DE69824853T2

DE69824853T2 - Zusammensetzung und Gegenstände zur Verminderung der Auswirkung von Entzündungen

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Publication number: DE69824853T2
Application number: DE69824853T
Authority: DE
Inventors: C. William STEWART; Mario Fsadni; M. Anna RICHTER; G. Julia LEVY; A. Claude HARITON; Gustav Huber; Modestus Obochi
Original assignee: University of British Columbia; QLT Inc; Quadra Logic Technologies Inc; Novartis AG
Current assignee: University of British Columbia; Novelion Therapeutics Inc; Novartis AG
Priority date: 1997-02-11
Filing date: 1998-01-14
Publication date: 2006-01-12
Anticipated expiration: 2018-01-15
Also published as: NZ337077A; ES2224355T3; HK1028190A1; US20020103180A1; US6677366B2; JP4012575B2; JP2005272464A; JP2002509531A; CN1269729A; EP0996465A1; AU734366B2; CZ282299A3; NO993841L; NO327175B1; AU5777298A; WO1998034644A1; CA2279427C; CN1187089C; NO993841D0; ATE270114T1

Description

FACHGEBIET
Diese Erfindung betrifft allgemein das Gebiet der Pharmakotherapeutika und der Anwendung der photodynamischen Therapie ("PDT") zur Verminderung oder Verhütung von Entzündungen an einem beschädigten Gewebe sowohl durch Intestinalverletzungen, zum Beispiel bei operativen Eingriffen, als auch durch Unfallverletzungen, zum Beispiel Hautschnitte, Verletzungen der Gelenke und Sehnen und die Behandlung von Brandopfern. Bei einer bevorzugten Ausführungsform betrifft die Erfindung die Anwendung einer "Niedrigdosis"-PDT zur Behandlung von Augengewebe, bei dem die Entzündung aufgrund der Manipulation des Augengewebes entstanden ist, insbesondere, wenn die Entzündung einen komplizierenden Faktor in der Genesung des Patienten von einer erforderlichen Maßnahme darstellt. Zu den üblichen Anwendungen zählen solche bei entzündlichen Augenerkrankungen und verschiedenen Arten von augenchirurgischen oder Laserbehandlungen, wie etwa einer Transplantation oder der herkömmlichenrweise zur Behandlung von Glaukom eingesetzten Filtrationschirurgie am Auge. Bei einer besonders bevorzugten Ausführungsform betrifft die Erfindung die Verlängerung der Fortbestandsdauer der Filtrationsblase zur Verbesserung des Ergebnisses der Filtrationschirurgie.
HINTERGRUND
Entzündungen im allgemeinen
Die allgemein mit einer Entzündung verbundenen vier Hauptanzeichen sind: (1) Rötung, (2) Schwellung, (3) Wärmegefühl und (4) Schmerz, wobei ein optionales fünftes Hauptanzeichen der Verlust der Funktion des betroffenen Körperteils ist. Während eine Verletzung eine komplexe Reihe von Ereignissen auslöst, von denen viele gleichzeitig auftreten und in vielfältiger Weise miteinander in Beziehung stehen, ist bekannt, dass kleine Blutgefäße in bedeutsamer Weise an der Auslösung der Entzündung teilhaben. Tatsächlich stellt eine Entzündung einen der wertvollen Abwehrmechanismen des Körpers dar und wird generell als dreiphasig verstanden: die degenerative Phase, die vaskuläre Phase und die Heilungsphase. Siehe Klein, "Defense Reactions in Action", Immunology, The Science of Self-Nonself Discrimination, Kapitel 14, 577–84 (1982).
Spezifisch beginnen in der degenerativen Phase die betroffenen Zellen, insbesondere epidermale Zellen und Fibroblasten, zu schwellen, wobei ihre Zytoplasmen vakuolisiert und ihre Kerne größer werden und fragmentieren. Ein Teil der Blutplättchen in den beschädigten Blutgefäßen zersetzt sich und setzt Serotonin und andere Mediatoren frei, die auf die sympathetischen Nervenendigungen wirken.
Die vaskuläre Phase ist durch Veränderungen in den Blutgefäßen, eine umfangreiche Wanderung und Aktivität der sogenannten entzündlichen Zellen (Granulozyten – insbesondere Neutrophile, Lymphozyten, Monozyten und Makrophagen) und die Beseitigung degenerierter Zellen und Zelltrümmer gekennzeichnet. Das kapilläre Netzwerk und die postkapillären Venulen werden bei der aktiven Hyperämie von Blut überflutet, gestaut und prall überfüllt. Da sich die Zahl der Kapillaren ebenfalls vermehrt, ist ein rötliches Erscheinungsbild des entzündeten Gewebes, manchmal als "Flamme" bezeichnet, zu beobachten. Der verstärkte Blutstrom bewirkt auch, dass sich die Temperatur der entzündeten Fläche dem wärmeren Aortablut, verglichen zum umgebenden normalen Gewebe, annähert, was eine Hitzeempfindung erzeugt.
Auf eine Verletzung hin setzt das beschädigte Gewebe Substanzen frei, die als mit Histamin verwandt bekannt sind und als H-Substanzen bezeichnet werden, einem Gemisch aus Histamin und Serotonin, das aus zerbrochenen Gewebe-Mastztellen freigesetzt wird. Die H-Substanzen bewirken eine aktive Erweiterung der Blutgefäße, wobei sich die Endothelzellen des erweiterten Gefäßes voneinander trennen, was zu einer Vergrößerung der Abstände zwischen ihnen führt. Die Endothelauskleidung der Blutgefäße wird zunehmend mit Leukozyten ausgepflastert, was einen Teil der Flüssigkeit in das umgebende Gewebe hinausdrängt. Die proteinreiche Flüssigkeit, die aus dem Gefäß in das umgebende Gewebe austritt, bewirkt eine Gewebeschwellung.
Die entweichende Flüssigkeit enthält auch Substanzen, die bakterielle Toxine neutralisieren und die Zerstörung des die Entzündung verursachenden Agens unterstützen.
Die Leukozyten, insbesondere Neutrophilen und Monozyten, wandern auf der Blutgefäßwand herum, bis sie eine geeignete Lücke finden, durch die sie in die perivaskulären Strukturen und Geweberäume austreten können. Die Leukozyten greifen die toten und absterbenden Zellen an, verdauen sie intrazellulär durch Phagozytose oder extrazellulär durch proteolytische Enzyme, die von ihren Lysosomen freigesetzt werden, wenn sie selbst absterben. Die Anreize für die Leukozytenemigration werden als vom verletzten Gewebe in Form von chemotaktischen Faktoren ausgehend erachtet.
Bei den Blutplättchen handelt es sich um einen anderen Zelltyp, der durch eine Gewebsverletzungen tiefgreifend betroffen ist. Kurz nach der Verletzung heften sich die Blutplättchen einzeln oder in Klümpchen an die Gefäßwände. Gleichzeitig beginnen Fibrinfasern aufzutreten und ein feines Netz zu bilden, das beim Einfangen von Zellen hilft. Der resultierende Klumpen zieht die Kanten des zerrissenen Gewebes zusammen.
Der intra- und extrazelluläre Verdau von nekrotischem Gewebe durch Neutrophile und Monozyten erzeugt eine Flüssigkeit, die sich mit dem aus den Blutgefäßen ausgestoßenen serösen Material verbindet. Bildet sich ein Abszeß, so wird die Höhle durch eine pyrogene Membran ausgekleidet, die bei mit Bakterien infizierten Wunden die Streuung und Vervielfachung der pathogenen Mikroorganismen in das Blut verhindert.
In den ersten beiden Phasen des entzündlichen Prozesses wird der Fremdkörper entweder zerstört, zum Beispiel dann, wenn der Fremdkörper ein Organismus ist, oder das ihn umgebende Gewebe abgelöst, zum Beispiel wenn er ein Splitter ist. In der Heilungsphase beginnt die Entzündung abzuklingen, wobei einzelne Blutgefäße und Gefäßstrukturen sich wieder normalisieren und die Wundreparatur einsetzt. Die drei Hauptereignisse im Reparaturprozess sind (1) Bildung von neuem Bindegewebe durch proliferative Fibroblasten; (2) Regeneration des Epithels, und (3) Auswachsen neuer Kapillaren.
Noch vor dem Abklingen der Entzündung beginnen Fibroblasten, aus dem umgebenden normalen Gewebe in die verletzte Fläche zu wandern, wo sie gewöhnlich in einem ruhenden Zustand existieren. Sie wandern mittels einer amöboiden Bewegung an Fibrinsträngen entlang und verteilen sich über die gesamte Heilungsfläche. Einmal im verletzten Gewebe in einer Position fixiert, beginnen sie mit der Collagensynthese und Sekretion dieses Proteins, das sich selbst zu Fasern anordnet. Die Fasern orientieren sich mit ihren Längsachsen in Richtung des größten Drucks. Mit zunehmender Festigkeit der Collagenbündel zersetzen sich die Fibroblasten nach und nach und heften sich dicht an die Bündel, und die verletzte Fläche verwandelt sich zu Narbengewebe.
Zeitgleich mit der Bildung des Narbengewebes beginnen sich die intakten epidermalen Zellen am Wundrand zu vermehren und bewegen sich als eine Platte zum Mittelpunkt der verletzten Fläche. Mit dem Abklingen der Entzündung erwächst ein Bedarf an einer direkten Blutzufuhr, und neue Gefäße beginnen in die Wunde hineinzuwachsen.
Es ist bekannt, dass bei Betrachtung einer Entzündung auf molekularer Basis eine Anzahl aktiver Verbindungen in einer komplexen Weise miteinander wechselwirkt. Unter den durch Verletzung beschädigten Zellen befinden sich Mastzellen, die Mediatoren freisetzen, die eine Frühphase einer Gefäßenweiterung auslösen, begleitet von der Abtrennung von Endothelzellen und Freilegung der Collagenfasern in der subendothelialen Schicht. Fasern in den interzellulären Lücken, die sich bei Blutgefäßen bilden, fangen Blutplättchen ein und lösen die Freisetzung der Mediatoren aus diesen Zellen aus.
Über die Blutplättchen hinaus wechselwirken die freigelegten Collagenfasern auch mit Proteinen des Plasmas, die durch die Poren der erweiterten Gefäßwand einsickern, einschließlich des auslösenden Faktors der Blutgerinnungs-Kaskade. Diese Proteine initiieren auch die Kinin-Bradykinin-Kaskade, wobei Bradykinin erzeugt wird, welches an der Gefäßerweiterung, der zunehmenden Durchlässigkeit des Blutgefäßes und der Chemotaxie beteiligt ist.
Ein viertes Molekularsystem, die Komplement-Kaskade, kann durch mehrere Reize aktiviert werden: die verletzten Blutgefäße, die proteolytischen Enzyme, die durch die beschädigten Zellen freigesetzt werden, die Membrankomponenten jeglicher beteiligter Bakterien und Antigen-Antikörper-Komplexe. Einige der aktivierten Komplement-Komponenten wirken als chemotaktische Faktoren, die für das Einströmen von Leukozyten in die entzündete Fläche verantwortlich sind. Andere erleichtern die Phagozytose und sind an der Zelllyse beteiligt.
Augenentzündung
Bei Glaukom handelt es sich um eine Erkrankung des Auges, bei der ein hoher Augeninnendruck eine Schädigung des Sehvermögens bei einem Individuum bewirkt. In einem gesunden Auge wird durch die Epithelzellen des Ziliarkörpers, der um den Innenumfang der Iris (zur Innenseite des Augapfels hin) lokalisiert ist, eine Flüssigkeit erzeugt. Zu den Funktionen dieser Flüssigkeit zählen die Ernährung der Zellen im Auge und die Aufrechterhaltung eines positiven Drucks innerhalb des Augapfels, der erforderlich ist, um die korrekte Raumverteilung der zur Bilderzeugung erforderlichen Sehapparatteile, ähnlich der Trägerstruktur eines Kamerakörpers in einem Fotoapparat, aufrechtzuerhalten.
Die Flüssigkeit wird normalerweise durch Filtration durch das Trabekelmaschenwerk, einem zirkulären Körper, der kreisförmig im Winkel zwischen der Iris und der Hornhaut im vorderen Abschnitt des Auges platziert ist, aus dem Auge entfernt. Die Flüssigkeit dringt typischerweise durch mikroskopisch große Löcher im Trabekelmaschenwerk in den Schlemm-Kanal und dann durch Verbindungskanäle, die die Flüssigkeit in die Episkleralvenen und aus dem Auge heraus führen. In der Pathologie des Glaukoms ist der Abfluss der Flüssigkeit aus dem Auge vermindert, was zu einem scharfen Anstieg des Augeninnendrucks, einer Beschädigung der inneren Augengewebe und schließlich zum vollständigen Verlust des Sehvermögens führt.
Das therapeutische Ziel bei der Behandlung von Glaukom ist immer dasselbe, d.h. die Senkung des Augeninnendrucks entweder durch Herabsetzung der Flüssigkeitsproduktion oder durch Erhöhung des Abflusses oder der "Filtration" der Flüssigkeit aus dem Auge heraus. Zwar gibt es verschiedene Methoden zur Erreichung dieses Ziels, doch wird zunächst immer der medikamentöse Weg versucht. Ist die Medikation in der Kontrolle des erhöhten Augeninnendrucks nicht erfolgreich, so werden andere, invasivere Techniken angewendet, wie etwa eine Laserbehandlung oder eine operative Intervention.
Zu den Laserverfahren zählen die Trabekuloplastie, bei der der Laser zum Brennen von Löchern in das Trabekelmaschenwerk eingesetzt wird. Zu den operativen Techniken zählen (1) eine Trabekulotomie, bei der eine Metallsonde oder "Trabekulotom" zur Erwreiterung der Öffnung zwischen dem Schlemm-Kanal und der Vorderkammer des Auges um etwa ein Drittel des Umfangs des normalen Abflusswinkels eingesetzt wird; (2) eine Trabekulektomie, die das Schneiden durch das Trabekelmaschenwerk einbezieht; und (3) eine Iridektomie, die das Ausschneiden von Teilen der Iris betrifft. Eine Sklerostomie involviert das Schneiden durch die Lederhaut entweder mit einem Laser oder einem chirurgischen Instrument. Trabekulektomie, Iridektomie und Sklerostomie sind alle mit der Bildung einer Filtrations-"Blase" verbunden, einer kleinen Blase, in die überschüssige Augenflüssigkeit abgezweigt wird, um dadurch den Abfluss aus dem Auge zu fördern.
Eine Glaukom-Filtrationschirurgie wird gewöhnlich für Patienten empfohlen, die eine progressive glaukomatöse Schädigung aufweisen, und für Patienten, die bei ihrer derzeitigen Höhe des Augendrucks einem signifikanten Risiko von Fortschreiten der Erkrankung ausgesetzt sind. Bei Patienten mit einer schweren Schädigung ist die Langzeit-Prognose besser, wenn der Augeninnendruck ("IOD") auf weniger als 20 mm Hg vermindert und auf dieser Höhe gehalten werden kann. Daher wird gewöhnlich bei Patienten mit fortgeschrittener Schädigung und Augendrücken von über 18 – 20 mm Hg eine Filtrationschirurgie stark empfohlen.
Die Operation fällt allgemein in eine von zwei Kategorien: (1) Vollhaut-Verfahren oder (2) „Guarded Fistula"-Verfahren. Das grundlegendere „Guarded Fistula"-Verfahren beinhaltet typischerweise die folgenden Trabekulektomie-Schritte:

a. Zurückziehen des Augenlids;
b. Durchdringen des Limbus (ein durchscheinendes Gewebe, welches den Übergang zwischen der trüben Lederhaut und der klaren Hornhaut des Auges darstellt), um eine Öffnung in die vordere Augenkammer (begrenzt durch die farbige Iris und die klare Hornhaut, die die Iris bedeckt) von der Außenseite des Vorderabschnitts des Auges zu schaffen;
c. an einem Punkt unterhalb der Iris, Zurückziehen der Außenschichten der Bindehaut und Schneiden eines dreieckigen Lederhautlappens, wobei die Basis des Dreiecks am Limbus sitzt;
d. Eindringen in die vordere Augenkammer von der Basis des dreieckigen Lederhautlappens aus;
e. Ausschneiden eines Abschnitts des darunterliegenden Trabekelmaschenwerks zum Bilden einer Fistel oder eines Verbindungskanals;
f. Ausschneiden eines kleinen Teils der Iris durch die Fistel;
g. Schließen des Lederhautlappens durch Nahtstiche;
h. Zunähen der Bindehaut; und
i. Einspritzen einer physiologisch geeigneten Flüssigkeit, z.B. einer basischen Salzlösung ("BSS"), in die vordere Augenkammer durch die den Limbus durchdringende äußere Öffnung, die in Schritt b vorgenommen wurde, um die entlang des Limbus gebildete Blase zu heben und so zu bestätigen, dass die Fistel nicht blockiert ist, und um zu bestätigen, dass keine Sickerlöcher in der Blase vorhanden sind.

