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GEBIET DER
ERFINDUNG
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Die
vorliegende Erfindung betrifft Verfahren zur Herstellung von Kollagen
aus Geweben von Menschen oder anderen Tieren. Insbesondere stellt
die vorliegende Erfindung Verfahren zur Herstellung von Kollagen
für biomedizinische,
veterinärmedizinische
und andere Anwendungen bereit.
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HINTERGRUND
DER ERFINDUNG
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Kollagen
ist das Protein, das bei Säugetieren
besonders reichlich vorhanden ist. (Siehe US-Patent Nr. 5.043.426
von Goldstein). Tatsächlich
macht es 30% des Trockengewichts des menschlichen Körpers aus. (Siehe
L. C. Junqueira und J. Carneiro, Basic Histology, 4. Ausgabe, Lange
Medical Publications, Los Altos, CA (1983), Seiten 89–119). Kollagen
bei Wirbeltieren gehört
in der Tat zu einer Familie von Proteinen, die von mehreren Zelltypen
produziert werden. Innerhalb dieser Proteinfamilie lassen sich die
Kollagenarten anhand ihrer chemischen Zusammensetzungen, unterschiedlichen
morphologischen und pathologischen Merkmalen, Verteilungen innerhalb
von Geweben und ihren Funktionen unterscheiden. Obwohl bereits viele
Arten von Kollagen beschrieben wurden, wurden nur fünf große Arten
anerkannt.
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A. Kollagenformen
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Kollagen
vom Typ I ist die Kollagenform, die am reichlichsten vorkommt und
im Körper
weit verteilt ist. In den Geweben liegt es in Strukturen vor, die
klassisch als „Kollagenfasern" bezeichnet werden
und die Knochen, Dentin, Sehnen, Faszien, Sklera, Organkapseln,
Dermis, Faserknorpel usw. bilden. Die Hauptfunktion von Kollagen
Typ I ist Widerstand gegen Spannung. Mikroskopisch erscheint Kollagen
Typ I als dicht gepackte, dicke, nicht-argyrophile, stark doppelbrechende,
rote oder gelbe Fasern. Seine Ultrastruktur ist durch dicht gepackte
dicke Fibrillen mit starken Schwankungen im Durchmesser gekennzeichnet.
Es wird von Fibroblasten, Osteoblasten, Odontoblasten und Chondroblasten
produziert.
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Kollagen
vom Typ II findet sich hauptsächlich
in Knorpel (z. B. hyalinem und elastischem Knorpel). Die Hauptfunktion
von Kollagen Typ II ist der Widerstand gegen intermittierenden Druck.
Mikroskopisch erscheint es als loses Kollagennetz, das nur nach
Piorosirius-Anfärbung
und mit Polarisationsmikroskopie sichtbar ist. Seine Ultrastruktur
ist dadurch gekennzeichnet, dass sie anscheinend keine Fasern besitzt,
aber dafür
sehr dünne
Fibrillen, die in reichlich Grundsubstanz eingebettet sind. Es wird
von Chondroblasten produziert.
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Kollagen
vom Typ III wird in der Regel mit Kollagen Typ I in Geweben in Verbindung
gebracht und kann die kollagene Komponente von retikulären Fasern
darstellen. Es findet sich in der glatten Muskulatur, in Endoneurium,
Arterien, Uterus, Leber, Milz, Nieren und Lungengewebe. Die Hauptfunktion
von Kollagen Typ III ist die Aufrechterhaltung der Struktur ausdehnbarer
Organe. Mikroskopisch erscheint es als loses Netz aus dünnen, argyrophilen
und schwach doppelbrechenden grünlichen
Fasern. Seine Ultrastruktur ist durch lose gepackte dünne Fibrillen
mit relativ gleichförmigen
Durchmessern gekennzeichnet. Es wird von Fibroblasten der glatten
Muskulatur, Retikulumzellen, Schwann-Zellen und Hepatozyten produziert.
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Kollagen
vom Typ IV findet sich in der epithelialen und endothelialen Basallamina
und den Basalmembranen. Die Hauptfunktion von Kollagen Typ IV ist
Unterstützung
und Filtration. Mikroskopisch erscheint es als dünne, amorphe, schwach doppelbrechende
Membran. Ultrastrukturell scheint es weder Fasern noch Fibrillen aufzuweisen.
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Kollagen
vom Typ V findet sich in den Fötalmembranen,
Blutgefäßen, der
plazentären
Basalmembran und in kleinen Mengen auch in anderen Geweben. Diese
Art von Kollagen ist noch relativ wenig charakterisiert.
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B. Struktur von Kollagen
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Die
wichtigsten Aminosäuren,
die in Kollagen gefunden werden, sind Glycin, Prolin und Hydroxyprolin. Hydroxylysin
ist ebenfalls für
Kollagen charakteristisch. Diese Hydroxyaminosäuren sind das Resultat einer Hydroxylierung
von Prolin und Lysin in wachsenden Kollagenpolypeptiden während der
Kollagensynthese. Der Kollagengehalt in einem Gewebe kann durch
Messung seines Hydroxyprolingehalts festgestellt werden.
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Kollagen
besteht aus Polypeptid-Ketten mit der Bezeichnung „α". Es gibt zwei Arten
von α-Ketten, nämlich „alpha-1" („α-1") und „alpha-2" („α-2"). Die wichtigsten
Arten von α-1-Ketten sind α1(I), α1(II), α1(III) und α1(IV), die
in unterschiedlichen Kombinationen aggregieren und so Dreifachhelixe
der Arten I, II, III, IV und V produzieren. Kollagen Typ I besteht
aus zwei α1-Ketten
und einer α2-Kette.
Seine Formel ist (α1[I])2 α2. Die Formel
von Kollagen Typ II ist (α1[II])3,
während
die Formel von Kollagen Typ III (α1[III])3
und von Typ IV (α1[IV])3
ist.
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„Tropokollagen" ist die Proteineinheit,
die zu Aggregaten von mikrofibrillären Untereinheiten, die zur Bildung
von „Kollagenfibrillen" gepackt sind, polymerisiert.
Wasserstoffbindungen und hydrophobe Wechselwirkungen sind für die Aggregation
und Packung kritisch. Kovalente Vernetzungen verstärken die
Struktur der Kollagenfibrillen. Kollagenfibrillen sind dünn und länglich,
weisen unterschiedliche Durchmesser auf und besitzen eine Querstreifung
mit einer charakteristischen Periodizität von 64 nm. Die Querstreifung
entsteht durch überlappende
Anordnung der Untereinheiten-Tropokollagen-Moleküle. In Kollagen
vom Typ I und III verbinden sich diese Fibrillen und bilden Kollagen "fasern". Bei Kollagen Typ
I können
durch Zusammenschluss der Fasern Kollagen "bündel" entstehen. Kollagen
Typ II ist als Fibrillen zu sehen, bildet aber keine Fasern, während Typ
IV und V weder Fibrillen noch Fasern bilden.
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Kollagenfasern
sind die am reichlichsten vorkommenden Fasern in Bindegewebe. Ihre
Inelastizität
und molekulare Konfiguration führen
zu Kollagenfasern mit einer Zugfestigkeit, die höher ist als die von Stahl.
Kollagen bietet somit eine Kombination aus Flexibilität und Stärke für die Gewebe,
in denen es vorkommt. In vielen Teilen des Körpers sind Kollagenfasern in
parallelen Reihen organisiert, um „Bündel" zu bilden.
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Frische
Kollagenfasern erscheinen als farblose Stränge, aber wenn eine große Menge
Fasern vorhanden ist, führen
sie dazu, dass die Gewebe, in denen sie vorkommen, weiß werden
(z. B. Sehnen und Aponeurosen). Die Anordnung des länglichen
Tropokollagens in den Fasern führt
dazu, dass sie doppelbrechend werden. Eine Anfärbung mit bestimmten sauren
Farbstoffen (z. B. Sirius-Rot) verstärkt diese Doppelbrechung. Da diese
Erhöhung
der Doppelbrechung nur in orientierten Kollagenstrukturen beobachtet
wird, ist sie eine nützliche
Methode zum Nachweis des Vorliegens von Kollagen in einem Gewebe.
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C. Eigenschaften und Anwendungen
von Kollagen
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Kollagen
besitzt viele Eigenschaften, die es zu einer attraktiven Substanz
für diverse
medizinische Anwendungen machen, beispielsweise für Implantate,
Transplantate, Organersatz, Gewebsäquivalente, Glaskörperersatz,
plastische und kosmetische Chirurgie, chirurgische Nähte, chirurgische
Verbände
für Wunden,
Verbrennungen usw. (Siehe z. B. US-Patent Nr. 5.106.949, 5.104.660,
5.081.106, 5.383.930, 4.485.095, 4.485.097, 4.539.716, 4.546.500,
4.409.332, 4.604.346, 4.835.102, 4.837.379, 3.800.792, 3.491.760, 3.113.568,
3.471.598, 2.202.566 und 3.157.524; J. F. Prudden, Arch. Surg. 89:
1046–1059
(1964); und E. E. Peacock et al. Ann. Surg. 161: 238–247 (1965)).
Beispielsweise ist Kollagen an sich relativ schwach immunogen, was
zumindest teilweise auf die Maskierung der potenziellen antigenen
Determinanten in der Kol lagenstruktur zurückzuführen ist. Ferner widersteht
es aufgrund seiner spiralförmigen
Struktur Proteolyse. Darüber hinaus
ist es eine natürliche
Substanz für
die Zelladhäsion
und die wichtigste Spannungsbelastungen aufnehmende Komponente des
Muskel- und Skelettsystems. Deshalb wurden der Produktion von Kollagenfasern
und Membranen für
medizinische und veterinärmedizinische
Anwendungen große
Anstrengungen gewidmet.
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Kollagen
wurde bereits zur Gewebeverstärkung,
als Ersatz für
Paraffin, Petrolatum, Pflanzenöle,
Lanolin, Bienenwachs und Silikon verwendet. (Siehe z. B. US-Patent
Nr. 5.002.071.) Die Verwendung von Kollagen in Implantaten wurde
jedoch mit Problemen in Zusammenhang gebracht. Da die nichtkollagenen
Proteine, die in unreinen Kollagenpräparaten vorliegen, potentere
Immunogene sind als Kollagen und eine Entzündungsreaktion auslösen können, ist
es extrem wichtig, hochreines Kollagen zu verwenden. Wenn die Entzündungskaskade
stimuliert ist, kommt es zur Resorption von Kollagen durch die infiltrierenden
Entzündungszellen
(z. B. Makrophagen und Granulozyten), die Kollagenase enthalten,
was zum Aufschluss von Kollagen führt. Darüber hinaus ist Kollagen selbst
chemotaktisch und wird bei seiner Zerlegung in kleinere Peptidfragmente zunehmend
chemotaktischer. Es gibt auch Bedenken hinsichtlich der Verwendung
von nichtmenschlichem Kollagen. Beispielsweise ist ein wiederholt
dokumentiertes Problem im Zusammenhang mit der Verwendung von Rinderkollagen
als Biomaterial die konstante, chronische zelluläre Entzündungsreaktion, die nach seiner Implantation
oder Verwendung in Erscheinung tritt. Diese Entzündung kann zur Bildung von
Narbengewebe, Adhäsionsbildung,
Störungen
der Erwärmung
von Hauträndern,
Pseudointima-Bildung,
Pseudodiaphragma-Bildung, Störung
von Anastomosen, vorübergehendem
leichtem Fieber, Aneurysmen oder anderen Problemen führen.
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D. Herstellung von Kollagen
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Kollagenpräparate werden
in der Regel aus Haut, Sehnen (z. B. Rinder-Achillessehnen, Schwanz- und
Extensorsehnen), Häuten oder
anderen tierischen Teilen in Verfahren hergestellt, die Säure- und/oder
Enzymextraktion beinhalten. Grundsätzlich umfassen Verfahren zur
Herstellung von Kollagen die Reinigung des Kollagens durch Extraktion
mit verdünnten
organischen Säuren,
die Ausfällung
mit Salzen, eine optionale Gelierung und/oder Lyophilisierung, tangentiale
Filtration usw. Nach Abtrennen von Faszie, Fett und Verunreinigungen
wird das Gewebe einer mäßigen Digestion
mit proteolytischen Enzymen, wie z. B. Pepsin, unterworfen und das
Kollagen wird dann bei neutralem pH ausgefällt, erneut gelöst und restliche
Verunreinigungen bei saurem pH ausgefällt. Das Gewebe wird dann mit
einer stark alkalischen Substanz aufgeschlossen und dann mit einer
Säure behandelt,
um Schwellung zu fördern.
Die Kollagenfasern werden dann mit Salzen oder organischen Lösungsmitteln
ausgefällt
und dehydriert. (Siehe z. B. US-Patent Nr. 5.028.695). Schließlich kann
das extrahierte Kollagen in fein verteiltes faserförmiges Kollagen
umgewandelt werden, indem wasser-nasses Kollagen zur Entfernung
von Wasser mit Aceton behandelt, zur Gewinnung einer festen Kollagenmasse
zentrifugiert und das Kollagen während
der Trocknung deaggregiert wird. (Siehe z. B. US-Patent Nr. 4148664).
Die Kollagenzubereitung kann dann wieder auf einen neutralen pH
gebracht und in Form von Fasern getrocknet werden. So können vollständig transparente
physiologisch und hämokompatible
Gele, Kollagenfilme und Lösungen
hergestellt werden. Diese Formen von Kollagen können dann zur Herstellung von
Kontaktlinsen und Implantaten verwendet werden.
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Ein
Nachteil der Behandlung mit Pepsin ist die Tatsache, dass die Kollagenzubereitung
teilweise zersetzt werden kann (d. h. die Extraktionsenzyme spalten
das Kollagenmolekül
an den terminalen nichtspiralförmigen
Regionen, die interkollagene Vernetzungen enthalten). Tatsächlich wurde
gefunden, dass mit Pepsin extrahiertes Kollagen Präparate ergibt,
die für
bestimmte Anwendungen zu schwach sind, und zwar insbesondere für Anwendungen,
in denen erhebliche mechanische Manipulation des Kollagenpräparats erforderlich
ist.
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Einige
Säurebehandlungen
sind ebenfalls mit Nachteilen behaftet. Beispielsweise wird in dem
von Chvapil (M. Chvapil et al., Intl. Rev. Connective Tiss. Res.,
6: 1–55
(1979)) beschriebenen Säureverfahren
Rindersehnenkollagen mit Säure
löslich
gemacht, um eine Kollagensuspension zu erhalten. Diese Suspension wird
dann entweder dialysiert oder in Kochsalzlösung ausgefällt und ergibt ein amorphes
Präzipitat,
das nichtfibrilläres
denaturiertes Kollagen enthält.
Das mit diesem Verfahren hergestellte Kollagen eignet sich im Allgemeinen
nicht direkt für
medizinische Zwecke, da es in feuchten Medien nicht zugfest ist
und bei Applikation auf lebendem Gewebe nur wenig Widerstand gegen
enzymatischen Abbau bietet. Darüber
hinaus ist denaturiertes Kollagen oder Kollagen, das zur Umformung
seiner physikalischen und biologischen Eigenschaften behandelt wurde,
um es an Kollagen anzunähern,
in vivo häufig
nicht zufriedenstellend. Häufig
fehlen ihm die mechanischen Eigenschaften, die für feuchte Verbände benötigt werden,
weil ihm die in vivo organisierte Struktur fehlt (d. h. in diesem
künstlichen
Kollagen liegen keine Kollagenfasern vor).
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GB
1 204 048 beschreibt ein Verfahren zur Reinigung von Kollagen von
antigenen Substanzen in einem einzelnen Proteolyseschritt mit Elastase
(d. h. Ficin) und einem Reduktionsschritt vor oder nach dem Proteolyseschritt.
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Die
derzeitigen Methoden zur Herstellung von Kollagen sind somit unzureichend.
Es besteht ein klarer Bedarf nach der Entwicklung verbesserter Verfahren
für die
Produktion großer
Mengen von hochwertigem Kollagen für medizinische Behandlungen.
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ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
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Die
vorliegende Erfindung betrifft Verfahren zur Herstellung von Kollagen
aus Geweben von Menschen oder anderen Tieren. Insbesondere stellt
die vorliegende Erfindung Verfahren zur Herstellung von Kollagen
für biomedizinische
Anwendungen bereit.
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Die
vorliegende Erfindung stellt zahlreiche Ausführungsformen für die Aufreinigung
von Kollagen bereit. Besonders bevorzugt ist das gemäß einer
Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung aufgereinigte Kollagen Kollagen vom Typ
I.
