DE69824039T2

DE69824039T2 - Heterodimäre fusionsproteine zur verwendung für gezielte immuntherapie und allgemeine immunerregung

Info

Publication number: DE69824039T2
Application number: DE69824039T
Authority: DE
Inventors: D. Stephen GILLIES; Kin-Ming Lo; Yan Lan
Original assignee: EMD Serono Research Center Inc
Current assignee: Merck Patent GmbH
Priority date: 1997-12-08
Filing date: 1998-12-08
Publication date: 2005-08-18
Anticipated expiration: 2018-12-09
Also published as: US7576193B2; AU763719B2; DE69824039D1; US20100015089A1; JP4336452B2; CA2693296A1; JP2001525423A; US20020193570A1; ES2221717T3; JP2009149640A; ATE267215T1; US7226998B2; PT1037927E; CA2693296C; US6838260B2; EP1489100A2; US20050137384A1; EP1489100A3; EP1037927B1; EP1489100B1

Description

Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft allgemein Fusionsproteine. Genauer gesagt, betrifft die vorliegende Erfindung heterodimere Fusionsproteine, die für die zielgerichtete Immuntherapie und allgemeine Immunstimulation verwendbar sind.
Hintergrund der Erfindung
Einer der Schlüsselimmunregulatoren ist die T-Helferzelle, die mit Antigenen reagiert, die an HLA-Klasse-II-Molekülen präsentiert werden. Diese CD4⁺-Zelle differenziert sich als Antwort auf die Stimulation durch Antigen und wird je nach den Cytokinen, die sie sezerniert, zu einer Typ 1- oder Typ 2-Helferzelle (Th1 oder Th2). Mosmann und Coffman, Ann. Rev. Immunol. 7:145-173 (1989). Eine Th1-Antwort führt zur Sekretion von Interleukin-2 (IL-2) und Interferon-γ (IFN-γ), die eine zellvermittelte Immunreaktionen gegen intrazelluläre Pathogene stimuliert. Eine Th2-Antwort führt zur Sekretion von IL-4, IL-5 und IL-10, die Antikörperantworten auf extrazelluläre Pathogene stimuliert. Die interessanteste Komponente dieses Regulationssystems ist, dass die eine Antwort die andere durch die negativen regulatorischen Aktivitäten der gebildeten Cytokine hemmt. So können IL-4 und IL-10 die Th1-Antworten herunterregulieren, während IFN-γ die Th2-Antworten herunterregulieren kann.
Die regulatorische Aktivität von T-Helferzellen und ihre Differenzierung, nachdem sie einem Antigen ausgesetzt waren, wird ebenfalls durch Cytokine reguliert. IL-12, ein disulfidverknüpftes, heterodimeres Cytokin mit einer 40 kDa-Untereinheit und einer 35 kDa-Untereinheit, übt einen starken positiven regulatorischen Einfluss auf die Entwicklung von Th1-Helfer-T-Zellantworten aus. Siehe Review von Trinchieri, Blood 84: 4008-4027 (1994). IL-12 hat auch einen starken synergistischen Effekt auf die Induktion von IFN-γ sowohl aus T-Helferzellen als auch natürlichen Killer- (NK-) Zellen (Eur. Patentanmeldg. 90123670.3). Sezerniertes IFN-γ hemmt dann jede Th2-Zellproliferation und polarisiert die Antwort in Richtung einer bevorzugt zellvermittelten Immunität.
Ein Weg zum Verändern des Ergebnisse einer Immunantwort wäre es, das geeignete Cytokin zum Zeitpunkt der Antigenstimulation zu verabreichen. Wenn IL-4 das während der Antigenstirnulation hauptsächlich vorliegende Cytokin ist, wird die Th2-Antwort verstärkt und die Th1-Antwort gehemmt. Wenn im Gegensatz dazu IL-12 das während der Antigenstimulation hauptsächlich vorliegende Cytokin ist, wird die Th1-Antwort verstärkt und die Th2-Antwort gehemmt. Jedoch ist die systemische Verabreichung von Cytokinen auf Grund ihrer sehr kurzen Zirkulationshalbwertzeiten und ihrer schädlichen Nebenwirkungen schwierig.
Ein besserer Ansatz ist, die Wirkung des Cytokins auf ein Zelloberflächenantigen zu richten, indem man es mit einem Antikörper (oder einem davon abgeleiteten Fragment) mit Spezifität und Affinität für dieses Antigen fusioniert. Siehe Gillies et al., Proc. Natl. Acad. Sci 89: 1428-1432 (1992); U.S.-Patent Nr. 5,650,150, dessen Offenbarung hierin durch Bezugnahme aufgenommen ist. Alternativ kann das stimulatorische Cytokin an ein Proteinantigen mittels einer Peptidbindung in Form eines Fusionsproteins gebunden werden. Siehe Hazama et al., Vaccine 11: 629-636 (1993). Jedoch erschwert die komplexe Struktur von IL-12 die Expression als Fusionsprotein, weil im Endprodukt genau das gleiche molare Verhältnis jeder Untereinheit exprimiert werden muss. Tatsächlich wird IL-12 selbst natürlicherweise als Mischung von p40-Homodimer exprimiert und sezerniert. D'Andrea et al., J. Exp. Med., 176: 1387-1398 (1992).
WO 96/1842 offenbart dimere Fc-Moleküle, die über ihre Aminotermini an die Carboxyltermini von Cytokinen, wie IL-10, gebunden sind. Ein spezifisches IL-12-Fusionsprotein ist nicht eindeutig erwähnt. Mark et al. (J. Biol. Chem. 1992, 267, 36, S. 26166-26171) lehrt ein Fusionsprotein, das eine konstante Region einer IgG-Schwerkette, über ihren Aminoterminus an die Beta-Einheit von HGFr gebunden, umfasst, wobei die Beta-Einheit an die Alpha-Einheit eines Heterodimers gebunden ist.
Kim et al. (J. Immunol. 1997, 158, S. 4137-4144) offenbart ein Ovalbumin-IL-12-Fusionsprotein, wobei die p40-Untereinheit von IL-12 an das Protein und die p35-Untereinheit an die p40-Untereinheit gebunden ist. Keines dieser Dokumente lehrt die Herstellung von Fusionsproteinen, vorzugsweise von Ig-Schwerkettenfusionsproteinen, die Untereinheiten eines Cytokins umfassen, wobei die Untereinheiten in einem äquimolaren Verhältnis exprimiert werden.
Daher besteht im Stand der Technik ein Bedarf an Verfahren zur Herstellung von Fusionsproteinen mit heterodimeren Cytokinen und einem Antikörper oder einem Antigen, das die natürliche heterodimere Struktur des Cytokins aufrechterhält und die Moleküle in äquimolaren Verhältnissen der Untereinheiten sezerniert.
Zusammenfassung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung stellt heterodimere Fusionsproteine, die sich für die gezielte Immuntherapie und die allgemeine Immunstimulation eignen, und Verfahren zur Herstellung dieser heterodimeren Fusionsproteine bereit. Insbesondere stellt die vorliegende Erfindung Verfahren zur Herstellung von Fusionsproteinen mit IL-12 bereit, die seine natürliche heterodimere Struktur aufrechterhalten und die Sekretion mit äquimolaren Verhältnissen der IL-12-Untereinheiten bereitstellen.
Unter einem Aspekt der Erfindung umfasst das Fusionsprotein zwei chimäre Ketten, die durch eine Disulfidbrücke miteinander verbunden sind. Jede chimäre Kette umfasst eine unterschiedliche Untereinheit des heterodimeren Cytokins, das durch eine Peptidbindung an einen Abschnitt einer schweren Ig-Kette gebunden ist.
Bei einer alternativen bevorzugten Ausführungsform umfasst das Fusionsprotein eine erste chimäre Kette, die eine der Untereinheiten des heterodimeren Cytokins umfasst, die durch eine Peptidbindung an einen Abschnitt einer Ig-Schwerkette gebunden ist. Diese Untereinheit ist durch eine Disulfidbindung an die andere Untereinheit des heterodimeren Cytokins gebunden. Diese erste chimäre Kette ist durch eine Disulfidbrücke an eine zweite chimäre Kette gebunden, die eine der Untereinheiten des heterodimeren Cytokins umfasst, die durch eine Peptidbindung an einen Abschnitt einer Ig-Schwerkette und durch eine Disulfidbindung an die andere Untereinheit des heterodimeren Cytokins gebunden ist.
Bei einer bevorzugten Ausführungsform dieser Alternative ist die Cytokinuntereinheit, die an die Ig-Schwerkette jeder chimären Kette gebunden ist, die p35-Unter einheit von IL-12, und die andere, an p35 gebundene Untereinheit ist die p40-Untereinheit von IL-12.
Erfindungsgemäße Fusionsproteine können aufgrund zweier Aspekte ihrer Struktur als chimär betrachtet werden. Erstens ist das Fusionsprotein dahingehend chimär, dass es eine Immunglobulinkette (in der Regel, aber nicht ausschließlich eine Schwerkette) von geeigneter Antigen-Bindungsspezifität, gebunden an ein gegebenes heterodimeres Cytokin, umfasst. Zweitens kann ein erfindungsgemäßes Immunkonjugat in dem Sinn chimär sein, dass es eine variable Region und eine konstante Region umfasst, die die gewöhnlich mit der variablen Region verbundene konstante Region oder eine unterschiedliche und folglich eine V/C-Chimäre sein kann; z. B. variable und konstante Regionen verschiedener Spezies. Ebenso umfasst der Begriff „Fusionsprotein" Konstrukte mit einer Bindungsdomäne, die Gerüstregionen und variable Regionen (d.h. komplementaritätsbestimmende Regionen) verschiedener Spezies umfasst, wie von Winter, et al., GB 2,188,638 offenbart.
Das erfindungsgemäße heterodimere Cytokin-Antikörper-Fusionsprotein zeigt bevorzugt Artigenbindungsspezifität. In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst das heterodimere Cytokin-Antikörper-Fusionsprotein eine schwere Kette. Die schwere Kette kann CH1-, CH2-, und/oder CH3-Domänen umfassen. Bei einer alternativen bevorzugten Ausführungsform umfasst das heterodimere Cytokin-Antikörper-Fusionsprotein eine leichte Kette. Die Erfindung stellt somit Fusionsproteine bereit, bei denen die Antigenbindungsspezifität und Aktivität eines Antikörpers mit der starken biologischen Aktivität eines heterodimeren Cytokins kombiniert sind. Ein erfindungsgemäßes Fusionsprotein kann verwendet werden, ein heterodimeres Cytokin in vivo selektiv an eine Zielzelle heranzuführen, so dass das heterodimere Cytokin eine lokalisierte biologische Wirkung ausüben kann.
