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Gebiet der
Erfindung
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Die
vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren für die in
vitro Molekülevolution
von Proteinfunktionen, insbesondere durch Umsetzen von DNA-Segmente,
die unter Verwendung einer Exonuklease erhalten werden.
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Hintergrund
der Erfindung
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Proteinfunktion
kann in vitro durch eine Anzahl von Verfahren modifiziert und verbessert
werden, einschließlich
platzgerichteter Mutationserzeugung (Alber et al, Nature, 5; 330
(6143): 41-46, 1987) kombinatorisches Klonen (Huse et al, Science,
246:1275-1281, 1989; Marks et al, Biotechnology, 10: 779-783, 1992)
und zufällige
Mutationserzeugung kombiniert mit einem geeigneten Selektionssystem
(Barbas et al, PNAS. USA, 89: 4457-4461, 1992).
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Das
Verfahren von zufälliger
Mutationserzeugung zusammen mit Selektion ist in einer Anzahl von
Fällen
verwendet worden, um Proteinfunktionen zu verbessern, und zwei unterschiedliche
Strategien existieren. Die erste ist die Randomisierung der gesamten
Gensequenz in Kombination mit der Selektion einer Proteinvariante
(eines Proteinmutanten) mit den gewünschten Eigenschaften, gefolgt
von einer neuen Runde von zufälliger
Mutationserzeugung und Selektion. Dieses Verfahren kann dann wiederholt
werden, bis eine Proteinvariante gefunden ist, die als optimal angesehen
wird (Schier R. et al, J. Mol. Biol. 1996 263 (4): 551-567). Hier ist
es der traditionelle Weg, Mutationen durch fehlerbehaftete PCR (Leung
et al, Technique, 1:11-15, 1989) mit einer Mutationsrate von ungefähr 0,7 einzuführen. Die
zweite ist, dass definierte Regionen eines Gens durch degenerierte
Primer mutiert werden können,
die Mutationsraten von bis zu 100 % ermöglichen (Griffiths et al, EMBO.
J, 13: 3245-3260,
1994; Yang et al, J. Mol. Biol. 254: 392-403, 1995). Je höher die
verwendete Mutationsrate ist, desto begrenzter ist die Region des
Gens, die den Mutationen unterworfen werden kann.
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Zufällige Mutierung
ist umfangreich auf dem Gebiet des Entwickelns von Antikörpern verwendet
worden. In vivo gebildete Antikörpergene
können
in vitro geklont werden (Larrick et al, Biochem. Biophys. Res. Commun.
160: 1250-1256, 1989), und zufällige
Kombinationen der Gene, die die variablen schweren und leichten
Gene codieren, können
einer Selektion unterworfen werden (Marks et al, Biotechnology,
10: 779-783, 1992). Selektierte funktionale Antikörperfragmente
können
unter Anwendung von zufälliger
Mutationserzeugung und zusätzlichen
Selektionsrunden weiter verbessert werden (Schier R. et al, J. Mol.
Biol. 1996 263 (4): 551-567).
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Der
Strategie zufälliger
Mutationserzeugung folgt eine Selektion. Varianten mit interessierenden
Eigenschaften können
selektiert werden, und die mutierten DNA-Regionen von unterschiedlichen
Varianten, jede mit interessierenden Eigenschaften, werden zu einer
codierenden Sequenz kombiniert (Yang et al, J. Mol. Biol. 254: 392-403,
1995). Dies ist ein sequenzieller Prozess mit vielen Schritten,
und potentielle synergistische Effekte verschiedener Mutationen
in unterschiedlichen Regionen können
verloren gehen, weil sie keiner Selektion in Kombination unterworfen
waren. Somit umfassen diese beiden Strategien nicht die gleichzeitige
Mutierung von definierten Regionen und die Selektion einer Kombination
dieser Regionen. Ein anderer Prozess schließt eine kombinatorische Paarbildung
von Genen ein, die verwendet werden kann, um z.B. Antikörperaffinität zu verbessern
(Marks et al, Biotechnology, 10: 779-783, 1992). Hier werden die
drei CDR-Regionen bei jedem variablen Gen fixiert, und diese Technologie
erlaubt es nicht, einzelne Gensegmente in dem Gen für die variable
Domain, die z. B. die CDR-Regionen umfasst, zwischen Klonen umzusetzen.
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Das
Konzept einer DNA-Umsetzung (Stemmer, nature 370: 389-391, 1994)
verwendet eine zufällige Fragmentierung
von DNA und den Zusammenbau von Fragmenten in eine funktionale codierende
Sequenz. Bei diesem Prozess ist es möglich, chemisch synthetisierte
DNA-Sequenzen einzuführen
und auf diese Weise eine Variation auf definierte Plätze in dem
Gen, dessen DNA-Sequenz bekannt ist, zu richten (Crameri et al, Biotechniques,
18: 194-196, 1995). In der Theorie ist es auch möglich, DNA zwischen jeglichen
Klonen umzusetzen. Wenn das resultierende ungesetzte Gen jedoch
funktional bezüglich
Expression und Aktivität
sein soll, müssen
die umzusetzenden Klone mit der Ausnahme der zufälligen Mutationen auf niedrigem
Niveau verwandt oder sogar identisch sein. DNA-Umsetzung zwischen genetisch unterschiedlichen
Klonen wird allgemein nicht-funktionalen Gene erzeugen.
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Die
WO-A-97/20078 offenbart Verfahren zum DNA-Umsetzen, die danach streben,
den Grad an Variation zu maximieren, die in die Polyonukleotide
eingeführt
wird, um so große
Banken von Polynukleotidvarianten zu erzeugen. Dieses Ziel wird
durch wiederholte Zyklen des Fragmentierens eines Doppelstrangausgangspolynukleotids,
des Denaturierens des Doppelstrangfragments und des den resultierenden
Einzelstrangfragmenten Erlaubens, sich aneinander anzulassen, verfolgt.
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Die
Selektion von funktionalen Proteinen aus Molekülbanken ist durch die Entwicklung
der Phagenanzeigetechnologie (Phage Display Technology; Parmley
et al, Gene, 73: 305-391 1988; McCafferty et al, Nature, 348: 552-554,
1990; Barbas et al, PNAS. USA, 88:7978-7982, 1991) revolutioniert
worden. Hier wird der Phenotyp (das Protein) direkt mit seinem entsprechenden
Genotyp (seiner DNA) verknüpft
und dies erlaubt ein direktes Klonen des genetischen Materials,
das dann weiteren Modifikationen unterworfen werden kann, um die Proteinfunktion
zu verbessern. Phagenanzeige ist verwendet worden, um funktionale
Verbinder aus einer Anzahl von Molekülbanken mit bis zu 1011 Transformanten Größe zu klonen (Griffiths et
al, EMBO. J. 13: 3245-3260, 1994). So kann Phagenanzeige verwendet
werden, um funktionale Verbinder direkt aus Molekühlbanken
zu Klonen und kann auch verwendet werden, um die ursprünglich ausgewählten Klone
weiter zu verbessern.
