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Gebiet der Erfindung
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Die
vorliegende Erfindung betrifft allgemein Fusionsproteine. Genauer
gesagt, betrifft die vorliegende Erfindung heterodimere Fusionsproteine,
die für
die zielgerichtete Immuntherapie und allgemeine Immunstimulation
verwendbar sind.
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Hintergrund der Erfindung
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Einer
der Schlüsselimmunregulatoren
ist die T-Helferzelle, die mit Antigenen reagiert, die an HLA-Klasse-II-Molekülen präsentiert
werden. Diese CD4+-Zelle differenziert sich
als Antwort auf die Stimulation durch Antigen und wird je nach den
Cytokinen, die sie sezerniert, zu einer Typ 1- oder Typ 2-Helferzelle (Th1
oder Th2). Mosmann und Coffman, Ann. Rev. Immunol. 7:145-173 (1989).
Eine Th1-Antwort
führt zur
Sekretion von Interleukin-2 (IL-2) und Interferon-γ (IFN-γ), die eine
zellvermittelte Immunreaktionen gegen intrazelluläre Pathogene
stimuliert. Eine Th2-Antwort führt
zur Sekretion von IL-4, IL-5 und IL-10, die Antikörperantworten
auf extrazelluläre
Pathogene stimuliert. Die interessanteste Komponente dieses Regulationssystems ist,
dass die eine Antwort die andere durch die negativen regulatorischen
Aktivitäten
der gebildeten Cytokine hemmt. So können IL-4 und IL-10 die Th1-Antworten
herunterregulieren, während
IFN-γ die
Th2-Antworten herunterregulieren kann.
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Die
regulatorische Aktivität
von T-Helferzellen und ihre Differenzierung, nachdem sie einem Antigen ausgesetzt
waren, wird ebenfalls durch Cytokine reguliert. IL-12, ein disulfidverknüpftes, heterodimeres
Cytokin mit einer 40 kDa-Untereinheit und einer 35 kDa-Untereinheit, übt einen
starken positiven regulatorischen Einfluss auf die Entwicklung von
Th1-Helfer-T-Zellantworten aus. Siehe Review von Trinchieri, Blood
84: 4008-4027 (1994). IL-12 hat auch einen starken synergistischen
Effekt auf die Induktion von IFN-γ sowohl
aus T-Helferzellen als auch natürlichen
Killer- (NK-) Zellen (Eur. Patentanmeldg. 90123670.3). Sezerniertes
IFN-γ hemmt
dann jede Th2-Zellproliferation und polarisiert die Antwort in Richtung
einer bevorzugt zellvermittelten Immunität.
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Ein
Weg zum Verändern
des Ergebnisse einer Immunantwort wäre es, das geeignete Cytokin
zum Zeitpunkt der Antigenstimulation zu verabreichen. Wenn IL-4 das
während
der Antigenstirnulation hauptsächlich
vorliegende Cytokin ist, wird die Th2-Antwort verstärkt und
die Th1-Antwort gehemmt. Wenn im Gegensatz dazu IL-12 das während der
Antigenstimulation hauptsächlich
vorliegende Cytokin ist, wird die Th1-Antwort verstärkt und
die Th2-Antwort gehemmt. Jedoch ist die systemische Verabreichung
von Cytokinen auf Grund ihrer sehr kurzen Zirkulationshalbwertzeiten
und ihrer schädlichen
Nebenwirkungen schwierig.
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Ein
besserer Ansatz ist, die Wirkung des Cytokins auf ein Zelloberflächenantigen
zu richten, indem man es mit einem Antikörper (oder einem davon abgeleiteten
Fragment) mit Spezifität
und Affinität
für dieses Antigen
fusioniert. Siehe Gillies et al., Proc. Natl. Acad. Sci 89: 1428-1432
(1992); U.S.-Patent Nr. 5,650,150, dessen Offenbarung hierin durch
Bezugnahme aufgenommen ist. Alternativ kann das stimulatorische
Cytokin an ein Proteinantigen mittels einer Peptidbindung in Form
eines Fusionsproteins gebunden werden. Siehe Hazama et al., Vaccine
11: 629-636 (1993). Jedoch erschwert die komplexe Struktur von IL-12
die Expression als Fusionsprotein, weil im Endprodukt genau das
gleiche molare Verhältnis
jeder Untereinheit exprimiert werden muss. Tatsächlich wird IL-12 selbst natürlicherweise
als Mischung von p40-Homodimer exprimiert und sezerniert. D'Andrea et al., J.
Exp. Med., 176: 1387-1398 (1992).
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WO
96/1842 offenbart dimere Fc-Moleküle, die über ihre Aminotermini an die
Carboxyltermini von Cytokinen, wie IL-10, gebunden sind. Ein spezifisches
IL-12-Fusionsprotein
ist nicht eindeutig erwähnt.
Mark et al. (J. Biol. Chem. 1992, 267, 36, S. 26166-26171) lehrt
ein Fusionsprotein, das eine konstante Region einer IgG-Schwerkette, über ihren
Aminoterminus an die Beta-Einheit von HGFr gebunden, umfasst, wobei
die Beta-Einheit an die Alpha-Einheit eines Heterodimers gebunden
ist.
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Kim
et al. (J. Immunol. 1997, 158, S. 4137-4144) offenbart ein Ovalbumin-IL-12-Fusionsprotein, wobei die
p40-Untereinheit von IL-12 an das Protein und die p35-Untereinheit an die
p40-Untereinheit gebunden ist. Keines dieser Dokumente lehrt die
Herstellung von Fusionsproteinen, vorzugsweise von Ig-Schwerkettenfusionsproteinen,
die Untereinheiten eines Cytokins umfassen, wobei die Untereinheiten
in einem äquimolaren Verhältnis exprimiert
werden.
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Daher
besteht im Stand der Technik ein Bedarf an Verfahren zur Herstellung
von Fusionsproteinen mit heterodimeren Cytokinen und einem Antikörper oder
einem Antigen, das die natürliche
heterodimere Struktur des Cytokins aufrechterhält und die Moleküle in äquimolaren
Verhältnissen
der Untereinheiten sezerniert.
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Zusammenfassung der Erfindung
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Die
vorliegende Erfindung stellt heterodimere Fusionsproteine, die sich
für die
gezielte Immuntherapie und die allgemeine Immunstimulation eignen,
und Verfahren zur Herstellung dieser heterodimeren Fusionsproteine
bereit. Insbesondere stellt die vorliegende Erfindung Verfahren
zur Herstellung von Fusionsproteinen mit IL-12 bereit, die seine
natürliche
heterodimere Struktur aufrechterhalten und die Sekretion mit äquimolaren Verhältnissen
der IL-12-Untereinheiten bereitstellen.
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Unter
einem Aspekt der Erfindung umfasst das Fusionsprotein zwei chimäre Ketten,
die durch eine Disulfidbrücke
miteinander verbunden sind. Jede chimäre Kette umfasst eine unterschiedliche
Untereinheit des heterodimeren Cytokins, das durch eine Peptidbindung
an einen Abschnitt einer schweren Ig-Kette gebunden ist.
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Bei
einer alternativen bevorzugten Ausführungsform umfasst das Fusionsprotein
eine erste chimäre Kette,
die eine der Untereinheiten des heterodimeren Cytokins umfasst,
die durch eine Peptidbindung an einen Abschnitt einer Ig-Schwerkette
gebunden ist. Diese Untereinheit ist durch eine Disulfidbindung
an die andere Untereinheit des heterodimeren Cytokins gebunden.
Diese erste chimäre
Kette ist durch eine Disulfidbrücke an
eine zweite chimäre
Kette gebunden, die eine der Untereinheiten des heterodimeren Cytokins
umfasst, die durch eine Peptidbindung an einen Abschnitt einer Ig-Schwerkette
und durch eine Disulfidbindung an die andere Untereinheit des heterodimeren
Cytokins gebunden ist.
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Bei
einer bevorzugten Ausführungsform
dieser Alternative ist die Cytokinuntereinheit, die an die Ig-Schwerkette
jeder chimären
Kette gebunden ist, die p35-Unter einheit von IL-12, und die andere,
an p35 gebundene Untereinheit ist die p40-Untereinheit von IL-12.
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Erfindungsgemäße Fusionsproteine
können
aufgrund zweier Aspekte ihrer Struktur als chimär betrachtet werden. Erstens
ist das Fusionsprotein dahingehend chimär, dass es eine Immunglobulinkette
(in der Regel, aber nicht ausschließlich eine Schwerkette) von
geeigneter Antigen-Bindungsspezifität, gebunden an ein gegebenes
heterodimeres Cytokin, umfasst. Zweitens kann ein erfindungsgemäßes Immunkonjugat
in dem Sinn chimär
sein, dass es eine variable Region und eine konstante Region umfasst,
die die gewöhnlich mit
der variablen Region verbundene konstante Region oder eine unterschiedliche
und folglich eine V/C-Chimäre sein
kann; z. B. variable und konstante Regionen verschiedener Spezies.
Ebenso umfasst der Begriff „Fusionsprotein" Konstrukte mit einer
Bindungsdomäne,
die Gerüstregionen
und variable Regionen (d.h. komplementaritätsbestimmende Regionen) verschiedener
Spezies umfasst, wie von Winter, et al., GB 2,188,638 offenbart.
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Das
erfindungsgemäße heterodimere
Cytokin-Antikörper-Fusionsprotein
zeigt bevorzugt Artigenbindungsspezifität. In einer bevorzugten Ausführungsform
umfasst das heterodimere Cytokin-Antikörper-Fusionsprotein eine schwere
Kette. Die schwere Kette kann CH1-, CH2-, und/oder CH3-Domänen umfassen.