Vorzugsweise zeigt das erfindungsgemäße Fusionsprotein die biologische Aktivität eines Cytokins. Das bevorzugte heterodimere Cytokin des Fusionsproteins ist IL-12. Fusionen mit Antikörpern, die Antigene binden können, eignen sich zur Co- Lokalisation der immunstimulatorischen Aktivität von IL-12 entweder an Zielzellen oder an Zielproteinantigenen.
Außerdem hat das erfindungsgemäße Fusionsprotein vorzugsweise eine längere Zirkulationshalbwertszeit als ein ungebundenes heterodimeres Cytokin. Fusionen mit dem Fc-Anteil von Antikörpern und IL-12 eignen sich zur Veränderung der Pharmakologie und biologischen Verteilung des Moleküls durch Erhöhen seiner Zirkulationshalbwertszeit und seiner Affinität für Fc-Rezeptor-tragende Zellen, z.B. antigenpräsentierende Zellen. Veränderungen in der biologischen Verteilung können auch seine systemische Toxizität ändern, indem sich der Mechanismus verändert, durch den es aus dem Kreislauf entfernt wird.
Unter einem anderen Aspekt der Erfindung umfasst das Fusionsprotein ein heterodimeres Cytokin, das an ein Protein mit antigenen Eigenschaften gebunden ist. Dieses erfindungsgemäße Fusionsprotein zeigt die biologische Aktivität eines Cytokins und antigene Aktivität. Außerdem hat dieses erfindungsgemäße Fusionsprotein bevorzugt eine längere Zirkulationshalbwertszeit als ein ungebundenes heterodimeres Cytokin. Das bevorzugte heterodimere Cytokin dieses Fusionsproteins ist IL-12. Das Fusionsprotein umfasst zwei chimäre Ketten, die durch eine Disulfidbindung verbunden sind. Jede chimäre Kette umfasst eine unterschiedliche Untereinheit des heterodimeren Cytokins, die jeweils durch eine Peptidbindung an das Protein mit antigenen Eigenschaften gebunden sind.
Die Erfindung umfasst auch DNA-Konstrukte, die die vorstehend beschriebenen Fusionsproteine codieren, und Zelllinien, z. B. Myelome, die mit diesen Konstrukten transfiziert sind.
Die Erfindung umfasst auch ein Verfahren ein zur Herstellung eines Fusionsproteins, wie vorstehend, nachstehend und in den Ansprüchen spezifiziert. Das Verfahren umfasst (1) die Bindung der ersten der zwei Untereinheiten eines heterodimeren Cytokins durch eine Peptidbindung an eine Ig-Schwerkette oder an ein Protein mit antigenen Eigenschaften, wodurch eine erste chimäre Kette gebildet wird; (2) die Bindung der zweiten der zwei Untereinheiten des heterodimeren Cytokins durch eine Peptidbindung an eine Ig-Schwerkette oder an ein Protein mit antigenen Eigenschaften, wodurch eine zweite chimäre Kette gebildet wird; und (3) die Verbindung der ersten und der zweiten chimären Kette durch eine Disulfidbindung, wodurch das Fusionsprotein gebildet wird. Das erhaltene Fusionsprotein kann Bindungsspezifität für ein vorbestimmtes Antigen und die biologische Aktivität eines Cytokins aufweisen.
Die Erfindung umfasst auch ein Verfahren zur Herstellung eines bevorzugten dimeren IL-12-Fusionsproteins, wie vorstehend, nachstehend und in den Ansprüchen spezifiziert. Das Verfahren umfasst die folgenden Schritte: (i) das Binden der p35-Untereinheit von IL-12 durch eine Peptidbindung über ihren Aminoterminus an den Carboxylterminus des Ig-Schwerketten-Abschnitts, wodurch eine erste chimäre Kette gebildet wird, wobei die p35-Untereinheit an die p40-Untereinheit durch eine Disulfidbindung gebunden ist, (ii) das Binden der p35-Untereinheit von IL-12 durch eine Peptidbindung über ihren Aminoterminus an den Carboxylterminus des Ig-Schwerketten-Abschnitts, wodurch eine zweite chimäre Kette gebildet wird, wobei die p35-Untereinheit an die p40-Untereinheit durch eine Disulfidbindung gebunden ist, und (iii) das Verbinden dieser ersten und zweiten chimären Kette durch eine Disulfidbindung, wodurch ein dimeres Fusionsprotein gebildet wird.
Die erfindungsgemäßen IL-12-Fusionsproteine eignen sich zur spezifischen Zielansteuerung oder zur Immunstimulation, wenn es wichtig ist, eine zellvermittelte Immunantwort zu erzeugen, beispielsweise bei der Krebsimmuntherapie oder bei antiviralen Antworten. Sie eignen sich auch zur spezifischen Herunterregulation von Th2-Anworten, die oft zur Überproduktion von IL-4 führen. Von diesem Cytokin wurde gezeigt, dass es für die Entwicklung einer Allergie durch Induktion einer Th2-Antwort und die daraus resultierende Überproduktion an IgE-Antikörper wesentlich ist.
Kurze Beschreibung der Abbildungen
Die vorstehenden und andere Aufgaben der vorliegenden Erfindung und ihre verschiedenen Merkmale können vollständiger verstanden werden durch die folgende Beschreibung zusammen mit den beigefügten Abbildungen, wobei:
1 eine schematische Darstellung der vorhergesagten Proteinstruktur heterodimerer Fusionsproteine ist;
2 eine schematische Darstellung einer SDS-PAGE ist, die eine Analyse unter reduzierenden Bedingungen von Proteinen zeigt, die aus Zellen sezerniert werden, die mit Vektoren transfiziert sind, die das Fc-p35-Fusionsprotein (Spur 1), das Fc-p40-Fusionsprotein (Spur 2), das Fc-p35-Fusionsprotein und das Fc-p40-Fusionsprotein (Spur 3), das Fc-p35-Fusionsprotein und die p40-Untereinheit (Spur 4) und die p35-Untereinheit und das Fc-p40-Fusionsprotein (Spur 5) exprimieren.
3 eine schematische Darstellung der vorhergesagten Proteinstruktur exprimierter Fusionsproteine ist;
4 ein Balkendiagramm ist, das die Fähigkeit verschiedener Fusionsproteine zur Stimulation der IFN-γ-Produktion darstellt;
5A eine schematische Darstellung einer SDS-PAGE ist, die eine Analyse von gesamten Antikörper-IL-12-Fusionsproteinen, die von zwei unabhängigen Transfektanten hergestellt werden, unter nicht reduzierenden (Spuren 1 und 2) und reduzierenden Bedingungen zeigt (Spuren 3 und 4);
5B–5D graphische Darstellungen sind, die die Wirkungen von Human-IL-12 (X), Hu-KS-IL-12-Fusionsprotein mit beiden humanen IL-12-Ketten (geschlossene Quadrate) und Hu-KS-1/4-Maus-p35-Human-p40-Fusionsprotein (offene Quadrate) auf die Proliferation von mitogenaktivierten humanen PBMC (Bild B); die Induktion der IFN-γ-Sekretion aus PHA-aktivierten PBMC (Bild C) und aus Mauseffektorzellen, die mit Concanavalin A vorstimuliert sind (Bild D), zeigen;
6A–6B graphische Darstellungen sind, die die Wirkungen von IL-12 (X), Einketten-Fusionsprotein mit humanen p35- und p40-Untereinheiten (geschlossene Quadrate) und Einketten-Fusionsprotein mit einer p35-Untereinheit der Maus und einer humanen p40-Untereinheit (offene Quadrate) auf die Induktion der IFN-γ-Sekretion zeigen;
6C eine graphische Darstellung ist, der die Antigenbindungsaktivität von gesamtem Hu-KS-1/4-IL-12-Fusionsprotein (offene Quadrate), Einketten-Fusionsprotein mit Human-IL-12 (offene Rauten), Einketten-Fusionsprotein mit Maus-p35-Human-p40 (offene und freie Kreise) und Human-IL-12 (offene Dreiecke) zeigt;
7 eine graphische Darstellung ist, der die Serumhalbwertszeit von Hu-KS-I1-12-(Maus-p35-Human-p40) zeigt, gemessen durch einen ELISA unter Verwendung eines Einfangschritts mit Anti-Human-H- und -L-Kette und einen zweiten Nachweis mit Anti-Human-Fc-Antikörper (geschlossene Rauten) oder Anti-Human-IL-12-p40-Antikörper (offene Quadrate);
8 (oberes und unteres Bild) graphische Darstellungen sind, die die Immunogenizität von IL-12-Fusionsproteine zeigen. Serumverdünnungen von Tieren, denen entweder Hu-KS-1/4-Antikörper oder Hu-KS-1/4-IL-12-(Maus-p35-Human-p40) injiziert wurde, wurden bezüglich der Reaktivität gegen den Hu-KS-1/4-Antikörper getestet.
Eingehende Beschreibung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung beschreibt Fusionsproteine zwischen heterodimeren Cytokinen und anderen Proteinen. Heterodimere Cytokine können zum Beispiel mit Proteinen mit zielansteuernden oder antigenen Eigenschaften fusioniert werden. Fusionsproteine zwischen heterodimeren Cytokinen und Proteinen mit zielansteuernden oder antigenen Eigenschaften können eine längere Zirkulationshalbwertszeit besitzen als ungebundene heterodimere Cytokine. Zielansteuerungs- oder Antigeneigenschaften sind für die verlängerte Zirkulationshalbwertszeit nicht nötig, da diese Eigenschaft auch durch Fusionieren eines heterodimeren Cytokins mit einem Protein erzielt werden kann, dem zielerkennende oder antigene Eigenschaften fehlen, wie zum Beispiel Serumalbumin.