Das Vollhaut-Verfahren weicht darin ab, dass eine direkte Öffnung, ohne den Lederhautlappen, zur Verbindung der vorderen Augenkammer mit dem unter der Bindehaut liegenden Raum durch den Limbus geschaffen wird. Nachdem die äußeren Schichten der Bindehaut zurückgezogen wurden, wird die Fistel durch Sklerektomie (Schneiden einer Gewebelippe aus der Lederhaut am Limbus), thermische Sklerostomie (Schneiden einer flachen Furche in die Lederhaut parallel zur Limbusoberfläche), Lasersklerostomie oder Trephination geschaffen. Stewart, "Filtering Surgery – Techniques and Operative Complications", Clinical Practice of Glaucoma, Kapitel 10, 333–61 (1990).
Im Anschluss an die Operation wird der Zustand der Filtrationsblase auf einer regelmäßigen Basis sorgfältig überprüft. Anfänglich ist die Blase gewöhnlich gut von der Lederhaut abgehoben. Bei vielen Augen zeigt sich ein beginnender Bereich von Avaskularität in der Bindehaut am ersten postoperativen Tag, gewöhnlich um die Stelle der Fistel. Der avaskuläre Bereich wird duch Feststellen eines lokalisierten Verlusts von Kapillaren und Venulen identifiziert. Bei Untersuchung der vorderen Augenkammer kann eine Rötung oder Flamme von geringem Umfang vorhanden sein, was auf eine Entzündung hinweist. Der IOD in der ersten postoperativen Woche beträgt gewöhnlich weniger als 5 mm Hg, obschon er auch im Bereich von 6 – 10 mm Hg liegen kann. Nach der anfänglichen Untersuchung wird der Patient gewöhnlich auf eine Antibiotikum-Steroid-Kombination gesetzt. Stewart, "Postoperative Complications of Filtering Surgery", Clinical Practice of Glaucoma, Kapitel 11, 363–90 (1990).
In der zweiten bis vierten postoperativen Woche nimmt die Entzündung der Bindehaut und der Blase ab und beruhigt sich die vordere Augenkammer mit abklingendem Umfang der Rötung. Auch wird die Blase als Folge der Narbenbildung gewöhnlich ein wenig kleiner. Außerdem zeigt die Blase im allgemeinen weiterhin einen avaskulären Bereich, der an Größe zunehmen kann. Der IOD in der zweiten bis vierten postoperativen Woche steigt gewöhnlich auf 10 mm Hg oder mehr. Stewart, " Postoperative Complications of Filtering Surgery", Clinical Practice of Glaucoma, Kapitel 11, 363–90 (1990).
Nach vier Wochen eines unkomplizierten postoperativen Verlaufs weist die Bindehaut gewöhnlich wenig oder keine Entzündung auf. Die wohlfunktionierende Blase behält typischerweise einen avaskulären Bereich bei und kann entweder minimal oder deutlich von der Lederhaut abgehoben sein. Außerdem sollte sich der IOD während dieser Periode idealerweise bei 10 bis 15 mm Hg stabilisieren. Topische postoperative Steroide werden entsprechend des Umfangs der Entzündung in der Filtrationsblase und der vorderen Augenkammer langsam herabgesetzt. Bleibt die Blase vaskulär und entzündet, so werden die Steroide gewöhnlich beibehalten und manchmal sogar erhöht, um die Rückbildung der Entzündung in einem vorderen Augensegment zu beschleunigen und dadurch die Narbenbildung einzuschränken. Stewart, "Postoperative Complications of Filtering Surgery", Clinical Practice of Glaucoma, Kapitel 11, 363–90 (1990).
Ungünstigerweise kann während der frühen postoperativen Periode nach der Filtrationschirurgie ein Patient eine Vielfalt verschiedener Komplikationen erleiden, von denen eine ein Blasenversagen ist. Bei vielen Patienten tritt das Blasenversagen nach ein bis sechs Monaten postoperativ auf, wobei die Blase schließlich den Augendruck nicht mehr kontrollieren kann. Klinisch gesehen sind Filtrationsblasen, die schlecht funktionieren, gewöhnlich von geringer Breite, schlecht angehoben und sind zumindest teilweise vaskularisiert, weshalb der IOD wiederum über den Normalbereich hinaus ansteigt. Stewart, "Postoperative Complications of Filtering Surgery", Clinical Practice of Glaucoma, Kapitel 11, 363–90 (1990).
Der Erfolg der Filtrationschirurgie hängt davon ab, wie lange nach der Operation die Blase funktional bleibt. Patienten entwickeln typischerweise ein Blasenversagen entweder durch eine Blockade an der Stelle der Fistel oder durch eine Vernarbung an der Grenzfläche zwischen der Bindehaut und der Lederhaut. Ist die Stelle der Fistel blockiert, so kann eine von mehreren Lasertherapie-Techniken oder herkömmlichen operativen Techniken angewendet werden. Unglücklicherweise kann jedoch selbst dann, wenn die Fistel in dieser Weise geöffnet wird, der wässrige Abfluss aufgrund einer zuvorigen Blasenverwachsung an die Lederhaut beschränkt sein. Versagen diese Verfahren und ist der IOD des Patienten bei maximaler medikamentöser Therapie unkontrolliert, so kann die Durchführung eines weiteren Filtrationsverfahrens an einer unterschiedlichen Stelle erforderlich sein. Bleibt die Fistel geöffnet, doch ist die Blase klein, so resultiert der erhöhte IOD möglicherweise aus der Vernarbung zwischen der Bindehaut und der Lederhaut, was der häufigste Grund des Blasenversagens bleibt. Stewart, "Postoperative Complications of Filtering Surgery", Clinical Practice of Glaucoma, Kapitel 11, 363–90 (1990).
Die Manipulation der Augengewebe, insbesondere der Bindehaut, bei der Filtrationschirurgie führt notwendigerweise zu Entzündung und schließlich Vernarbung. Allgemein gilt, je mehr Manipulation, um so kürzer die Fortbestandsdauer der Blase. Da eine Filtrationschirurgie bei Patienten mit hohem Glaukomrisiko oftmals zu Versagen als Folge einer postoperativen Vernarbung führt, scheinen Fibroblasten eine entscheidende Rolle bei diesem Prozess zu spielen. Katz et al., "Mitomycin C versus 5-Fluorouracil in High-Risk Glauoma Filtering Surgery", Ophthalmology, 102:9, 1263–68 (1995). Einer der Hauptgründe für das Versagen der Glaukom-Filtrationschirurgie ist das Vorhandensein von Fibroblasten im Subkonjunktivagewebe (Berlin et al., "The Role of Laser Sclerostomy in Glaucoma Surgery", Current Opinion in Ophthalmology 6:102–114 (1995)), und schlägt die Operation fehl, so liegt dies gewöhnlich daran, dass eine Fibroblastenwucherung und Vernarbung an der Filtrationsstelle stattgefunden hat (Mora et al., "Trabeculectomy with Intraoperative Sponge 5-Fluorouracil", Ophthalmology, 103:963–70 (1996)).
Bei sogenannten "Hochrisiko"-Patienten, bei denen ein hohes prozentuales Blasenversagen aufgrund von Fibrose auftritt, ist manchmal eine begleitende Behandlung zur Operation zur Verlängerung der Fortbestandsrate der Filtrationsblase hilfreich. Es wurden viele Techniken zur Verminderung der Entzündung und Narbenbildung entwickelt, wodurch die Funktion der bei der Filtrationschirurgie geschaffenen Filtrationsblase verlängert wird, wie z.B. einfache Digitalmassage des Auges auf einer periodischen Basis für etwa vier Wochen nach der Operation.
Pharmakologische Techniken zur Begrenzung der Narbenbildung durch Hemmung der Entzündungsreaktion und Verhinderung der Bildung von Collagen bei spezifischen Stufen entlang seines Syntheseweges wurden ebenfalls ausprobiert. Oftmals werden Corticosteroide entweder topisch als Tropfen oder subkonjunktival injiziert angewendet, um das Verhindern der Vernarbung der Blase durch Hemmen der Entzündungsreaktion und Fibroblastenwucherung zu unterstützen. Stewart, "Filtering Surgery – Techniques and Operative Complications", Clinical Practice of Glaucoma, Kapitel 10, 333–61 (1990). Üblicherweise werden topische Steroide zur Minimierung der Narbenbildung solange fortgesetzt, bis die Entzündung des vorderen Augensegments sich zurückgebildet hat. Stewart, "Postoperative Complications of Filtering Surgery", Clinical Practice of Glaucoma, Kapitel 11, 363–90 (1990). Ein typisches Behandlungsprogramm kann die postoperative topische Anwendung alle drei Stunden bei schnellem Absetzen über etwa 20 Tage indizieren. Araujo et al., "A Ten-Year Follow-up on a Prospective, Randomized Trial of Postoperative Corticosteroids after Trabeculectomy", Ophthalmology 102:1753–99 (1995).
Bei 5-Fluoruracil ("5-FU") handelt es sich um ein fluoriertes Pyrimidin-Analogon mit antimetabolischer Aktivität (ein kompetitiver Inhibitor der Thymidylatsynthase), welches ebenfalls eine antifibrotische Wirkung durch Verminderung der Fibroblastenwucherung ausübt und so die Vernarbung der Filtrationsblase verhindert. Typischerweise wurde 5-FU in Fällen mit schlechten chirurgischen Prognosen verwendet. Nach dem Zwei-Jahres-Zeitpunkt hat 5-FU eine Erfolgsrate bei der Filtrationschirurgie von zwischen 60 und 70 % gezeigt. 5-FU wird gewöhnlich durch eine Reihe subkonjunktivaler Injektionen verabreicht.
Über die Unbequemlichkeit und das Unbehagen durch häufige und wiederholte postoperative Injektionen hinaus wurde von einer Reihe ernsthafter Komplikationen mit subkonjunktivalem 5-FU berichtet, einschließlich epithelialer Defekte, subepithelialer Vernarbung, Hornhautgeschwürbildung, konjunktivalem Wundaussickern, Blasenlöchern, suprachoroidaler Einblutung, Retinaablösung und Endophthalmitis. Obschon 5-FU die Blasenhaltbarkeit verlängern kann, ist daher das Auftreten von Hornhautepithel-Defekten, Vernarbung und Vaskularisierung aufgrund der generellen Toxizität dieses Mittels ebenfalls hoch. Stewart, "Filtering Surgery – Techniques and Operative Complications", Clinical Practice of Glaucoma, Kapitel 10, 333–61 (1990). Siehe auch Khaw et al., "Five-minute Treatments with Fluorouracil, Floxuridine, and Mitomycin Have Long-term Effects on Human Tenon's Capsule Fibroblasts", Arch. Ophthalmol., 110:1150–54 (1992); Kupin et al., "Adjunctive Mitomycin C in Primary Trabeculectomy in Phakic Eyes", Am. J. of Ophthalmology, 119:30–39 (1995); und Katz et al., "Mitomycin C versus 5-Fluorouracil in High-risk Glaucoma Filtering Surgery", Ophthalmology, 102:9, 1263–69 (1995). Siehe auch Kay et al., "Delivery of Antifibroblast Agents as Adjuncts to Filtration Surgery-Part II: Delivery of 5-Fluorouracil and Bleomycin in a Collagen Implant: Pilot Study in the Rabbit", Ophthalmic Surg., 17:796–801 (1986); und Khaw et al., "Effects of Inoperative 5-Fluorouracil or Mitomycin C on Glaucoma Filtration Surgery in the Rabbit", Ophthalmology, 100:367–72 (1993).
Einige Autoren haben berichtet, dass ein Hornhautödem aufgrund von versehentlicher intraokularer Exposition durch Verwendung einer niedrigeren Konzentration, z.B. 0,5 ml an 10 mg/ml 5-FU in den üblichen subkonjunktivalen Injektionen verhindert werden konnte. Chalfin et al., "Corneal Endothelial Toxic Effect Secondary to Fluorouracil Needle Bleb Revision", Arch. Ophthalmol., 113:1093–94 (1993). Andere haben angemerkt, dass die Verwendung von 5-FU durch intraoperative Verabreichung unter Verwendung eines mit 50 mg/ml der Verbindung getränkten Tupfers und Belassen des Tupfers in Kontakt mit der Blasenstelle für einen kurzen Zeitraum sicherer und wirksamer gemacht werden kann. Mora et al., "Trabeculectomy with Intraoperative Sponge 5-Fluorouracil", Ophthalmology, 103:963–970 (1996). Allerdings sind selbst dann ergänzende postoperative Injektionen in einigen Fällen erforderlich, wobei die Injektionen nach wie vor mit einem unerwünscht hohen Vorkommen von Hornhautepithel-Schädigung verbunden sind.
Der Desoxyribose-Zucker von Fluoruracil, Floxuridin, ist etwa 100-mal wirksamer als Fluoruracil in der langfristigen Hemmung von okularen Fibroblasten, und kann so als eine Einzeldosis verabreicht werden. Allerdings ist der Grad zwischen der Bewirkung von Zelltod anstelle der Hemmung relativ schmal. Daher unterliegt die Verwendung von Floxuridin der Gefahr, dass gesunde Gewebe relativ hohen Dosen potentiell zytotoxischer Materialien ausgesetzt werden. Khaw et al., "Five-minute Treatments with Fluorouracil, Floxuridine, and Mitomycin Have Long-term Effects on Human Tenon's Capsule Fibroblasts", Arch. Ophthalmol., 110:1150–54 (1992).
Ähnliche Wirkungen wurden mit Mitomycin oder Mitomycin C ("MMC") festgestellt. Da es viel wirksamer als 5-FU ist, kann MMC auch in einer einzelnen intraoperativen Anwendung, typischerweise bei einer Kontaktzeit von etwa ein bis fünf Minuten, gefolgt von ausgiebiger Spülung, verabreicht werden. Bei MMC handelt es sich um ein alkylierendes antiproliferatives Mittel, das aus dem Fermentationsfiltrat einer bestimmten Spezies von Streptomyces isoliert wird. Es handelt sich um ein antifibrotisches, antineoplastisches Antibiotikum, das die Vernarbung von Filtrationsblasen durch Hemmen der Vermehrung von Fibroblasten verhindert. Es vermindert gewöhnlich wirksam eine postoperative subkonjunktivale Fibrose und zeigt daher eine verlängernde Wirkung auf die Fortbestandsdauer von Filtrationsblasen und senkt den IOD.
Allerdings ist MMC bei hohen Konzentrationen auch zellzerstörend und erzeugt eine unerwünschte okulare Hypotonie (IOD kleiner 5 oder 6 mm Hg) bei sogar einem Drittel der damit behandelten Patienten. Andere unerwünschte Nebenwirkungen umfassen konjunktivales Wundaussickern, choroidale Ablösungen und hypotonische Makulopathie bei einer Wahrscheinlichkeit spät eintretender Blasenlöcher von etwa 25 %. Siehe Khaw et al., "Five-minute Treatments with Fluorouracil, Floxuridine, and Mitomycin Have Long-term Effects on Human Tenon's Capsule Fibroblasts", Arch. Ophthalmol., 110:1150–54 (1992); Zacharia et al., "Ocular Hypotony after Trabeculectomy with Mitomycin C", Am. J. of Ophthalmology, 116:314–25 (1993); Kupin et al., "Adjunctive Mitomycin C in Primary Trabeculectomy in Phakic Eyes", Am. J. of Ophthalmology, 119:30–39 (1995); Katz et al., "Mitomycin C versus 5-Fluorouracil in High-risk Glaucoma Filtering Surgery", Ophthalmology, 102:9, 1263–69 (1995); Shin et al., "Adjunctive Subconjunctival Mitomycin C in Glaucoma Triple Procedure", Ophthalmology, 102:10, 1550–58 (1995); Nouri- Mahdavi et al., "Outcomes of Trabeculectomy for Primary Open-angle Glaucoma", Ophthalmology, 102:12, 1760–69 (1995); und Mora et al., "Trabeculectomy with Intraoperative Sponge 5-Fluorouracil", Ophthalmology, 103:963–70 (1996). Eine Gruppe von Forschern berichtete sogar von einem erhöhten Vorkommen von Skleritis bei starken Schmerzen und Rötung der Lederhaut im Anschluss an die topische Behandlung mit MMC während der Trabekulektomie. Fourman, "Scleritis after Glaucoma Filtering Surgery with Mitomycin C", Ophthalmology, 102:10, 1569–71 (1995). Siehe auch Liang et al., "Comparison of Mitomycin C and 5-Fluorouracil on Filtration Surgery Success in Rabbit Eyes", J. Glaucoma, 1:87–93 (1992).
Andere Wissenschaftler berichteten von der Anwendung der Lasersklerostomie in Verbindung entweder mit 5-FU oder MMC. Während die Anwendung von nach der Laserbehandlung über einen Zeitraum von zwei Wochen verabreichtem 5-FU als Erfolg beschrieben wurde von Berlin et al., "The Role of Laser Sclerostomy in Glaucoma Surgery", Current Opinion in Ophthalmology 6:11, 102–114 (1995), wurde vorgeschlagen, dass die Anwendung von MMC, wie über eine Reihe unterschiedlicher Kanäle verabreicht (subkonjunktivale Injektion, subkonjunktivaler Gelschaum, topische Tropfen oder durch absorbierende Tupfer), in Verbindung mit einer Laserbehandlung sogar noch wirksamer sein könnte. Die üblichen Komplikationen wurden jedoch ebenfalls festgestellt, d.h. Hornhauttoxizität, Wundaussickern, chronische Hpyotonie, choroidale Ablösung und hypotonische Makulopathie.
Beta-Aminopropionitrit ("BAPN") und D-Penicillamin wurden zur Hemmung der Vernetzung der Collagenfasern verwendet, was darin hilfreich sein kann, das Collagen in einem unreifen Zustand nach der Filtrationschirurgie zu halten und folglich die Blasenvernarbung einzuschränken. Ein anfänglicher Bericht über eine postoperative Anwendung einer topischen BAPN-Salbe stellt fest, dass diese den IOD unter 22 mm Hg bei 74 % der Patienten hielt. Allerdings ergaben Tierstudien unter Verwendung sowohl von BAPN als auch D-Penicillamin eine lediglich beschränkte Wirksamkeit. Stewart, "Filtering Surgery – Techniques and Operative Complications", Clinical Practice of Glaucoma, Kapitel 10, 333–61 (1990).
Für eine Diskussion von Bleomycin, siehe Khaw et al., "Effects of Inoperative 5-Fluorouracil or Mitomycin C on Glaucoma Filtration Surgery in the Rabbit", Ophthalmology, 100:367–72 (1993). Für eine Diskussion von Cytosinarabinocid-imprägnierten Polymeren, siehe Lee et al., "Effects of Cytosine Arabinoside-impregnated Bioerodible Polymers on Glaucoma Filtration Surgery in Rabbits", J. Glaucoma, 2:96–100 (1993).
Photodynamische Therapie
Die photodynamische Therapie ("PDT") ist eine anerkannte Krebstherapieform, die für viele Zwecke eingesetzt werden kann, wie zum Beispiel der Behandlung von festen Tumoren (z.B. US-Patent Nrn. 4.932.934 und 5.283.255); die Schwächung blutgetragener Ziele, wie z.B. Leukämiezellen, immunreaktive Zellen (gleichzeitig anhängige Anmeldungen der laufenden Nrn. 07/889,707; 08/309.509; 08/374.158 und 08/174.211) und unerwünschte Mikroorganismen (US-Patent Nr. 5.360.734), die Verhütung von Restenose (US-Patent Nr. 5.422.362); die Diagnose und Behandlung bestimmter neovaskulärer Augenstörungen (gleichzeitig anhängige Anmeldung der laufenden Nrn. 08/209.473, 08/390.591 und 08/613.420); die Beseitigung arteriosklerotischer Plaque (gleichzeitig anhängige Anmeldung der laufenden Nr. 08/663,890); und die Verhütung einer Transplantat-Abstoßung (gleichzeitig anhängige Anmeldung der laufenden Nr. 08/371.707).
Die PDT bezieht die lokale oder systemische Anwendung eines lichtabsorbierenden photosensiblen Mittels ein, gewöhnlich eines Porphyrin-Derivats, welches sich selektiv in Zielgeweben anhäuft. Auf die Bestrahlung mit sichtbarem Licht einer aktivierenden Wellenlänge hin werden reaktive Sauerstoff-Spezies in den Photosensibilisator enthaltenden Zellen erzeugt, was den Zelltod fördert. Bei der Behandlung von Tumoren beispielsweise stellt man sich den Photosensibilisierungsprozess so vor, dass er Singulett-Sauerstoff entstehen lässt, ein aktiviertes Derivat von molekularem Sauerstoff, welcher mit einer Reihe spezifischer Stellen in Zellen und Geweben oxidativ reagieren kann. Als Folge dessen erleiden die Tumorzellen eine irreversible Schädigung auf einem subzellulären Niveau, insbesondere in der Zellmembran und den Mitochondrien. In vivo ist die Tumorzerstörung das Ergebnis eines komplexen Wechselspiels multipler Faktoren, die die Struktur des Bindegewebes beeinflussen, welches das Stroma eines Tumors und das den Tumor nährende vaskuläre Gewebe physisch trägt. Zhou, "Mechanisms of Tumor Necrosis Inducted by Photodynamic Therapy", J. of Photochem. and Photobiol., B: Biology, 3, 299–318 (1989).
Es ist klar, dass Photosensibilisatoren vorzugsweise in Tumorgewebe aufgenommen und dort angehäuft werden und dass durch PDT eine gewisse Tumor-Stromazell-Nekrose selektiv und direkt bewirkt wird. Allerdings sind auch Gefäßverletzungen und die nachfolgende Anoxie von Tumorzellen am durch PDT induzierten Tumor-Nekrotisierungsprozess beteiligt. Insbesondere in diesem letzteren Fall wurde die PDT-induzierte Tumornekrose als Ergebnis einer akuten entzündlichen Reaktion auf die physikochemischen Veränderungen in der Gefäßwand erachtet. Die schnelle Verminderung der Blutzufuhr als auch das Einsetzen eines entzündlichen Ödems in Tumor führt zu Hypoxie oder sogar Anoxie der durch Licht geschädigten neoplastischen Zellen, die schließlich nekrotisieren. Der gesamte schädigende Prozess wird durch die Freisetzung vasoaktiver oder gewebelysierender Substanzen wie Histamin, Proteasen und Säurephosphatasen aus den lichtgeschädigten Mastzellen und Neutrophilen im Tumorstroma, die ebenfalls mit entzündlichen Prozessen verbunden sind, vervielfältigt. Zhou, "Mechanisms of Tumor Necrosis Induced by Photodynamic Therapy", J. of Photochem. and Photobiol., B: Biology, 3, 299–318 (1989).
Es wurde erkannt, dass die gewöhnlich durch PDT bei anerkannten Krebs-Behandlungsprotokollen induzierte akute entzündliche Phase ein doppelschneidiges Schwert darstellt. Die Untersuchung experimenteller Tumormodelle hat gezeigt, dass nach Anwendung der PDT ein Exudat, das reich an Proteinen und neutralen Lipiden ist, in den extrazellulären Raum infiltriert und sich gegen eine "Wand" aus perinekrotischen vitalen Zellen ("hypoxische Zellen") ansammelt, die gegen die "Geister" der nekrotischen Zellen standhalten. Aus der Perspektive einer positiven Krebsbehandlung kann das entzündliche Exudat dabei hilfreich sein, Protein-gebundene Photosensibilisatoren in die inneren Bereiche des Tumors zu transportieren, die ansonsten schwierig erreichbar wären. Dieser Strom von entzündlichem Exudat kann andererseits Sauerstoff und Nährstoffe mit sich bringen und so die bei den Wundheilungsprozessen beteiligten Zellen nähren. Daher wurde der in Verbindung mit der PDT auftretende entzündliche Zustand als eine unabänderliche Tatsache erkannt, die die Behandlung von karzinomatösen Tumoren oftmals verkompliziert. Freitas, "Inflammation and Photodynamic Therapy", J. Photochem. and Photobiol., B: Biology, 8:340–41 (1991).
Es wurde einige Arbeit an der PDT vorgenommen, um eine antifibrotische Wirkung in Verbindung mit der Glaukom-Filtrationschirurgie unter Verwendung von Zinnethyletiopurpurin ("SnET2") als dem photosensiblen Agens zu erzielen. Spezifisch wurden Kaninchen, die subkonjunktivale Injektionen von SnET2 erhielten, einer Filtrationschirurgie unterzogen, gefolgt von einer postoperativen Lichtbestrahlung. Hill et al., "Photodynamic Therapy with Tin Ethyl Etiopurpurin as an Alternative Anti-fribrotic Treatment Following Glaucoma Filtering Surgery", Photochem. Photobiol., 61 Suppl., 68S, TPM-E9 (1995); und Hill et al., "Photodynamic Therapy (PDT) for Antifibrosis in a Rabbit Model of Filtration Surgery", Investigative Ophthalmology and Visual Science, 36:4, S877 (1995). Bei dieser vorbereitenden Arbeit geben die Autoren jedoch keinerlei Kontrolldaten an, weshalb es schwer zu bestimmen ist, um wieviel die Behandlung von Hill et al. tatsächlich die Fortbestandsrate der Filtrationsblase gegenüber unbehandelten Blasen verlängerte.
Weiterhin schreiben Hill et al., dass mehr als drei Stunden nach Injektion des photosensibilisierenden Mittels verstrichen, bis die Chirurgie und der Bestrahlungsschritt erfolgten, was dem Photosensibilisator ausreichend Zeit ließ, um in die mit der Verletzung verbundenen Gewebe absorbiert zu werden, ihm aber auch erlaubt haben könnte, sich in weitere Nicht-Zielbereiche des Auges auszubreiten. Da die Autoren berichten, dass große, transiente Bereiche von avaskulärer Bindehaut erzeugt wurden, wobei die avaskuläre Region bis zu vollen vier Wochen nach der Operation nicht auf die Filtrationsblase beschränkt war, ist klar, dass unerwünscht große Flächen des Auges durch die Behandlung beeinträchtigt waren. Angesichts der wohlbekannten, potenziell zerstörerischen, nekrotischen Wirkung der PDT bei anderen Anwendungen, besteht Bedarf nach einer Verminderung oder Verhütung einer Entzündung dadurch, dass der Grad und Umfang der pharmakologischen Aktivität zuverlässig kontrolliert werden kann.
BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Überraschenderweise wurde nun festgestellt, dass bei der geeigneten Wahl eines photosensibilisierenden Mittels, das von den verletzten Geweben schnell absorbiert wird, doch in Abwesenheit von Licht nicht-toxisch ist, die PDT eine vorhersagbare und nutzbringende entzündungshemmende Wirkung zeigt, die selbst für zarte Gewebe wie den Augenbereich nützlich ist. Dies stellt in Anbetracht der Lehren der Vergangenheit, dass die PDT eigentlich für die Verursachung von entzündlichen Reaktionen verantwortlich ist, anstatt sie vielmehr zu vermindern oder zu verhüten, eine besonders überraschende Entdeckung dar.
Spezifisch wurde nun entdeckt, dass die Wirkungen einer an verletztem Gewebe entstehenden Entzündung durch eine niedrig dosierte PDT vermindert oder verhütet werden kann.
Spezifisch betrifft die Erfindung die Verwendung eines photosensibilisierenden Mittels, das zum Eindringen in Gewebe fähig ist, in der Herstellung eines Medikaments zur Verminderung oder Verhütung einer solchen Entzündung bei einem Verfahren, welches die folgenden Schritte umfasst:

a. Bringen des beschädigten Gewebes, oder Gewebes vor der Verletzung, in Kontakt mit dem photosensibilisierenden Mittel, so dass es in das Gewebe eindringt, und
b. Aussetzen des kontaktierten Gewebes einem Licht mit einer Wellenlänge, welche vom photosensibilisierenden Mittel absorbiert wird, über eine ausreichend lange Zeit, um eine Entzündung im exponierten Gewebe zu vermindern oder zu verhüten, doch nicht so lange, dass eine Nekrose oder ein Erythem des exponierten beschädigten Gewebes bewirkt wird.

Die Methode der Erfindung ist besonders vorteilhaft, wenn das beschädigte Gewebe für eine weitere Verletzung oder Entzündung hochgradig empfindlich ist, wie etwa bei Augengewebe der Fall, da die geeigneten Photosensibilisatoren nicht aus sich selbst heraus von antiproliferativer Wirkung oder in Abwesenheit einer aktivierenden Bestrahlung für zarte Gewebe zytotoxisch sind. Da weiterhin die meisten photosensibilisierenden Mittel für menschliche Gewebe nicht-toxisch sind, sofern nicht durch Licht aktiviert, und da das photosensibilisierende Mittel der Erfindung dazu fähig ist, relativ schnell in verletztes Gewebe einzudringen, lässt sich der Grad der pharmakologischen Wirksamkeit sowohl durch den Umfang der Bestrahlung als auch entweder den Umfang des physikalischen Kontakts mit dem Photosensibilisator oder seiner Konzentration, z.B. im Blutstrom, zum Zeitpunkt der Bestrahlung leicht kontrollieren. Folglich ist die therapeutische Wirkung der Erfindung leichter regulierbar als bei bekannten pharmakologischen antifibrotischen Techniken.
Bei einer anderen Ausführungsform betrifft die Erfindung die Verwendung einer Zusammensetzung, welche umfasst:

a. 1 μg/ml bis 2 mg/ml eines photosensibilisierenden Mittels, das zum Eindringen in das Gewebe fähig ist, und
b. einen pharmazeutisch geeigneten Träger, in der Herstellung eines Medikaments zur Verminderung oder Verhütung der Wirkungen einer Entzündung, die von beschädigtem Augengewebe ausgeht.

KURZBESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1 zeigt eine graphische Darstellung des prozentualen Fortbestands der Filtrationsblase bei Kaninchen in jeder von vier Gruppen.
2 zeigt eine graphische Darstellung der Differenzen zwischen den Gruppen bezüglich der Blasengröße an jedem Untersuchungstag bis zum postoperativen Tag 12.
3 zeigt eine graphische Darstellung der Differenzen zwischen Gruppen bezüglich der Blasenhöhe an jedem Untersuchungstag bis zum postoperativen Tag 12.
4 zeigt eine graphische Darstellung der Differenzen bei konjunktivalem Erythem über der Filtrationsblase an jedem Untersuchungstag bis zum postoperativen Tag 12.
5 zeigt die Formeln der typischen grünen Porphyrine, die bei den Methoden, Zusammensetzungen und Gegenständen der Erfindung nützlich sind.
6 zeigt die Struktur von vier BPD-artigen Verbindungen, die als photosensibilisierende Mittel bei der Erfindung besonders nützlich sind.
AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Der Begriff "Entzündung" in dieser Anmeldung bezieht sich auf eine Reihe von Veränderungen, die in einem lebenden Körper nach einer Verletzung auftreten. Die Verletzung kann durch physikalische Ursachen wie übermäßiger Wärme oder Kälte, Druck, Ultraviolettlicht- oder ionisierende Bestrahlung, Schnitte oder Abschürfungen, oder durch eine breite Vielfalt von anorganischen oder organischen chemischen Substanzen oder durch biologische Verursacher wie Viren, Bakterien und andere Parasiten bewirkt sein.
Photosensibilisierendes Mittel
Bei einem "photosensibilisierenden Mittel" handelt es sich um eine chemische Verbindung, die dann, wenn sie einem Licht einer Wellenlänge ausgesetzt wird, die durch den Photosensibilisator absorbierbar ist, die Lichtenergie absorbiert, was die gewünschte physiologische Wirkung erzielt, z.B. eine kontrollierte entzündungshemmende Wirkung. Die photosensibilisierenden Mittel zur Verwendung gemäß der vorliegenden Erfindung weisen vorzugsweise ein Absorptionsspektrum auf, das innerhalb des Bereichs der Wellenlängen von 350 nm bis 1200 nm liegt, welches Absorptionsspektrum für die gewünschte Durchdringung in einer als solcher bekannten Weise maßgeschneidert werden kann und vorzugsweise zwischen etwa 400 und 900 nm beträgt, und am bevorzugtesten zwischen 600 und 800 nm. Typischerweise absorbiert das photosensibilisierende Mittel Licht von zumindest einigen der Wellenlängen im sichtbaren Bereich des elektromagnetischen Spektrums.
Eine andere Eigenschaft der Photosensibilisatoren im allgemeinen, die von besonderer Bedeutung für die Ausführung der vorliegenden Erfindung ist, besteht im relativen Nichtvorhandensein von Toxizität für Zellen in Abwesenheit der photochemischen Wirkung und in der leichten Clearance aus Geweben in Abwesenheit einer Zielspezifischen Wechselwirkung zwischen bestimmten Zellen und dem Photosensibilisator.
Der Photosensibilisator zur Verwendung gemäß der Erfindung kann ein beliebiges photosensibilisierendes Mittel sein, das sich für die photodynamische Therapie ("PDT") eignet, und das zum Eindringen in das verletzte und zu behandelnde Gewebe und zum Bewirken des gewünschten Grades der Bioverteilung in weniger als einer Stunde fähig ist. Ob dieses Kriterium durch einen potenziellen Kandidaten für den Photosensibilisator erfüllt wird, lässt sich mittels des folgenden einfachen Tests leicht und schnell bestimmen:

1. Präparieren lebender kultivierter Zellen (vorzugsweise aus einer in Suspension gezüchteten Kultur; jegliche Zelllinie ist geeignet).
2. Zugeben des zu testenden Photosensibilisators zu den Zellen bei Konzentrationen von 1–3 μg/ml in Gegenwart von 10 % Serum.
3. Entfernen des überschüssigen photosensibilisierenden Wirkstoffes durch Konzentration im Anschluss an verschiedene Inkubationsperioden (z.B. 5, 15, 30 und 60 Minuten).
4. Waschen der Zellen mit Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung und Lysieren durch Gefrieren und Auftauen.
5. Bestimmen der Konzentration eines getesteten Photosensibilisators in Zelllysaten durch Fluoreszenz gegenüber geeigneten Standards.