Bei einer alternativen bevorzugten Ausführungsform umfasst das heterodimere
Cytokin-Antikörper-Fusionsprotein
eine leichte Kette. Die Erfindung stellt somit Fusionsproteine bereit,
bei denen die Antigenbindungsspezifität und Aktivität eines
Antikörpers
mit der starken biologischen Aktivität eines heterodimeren Cytokins
kombiniert sind. Ein erfindungsgemäßes Fusionsprotein kann verwendet
werden, ein heterodimeres Cytokin in vivo selektiv an eine Zielzelle
heranzuführen,
so dass das heterodimere Cytokin eine lokalisierte biologische Wirkung
ausüben kann.
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Vorzugsweise
zeigt das erfindungsgemäße Fusionsprotein
die biologische Aktivität
eines Cytokins. Das bevorzugte heterodimere Cytokin des Fusionsproteins
ist IL-12. Fusionen mit Antikörpern,
die Antigene binden können,
eignen sich zur Co- Lokalisation
der immunstimulatorischen Aktivität von IL-12 entweder an Zielzellen
oder an Zielproteinantigenen.
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Außerdem hat
das erfindungsgemäße Fusionsprotein
vorzugsweise eine längere
Zirkulationshalbwertszeit als ein ungebundenes heterodimeres Cytokin.
Fusionen mit dem Fc-Anteil von Antikörpern und IL-12 eignen sich
zur Veränderung
der Pharmakologie und biologischen Verteilung des Moleküls durch
Erhöhen
seiner Zirkulationshalbwertszeit und seiner Affinität für Fc-Rezeptor-tragende
Zellen, z.B. antigenpräsentierende Zellen.
Veränderungen
in der biologischen Verteilung können
auch seine systemische Toxizität ändern, indem sich
der Mechanismus verändert,
durch den es aus dem Kreislauf entfernt wird.
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Unter
einem anderen Aspekt der Erfindung umfasst das Fusionsprotein ein
heterodimeres Cytokin, das an ein Protein mit antigenen Eigenschaften
gebunden ist. Dieses erfindungsgemäße Fusionsprotein zeigt die
biologische Aktivität
eines Cytokins und antigene Aktivität. Außerdem hat dieses erfindungsgemäße Fusionsprotein
bevorzugt eine längere
Zirkulationshalbwertszeit als ein ungebundenes heterodimeres Cytokin. Das
bevorzugte heterodimere Cytokin dieses Fusionsproteins ist IL-12.
Das Fusionsprotein umfasst zwei chimäre Ketten, die durch eine Disulfidbindung
verbunden sind. Jede chimäre
Kette umfasst eine unterschiedliche Untereinheit des heterodimeren
Cytokins, die jeweils durch eine Peptidbindung an das Protein mit
antigenen Eigenschaften gebunden sind.
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Die
Erfindung umfasst auch DNA-Konstrukte, die die vorstehend beschriebenen
Fusionsproteine codieren, und Zelllinien, z. B. Myelome, die mit
diesen Konstrukten transfiziert sind.
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Die
Erfindung umfasst auch ein Verfahren ein zur Herstellung eines Fusionsproteins,
wie vorstehend, nachstehend und in den Ansprüchen spezifiziert. Das Verfahren
umfasst (1) die Bindung der ersten der zwei Untereinheiten eines
heterodimeren Cytokins durch eine Peptidbindung an eine Ig-Schwerkette
oder an ein Protein mit antigenen Eigenschaften, wodurch eine erste
chimäre
Kette gebildet wird; (2) die Bindung der zweiten der zwei Untereinheiten
des heterodimeren Cytokins durch eine Peptidbindung an eine Ig-Schwerkette oder
an ein Protein mit antigenen Eigenschaften, wodurch eine zweite
chimäre
Kette gebildet wird; und (3) die Verbindung der ersten und der zweiten
chimären
Kette durch eine Disulfidbindung, wodurch das Fusionsprotein gebildet
wird. Das erhaltene Fusionsprotein kann Bindungsspezifität für ein vorbestimmtes
Antigen und die biologische Aktivität eines Cytokins aufweisen.
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Die
Erfindung umfasst auch ein Verfahren zur Herstellung eines bevorzugten
dimeren IL-12-Fusionsproteins, wie vorstehend, nachstehend und in
den Ansprüchen
spezifiziert. Das Verfahren umfasst die folgenden Schritte: (i)
das Binden der p35-Untereinheit von IL-12 durch eine Peptidbindung über ihren
Aminoterminus an den Carboxylterminus des Ig-Schwerketten-Abschnitts,
wodurch eine erste chimäre
Kette gebildet wird, wobei die p35-Untereinheit an die p40-Untereinheit
durch eine Disulfidbindung gebunden ist, (ii) das Binden der p35-Untereinheit
von IL-12 durch eine Peptidbindung über ihren Aminoterminus an
den Carboxylterminus des Ig-Schwerketten-Abschnitts, wodurch eine
zweite chimäre
Kette gebildet wird, wobei die p35-Untereinheit an die p40-Untereinheit
durch eine Disulfidbindung gebunden ist, und (iii) das Verbinden
dieser ersten und zweiten chimären
Kette durch eine Disulfidbindung, wodurch ein dimeres Fusionsprotein
gebildet wird.
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Die
erfindungsgemäßen IL-12-Fusionsproteine
eignen sich zur spezifischen Zielansteuerung oder zur Immunstimulation,
wenn es wichtig ist, eine zellvermittelte Immunantwort zu erzeugen,
beispielsweise bei der Krebsimmuntherapie oder bei antiviralen Antworten.
Sie eignen sich auch zur spezifischen Herunterregulation von Th2-Anworten,
die oft zur Überproduktion
von IL-4 führen.
Von diesem Cytokin wurde gezeigt, dass es für die Entwicklung einer Allergie
durch Induktion einer Th2-Antwort und die daraus resultierende Überproduktion an
IgE-Antikörper
wesentlich ist.
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Kurze Beschreibung der
Abbildungen
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Die
vorstehenden und andere Aufgaben der vorliegenden Erfindung und
ihre verschiedenen Merkmale können
vollständiger
verstanden werden durch die folgende Beschreibung zusammen mit den
beigefügten
Abbildungen, wobei:
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1 eine schematische Darstellung der vorhergesagten
Proteinstruktur heterodimerer Fusionsproteine ist;
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2 eine
schematische Darstellung einer SDS-PAGE ist, die eine Analyse unter
reduzierenden Bedingungen von Proteinen zeigt, die aus Zellen sezerniert
werden, die mit Vektoren transfiziert sind, die das Fc-p35-Fusionsprotein
(Spur 1), das Fc-p40-Fusionsprotein
(Spur 2), das Fc-p35-Fusionsprotein und das Fc-p40-Fusionsprotein
(Spur 3), das Fc-p35-Fusionsprotein und die p40-Untereinheit (Spur
4) und die p35-Untereinheit und das Fc-p40-Fusionsprotein (Spur
5) exprimieren.
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3 eine
schematische Darstellung der vorhergesagten Proteinstruktur exprimierter
Fusionsproteine ist;
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4 ein
Balkendiagramm ist, das die Fähigkeit
verschiedener Fusionsproteine zur Stimulation der IFN-γ-Produktion
darstellt;
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5A eine
schematische Darstellung einer SDS-PAGE ist, die eine Analyse von
gesamten Antikörper-IL-12-Fusionsproteinen,
die von zwei unabhängigen
Transfektanten hergestellt werden, unter nicht reduzierenden (Spuren
1 und 2) und reduzierenden Bedingungen zeigt (Spuren 3 und 4);
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5B–5D graphische
Darstellungen sind, die die Wirkungen von Human-IL-12 (X), Hu-KS-IL-12-Fusionsprotein
mit beiden humanen IL-12-Ketten (geschlossene Quadrate) und Hu-KS-1/4-Maus-p35-Human-p40-Fusionsprotein
(offene Quadrate) auf die Proliferation von mitogenaktivierten humanen
PBMC (Bild B); die Induktion der IFN-γ-Sekretion aus PHA-aktivierten
PBMC (Bild C) und aus Mauseffektorzellen, die mit Concanavalin A
vorstimuliert sind (Bild D), zeigen;
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6A–6B graphische
Darstellungen sind, die die Wirkungen von IL-12 (X), Einketten-Fusionsprotein
mit humanen p35- und p40-Untereinheiten (geschlossene Quadrate)
und Einketten-Fusionsprotein mit einer p35-Untereinheit der Maus
und einer humanen p40-Untereinheit (offene Quadrate) auf die Induktion
der IFN-γ-Sekretion zeigen;
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6C eine
graphische Darstellung ist, der die Antigenbindungsaktivität von gesamtem Hu-KS-1/4-IL-12-Fusionsprotein
(offene Quadrate), Einketten-Fusionsprotein mit Human-IL-12 (offene
Rauten), Einketten-Fusionsprotein mit Maus-p35-Human-p40 (offene und freie Kreise)
und Human-IL-12 (offene Dreiecke) zeigt;
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7 eine
graphische Darstellung ist, der die Serumhalbwertszeit von Hu-KS-I1-12-(Maus-p35-Human-p40)
zeigt, gemessen durch einen ELISA unter Verwendung eines Einfangschritts
mit Anti-Human-H- und -L-Kette und einen zweiten Nachweis mit Anti-Human-Fc-Antikörper (geschlossene
Rauten) oder Anti-Human-IL-12-p40-Antikörper (offene
Quadrate);
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8 (oberes und unteres Bild) graphische
Darstellungen sind, die die Immunogenizität von IL-12-Fusionsproteine
zeigen. Serumverdünnungen
von Tieren, denen entweder Hu-KS-1/4-Antikörper oder Hu-KS-1/4-IL-12-(Maus-p35-Human-p40) injiziert
wurde, wurden bezüglich
der Reaktivität
gegen den Hu-KS-1/4-Antikörper getestet.