Die erfindungsgemäßen Fusionsproteine können durch gentechnologische Verfahren hergestellt werden. Wie in 1 gezeigt, können verschiedene Fusionsproteinkonstrukte durch die erfindungsgemäßen Methoden hergestellt werden. Bei einer Ausführungsform wird eine der Untereinheiten des heterodimeren Cytokins, die mit einem Protein mit antigenen Eigenschaften oder einer Ig-Schwerkette fusioniert ist, mit einer freien Untereinheit des anderen Typs coexprimiert. Nach der Expression wird die chimäre Kette durch eine Disulfidbindung an die freie Untereinheit gebunden (1B). Bei einer anderen Ausführungsform kann das Protein mit antigenen Eigenschaften oder eine Ig-Schwerkette, das/die mit einer Untereinheit fusioniert ist, an ein anderes Protein mit antigenen Eigenschaften oder eine Ig-Schwerkette gebunden werden. Da jedes Protein mit antigenen Eigenschaften oder jede Ig-Schwerkette an ein heterodimeres Cytokin gebunden ist, besitzt das erhaltene Konstrukt zwei Moleküle des heterodimeren Cytokins (1C) Bei noch einer anderen Ausführungsform ist jede Untereinheit des heterodimeren Cytokins mit einem Protein mit antigenen Eigenschaften oder einer Ig-Schwerkette fusioniert und die zwei chimären Ketten sind durch eine Disulfidbindung verbunden. Das erhaltene Konstrukt besitzt nur ein Molekül des heterodimeren Cytokins (1D). Bei noch einer anderen Ausführungsform werden zwei Untereinheiten des heterodimeren Cytokins, die mit einem Protein mit antigenen Eigenschaften oder einer Ig-Schwerkette fusioniert sind, mit einer freien Untereinheit coexprimiert. Das erhaltene Konstrukt besitzt drei Untereinheiten des heterodimeren Cytokins (1E).
Zurzeit ist IL-12 das einzige bekannte heterodimere Cytokin. Nach der Identifikation und Sequenzierung neuer heterodimerer Cytokine wird ein Fachmann jedoch in der Lage sein, erfindungsgemäße Verfahren zur Herstellung von Fusionsproteinen mit diesen neuen heterodimeren Cytokinen zu verwenden.
Verfahren zur Synthese geeigneter Ausführungsformen der Erfindung sowie geeignete Assays zum Testen ihrer pharmakologischen Aktivitäten sowohl in vitro als auch in vorklinischen in vivo Tiermodellen sind beschrieben. Das bevorzugte Genkonstrukt, das eine chimäre Kette (d.h. eine Untereinheit des heterodimeren Cytokins, fusioniert mit einem Protein mit antigenen Eigenschaften oder einer Ig-Schwerkette) codiert, umfasst in 5'- nach 3'-Richtung ein DNA-Segment, das ein Protein mit antigenen Eigenschaften oder eine Ig-Schwerkette codiert, und DNA, die eine Untereinheit des heterodimeren Cytokins codiert. Ein alternatives bevorzugtes Genkonstrukt umfasst in 5'- nach 3'-Richtung ein DNA-Segment, das eine Untereinheit des heterodimeren Cytokins codiert, und DNA, die ein Protein mit antigenen Eigenschaften oder eine Ig-Schwerkette codiert. Das fusionierte Gen wird für die Transfektion geeigneter Empfängerzellen, in denen es exprimiert wird, in einem Expressionsvektor zusammengesetzt oder darin eingebracht.
Die Erfindung wird ferner durch die folgenden nichtbeschränkenden Beispiele erläutert:
Beispiel 1 Klonierung von cDNAs, die Human- und Maus-IL-12-Untereinheiten codieren
Humane periphere Blutmonocyten (PBMC) wurden von einem gesunden Freiwilligen erhalten und durch Zentrifugation auf einem Ficoll-Hypaque-Gradienten (Pharmacia) (1700 U/min für 20 min) gereinigt. Der „Buffy Coat", der die PBMC enthält, wurde mit serumfreiem Kulturmedium (SF-RPMI) auf ein Volumen von 50 ml verdünnt und durch Zentrifugation bei 1500 U/min für 5 min gesammelt. Die Zellen wurden in AIM-V-Zellkulturmedium (GIBCO) bis zu einer Dichte von 5 × 10⁶ Zellen/ml resuspendiert und für 2 Tage bei 37 °C in einem befeuchteten CO₂-Inkubator gezüchtet. Die anhaftenden Zellen wurden selektiert, indem die Kulturflasche leicht geschüttelt wurde, um nicht haftende Zellen zu entfernen. Frisches Medium, das Phorbolester (100 nM) und das Calciumionophor Ionomycin (0,1 μg/ml) enthielt, wurde zugesetzt. Nach drei Tagen wurden die Zellen durch sanftes Abschaben und Zentrifugation gesammelt. PolyA⁺-mRNA wurde unter Verwendung von mit Oligo-dT beschichteten Kugeln (Dynal, Inc.) hergestellt.
Untereinheiten-cDNAs wurden unter Verwendung von Polymerasekettenreaktionen (PCR) kloniert. Erststrang-cDNA wurde in einer 50 μl Reaktion, die Oligo-dT-Primer (50μg/ml), Reaktionspuffer, RNAsin (10 U/ml) und reverse Transkriptase enthielt, synthetisiert. Die Inkubation erfolgte bei 43 °C für 2 h, gefolgt von Extraktion mit Phenol, Phenol:Chloroform (50:50) und Fällung mit Ethanol. Das cDNA-Produkt wurde als Matrize für PCR-Reaktionen verwendet, die Taq-Polymerase und Reaktionspuffer (10x Puffer; Perkin Elmer), Sense- und Antisense-Primer (jeweils 0,2 bis 0,5 μm) und 10 % der cDNA-Reaktion enthielten. Die Primersequenzen waren 5'-CCAGAAAGCAAGAGACCAGAG-3' (SEQ ID NR: 1) für den Sense-Primer und 5'-GGAGGGACCTCGAGTTTTAGGAAGCATTCAG-3' (SEQ ID NR: 2) für den Antisense-Primer der p35-Untereinheiten-cDNA. Der Sense-Primer stammt von einer Sequenz im 5'-untranslatierten Bereich des p35-Boten unmittelbar stromaufwärts von einer XmaI-Restriktionsstelle, während der Antisense-Primer ein Translations-Stoppcodon codiert, worauf kurz danach eine geeignete XhoI-Restriktionsstelle zur gerichteten Subklonierung in einen Expressionsvektor folgt. Die Primer für die p40-Untereinheiten-cDNA waren 5'-CTCCGTCCTGTCTAGAGCAAGATGTGTC-3' (SEQ ID NR: 3) für den Sense-Primer und 5'-GCTTCTCGAGAACCTAACTGCAGGGCACAG-3' (SEQ ID NR: 4) für den Antisense-Primer. Der Sense-Primer codiert eine einzelne XbaI-Restriktionsstelle stromaufwärts vom Translationsstart, während der Antisense-Prirner ein Stoppcodon und, wie vorstehend, eine einzelne XhoI-Restriktionsstelle codiert. Beide Untereinheitssequenzen, die mit diesen PCR-Primern kloniert werden, werden als Einzelproteine exprimiert und benötigen daher native oder andere sekretorische Leadersequenzen für den korrekten Zusammenbau und die korrekte Sekretion des Heterodimers. Die PCR-Reaktionen bestanden aus 40 Zyklen einschließlich: 1 min bei 92 °C, 2 min bei 52 °C und 3 min bei 72 °C, die auf einen anfänglichen Denaturierungsschritt von 94 °C für 2 min folgen. Die Produkte wurden über ein Gel gereinigt und zur Sequenzüberprüfung in den SK-Klonierungsvektor (Stratagene) kloniert. Die DNA-Sequenzierung wurde unter Verwendung eines kommerziellen Kits (U.S. Biochemical) an jeder Untereinheiten-cDNA durchgeführt. Das gleiche Verfahren kann zur Klonierung der Maus-p35-Untereinheiten-cDNA aus Milzzellen, die mit Concanavalin A (5 μg/ml in Kulturmedium für 3 Tage) aktiviert sind, verwendet werden. Empfohlene Primer sind 5'-CCTCTACTAACATGTGTCAATCACGCTACCTC-3' (SEQ ID NR: 5) für den Sense-Primer und 5'-CCCTCGAGTCAGGCGGAGCTCAGATAGCC-3' (SEQ ID NR: 6) für den Antisense-Primer, die die gleichen Restriktionstellen codieren, wie vorstehend für die humane p35-Unterheit beschrieben.
Beispiel 2 Expression der Fusionsproteinkombinationen in transfizierten Säugerzellen
Um die fusionierten Versionen jeder Untereinheit herzustellen, wurden die DNAs, die jeweils die reife Proteinsequenz codieren, folgendermaßen angepasst. Die p40-Untereinheiten-DNA wurde mit NdeI, das sehr nahe an der Verknüpfungsstelle des reifen Proteins mit der Leadersequenz schneidet, und mit XhoI verdaut. Ein Adapteroligonucleotid mit der Sequenz 5'-CCGGGCAAGTCCA-3' (SEQ ID NR: 7) wurde synthetisiert, das an ein zweites, teilweise komplementäres Oligonucleotid mit der Sequenz 5'-TATGGACTTGC-3' (SEQ ID NR: 8) hybridisierte. Die doppelsträngige DNA enthält überhängende Sequenz, die mit der Ligation an eine XmaI-Restriktionsstelle am 5'-Ende und an eine NdeI-Stelle am 3'-Ende kompatibel ist. Dieses Fragment wurde an das NdeI/XhoI-Fragment der p40-cDNA ligiert und als ein XmaI-XhoI-Fragment in den Vektor pdC-Fx-X kloniert, der mit XmaI und XhoT geschnitten worden war. Dieser Vektor enthält bereits ein Human-IgGl-Fc codierendes DNA-Fragment in seiner genomischen Konfiguration (einschließlich Introns und Exons), das stromabwärts einer Leadersequenz fusioniert ist, die von einer Maus-Leichtkette stammt. Siehe Gillies et al., J. Immunol. Methods 125: 191-202 (1989). Das Einbringen eines DNA-Fragments in seine einzige XmaI-Restriktionsstelle erlaubt die Herstellung von Fusionsproteinen, die direkt an den Carboxylterminus des Fc gebunden sind, vorausgesetzt dass der Leserahmen zwischen den zwei Sequenzen aufrechterhalten wird (Lo et al., U.S.-Patent Nr. 5,541,087). Andere Proteine (z.B. Antigen, Serumalbumin) können auf die gleiche Weise an den Aminoterminus dieser Untereinheiten fusioniert werden. Die Vorteile dieses Verfahrens umfassen die großen hergestellten Produktmengen und die Einfachheit der Reinigung des Produkts durch Bindung an und Elution von Protein-A-Sepharose.
