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GEBIET DER
ERFINDUNG
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Die vorliegende Erfindung richtet
sich auf vernetzte Kollagen-Polysaccharid-Matrizes für die therapeutische
Reparatur von Gewebe wie z. B. Knochen-, Knorpel- und Weichgewebe;
Verfahren zur Herstellung solcher Matrizes; und beschreibt, wie
sie bei Verfahren zum Reparieren von Gewebe verwendet werden. Die
vorliegende Erfindung stellt eine vernetzte Kollagen-Polysaccharid-Matrix
bereit, die allein oder in Kombination mit anderen Therapeutika
wie z. B. Wachstumsfaktoren für
die Gewebereparatur verabreicht wird. Die vorliegende Erfindung
stellt auch eine vernetzte Kollagen-Polysaccharid-Matrix bereit,
die ferner Fibrin umfasst .
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HINTERGRUND
DER ERFINDUNG
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Es besteht ein klinischer Bedarf
für eine
Knochentransplantationsmatrix, die knochenleitende Eigenschaften
gleich einem autogenen Knochen bietet und die auf unbegrenzten Vorrat
hergestellt werden kann. Obwohl einige Knochenersatzmittel zur Verfügung stehen,
bestehen viele aus Materialien, die schlechte physikalische Handhabungs-
und Resorptionseigenschaften aufweisen, die ihre Verwendung und
die radiographische Auswertung kompliziert machen.
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Ebenso gibt es trotz jahrelanger
intensiver Forschung kein konsistent wirksames kommerzielles Produkt,
das die Aufrechterhaltung des Chondrozytenphänotyps von Knorpelgewebe unterstützt. Frühere Strategien
zum Erleichtern der Reparatur von beschädigtem Knorpel haben die Transplantation
von existierendem Wirtsknorpel und/oder die Implantation von Prothesevorrichtungen
eingeschlossen. Begrenzungen dieser Verfahren sind die Verfügbarkeit
von Spendergewebe und die begrenzte Lebensdauer von Protheseimplantaten. In
jüngerer
Zeit wurde die Kultivierung von reifen Chondrozyten ex vivo auf
polymeren Gerüsten
bei einem Versuch verwendet, Knorpeltransplantationsmaterial zu
erzeugen, aber dies wurde noch nicht umfangreich anerkannt, teilweise
da es zwei Operationsvorgänge
beinhaltet: einen, um Chondrozyten zu ernten, und den zweiten, um
sie nach der Ausbreitung in vitro zu implantieren.
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Kollagene und Glycosaminoglykane
sind zwei Klassen von Biomaterialien, die sich für die Verwendung bei der Knochenregeneration
eignen. Matrizes auf Kollagenbasis wurden bei der Knochentransplantation verwendet.
Kollagen vom Typ I weist gute Zelladhäsionseigenschaften, insbesondere
für den
Knochen bildende Osteoblastenzellen, auf. Kollagen weist die Fähigkeit
auf, sowohl als aktives als auch inertes Gerüstmaterial für das Wachstum
zu dienen.
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Hyaluronsäure ist ein natürlicher
Bestandteil der extrazellulären
Knorpelmatrix und sie wird leicht sterilisiert, ist bioabbaubar
und kann in einem breiten Bereich von Konsistenzen und Formaten
hergestellt werden. Sie ist im Allgemeinen bioverträglich und
ihre Resorptionseigenschaften können
durch die Manipulation von Monomeren zu Polymerformen, am üblichsten
durch die Veresterung der Carbonsäuregruppen der Glucuronsäurereste,
gesteuert werden.
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Dextransulfat ist ein glycosaminoglykanartiges
polyionisches Derivat von Dextran und es wurde gezeigt, dass es
als Biomaterial und Arzneimittel für die Behandlung von Hyperlipämie nützlich ist.
Es wird durch Veresterung von Dextran, einem hydrophilen Polymer
von Glucose, das durch bestimmte Bakterienstämme synthetisiert wird, hergestellt.
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Die Internationale Patentanmeldung
Nr. WO 96/25961 offenbart eine resorbierbare Matrix zur Rekonstruktion
von Knorpelgewebe mit Kollagenfasern und einem Glycosaminoglykan.
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Biologischer Klebstoff mit Fibrin
hat eine lange Geschichte als medizinische Gewebeadhäsionsvorrichtung
und es wird angenommen, dass er in Europa kommerziell verfügbar ist
(Patent der Vereinigten Staaten Nr. 5 260 420, herausgegeben am
9. November 1993). Ein Hindernis, das seine Anwendung begrenzt,
ist die kurze Umsatz- und Verweilzeit, die im Bereich von einigen
Tagen bis zu einigen Wochen in Abhängigkeit von der Implantationsstelle
liegt. Die Integration von Kollagenfasern in Fibrinklebstoff wurde
berichtet (Sierra et al., 1993, Trans. Soc. Biomater., Band 16:
257, und Patent der Vereinigten Staaten Nr. 5 290 552). Längere Koagulationszeiten
sind jedoch für
die Kollagen/Fibrin-Zusammensetzungen
im Vergleich zu Fibrin allein erforderlich.
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Obwohl diese Materialien separat
oder in Kombination mit anderen Materialien verwendet wurden, bestand
bis jetzt keine Erkennung von Kombinationen und Verfahren zur Herstellung
von Kombinationen solcher Materialien, um eine vorteilhafte Matrix
für die
Reparatur von Knochen-, Knorpel- und/oder Weichgewebe zu bilden,
die keine externen Vernetzungs- oder Ionenbindemittel verwenden.
Es bleibt ein Bedarf für
bioabbaubare, bioverträgliche
Matrizes, die die strukturelle Integrität aufrechterhalten und die
verwendet werden können,
um Gewebe zu reparieren, ohne auf unerwünschte Kultivierungsverfahren
ex vivo zurückzugreifen.
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ZUSAMMENFASSUNG
DER ERFINDUNG
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Die vorliegende Erfindung stellt
vernetzte Kollagen-Polysaccharid-Matrizes,
Verfahren zur Herstellung solcher Matrizes bereit. Verfahren zur
Verwendung der Matrizes bei der Reparatur von Gewebe wie z. B. Knochen-,
Knorpel- und Weichgewebe werden auch beschrieben. Das Kollagen kann
gereinigtes, natürliches
oder modifiziertes Kollagen beliebigen Typs sein. In einem Ausführungsbeispiel
ist das Kollagen Kollagen vom Typ I und in einem anderen Ausführungsbeispiel
ist das Kollagen Kollagen vom Typ II.
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Die Art von Polysacchariden, die
verwendet werden können,
umfassen Hyaluronsäure,
Chondroitinsulfat, Dermatansulfat, Keratansulfat, Heparan, Heparansulfat,
Dextran, Dextransulfat, Alginat und andere langkettige Polysaccharide.
In einem bevorzugten Ausführungsbeispiel
ist das Polysaccharid Hyaluronsäure.
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Eine vernetzte Kollagen-Polysaccharid-Matrix
der vorliegenden Erfindung kann allein zum Leiten des Wachstums
von Gewebe; in Kombination mit einem Wachstumsfaktor zum Induzieren
des Wachstums von Gewebe; in Kombination mit Fibrin zum Verankern
der Matrix an Stellen eines Gewebedefekts, oder in Kombination mit
sowohl einem Wachstumsfaktor als auch Fibrin verwendet werden.
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Wachstumsfaktoren, die bei einer
Matrix der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, umfassen,
sind jedoch nicht begrenzt auf Mitglieder der TGF-β-Superfamilie,
einschließlich
TGF-β1,2
und 3, die knochenmorphogenen Proteine (BMP's), die Wachstumsdifferenzierungsfaktoren
(GDF's), und ADMP-1;
Mitglieder der Fibroblasten-Wachstumsfaktorfamilie,
einschließlich
saurem und basischem Fibroblasten-Wachstumsfaktor (FGF-1 und -2);
Mitglieder der Hedgehog-Proteinfamilie, einschließlich Indian-,
Sonic- und Desert-Hedgehog; Mitglieder der Familie von insulinartigen
Wachstumsfaktoren (IGF), einschließlich IGF-I und -II; Mitglieder
der Familie der von Blutplättchen
abgeleiteten Wachstumsfaktoren (PDGF), einschließlich PDGF-AB, PDGF-BB und
PDGF-AA; Mitglieder der Interleukin- (IL) Familie, einschließlich IL-1
bis -6; und Mitglieder der Familie von koloniestimulierenden Faktoren
(CSF), einschließlich
CSF-1, G-CSF und GM-CSF.