Zu einer besonders wirksamen Gruppe von Photosensibilisatoren zählen grüne Porphyrine, die ausführlich beschrieben sind bei Levy et al., US-Patent Nr. 5.171.749, ausgegeben am 15. Dezember 1992. Der Begriff "grüne Porphyrine" bezieht sich auf Porphyrin-Derivate, die durch Umsetzen eines Porphyrin-Kerns mit einem Alkyn in einer Reaktion vom Diels-Alder-Typ zum Erhalt eines Monohydrobenzoporphyrins erhalten werden. Typischerweise werden grüne Porphyrine ausgewählt aus einer Gruppe von Porphyrin-Derivaten, die durch Diels-Alder-Reaktionen von Acetylen-Derivaten mit Protoporphyrin unter Bedingungen erhalten werden, die die Reaktion an lediglich einer der zwei verfügbaren konjugierten, nicht-aromatischen Dien-Strukturen fördern, die in den Protoporphyrin-IX-Ringsystemen (Ringe A und B) vorhanden sind.
Mehrere Strukturen von typischen grünen Porphyrinen sind in 6 gezeigt. Die Diels-Alder-Reaktion führt ursprünglich zur Bildung eines Cyclohexadiens – hierin als "Hydrobenzo" bezeichnet – in Kondensation an den pyrrolischen A- oder B-Ring, wie in Formeln 1 und 2 der 6 gezeigt. Die Neuanordnung des π-Systems im Hexadien-Ring führt zur Bildung der Verbindungen der Formeln 3 und 4, und die Reduktion liefert die Verbindungen der Formeln 5 und 6. Aus praktischen Gründen werden die Verbindungen der Formeln 5 und 6 jedoch vorzugsweise unter Durchführung der zuvor erörterten Diels-Alder-Reaktion mit dem entsprechenden Olefin als Ersatz für die übliche Acetylen-Verbindung hergestellt, wodurch eine reduziertere Version der resultierenden Porphyrin-Ringstruktur erzeugt wird. Diese Verbindungen sind in Formeln 1–6 gezeigt, wobei Wasserstoff die Stickstoffe des inneren Rings besetzt. Es sollte allerdings klar sein, dass die metallisierten Formen, in denen ein Kation einen oder beide dieser Wasserstoffe ersetzt, ebenfalls verwendet werden kann. Die Herstellung der bei dieser Erfindung nützlichen grünen Porphyrin-Verbindungen ist ausführlich in US-Patent Nr.. 5.095.030 beschrieben.
Aus Gründen der Bequemlichkeit wird allgemein eine Abkürzung für den Begriff Hydromonobenzoporphyrin-Derivat – "BPD" – zur Bezeichnung der Verbindungen der Formeln 3 und 4 der 5 verwendet. Verbindungen der Formeln 3 und 4 und Gemische davon sind besonders bevorzugt.
Wie in 5 gezeigt, sind R¹, R², R³ und R⁴ nicht-eingreifende Substituenten, die die Wirksamkeit der Verbindung der Erfindung nicht nennenswert beeinflussen. Spezifischer gesagt wird der Begriff "nicht-eingreifende Substituenten" zur Bezeichnung von Substituenten verwendet, die die Fähigkeit des grünen Porphyrins, als ein durch verletztes Gewebe absorbierbarer Photosensibilisator zu wirken und dabei eine pharmakologische Wirkung in weniger als einer Stunde auszuüben, nicht zerstören. Bei den Verbindungen der 5 und 6 sind R¹ und R² generell und unabhängig voneinander Elektronen-entziehende Substituenten oder irgendwelche anderen aktivierenden Substituenten, die ausreichend Elektronen-entziehend sind, um die Rate der Diels-Alder-Reaktion zu erhöhen, die sowohl mit A- als auch B-Ringen ablaufen kann, doch vorzugsweise bei lediglich einem Ring erfolgt. Beispiele geeigneter R¹- und R²-Gruppen beinhalten Carbalkoxy(2-6C), Alkyl-(1-6C9)-sulfonyl oder Aryl-(6-10C)-sulfonyl, Aryl(6-10C), Cyano und -CONR⁵CO-, worin R⁵ Aryl(6-10C) oder Akyl(1-6C) ist. Eines von R¹ und R² kann auch ein Wasserstoff sein, solange das andere ein Elektronen-entziehender Substituen von ausreichender Stärke ist, um die Diels-Alder-Reaktion zu erleichtern. Am häufigsten sind R¹ und R² Carbalkoxy-Gruppen, vorzugsweise Methyl- oder Ethylcarboxyester. Bevorzugte Verbindungen sind solche, in denen R¹ und R² dieselben sind und Carbalkoxy, insbesondere Carboethoxy, sind.
Wie hierin verwendet, steht der Begriff "Carboxy", wie herkömmlicherweise definiert, für -COOH, während "Carbalkoxy" für -COOR steht, worin R Alkyl ist. "Carboxyalkyl" steht für den Substituenten -R'-COOH, worin R' Alkylen ist. "Carbalkoxyalkyl" steht für -R'-COOR, worin R' Alkylen und R Alkyl oder Alkanol ist. "Alkyl" steht generell für eine gesättigte gerad- oder verzweigtkettige Hydrocarbyl-Komponente von 1–6 Kohlenstoffatomen wie Methyl, n-Hexyl, 2-Methylpentyl, t-Butyl, n-Propyl und so weiter. "Alkylen" ist dasselbe wie "Alkyl", außer, dass die Gruppe zweiwertig und nicht einwertig ist. "Aryl" steht für eine aromatische cyclische Gruppe wie Phenyl, Naphthyl, Pyridyl und ähnliches. Die Aryl-Gruppe in den Verbindungen zur Verwendung gemäß der Erfindung ist wahlweise mit 1 – 3 Substituenten substituiert, die unabhängig ausgewählt sein können aus der Gruppe, bestehend aus Halo, wie etwa Fluor, Chlor, Brom oder lod; niederem Alkyl(1-4C); und niederem Alkoxy(1-4C). "Aryl"- oder "Alkylsulfonyl"-Gruppen weisen die Formel -SO₂R auf, worin R Alkyl oder Aryl ist, wie oben definiert.
R³ ist unabhängig eine ω-Carboxyalkyl-Gruppe(2-6C) oder ein Salz, Amid, Ester oder Acylhydrazon davon, oder ist Alkyl(1-6C). Vorzugsweise ist R³ 2-Carboxyethyl oder der Alkyl- oder Alkanolester davon, und ist R⁴ Vinyl. Die meisten dieser Ausführungsformen sind jedoch aufgrund der Verfügbarkeit der nativen Porphyrine und weniger aufgrund von Überlegungen bezüglich der biologischen Wirksamkeit bevorzugt. Wie in 5 gezeigt, sind Adukte, die durch die Reaktion von R¹-C≡C-R² mit einem Protoporphyrin-IX-Ringsystem gebildet sind (worin R³ eine geschützte Form von 2-Carboxyethyl ist, wie etwa 2-Carbomethoxyethyl oder 2-Carboethoxyethyl, und R⁴-CH=CH₂ ist), Verbindungen der Formeln 1 und 2. Verbindungen der Formel 1 resultieren aus der Addition an den A-Ring, und Verbindungen der Formel 2 resultieren aus der Addition an den B-Ring.
Bequem geeignete Ausgangsmaterialien für die grünen Porphyrin-Verbindungen zur Verwendung gemäß der Erfindung zählen die natürlich vorkommenden Porphyrine, worin R³ entweder -CH₂CH₂COOH, -CH₂CHRCONR₂ oder -CH₂CHRCOOR ist, worin R Alkyl(1-6C) oder Alkanol(1-6C) ist. Die exakte Beschaffenheit von R³ jedoch, sofern sie nicht eine π-Bindung in Konjugation an eine Ring-π-Bindung enthält, ist gewöhnlich für den Ablauf der Diels-Alder-Reaktion oder für die Wirksamkeit des resultierenden Produkts nicht relevant. R³ kann daher ein beliebiges aus einer breiten Vielfalt von Gruppen sein, wie zum Beispiel niederem Alkyl(1-4C); und ω-Carboxyalkyl(2-6C) und dessen Ester und Amide. Der R³-Substituent kann ebenfalls mit einer Hydroxygruppe substituiert sein; Halogen, wie etwa Fluor, Chlor, Brom oder lod; oder mit anderen nicht-reaktiven Substituenten.
Ist R³-CH₂CHR-COOR, so wurde es als vorteilhaft befunden, die veresterte Carboxy-Gruppe zu hydrolysieren oder teilweise zu hydrolysieren. Typischerweise erfolgt die Hydrolyse an der R³-Position bequemer und bei einer viel schnelleren Rate als die der Estergruppen von R¹ oder R². Außerdem sind die Eigenschaften der Löslichkeit und biologischen Verteilung der resultierenden Verbindungen wünschenswerter als die der unhydrolysierten Form. Die Hydrolyse führt zu Disäure- oder Monosäure-Produkten (oder deren Salzen).
Bei Verbindungen der Formeln 1 und 2 ist R⁴ üblicherweise -CH=CH₂, zumindest anfänglich, doch wird diese Vinyl-Gruppe ohne weiteres zu anderen Ausführungsformen von R⁴ durch die Addition an, oder die Oxidation des, Vinyl-Ringsubstituenten von Ring B oder A in Formel 1 bzw. 2. Folglich kann R⁴ einer aus einer breiten Vielfalt von Substituenten sein, die mit dem übereinstimmen, was durch eine einfache Additionsreaktion erzeugt wird. So kann ein beispielhaftes Additions-Reagens von der Form HX sein, worin H an den Kohlenstoff angrenzend an den Ring addiert wird, um eine R⁴-Position mit der folgenden Formel zu erhalten:
Daher ist bei einer Ausführungsform einer der addierten Substituenten ein Wasserstoff und ist der andere gewählt aus der Gruppe, bestehend aus Wasserstoff; Halo, wie etwa Fluor, Chlor, Brom oder lod; Hydroxy; niederem Alkoxy; Amino; Amid; Sulhydryl; oder einem Organosulfid. Zum Beispiel schafft die Markovnikov-Addition von Wasser eine Substituenten-Struktur analog einem Hämatoporphyrin-Ringsystem am relevanten Ring. Die Vinylgruppe kann ebenfalls oxidiert werden, um als einen Substituenten in der R⁴-Position -CH₂OH, -CHO oder -COOH oder deren Salze oder Ester zu erhalten. Die Additions- oder Oxidationsprodukte können selbst ebenfalls substituiert sein, wenn die addierten Substituenten funktionelle Abgangsgruppen sind. Ist zum Beispiel Br ein Substituent, so kann es durch Komponenten wie -OH, -OR, worin R Alkyl(1-6C) ist, wie oben beschrieben, Halo, -NH₂, -NHR, -NR₂ und ähnliches ersetzt werden.
Daher steht R⁴ generell für jeglichen Substituenten, zu dem die Vinylgruppe -CH=CH₂ durch Spaltung oder Addition ohne weiteres umwandelbar ist, und weitere Substituenten, die durch Reaktion guter Abgangsgruppen mit zusätzlichen Komponenten erzeugt werden. Vorzugsweise ist R⁴ jedoch Vinyl(-CH=CH₂); -CHOR^4', worin R^4' H oder Alkyl(1-6C) ist, wahlweise substituiert mit einem hydrophilen Substituenten wie -CH₂OH; -CHO; -COOR^4', wie z.B. COOH oder -COOCH₃; -CH(OR^4')CH₃, wie z.B. -CH(OH)CH₃ oder -CH(OCH₃)CH₃; -CH(OR^4')CH₂OR^4'; -CH(OH)CH₂OH; -CH(SR^4')CH₃, wie z.B. -CH(SCH₃)CH₃ und dessen Disulfid; -CH(NR^4')CH₃; -CH(CN)CH₃; -CH(pyridiniumbromid)CH₃; -CH(COOR^4')CH₃; -CH(COOCR^4')CH₃; -CH₂(halo)CH₃, wie z.B. -CHBrCH₃; oder -CH(halo)CH₂(halo). Alternativ kann R⁴ eine organische Gruppe von weniger als 12 Kohlenstoffatomen sein, die aus der direkten oder indirekten Derivatisierung von Vinyl resultiert; oder kann R⁴ zusätzliche Porphyrin- oder Porphyrinverwandte Ringsysteme bereitstellt, wie etwa eine Gruppe, die 1 – 3 Tetrapyrrol-artige Kerne der Formel -L-P, wie nachstehend definiert, enthält. Solche Verbindungen, in denen R⁴-CH=CH₂, -CH(OH)CH₃, -CH(halo)CH₃ oder eine Gruppe ist, die 1 – 3 Tetrapyrrol-artige Kerne der Formel -L-P enthält, wie nachstehend definiert, sind bevorzugt.
Wie hierin verwendet, steht der Begriff "Tetrapyrrol-artiger Kern" für ein Vier-Ringsystem des folgenden Grundgerüsts:
oder ein Salz, Ester, Amid ode Acylhydrazon davon, welches in hohem Maße konjugiert ist. Es enthält das Porphyrinsystem, welches effektiv ein vollständig konjugiertes System ist; das Chlorsystem, welches effektiv eine Dihydro-Form des Porphyrins ist; und das reduzierte Chlorsystem, welches eine Tetrahydro-Form des konjugierten Porphyrinsystems ist. Wird "Porphyrin" spezifiziert, so ist das vollständig konjugierte System gemeint. Grüne Prophyrine sind effektiv eine Dihydro-Form des Porphyrinsystems.
Bei einer Ausführungsform enthält der Substituent R⁴ mindestens einen zusätzlichen Tetrapyrrol-artigen Kern. Die resultierenden Verbindungen zur Verwendung gemäß der Erfindung sind Dimere oder Oligomere, in denen zumindest eines der Tetrapyrrolartigen Ringsysteme ein grüner Porphyrin ist. Die Knüpfung zwischen der grünen Porphyrin-Komponente an der R⁴-Position an ein zusätzliches Tetrapyrrol-artiges Ringsystem kann durch eine Ether-,Amin- oder Vinyl-Bindung erfolgen. Porphyrin-Ringsysteme mit zwei verfügbaren Substituenten-Positionen (sowohl bei A- als auch B-Ringen) entsprechend R⁴ können zusätzlich derivatisiert werden, wie nachstehend erläutert.
Ist R⁴ "-L-P", so wird -L- ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus:
und ist P eine Porphyrinstruktur oder ein zweiter grüner Porphyrin der Formeln 1 – 6 der 5, außer, dass eine zweite R⁴-Gruppe durch das obige L ersetzt ist.
(Es ist ebenfalls klar, dass dann, wenn -L- von der oben gezeigten Formel (e) oder (f) ist, das Ringsystem, an das die Doppelbindung gebunden ist, ein Resonanzsystem aufweisen wird entsprechend
in dem Ring, an den die Doppelbindung gebunden ist, wie gezeigt.)
Die Hydromonobenzoporphyrine, die direkt aus der oben beschriebenen Diels-Alder-Reaktion resultieren, können ebenfalls zu den in Formeln 3 und 4 der 5 gezeigten BPD-Verbindungen isomerisiert werden. Die Darstellungen der Verbindungen 3 und 4 in 5 zeigen nicht die relative Position der exocyclischen Methylgruppe (Ring A der Formel 3 und Ring B der Formel 4) bezüglich des R²-Substituenten. Beide Isomere sind verfügbar. Die Verbindungen der Formeln 3 und 4 sind bei den Methoden und Zusammensetzungen der Erfindung besonders bevorzugt.