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In
einer Ausführungsform
stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Aufreinigung
von Kollagen bereit, bei dem man: eine kollagenhaltige Probe, ein
erstes und zweites proteolytisches Enzympräparat und ein Reduktionsmittel
bereitstellt; die Kollagenprobe mit dem ersten proteolytischen Enzympräparat in
Kontakt bringt und so zu einer ersten Kollagenlösung gelangt; die erste Kollagenlösung mit
dem Reduktionsmittel in Kontakt bringt und so zu einer zweiten Kollagenlösung gelangt;
die zweite Kollagenlösung
mit dem zweiten proteolytischen Enzympräparat in Kontakt bringt und
so zu aufgereinigtem Kollagen gelangt. Das erste und zweite proteolytische
Enzympräparat
enthält
Papain.
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In
einer alternativen Ausführungsform
umfasst das erfindungsgemäße Verfahren
ferner den Schritt der Entepithelialisierung der Probe, bevor sie
mit dem ersten proteolytischen Enzympräparat in Kontakt gebracht wird.
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In
einer alternativen Ausführungsform
des erfindungsgemäßen Verfahrens
stammt das Reduktionsmittel aus der Gruppe Natriumsulfid, Dithiothreitol,
Glutathion und Natriumborhydrid. In einer bevorzugten Ausführungsform
enthält
das Reduktionsmittel Natriumborhydrid.
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In
einer weiteren Ausführungsform
umfasst das erfindungsgemäße Verfahren
den weiteren Schritt, dass das aufgereinigte Kollagen mit einem
Entlipidisierungsmittel in Kontakt gebracht wird und man so zu entlipidisiertem
Kollagen gelangt. In einer bevorzugten Ausführungsform dieses Verfahrens
ent hält
das Delipidisierungsmittel ein Gemisch aus Chloroform und Methanol.
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In
einer besonders bevorzugten Ausführungsform
umfasst das erfindungsgemäße Verfahren
ferner die folgenden Schritte: Verpressen des entlipidisierten Kollagens
zu Presskollagen; Entwässern
des Presskollagens, wodurch man zu entwässertem Kollagen gelangt sowie
Dispergieren und Trocknen des entwässerten Kollagens, wodurch
man Kollagenfasern erhält.
In dieser Ausführungsform
der erfindungsgemäßen Verfahren werden
die Kollagenfasern also getrocknet.
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In
einer anderen alternativen Ausführungsform
umfasst das erfindungsgemäße Verfahren
den Schritt, dass man entlipidisiertes Kollagen mit einem Phosphorylierungsmittel
in Kontakt bringt und so zu phosphoryliertem Kollagen gelangt. In
einer bevorzugten Ausführungsform
stammt das Phosphorylierungsmittel aus der Gruppe Natriumtrimetaphosphat,
Natriumhexametaphosphat, Natriumultraphosphat, Natriumtetrametaphosphat,
Phosphorsäureanhydrid
und Phosphoryltrichlorid. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform
enthält
das Phosphorylierungsmittel Natriumtrimetaphosphat. In einer alternativ
bevorzugten Ausführungsform enthält das auf
gereinigte Kollagen CollagenPROTM.
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In
einer Ausführungsform
stellt die vorliegende Erfindung aufgereinigtes Kollagen bereit,
das aufgereinigt wurde, indem man: eine kollagenhaltige Probe, ein
erstes und zweites proteolytisches Enzympräparat, wobei beide dieser proteolytischen
Enzympräparate
Papain enthalten, und ein Reduktionsmittel bereitstellt; die Kollagenprobe
mit dem ersten proteolytischen Enzympräparat in Kontakt bringt und
so zu einer ersten Kollagenlösung
gelangt; die erste Kollagenlösung
mit dem Reduktionsmittel in Kontakt bringt und so zu einer zweiten
Kollagenlösung
gelangt; die zweite Kollagenlösung
mit dem zweiten proteolytischen Enzympräparat in Kontakt bringt und
so zu aufgereinigtem Kollagen gelangt.
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Ferner
ist vorgesehen, dass das aufgereinigte Kollagen aus zusätzlichen
Verbindungen besteht, einschließlich
aber ohne Einschränkung
antimikrobielle Mittel, antivirale Mittel, Wachstumsfaktoren, dehydratationverhindernde
Verbindungen, antiseptische Mittel oder andere Verbindungen, die
sich für
biomedizinische und/oder veterinärmedizinische
Anwendungen eignen.
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Die
vorliegende Erfindung stellt auch eine alternative Ausführungsform
bereit, die Verfahren zur Produktion von biokompatiblem Kollagen
umfasst, bei dem man: eine kollagenhaltige Probe, ein erstes und
zweites proteolytisches Enzympräparat,
wobei beide dieser proteolytischen Enzympräparate Papain enthalten, und ein
Reduktionsmittel, ein Entlipidisierungsmittel und ein Phosphorylierungsmittel
bereitstellt; die Kollagenprobe mit dem ersten proteolytischen Enzympräparat in
Kontakt bringt und so zu einer ersten Kollagenlösung gelangt; die erste Kollagenlösung mit
dem Reduktionsmittel in Kontakt bringt und so zu einer zweiten Kollagenlösung gelangt;
die zweite Kollagenlösung
mit dem zweiten proteolytischen Enzympräparat in Kontakt bringt und
so zu einer proteolysierten Kollagenlösung gelangt; die proteolysierte
Kollagenlösung
mit dem Entlipidisierungsmittel in Kontakt bringt und so zu entlipidisiertem
Kollagen gelangt und das entlipidisierte Kollagen mit dem Phosphorylierungsmittel
in Kontakt bringt und so zu phosphoryliertem Kollagen gelangt.
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In
einer alternativen Ausführungsform
umfasst das erfindungsgemäße Verfahren
ferner den Schritt der Entepithelialisierung der Probe, bevor sie
mit dem ersten proteolytischen Enzympräparat in Kontakt gebracht wird.
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In
einer alternativen Ausführungsform
des erfindungsgemäßen Verfahrens
stammt das Reduktionsmittel aus der Gruppe Natriumsulfid, Dithiothreitol,
Glutathionin und Natriumborhydrid. In einer bevorzugten Ausführungsform
enthält
das Reduktionsmittel Natriumborhydrid.
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In
einer alternativen Ausführungsform
enthält
das Entlipidisierungsmittel ein Gemisch aus Chloroform und Methanol.
In einer weiteren Ausführungsform
stammt das Phosphorylierungsmittel aus der Gruppe Natriumtrimetaphosphat,
Natriumhexametaphosphat, Natriumultraphosphat, Natriumtetrametaphosphat,
Phosphorsäureanhydrid
und Phosphoryltrichlorid. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform
enthält
das Phosphorylierungsmittel Natriumtrimetaphosphat.
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In
einer weiteren Ausführungsform
umfasst das erfindungsgemäße Verfahren
ferner die folgenden Schritte: Verpressen des entlipidisierten Kollagens
zu Presskollagen; Entwässern
des Presskollagens, wodurch man zu entwässertem Kollagen gelangt sowie
Dispergieren und Trocknen des entwässerten Kollagens, wodurch
man Kollagenfasern erhält.
In dieser Ausführungsform
der erfindungsgemäßen Verfahren
werden die Kollagenfasern also getrocknet.
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In
einer besonders bevorzugten Ausführungsform
umfasst das Verfahren ferner den Schritt der Filtersterilisierung
des entlipidisierten Kollagens, bevor das entlipidisierte Kollagen
mit dem Phosphorylierungsmittel in Kontakt gebracht wird, um zu
phosphoryliertem Kollagen zu gelangen.
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Die
vorliegende Erfindung stellt ferner gereinigtes Kollagen bereit,
so dass es biokompatibel ist. In dieser Ausführungsform wird das biokompatible
Kollagen hergestellt, indem man: eine kollagenhaltige Probe, ein erstes
und zweites proteolytisches Enzympräparat, wobei beide diese proteolytischen
Enzympräparate
Papain enthalten, und ein Reduktionsmittel, ein Entlipidisierungsmittel
und ein Phosphorylierungsmittel bereitstellt; die Kollagenprobe
mit dem ersten proteolytischen Enzympräparat in Kontakt bringt und
so zu einer ersten Kollagenlösung
gelangt; die erste Kollagenlösung
mit dem Reduktionsmittel in Kontakt bringt und so zu einer zweiten
Kollagenlösung
gelangt; die zweite Kollagenlösung
mit dem zweiten proteolytischen Enzympräparat in Kontakt bringt und
so zu einer proteolysierten Kollagenlösung gelangt; die proteolysier te
Kollagenlösung
mit dem Entlipidisierungsmittel in Kontakt bringt und so zu entlipidisiertem
Kollagen gelangt und das entlipidisierte Kollagen mit dem Phosphorylierungsmittel
in Kontakt bringt und so zu phosphoryliertem Kollagen gelangt. In einer
bevorzugten Ausführungsform
enthält
das phosphorylierte Kollagen CollagenPROTM.
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In
einer weiteren bevorzugten Ausführungsform
enthält
das biokompatible Kollagen einen Film oder eine Membran, während in
anderen bevorzugten Ausführungsformen
das biokompatible Kollagen einen Feststoff enthält, während in anderen alternativ
bevorzugten Ausführungsformen
das biokompatible Kollagen eine Lösung enthält. In anderen Ausführungsformen
ist das biokompatible Kollagen ein getrockneter Film, der vor seinem
Auftrag entwässert
wird.
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Ferner
ist vorgesehen, dass das biokompatible Kollagen aus zusätzlichen
Verbindungen besteht, einschließlich
aber ohne Einschränkung
antimikrobielle Mittel, antivirale Mittel, Wachstumsfaktoren, dehydratationverhindernde
Verbindungen, antiseptische Mittel oder andere Verbindungen, die
sich für
biomedizinische und/oder veterinärmedizinische
Anwendungen eignen.
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Die
vorliegende Erfindung sieht auch die Verwendung des gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren auf
gereinigten Kollagens zur Herstellung eines Arzneimittels vor, um
bei einer blutenden Wunde ein Stillen der Blutung zu erzielen.
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Die
vorliegende Erfindung sieht auch die Verwendung des wie oben beschrieben
aufgereinigten Kollagens zur Herstellung eines Arzneimittels für die Behandlung
einer Transplantationsstelle vor.
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BESCHREIBUNG
DER FIGUREN
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1 ist
ein Fließdiagramm
einer Ausführungsform
des Twice Treatment ProcessTM (TTPTM).
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2 ist
ein Diagramm, das die Phosphorylierung von Serin zu Phosphoserin
zeigt.
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3 ist
ein Balkendiagramm, das die Wundheilungseigenschaften verschiedener
Kollagenpräparate zeigt.
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4 ist
eine graphische Darstellung der Wundheilungseigenschaften und der
Blutgerinnungszeiten verschiedener Präparate.
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BESCHREIBUNG
DER ERFINDUNG
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Die
vorliegende Erfindung betrifft Verfahren zur Herstellung von Kollagen
aus Geweben von Menschen oder anderen Tieren. Insbesondere stellt
die Erfindung Verfahren zur Herstellung von Kollagen für biomedizinische,
veterinärmedizinische
und andere Anwendungen bereit.
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Die
vorliegende Erfindung wurde entwickelt, um sich mit den Problemen
zu befassen, die sich im Zusammenhang mit den häufig verwendeten Kollagenpräparaten
ergeben. Die vorliegende Erfindung beruht zum Teil auf der Entdeckung,
dass Kollagen so hergestellt werden kann, dass alle nichtkollagenen
Materialien entfernt werden, während
die native molekulare quaternäre
Struktur und andere charakteristische Merkmale von Kollagen (z.
B. Länge,
Durchmesser und Periodizität
von Fibrillen von Kollagen Typ 2 wie oben beschrieben) beibehalten
werden.
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Die
erfindungsgemäßen Verfahren
erleichtern die enzymatische Entfernung aller fremden Materialien, während die
nativen Kollagenmoleküle
in ihrer ursprünglichen
Faserkonfiguration erhalten bleiben. Die erfindungsgemäßen Verfahren
können
zur Herstellung von hochgereinigtem Kollagen aus verschiedenen tierischen
Quellen (einschließlich
menschliche Quellen) verwendet werden, da die meisten, wenn nicht
sogar alle, konjugierten Proteolipide und Phospholipide, die das
Ursprungskollagen verunreinigen, durch die Verwendung eines bestimmten Gemisches
aus organischen Lösungsmitteln
entfernt werden. In verschiedenen Ausführungsformen weist das erfindungsgemäße hergestellte
Kollagen bessere Wundheilungs- und hämostatische Eigenschaften auf
als frühere
entwickelte Kollagenpräparate.
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Im
Gegensatz zu den früher
berichteten enzymatischen Verfahren, in denen Papain verwendet wurde (z.
B. US-Patent Nr. 3.529.530 und 5.316.942) für Kollagenpräparate,
verwenden die erfindungsgemäßen Verfahren
ein aus zwei Schritten bestehendes Enzymbehandlungsverfahren. In
einer Ausführungsform
werden die Kollagenpolymere in dem erfindungsgemäßen, aus zwei Schritten bestehenden
Behandlungsverfahren („Twice
Treatment ProcessTM" oder „TTPTM") nicht-entzündlich durch
Verfahren, in denen Papain zusammen mit Oxidations- und Reduktionsmitteln
eingesetzt wird. „Zwei
Behandlungen" bezieht
sich dabei auf die Verwendung von Papain in zwei Schritten: eine
erste proteolytische Behandlung wird durchgeführt, gefolgt von einer Behandlung
mit einem Reduktionsmittel, auf die dann eine zweite proteolytische
Behandlung folgt. In besonders bevorzugten Ausführungsformen folgt in diesem
Verfahren dann die Entfernung von Proteolipiden und Phospholipiden
mit einer Lösung
aus Chloroform und Methanol. In weiteren Ausführungsformen wird das Kollagen
durch unterschiedliche Grade kontrollierter Phosphorylierung biologisch
aktiviert.
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Die
Verwendung von Papain wurde als sicheres Mittel zur Behandlung von
Kollagen für
menschlichen Gebrauch vorgesehen, weil es traditionell in der Lebensmittelindustrie
und in Verbindung mit Wundreinigungsmitteln eingesetzt wird. Im
Vergleich mit Pepsin, dem Enzym, das am häufigsten für die Herstellung von Kollagen
für biomedizinische
Anwendungen verwendet wird, wurden mit Papain bessere Ergebnisse
im Hinblick auf verringerte Immunogenität erhalten. Papain ist ein
Enzym, das aus der Papaya extrahiert wird und kann bekanntlich die
Disulfidbindungen oder Cystein aufbrechen. Da viele immunogene Moleküle Cystindisulfid-Bindungen
enthalten, kann Papain verwendet werden, um diese Moleküle abzubauen
und sie nicht-immunogen zu
machen. Beispielsweise kann Papain zahlreiche natürlich vorkommende
Proteine und Peptide sowie Benzoylaminosäureester abbauen (siehe z.
B. Smith und Kimmel, Enzymes, The, Band 4, 2. Ausgabe, Academic Press,
NY, Seite 138 (1960)). Darüber
hinaus soll Papain eine lytische Wirkung auf Elastin, einer der
Verunreinigungen, die sich nur schwer aus aufgereinigtem Kollagen
entfernen lässt,
haben (siehe z. B. Coulson, Biochim. Biophys. Acta 237: 378 (1971);
und Smith et al., Nature 198: 1311 (1963)).
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Erste
Versuche mit einer einstufigen Behandlung mit Papain zur Entfernung
von immunogenen Stellen aus Kollagen waren im Hinblick auf die Veränderung
der Leistung von aufgereinigtem Kollagen in vivo größtenteils
erfolglos (siehe Beispiel 3 unten). Diese Beobachtungen führten zur
Entwicklung der erfindungsgemäßen Verfahren,
die zum Aufbrechen und Lockern der natürlichen Vernetzungen der Kollagenfasern
(z. B. Aldol-Kondensation)
führen.
Auf diese Weise hat das in der zweiten Behandlung verwendete Papain
(d. h. Papain wird in zwei Behandlungsschritten verwendet) Zugang
zu den meisten, oder sogar allen Oberflächen der Kollagenmoleküle, wodurch
die Freisetzung von eingeschlossenen immunogenen Stellen aus dem
Kollagenpräparat
erleichtert wird. Diese Entwicklungen führten zu einer erfindungsgemäßen Ausführungsform,
bei der Papain in zwei bestimmten Stadien des Verfahrens eingesetzt
wird (d. h. vor und nach der Behandlung des Kollagens mit einem
Reduktions- und/oder Auffaltungsmittel). Diese Verfahren stellen
somit ein Mittel zur Produktion von hochreinem und nicht-immunogenem Kollagen
bereit.
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In
einer bevorzugten Ausführungsform
ist ein Entlipidisierungsverfahren vorgesehen, in dem Lösungsmittel
zur Entfernung von Proteolipiden und Phospholipiden verwendet werden.
