DE69823361T2

DE69823361T2 - Herstellung von kollagen

Info

Publication number: DE69823361T2
Application number: DE69823361T
Authority: DE
Inventors: Subramanian Gunasekaran
Original assignee: NOVA GEN Inc; Nova Gen Inc Newark
Current assignee: NOVA GEN Inc; Nova Gen Inc Newark
Priority date: 1997-01-13
Filing date: 1998-01-12
Publication date: 2005-05-04
Anticipated expiration: 2018-01-13
Also published as: EP1007065A1; EP1007065A4; CA2277896A1; EP1007065B1; AU740950B2; AU5910798A; ATE264689T1; US6127143A; US6548077B1; WO1998030225A1; DE69823361D1; JP2001508301A; US5814328A; CA2277896C; JP4025897B2

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft Verfahren zur Herstellung von Kollagen aus Geweben von Menschen oder anderen Tieren. Insbesondere stellt die vorliegende Erfindung Verfahren zur Herstellung von Kollagen für biomedizinische, veterinärmedizinische und andere Anwendungen bereit.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Kollagen ist das Protein, das bei Säugetieren besonders reichlich vorhanden ist. (Siehe US-Patent Nr. 5.043.426 von Goldstein). Tatsächlich macht es 30% des Trockengewichts des menschlichen Körpers aus. (Siehe L. C. Junqueira und J. Carneiro, Basic Histology, 4. Ausgabe, Lange Medical Publications, Los Altos, CA (1983), Seiten 89–119). Kollagen bei Wirbeltieren gehört in der Tat zu einer Familie von Proteinen, die von mehreren Zelltypen produziert werden. Innerhalb dieser Proteinfamilie lassen sich die Kollagenarten anhand ihrer chemischen Zusammensetzungen, unterschiedlichen morphologischen und pathologischen Merkmalen, Verteilungen innerhalb von Geweben und ihren Funktionen unterscheiden. Obwohl bereits viele Arten von Kollagen beschrieben wurden, wurden nur fünf große Arten anerkannt.
A. Kollagenformen
Kollagen vom Typ I ist die Kollagenform, die am reichlichsten vorkommt und im Körper weit verteilt ist. In den Geweben liegt es in Strukturen vor, die klassisch als „Kollagenfasern" bezeichnet werden und die Knochen, Dentin, Sehnen, Faszien, Sklera, Organkapseln, Dermis, Faserknorpel usw. bilden. Die Hauptfunktion von Kollagen Typ I ist Widerstand gegen Spannung. Mikroskopisch erscheint Kollagen Typ I als dicht gepackte, dicke, nicht-argyrophile, stark doppelbrechende, rote oder gelbe Fasern. Seine Ultrastruktur ist durch dicht gepackte dicke Fibrillen mit starken Schwankungen im Durchmesser gekennzeichnet. Es wird von Fibroblasten, Osteoblasten, Odontoblasten und Chondroblasten produziert.
Kollagen vom Typ II findet sich hauptsächlich in Knorpel (z. B. hyalinem und elastischem Knorpel). Die Hauptfunktion von Kollagen Typ II ist der Widerstand gegen intermittierenden Druck. Mikroskopisch erscheint es als loses Kollagennetz, das nur nach Piorosirius-Anfärbung und mit Polarisationsmikroskopie sichtbar ist. Seine Ultrastruktur ist dadurch gekennzeichnet, dass sie anscheinend keine Fasern besitzt, aber dafür sehr dünne Fibrillen, die in reichlich Grundsubstanz eingebettet sind. Es wird von Chondroblasten produziert.
Kollagen vom Typ III wird in der Regel mit Kollagen Typ I in Geweben in Verbindung gebracht und kann die kollagene Komponente von retikulären Fasern darstellen. Es findet sich in der glatten Muskulatur, in Endoneurium, Arterien, Uterus, Leber, Milz, Nieren und Lungengewebe. Die Hauptfunktion von Kollagen Typ III ist die Aufrechterhaltung der Struktur ausdehnbarer Organe. Mikroskopisch erscheint es als loses Netz aus dünnen, argyrophilen und schwach doppelbrechenden grünlichen Fasern. Seine Ultrastruktur ist durch lose gepackte dünne Fibrillen mit relativ gleichförmigen Durchmessern gekennzeichnet. Es wird von Fibroblasten der glatten Muskulatur, Retikulumzellen, Schwann-Zellen und Hepatozyten produziert.
Kollagen vom Typ IV findet sich in der epithelialen und endothelialen Basallamina und den Basalmembranen. Die Hauptfunktion von Kollagen Typ IV ist Unterstützung und Filtration. Mikroskopisch erscheint es als dünne, amorphe, schwach doppelbrechende Membran. Ultrastrukturell scheint es weder Fasern noch Fibrillen aufzuweisen.
Kollagen vom Typ V findet sich in den Fötalmembranen, Blutgefäßen, der plazentären Basalmembran und in kleinen Mengen auch in anderen Geweben. Diese Art von Kollagen ist noch relativ wenig charakterisiert.
B. Struktur von Kollagen
Die wichtigsten Aminosäuren, die in Kollagen gefunden werden, sind Glycin, Prolin und Hydroxyprolin. Hydroxylysin ist ebenfalls für Kollagen charakteristisch. Diese Hydroxyaminosäuren sind das Resultat einer Hydroxylierung von Prolin und Lysin in wachsenden Kollagenpolypeptiden während der Kollagensynthese. Der Kollagengehalt in einem Gewebe kann durch Messung seines Hydroxyprolingehalts festgestellt werden.
Kollagen besteht aus Polypeptid-Ketten mit der Bezeichnung „α". Es gibt zwei Arten von α-Ketten, nämlich „alpha-1" („α-1") und „alpha-2" („α-2"). Die wichtigsten Arten von α-1-Ketten sind α1(I), α1(II), α1(III) und α1(IV), die in unterschiedlichen Kombinationen aggregieren und so Dreifachhelixe der Arten I, II, III, IV und V produzieren. Kollagen Typ I besteht aus zwei α1-Ketten und einer α2-Kette. Seine Formel ist (α1[I])2 α2. Die Formel von Kollagen Typ II ist (α1[II])3, während die Formel von Kollagen Typ III (α1[III])3 und von Typ IV (α1[IV])3 ist.
„Tropokollagen" ist die Proteineinheit, die zu Aggregaten von mikrofibrillären Untereinheiten, die zur Bildung von „Kollagenfibrillen" gepackt sind, polymerisiert. Wasserstoffbindungen und hydrophobe Wechselwirkungen sind für die Aggregation und Packung kritisch. Kovalente Vernetzungen verstärken die Struktur der Kollagenfibrillen. Kollagenfibrillen sind dünn und länglich, weisen unterschiedliche Durchmesser auf und besitzen eine Querstreifung mit einer charakteristischen Periodizität von 64 nm. Die Querstreifung entsteht durch überlappende Anordnung der Untereinheiten-Tropokollagen-Moleküle. In Kollagen vom Typ I und III verbinden sich diese Fibrillen und bilden Kollagen "fasern". Bei Kollagen Typ I können durch Zusammenschluss der Fasern Kollagen "bündel" entstehen. Kollagen Typ II ist als Fibrillen zu sehen, bildet aber keine Fasern, während Typ IV und V weder Fibrillen noch Fasern bilden.
Kollagenfasern sind die am reichlichsten vorkommenden Fasern in Bindegewebe. Ihre Inelastizität und molekulare Konfiguration führen zu Kollagenfasern mit einer Zugfestigkeit, die höher ist als die von Stahl. Kollagen bietet somit eine Kombination aus Flexibilität und Stärke für die Gewebe, in denen es vorkommt. In vielen Teilen des Körpers sind Kollagenfasern in parallelen Reihen organisiert, um „Bündel" zu bilden.
Frische Kollagenfasern erscheinen als farblose Stränge, aber wenn eine große Menge Fasern vorhanden ist, führen sie dazu, dass die Gewebe, in denen sie vorkommen, weiß werden (z. B. Sehnen und Aponeurosen). Die Anordnung des länglichen Tropokollagens in den Fasern führt dazu, dass sie doppelbrechend werden. Eine Anfärbung mit bestimmten sauren Farbstoffen (z. B. Sirius-Rot) verstärkt diese Doppelbrechung. Da diese Erhöhung der Doppelbrechung nur in orientierten Kollagenstrukturen beobachtet wird, ist sie eine nützliche Methode zum Nachweis des Vorliegens von Kollagen in einem Gewebe.
C. Eigenschaften und Anwendungen von Kollagen
Kollagen besitzt viele Eigenschaften, die es zu einer attraktiven Substanz für diverse medizinische Anwendungen machen, beispielsweise für Implantate, Transplantate, Organersatz, Gewebsäquivalente, Glaskörperersatz, plastische und kosmetische Chirurgie, chirurgische Nähte, chirurgische Verbände für Wunden, Verbrennungen usw. (Siehe z. B. US-Patent Nr. 5.106.949, 5.104.660, 5.081.106, 5.383.930, 4.485.095, 4.485.097, 4.539.716, 4.546.500, 4.409.332, 4.604.346, 4.835.102, 4.837.379, 3.800.792, 3.491.760, 3.113.568, 3.471.598, 2.202.566 und 3.157.524; J. F. Prudden, Arch. Surg. 89: 1046–1059 (1964); und E. E. Peacock et al. Ann. Surg. 161: 238–247 (1965)). Beispielsweise ist Kollagen an sich relativ schwach immunogen, was zumindest teilweise auf die Maskierung der potenziellen antigenen Determinanten in der Kol lagenstruktur zurückzuführen ist. Ferner widersteht es aufgrund seiner spiralförmigen Struktur Proteolyse. Darüber hinaus ist es eine natürliche Substanz für die Zelladhäsion und die wichtigste Spannungsbelastungen aufnehmende Komponente des Muskel- und Skelettsystems. Deshalb wurden der Produktion von Kollagenfasern und Membranen für medizinische und veterinärmedizinische Anwendungen große Anstrengungen gewidmet.
Kollagen wurde bereits zur Gewebeverstärkung, als Ersatz für Paraffin, Petrolatum, Pflanzenöle, Lanolin, Bienenwachs und Silikon verwendet. (Siehe z. B. US-Patent Nr. 5.002.071.) Die Verwendung von Kollagen in Implantaten wurde jedoch mit Problemen in Zusammenhang gebracht. Da die nichtkollagenen Proteine, die in unreinen Kollagenpräparaten vorliegen, potentere Immunogene sind als Kollagen und eine Entzündungsreaktion auslösen können, ist es extrem wichtig, hochreines Kollagen zu verwenden. Wenn die Entzündungskaskade stimuliert ist, kommt es zur Resorption von Kollagen durch die infiltrierenden Entzündungszellen (z. B. Makrophagen und Granulozyten), die Kollagenase enthalten, was zum Aufschluss von Kollagen führt. Darüber hinaus ist Kollagen selbst chemotaktisch und wird bei seiner Zerlegung in kleinere Peptidfragmente zunehmend chemotaktischer. Es gibt auch Bedenken hinsichtlich der Verwendung von nichtmenschlichem Kollagen. Beispielsweise ist ein wiederholt dokumentiertes Problem im Zusammenhang mit der Verwendung von Rinderkollagen als Biomaterial die konstante, chronische zelluläre Entzündungsreaktion, die nach seiner Implantation oder Verwendung in Erscheinung tritt. Diese Entzündung kann zur Bildung von Narbengewebe, Adhäsionsbildung, Störungen der Erwärmung von Hauträndern, Pseudointima-Bildung, Pseudodiaphragma-Bildung, Störung von Anastomosen, vorübergehendem leichtem Fieber, Aneurysmen oder anderen Problemen führen.
D. Herstellung von Kollagen
Kollagenpräparate werden in der Regel aus Haut, Sehnen (z. B. Rinder-Achillessehnen, Schwanz- und Extensorsehnen), Häuten oder anderen tierischen Teilen in Verfahren hergestellt, die Säure- und/oder Enzymextraktion beinhalten. Grundsätzlich umfassen Verfahren zur Herstellung von Kollagen die Reinigung des Kollagens durch Extraktion mit verdünnten organischen Säuren, die Ausfällung mit Salzen, eine optionale Gelierung und/oder Lyophilisierung, tangentiale Filtration usw. Nach Abtrennen von Faszie, Fett und Verunreinigungen wird das Gewebe einer mäßigen Digestion mit proteolytischen Enzymen, wie z. B. Pepsin, unterworfen und das Kollagen wird dann bei neutralem pH ausgefällt, erneut gelöst und restliche Verunreinigungen bei saurem pH ausgefällt. Das Gewebe wird dann mit einer stark alkalischen Substanz aufgeschlossen und dann mit einer Säure behandelt, um Schwellung zu fördern. Die Kollagenfasern werden dann mit Salzen oder organischen Lösungsmitteln ausgefällt und dehydriert. (Siehe z. B. US-Patent Nr. 5.028.695). Schließlich kann das extrahierte Kollagen in fein verteiltes faserförmiges Kollagen umgewandelt werden, indem wasser-nasses Kollagen zur Entfernung von Wasser mit Aceton behandelt, zur Gewinnung einer festen Kollagenmasse zentrifugiert und das Kollagen während der Trocknung deaggregiert wird. (Siehe z. B. US-Patent Nr. 4148664). Die Kollagenzubereitung kann dann wieder auf einen neutralen pH gebracht und in Form von Fasern getrocknet werden. So können vollständig transparente physiologisch und hämokompatible Gele, Kollagenfilme und Lösungen hergestellt werden. Diese Formen von Kollagen können dann zur Herstellung von Kontaktlinsen und Implantaten verwendet werden.
Ein Nachteil der Behandlung mit Pepsin ist die Tatsache, dass die Kollagenzubereitung teilweise zersetzt werden kann (d. h. die Extraktionsenzyme spalten das Kollagenmolekül an den terminalen nichtspiralförmigen Regionen, die interkollagene Vernetzungen enthalten). Tatsächlich wurde gefunden, dass mit Pepsin extrahiertes Kollagen Präparate ergibt, die für bestimmte Anwendungen zu schwach sind, und zwar insbesondere für Anwendungen, in denen erhebliche mechanische Manipulation des Kollagenpräparats erforderlich ist.
Einige Säurebehandlungen sind ebenfalls mit Nachteilen behaftet. Beispielsweise wird in dem von Chvapil (M. Chvapil et al., Intl. Rev. Connective Tiss. Res., 6: 1–55 (1979)) beschriebenen Säureverfahren Rindersehnenkollagen mit Säure löslich gemacht, um eine Kollagensuspension zu erhalten. Diese Suspension wird dann entweder dialysiert oder in Kochsalzlösung ausgefällt und ergibt ein amorphes Präzipitat, das nichtfibrilläres denaturiertes Kollagen enthält. Das mit diesem Verfahren hergestellte Kollagen eignet sich im Allgemeinen nicht direkt für medizinische Zwecke, da es in feuchten Medien nicht zugfest ist und bei Applikation auf lebendem Gewebe nur wenig Widerstand gegen enzymatischen Abbau bietet. Darüber hinaus ist denaturiertes Kollagen oder Kollagen, das zur Umformung seiner physikalischen und biologischen Eigenschaften behandelt wurde, um es an Kollagen anzunähern, in vivo häufig nicht zufriedenstellend. Häufig fehlen ihm die mechanischen Eigenschaften, die für feuchte Verbände benötigt werden, weil ihm die in vivo organisierte Struktur fehlt (d. h. in diesem künstlichen Kollagen liegen keine Kollagenfasern vor).
GB 1 204 048 beschreibt ein Verfahren zur Reinigung von Kollagen von antigenen Substanzen in einem einzelnen Proteolyseschritt mit Elastase (d. h. Ficin) und einem Reduktionsschritt vor oder nach dem Proteolyseschritt.
Die derzeitigen Methoden zur Herstellung von Kollagen sind somit unzureichend. Es besteht ein klarer Bedarf nach der Entwicklung verbesserter Verfahren für die Produktion großer Mengen von hochwertigem Kollagen für medizinische Behandlungen.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft Verfahren zur Herstellung von Kollagen aus Geweben von Menschen oder anderen Tieren. Insbesondere stellt die vorliegende Erfindung Verfahren zur Herstellung von Kollagen für biomedizinische Anwendungen bereit.
Die vorliegende Erfindung stellt zahlreiche Ausführungsformen für die Aufreinigung von Kollagen bereit. Besonders bevorzugt ist das gemäß einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung aufgereinigte Kollagen Kollagen vom Typ I.