Dieselbe allgemeine Strategie wurde verwendet, um die DNA der p35-Untereinheit an Human-Fc zu fusionieren. In diesem Fall wurde ein XmaI-BalI-Linker unter Verwendung der Oligonucleotide 5'-CCGGGAAGAAACCTCCCCGTGG-3' (SEQ ID NR: 9) und 5'-CCACGGGGAGGTTTCTTC-3' (SEQ ID NR: 10) synthetisiert, die an eine p35-Untereinheiten-DNA ligiert, mit BalI und XhoI geschnitten und als ein XmaI/UXhoI-Fragment in den pdC-Fc-X-Vektor subkloniert wurden, wie vorstehend beschrieben. Für die humane p35-Untereinheit wurde gezeigt, dass sie in Humanzellen, aber nicht in Mauszellen hinsichtlich der IL-12-Aktivität aktiv ist, wohingegen die humane p40-Untereinheit keine Artspezifität zeigt. Daher kann die humane p40-Untereinheit entweder zur Herstellung aller Human-I1-12-Fusionsproteine oder von Human/Maus-Hybridfusionsproteinen verwendet werden.
Die erhaltenen Konstrukte codieren Fc-p35- oder Fc-p40-Fusionsproteine, von denen erwartet wird, dass sie spontan zu Proteinen von 120 kD (50 kD von Fc) beziehungsweise 130 kD dimerisieren und nach Reduktion auf denaturierenden SDS-Gelen wie Proteine von 60 kD und 65 kD wandern. Die einzelnen Untereinheiten-cDNAs wurden für ihre Expression als unabhängige Proteine in den pdC-Expressionsvektor (ohne Fc) subkloniert. Dieser Vektor stellt Promotersequenzen zur Expression von mRNA bereit, die von dem cDNA-Insert nach der Transfektion von Säugerzellen transkribiert wird. Er stellt ferner stromabwärts der XhoI-Insertionsstelle einen 3'-untranslatierten Bereich und eine PolyA-Verknüpfungsstelle bereit. Es gibt auch Sequenzen, die für die Vermehrung des Plasmids in E. coli und für die Selektion mit Ampicillin notwendig sind, ebenso wie ein Selektionsmarkergen, wie Dihydrofolatreduktase (dhfr), das eine Resistenz gegen Methotrexat verleiht. Die gleichen Komponenten werden auch bei dem pdC-Fc-X-Vektor zur Expression der Fusionsproteine verwendet.
Zur Expression des biologisch aktiven I1-12-Fusionsprotein-Heterodimers wuden verschiedene Kombinationen der einzelnen Vektoren, die Fusions- und Nichtfusionsformen der Untereinheiten codieren, durch Cotransfektion von humanen 293-Epidermiskarzinomzellen transient exprimiert. Die DNA wurde unter Ver wendung von Präparationskits (Wizard, Promega Inc.) gereinigt und zur Sterilisation und zum Resuspendieren in sterilem Wasser mit Ethanol gefällt. Calciumphosphatniederschläge wurden durch Standardverfahren unter Verwendung von 10 μg DNA pro ml (jeweils 5 μg, wenn zwei Plasmide cotransfiziert wurden) hergestellt, und 0,5 ml/Platte wurden zu 293-Kulturen gegeben, die auf 60-mm-Platten bei nahezu 70 %iger Konfluenz wuchsen. MOLECULAR CLONINGA LABOTATORY MANUAL, 2. Aufl. (Sambrook, Fritsch und Maniatis, Hrsg., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989). Nach 16 h wurde das Medium, das den Niederschlag enthielt, entfernt und gegen frisches Medium ausgetauscht. Nach 3 Tagen wurde der Überstand entfernt und mittels ELISA, biologischer Bestimmung der IL-12-Aktivität oder Immunpräzipitation und Analyse auf SDS-Gelen von radioaktiv markierten Proteinen bezüglich der Produktion einer Expression transfizierter Gene untersucht. Zum Markieren wurde Medium ohne Methionin zum Ersetzen des Wachstumsmediums am zweiten Tag der Kultur verwendet, und ³⁵S-Methionin (100 μCi/ml) wird zugesetzt. Nach weiteren 16 h Inkubation wurde das Medium geerntet, durch Zentrifugation geklärt (5 min bei 13000 U/min in einer Tisch-Mikrozentrifuge) und mit Protein-A-Sepharosekugeln (10 μl Kugelvolumen pro ml Kulturüberstand) inkubiert. Nach 1 h bei Raumtemperatur wurden die Kugeln durch wiederholte Zentrifugation und Resuspendieren in PBS-Puffer, der 1 % NP-40 enthielt, gewaschen. Das endgültige Pellet wurde in SDS enthaltendem Gelpuffer resuspendiert und für 2 min gekocht. Nach Entfernen der Kugeln durch Zentrifugation wurde der Überstand in zwei Aliquote unterteilt. Reduktionsmittel (5 % 2-Mercaptoethanol) wurde zu einer Probe gegeben und beide wurden 5 min gekocht, bevor sie auf ein SDS-Polyacrylamidgel aufgetragen wurden. Nach der Elektrophorese wurde das Gel einem Röntgenfilm ausgesetzt (Autoradiographie).
Ein Beispiel einer Analyse der Coexpression verschiedener Fusionsproteine und einzeln exprimierter Proteine unter reduzierenden Bedingungen ist in 2 gezeigt. Die Ergebnisse zeigen, dass die p35-Untereinheit nicht aus der Zelle sezerniert werden kann, sogar wenn sie als Fusionsprotein mit dem Fc-Fragment exprimiert wird (Spur 1). Die p40-Untereinheit wurde dagegen ohne weiteres sezerniert, wenn sie an Fc fusioniert war (Spur 2). Die p35-Untereinheit wurde sezerniert, wenn sie sich mit der p40-Untereinheit paaren konnte, entweder als Fc-p35-Fusionspaarung mit einem Fc-p40-Fusionsprotein (Spur 3), die Fc-p35-Paarung mit freiem p40 (Spur 4) oder Paarung von freiem p35 mit dem Fc-p40-Fusionsprotein (Spur 5). In allen Fällen der Expression einer freien Untereinheit zusammen mit einem Fusionsprotein verbindet sich die freie Untereinheit mit der anderen Untereinheit und bildet eine kovalente Disulfidbindung. Ein Diagramm dieser verschiedenen Kombinationen ist in 1 gezeigt. Man sollte beachten, dass das Konstrukt mit jeder Untereinheit, die an Fc fusioniert ist und in derselben Zelle coexprimiert wird, ein Molekül IL-12 pro Fc besitzt (1D), wohingegen die Konstrukte aus der Fusion einer einzelnen Untereinheit mit Fc, die mit einer freien Untereinheit (des anderen Typs) gepaart ist, zwei Moleküle IL-12 pro Fc besitzt (1C). Es wird erwartet, dass eine Expression in stabil transfizierten Zellen sich von der transienten Expression unterscheidet, weil die Expression und Sekretion von p35 unabhängig ist. Folglich ist die Überexpression von p40 möglich und für die Zelle vorteilhafter, da es leicht exportiert werden kann. Dies könnte zu einem übermäßigen Vorkommen von Fc-p40-Untereinheiten im Vergleich zu Fc-p35-Untereinheiten führen und eine Mischung aus Heterodimer- und p40-Homodimer-Sekretion aus der Zelle bewirken. Dies wäre ineffizient und würde zur Problemen bei der Reinigung führen. Die Expression von p35 bringt wahrscheinlich einen Wachstumsnachteil mit sich, da überschüssiges Protein wahrscheinlich im endoplasmatischen Retikulum abgebaut wird, wenn es nicht mit der p40-Untereinheit effizient gepaart ist. So ist es möglich, einen Vorteil aus dieser Situation zu ziehen, um die ausgewogene Sekretion nur eines Heterodimerfusionsprodukts sicherzustellen, indem die p35-Untereinheit als Fusionsprotein zusammen mit freier p40-Untereinheit exprmiert wird. Nur mit einer äquimolaren Menge der p40-Untereinheit gepaartes p35-Fusionsprotein kann sezerniert werden. Die Reinigung diese Produkts an Protein A ergibt eine homogene Zubereitung des Heterodimers. Eine schematische Darstellung der vorhergesagten Proteinstruktur des exprimierten Fusionsproteins ist in 3 dargestellt.
Beispiel 3 Aktivität von Fusionsproteinen in einem IFN-γ-Induktionsassay
Die biologische Aktivität wurde in einem IFN-γ-Induktionsassay unter Verwendung mitogenaktivierter, wie in Beispiel 1 gereinigter Human-PBMC gemessen.
Nach der Gradientenzentrifugation wurden die Zellen in Zellkulturmedium, das 10 % fötales Rinderserum (RPMI-10) und Phytohämagglutinin (PHA; 10 μg/ml) enthielt, bis zu einer Dichte von 5 × 10⁶ Zellen/ml resuspendiert und 3 Tage bei 37 °C in einem befeuchteten CO₂-Inkubator gezüchtet. Die PHA-aktivierten Zellen wurden mittels Zentrifugation gesammelt, dreimal mit dem gleichen Volumen an SF-RPMI gewaschen und in frischem RPMI-10 (1 × 10⁶ Zellen/ml) resuspendiert. Aliquote (100 μl) wurden in die Vertiefungen von mehreren Platten mit 96 Vertiefungen gegeben, wobei eine endgültige Zellzahl von 10⁵ pro Vertiefung erhalten wurde. Testproben aus dem Kulturmedium wurden in frischem Kulturmedium seriell verdünnt und zu den Vertiefungen der Platte mit 96 Vertiefungen gegeben. Es wurde Stimulationsmedium (50 μl/Vertiefung), das 10 % Serum und IL-2 (25 U/ml) enthielt, zugesetzt. Kontrollvertiefungen erhielten nur IL-2 (negative Kontrolle) oder IL-2 und kommerzielles IL-12 (R & D Systems), aber keine Probe (positive Kontrolle). Die Platten wurden für 48 h bei 37 °C in einem CO₂-Inkubator inkubiert, wonach Aliquote (20 μl) zur Analyse der IFN-γ-Konzentration durch ELISA entnommen wurden.
Der gleiche Assay wurde verwendet, um die Aktivität der Mausformen der IL-12-Fusionsproteine zu bestimmen, ausgenommen dass Milzzellen aus Balb/c-Mäusen, die für 3 Tage mit Concanavalin A aktiviert worden waren, anstelle von PHA-aktivierten Human-PBMC verwendet wurden. Es wurde ein mausspezifischer ELISA verwendet, um die IFN-γ-Menge, die durch die Human-p40/Maus-p35-Hybridmoleküle induziert wurde, zu quantifizieren.