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Eingehende Beschreibung
der Erfindung
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Die
vorliegende Erfindung beschreibt Fusionsproteine zwischen heterodimeren
Cytokinen und anderen Proteinen. Heterodimere Cytokine können zum
Beispiel mit Proteinen mit zielansteuernden oder antigenen Eigenschaften
fusioniert werden. Fusionsproteine zwischen heterodimeren Cytokinen
und Proteinen mit zielansteuernden oder antigenen Eigenschaften
können
eine längere
Zirkulationshalbwertszeit besitzen als ungebundene heterodimere
Cytokine. Zielansteuerungs- oder
Antigeneigenschaften sind für
die verlängerte Zirkulationshalbwertszeit
nicht nötig,
da diese Eigenschaft auch durch Fusionieren eines heterodimeren
Cytokins mit einem Protein erzielt werden kann, dem zielerkennende
oder antigene Eigenschaften fehlen, wie zum Beispiel Serumalbumin.
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Die
erfindungsgemäßen Fusionsproteine
können
durch gentechnologische Verfahren hergestellt werden. Wie in 1 gezeigt, können verschiedene Fusionsproteinkonstrukte
durch die erfindungsgemäßen Methoden
hergestellt werden. Bei einer Ausführungsform wird eine der Untereinheiten
des heterodimeren Cytokins, die mit einem Protein mit antigenen
Eigenschaften oder einer Ig-Schwerkette fusioniert ist, mit einer
freien Untereinheit des anderen Typs coexprimiert. Nach der Expression
wird die chimäre
Kette durch eine Disulfidbindung an die freie Untereinheit gebunden
(1B). Bei einer anderen Ausführungsform kann das Protein mit
antigenen Eigenschaften oder eine Ig-Schwerkette, das/die mit einer
Untereinheit fusioniert ist, an ein anderes Protein mit antigenen
Eigenschaften oder eine Ig-Schwerkette gebunden werden. Da jedes
Protein mit antigenen Eigenschaften oder jede Ig-Schwerkette an
ein heterodimeres Cytokin gebunden ist, besitzt das erhaltene Konstrukt
zwei Moleküle
des heterodimeren Cytokins (1C) Bei
noch einer anderen Ausführungsform
ist jede Untereinheit des heterodimeren Cytokins mit einem Protein
mit antigenen Eigenschaften oder einer Ig-Schwerkette fusioniert und die zwei
chimären
Ketten sind durch eine Disulfidbindung verbunden. Das erhaltene
Konstrukt besitzt nur ein Molekül
des heterodimeren Cytokins (1D). Bei
noch einer anderen Ausführungsform
werden zwei Untereinheiten des heterodimeren Cytokins, die mit einem
Protein mit antigenen Eigenschaften oder einer Ig-Schwerkette fusioniert
sind, mit einer freien Untereinheit coexprimiert. Das erhaltene
Konstrukt besitzt drei Untereinheiten des heterodimeren Cytokins
(1E).
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Zurzeit
ist IL-12 das einzige bekannte heterodimere Cytokin. Nach der Identifikation
und Sequenzierung neuer heterodimerer Cytokine wird ein Fachmann
jedoch in der Lage sein, erfindungsgemäße Verfahren zur Herstellung
von Fusionsproteinen mit diesen neuen heterodimeren Cytokinen zu
verwenden.
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Verfahren
zur Synthese geeigneter Ausführungsformen
der Erfindung sowie geeignete Assays zum Testen ihrer pharmakologischen
Aktivitäten
sowohl in vitro als auch in vorklinischen in vivo Tiermodellen sind beschrieben.
Das bevorzugte Genkonstrukt, das eine chimäre Kette (d.h. eine Untereinheit
des heterodimeren Cytokins, fusioniert mit einem Protein mit antigenen
Eigenschaften oder einer Ig-Schwerkette)
codiert, umfasst in 5'-
nach 3'-Richtung
ein DNA-Segment, das ein Protein mit antigenen Eigenschaften oder
eine Ig-Schwerkette codiert, und DNA, die eine Untereinheit des
heterodimeren Cytokins codiert. Ein alternatives bevorzugtes Genkonstrukt
umfasst in 5'- nach
3'-Richtung ein
DNA-Segment, das eine Untereinheit des heterodimeren Cytokins codiert,
und DNA, die ein Protein mit antigenen Eigenschaften oder eine Ig-Schwerkette
codiert. Das fusionierte Gen wird für die Transfektion geeigneter
Empfängerzellen,
in denen es exprimiert wird, in einem Expressionsvektor zusammengesetzt
oder darin eingebracht.
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Die
Erfindung wird ferner durch die folgenden nichtbeschränkenden
Beispiele erläutert:
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Beispiel 1 Klonierung
von cDNAs, die Human- und Maus-IL-12-Untereinheiten codieren
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Humane
periphere Blutmonocyten (PBMC) wurden von einem gesunden Freiwilligen
erhalten und durch Zentrifugation auf einem Ficoll-Hypaque-Gradienten
(Pharmacia) (1700 U/min für
20 min) gereinigt. Der „Buffy
Coat", der die PBMC
enthält,
wurde mit serumfreiem Kulturmedium (SF-RPMI) auf ein Volumen von
50 ml verdünnt
und durch Zentrifugation bei 1500 U/min für 5 min gesammelt. Die Zellen
wurden in AIM-V-Zellkulturmedium (GIBCO) bis zu einer Dichte von
5 × 106 Zellen/ml resuspendiert und für 2 Tage
bei 37 °C
in einem befeuchteten CO2-Inkubator gezüchtet. Die
anhaftenden Zellen wurden selektiert, indem die Kulturflasche leicht
geschüttelt
wurde, um nicht haftende Zellen zu entfernen. Frisches Medium, das
Phorbolester (100 nM) und das Calciumionophor Ionomycin (0,1 μg/ml) enthielt,
wurde zugesetzt. Nach drei Tagen wurden die Zellen durch sanftes
Abschaben und Zentrifugation gesammelt. PolyA+-mRNA
wurde unter Verwendung von mit Oligo-dT beschichteten Kugeln (Dynal,
Inc.) hergestellt.
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Untereinheiten-cDNAs
wurden unter Verwendung von Polymerasekettenreaktionen (PCR) kloniert. Erststrang-cDNA
wurde in einer 50 μl
Reaktion, die Oligo-dT-Primer (50μg/ml),
Reaktionspuffer, RNAsin (10 U/ml) und reverse Transkriptase enthielt,
synthetisiert. Die Inkubation erfolgte bei 43 °C für 2 h, gefolgt von Extraktion
mit Phenol, Phenol:Chloroform (50:50) und Fällung mit Ethanol. Das cDNA-Produkt
wurde als Matrize für
PCR-Reaktionen verwendet, die Taq-Polymerase und Reaktionspuffer
(10x Puffer; Perkin Elmer), Sense- und Antisense-Primer (jeweils 0,2 bis
0,5 μm)
und 10 % der cDNA-Reaktion enthielten. Die Primersequenzen waren
5'-CCAGAAAGCAAGAGACCAGAG-3' (SEQ ID NR: 1) für den Sense-Primer
und 5'-GGAGGGACCTCGAGTTTTAGGAAGCATTCAG-3' (SEQ ID NR: 2) für den Antisense-Primer
der p35-Untereinheiten-cDNA. Der Sense-Primer stammt von einer Sequenz
im 5'-untranslatierten
Bereich des p35-Boten unmittelbar stromaufwärts von einer XmaI-Restriktionsstelle,
während
der Antisense-Primer ein Translations-Stoppcodon codiert, worauf
kurz danach eine geeignete XhoI-Restriktionsstelle
zur gerichteten Subklonierung in einen Expressionsvektor folgt.
Die Primer für
die p40-Untereinheiten-cDNA waren 5'-CTCCGTCCTGTCTAGAGCAAGATGTGTC-3' (SEQ ID NR: 3) für den Sense-Primer
und 5'-GCTTCTCGAGAACCTAACTGCAGGGCACAG-3' (SEQ ID NR: 4) für den Antisense-Primer.
Der Sense-Primer codiert eine einzelne XbaI-Restriktionsstelle stromaufwärts vom
Translationsstart, während
der Antisense-Prirner
ein Stoppcodon und, wie vorstehend, eine einzelne XhoI-Restriktionsstelle
codiert. Beide Untereinheitssequenzen, die mit diesen PCR-Primern
kloniert werden, werden als Einzelproteine exprimiert und benötigen daher
native oder andere sekretorische Leadersequenzen für den korrekten
Zusammenbau und die korrekte Sekretion des Heterodimers. Die PCR-Reaktionen
bestanden aus 40 Zyklen einschließlich: 1 min bei 92 °C, 2 min
bei 52 °C
und 3 min bei 72 °C,
die auf einen anfänglichen
Denaturierungsschritt von 94 °C
für 2 min
folgen. Die Produkte wurden über
ein Gel gereinigt und zur Sequenzüberprüfung in den SK-Klonierungsvektor
(Stratagene) kloniert. Die DNA-Sequenzierung wurde unter Verwendung
eines kommerziellen Kits (U.S. Biochemical) an jeder Untereinheiten-cDNA
durchgeführt.
Das gleiche Verfahren kann zur Klonierung der Maus-p35-Untereinheiten-cDNA
aus Milzzellen, die mit Concanavalin A (5 μg/ml in Kulturmedium für 3 Tage)
aktiviert sind, verwendet werden. Empfohlene Primer sind 5'-CCTCTACTAACATGTGTCAATCACGCTACCTC-3' (SEQ ID NR: 5) für den Sense-Primer
und 5'-CCCTCGAGTCAGGCGGAGCTCAGATAGCC-3' (SEQ ID NR: 6) für den Antisense-Primer,
die die gleichen Restriktionstellen codieren, wie vorstehend für die humane
p35-Unterheit beschrieben.
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Beispiel 2 Expression
der Fusionsproteinkombinationen in transfizierten Säugerzellen
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Um
die fusionierten Versionen jeder Untereinheit herzustellen, wurden
die DNAs, die jeweils die reife Proteinsequenz codieren, folgendermaßen angepasst.
Die p40-Untereinheiten-DNA
wurde mit NdeI, das sehr nahe an der Verknüpfungsstelle des reifen Proteins
mit der Leadersequenz schneidet, und mit XhoI verdaut. Ein Adapteroligonucleotid
mit der Sequenz 5'-CCGGGCAAGTCCA-3' (SEQ ID NR: 7) wurde
synthetisiert, das an ein zweites, teilweise komplementäres Oligonucleotid
mit der Sequenz 5'-TATGGACTTGC-3' (SEQ ID NR: 8) hybridisierte.