Frühe Versuche
zur Entfernung dieser Verbindungen aus Kollagen mit einem einzelnen
organischen Lösungsmittel(n),
wie z. B. Ether, Aceton, Ethanol, Isopropylalkohol usw., konnten
nicht alle Proteolipide oder konjugierte Lipide wie Proteolipide wirksam
entfernen (siehe Beispiel 4). Deshalb wurde eine einzigartige Technik
entwickelt, in der ein 3 : 1 (v/v) Gemisch aus Chloroform : Methanol
zur Entfernung aller Proteolipide und Phospholipide verwendet wurde.
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In
einer bevorzugten Ausführungsform
kann auf gereinigtes Kollagen durch kovalent bindende Phosphate
zu Hydroxylgruppen von hydroxylierten Aminosäuren chemisch modifiziert werden,
wie dies in Beispiel 6 gezeigt wird. Obwohl sie für das Verständnis der
vorliegenden Erfindung nicht notwendig ist, beinhaltet diese Reaktion
wahrscheinlich die kovalente Bindung von Phosphat an die Hydroxylgruppe
von Serin, Tyrosin und/oder Threonin, Hydroxylysin und Hydroxyprolin.
Die Reaktion verläuft
kontrolliert, um den Reaktionsgrad einzuschränken. Am Ende dieses Schritts
können
reaktive Gruppen, die möglicherweise
noch im Kollagen zurückgeblieben
sind, vollständig
zu Phosphoryl, Hydroxyl- oder Sulfonylgruppen umgewandelt werden,
indem sie mit Trimetaphosphat oder anderen Wirkstoffen in Kontakt
gebracht werden. Das Endprodukt mit unterschiedlichen Graden der
chemischen Modifikation oder ohne Modifikation, das in einem physiologischen
Puffer entweder löslich
oder unlöslich
ist, eignet sich für
zahlreiche Anwendungen. Auf diese Weise kann das aufgereinigte Produkt
auf bestimmte Verwendungszwecke abgestimmt werden. Beispielsweise
können
bioaktive Reaktionen durch Reaktion des Kollagens mit linearen oder
zyklischen Polyphosphaten bei alkalischem pH gefördert werden.
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Das
endgültige
Kollagenpräparat
kann als Lösung
oder Feststoff verwendet werden und eignet sich für zahlreiche
Zwecke, einschließlich
aber ohne Einschränkung
für biologische
Implantate, Prothesen, Transplantate und die Freisetzung von Arzneimitteln.
Ferner ist vorgesehen, dass es sich als chirurgisches Hilfsmittel
während
Transplantationen und zur Verhinderung von postoperativem Lösen eines
Implantats, als Hämostatikum,
zur Verstärkung
von Weichteilen und als Unterstützung
für das
Zellwachstum in vitro (d. h. in Zellkulturen) eignet.
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Bei
der Verwendung als Hämostatikum
eignet sich das gemäß den erfindungsgemäßen Verfahren
hergestellte Kollagen insbesondere zur Kontrolle von Blutungen aus
Oberflächen,
insbesondere großen
Oberflächen.
Beispielsweise kann das erfindungsgemäße Kollagen als Hämostatikum
auf durchschnittenen oder durchtrennten Knochen, Organen (z. B.
Milz, Leber oder Nieren mit chirurgischen oder traumatischen Schnittwunden),
dem zentralen Nervensystem mit seiner großen Anzahl kleiner Blutgefäße, bei
prothetischen Operationen, auf nässenden
Flächen
infolge der chirurgischen Abtragung von nekrotischem Gewebe, in
der kosmetischen Chirurgie und auf allen Oberflächen, aus denen Blut aus einer
oder mehreren Quellen austritt (z. B. Schnittwunden im Gesicht)
verwendet werden. Dieses hämostatische
Kollagenpräparat
kann in unterschiedlichen Formen aufgebracht werden (z. B. als Pulver
direkt auf die Oberfläche;
als blutstillendes Mittel in Stiftform; als Gel, Schwamm oder in
Stoffform). Die verwendete Menge des hämostatischen Kollagenpräparats schwankt
je nach Blutungsgrad, zu behandelnder Fläche und Stärke des Blutflusses: die einzige
Erfordernis ist, dass die gewünschte
Kontrolle erzielt wird.
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Definitionen
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Zum
besseren Verständnis
der Erfindung werden unten einige Begriffe erläutert.
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Die
Begriffe „Untersuchungsmaterial" oder „Probe" werden in der vorliegenden
Erfindung und den Ansprüchen
untereinander austauschbar und im breitesten Sinn verwendet. Einerseits
umfassen sie ein klinisches Untersuchungsmaterial (d. h. eine Probe)
oder eine Kultur (z. B. mikrobiologische Kulturen). Andererseits
umfassen sie sowohl biologische als auch Umweltproben. Biologische
Proben können
tierische, einschließlich
menschliche, Flüssigkeiten
oder Gewebe, Nahrungsmittel oder Inhaltsstoffe sein. Diese Beispiele sollen
aber die für
die vorliegende Erfindung geltenden Probentypen nicht einschränken.
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Die „nichtmenschlichen
Tiere" der Erfindung
sind alle Tiere außer
Menschen. Solche nichtmenschlichen Tiere sind Wirbeltiere, wie z.
B. Nagetiere, nichtmenschliche Primaten, Schafe, Rinder, Wiederkäuer, Lagomorphen,
Schweine, Pferde, Hunde, Katzen, Vögel usw. Es ist zwar nicht
vorgesehen, dass die vorliegende Erfindung auf ein bestimmtes Tier
beschränkt
wird, aber bevorzugte nichtmenschliche Tiere sind Vieh, wie z. B.
Rinder und Schafe.
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Wie
hierin verwendet bezieht sich der Begriff „Prokollagen" auf das Vorläuferprotein,
das in der extrazellulären
Matrix unter Bildung von Kollagen aufgespalten wird. Insbesondere
bezieht sich Prokollagen auf „pro-α-Ketten", die Vorläufer der
Kollagen α-Ketten
sind. Pro-α-Ketten
enthalten „Pro-Peptide", die für die Bildung
der Dreifachhelixgestalt von Prokollagen wichtig sind.
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Wie
hierin verwendet bezieht sich der Begriff „Kollagen" auf die extrazelluläre Familie der faserigen Proteine,
die durch ihre steife, spiralförmige
Dreifachstrang-Struktur gekennzeichnet sind. Drei Kollagen-Polypeptid-Ketten
(„α-Ketten") sind umeinander
gewickelt, um dieses spiralförmige
Molekül
zu bilden. Der Begriff umfasst auch die verschiedenen Arten von
Kollagen, aber die bevorzugte Form ist Kollagen Typ I.
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Wie
hierin verwendet bezieht sich der Begriff „Kollagenprobe" auf jede Kollagenquelle,
einschließlich aber
ohne Einschränkung
Häute,
Haut, Sehnen, Blutgefäße, Darm,
Leber, Milz, Herzklappe, Knochen usw. Die Quelle der Kollagenprobe
soll nicht auf eine bestimmte Gewebequelle oder eine bestimmte Gewebeart
beschränkt
werden. Die einzige Anforderung ist, dass die Kollagenprobe den
Kollagentyp enthält,
der aufgereinigt werden soll (z. B. Kollagen Typ I). Die vorliegende
Erfindung soll aber nicht auf eine bestimmte Art von aufgereinigtem
Kollagen beschränkt
werden.
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Wie
hierin verwendet bezieht sich der Begriff „Kollagenfibrillen" auf die langen dünnen Polymere
von Kolla gen, die zu Bündeln
gruppiert sind und als „Kollagenfasern" bezeichnet werden.
Die „Kollagenmatrix" bezieht sich auf
eine extrazelluläre
Kollagenmatrix mit der charakteristischen periodischen Querstreifung,
die unter dem Elektronmikroskop zu erkennen sein kann. Charakteristisch
wird die Kollagenmatrix gebildet, wenn normale Kollagenmoleküle in einer
viertelversetzten Anordnung in einer dreidimensionalen Struktur
angeordnet werden, die unter dem Elektronenmikroskop als 67nm-Streifung erscheint.
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Wie
hierin verwendet bezieht sich der Begriff „Presskollagen" auf eine Kollagenprobe,
die durch Aufbringen von Druck gepresst wurde. In bevorzugten Ausführungsformen
ist das zu pressende Kollagen nasses mit TTPTM behandeltes
und entlipidisiertes Kollagen. Diese Kompression kann mit jedem
Mittel durchgeführt werden
(d. h. Handpressen oder Pressmaschinen). Diese Kompression soll
eine Reihe von Drücken
im Bereich von 5.000 bis 50.000 Pfund pro Quadrat-Inch (psi) der
Probe (34474–344740
kPa) umfassen. In bevorzugten Ausführungsformen beträgt der aufgebrachte
Druck ca. 9.000 (62052 kPa), während
in anderen bevorzugten Ausführungsformen
der aufgebrachte Druck ca. 30.000 (206841 kPa) beträgt. In besonders
bevorzugten Ausführungsformen
wird das gepresste Kollagen zu einem Presskuchen geformt.
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Wie
hierin verwendet bezieht sich der Begriff „entwässertes Kollagen" auf eine Kollagenprobe,
die mit einer beliebigen allgemein bekannten Methode aus dem Stand
der Technik entwässert
wurde. In bevorzugten Ausführungsformen
wird entwässertes
Kollagen durch Lyophilisierung oder Desikkation hergestellt.
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Wie
hierin verwendet bezieht sich der Begriff „Trocknung" auf jedes Verfahren zur Entfernung
von Wasser aus einer Probe. Der Begriff soll auch Verfahren einschließlich, aber
ohne Einschränkung,
Lufttrocknung und Erwärmung
beinhalten.
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Wie
hierin verwendet bezieht sich der Begriff „Dispergierung" auf die mechanische
Trennung einer Probe. Der Begriff soll zum Beispiel die Trennung
der Komponenten beinhalten, die in einem Kuchen aus gepresstem Kollagen
enthalten sind. In dieser Ausführungsform
sind die Komponenten des Presskuchens zu Fasern dispergiert. In
bevorzugten Ausführungsformen
wird das Kollagen gerührt
und in einer Flüssigkeit
suspendiert. Diese Fasern enthalten Kollagenfasern wie oben beschrieben
(d. h. Bündel
von Kollagenfibrillen). Somit soll diese Definition sowohl native
als auch getrocknete Kollagenfasern umfassen.
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Wie
hierin verwendet bezieht sich der Begriff „Hämostatikum" auf ein Mittel, das den Blutfluss stoppt oder
bremst.
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Wie
hierin verwendet bezieht sich der Begriff „proteolytisches Mittel" auf Papain, das
mit Kollagen assoziierte Proteine abbauen kann, aber Kollagen Typ
I in seiner nativen Konfiguration lässt. In einigen Ausführungsformen
ist aber vorgesehen, dass das proteolytische Mittel die mit den
Kollagenfasern verbundenen Vernetzungen in Kollagen aufbricht. Auf
diese Weise werden Vernetzungen zwischen den Strängen in den Fasern gelockert,
so dass die Fasern ihre Grundform behalten, aber ausreichend Raum
zwischen den Fasern bleibt, dass Moleküle, die normalerweise in der
Kollagenfaserstruktur eingeschlossen sind, entfernt werden können.
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Wie
hierin verwendet bezieht sich der Begriff „proteolysiertes Kollagen" auf Kollagen, das
mit mindestens einem proteolytischen Enzym behandelt wurde.
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Wie
hierin verwendet bezieht sich der Begriff „auf gereinigt" auf die Entfernung
von Verunreinigungen aus einer Probe. Beispielsweise soll er proteolysiertes
Kollagen umfassen. Der Begriff soll nicht auf einen bestimmten Reinheitsgrad
beschränkt
werden. In bevorzugten Ausführungsformen
wird die auf gereinigte Probe aber mit proteolytischen Enzymen behandelt.
In besonders bevorzugten Ausführungsformen
wurde die aufgereinigte Probe anschließenden Behandlungen unterworfen, einschließlich aber
ohne Einschränkung
einer Entlipidisierung und/oder Phosphorylierung.
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Wie
hierin verwendet bezieht sich der Begriff „Reduktionsmittel" auf jede Verbindung
oder Verbindungsgemisch, die bzw. das eine andere Verbindung reduzieren
kann. In diesem Verfahren wird der Anteil an Wasserstoff erhöht, während der
Anteil an Sauerstoff verringert wird und die Anzahl Mehrfachbindungen
verringert wird. Insbesondere soll der Begriff jedes Mittel umfassen,
das Protein aus ihren nativen Konfigurationen durch Aufbrechen der
Disulfidbindungen entfalten kann. Solche Mittel beinhalten, ohne
aber darauf beschränkt zu
sein, Verbindungen wie z. B. Natriumsulfid, Dithiothreitol, Glutathion
und Natriumborhydrid. Der Begriff „reduziertes Kollagen" bezieht sich auf
Kollagen, das mit mindestens einem Reduktionsmittel in Kontakt gebracht oder
behandelt wurde.
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Wie
hierin verwendet bezieht sich der Begriff „Phosphorylierungsmittel" auf jede Verbindung
oder Verbindungsgemisch, die bzw. das eine andere Verbindung phosphorylieren
kann. Solche Verbindungen umfassen, ohne aber darauf beschränkt zu sein,
Natriumtrimetaphosphat, Natriumhexametaphosphat, Natriumultraphosphat,
Natriumtetrametaphosphat, Phosphorsäureanhydrid und Phosphoryltrichlorid.
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Wie
hierin verwendet bezieht sich der Begriff „phosphoryliertes Kollagen" auf Kollagen, das
zur Erhöhung
der Anzahl phosphorylierter Aminosäuren in den Kollagenmolekülen behandelt
wurde. Der Begriff soll eine Reihe von Phosphorylierungen umfassen,
von einer minimalen Phosphorylierung (d. h. nur eine Aminosäure wurde
phosphoryliert) bis zu einer maximalen Phosphorylierung (d. h. alle
Aminosäuren,
die für
die Phosphorylierung zur Verfügung
stehen und geeignet sind, wurden phosphoryliert) oder jeder Grad
von Phosphorylierung innerhalb dieses Bereiches.
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Wie
hierin verwendet bezieht sich der Begriff „Entlipidisierungsmittel" auf jede Verbindung
oder Verbindungsgemisch, die bzw. das Lipideinheiten entfernen (d.
h. entlipidisieren) kann. Insbesondere soll der Begriff Substanzen
umfassen, die Moleküle,
einschließlich
aber ohne Einschränkung
Phospholipide, neutrale Lipide, Proteolipide und Glykolipide, aus
Kollagen entfernen können.
Solche Substanzen beinhalten organische Lösungsmittel wie Chloroform
und Methanol. Der Begriff „entlipidisiertes
Kollagen" bezieht
sich auf Kollagen, das mit mindestens einem Entlipidisierungsmittel
in Kontakt gebracht oder behandelt wurde. In besonders bevorzugten
Ausführungsformen
ist das Entlipidisierungsmittel ein Gemisch aus Chloroform und Methanol
im Verhältnis
3 : 1.
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Wie
hierin verwendet bezieht sich der Begriff „Alkali" auf ein Hydroxyid eines Alkalimetalls
(z. B. Lithium, Natrium, Kalium, Rubidium, Cäsium und Francium). Er umfasst
auch Substanzen, die eine alkalische Lösung (pH > 7) in Wasser liefern (z. B. CaO, Ca(OH)2 und Na2CO3).
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Wie
hierin verwendet bezieht sich der Begriff „modifiziertes Kollagen" auf Kollagen, das
durch Mittel wie Phosphorylierung, Fluorierung, Halogenierung (z.
B. Chlorierung), Sulfonierung und/oder Hydroxylierung chemisch modifiziert
wurde.
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Wie
hierin verwendet bezieht sich der Begriff „filtersterilisiert" auf eine Probe,
die auf einen Filter aufgebracht wurde, um unerwünschte Verunreinigungen wie
z. B. Bakterien aus der Probe zu entfernen.
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Wie
hierin verwendet bezieht sich der Begriff „Entepithelialisierung" auf das Verfahren
der Entfernung von Epithelgewebe und/oder Zellen aus einer Probe.
Der Begriff „Epithel" betrifft das Epithel,
d. h. die zelluläre Abdeckschicht
der internen und externen Körperoberflächen.
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Wie
hierin verwendet bezieht sich der Begriff „biokompatibles Kollagen" auf Kollagen, das
sich für
biomedizinische oder ve terinärmedizinische
Anwendungen eignet, einschließlich
aber ohne Einschränkung
Prothesen und Implantate.