Für das Humansystem wurde ein quantitativer ELISA entwickelt, indem Platten mit 96 Vertiefungen (Nunc-Immunoplate F96 Cert. Maxisorb) mit einem monoklonalen Mausantikörper gegen Human-IFN-γ (1 μg/ml) in phosphatgepufferter Salzlösung (PBS; Pestka Biological Laboratories) über Nacht bei 4 °C beschichtet wurden, ungebundener Antikörper dreimal mit PBS abgewaschen wurde und mit einer Lösung von 1 % Rinderserumalbumin (BSA) und 1 % Ziegenserum in PBS (150 μl/Vertiefung für 2 h bei 37 °C) blockiert wurde. Nach viermaligem Waschen der blockierten Platten mit PBS wurden Testproben und Verdünnungen des IFN-γ-Standards bis zu einem Endvolumen von 100 μl/Vertiefung zugegeben. Nach anschließender Inkubation bei 4 °C über Nacht wurden die Platten viermal mit PBS gewaschen, und ein polyklonales Antiserum aus Kaninchen gegen Human-IFN-γ (1/10000-Verdünnung; Petska Biological Laboratories) wurde zugesetzt. Nach zusätzlicher Inkubation für 1 h bei 37 °C und viermaligem Waschen mit PBS wurde ein polyklonaler Esel-Anti-Kaninchen-Nachweisantikörper, der mit Meerrettichperoxidase konjugiert war, (1/700-Verdünnung; Petska Biological Laboratories) für 1 h bei 37 °C zugegeben. Die Platten werden dann viermal mit PBS gewaschen, und 100 μl K-Blue-Substrat (ELISA Technologies, Neogen Corp.) wurden zugesetzt, bis die Farbe in den Vertiefungen, die die Standardkurve enthielten, ausreichend entwickelt war, und zu diesem Zeitpunkt wurden 100 μl von Red-Stop-Lösung zugesetzt (ELISA Technologies). Die Platte wurde bei 650 nm unter Verwendung eines ELISA-Plattenlesers (Dynatech MR7000) gelesen, und die Menge an IFN-γ wurde durch Vergleich der optischen Dichte der Testprobe mit der Standardkurve, die aus den Verdünnungen des Kontroll-IFN-γ erhalten wurde, berechnet. Die Menge an IFN-γ, die in Gegenwart von sowohl IL-2 als auch IL 12 induziert wurde, reicht im Allgemeinen von 1200-2000 pg/ml, während die in Abwesenheit von IL-12 gebildete Menge im Allgemeinen weniger als 50 pg/ml betrug.
Die im Beispiel 2 beschriebene biologische Aktivität der Kulturüberstande wurde bezüglich ihrer Fähigkeit verglichen, die IFN-γ-Produktion zu stimulieren. Wie in 4 gezeigt, wurde die höchste Aktivität mit dem Fc-p35-Fusionsprotein erhalten, das mit freier p40-Untereinheit coexprimiert wurde, obgleich die anderen Kombinationen mit beiden Untereinheiten ebenfalls aktiv waren. Genauere Messungen mit gereinigten Proteinen sind nachstehend beschrieben.
Beispiel 4 Expression von Antikörper-IL-12-Fusionsproteinen
Die im Beispiel 2 beschriebenen Experimente zeigen, dass ein geeigneter Weg zur Expression von Fusionsproteinen mit dem heterodimeren IL-12-Cytokin die Coexpression eines fusionierten p35-Untereinheitproteins zusammen mit freier p40-Untereinheit in derselben Zelle ist. Dies kann durch zwei Ansätze erreicht werden: Der erste wird erreicht, indem der Fusionsproteinvektor und der p40-Expressionsvektor gleichzeitig cotransfiziert werden (d.h. simultane Transfektion); der zweite besteht darin, zuerst eine Zelle nur mit p40 zu transfizieren und bezüglich Zellen zu selektieren, die dieses Protein stabilen auf hohem Niveau sezernieren, und dann diese Zelle als Empfänger für die Transfektion durch das das Fusionsprotein exprimierende Konstrukt zu verwenden (d.h. sequenzielle Transfektion). Das letztere Verfahren ist besonders geeignet, wenn das Fusionsprotein ein Antikörpermolekül mit sowohl schwerer als auch leichter Kette ist, das für der korrekten Zusammenbau und die korrekte Sekretion richtig zusammengesetzt sein muss. Theoretisch könnte die Fusion der p35-Untereinheit mit der schweren oder leichten Kette erfolgen, aber bei der bevorzugten Ausführungsform erfolgt sie an den Carboxylterminus der schweren Kette, wo sie mehr Freiheit zur Wechselwirkung mit den IL-12-Rezeptoren auf Zellen hat. Es ist auch möglich, die p35-Untereinheit über ihren Carboxylterminus an den Aminoterminus der schweren oder leichten Kette zu fusionieren. In diesem Fall wird eine Leadersequenz für die p35-Expression benötigt, da es sich am Aminoterminus des Fusionsproteins befindet und somit für den Zusammenbau und die Sekretion aus der Zelle eine Zielsteuerung zum endoplasmatischem Retikulum erfordert.
Das Nucleinsäurekonstrukt kann auch den endogenen Promotor und Enhancer für das Gen, das die variable Region kodiert, umfassen, so dass die Expression der chimären Immunglobulinkette reguliert wird. Zum Beispiel können die Gene, die die variable Region codieren, als DNA-Fragmente erhalten werden, die das Leaderpeptid, das VJ-Gen [funktionell umgelagerte variable (V-) Regionen mit Joining- (J-) Segment] für die leichte Kette oder das VDJ-Gen für die schwere Kette und den endogenen Promotor und Enhancer für diese Gene enthalten. Ersatzweise kann das Gen, das die variable Region kodiert, jenseits von endogenen regulatorischen Elementen erhalten und in einem Expressionsvektor verwendet werden, der diese Elemente bereitstellt.
Gene für variable Regionen können durch Standard-DNA-Klonierungsverfahren aus Zellen, die den gewünschten Antikörper herstellen, erhalten werden. Screening der Genombibliothek bezüglich einer spezifischen, funktionell umgelagerten variablen Region kann unter Verwendung geeigneter DNA-Sonden, wie DNA-Segmenten, die die DNA-Sequenz der J-Region und Sequenzen stromabwärts enthalten, erzielt werden. Die Identifizierung und Bestätigung der korrekten Klone werden dann durch DNA-Sequenzierung der klonierten Gene und Vergleich der Sequenz mit der entsprechenden Sequenz der richtig gespleißten VolllängenmRNA erzielt.
4.1 Gleichzeitige Transfektion
Gleichzeitige Transfektion kann durch Konstruktion eines Vektors mit zwei Transkriptionseinheiten und einem selektierbarem Markergen erzielt werden. Solche Vektoren sind für die Expression rekombinanter Antikörper in Säugerzellen beschrieben. Gillies et al., J. Immunol. Methods 125: 191-202 (1989). Ein alternatives Verfahren besteht aus der Verwendung zweier unabhängiger Plasmidvektoren (einem mit einer Transkriptionseinheit für das Fusionsprotein und einem mit einer Transkriptionseinheit für die p40-Untereinheit) mit ihren eigenen selektierbaren Markergenen und der Selektion bezüglich erfolgreich transfizierter, exprimierender Zellen durch Züchtung in Gegenwart von Arzneistoffen, gegen die die Zellen resistent geworden sind (z.B. Methotrexat in mit dem dhfr-Gen transfizierten Zellen). Eine noch weitere Möglichkeit ist die Verwendung eines Expressionsvektors für das Fusionsprotein an die p35-Untereinheit, der ein selektierbares Markergen enthält, und die Cotransfektion eines zweiten Vektors ohne selektierbares Markergen und mit einer Transkriptionseinheit für die p40-Untereinheit. Jeder arzneistoffresistente Klon, der durch das zuletzt genannte Verfahren erhalten wird, kann das Fusionsprotein in Abwesenheit der p40-Untereinheit nicht sezernieren und würde somit durch einen ELISA-Assay des Kulturüberstandes nicht nachgewiesen. Nur Zellen, die mit beiden Vektoren transfiziert sind, würden das intakte Fusionsprotein-p40-Heterodimer sezernieren.
Es wurde ein Plasmidvektor (pdHL7-14.18-p35) konstruiert, wie in Gillies et al., J. Immunol. Methods 125: 191-202 (1989) beschrieben, der ein selektierbares dhfr-Markergen, eine Transkriptionseinheit, die eine humanisierte 14.18-Anti-GD2-Antikörper-Leichtkette codiert, und eine Transkriptionseinheit enthält, die eine humanisierte Schwerkette, fusioniert mit der p35-Untereinheit des Human-IL-12, codiert. Die Fusion wurde durch Ligation des XmaI-XhoI-Fragments der angepassten p35-Untereinheiten-cDNA, wie im Beispiel 2 beschrieben, an eine ein zelne XmaI-Restriktionsstelle am Ende des CH3-Exons des humanen IgGl-H-Kettengens erreicht. Sowohl die H- als auch die L-Ketten-Transkriptionseinheiten enthalten einen Cytomegalievirus- (CMV-) Promoter (anstelle des Metallothioneinpromoters in der Originalbezugsstelle) am 5'-Ende und eine Polyadenylierungsstelle am 3'-Ende. Ein ähnlicher Vektor (pC-p40) wurde für die Expression der freien p40-Untereinheit konstruiert, enthielt aber kein selektierbares Markergen (dhfr oder anderes), verwendete aber dennoch den CMV-Promoter zur Transkription. Die codierende Region beinhaltete in diesem Fall die natürliche Leadersequenz der p40-Untereinheit für den ordnungsgemäßen Transport zum endoplasmatischen Retikulum und für den Zusammenbau mit dem Fusionsprotein. Eine andere Version dieses Vektors (pNC-p40), die das Neomycin-Resistenzgen beinhaltet, wurde zur Verwendung bei der sequenziellen Transfektion konstruiert.
Für die gleichzeitige Transfektion wurden Plasmid-DNAs (ungefähr 10 μg von jedem Plasmid; pdHL7-14.18-p35 und pC-p40) durch Spaltung mit SalI-Restriktionsenzym linearisiert, unter Verwendung des PCR-Cleanup-Kits (Wizard, Promega) gereinigt und in 5 × 10⁶ Myelomzellen (in 0,5 ml eiskaltem PBS) unter Verwendung einer Einstellung von 0,25 V und 500 μF elektroporiert. Nach einer Erholungszeit von 10 min auf Eis wurden die Zellen in frisches Medium überfihrt und in Platten mit 96 Vertiefungen zu etwa 10⁵ Zellen/ml plattiert. Nach 48 h wurden die Zellen mit Medium gefüttert, das Methotrexat (0,1 μM) enthielt. Frisches Medium wurde durch Austausch der Hälfte des Flüssigkeitsvolumens alle 4 Tage zugefügt, bis Klone erschienen. Die Expression des gewünschten Antikörper-IL-12-Fusionsproteins wurde unter Verwendung eines ELISA, der auf dem Nachweis von Antikörper-Fc basierte, untersucht. Der Fangantikörper reagierte mit humanen H- und L-Ketten, und der Nachweis verwendete einen für humanen Fc spezifischen Antikörper. Positive Klone wurden in Selektionsmedium vermehrt, und das Produkt wurde durch Bindung an und Elution von Protein-A-Sepharose, wie vorstehend beschrieben, gereinigt. Eluierte Proteine wurden durch PAGE analysiert und durch Färbung mit Coomassie Blue nachgewiesen.