Die doppelsträngige
DNA enthält überhängende Sequenz,
die mit der Ligation an eine XmaI-Restriktionsstelle am 5'-Ende und an eine
NdeI-Stelle am 3'-Ende
kompatibel ist. Dieses Fragment wurde an das NdeI/XhoI-Fragment
der p40-cDNA ligiert
und als ein XmaI-XhoI-Fragment in den Vektor pdC-Fx-X kloniert,
der mit XmaI und XhoT geschnitten worden war. Dieser Vektor enthält bereits
ein Human-IgGl-Fc codierendes DNA-Fragment in seiner genomischen
Konfiguration (einschließlich
Introns und Exons), das stromabwärts
einer Leadersequenz fusioniert ist, die von einer Maus-Leichtkette
stammt. Siehe Gillies et al., J. Immunol. Methods 125: 191-202 (1989).
Das Einbringen eines DNA-Fragments in seine einzige XmaI-Restriktionsstelle
erlaubt die Herstellung von Fusionsproteinen, die direkt an den
Carboxylterminus des Fc gebunden sind, vorausgesetzt dass der Leserahmen
zwischen den zwei Sequenzen aufrechterhalten wird (Lo et al., U.S.-Patent
Nr. 5,541,087). Andere Proteine (z.B. Antigen, Serumalbumin) können auf
die gleiche Weise an den Aminoterminus dieser Untereinheiten fusioniert
werden. Die Vorteile dieses Verfahrens umfassen die großen hergestellten
Produktmengen und die Einfachheit der Reinigung des Produkts durch
Bindung an und Elution von Protein-A-Sepharose.
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Dieselbe
allgemeine Strategie wurde verwendet, um die DNA der p35-Untereinheit
an Human-Fc zu fusionieren. In diesem Fall wurde ein XmaI-BalI-Linker
unter Verwendung der Oligonucleotide 5'-CCGGGAAGAAACCTCCCCGTGG-3' (SEQ ID NR: 9) und 5'-CCACGGGGAGGTTTCTTC-3' (SEQ ID NR: 10)
synthetisiert, die an eine p35-Untereinheiten-DNA ligiert, mit BalI
und XhoI geschnitten und als ein XmaI/UXhoI-Fragment in den pdC-Fc-X-Vektor
subkloniert wurden, wie vorstehend beschrieben. Für die humane
p35-Untereinheit wurde gezeigt, dass sie in Humanzellen, aber nicht
in Mauszellen hinsichtlich der IL-12-Aktivität aktiv ist, wohingegen die
humane p40-Untereinheit keine Artspezifität zeigt. Daher kann die humane
p40-Untereinheit entweder zur Herstellung aller Human-I1-12-Fusionsproteine
oder von Human/Maus-Hybridfusionsproteinen verwendet werden.
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Die
erhaltenen Konstrukte codieren Fc-p35- oder Fc-p40-Fusionsproteine,
von denen erwartet wird, dass sie spontan zu Proteinen von 120 kD
(50 kD von Fc) beziehungsweise 130 kD dimerisieren und nach Reduktion
auf denaturierenden SDS-Gelen wie Proteine von 60 kD und 65 kD wandern.
Die einzelnen Untereinheiten-cDNAs wurden für ihre Expression als unabhängige Proteine
in den pdC-Expressionsvektor (ohne Fc) subkloniert. Dieser Vektor
stellt Promotersequenzen zur Expression von mRNA bereit, die von
dem cDNA-Insert nach der Transfektion von Säugerzellen transkribiert wird.
Er stellt ferner stromabwärts
der XhoI-Insertionsstelle einen 3'-untranslatierten Bereich und eine PolyA-Verknüpfungsstelle
bereit. Es gibt auch Sequenzen, die für die Vermehrung des Plasmids
in E. coli und für
die Selektion mit Ampicillin notwendig sind, ebenso wie ein Selektionsmarkergen,
wie Dihydrofolatreduktase (dhfr), das eine Resistenz gegen Methotrexat verleiht.
Die gleichen Komponenten werden auch bei dem pdC-Fc-X-Vektor zur Expression
der Fusionsproteine verwendet.
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Zur
Expression des biologisch aktiven I1-12-Fusionsprotein-Heterodimers
wuden verschiedene Kombinationen der einzelnen Vektoren, die Fusions-
und Nichtfusionsformen der Untereinheiten codieren, durch Cotransfektion
von humanen 293-Epidermiskarzinomzellen transient exprimiert. Die
DNA wurde unter Ver wendung von Präparationskits (Wizard, Promega
Inc.) gereinigt und zur Sterilisation und zum Resuspendieren in sterilem
Wasser mit Ethanol gefällt.
Calciumphosphatniederschläge
wurden durch Standardverfahren unter Verwendung von 10 μg DNA pro
ml (jeweils 5 μg,
wenn zwei Plasmide cotransfiziert wurden) hergestellt, und 0,5 ml/Platte
wurden zu 293-Kulturen gegeben, die auf 60-mm-Platten bei nahezu 70 %iger Konfluenz
wuchsen. MOLECULAR CLONINGA LABOTATORY MANUAL, 2. Aufl. (Sambrook,
Fritsch und Maniatis, Hrsg., Cold Spring Harbor Laboratory Press,
1989). Nach 16 h wurde das Medium, das den Niederschlag enthielt, entfernt
und gegen frisches Medium ausgetauscht. Nach 3 Tagen wurde der Überstand
entfernt und mittels ELISA, biologischer Bestimmung der IL-12-Aktivität oder Immunpräzipitation
und Analyse auf SDS-Gelen von radioaktiv markierten Proteinen bezüglich der
Produktion einer Expression transfizierter Gene untersucht. Zum Markieren
wurde Medium ohne Methionin zum Ersetzen des Wachstumsmediums am
zweiten Tag der Kultur verwendet, und 35S-Methionin
(100 μCi/ml)
wird zugesetzt. Nach weiteren 16 h Inkubation wurde das Medium geerntet,
durch Zentrifugation geklärt
(5 min bei 13000 U/min in einer Tisch-Mikrozentrifuge) und mit Protein-A-Sepharosekugeln
(10 μl Kugelvolumen
pro ml Kulturüberstand)
inkubiert. Nach 1 h bei Raumtemperatur wurden die Kugeln durch wiederholte
Zentrifugation und Resuspendieren in PBS-Puffer, der 1 % NP-40 enthielt,
gewaschen. Das endgültige
Pellet wurde in SDS enthaltendem Gelpuffer resuspendiert und für 2 min
gekocht. Nach Entfernen der Kugeln durch Zentrifugation wurde der Überstand
in zwei Aliquote unterteilt. Reduktionsmittel (5 % 2-Mercaptoethanol)
wurde zu einer Probe gegeben und beide wurden 5 min gekocht, bevor sie
auf ein SDS-Polyacrylamidgel aufgetragen wurden. Nach der Elektrophorese
wurde das Gel einem Röntgenfilm
ausgesetzt (Autoradiographie).
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Ein
Beispiel einer Analyse der Coexpression verschiedener Fusionsproteine
und einzeln exprimierter Proteine unter reduzierenden Bedingungen
ist in 2 gezeigt. Die Ergebnisse zeigen, dass die p35-Untereinheit
nicht aus der Zelle sezerniert werden kann, sogar wenn sie als Fusionsprotein
mit dem Fc-Fragment exprimiert wird (Spur 1). Die p40-Untereinheit
wurde dagegen ohne weiteres sezerniert, wenn sie an Fc fusioniert war
(Spur 2). Die p35-Untereinheit wurde sezerniert, wenn sie sich mit
der p40-Untereinheit paaren konnte, entweder als Fc-p35-Fusionspaarung
mit einem Fc-p40-Fusionsprotein (Spur 3), die Fc-p35-Paarung mit freiem
p40 (Spur 4) oder Paarung von freiem p35 mit dem Fc-p40-Fusionsprotein (Spur
5). In allen Fällen
der Expression einer freien Untereinheit zusammen mit einem Fusionsprotein
verbindet sich die freie Untereinheit mit der anderen Untereinheit
und bildet eine kovalente Disulfidbindung. Ein Diagramm dieser verschiedenen
Kombinationen ist in 1 gezeigt. Man
sollte beachten, dass das Konstrukt mit jeder Untereinheit, die
an Fc fusioniert ist und in derselben Zelle coexprimiert wird, ein
Molekül
IL-12 pro Fc besitzt (1D), wohingegen die Konstrukte
aus der Fusion einer einzelnen Untereinheit mit Fc, die mit einer
freien Untereinheit (des anderen Typs) gepaart ist, zwei Moleküle IL-12
pro Fc besitzt (1C). Es wird erwartet, dass
eine Expression in stabil transfizierten Zellen sich von der transienten
Expression unterscheidet, weil die Expression und Sekretion von p35
unabhängig
ist. Folglich ist die Überexpression
von p40 möglich
und für
die Zelle vorteilhafter, da es leicht exportiert werden kann. Dies
könnte
zu einem übermäßigen Vorkommen
von Fc-p40-Untereinheiten im Vergleich zu Fc-p35-Untereinheiten
führen
und eine Mischung aus Heterodimer- und p40-Homodimer-Sekretion aus
der Zelle bewirken. Dies wäre
ineffizient und würde
zur Problemen bei der Reinigung führen. Die Expression von p35
bringt wahrscheinlich einen Wachstumsnachteil mit sich, da überschüssiges Protein
wahrscheinlich im endoplasmatischen Retikulum abgebaut wird, wenn
es nicht mit der p40-Untereinheit effizient gepaart ist. So ist
es möglich,
einen Vorteil aus dieser Situation zu ziehen, um die ausgewogene
Sekretion nur eines Heterodimerfusionsprodukts sicherzustellen,
indem die p35-Untereinheit als Fusionsprotein zusammen mit freier
p40-Untereinheit exprmiert wird. Nur mit einer äquimolaren Menge der p40-Untereinheit
gepaartes p35-Fusionsprotein kann sezerniert werden. Die Reinigung
diese Produkts an Protein A ergibt eine homogene Zubereitung des
Heterodimers. Eine schematische Darstellung der vorhergesagten Proteinstruktur
des exprimierten Fusionsproteins ist in 3 dargestellt.