In einer Ausführungsform stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Aufreinigung von Kollagen bereit, bei dem man: eine kollagenhaltige Probe, ein erstes und zweites proteolytisches Enzympräparat und ein Reduktionsmittel bereitstellt; die Kollagenprobe mit dem ersten proteolytischen Enzympräparat in Kontakt bringt und so zu einer ersten Kollagenlösung gelangt; die erste Kollagenlösung mit dem Reduktionsmittel in Kontakt bringt und so zu einer zweiten Kollagenlösung gelangt; die zweite Kollagenlösung mit dem zweiten proteolytischen Enzympräparat in Kontakt bringt und so zu aufgereinigtem Kollagen gelangt. Das erste und zweite proteolytische Enzympräparat enthält Papain.
In einer alternativen Ausführungsform umfasst das erfindungsgemäße Verfahren ferner den Schritt der Entepithelialisierung der Probe, bevor sie mit dem ersten proteolytischen Enzympräparat in Kontakt gebracht wird.
In einer alternativen Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens stammt das Reduktionsmittel aus der Gruppe Natriumsulfid, Dithiothreitol, Glutathion und Natriumborhydrid. In einer bevorzugten Ausführungsform enthält das Reduktionsmittel Natriumborhydrid.
In einer weiteren Ausführungsform umfasst das erfindungsgemäße Verfahren den weiteren Schritt, dass das aufgereinigte Kollagen mit einem Entlipidisierungsmittel in Kontakt gebracht wird und man so zu entlipidisiertem Kollagen gelangt. In einer bevorzugten Ausführungsform dieses Verfahrens ent hält das Delipidisierungsmittel ein Gemisch aus Chloroform und Methanol.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform umfasst das erfindungsgemäße Verfahren ferner die folgenden Schritte: Verpressen des entlipidisierten Kollagens zu Presskollagen; Entwässern des Presskollagens, wodurch man zu entwässertem Kollagen gelangt sowie Dispergieren und Trocknen des entwässerten Kollagens, wodurch man Kollagenfasern erhält. In dieser Ausführungsform der erfindungsgemäßen Verfahren werden die Kollagenfasern also getrocknet.
In einer anderen alternativen Ausführungsform umfasst das erfindungsgemäße Verfahren den Schritt, dass man entlipidisiertes Kollagen mit einem Phosphorylierungsmittel in Kontakt bringt und so zu phosphoryliertem Kollagen gelangt. In einer bevorzugten Ausführungsform stammt das Phosphorylierungsmittel aus der Gruppe Natriumtrimetaphosphat, Natriumhexametaphosphat, Natriumultraphosphat, Natriumtetrametaphosphat, Phosphorsäureanhydrid und Phosphoryltrichlorid. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform enthält das Phosphorylierungsmittel Natriumtrimetaphosphat. In einer alternativ bevorzugten Ausführungsform enthält das auf gereinigte Kollagen CollagenPRO^TM.
In einer Ausführungsform stellt die vorliegende Erfindung aufgereinigtes Kollagen bereit, das aufgereinigt wurde, indem man: eine kollagenhaltige Probe, ein erstes und zweites proteolytisches Enzympräparat, wobei beide dieser proteolytischen Enzympräparate Papain enthalten, und ein Reduktionsmittel bereitstellt; die Kollagenprobe mit dem ersten proteolytischen Enzympräparat in Kontakt bringt und so zu einer ersten Kollagenlösung gelangt; die erste Kollagenlösung mit dem Reduktionsmittel in Kontakt bringt und so zu einer zweiten Kollagenlösung gelangt; die zweite Kollagenlösung mit dem zweiten proteolytischen Enzympräparat in Kontakt bringt und so zu aufgereinigtem Kollagen gelangt.
Ferner ist vorgesehen, dass das aufgereinigte Kollagen aus zusätzlichen Verbindungen besteht, einschließlich aber ohne Einschränkung antimikrobielle Mittel, antivirale Mittel, Wachstumsfaktoren, dehydratationverhindernde Verbindungen, antiseptische Mittel oder andere Verbindungen, die sich für biomedizinische und/oder veterinärmedizinische Anwendungen eignen.
Die vorliegende Erfindung stellt auch eine alternative Ausführungsform bereit, die Verfahren zur Produktion von biokompatiblem Kollagen umfasst, bei dem man: eine kollagenhaltige Probe, ein erstes und zweites proteolytisches Enzympräparat, wobei beide dieser proteolytischen Enzympräparate Papain enthalten, und ein Reduktionsmittel, ein Entlipidisierungsmittel und ein Phosphorylierungsmittel bereitstellt; die Kollagenprobe mit dem ersten proteolytischen Enzympräparat in Kontakt bringt und so zu einer ersten Kollagenlösung gelangt; die erste Kollagenlösung mit dem Reduktionsmittel in Kontakt bringt und so zu einer zweiten Kollagenlösung gelangt; die zweite Kollagenlösung mit dem zweiten proteolytischen Enzympräparat in Kontakt bringt und so zu einer proteolysierten Kollagenlösung gelangt; die proteolysierte Kollagenlösung mit dem Entlipidisierungsmittel in Kontakt bringt und so zu entlipidisiertem Kollagen gelangt und das entlipidisierte Kollagen mit dem Phosphorylierungsmittel in Kontakt bringt und so zu phosphoryliertem Kollagen gelangt.
In einer alternativen Ausführungsform umfasst das erfindungsgemäße Verfahren ferner den Schritt der Entepithelialisierung der Probe, bevor sie mit dem ersten proteolytischen Enzympräparat in Kontakt gebracht wird.
In einer alternativen Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens stammt das Reduktionsmittel aus der Gruppe Natriumsulfid, Dithiothreitol, Glutathionin und Natriumborhydrid. In einer bevorzugten Ausführungsform enthält das Reduktionsmittel Natriumborhydrid.
In einer alternativen Ausführungsform enthält das Entlipidisierungsmittel ein Gemisch aus Chloroform und Methanol. In einer weiteren Ausführungsform stammt das Phosphorylierungsmittel aus der Gruppe Natriumtrimetaphosphat, Natriumhexametaphosphat, Natriumultraphosphat, Natriumtetrametaphosphat, Phosphorsäureanhydrid und Phosphoryltrichlorid. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform enthält das Phosphorylierungsmittel Natriumtrimetaphosphat.
In einer weiteren Ausführungsform umfasst das erfindungsgemäße Verfahren ferner die folgenden Schritte: Verpressen des entlipidisierten Kollagens zu Presskollagen; Entwässern des Presskollagens, wodurch man zu entwässertem Kollagen gelangt sowie Dispergieren und Trocknen des entwässerten Kollagens, wodurch man Kollagenfasern erhält. In dieser Ausführungsform der erfindungsgemäßen Verfahren werden die Kollagenfasern also getrocknet.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform umfasst das Verfahren ferner den Schritt der Filtersterilisierung des entlipidisierten Kollagens, bevor das entlipidisierte Kollagen mit dem Phosphorylierungsmittel in Kontakt gebracht wird, um zu phosphoryliertem Kollagen zu gelangen.
Die vorliegende Erfindung stellt ferner gereinigtes Kollagen bereit, so dass es biokompatibel ist. In dieser Ausführungsform wird das biokompatible Kollagen hergestellt, indem man: eine kollagenhaltige Probe, ein erstes und zweites proteolytisches Enzympräparat, wobei beide diese proteolytischen Enzympräparate Papain enthalten, und ein Reduktionsmittel, ein Entlipidisierungsmittel und ein Phosphorylierungsmittel bereitstellt; die Kollagenprobe mit dem ersten proteolytischen Enzympräparat in Kontakt bringt und so zu einer ersten Kollagenlösung gelangt; die erste Kollagenlösung mit dem Reduktionsmittel in Kontakt bringt und so zu einer zweiten Kollagenlösung gelangt; die zweite Kollagenlösung mit dem zweiten proteolytischen Enzympräparat in Kontakt bringt und so zu einer proteolysierten Kollagenlösung gelangt; die proteolysier te Kollagenlösung mit dem Entlipidisierungsmittel in Kontakt bringt und so zu entlipidisiertem Kollagen gelangt und das entlipidisierte Kollagen mit dem Phosphorylierungsmittel in Kontakt bringt und so zu phosphoryliertem Kollagen gelangt. In einer bevorzugten Ausführungsform enthält das phosphorylierte Kollagen CollagenPRO^TM.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform enthält das biokompatible Kollagen einen Film oder eine Membran, während in anderen bevorzugten Ausführungsformen das biokompatible Kollagen einen Feststoff enthält, während in anderen alternativ bevorzugten Ausführungsformen das biokompatible Kollagen eine Lösung enthält. In anderen Ausführungsformen ist das biokompatible Kollagen ein getrockneter Film, der vor seinem Auftrag entwässert wird.
Ferner ist vorgesehen, dass das biokompatible Kollagen aus zusätzlichen Verbindungen besteht, einschließlich aber ohne Einschränkung antimikrobielle Mittel, antivirale Mittel, Wachstumsfaktoren, dehydratationverhindernde Verbindungen, antiseptische Mittel oder andere Verbindungen, die sich für biomedizinische und/oder veterinärmedizinische Anwendungen eignen.
Die vorliegende Erfindung sieht auch die Verwendung des gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren auf gereinigten Kollagens zur Herstellung eines Arzneimittels vor, um bei einer blutenden Wunde ein Stillen der Blutung zu erzielen.
Die vorliegende Erfindung sieht auch die Verwendung des wie oben beschrieben aufgereinigten Kollagens zur Herstellung eines Arzneimittels für die Behandlung einer Transplantationsstelle vor.
BESCHREIBUNG DER FIGUREN
1 ist ein Fließdiagramm einer Ausführungsform des Twice Treatment Process^TM (TTP^TM).
2 ist ein Diagramm, das die Phosphorylierung von Serin zu Phosphoserin zeigt.
3 ist ein Balkendiagramm, das die Wundheilungseigenschaften verschiedener Kollagenpräparate zeigt.
4 ist eine graphische Darstellung der Wundheilungseigenschaften und der Blutgerinnungszeiten verschiedener Präparate.
BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft Verfahren zur Herstellung von Kollagen aus Geweben von Menschen oder anderen Tieren. Insbesondere stellt die Erfindung Verfahren zur Herstellung von Kollagen für biomedizinische, veterinärmedizinische und andere Anwendungen bereit.
Die vorliegende Erfindung wurde entwickelt, um sich mit den Problemen zu befassen, die sich im Zusammenhang mit den häufig verwendeten Kollagenpräparaten ergeben. Die vorliegende Erfindung beruht zum Teil auf der Entdeckung, dass Kollagen so hergestellt werden kann, dass alle nichtkollagenen Materialien entfernt werden, während die native molekulare quaternäre Struktur und andere charakteristische Merkmale von Kollagen (z. B. Länge, Durchmesser und Periodizität von Fibrillen von Kollagen Typ 2 wie oben beschrieben) beibehalten werden.
Die erfindungsgemäßen Verfahren erleichtern die enzymatische Entfernung aller fremden Materialien, während die nativen Kollagenmoleküle in ihrer ursprünglichen Faserkonfiguration erhalten bleiben. Die erfindungsgemäßen Verfahren können zur Herstellung von hochgereinigtem Kollagen aus verschiedenen tierischen Quellen (einschließlich menschliche Quellen) verwendet werden, da die meisten, wenn nicht sogar alle, konjugierten Proteolipide und Phospholipide, die das Ursprungskollagen verunreinigen, durch die Verwendung eines bestimmten Gemisches aus organischen Lösungsmitteln entfernt werden. In verschiedenen Ausführungsformen weist das erfindungsgemäße hergestellte Kollagen bessere Wundheilungs- und hämostatische Eigenschaften auf als frühere entwickelte Kollagenpräparate.
Im Gegensatz zu den früher berichteten enzymatischen Verfahren, in denen Papain verwendet wurde (z. B. US-Patent Nr. 3.529.530 und 5.316.942) für Kollagenpräparate, verwenden die erfindungsgemäßen Verfahren ein aus zwei Schritten bestehendes Enzymbehandlungsverfahren. In einer Ausführungsform werden die Kollagenpolymere in dem erfindungsgemäßen, aus zwei Schritten bestehenden Behandlungsverfahren („Twice Treatment Process^TM" oder „TTP^TM") nicht-entzündlich durch Verfahren, in denen Papain zusammen mit Oxidations- und Reduktionsmitteln eingesetzt wird. „Zwei Behandlungen" bezieht sich dabei auf die Verwendung von Papain in zwei Schritten: eine erste proteolytische Behandlung wird durchgeführt, gefolgt von einer Behandlung mit einem Reduktionsmittel, auf die dann eine zweite proteolytische Behandlung folgt. In besonders bevorzugten Ausführungsformen folgt in diesem Verfahren dann die Entfernung von Proteolipiden und Phospholipiden mit einer Lösung aus Chloroform und Methanol. In weiteren Ausführungsformen wird das Kollagen durch unterschiedliche Grade kontrollierter Phosphorylierung biologisch aktiviert.
Die Verwendung von Papain wurde als sicheres Mittel zur Behandlung von Kollagen für menschlichen Gebrauch vorgesehen, weil es traditionell in der Lebensmittelindustrie und in Verbindung mit Wundreinigungsmitteln eingesetzt wird. Im Vergleich mit Pepsin, dem Enzym, das am häufigsten für die Herstellung von Kollagen für biomedizinische Anwendungen verwendet wird, wurden mit Papain bessere Ergebnisse im Hinblick auf verringerte Immunogenität erhalten. Papain ist ein Enzym, das aus der Papaya extrahiert wird und kann bekanntlich die Disulfidbindungen oder Cystein aufbrechen. Da viele immunogene Moleküle Cystindisulfid-Bindungen enthalten, kann Papain verwendet werden, um diese Moleküle abzubauen und sie nicht-immunogen zu machen. Beispielsweise kann Papain zahlreiche natürlich vorkommende Proteine und Peptide sowie Benzoylaminosäureester abbauen (siehe z. B. Smith und Kimmel, Enzymes, The, Band 4, 2. Ausgabe, Academic Press, NY, Seite 138 (1960)). Darüber hinaus soll Papain eine lytische Wirkung auf Elastin, einer der Verunreinigungen, die sich nur schwer aus aufgereinigtem Kollagen entfernen lässt, haben (siehe z. B. Coulson, Biochim. Biophys. Acta 237: 378 (1971); und Smith et al., Nature 198: 1311 (1963)).
Erste Versuche mit einer einstufigen Behandlung mit Papain zur Entfernung von immunogenen Stellen aus Kollagen waren im Hinblick auf die Veränderung der Leistung von aufgereinigtem Kollagen in vivo größtenteils erfolglos (siehe Beispiel 3 unten). Diese Beobachtungen führten zur Entwicklung der erfindungsgemäßen Verfahren, die zum Aufbrechen und Lockern der natürlichen Vernetzungen der Kollagenfasern (z. B. Aldol-Kondensation) führen. Auf diese Weise hat das in der zweiten Behandlung verwendete Papain (d. h. Papain wird in zwei Behandlungsschritten verwendet) Zugang zu den meisten, oder sogar allen Oberflächen der Kollagenmoleküle, wodurch die Freisetzung von eingeschlossenen immunogenen Stellen aus dem Kollagenpräparat erleichtert wird. Diese Entwicklungen führten zu einer erfindungsgemäßen Ausführungsform, bei der Papain in zwei bestimmten Stadien des Verfahrens eingesetzt wird (d. h. vor und nach der Behandlung des Kollagens mit einem Reduktions- und/oder Auffaltungsmittel). Diese Verfahren stellen somit ein Mittel zur Produktion von hochreinem und nicht-immunogenem Kollagen bereit.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist ein Entlipidisierungsverfahren vorgesehen, in dem Lösungsmittel zur Entfernung von Proteolipiden und Phospholipiden verwendet werden. Frühe Versuche zur Entfernung dieser Verbindungen aus Kollagen mit einem einzelnen organischen Lösungsmittel(n), wie z. B. Ether, Aceton, Ethanol, Isopropylalkohol usw., konnten nicht alle Proteolipide oder konjugierte Lipide wie Proteolipide wirksam entfernen (siehe Beispiel 4). Deshalb wurde eine einzigartige Technik entwickelt, in der ein 3 : 1 (v/v) Gemisch aus Chloroform : Methanol zur Entfernung aller Proteolipide und Phospholipide verwendet wurde.