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Die
zufällige
Kombination von DNA aus unterschiedlichen mutierten Klonen in Kombination
mit der Selektion von erwünschter
Funktion ist ein effizienterer Weg, den Sequenzraum zu durchsuchen,
wenn er mit der sequenziellen Selektion und Kombination von selektierten
Klonen verglichen wird.
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Zusammenfassung
der Erfindung
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Gemäß einem
Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zum Erzeugen
einer Polynukleotidsequenz oder eine -sequenzpopulation aus einer
Ursprungspolynukleotidsequenz bereitgestellt, die ein oder mehrere
Proteinmotive codiert, mit den Schritten:
- a)
Aufschließen
der Ursprungspolynukleotidsequenz mit einer Exonuklese, um eine
Fragmentpopulation zu erzeugen;
- b) Kontaktieren der Fragmente mit einer Polynukleotidsequenzmatritze
unter Anlassbedingungen;
- c) Verstärken
der Fragmente, die sich in Schritt b) an die Matrize anlassen, um
mindestens eine Polynukleotidsequenz zu erzeugen, die ein oder mehrere
Proteinmotive codiert, die geänderte
Eigenschaften verglichen mit den einem oder den mehreren Proteinmotiven
aufweisen, welche durch das Ursprungspolynukleotid codiert werden.
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Das
Ursprungspolynukleotid ist vorzugsweise ein Doppelstrang, und das
Verfahren weist weiterhin vor dem Schritt b) den Schritt des Erzeugens
einer Einzelstrangpolynukleotidsequenz aus den Doppelstrangfragmenten
auf. Weiterhin ist die Polynukleotidmatrize vorzugsweise die Ursprungspolynukleotidsequenz
oder zumindest eine Polynukleotidsequenz, die Sequenz mit der Ursprungsnukleotidsequenz
gemeinsam hat, so dass die Fragmente unter Anlassbedingungen mit
der Matritze hybridisieren. Wenn z. B. das Ursprungspolynukleotid
ein Antikörper
ist, kann die Matritze ein unterschiedlicher Antikörper sein,
der konstante Domänen
oder Rahmenregionen gemein hat.
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Deshalb
wird typischerweise ein Verfahren des Kombinierens von Polynukleotidfragmenten
zum Erzeugen einer Polynukleotidsequenz oder Population von Sequenzen
mit gewünschten
Eigenschaften bereitgestellt, wobei das Verfahren die Schritte aufweist:
- (a) Aufschließen eines linearen Doppelstrangursprungspolynukleotids,
das ein oder mehrere Proteinmotive codiert, mit einer Exonuklease,
um eine Population von Doppelstrangfragmenten von variierenden Längen zu
erzeugen;
- (b) Erhalten von Einzelstrangpolynukleotiden aus den Doppelstrangfragmenten;
und
- (c) Zusammenbauen einer Polynukleotidsequenz aus den Sequenzen,
die aus dem Schritt (b) erhalten werden.
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Vorzugsweise
weist das Verfahren weiterhin den Schritt des (d) Expressivierens
des resultierenden Proteins, das durch die zusammengebaute Polynukleotidsequenz
codiert wird, und des Screenens des Proteins in Bezug auf die gewünschten
Eigenschaften auf.
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Vor
dem Zusammenbau der Polynukleotidsequenz in dem Schritt (c) werden
die Doppelstrangsequenzen vorzugsweise aufgereinigt und dann gemischt,
um ihren Zusammenbau zu erleichtern. Durch Steuern der Reaktionszeit
der Exonuklease kann die Größe der Polynukleotidfragmente
festgelegt werden. Das Festlegen der Längen der Polynukleotidfragmente
auf diese Weise vermeidet die Notwendigkeit, einen weiteren Schritt bereitstellen
zu müssen,
wie beispielsweise das Aufreinigen der Fragmente gewünschter
Länge von
einem Gel.
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Da
weiterhin einige Exonukleasen Polynukleotidsequenzen sowohl von
dem 3'-Ende als
auch dem 5'-Ende her aufschließen, können sich
die ausgewählten
Fragmente um die Mitte der Gensequenz herum zentrieren, falls diese
konkrete Region der Sequenz erwünscht
ist. Diese Sequenz aus der Mitte eines Gens kann beispielsweise
durch fehlerbehaftete PCR zufällig
mutiert werden und kann für
den Umsetzungsprozess erwünscht
sein.
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In
einigen Fällen
mag es jedoch wünschenswert
sein, nicht die Sequenz aus der Mitte des Gens umzusetzen. Dies
kann durch Auswählen
langer Fragmente nach der Behandlung mit Exonuklease verhindert werden.
Umgekehrt mögen,
falls es wünschenswert
ist, die Mitte der Gensequenz umzusetzen, kurze mit Exonuklease
behandelte Fragmente verwendet werden.
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Um
eine Polynukleotidsequenz mit gewünschten Eigenschaften zu erzeugen,
kann das Doppelstrangursprungspolynukleotid, das ein oder mehrere
Proteinmotive codiert, Mutationserzeugung unterworfen werden, um
eine Vielzahl von unterschiedlich mutierten Derivaten davon zu erzeugen.
Gleichermaßen
kann ein Doppelstrangursprungspolynukleotid erhalten werden, das
bereits eine Vielzahl von Proteinmotivvarianten von unbekannter
Sequenz codiert.
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Zufällige Mutierung
kann durch jegliches konventionelles Verfahren bewirkt werden, wie
es oben beschrieben wurde, aber ein geeignetes Verfahren ist fehlerbehaftete
PCR.
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Es
ist bevorzugt, PCR-Technologie zu verwenden, um die Einzelstrangpolynukleotidfragmente
in die Doppelstrangpolynukleotidsequenz zusammenzubauen.
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Die
Polynukleotidsequenz ist vorzugsweise DNA, obwohl RNA verwendet
werden kann. Der Einfachheit halber wird der Begriff Polynukleotid
jetzt im folgenden Text in Bezug auf DNA verwendet werden, aber
es ist zu verstehen, dass die vorliegende Erfindung sowohl auf RNA
als auch auf DNA anwendbar ist.