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Beispiel 3 Aktivität von Fusionsproteinen
in einem IFN-γ-Induktionsassay
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Die
biologische Aktivität
wurde in einem IFN-γ-Induktionsassay
unter Verwendung mitogenaktivierter, wie in Beispiel 1 gereinigter
Human-PBMC gemessen.
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Nach
der Gradientenzentrifugation wurden die Zellen in Zellkulturmedium,
das 10 % fötales
Rinderserum (RPMI-10) und Phytohämagglutinin
(PHA; 10 μg/ml)
enthielt, bis zu einer Dichte von 5 × 106 Zellen/ml
resuspendiert und 3 Tage bei 37 °C
in einem befeuchteten CO2-Inkubator gezüchtet. Die
PHA-aktivierten Zellen wurden mittels Zentrifugation gesammelt,
dreimal mit dem gleichen Volumen an SF-RPMI gewaschen und in frischem
RPMI-10 (1 × 106 Zellen/ml) resuspendiert. Aliquote (100 μl) wurden
in die Vertiefungen von mehreren Platten mit 96 Vertiefungen gegeben,
wobei eine endgültige
Zellzahl von 105 pro Vertiefung erhalten
wurde. Testproben aus dem Kulturmedium wurden in frischem Kulturmedium
seriell verdünnt
und zu den Vertiefungen der Platte mit 96 Vertiefungen gegeben.
Es wurde Stimulationsmedium (50 μl/Vertiefung),
das 10 % Serum und IL-2 (25 U/ml) enthielt, zugesetzt. Kontrollvertiefungen
erhielten nur IL-2 (negative Kontrolle) oder IL-2 und kommerzielles
IL-12 (R & D
Systems), aber keine Probe (positive Kontrolle). Die Platten wurden
für 48
h bei 37 °C
in einem CO2-Inkubator inkubiert, wonach
Aliquote (20 μl)
zur Analyse der IFN-γ-Konzentration
durch ELISA entnommen wurden.
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Der
gleiche Assay wurde verwendet, um die Aktivität der Mausformen der IL-12-Fusionsproteine zu bestimmen,
ausgenommen dass Milzzellen aus Balb/c-Mäusen, die für 3 Tage mit Concanavalin A
aktiviert worden waren, anstelle von PHA-aktivierten Human-PBMC verwendet wurden.
Es wurde ein mausspezifischer ELISA verwendet, um die IFN-γ-Menge, die
durch die Human-p40/Maus-p35-Hybridmoleküle induziert
wurde, zu quantifizieren.
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Für das Humansystem
wurde ein quantitativer ELISA entwickelt, indem Platten mit 96 Vertiefungen (Nunc-Immunoplate
F96 Cert. Maxisorb) mit einem monoklonalen Mausantikörper gegen
Human-IFN-γ (1 μg/ml) in
phosphatgepufferter Salzlösung
(PBS; Pestka Biological Laboratories) über Nacht bei 4 °C beschichtet
wurden, ungebundener Antikörper
dreimal mit PBS abgewaschen wurde und mit einer Lösung von
1 % Rinderserumalbumin (BSA) und 1 % Ziegenserum in PBS (150 μl/Vertiefung
für 2 h
bei 37 °C)
blockiert wurde. Nach viermaligem Waschen der blockierten Platten
mit PBS wurden Testproben und Verdünnungen des IFN-γ-Standards bis zu
einem Endvolumen von 100 μl/Vertiefung
zugegeben. Nach anschließender
Inkubation bei 4 °C über Nacht
wurden die Platten viermal mit PBS gewaschen, und ein polyklonales
Antiserum aus Kaninchen gegen Human-IFN-γ (1/10000-Verdünnung; Petska
Biological Laboratories) wurde zugesetzt. Nach zusätzlicher
Inkubation für
1 h bei 37 °C
und viermaligem Waschen mit PBS wurde ein polyklonaler Esel-Anti-Kaninchen-Nachweisantikörper, der
mit Meerrettichperoxidase konjugiert war, (1/700-Verdünnung; Petska Biological
Laboratories) für
1 h bei 37 °C
zugegeben. Die Platten werden dann viermal mit PBS gewaschen, und
100 μl K-Blue-Substrat
(ELISA Technologies, Neogen Corp.) wurden zugesetzt, bis die Farbe
in den Vertiefungen, die die Standardkurve enthielten, ausreichend
entwickelt war, und zu diesem Zeitpunkt wurden 100 μl von Red-Stop-Lösung zugesetzt
(ELISA Technologies). Die Platte wurde bei 650 nm unter Verwendung
eines ELISA-Plattenlesers (Dynatech MR7000) gelesen, und die Menge
an IFN-γ wurde
durch Vergleich der optischen Dichte der Testprobe mit der Standardkurve,
die aus den Verdünnungen
des Kontroll-IFN-γ erhalten wurde,
berechnet. Die Menge an IFN-γ,
die in Gegenwart von sowohl IL-2 als auch IL 12 induziert wurde,
reicht im Allgemeinen von 1200-2000 pg/ml, während die in Abwesenheit von
IL-12 gebildete Menge im Allgemeinen weniger als 50 pg/ml betrug.
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Die
im Beispiel 2 beschriebene biologische Aktivität der Kulturüberstande
wurde bezüglich
ihrer Fähigkeit
verglichen, die IFN-γ-Produktion
zu stimulieren. Wie in 4 gezeigt, wurde die höchste Aktivität mit dem
Fc-p35-Fusionsprotein erhalten, das mit freier p40-Untereinheit
coexprimiert wurde, obgleich die anderen Kombinationen mit beiden
Untereinheiten ebenfalls aktiv waren. Genauere Messungen mit gereinigten
Proteinen sind nachstehend beschrieben.
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Beispiel 4 Expression
von Antikörper-IL-12-Fusionsproteinen
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Die
im Beispiel 2 beschriebenen Experimente zeigen, dass ein geeigneter
Weg zur Expression von Fusionsproteinen mit dem heterodimeren IL-12-Cytokin
die Coexpression eines fusionierten p35-Untereinheitproteins zusammen
mit freier p40-Untereinheit in derselben Zelle ist. Dies kann durch
zwei Ansätze
erreicht werden: Der erste wird erreicht, indem der Fusionsproteinvektor
und der p40-Expressionsvektor
gleichzeitig cotransfiziert werden (d.h. simultane Transfektion); der
zweite besteht darin, zuerst eine Zelle nur mit p40 zu transfizieren
und bezüglich
Zellen zu selektieren, die dieses Protein stabilen auf hohem Niveau
sezernieren, und dann diese Zelle als Empfänger für die Transfektion durch das
das Fusionsprotein exprimierende Konstrukt zu verwenden (d.h. sequenzielle
Transfektion). Das letztere Verfahren ist besonders geeignet, wenn
das Fusionsprotein ein Antikörpermolekül mit sowohl
schwerer als auch leichter Kette ist, das für der korrekten Zusammenbau
und die korrekte Sekretion richtig zusammengesetzt sein muss. Theoretisch
könnte
die Fusion der p35-Untereinheit mit der schweren oder leichten Kette
erfolgen, aber bei der bevorzugten Ausführungsform erfolgt sie an den
Carboxylterminus der schweren Kette, wo sie mehr Freiheit zur Wechselwirkung
mit den IL-12-Rezeptoren auf Zellen hat. Es ist auch möglich, die
p35-Untereinheit über ihren
Carboxylterminus an den Aminoterminus der schweren oder leichten
Kette zu fusionieren. In diesem Fall wird eine Leadersequenz für die p35-Expression
benötigt,
da es sich am Aminoterminus des Fusionsproteins befindet und somit
für den
Zusammenbau und die Sekretion aus der Zelle eine Zielsteuerung zum
endoplasmatischem Retikulum erfordert.
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Das
Nucleinsäurekonstrukt
kann auch den endogenen Promotor und Enhancer für das Gen, das die variable
Region kodiert, umfassen, so dass die Expression der chimären Immunglobulinkette
reguliert wird. Zum Beispiel können
die Gene, die die variable Region codieren, als DNA-Fragmente erhalten
werden, die das Leaderpeptid, das VJ-Gen [funktionell umgelagerte
variable (V-) Regionen mit Joining- (J-) Segment] für die leichte
Kette oder das VDJ-Gen für
die schwere Kette und den endogenen Promotor und Enhancer für diese Gene
enthalten. Ersatzweise kann das Gen, das die variable Region kodiert,
jenseits von endogenen regulatorischen Elementen erhalten und in
einem Expressionsvektor verwendet werden, der diese Elemente bereitstellt.
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Gene
für variable
Regionen können
durch Standard-DNA-Klonierungsverfahren aus Zellen, die den gewünschten
Antikörper
herstellen, erhalten werden. Screening der Genombibliothek bezüglich einer
spezifischen, funktionell umgelagerten variablen Region kann unter
Verwendung geeigneter DNA-Sonden, wie DNA-Segmenten, die die DNA-Sequenz
der J-Region und Sequenzen stromabwärts enthalten, erzielt werden. Die
Identifizierung und Bestätigung
der korrekten Klone werden dann durch DNA-Sequenzierung der klonierten
Gene und Vergleich der Sequenz mit der entsprechenden Sequenz der
richtig gespleißten
VolllängenmRNA
erzielt.