In einer bevorzugten Ausführungsform kann auf gereinigtes Kollagen durch kovalent bindende Phosphate zu Hydroxylgruppen von hydroxylierten Aminosäuren chemisch modifiziert werden, wie dies in Beispiel 6 gezeigt wird. Obwohl sie für das Verständnis der vorliegenden Erfindung nicht notwendig ist, beinhaltet diese Reaktion wahrscheinlich die kovalente Bindung von Phosphat an die Hydroxylgruppe von Serin, Tyrosin und/oder Threonin, Hydroxylysin und Hydroxyprolin. Die Reaktion verläuft kontrolliert, um den Reaktionsgrad einzuschränken. Am Ende dieses Schritts können reaktive Gruppen, die möglicherweise noch im Kollagen zurückgeblieben sind, vollständig zu Phosphoryl, Hydroxyl- oder Sulfonylgruppen umgewandelt werden, indem sie mit Trimetaphosphat oder anderen Wirkstoffen in Kontakt gebracht werden. Das Endprodukt mit unterschiedlichen Graden der chemischen Modifikation oder ohne Modifikation, das in einem physiologischen Puffer entweder löslich oder unlöslich ist, eignet sich für zahlreiche Anwendungen. Auf diese Weise kann das aufgereinigte Produkt auf bestimmte Verwendungszwecke abgestimmt werden. Beispielsweise können bioaktive Reaktionen durch Reaktion des Kollagens mit linearen oder zyklischen Polyphosphaten bei alkalischem pH gefördert werden.
Das endgültige Kollagenpräparat kann als Lösung oder Feststoff verwendet werden und eignet sich für zahlreiche Zwecke, einschließlich aber ohne Einschränkung für biologische Implantate, Prothesen, Transplantate und die Freisetzung von Arzneimitteln. Ferner ist vorgesehen, dass es sich als chirurgisches Hilfsmittel während Transplantationen und zur Verhinderung von postoperativem Lösen eines Implantats, als Hämostatikum, zur Verstärkung von Weichteilen und als Unterstützung für das Zellwachstum in vitro (d. h. in Zellkulturen) eignet.
Bei der Verwendung als Hämostatikum eignet sich das gemäß den erfindungsgemäßen Verfahren hergestellte Kollagen insbesondere zur Kontrolle von Blutungen aus Oberflächen, insbesondere großen Oberflächen. Beispielsweise kann das erfindungsgemäße Kollagen als Hämostatikum auf durchschnittenen oder durchtrennten Knochen, Organen (z. B. Milz, Leber oder Nieren mit chirurgischen oder traumatischen Schnittwunden), dem zentralen Nervensystem mit seiner großen Anzahl kleiner Blutgefäße, bei prothetischen Operationen, auf nässenden Flächen infolge der chirurgischen Abtragung von nekrotischem Gewebe, in der kosmetischen Chirurgie und auf allen Oberflächen, aus denen Blut aus einer oder mehreren Quellen austritt (z. B. Schnittwunden im Gesicht) verwendet werden. Dieses hämostatische Kollagenpräparat kann in unterschiedlichen Formen aufgebracht werden (z. B. als Pulver direkt auf die Oberfläche; als blutstillendes Mittel in Stiftform; als Gel, Schwamm oder in Stoffform). Die verwendete Menge des hämostatischen Kollagenpräparats schwankt je nach Blutungsgrad, zu behandelnder Fläche und Stärke des Blutflusses: die einzige Erfordernis ist, dass die gewünschte Kontrolle erzielt wird.
Definitionen
Zum besseren Verständnis der Erfindung werden unten einige Begriffe erläutert.
Die Begriffe „Untersuchungsmaterial" oder „Probe" werden in der vorliegenden Erfindung und den Ansprüchen untereinander austauschbar und im breitesten Sinn verwendet. Einerseits umfassen sie ein klinisches Untersuchungsmaterial (d. h. eine Probe) oder eine Kultur (z. B. mikrobiologische Kulturen). Andererseits umfassen sie sowohl biologische als auch Umweltproben. Biologische Proben können tierische, einschließlich menschliche, Flüssigkeiten oder Gewebe, Nahrungsmittel oder Inhaltsstoffe sein. Diese Beispiele sollen aber die für die vorliegende Erfindung geltenden Probentypen nicht einschränken.
Die „nichtmenschlichen Tiere" der Erfindung sind alle Tiere außer Menschen. Solche nichtmenschlichen Tiere sind Wirbeltiere, wie z. B. Nagetiere, nichtmenschliche Primaten, Schafe, Rinder, Wiederkäuer, Lagomorphen, Schweine, Pferde, Hunde, Katzen, Vögel usw. Es ist zwar nicht vorgesehen, dass die vorliegende Erfindung auf ein bestimmtes Tier beschränkt wird, aber bevorzugte nichtmenschliche Tiere sind Vieh, wie z. B. Rinder und Schafe.
Wie hierin verwendet bezieht sich der Begriff „Prokollagen" auf das Vorläuferprotein, das in der extrazellulären Matrix unter Bildung von Kollagen aufgespalten wird. Insbesondere bezieht sich Prokollagen auf „pro-α-Ketten", die Vorläufer der Kollagen α-Ketten sind. Pro-α-Ketten enthalten „Pro-Peptide", die für die Bildung der Dreifachhelixgestalt von Prokollagen wichtig sind.
Wie hierin verwendet bezieht sich der Begriff „Kollagen" auf die extrazelluläre Familie der faserigen Proteine, die durch ihre steife, spiralförmige Dreifachstrang-Struktur gekennzeichnet sind. Drei Kollagen-Polypeptid-Ketten („α-Ketten") sind umeinander gewickelt, um dieses spiralförmige Molekül zu bilden. Der Begriff umfasst auch die verschiedenen Arten von Kollagen, aber die bevorzugte Form ist Kollagen Typ I.
Wie hierin verwendet bezieht sich der Begriff „Kollagenprobe" auf jede Kollagenquelle, einschließlich aber ohne Einschränkung Häute, Haut, Sehnen, Blutgefäße, Darm, Leber, Milz, Herzklappe, Knochen usw. Die Quelle der Kollagenprobe soll nicht auf eine bestimmte Gewebequelle oder eine bestimmte Gewebeart beschränkt werden. Die einzige Anforderung ist, dass die Kollagenprobe den Kollagentyp enthält, der aufgereinigt werden soll (z. B. Kollagen Typ I). Die vorliegende Erfindung soll aber nicht auf eine bestimmte Art von aufgereinigtem Kollagen beschränkt werden.
Wie hierin verwendet bezieht sich der Begriff „Kollagenfibrillen" auf die langen dünnen Polymere von Kolla gen, die zu Bündeln gruppiert sind und als „Kollagenfasern" bezeichnet werden. Die „Kollagenmatrix" bezieht sich auf eine extrazelluläre Kollagenmatrix mit der charakteristischen periodischen Querstreifung, die unter dem Elektronmikroskop zu erkennen sein kann. Charakteristisch wird die Kollagenmatrix gebildet, wenn normale Kollagenmoleküle in einer viertelversetzten Anordnung in einer dreidimensionalen Struktur angeordnet werden, die unter dem Elektronenmikroskop als 67nm-Streifung erscheint.
Wie hierin verwendet bezieht sich der Begriff „Presskollagen" auf eine Kollagenprobe, die durch Aufbringen von Druck gepresst wurde. In bevorzugten Ausführungsformen ist das zu pressende Kollagen nasses mit TTP^TM behandeltes und entlipidisiertes Kollagen. Diese Kompression kann mit jedem Mittel durchgeführt werden (d. h. Handpressen oder Pressmaschinen). Diese Kompression soll eine Reihe von Drücken im Bereich von 5.000 bis 50.000 Pfund pro Quadrat-Inch (psi) der Probe (34474–344740 kPa) umfassen. In bevorzugten Ausführungsformen beträgt der aufgebrachte Druck ca. 9.000 (62052 kPa), während in anderen bevorzugten Ausführungsformen der aufgebrachte Druck ca. 30.000 (206841 kPa) beträgt. In besonders bevorzugten Ausführungsformen wird das gepresste Kollagen zu einem Presskuchen geformt.
Wie hierin verwendet bezieht sich der Begriff „entwässertes Kollagen" auf eine Kollagenprobe, die mit einer beliebigen allgemein bekannten Methode aus dem Stand der Technik entwässert wurde. In bevorzugten Ausführungsformen wird entwässertes Kollagen durch Lyophilisierung oder Desikkation hergestellt.
Wie hierin verwendet bezieht sich der Begriff „Trocknung" auf jedes Verfahren zur Entfernung von Wasser aus einer Probe. Der Begriff soll auch Verfahren einschließlich, aber ohne Einschränkung, Lufttrocknung und Erwärmung beinhalten.
Wie hierin verwendet bezieht sich der Begriff „Dispergierung" auf die mechanische Trennung einer Probe. Der Begriff soll zum Beispiel die Trennung der Komponenten beinhalten, die in einem Kuchen aus gepresstem Kollagen enthalten sind. In dieser Ausführungsform sind die Komponenten des Presskuchens zu Fasern dispergiert. In bevorzugten Ausführungsformen wird das Kollagen gerührt und in einer Flüssigkeit suspendiert. Diese Fasern enthalten Kollagenfasern wie oben beschrieben (d. h. Bündel von Kollagenfibrillen). Somit soll diese Definition sowohl native als auch getrocknete Kollagenfasern umfassen.
Wie hierin verwendet bezieht sich der Begriff „Hämostatikum" auf ein Mittel, das den Blutfluss stoppt oder bremst.
Wie hierin verwendet bezieht sich der Begriff „proteolytisches Mittel" auf Papain, das mit Kollagen assoziierte Proteine abbauen kann, aber Kollagen Typ I in seiner nativen Konfiguration lässt. In einigen Ausführungsformen ist aber vorgesehen, dass das proteolytische Mittel die mit den Kollagenfasern verbundenen Vernetzungen in Kollagen aufbricht. Auf diese Weise werden Vernetzungen zwischen den Strängen in den Fasern gelockert, so dass die Fasern ihre Grundform behalten, aber ausreichend Raum zwischen den Fasern bleibt, dass Moleküle, die normalerweise in der Kollagenfaserstruktur eingeschlossen sind, entfernt werden können.
Wie hierin verwendet bezieht sich der Begriff „proteolysiertes Kollagen" auf Kollagen, das mit mindestens einem proteolytischen Enzym behandelt wurde.
Wie hierin verwendet bezieht sich der Begriff „auf gereinigt" auf die Entfernung von Verunreinigungen aus einer Probe. Beispielsweise soll er proteolysiertes Kollagen umfassen. Der Begriff soll nicht auf einen bestimmten Reinheitsgrad beschränkt werden. In bevorzugten Ausführungsformen wird die auf gereinigte Probe aber mit proteolytischen Enzymen behandelt. In besonders bevorzugten Ausführungsformen wurde die aufgereinigte Probe anschließenden Behandlungen unterworfen, einschließlich aber ohne Einschränkung einer Entlipidisierung und/oder Phosphorylierung.
Wie hierin verwendet bezieht sich der Begriff „Reduktionsmittel" auf jede Verbindung oder Verbindungsgemisch, die bzw. das eine andere Verbindung reduzieren kann. In diesem Verfahren wird der Anteil an Wasserstoff erhöht, während der Anteil an Sauerstoff verringert wird und die Anzahl Mehrfachbindungen verringert wird. Insbesondere soll der Begriff jedes Mittel umfassen, das Protein aus ihren nativen Konfigurationen durch Aufbrechen der Disulfidbindungen entfalten kann. Solche Mittel beinhalten, ohne aber darauf beschränkt zu sein, Verbindungen wie z. B. Natriumsulfid, Dithiothreitol, Glutathion und Natriumborhydrid. Der Begriff „reduziertes Kollagen" bezieht sich auf Kollagen, das mit mindestens einem Reduktionsmittel in Kontakt gebracht oder behandelt wurde.
Wie hierin verwendet bezieht sich der Begriff „Phosphorylierungsmittel" auf jede Verbindung oder Verbindungsgemisch, die bzw. das eine andere Verbindung phosphorylieren kann. Solche Verbindungen umfassen, ohne aber darauf beschränkt zu sein, Natriumtrimetaphosphat, Natriumhexametaphosphat, Natriumultraphosphat, Natriumtetrametaphosphat, Phosphorsäureanhydrid und Phosphoryltrichlorid.
Wie hierin verwendet bezieht sich der Begriff „phosphoryliertes Kollagen" auf Kollagen, das zur Erhöhung der Anzahl phosphorylierter Aminosäuren in den Kollagenmolekülen behandelt wurde. Der Begriff soll eine Reihe von Phosphorylierungen umfassen, von einer minimalen Phosphorylierung (d. h. nur eine Aminosäure wurde phosphoryliert) bis zu einer maximalen Phosphorylierung (d. h. alle Aminosäuren, die für die Phosphorylierung zur Verfügung stehen und geeignet sind, wurden phosphoryliert) oder jeder Grad von Phosphorylierung innerhalb dieses Bereiches.
Wie hierin verwendet bezieht sich der Begriff „Entlipidisierungsmittel" auf jede Verbindung oder Verbindungsgemisch, die bzw. das Lipideinheiten entfernen (d. h. entlipidisieren) kann. Insbesondere soll der Begriff Substanzen umfassen, die Moleküle, einschließlich aber ohne Einschränkung Phospholipide, neutrale Lipide, Proteolipide und Glykolipide, aus Kollagen entfernen können. Solche Substanzen beinhalten organische Lösungsmittel wie Chloroform und Methanol. Der Begriff „entlipidisiertes Kollagen" bezieht sich auf Kollagen, das mit mindestens einem Entlipidisierungsmittel in Kontakt gebracht oder behandelt wurde. In besonders bevorzugten Ausführungsformen ist das Entlipidisierungsmittel ein Gemisch aus Chloroform und Methanol im Verhältnis 3 : 1.
Wie hierin verwendet bezieht sich der Begriff „Alkali" auf ein Hydroxyid eines Alkalimetalls (z. B. Lithium, Natrium, Kalium, Rubidium, Cäsium und Francium). Er umfasst auch Substanzen, die eine alkalische Lösung (pH > 7) in Wasser liefern (z. B. CaO, Ca(OH)₂ und Na₂CO₃).
Wie hierin verwendet bezieht sich der Begriff „modifiziertes Kollagen" auf Kollagen, das durch Mittel wie Phosphorylierung, Fluorierung, Halogenierung (z. B. Chlorierung), Sulfonierung und/oder Hydroxylierung chemisch modifiziert wurde.
Wie hierin verwendet bezieht sich der Begriff „filtersterilisiert" auf eine Probe, die auf einen Filter aufgebracht wurde, um unerwünschte Verunreinigungen wie z. B. Bakterien aus der Probe zu entfernen.
Wie hierin verwendet bezieht sich der Begriff „Entepithelialisierung" auf das Verfahren der Entfernung von Epithelgewebe und/oder Zellen aus einer Probe. Der Begriff „Epithel" betrifft das Epithel, d. h. die zelluläre Abdeckschicht der internen und externen Körperoberflächen.
Wie hierin verwendet bezieht sich der Begriff „biokompatibles Kollagen" auf Kollagen, das sich für biomedizinische oder ve terinärmedizinische Anwendungen eignet, einschließlich aber ohne Einschränkung Prothesen und Implantate.
Wie hierin verwendet bezieht sich der Begriff „Biomolekül" auf jedes Molekül, das biomedizinisch oder veterinärmedizinisch angewendet werden kann. Beispielsweise soll der Begriff verschiedene Verbindungen und Substanzen umfassen, einschließlich Kollagen, synthetische Polymere oder andere Materialien, die sich zur Implantation, Transplantation und/oder Grafting eignen.
Der Begriff „Graft/Prothese" bezieht sich auf jedes Gewebe oder Organ zur Implantation oder Transplantation und auf das Verfahren zur Implantation oder Transplantation dieses Gewebes. Beispielsweise ist ein Hauttransplantat ein Stück Haut oder anderes Gewebe oder Material, das transplantiert wird, um einen verlorenen Hautteil zu ersetzen. Der Begriff soll auch Materialien, wie z. B. aufgereinigtes Kollagen oder andere geeignete biokompatible Substanzen zum Ersatz von verlorenen oder beschädigten Geweben oder Organen umfassen. Insbesondere bezieht sich der Begriff „Graft" hierin auf den Ersatz von Haut oder anderen Geweben oder Organen, die der Umgebung ausgesetzt sind. Beispielsweise kann der Begriff sich auf Gewebe wie Haut, Kutangewebe, Schleimhäute, Bindehaut usw. beziehen. Der Begriff soll aber nicht auf eine bestimmte Gewebeart beschränkt sein.
Der Begriff „Transplantat" bezieht sich auf Gewebe, das für Grafting, Implantation oder Transplantation verwendet wird aber auch auf den Transfer von Geweben von einer Körperstelle an eine andere, oder auf den Transfer von Geweben von einer Person zu einer anderen, oder auf die Einführung von biokompatiblen Materialien in oder auf den Körper. Der Begriff „Transplantation" bezieht sich auf die Transplantation von Gewebe von einem Körperteil auf einen anderen oder auf eine andere Person. Das Gewebe oder Organ, das für die Transplantation oder das Grafting verwendet wird, soll aber auch Materialien wie z. B. Kollagen, das nach den erfindungsgemäßen Verfahren auf gereinigt wurde, umfassen. Das Graft oder Transplantat soll daher nicht auf natürlich vorkommende Gewebe beschränkt sein.