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Jegliche
Exonuklease, die Polynukleotide primär von dem 3'-Ende oder dem 5'-Ende oder sowohl von dem 3'-Ende als auch dem
5'-Ende her aufschließt, kann
verwendet werden. Beispiele für
eine geeignete Exonuklease, die gemäß der vorliegenden Erfindung
verwendet werden kann, umfassen BAL31 und Exonuklease III.
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BAL31
ist eine Exonuklease, die Nukleotidbasen aufschließt und sowohl
von dem 3'-Ende
als auch dem 5'-Ende
eines linearen Polynukleotidmoleküls entfernt. Das Enzym verwendet
Ca2+ als einen Cofaktor, der in Komplexen mit EGTA (Ethylenglycol-bis-(b-aminethylether)-N,N,N',N'-tetraessigsäure) gebunden
werden kann. EGTA bindet nicht Mg2+, was für den nachfolgenden PCR-Prozess
wichtig ist. Lineare DNA-Sequenzen werden mit BAL31 aufgeschlossen,
und die Reaktion wird zu unterschiedlichen Zeitpunkten durch die Zugabe
von EGTA gestoppt. Die einzeln aufgeschlossenen Fragmente werden
gereinigt, gemischt und durch PCR-Technologie wieder zusammengebaut.
Die zusammengebauten (rekonstruierten) Gene können DNA in einen Expressionsvektor
für das
Expressivieren des Proteins geklont werden. Das Protein kann dann
auf verbesserte Eigenschaften hin analysiert werden.
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Die
PCR-Technik verwendet eine Matrize, die die Sequenz vorm Wildtyp
oder eine rekonstruierte Sequenz gemäß der vorliegenden Erfindung
sein kann. Die Fragmente hybridisieren mit der Matrize in den geeigneten
Regionen (d. h. wo die Homologie zwischen den zwei Strängen am
höchsten
ist), und die verbleibende Sequenz wird durch Verlängerung
des Fragments unter Verwendung der Matrize gemäß der PCR-Technik erzeugt.
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Das
Verfahren der vorliegenden Erfindung stellt verschiedene Vorteile
gegenüber
bekannten Umsetzungstechniken bereit. Zum Beispiel führt bei
anderen DNA-Umsetzungstechniken der Prozess selbst Mutationen über die
gesamte Gensequenz ein. Die vorliegende Erfindung erlaubt die Konzentration
von Mutation auf i) die flankierenden Regionen nach Kombination
von Wildtypfragmenten entweder auf einer bereits rekombinierten
Matrize, die durch das Verfahren der vorliegenden Erfindung erzeugt
würde,
auf einer Matrize, die auf einem anderen Weg mutiert wurde, oder
einem Gen (oder einer Genkombination, z. B. einer Kombination von Antikörpergenen)
mit der gewünschten
Sequenz; oder ii) die Mittelregion nach Rekombination der mutierten Fragmente,
die durch das Verfahren der vorliegenden Erfindung erzeugt wurden,
auf einer Matrize vom Wildtyp.
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Mit
anderen Worten kann, wenn es wünschenswert
ist, ein Gen mit Mutationen bereitzustellen, die in seinen flankierenden
Bereichen konzentriert sind, ein Wildtypfragment, das sich auf die
Mittelregion des Gens bezieht, in Verbindung mit einer rekonstruierten
und/oder mutierten Matrizensequenz für den PCR-Prozess verwendet
werden. Auf diese Weise erzeugt der PCR-Prozess eine komplementäre Sequenz
zu der rekonstruierten/mutierten Matrizensequenz, wenn er das Wildtypfragment
verlängert.
Deshalb wird die resultierende Sequenz im Wesentlichen eine Mittelregion
aufweisen, die der Wildtypsequenz entspricht, und flankierende Regionen
mit eingebauten Mutationen.
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Umgekehrt
kann, wenn es wünschenswert
ist, ein Gen bereitzustellen, das Mutationen aufweist, die in seiner
Mittelregion konzentriert sind, ein rekonstruiertes oder mutiertes
Fragment, das der Mittelregion des Gens entspricht, in Verbindung
mit einem einer Wildtypmatrize bei dem PCR-Prozess verwendet werden.
Auf diese Weise erzeugt der PCR-Prozess durch Verlängern des
mutierten Fragments unter Verwendung der Wildtypmatrize eine Sequenz,
die im Wesentlichen eine mutierte Mittelregion und flankierende
Regionen vom Wildtyp aufweist.
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Weiterhin
erzeugt das Verfahren der vorliegenden Erfindung einen Satz von
progressiv gekürzten DNA-Fragmenten
für jeden
Zeitpunkt, zu dem eine DNA-Probe aus der BAL31-Behandlung entnommen
wird. Die DNA-Proben können
gesammelt und zusammengefasst werden, oder optional können einzelne
Proben ausgewählt
und bei dem Verfahren verwendet werden. So erlaubt die vorliegende
Erfindung eine Selektion, welche DNA-Proben in dem Rekombinationssystem
verwendet werden, und stellt deshalb einen weiteren Freiheitsgrad
bei der Steuerung bereit.
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Das
Verfahren der vorliegenden Erfindung kann an jedem Polynukleotid
durchgeführt
werden, das ein bestimmtes Produkt codiert, z. B. irgendein Produkt
mit Bindungs- oder katalytischen Eigenschaften, z. B. Antikörper oder
Teile von Antikörpern,
Enzyme oder Rezeptoren. Weiterhin kann jedes Polynukleotid, das
eine Funktion aufweist, die beispielsweise durch katalytische RNA
geändert
werden kann, gemäß der vorliegenden Erfindung
umgesetzt werden. Es ist bevorzugt, wenn das Ursprungspolynukleotid,
das ein oder mehrere Proteinmotive codiert, mindestens 12 Nukleotide
lang ist, mehr bevorzugt mindestens 20 Nukleotide lang ist und noch
mehr bevorzugt mindestens 50 Nukleotide lang ist. Polynukleotide,
die mindestens 100 Nukleotide lang sind oder sogar mindestens 200
Nukleotide lang sind, können
verwendet werden. Wo Ursprungspolynukleotide verwendet werden, die
große
Proteine codieren, so wie Enzyme oder Antikörper, können diese viele hundert oder
tausend Basen lang sein. Die vorliegende Erfindung kann bei jeder
Größe des Ursprungspolynukleotids
durchgeführt
werden.