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Das Verfahren zur Herstellung einer
Kollagen-Polysaccharid-Matrix
der vorliegenden Erfindung umfasst die Schritte des Oxidierens eines
exogenen Polysaccharids, um ein modifiziertes exogenes Polysaccharid
mit Aldehydgruppen zu bilden, und des Reagierens des modifizierten
exogenen Polysaccharids mit Kollagen unter Bedingungen, so dass
die Aldehydgruppen kovalent mit Kollagen reagieren, um eine vernetzte
Matrix zu bilden. Das Verfahren kann ferner den Schritt des Zugebens
eines Wachstumsfaktors zur Matrix umfassen. Ein Wachstumsfaktor
kann vor oder nach dem Schritt des Reagierens des modifizierten
Polysaccharids mit dem Kollagen zugegeben werden.
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Das in einer vernetzten Kollagen-Polysaccharid-Matrix
der vorliegenden Erfindung verwendete Fibrin wird hergestellt, indem
eine vorgeformte Matrix mit einer Quelle für Fibrinogen und Thrombin in
Kontakt gebracht wird oder indem das Fibrinogen und Thrombin mit
dem modifizierten exogenen Polysaccharid und Kollagen zum Zeitpunkt
der Reaktion kombiniert werden. Alternativ können Fibrinogen und Thrombin
in einer Kollagen-Polysaccharid-Matrix zu einer anderen vorgeformten
Kollagen-Polysaccharid-Matrix zugegeben werden. Daher umfasst die
vorliegende Erfindung auch ein Verfahren zur Herstellung einer vernetzten
Kollagen-Polysaccharid-Matrix mit Fibrin.
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Die vorliegende Erfindung ist bei
Verfahren nützlich,
die eine vernetzte Kollagen-Polysaccharid-Matrix verwenden, um das
Wachstum von Gewebe zu leiten, indem die Matrix an die Stellen der
gewünschten
Gewebereparatur verabreicht wird. Die Matrix in Kombination mit
einem Wachstumsfaktor kann verabreicht werden, um das Wachstum von
Gewebe an Stellen von gewünschter
Reparatur zu induzieren. Eine Matrix, die ferner Fibrin umfasst,
kann verabreicht werden, um die Matrix an den gewünschten
Stellen wie z. B. Gewebedefektstellen zu verankern.
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Wie in dieser Erörterung verwendet, ist "Reparatur" als Wachstum von
neuem Gewebe definiert. Das neue Gewebe kann phänotypisch oder genotypisch
zum ursprünglichen
verlorenen Gewebe identisch sein oder nicht. Wie hierin verwendet,
bedeutet "Regeneration
von Gewebe", dass
das neue gewachsene Gewebe zum verlorenen Gewebe identisch ist.
Die Gewebereparatur kann auch das Ergebnis des Ersetzens von verlorenem
Gewebe durch nicht-identische Gewebe sein, beispielsweise das Ersetzen
von hyalinem Gelenkknorpel durch Faserknorpel bei einem Gelenkdefekt.
Die grundlegenden Zelleneigenschaften, die an der Reparatur beteiligt
sind, umfassen Adhäsion,
Proliferation, Wanderung und Differenzierung.
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Mit "Leiten" ist gemeint, dass das Wirtsgewebe,
z. B. Knochen-, Knorpel- oder Weichgewebe, durch Ausbreitung von
existierendem Gewebe auf oder in die vernetzte Kollagen-Polysaccharid-Matrix
wächst.
Beim Leiten bewegen sich Reparaturzellen auf und in die Matrix,
um neues Gewebe, das zum umgebenden Wirtsgewebe identisch ist, zu
synthetisieren und neu zu modellieren. Mit Induktion ist gemeint,
dass das Wachstum und die Differenzierung von Stammreparaturzellen
stimuliert wird. Diese Stammzellen fahren fort, neues Gewebe so
zu synthetisieren und neu zu modellieren, dass es mit dem umgebenden
Wirtsgewebe durchgehend ist.
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Wie hierin verwendet, kann ein Gewebedefekt
das Ergebnis eines angeborenen Zustands, einer Verletzung, einer
Operation, von Krebs oder einer anderen Krankheit sein.
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Wie in dieser Erörterung verwendet, bezieht
sich ein exogenes Polysaccharid auf ein freies Polysaccharid.
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Die Verhältnisse des Kollagens zum Polysaccharid
können
verändert
werden, um sowohl die physikalischen als auch die biologischen Eigenschaften
der Matrix zu verändern.
Ein höherer
Anteil an Kollagen führt zu
einer poröseren,
schwammartigen Matrix. Ein höherer
Anteil an Polysaccharid führt
zu einer mehr gelartigen Matrix.
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Beschreibung
der bevorzugten Ausführungsbeispiele
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Das Verfahren zur Herstellung einer
Matrix der vorliegenden Erfindung umfasst die Schritte des Öffnens von
Zuckerringen an einem exogenen Polysaccharid und des Oxidierens
von endständigen
Hydroxygruppen zu Aldehyden unter Verwendung von beispielsweise
Natrium- oder Kaliumperjodat als selektives Oxidationsmittel. Die
Menge an Aldehydgruppen, die in dieser Weise erzeugt werden, kann
stöchiometrisch
gesteuert werden. Typischerweise können etwa 1% bis 50% der Ringe
in dieser weise geöffnet
werden. Bevorzugter werden etwa 1% bis 5% der Ringe geöffnet, um
die Aldehydgruppen zu bilden. Diese Aldehydgruppen können kovalente
Vernetzungsstellen mit dem Kollagen an Aminstellen an den Kollagenpeptidketten
bilden. Da die Aldehydgruppen in situ ohne die Zugabe einer separaten
Vernetzungsverbindung gebildet werden, wird angenommen, dass der
intermolekulare Abstand zwischen dem Grundgerüst der Polysaccharidkette und
der Kollagenkette, die mit dieser vernetzt wird, geringer ist als
der entsprechende Abstand unter Verwendung einer Vernetzungsverbindung.
Folglich werden die Polysaccharid- und Kollagengrundgerüste relativ
eng gebunden, was eine vorteilhafte Struktur für den Zweck der Bereitstellung
einer Matrix erzeugt, die das Wachstum von Knochen-, Knorpel- oder
Weichgewebe unterstützt,
leitet oder induziert.
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Das Ausgangsmaterial zur Herstellung
des Kollagens kann gereinigtes, natürliches Kollagen oder modifiziertes
Kollagen eines beliebigen Typs sein. Ein bevorzugtes Kollagen für das Knochenwachstum
ist Kollagen vom Typ I, wohingegen ein bevorzugtes Kollagen für das Knorpelwachstum
Kollagen vom Typ II ist. Das Kollagen kann vernetzt oder nicht-vernetzt
sein, aber es ist bevorzugt, dass das Kollagen nicht-vernetzt ist,
um mehr Zugänglichkeit
zu Seitengruppen für
die Vernetzung mit den Polysaccharidaldehydgruppen bereitzustellen.
Wenn Kollagen vom Typ I für
die Gewebereparatur verwendet wird, bei der es erwünscht ist,
die zugehörige
Zellenadhäsionsstelle
zu maskieren, wie z. B. Knorpelreparatur, können die Adhäsionsstellen
durch die Verwendung von nicht- zelladhäsiven Polysacchariden
maskiert werden, um die erhöhte
Zell-Zell-Wechselwirkung und -Adhäsion zu unterstützen.
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Die Art von Polysacchariden, die
verwendet werden können,
umfassen Hyaluronsäure,
Chondroitinsulfat, Dermatan, Dextransulfat, Alginat und andere langkettige
Polysaccharide. Typischerweise weist das Polysaccharid ein mittleres
Molekulargewicht von etwa 1000 bis 10000000 DA auf.
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Die Reagenzien zum Öffnen von
Zuckerringen an dem exogenen Polysaccharid können ein beliebiges selektives
Oxidationsmittel sein, das eine endständige Hydroxylgruppe zu einem
Aldehyd oxidiert, wie z. B. Kalium- oder Natriumperjodat. Andere
Reagenzien umfassen spezifische Zuckeroxidasen.
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Das bevorzugte Polysaccharid ist
Hyaluronsäure.
Der relative Anteil von Polysaccharid zu Kollagen verleiht der Matrix
verschiedene physikalische und biologische Eigenschaften. Der Anteil
von Polysaccharid zu Kollagen kann auf einer Molverhältnisbasis
oder auf einer Gewichtsverhältnisbasis
charakterisiert werden. Typischerweise ist das Gewichtsverhältnis von
Kollagen zu Polysaccharid 99 : 1 bis etwa 1 : 99. Dies stellt jeweils
ein ungefähres
Molverhältnis
von 99,9 : 0,1 bis 1 : 9 dar, wobei ein mittleres Molekulargewicht
von 1000000 Dalton für
Hyaluronsäure
und 100000 Dalton für
Kollagen angenommen wird. Das Molverhältnis kann in Abhängigkeit
von dem tatsächlichen
Molekulargewicht des verwendeten Polysaccharids und Kollagens variieren.
In einem hierin offenbarten bevorzugten Ausführungsbeispiel ist das Gewichtsverhältnis von
Kollagen zu Polysaccharid 9 : 1 bis etwa 1 : 9.