Wie hierin verwendet bezieht sich der Begriff „Implantation" auf die Einführung eines Organs oder Gewebes in eine neue Körperstelle sowie die Einführung von biokompatiblem, biologischem, lebendem, inertem oder radioaktivem Material in den Körper. Der Begriff „implantieren" bezieht sich auf das Verfahren des Einführens oder Transplantieren von Gewebe, inertem, lebendem, radioaktivem oder biokompatiblem Material in intakte Gewebe oder eine Körperhöhle, sowie auf das so eingesetzte oder transplantierte Material.
Wie hierin verwendet bezieht sich der Begriff „Lappen" auf eine Gewebemasse zum Transplantieren, in der Regel Haut, die nur teilweise von einem Teil des Körpers entfernt wird, so dass sie während der Überführung zu einer anderen Körperstelle oder einer anderen Person ihre eigene Blutversorgung behält. Der Begriff soll auch Gewebemassen für die Transplantation oder Implantation umfassen, die vor ihrer Transplantation oder Implantation in vitro gezüchtet wurden.
VERSUCHE
Die folgenden Beispiele sollen bestimmte bevorzugte Ausführungsformen und Aspekte der vorliegenden Erfindung zeigen und weiter veranschaulichen, aber den Umfang nicht einschränken.
In den folgenden Versuchen gelten folgende Abkürzungen: Eq (Äquivalente); M (molar); μM (mikromolar); N (normal); mol (Mol); mmol (Millimol); μmol (Mikromol); nmol (Nanomol); g (Gramm); mg (Milligramm); μg (Mikrogramm); ng (Nanogramm); l (Liter); ml (Milliliter); μl (Mikroliter); cm (Zentimeter); mm (Millimeter); μm (Mikrometer); nm (Nanometer); A (Ångström); xg oder × g (mal Schwerkraft); w/w (Gewicht zu Gewicht); w/v (Gewicht zu Volumen); °C (Grad Celsius); U/min (Umdrehungen pro Minute); physiologische Kochsalzlösung (0,9% NaCl-Lösung, pH 6.2 ± 0.3); Harlan Sprague Dawley (Harlan Sprague Dawley. Inc., Madison, WI); Fisher (Fisher Scientific, Pittsburgh, PA); Sigma (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO); Aldrich (Aldrich Chemical Company. Inc., Milwaukee, WI); Spectrum (Spectrum Chemicals, Inc., Gardena, CA); American (American Dade, Division of American Hospital Supply Co., Dade, FL); PDL (Protein Design Laboratories, Mountain View, CA); Nitabell Rabittry (Nitabell Rabittry, Hayward, CA); Axygen (Axygen, Inc., Hayward, CA); Arizona Health Sciences (Arizona Health Sciences Center, Tucson, AZ); Collaborative Research (Collaborative Research, Inc., Bedford, MA); Medchem Products (Medchem Products, Woburn, MA); Collatek (Collatek, Inc., Plainsboro, NJ); Boehringer Mannheim (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN); J & J Medical (J & J Medical, Inc., Arlington, TX); Axygen (Axygen Inc., Hayward, CA); Papain Products (Papain Products, Tamilnadu, Indien); Beckman (Beckman Instruments, Inc., Fullerton, CA); und Brinkmann (Brinkmann Instruments, Inc., Westbury, NY).
Sofern nichts anderes angegeben ist, wurden alle Chemikalien von kommerziellen Anbietern, wie z. B. Sigma, Fisher oder Spectrum, erhalten. Alle in diesen Beispielen verwendeten Lösungsmittel stammen von Spectrum Chemicals und waren für die Spektrophotometrie oder als Reagenzien bestimmt. Das in diesen Beispielen verwendete Papain wurde von Sigma oder Papain Products erhalten.
BEISPIEL 1
Isolierung und Aufreinigung von Kollagen mit Papain
In diesem Beispiel wurde Kollagen aus enthaarten Rinderhäuten in einem einstufigen Enzymbehandlungsverfahren aufgereinigt.
Zunächst wurden 100 g saubere enthaarte Rinderhaut aus einem örtlichen Schlachthaus in Stücke mit einer Dicke von ca. 1 cm und einer Länge von ca. 10 cm gehackt oder geschnitten. Die geschnittenen Scheiben wurden in drei Liter eines Waschpuf fers gewaschen, der doppelt destilliertes Wasser mit 30 g NaCl, 3 g ZnCl, 4,5 mg Methylparaben, 0,9 g Propylparaben enthielt. In einigen Versuchen enthielt der Waschpuffer 30,0 g NaCl, 3 g ZnCl, 4,5 g Methylparaben und 1,5 g Trichlorphenat oder 3 g Hypochlorit. In den gereinigten Kollagenpräparaten, die diese unterschiedlichen Waschpuffer verwenden, wurden keine Unterschiede beobachtet. Die Wäsche erfolgte 6–8 Stunden bei 5–15°C unter ständigem Rühren mit einem Rotator (Modell Nr. 4140, American). Der Waschvorgang wurde zweimal wiederholt, wobei die Flüssigkeit nach jeder Wäsche von den Feststoffen abgegossen wurde. Der wiederholte Waschvorgang entfernte den größten Teil der Albumine und Globuline, die normalerweise ca. 1–5% des Trockengewichts der Probe ausmachen.
Vor Verabreichung der Enzymbehandlung wurde die Probe entepithelialisiert. Bei diesem Verfahren wurde 1 Liter kalter entepithelialisierter Puffer, der kaltes entionisiertes Wasser mit 24 g NaOH und 56 g Calciumoxid enthielt, der zuvor gewaschenen Probe hinzugefügt, und die Probe wurde 15 Minuten bei 5000 × g zentrifugiert, um feste Materialstücke zu erhalten. Die Probe wurde auf einem Rotator bei 80–100 U/min 48 Stunden bei 15°C gerührt. Die Entepithelialisierungslösung wurde alle 16 Stunden ersetzt. Am Ende des 48-Stunden-Zeitraums wurden die Stücke 2 Stunden in 3 Liter entionisiertem Wasser unter Rühren bei 80–100 U/min eingeweicht und die Feststoffe wurden durch Zentrifugation bei 5000 × g über 15 Minuten gewonnen. 100 g Borsäure, gelöst in 3 Liter entionisiertem Wasser, das auf 4°C vorgekühlt war, wurde hinzugefügt und die Probe wurde 16 Stunden bei 4°C gerührt. Der pH wurde gemessen und auf ca. 8,3 eingestellt. Die Probe wurde pro Wäsche 2 Stunden zweimal mit je 3 Liter entionisiertem Wasser gewaschen und die Feststoffe wurden durch Zentrifugation wie oben beschrieben gewonnen. Obwohl dieses Verfahren in diesem Beispiel verwendet wurde, gibt es verschiedene verfügbare Verfahren zur Erzielung der Entepithelialisierung der Proben, die im Stand der Technik bekannt sind. Jedes dieser Standardverfahren, die dem Fachmann zur Verfügung stehen, kann er folgreich zur Erzielung der gewünschten Entepithelialisierung eingesetzt werden.
Nach der Wäsche wurde die Probe in einer einstufigen enzymatischen Behandlung mit Papain behandelt. In diesem Verfahren wurde die Probe 2 Stunden bei Raumtemperatur weiter in 3 Liter pyrogenfreiem entionisiertem Wasser gewaschen. Die Probe wurde 15 Minuten bei 5000 × g zentrifugiert und abgegossen. Ein Liter physiologische Kochsalzlösung wurde der Probe dann hinzugefügt. Papain (Sigma oder Papain Products) wurde in einer Rate von 1–2 mg pro ml Gesamtvolumen (d. h. 1 Liter) unter ständigem Rühren hinzugefügt. Nach Hinzufügen von Papain wurde die Lösung unter Rühren mit einem Rotator mit 80–100 U/min ca. 16 Stunden bei 37°C inkubiert.
Nach dieser ersten Enzymbehandlung wurde das überschüssige Wasser abgeschüttet und die Feststoffe wurden dreimal mit 2 Liter entionisiertem Wasser gewaschen. Ein Liter 0,2 M Natriumborhydrid wurde dann den gewaschenen Feststoffen hinzugefügt. Die Feststoffe wurden 3 Stunden unter Rühren mit einem Rotator bei 80–100 U/min inkubiert. Das überschüssige Wasser wurde abgegossen und die Feststoffe wurden dreimal mit 2 Liter entionisiertem Wasser gewaschen.
Robuste Behandlung
Zusätzlich zur normalen Enzymbehandlung und anschließender Reduktionsbehandlung wie oben beschrieben wurde auch eine „Robuste Behandlung" geprüft. In dieser Behandlung wurde eine im Vergleich mit der „normalen" Behandlung vielfach erhöhte Inkubationszeit und Enzymkonzentration verwendet. Obwohl die restlichen Schritte dieselben waren wie für die normale Behandlung beschrieben (d. h. das in der „Robusten Behandlung" verwendete Kollagen wurde mit derselben Rinderhaut und denselben Schneid- und Waschschritten hergestellt), wurde in der Robusten Behandlung 4 mg Papain pro ml Lösung hinzugefügt und im enzymatischen Behandlungsschritt wurde 24 Stunden inku biert, anstatt 1 mg Papain pro ml Lösung und 16 Stunden Inkubationszeit.
Die Menge der restlichen Verunreinigungen und Kollagen in dieser Zubereitung wurde bestimmt und mit den Ergebnissen verglichen, die mit den in Beispiel 2 beschriebenen Verfahren erhalten wurden.
BEISPIEL 2
Isolierung und Aufreinigung von Kollagen Typ I
Dieses Beispiel beschreibt die Verfahren und Aspekte der Entwicklung des „Twice-Treatment Process^TM" (TTP^TM) einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung.
In diesem Beispiel wird der „Twice-Treatment Process^TM" (TTP^TM) beschrieben. In diesem Beispiel wurde Kollagen Typ I aus enthaarter Rinderhaut auf gereinigt. Zunächst wurden 100 g saubere enthaarte Rinderhaut aus einem örtlichen Schlachthaus in Stücke mit einer Dicke von ca. 1 cm und einer Länge von ca. 10 cm gehackt oder geschnitten. Die geschnittenen Scheiben wurden in drei Liter eines Waschpuffers gewaschen, der doppelt destilliertes Wasser mit 30 g NaCl, 3 g ZnCl, 4,5 g Methylparaben, 0,9 g Propylparaben enthielt. In einigen Versuchen enthielt der Waschpuffer 30,0 g NaCl, 3 g ZnCl, 4,5 g Methylparaben und 1,5 g Trichlorphenat oder 3 g Hypochlorit. In den gereinigten Kollagenpräparaten, die diese unterschiedlichen Waschpuffer verwenden, wurden keine Unterschiede beobachtet. Die Wäsche erfolgte 6–8 Stunden bei 5–15°C unter ständigem Rühren mit einem Rotator (Modell Nr. 4140, American) bei 80–100 U/min. Der Waschvorgang wurde zweimal mit 15-minütiger Zentrifugation bei 5000 × g wiederholt, wobei der Überstand jedes Mal abgegossen wurde. Der wiederholte Waschvorgang entfernte den größten Teil der Albumine und Globuline, die normalerweise ca. 1–5% des Trockengewichts der Probe ausmachen.
Vor Verabreichung der Enzymbehandlung wurde die Probe entepithelialisiert. Bei diesem Verfahren wurde 1 Liter kalter entepithelialisierter Puffer, der kaltes entionisiertes Wasser mit 24 g NaOH und 56 g Calciumoxid enthielt, der zuvor gewaschenen Probe hinzugefügt, und die Probe wurde 15 Minuten bei 5000 × g zentrifugiert, um feste Materialstücke zu erhalten. Die Probe wurde auf einem Rotator bei 80–100 U/min 48 Stunden bei 15°C gerührt. Die Entepithelialisierungslösung wurde alle 16 Stunden ersetzt. Am Ende des 48-Stunden-Zeitraums wurden die Stücke 2 Stunden in 3 Liter entionisiertem Wasser unter Rühren bei 80–100 U/min eingeweicht und die Feststoffe wurden durch Zentrifugation bei 5000 × g über 15 Minuten gewonnen. 100 g Borsäure, gelöst in 3 Liter entionisiertem Wasser, das auf 4°C vorgekühlt war, wurde hinzugefügt und die Probe wurde 16 Stunden bei 4°C gerührt. Der pH wurde gemessen und auf ca. 8,3 eingestellt. Die Probe wurde pro Wäsche 2 Stunden zweimal mit je 3 Liter entionisiertem Wasser gewaschen und die Feststoffe wurden durch Zentrifugation wie oben beschrieben gewonnen. Obwohl dieses Verfahren in diesem Beispiel verwendet wurde, gibt es verschiedene verfügbare Verfahren zur Erzielung der Entepithelialisierung der Proben, die im Stand der Technik bekannt sind. Jedes dieser Standardverfahren, die dem Fachmann zur Verfügung stehen, kann erfolgreich zur Erzielung der gewünschten Entepithelialisierung eingesetzt werden.
Nach der Wäsche wurde die Probe mit TTP^TM behandelt. In diesem Verfahren wurde die Probe 2 Stunden bei Raumtemperatur weiter in 3 Liter pyrogenfreiem entionisiertem Wasser gewaschen und das Wasser wurde abgegossen. Ein Liter physiologische Kochsalzlösung wurde der Probe dann hinzugefügt. Papain wurde in einer Rate von 1–2 mg pro ml Gesamtvolumen (d. h. 1 Liter) unter ständigem Rühren hinzugefügt. Nach Hinzufügen von Papain wurde die Lösung unter Rühren mit einem Rotator mit 80–100 U/min ca. 16 Stunden bei 37°C inkubiert.
Nach dieser ersten Enzymbehandlung wurde das überschüssige Wasser abgeschüttet und die Feststoffe wurden dreimal mit 2 Liter entionisiertem Wasser gewaschen. Ein Liter 0,2 M Natriumborhydrid wurde dann den gewaschenen Feststoffen hinzugefügt. Die Feststoffe wurden 3 Stunden unter Rühren mit einem Rotator bei 80–100 U/min inkubiert. Das überschüssige Wasser wurde abgegossen und die Feststoffe wurden dreimal mit 2 Liter entionisiertem Wasser gewaschen. Anschließend wurde die zweite Enzymbehandlung an den Feststoffen durchgeführt, wobei das oben für die erste Enzymbehandlung beschriebene Verfahren verwendet wurde. Ein starkes Reduktionsmittel erwies sich als absolut notwendig. Obwohl es für das Verständnis oder die Verwendung der vorliegenden Erfindung nicht wesentlich ist, kann es sein, dass dieses starke Reduktionsmittel eine reversibel reaktive Gruppe stabilisiert, die nach der ersten Enzymbehandlung zurückbleiben kann. Dieser Schritt verringerte auch die Menge an Aldehyd, das möglicherweise an Aldol-Kondensationsreaktionen beteiligt sein kann (d. h. Reaktionen zwischen zwei Aldehydgruppen) oder an Schiff-Basen-Reaktionen (d. h. Reaktionen zwischen einer Aldehydgruppe und einer Aminogruppe (siehe z. B. Nimni et al. „Bioprosthesis derived from crosslinked and chemically modified collagenous tissues." in Collagen, Band 3, M. E. Nimni et al., CRC Press, Inc., Boca Raton, FL (1988), Seite 5). Es kann auch die Interketten-Disulfid-Bindungen in der spiralförmigen Region desselben Moleküls, die nur in Kollagen Typ III vorliegen, verringern (siehe z. B. D. Amiel et al. „Biochemistry of tendon and ligament" in Collagen, Band 3, Seite 229, supra).
Nach der zweiten Enzymbehandlung wurde das überschüssige Wasser abgeschüttet und die Feststoffe wurden dreimal mit 2 Liter entionisiertem Wasser gewaschen. Obwohl es für das Verständnis der vorliegenden Erfindung nicht wesentlich ist, kann es sein, dass die erste Enzymbehandlung das Kollagen in der Zubereitung soweit freisetzt, dass es für einen weiteren Angriff durch ein Reduktionsmittel (z. B. Natriumsulfid, Thiothreitol, Dithiothreitol, Glutathion oder Natriumborhydrid) mit oder ohne alkalische Verbindungen zum Aufquellen des Kollagens empfänglich ist. Nach der chemischen Behandlung wurde eine zweite Behandlung mit Papain durchgeführt, um alle rest lichen nicht-kollagenen Verunreinigungen (z. B. interstitielles Elastin) gründlich zu entfernen.
Kollagen, das gemäß der zweistufigen enzymatischen Behandlung hergestellt wurde, und Kollagen, das mit der in Beispiel 1 beschriebenen einstufigen enzymatischen Behandlung hergestellt wurde, wurde untersucht, um den Grad der Entfernung der nicht-kollagenen Faserproteine (z. B. Elastin) wie in Beispiel 3 beschrieben festzustellen.
