ die
Lösung
für 24
h bei Umgebungstemperatur rühren,
wonach das Gemisch eine hellgelbe Farbe annahm. Lösungsmittel
wurde im Vakuum entfernt und der Rückstand wurde in 5 ml Wasser
wieder gelöst
und dreimal mit Ethylacetat extrahiert, um überschüssiges DTNP zu entfernen. Die
wässrige
Schicht wurde lyophilisiert und das Produkte wurde ohne weitere
Reinigung verwendet.
- A2. Binden von Arzneimittel N-Acetyl-Cys(SH)-Ala-Ala-(Arg)7-CO2H (0,0083 mmol) wurde in 1 ml entgastem
H2O (pH-Wert = 5) unter Argon bei Raumtemperatur
unter Rühren
gelöst.
6-Mercaptopurin (1,42 mg, 0,0083 mmol, 1 Äg.) in 0,5 ml DMF wurde zu
dem Gemisch gegeben. Man ließ die
Reaktion für
18 h unter Inertatmosphäre
bei Umgebungstemperatur rühren.
Nach 18 h entwickelte sich eine hellgelbe Farbe, wodurch das Vorliegen
von freiem 5-Nitro-2-thiopyridin
angezeigt wird. Lösungsmittel
wurde unter verringertem Druck entfernt und der Rückstand
wurde durch HPLC gereinigt, wodurch das gewünschte Produkt (I, 6A) in 50% Gesamtausbeute
bereitgestellt wird.
-
B. Fotospaltbares Taxolkonjugat
-
3-Nitro-4-(brommethyl)benzoesäure (100
mg, 0,384 mmol) wird in wasserfreiem Methanol (5 ml) unter einer
Stickstoffatmosphäre
gelöst.
Zu dieser Lösung
wird Natriummethoxid (88 μl,
25% (Gew./Gew) in Methanol, 0,384 mmol, 1 Äq.) gegeben, gefolgt von der
Zugabe von 6-Mercaptopurin (58,2 mg, 0,384 mmol, 1 Äq.). Das
Gemisch wird auf Rückfluss
erwärmt
und man lässt
für 3 h
rühren.
Das Reaktionsgemisch wird dann gekühlt, filtriert und durch Ansäuren mit
6N HCl gequencht. Das Reaktionsvolumen wird dann auf die Hälfte reduziert,
bei welchem Punkt das Produkt präzipitiert
und durch Filtration gesammelt wird. Der Rückstand wird in Methanol gelöst, filtriert
(falls notwendig) und unter verringertem Druck konzentriert, um
das gewünschte Sulfid
(II, 6B) in 50 Ausbeute
als einen gelben, pulverförmigen
Feststoff bereitzustellen.
-
C. Phosphatspaltbares
Taxolkonjugat
-
- C1. Zu einer Suspension von o-Hydroxyphenylessigsäure (15,0
g, 0,099 mol) in H2O (39 ml) wurde bei 0°C eine Lösung von
Salpetersäure
(12 ml 65%-ig in 8 ml H2O) langsam mit einer
Pipette zugegeben. Die Lösung
wurde für
zusätzliche
1,5 h bei 0°C
gerührt.
Das Gemisch wurde dann auf Umgebungstemperatur erwärmt und
man ließ es
für zusätzliche
0,5 h rühren.
Die heterogene Lösung
wurde über
Eis (10 g) gegossen und filtriert, um das unlösliche ortho-Nitro-Isomer zu
entfernen. Die rötliche
Lösung
wurde unter verringertem Druck konzentriert und der voluminöse Rückstand
wurde in 6N HCl gelöst
und durch Celit filtriert. Das Lösungsmittel
wurde wieder unter verringertem Druck entfernt, um die gewünschte 2-Hydroxy-4-nitro-phenylessigsäure als
einen hellen, braun-roten Feststoff (40% Ausbeute) bereitzustellen.
Das Produkt (IV-a) wurde in dem nächsten Schritt ohne weitere
Reinigung verwendet.
- C2. Produkt IV-a (765 mg, 3,88 mmol) wurde in frisch destilliertem
THF (5 ml) unter Argonatmosphäre
gelöst.
Die Lösung
wurde bei 0°C
gekühlt
und Boran-THF (1,0 M in THF, 9,7 ml, 9,7 mmol, 2,5 Äq.) wurde tropfenweise über eine
Spritze unter offensichtlicher Entwicklung von Wasserstoff zugegeben.