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Die Verhältnisse des Kollagens zum Polysaccharid
können
verändert
werden, um sowohl die physikalischen als auch die biologischen Eigenschaften
der Matrix zu verändern.
Biologisch ahmt ein höherer
Anteil an Kollagen vom Typ I die Zusammensetzung und den Aufbau
von Knochen genauer nach, wohingegen ein höherer Anteil an Kollagen vom
Typ II die Zusammensetzung von Knorpel genauer nachahmt. Den Knochen bildende
Zellen treten mit spezifischen Zelladhäsionsstellen an Kollagen in
Wechselwirkung und werden sich teilen, wandern und differenzieren,
um neuen Knochen zu bilden.
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Alternativ ahmt das Erhöhen des
Anteils an Polysaccharid, vorzugsweise Hyaluronsäure, eine natürliche Knorpelmatrix
genauer nach. Außerdem
maskiert ein höherer
Anteil an Polysaccharid einige spezifische Zelladhäsionsstellen
an Kollagen und begünstigt
andere Zell-Zell-Wechselwirkungen und eine Aggregation, die bei
der Entwicklung von Knorpelgewebe wichtig sind.
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Wachstumsfaktoren, die mit einer
Matrix der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, umfassen,
sind jedoch nicht begrenzt auf Mitglieder der TGF-β-Superfamilie,
einschließlich
TGF-β1,2
und 3, die knochenmorphogenen Proteine (BMP's), die Wachstumsdifferenzierungsfaktoren
(GDF's), und ADMP-1;
Mitglieder der Fibroblasten-Wachstumsfaktorfamilie,
einschließlich
saurem und basischem Fibroblasten-Wachstumsfaktor (FGF-1 und -2);
Mitglieder der Hedgehog-Proteinfamilie, einschließlich Indian-,
Sonic- und Desert-Hedgehog; Mitglieder der Familie von insulinartigen
Wachstumsfaktoren (IGF), einschließlich IGF-I und -II; Mitglieder
der Familie der von Blutplättchen
abgeleiteten Wachstumsfaktoren (PDGF), einschließlich PDGF-AB, PDGF-BB und
PDGF-AA; Mitglieder der Interleukin- (IL) Familie, einschließlich IL-1
bis -6; und Mitglieder der Familie von koloniestimulierenden Faktoren
(CSF), einschließlich
CSF-1, G-CSF und GM-CSF. Wachstumsfaktorzubereitungen werden entweder
kommerziell erhalten oder isoliert und gereinigt aus Gewebe oder
aus rekombinanten Quellen.
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Wachstumsfaktoren können in
die Kollagen/HA/Fibrin-Matrizes über
einen breiten Dosierungsbereich (Bereich von Fentogramm bis Milligramm)
gegeben werden. Faktoren wie z. B. Kosten, Sicherheit und das gewünschte Wachstumsfaktor- Freisetzungsprofil
geben die Menge an Wachstumsfaktor vor, die auf die Matrix gegeben
wird.
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Thrombin wirkt als Katalysator für Fibrinogen,
um Fibrin bereitzustellen. In der vorliegenden Erfindung wird Thrombin
zu Fibrinogen in einer Menge zugegeben, die ausreicht, um die Polymerisation
des verwendeten Fibrinogens zu katalysieren. In einem Ausführungsbeispiel
werden das Fibrinogen und Thrombin zuerst vereinigt und dann schnell
zu einer vorgeformten vernetzten Kollagen-Polysaccharid-Matrix zugegeben, die dann
auch zu einer weiteren vorgeformten Kollagen-Polysaccharid-Matrix
zugegeben werden kann. In einem weiteren Ausführungsbeispiel der vorliegenden
Erfindung werden das Fibrinogen und Thrombin einzeln zu einer Reaktion
zugegeben, die oxidiertes exogenes Polysaccharid und Kollagen enthält. In diesem
Ausführungsbeispiel
ist es erwünscht,
das Fibrinogen und Thrombin getrennt zu halten und das oxidierte
exogene Polysaccharid und Kollagen getrennt zu halten, bis die Endreaktion
erwünscht
ist.
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Die Konzentration an Fibrinogen,
die beim Bilden der Matrix verwendet wird, ist vorzugsweise 10 mg/ml
oder mehr. Das Thrombin wird zum Fibrinogen in einer Konzentration
von etwa 0,01 NIH-Einheiten bis etwa 100 NIH-Einheiten/ml und vorzugsweise
etwa 0,1–2,0
NIH-Einheiten/ml zugegeben. Das Thrombin ist von einer Vielfalt
von Quellen kommerziell erhältlich,
einschließlich
von Calbiochem-Novabiochem, San Diego, CA. Fibrinogen kann von autologem
Patientenplasma oder von kommerziellen Quellen, wie z. B. Calbiochem-Novabiochem, San
Diego, CA, gewonnen werden.
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Die erfindungsgemäßen Matrizes können durch
Lyophilisierung oder Nassabscheidung und Lufttrocknen in Formen
mit gewünschter
Form zu einer beliebigen Form geformt werden. Das lyophilisierte
oder nassabgeschiedene Material mit einem hohen Anteil an Polysacchariden
kann zur Injektion oder direkten Einbringung in eine Fraktur auch
zu viskosen Gelen geformt werden.
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Die Nützlichkeit der erfindungsgemäßen Matrizes
kann durch Tests sowohl in vitro als auch in vivo gezeigt werden.
Für die
Tests in vitro werden fötale
Ratten-Schädeldecken-Primärzellen,
die durch eine Reihe von Kollagenaseverdauungen gemäß dem Verfahren
von Wong und Cohn (PNAS USA 72: 3167–3171, 1975) geerntet werden,
oder Ratten-Epiphysen-Primärknorpel,
Thyberg und Moskalewski, (Cell Tissue Res. 204: 77–94, 1979)
oder Kaninchen-Gelenkchondrozyten,
die durch das Verfahren von Blein-Sella O. et al., (Methods Mol.
Biol, 43: 169–175,
1995) geerntet werden, in die Matrizes geimpft und unter herkömmlichen
Bedingungen für
1–4 Wochen
kultiviert. Die Kulturen werden dann histologisch verarbeitet und
bewertet.
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Die knorpelleitende Fähigkeit
der Matrizes der vorliegenden Erfindung kann durch die erfolgreiche
Unterstützung
der Adhäsion,
Wanderung, Proliferation und Differenzierung von primären Rattenknochenmark- und
Stromazellen sowie mit Retinoinsäure
behandelten primären
Ratten- oder Kaninchenchondrozyten festgestellt werden. Knochenmark-
und Knochenmarkstromazellen nähern
sich eng den frühen
Knorpelvorläuferzellen
an, die im subchondralen Knochenmark von Volldefekten zu finden
sind. Knochenmark wird von den langen Knochen von 2–3 Wochen
alten Inzest-Lewis-Ratten geerntet und direkt zu einer Matrix zugegeben
und für
2 Wochen unter Standardbedingungen kultiviert. Die anhaftende Stromazellpopulation,
die aus diesen Kulturen wächst,
wird überführt und
zur Verwendung gefroren. Zellen von bis zu sechs Durchgängen werden
zum Kultivieren und Beimpfen an der Matrix verwendet.
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Mit Retinoinsäure behandelte Chondrozyten
stellen die letzteren Stufen der Chondrogenese dar. Die Retinoinsäurebehandlung
von Primärzellen
wird vor der Kultivierung an einer oder dem Impfen der Zellen in eine
Kandidatenmatrix durchgeführt
(Dietz, U. et al., 1993, J. Cell Biol. 52(1): 57–68).
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In einem alternativen Verfahren werden
in vitro-Untersuchungen
der Chondrozyten einer frühen
und späten
Stufe kombiniert, um zu ermöglichen,
dass Stromazellen die Matrizes konditionieren, und um sie dann gegen
reifere Chondrozyten austauschen. In dieser Weise kann die Entwicklung
der Matrizes während
der frühen
Phasen der Chondrogenese auf Auswirkungen auf die späteren Stufen
des Prozesses getestet werden.
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Die Zelladhäsion und -proliferation an
der Matrix werden unter Verwendung eines MTS-Assays überwacht,
der die Zellzahl und -lebensfähigkeit
auf der Basis von Mitochondrienaktivität messen kann. Stromazellen
oder Chondrozyten werden an Matrizes für 6–18 h in Gegenwart oder Abwesenheit
von Serum für
die Adhäsionsanalyse
und für
1–2 Wochen
für die
Proliferationsbeurteilung kultiviert.
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Für
das Testen der Zellwanderung werden die Matrizes auf poröse Trans-Well-Membrankultureinsätze (Corning)
aufgetragen oder gesetzt. Stromazellen werden auf die Matrizes in
der oberen Kammer des Trans-Well geimpft und ein chemisches Attraktans
(Wachstumsfaktor, PDGF) in der unteren Kammer angeordnet. Nach 12–18 h Kultivierung
werden die Zellen, die durch die Matrix zur unteren Seite der Trans-Well-Membran
gewandert sind, durch den MTS-Assay quantitativ bestimmt. Die Matrizes
werden aus der oberen Kammer entfernt und histologisch verarbeitet,
um den Grad der Infiltration zu bewerten.