4.2 Sequenzielle Transfektion
Für die sequenzielle Transfektion wurde das Plasmid pNC-p40 in Zellen elektroporiert, wie vorstehend beschrieben, und die Zellen wurden ausplattiert und in G418-enthaltendem Medium selektiert. Die Kulturüberstände von arzneistoffresistenten Klonen wurden durch ELISA bezüglich der Produktion der p40-Untereinheit getestet. Der Fangantikörper war ein Maus-Anti-Auman-IL-12-p40 und der Nachweisantikörper war gegen humanes IL-12-p40/p70 gerichtet. Kommerzielle ELISA-Kits sind von mehreren Herstellern für diesen Zweck erhältlich (Pharminogen, San Diego; R&D Systems, MN). Die am meisten produzierenden Zellklone wurden bezüglich der stabilen Expression von p40 getestet. Einer dieser Klone wurde mit pdHL7-14.18-p35-Plasmid-DNA transfiziert, wie vorstehend beschrieben, und die Klone wurden in Methotrexat enthaltendem Medium selektiert. Die Expression des gewünschten Antikörper-IL-12-Fusionsproteins wurde unter Verwendung eines ELISA untersucht, der auf dem Antikörper-Fc-Nachweis basiert. Der Fangantikörper reagierte mit humanen Hund L-Ketten, und der Nachweis verwendete einen für humanen Fc spezifischen Antikörper. Positive Klone wurden in Selektionsrnedium vermehrt, und das Produkt wurde durch Bindung an und Elution von Protein-A-Sepharose, wie vorstehend beschrieben, gereinigt. Eluierte Proteine wurden durch PAGE analysiert und durch Färbung mit Coomassie Blue nachgewiesen.
4.3 Aktivitäten der Antikörper-IL-12-Fusionsproteine
Wie in Tabelle 1 zusammengefasst, wurden Fusionsprotein exprimierende Zellen entweder durch gleichzeitige Transfektion oder sequenzielle Transfektion erhalten, aber produktivere Klone wurden unter Verwendung von sequenzieller Transfektion erhalten. Das von zwei einzelnen Transfektanten sezernierte Produkt wurde bezüglich der Kettenzusammensetzung untersucht. Die SDS-PAGE-Analyse ist in 5A gezeigt. Beide Klone sezernieren eindeutig die gleiche relative Menge von jeder der drei Ketten: leichte Kette, H-Kette-p35 und kovalent gebundenes p40, was den vollständigen und ordnungsgemäßen Zusammenbau dieses 6-Kettenmoleküls zeigt. Das gleiche Verfahren wurde mit einem zweiten Antikörper, KS-1/4, erhalten, der mit dem EpCAM-Antigen reagiert, das auf praktisch allen Epidermiskarzinornzellen (Colon-, Lungen-, Brust-, Prostata-, Pankreas-, Eierstock- und Blasenkarzinom) exprimiert wird. Genau die gleichen Ergebnisse wurden erhalten, einschließlich normaler Bindungsaktivitäten der Antikörper an ihre jeweiligen Antigene.
Die biologischen Aktivitäten der gesamten Antikörper-IL-12-Fusionsproteine sind in 5 gezeigt. Wenn die Fähigkeit untersucht wurde, die Proliferation mitogenaktivierter Human-PBMC zu stimulieren, war das Hu-KS-IL-12-Fusionsprotein mit beiden Human-IL-12-Ketten auf molarer Ebene beinahe so aktiv wie der Human-IL-12-Standard (5B). Das gleiche Konstrukt, das die Maus-p35-Untereinheit, fusioniert an Hu-KS-1/4, enthielt, war zur Stimulation von Human-PBMC deutlich weniger wirksam. Wenn die Fähigkeit untersucht wurde, die Sekretion von IFN-γ aus PHA-aktivierten PBMC zu induzieren, war das Hu-KS-IL-12-Protein mit humanen IL-12-Ketten etwa 6-fach weniger wirksam als der IL-12-Standard, während die Hybridform noch weitere 4-mal weniger wirksam war (5C). Wenn Mauseffektorzellen (die mit Concanavalin A vorstimuliert waren) verwendet wurden, war die Hybridform etwa 50fach weniger wirksam als der Maus-IL-12-Standard. Die ausschließlich humane Form war inaktiv (5D), wie aufgrund der Literatur erwartet. Siehe Schoenhaut et al., J. Immunol. 148: 3433-3340 (1992).
Tabelle 1 Vergleich von Cotransfektion und sequenzieller Transfektion der IL-12-Fusionsprotein-Expression
Beispiel 5 Expression von Einketten-IL-12-Fusionsproteinen
Die vorstehend beschriebenen Verfahren zur Herstellung von dimerem Antikörper und auf Fc basierenden Fusionsproteinen können auch in ihrer einfacheren Form verwendet werden, um Einketten-Fusionsproteine mit IL-12 zu exprimieren (die keine Dirnere bilden). In diesem Fall wird die ein einzelnes Polypeptid codierende Sequenz an die Sequenz für die p35-Untereinheit gebunden und in derselben Zelle wie die freie p40-Untereinheit coexprimiert. Jedes der beiden Verfahren, gleichzeitige oder sequenzielle Transfektion, kann verwendet werden, um heterodimere Einketten-Fusionsproteine zu erzeugen. Der Zweck solcher Fusionsproteine kann entweder die Zielsteuerung von IL-12 an eine Antigen tragende Zelle durch die Fusion eines Einketten-Fv- (sc-Fv-) Antikörpers (Huston und Oppermann, WO 88/09344) oder die Kombination der sehr spezifischen immunstimulatorischen Wirkung von IL-12 zusammen mit einem Proteinantigen als ein Adjuvans sein. Die Verbindung von stimulatorischem Proteinen und Antigen gewährleistet die Co-Lokalisation nach der Injektion in ein Tier. Das Antigen kann jedes Polypeptid sein. Diese können Antikörper in Tieren induzieren, die mit Tumor-, viralen oder anderen Antigenen reagieren können, die therapeutischen Wert besitzen. Zum Beispiel kann sc-Fv, wie oft vorteilhaft, dazu verwendet werden, Immunantworten auf Antikörper-V-Regionen einschließlich des Idiotyps (der spezifischen Antigenbindungsregion) zum Zweck einer Stimulation des Idiotypnetzwerks zu induzieren.
Der für diese Fusionsproteine verwendete Antigentyp kann auch einer sein, der gewöhnlich eine allergische Antwort induziert, wie das Der p I und Der p II von Staubmilben oder Tropomyosin von verschiedenen Schalentierarten, die auf DNA-Ebene an die p35-Untereinheit von IL-12 fusioniert und in derselben Zelle mit der p40-Untereinheit exprimiert werden können. Die Immunisierung mit solchen Fusionsproteinen induziert eine stärkere Th1-Helferzellantwort, die zur Desensibilisierung der krankheitsverursachenden Th2-Antwort bei atopischen Patienten mit Allergie geeignet ist.
Um die Expression eines Einketten-Fusionsproteins zu zeigen, wurde eine scFv-Version des KS-1/4-Antikörpers konstruiert. Das 5'-Ende des proteincodierenden Abschnitts des Fusionsgens (eines XbaI-AflII-Fragments) besteht aus einer Leadersequenz, die von einer Maus-κ-Leichtkette stammt, fusioniert mit der reifen Proteinsequenz der V-Region der KS-1/4-L-Leichtkette. Das Ende der V-Region ist im Leserahmen mit einer DNA fusioniert, die eine einfache Linkersequenz (Gly₄Ser)₃ codiert und von anderen beschrieben ist (Huston und Oppermann, WO 88/09344), im Leserahmen gefolgt von der Sequenz, die die H-Ketten-V-Region von KS-1/4 codiert. Das 3'-Ende dieses scFv enthält eine XmaI-Restriktionsstelle, die mit der Ligation an das 5'-Ende der Human- und Mausversionen (XmaI-XhoI-Fragmente) der p35-Untereinheit des IL-12 kompatibel ist. Die endgültigen XbaI-XhoI-Fragmente wurden in die entsprechenden Stellen des gleichen Expressionsvektors (pdC) eingesetzt, der zur Expression des freien IL-12-Untereinheiten verwendet wurde, wobei die Vektoren pdC-SCA-hu-p35 und pdC-SCA-mu-p35 erhalten wurden.
Diese Vektoren wurden in eine Human-p40 exprimierende Zelllinie eingebracht und in Medium, das Methotrexat (0,1 μM) enthielt, gezüchtet. Fusionsproteine exprimierende, arzneistoffresistente Klone wurden durch ELISA-Assays identifiziert, die für die Spezies von p35 spezifisch sind, die in dem Konstrukt verwendet wurden (d.h. ein IL-12-Human-p40-Antikörper wurde für das Einfangen des Antigens und spezifische Anti-Maus- oder -Human-p35-Antikörper wurden für den Nachweis verwendet). Kulturmedien von jedem Typ des Einketten-Fusionsproteins wurden zur Bestimmung ihrer Mengen verwendet, so dass relative spezifische Aktivitäten berechnet werden konnten. Serielle Verdünnungen jeder Probe wurden bezüglich der Fähigkeit getestet, die IFN-γ-Sekretion zu induzieren, wie vorstehend im Beispiel 2 eingehend beschrieben. Die Ergebnisse sind in 6 gezeigt, die die Aktivität von Einketten-IL-12-Fusionsproteinen, die entweder mit beiden humanen Untereinheiten oder mit Maus-p35 und Human-p40 hergestellt wurden, sowie die Artspezifität der Fusionsproteine vergleicht. Die Daten zeigen, dass das Human-IL-12-Einketten-Fusionsprotein in ihrer Fähigkeit zur Induktion von IFN-γ genauso wirksam ist wie die gesamten Antikörperfusionen, es aber nicht so stark wie der Human-IL-12-Standard ist, wenn Human-PBMC verwendet wurden (6A). Die Maus/Human-Hybridform war etwa 50fach weniger stark als die Maus-IL-12-Kontrolle, wie mit dem gesamten Antikörperkonstrukt gesehen wurde (6B). 6C zeigt einen Antigen-Bindungstest des Einketten-IL-12-Proteins. Platten wurden mit dem KS-Antigen beschichtet, das durch den KS-1/4-Antikörper erkannt wird, und dazu verwendet, jeglichen reaktiven Antikörper oder jegliches Antikörperfusionsprotein einzufangen. Nach mehrmaligem Waschen wurde das gebundene Fusionsprotein unter Verwendung eines Anti-Human-IL-12- p40-Antikörpers nachgewiesen. Die Daten zeigen, dass die Einzketten-Fusionsproteine an die antigenbeschichtete Platte gebunden wurden und mit einem Antikörper-IL-12 nachgewiesen werden konnten, womit demonstriert wurde, dass die fusionierten Moleküle Antigenbindungsaktivität beibehalten. Die Intensität der Bindung war etwa 3-fach niedriger als diejenige, die mit dem gesamten KS-1/4-Antikörper beobachtet wird, aber dies ist aufgrund der Monovalenz des Einkettenkonstrukts nicht unerwartet.