Man ließ die Reaktion
für zusätzliche
16 h rühren,
langsam auf Raumtemperatur erwärmen.
Die Reaktion wurde durch langsames Zugeben von 1 M HCl (unter heftiger
Blasenentwicklung) und 10 ml Ethylacetat gequencht. Die Schichten
wurden getrennt und die wässrige
Schicht fünfmal
mit Ethylacetat extrahiert. Die kombinierten organischen Schichten
wurden mit Salzlauge gewaschen und über Magnesiumsulfat getrocknet.
Das Lösungsmittel
wurde im Vakuum verdampft und der Rückstand durch schnelle Säulenchromatografie
(1 : 1 Hexan : Ethylacetat) gereinigt, um den gewünschten
Nitroalkohol (IV-b) als einen leicht gelben Feststoff (85% Ausbeute)
bereitzustellen.
- C3. Nitroalkohol (IV-b) (150 mg, 0,819 mmol) wurde in trockenen
DMF (5 ml), enthaltend Di-t-butyldicarbonat (190 mg, 1,05 Äq,) und
10% Pd-C (10 mg) gelöst.
Das Gemisch wurde in einem Parr-Gerät angeordnet und fünfmal unter
Druck gesetzt/gespült.
Die Lösung
wurde dann auf 47 psi unter Druck gesetzt und man ließ sie für 24 h schütteln. Die
Reaktion wurde durch Filtration durch Celit gequencht und das Lösungsmittel wurde
unter verringertem Druck entfernt. Der Rückstand wurde durch Säulenchromatografie
(1 : 1 Hexan : Ethylacetat) gereinigt, um das geschützte Anilinprodukt
(IV-c) als einen gelb-braunen kristallinen Feststoff in 70% Ausbeute
bereitzustellen.
- C4. TBDMS-CI (48 mg, 0,316 mmol) wurde in frisch destilliertem
Dichlormethan (4 ml) unter einer Argonatmosphäre gelöst. Zu dieser Lösung wurde
Imidazol (24 mg, 0,347 mmol, 1,1 Äq.) gegeben und es bildete sich
unmittelbar ein weißes
Präzipitat.
Die Lösung
wurde für
30 min bei Raumtemperatur gerührt,
zu welchem Zeitpunkt Produkt IV-c (80 mg, 0,316 mmol, 1,0 Äq.) rasch
als eine Lösung
in Dichlormethan/THF (1,0 ml) zugegeben wurde. Man ließ das resultierende
Gemisch für
zusätzliche
18 h bei Raumtemperatur rühren.
Die Reaktion wurde durch Zugabe von gesättigtem wässrigem Ammoniumchlorid gequencht.
Die Schichten wurden abgetrennt und die wässrige Phase dreimal mit Ethylacetat
extrahiert und die vereinigten organischen Schichten mit Salzlösung gewaschen
und über
Natriumsulfat getrocknet. Die organische Phase wurde konzentriert,
um Silyletherphenolprodukt (IV-d) als ein leicht gelbes Öl (90% Ausbeute)
bereitzustellen.
- C5. Silyletherphenol IV-d (150 mg, 0,408 mmol) wurde in frisch
destilliertem THF (7 ml) unter Argon gelöst und die Lösung auf
0°C gekühlt. n-BuLi (2,3 M in Hexan,
214 μl)
wurde dann tropfenweise über
eine Spritze zugegeben. Es wurde eine Farbänderung von leicht gelb nach
tief rot unmittelbar festgestellt. Nach 5 min wurde Tetrabenzylpyrophosphat
(242 mg, 0,45 mmol, 1,1 Äq.)
schnell zu der gerührten
Lösung
unter Argon gegeben. Die Lösung
wurde für
zusätzliche
18 h unter Inertatmosphäre
gerührt,
langsam auf Raumtemperatur erwärmt,
während
welcher Zeit sich ein weißes
Präzipitat
bildete. Die Reaktion wurde durch Zugabe von gesättigtem wässrigem Ammoniumchlorid und
10 ml Ethylacetat gequencht. Die Schichten wurden getrennt und die
wässrige
Schicht wurde fünfmal
mit Ethylacetat extrahiert. Die vereinigten organischen Phasen wurden
mit Salzlösung
gewaschen und über
Magnesiumsulfat getrocknet. Das Lösungsmittel wurde durch Verdampfen
entfernt und der Rückstand
durch schnelle Säulenchromatographie
(1 : 1 Hexan : Ethylacetat) gereinigt, um den gewünschten
Phosphatsilylether (IV-e) als ein leicht oranges Öl (90% Ausbeute) zu
erhalten.