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Wie
hierin verwendet bezieht sich der Begriff „Biomolekül" auf jedes Molekül, das biomedizinisch oder veterinärmedizinisch
angewendet werden kann. Beispielsweise soll der Begriff verschiedene
Verbindungen und Substanzen umfassen, einschließlich Kollagen, synthetische
Polymere oder andere Materialien, die sich zur Implantation, Transplantation
und/oder Grafting eignen.
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Der
Begriff „Graft/Prothese" bezieht sich auf
jedes Gewebe oder Organ zur Implantation oder Transplantation und
auf das Verfahren zur Implantation oder Transplantation dieses Gewebes.
Beispielsweise ist ein Hauttransplantat ein Stück Haut oder anderes Gewebe
oder Material, das transplantiert wird, um einen verlorenen Hautteil
zu ersetzen. Der Begriff soll auch Materialien, wie z. B. aufgereinigtes
Kollagen oder andere geeignete biokompatible Substanzen zum Ersatz
von verlorenen oder beschädigten
Geweben oder Organen umfassen. Insbesondere bezieht sich der Begriff „Graft" hierin auf den Ersatz
von Haut oder anderen Geweben oder Organen, die der Umgebung ausgesetzt
sind. Beispielsweise kann der Begriff sich auf Gewebe wie Haut, Kutangewebe,
Schleimhäute,
Bindehaut usw. beziehen. Der Begriff soll aber nicht auf eine bestimmte
Gewebeart beschränkt
sein.
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Der
Begriff „Transplantat" bezieht sich auf
Gewebe, das für
Grafting, Implantation oder Transplantation verwendet wird aber
auch auf den Transfer von Geweben von einer Körperstelle an eine andere,
oder auf den Transfer von Geweben von einer Person zu einer anderen,
oder auf die Einführung
von biokompatiblen Materialien in oder auf den Körper. Der Begriff „Transplantation" bezieht sich auf
die Transplantation von Gewebe von einem Körperteil auf einen anderen
oder auf eine andere Person. Das Gewebe oder Organ, das für die Transplantation
oder das Grafting verwendet wird, soll aber auch Materialien wie
z. B. Kollagen, das nach den erfindungsgemäßen Verfahren auf gereinigt
wurde, umfassen. Das Graft oder Transplantat soll daher nicht auf natürlich vorkommende
Gewebe beschränkt
sein.
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Wie
hierin verwendet bezieht sich der Begriff „Implantation" auf die Einführung eines
Organs oder Gewebes in eine neue Körperstelle sowie die Einführung von
biokompatiblem, biologischem, lebendem, inertem oder radioaktivem
Material in den Körper.
Der Begriff „implantieren" bezieht sich auf
das Verfahren des Einführens
oder Transplantieren von Gewebe, inertem, lebendem, radioaktivem
oder biokompatiblem Material in intakte Gewebe oder eine Körperhöhle, sowie
auf das so eingesetzte oder transplantierte Material.
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Wie
hierin verwendet bezieht sich der Begriff „Lappen" auf eine Gewebemasse zum Transplantieren, in
der Regel Haut, die nur teilweise von einem Teil des Körpers entfernt
wird, so dass sie während
der Überführung zu
einer anderen Körperstelle
oder einer anderen Person ihre eigene Blutversorgung behält. Der
Begriff soll auch Gewebemassen für
die Transplantation oder Implantation umfassen, die vor ihrer Transplantation
oder Implantation in vitro gezüchtet
wurden.
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VERSUCHE
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Die
folgenden Beispiele sollen bestimmte bevorzugte Ausführungsformen
und Aspekte der vorliegenden Erfindung zeigen und weiter veranschaulichen,
aber den Umfang nicht einschränken.
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In
den folgenden Versuchen gelten folgende Abkürzungen: Eq (Äquivalente);
M (molar); μM
(mikromolar); N (normal); mol (Mol); mmol (Millimol); μmol (Mikromol);
nmol (Nanomol); g (Gramm); mg (Milligramm); μg (Mikrogramm); ng (Nanogramm);
l (Liter); ml (Milliliter); μl
(Mikroliter); cm (Zentimeter); mm (Millimeter); μm (Mikrometer); nm (Nanometer);
A (Ångström); xg oder × g (mal
Schwerkraft); w/w (Gewicht zu Gewicht); w/v (Gewicht zu Volumen); °C (Grad Celsius);
U/min (Umdrehungen pro Minute); physiologische Kochsalzlösung (0,9% NaCl-Lösung, pH
6.2 ± 0.3);
Harlan Sprague Dawley (Harlan Sprague Dawley. Inc., Madison, WI);
Fisher (Fisher Scientific, Pittsburgh, PA); Sigma (Sigma Chemical
Co., St. Louis, MO); Aldrich (Aldrich Chemical Company. Inc., Milwaukee,
WI); Spectrum (Spectrum Chemicals, Inc., Gardena, CA); American
(American Dade, Division of American Hospital Supply Co., Dade,
FL); PDL (Protein Design Laboratories, Mountain View, CA); Nitabell
Rabittry (Nitabell Rabittry, Hayward, CA); Axygen (Axygen, Inc.,
Hayward, CA); Arizona Health Sciences (Arizona Health Sciences Center,
Tucson, AZ); Collaborative Research (Collaborative Research, Inc., Bedford,
MA); Medchem Products (Medchem Products, Woburn, MA); Collatek (Collatek,
Inc., Plainsboro, NJ); Boehringer Mannheim (Boehringer Mannheim,
Indianapolis, IN); J & J
Medical (J & J
Medical, Inc., Arlington, TX); Axygen (Axygen Inc., Hayward, CA);
Papain Products (Papain Products, Tamilnadu, Indien); Beckman (Beckman
Instruments, Inc., Fullerton, CA); und Brinkmann (Brinkmann Instruments,
Inc., Westbury, NY).
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Sofern
nichts anderes angegeben ist, wurden alle Chemikalien von kommerziellen
Anbietern, wie z. B. Sigma, Fisher oder Spectrum, erhalten. Alle
in diesen Beispielen verwendeten Lösungsmittel stammen von Spectrum
Chemicals und waren für
die Spektrophotometrie oder als Reagenzien bestimmt. Das in diesen
Beispielen verwendete Papain wurde von Sigma oder Papain Products
erhalten.
-
BEISPIEL 1
-
Isolierung
und Aufreinigung von Kollagen mit Papain
-
In
diesem Beispiel wurde Kollagen aus enthaarten Rinderhäuten in
einem einstufigen Enzymbehandlungsverfahren aufgereinigt.
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Zunächst wurden
100 g saubere enthaarte Rinderhaut aus einem örtlichen Schlachthaus in Stücke mit einer
Dicke von ca. 1 cm und einer Länge
von ca. 10 cm gehackt oder geschnitten. Die geschnittenen Scheiben wurden
in drei Liter eines Waschpuf fers gewaschen, der doppelt destilliertes
Wasser mit 30 g NaCl, 3 g ZnCl, 4,5 mg Methylparaben, 0,9 g Propylparaben
enthielt. In einigen Versuchen enthielt der Waschpuffer 30,0 g NaCl,
3 g ZnCl, 4,5 g Methylparaben und 1,5 g Trichlorphenat oder 3 g
Hypochlorit. In den gereinigten Kollagenpräparaten, die diese unterschiedlichen
Waschpuffer verwenden, wurden keine Unterschiede beobachtet. Die
Wäsche
erfolgte 6–8
Stunden bei 5–15°C unter ständigem Rühren mit
einem Rotator (Modell Nr. 4140, American). Der Waschvorgang wurde
zweimal wiederholt, wobei die Flüssigkeit
nach jeder Wäsche
von den Feststoffen abgegossen wurde. Der wiederholte Waschvorgang
entfernte den größten Teil
der Albumine und Globuline, die normalerweise ca. 1–5% des
Trockengewichts der Probe ausmachen.
-
Vor
Verabreichung der Enzymbehandlung wurde die Probe entepithelialisiert.
Bei diesem Verfahren wurde 1 Liter kalter entepithelialisierter
Puffer, der kaltes entionisiertes Wasser mit 24 g NaOH und 56 g
Calciumoxid enthielt, der zuvor gewaschenen Probe hinzugefügt, und
die Probe wurde 15 Minuten bei 5000 × g zentrifugiert, um feste
Materialstücke
zu erhalten. Die Probe wurde auf einem Rotator bei 80–100 U/min
48 Stunden bei 15°C
gerührt.
Die Entepithelialisierungslösung
wurde alle 16 Stunden ersetzt. Am Ende des 48-Stunden-Zeitraums wurden
die Stücke
2 Stunden in 3 Liter entionisiertem Wasser unter Rühren bei
80–100 U/min
eingeweicht und die Feststoffe wurden durch Zentrifugation bei 5000 × g über 15 Minuten
gewonnen. 100 g Borsäure,
gelöst
in 3 Liter entionisiertem Wasser, das auf 4°C vorgekühlt war, wurde hinzugefügt und die
Probe wurde 16 Stunden bei 4°C
gerührt.
Der pH wurde gemessen und auf ca. 8,3 eingestellt. Die Probe wurde
pro Wäsche
2 Stunden zweimal mit je 3 Liter entionisiertem Wasser gewaschen
und die Feststoffe wurden durch Zentrifugation wie oben beschrieben
gewonnen. Obwohl dieses Verfahren in diesem Beispiel verwendet wurde,
gibt es verschiedene verfügbare
Verfahren zur Erzielung der Entepithelialisierung der Proben, die
im Stand der Technik bekannt sind. Jedes dieser Standardverfahren,
die dem Fachmann zur Verfügung stehen,
kann er folgreich zur Erzielung der gewünschten Entepithelialisierung
eingesetzt werden.
-
Nach
der Wäsche
wurde die Probe in einer einstufigen enzymatischen Behandlung mit
Papain behandelt. In diesem Verfahren wurde die Probe 2 Stunden
bei Raumtemperatur weiter in 3 Liter pyrogenfreiem entionisiertem
Wasser gewaschen. Die Probe wurde 15 Minuten bei 5000 × g zentrifugiert
und abgegossen. Ein Liter physiologische Kochsalzlösung wurde
der Probe dann hinzugefügt.
Papain (Sigma oder Papain Products) wurde in einer Rate von 1–2 mg pro
ml Gesamtvolumen (d. h. 1 Liter) unter ständigem Rühren hinzugefügt. Nach
Hinzufügen
von Papain wurde die Lösung
unter Rühren
mit einem Rotator mit 80–100
U/min ca. 16 Stunden bei 37°C
inkubiert.
-
Nach
dieser ersten Enzymbehandlung wurde das überschüssige Wasser abgeschüttet und
die Feststoffe wurden dreimal mit 2 Liter entionisiertem Wasser
gewaschen. Ein Liter 0,2 M Natriumborhydrid wurde dann den gewaschenen
Feststoffen hinzugefügt.
Die Feststoffe wurden 3 Stunden unter Rühren mit einem Rotator bei
80–100
U/min inkubiert. Das überschüssige Wasser
wurde abgegossen und die Feststoffe wurden dreimal mit 2 Liter entionisiertem
Wasser gewaschen.
-
Robuste Behandlung
-
Zusätzlich zur
normalen Enzymbehandlung und anschließender Reduktionsbehandlung
wie oben beschrieben wurde auch eine „Robuste Behandlung" geprüft. In dieser
Behandlung wurde eine im Vergleich mit der „normalen" Behandlung vielfach erhöhte Inkubationszeit
und Enzymkonzentration verwendet. Obwohl die restlichen Schritte
dieselben waren wie für
die normale Behandlung beschrieben (d. h. das in der „Robusten Behandlung" verwendete Kollagen
wurde mit derselben Rinderhaut und denselben Schneid- und Waschschritten
hergestellt), wurde in der Robusten Behandlung 4 mg Papain pro ml
Lösung
hinzugefügt
und im enzymatischen Behandlungsschritt wurde 24 Stunden inku biert,
anstatt 1 mg Papain pro ml Lösung
und 16 Stunden Inkubationszeit.
-
Die
Menge der restlichen Verunreinigungen und Kollagen in dieser Zubereitung
wurde bestimmt und mit den Ergebnissen verglichen, die mit den in
Beispiel 2 beschriebenen Verfahren erhalten wurden.
-
BEISPIEL 2
-
Isolierung
und Aufreinigung von Kollagen Typ I
-
Dieses
Beispiel beschreibt die Verfahren und Aspekte der Entwicklung des „Twice-Treatment
ProcessTM" (TTPTM) einer
Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung.
-
In
diesem Beispiel wird der „Twice-Treatment
ProcessTM" (TTPTM) beschrieben.
In diesem Beispiel wurde Kollagen Typ I aus enthaarter Rinderhaut
auf gereinigt. Zunächst
wurden 100 g saubere enthaarte Rinderhaut aus einem örtlichen
Schlachthaus in Stücke
mit einer Dicke von ca. 1 cm und einer Länge von ca. 10 cm gehackt oder
geschnitten. Die geschnittenen Scheiben wurden in drei Liter eines
Waschpuffers gewaschen, der doppelt destilliertes Wasser mit 30
g NaCl, 3 g ZnCl, 4,5 g Methylparaben, 0,9 g Propylparaben enthielt.
In einigen Versuchen enthielt der Waschpuffer 30,0 g NaCl, 3 g ZnCl,
4,5 g Methylparaben und 1,5 g Trichlorphenat oder 3 g Hypochlorit.
In den gereinigten Kollagenpräparaten,
die diese unterschiedlichen Waschpuffer verwenden, wurden keine
Unterschiede beobachtet. Die Wäsche
erfolgte 6–8
Stunden bei 5–15°C unter ständigem Rühren mit
einem Rotator (Modell Nr. 4140, American) bei 80–100 U/min. Der Waschvorgang
wurde zweimal mit 15-minütiger
Zentrifugation bei 5000 × g
wiederholt, wobei der Überstand
jedes Mal abgegossen wurde. Der wiederholte Waschvorgang entfernte
den größten Teil
der Albumine und Globuline, die normalerweise ca. 1–5% des
Trockengewichts der Probe ausmachen.
-
Vor
Verabreichung der Enzymbehandlung wurde die Probe entepithelialisiert.
Bei diesem Verfahren wurde 1 Liter kalter entepithelialisierter
Puffer, der kaltes entionisiertes Wasser mit 24 g NaOH und 56 g
Calciumoxid enthielt, der zuvor gewaschenen Probe hinzugefügt, und
die Probe wurde 15 Minuten bei 5000 × g zentrifugiert, um feste
Materialstücke
zu erhalten. Die Probe wurde auf einem Rotator bei 80–100 U/min
48 Stunden bei 15°C
gerührt.
Die Entepithelialisierungslösung
wurde alle 16 Stunden ersetzt. Am Ende des 48-Stunden-Zeitraums wurden
die Stücke
2 Stunden in 3 Liter entionisiertem Wasser unter Rühren bei
80–100 U/min
eingeweicht und die Feststoffe wurden durch Zentrifugation bei 5000 × g über 15 Minuten
gewonnen. 100 g Borsäure,
gelöst
in 3 Liter entionisiertem Wasser, das auf 4°C vorgekühlt war, wurde hinzugefügt und die
Probe wurde 16 Stunden bei 4°C
gerührt.
Der pH wurde gemessen und auf ca. 8,3 eingestellt. Die Probe wurde
pro Wäsche
2 Stunden zweimal mit je 3 Liter entionisiertem Wasser gewaschen
und die Feststoffe wurden durch Zentrifugation wie oben beschrieben
gewonnen. Obwohl dieses Verfahren in diesem Beispiel verwendet wurde,
gibt es verschiedene verfügbare
Verfahren zur Erzielung der Entepithelialisierung der Proben, die
im Stand der Technik bekannt sind. Jedes dieser Standardverfahren,
die dem Fachmann zur Verfügung stehen,
kann erfolgreich zur Erzielung der gewünschten Entepithelialisierung
eingesetzt werden.
-
Nach
der Wäsche
wurde die Probe mit TTPTM behandelt. In
diesem Verfahren wurde die Probe 2 Stunden bei Raumtemperatur weiter
in 3 Liter pyrogenfreiem entionisiertem Wasser gewaschen und das
Wasser wurde abgegossen. Ein Liter physiologische Kochsalzlösung wurde
der Probe dann hinzugefügt.
Papain wurde in einer Rate von 1–2 mg pro ml Gesamtvolumen
(d. h. 1 Liter) unter ständigem
Rühren
hinzugefügt.
Nach Hinzufügen
von Papain wurde die Lösung
unter Rühren
mit einem Rotator mit 80–100
U/min ca. 16 Stunden bei 37°C
inkubiert.