Die Aktivitätsergebnisse mit sowohl dem gesamten Antikörper als auch den Einketten-IL-12-Fusionsproteinen deuten darauf hin, dass der Aminoterminus der p35-Kette zur Bindung des Rezeptors wichtig sein könnte, weil Fusionen die Aktivität zu verringern scheinen. Dennoch sind die Antikörper-IL-12-Moleküle in Konzentrationen über 1 ng/ml noch sehr starke Induktoren von IFN-γ. Es wird erwartet, dass die Konzentration solcher Moleküle in behandelten Tieren sowohl im Kreislauf, als auch am angesteuerten Wirkort um mehrere Größenordnungen höher als diese ist.
Ein möglicher Weg zur Erhöhung der spezifischen Aktivität von Antikörper-IL-12-Fusionsproteinen wäre, einen flexiblen Peptidlinker zwischen die Antikörper- und p35-Sequenzen einzufügen, so dass sich für die aminoterminalen Sequenzen dieser Untereinheit mehr Freiheit ergibt. Eine Sequenz, wie der vorstehend beschriebene (Gly₄Ser)₃-Linker, könnte auf diese Weise verwendet werden. Ein mögliches Problem bei diesem Ansatz ist, dass solch ein Linker immunogen sein könnte, insbesondere wenn er mit einem starken Immunstimulator, wie IL-12, fusioniert ist.
Beispiel 6 Pharmakokinetische Eigenschaften von IL-12-Fusionsproteinen
Die Antikörper-IL-12-Fusionsproteine wurden bezüglich ihres pharmakokinetischen Verhaltens nach intravenöser Injektion in Balb/c-Mäuse untersucht. Das Blut wurden von Mäusen durch retroorbitale Blutung gesammelt und bei 4 °C in Eppendorf-Mikrozentrifugationsröhrchen aufbewahrt. ELISA-Verfahren wurden dazu verwendet, die Menge an humanem Antikörper sowie die Menge an intaktem IL-12-Fusionsprotein, die im Blut an steigenden Zeitpunkten verblieb, zu messen.
Das erste ELISA, der humanen Antikörper misst, verwendet einen Antikörper gegen humane H- und L-Ketten zum Einfangen und einen Anti-Human-Fc-Antikörper zum Nachweis. Der fusionsproteinspezifische Assay verwendet den gleichen ersten Fangschritt, aber einen Anti-p40-Untereinheit-Antikörper zum Nachweis. Wie in 7 gezeigt, hatten sowohl der Antikörper als auch das IL-12-Fusionsprotein eine verlängerte Halbwertzeiten, aber die Halbwertzeit des Fusionsproteins war etwas kürzer. Dies deutet darauf hin, dass das zirkulierende Fusionsprotein mit der Zeit gespalten wird und IL-12 freisetzt, während der Antikörper im Kreislauf verbleibt. Früher beschriebene Experimente mit anderen Antikörper-Cytokin-Fusionsproteinen zeigen, dass Cytokine durch Proteasespaltung freigesetzt werden können. Siehe Gillies et al. Bioconj. Chem. 4: 230-235 (1993). Dennoch sind die Halbwertzeiten der Fusionsproteine wesentlich länger als der 3 h-Wert, der für natives IL-12 angegeben wird. Tatsächlich ist die Serumkonzentration nach 72 h immer noch viel höher als das Niveau, das zur Induktion der IFN-γ Sekretion erforderlich ist. Trincieri, Blood 84: 4008-4027 (1992).
Beispiel 7 Behandlung eines etablierten Kolonkarzinoms mit Antikörper-IL-12-Fusionsprotein
Das Kolonkarzinom CT26 der Maus ist besonders unempfindlich gegen eine Behandlung mittels systemischer Verabreichung von Maus-IL-12 in nichttoxischen Dosen. Martinotti et al., Eur. J. Immunol 25: 137-146 (1995). Ein wenig Wirksamkeit wurde festgestellt, wenn die systemische Verabreichung von IL-12 zusammen mit wiederholter Impfung bestrahlter CT26-Zellen kombiniert wurde, die so verändert waren, dass sie IL-2 sezernierten. Vagliani et al., Cancer Res. 56. 467-470 (1996). Ein alternatives Verfahren zur erfolgreichen Therapie umfasst die Veränderung von CT26, so dass niedrige Niveaus von IL-12 freigesetzt werden. Dies war unwirksam, wenn die Mäuse nicht zuerst mit Antikörpern zur Verarmung von CD4⁺-Zellen behandelt wurden, Martinotti et al., Eur. J. Immunol 25: 137-146 (1995), was wahrscheinlich auf eine immunsuppressive Wirkung dieser Zellen, nachdem sie den veränderten Tumoren in vivo ausgesetzt waren, zurückzuführen ist. Noch ein anderes Verfahren zur Veränderung erheblich stärkerer IL-12-Sekretoren war weit erfolgreicher, was somit zeigt, dass die Menge an lokalem IL-12 für die Etablierung einer Immunantwort auf subkutane Tumoren entscheidend war, Columbo et al. Cancer Res. 56: 2531-2534 (1996). In diesem Fall wurde jedoch keine Behandlung etablierter, streuender Tumoren demonstriert, die den im klinischem Rahmen beobachteten ähneln. Der Zweck des vorliegenden Experiments war eine Abschätzung der Wirksamkeit von Antikörper-IL-12-Fusionsproteinen zur Behandlung des Kolonkarzinoms CT26 der Maus.
CT26-Zellen wurden mit einer cDNA transfiziert, die das Antigen codiert, das durch den KS-1/4-Antikörper erkannt wird und entweder als KS-Antigen (KSA) oder epitheliales Zelladhäsionsmolekül (EpCAM) bezeichnet wird. Klone, die dieses Protein auf ihrer Oberfläche exprimierten, wurden durch Immunfärbung mit KS-1/4 und fluoreszenzaktivierte Zellsorter- (FACS-) Analyse identifiziert. Zellen von einem Klon, der KSA stabil exprimiert, (Klon 21.6) wurden in die Schwanzvene von Balb/c-Mäusen injiziert (1 × 10⁵ pro Maus). Unbehandelte Mäuse bildeten umfangreiche Lungenmetastasen am Tag 28 und starben innerhalb von 40 Tagen nach der Beimpfung. Die Wachstumsrate war praktisch die gleiche wie bei den Mutterzellen, was zeigte, dass die Expression des Human-KSA keine Wirkung auf die Immunogenizität von CT26 oder die Fähigkeit zur Bildung von Tumoren hatte.
Die Wirksamkeit des Antikörper-IL-12-Fusionsproteins zur Therapie von CT26-Metastasen wurde in diesem Mausmodell unter Verwendung der Human/Maus-Hybridform getestet, die Wirksamkeit auf Mauszellen besitzt. Nach Tumorzellinjektion erhielten die Mäuse entweder Injektionen von PBS (Nichtbehandlungskontrolle), KS-1/4-IL-2-Fusionsprotein (positive Kontrolle), KS-1/4-Antikörper mit freiem IL-2 (negative Kontrolle) oder KS-1/4-IL-12-Fusionsprotein (Testprobe). Die Behandlung begann am Tag 4, einem Zeitpunkt, zu dem etablierte Metastasen leicht durch histologische Färbung in den Lungen der Tiere nachweisbar sind, und setzte sich täglich für 5 Tage fort. Am Tag 28 nach der Tumorzellbeimpfung wurden die Tiere getötet und ihre Lungen bezüglich der Anwesenheit von Tumor untersucht. Die Gewichte der Lungen wurden ebenfalls gemessen, um die Menge an Tumormasse bezogen auf tumorfreie Mäuse zu bestimmen. Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 zusammengefasst. Unbehandelte Tiere hatten eine umfangreiche metastatische Erkrankung, die durch beinahe vollständige Oberflächenbedeckung des Organs mit Tumor durch Fusion einzelner metastatischer Knoten charakterisiert war. Die Gewichte der Lungen stiegen durchschnittlich um das Dreifache an, was zeigt, dass die Tumormassen tatsächlich den Großteil des Organs ausmachten. Behandelte Tiere hatten geringe, wenn überhaupt, Anzeichen von Metastasen, wobei einige Tiere vollständig tumorfrei waren. Keines der Tiere wies irgendein offenkundiges Zeichen von Toxizität während des Behandlungsverfahrens auf. So kann, im Gegensatz zur Behandlung mit systemischem IL-12, die Therapie mit Antikörper-IL-12-Fusionsprotein ein etabliertes metastasierendes CT26-Kolonkarzinom bekämpfen.
Tabelle 2 Behandlung von Lungenmetastasen des Kolonkarzinoms der Maus bei SCID-Mäusen mit Antikörper-IL-12-Fusionsproteinen
Experimentelle Lungenmetastasen wurden durch intravenöse Injektion von 10⁵ CT26-KSA-Zellen induziert. Die Behandlung begann drei Tage später mit intravenöser Injektion von 10 μg des humanisierten KS-1/4-Antikörpers oder des angegebenen Fusionsproteins für fünf aufeinander folgende Tage. Die Tiere wurde getötet, und die Metastasenbewertung wurde durch das Ausmaß der Oberflächenbedeckung ermittelt: 0 = keine sichtbaren Metastasenfoci; 1 = weniger als 5 % der Oberfläche bedeckt; 2 = 5 bis 50 % der Oberfläche bedeckt; und 3 = mehr als 50 % der Lungenoberfläche ist mit Metastasenfoci bedeckt.