Außerdem könnten die Diels-Alder-Produkte selektiv reduziert werden, indem sie in Gegenwart eines Katalysators wie Palladium auf Kohle mit Wasserstoff behandelt würden, um die gesättigten Ring-Analoga zu erhalten, die als Formeln 5 und 6 in 5 gezeigt sind und den jeweiligen Diels-Alder-Produkten der Ringe A und B entsprechen. Wie oben erläutert, ist jedoch die üblichere Praxis die, die Diels-Alder-Reaktion, ausgehend von einem Olefin-Ausgangsmaterial, anstelle des üblichen Acetylen-Ausgangsmaterials durchzuführen, um eine reduziertere Form des resultierenden Porphyrin-Ringsystems zu erhalten. Die oben bezüglich der Verbindungen der Formeln 1 und 2 betreffend die Derivatisierung durch Umwandlung des verbliebenen Vinyl-Substituenten (R⁴) und bezüglich der Variabilität von R³ angegebene Beschreibung gilt ebenfalls für die Verbindungen der Formeln 3, 4, 5 und 6.
Bevorzugte Ausführungsformen des grünen Porphyrins zur Verwendung gemäß der Erfindung sind solche, in denen das Diels-Alder-Produkt neu angeordnet und teilhydrolysiert ist. Sogar noch bevorzugter sind die Verbindungen der Formeln 3 und 4 (BPDs), worin die Carbalkoxy-Gruppen in den R³-Positionen ebenfalls hydrolysiert oder teilhydrolysiert wurden. Die Verbindungen zur Verwendung gemäß der Erfindung, die -COOH enthalten, können entweder als die freie Säure oder in Form von Salzen mit organischen oder anorganischen Basen hergestellt werden.
In 6 sind vier besonders bevorzugte Verbindungen zur Verwendung gemäß der Erfindung gezeigt, die durch Formeln 3 und 4 abgedeckt sind, die kollektiv als Benzoporphyrin-Derivate bezeichnet sind, d.h. BPD-DA, BPD-DB, BPD-MA und BPD-MB. Diese stellen hydrolysierte oder teilhydrolysierte Formen der neu angeordneten Produkte der Formel 3 und 4 dar, worin eine oder beide der geschützten Carboxylgruppen von R³ hydrolysiert wurden. Die Estergruppen an R¹ und R² hydrolysieren relativ langsam, so dass die Umwandlung zu den in 6 gezeigten Formen ohne weiteres bewirkt wird. Die bevorzugteste dieser grünen Porphyrin-Verbindungen ist BPD-MA.
In 6 ist R³-CH₂CH₂COOR^3', worin R^3' in den einzelnen Verbindungen variiert. Spezifisch sind in BPD-DA R¹ und R² Carbalkoxy, ist R³ Wasserstoff und befindet sich die Derivatisierung an Ring A. BPD-DB stellt die entsprechende Verbindung mit der Derivatisierung am Ring B dar. BPD-MA stellt die teilhydrolysierte Form von BPD-DA dar, und BPD-MB steht für teilhydrolysierte Form von BPD-DB. Daher sind bei diesen letzteren Verbindungen R¹ und R² Carbalkoxy; ist ein R^3' Wasserstoff und das andere R^3' Alkyl(1-6C).
Die Verbindungen der Formeln BPD-MA und BPD-MB können homogen sein, wobei lediglich das Carbalkoxyethyl des C-Rings oder lediglich das Carbalkoxyethyl des D-Rings hydrolysiert wäre, oder können Gemische der C- und D-Ringsubstituent-Hydrolysate sein. Außerdem können Gemische von zwei oder mehreren von BPD-MA, -MB, -DA und -DB bei der Erfindung verwendet werden.
Es sollte zur Kenntnis genommen werden, dass viele der Verbindungen der 5 mindestens ein chirales Zentrum enthalten und daher als optische Isomere existieren können. Beim Verfahren der Erfindung können Verbindungen mit beiden Konfigurationen der chiralen Kohlenstoffe verwendet werden, ob die Verbindungen nun als Isolate eines einzelnen Stereoisomers oder als Gemische von Enantiomeren und/oder Diastereomern vorliegen. Die Trennung von Gemischen von Diastereomeren kann mittels einer herkömmlichen Methode bewirkt werden. Gemische der Enantiomere können mittels einer der üblichen Techniken getrennt werden, wie etwa durch Umsetzen mit optisch aktiven Präparaten und durch Trennen der resultierenden Diastereomere.
Es sollte außerdem zur Kenntnis genommen werden, dass die Reaktionsprodukte unaufgetrennte Gemische von A- und B-Ringadditionen sein können, z.B. Gemische der Formeln 1 und 2 oder 3 und 4 oder 5 und 6. Bei der Erfindung können entweder die getrennten Formen, z.B. Formel 3 allein oder 4 allein, oder Gemische in einem beliebigen Verhältnis verwendet werden.
Darüber hinaus können dimere Formen des grünen Porphyrins und dimere oder multimere Formen von Kombinationen aus grünem Porphyrin und Porphyrin verwendet werden, um mehr Licht auf einer pro Mol-Basis zu absorbieren. Die dimeren und oligomeren Verbindungen zur Verwendung gemäß der Erfindung können unter Anwendung von Reaktionen analog jenen zur Dimerisation und Oligomerisation der Porphyrine als solche hergestellt werden. Die grünen Porphyrine oder grünen Porphyrin/Porphyrin-Verbindungen können direkt erzeugt werden, oder die Porphyrine können gekoppelt werden, gefolgt von einer Diels-Alder-Reaktion eines der beiden oder beider terminaler Porphyrine zu ihrer Umwandlung zu den entsprechenden grünen Porphyrinen.
Pharmazeutische Zusammensetzung
Typischerweise wird das photosensibilisierende Mittel zur Verwendung gemäß der Erfindung zu einer pharmazeutischen Zusammensetzung formuliert, indem das photosensibilisierende Mittel, das typischerweise bei Raumtemperaturen, geeigneten pH-Werten und dem gewünschten Reinheitsgrad gewählt wird, mit ein oder mehreren physiologisch geeigneten Trägern, d.h. Trägern, die nicht-toxisch für die Empfänger bei den angewendeten Dosierungen und Konzentrationen sind, vermengt wird. Zu geeigneten Zusammensetzungen zählen solche, die für die systemische oder topische Verabreichung geeignet sind, einschließlich Präparaten zur Injektion, transmukosalen Verabreichung oder transdermalen Verabreichung.
Die Zusammensetzung zur Verwendung gemäß der Erfindung umfasst vorzugsweise etwa 1 μg/ml bis etwa 2 mg/ml des photosensibilisierenden Mittels, was in erster Linie vom Verabreichungsweg abhängt. Für die topische Verabreichung werden vorzugsweise etwa 0,1 bis etwa 2,0 mg/ml verwendet. Für die systemische Verabreichung, z.B. intravenöse Injektion, variiert die Konzentration des photosensibilisierenden Mittels vorzugsweise von 0,3 bis etwa 0,5 mg/ml.
Vorzugsweise wird das photosensibilisierende Mittel in einer flüssigen, gelförmigen oder gelatineartigen festen pharmazeutischen Zusammensetzung entweder einzeln mit Wasser oder zusammen mit anderen pharmazeutisch geeigneten Exzipienzien verabreicht, wie z.B. beschrieben bei Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton Pennsylvania (Gennaro, Hrg. 1990). Als Flüssigkeit kann die den Photosensibilisator enthaltende pharmazeutische Zusammensetzung eine Suspension oder eine Emulsion sein. Insbesondere sind oftmals liposomale oder lipophile Formulierungen erwünscht. Das photosensibilisierende Mittel zur Verwendung gemäß der Erfindung kann innerhalb von Liposomen oder gebunden an ihre Oberfläche oder beides vorliegen. Geeignete Methoden zur Präparierung der Liposomen sind im Fachgebiet wohlbekannt. Die Aufnahme grüner Porphyrin-Verbindungen in solche Präparate ist zum Beispiel beschrieben bei Allison et al., US-Patent Nr. 5.214.036, ausgegeben am 25. Mai 1993, und Desai et al., gleichzeitig anhängige Anmeldung der laufenden Nummer 08/489.850, eingereicht am 13. Juni 1995. Werden Suspensionen oder Emulsionen verwendet, so zählen zu geeigneten Exzipienzien Wasser, Kochsalzlösung, Dextrose, Glycerol und ähnliches. Diese pharmazeutischen Zusammensetzungen können auch geringfügige Mengen an nicht-toxischen Hilfssubstanzen enthalten, wie z.B. Benetzungs- oder Emulgationsmittel, Antioxidanzien, pH-Puffermittel und ähnliches.
Der pH-Wert der Formulierung hängt hauptsächlich von der speziellen Anwendung und der Konzentration des Photosensibilisators ab, doch liegt vorzugsweise im Bereich von 3 bis etwa B. Bevorzugt wird der Photosensibilisator bei einem neutralen pH-Wert gehalten (z.B. etwa 6,5 bis etwa 7,5), um sein Anhaften an den Trägerformen, in die er eingebracht ist, zu verhindern, wie dies bei pH-Werten annähernd physiologischen Werten auftritt, und um eine Aktivierung des Photosensibilisators zu gewährleisten. Daher stellt eine Formulierung des Photosensibilisators in einer Elektrolytlösung, die einen ausgeglichenen Salzpuffer bei pH 6,5 enthält, doch kein fötales Rinderserum ("FBS"), eine geeignete Ausführungsform dar. Der Grund dafür, dass das FBS weggelassen wird, ist der, dass es antigene Komponenten enthält, die eine Entzündungsreaktion verstärken könnten. Sollte das photosensibilisierende Mittel an dem Behältnis, in dem die es enthaltende pharmazeutische Zusammensetzung aufbewahrt wird, haften, so kann ein geeigneter nicht-antigener Inhaltsstoff, wie etwa humanes Serumalbumin, wahlweise in einer Menge zugegeben werden, die das photosensibilisierende Mittel, das am zu behandelnden beschädigten Gewebe haftet, nicht beeinträchtigt.
Das photosensibilisierende Mittel kann mit ein oder mehreren Immunsuppressiva kombiniert werden, um die entzündungshemmende Wirkung auf das beschädigte Gewebe zu verstärken. Der Begriff "Immunsuppressivum", wie hierin verwendet, bezieht sich auf Substanzen, die auf eine Unterdrückung oder Maskierung von T-Lymphozytenreaktionen hinwirken. Hierzu würden Substanzen zählen, die die Zytokin-Produktion unterdrücken, die Selbst-Antigen-Expression herabregulieren oder unterdrücken oder die MHC-Antigene maskieren.
Zu Beispielen solcher Mittel zählen 2-Amino-6-aryl-5-substituierte Pyrimidine; Azathioprin oder Cyclophosphamid; Bromcryptin; Glutaraldehyd; antiidiotypische Antikörper für MHC-Antigene; Cyclosporin A; ein oder mehrere Steroide, vorzugsweise Corticosteroide und Glucocorticosteroide wie Prednison, Methylprednisolon und Dexamethason; Anti-Interferon-Gamma-Antikörper; Anti-Tumornekrose-Faktor-Alpha-Antikörper; Anti-Tumornekrose-Faktor-Beta-Antikörper; Anti-Interleukin-2-Antikörper; Antizytokin-Rezeptor-Antikörper wie Anti-IL-2-Rezeptor-Antikörper; heterologes Anti-Lymphozyt-Globulin; Pan-T-Antikörper, vorzugsweise OKT-3-monoklonale Antikörper; Antikörper zu CD4; Streptokinase; Streptodornase; oder RNA oder DNA vom Wirt.
Das immunsuppressive Mittel kann eine Ergänzung darstellen oder in Kombination in derselben Dosierungshöhe wie das photosensibilisierende Mittel oder in einer reduzierten Dosis verwendet werden, und kann gleichzeitig oder separat, systemisch oder lokal, verabreicht werden. Die wirksame Menge solcher Agenzien unterliegt weitgehend den therapeutischen Zwecken und hängt von der Menge an in der Formulierung vorhandenem photosensibilisierenden Mittel ab, der Art von Verletzung, dem Typ des Immunsuppressivum, dem Verabreichungsort, der Verabreichungsmethode, dem Dosierungsschema der Verabreichung, weiteren der oben erörterten Faktoren und weiteren den durchführenden Ärzten bekannten Faktoren. Allerdings ist die geeignete Menge an Immunsuppressivum zur Verwendung mit der Erfindung typischerweise niedriger als die, die normalerweise für die Behandlung ähnlicher verletzter Gewebe ratsam ist.
Wird ein Immunsuppressivum verwendet, so kann es mittels jeglicher geeigneten Methode verabreicht werden, einschließlich der parenteralen und, sofern zur lokalen immunsuppressiven Behandlung erwünscht, intraläsional, d.h. topisch an die verletzten Gewebe. Zu parenteralen Infusionen zählen die intramuskuläre, intravenöse, intraarterielle, intraperitoneale, subkutane und subkonjunktivale Verabreichung.
Soll die pharmazeutische Zusammensetzung zur Verwendung gemäß der Erfindung topisch angewendet werden, zum Beispiel als Auftrag auf die verletzten Gewebe, so kann die Verwendung einer viskösen Lösung, zum Beispiel eines Gels, vor einer nicht-viskösen Lösung bevorzugt sein. Das Gel kann zum Beispiel durch Mischen einer Lösung des gewünschten photosensibilisierenden Mittels mit einem Gelbildner, z.B. einem Polysaccharid, vorzugsweise einem wasserlöslichen Polysaccharid, z.B. Hyaluronsäure, Stärken und Cellulose-Derivate (z.B. Methylcellulose, Hydroyethylcellulose und Carobxymethylcellulose) zubereitet werden. Ist ein Polysaccharid in einer Gelformulierung vorhanden, so liegt die gewöhnlich vorhandene Menge im Bereich von etwa 1–90 Gew.-% des Gels, bevorzugt etwa 1–20 %. Beispiele anderer geeigneter Polysaccharide für diesen Zweck und eine Bestimmung der Löslichkeit der Polysaccharide sind zu finden in EP 267.017 , veröffentlicht am 11. Mai 1988.