-
Nach
dieser ersten Enzymbehandlung wurde das überschüssige Wasser abgeschüttet und
die Feststoffe wurden dreimal mit 2 Liter entionisiertem Wasser
gewaschen. Ein Liter 0,2 M Natriumborhydrid wurde dann den gewaschenen
Feststoffen hinzugefügt.
Die Feststoffe wurden 3 Stunden unter Rühren mit einem Rotator bei
80–100
U/min inkubiert. Das überschüssige Wasser
wurde abgegossen und die Feststoffe wurden dreimal mit 2 Liter entionisiertem
Wasser gewaschen. Anschließend
wurde die zweite Enzymbehandlung an den Feststoffen durchgeführt, wobei
das oben für
die erste Enzymbehandlung beschriebene Verfahren verwendet wurde.
Ein starkes Reduktionsmittel erwies sich als absolut notwendig.
Obwohl es für
das Verständnis oder
die Verwendung der vorliegenden Erfindung nicht wesentlich ist,
kann es sein, dass dieses starke Reduktionsmittel eine reversibel
reaktive Gruppe stabilisiert, die nach der ersten Enzymbehandlung
zurückbleiben kann.
Dieser Schritt verringerte auch die Menge an Aldehyd, das möglicherweise
an Aldol-Kondensationsreaktionen
beteiligt sein kann (d. h. Reaktionen zwischen zwei Aldehydgruppen)
oder an Schiff-Basen-Reaktionen (d. h. Reaktionen zwischen einer
Aldehydgruppe und einer Aminogruppe (siehe z. B. Nimni et al. „Bioprosthesis
derived from crosslinked and chemically modified collagenous tissues." in Collagen, Band
3, M. E. Nimni et al., CRC Press, Inc., Boca Raton, FL (1988), Seite
5). Es kann auch die Interketten-Disulfid-Bindungen
in der spiralförmigen
Region desselben Moleküls,
die nur in Kollagen Typ III vorliegen, verringern (siehe z. B. D.
Amiel et al. „Biochemistry
of tendon and ligament" in
Collagen, Band 3, Seite 229, supra).
-
Nach
der zweiten Enzymbehandlung wurde das überschüssige Wasser abgeschüttet und
die Feststoffe wurden dreimal mit 2 Liter entionisiertem Wasser
gewaschen. Obwohl es für
das Verständnis
der vorliegenden Erfindung nicht wesentlich ist, kann es sein, dass
die erste Enzymbehandlung das Kollagen in der Zubereitung soweit
freisetzt, dass es für
einen weiteren Angriff durch ein Reduktionsmittel (z. B. Natriumsulfid,
Thiothreitol, Dithiothreitol, Glutathion oder Natriumborhydrid)
mit oder ohne alkalische Verbindungen zum Aufquellen des Kollagens
empfänglich
ist. Nach der chemischen Behandlung wurde eine zweite Behandlung
mit Papain durchgeführt,
um alle rest lichen nicht-kollagenen Verunreinigungen (z. B. interstitielles
Elastin) gründlich
zu entfernen.
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Kollagen,
das gemäß der zweistufigen
enzymatischen Behandlung hergestellt wurde, und Kollagen, das mit
der in Beispiel 1 beschriebenen einstufigen enzymatischen Behandlung
hergestellt wurde, wurde untersucht, um den Grad der Entfernung
der nicht-kollagenen Faserproteine (z. B. Elastin) wie in Beispiel
3 beschrieben festzustellen.
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BEISPIEL 3
-
Gehalt
an unlöslichen
nicht-kollagenen Proteinen (Elastin) In diesem Beispiel wurden verschiedene Proben
von Kollagenzubereitungen auf ihren Gehalt an nicht-kollagenem unlöslichem
Protein mit den von Soskel et al. (N. T. Soskel et al., Meth. Enzymol.,
144: 199 (1952)) beschriebenen Verfahren untersucht. Die in diesem
Beispiel untersuchten Proben wurden wie unten beschrieben behandelt.
-
Kurz
gesagt wurden ca. 25 g einer nassen Testprobe wurden mit einem 2
: 1-Gemisch aus Chloroform und Methanol (v/v) entlipidisiert. Die
Proben wurden in flüssigem
Stickstoff eingefroren und zu Stücken
zerdrückt.
Die Stücke
wurden dann in 100% Isopropylalkohol gelegt, um ein Bakterienwachstum
zu vermeiden. Die Stücke
wurden anschließend
15 min bei 5000 xg zentrifugiert, die Überstände wurden abgegossen und die
Pellets wurden bei 60°C
an der Luft getrocknet. Die getrockneten Proben wurde anschließend in
einem Desikkator auf Raumtemperatur gebracht, und ca. 10 g jeder
Probe wurden in 200 ml Polypropylen-Röhrchen überführt. 100 ml 0,1 N NaOH bei
4°C wurde
jedem Röhrchen
hinzugefügt
und der Inhalt wurde vermischt. Die Röhrchen wurden dann 45 Minuten
in ein kochendes Wasserbad gestellt. Da der Abbau von Elastin nach
60 Minuten beginnt, wurde es als wichtig angesehen, die Röhrchen nach
45 Minuten aus dem kochenden Wasserbad zu nehmen. Die Proben wurden
dann mit kaltem 0,1 N NaOH und anschließend mit kaltem doppelt destilliertem
Wasser gewaschen. Die Proben wurden über P2O5 getrocknet oder lyophilisiert, um Feuchtigkeitseinschluss
in den Proben zu vermeiden, der zu einem höheren Messgewicht führen würde. Die
Proben wurden bis zum Gebrauch in einem Desikkator aufbewahrt. Die
Proben wurden für
die gravimetrische Quantifizierung auf ein konstantes Gewicht gebracht
(d. h. die Proben wurden wiederholt gewogen, bis keine Gewichtsschwankungen
mehr vorlagen).
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Tabelle
1 zeigt die Ergebnisse, als Trockengewicht in %, von 10 der getrockneten
Ausgangsproben. In dieser Tabelle stammen die Ergebnisse von Proben,
die mit den „normalen" und „robusten" (d. h. die in Beispiel 1
beschriebene robuste Behandlung) Papain-Enzymbehandlungen hergestellt
wurden. In dieser Tabelle bezieht sich „Nur Enzym" auf eine Probe, die nach dem Verfahren
von Beispiel 1 bearbeitet wurde (d. h. sie wurde ohne Reduktionsmittel
bearbeitet – die
erste Enzymbehandlung wurde durchgeführt und das Behandlungsverfahren
wurde angehalten).
-
In
diesem Versuch wurden Proben, die nach der oben beschriebenen TTP-Methode
hergestellt wurden, sowie Proben, die nach der in Beispiel 1 beschriebenen „Robusten
Behandlung" hergestellt
wurden, untersucht. Darüber
hinaus wurden zwei weitere Proben mit der normalen Behandlung und
der robusten Behandlung geprüft.
Die Probe „Enzym->Reduktionsmittel" bezieht sich auf
eine Probe, die nach einer Enzymbehandlung und einem Reduktionsschritt
untersucht wurde (d. h. die erste Enzymbehandlung aus Beispiel 2,
gefolgt von dem Reduktionsschritt aus Beispiel 2).
-
Die
als „Reduktionsmittel->Enzym" bezeichnete Probe
bezieht sich auf eine Probe, die nach einem Reduktionsschritt und
anschließender
Enzymbehandlung untersucht wurde. Diese Probe „Reduktionsmittel->Enzym" stammt aus derselben
Kollagenquelle und wurde wie in Beispiel 1 und 2 beschrieben geschnitten und
gewaschen. Die Testprobe wurde zunächst mit dem in Beispiel 2
beschriebenen Reduktionsverfahren reduziert, aber ohne die erste
Enzymbehandlung. Nach diesem Reduktionsschritt wurden die für die erste
Enzymbehandlung beschriebenen Verfahren an der reduzierten Probe
durchgeführt.
-
Die
als „TTPTM behandelte" Probe bezeichnete Probe wurde nach
den Verfahren von Beispiel 2 hergestellt. Da mit den normalen Methoden
der TTPTM Behandlung kein unlösliches
nicht-kollagenes
Protein nachgewiesen werden konnte, wurde auf die robuste Version
dieses Verfahrens verzichtet. Die Eigenschaften dieser TTPTM-behandelten Probe werden in Beispiel 5
unten ausführlicher
beschrieben.
-
Die
unbehandelte Kontrolle enthielt 1,24 ± 0,190% Trockengewicht von
nicht-kollagenem unlöslichem Protein,
während
die mit dem TTP-Verfahren hergestellte Probe keinen nachweisbaren
Gehalt (Trockengewicht) an nicht-kollagenem unlöslichem Protein enthielt. Diese
Ergebnisse zeigen, dass in diesem Versuch signifikant mehr nicht-kollagenes
Fremdprotein entfernt wurde als bei dem Kollagen, das mit nur einem
Enzymbehandlungsschritt wie in Beispiel 1 beschrieben hergestellt
wurde.
-
-
BEISPIEL 4
-
Entlipidisierung von TTPTM-behandeltem Kollagen
-
In
diesem Beispiel wurde wie in Beispiel 2 beschriebenes TTPTM-behandeltes Kollagen zur Entfernung von
weiteren potenziell immunogenen Stellen von dem TTPTM-behandelten
Kollagen entlipidisiert.
-
Fraktionierte
Salzpräzipitation
-
Zunächst wurde
das TTPTM-behandelte Kollagen Typ I durch
fraktionierte NaCl-Salzpräzipitation
wie von Hill und Harper (R. J. Hill und E. Harper, Anal. Biochem.,
141: 83–93
(1984)) beschrieben getrennt. Kurz gesagt wurde das enzymbehandelte
Kollagen wurde in 0,5 M NaCl in tris(Hydroxymethylaminomethanpuffer) bei
pH 7,4 gelöst.
Die NaCl-Konzentration wurde anschließend auf 1,7 M erhöht. Die
Lösung
wurde gemischt und 1 Stunde bei 10000 × g und 0–4°C zentrifugiert. Das entwässerte Präzipitat
wurde gemischt und in 0,5 M Essigsäure gelöst, und der pH-Wert wurde auf
7,0 eingestellt. Natriumchlorid wurde bis zu einer Endkonzentration
von 2,5 M hinzugefügt
und das Präzipitat
wurde in einem weiteren Zentrifugationsschritt wie oben gewonnen.
-
Das
ausgefällte
Kollagen wurde dann gegen entionisiertes Wasser dialysiert und vor
der Entlipidisierung für
die quantitative Analyse des Lipidgehalts in der Kollagenprobe lyophilisiert.
-
In
späteren
Versuchen wurde gefunden, dass diese fraktionierte Salzpräzipitation
häufig
nicht notwendig war, da sie keinen Einfluss auf den Reinheitsgrad
des TTPTM-behandelten Kollagenprotokolls
vom Typ I hatte. Dieser Schritt kann aber vor der Entlipidisierung
durchgeführt
werden.
-
Entlipidisierung
-
Das
Kollagenpräparat
wurde dann mit dem Verfahren von Folch et al. (Folch et al., J.
Biol. Chem., 226: 497–509
(1957)) mit Abwandlungen entlipidisiert. Dieser Schritt umfasste
die Lösungsmittelextraktion
der Gesamtlipide, einschließlich
Ganglioside und Phospho-Inosite. Kurz gesagt wurde das Kollagenpräparat wurde in
einem Gemisch aus Chloroform und Methanol (2 : 1, v/v) gerührt. Das
Volumen von Chloroform : Methanol betrug das 20fache des Volumens
der Kollagenprobe (d. h. 20 Teile des Chloroform : Methanol-Gemisches wurde
1 Teil Kollagenprobe hinzugeführt).
Die Probe wurde dabei gut gerührt
und eine Stunde bei 40–45°C kräftig geschüttelt.
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Das
Homogenisat wurde in eine Ampulle überführt und 0,2 Volumen von 0,88%
KCl wurde hinzugefügt.
Die beiden Phasen des Gemisches wurden in einem Abtrenntrichter
getrennt. Die untere Phase mit den Hauptlipiden wurde entfernt und
die obere Phase, die das Kollagen enthielt, wurde zweimal mit einem
Gemisch aus Chloroform, Methanol und Wasser im Verhältnis 3
: 48 : 47 (v/v) gewaschen. Das Kollagenpräparat wurde dann mit einem
5 : 80 : 15-Gemisch (v/v) derselben Bestandteile (d. h. Chloroform,
Methanol und Wasser) gewaschen und mit einem Druck von 9000 ± 1000
psi unter Verwendung einer Handpresse entwässert. Dadurch wurde das Wasser
aus dem Kollagenpräparat
gedrückt,
um eine entwässerte
Masse zu erhalten. Für
diesen Schritt können
aber auch Drücke
im Bereich von ca. 8000 psi bis 30000 psi verwendet werden. Durch
Aufbringen von Druck von 8000 psi wird das gesamte Fremdwasser von
der Außenseite
der Moleküle
entfernt, während
ein Druck von ca. 30000 psi sogar das intramolekulare Wasser entfernt.
Die vorliegende Erfindung soll aber nicht auf diese speziellen Drücke beschränkt werden.
-
Der
Presskuchen wurde anschließend
in einer Kaffeemühle
dispergiert und in einem belüfteten
Trocknungsofen bei 40–45°C an der
Luft getrocknet. Die Reinheit der entlipidisier ten Probe wurde dann
auf Phospholipide, neutrale Lipide und Glycolipide wie unten beschrieben
untersucht.
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Der
Nachweis von Phospholipiden in den Proben erfolgte mithilfe von
Dünnschichtchromatographie (DC)
wie von Skipski et al. (Skipski et al., Biochem. J., 90: 374–378 (1964))
beschrieben. Kurz gesagt wurde 10 g der entlipidisierten Probe wurden
mit einer Kieselgel-DC-Methode untersucht. Zur Vorbereitung der TLC-Platte
wurde zunächst
eine Aufschlämmung
von 45 g Kieselgel H (Spectrum) in 65 ml entionisiertem Wasser hergestellt.
Die Aufschlämmung
wurde auf eine saubere Glasplatte (20 cm × 20 cm) auf eine Dicke von
0,5 mm gegossen, an der Luft getrocknet und 60 Minuten bei 60°C aktiviert
(d. h. ausgehärtet),
auf Raumtemperatur gekühlt
und sofort verwendet. Eine bekannte Menge von extrahiertem Lipid
(200 μl)
wurde als Streifen auf das getrocknete Kieselgel aufgetragen, ca.
2 cm vom Boden der Platte. Die Probe wurde an der Luft getrocknet
und dann in ein Irrigationsmedium aus Chloroform : Methanol : wässriger
Ammoniak (28%) im Verhältnis
65 : 25 : 5 (v/v) in einer Glaskammer gebracht. Sobald die Lösungsmittelfront
sich der Oberseite der Platte annäherte, wurden die Platten aus
der Glaskammer entfernt und an der Luft getrocknet. Die Platten
wurden dann mit Joddampf entwickelt. An den Stellen, an denen Phospholipide
vorlagen, erschienen gelblich braune Flecken. Die Quantifizierung
der vorliegenden Phospholipide erfolgte mit den Verfahren von Fiske
und Subbarow wie in Beispiel 7 unten beschrieben. Die Ergebnisse
sind in Tabelle 2 unten gezeigt.
-
Die
Anwesenheit von neutralen Lipiden und Glykolipiden in dem TTPTM-behandelten Kollagen wurde mit einem chromatographischen
Verfahren mit Kieselsäure-Säule wie
von Rouser et al. (G. Rouser et al., Lipids 2: 37–40 (1967))
beschrieben, bestimmt. Kurz gesagt wurde eine Säule (10 mm × 20 mm) mit Kieselsäure (Spectrum)
wurde vorbereitet und 10 g des entlipidisierten Kollagens wurde
in sequentiellen Anteilen von jeweils 2 Gramm auf die Säule aufgebracht.
So wurde die gesamte Probe von 10 g in fünf Durchläufe auf der Säule getrennt;
die eluierten Proben wurde alle zusammengefasst. Die Probe wurde
mit 160 ml Chloroform : Aceton (1 : 1, v/v) und dann mit einer Reihe
von Aceton- und Aceton : Wasser-Lösungen eluiert. Die eluierten neutralen
und Glykolipide wurden von der Säule
gesammelt, an der Luft getrocknet und gravimetrisch geschätzt. Die
Ergebnisse sind in Tabelle 2 gezeigt.
-
Für Vergleichszwecke
wurden mehrere Proben der vor dem oben beschriebenen Entlipidisierungsschritt
hergestellten lyophilisierten Kollagenproben einer Lipidextraktion
mit unterschiedlichen organischen Lösungsmitteln unterworfen. 15
g der trockenen Probe wurden in mehrere Behälter gegeben. Anschließend wurde
jedem Behälter
100 ml jedes der Lösungsmittel
hinzugefügt
(d. h. ein Lösungsmittel
wurde jeder Probe hinzugefügt).