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Die Analyse von Differenzierungsmarkern,
die für
die Chondrogenese und Osteogenese relevant sind, werden sowohl auf
dem Protein- als auch dem Transkriptionsniveau ausgewertet. Die
spezifischen Marker, die analysiert werden können, umfassen: 1) Kollagen
vom Typ II und Isoformen von IIA, IIB; 2) Aggrecanproteoglykan;
3) Kollagen vom Typ IX, X und XI; 4) Kollagen vom Typ I; 5) Knorpelmatrixprotein
(CMP); 6) Cart-1-Transkriptionsfaktor; 7) Fibronectin (EDA-, EDB-Isoformen);
8) Decorinproteoglykan; 9) Verbindungsprotein; 10) NG-2-Proteoglykan;
11) Biglycanproteoglykan; 12) alkalische Phosphatase. Die Differenzierung kann
durch Northern/PCR-Analyse, Western-Blotting oder durch metabolische Zellmarkierung
gemessen werden.
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Für
die Northern/PCR-Analyse wird RNA durch Standardprozeduren aus Stromazellen
oder Chondrozyten isoliert, die auf Kompositmatrizes kultiviert
wurden. Zeitverlauftests können
verwendet werden, um die optimalen Kultivierungszeiträume festzulegen,
die im Bereich von 1 bis 6 Wochen in Abhängigkeit von der Zellart liegen.
Die isolierte RNA wird durch Northern-Gel- und Hybridisierungsverfahren
mit spezifischer cDNA oder PCR-amplifizierten
Sonden analysiert. Die Northern-Analyse wird durch Densitometerabtastung
von Autoradiographen und Normierung auf Signale von konstitutiven
Genen (G3PDH) quantitativ bestimmt. Die Northern-Analyse kann mit
quantitativer PCR-Analyse unter Verwendung von Primern, die aus
den veröffentlichten cDNA-Sequenzen
der zu analysierenden Gene erzeugt werden, ergänzt werden.
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Für
Western-Blotting werden solubilisierte Proteinlysate aus Zellen
isoliert, die auf Kompositmatrizes durch Standardverfahren (Spiro
R. C., et al., 1991, J. Cell. Biol., 115: 1463–1473) kultiviert wurden. Nach
der Lyse von Zellen werden die Matrizex in stärkeren Denaturierungsmitteln
(8 M Harnstoff, GnHCL) extrahiert, um matrixgebundene oder integrierte
Proteine zu entfernen und zu untersuchen. Proteinproben werden durch Standard-Western-Blottingverfahren
unter Verwendung von spezifischen polyklonalen oder monoklonalen
Antikörpern
analysiert.
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Für
die metabolische Zellmarkierung werden auf einer Kompositmatrix
kultivierte Zellen metabolisch mit 35SO4, 35S-Methionin oder 3H/14C-markierten Aminosäuren durch Standardverfahren
(Spiro et al., oben) radiomarkiert. Solubilisierte zelluläre und mit
der Matrix verbundene Proteine werden quantitativ einer Immunpräzipitation
mit Antikörpern
unterzogen, die für
das interessierende Protein spezifisch sind, und durch SDS-PAGE
(Spiro et al., oben) analysiert. Die quantitative Bestimmung der
Ergebnisse wird durch Densitometerabtastung von Autoradiographen
durchgeführt
und die Signale werden entweder auf Zelläquivalente oder auf ein konstitutives
Protein wie z. B. Actin normiert.
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Außerdem kann die Fähigkeit
einer Matrix der vorliegenden Erfindung, die chondrogenetische Differenzierung
in vivo zu unterstützen,
an einem Inzucht-Ratten-Weichgewebeimplantatmodell
getestet werden. Rattenknochenmark- oder -stromazellen, die vorstehend
beschrieben wurden, werden mit hoher Dichte in Matrizes geimpft, über Nacht
in MEM-Medium, das 10% FBS-Serum und Antibiotika enthält, kultiviert,
dann in Millipore-Diffusionskammern überführt und
intraperitoneal oder subkutan in 8 Wochen alte Empfänger implantiert. Die
Kammern werden nach 3 Wochen geerntet und histologisch auf Knorpelbildung
bewertet.
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Ein Transplantationsmodell in gekreuzten
Ratten wird verwendet, um die Fähigkeit
der Kompositmatrizes, den Knorpelphänotyp in vivo beizubehalten,
zu bewerten. Rippenknorpel-Chondrozyten werden mit hoher Dichte
in Matrizes geimpft und über
Nacht in Ham's F-12,
das 1% Rattenserum und Antibiotika enthält, geimpft. Die beimpften
Matrizes werden dann in hintere Schienbeinmuskeltaschen, die durch
stumpfe Präparation
erzeugt wurden, in 8 Wochen alten männlichen Sprague-Dawley-Ratten
implantiert. Explantate werden nach 14 und 28 Tagen genommen und histologisch
auf die Matrixkompatibilität,
das Knorpelwachstum und das Aufrechterhalten des differenzierten
Phänotyps
auf der Basis von Anfärbung
für Aggrecan
und Kollagen vom Typ II bewertet.
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Die Fähigkeit einer Matrix der vorliegenden
Erfindung, mit extrazellulären
Matrixproteinen (Proteoglykanen, Proteinen und Wachstumsfaktoren),
die im umgebenden Serum, in Gewebeflüssigkeit oder in den Sekretionsprodukten
von Knorpelvorläuferzellen
zu finden sind, in Wechselwirkung zu treten, korreliert außerdem mit
dem knorpelleitenden Potential einer Matrix. Die Wechselwirkung
der Matrizes der vorliegenden Erfindung mit extrazellulären Matrixproteinen
kann durch Fachleuten bekannte Mittel gemessen werden, wie z. B.
Western-Blotting, Affinitätscoelektrophorese-Verfahren
und Bindungseigenschaften.
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Um die Serumproteinbindung an eine
Matrix der vorliegenden Erfindung zu testen, wird die Matrix in Kulturmedien,
die zunehmende Mengen an Serum (verschiedene Spezies und Quellen)
enthalten, inkubiert. Nach Waschen werden gebundene Proteine durch
Sieden in SDS-PAGE-Probenpuffer eluiert und unsolubilisierte Matrix
wird durch Zentrifugation entfernt. Die SDS-PAGE-Rnalyse wird verwendet,
um das Bindungsmuster der Matrizes anfänglich zu dokumentieren. Western-Blotting
wird dann durchgeführt,
um spezifisch gebundene Komponenten wie z. B. Fibronectin und Vitronectin
zu identifizieren.
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Affinitätscoelektrophorese wird verwendet,
um die Proteoglykanbindung an eine Matrix der vorliegenden Erfindung
zu analysieren. Mit 35SO4 markiertes
oder jodiertes Proteoglykan (Aggrecan), das aus Rind und Ratte (oder
anderen Quellen) isoliert wurde, wird in ACE-Gele (Lee, M. K. et
al., 1991, 88: 2768–2772),
die Kompositmatrizes oder Kollagengerüste allein enthalten, gegeben.
Die Bindungsaffinität
von Aggrecan für Kollagengerüste mit
und ohne Hyaluronsäure
oder Dextransulfat wird als Maß für die Fähigkeit
der Kompositmatrizes, eine Knorpelmatrix aufzubauen, genommen.
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Eine Auswertung der Proteinwechselwirkungen
mit auf Kollagen basierenden Kompositmatrizes kann potentiell durch
den großen Überschuss
an Kollagenprotein behindert werden. Die Kollagengerüste weisen
genügend
innewohnende strukturelle Integrität auf und sind in einem Ausmaß vernetzt,
das ihre vollständige
Solubilisierung verhindert, aber einiges Kollagenprotein kann in
dem SDS-PAGE-Probenpuffer
solubilisiert werden. Somit könnte
dies die Visualisierung von anderen gebundenen Proteinen, insbesondere
der zellsynthetisierten Kollagene, verschleiern und kann auch einen
hohen Hintergrund bei der Western-Blotanalyse verursachen. Daher
besteht ein alternativer Ansatz darin, radiomarkierte oder biotinylierte
Proteine für
die Bindungsanalyse zu verwenden. Serumproteine können vor
der Inkubation mit den Kompositmatrizes biotinyliert werden und
dann mit Reagenzien auf Avidinbasis entwickelt werden. Beide Methoden
ermöglichen
die Visualisierung von zur Matrix gehörenden Komponenten ohne die
Störung
durch das Gerüst-Kollagenprotein.