BEISPIEL 3
Gehalt an unlöslichen nicht-kollagenen Proteinen (Elastin) In diesem Beispiel wurden verschiedene Proben von Kollagenzubereitungen auf ihren Gehalt an nicht-kollagenem unlöslichem Protein mit den von Soskel et al. (N. T. Soskel et al., Meth. Enzymol., 144: 199 (1952)) beschriebenen Verfahren untersucht. Die in diesem Beispiel untersuchten Proben wurden wie unten beschrieben behandelt.
Kurz gesagt wurden ca. 25 g einer nassen Testprobe wurden mit einem 2 : 1-Gemisch aus Chloroform und Methanol (v/v) entlipidisiert. Die Proben wurden in flüssigem Stickstoff eingefroren und zu Stücken zerdrückt. Die Stücke wurden dann in 100% Isopropylalkohol gelegt, um ein Bakterienwachstum zu vermeiden. Die Stücke wurden anschließend 15 min bei 5000 xg zentrifugiert, die Überstände wurden abgegossen und die Pellets wurden bei 60°C an der Luft getrocknet. Die getrockneten Proben wurde anschließend in einem Desikkator auf Raumtemperatur gebracht, und ca. 10 g jeder Probe wurden in 200 ml Polypropylen-Röhrchen überführt. 100 ml 0,1 N NaOH bei 4°C wurde jedem Röhrchen hinzugefügt und der Inhalt wurde vermischt. Die Röhrchen wurden dann 45 Minuten in ein kochendes Wasserbad gestellt. Da der Abbau von Elastin nach 60 Minuten beginnt, wurde es als wichtig angesehen, die Röhrchen nach 45 Minuten aus dem kochenden Wasserbad zu nehmen. Die Proben wurden dann mit kaltem 0,1 N NaOH und anschließend mit kaltem doppelt destilliertem Wasser gewaschen. Die Proben wurden über P₂O₅ getrocknet oder lyophilisiert, um Feuchtigkeitseinschluss in den Proben zu vermeiden, der zu einem höheren Messgewicht führen würde. Die Proben wurden bis zum Gebrauch in einem Desikkator aufbewahrt. Die Proben wurden für die gravimetrische Quantifizierung auf ein konstantes Gewicht gebracht (d. h. die Proben wurden wiederholt gewogen, bis keine Gewichtsschwankungen mehr vorlagen).
Tabelle 1 zeigt die Ergebnisse, als Trockengewicht in %, von 10 der getrockneten Ausgangsproben. In dieser Tabelle stammen die Ergebnisse von Proben, die mit den „normalen" und „robusten" (d. h. die in Beispiel 1 beschriebene robuste Behandlung) Papain-Enzymbehandlungen hergestellt wurden. In dieser Tabelle bezieht sich „Nur Enzym" auf eine Probe, die nach dem Verfahren von Beispiel 1 bearbeitet wurde (d. h. sie wurde ohne Reduktionsmittel bearbeitet – die erste Enzymbehandlung wurde durchgeführt und das Behandlungsverfahren wurde angehalten).
In diesem Versuch wurden Proben, die nach der oben beschriebenen TTP-Methode hergestellt wurden, sowie Proben, die nach der in Beispiel 1 beschriebenen „Robusten Behandlung" hergestellt wurden, untersucht. Darüber hinaus wurden zwei weitere Proben mit der normalen Behandlung und der robusten Behandlung geprüft. Die Probe „Enzym->Reduktionsmittel" bezieht sich auf eine Probe, die nach einer Enzymbehandlung und einem Reduktionsschritt untersucht wurde (d. h. die erste Enzymbehandlung aus Beispiel 2, gefolgt von dem Reduktionsschritt aus Beispiel 2).
Die als „Reduktionsmittel->Enzym" bezeichnete Probe bezieht sich auf eine Probe, die nach einem Reduktionsschritt und anschließender Enzymbehandlung untersucht wurde. Diese Probe „Reduktionsmittel->Enzym" stammt aus derselben Kollagenquelle und wurde wie in Beispiel 1 und 2 beschrieben geschnitten und gewaschen. Die Testprobe wurde zunächst mit dem in Beispiel 2 beschriebenen Reduktionsverfahren reduziert, aber ohne die erste Enzymbehandlung. Nach diesem Reduktionsschritt wurden die für die erste Enzymbehandlung beschriebenen Verfahren an der reduzierten Probe durchgeführt.
Die als „TTP^TM behandelte" Probe bezeichnete Probe wurde nach den Verfahren von Beispiel 2 hergestellt. Da mit den normalen Methoden der TTP^TM Behandlung kein unlösliches nicht-kollagenes Protein nachgewiesen werden konnte, wurde auf die robuste Version dieses Verfahrens verzichtet. Die Eigenschaften dieser TTP^TM-behandelten Probe werden in Beispiel 5 unten ausführlicher beschrieben.
Die unbehandelte Kontrolle enthielt 1,24 ± 0,190% Trockengewicht von nicht-kollagenem unlöslichem Protein, während die mit dem TTP-Verfahren hergestellte Probe keinen nachweisbaren Gehalt (Trockengewicht) an nicht-kollagenem unlöslichem Protein enthielt. Diese Ergebnisse zeigen, dass in diesem Versuch signifikant mehr nicht-kollagenes Fremdprotein entfernt wurde als bei dem Kollagen, das mit nur einem Enzymbehandlungsschritt wie in Beispiel 1 beschrieben hergestellt wurde.
Tabelle 1
BEISPIEL 4
Entlipidisierung von TTP^TM-behandeltem Kollagen
In diesem Beispiel wurde wie in Beispiel 2 beschriebenes TTP^TM-behandeltes Kollagen zur Entfernung von weiteren potenziell immunogenen Stellen von dem TTP^TM-behandelten Kollagen entlipidisiert.
Fraktionierte Salzpräzipitation
Zunächst wurde das TTP^TM-behandelte Kollagen Typ I durch fraktionierte NaCl-Salzpräzipitation wie von Hill und Harper (R. J. Hill und E. Harper, Anal. Biochem., 141: 83–93 (1984)) beschrieben getrennt. Kurz gesagt wurde das enzymbehandelte Kollagen wurde in 0,5 M NaCl in tris(Hydroxymethylaminomethanpuffer) bei pH 7,4 gelöst. Die NaCl-Konzentration wurde anschließend auf 1,7 M erhöht. Die Lösung wurde gemischt und 1 Stunde bei 10000 × g und 0–4°C zentrifugiert. Das entwässerte Präzipitat wurde gemischt und in 0,5 M Essigsäure gelöst, und der pH-Wert wurde auf 7,0 eingestellt. Natriumchlorid wurde bis zu einer Endkonzentration von 2,5 M hinzugefügt und das Präzipitat wurde in einem weiteren Zentrifugationsschritt wie oben gewonnen.
Das ausgefällte Kollagen wurde dann gegen entionisiertes Wasser dialysiert und vor der Entlipidisierung für die quantitative Analyse des Lipidgehalts in der Kollagenprobe lyophilisiert.
In späteren Versuchen wurde gefunden, dass diese fraktionierte Salzpräzipitation häufig nicht notwendig war, da sie keinen Einfluss auf den Reinheitsgrad des TTP^TM-behandelten Kollagenprotokolls vom Typ I hatte. Dieser Schritt kann aber vor der Entlipidisierung durchgeführt werden.
Entlipidisierung
Das Kollagenpräparat wurde dann mit dem Verfahren von Folch et al. (Folch et al., J. Biol. Chem., 226: 497–509 (1957)) mit Abwandlungen entlipidisiert. Dieser Schritt umfasste die Lösungsmittelextraktion der Gesamtlipide, einschließlich Ganglioside und Phospho-Inosite. Kurz gesagt wurde das Kollagenpräparat wurde in einem Gemisch aus Chloroform und Methanol (2 : 1, v/v) gerührt. Das Volumen von Chloroform : Methanol betrug das 20fache des Volumens der Kollagenprobe (d. h. 20 Teile des Chloroform : Methanol-Gemisches wurde 1 Teil Kollagenprobe hinzugeführt). Die Probe wurde dabei gut gerührt und eine Stunde bei 40–45°C kräftig geschüttelt.
Das Homogenisat wurde in eine Ampulle überführt und 0,2 Volumen von 0,88% KCl wurde hinzugefügt. Die beiden Phasen des Gemisches wurden in einem Abtrenntrichter getrennt. Die untere Phase mit den Hauptlipiden wurde entfernt und die obere Phase, die das Kollagen enthielt, wurde zweimal mit einem Gemisch aus Chloroform, Methanol und Wasser im Verhältnis 3 : 48 : 47 (v/v) gewaschen. Das Kollagenpräparat wurde dann mit einem 5 : 80 : 15-Gemisch (v/v) derselben Bestandteile (d. h. Chloroform, Methanol und Wasser) gewaschen und mit einem Druck von 9000 ± 1000 psi unter Verwendung einer Handpresse entwässert. Dadurch wurde das Wasser aus dem Kollagenpräparat gedrückt, um eine entwässerte Masse zu erhalten. Für diesen Schritt können aber auch Drücke im Bereich von ca. 8000 psi bis 30000 psi verwendet werden. Durch Aufbringen von Druck von 8000 psi wird das gesamte Fremdwasser von der Außenseite der Moleküle entfernt, während ein Druck von ca. 30000 psi sogar das intramolekulare Wasser entfernt. Die vorliegende Erfindung soll aber nicht auf diese speziellen Drücke beschränkt werden.
Der Presskuchen wurde anschließend in einer Kaffeemühle dispergiert und in einem belüfteten Trocknungsofen bei 40–45°C an der Luft getrocknet. Die Reinheit der entlipidisier ten Probe wurde dann auf Phospholipide, neutrale Lipide und Glycolipide wie unten beschrieben untersucht.
Der Nachweis von Phospholipiden in den Proben erfolgte mithilfe von Dünnschichtchromatographie (DC) wie von Skipski et al. (Skipski et al., Biochem. J., 90: 374–378 (1964)) beschrieben. Kurz gesagt wurde 10 g der entlipidisierten Probe wurden mit einer Kieselgel-DC-Methode untersucht. Zur Vorbereitung der TLC-Platte wurde zunächst eine Aufschlämmung von 45 g Kieselgel H (Spectrum) in 65 ml entionisiertem Wasser hergestellt. Die Aufschlämmung wurde auf eine saubere Glasplatte (20 cm × 20 cm) auf eine Dicke von 0,5 mm gegossen, an der Luft getrocknet und 60 Minuten bei 60°C aktiviert (d. h. ausgehärtet), auf Raumtemperatur gekühlt und sofort verwendet. Eine bekannte Menge von extrahiertem Lipid (200 μl) wurde als Streifen auf das getrocknete Kieselgel aufgetragen, ca. 2 cm vom Boden der Platte. Die Probe wurde an der Luft getrocknet und dann in ein Irrigationsmedium aus Chloroform : Methanol : wässriger Ammoniak (28%) im Verhältnis 65 : 25 : 5 (v/v) in einer Glaskammer gebracht. Sobald die Lösungsmittelfront sich der Oberseite der Platte annäherte, wurden die Platten aus der Glaskammer entfernt und an der Luft getrocknet. Die Platten wurden dann mit Joddampf entwickelt. An den Stellen, an denen Phospholipide vorlagen, erschienen gelblich braune Flecken. Die Quantifizierung der vorliegenden Phospholipide erfolgte mit den Verfahren von Fiske und Subbarow wie in Beispiel 7 unten beschrieben. Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 unten gezeigt.
Die Anwesenheit von neutralen Lipiden und Glykolipiden in dem TTP^TM-behandelten Kollagen wurde mit einem chromatographischen Verfahren mit Kieselsäure-Säule wie von Rouser et al. (G. Rouser et al., Lipids 2: 37–40 (1967)) beschrieben, bestimmt. Kurz gesagt wurde eine Säule (10 mm × 20 mm) mit Kieselsäure (Spectrum) wurde vorbereitet und 10 g des entlipidisierten Kollagens wurde in sequentiellen Anteilen von jeweils 2 Gramm auf die Säule aufgebracht. So wurde die gesamte Probe von 10 g in fünf Durchläufe auf der Säule getrennt; die eluierten Proben wurde alle zusammengefasst. Die Probe wurde mit 160 ml Chloroform : Aceton (1 : 1, v/v) und dann mit einer Reihe von Aceton- und Aceton : Wasser-Lösungen eluiert. Die eluierten neutralen und Glykolipide wurden von der Säule gesammelt, an der Luft getrocknet und gravimetrisch geschätzt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 gezeigt.
Für Vergleichszwecke wurden mehrere Proben der vor dem oben beschriebenen Entlipidisierungsschritt hergestellten lyophilisierten Kollagenproben einer Lipidextraktion mit unterschiedlichen organischen Lösungsmitteln unterworfen. 15 g der trockenen Probe wurden in mehrere Behälter gegeben. Anschließend wurde jedem Behälter 100 ml jedes der Lösungsmittel hinzugefügt (d. h. ein Lösungsmittel wurde jeder Probe hinzugefügt). Die in diesem Versuch verwendeten Lösungsmittel waren Ether, Hexan, Methanol, Ethanol, Isopropylalkohol, Benzol, Chloroform, Aceton und Chloroform : Methanol (2 : 1). Die Behälter wurden unter Rühren in einem Orbitalrotator bei 100 U/min 6 Stunden bei ca. 40°C inkubiert. Die Lösungsmittel wurden dann durch Zentrifugation von den Kollagenproben getrennt und verdunstet. 10 g jeder der mit unterschiedlichen Lösungsmitteln behandelten entlipidisierten und getrockneten Proben wurden für Lipidschätzungen wie oben beschrieben verwendet. Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 unten gezeigt. In dieser Tabelle sind die Anteile ausgedrückt als prozentualer Anteil des gesamten Trockengewichts an Kollagen in der Probe.
Tabelle 2
Wie in Tabelle 2 zu sehen wurden in den mit Chloroform : Methanol extrahierten Proben, die wie oben beschrieben hergestellt wurden, keine nachweisbaren Mengen an Phospholipiden, neutralen Lipiden und Glykolipiden gefunden. Im Gegensatz dazu zeigten dieselben Proteinproben nachweisbare Mengen von Phospholipiden, neutralen Lipiden und/oder Glykolipiden, wenn die Entlipidisierung mit den traditionellen Verfahren durchgeführt wurde (z. B. unter Verwendung eines einzelnen Lösungsmittelsystems wie z. B. Ether, Hexan, Methanol, Ethanol, Isopropylalkohol, Benzol, Chloroform oder Aceton). Diese Phospholipide, neutralen Lipide und/oder Glykolipide sind in diesen Proben auch nach längerer Extraktion (z. B. mehrere Tage) bei Raumtemperatur oder leicht erhöhten Temperaturen (z. B. 50°C) nachweisbar.
BEISPIEL 5
Gehalt an Cystein, Hydroxyprolin und Hexosamin und Elastin (unlösliches nicht-kollagenes Protein) in TTP^TM-behandeltem Kollagen
In diesem Beispiel wurde der Gehalt von Cystein, Hydroprolin, Hexosamin und Elastin von entlipidisiertem und TTP^TM-behandeltem Kollagen bestimmt. Der Hydroxyprolin-Gehalt gilt als Maß für die Kollagenmenge in der Probe.
Die entlipidisierte und entwässerte Kollagenprobe Typ I wurde in 0,1 M Essigsäure auf eine Konzentration von 0,3% (w/v) rekonstituiert. Die Reinheit des Kollagens wurde mittels HPLC bestimmt, um den Aminosäurengehalt mit einem Beckman 6300 Aminosäurenanalysator gemäß den Anweisungen des Herstellers zu bestimmen. Der Cysteingehalt der Probe wurde bestimmt und der Cysteingehalt eines Kollagenpräparats, das „weniger phosphoryliert" war, wie in Beispiel 6 beschrieben, wurde bestimmt. Diese Ergebnisse zeigten, dass der Molanteil des TTP^TM-behandelten Kollagens und des „weniger phosphorylierten" Kollagens 0,09 betrug.
Darüber hinaus wurde der Gehalt an unlöslichem nicht-kollagenem Protein (d. h. Elastin) von mit TTP^TM behandeltem Kollagen mithilfe der in Beispiel 3 beschriebenen Methoden zum Untersuchen des Gehalts an unlöslichem nicht-kollagenem Protein von Kollagen bestimmt. Da Elastin das einzige nicht-kollagene Protein war, das potenziell in dem TTP^TM-behandelten Kollagenpräparat vom Typ I blieb, wurde davon ausgegangen, dass es wichtig ist, den Elastingehalt dieses Präparats zu bestimmen und mit dem Gehalt von Kollagen zu vergleichen, das mit anderen Verfahren behandelt worden war (z. B. das phosphorylierte Kollagen von Beispiel 6). Die Ergebnisse dieser Versuche sind in Tabelle 3 unten gezeigt. Diese Ergebnisse sind als prozentualer Anteil (Gewicht/Gewicht) auf Trockengewichtsbasis ausgedrückt.