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4.1 Gleichzeitige Transfektion
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Gleichzeitige
Transfektion kann durch Konstruktion eines Vektors mit zwei Transkriptionseinheiten
und einem selektierbarem Markergen erzielt werden. Solche Vektoren
sind für
die Expression rekombinanter Antikörper in Säugerzellen beschrieben. Gillies
et al., J. Immunol. Methods 125: 191-202 (1989). Ein alternatives Verfahren
besteht aus der Verwendung zweier unabhängiger Plasmidvektoren (einem
mit einer Transkriptionseinheit für das Fusionsprotein und einem
mit einer Transkriptionseinheit für die p40-Untereinheit) mit
ihren eigenen selektierbaren Markergenen und der Selektion bezüglich erfolgreich
transfizierter, exprimierender Zellen durch Züchtung in Gegenwart von Arzneistoffen,
gegen die die Zellen resistent geworden sind (z.B. Methotrexat in
mit dem dhfr-Gen transfizierten Zellen). Eine noch weitere Möglichkeit
ist die Verwendung eines Expressionsvektors für das Fusionsprotein an die
p35-Untereinheit, der ein selektierbares Markergen enthält, und
die Cotransfektion eines zweiten Vektors ohne selektierbares Markergen
und mit einer Transkriptionseinheit für die p40-Untereinheit. Jeder arzneistoffresistente
Klon, der durch das zuletzt genannte Verfahren erhalten wird, kann
das Fusionsprotein in Abwesenheit der p40-Untereinheit nicht sezernieren und würde somit durch
einen ELISA-Assay des Kulturüberstandes
nicht nachgewiesen. Nur Zellen, die mit beiden Vektoren transfiziert
sind, würden
das intakte Fusionsprotein-p40-Heterodimer sezernieren.
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Es
wurde ein Plasmidvektor (pdHL7-14.18-p35) konstruiert, wie in Gillies
et al., J. Immunol. Methods 125: 191-202 (1989) beschrieben, der
ein selektierbares dhfr-Markergen,
eine Transkriptionseinheit, die eine humanisierte 14.18-Anti-GD2-Antikörper-Leichtkette
codiert, und eine Transkriptionseinheit enthält, die eine humanisierte Schwerkette,
fusioniert mit der p35-Untereinheit des Human-IL-12, codiert. Die
Fusion wurde durch Ligation des XmaI-XhoI-Fragments der angepassten
p35-Untereinheiten-cDNA, wie im Beispiel 2 beschrieben, an eine
ein zelne XmaI-Restriktionsstelle am Ende des CH3-Exons des humanen
IgGl-H-Kettengens
erreicht. Sowohl die H- als auch die L-Ketten-Transkriptionseinheiten
enthalten einen Cytomegalievirus- (CMV-) Promoter (anstelle des
Metallothioneinpromoters in der Originalbezugsstelle) am 5'-Ende und eine Polyadenylierungsstelle
am 3'-Ende. Ein ähnlicher
Vektor (pC-p40) wurde für
die Expression der freien p40-Untereinheit konstruiert, enthielt
aber kein selektierbares Markergen (dhfr oder anderes), verwendete
aber dennoch den CMV-Promoter zur Transkription. Die codierende
Region beinhaltete in diesem Fall die natürliche Leadersequenz der p40-Untereinheit
für den
ordnungsgemäßen Transport
zum endoplasmatischen Retikulum und für den Zusammenbau mit dem Fusionsprotein.
Eine andere Version dieses Vektors (pNC-p40), die das Neomycin-Resistenzgen
beinhaltet, wurde zur Verwendung bei der sequenziellen Transfektion
konstruiert.
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Für die gleichzeitige
Transfektion wurden Plasmid-DNAs (ungefähr 10 μg von jedem Plasmid; pdHL7-14.18-p35
und pC-p40) durch Spaltung mit SalI-Restriktionsenzym linearisiert, unter
Verwendung des PCR-Cleanup-Kits (Wizard, Promega) gereinigt und
in 5 × 106 Myelomzellen (in 0,5 ml eiskaltem PBS)
unter Verwendung einer Einstellung von 0,25 V und 500 μF elektroporiert.
Nach einer Erholungszeit von 10 min auf Eis wurden die Zellen in
frisches Medium überfihrt
und in Platten mit 96 Vertiefungen zu etwa 105 Zellen/ml plattiert.
Nach 48 h wurden die Zellen mit Medium gefüttert, das Methotrexat (0,1 μM) enthielt.
Frisches Medium wurde durch Austausch der Hälfte des Flüssigkeitsvolumens alle 4 Tage
zugefügt,
bis Klone erschienen. Die Expression des gewünschten Antikörper-IL-12-Fusionsproteins
wurde unter Verwendung eines ELISA, der auf dem Nachweis von Antikörper-Fc
basierte, untersucht. Der Fangantikörper reagierte mit humanen
H- und L-Ketten, und der Nachweis verwendete einen für humanen
Fc spezifischen Antikörper.
Positive Klone wurden in Selektionsmedium vermehrt, und das Produkt
wurde durch Bindung an und Elution von Protein-A-Sepharose, wie
vorstehend beschrieben, gereinigt. Eluierte Proteine wurden durch
PAGE analysiert und durch Färbung mit
Coomassie Blue nachgewiesen.
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4.2 Sequenzielle Transfektion
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Für die sequenzielle
Transfektion wurde das Plasmid pNC-p40 in Zellen elektroporiert,
wie vorstehend beschrieben, und die Zellen wurden ausplattiert und
in G418-enthaltendem Medium selektiert. Die Kulturüberstände von
arzneistoffresistenten Klonen wurden durch ELISA bezüglich der
Produktion der p40-Untereinheit getestet.
Der Fangantikörper
war ein Maus-Anti-Auman-IL-12-p40 und der Nachweisantikörper war
gegen humanes IL-12-p40/p70 gerichtet. Kommerzielle ELISA-Kits sind
von mehreren Herstellern für
diesen Zweck erhältlich
(Pharminogen, San Diego; R&D
Systems, MN). Die am meisten produzierenden Zellklone wurden bezüglich der
stabilen Expression von p40 getestet. Einer dieser Klone wurde mit
pdHL7-14.18-p35-Plasmid-DNA transfiziert, wie vorstehend beschrieben,
und die Klone wurden in Methotrexat enthaltendem Medium selektiert.
Die Expression des gewünschten
Antikörper-IL-12-Fusionsproteins wurde
unter Verwendung eines ELISA untersucht, der auf dem Antikörper-Fc-Nachweis
basiert. Der Fangantikörper
reagierte mit humanen Hund L-Ketten, und der Nachweis verwendete
einen für
humanen Fc spezifischen Antikörper.
Positive Klone wurden in Selektionsrnedium vermehrt, und das Produkt
wurde durch Bindung an und Elution von Protein-A-Sepharose, wie
vorstehend beschrieben, gereinigt. Eluierte Proteine wurden durch
PAGE analysiert und durch Färbung
mit Coomassie Blue nachgewiesen.
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4.3 Aktivitäten der
Antikörper-IL-12-Fusionsproteine
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Wie
in Tabelle 1 zusammengefasst, wurden Fusionsprotein exprimierende
Zellen entweder durch gleichzeitige Transfektion oder sequenzielle
Transfektion erhalten, aber produktivere Klone wurden unter Verwendung
von sequenzieller Transfektion erhalten. Das von zwei einzelnen
Transfektanten sezernierte Produkt wurde bezüglich der Kettenzusammensetzung
untersucht. Die SDS-PAGE-Analyse ist in 5A gezeigt.
Beide Klone sezernieren eindeutig die gleiche relative Menge von
jeder der drei Ketten: leichte Kette, H-Kette-p35 und kovalent gebundenes
p40, was den vollständigen
und ordnungsgemäßen Zusammenbau
dieses 6-Kettenmoleküls
zeigt. Das gleiche Verfahren wurde mit einem zweiten Antikörper, KS-1/4, erhalten, der
mit dem EpCAM-Antigen reagiert, das auf praktisch allen Epidermiskarzinornzellen
(Colon-, Lungen-, Brust-, Prostata-, Pankreas-, Eierstock- und Blasenkarzinom)
exprimiert wird. Genau die gleichen Ergebnisse wurden erhalten, einschließlich normaler
Bindungsaktivitäten
der Antikörper
an ihre jeweiligen Antigene.
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Die
biologischen Aktivitäten
der gesamten Antikörper-IL-12-Fusionsproteine
sind in 5 gezeigt. Wenn die Fähigkeit
untersucht wurde, die Proliferation mitogenaktivierter Human-PBMC
zu stimulieren, war das Hu-KS-IL-12-Fusionsprotein mit beiden Human-IL-12-Ketten
auf molarer Ebene beinahe so aktiv wie der Human-IL-12-Standard
(5B). Das gleiche Konstrukt, das die Maus-p35-Untereinheit, fusioniert
an Hu-KS-1/4, enthielt, war zur Stimulation von Human-PBMC deutlich weniger
wirksam. Wenn die Fähigkeit
untersucht wurde, die Sekretion von IFN-γ aus PHA-aktivierten PBMC zu
induzieren, war das Hu-KS-IL-12-Protein
mit humanen IL-12-Ketten etwa 6-fach weniger wirksam als der IL-12-Standard, während die
Hybridform noch weitere 4-mal weniger wirksam war (5C).
Wenn Mauseffektorzellen (die mit Concanavalin A vorstimuliert waren)
verwendet wurden, war die Hybridform etwa 50fach weniger wirksam
als der Maus-IL-12-Standard. Die ausschließlich humane Form war inaktiv
(5D), wie aufgrund der Literatur erwartet. Siehe
Schoenhaut et al., J. Immunol. 148: 3433-3340 (1992).
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Tabelle
1 Vergleich
von Cotransfektion und sequenzieller Transfektion der IL-12-Fusionsprotein-Expression
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Beispiel 5 Expression
von Einketten-IL-12-Fusionsproteinen
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Die
vorstehend beschriebenen Verfahren zur Herstellung von dimerem Antikörper und
auf Fc basierenden Fusionsproteinen können auch in ihrer einfacheren
Form verwendet werden, um Einketten-Fusionsproteine mit IL-12 zu
exprimieren (die keine Dirnere bilden). In diesem Fall wird die
ein einzelnes Polypeptid codierende Sequenz an die Sequenz für die p35-Untereinheit
gebunden und in derselben Zelle wie die freie p40-Untereinheit coexprimiert.