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Alternativ werden die Verschiebung
in der Expression von Kollagen vom Typ I zu Typ II und das Spleißen des
Transkripts von Kollagen vom Typ II von der Isoform vom Typ IIA
zum Typ IIB (Sandell, L. J. et al., 1991, J. Cell Biol. 114: 1307–1319) durch
Fachleuten bekannte Mittel gemessen, um die Differenzierung einen chondrogenetischen
Weg hinab zu bestimmen. Die Expression des zum Knorpel gehörenden Proteoglykans, Aggrecan
(Schmid, T. M., et al., 1985, J. Cell Biol. 100: 598–605 und
Kuettner K. E. 1992, Clin. Biochem. 25: 155–163) und ein Knorpelhomöoprotein-Transkriptionsfaktor
(Cart-1) scheinen auch Marker für Zellen
zu sein, die auf die Chondrozytenlinie festgelegt sind.
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Für
die Tests in vivo werden die Matrizes auf die Fähigkeiten zum Unterstützen der
Knochenheilung in einem Rattenschädeldefektmodell durch Implantation
in einen Defekt von 5 mm mal 3 mm, der im Scheitelbein von 6 Wochen
alten männlichen
Sprague-Dawley-Ratten erzeugt wurde, bewertet. Die Defekte werden
nach 28 Tagen durch radiographische und histologische Analyse bewertet.
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Das in vivo Modell für die Knorpelreparatur
ist ein Gelenkknorpelvolldefekt im Kaninchen (Amiel et al., 1985,
J. Bone Joint Surg. 67A: 911). Defekte, die ungefähr 3,7 mm
im Durchmesser messen, und ein 5 mm tiefer Defekt werden in der
Mitte der medialen Femurkondyli von erwachsenen männlichen
weißen
Neuseeland-Kaninchen erzeugt. Die Defekte werden dann entweder mit
Matrix gefüllt
oder als Kontrollen ungefüllt
gelassen. Die Defekte werden nach 6 und 12 Wochen morphologisch
und histologisch bewertet.
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Die Matrizes der vorliegenden Erfindung
können
für die
Behandlung von Knochen- und/oder Knorpeldefekten verwendet werden,
die mit chirurgischer Resektion wie z. B. Spondylosyndesen; Verletzung;
Krankheit; Infektion; Krebs oder Gendefekten verbunden sind. Die
erfindungsgemäßen Matrizes
können
durch Implantation, direktes Aufbringen oder Injektion in Abhängigkeit
von der beabsichtigten Anwendung der Matrix, den physikalischen
Eigenschaften der Matrix und dem Gewichtsverhältnis von Kollagen zu Polysaccharid
in der Matrix verabreicht werden.
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In einem Aspekt der vorliegenden
Erfindung wird die Matrix mit einem höheren Anteil an Kollagen im Vergleich
zu Polysaccharid bereitgestellt, liegt in einer schwammartigen Form
vor und wird chirurgisch an einer Stelle implantiert, an der das
Wachstum von neuem Knochengewebe erwünscht ist, wie z. B. in Spondylosyndesen.
In einem Aspekt umfasst die Matrix ferner einen Wachstumsfaktor
wie z. B. BMP-2. In einem weiteren Aspekt umfasst die Matrix ferner
Fibrin, um die Verankerung der Matrix an der gewünschten Stelle zu erleichtern.
In einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung weist die Matrix
einen höheren
Anteil an Polysaccharid im Vergleich zu Kollagen auf, wird zu einem
viskosen Gel geformt und wird entweder direkt an einer Stelle aufgebracht
oder in diese injiziert, an welcher das Wachstum von neuem Knochengewebe
erwünscht ist,
wie z. B. bei Knochenfülldefekten,
einer Frakturreparatur und periodontalen Transplantationsdefekten.
In noch einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung wird die
Matrix mit einem höheren
Anteil an Polysaccharid versehen, wird zu einem viskosen Gel geformt
und wird direkt in eine Stelle injiziert oder durch eine Gelenkendoskopprozedur
zu dieser geliefert, an welcher das Wachstum von Knorpelgewebe erwünscht ist,
wie z. B. bei einer durch Verletzung induzierten Knorpelbeschädigung oder
einer durch Krankheit induzierten Knorpelbeschädigung, wie z. B. bei Osteoarthritis
oder rheumatoider Arthritis.
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Wie für Fachleute selbstverständlich ist,
hängt die
Menge der zu verabreichenden Matrix zum Leiten des Wachstums von
Knochen- oder Knorpelgewebe vom Ausmaß des zu behandelnden Knochen-
oder Knorpeldefekts ab. Wie auch für Fachleute selbstverständlich ist,
geben die Kosten, die Sicherheit und das gewünschte Wachstumsfaktor-Freisetzungsprofil
die Art und Menge an Wachstumsfaktor, der in die Matrix gegeben
wird, vor.
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Die folgenden Beispiele werden für Erläuterungszwecke
bereitgestellt und sollen die Erfindung in keiner Weise begrenzen.
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Beispiel 1
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Dieses Beispiel stellt die Herstellung
einer Vielzahl von Matrizes zur Verwendung bei der Knochen- und/oder
Knorpelreparatur dar. In den folgenden Matrizes wurde Kollagen vom
Typ I als Rohmaterial verwendet. Semed F Kollagen (Typ I, unlöslich) und
Semed S Kollagen (Typ I, säurelöslich) waren
von Kensey-Nash. Hyaluronsäurepolyaldehyd,
Dextranpolyaldehyd, Dextransulfat/Polyaldehyd und Chondroitinsulfat/Polyaldehyd
wurden durch Oxidation des zugehörigen
Polysaccharids mit Natriumperjodat mit Reagensqualität hergestellt.
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Die Matrix basierte in diesem Fall
auf der Reaktion von Proteinaminresten an dem Kollagen mit den aktiven
Aldehydgruppen, die an den Zuckerringen des Polysaccharids erzeugt
wurden. Matrizes mit verschiedenen Oberflächeneigenschaften und unterschiedlicher
biologischer Aktivität
werden durch Steuern der Verhältnisse
des Kollagens zu den Polysacchariden, des Typs von Kollagen, der
Typen von Polysacchariden sowie der Dichte der an den Polysacchariden
erzeugten Aldehydgruppen synthetisiert.
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Semed F Kollagen (8,1 Teile) und
Semed S Kollagen (0,9 Teile) wurden in einer Hyaluronat/Polyaldehyd-Lösung (1
Teil, 5% der Wiederholungseinheiten waren oxidiert: pH 3– 3,5),
die 10 mM Natriumcyanoborhydrid (NaCNBH3)
enthielt, in einem Hochleistungsmischer mit niedriger Geschwindigkeit
für 10
Sekunden, gefolgt von hoher Geschwindigkeit für weitere 5 Sekunden, dispergiert.
Die Aufschlämmung
(Feststoffkonzentration: 28 mg/ml) wurde in eine Form gegossen,
bei Umgebungstemperatur für
24 Stunden inkubiert und lyophilisiert. Dies bildete einen Schwamm,
der mehrere Male in destilliertem Wasser gewaschen wurde, um das NaCNBH3 vollständig
zu entfernen. Der gewaschene Schwamm wurde dann lyophilisiert.
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Der obigen Prozedur wurde gefolgt,
um andere Matrizes unter Verwendung der folgenden Ausgangsmaterialien
herzustellen:
| Semed F Kollagen (0,9 Teile) | Hyaluronat/Polyaldehyd-Lösung |
| Semed S Kollagen (0,1 Teile) | (1 Teil, 5% der Wiederholungseinheiten oxidiert) Feststoffkonzentration:
15 mg/ml |
| Semed F Kollagen (0,9 Teile) | Hyaluronat/Polyaldehyd-Lösung |
| Semed S Kollagen (0,1 Teile) | (2 Teile, 5% der Wiederholungseinheiten
oxidiert) Feststoffkonzentration: 15 mg/ml |
| Semed F Kollagen (0,9 Teile) | Hyaluronat/Polyaldehyd-Lösung |
| Semed S Kollagen (0,1 Teile) | (4 Teile, 5% der Wiederholungseinheiten
oxidiert) Feststoffkonzentration: 15 mg/ml |
| Semed F Kollagen (0,9 Teile) | Hyaluronat/Polyaldehyd-Lösung |
| Semed S Kollagen (0,1 Teile) | (4 Teile, 1% der Wiederholungseinheiten
oxidiert) Feststoffkonzentration: 15 mg/ml |
| Kollagen vom Typ II (9 Teile) | Hyaluronat/Polyaldehyd-Lösung (1 Teil, 5% der Wiederholungseinheiten
oxidiert) Feststoffkonzentration: 15 mg/ml |
| Kollagen vom Typ II (1 Teil) | Hyaluronat/Polyaldehyd-Lösung (1 Teil, 5% der Wiederholungseinheiten
oxidiert) Feststoffkonzentration: 15 mg/ml |
| Semed F Kollagen (7 Teile) | Hyaluronat/Polyaldehyd-Lösung |
| Kollagen vom Typ II (2 Teile) | (1 Teil, 5% der Wiederholungseinheiten oxidiert) Feststoffkonzentration:
15 mg/ml |
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| Semed F Kollagen (8,1 Teile) |
Dextran/Polyaldehyd-Lösung |
| Semed S Kollagen (0,9 Teile) |
(1 Teil, 5% der Wiederholungseinheiten oxidiert) Feststoffkonzentration:
28 mg/ml |
| Semed F Kollagen (8,1 Teile) |
Dextransulfat/Polyaldehyd |
| Semed S Kollagen (0,9 Teile) |
(1 Teil, 5% der Wiederholungseinheiten oxidiert) Feststoffkonzentration:
28 mg/ml |
| Semed F Kollagen (8,1 Teile) |
Chondroitinsulfat/Polyaldehyd |
| Semed S Kollagen (0,9 Teile) |
(1 Teil, 5% der Wiederholungseinheiten oxidiert) Feststoffkonzentration:
28 mg/ml |
| Semed F Kollagen (0,9 Teile) |
Hyaluronat/Polyaldehyd-Lösung |
| Semed S Kollagen (0,1 Teile) |
(4 Teile, 5% der Wiederholungseinheiten
oxidiert) Feststoffkonzentration: 15 mg/ml |
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Beispiel 2
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Die Matrizes von Beispiel 1 wurden
auf ihre Fähigkeit
bewertet, die Knochenheilung in einem Ratten-Schädeldefektmodell
zu unterstützen.