Der Hydroxyprolin- und Hexosamingehalt des entlipidisierten und entwässerten Kollagens Typ 1 und von Kollagen, das nach den in US-Patent Nr. 5.374.539 beschriebenen Verfahren hergestellt wurde, sowie von zwei phosphorylierten Kollagenproben („mehr phosphoryliert" und „weniger phosphoryliert") wie in Beispiel 6 beschrieben, wurde in den folgenden Versuchen untersucht.
Bestimmung der Hydroxyprolin-Konzentration
Der Hydroxyprolin-Gehalt des entlipidisierten und entwässerten Kollagens Typ I und von Kollagen, das nach den in US-Patent Nr. 5.374.539 beschriebenen Verfahren hergestellt wurde, sowie von zwei phosphorylierten Kollagenproben („mehr phosphoryliert" und „weniger phosphoryliert") wie in Beispiel 6 beschrieben, wurde nach dem von Stegeman beschriebenen Ver fahren (H. Stegeman, J. Physiol. Chem., 311: 41 (1958)) geschätzt. Das in diesem Beispiel verwendete 0,03 M Chloramin T wurde hergestellt, indem 0,845 g Chloramin T 100 ml eines Puffers aus 20 ml Wasser, 30 ml Propanol und 50 ml Citratacetat-Puffer von pH 6 hinzugefügt wurde. Der Citratacetat-Puffer (pH 6) wurde hergestellt, indem 50 g Zitronensäure (1H₂O), 12 ml Eisessig, 120 g Natriumacetat (3H₂O) und 34 g NaOH 500 ml Wasser hinzugefügt wurden. Das Volumen wurde auf 1 Liter eingestellt und der pH-Wert wurde auf 6 eingestellt. Perchlorsäure (3M) wurde in 25,5 ml 70% HClO₄ hergestellt und das Volumen wurde in Wasser auf 100 ml eingestellt. Die Hydroxyprolin-Stammlösung bestand aus 5 μg Hydroxyprolin pro ml Wasser. Die Hydroxyprolin-Standards wurden hergestellt, indem 20 mg Hydroxyprolin pro 100 ml Wasser und 0,05 ml konzentrierte HCl hinzugefügt wurden.
Die Hydroxyprolin-Konzentrationen wurden wie folgt bestimmt: ein ml jeder Probe und 1 ml der Standardlösung mit 2–5 μg Hydroxyprolin wurden 1 ml Chloramin-Lösung in getrennten Röhrchen hinzugefügt und 20 Minuten bei Raumtemperatur gemischt. Ein ml Perchlorsäure wurde dann den Röhrchen hinzugefügt und 5 Minuten bei Raumtemperatur gemischt. Ein ml 5% p-Dimethylaminobenzaldehyd in Propanol wurde jedem Röhrchen hinzugefügt und 18 Minuten in einem Wasserbad bei 60°C gemischt. Die Röhrchen wurden auf 20°C abgekühlt und die optische Dichte wurde bei 550 nm abgelesen. Die Ergebnisse sind in Tabelle 3 unten gezeigt.
Bestimmung der Hexosamin-Konzentration
Die Hexosamin-Gesamtkonzentration des entlipidisierten und entwässerten Kollagens Typ I und von Kollagen, das nach den in US-Patent Nr. 5.374.539 beschriebenen Verfahren hergestellt wurde, sowie von zwei phosphorylierten Kollagenproben („mehr phosphoryliert" und „weniger phosphoryliert") wie in Beispiel 6 beschrieben, wurde mit dem von Blumenkrantz et al. (N. Blumenkrantz und G. Absoe-Hansen, Clin. Biochem., 9: 269 (1976)) beschriebenen Verfahren geschätzt.
Die in diesem Versuch verwendete Lösung von Trinatriumphosphat/Kaliumtetraborat wurde hergestellt, indem 98 ml 1 N tribasisches Natriumphosphat und 0,5 N Kaliumtetraborat gemischt wurden. Diese Lösung von Trinatriumphosphat/Kaliumtetraborat wurde dann als Lösungsmittel für die Acetylaceton-Gemische zur Bestimmung von Hexosamin in den Proben verwendet. Acetylaceton I wurde als 3,5%ige (v/v) Lösung in Natriumphosphat/Kaliumborat-Puffer hergestellt. Acetylaceton II wurde als 3,5%ige (v/v) Lösung in 0,5 N Kaliumtetraborat hergestellt. Das in diesen Versuchen verwendete Ehrlich-Reagenz wurde hergestellt, indem 3,2 g p-Dimethylaminobenzaldehyd 30 ml 12 N HCl hinzugefügt und mit 210 ml 2-Propanol verdünnt wurde.
Kurz gesagt wurde die entlipidisierte Probe wurde dann in ein Röhrchen gegeben. 6 N HCl wurde in die Probe gemischt und die Probe wurde 30 Minuten bei 120°C (oder 12–14 Stunden bei 100°C) hydrolysiert und anschließend zur Trockne verdampft. Gleichzeitig wurden Standards von Glucosamin und Galactosamin (2,5 bis 40 μg für jeden) hydrolysiert und mit denselben Verfahren zur Trockne eingedampft. Die Proben und Standards wurden in doppelt destilliertem Wasser resuspendiert.
In dem Versuch zur Bestimmung der Gesamtmenge von Hexosamin wurde 0,8 ml Probe oder Standard 0,6 ml 3,5% Acetylaceton I in separaten Reagenzröhrchen hinzugefügt und gemischt. Die Röhrchen wurden 30 Minuten auf 100°C erhitzt und dann abgekühlt. Anschließend wurde jedem Röhrchen 2 ml Ehrlich-Reagenz hinzugefügt und gemischt. Die Röhrchen wurden 5 Minuten inkubiert und die optische Dichte wurde bei 535 nm bestimmt.
In dem Test zur Differenzierung zwischen Glucosamin und Galactosamin wurde 0,8 ml Probe oder Standard 0,6 ml 3,5% Acetylaceton II in separaten Reagenzröhrchen hinzugefügt und gemischt. Die Röhrchen wurden 2 Stunden in zerdrücktes Eis gestellt und anschließend 15 Minuten bei 50°C erhitzt. Dann wurde den Röhrchen 2 ml Ehrlich-Reagenz hinzugefügt und ge mischt. Die Röhrchen wurden 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert und die optische Dichte bei 530 nm wurde bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 3 unten gezeigt. Diese Ergebnisse sind als prozentualer Anteil (Gewicht/Gewicht) auf Trockengewichtsbasis ausgedrückt.
Tabelle 3
BEISPIEL 6
Chemische Modifizierung von filtersterilisiertem Kollagen Typ
In diesem Beispiel wurde TTP^TM-behandeltes Kollagen, das nach den in Beispiel 5 beschriebenen Verfahren hergestellt worden war, zur Herstellung von „CollagenPRO^TM" weiter behandelt. Wie in der vorliegenden Erfindung verwendet bezieht sich „CollagenPRO^TM" somit auf aufgereinigtes Kollagen, das phosphoryliert wurde.
CollagenPRO^TM wurde aus TTP^TM-behandeltem Kollagen hergestellt, das nach den in Beispiel 5 beschriebenen Methoden hergestellt worden war. Zunächst wurde TTP^TM-behandeltes Kollagen filtersterilisiert, indem die Präparate durch einen 0,22 μ Filter, der an einer 30ml-Spritze befestigt war, geleitet wurden. Die filtersterilisierten Kollagensuspensionen wurden dann bis zum Gebrauch bei 4°C aufbewahrt. Diese filtersterilisierten Kollagenpräparate wurden chemisch modifiziert, um die optimalen Modifikationen für die Herstellung von aufgereinigtem Kollagen für biomedizinische Anwendungen zu bestimmen. Das gesamte Verfahren wurden unter sterilen Bedingungen und unter Verwendung vorsterilisierter Zutaten und pyrogenfreiem sterilem Wasser durchgeführt.
Zunächst wurde 100 ml einer 0,3%-igen Lösung von Kollagen in 0,1 M Essigsäure mit 5 N NaOH bei 4°C behandelt, bis ein pH-Wert von 11,5 erreicht wurde. Dann wurde Natriumtrimetaphosphat in einer Endkonzentration von 0,03 M hinzugefügt. Das Kollagen wurde in einer sterilen Haube ca. 3 Stunden bei Raumtemperatur unter Rühren mit einem Orbitalrotator bei 160 U/min reagiert. Dieses modifizierte Kollagen wurde bei 4°C durch Dialyse gegen entionisiertes Wasser gewaschen, bis keine Restionen mehr aus der Kollagenprobe austraten. Teile des modifizierten Kollagens wurden durch Lyophilisierung (d. h. Gefriertrocknung) mit dem Fachmann allgemein bekannten Verfahren getrocknet. Die lyophilisierten Proben wurden mindes tens fünf Tage vor weiteren Versuchen in einem Desikkator aufbewahrt.
Bei einigen Versuchen war es von Interesse, gereinigtes Kollagen mit unterschiedlichen Phosphorylierungsgraden aufzunehmen. Bei Proben mit mehr phosphoryliertem Kollagen, das in den folgenden Beispielen als „Mehr phosphoryliertes Kollagen" bezeichnet wurde, wurden ca. 40% der im Kollagen verfügbaren modifizierbaren Stellen phosphoryliert. Für Proben mit einem geringeren Phosphorylierungsgrad, wird das Präparat als „Weniger phosphoryliertes Kollagen" in den Beispielen bezeichnet. Um ein aufgereinigtes Kollagen mit geringerer Phosphorylierung zu erhalten, wurde 0,01 M Natriumtrimetaphosphat im Phosphorylierungsschritt anstelle von 0,03 M Natriumtrimetaphosphat verwendet. Darüber hinaus betrug die Inkubationszeit 1 Stunde anstatt 3 Stunden mit 0,03 M Natriumtrimetaphosphat.
Es ist vorgesehen, dass die Phosphorylierung von Biomolekülen, wie z. B. Wachstumsfaktoren (z. B. EGF), Interleukinen (z. B. IL1) und anderen biologisch wirksamen Molekülen vorteilhaft ist. Für die Phosphorylierung von EGF wird 1 ml 0,1% EGF, das auf einen pH von 11,5 eingestellt wurde, bei denselben Konzentrationen und unter denselben Bedingungen (z. B. Rühren und Temperatur) wie oben beschrieben 0,2 ml Natriumtrimetaphosphat hinzugefügt. Die Probe wird dann zur Entfernung der Salze dialysiert und das phosphorylierte EGF kann nach Bedarf verwendet werden.
BEISPIEL 7
Test auf kovalent gebundenen Phosphor
In diesem Beispiel wurde die gewaschene Kollagenprobe mit dem von Fiske und Subbarow (C. H. Fiske und Y. Subbarow, J. Biol. Chem., 66: 375–400 (1925)) beschriebenen Verfahren auf Anwesenheit von kovalent gebundenem Phosphor getestet. Kurz gesagt wurde dabei 1 mg getrocknetes modifiziertes Kollagen, das nach Beispiel 6 hergestellt und lyophilisiert worden war, mit 1 ml 72%-iger Perchlorsäure gemischt und dann 20 Minuten bei 200°C aufgeschlossen. Der aufgeschlossenen Probe wurde entionisiertes Wasser hinzugefügt, um das Volumen auf 4 ml einzustellen. Anschließend wurden nacheinander die folgenden Reagenzien hinzugefügt und gut gemischt. Zunächst wurde 0,4 ml 2,5%-iges Ammoniummolybdat in 3 N Schwefelsäure hinzugefügt. Diesem Gemisch wurden 0,2 ml des Reduktionsmittels 1-Amino-2-Naphthol-Schwefelsäure hinzugefügt. Das Kollagengemisch wurde dann 10 Minuten bei 100°C inkubiert und die Farbentwicklung, gemessen bei 600 nm in einem Spektrophotometer (Beckman DU-2) wurde beobachtet. Kaliumdihydrogenmonophosphat wurde als Phosphorstandard verwendet. Als Kontrolle diente unmodifiziertes Kollagen, das nach Beispiel 2 hergestellt wurde.
Der Phosphorgehalt wurde geschätzt, indem die mit den Kaliumdihydrogenmonophosphat-Standards erhaltenen Ergebnisse graphisch dargestellt wurden. In diesem Versuch konnte in den mit TTP^TM behandelten Proben kein gebundener Phosphor nachgewiesen werden. Bei Proben mit mehr phosphoryliertem Kollagen (d. h. bei denen 40% der im Kollagen verfügbaren modifizierbaren Stellen phosphoryliert waren) wurde 2,5% (Gewicht/Gewicht; Trockengewichtsbasis) gebundener Phosphor nachgewiesen. Bei Proben mit geringerer Phosphorylierung wurde 0,8% (Gewicht/Gewicht; Trockengewichtsbasis) gebundener Phosphor nachgewiesen.
Diese Ergebnisse zeigten, dass der Phosphorgehalt des modifizierten Kollagens im Vergleich mit der unbehandelten Kontrolle signifikant anstieg. In der als Kontrolle dienenden unbehandelten Kollagenprobe wurde keine messbare Menge Phosphor nachgewiesen. Es wurde geschätzt, dass eine erhebliche Menge von Hydroxyaminosäuren (z. B. Serin und Tyrosin) irreversibel phosphoryliert waren und Phosphoester-Bindungen bildeten. Obwohl dies für das Verständnis der Erfindung nicht notwendig ist, zeigt 2 eine Reaktion, die bei dieser Phosphorylierung auftreten kann.
Es konnte gezeigt werden, dass dieses modifizierte Kollagen verbesserte biologische Eigenschaften aufwies, wie in Beispiel 10–15 beschrieben. Bei der Aufreinigung von Kollagen muss aber bekanntlich mit Vorsicht vorgegangen werden, weil Verunreinigungen, die in unreinen Kollagenpräparaten vorliegen, aufgrund der Phosphorylierung von kontaminierten Proteinen (z. B. Elastin) unerwünschte biologische Reaktionen hervorrufen können.
Ein wichtiger Punkt ist, dass die Modifizierungsmenge kontrolliert werden kann, wobei der Bereich schwankt zwischen keinen und maximal ca. 40% der modifizierbaren Aminosäuren im Kollagen. Die pH-Bedingungen, unter denen die Reaktion erfolgt, können von 8 bis 13 schwanken, je nach gewünschtem Modifikationsumfang. Darüber hinaus kann die Reaktionstemperatur zwischen 4 und 45°C schwanken. In anderen Versuchen wurde beobachtet, dass die Proben bei Temperaturen unter 4°C zu Einfrieren neigten, während das Kollagen bei Temperaturen über 45°C denaturieren kann.
Die chemische Verbindung, die zur Reaktion mit dem Kollagen verwendet wird, kann aus der folgenden Gruppe stammen, ohne aber darauf beschränkt zu sein: verschiedene Polyphosphate (z. B. Natriumhexametaphosphat, Natriumultraphosphat und Natriumtetrametaphosphat), Phosphorsäureanhydrid und Phosphoryltrichlorid, das in organischen nichtpolaren Lösungsmitteln, wie z. B. Hexan usw. gelöst ist.
Vorgesehen ist auch, dass andere nicht-kollagene biologische Materialien für unterschiedliche biologische Anwendungen auf ähnliche Weise chemisch modifiziert werden. Auch andere Modifikationen, die sich für die Herstellung von Kollagen eignen, können in Zellkulturen oder Anwendungen in vivo verwendet werden, einschließlich aber ohne Einschränkung Fluorierung, Halogenierung (z. B. Chlorierung), Sulfonierung und/oder Hydroxylierung des gemäß den Verfahren von Beispiel 2 hergestellten Kollagens und des phosphorylierten Kollagens, das gemäß den oben beschriebenen Verfahren hergestellt wurde. Diese Modifikationen können zusammen (d. h. mehrere Modifikationen können am selben Präparat durchgeführt werden) oder getrennt durchgeführt werden.
BEISPIEL 8
Löslichkeit von modifiziertem Kollagen
In diesem Beispiel wurde die Löslichkeit von gereinigtem Kollagen Typ I, das wie in Beispiel 6 beschrieben modifiziert worden war, bestimmt und mit der Löslichkeit von nativem Kollagen verglichen.