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Die
vorliegende Erfindung stellt auch Polynukleotidsequenzen bereit,
die durch das oben beschriebene Verfahren erzeugt wurden und gewünschte Eigenschaften
aufweisen. Diese Sequenzen können
zum Erzeugen von Gentherapievektoren und Konstrukten für die Therapie
von replikationsdefekten Genen oder für Impfvektoren für DNA-basierte
Impfungen verwendet werden. Weiterhin können die Polynukleotidsequenzen als
Forschungswerkzeuge verwendet werden.
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Die
vorliegende Erfindung stellt auch eine Polynukleotidsequenzbank
bereit, die durch das oben beschriebene Verfahren erzeugt wird und
aus der ein Polynukleotid ausgewählt
werden kann, das ein Protein mit den gewünschten Eigenschaften codiert.
Es ist bevorzugt, dass die Polynukleotidbank eine DNA- oder cDNA-Bank
ist.
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Die
vorliegenden Erfindungen stellen auch Proteine, so wie Antikörper, Enzyme
und Rezeptoren, bereit, die andere Eigenschaften als diejenigen
des Wildtyps haben und die durch das oben beschriebene Verfahren
erzeugt werden. Diese Proteine können
einzeln oder innerhalb eines pharmazeutisch akzeptablen Trägers als
Impfstoffe oder Medikamente für
die Therapie verwendet werden, z. B. als Immunogene, Antigene oder
dergleichen zum Erhalten von spezifischen Antikörpern. Sie können auch
als Forschungswerkzeuge verwendet werden.
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Die
gewünschten
Eigenschaften eines durch die vorliegende Erfindung erzeugten Polynukleotids
oder eines Proteins, das durch ein durch die vorliegende Erfindung
erzeugtes Polynukleotid codiert wird, können jegliche Variation bei
der normalen Aktivität
des (Ursprungs-)Polynukleotids vom Wildtyps oder des Polypeptids,
Proteins oder Proteinmotivs, das hierdurch codiert wird, sein. Z.
B. kann es wünschenswert
sein, die katalytische Aktivität
eines Enzyms zu reduzieren oder zu erhöhen, oder die Bindungsspezifizität eines
Antikörpers
zu verbessern oder reduzieren. Weiterhin kann es, wenn das Protein
oder Polynukleotid ein Immunogen ist, wünschenswert sein, seine Fähigkeit,
spezifische Antikörper
gegen es zu erhalten, zu reduzieren oder zu erhöhen. Das Ursprungspolynukleotid
codiert vorzugsweise ein oder mehrere Proteinmotive. Diese sind
durch Regionen von Polynukleotidsequenz definiert, die eine Polypeptidsequenz
codieren, die eine charakteristische Proteinfunktion hat oder potentiell
hat. Z. B. kann ein Proteinmotiv einen Teil eines Proteins oder
ein gesamtes Protein definieren, beispielsweise ein Epitop oder
einen Spaltungsplatz oder einen katalytischen Platz usw. Innerhalb
des Bereichs der vorliegenden Erfindung muss ein expressiviertes
Proteinmotiv jedoch keine Aktivität zeigen oder "korrekt" gefaltet sein.
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Es
kann wünschenswert
sein, ein Protein zu modifizieren, um die Konformation bestimmter
Epitope zu ändern,
wodurch seine Antigenizität
verbessert und/oder seine Kreuzreaktivität reduziert wird. Z. B. kann
die Modifikation, sollte solch ein Protein als Antigen verwendet
werden, jegliche Kreuzreaktion von gezogenen Antikörpern mit ähnlichen
Proteinen reduzieren.
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Obwohl
der Begriff "Enzyme" verwendet wird,
ist dieser so zu interpretieren, als dass er auch jegliches Polypeptid
mit einer enzymartigen Aktivität,
d. h. einer katalytischen Funktion, einschließt. Z. B. können Polypeptide, die Teil
eines Enzyms sind, immer noch katalytische Funktion besitzen. Gleichermaßen sollte
der Begriff "Antikörper" so ausgelegt werden,
dass er jegliche bindende Substanz abdeckt, die eine bindende Domain mit
der erforderlichen Spezifizität
aufweist. Dies umfasst Antikörperfragmente,
Derivate, funktionale Äquivalente
und Homologe von Antikörpern,
einschließlich
synthetischen Moleküle
und Moleküle,
deren Form diejenige eines Antikörpers
nachbildet, was es ihr ermöglicht,
an ein Antigen oder Epitop anzubinden. Beispiele für Antikörperfragmente,
die in der Lage sind, ein Antigen oder einen anderen Bindungspartner
zu binden, sind ein Fab-Fragment, das aus den VL-, VH-, C1- und
CH1-Domänen
besteht, das Fd-Fragment, das aus den VH- und CH1-Domänen besteht;
das Fv-Fragment, das aus den VL- und VH-Domänen eines Einzelarms eines
Antikörpers
besteht; das dAb-Fragment, das aus einer VH-Domain besteht; isolierte
CDR-Regionen und F(ab')2-Fragmente, ein bivalentes
Fragment, das zwei Fab-Fragmente umfasst, die durch eine Disulfidbrücke in der
Verbindungsregion verknüpft
sind. Einzelketten-Fv-Fragmente sind auch eingeschlossen.
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Um
eine Expression der erzeugten Polynukleotidsequenz zu erhalten,
kann die Sequenz in einen Vektor eingebaut werden, der Steuersequenzen
aufweist, welche operativ an die Polynukleotidsequenz angehängt sind,
um ihre Expression zu steuern. Die Vektoren können andere Sequenzen, wie
beispielsweise Promotoren oder Verstärker umfassen, um die Expression
der eingesetzten Polynukleotidsequenz sowie weiterer Polynukleotidsequenzen
zu steuern, so dass das durch das Polynukleotid codierte Protein
als eine Fusion produziert wird, und/oder Nukleinsäuren, die
Sekretionssignale codieren, so dass das in der Wirtszelle produzierte
Protein von der Zelle sekretiert wird. Das durch die Polynukleotidsequenz
codierte Protein kann dann durch Transformieren des Vektors in Wirtszellen,
in denen der Vektor funktional ist, Kultivieren der Wirtszellen,
so dass das Protein produziert wird, und Bergen des Proteins aus
den Wirtszellen oder dem umgebenen Medium erhalten werden. Prokaryotische
oder eukaryotische Zellen werden zu diesem Zweck im Stand der Technik
verwendet, einschl. Stämmen
von E. coli, Hefe und eukaryotische Zellen, wie beispielsweise COS-
oder CHO-Zellen. Die Wahl der Wirtszellen kann verwendet werden,
um die Eigenschaften des in diesen Zellen expressivierten Proteins
zu steuern, indem z. B. gesteuert wird, wo das Protein in den Wirtszellen
abgelagert wird, oder indem Eigenschaften, wie beispielsweise seine
Glycosylierung, beeinflusst werden.