Eine Matrix der vorliegenden Erfindung mit 1 Teil Kollagen (Semed F
Kollagen 0,9 Teile: Semed 0,1 Teile) zu 1 Teil Hyaluronat/Polyaldehyd-Lösung (5%
der Wiederholungseinheiten oxidiert, aus einer Feststoffkonzentration
mit 15 mg/ml) wurde in einen Defekt von 5 mm mal 3 mm, der im Scheitelbein
von 6 Wochen alten männlichen
Sprague-Dawley-Ratten erzeugt wurde, implantiert. Die Defekte wurden
nach 28 Tagen durch radiographische und histologische Analyse bewertet.
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Die radiographische Analyse der Defekte
deutet darauf hin, dass eine signifikante Knochenheilung bei den
ungefüllten
Defekten geschah. Alle mit Matrix gefüllten Defekte waren vollständig strahlenundurchlässig ohne
auffällige
Defektränder,
was auf eine vollständige
Heilung hinwies. Ungefüllte
Defekte erschienen als ovale strahlendurchlässige Bereiche mit abgerundeten
Ecken, was auf minimale Heilung hindeutete.
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Die histologische Bewertung korrelierte
mit radiographischen Ergebnissen. Die Defekte wurden mit einem kontinuierlichen
Lappen von Knochengewebe gefüllt,
das in der Zellstruktur und Struktur normal war, mit erwartungsgemäßen Markräumen und
reifendem hämopoetischem
Knochenmark. Spuren von restlichem Implantatmaterial wurden zusammen
mit einem leicht chronischen Entzündungsinfiltrat gezeigt. In
einigen Bereichen wurde der neue Knochen innerhalb der Zwischenräume des
Implantatmaterials abgelagert und die Knochenoberflächen wurden
mit aktiven Osteoblasten ausgekleidet. Diese Ergebnisse zeigen,
dass die Implantation einer Kollagen-Polysaccharid-Polyaldehyd-Matrix die Knochenbildung
von normalem reparierbaren Knochen in diesem kritischen Defektmodell
leitete.
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Beispiel 3
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Dieses Beispiel stellt die Knochenleitung
und Knocheninduktion von CN/HA-Matrizes der vorliegenden Erfindung
dar. In einem Aspekt wurde die Knochenleitung durch Implantation
einer CN/HA-Matrix allein in einem Rattenschädeldefekt mit radiographischer
und histologischer Bewertung der Knochenbildung nach 1, 2, 3 und
4 Wochen untersucht. In einem weiteren Aspekt wurde die Knocheninduktion
durch intramuskuläre
Implantation von CN/HA-Matrizes, die knochenmorphogenes Protein
(BMP) enthielten, mit anschließender
histologischer und biochemischer Bewertung der ektopischen Knochenbildung
untersucht.
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Materialien und Methoden
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Herstellung
einer Matrix mit und ohne BMP
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Eine vernetzte Matrix aus Kollagen-Hyaluronat
9 : 1 wurde wie in Beispiel 1 beschrieben hergestellt und lyophilisiert.
Zur Herstellung einer Matrix mit einem Wachstumsfaktor wurde BMP
(erhalten von Intermedic Orthopedics, Denver, CO.) aufgelöst und zur
lyophilisierten Matrix in einer Endkonzentration von 0,1% (50 μg pro 50 μl Matrix)
zugegeben. Die Matrix/Wachstumsfaktor-Kombination wurde dann ein
zweites Mal vor der Implantation in den Schädeldefekt lyophilisiert.
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Knochenleitung
in Rattenschädeldefekten
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Um die Fähigkeit einer Kollagen-Hyaluronsäure-Matrix
(CN/HA-Gerüste),
das Einwachsen von Knochengewebe zu unterstützen, zu bewerten, wurden CN/HA-Gerüste in Defekte
implantiert, die in dem Scheitelbein von 6 Wochen alten männlichen
Sprague-Dawley-Ratten durch eine Modifikation eines vorher beschriebenen
Verfahrens erzeugt wurden (Mulliken, J. B. et al., 1980, reconstru.
Surg. 65: 553–559).
Kurz gesagt, wurden bilaterale, rechteckige Defekte von ungefähr 5 mm
mal 3 mm unter Verwendung eines Dremel-Bohrers mit niedriger Geschwindigkeit,
der mit einem Gravierbohreinsatz ausgestattet war, unter konstantem
Ausspülen
während
des Bohrens hergestellt. Linke Defekte wurden mit einem vorgeschnittenen
trockenen Stück
eines CN/HA-Gerüsts
gefüllt
und rechte Defekte blieben ungefüllt
und dienten als unbehandelte Kontrollen. Die Tiere wurden nach 7,
14, 21 und 28 Tagen geopfert und die Schädeldecken wurden entfernt und
in 10% neutralem gepufferten Formalin fixiert.
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Intramuskuläre ektopische
Knocheninduktion
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Um die Fähigkeit von CN/HA-Gerüsten, knocheninduktive
Wachstumsfaktoren zu liefern, zu bewerten, wurden Implantate von
CN/HA, die knochenmorphogenes Protein (BMP) enthielten, in bilateralen
Taschen angeordnet, die in den Schienbeinmuskeln von 4 Wochen alten
männlichen
Sprague-Dawley-Ratten
erzeugt wurden. Jede CN/HA-Matrix wurde mit 50 μg BMP durch Absorption und anschließende Lyophilisierung
gefüllt und
das gegenüberliegende
Glied erhielt Implantate von CN/HA ohne BMP. Die Tiere wurden nach
21 Tagen geopfert und die Implantatmaterialien wurden aus dem umgebenden
Gewebe entfernt. Die explantierten Gewebe wurden in zwei Stücke geschnitten:
ein Stück
wurde extrahiert und auf alkalische Phosphatase getestet (Lowry
et al., 1954, J. Biol. Chem. 207: 19 und Sampath, et al., 1981,
Proc. Natl. Acad. Sci. 78: 7599–7603) und
das andere Stück
in 10% neutralem gepufferten Formalin fixiert, entkalkt und für die histologische
Bewertung verarbeitet. Paraffinabschnitte mit 6 μm Dicke wurden mit Hämatoxylin
und Eosin angefärbt
und auf die ektopische Knochenbildung, Entzündung und das Restimplantataussehen
untersucht. Die Aktivität
von alkalischer Phosphatase wurde in Einheiten ausgedrückt, wobei
1 Einheit gleich nMol p-Nitrophenol ist, das pro Minute bei 37°C (aus p-Nitrophenylphosphat-Substrat) erzeugt
wird.
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Radiographische
Bewertung
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Radiographien von fixierter Schädeldecke,
die mit einer Faxitron-Röntgenstrahleinheit
(Hewlett-Packard, Modell 43855A) aufgenommen wurden, wurden auf
einem X-Omat-TL-Film (Kodak) aufgezeichnet. Spuren von strahlendurchlässigen Bereichen
wurden quantifiziert, um die % Verringerung der Defektgröße relativ zu
unbehandelten Defekten zu berechnen.
-
Histologische
Bewertung
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Schädeldecken- und intramuskuläre Implantatprüfstücke wurden
in Formical (American Histology, Lodi, CA) entkalt. Grobe Querschnitte
wurden durch die ungefähre
Mitte der Schädeldefekte
vor der Verarbeitung hergestellt. Sechs um Paraffinabschnitte in
der Mitte der Defekte oder von explantierten Geweben wurden mit Hämatoxylin
und Eosin angefärbt.