In diesem Beispiel wurden 10 ml der 0,3%-igen Lösungen von unmodifiziertem (d. h. nativem) Kollagen und von modifiziertem Kollagen in 0,1 M Essigsäure hergestellt. Die optische Dichte jeder Lösung wurde bei 450 nm bestimmt. Eine kleine Menge von 0,5 M NaOH wurde jeder Lösung vorsichtig hinzugefügt, um den pH auf einen neutralen Wert (d. h. 7) einzustellen. Die optische Dichte wurde erneut bei 450 nm gemessen. Die folgende Tabelle zeigt die Werte der optischen Dichte dieser Proben. Die Zunahme der optischen Dichte des nativen Kollagens wies darauf hin, dass in dieser Probe mehr unlösliches Protein vorlag als im modifizierten Kollagen. Das modifizierte Kollagen hatte somit auch bessere Löslichkeitsmerkmale unter neutralen Bedingungen. Während dies für das Verständnis der vorliegenden Erfindung nicht notwendig ist, kann diese Beobachtung dennoch das Ergebnis einer Verschiebung im isoelektrischen Punkt des Kollagens sein.
Tabelle 4.
BEISPIEL 9
Herstellung des CollagenPRO^TM Films
In diesem Beispiel wurden Filme (d. h. Membranen) von chemisch behandeltem, filtersterilisiertem Kollagen (d. h. CollagenPRO^TM), das nach den in Beispiel 6 beschriebenen Verfahren hergestellt worden war, zur Verwendung in Versuchen in vivo und in vitro hergestellt. In einigen Versuchen wurde das Kollagen aus Rinder-Achillessehnen anstatt aus Rinderhäuten gewonnen. Beide Kollagenquellen waren für die Verwendung in den folgenden Beispielen zufrieden stellend.
Zunächst wurde die Suspension in sterile 15 × 2 cm Petri-Schalen bis zu einer Tiefe von ca. 8 mm gegossen. Die Petri-Schalen wurden abgedeckt und 48 Stunden bei konstanter Temperatur von 37°C gelagert, um eine gleichförmige Anfangsgelierung zu fördern. Dafür waren häufig 3–5 Tage erforderlich, bis die Filme offensichtlich trocken waren. Am Ende der anfänglichen 48-Stunden-Gelierungsphase wurde die Abdeckung von den Petri-Schalen entfernt und die Trocknung wurde in einer chemischen Abzugshaube bei Raumtemperatur fortgesetzt. Am Ende des Trocknungsvorgangs wurden die Kollagenfilme mit Ethylenoxidgas sterilisiert und für tierexperimentelle Implantation, Transplantation, Grafting oder andere Versuche verwendet. Diese Filme wurden auch in darauffolgenden Experimenten verwendet.
BEISPIEL 10
Untersuchung von chemisch modifiziertem Kollagen in Hauttransplantaten in vivo
In diesem Beispiel wurde die Eignung und Biokompatibilität des chemisch modifizierten Kollagens Typ I, das wie in Beispiel 6 beschrieben hergestellt wurde, und von unmodifiziertem Kollagen, das wie in Beispiel 2 beschrieben hergestellt wurde, für Anwendungszwecke in vivo bestimmt. Gereinigte gewaschene Kollangenproben, die wie in Beispiel 9 beschrieben erhalten wurden, wurden in Form dünner Filme mit einer Dicke von 0,3 mm getrocknet.
In diesem Beispiel wurden sechzehn männliche Schweizer Albinomäuse verwendet, um die Eignung und Biokompatibilität dieser Kollagenpräparate zu prüfen. Zunächst wurde ein kreisförmiges Hautareal mit einem Durchmesser von 1 cm chirurgisch von den Rücken der Tiere entfernt. Diese Areale wurden dann unter aseptischen Bedingungen mit Test- oder Kontrollkollagenfilm abgedeckt (d. h. Grafting). Das in diesem Beispiel verwendete Kollagen wurde mit Ethylenoxid sterilisiert. Die Tiere wurden drei Wochen auf makroskopische Anzeichen von Entzündung (d. h. Rötung, Schwellung, Wärme usw) beobachtet. Bei keinem der Tiere wurden unerwünschte Reaktionen beobachtet. Die Tiere wurden am Ende des dreiwöchigen Zeitraums nach Grafting des Kollagenfilms getötet.
Der gesamte Hautlappen, einschließlich dem transplantierten Kollagen, wurde bei jedem Tier von der Operationsstelle entfernt und in 70% Alkohol fixiert, entwässert und mit den im Stand der Technik bekannten Verfahren in Wachs eingebettet. Die eingebetteten Proben wurden in Schnitte mit einer Dicke von 5 Mikron geschnitten und mit Goldner's einstufiger Trichrom-Anfärbung (OST) sowie mit Hämatoxylin und Eosin (H&E) mit Methoden des Standes der Technik angefärbt.
Die histologischen Ergebnisse zeigten keine unerwünschte Reaktion bei den beiden Versuchsgruppen. Die Zellinfiltration und die Neoepithelialisierungsrate (d. h. die Infiltration von Epithelzellen zum Zentrum des Transplantats) wurde durch keines der Testgraftmaterialien beeinflusst. Dagegen zeigte die Kontrollprobe eine bemerkenswerte Anzahl von Fremdkörper-Riesenzellen, die am Kollagenfilm anhafteten. Darüber hinaus wurde bei den Kontrollen wie in 2 gezeigt eine langsamere Epithelialisierungsrate beobachtet.
BEISPIEL 11
Untersuchung von chemisch modifiziertem Kollagen in Implantaten in vivo
In diesem Beispiel wurde Kollagen Typ I aus Gewebeproben von Rinderdarm (der auf einem lokalen Markt gekauft worden war) gereinigt und mit den Verfahren von Beispiel 6 chemisch modifiziert. Diese Proben wurden dann in Kaninchen implantiert, um die Eignung und Biokompatibilität von Kollagen, das nach den erfindungsgemäßen Verfahren hergestellt worden war, zu bestimmen. In diesen Versuchen wurde auch Kontrollkollagen verwendet, das nach den in Beispiel 2 beschriebenen Verfahren hergestellt worden war.
Ausgewachsene männliche weiße Neuseeländer Kaninchen mit einem Gewicht von ca. 3,5 bis 4 kg von Nitabell Rabittry wurden in diesem Beispiel verwendet. Die Tiere wurden zunächst mit einer entsprechenden Dosis Ketamin sediert und mit Ketamin/Xylaxin (PDL) wie für kleinere Operationen angemessen narkotisiert. Die Haare auf der Rückenseite der Tiere wurden geschoren und mit einer Betadin-Abreibung und Abwischen mit 70%-igem Alkohol für die Operation vorbereitet. Die Tiere wurden in drei Gruppen mit je zwei Tieren aufgeteilt. In der Haut jedes Tiers wurde ein kleiner Einschnitt angebracht, um Unterhauttaschen zu erhalten. Bei jeder Kaninchengruppe erfolgten vier Implantationen. Sechs der Kaninchen (24 Stellen) wurden auf beiden Seiten operiert, wobei die Implantate auf beide Seiten der Mittellinie des Rückens gelegt wurden. Jedes Implantat enthielt 50 mg getrocknete Kollagenprobe, die zu einem ungefähr runden Ball gedreht wurde und subkutan auf jede Stelle gelegt wurde.
Die Tiere wurden drei Wochen auf makroskopische Anzeichen von Entzündung (d. h. Rötung, Schwellung usw.) beobachtet. Bei keinem der Tiere wurden unerwünschte Reaktionen beobachtet. Nach 3 Wochen wurden die Tiere getötet und die Implantate chirurgisch entfernt, in 70% Alkohol fixiert, entwässert und nach den im Stand der Technik allgemein bekannten Verfahren in Paraffin eingebettet. Schnitte mit einer Dicke von 5 Mikron wurden geschnitten und nach allgemein bekannten Verfahren des Standes der Technik mit OST und H&E angefärbt.
Die Ergebnisse zeigten eine stärkere Vaskularisierung und fibroblastisches Einwachsen in beiden Versuchsgruppen. Die Kontrollproben zeigten eine relativ geringe Vaskularisierung sowie die Prävalenz von mehrkernigen Riesenzellen, was die geringere Biokompatibilität dieser Proben zeigt.
BEISPIEL 12
Alkalische Phosphatasewirkung
In diesem Beispiel wurden die wie in Beispiel 9 beschrieben untersuchten Kollagenimplantate auf ihre alkalische Phosphatasewirkung untersucht. Die alkalische Phosphatasewirkung war von Interesse, weil die Hypothese aufgestellt wurde, dass dieses Enzym mit der Gewebebildung und Kalzifizierung in Zusammenhang steht. Der in diesem Beispiel verwendete Versuch beruht auf den Verfahren von Bradenberger und Hanson (H. Bradenberger und R. Hanson, Helv. Chim. Acta 36: 900 (1953); und Hofstee (B. H. Hofstee, Arch. Biochem. Biophys. 51: 139 (1954)). Bei diesem kolorimetrischen Verfahren wird die Wirkung der alkalischen Phosphatase auf die Hydrolyse von o-Carboxy-Phenylphosphat gemessen.
Kurz gesagt wurden Proben von ca. 10 mg jedes der gewonnenen Kollagenimplantate aus Beispiel 10 wurden mit einer Rate von 1 mg in 1 ml Tris-Puffer (0,1 M Tris, pH 8,5) fünf Minuten dispergiert. Die Temperatur der dispergierten Proben wurde bei 0–5°C gehalten. Zur Verhinderung von enzymatischen Reaktionen vor dem Versuch, wurde eine kleine Menge Detergens (bis zu einer Endkonzentration von 0,1 M Natriumdeoxycholat) den dispergierten Proben hinzugefügt, um die Freisetzung von membrangebundenen Enzymen zu erleichtern. Die dispergierten Proben wurden dann in einem Polytron-Homogenisator (Brinkmann) 30 Sekunden gemischt und in einem Eisbad gekühlt.
Für jede Probe wurden die Lösungen 20–30 Minuten in einem Wasserbad bei 25°C inkubiert, um die Enzyme zu aktivieren. Eine Testlösung aus 2 ml Glycin (0,2 M pH 8,8), 1 ml 3,65 mM o-Carboxyphenylphosphat (OCCP) und 0,5 ml 0,05 M MgCl₂ wurde in eine Küvette überführt und 3–4 Minuten bei 25°C inkubiert. Kollagentestproben (0,1 ml, vorgefiltert mit einem 0,22 Mikron Filter, der an einer 5ml-Spritze befestigt war) wurden den Lösungen in den Küvetten hinzugefügt. Die optische Dichte des Küvetteninhalts wurde dann bei 300 nm bei Raumtemperatur bestimmt.
Die Aktivität ist in Einheiten pro mg Gewebe angegeben und basiert auf der Anzahl Mikromol von pro Minute hydrolysiertem OCCP bei 25°C bei pH unter den oben beschriebenen Bedingungen.
Die Ergebnisse zeigten signifikant erhöhte Mengen an alkalischer Phosphataseaktivität (34% Erhöhung: P < 0,0005) in den modifizierten Kollagenimplantaten im Vergleich mit den unmodifizierten Implantaten.
BEISPIEL 13
Verwendung von CollagenPRO^TM für die Wundheilung
In diesem Beispiel wurde die Eignung von Kollagen Typ I aus Achillessehnen von Rindern (erworben auf einem lokalen Markt) untersucht. Das Kollagen wurde extrahiert und wie in Beispiel 9 beschrieben zu gleichmäßig dünnen trockenen Filmen gemacht. Ein Kontrollfilm wurde mit der in US-Patent Nr. 5.374.539 beschriebenen Standard-Pepsin-Enzymbehandlungsmethode hergestellt. Zusätzlich zu dem im Beispiel 9 beschriebenen CollagenPRO^TM wurden natives Rinderkollagen vom Typ I, hergestellt wie in US-Patent Nr. 5.374.539 beschrieben, und mit Glutaraldehyd vernetztes Rinderkollagen (wie in diesem Patent beschrieben) untersucht. Alle Proben wurden in Anwesenheit von 0,5 ml rekonstituiertem epidermalem Wachstumsfaktor (EGF; Collaborative Research Inc.) (1 μg/3 ml PBS) und ohne Zusatz von EGF untersucht.
Für dieses Beispiel wurden Epithelzellkulturen gewählt, weil sie ein Modellsystem zur Untersuchung von Ereignissen, die den Verschluss von oberflächlichen Epitheldefekten steuern, und zur Prüfung der Wirkungen von exogenen Mitteln auf diese Ereignisse liefern. Diese Verfahren haben im Vergleich mit Wundverschlussmodellen in vivo einige Vorteile. Beispielsweise lässt sich das extrazelluläre Milieu in Zellkultursystemen viel leichter manipulieren. Frühere Berichte weisen darauf hin, dass die Epithelreaktion in vitro der in vivo beobachteten Reaktion ähnelt und leicht quantifiziert werden kann (siehe z. B. S. Gunasekaran et al., Proc. Soc. Biomater., 20: 311 (1994); und S. Simmons et al. Toxicol. Appl. Pharmacol. 88: 13–23 (1987)). Dieser Versuch sollte die vergleichende Eignung von verschiedenen Kollagensubstraten für den Wundverschluss zeigen. Insbesondere wurde die Wechselwirkung der Kollagensubstrate mit EGF untersucht.
Primäre Zellkulturen wurden von chirurgisch entfernten Hornhäuten von getöteten weißen Neuseeländer Kaninchen (1,5–2,5 kg) erhalten. Die chirurgisch isolierten Hornhäute wurden in Dispase II (Boehringer Mannheim) bei 37°C in einem befeuchteten CO₂-Inkubator inkubiert. Nach 1 Stunde wurden die Hornhäute in ein primäres Zellkulturmedium aus Dulbeccos modifiziertem Eagle-Medium, das mit 5% fötalem Kälberserum, 0,5% Dimethylsulfoxid (DMSO, 50 ng/ml Gentamicin, 146 μg/ml L-Glutamin, 5 μg/ml Insulin und 10 μg/ml EGF angereichert war, überführt. Die volle Dicke der Hornhautepithelplatten wurden vorsichtig von den Hornhautproben abgezogen, in Trypsin gelegt, vorsichtig vermischt und 5 Minuten bei 2000 × g und 4°C zentrifugiert. Die Überstände wurden entfernt und die Zellen von sechs Hornhäuten wurden kombiniert und in frischem primärem Kulturmedium resuspendiert und in sechs 35 mm Kulturschalen ausgestrichen. Die Kulturen wurden bei 37°C in einen befeuchteten CO₂-Inkubator gestellt. Das Kulturmedium wurde dreimal pro Woche gewechselt.
Am siebten Inkubationstag waren die primären Kulturen konfluent und sie wurden 5–10 Minuten in Trypsin behandelt. Die Zellen wurden von den Kulturschalen pipettiert und 5 Minuten bei 2000 × g zentrifugiert. Der Überstand wurde entfernt und das Kulturkontrollmedium bestand aus dem oben beschriebenen Dulbeccos modifiziertem Eagle-Medium ohne EGF. Die Zellen wurden pipettiert, um eine Suspension von Einzelzellen zu erhalten und mit einem Hemazytometer gezählt. 24 Vertiefungsmultiplatten wurden mit 3–4 × 10⁴ Zellen/Vertiefung in 1 ml Medium pro Vertiefung geimpft. Die Subkulturzellen konnten 7 Tage wachsen, wobei das Medium innerhalb dieses Zeitraums dreimal gewechselt wurde.
Am 7. Tag der Subkultur wurden die in den Vertiefungen enthaltenen Zellen gezählt, um sicherzustellen, dass in jeder Vertiefung mindestens 1,6 × 10⁵ Zellen anwesend waren. Die Zellschichten wurden mit Filterscheiben (Durchmesser 7 mm) wie von Jumblatt und Neufeld (siehe M. Jumblatt und A. Neufeld, Invest. Ophthamol. Visual Sci., 15: 4–14 (1986)) beschrieben verletzt ("verwundet"). Kurz gesagt wurde das Zellkulturmedium wurde aus den Vertiefungen entfernt und die Fil ter wurden auf die Zellschicht gelegt und mit einem Kolben (Durchmesser 7 mm) nach unten gedrückt. Eine vorgekühlte Stahlsonde mit einem Durchmesser von 6 mm wurde 5 Sekunden auf den Boden der Vertiefungen, direkt unter jeder Scheibe, gehalten. Scheiben mit daran haftenden toten Zellen wurden dann aus jeder Vertiefung entfernt. Vor dem Zufügen des Kontrollmediums wurden jeder Vertiefung die Testmaterialien (Kollagen, das nach den in Beispiel 9 beschriebenen Verfahren hergestellt wurde (CollagenPro^TM) sowie native Typ I Rinderkollagen und vernetztes Typ I Rinderkollagen (hergestellt gemäß US-Patent Nr. 5.374.539) hinzugefügt. Die Multiplatten mit den „verwundeten" Zellschichten und dem Testkollagen wurden 24 Stunden erneut inkubiert, um Zellwachstum in dem verwundeten Bereich zu gestatten. Die Vertiefungen wurden im Verlauf dieses 24-stündigen Wachstumszeitraums in Abständen beobachtet, um den Bereich der von der Scheibe verwundeten Zellschicht zu messen. Diese Messungen erfolgten mikroskopisch im Abstand von 0, 12, 18 und 24 Stunden.