Die in diesem Versuch verwendeten Lösungsmittel waren Ether, Hexan,
Methanol, Ethanol, Isopropylalkohol, Benzol, Chloroform, Aceton
und Chloroform : Methanol (2 : 1). Die Behälter wurden unter Rühren in
einem Orbitalrotator bei 100 U/min 6 Stunden bei ca. 40°C inkubiert.
Die Lösungsmittel
wurden dann durch Zentrifugation von den Kollagenproben getrennt
und verdunstet. 10 g jeder der mit unterschiedlichen Lösungsmitteln
behandelten entlipidisierten und getrockneten Proben wurden für Lipidschätzungen
wie oben beschrieben verwendet. Die Ergebnisse sind in Tabelle 2
unten gezeigt. In dieser Tabelle sind die Anteile ausgedrückt als
prozentualer Anteil des gesamten Trockengewichts an Kollagen in
der Probe.
-
-
-
Wie
in Tabelle 2 zu sehen wurden in den mit Chloroform : Methanol extrahierten
Proben, die wie oben beschrieben hergestellt wurden, keine nachweisbaren
Mengen an Phospholipiden, neutralen Lipiden und Glykolipiden gefunden.
Im Gegensatz dazu zeigten dieselben Proteinproben nachweisbare Mengen
von Phospholipiden, neutralen Lipiden und/oder Glykolipiden, wenn
die Entlipidisierung mit den traditionellen Verfahren durchgeführt wurde
(z. B. unter Verwendung eines einzelnen Lösungsmittelsystems wie z. B.
Ether, Hexan, Methanol, Ethanol, Isopropylalkohol, Benzol, Chloroform
oder Aceton). Diese Phospholipide, neutralen Lipide und/oder Glykolipide
sind in diesen Proben auch nach längerer Extraktion (z. B. mehrere
Tage) bei Raumtemperatur oder leicht erhöhten Temperaturen (z. B. 50°C) nachweisbar.
-
BEISPIEL 5
-
Gehalt an Cystein, Hydroxyprolin
und Hexosamin und Elastin (unlösliches
nicht-kollagenes Protein) in TTPTM-behandeltem
Kollagen
-
In
diesem Beispiel wurde der Gehalt von Cystein, Hydroprolin, Hexosamin
und Elastin von entlipidisiertem und TTPTM-behandeltem Kollagen
bestimmt. Der Hydroxyprolin-Gehalt gilt als Maß für die Kollagenmenge in der
Probe.
-
Die
entlipidisierte und entwässerte
Kollagenprobe Typ I wurde in 0,1 M Essigsäure auf eine Konzentration
von 0,3% (w/v) rekonstituiert. Die Reinheit des Kollagens wurde
mittels HPLC bestimmt, um den Aminosäurengehalt mit einem Beckman
6300 Aminosäurenanalysator
gemäß den Anweisungen
des Herstellers zu bestimmen. Der Cysteingehalt der Probe wurde
bestimmt und der Cysteingehalt eines Kollagenpräparats, das „weniger
phosphoryliert" war,
wie in Beispiel 6 beschrieben, wurde bestimmt. Diese Ergebnisse
zeigten, dass der Molanteil des TTPTM-behandelten Kollagens
und des „weniger
phosphorylierten" Kollagens
0,09 betrug.
-
Darüber hinaus
wurde der Gehalt an unlöslichem
nicht-kollagenem
Protein (d. h. Elastin) von mit TTPTM behandeltem
Kollagen mithilfe der in Beispiel 3 beschriebenen Methoden zum Untersuchen
des Gehalts an unlöslichem
nicht-kollagenem Protein von Kollagen bestimmt. Da Elastin das einzige
nicht-kollagene
Protein war, das potenziell in dem TTPTM-behandelten
Kollagenpräparat
vom Typ I blieb, wurde davon ausgegangen, dass es wichtig ist, den
Elastingehalt dieses Präparats
zu bestimmen und mit dem Gehalt von Kollagen zu vergleichen, das
mit anderen Verfahren behandelt worden war (z. B. das phosphorylierte
Kollagen von Beispiel 6). Die Ergebnisse dieser Versuche sind in
Tabelle 3 unten gezeigt. Diese Ergebnisse sind als prozentualer
Anteil (Gewicht/Gewicht) auf Trockengewichtsbasis ausgedrückt.
-
Der
Hydroxyprolin- und Hexosamingehalt des entlipidisierten und entwässerten
Kollagens Typ 1 und von Kollagen, das nach den in US-Patent Nr.
5.374.539 beschriebenen Verfahren hergestellt wurde, sowie von zwei
phosphorylierten Kollagenproben („mehr phosphoryliert" und „weniger
phosphoryliert")
wie in Beispiel 6 beschrieben, wurde in den folgenden Versuchen
untersucht.
-
Bestimmung
der Hydroxyprolin-Konzentration
-
Der
Hydroxyprolin-Gehalt des entlipidisierten und entwässerten
Kollagens Typ I und von Kollagen, das nach den in US-Patent Nr. 5.374.539
beschriebenen Verfahren hergestellt wurde, sowie von zwei phosphorylierten
Kollagenproben („mehr
phosphoryliert" und „weniger
phosphoryliert")
wie in Beispiel 6 beschrieben, wurde nach dem von Stegeman beschriebenen
Ver fahren (H. Stegeman, J. Physiol. Chem., 311: 41 (1958)) geschätzt. Das
in diesem Beispiel verwendete 0,03 M Chloramin T wurde hergestellt,
indem 0,845 g Chloramin T 100 ml eines Puffers aus 20 ml Wasser,
30 ml Propanol und 50 ml Citratacetat-Puffer von pH 6 hinzugefügt wurde.
Der Citratacetat-Puffer
(pH 6) wurde hergestellt, indem 50 g Zitronensäure (1H2O),
12 ml Eisessig, 120 g Natriumacetat (3H2O)
und 34 g NaOH 500 ml Wasser hinzugefügt wurden. Das Volumen wurde
auf 1 Liter eingestellt und der pH-Wert wurde auf 6 eingestellt.
Perchlorsäure
(3M) wurde in 25,5 ml 70% HClO4 hergestellt
und das Volumen wurde in Wasser auf 100 ml eingestellt. Die Hydroxyprolin-Stammlösung bestand
aus 5 μg
Hydroxyprolin pro ml Wasser. Die Hydroxyprolin-Standards wurden
hergestellt, indem 20 mg Hydroxyprolin pro 100 ml Wasser und 0,05
ml konzentrierte HCl hinzugefügt
wurden.
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Die
Hydroxyprolin-Konzentrationen wurden wie folgt bestimmt: ein ml
jeder Probe und 1 ml der Standardlösung mit 2–5 μg Hydroxyprolin wurden 1 ml
Chloramin-Lösung
in getrennten Röhrchen
hinzugefügt
und 20 Minuten bei Raumtemperatur gemischt. Ein ml Perchlorsäure wurde
dann den Röhrchen
hinzugefügt
und 5 Minuten bei Raumtemperatur gemischt. Ein ml 5% p-Dimethylaminobenzaldehyd
in Propanol wurde jedem Röhrchen
hinzugefügt
und 18 Minuten in einem Wasserbad bei 60°C gemischt. Die Röhrchen wurden
auf 20°C abgekühlt und
die optische Dichte wurde bei 550 nm abgelesen. Die Ergebnisse sind
in Tabelle 3 unten gezeigt.
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Bestimmung
der Hexosamin-Konzentration
-
Die
Hexosamin-Gesamtkonzentration des entlipidisierten und entwässerten
Kollagens Typ I und von Kollagen, das nach den in US-Patent Nr.
5.374.539 beschriebenen Verfahren hergestellt wurde, sowie von zwei
phosphorylierten Kollagenproben („mehr phosphoryliert" und „weniger
phosphoryliert")
wie in Beispiel 6 beschrieben, wurde mit dem von Blumenkrantz et
al. (N. Blumenkrantz und G. Absoe-Hansen, Clin. Biochem., 9: 269
(1976)) beschriebenen Verfahren geschätzt.
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Die
in diesem Versuch verwendete Lösung
von Trinatriumphosphat/Kaliumtetraborat wurde hergestellt, indem
98 ml 1 N tribasisches Natriumphosphat und 0,5 N Kaliumtetraborat
gemischt wurden. Diese Lösung
von Trinatriumphosphat/Kaliumtetraborat wurde dann als Lösungsmittel
für die
Acetylaceton-Gemische zur Bestimmung von Hexosamin in den Proben
verwendet. Acetylaceton I wurde als 3,5%ige (v/v) Lösung in Natriumphosphat/Kaliumborat-Puffer
hergestellt. Acetylaceton II wurde als 3,5%ige (v/v) Lösung in
0,5 N Kaliumtetraborat hergestellt. Das in diesen Versuchen verwendete
Ehrlich-Reagenz wurde hergestellt, indem 3,2 g p-Dimethylaminobenzaldehyd 30 ml 12 N
HCl hinzugefügt
und mit 210 ml 2-Propanol verdünnt
wurde.
-
Kurz
gesagt wurde die entlipidisierte Probe wurde dann in ein Röhrchen gegeben.
6 N HCl wurde in die Probe gemischt und die Probe wurde 30 Minuten
bei 120°C
(oder 12–14
Stunden bei 100°C)
hydrolysiert und anschließend
zur Trockne verdampft. Gleichzeitig wurden Standards von Glucosamin
und Galactosamin (2,5 bis 40 μg
für jeden)
hydrolysiert und mit denselben Verfahren zur Trockne eingedampft.
Die Proben und Standards wurden in doppelt destilliertem Wasser
resuspendiert.
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In
dem Versuch zur Bestimmung der Gesamtmenge von Hexosamin wurde 0,8
ml Probe oder Standard 0,6 ml 3,5% Acetylaceton I in separaten Reagenzröhrchen hinzugefügt und gemischt.
Die Röhrchen
wurden 30 Minuten auf 100°C
erhitzt und dann abgekühlt.
Anschließend
wurde jedem Röhrchen
2 ml Ehrlich-Reagenz hinzugefügt
und gemischt. Die Röhrchen
wurden 5 Minuten inkubiert und die optische Dichte wurde bei 535
nm bestimmt.
-
In
dem Test zur Differenzierung zwischen Glucosamin und Galactosamin
wurde 0,8 ml Probe oder Standard 0,6 ml 3,5% Acetylaceton II in
separaten Reagenzröhrchen
hinzugefügt
und gemischt. Die Röhrchen wurden
2 Stunden in zerdrücktes
Eis gestellt und anschließend
15 Minuten bei 50°C
erhitzt. Dann wurde den Röhrchen
2 ml Ehrlich-Reagenz hinzugefügt
und ge mischt. Die Röhrchen
wurden 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert und die optische
Dichte bei 530 nm wurde bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle
3 unten gezeigt. Diese Ergebnisse sind als prozentualer Anteil (Gewicht/Gewicht)
auf Trockengewichtsbasis ausgedrückt.
-
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BEISPIEL 6
-
Chemische
Modifizierung von filtersterilisiertem Kollagen Typ
-
In
diesem Beispiel wurde TTPTM-behandeltes
Kollagen, das nach den in Beispiel 5 beschriebenen Verfahren hergestellt
worden war, zur Herstellung von „CollagenPROTM" weiter behandelt.
Wie in der vorliegenden Erfindung verwendet bezieht sich „CollagenPROTM" somit
auf aufgereinigtes Kollagen, das phosphoryliert wurde.
-
CollagenPROTM wurde aus TTPTM-behandeltem
Kollagen hergestellt, das nach den in Beispiel 5 beschriebenen Methoden
hergestellt worden war. Zunächst
wurde TTPTM-behandeltes Kollagen filtersterilisiert, indem
die Präparate
durch einen 0,22 μ Filter,
der an einer 30ml-Spritze befestigt war, geleitet wurden. Die filtersterilisierten
Kollagensuspensionen wurden dann bis zum Gebrauch bei 4°C aufbewahrt.
Diese filtersterilisierten Kollagenpräparate wurden chemisch modifiziert,
um die optimalen Modifikationen für die Herstellung von aufgereinigtem
Kollagen für
biomedizinische Anwendungen zu bestimmen. Das gesamte Verfahren
wurden unter sterilen Bedingungen und unter Verwendung vorsterilisierter
Zutaten und pyrogenfreiem sterilem Wasser durchgeführt.
-
Zunächst wurde
100 ml einer 0,3%-igen Lösung
von Kollagen in 0,1 M Essigsäure
mit 5 N NaOH bei 4°C
behandelt, bis ein pH-Wert
von 11,5 erreicht wurde. Dann wurde Natriumtrimetaphosphat in einer
Endkonzentration von 0,03 M hinzugefügt. Das Kollagen wurde in einer
sterilen Haube ca. 3 Stunden bei Raumtemperatur unter Rühren mit
einem Orbitalrotator bei 160 U/min reagiert. Dieses modifizierte
Kollagen wurde bei 4°C
durch Dialyse gegen entionisiertes Wasser gewaschen, bis keine Restionen
mehr aus der Kollagenprobe austraten. Teile des modifizierten Kollagens
wurden durch Lyophilisierung (d. h. Gefriertrocknung) mit dem Fachmann
allgemein bekannten Verfahren getrocknet. Die lyophilisierten Proben
wurden mindes tens fünf Tage
vor weiteren Versuchen in einem Desikkator aufbewahrt.
-
Bei
einigen Versuchen war es von Interesse, gereinigtes Kollagen mit
unterschiedlichen Phosphorylierungsgraden aufzunehmen. Bei Proben
mit mehr phosphoryliertem Kollagen, das in den folgenden Beispielen
als „Mehr
phosphoryliertes Kollagen" bezeichnet
wurde, wurden ca. 40% der im Kollagen verfügbaren modifizierbaren Stellen
phosphoryliert. Für
Proben mit einem geringeren Phosphorylierungsgrad, wird das Präparat als „Weniger
phosphoryliertes Kollagen" in
den Beispielen bezeichnet. Um ein aufgereinigtes Kollagen mit geringerer
Phosphorylierung zu erhalten, wurde 0,01 M Natriumtrimetaphosphat
im Phosphorylierungsschritt anstelle von 0,03 M Natriumtrimetaphosphat
verwendet. Darüber
hinaus betrug die Inkubationszeit 1 Stunde anstatt 3 Stunden mit
0,03 M Natriumtrimetaphosphat.
-
Es
ist vorgesehen, dass die Phosphorylierung von Biomolekülen, wie
z. B. Wachstumsfaktoren (z. B. EGF), Interleukinen (z. B. IL1) und
anderen biologisch wirksamen Molekülen vorteilhaft ist. Für die Phosphorylierung
von EGF wird 1 ml 0,1% EGF, das auf einen pH von 11,5 eingestellt
wurde, bei denselben Konzentrationen und unter denselben Bedingungen
(z. B. Rühren
und Temperatur) wie oben beschrieben 0,2 ml Natriumtrimetaphosphat
hinzugefügt.
Die Probe wird dann zur Entfernung der Salze dialysiert und das
phosphorylierte EGF kann nach Bedarf verwendet werden.
-
BEISPIEL 7
-
Test auf kovalent
gebundenen Phosphor
-
In
diesem Beispiel wurde die gewaschene Kollagenprobe mit dem von Fiske
und Subbarow (C. H. Fiske und Y. Subbarow, J. Biol. Chem., 66: 375–400 (1925))
beschriebenen Verfahren auf Anwesenheit von kovalent gebundenem
Phosphor getestet. Kurz gesagt wurde dabei 1 mg getrocknetes modifiziertes
Kollagen, das nach Beispiel 6 hergestellt und lyophilisiert worden
war, mit 1 ml 72%-iger Perchlorsäure
gemischt und dann 20 Minuten bei 200°C aufgeschlossen. Der aufgeschlossenen
Probe wurde entionisiertes Wasser hinzugefügt, um das Volumen auf 4 ml
einzustellen. Anschließend
wurden nacheinander die folgenden Reagenzien hinzugefügt und gut
gemischt. Zunächst
wurde 0,4 ml 2,5%-iges Ammoniummolybdat in 3 N Schwefelsäure hinzugefügt. Diesem
Gemisch wurden 0,2 ml des Reduktionsmittels 1-Amino-2-Naphthol-Schwefelsäure hinzugefügt. Das
Kollagengemisch wurde dann 10 Minuten bei 100°C inkubiert und die Farbentwicklung,
gemessen bei 600 nm in einem Spektrophotometer (Beckman DU-2) wurde
beobachtet. Kaliumdihydrogenmonophosphat wurde als Phosphorstandard
verwendet. Als Kontrolle diente unmodifiziertes Kollagen, das nach
Beispiel 2 hergestellt wurde.