Die Gewebe wurden auf Bioverträglichkeit
(Entzündung),
Restimplantatbeständigkeit
und neue Knochenbildung bewertet. Die Knochenheilung von Schädeldefekten
wurde subjektiv auf einer linearen Skala von 1 bis 5 auf der Basis
der Breite des mit Reparaturknochen überbrückten Defekts bewertet.
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Ergebnisse
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Knochenleitung von CN/HA-Matrizes
-
Unbehandelte Schädeldefekte zeigten typischerweise
minimale Knochenreparatur während
des Zeitraums von 4 Wochen. Radiographien von entfernter Schädeldecke
zeigten eine leichte Rundung der ungefüllten rechteckigen Defekte
nach 28 Tagen, was darauf hindeutete, dass eine gewisse spontane
Knochenreparatur ausgehend von den Schnittkanten stattgefunden hatte.
Histologisch waren ungefüllte
Defekte nach 1, 2, 3 und 4 Wochen durch ein dünnes Band von Fasergewebe überbrückt, wobei
ein kleines Ausmaß an
Reparatur durch Knochengewebe an den Schnittenden des lamellaren
Schädeldeckenknochens
nach 2 Wochen ersichtlich war. Der Reparaturknochen wies normale
Färbung
und Zelleneigenschaften auf. Typischerweise waren unbehandelte Schädeldefekte
minimal proliferativ und zeigten keine signifikante Entzündungsreaktion.
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Im Vergleich zeigten mit CN/HA-Matrizes
gefüllte
Defekte fortschreitend zunehmende Strahlenundurchlässigkeit über 4 Wochen.
Nach 4 Wochen waren behandelte Defekte vollständig oder fast vollständig strahlenundurchlässig. Die
Verringerung der Defektflächen
für behandelte
Defekte relativ zu unbehandelten Kontrollen sind in Tabelle I dargestellt.
-
Tabelle
I: Zusammenfassung von radiographischer und histologischer Bewertung
-
Ebenso zeigte die histologische Bewertung
eine zunehmende Reparaturknochenbildung während des Zeitraums von 4 Wochen
(siehe Tabelle 1). Eine minimale Reparaturknochenbildung wurde am
geschnittenen Scheitelbein nach 1 Woche beobachtet. Das Einwachsen
von Fasergewebe wurde von einem diffusen chronischen Entzündungszelleninfiltrat
begleitet. In einigen Bereichen war eine Kondensation des Fasergewebes aufgetreten,
die einer knochenähnlichen
Ablagerung ähnelte.
Zu diesem frühen
Zeitpunkt war die Mehrheit des Defekts mit dem retikulären Netzwerk
des CN/HA-Matrixmaterials gefüllt.
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Nach zwei Wochen wurden variable
Ausmaße
an neuer Knochenbildung beobachtet, wobei 3 von 6 Defekten vollständig oder
fast vollständig
mit sehr jungem neuen Knochengewebe überbrückt waren. Der neue Knochen
wies ein normales histologisches Aussehen auf und schien Implantatmaterial
in seine Substanz integriert zu haben. Die ersten Stufen der Osteoid-
und Knochenablagerung schienen im mittleren Bereich der CN/HA-Matrix
innerhalb eines vaskularisierten Fasergewebes voranzuschreiten.
Zu diesem Zeitpunkt war eine im Allgemeinen milde chronische Entzündungsreaktion
mit den CN/HA-Matrizes verbunden.
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Ebenso waren 4 von 6 Defekten, die
mit CN/HA behandelt wurden, nach 3 Wochen im Wesentlichen vollständig mit
Knochengewebe überbrückt, wobei
die restlichen 2 Prüfstücke mäßige Knochenreparatur
zeigten. Der neue Knochen enthielt Osteozyten in Lakunen, Umkehrstriche,
zahlreiche mit Osteoblasten ausgekleidete Knochenoberflächen und
reifende Markräume.
Kleine Mengen an Restmatrixmaterial in Zusammenhang mit Fasergewebe
und eine milde chronische Entzündungsreaktion
wurden auch peripher zum neu gebildeten Knochen beobachtet.
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Nach 4 Wochen waren 5 von 6 Defekten
vollständig
oder fast vollständig
durch Reparaturknochengewebe überbrückt. Die
Neumodellierung und Reifung des Knochengewebes geschah scheinbar
als lamellarer Knochen und hämopoetische
Markräume
lagen innerhalb des Knochengewebes vor. Eine sehr leichte Entzündung, die
aus einem diffusen chronischen Entzündungszelleninfiltrat bestand,
war mit Fragmenten der restlichen CN/HA-Matrix und Fasergewebe in
einigen Bereichen benachbart zum neuen Knochen verbunden.
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Ektopische Knochenbildung,
induziert durch mit BMP gefüllte
CN/HA-Gerüste
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Nach 21 Tagen unterstützte die
intramuskuläre
Implantation von CN/HA das Einwachsen eines feinen Fasergewebes
innerhalb die Zwischenräume
des Matrixgerüsts
und rief eine milde bis mäßige chronische
Entzündungszellreaktion
hervor.
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Die Implantate waren von Muskelgewebe
mit histologisch normalem Aussehen und einer geringfügig verdickten
Kapsel aus feinem Fasergewebe umgeben. Einige mehrkernige Riesenzellen
lagen auch peripher in bezug auf das Implantatmaterial vor.
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Im Gegensatz induzierten mit 50 μg BMP gefüllte CN/HA-Gerüste eine
ausgedehnte ektopische Knochenbildung nach der Implantation in Ratten-Schienbeinmuskeltaschen
für 21
Tage. Inseln von neuem Knochen hatten sich über die gesamte CN/HA-Matrix
innerhalb eines Einwuchses von fibrovaskulärem Gewebe gebildet. Das Knochengewebe
im mittleren Bereich des Implantats schien weniger reif als das
am Umfang des Implantats vorliegende Knochengewebe. Die Knochengewebe-Verbindungsspiculi
enthielten Umkehrstriche, Osteozyten in Lakunen und viele Bereiche
von mutmaßlichem
hämopoetischen
Mark. Einige gestreute Chondrozyten lagen auch innerhalb des neuen
Knochens vor. Nur Spuren von restlichem Matrixmaterial konnten innerhalb
des knochigen Knöchelchens
erkannt werden. Eine verdickte Fasergewebekapsel, die einige chronische
Entzündungszellen
enthielt, lag peripher vor. Die spezifische Aktivität von alkalischer
Phosphatase für 21-Tag-Explantate
von CN/HA-Gerüsten,
die 50 μg
BMP enthielten, betrug 22 ± 6
Einheiten, während
alkalische Phosphatase in Explantaten von nur CN/HA nicht nachgewiesen
wurde (< 1 Einheit).
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CN/HA-Matrizes (Implantate) allein
waren knochenleitend und unterstützten
die neue Knochenbildung, wenn sie in Rattenschädeldefekte implantiert wurden.
Die CN/HA-Implantate
bestanden aus einem retikulären
Netzwerk von Kollagenfasern mit einer kanalartigen Struktur, die
das Zelleneinwachsen über
das gesamte Implantat förderte.
Die Knochenneubildung war nach 2 Wochen durch radiographische und
histologische Bewertungen ersichtlich. Nach 4 Wochen waren die Defekte
fast vollständig
mit neuem Knochengewebe gefüllt,
im Vergleich zu unbehandelten Defekten, die typischerweise durch
ein dünnes
Band aus Fasergewebe überbrückt waren,
mit minimaler Knochenreparatur. Nur kleine Mengen an restlichem
CN/HA-Implantatmaterial lagen nach 4 Wochen vor, wobei die Mehrheit
des Implantats entweder resorbiert oder in den neu gebildeten Knochen
integriert war. Die Matrizes zeigten gute Bioverträglichkeit
und riefen keine signifikante Entzündungsreaktion hervor. Die
CN/HA-Matrizes allein dienten als Gerüst für die Geweberegeneration, wodurch
die Rekrutierung von mesenchymalem Fasergewebe in den Defekt und
die anschließende
Ablagerung von Knochengewebe und Knochen gefördert wurde.
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Die intramuskulär in die Ratte implantierten
CN/HA-Matrizes wurden gut toleriert und förderten das Wachstum von fibrovaskulärem Gewebe
nach 21 Tagen. Wenn die CN/HA-Matrizes
50 μg BMP
enthielten, wurde eine extensive ektopische Knochenbildung induziert.
Obwohl die neue Knochengewebebildung über das gesamte Implantat ersichtlich
war, schien das Knöchelchen
peripher reifer zu sein. Ähnlich
der CN/HA-Matrix allein, die in Schädeldefekte implantiert wurde,
war theoretisch die gesamte Matrix plus BMP resorbiert oder in den
neuen Knochen integriert worden. Diese Ergebnisse weisen darauf
hin, dass CN/HA-Matrizes geeignete Abgabeträger für knocheninduktive Faktoren
sind und die Kaskade von Ereignissen unterstützen, die stattfinden, wenn
mesenchymale Zellen in den Knochen differenzieren. Die Effizienz
der CN/HA-Matrizes bei der Abgabe von knocheninduktiven Faktoren
kann durch eine BMP-Dosis-Wirkungs-Untersuchung
in vivo festgestellt werden.