Der Verschluss des verletzten Bereichs auf der Zellschicht innerhalb der Vertiefungen wurde durch Fixierung der Zellschichten und Kollagentestproben mit 10% neutral gepuffertem Formalin für mindestens 10 Minuten gestoppt. Die Zellen wurden dann mindestens 10 Minuten mit Giemsa-Stammlösung angefärbt, in 10% neutral gepuffertem Formalin gespült und an der Luft getrocknet. Die angefärbten Vertiefungen in der Mikroplatte wurden mikroskopisch untersucht und die Wundbereiche wurden gemessen.
3 ist ein Balkendiagramm, das die in diesem Beispiel erhaltenen Ergebnisse des in vitro Wundverschlusses zeigt. In dieser Figur steht „SC" für CollagenPro^TM, „NC" für natives Kollagen, „XC" für vernetztes Rinderkollagen Typ I und „GF" für EGF. Diese Ergebnisse zeigen, dass die Kollagenpräparate sich nicht gleich verhalten. Die mit CollagenPro^TM mit und ohne EGF erhaltenen Ergebnisse zeigten einen schnelleren Wundverschluss als die mit den anderen Kollagenpräparaten erhaltenen Ergebnisse. Die in Beispiel 10 und 11 beschriebenen Versuche in vivo zeigten, dass die Abgabe von Wachstumsfaktoren wirksamer war, wenn die Abgabe durch CollagenPro^TM erfolgte als mit nativem Typ I Kollagen, das nach dem Verfahren von US-Patent Nr. 5.374.539 hergestellt worden war. Darüber hinaus zeigten diese Ergebnisse, dass eine Vernetzung von Kollagen im Allgemeinen die Epithelialisierung nicht unterstützt.
BEISPIEL 14
Hämostasetests in vitro
In diesem Beispiel wurde das wie in Beispiel 6 beschrieben hergestellte Kollagen in weiteren Tests verwendet, um seine Eignung als Hämostasemittel in vivo zu bestimmen.
Hämostase (d. h. Blutgerinnung) ist ein primäres Ereignis während der normalen Wundreparatur. Kollagen ist ein natürliches Hämostasemittel, das in fast jedem Gewebe vorliegt und das anscheinend auch eine spezifische Affinität für Zellen und Wachstumsfaktoren aufweist, die für die normale Wundheilung äußerst wichtig sind (siehe z. B. Gunasekaran, in Encyclopedia of Biomaterials and Bioengineering, 2 (37): 2293–2310 (1995)). Obwohl auch andere Materialien die Hämostase unterstützen können, kann es sein, dass sie im Gegensatz zu Kollagen die Wundheilungsrate nicht optimieren. Ziel dieses Beispiels war die Bestimmung der hämostatischen und wundheilenden Eigenschaften verschiedener Verbindungen und Substanzen. In diesem Beispiel wurden Kollagenfasern (Avitene von Medchem), Schwämme (Helistat von Collatek) und Gelatine (Gelfoam von Arizona Health Sciences) und wie unten beschrieben hergestellte Gelatinefragmente untersucht. Zusätzliche Substanzen, die früher als Hämostasemittel verwendet wurden, wie z. B. Thrombin (z. B. Thrombinar und Thromostat) und Cellulose (z. B. Surgicel und Oxycel, J&J Medical) wurden in diesen Versuchen nicht verwendet. Thrombin wurde nicht verwendet, weil es zu immunologischen und lokalen Freisetzungsproblemen führen kann.
Natives Rinderkollagen Typ I wurde wie in Beispiel 2 beschrieben hergestellt. Avitene, Helistat und Gelfoam wurden von den jeweiligen Anbietern bezogen. Gelatinefragmente wurden durch begrenzte unspezifische Proteasebehandlung von Gelatine (Sigma) hergestellt. Die Gelatinefragmente wurden anschließend durch Größenausschluss-Säulenchromatographie auf Sephadex G-50 und G-100 Gel in Multi-Spin-Säulen (Axygen) wie vom Hersteller beschrieben gereinigt. Zwei Fragmentgruppen wurden isoliert und gereinigt. Eine Gruppe wurde als „hochmolekulares Gelatinepeptid" bezeichnet. Diese Gruppe enthielt Peptide mit einem Molekulargewicht im Bereich von 50–100 kD. Die andere Fragmentgruppe wurde als „niedermolekulares Gelatinepeptid" bezeichnet. Diese Gruppe enthielt Peptide mit einem Molekulargewicht im Bereich von 30–50 kD.
Die Standardgerinnungsmethode von Lee-White wurde in diesem Beispiel verwendet, wie von Brown (B. A. Brown, Hematology: Principles and Practice, 3. Ausgabe, Lea & Febiger, Philadelphia, (1980), Seiten 125–126) beschrieben und wie dem Fachmann im Stand der Hämatologie-Technik geläufig ist. Mit diesem Verfahren wurden mehrere Versuche durchgeführt, in denen das untersuchte Blutvolumen entweder 0,5 ml oder 1 ml war (wobei die anderen Reagenzien in den richtigen Anteilen gehalten wurden). Da zwischen den Testläufen mit diesen unterschiedlichen Volumen keine Unterschiede beobachtet wurden, wurde in den meisten Versuchen 0,5 ml Blut verwendet. Kurz gesagt wurde 3 mg jeder Probe, die zuvor in einem Desikkator aufbewahrt worden war, wurde sorgfältig gemessen und jede Probe wurde separat in 10 cm lange saubere Röhrchen aus Polypropylen gefüllt. Frisches Blut (5 ml) wurde gesunden Probanden mittels Venenpunktion entnommen und die Blutentnahmezeit wurde vermerkt. Jedem Röhrchen wurde 0,5 ml Blut hinzugefügt und alle 30 Sekunden vorsichtig gerührt, bis sich Gerinnsel gebildet hatten. Die Zeit bis zur ersten Gerinnselbildung wurde vermerkt.
Die Ergebnisse dieser Versuche sind in 4 gezeigt. Wie in dieser Figur zu sehen war die Gerinnungszeit am größten für die niedermolekularen Gelatinepeptid-Fragmente („LMW Gel. Pept") und am geringsten für CollagenPro^TM („Natives Koll." in der Figur).
Die Gerinnungszeit der hochmolekularen Gelatinepeptidfragmente („HMW Gel. Pept.") war fast so hoch wie die der niedermolekularen Gelatinepeptide. Die aus Avitene („Avitene") erhaltenen Kollagenfasern hatten die zweitschnellste Gerinnungszeit, während die Helistat („Helistat") und Gelfoam („Gelfoam") Präparate die nächstschnellsten Gerinnungszeiten aufwiesen. Wie in 4 gezeigt war die Gerinnungszeit von Gelfoam nur etwas schneller als die der hochmolekularen Gelatinepeptid-Fragmente.
BEISPIEL 15
Hämostase in vivo
Dieses Beispiel war eine Fortsetzung des vorherigen Beispiels und wurde durchgeführt, um die hämostatischen Fähigkeiten des Kollagens und anderer in Beispiel 9 verwendeter Präparate in vivo zu untersuchen.
In diesem Beispiel wurden ausgewachsene männliche Sprague-Dawley-Ratten verwendet. Kreisförmige Hautareale (2 cm) ganzer Dicke wurden operativ von den Rücken der narkotisierten Tiere wie in Beispiel 10 beschrieben entfernt. Die freigelegten Bereiche wurden aseptisch mit den in Beispiel 13 beschriebenen Kollagenpräparaten bedeckt (d. h. transplantiert). Nach 3 Wochen wurden die Tiere getötet und die Hautlappen wurden chirurgisch entfernt und in 70%-igem Alkohol fixiert, entwässert und in Paraffin eingebettet, wobei die im Stand der Technik herkömmlichen Verfahren verwendet wurden. Abschnitte mit einer Dicke von 5 Mikron wurden ausgeschnitten und mit den im Stand der Technik herkömmlichen Techniken mit OST und H&E angefärbt.
Die relative Ausdehnung der Neoepithelialisierung und Wundheilung wurde beobachtet und histologisch beurteilt. Es fanden sich keine makroskopischen Zeichen einer Entzündung in oder um die transplantierten Bereiche auf den Rücken der Tiere. Die Ergebnisse dieses Versuchs sind in 4 gezeigt. Wie in dieser Figur zu sehen zeigte der CollagenPro^TM Film eine signifikant schnellere Wundheilungsrate und Blutgerinnungszeit als die restlichen Proben, wobei Avitene die zweitschnellste Rate und Helistat die drittschnellste Rate zeigte. Die Ergebnisse der Wundheilungs- und Blutgerinnungszeiten in Prozent sind in 4 gezeigt.
Wie bereits beschrieben ergeben diese unterschiedlichen Substanzen in biologischen Systemen schwankende Ergebnisse. Obwohl es für das Verständnis der Erfindung nicht notwendig ist, kann die relativ schlechte Leistung von Gelatine und Gelatinepeptiden darauf hinweisen, dass die Struktur von Kollagen in den Hämostase- und Wundheilungsverfahren eine wichtige Rolle spielt.
Aus dem Vorhergehenden wird deutlich, dass die verschiedenen Ausführungsformen des nach den erfindungsgemäßen Verfahren hergestellten Kollagens für verschiedene biomedizinische Anwendungen geeignet sind, bei denen nicht-entzündliches Kollagen benötigt wird. Es wird davon ausgegangen, dass das erfindungsgemäße nicht-entzündliche Kollagen unter mehreren Bedingungen und für zahlreiche Anwendungszwecke verwendet werden kann, einschließlich aber ohne Einschränkung für nicht-entzündliche Kollagennähte, für den Weichteilersatz mit Kollagen, einschließlich Verbände von Wunden und Verbrennungen, Ersatz von Arterien, als Hämostasemittel, als Matrizen zur Freisetzung von Arzneimitteln, als Glaskörperersatz für die ophthalmologische Therapie, in der endodontischen Therapie, als Zellkulturträger usw. Ferner wird davon ausgegangen, dass verschiedene Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung in jeder Form, einschließlich aber ohne Einschränkung, als Faser- oder Membranfilme, Beutel, Schwämme, Nähte und wässrige Suspensionen oder Verbundstoffe eingesetzt werden können. Darüber hinaus kann das erfindungsgemäß hergestellte Kollagen bei Bedarf für die gewünschte Anwendung und für ein verbessertes bioaktives Ansprechen weiter modifiziert werden. Es wird auch davon ausgegangen, dass die erfindungsgemäßen Verfahren für die Herstellung von anderen Biomolekülen als auch Kollagen geeignet sind.

Claims

Verfahren zur Aufreinigung von Kollagen, dadurch gekennzeichnet, dass man a) folgendes bereitstellt: i) eine kollagenhaltige Probe, ii) ein erstes und zweites proteolytisches Enzympräparat, wobei beide diese proteolytischen Enzympräparate Papain enthalten, und iii) ein Reduktionsmittel; b) die Kollagenprobe mit dem ersten proteolytischen Enzympräparat in Kontakt bringt und so zu einer ersten Kollagenlösung gelangt; c) die erste Kollagenlösung mit dem Reduktionsmittel in Kontakt bringt und so zu einer zweiten Kollagenlösung gelangt; d) die zweite Kollagenlösung mit dem zweiten proteolytischen Enzympräparat in Kontakt bringt und so zu aufgereinigtem Kollagen gelangt.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Reduktionsmittel aus der Gruppe Natriumsulfid, Dithiothreit, Glutathionin und Natriumborhydrid stammt.
Verfahren nach Anspruch 2, wobei das Reduktionsmittel weiterhin eine Base aus der Gruppe Natriumhydroxid, Ammoniumhydroxid, Kaliumhydroxid und Calciumhydroxid enthält.
Verfahren nach Anspruch 1, das weiterhin den Schritt e) enthält, in dem man aufgereinigtes Kollagen mit einem Entlipidisierungsmittel in Kontakt bringt und so zu entlipidisiertem Kollagen gelangt.
Verfahren nach Anspruch 4, wobei das Entlipidisierungsmittel eine Mischung aus Chloroform und Methanol enthält.
Verfahren nach Anspruch 5, das weiterhin die folgenden Schritte enthält: f) Verpressen des entlipidisierten Kollagens zu Preßkollagen; g) Entwässern des Preßkollagens, wodurch man zu entwässertem Kollagen gelangt sowie h) Dispergieren und Trocknen des entwässerten Kollagens, wodurch man Kollagenfasern erhält.
Verfahren nach Anspruch 5, wobei man das entlipidisierte Kollagen mit einem Phosporylierungsmittel in Kontakt bringt und so zu phosphoryliertem Kollagen gelangt.
Verfahren nach Anspruch 7, wobei das Phosphorylierungsmittel aus der Gruppe Natriumtrimetaphosphat, Natriumhexametaphosphat, Natriumultraphosphat, Natriumtetrametaphosphat, Phosphorsäureanhydrid und Phosphorylchlorid stammt.
Verfahren nach Anspruch 7, wobei das Phosphorylierungsmittel Natriumtrimetaphosphat enthält.
Verfahren nach Anspruch 1, das weiterhin den Schritt enthält, dass man die Probe zuerst entepithelisiert und dann mit dem ersten proteolytischen Enzympräparat in Kontakt bringt.
Gereinigtes Kollagen, das nach dem Verfahren nach Anspruch 1 hergestellt wurde.
Verfahren zur Herstellung von biologisch kompatiblen Kollagen, das dadurch gekennzeichnet ist, dass man a) folgendes bereitstellt: i) eine kollagenhaltige Probe, ii) ein erstes und zweites proteolytisches Enzympräparat, wobei beide diese proteolytischen Enzympräparate Papain enthalten, iii) ein Reduktionsmittel, iv) ein Entlipidisierungsmittel und v) ein Phosphorylierungsmittel; b) die Kollagenprobe mit dem ersten proteolytischen Enzympräparat in Kontakt bringt und so zu einer ersten Kollagenlösung gelangt; c) die erste Kollagenlösung mit dem Reduktionsmittel in Kontakt bringt und so zu einer zweiten Kollagenlösung gelangt; d) die zweite Kollagenlösung mit dem zweiten proteolytischen Enzympräparat in Kontakt bringt und so zu einer proteolysierten Kollagenlösung gelangt; e) die proteolysierte Kollagenlösung mit dem Entlipidisierungsmittel in Kontakt bringt und so zu entlipidisiertem Kollagen gelangt und f) das entlipidisierte Kollagen mit dem Phosphorylierungsmittel in Kontakt bringt und so zu phosphoryliertem Kollagen gelangt.
Verfahren nach Anspruch 13, wobei das Reduktionsmittel aus der Gruppe Natriumsulfid, Dithiothreit, Glutathionin und Natriumborhydrid stammt.
Verfahren nach Anspruch 12, wobei das Entlipidisierungsmittel eine Mischung aus Chloroform und Methanol enthält.
Verfahren nach Anspruch 12, wobei das Phosphorylierungsmittel aus der Gruppe Natriumtrimetaphosphat, Natriumhe xametaphosphat, Natriumultraphosphat, Natriumtetrametaphosphat, Phosphorsäureanhydrid und Phosphorylchlorid stammt.
Verfahren nach Anspruch 15, wobei das Phosphorylierungsmittel Natriumtrimetaphosphat enthält.
Verfahren nach Anspruch 12, das weiterhin den Schritt enthält, dass man die Probe zuerst entepithelisiert und dann mit dem ersten proteolytischen Enzympräparat in Kontakt bringt.
Verfahren nach Anspruch 12, das weiterhin den Schritt enthält, dass man das entlipidisierte Kollagen zuerst steril filtriert und dann das entlipidisierte Kollagen mit dem Phosphorylierungsmittel in Kontakt bringt und so zu phosphoryliertem Kollagen gelangt.
Verfahren nach Anspruch 12, das weiterhin die folgenden Schritte enthält: Verpressen des entlipidisierten Kollagens zu Preßkollagen; Entwässern des Preßkollagens, wodurch man zu entwässertem Kollagen gelangt sowie Dispergieren und Trocknen des entwässerten Kollagens, wodurch man zu Kollagenfasern gelangt, und erst dann das entlipidisierte Kollagen phosphoryliert.
Auf gereinigtes Kollagen, das nach dem Verfahren nach Anspruch 12 hergestellt wurde.
Verwendung des aufgereinigten Kollagens nach Anspruch 1 zur Herstellung eines Arzneimittels, um bei einer blutenden Wunde ein Stillen der Blutung zu erzielen.
Verwendung des aufgereinigten Kollagens nach Anspruch 1 zur Herstellung eines Arzneimittels für die Behandlung einer Transplantationsstelle.