-
Der
Phosphorgehalt wurde geschätzt,
indem die mit den Kaliumdihydrogenmonophosphat-Standards erhaltenen
Ergebnisse graphisch dargestellt wurden. In diesem Versuch konnte
in den mit TTPTM behandelten Proben kein
gebundener Phosphor nachgewiesen werden. Bei Proben mit mehr phosphoryliertem
Kollagen (d. h. bei denen 40% der im Kollagen verfügbaren modifizierbaren
Stellen phosphoryliert waren) wurde 2,5% (Gewicht/Gewicht; Trockengewichtsbasis)
gebundener Phosphor nachgewiesen. Bei Proben mit geringerer Phosphorylierung
wurde 0,8% (Gewicht/Gewicht; Trockengewichtsbasis) gebundener Phosphor
nachgewiesen.
-
Diese
Ergebnisse zeigten, dass der Phosphorgehalt des modifizierten Kollagens
im Vergleich mit der unbehandelten Kontrolle signifikant anstieg.
In der als Kontrolle dienenden unbehandelten Kollagenprobe wurde
keine messbare Menge Phosphor nachgewiesen. Es wurde geschätzt, dass
eine erhebliche Menge von Hydroxyaminosäuren (z. B. Serin und Tyrosin)
irreversibel phosphoryliert waren und Phosphoester-Bindungen bildeten.
Obwohl dies für
das Verständnis
der Erfindung nicht notwendig ist, zeigt 2 eine Reaktion,
die bei dieser Phosphorylierung auftreten kann.
-
Es
konnte gezeigt werden, dass dieses modifizierte Kollagen verbesserte
biologische Eigenschaften aufwies, wie in Beispiel 10–15 beschrieben.
Bei der Aufreinigung von Kollagen muss aber bekanntlich mit Vorsicht
vorgegangen werden, weil Verunreinigungen, die in unreinen Kollagenpräparaten
vorliegen, aufgrund der Phosphorylierung von kontaminierten Proteinen
(z. B. Elastin) unerwünschte
biologische Reaktionen hervorrufen können.
-
Ein
wichtiger Punkt ist, dass die Modifizierungsmenge kontrolliert werden
kann, wobei der Bereich schwankt zwischen keinen und maximal ca.
40% der modifizierbaren Aminosäuren
im Kollagen. Die pH-Bedingungen, unter denen die Reaktion erfolgt,
können
von 8 bis 13 schwanken, je nach gewünschtem Modifikationsumfang.
Darüber
hinaus kann die Reaktionstemperatur zwischen 4 und 45°C schwanken.
In anderen Versuchen wurde beobachtet, dass die Proben bei Temperaturen
unter 4°C
zu Einfrieren neigten, während
das Kollagen bei Temperaturen über
45°C denaturieren
kann.
-
Die
chemische Verbindung, die zur Reaktion mit dem Kollagen verwendet
wird, kann aus der folgenden Gruppe stammen, ohne aber darauf beschränkt zu sein:
verschiedene Polyphosphate (z. B. Natriumhexametaphosphat, Natriumultraphosphat
und Natriumtetrametaphosphat), Phosphorsäureanhydrid und Phosphoryltrichlorid,
das in organischen nichtpolaren Lösungsmitteln, wie z. B. Hexan
usw. gelöst
ist.
-
Vorgesehen
ist auch, dass andere nicht-kollagene biologische Materialien für unterschiedliche
biologische Anwendungen auf ähnliche
Weise chemisch modifiziert werden. Auch andere Modifikationen, die
sich für
die Herstellung von Kollagen eignen, können in Zellkulturen oder Anwendungen
in vivo verwendet werden, einschließlich aber ohne Einschränkung Fluorierung,
Halogenierung (z. B. Chlorierung), Sulfonierung und/oder Hydroxylierung
des gemäß den Verfahren
von Beispiel 2 hergestellten Kollagens und des phosphorylierten Kollagens,
das gemäß den oben
beschriebenen Verfahren hergestellt wurde. Diese Modifikationen
können
zusammen (d. h. mehrere Modifikationen können am selben Präparat durchgeführt werden)
oder getrennt durchgeführt
werden.
-
BEISPIEL 8
-
Löslichkeit
von modifiziertem Kollagen
-
In
diesem Beispiel wurde die Löslichkeit
von gereinigtem Kollagen Typ I, das wie in Beispiel 6 beschrieben
modifiziert worden war, bestimmt und mit der Löslichkeit von nativem Kollagen
verglichen.
-
In
diesem Beispiel wurden 10 ml der 0,3%-igen Lösungen von unmodifiziertem
(d. h. nativem) Kollagen und von modifiziertem Kollagen in 0,1 M
Essigsäure
hergestellt. Die optische Dichte jeder Lösung wurde bei 450 nm bestimmt.
Eine kleine Menge von 0,5 M NaOH wurde jeder Lösung vorsichtig hinzugefügt, um den pH
auf einen neutralen Wert (d. h. 7) einzustellen. Die optische Dichte
wurde erneut bei 450 nm gemessen. Die folgende Tabelle zeigt die
Werte der optischen Dichte dieser Proben. Die Zunahme der optischen
Dichte des nativen Kollagens wies darauf hin, dass in dieser Probe
mehr unlösliches
Protein vorlag als im modifizierten Kollagen. Das modifizierte Kollagen
hatte somit auch bessere Löslichkeitsmerkmale
unter neutralen Bedingungen. Während
dies für
das Verständnis
der vorliegenden Erfindung nicht notwendig ist, kann diese Beobachtung
dennoch das Ergebnis einer Verschiebung im isoelektrischen Punkt
des Kollagens sein.
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-
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BEISPIEL 9
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Herstellung des CollagenPROTM Films
-
In
diesem Beispiel wurden Filme (d. h. Membranen) von chemisch behandeltem,
filtersterilisiertem Kollagen (d. h. CollagenPROTM),
das nach den in Beispiel 6 beschriebenen Verfahren hergestellt worden
war, zur Verwendung in Versuchen in vivo und in vitro hergestellt.
In einigen Versuchen wurde das Kollagen aus Rinder-Achillessehnen
anstatt aus Rinderhäuten
gewonnen. Beide Kollagenquellen waren für die Verwendung in den folgenden
Beispielen zufrieden stellend.
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Zunächst wurde
die Suspension in sterile 15 × 2
cm Petri-Schalen
bis zu einer Tiefe von ca. 8 mm gegossen. Die Petri-Schalen wurden abgedeckt
und 48 Stunden bei konstanter Temperatur von 37°C gelagert, um eine gleichförmige Anfangsgelierung
zu fördern.
Dafür waren
häufig
3–5 Tage
erforderlich, bis die Filme offensichtlich trocken waren. Am Ende
der anfänglichen
48-Stunden-Gelierungsphase wurde die Abdeckung von den Petri-Schalen
entfernt und die Trocknung wurde in einer chemischen Abzugshaube
bei Raumtemperatur fortgesetzt. Am Ende des Trocknungsvorgangs wurden
die Kollagenfilme mit Ethylenoxidgas sterilisiert und für tierexperimentelle
Implantation, Transplantation, Grafting oder andere Versuche verwendet.
Diese Filme wurden auch in darauffolgenden Experimenten verwendet.
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BEISPIEL 10
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Untersuchung
von chemisch modifiziertem Kollagen in Hauttransplantaten in vivo
-
In
diesem Beispiel wurde die Eignung und Biokompatibilität des chemisch
modifizierten Kollagens Typ I, das wie in Beispiel 6 beschrieben
hergestellt wurde, und von unmodifiziertem Kollagen, das wie in
Beispiel 2 beschrieben hergestellt wurde, für Anwendungszwecke in vivo
bestimmt. Gereinigte gewaschene Kollangenproben, die wie in Beispiel
9 beschrieben erhalten wurden, wurden in Form dünner Filme mit einer Dicke
von 0,3 mm getrocknet.
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In
diesem Beispiel wurden sechzehn männliche Schweizer Albinomäuse verwendet,
um die Eignung und Biokompatibilität dieser Kollagenpräparate zu
prüfen.
Zunächst
wurde ein kreisförmiges
Hautareal mit einem Durchmesser von 1 cm chirurgisch von den Rücken der
Tiere entfernt. Diese Areale wurden dann unter aseptischen Bedingungen
mit Test- oder Kontrollkollagenfilm abgedeckt (d. h. Grafting).
Das in diesem Beispiel verwendete Kollagen wurde mit Ethylenoxid
sterilisiert. Die Tiere wurden drei Wochen auf makroskopische Anzeichen
von Entzündung
(d. h. Rötung,
Schwellung, Wärme
usw) beobachtet. Bei keinem der Tiere wurden unerwünschte Reaktionen
beobachtet. Die Tiere wurden am Ende des dreiwöchigen Zeitraums nach Grafting des
Kollagenfilms getötet.
-
Der
gesamte Hautlappen, einschließlich
dem transplantierten Kollagen, wurde bei jedem Tier von der Operationsstelle
entfernt und in 70% Alkohol fixiert, entwässert und mit den im Stand
der Technik bekannten Verfahren in Wachs eingebettet. Die eingebetteten
Proben wurden in Schnitte mit einer Dicke von 5 Mikron geschnitten
und mit Goldner's
einstufiger Trichrom-Anfärbung
(OST) sowie mit Hämatoxylin
und Eosin (H&E) mit
Methoden des Standes der Technik angefärbt.
-
Die
histologischen Ergebnisse zeigten keine unerwünschte Reaktion bei den beiden
Versuchsgruppen. Die Zellinfiltration und die Neoepithelialisierungsrate
(d. h. die Infiltration von Epithelzellen zum Zentrum des Transplantats)
wurde durch keines der Testgraftmaterialien beeinflusst. Dagegen
zeigte die Kontrollprobe eine bemerkenswerte Anzahl von Fremdkörper-Riesenzellen, die
am Kollagenfilm anhafteten. Darüber
hinaus wurde bei den Kontrollen wie in 2 gezeigt
eine langsamere Epithelialisierungsrate beobachtet.
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BEISPIEL 11
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Untersuchung
von chemisch modifiziertem Kollagen in Implantaten in vivo
-
In
diesem Beispiel wurde Kollagen Typ I aus Gewebeproben von Rinderdarm
(der auf einem lokalen Markt gekauft worden war) gereinigt und mit
den Verfahren von Beispiel 6 chemisch modifiziert. Diese Proben wurden
dann in Kaninchen implantiert, um die Eignung und Biokompatibilität von Kollagen,
das nach den erfindungsgemäßen Verfahren
hergestellt worden war, zu bestimmen. In diesen Versuchen wurde
auch Kontrollkollagen verwendet, das nach den in Beispiel 2 beschriebenen
Verfahren hergestellt worden war.
-
Ausgewachsene
männliche
weiße
Neuseeländer
Kaninchen mit einem Gewicht von ca. 3,5 bis 4 kg von Nitabell Rabittry
wurden in diesem Beispiel verwendet. Die Tiere wurden zunächst mit
einer entsprechenden Dosis Ketamin sediert und mit Ketamin/Xylaxin
(PDL) wie für
kleinere Operationen angemessen narkotisiert. Die Haare auf der
Rückenseite
der Tiere wurden geschoren und mit einer Betadin-Abreibung und Abwischen
mit 70%-igem Alkohol für
die Operation vorbereitet. Die Tiere wurden in drei Gruppen mit
je zwei Tieren aufgeteilt. In der Haut jedes Tiers wurde ein kleiner
Einschnitt angebracht, um Unterhauttaschen zu erhalten. Bei jeder
Kaninchengruppe erfolgten vier Implantationen. Sechs der Kaninchen
(24 Stellen) wurden auf beiden Seiten operiert, wobei die Implantate
auf beide Seiten der Mittellinie des Rückens gelegt wurden. Jedes
Implantat enthielt 50 mg getrocknete Kollagenprobe, die zu einem
ungefähr
runden Ball gedreht wurde und subkutan auf jede Stelle gelegt wurde.
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Die
Tiere wurden drei Wochen auf makroskopische Anzeichen von Entzündung (d.
h. Rötung,
Schwellung usw.) beobachtet. Bei keinem der Tiere wurden unerwünschte Reaktionen
beobachtet. Nach 3 Wochen wurden die Tiere getötet und die Implantate chirurgisch
entfernt, in 70% Alkohol fixiert, entwässert und nach den im Stand
der Technik allgemein bekannten Verfahren in Paraffin eingebettet.
Schnitte mit einer Dicke von 5 Mikron wurden geschnitten und nach
allgemein bekannten Verfahren des Standes der Technik mit OST und H&E angefärbt.
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Die
Ergebnisse zeigten eine stärkere
Vaskularisierung und fibroblastisches Einwachsen in beiden Versuchsgruppen.
Die Kontrollproben zeigten eine relativ geringe Vaskularisierung
sowie die Prävalenz
von mehrkernigen Riesenzellen, was die geringere Biokompatibilität dieser
Proben zeigt.
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BEISPIEL 12
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Alkalische
Phosphatasewirkung
-
In
diesem Beispiel wurden die wie in Beispiel 9 beschrieben untersuchten
Kollagenimplantate auf ihre alkalische Phosphatasewirkung untersucht.
Die alkalische Phosphatasewirkung war von Interesse, weil die Hypothese
aufgestellt wurde, dass dieses Enzym mit der Gewebebildung und Kalzifizierung
in Zusammenhang steht. Der in diesem Beispiel verwendete Versuch
beruht auf den Verfahren von Bradenberger und Hanson (H. Bradenberger
und R. Hanson, Helv. Chim. Acta 36: 900 (1953); und Hofstee (B.
H. Hofstee, Arch. Biochem. Biophys. 51: 139 (1954)). Bei diesem
kolorimetrischen Verfahren wird die Wirkung der alkalischen Phosphatase
auf die Hydrolyse von o-Carboxy-Phenylphosphat
gemessen.
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Kurz
gesagt wurden Proben von ca. 10 mg jedes der gewonnenen Kollagenimplantate
aus Beispiel 10 wurden mit einer Rate von 1 mg in 1 ml Tris-Puffer
(0,1 M Tris, pH 8,5) fünf
Minuten dispergiert. Die Temperatur der dispergierten Proben wurde
bei 0–5°C gehalten.
Zur Verhinderung von enzymatischen Reaktionen vor dem Versuch, wurde
eine kleine Menge Detergens (bis zu einer Endkonzentration von 0,1
M Natriumdeoxycholat) den dispergierten Proben hinzugefügt, um die
Freisetzung von membrangebundenen Enzymen zu erleichtern. Die dispergierten
Proben wurden dann in einem Polytron-Homogenisator (Brinkmann) 30
Sekunden gemischt und in einem Eisbad gekühlt.
-
Für jede Probe
wurden die Lösungen
20–30
Minuten in einem Wasserbad bei 25°C
inkubiert, um die Enzyme zu aktivieren. Eine Testlösung aus
2 ml Glycin (0,2 M pH 8,8), 1 ml 3,65 mM o-Carboxyphenylphosphat
(OCCP) und 0,5 ml 0,05 M MgCl2 wurde in
eine Küvette überführt und
3–4 Minuten
bei 25°C
inkubiert. Kollagentestproben (0,1 ml, vorgefiltert mit einem 0,22
Mikron Filter, der an einer 5ml-Spritze befestigt war) wurden den
Lösungen
in den Küvetten
hinzugefügt.
Die optische Dichte des Küvetteninhalts
wurde dann bei 300 nm bei Raumtemperatur bestimmt.
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Die
Aktivität
ist in Einheiten pro mg Gewebe angegeben und basiert auf der Anzahl
Mikromol von pro Minute hydrolysiertem OCCP bei 25°C bei pH
unter den oben beschriebenen Bedingungen.
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Die
Ergebnisse zeigten signifikant erhöhte Mengen an alkalischer Phosphataseaktivität (34% Erhöhung: P < 0,0005) in den
modifizierten Kollagenimplantaten im Vergleich mit den unmodifizierten
Implantaten.
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BEISPIEL 13
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Verwendung von CollagenPROTM für
die Wundheilung
-
In
diesem Beispiel wurde die Eignung von Kollagen Typ I aus Achillessehnen
von Rindern (erworben auf einem lokalen Markt) untersucht. Das Kollagen
wurde extrahiert und wie in Beispiel 9 beschrieben zu gleichmäßig dünnen trockenen
Filmen gemacht. Ein Kontrollfilm wurde mit der in US-Patent Nr.