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Beispiel 4
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Dieses Beispiel stellt dar, dass
eine Matrix der vorliegenden Erfindung die Aufrechterhaltung des Chondrozytenphänotyps in
vitro unterstützt.
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Ratten-Primärchondrozyten, die durch das
Verfahren von Blein-Sella O. et al., oben, hergestellt wurden, wurden
in eine Matrix geimpft, die durch das in Beispiel 1 offenbarte Verfahren
hergestellt wurde und die 1 Teil Kollagen (Semed F Kollagen 0,9
Teile : Semed 0,1 Teile) zu 1 Teil Hyaluronat/Polyaldehyd-Lösung (5% der
Wiederholungseinheiten oxidiert, aus einer Feststoffkonzentration
mit 15 mg/ml) enthielt, und unter Verwendung von herkömmlichen
Bedingungen für
1–4 Wochen
kultiviert. Die Kulturen wurden dann histologisch verarbeitet und
bewertet. Die Ergebnisse zeigen, dass Schädeldeckenzellen, die in die
Matrix gesät
wurden, wachsen und weiterhin alkalische Phosphatase, ein Marker
für Knochen
bildende Zellen, exprimieren. Die in die Matrix gesäten Chondrozyten
proliferieren auch und synthetisieren eine metachromatisch färbende extrazelluläre Matrix,
die auf einen hohen Proteoglykangehalt hindeutet, der für den Chondrozytenphänotyp typisch ist.
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Beispiel 5
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Matrizes, die durch den in Beispiel
1 beschriebenen Prozess hergestellt wurden und die verschiedene Verhältnisse
von Kollagen zu Polysaccharid enthalten, werden in einen Gelenkknorpelvolldefekt
im Kaninchen implantiert, wie bei Amiel et al., oben, beschrieben.
Defekte, die ungefähr
3,7 mm im Durchmesser messen, und ein 5 mm tiefer Defekt werden
in der Mitte der medialen Femurkondyli von erwachsenen männlichen
weiden Neuseeland-Kaninchen erzeugt. Die Defekte werden dann entweder
mit Matrix gefüllt
oder als Kontrollen ungefüllt
gelassen. Die Defekte werden morphologisch und histologisch nach
6 und 12 Wochen bewertet.
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Beispiel 6
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Dieses Beispiel stellt die Auswirkung
von Kollagen und Hyaluronat auf die Fibrinkoagulation dar.
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Die Auswirkung von Kollagen/Hyaluronat-Gel
auf die Koagulationszeit von Fibrinogen wurde folgendermaßen bewertet:
0,5 ml gereinigte Fibrinogenlösung
(30 mg/ml, PBS) wurde in ein Glasröhrchen von 10 ml gegeben und
in einem Wasserbad bei 37°C
für 5 min.
inkubiert. 0,1 ml CaCl2-Lösung (0,2
M), die 0,5 NIH-U Thrombin enthielt, und verschiedene Konzentrationen
an Kollagen und Hyaluronatpolyaldehyd wurden zugegeben und mit einem
Rührstab
vermischt. Die für
die Bildung von Gel auf dem Rührstab
erforderliche Zeit wurde als Koagulationszeit aufgezeichnet. Die
Ergebnisse sind in Tabelle 1 dargestellt.
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Tabelle
1
Fibrinkoagulationszeit in Gegenwart von Kollagen und Hyaluronat
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Beispiel 7
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Dieses Beispiel stellt die Bildung
eines dreidimensionalen Gerüsts
einer vernetzten Kollagen-Hyaluronat-Matrix mit Fibrinogen und Thrombin
in einem Gewebekulturmedium dar.
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Dieser Versuch wurde mit einem Dreiwege-Absperrhahn,
der mit einem Steckerluer-Gleitadapter ausgestattet war und mit
dem zwei Spritzen verbunden waren, durchgeführt. Die Spritze A enthielt
5 ml Fibrinogen und Hyaluronatpolyaldehyd (jeweils 20 mg/ml, in
DMEM-Medium), die Spritze B enthielt Thrombin (2 NIH-U/ml, in DMEM-Medium) und eine
Kollagen-Semed S (Kensey Nash) Suspension (20 mg/ml, in DMEM-Medium),
die auf einen Faserdurchmesser von etwa 50 mm in einem Hochleistungsmischer
vorgemischt worden war. Der Inhalt der Spritzen wurde zwischen den
zwei Spritzen schnell vermischt und der Inhalt wurde in eine Spritze gezogen,
die dann in einem Winkel von 60° in
eine phosphatgepufferte Salz- (PBS) Lösung (40 ml im 100 ml Glasbecher)
gehalten wurde, und der Inhalt wurde in die PBS-Lösung abgegeben.
Die gesamte Abgabe, einschließlich
Vermischen, wurde in 10 s beendet. Keine Auflösung des so gebildeten Gels
wurde nach der Inkubation bei Umgebungstemperatur oder bei 37°C beobachtet.
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Beispiel 8
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Dieses Beispiel stellt die Bildung
eines dreidimensionalen Gerüsts
einer vernetzten Kollagen-Hyaluronat-Matrix mit Fibrinogen und Thrombin
in desionisiertem Wasser dar.
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Der Versuch wurde mit einem Dreiwege-Absperrhahn,
der mit einem Steckerluer-Gleitadapter ausgestattet war und mit
dem zwei Spritzen verbunden waren, durchgeführt. Die Spritze A enthielt
5 ml Fibrinogen und Hyaluronatpolyaldehyd (jeweils 20 mg/ml, 12
mM NaOH), die Spritze B enthielt Thrombin (2 NIH-U/ml) und gereinigte
Kollagenlösung
(Collagen Corporation, 3 mg/ml, 12 mM HCl). Der Inhalt der Spritzen
wurde zwischen den zwei Spritzen schnell vermischt und der Inhalt
wurde in eine Spritze gezogen, die dann in einem Winkel von 60° in eine
phosphatgepufferte Salz- (PBS) Lösung
(40 ml im 100 ml Glasbecher) gehalten wurde, und der Inhalt wurde
in die PBS-Lösung
abgegeben. Die gesamte Abgabe wurde in 10 s beendet. Keine Auflösung des
so gebildeten Gels wurde nach der Inkubation bei Umgebungstemperatur
oder bei 37°C
beobachtet.
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Beispiel 9
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Dieses Beispiel stellt die Bewertung
der Bioverträglichkeit
und Verweilzeit einer vernetzten Kollagen-Hyaluronat-Matrix mit
Fibrinogen und Thrombin in vivo dar.
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Gele mit verschiedenen Zusammensetzungen,
wie in Tabelle 2 beschrieben, wurden unter Verwendung eines Dreiwege-Absperrhahns, der
mit einem Steckerluer-Gleitadapter ausgestattet war, und von zwei Spritzen
hergestellt. Nach dem Vermischen wurden die Gemische in eine Zellkulturplatte
mit 24 Vertiefungen mit der Rate von 0,5 ml/Vertiefung gegossen
und bei Umgebungstemperatur für
15 min. stehen gelassen. Die so gebildeten Gele wurden lyophilisiert,
in 10 × 10 × 5 mm lange
Würfel
geschnitten und mit Ethanol sterilisiert. Diese Prüfstücke wurden
dann in Taschen angeordnet, die durch stumpfe Präparation im Schienbeinmuskel von
4 bis 5 Wochen alten männlichen
Sprague-Dawley-Ratten hergestellt wurden. Die Ratten wurden nach
3, 7 und 14 Tagen geopfert und die Explantate wurden histologisch
auf Bioverträglichkeit
und Implantatbeständigkeit
bewertet.
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Tabelle
2
Zusammensetzungen von Matrizes für einen Test in vivo
-
Die histologische Bewertung zeigte
eine erhöhte
Beständigkeit
von Implantaten, die aus Kollagen/Hyaluronat und Fibrin bestanden.
Am Tag 3 war die Mehrheit der Implantate, die Fibrin und Fibrin/Hyaluronat
enthielten, abgebaut. Am Tag 7 waren alle auf Fibrin basierenden
Matrizes vollständig
resorbiert, während
eine kleine Menge an restlicher Fibrin/Hyaluronat-Matrix noch beobachtet
werden konnte. Am Tag 14 konnten nur Kollagen enthaltende Matrizes
noch an den Implantatstellen gefunden werden. Ausgehend vom Tag
7 konnten einige Blutgefäße in Fibrin/Kollagen-Matrizes
und in Fibrin/Kollagen/Hyaluronatpolyaldehyd-Matrizes und auch in der
Kontrolle, Kollagenmatrizes, beobachtet werden. Außerdem schienen
Zusammensetzungen mit Hyaluronat das Wachstum von Blutgefäßen zu verstärken.