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Das
durch die Polynukleotidsequenz codierte Protein kann durch im Stand
der Technik wohl bekannte Verfahren expressiviert werden. Bequemerweise
kann die Expression durch Ziehen einer Wirtszelle in einer Kultur,
die solch einen Vektor enthält,
unter geeigneten Bedingungen, die die Expression des Proteins verursachen
oder erlauben, erreicht werden.
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Systeme
zum Klonen und Expressivieren eines Proteins in einer Vielzahl von
unterschiedlichen Wirtszellen sind wohl bekannt. Geeignete Wirtszellen
umfassen Bakterien, eukaryotische Zellen, wie beispielsweise Säugetierzellen
und Hefe, und Baculovirussysteme. Säugetierzelllinien, die im Stand
der Technik zur Expression eines heterologen Polypeptids verfügbar sind,
umfassen Eierstockzellen des chinesischen Hamsters, HeLa-Zellen,
Babyhamsternierenzellen, COS-Zellen und viele andere. Ein üblicher,
bevorzugter bakterieller Wirt ist E. coli.
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Geeignete
Vektoren, die angemessene Regelsequenzen aufweisen, einschließlich Promotorsequenzen,
Terminatorsequenzen, Polyadenylierungssequenzen, Verstärkersequenzen,
Markierungsgene oder andere Sequenzen, können je nach Bedarf ausgewählt oder
konstruiert werden. Vektoren können
je nach Bedarf Plasmide, viral, z. B. Phagen, oder Phagemide sein.
Bezüglich
weiterer Details siehe z. B. Molecular Cloning: a Laboratory Manual:
2. Auflage, Sambrook et al., 1989, Cold Spring Harbor Laboratory
Press. Viele bekannte Techniken und Protokolle zur Manipulation
von Polynukleotidsequenzen, z. B. bei der Präparation von Polynukleotidkonstrukten,
bei der Mutationserzeugung, beim Sequenzieren, bei der Einführung von
DNA in Zellen und bei der Genexpression sowie zur die Analyse von
Proteinen sind detailliert in Current Protocols in Molecular Biology,
Ausubel et al. Hrsg., John Wiley & Sons,
1992 beschrieben.
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Das
FIND-System kann zur Erzeugung der DNA-Banken verwendet werden,
die verschiedene variable Sequenzen aufweisen und die nach der gewünschten
Proteinfunktion auf eine Anzahl von Wegen gescreent werden können. Phagenanzeige
kann zum selektiven Binden (Griffith et al., EMBO J. 113: 3245-3260,
1994) oder Screenen nach Enzymfunktion (Crameri A. et al, Nature
1998 15; 391 (6664): 288-291; Zhang J. H. et al, PNAS. USA 1997
94 (9): 4504-4509; Warren M.S. et al, Biochemistry 1996, 9; 35 (27):
8855-8862) verwendet werden. Ein Protein, das durch die vorliegende
Erfindung bereitgestellt wird, kann beim Screenen nach Molekülen verwendet
werden, die seine Aktivität
oder Funktion beeinflussen oder modulieren. Solche Moleküle können in
einem therapeutischen (möglicherweise
auch einem prophylaktischen) Kontext nützlich sein.
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Die
vorliegende Erfindung stellt auch Vektoren bereit, die Polynukleotidsequenzen
aufweisen, welche durch das oben beschriebene Verfahren erzeugt
wurden.
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Die
vorliegende Erfindung stellt auch Zusammensetzungen bereit, die
entweder Polynukleotidsequenzen, Vektoren, die diese Polynukleotidsequenzen
aufweisen, oder Proteine, die durch das oben beschriebene Verfahren
erzeugt wurden, und einen pharmazeutisch akzeptablen Träger oder
einen für
Forschungszwecke geeigneten Träger
aufweisen.
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Die
vorliegende Erfindung stellt auch ein Verfahren bereit, das nach
der Identifikation des Polynukleotids oder Polypeptids mit den gewünschten
Eigenschaften durch das oben beschriebene Verfahren die Herstellung
dieses Polypeptids oder Polynukleotids als Ganzes oder in Teilen
aufweist, optional in Verbindung mit zusätzlichen Polypeptiden oder
Polynukleotiden.
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Nach
der Identifikation eines Polynukleotids oder Polypeptids, das die
gewünschten
Eigenschaften aufweist, können
diese dann durch wohl bekannte Techniken, wie beispielsweise PCR
oder Klonen einer Expression innerhalb einer Wirtszelle, hergestellt
werden, um eine größere Anzahl
bereitzustellen. Die resultierenden Polypeptide oder Polynukleotide
können
bei der Herstellung von Medikamenten zur diagnostischen Verwendung,
pharmazeutischen Verwendung, Therapie usw. verwendet werden. Dies
wird unten weiter diskutiert werden. Alternativ kann das hergestellte
Polynukleotid oder Polypeptid als Forschungswerkzeug verwendet werden,
d. h., Antikörper
können
in Immuntests verwendet werden, und Polynukleotide können als
Hybridisierungssonden oder -primer verwendet werden. Die Polypeptide
oder Polynukleotide, die durch das erfindungsgemäße Verfahren erzeugt und als
die wünschenswerten
Eigenschaften aufweisend identifiziert werden, können in pharmazeutische Zusammensetzungen
formuliert werden. Diese Zusammensetzungen können zusätzlich zu einer der obigen
Substanzen ein pharmazeutisch akzeptables Verdünnungsmittel, einen pharmazeutisch
akzeptablen Träger,
einen pharmazeutisch akzeptabeln Puffer, einen pharmazeutisch akzeptablen Stabilisator
oder andere Materialien aufweisen, die dem Fachmann wohl bekannt
sind. Solche Materialien sollten nicht-toxisch sein und sollten
nicht mit der Wirksamkeit des aktiven Inhaltsstoffs wechselwirken.
Die genaue Art des Trägers
oder des anderen Materials kann von der Verabreichungsroute abhängen, z.
B. der oralen, intravenösen,
kutanen oder subkutanen, nasalen, intramuskulären oder intraperitonalen Route.