Jedes der beiden Verfahren, gleichzeitige oder sequenzielle Transfektion,
kann verwendet werden, um heterodimere Einketten-Fusionsproteine
zu erzeugen. Der Zweck solcher Fusionsproteine kann entweder die
Zielsteuerung von IL-12 an eine Antigen tragende Zelle durch die
Fusion eines Einketten-Fv- (sc-Fv-) Antikörpers (Huston und Oppermann,
WO 88/09344) oder die Kombination der sehr spezifischen immunstimulatorischen
Wirkung von IL-12 zusammen mit einem Proteinantigen als ein Adjuvans
sein. Die Verbindung von stimulatorischem Proteinen und Antigen
gewährleistet
die Co-Lokalisation nach der Injektion in ein Tier. Das Antigen
kann jedes Polypeptid sein. Diese können Antikörper in Tieren induzieren,
die mit Tumor-, viralen oder anderen Antigenen reagieren können, die
therapeutischen Wert besitzen. Zum Beispiel kann sc-Fv, wie oft
vorteilhaft, dazu verwendet werden, Immunantworten auf Antikörper-V-Regionen
einschließlich
des Idiotyps (der spezifischen Antigenbindungsregion) zum Zweck
einer Stimulation des Idiotypnetzwerks zu induzieren.
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Der
für diese
Fusionsproteine verwendete Antigentyp kann auch einer sein, der
gewöhnlich
eine allergische Antwort induziert, wie das Der p I und Der p II
von Staubmilben oder Tropomyosin von verschiedenen Schalentierarten,
die auf DNA-Ebene
an die p35-Untereinheit von IL-12 fusioniert und in derselben Zelle
mit der p40-Untereinheit exprimiert werden können. Die Immunisierung mit
solchen Fusionsproteinen induziert eine stärkere Th1-Helferzellantwort,
die zur Desensibilisierung der krankheitsverursachenden Th2-Antwort
bei atopischen Patienten mit Allergie geeignet ist.
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Um
die Expression eines Einketten-Fusionsproteins zu zeigen, wurde
eine scFv-Version
des KS-1/4-Antikörpers
konstruiert. Das 5'-Ende
des proteincodierenden Abschnitts des Fusionsgens (eines XbaI-AflII-Fragments)
besteht aus einer Leadersequenz, die von einer Maus-κ-Leichtkette
stammt, fusioniert mit der reifen Proteinsequenz der V-Region der
KS-1/4-L-Leichtkette. Das Ende der V-Region ist im Leserahmen mit
einer DNA fusioniert, die eine einfache Linkersequenz (Gly4Ser)3 codiert und
von anderen beschrieben ist (Huston und Oppermann, WO 88/09344),
im Leserahmen gefolgt von der Sequenz, die die H-Ketten-V-Region von KS-1/4
codiert. Das 3'-Ende
dieses scFv enthält
eine XmaI-Restriktionsstelle,
die mit der Ligation an das 5'-Ende
der Human- und Mausversionen (XmaI-XhoI-Fragmente) der p35-Untereinheit
des IL-12 kompatibel ist. Die endgültigen XbaI-XhoI-Fragmente
wurden in die entsprechenden Stellen des gleichen Expressionsvektors
(pdC) eingesetzt, der zur Expression des freien IL-12-Untereinheiten verwendet
wurde, wobei die Vektoren pdC-SCA-hu-p35 und pdC-SCA-mu-p35 erhalten wurden.
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Diese
Vektoren wurden in eine Human-p40 exprimierende Zelllinie eingebracht
und in Medium, das Methotrexat (0,1 μM) enthielt, gezüchtet. Fusionsproteine
exprimierende, arzneistoffresistente Klone wurden durch ELISA-Assays
identifiziert, die für
die Spezies von p35 spezifisch sind, die in dem Konstrukt verwendet wurden
(d.h. ein IL-12-Human-p40-Antikörper
wurde für
das Einfangen des Antigens und spezifische Anti-Maus- oder -Human-p35-Antikörper wurden
für den
Nachweis verwendet). Kulturmedien von jedem Typ des Einketten-Fusionsproteins
wurden zur Bestimmung ihrer Mengen verwendet, so dass relative spezifische
Aktivitäten
berechnet werden konnten. Serielle Verdünnungen jeder Probe wurden
bezüglich
der Fähigkeit
getestet, die IFN-γ-Sekretion
zu induzieren, wie vorstehend im Beispiel 2 eingehend beschrieben.
Die Ergebnisse sind in 6 gezeigt,
die die Aktivität
von Einketten-IL-12-Fusionsproteinen, die entweder mit beiden humanen
Untereinheiten oder mit Maus-p35 und Human-p40 hergestellt wurden,
sowie die Artspezifität
der Fusionsproteine vergleicht. Die Daten zeigen, dass das Human-IL-12-Einketten-Fusionsprotein
in ihrer Fähigkeit
zur Induktion von IFN-γ genauso
wirksam ist wie die gesamten Antikörperfusionen, es aber nicht
so stark wie der Human-IL-12-Standard ist, wenn Human-PBMC verwendet
wurden (6A). Die Maus/Human-Hybridform war
etwa 50fach weniger stark als die Maus-IL-12-Kontrolle, wie mit
dem gesamten Antikörperkonstrukt
gesehen wurde (6B). 6C zeigt
einen Antigen-Bindungstest des Einketten-IL-12-Proteins. Platten wurden mit dem KS-Antigen
beschichtet, das durch den KS-1/4-Antikörper erkannt wird, und dazu
verwendet, jeglichen reaktiven Antikörper oder jegliches Antikörperfusionsprotein
einzufangen. Nach mehrmaligem Waschen wurde das gebundene Fusionsprotein
unter Verwendung eines Anti-Human-IL-12- p40-Antikörpers nachgewiesen. Die Daten
zeigen, dass die Einzketten-Fusionsproteine
an die antigenbeschichtete Platte gebunden wurden und mit einem
Antikörper-IL-12
nachgewiesen werden konnten, womit demonstriert wurde, dass die
fusionierten Moleküle
Antigenbindungsaktivität
beibehalten. Die Intensität
der Bindung war etwa 3-fach niedriger als diejenige, die mit dem
gesamten KS-1/4-Antikörper beobachtet
wird, aber dies ist aufgrund der Monovalenz des Einkettenkonstrukts
nicht unerwartet.
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Die
Aktivitätsergebnisse
mit sowohl dem gesamten Antikörper
als auch den Einketten-IL-12-Fusionsproteinen deuten darauf hin,
dass der Aminoterminus der p35-Kette zur Bindung des Rezeptors wichtig
sein könnte,
weil Fusionen die Aktivität
zu verringern scheinen. Dennoch sind die Antikörper-IL-12-Moleküle in Konzentrationen über 1 ng/ml
noch sehr starke Induktoren von IFN-γ. Es wird erwartet, dass die
Konzentration solcher Moleküle
in behandelten Tieren sowohl im Kreislauf, als auch am angesteuerten
Wirkort um mehrere Größenordnungen
höher als
diese ist.
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Ein
möglicher
Weg zur Erhöhung
der spezifischen Aktivität
von Antikörper-IL-12-Fusionsproteinen
wäre, einen
flexiblen Peptidlinker zwischen die Antikörper- und p35-Sequenzen einzufügen, so
dass sich für
die aminoterminalen Sequenzen dieser Untereinheit mehr Freiheit
ergibt. Eine Sequenz, wie der vorstehend beschriebene (Gly4Ser)3-Linker, könnte auf
diese Weise verwendet werden. Ein mögliches Problem bei diesem Ansatz
ist, dass solch ein Linker immunogen sein könnte, insbesondere wenn er
mit einem starken Immunstimulator, wie IL-12, fusioniert ist.
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Beispiel 6 Pharmakokinetische
Eigenschaften von IL-12-Fusionsproteinen
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Die
Antikörper-IL-12-Fusionsproteine
wurden bezüglich
ihres pharmakokinetischen Verhaltens nach intravenöser Injektion
in Balb/c-Mäuse
untersucht. Das Blut wurden von Mäusen durch retroorbitale Blutung gesammelt
und bei 4 °C
in Eppendorf-Mikrozentrifugationsröhrchen aufbewahrt. ELISA-Verfahren
wurden dazu verwendet, die Menge an humanem Antikörper sowie
die Menge an intaktem IL-12-Fusionsprotein, die im Blut an steigenden
Zeitpunkten verblieb, zu messen.
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Das
erste ELISA, der humanen Antikörper
misst, verwendet einen Antikörper
gegen humane H- und L-Ketten zum Einfangen und einen Anti-Human-Fc-Antikörper zum
Nachweis. Der fusionsproteinspezifische Assay verwendet den gleichen
ersten Fangschritt, aber einen Anti-p40-Untereinheit-Antikörper zum
Nachweis. Wie in 7 gezeigt, hatten sowohl der
Antikörper
als auch das IL-12-Fusionsprotein
eine verlängerte
Halbwertzeiten, aber die Halbwertzeit des Fusionsproteins war etwas
kürzer.
Dies deutet darauf hin, dass das zirkulierende Fusionsprotein mit
der Zeit gespalten wird und IL-12 freisetzt, während der Antikörper im
Kreislauf verbleibt. Früher
beschriebene Experimente mit anderen Antikörper-Cytokin-Fusionsproteinen zeigen, dass Cytokine
durch Proteasespaltung freigesetzt werden können. Siehe Gillies et al.
Bioconj. Chem. 4: 230-235 (1993). Dennoch sind die Halbwertzeiten
der Fusionsproteine wesentlich länger
als der 3 h-Wert,
der für
natives IL-12 angegeben wird. Tatsächlich ist die Serumkonzentration
nach 72 h immer noch viel höher
als das Niveau, das zur Induktion der IFN-γ Sekretion erforderlich ist.