- C6. Phosphatsilylether (IV-e) (10 mg, 0,0159 mmol) wurde in
2 ml trockenem Ethanol bei Raumtemperatur gelöst. Zu der gerührten Lösung wurden
20 μl konz.
HCl (1% V : V Lösung)
gegeben und man ließ das
Gemisch rühren
bis die TLC-Analyse anzeigte, dass die Reaktion vollständig war.
Festes Natriumcarbonat wurde zugegeben, um die Reaktion zu quenchen
und das Gemisch wurde rasch durch Silikagel filtriert und konzentriert,
um rohes Alkoholdibenzylphosphatprodukt (IV-f) als ein leicht gelbes Öl (100%
Ausbeute) zu ergeben.
- C7. Alkohol IV-f (78 mg, 0,152 mmol) wurde in frisch destilliertem
Dichlormethan (10 ml) unter einer Argonatmosphäre gelöst. Zu der Lösung wurde Dess-Martin
Periodinan (90 mg, 0,213 mmol, 1,4 Äq.) gegeben. Man ließ die Lösung rühren und
das Fortschreiten der Reaktion wurde durch TLC-Analyse beobachtet. Wenn
TLC Vollständigkeit
anzeigte, wurde die Reaktion durch Zugabe von 1 : 1 gesättigtes
wässriges
Natriumbicarbonat: gesättigtes
wässriges
Natriumthiosulfit gequencht. Man ließ das Zweiphasengemisch für 1 h bei
Umgebungstemperatur rühren.
Die Schichten wurden getrennt und die wässrige Phase wurde dreimal
mit Ethylactat extrahiert. Die vereinigten organischen Schichten
wurden mit Salzlösung
gewaschen und über
Natriumsulfat getrocknet. Lösungsmittel
wurde unter verringertem Druck entfernt, um Aldehydprodukt (IV-g)
als ein leicht braun-gelbes Öl
(100% Ausbeute) bereitzustellen.
- C8. Aldehyd IV-g (78 mg, 0,152 mmol) wurde in t-Butanol/Wasser
(3,5 ml) unter Inertatmosphäre
gelöst.
Zu der schnell gerührten
Lösung
wurden 2-Methyl-2-buten
(1,0 M in THF, 1,5 ml), Natriumphosphatmonobase (105 mg, 0,76 mmol,
5 Äq.)
und Natriumchlorit (69 mg, 0,76 mmol, 5 Äq.) gegeben. Man ließ die Lösung für zusätzliche
8 Stunden bei Raumtemperatur rühren.
Die Lösung
wurde dann konzentriert und der Rückstand wurde angesäuert und
mit Ethylacetat dreimal extrahiert. Die vereinigten organischen
Phasen wurden über
Magnesiumsulfat getrocknet. Die Lösung wurde wieder unter verringertem
Druck konzentriert und der Rückstand
wurde über
Säulenchromatografie
(2 : 1 Ethylacetat : Hexan) gereinigt, um das gewünschte Carbonsäurediphenylphosphat
(IV-h) als ein leicht gelbes Öl
(65% Ausbeute) zu ergeben.
- C9. Säure
IV-h (8,0 mg, 0,0152 mmol, 1,1 Äq.)
wurde in frisch destilliertem Dichlormethan (2 ml) unter Argon bei
Umgebungstemperatur gelöst.
Zu diesem Gemisch wurde Paclitaxel (12 mg, 0,0138 mmol, 1 Äq.) gegeben,
gefolgt von DMAP (2 mg, 0,0138 mmol, 1 Äq.) und DCC (3,2 mg, 0,0152,
1,1 Äq).
Man ließ das Gemisch
bei Raumtemperatur für
zusätzliche
4 h rühren,
während
welcher Zeit sich ein leichtes Präzipitat bildete. Wenn TLC-Analyse
zeigte, dass die Reaktion abgeschlossen war, wurde Lösungsmittel
unter verringertem Druck entfernt und der Rückstand wurde durch schnelle
Säulenchromatografie
(1 : 1 Hexan : Ethylacetat) gereinigt, um Paclitaxel-C2'-Carboxylatester
(IV-i) als einen weißen,
kristallinen Feststoff (65% Ausbeute) zu ergeben.