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Pharmazeutische
Zusammensetzungen für
die orale Verabreichung können
in Tabletten-, Kapsel-, Pulver- oder flüssiger Form vorliegen. Eine
Tablette kann einen festen Träger,
wie beispielsweise Gelatine oder ein Adjuvans aufweisen. Flüssige pharmazeutische
Zusammensetzungen umfassen allgemein einen flüssigen Träger, wie beispielsweise Wasser,
Petroleum, tierische oder Pflanzenöle, Mineralöl oder synthetisches Öl. Physiologische
Salzlösung,
Dextrose- oder andere Saccharidlösungen
oder Glycole, wie beispielsweise Ethylen, Glycol, Propylenglycol
oder Polyethylenglycol, können
eingeschlossen werden.
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Zur
intravenösen,
kutanen oder subkutanen Injektion oder zur Injektion am Ort der
Erkrankung wird der aktive Inhaltsstoff in der Form einer parenteral
akzeptablen wässrigen
Lösung
vorliegen, die keimfrei ist und einen geeigneten pH-Wert, eine geeignete
Isotonizität
und eine geeignete Stabilität
aufweist. Der Fachmann ist wohl in der Lage unter Verwendung von
z. B. isotonischen Vehikeln, so wie Natriumchloridinjektionslösung, Ringer-Injektionslösung und
mit Lactat versetzter Ringer-Injektionslösung, geeignete
Lösungen
zuzubereiten. Konservierungsstoffe, Stabilisatoren, Puffer, Antioxidationsmittel
und/oder andere Zusätze
können, falls
erforderlich, eingeschlossen werden.
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Je
nachdem, ob es sich um ein Polypeptid, beispielsweise einen Antikörper oder
ein Fragment desselben, ein Enzym, ein Polynukleotid oder ein Nukleinsäuremolekül handelt,
der/das nach Erzeugen durch die vorliegende Erfindung identifiziert
wurde und an ein Individuum zu verabreichen ist, erfolgt die Verabreichung vorzugsweise
in einer "prophylaktisch
wirksamen Menge" oder
einer "therapeutisch
wirksamen Menge" (je nach
Einzelfall, obwohl Prophylaxe als Therapie angesehen werden kann),
die jeweils ausreichend ist, um Nutzen für das Individuum zu erbringen.
Die tatsächlich
verabreichte Menge und die Rate und der Zeitverlauf der Verabreichung
werden von der Art und Ernsthaftigkeit dessen abhängen, was
behandelt wird. Die Verschreibung der Behandlung, beispielsweise
Entscheidungen über
die Dosierung usw., liegen innerhalb der Verantwortlichkeit des
Allgemeinmediziners oder anderer medizinischer Doktoren und berücksichtigt
typischerweise die zu behandelnde Störung, den Zustand des einzelnen
Patienten, den Ort der Verabreichung, das Verfahren der Verabreichung
und andere Faktoren, die dem Praktiker bekannt sind. Beispiele der
Techniken und Protokolle, die oben erwähnt sind, können in Remington's Pharmaceutical
Sciences, 16. Auflage, Osol, A.(Hrsg.), 1980, gefunden werden.
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Alternativ
können
zielgerichtete Therapien verwendet werden, um das aktive Mittel
unter Verwendung von zielgerichteten Systemen, wie beispielsweise
Antikörpern
oder zellspezifische Liganden, spezifischer an bestimmte Arten von
Zellen auszutragen. Das Zielrichten kann aus einer Vielzahl von
Gründen
wünschenswert sein;
z. B. wenn das Mittel in unakzeptabler Weise toxisch ist oder falls
es anderweitig eine zu hohe Dosierung erfordern würde oder
falls es anderweitig nicht in der Lage wäre, in die Zielzellen einzutreten.
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Statt
diese Mittel direkt zu verabreichen, können Sie in den Zielzellen
durch Expression von einem codierenden Gen erzeugt werden, das in
die Zellen eingeführt
wurde, beispielsweise in einem viralen Vektor (eine Variante VDEPT-Technik).
Der Vektor könnte
auf die zu behandelnden spezifischen Zellen zielgerichtet werden,
oder er könnte
regulatorische Elemente enthalten, die durch die Zielzellen mehr
oder weniger selektiv eingeschaltet werden.
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Alternativ
könnte
das Mittel in einer Vorstufenform verabreicht werden zur Umwandlung
in die aktive Form durch ein aktivierendes Mittel, das in den zu
behandelnden Zellen produziert oder auf diese gerichtet wird. Diese
Art von Ansatz ist manchmal als ADEPT oder VDEPT bekannt, wobei
der erstere das Zielrichten des aktivierenden Mittels auf die Zellen
durch Konjugation zu einem zellspezifischen Antikörper umfasst,
während
der letztere das Produzieren des aktivierenden Mittels, beispielsweise
eines Enzyms, in einem Vektor durch Expression von codierender DNA
in einem viralen Vektor umfasst (s. z. B. EP-A-415 731 und WO 90/07936).
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Eine
Zusammensetzung kann allein oder in Kombination mit anderen Behandlungen
verabreicht werden, entweder gleichzeitig oder aufeinander folgend,
abhängig
von dem zu behandelnden Zustand.
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Als
eine weitere Alternative könnte
das Polynukleotid, das als die wünschenswerten
Eigenschaften aufweisend nach der Erzeugung durch das Verfahren
der vorliegenden Erfindung identifiziert wurde, in einem Gentherapieverfahren
verwendet werden, um einen Patienten zu behandeln, der nicht in
der Lage ist, das aktive Polypeptid zu synthetisieren, das durch
das Polypeptid codiert wird, oder nicht in der Lage ist, dieses
auf einem normalen Niveau zu synthetisieren, wodurch der Effekt
bereitgestellt wird, der durch das entsprechende Protein vom Wildtyp
bereitgestellt wird.
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Vektoren,
wie beispielsweise virale Vektoren, sind im Stand der Technik verwendet
worden, um Polynukleotide in eine große Vielzahl von unterschiedlichen
Zielzellen einzuführen.
Typischerweise werden die Zielzellen gegenüber den Vektoren ausgesetzt,
so dass eine Transfektion bei einem ausreichenden Anteil der Zellen
stattfinden kann, um einen nützlichen
therapeutischen oder prophylaktischen Effekt durch die Expression
des gewünschten
Polypeptids bereitzustellen.
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Die
transfektierte Nukleinsäure
kann dauerhaft in das Genom jeder der angezielten Tumorzellen eingebaut
werden, was für
lang anhaltenden Wirkung sorgt, oder alternativ kann die Behandlung
periodisch zu wiederholen sein.