5.374.539 beschriebenen Standard-Pepsin-Enzymbehandlungsmethode
hergestellt. Zusätzlich
zu dem im Beispiel 9 beschriebenen CollagenPROTM wurden
natives Rinderkollagen vom Typ I, hergestellt wie in US-Patent Nr. 5.374.539
beschrieben, und mit Glutaraldehyd vernetztes Rinderkollagen (wie
in diesem Patent beschrieben) untersucht. Alle Proben wurden in
Anwesenheit von 0,5 ml rekonstituiertem epidermalem Wachstumsfaktor (EGF;
Collaborative Research Inc.) (1 μg/3
ml PBS) und ohne Zusatz von EGF untersucht.
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Für dieses
Beispiel wurden Epithelzellkulturen gewählt, weil sie ein Modellsystem
zur Untersuchung von Ereignissen, die den Verschluss von oberflächlichen
Epitheldefekten steuern, und zur Prüfung der Wirkungen von exogenen
Mitteln auf diese Ereignisse liefern. Diese Verfahren haben im Vergleich
mit Wundverschlussmodellen in vivo einige Vorteile. Beispielsweise
lässt sich
das extrazelluläre
Milieu in Zellkultursystemen viel leichter manipulieren. Frühere Berichte
weisen darauf hin, dass die Epithelreaktion in vitro der in vivo beobachteten
Reaktion ähnelt
und leicht quantifiziert werden kann (siehe z. B. S. Gunasekaran
et al., Proc. Soc. Biomater., 20: 311 (1994); und S. Simmons et
al. Toxicol. Appl. Pharmacol. 88: 13–23 (1987)). Dieser Versuch
sollte die vergleichende Eignung von verschiedenen Kollagensubstraten
für den
Wundverschluss zeigen. Insbesondere wurde die Wechselwirkung der
Kollagensubstrate mit EGF untersucht.
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Primäre Zellkulturen
wurden von chirurgisch entfernten Hornhäuten von getöteten weißen Neuseeländer Kaninchen
(1,5–2,5 kg)
erhalten. Die chirurgisch isolierten Hornhäute wurden in Dispase II (Boehringer Mannheim)
bei 37°C
in einem befeuchteten CO2-Inkubator inkubiert.
Nach 1 Stunde wurden die Hornhäute
in ein primäres
Zellkulturmedium aus Dulbeccos modifiziertem Eagle-Medium, das mit
5% fötalem
Kälberserum, 0,5%
Dimethylsulfoxid (DMSO, 50 ng/ml Gentamicin, 146 μg/ml L-Glutamin, 5 μg/ml Insulin
und 10 μg/ml
EGF angereichert war, überführt. Die
volle Dicke der Hornhautepithelplatten wurden vorsichtig von den
Hornhautproben abgezogen, in Trypsin gelegt, vorsichtig vermischt
und 5 Minuten bei 2000 × g
und 4°C
zentrifugiert. Die Überstände wurden
entfernt und die Zellen von sechs Hornhäuten wurden kombiniert und
in frischem primärem
Kulturmedium resuspendiert und in sechs 35 mm Kulturschalen ausgestrichen.
Die Kulturen wurden bei 37°C
in einen befeuchteten CO2-Inkubator gestellt.
Das Kulturmedium wurde dreimal pro Woche gewechselt.
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Am
siebten Inkubationstag waren die primären Kulturen konfluent und
sie wurden 5–10
Minuten in Trypsin behandelt. Die Zellen wurden von den Kulturschalen
pipettiert und 5 Minuten bei 2000 × g zentrifugiert. Der Überstand
wurde entfernt und das Kulturkontrollmedium bestand aus dem oben
beschriebenen Dulbeccos modifiziertem Eagle-Medium ohne EGF. Die
Zellen wurden pipettiert, um eine Suspension von Einzelzellen zu erhalten
und mit einem Hemazytometer gezählt.
24 Vertiefungsmultiplatten wurden mit 3–4 × 104 Zellen/Vertiefung
in 1 ml Medium pro Vertiefung geimpft. Die Subkulturzellen konnten
7 Tage wachsen, wobei das Medium innerhalb dieses Zeitraums dreimal
gewechselt wurde.
-
Am
7. Tag der Subkultur wurden die in den Vertiefungen enthaltenen
Zellen gezählt,
um sicherzustellen, dass in jeder Vertiefung mindestens 1,6 × 105 Zellen anwesend waren. Die Zellschichten
wurden mit Filterscheiben (Durchmesser 7 mm) wie von Jumblatt und
Neufeld (siehe M. Jumblatt und A. Neufeld, Invest. Ophthamol. Visual
Sci., 15: 4–14
(1986)) beschrieben verletzt ("verwundet"). Kurz gesagt wurde
das Zellkulturmedium wurde aus den Vertiefungen entfernt und die
Fil ter wurden auf die Zellschicht gelegt und mit einem Kolben (Durchmesser
7 mm) nach unten gedrückt.
Eine vorgekühlte
Stahlsonde mit einem Durchmesser von 6 mm wurde 5 Sekunden auf den
Boden der Vertiefungen, direkt unter jeder Scheibe, gehalten. Scheiben
mit daran haftenden toten Zellen wurden dann aus jeder Vertiefung
entfernt. Vor dem Zufügen
des Kontrollmediums wurden jeder Vertiefung die Testmaterialien
(Kollagen, das nach den in Beispiel 9 beschriebenen Verfahren hergestellt
wurde (CollagenProTM) sowie native Typ I
Rinderkollagen und vernetztes Typ I Rinderkollagen (hergestellt
gemäß US-Patent
Nr. 5.374.539) hinzugefügt.
Die Multiplatten mit den „verwundeten" Zellschichten und
dem Testkollagen wurden 24 Stunden erneut inkubiert, um Zellwachstum
in dem verwundeten Bereich zu gestatten. Die Vertiefungen wurden
im Verlauf dieses 24-stündigen
Wachstumszeitraums in Abständen
beobachtet, um den Bereich der von der Scheibe verwundeten Zellschicht
zu messen. Diese Messungen erfolgten mikroskopisch im Abstand von
0, 12, 18 und 24 Stunden.
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Der
Verschluss des verletzten Bereichs auf der Zellschicht innerhalb
der Vertiefungen wurde durch Fixierung der Zellschichten und Kollagentestproben
mit 10% neutral gepuffertem Formalin für mindestens 10 Minuten gestoppt.
Die Zellen wurden dann mindestens 10 Minuten mit Giemsa-Stammlösung angefärbt, in
10% neutral gepuffertem Formalin gespült und an der Luft getrocknet.
Die angefärbten
Vertiefungen in der Mikroplatte wurden mikroskopisch untersucht
und die Wundbereiche wurden gemessen.
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3 ist
ein Balkendiagramm, das die in diesem Beispiel erhaltenen Ergebnisse
des in vitro Wundverschlusses zeigt. In dieser Figur steht „SC" für CollagenProTM, „NC" für natives
Kollagen, „XC" für vernetztes Rinderkollagen
Typ I und „GF" für EGF. Diese
Ergebnisse zeigen, dass die Kollagenpräparate sich nicht gleich verhalten.
Die mit CollagenProTM mit und ohne EGF erhaltenen
Ergebnisse zeigten einen schnelleren Wundverschluss als die mit
den anderen Kollagenpräparaten
erhaltenen Ergebnisse. Die in Beispiel 10 und 11 beschriebenen Versuche
in vivo zeigten, dass die Abgabe von Wachstumsfaktoren wirksamer
war, wenn die Abgabe durch CollagenProTM erfolgte
als mit nativem Typ I Kollagen, das nach dem Verfahren von US-Patent
Nr. 5.374.539 hergestellt worden war. Darüber hinaus zeigten diese Ergebnisse,
dass eine Vernetzung von Kollagen im Allgemeinen die Epithelialisierung
nicht unterstützt.
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BEISPIEL 14
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Hämostasetests in vitro
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In
diesem Beispiel wurde das wie in Beispiel 6 beschrieben hergestellte
Kollagen in weiteren Tests verwendet, um seine Eignung als Hämostasemittel
in vivo zu bestimmen.
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Hämostase
(d. h. Blutgerinnung) ist ein primäres Ereignis während der
normalen Wundreparatur. Kollagen ist ein natürliches Hämostasemittel, das in fast
jedem Gewebe vorliegt und das anscheinend auch eine spezifische
Affinität
für Zellen
und Wachstumsfaktoren aufweist, die für die normale Wundheilung äußerst wichtig
sind (siehe z. B. Gunasekaran, in Encyclopedia of Biomaterials and
Bioengineering, 2 (37): 2293–2310 (1995)).
Obwohl auch andere Materialien die Hämostase unterstützen können, kann
es sein, dass sie im Gegensatz zu Kollagen die Wundheilungsrate
nicht optimieren. Ziel dieses Beispiels war die Bestimmung der hämostatischen
und wundheilenden Eigenschaften verschiedener Verbindungen und Substanzen.
In diesem Beispiel wurden Kollagenfasern (Avitene von Medchem),
Schwämme
(Helistat von Collatek) und Gelatine (Gelfoam von Arizona Health
Sciences) und wie unten beschrieben hergestellte Gelatinefragmente
untersucht. Zusätzliche
Substanzen, die früher
als Hämostasemittel
verwendet wurden, wie z. B. Thrombin (z. B. Thrombinar und Thromostat)
und Cellulose (z. B. Surgicel und Oxycel, J&J Medical) wurden in diesen Versuchen nicht
verwendet. Thrombin wurde nicht verwendet, weil es zu immunologischen
und lokalen Freisetzungsproblemen führen kann.
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Natives
Rinderkollagen Typ I wurde wie in Beispiel 2 beschrieben hergestellt.
Avitene, Helistat und Gelfoam wurden von den jeweiligen Anbietern
bezogen. Gelatinefragmente wurden durch begrenzte unspezifische
Proteasebehandlung von Gelatine (Sigma) hergestellt. Die Gelatinefragmente
wurden anschließend durch
Größenausschluss-Säulenchromatographie
auf Sephadex G-50 und G-100 Gel in Multi-Spin-Säulen (Axygen) wie vom Hersteller
beschrieben gereinigt. Zwei Fragmentgruppen wurden isoliert und
gereinigt. Eine Gruppe wurde als „hochmolekulares Gelatinepeptid" bezeichnet. Diese
Gruppe enthielt Peptide mit einem Molekulargewicht im Bereich von
50–100
kD. Die andere Fragmentgruppe wurde als „niedermolekulares Gelatinepeptid" bezeichnet. Diese
Gruppe enthielt Peptide mit einem Molekulargewicht im Bereich von
30–50
kD.
-
Die
Standardgerinnungsmethode von Lee-White wurde in diesem Beispiel
verwendet, wie von Brown (B. A. Brown, Hematology: Principles and
Practice, 3. Ausgabe, Lea & Febiger,
Philadelphia, (1980), Seiten 125–126) beschrieben und wie dem
Fachmann im Stand der Hämatologie-Technik
geläufig
ist. Mit diesem Verfahren wurden mehrere Versuche durchgeführt, in
denen das untersuchte Blutvolumen entweder 0,5 ml oder 1 ml war
(wobei die anderen Reagenzien in den richtigen Anteilen gehalten
wurden). Da zwischen den Testläufen
mit diesen unterschiedlichen Volumen keine Unterschiede beobachtet
wurden, wurde in den meisten Versuchen 0,5 ml Blut verwendet. Kurz
gesagt wurde 3 mg jeder Probe, die zuvor in einem Desikkator aufbewahrt
worden war, wurde sorgfältig
gemessen und jede Probe wurde separat in 10 cm lange saubere Röhrchen aus
Polypropylen gefüllt.
Frisches Blut (5 ml) wurde gesunden Probanden mittels Venenpunktion
entnommen und die Blutentnahmezeit wurde vermerkt. Jedem Röhrchen wurde
0,5 ml Blut hinzugefügt
und alle 30 Sekunden vorsichtig gerührt, bis sich Gerinnsel gebildet
hatten. Die Zeit bis zur ersten Gerinnselbildung wurde vermerkt.
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Die
Ergebnisse dieser Versuche sind in 4 gezeigt.
Wie in dieser Figur zu sehen war die Gerinnungszeit am größten für die niedermolekularen
Gelatinepeptid-Fragmente („LMW
Gel. Pept") und
am geringsten für
CollagenProTM („Natives Koll." in der Figur).
-
Die
Gerinnungszeit der hochmolekularen Gelatinepeptidfragmente („HMW Gel.
Pept.") war fast
so hoch wie die der niedermolekularen Gelatinepeptide. Die aus Avitene
(„Avitene") erhaltenen Kollagenfasern hatten
die zweitschnellste Gerinnungszeit, während die Helistat („Helistat") und Gelfoam („Gelfoam") Präparate die
nächstschnellsten
Gerinnungszeiten aufwiesen. Wie in 4 gezeigt
war die Gerinnungszeit von Gelfoam nur etwas schneller als die der
hochmolekularen Gelatinepeptid-Fragmente.
-
BEISPIEL 15
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Hämostase in vivo
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Dieses
Beispiel war eine Fortsetzung des vorherigen Beispiels und wurde
durchgeführt,
um die hämostatischen
Fähigkeiten
des Kollagens und anderer in Beispiel 9 verwendeter Präparate in
vivo zu untersuchen.
-
In
diesem Beispiel wurden ausgewachsene männliche Sprague-Dawley-Ratten verwendet.
Kreisförmige
Hautareale (2 cm) ganzer Dicke wurden operativ von den Rücken der
narkotisierten Tiere wie in Beispiel 10 beschrieben entfernt. Die
freigelegten Bereiche wurden aseptisch mit den in Beispiel 13 beschriebenen
Kollagenpräparaten
bedeckt (d. h. transplantiert). Nach 3 Wochen wurden die Tiere getötet und
die Hautlappen wurden chirurgisch entfernt und in 70%-igem Alkohol
fixiert, entwässert
und in Paraffin eingebettet, wobei die im Stand der Technik herkömmlichen
Verfahren verwendet wurden. Abschnitte mit einer Dicke von 5 Mikron wurden
ausgeschnitten und mit den im Stand der Technik herkömmlichen
Techniken mit OST und H&E
angefärbt.
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Die
relative Ausdehnung der Neoepithelialisierung und Wundheilung wurde
beobachtet und histologisch beurteilt. Es fanden sich keine makroskopischen
Zeichen einer Entzündung
in oder um die transplantierten Bereiche auf den Rücken der
Tiere. Die Ergebnisse dieses Versuchs sind in 4 gezeigt.
Wie in dieser Figur zu sehen zeigte der CollagenProTM Film
eine signifikant schnellere Wundheilungsrate und Blutgerinnungszeit
als die restlichen Proben, wobei Avitene die zweitschnellste Rate
und Helistat die drittschnellste Rate zeigte. Die Ergebnisse der
Wundheilungs- und Blutgerinnungszeiten in Prozent sind in 4 gezeigt.
-
Wie
bereits beschrieben ergeben diese unterschiedlichen Substanzen in
biologischen Systemen schwankende Ergebnisse. Obwohl es für das Verständnis der
Erfindung nicht notwendig ist, kann die relativ schlechte Leistung
von Gelatine und Gelatinepeptiden darauf hinweisen, dass die Struktur
von Kollagen in den Hämostase-
und Wundheilungsverfahren eine wichtige Rolle spielt.
-
Aus
dem Vorhergehenden wird deutlich, dass die verschiedenen Ausführungsformen
des nach den erfindungsgemäßen Verfahren
hergestellten Kollagens für
verschiedene biomedizinische Anwendungen geeignet sind, bei denen
nicht-entzündliches
Kollagen benötigt
wird. Es wird davon ausgegangen, dass das erfindungsgemäße nicht-entzündliche
Kollagen unter mehreren Bedingungen und für zahlreiche Anwendungszwecke
verwendet werden kann, einschließlich aber ohne Einschränkung für nicht-entzündliche
Kollagennähte,
für den
Weichteilersatz mit Kollagen, einschließlich Verbände von Wunden und Verbrennungen,
Ersatz von Arterien, als Hämostasemittel,
als Matrizen zur Freisetzung von Arzneimitteln, als Glaskörperersatz
für die
ophthalmologische Therapie, in der endodontischen Therapie, als
Zellkulturträger
usw. Ferner wird davon ausgegangen, dass verschiedene Ausführungsformen
der vorliegenden Erfindung in jeder Form, einschließlich aber ohne
Einschränkung,
als Faser- oder Membranfilme, Beutel, Schwämme, Nähte und wässrige Suspensionen oder Verbundstoffe
eingesetzt werden können.
Darüber
hinaus kann das erfindungsgemäß hergestellte
Kollagen bei Bedarf für
die gewünschte
Anwendung und für
ein verbessertes bioaktives Ansprechen weiter modifiziert werden.
Es wird auch davon ausgegangen, dass die erfindungsgemäßen Verfahren
für die
Herstellung von anderen Biomolekülen
als auch Kollagen geeignet sind.