Zu Beispielen geeigneter grenzflächenaktiver Mittel zählen die Poloxamer-grenzflächenaktiven Mittel, die in einer Reihe von Molekülen bestehen, die Blockcopolymere von Ethylenoxid und Propylenoxid sind, und zwar entweder alleine oder in Vermengung mit einem Phospholipid wie Eierlecithin. Ein anderes Beispiel einer kommerziell von Green Cross beziehbaren Emulsion stellt Fluosol-DA 20 % dar, welche Perfluordecalin und Perfluortripropylamin in Emulsion mit dem Poloxamer-grenzflächenaktiven Mittel namens Pluronic F-68 enthält. Die perfluorchemischen Emulsionen und ihre Wirkungen bei Säugern sind ausführlicher bei Bollands et al., J. Pharm. Pharmacol., 39:1021–24 (1987) beschrieben.
Die pharmazeutische Zusammensetzung zur Verwendung gemäß der Erfindung ist vorzugsweise steril. Die Sterilität wird ohne weiteres durch sterile Filtration durch 0,2-Mikrometer-Membranen erreicht. Einmal formuliert und sterilisiert, ist die Zusammensetzung möglicherweise nicht stabil gegenüber einer oxidativen Denaturierung.
Beispielsweise sind aber lyophilisierte Formulierungen zur Wiederherstellung, die BPD enthalten, zur Lagerung geeignet.
Art und Weise des Kontaktierens des Gewebes mit dem Photosensibilisator
Die Verminderung oder Verhütung einer Entzündung gemäß der vorliegenden Erfindung wird in relativ unmittelbarer Weise durch Zusammenbringen des vorgeschädigten Gewebes (oder zu verletzenden oder gerade beschädigten Gewebes) mit dem photosensibilisierenden Mittel unter Bedingungen, die die Bildung einer starken Verbindung zwischen dem photosensibilisierenden Mittel und dem Zielgewebe bei gleichzeitiger Minimierung der Konzentration an Photosensibilisator und, sofern praktisch machbar, Lokalisieren der Kontaktfläche auf das verletzte Ziel-Gewebe ermöglichen. Vorzugsweise beträgt die Kontaktdauer bei Schritt (a) wesentlich weniger als fünf Minuten.
Sind die vor Entzündung zu schützenden Zellen in einem lebenden, gesunden Tier enthalten, so kann der Photosensibilisator lokal oder systemisch verabreicht werden. Das photosensibilisierende Mittel kann durch Injektion verabreicht werden, solange der spezielle Injektionsmodus eine schnelle Clearance des Photosensibilisators aus dem Körper zulässt. Zum Beispiel würde sich eine intravenöse Injektion eignen. Alternativ kann der Photosensibilisator topisch oder enterisch angewendet werden, z.B. durch Auftragen oder Aufsprühen auf die Oberfläche des zu behandelnden Gewebes, oder über Pflaster oder Implantate, die typischerweise nach Ablauf einer zuvor festgelegten Kontaktdauer mit dem Photosensibilisator entfernbar sind.
Handelt es sich bei den vor Entzündung zu schützenden Zielgeweben um zarte Augengewebe, so ist ein topischer äußerer Auftrag aufgrund der lokalisierten Natur des Kontakts mit dem Auge, wie er mit der topischen Verabreichung erreichbar ist, bevorzugt, da dies zu einem größeren Sicherheitsspielraum führt. Bei einer besonders bevorzugten Ausführungsform wird der Photosensibilisator zur Verwendung gemäß der Erfindung mit dem Gebrauchsgegenstand der Erfindung aufgetragen, welcher sich aus dem Photosensibilisator und einem absorbierenden Applikator zusammensetzt. Der absorbierende Applikator umfasst jegliches absorbierende Material, das steril oder sterilisierbar ist, das den Photosensibilisator bei Kontakt mit den beschädigten Geweben ohne weiteres freisetzt und das mit dem photosensibilisierenden Mittel nicht chemisch reagiert. Vorzugsweise ist das absorbierende Material auch preiswert und wegwerfbar. Zu Beispielen für geeignete absorbierende Applikatoren zählen Wirkstoffgetränkte Tupfer und fusselfreie flexible Gewebe. Ein Wirkstoff-getränkter Tupfer, z.B. ein Weck-Zellstoff, stellt einen bevorzugten absorbierenden Applikator dar. Wird ein derartiger Applikator verwendet, so ist er vorzugsweise mit der pharmazeutischen Zusammensetzung zur Verwendung gemäß der Erfindung getränkt und wird topisch auf die Zielgewebe während oder kurz nach Auftreten der Verletzung, z.B. während einer chirurgischen Maßnahme, aufgetragen.
Der Kontaktierschritt kann über eine breite Vielfalt von Temperaturen stattfinden, wobei lediglich solche Temperaturen vermieden werden, die hoch genug sind, um das beschädigte Gewebe zu denaturieren oder anderweitig zu beeinträchtigen, und solche Temperaturen, die niedrig genug sind, um die zelluläre Aufnahme des Photosensibilisators zu minimieren. Vorzugsweise findet der Kontaktierschritt bei einer Temperatur im Bereich von 5°C bis 40°C, bevorzugt von 15°C bis 37°C, und am bevorzugtesten bei Raumtemperatur statt.
Dosierung
Bei der Methode der Erfindung wird dem Patienten eine Menge an photosensibilisierendem Mittel oder eines Gemischs des photosensibilisierenden Mittels in einer oder mehreren Dosen verabreicht. Die photosensibilisierenden Mittel zur Verwendung gemäß der Erfindung werden in einer Weise verabreicht, die mit einer guten medizinischen Praxis unter Berücksichtigung der Beschaffenheit der zu verhütenden oder zu vermindernden Entzündung, der Spezies und des medizinischen Zustandes des Patienten, des Vorhandenseins eines anderen Wirkstoffs im Körper des Patienten, der Reinheit und chemischen Form des Photosensibilisators, dem Verabreichungsweg, der Rate und dem Grad der zu erwartenden Absorption und weiteren, den ausführenden Ärzten bekannten Faktoren vereinbar ist. Eine therapeutisch wirksame Menge an Photosensibilisator ist eine Menge, die zur signifikanten Verminderung, auf die Lichtexposition hin, der Vermehrung von Fibroblasten wirksam ist und dadurch die Entzündungsreaktion und die unerwünschten Wirkungen, die mit der Entzündung in Verbindung stehen können, wie z.B. eine erhöhte Vaskularität und/oder Bildung von Narbengewebe, abgemildert.
Die Dosis des photosensibilisierenden Mittels variiert in Abhängigkeit von dem Zielgewebe und ist, sofern intravenös oder systemisch verabreicht, durch das Gewicht und dem optimalen Blutspiegel des Tiers beschränkt. Geeignete systemische Mengen pro Dosis liegen typischerweise bei weniger als 1,0 mg/kg Körpergewicht, vorzugsweise im Bereich von etwa 0,25 bis 0,75 mg/kg pro Dosis, und am bevorzugtesten bei 0,15 bis 0,50 mg/kg pro Dosis. Typischerweise beträgt die Dosis des photosensibilisierenden Mittels weniger als 0,50 mg/kg. Eine systemische Dosis von BPD als dem Photosensibilisator würde 0,3 mg/kg lediglich unter ungewöhnlichen Umständen übersteigen. Diese Dosierungsbereiche sollen als Vorschläge dienen und sollten nicht unbedingt als Beschränkungen betrachtet werden, da die individuellen Reaktionen der einzelnen Patienten ebenfalls variieren.
In Abhängigkeit von dem photosensibilisierenden Mittel und der Verabreichungsform kann ein äquivalenter optimaler systemischer Blutspiegel festgestellt werden, doch ist dies schwer zu bewerkstelligen, da der Photosensibilisator vorzugsweise sehr schnell abgebaut wird. Daher kann ein enormer Unterschied zwischen der Konzentration des Photosensibilisators im Blutstrom zum Zeitpunkt der Injektion und der Konzentration zum Zeitpunkt der Behandlung mit Licht vorliegen. Zum Beispiel kann die Konzentration an BPD zum Zeitpunkt der intravenösen Injektion im Bereich von etwa 1 – 10 mg/ml liegen, wohingegen sie zum Zeitpunkt der Lichtexposition lediglich im Bereich von 0,5 – 0,05 μg/ml liegen kann. Bei topischer Verabreichung ist typischerweise kein Photosensibilisator im Blut nachweisbar.
Bei topischer oder systemischer Verabreichung wird die Dosis am besten bezüglich der Konzentration der Zusammensetzung und der Zeitdauer des Kontakts mit dem Zielgewebe beschrieben. Ein generell wirksamer Bereich der Konzentrationen für das photosensibilisierende Mittel beträgt 0,1 bis 10 mg/ml, vorzugsweise 0,1 bis 5 mg/ml, und am bevorzugtesten 0,25 bis 2,0 mg/ml. Typischerweise beträgt die Konzentration des photosensibilisierenden Mittels 2 mg/ml oder weniger. Der Kontakt beinhaltet geeignterweise den Auftrag auf ein oder mehrere Oberflächen des verletzten Gewebes der pharmazeutischen Zusammensetzung der Erfindung. Der topische Kontakt mit dem Photosensibilisator erfolgt im allgemeinen für mindestens eine Minute, vorzugsweise weniger als fünf Minuten und sogar noch bevorzugter etwa ein bis zwei Minuten. Die Kontaktdauer hängt von Faktoren wie der Konzentration des photosensibilisierenden Mittels in der Zusammensetzung, dem zu behandelnden Gewebe und der speziellen Art von Zusammensetzung ab.
Nach einer zuvor festgelegten Kontaktdauer mit dem Photosensibilisator wird der überschüssige Photosensibilisator vorzugsweise von der Behandlungsfläche vor Schritt (b) der wie oben definierten Methode entfernt. Wird der Photosensibilisator systemisch verabreicht, so wird der Photosensibilisator so ausgewählt, dass er nicht nur schnelle pharmakokinetische Eigenschaften zeigt, sondern auch für eine schnelle Clearance aus dem Körper empfindlich ist. Wird der Photosensibilisator topisch verabreicht, so wird der Überschuss vorzugsweise durch Spülen oder Wegschwemmen mit einer physiologisch geeigneten, chemisch inerten Flüssigkeit, wie etwa normaler Kochsalzlösung oder BSS (ausgeglichene Salzlösung) oder Abwaschen mit Wasser oder einem anderen Lösungsmittel entfernt. Auch hier sollen diese Protokolle nicht als Beschränkung verstanden werden, da eine breite Variation in der Protokoll-Gestaltung zulässig ist.
Im Anschluss an den Schritt des Kontaktierens des beschädigten Gewebes oder des Gewebes vor der Verletzung mit einer Zusammensetzung, die den Photosensibilisator zur Verwendung gemäß der Erfindung enthält, wird das Gewebe einem Licht mit einer Wellenlänge ausgesetzt, die durch das photosensibilisierende Mittel absorbiert wird und zur Verminderung oder Verhütung von Entzündung führt. Der Begriff "Niedrigdosis-PDT" in dieser Anmeldung bezieht sich auf eine Dosis, die keine evidente Zellschädigung, Nekrose oder Erythem bewirkt und lediglich eine entzündungshemmende Wirkung zeigt. Da die gesamte PDT-Dosis von einer Kombination aus der Dosis des photosensibilisierenden Mittels und der Dosis des Bestrahlungslichts abhängt, kann die Niedrigdosis-PDT in Kombinationen aus relativ hohen Dosen an Photosensibilisator und geringen Lichtdosen, oder aber aus Kombinationen von relativ geringen Dosen an Photosensibilisator und hohen Lichtdosen verabreicht werden. Letztere Kombination aus wenig Photosensibilisator/hoher Lichtmenge kann auch durch Verabreichen einer relativ hohen Dosis an Photosensibilisator, gefolgt von einer ungewöhnlich langen "Inkubations"-Zeit vor der Bestrahlung mit Licht erreicht werden. Daher wäre eine breite Vielfalt von Bedingungen, die alle insgesamt eine relativ niedrige Dosis an PDT erzeugen, zur Anwendung gemäß der Erfindung geeignet.
Entsprechend eignet sich eine breite Vielfalt unterschiedlicher Kombinationen von Photosensibilisator-Dosen, Kontaktzeiten und Verabreichungsformen. Die folgenden groben Richtlinien können jedoch nützlich sein. Ein kurzer Kontakt (weniger als eine Stunde) mit hohen Dosen des Photosensibilisators, z.B. 2 mg/ml bei topischem Auftrag, wäre generell gleichwertig zu einer geringen Photosensibilisator-Dosis, z.B. 0,15 mg/kg bei intravenöser Verabreichung. Selbst nach einer hohen Dosis des intravenös verabreichten Photosensibilisators kann jedoch das Verschieben der Bestrahlung mit Licht auf einen späteren Zeitpunkt, z.B. mehr als drei Stunden nach Verabreichung des photosensibilisierenden Mittels, eine Niedrigdosis-PDT ergeben, da dann, wenn der Photosensibilisator zum schnellen Abbau fähig ist, nach drei Stunden nur noch sehr wenig davon in den Geweben vorhanden sein kann.
Zu spezifischen Beispielen der "Niedrigdosis-PDT" zählen:

• Die topische Anwendung oder lokalisierte Injektion von weniger als 2 mg/ml eines Benzoporphyrin-Derivat-("BPD")-Photosensibilisators, der weniger als 10 Minuten in Kontakt mit dem Zielgewebe belassen wird;
• die intravenöse Verabreichung von weniger als 0,15 mg/kg eines BPD mit einer Bestrahlung zu einem beliebigen Zeitpunkt nach Verabreichung des BPD, oder
• die intravenöse Verabreichung von 0,15 – 0,50 mg/kg BPD mit einer Bestrahlung mehr als sechs Stunden nach BPD-Verabreichung;

• weniger als 15/cm², angewendet 0 – 3 Stunden nach Verabreichung des Photosensibilisators, vorzugsweise etwa 7 – 12 J/cm²; oder
• bis zu 100 J/cm², angewendet später als sechs Stunden nach Verabreichung des Photosensibilisators.

Vorzugsweise beträgt die Lichtdosis beim Expositionsschritt b), wie oben definiert, weniger als 100 J/cm². Bevorzugter ist die Zeit zwischen Schritt a) und dem Expositionsschritt b), wie oben definiert, größer als sechs Stunden, und die Lichtdosis während dieses Expositionsschritts b) beträgt 15 bis 100 J/cm².
Während des Bestrahlungsschritts kann jegliches Licht, das vom Photosensibilisator absorbiert wird und das sich zur Anwendung mit dem beschädigten Gewebe eignet, eingesetzt werden, z.B. ein Licht von 380 bis 850 nm, was vom Photosensibilisator und von der Tiefe der gewünschten Gewebepenetration abhängt, vorzugsweise von 400 bis 700 nm. Für allgemeine entzündungshemmende Anwendungen kann Licht im sichtbaren Bereich des elektromagnetischen Spektrums, z.B. rotes Licht, blaues Licht oder sogar UVA-Licht, angewendet werden. Licht mit einer Wellenlänge von weniger als 400 nm ist akzeptabel, doch aufgrund der potenziell schädigenden Wirkungen des UVA-Lichts nicht bevorzugt. Licht mit einer längeren Wellenlänge als 700 nm ist ebenfalls geeignet, doch nicht besonders bevorzugt, da es schwer sichtbar ist, was die visuelle Kontrolle der Bestrahlung nahezu unmöglich macht. Für Augenanwendungen ist rotes Licht bevorzugt, da hierbei jegliche potenziell schädigenden Wirkungen des blauen und UVA-Spektralbereichs auf die empfindliche Netzhaut des Auges ausgeschaltet wird.
Ein Beispiel eines besonders bevorzugten Verfahrens, das bei der Filtrationschirurgie angewendet wird, ist das folgende:

1. Ein Wirkstoff-getränkter Tupfer wird mit 2 mg/ml einer wässrigen Dispersion von liposomalem BPD gesättigt;
2. der BPD-gesättigte Tupfer wird zwei Minuten lang in Kontakt mit dem zu behandelnden Gewebe platziert;
3. das überschüssige BPD wird durch Waschen mit reichlichen Mengen einer sterilen Kochsalzlösung oder ausgeglichenen Salzlösung entfernt; und
4. das BPD-behandelte Gewebe wird etwa 7 – 12 J/cm² Licht ausgesetzt.

Zu diesem Zeitpunkt scheint nicht ein einzelnes Protokoll für alle Fälle wünschenswert zu sein. Typische Protokolle umfassen jedoch entweder eine einzelne Behandlung oder eine Anfangsbehandlung, gefolgt wahlweise von 1–4 Zusatzbehandlungen. Lokale Behandlungen unter topischer Verabreichung von Photosensibilisator können alle 3 oder 4 Tage wiederholt werden. Bei systemischer Verabreichung des Photosensibilisators sind wiederholte Behandlungen allgemein um etwa eine Woche oder länger voneinander beabstandet, um jegliche unerwünschte Wirkungen aus der Ansammlung von überschüssigem Photosensibilisator zu vermeiden.
Die folgenden Beispiele sollen die Erfindung veranschaulichen, jedoch nicht beschränken.
BEISPIELE
Beispiel 1 – Lichtdosierung
Die Filtrationschirurgie wurde bei sechs gesunden Kaninchen an einem Auge vorgenommen. Ein Weck-Zellstofftupfer wurde mit einer wässrigen 2 mg/ml-Lösung des Photosensibilisators Benzoporphyrin-Derivat-Monosäure-Ring A (BPD-MA, auch bekannt als "BPD-Verteporfin") gesättigt. Während der Operation wurde der gesättigte Weck-Zellstoff zum topischen Auftrag von BPD-MA für zwei Minuten auf die Lederhaut und Bindehaut im Operationsfeld verwendet. Nach dem Auswaschen des überschüssigen Wirkstoffs mit BSS wurden sowohl die Lederhaut als auch die Bindehaut einem roten Licht mit einer Wellenlänge von etwa 690 nm ausgesetzt, welches mittels einer Licht-emittierenden Diode ("LED"), platziert in einem Abstand von etwa 1 cm vom zu bestrahlenden Gewebe, abgegeben wurde. Jedes der bei diesem Experiment verwendeten sechs Kaninchen erhielt eine unterschiedliche Lichtdosis, spezifisch 0, 3, 6, 12, 18 und 24 J/cm² über einen Zeitraum von 30 Sekunden bis 4 Minuten. Die behandelten Kaninchen wurden 11 – 12 Tage lang nach der Operation folgeuntersucht, indem die Höhe der Hydrationsblase, die Blasenvaskularität (indikativ für Entzündung) und die Verminderung des Augeninnendrucks ("IOD") bestimmt wurden. Die am Tag 5 und Tag 11 erhaltenen Daten sind nachstehend in Tabellen 1A bzw. 1B gezeigt.
TABELLE 1A Ergebnisse des Pilot-BPD-MA für die Lichtdosierung am postoperativen Tag 5
TABELLE 1B Ergebnisse des Pilot-BPD-MA für die Lichtdosierung am postoperativen Tag 11
Die Ergebnisse wiesen darauf hin, dass die Fortbestandsdauer der Filtrationsblase bei Augen am längsten war, die mit Licht bei einem mittleren Dosierungsbereich, d.h. relativ geringen Dosen an Wirkstoff und Licht ("Niedrigdosis-PDT"), behandelt wurden. Die Daten zeigen, dass eine gewisse Menge an PDT erforderlich war, doch dass höhere Dosen generell weniger wirksam waren als geringere Dosen. Bei der Kombination aus kurzer Inkubationsdauer mit BPD und der geringen Lichtdosis von 12 J/cm² stand nicht zu befürchten, den behandelten Zellen viel Schaden zuzufügen. Nichtsdestotrotz zeigte die Behandlung eine definitive pharmakologische Wirkung. Der Blasenfortbestand war mit dem Fehlen einer Entzündung verbunden, wie durch die Avaskularität und eine blasse Farbe der Blase angezeigt.
Andererseits war bei zu geringen oder zu hohen Lichtdosen die Blasenhöhe und die Menge des herabgesetzten Augeninnendrucks vermindert. Das Blasenversagen war mit einer Entzündung verbunden.
Die entsprechenden Filtrationsblasen sind in 1 gezeigt.
Beispiel 2 – Zeitpunkte der PBDT-Verabreichung
Der in diesem Beispiel verwendete Photosensibilisator wurde wie folgt zubereitet: Ein liposomal formuliertes Benzoporphyrin-Derivat, Monosäure-Ring A, BPD-MA oder BPD-Verteporfin, wurde durch QLT PhotoTherapeutics, Inc. als ein lyophilisiertes Pulver geliefert und mit sterilem destilliertem Wasser kurz vor der Verwendung wiederhergestellt. Das zu 1,98 mg/ml wiederhergestellte BPD wurde zum Sättigen des 3 mm-Schnittendes eines Weck-Zellstoffs verwendet. In den Kontrollgruppen wurde der Weck-Zellstoff mit einer basischen Salzlösung ("BSS") gesättigt.
Am Tag 0 wurde eine Vollhaut-Filtrationschirurgie an einem willkürlich ausgewählten Auge bei 48 Kaninchen, d.h. 12 in jeder der vier Gruppen, vorgenommen. Bei jedem Kaninchen diente das unbehandelte andere Auge als Kontrolle. Das Filtrationsverfahren wurde in der folgenden Weise durchgeführt: Jedes Tier wurde mit einem Gemisch von Ketamin und Xylazin anästhesiert. Ein Drahtspekulum wurde zum Trennen der Augenlider verwendet. Ein Bindehautlappen auf Formix-Basis wurde entweder im oberen nasalen oder oberen temporalen Quandranten geschaffen. Nach Schaffung des Lappens auf Formix-Basis wurde der mit BPD-MA (oder BSS-Placebo) gesättigte Weck-Zellstoff auf der Lederhaut hinter dem Limbus platziert, wo die Fistel geschaffen werden sollte. Die Bindehaut wurde über den Weck-Zellstoff drapiert. Der Weck-Zellstoff ruhte derart zwischen der Bindehaut und der Lederhaut, wobei sie auch mit der Episklera und der Tenon-Kapsel für zwei Minuten in Kontakt kam. Der Weck-Zellstoff wurde dann entfernt und die Fläche mit BSS gespült. Die Instrumente und Handschuhe wurden ebenfalls vor Eingreifen in das Auge gespült, wobei eine 1,0 mm-Trephine zum Eindringen in die vordere Augenkammer verwendet wurde.
Der Bindehautlappen wurde dann am Limbus mit zwei 7–0 Vicryl-Stichen befestigt. Sofort nach der Operation wurde jedes Kaninchen zwei Minuten lang einem Licht mit einer Wellenlänge von 690 nm ausgesetzt, wobei die in Beispiel 1 verwendete Lichtquelle (Quantum Devices, Inc.) 1 cm vom Auge entfernt platziert wurde. Die Lichtquelle wurde bei einer Maximalleistung (100 W/cm²) verwendet, was eine Gesamtdosierung von etwa 7,2 J ergab.
Ein Tropfen Tobramycin wurde dann in jedes Auge im Anschluss an die Operation eingebracht. Tobramycin und Prednisolonacetat wurden in beide Augen viermal pro Tag für eine Woche im Anschluss an die Operation eingeträufelt.