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Eine
Vielzahl von Vektoren, sowohl von viralen Vektoren, als auch von
Plasmidvektoren sind im Stand der Technik bekannt, siehe das US-Patent
Nr. 5,252,479 und die WO 93/07282. Insbesondere ist eine Anzahl von
Viren als Gentransfervektoren verwendet worden, einschl. Papovaviren,
wie beispielsweise SV40, Vacciniavirus, Herpesviren, einschl. HSV
und EBV, und Retroviren. Viele Gentherapieprotokolle im Stand der
Technik haben geschwächte
Mausretroviren verwendet.
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Als
Alternative zur Verwendung von viralen Vektoren umfassen andere
bekannte Verfahren zum Einführen
von Nukleinsäure
in Zellen Elektroporation, Kalziumphosphat, Copräzipitation, mechanische Techniken,
wie beispielsweise Mikroinjektion, Transfer vermittelt durch Liposome
und direkte DNA-Aufnahme
sowie Rezeptor-vermittelten DNA-Transfer.
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Wie
oben erwähnt
wurde, ist das Ziel von Gentherapie, die Nukleinsäure verwendet,
die ein Polypeptid oder einen aktiven Anteil davon codiert, die
Menge des Expressionsprodukts der Nukleinsäure in Zellen zu erhöhen, in
denen das Niveau des Polypeptids vom Wildtyp fehlt oder nur auf
reduzierten Niveaus vorliegt. Solch eine Behandlung kann therapeutisch
bei der Behandlung von Zellen sein, die bereits von Krebs befallen
sind, oder prophylaktisch bei der Behandlung von Individuen, die
durch Screenen dafür
bekannt sind, dass sie ein empfängliches
Allel aufweisen und deshalb eine Prädisposition in Bezug auf z.
B. Krebs.
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Die
vorliegende Erfindung stellt auch ein Kit zum Erzeugen einer Polynukleotidsequenz
bzw. einer – Sequenzpopulation
mit gewünschten
Eigenschaften bereit, das eine Exonuklease und Komponenten zum Durchführen einer
PCR-Technik aufweist, z. B. thermostabile DNA (Nukleotide) und ein
Stoppmittel, z. B. EGTA.
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Die
hiesigen Anmelder haben die oben beschriebene Technologie als FIND
(Fragment-induzierte Nukleotiddiversität) bezeichnet.
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Wie
oben dargelegt wurde, sorgt das FIND-Programm gemäß der vorliegenden
Erfindung bequemerweise für
die Erzeugung von mutierten Antikörpergensequenzen und deren
zufällige
Kombination zu funktionalen Antikörpern mit wünschenswerten Eigenschaften.
Als ein Beispiel dieses Aspekts der Erfindung werden die Antikörpergene
durch fehlerbehaftete PCR mutiert, was in eine Mutationsrate von
ungefähr
0,7 % resultiert. Der resultierende Pool von mutierten Antikörpergenen
wird dann mit einer Exonuklease aufgeschlossen, vorzugsweise BAL31,
und die Reaktion wird durch Zugabe von EGTA zu bestimmten Zeitpunkten
gestoppt, was in einen Satz von DNA-Fragmenten unterschiedlicher
Größen resultiert.
Diese können
dann wie oben beschrieben einem PCR-basierten Wiederzusammenbau
unterworfen werden. Die resultierenden wieder zusammengebauten DNA-Fragmente werden
dann geklont, und eine Genbank wird aufgebaut. Klone können dann aus
dieser Bank ausgewählt
und sequenziert werden.
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Eine
weitere Anwendung der FIND-Technologie ist die Erzeugung einer Population
von variablen DNA-Sequenzen, die für weitere Selektionen und Analysen
verwendet werden kann. Neben dem Kodieren größerer Proteine, z. B. von Antikörperfragmenten
und Enzymen, kann die DNA Peptide codieren, bei denen die funktionalen
Eigenschaften der Moleküle
für die
Auslegung unterschiedlicher Selektionssysteme verwendet werden können. Die
Selektion von rekombinierten DNA-Sequenzen, die Peptide codieren,
ist zuvor beschrieben worden (Fisch et al, PNAS. USA 1996 Jul 23;
93 (15): 7761-7766).
Zusätzlich
kann die variable DNA-Population verwendet werden, um eine Population
von RNA-Molekülen mit
beispielsweise katalytischen Aktivitäten zu produzieren. Vaish et
al (PNAS. USA, 3. März
1998; 95 (5): 2158-2162) demonstrierten die Auslegung von funktionalen
Systemen für
die Selektion von katalytischer RNA, und Eckstein F (Ciba Found.
Symp. 1997; 209; 207-212) hat die Anwendungen von katalytischer
RNA durch die spezifische Einführung
von katalytischer RNA in Zellen dargelegt. Das FIND-System kann
verwendet werden, um den Sequenzraum bei der Selektion von funktionalen
Peptiden/Molekülen
mit katalytischen Aktivitäten
basierend auf rekombinierten DNA-Sequenzen
weiter zu durchsuchen.
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Aspekte
und Ausführungsformen
der vorliegenden Erfindung werden jetzt unter Bezugnahme auf die beigefügten Zeichnungen
anhand von Beispielen illustriert werden. Weitere Aspekte und Ausführungsformen werden
vom Fachmann erkannt werden. Alle in diesem Text erwähnten Dokumente
werden hier durch Bezugnahme eingeschlossen.
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Kurzbeschreibung
der Zeichnungen
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1 zeigt
die prinzipiellen Schritte des Umsetzens von spezifischen DNA-Sequenzen
zwischen unterschiedlichen Klonen;
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2 zeigt
die prinzipiellen Schritte bei der PCR-Verlängerung von Exonukleasebehandelten
Gensequenzen.;
-
3 zeigt
die prinzipiellen Schritte bei der PCR-Verlängerung von langen Fragmenten
von Exonuklease-behandelten Gensequenzen. Die Verwendung von langen
Fragmenten resultiert dahinein, dass die Mittelregion des Gels nicht
rekombiniert wird. Diese Region kann jedoch zufällige Mutationen enthalten.
Die Mitte der Gensequenz kann sich so von anderen Klonen unterscheiden.