Beispiel 8 IL-12-Fusionsproteine als Impfstoffe
Das humanisierte KS-1/4-Antikörper-IL-12-Fusionsprotein in PBS-Puffer, das mit der Maus-p35-Untereinheit hergestellt wurde (HuKS-1/4-mIL-12), wurde in Balb/c-Mäuse intravenös injiziert (5 μg/Tag × 5). Kontrollmäuse erhielten den gleichen Antikörper in den gleichen Mengen, aber ohne gebundenes IL-12. Die Injektionslösung enthielt ferner keinerlei An von Adjuvans. Am Tag 10 wurden Blutproben durch retroorbitale Blutung in Mikrozentrifugenröhrchen gesammelt, und das Plasma wurde durch Sammeln der Blutproben in Plastikröhrchen herge stellt, die Natriumcitrat enthielten, gefolgt von Zentrifugation bei höchster Geschwindigkeit in einer Eppendorf-Tischmikrozentrifuge. ELISA-Platten (96 Vertiefungen) wurden mit Hu-KS-1/4-Protein beschichtet, das die humane konstante Region enthält, und zum Einfangen aller Mausantikörper, die als Antwort auf die Immunisierung hergestellt wurden, verwendet. Nach Abwaschen von ungebundenem Material wurden die gebundenen Mausantikörper mit an Meerrettichperoxidase gekoppelten Ziege-Anti-Maus-Fc-Antikörper (Jackson Immuno-Research) nachgewiesen. Alle gebundenen Antikörper konnten entweder zu den humanen konstanten Regionen oder der variablen Region gerichtet werden, die Hu-KS-1/4 und den Fusionsproteinen gemeinsam sind.
Wie in 8 gezeigt, gab es geringfügige oder keine Reaktivität mit Hu-KS-1/4 ohne fusioniertes IL-12. Das Fusionsprotein induzierte andererseits eine starke Antikörperantwort in Abwesenheit exogener Adjuvantien und ungeachtet der Tatsache, dass der intravenöse Verabreichungsweg zur Induktion solcher Antworten verglichen mit subkutaner oder intraperitonealer Verabreichung höchst ungünstig ist. Antikörper des IgG2a-Isotyps, die für durch IL-12 verstärkte Antworten typisch sind, wurden in der Gruppe, der Antikörper-IL-12 injiziert wurde, aber nicht in der Gruppe beobachtet, der Hu-KS-1/4-Antikörper injiziert wurde.
Die Immunogenität von auf verschiedenen Wegen verabreichten I1-12-Fusionsproteinen wird durch Injizieren einer Lösung des Fusionsproteins (wie des vorstehend beschriebenen) in PBS oder anderem biologisch verträglichen Puffer oder einem bekannten Adjuvans, wie unvollständigem oder vollständigem Freundschen Adjuvans, getestet. Zum Beispiel können einzelne oder mehrere subkutane, intradermale oder intraperitoneale Injektionen alle zwei Wochen gegeben werden. Alternativ kann das Fusionsprotein zuerst durch subkutane Injektion und anschließend durch intraperitoneale Injektion verabreicht werden. Freundsches Adjuvans kann aufgrund von Reizungen an der Injektionsstelle nicht bei Menschen verwendet werden. Alternative Adjuvantien, wie Niederschläge von Aluminiumhydroxid (Alum), sind für die Verwendung bei Menschen zugelassen und können erfindungsgemäß verwendet werden. Neue organisch-chemische Adjuvantien, die auf Squalenen oder Lipiden beruhen, können ebenfalls für Injektionen in die Haut verwendet werden.
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Heterodimeres Fusionsprotein, das Bindungsspezifität für ein vorbestimmtes Antigen und die biologische Aktivität eines Cytokins zeigt, umfassend eine erste und eine zweite chimäre Kette, die durch eine Disulfidbindung fusioniert sind, wobei jede chimäre Kette einen Ig-Schwerketten-Abschnitt und eine erste oder zweite Untereinheit eines heterodimeren Cytokins umfasst, wobei jeder Ig-Schwerketten-Abschnitt jeder chimären Kette durch seinen Carboxylterminus an den Aminoterminus der ersten oder zweiten Untereinheit des heterodimeren Cytokins gebunden ist und die Untereinheiten verschieden sind.
Heterodimeres Fusionsprotein nach Anspruch 1, wobei der Ig-Schwerketten-Abschnitt jeder Kette ein Fc-Abschnitt ist.
Heterodimeres Fusionsprotein nach Anspruch 1, das eine variable Region besitzt, die für ein Epitop auf einer Zielzelle spezifisch ist.
Fusionsprotein nach Anspruch 3, wobei der Ig-Schwerketten-Abschnitt ferner eine CH1-Domäne umfasst.
Fusionsprotein nach Anspruch 4, wobei der Ig-Schwerketten-Abschnitt ferner eine CH2-Domäne umfasst.
Fusionsprotein nach Anspruch 5, wobei der Ig-Schwerketten-Abschnitt ferner eine CH3-Domäne umfasst.
Fusionsprotein nach Anspruch 3, wobei der Abschnitt einer schweren Ig-Kette ferner eine CH1-, eine CH2- und eine CH3-Domäne umfasst.
Fusionsprotein nach einem der Ansprüche 1 – 7, wobei jede chimäre schwere Ig-Kette mit einer leichten Ig-Kette unter Bildung einer funktionellen Antigen-Bindungsstelle kombiniert ist.
Fusionsprotein nach einem der Ansprüche 1 bis 8, wobei das heterodimere Cytokin IL-12 ist.
Fusionsprotein nach Anspruch 8, wobei die schweren Ig-Ketten und die leichten Ig-Ketten vom Antikörper KS stammen und das heterodimere Cytokin IL-12 ist.
Heterodimeres Fusionsprotein, umfassend eine erste und eine zweite chimäre Kette, die durch eine Disulfidbindung fusioniert sind, wobei jede chimäre Kette ein Protein mit antigenen Eigenschaften und eine erste oder zweite Untereinheit eines heterodimeren Cytokins umfasst, wobei die Untereinheiten verschieden sind.
Heterodimeres Fusionsprotein nach Anspruch 11, wobei das Protein mit antigenen Eigenschaften durch seinen Carboxylterminus an den Aminoterminus der Untereinheit des heterodimeren Cytokins gebunden ist.
Verfahren zur Herstellung eines heterodimeren Cytokins nach einem der Ansprüche 1 bis 7 und 11 bis 12, umfassend die Schritte: (a) Binden einer ersten Untereinheit des heterodimeren Cytokins durch eine Peptidbindung des Aminoterminus der Untereinheit an den Carboxylterminus eines Abschnitts einer ersten schweren Ig-Kette oder eines Proteins mit antigenen Eigenschaften, wodurch eine erste chimäre Kette hergestellt wird; (b) Binden einer zweiten Untereinheit des heterodimeren Cytokins durch eine Peptidbindung des Aminoterminus der Untereinheit an den Carboxylterminus eines Abschnitts einer zweiten schweren Ig-Kette oder eines Proteins mit antigenen Eigenschaften, wodurch eine zweite chimäre Kette hergestellt wird; und (c) Verbinden der ersten und der zweiten chimären Kette durch eine Disulfidbindung, wodurch ein heterodimeres Fusionsprotein hergestellt wird.
Dimeres Fusionsprotein, das Bindungsspezifität für ein vorbestimmtes Antigen und die biologische Aktivität eines Cytokins zeigt, umfassend eine erste und eine zweite chimäre Kette, die durch eine Disulfidbindung verbunden sind, wobei jede chimäre Kette einen Ig-Schwerketten-Abschnitt und die p35-Untereinheit und die p40-Untereinheit von IL-12 umfasst, wobei jeder Ig-Schwerketten-Abschnitt jeder chimären Kette durch seinen Carboxylterminus an den Aminoterminus der p35-Untereinheit gebunden ist und die p35-Untereinheit durch eine Disulfidbindung an die p40-Untereinheit gebunden ist.
Fusionsprotein nach Anspruch 14, wobei der Ig-Schwerketten-Abschnitt jeder Kette ein Fc-Abschnitt ist.
Fusionsprotein nach Anspruch 14, das variable Regionen besitzt, die für ein Epitop auf einer Zielzelle spezifisch sind.
Fusionsprotein nach Anspruch 16, wobei jeder Ig-Schwerketten-Abschnitt jedes chimären IL-12-Fusionsmoleküls ferner eine CH1-, eine CH2- und eine CH3-Domäne umfasst.
Fusionsprotein nach Anspruch 17, wobei jede chimäre schwere Ig-Kette mit einer leichten Ig-Kette unter Bildung einer funktionellen Antigen-Bindungsstelle kombiniert ist.
Fusionsprotein nach Anspruch 18, wobei die schweren Ig-Ketten und die leichten Ig-Ketten vom Antikörper KS stammen.
Verfahren zur Herstellung eines dimeren IL-12-Fusionsproteins nach einem der Ansprüche 14 – 19, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfasst: (i) Binden der p35-Untereinheit von IL-12 durch eine Peptidbindung über ihren Aminoterminus an den Carboxylterminus des Ig-Schwerketten-Abschnitts, wodurch eine erste chimäre Kette hergestellt wird und wobei die p35-Untereinheit durch eine Disulfidbindung mit der p40-Untereinheit verbunden ist; (ii) Binden der p35-Untereinheit von IL-12 durch eine Peptidbindung über ihren Aminoterminus an den Carboxylterminus des Ig-Schwerketten-Abschnitts, wodurch eine zweite chimäre Kette hergestellt wird und wobei die p35-Untereinheit durch eine Disulfidbindung mit der p40-Untereinheit verbunden ist; und (iii) Verbinden der ersten und der zweiten chimären Kette durch eine Disulfidbindung, wodurch ein dimeres Fusionsprotein hergestellt wird.
Fusionsprotein nach einem der Ansprüche 1 bis 12 oder 14 – 19 als Medikament.
Verwendung des Fusionsproteins nach einem der Ansprüche 1 bis 12 oder 14 – 19 zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von Krebs.
Nucleotidsequenz, die ein Fusionsprotein nach einem der Ansprüche 1 bis 12 oder 14 – 19 codiert.
Expressionsvektor, umfassend eine Nucleotidsequenz nach Anspruch 23.
Wirtszelle, die mit einer Nucleotidsequenz nach Anspruch 23 oder einem Expressionsvektor nach Anspruch 24 transformiert oder transfiziert ist.