Das Kontrollauge erhielt denselben Photosensibilisator und subkonjunktivale Bestrahlung wie das operierte Auge, doch ohne Schaffung einer Fistel. Das Kontrollauge wurde zum Testen der Toxzität und als eine Basis zum Nachweisen einer Abnahme des IOD beim operierten Auge verwendet. Der Zeitpunkt, zu dem das BPD-MA angewendet wurde, wurde wie folgt variiert:

Gruppe 1:	während der Operation, Placebo-Behandlung; 48 Stunden nach der Operation, Placebo-Behandlung;
Gruppe 2:	während der Operation, BPD-Behandlung; 48 Stunden nach der Operation, Placebo-Behandlung;
Gruppe 3:	während der Operation, Placebo-Behandlung; 48 Stunden nach der Operation, BPD-Behandlung;
Gruppe 4:	während der Operation, BPD-Behandlung; und 48 Stunden nach der Operation, BPD-Behandlung.

Die BPD-Behandlung 48 Stunden nach der Operation bestand in der Aufbringung des 3 mm-Schnittendes eines mit einer wässrigen 2 mg/ml-Lösung von BPD-MA (oder Placebo) gesättigten Weck-Zellstoffs, der auf die Bindehaut über der Filtrationsblase für 2 Minuten gelegt wurde, gefolgt von Auswaschen des überschüssigen Photosensibilisators und Aussetzen einem roten LED-Licht mit einer Wellenlänge von 688 nm für eine Minute.
Postoperativ am Tag 0 und jeden zweiten Tag nach der Operation wurden die Kaninchen mit Schlitzlampen-Biomikroskopie zur Bestimmung der Breite der Filtrationsblase, der Höhe der Filtrationsblase, eines Bindehauterythems über der Blase, einer Zellrötung an der Vorderkammer und der Vorderkammertiefe untersucht. Es wurde eine Applanationstonometrie zur Messung des IOD nach der topischen Anästhesie vorgenommen. Eine Bewertung des subjektiven okularen Unbehagens wurde ebenfalls vorgenommen, indem das Befinden und die Fressgewohnheiten der Tiere bestimmt wurden, entsprechend der nachstehend gezeigten Bewertungsskala:

0:: normales Verhalten
1:: Kopfschütteln, Kopfkippen, Augenschielen
2:: Pfotenreiben am Auge
3:: Selbstverletzung/Selbstverstümmelung (mit Krallen)

Die Fortbestandsdauer der Blase wurde durch die Breite und Höhe der Blase und durch den IOD im Vergleich zum Kontrollauge bestimmt. Der Grad der Entzündungsreaktion wurde anhand eines Erythems über der Filtrationsblase bestimmt und auf einer Skala von 0 bis 3 bewertet. Die Kaninchen wurden geopfert, wenn ein Blasenversagen festgestellt wurde, d.h. wenn der Augeninnendruck im operierten Auge dem des Kontrollauges glich und die Filtrationsblase flach war.
Die graphische Darstellung in 2 zeigt den prozentualen Fortbestand der Filtrationsblase bei den Kaninchen in jeder der vier, in dieser Studie ausgewerteten Gruppen. Mittelwert (± SD) der Fortbestandsdauer war:
Gruppe 1: 10,3 ± 8 Tage;
Gruppe 2: 23,8 ± 12 Tage;
Gruppe 3: 10,1 ± 9 Tage; und
Gruppe 4: 23,2 ± 8 Tage.
Eine statistische Differenz wurde zwischen den meisten Gruppen (P < 0,001) beobachtet, jedoch nicht zwischen Gruppen 2 und 4 (P < 0,05). Die Behandlung mit BPD und Licht während der Operation (Gruppen 2 und 4) führte zu einem längeren Blasenfortbestand im Vergleich zur Placebo-Kontrolle (Gruppe 1) oder Behandlung erst 48 Stunden nach der Operation (Gruppe 3). Die zweite Behandlung mit BPD und Licht bei 48 Stunden (Gruppe 4) schien keine zusätzliche Wirkung zu zeigen. Ein Kruskal-Wallis-Test für die nicht-parametrische Analyse wurde zur Auswertung der Differenzen bei der Fortbestandsdauer der Filtrationsblasen zwischen den Gruppen angewendet.
Der IOD wurde mittels eines ANOVA-Tests ausgewertet, wobei eine Tendenz zu einem niedrigeren IOD beobachtet wurde, wenn BPD intraoperativ (P = 0,057) gegeben wurde. Aufgrund von Problemen mit dem zur Messung des IOD bei den Kaninchen verwendeten Tonometers waren die zuverlässigsten Parameter die Breite (3) und die Höhe (4) der Blase, die beide die Wirksamkeit der Niedrigdosis-PDT-Behandlung während der Operation anzeigten. Die Messung des Erythems über der Blase (in 5 gezeigt) ergab eine stärkere Entzündungsreaktion in Gruppen 1 und 3, bei denen die Blasen kurz nach der Operation versagten. In 3, 4 und 5 wurde eine statistische Differenz zwischen den Gruppen beobachtet (P = 0,001). Blasenhöhe und -breite als auch andere Schlitzlampen-Eigenschaften wurden mittels eines Chi-Square-Tests analysiert. Nebenwirkungen wurden ebenfalls mittels eines Chi-Square-Tests analysiert. Ein Cox Proportional Hazard Model wurde zur Auswertung von Parametern verwendet, die am exaktesten die Fortbestandsdauer der Filtrationsblase an jedem Untersuchungstag vorhersagten.
Im Vergleich zu vorangegangenen Kaninchen-Studien, bei denen unterstützende Medikamente für die Trabekulektomie untersucht wurden, wie nachstehend in Tabelle 2 gezeigt, zeigten die Ergebnisse, dass BPD die Fortbestandsdauer der Filtrationsblase im Vergleich zu normalen Kontrollen, Ara-A und 5-Fluoruracil, verlängerte.
Tabelle 2
Die Ergebnisse zeigten auch, dass BPD die Lebensdauer der Filtrationsblase bei Kaninchen mehr verlängerte als bei einigen Kanichen, die Mitomycin C erhalten hatten. Die mittlere Fortbestandsdauer bei Studien mit Mitomycin C war länger, was mit der Hypothese übereinstimmt, dass PDT klinisch weniger Überfiltration erzeugen würde als Mitomycin C, doch ähnlich einfach anwendbar ist bei höherer Sicherheit.
Die Daten zeigten eindeutig, dass längere Fortbestandsdauern der Blasen mit keinem Erythem oder lediglich minimalem Erythem verbunden waren, und somit einer Verminderung der entzündlichen Reaktion. Die Daten legten auch nahe, dass die Behandlung mit BPD und Licht bei relativ niedrigen Dosierungsbereichen die Entwicklung einer Entzündung verhinderte, insbesondere bei Verabreichung während der Operation.
Nebenwirkungen traten nur wenige auf und standen nicht spezifisch mit der Anwendung des Photosensibilisators in Beziehung. Ein Fibrin-Klümpchen wurde innerhalb der ersten vier Tage bei sechs Kaninchen beobachtet, von denen drei aus der Gruppe 2 und drei aus Gruppe 3 waren. In jedem Fall löste sich das Fibrin ohne Folgeerscheinungen bis zum Ende der ersten Woche auf. Ein Kaninchen starb am Tag 0, was als Komplikation der Anästhesie erachtet wurde. Keine anderen Nebenwirkungen wurden berichtet.
Am Tag 7 wurde ein Kaninchen aus jeder Gruppe, und im Anschluss an das Blasenversagen, zwei Kaninchen aus jeder Gruppe geopfert und einer histologischen und transmissionselektronenmikroskopischen ("TEM") Analyse unterzogen. Die histologische Auswertung wurde vorgenommen, nachdem zunächst die Kadaveraugen mit 10 gepuffertem neutralem Formalin fixiert wurden. Die Augen wurden prozessiert, zerteilt und dann mit Hämatoxylin und Eosin, als auch Masson-Trichrom, angefärbt. Die Proben wurden in einer maskierten Weise durch einen unabhängigen Beobachter untersucht.
Die Transmissionselektronenmikroskopie wurde durch Fixieren der Gewebeproben in 2,5 % Glutaraldehyd, gepuffert mit 0,1 M Cacodylat, das 7 % Sucrose enthielt, vorgenommen. Die Gewebe wurden anschließend für eine Stunde mit 2 % Osmiumtetroxid fixiert und durch abgestufte Alkoholkonzentrationen bis 100 % Ethanol dehydriert. Die 2 × 5 mm-Gewebeblöcke wurden dann mit katalysiertem Epoxyharz infiltriert. Dicke Sektionen (0,5 μm) wurden ausgeschnitten und mit Toluidinblau angefärbt und durch Lichtmikroskopie zur Bestimmung geeigneter Flächen untersucht. Eine dünne Sektion (80 nm) wurde dann ausgeschnitten, auf Kupfergitter aufgelegt und mit Uranylacetat und Bleicitrat für die TEM-Auswertung angefärbt. Ein Hitachi H7000-Transmissionselektronenmikroskop wurde zur Untersuchung dieser Sektionen verwendet.
Ein Lichtmikroskop zeigte am postoperativen Tag 7 bei den Filtrationsblasen, die BPD anstelle von Placebo bei der Operation erhalten hatten, dass Fibroblasten und eine leichte lymphozytische Reaktion bei den Kaninchen vorhanden waren, die sowohl am Tag 0 als auch am Tag 2 Placebo erhalten hatten. Außerdem zeigten diese Augen am Tag 7 eine gewisse Gefäßvermehrung und neue Collagenablagerungen.
Im Gegensatz dazu zeigten die Kaninchen, die BPD lediglich am Tag 2 erhalten hatten (Gruppe 3), vergrößerte Lymphkanäle zusätzlich zu den Fibroblasten, doch keine Gefäßvermehrung. In beiden Augen, die BPD bei der Operation erhalten hatten, wurde an der Filtrationsblase eine leichte lymphozytische Reaktion bemerkt. Allerdings wurden keine Fibroblasten, Gefäßzunahme oder Vergrößerung der lymphozytischen Kanäle festgestellt. Am Ende der Studie (3 Wochen postoperativ) wurden bei Augenfisteln, die BPD erhalten hatten, lediglich einige wenige Lymphozyten und keine Vermehrung der Blutgefäße an der Fistel festgestellt.
In Gruppen 2 und 4 wurde sowohl am Tag 7 als auch bei der Opferung ein verdünntes Epithel beobachtet. Dies wurde jedoch der erhöhten Blase und dem damit verbundenen Zusammenbruch des Tränensacks zurückgeführt, entgegen einer toxischen Wirkung durch die PDT-Behandlung.
Im Kontrollauge wurden keine Differenzen zwischen den Placebo- und den BPD-behandelten Augen bei der Untersuchung des vorderen Augensegments beobachtet, was klinisch auf ein Fehlen von Toxizität hinwies (P > 0,05). Außerdem ergab die histologische und transmissionselektronenmikroskopische Analyse weder im operierten noch im Kontrollauge einen Nachweis von Toxizität oder Entzündung an anderer Stelle als der Filtrationsstelle. Daher wurde keine Toxizität von BPD klinisch, histologisch oder durch Transmissionselektronenmikroskopie beobachtet.

Claims

Verwendung eines Photosensibilisators, der zum Eindringen in Gewebe fähig ist, in der Herstellung eines Medikaments zur Verminderung oder Verhütung der Wirkungen einer Entzündung, die von diesem Gewebe bei dessen Beschädigung ausgeht, bei einem Verfahren, welches die folgenden Schritte umfasst: (a) Bringen des beschädigten oder vorgeschädigten Gewebes in Kontakt mit dem Photosensibilisator, so dass er in das Gewebe eindringt; und (b) Aussetzen des kontaktierten Gewebes einem Licht mit einer Wellenlänge, welche vom Photosensibilisator absorbiert wird, über eine ausreichend lange Zeit, um eine Entzündung im exponierten Gewebe zu vermindern oder zu verhüten, doch nicht so lange, dass eine Nekrose oder ein Erythem des exponierten beschädigten Gewebes bewirkt wird.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei der Kontakt aus Schritt a) für weniger als fünf Minuten erfolgt.
Verwendung nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei zwischen dem Schritt a) und dem Schritt b) der überschüssige Photosensibilisator in Kontakt mit dem beschädigten Gewebe entfernt wird.
Verwendung nach Anspruch 3, wobei die Entfernung durch Wegspülen des Photosensibilisators mit steriler Kochsalzlösung oder einer ausgeglichenen Salzlösung erfolgt.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei zumindest ein Teil der Wellenlängen des Lichts im sichtbaren Bereich des elektromagnetischen Spektrums liegt.
Verwendung nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei die Dosis des Lichts während des Exponierschritts b) weniger als 100 J/cm² beträgt.
Verwendung nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei die Zeit zwischen dem Schritt a) und dem Exponierschritt b) zwischen null und drei Stunden beträgt und die Dosis des Lichts während des Exponierschritts b) weniger als 15 J/cm² beträgt.
Verwendung nach Anspruch 7, wobei die Dosis des Lichts während des Exponierschritts b) etwa 7–12 J/cm² beträgt.
Verwendung nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei die Zeit zwischen dem Schritt a) und dem Exponierschritt b) größer als sechs Stunden ist und die Dosis des Lichts während dieses Exponierschritts b) 15 bis 100 J/cm² beträgt.
Verwendung einer Zusammensetzung, umfassend: a) 1 μg/ml bis 2 mg/ml eines Photosensibilisators, der zum Eindringen in das Gewebe fähig ist; und b) einen pharmazeutisch geeigneten Träger, in der Herstellung eines Medikaments zur Verminderung oder Verhütung der Wirkungen einer Entzündung, die von beschädigtem Augengewebe ausgeht.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei das Gewebe Augengewebe ist.
Verwendung nach Anspruch 1 oder Anspruch 10, wobei der Photosensibilisator eine oder mehrere Monohydrobenzoporphyrin-Verbindungen umfasst.
Verwendung nach Anspruch 12, wobei der Photosensibilisator BPD-MA umfasst.
Verwendung nach Anspruch 1 oder Anspruch 10, wobei das Medikament zum topischen Auftrag formuliert ist.
Verwendung nach Anspruch 14, wobei der topische Auftrag durch einen Arzneimittel-getränkten Tupfer erfolgt.
Verwendung nach Anspruch 1 oder Anspruch 10, wobei der Photosensibilisator in Form einer Lösung mit einer Konzentration von 2 mg/ml oder weniger vorliegt.
Verwendung nach Anspruch 1 oder Anspruch 10, wobei das Medikament zur systemischen Verabreichung formuliert ist.
Verwendung nach Anspruch 17, wobei die Dosis des Photosensibilisators weniger als 0,50 mg/kg beträgt.
Verwendung nach Anspruch 1 oder Anspruch 10, wobei der Photosensibilisator Licht von zumindest einem Teil der Wellenlängen des sichtbaren Bereichs des elektromagnetischen Spektrums absorbiert.