Trincieri, Blood 84: 4008-4027 (1992).
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Beispiel 7 Behandlung
eines etablierten Kolonkarzinoms mit Antikörper-IL-12-Fusionsprotein
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Das
Kolonkarzinom CT26 der Maus ist besonders unempfindlich gegen eine
Behandlung mittels systemischer Verabreichung von Maus-IL-12 in
nichttoxischen Dosen. Martinotti et al., Eur. J. Immunol 25: 137-146
(1995). Ein wenig Wirksamkeit wurde festgestellt, wenn die systemische
Verabreichung von IL-12 zusammen mit wiederholter Impfung bestrahlter
CT26-Zellen kombiniert wurde, die so verändert waren, dass sie IL-2
sezernierten. Vagliani et al., Cancer Res. 56. 467-470 (1996). Ein
alternatives Verfahren zur erfolgreichen Therapie umfasst die Veränderung
von CT26, so dass niedrige Niveaus von IL-12 freigesetzt werden.
Dies war unwirksam, wenn die Mäuse
nicht zuerst mit Antikörpern
zur Verarmung von CD4+-Zellen behandelt
wurden, Martinotti et al., Eur. J. Immunol 25: 137-146 (1995), was
wahrscheinlich auf eine immunsuppressive Wirkung dieser Zellen,
nachdem sie den veränderten
Tumoren in vivo ausgesetzt waren, zurückzuführen ist. Noch ein anderes
Verfahren zur Veränderung
erheblich stärkerer
IL-12-Sekretoren
war weit erfolgreicher, was somit zeigt, dass die Menge an lokalem
IL-12 für
die Etablierung einer Immunantwort auf subkutane Tumoren entscheidend
war, Columbo et al. Cancer Res. 56: 2531-2534 (1996). In diesem
Fall wurde jedoch keine Behandlung etablierter, streuender Tumoren
demonstriert, die den im klinischem Rahmen beobachteten ähneln. Der Zweck
des vorliegenden Experiments war eine Abschätzung der Wirksamkeit von Antikörper-IL-12-Fusionsproteinen
zur Behandlung des Kolonkarzinoms CT26 der Maus.
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CT26-Zellen
wurden mit einer cDNA transfiziert, die das Antigen codiert, das
durch den KS-1/4-Antikörper
erkannt wird und entweder als KS-Antigen (KSA) oder epitheliales
Zelladhäsionsmolekül (EpCAM)
bezeichnet wird. Klone, die dieses Protein auf ihrer Oberfläche exprimierten,
wurden durch Immunfärbung
mit KS-1/4 und fluoreszenzaktivierte Zellsorter- (FACS-) Analyse
identifiziert. Zellen von einem Klon, der KSA stabil exprimiert,
(Klon 21.6) wurden in die Schwanzvene von Balb/c-Mäusen injiziert
(1 × 105 pro Maus). Unbehandelte Mäuse bildeten
umfangreiche Lungenmetastasen am Tag 28 und starben innerhalb von
40 Tagen nach der Beimpfung. Die Wachstumsrate war praktisch die
gleiche wie bei den Mutterzellen, was zeigte, dass die Expression
des Human-KSA keine Wirkung auf die Immunogenizität von CT26
oder die Fähigkeit
zur Bildung von Tumoren hatte.
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Die
Wirksamkeit des Antikörper-IL-12-Fusionsproteins
zur Therapie von CT26-Metastasen
wurde in diesem Mausmodell unter Verwendung der Human/Maus-Hybridform getestet,
die Wirksamkeit auf Mauszellen besitzt. Nach Tumorzellinjektion
erhielten die Mäuse
entweder Injektionen von PBS (Nichtbehandlungskontrolle), KS-1/4-IL-2-Fusionsprotein
(positive Kontrolle), KS-1/4-Antikörper mit freiem IL-2 (negative
Kontrolle) oder KS-1/4-IL-12-Fusionsprotein (Testprobe). Die Behandlung
begann am Tag 4, einem Zeitpunkt, zu dem etablierte Metastasen leicht
durch histologische Färbung
in den Lungen der Tiere nachweisbar sind, und setzte sich täglich für 5 Tage
fort. Am Tag 28 nach der Tumorzellbeimpfung wurden die Tiere getötet und
ihre Lungen bezüglich
der Anwesenheit von Tumor untersucht. Die Gewichte der Lungen wurden
ebenfalls gemessen, um die Menge an Tumormasse bezogen auf tumorfreie
Mäuse zu
bestimmen. Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 zusammengefasst. Unbehandelte
Tiere hatten eine umfangreiche metastatische Erkrankung, die durch
beinahe vollständige
Oberflächenbedeckung
des Organs mit Tumor durch Fusion einzelner metastatischer Knoten
charakterisiert war. Die Gewichte der Lungen stiegen durchschnittlich
um das Dreifache an, was zeigt, dass die Tumormassen tatsächlich den
Großteil
des Organs ausmachten. Behandelte Tiere hatten geringe, wenn überhaupt,
Anzeichen von Metastasen, wobei einige Tiere vollständig tumorfrei
waren. Keines der Tiere wies irgendein offenkundiges Zeichen von
Toxizität
während
des Behandlungsverfahrens auf. So kann, im Gegensatz zur Behandlung
mit systemischem IL-12, die Therapie mit Antikörper-IL-12-Fusionsprotein ein
etabliertes metastasierendes CT26-Kolonkarzinom bekämpfen.
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Tabelle
2 Behandlung
von Lungenmetastasen des Kolonkarzinoms der Maus bei SCID-Mäusen mit Antikörper-IL-12-Fusionsproteinen
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Experimentelle
Lungenmetastasen wurden durch intravenöse Injektion von 105 CT26-KSA-Zellen induziert. Die Behandlung
begann drei Tage später
mit intravenöser
Injektion von 10 μg
des humanisierten KS-1/4-Antikörpers
oder des angegebenen Fusionsproteins für fünf aufeinander folgende Tage.
Die Tiere wurde getötet,
und die Metastasenbewertung wurde durch das Ausmaß der Oberflächenbedeckung
ermittelt: 0 = keine sichtbaren Metastasenfoci; 1 = weniger als
5 % der Oberfläche
bedeckt; 2 = 5 bis 50 % der Oberfläche bedeckt; und 3 = mehr als
50 % der Lungenoberfläche
ist mit Metastasenfoci bedeckt.
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Beispiel 8 IL-12-Fusionsproteine
als Impfstoffe
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Das
humanisierte KS-1/4-Antikörper-IL-12-Fusionsprotein
in PBS-Puffer, das mit der Maus-p35-Untereinheit hergestellt wurde
(HuKS-1/4-mIL-12), wurde in Balb/c-Mäuse intravenös injiziert
(5 μg/Tag × 5). Kontrollmäuse erhielten
den gleichen Antikörper
in den gleichen Mengen, aber ohne gebundenes IL-12. Die Injektionslösung enthielt
ferner keinerlei An von Adjuvans. Am Tag 10 wurden Blutproben durch
retroorbitale Blutung in Mikrozentrifugenröhrchen gesammelt, und das Plasma
wurde durch Sammeln der Blutproben in Plastikröhrchen herge stellt, die Natriumcitrat
enthielten, gefolgt von Zentrifugation bei höchster Geschwindigkeit in einer
Eppendorf-Tischmikrozentrifuge. ELISA-Platten (96 Vertiefungen)
wurden mit Hu-KS-1/4-Protein beschichtet, das die humane konstante
Region enthält,
und zum Einfangen aller Mausantikörper, die als Antwort auf die
Immunisierung hergestellt wurden, verwendet. Nach Abwaschen von
ungebundenem Material wurden die gebundenen Mausantikörper mit
an Meerrettichperoxidase gekoppelten Ziege-Anti-Maus-Fc-Antikörper (Jackson
Immuno-Research)
nachgewiesen. Alle gebundenen Antikörper konnten entweder zu den
humanen konstanten Regionen oder der variablen Region gerichtet
werden, die Hu-KS-1/4 und den Fusionsproteinen gemeinsam sind.
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Wie
in 8 gezeigt, gab es geringfügige oder
keine Reaktivität
mit Hu-KS-1/4 ohne fusioniertes IL-12. Das Fusionsprotein induzierte
andererseits eine starke Antikörperantwort
in Abwesenheit exogener Adjuvantien und ungeachtet der Tatsache,
dass der intravenöse
Verabreichungsweg zur Induktion solcher Antworten verglichen mit
subkutaner oder intraperitonealer Verabreichung höchst ungünstig ist.
Antikörper
des IgG2a-Isotyps, die für
durch IL-12 verstärkte
Antworten typisch sind, wurden in der Gruppe, der Antikörper-IL-12
injiziert wurde, aber nicht in der Gruppe beobachtet, der Hu-KS-1/4-Antikörper injiziert
wurde.
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Die
Immunogenität
von auf verschiedenen Wegen verabreichten I1-12-Fusionsproteinen
wird durch Injizieren einer Lösung
des Fusionsproteins (wie des vorstehend beschriebenen) in PBS oder
anderem biologisch verträglichen
Puffer oder einem bekannten Adjuvans, wie unvollständigem oder
vollständigem
Freundschen Adjuvans, getestet. Zum Beispiel können einzelne oder mehrere
subkutane, intradermale oder intraperitoneale Injektionen alle zwei
Wochen gegeben werden. Alternativ kann das Fusionsprotein zuerst
durch subkutane Injektion und anschließend durch intraperitoneale
Injektion verabreicht werden. Freundsches Adjuvans kann aufgrund
von Reizungen an der Injektionsstelle nicht bei Menschen verwendet
werden. Alternative Adjuvantien, wie Niederschläge von Aluminiumhydroxid (Alum),
sind für
die Verwendung bei Menschen zugelassen und können erfindungsgemäß verwendet
werden. Neue organisch-chemische Adjuvantien, die auf Squalenen oder
Lipiden beruhen, können
ebenfalls für
Injektionen in die Haut verwendet werden.
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