- C10. Ester IV-i (5,0 mg) wurde in reiner Ameisensäure (1,0
ml) unter einer Argonatmosphäre
bei Raumtemperatur gelöst
und man ließ für 30 min
rühren.
Wenn TLC anzeigte, dass die Reaktion abgeschlossen war, wurde die
Lösung
unter verringertem Druck konzentriert und der Rückstand wurde durch schnelle
Filtration durch Silikagel gereinigt, um die gewünschte Anilin-Taxol-Verbindung (IV-j)
in 50% Ausbeute als ein weißes Pulver
zu ergeben.
- C11. Zu einer Lösung
von (Poly-di-CBZ)-geschütztem
AcHN-RRRRRRR-CO2H (1,2 Äq.
0,1 bis 1,0 M) in trockenem DMF wurde O-Benzotriazolyloxytetramethylurnoiumhexafluorphosphat
(HATU, 1,0 Äq.)
und eine katalytische Menge DMAP (0,2 Äq.) gegeben. Die Lösung wurde
unter Inertatmosphäre
für 5 min
bei Umgebungstemperatur gerührt.
Zu diesem Gemisch wurde dann Taxol-Anilin-Derivat (IV-j) als eine
Lösung in
trockenem DMF (minimales Volumen zum Lösen) gegeben. Die resultierende
Lösung
wurde für
zusätzliche
5 h bei Raumtemperatur gerührt.
Die Reaktion wurde abgeschlossen durch Konzentrieren des Reaktionsgemischs
unter verringertem Druck. Das rohe Reaktionsgemisch wurde dann durch
HLPC gereinigt, um das gewünschte
Material bereitzustellen (IV, 6D).
-
Beispiel 10
-
Transport von Metallionen
-
3,93 g DTPA werden in 100 ml HEPES-Puffer
gelöst
und 1,52 ml Europiumchloridatom-Standardlösung (Aldrich) gelöst in 8
ml HEPES-Puffer, werden zugegeben und für 30 Minuten bei Raumtemperatur
gerührt.
Chromatische Trennung und Lyophilisierung ergibt einen Eu-DTPA-Chelatkomplex. Dieser
Komplex wird dann an den Aminoterminus eines Polypeptids durch Festphasenpeptidchemie
konjugiert. Die zelluläre
Europiumionenaufnahme kann durch zeitaufgelöste Fluoreszenz gezeigt werden.
-
Beispiel 11
-
Aufnahme von PNA-Peptidkonjugaten
-
PNA-Peptidkonjugate wurden synthetisiert
unter Verwendung von Festphasenchemie mit kommerziell erhältlichen
Fmoc-Reagenzien (PerSeptive Biosystems, Cambridge, MA), entweder
auf einem Applied Biosystems 433A Peptidsynthesizer oder einem Millipore
Expedite Nukleinsäuresynthesesystem.
Polymere von D- oder L-Arginin wurden an den Amino- oder Carboxyltermini
von PNAs gebunden, welche analog den 5'- bzw. 3'-Enden der Nukleinsäuren sind. Die Konjugate wurden
auch modifiziert, um Fluorescein oder Biotin zu enthalten, durch
Zugeben eines Aminocapronsäurespacers
zu dem Aminoterminus des Konjugats und dann Binden von Biotin oder
Fluorescein. Die PNA-Peptidkonjugate
wurden von dem Festphaseharz gespalten, unter Verwendung von 95%
TFA, 2,5% Triisopropylsilan und 2,5% wässrigem Phenol. Das Harz wurde
durch Filtration entfernt und restliche Säure wurde durch Verdampfen
entfernt. Das Produkt wurde durch HPLC unter Verwendung einer C18-Reversephasesäule gereinigt
und das Produkt wurde lyophilisiert. Die gewünschten PNA-Polymerkonjugate
wurden unter Verwendung von Laserdesorptionsmassenspektrometrie
identifiziert.
-
A. Inhibierung zellulärer Sezernierung
von Gamma-IFN
-
- 1. PNA-Peptidkonjugate. Die folgenden Sense-
und Antisense-PNA-Peptidkonjugate
wurden hergestellt zum Inhibieren der gamma-IFN-Produktion, worin
r = D-Arginin und R = L-Arginin: Sense:
Antisense:
fluoreszentes
Antisense: worin X = Fluorescein-Aminocaproat
biotinyliertes
Antisense: worin Z = Biotin-Aminocaproat
- 2. Aufnahme durch T-Zellen. Um zu zeigen, dass PNA-Polyargininkonjugate
wirkungsvoll in Zellen eintreten, wurde das obige fluorezente Antisense-Konjugat
(X-SEQ ID N: 19) synthetisiert durch Konjugieren von Fluoresceinisothiocyanat
an den Aminoterminus von SEQ ID Nr: 18, unter Verwendung eines Aminocapronsäurespacers.
Zelluläre Aufnahme
wurde untersucht durch Inkubieren der Jurkat-Human-T-Zelllinie (5 × 105 Zellen/Vertiefung), entweder vorbehandelt
für 30
Minuten mit 0,5 Natriumazid oder Phosphat-gepufferter Salzlösung, mit variierenden
Mengen (100 nM bis 50 μm)
des Fluorescein-markierten Sense- und Antisens-PNA-r7-Konjugats, als auch
dem Antisense-PNA alleine (ohne r7-Segment). Die Menge Antisense-PNA,
die in die Zellen eintritt, wurde analysiert durch konfokale Mikroskopie
und FACS. In beiden Fällen
lagen nur in Zellen Fluoreszenzsignale vor, die nicht Azid ausgesetzt
waren und das Fluoreszenzsignal war abhängig von der Dosis des fluoreszierenden
Konjugats und von der Temperatur und Dauer der Inkubation.
- 3. Gamma-IFN-Assay. Die Menge gamma-Interferon, die durch eine
Maus-T-Zelllinie
(Klon 11.3) sezeneriert wird, wurde durch Inkubieren von 105 T-Zellen mit variierenden Mengen Antigen
(Peptid, bestehend aus den Gruppen 110–121 von Walsperma-Myoglobin)
und histokompatiblen Milzzellen von DBA/2-Mäusen (H-2d, 5 × 105),
welche als Antigen-präsentierende
Zellen (APCs) wirken, in Platten mit 96 Vertiefungen. Nach Inkubation
für 24
Stunden bei 37°C
wurden 100 μl
der Überstände in Mikrotiterplatten übergeführt, die
mit kommerziell erhältlichen
Anti-Gamma-IFN monoklonalen
Antikörpern
(Mab) (Pharmingen, San Diego, CA) beschichtet waren. Nach Inkubation
für eine
Stunde bei Raumtemperatur wurden die Platten mit PBS, enthaltend
1% fötales
Kalbsserum und 0,1% Tween 20, gewaschen, wonach ein zweiter, biotinylierter
gamma-IFN-Mab zugegeben wurde. Nach einer zweiten Stunde Inkubation
wurden die Platten wie zuvor gewaschen und Europium (Eu)-Streptavidin
(Delphia-Pharmacia) wurde zugegeben. Wieder nach einer Stunde Inkubation
wurde ein saurer Puffer zugegeben, um Eu freizusetzen, das durch
zeitaufgelöste Fluorometrie
auf einem Delphia-Plattenlesegerät
gemessen wurde. Die Fluoreszenzmenge war proportional der Menge
von Gamma-IFN, die erzeugt worden ist und konnte genau quantifiziert
werden durch Verwendung bekannter Mengen Gamma-IFN, zum Entwickeln
einer Standardkurve.
- 4. Inhibierung der gamma-IFN-Produktion durch Konjugate. Die
Fähigkeit
von PNA-Polyargininkonjugaten zum Inhibieren der Sezernierung von
gamma-IFN wurde untersucht durch Zugeben verschiedener Konzentrationen
der obigen gamma-IFN-Konjugate mit suboptimalen Dosen von Peptidantigen
(0,5 μm)
zu einem Gemisch von Klon 11.3 T-Zellen und histokompatiblen Milzzellen.
PNA-Sequenzen, denen Polyarginingruppen fehlen und nicht konjugiertes
D-Argininheptamer
wurden ebenfalls getestet.
-
Nach 24 Stunden wurden Aliquote der
gezüchteten Überstände entnommen
und die Menge Gamma-IFN wurde gemessen unter Verwendung des in Abschnitt
3 oben beschriebenen Fluoreszenzbindungsassays. Behandlung der Zellen
mit dem Antisense-PNA-r7-Konjugat führte zu einer über 70%-igen
Verringerung der IFN-Sezernierung, während äquivalente molare Mengen des
Sense PNA-r7-Antisense-PNA,
dem r7 fehlt, oder r7 alleine keine Inhibierung zeigten (7).
-
Beispiel 12
-
Transport von Großem Proteinantigen
in APCs
-
Ein Konjugat von Ovalbumin, gekoppelt
an ein Poly-L-Argininheptamer, wurde gebildet durch Umsetzen eines
Cystein-enthaltenden Polypeptidpolymers (Cys-Ala-Ala-Ala-Arg7,
SEQ ID Nr: 21) mit Ovalbumin (45 kDa) in der Gegenwart von Sulfo-MBS,
einem heterobifunktionellen Quervernetzer (Pierce Chemical Co., Rockford,
IL). Das molare Verhältnis
von Peptid, das an Ovalbumin konjugiert ist, wurde durch Aminosäureanalyse
quantifiziert. Das Konjugatprodukt wurde als OV-R7 bezeichnet. Das
Konjugat wurde zu B-Zellen gegeben (Endkonzentration 10 μM), welche
ebenfalls als Antigen-präsentierende
Zellen (APCs) bezeichnet werden, welche gemäß Standardverfahren isoliert
wurden. Die APCs wurden mit OV-R7 inkubiert und dann wurden sie
zu einer Präparation
von cytotoxischen T-Lymphozyten,
isoliert durch Standardverfahren, gegeben. Behandeln von CTLs mit
APCs, die inkubiert worden sind mit OV-R7, erzeugte CD8+-Albuminspezifische CTLs.
Im Gegensatz hierzu konnten APCs, die mit unmodifiziertem Ovalbumin
behandelt worden sind, die CTLs nicht stimulieren.
-
In einem anderen Versuch wurden histokompatible
dendritische Zellen (ein spezifischer Typ von APC) Albumin-R7-Konjugaten
ausgesetzt und wurden dann in Mäuse
injiziert. Nachfolgende Analyse von Blut dieser Mäuse zeigte
das Vorliegen Albumin-spezifischer CTLs. Kontrollmäuse erhielten
dendritische Zellen, die unmodifiziertem Albumin ausgesetzt waren.
Die Kontrollmäuse
zeigten nicht die Albumin-spezifische CTL-Antwort.
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Beispiel 13
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Verstärkte Aufnahme von Peptid, das
von V7 stammt
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Ein Konjugat, bestehend aus einem
Teil der C-terminalen cytoplasmatischen Schwanzregion von V7 (ein
Leukozytenoberflächenprotein)
mit der Sequenz KLSTLRSNT (SEQ ID Nr: 22; Ruegg et al., 1995) wurde synthetisiert,
wobei 7 Argininreste an seinen C-Terminus gemäß Standardverfahren gebunden
wurden, unter Verwendung eines Peptidsynthesizers (Applied Biosystems
Modell 433). Das Konjugat wurde zu (Endkonzentration ≈ 10 μM) zu T-Zellen
gegeben, welche durch Standardverfahren isoliert worden waren und
es wurde bei 37°C
für mehrere
Stunden über
Nacht inkubiert. Zellen wurden unter Verwendung von Detergens (1%
Triton X-100) lysiert. DNA wurde entfernt und die lösliche (Protein-enthaltende)
Fraktion wurde einer Immunpräzipitation
mit Anti-V7-Mausmonoklonalem Antikörper in Kombination mit Ziegen-Anti-Maus-IgG
unterzogen. RAF-1 ist eine Kinase, die assoziiert mit und inaktiviert
ist durch Assoziation mit V7.
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Bei Fehlen einer Peptidbehandlung
copräzipitierte
RAF-1-Protein mit V7. In Peptid-behandelten Zellen wurde RAF-1-Protein
von dem V7-Immunokomplex eliminiert. Die gleichen Peptide waren
nicht in der Lage, einen Komplex, der aus RAF-1 und p21 Ras bestand,
zu zerstören,
wodurch nichtspezifische Modifikation von RAF-1 durch das V7-Peptid
ausgeschlossen wird.
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In einer zweiten Studie wurde der
V7-Peptidteil des V7-Poly-Arginin-Konjugats in vitro phosphoryliert unter
Verwendung von Protein-Kinase-C. Anti-RAF-1-Präzipitate
von T-Zellen, die den phosphorylierten V7-Schwanzpeptiden ausgesetzt
waren, jedoch nicht dem unphosphorylierten V7-Schwanzpeptid, zeigten
potente Inhibierung der RAF-Kinaseaktivität.
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Wenngleich die Erfindung unter Bezugnahme
auf spezifische Verfahren und Ausführungsformen beschrieben worden
ist, wird ersichtlich sein, dass verschiedene Modifikationen und
Veränderungen
gemacht werden können.