Die Mittelregion der Sequenz kann sich in ihrer Länge unterscheiden,
aber durch Verwendung von längeren
Primern kann die Mittelregion abgedeckt werden;
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4 zeigt
die prinzipiellen Schritte bei der PCR-Verlängerung von kurzen Fragmenten
von Exonuklease-behandelten Gensequenzen. Die Verwendung von kurzen
Fragmenten resultiert dahinein, dass die Mittelregion des Gens rekombiniert
wird. Wenn eine längere
Reaktionszeit für
den Exonukleaseaufschluss verwendet wird, wird ein Satz von Fragmenten
von unterschiedlichen Längen
erzeugt. Wenn die Fragmente kurz sind, werden einige Fragmente weg
von der Mittelregion der Gensequenz angeordnet sein, wodurch eine
Rekombination der Mittelsequenz ermöglicht wird;
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5 zeigt
das Erscheinungsbild von DNA in unterschiedlichen festen Zeitintervallen
nach Aufschluss mit BAL31-Nuklease. Die DNA wurde mit dem Enzym
vermischt und bei 30 °C
inkubiert. Zu unterschiedlichen Zeitpunkten wurden Proben entnommen,
und die enzymatische Aktivität
wurde durch Zugabe von 20 mM EGTA gestoppt. Die Proben von unterschiedlichen
Zeitpunkten wurden gereinigt und auf einem 2 % Agarosegel analysiert.
Die Proben sind wie folgt bezeichnet: 1 Kb = DNA-Molekülmarker 1; 2 – 10m =
2 bis 10 min. BAL31-Inkubationsbeispiele;
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6 zeigt
A) das theoretische Einsetzen nach Restriktionsaufschluss des Fragments,
das aus der Primer-Kombination FIND 1, pBR322 Nhel-vorwärts-STOPP-Primer
mit umgekehrtem (engl.: reversed) pBR322-Eagl-Primer, resultiert.
Dies wird FIND 1 und SEQ ID #5 bezeichnet; und B) das theoretische
Einsetzen nach Restriktionsaufschluss des Fragments, das aus der
Primer-Kombination pBR322-HindIII-Vorwärtsprimer und pBR322-SaII-Umkehrstoppprimer
resultiert. Dies wird FIND 3 und SEQ ID #6 bezeichnet; und
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7 zeigt
die experimentell bestimmten Sequenzen der zwei ersten FIND-Klone
nach automatisiertem Sequenzieren. A) zeigt die FIND 1-Sequenz,
wobei der STOPP-Kodon fett markiert ist (SEQ ID #7); und B) zeigt
die FIND 3-Sequenz, wobei der STOPP-Kodon unterstrichen ist (SEQ
ID #8).
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8 zeigt
die Sequenz von pEXmid V (4055bp), wobei die Ncol- und Sall-Plätze unterstricken
markiert sind (SEQ ID #9).
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Detaillierte
Beschreibung und Beispielsbelegung der Erfindung
-
Ein
Aspekt der DNA-Umsetzungsprozedur kann durch die in 1 gezeigten
Schritte illustriert werden. Bei diesem Beispiel wird das Gen verwendet,
das Tetracyclin-Resistenz (Tet-R) bei dem Plasmid pBR322 codiert.
Zwei Klone wurden durch platzgerichtete Mutationserzeugung erzeugt;
einer mit einem konstruierten Stoppkodon nahe dem 5'-Terminus und einer
mit einem Stoppkodon nahe dem 3'-Terminus
des Tet-R-Gens. Der Phenotyp dieser zwei Gene ist Tetracyclin-sensitiv.
Durch Mischen der beiden Klone in äquimolaren Mengen und Aufschließen mit
BAL31 wurden Revertanten selektiert. Nach dem Klonen der wieder
zusammengebauten Gene (unter Kombination der beiden Genen, die die
beiden Stoppkodons tragen) wurden Revertanten mit einer Frequenz
von 16 % detektiert, d. h. 16 % der Klone waren Tetracyclin-resistent.
Das Experiment verwandte die Ampicillin-Beständigkeit
bei pBR322 für
die primäre
Selektion, und dann wurden einzelne Amp-R-Klone unter Tetracyclinselektion
getestet (siehe die Übersicht
in 1 und die theoretische Betrachtung in 2).
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Eine
detailliertere Beschreibung von Beispielen der vorliegenden Erfindung
wird unten gegeben werden.
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Reagenzien:
-
AmpIiTaq®-Polymerase
wurde von Perkin-Elmer Corp., dNTP von Boehringer Mannheim Biochemica (Mannheim,
Deutschland) und BAL31-Nuklease von New England Biolabs Inc. (Beverly,
USA) erworben. Klenow-Enzym wurde von Amersham erworben. Alle Restriktionsenzyme
wurden von Boehringer Mannheim Biochemica (Mannheim, Deutschland)
erworben. Ethidiumbromid wurde von Bio-Rad Laboratories (Bio-Rad
Laboratories, Hercules, CA, USA) erworben. T4-DNA-Ligase wurde von
Appligene Inc. (Pleasanton, CA, USA) erworben.
-
Alle
Primer wurden im Labor konstruiert und mit einem Applied Biosystems
391 DNA-Synthetisierer synthetisiert.
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PCR:
-
Alle
Polymerasekettenreaktionen (Polymerase Chain Reactions = PCR) wurden
in einem automatischen Thermozykler (Perkin-Elmer Cetus 480, Norwalk,
CT, USA) durchgeführt.
PCR-Techniken für die Verstärkung von
Nukleinsäuren
sind in dem US-Patent Nummer 4,683,195 beschrieben. Die PCR-Reaktionen
liefen bei unterschiedlicher Anzahl an Zyklen ab, die das folgende
Profil aufwiesen: Denaturierung (94 °C, 1 Minute), Primeranlassen
(55 °C,
1 Minute) und Ausweitung (72 °C,
1 Minute) unter Anwendung einer Rampenzeit von 1 Sekunde. Die PCR-Reaktionen
enthielten, soweit nichts anderes angegeben ist, 5 μl jedes Primers
(20 μM),
8 μl dNTP
(1,25 mM jeweils von dTTP, dATP, dCTP und dGTP), 10 μl 10 × Reaktionspuffer,
0,5 μl thermostabile
DNA-Polymerase AmpliTaq® (5U/μ) (Perkin-Elmer
Corp.) und Wasser auf ein Endvolumen von 10 μl. Bei allen PCR-Experimenten
wurden diese Parameter verwendet, und die Anzahl der Reaktionszyklen
wurde variiert. Quellen zur allgemeinen Verwendung PCR-Techniken
umfassen Mullis et al, Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol., 51:263,
(1987), Ehrlich (Hrsg.), PCR Technology, Stockton Press, NY, 1989,
Ehrlich et al, Science, 252: 1643-1650, (1991), "PCR protocols; A Guide to Methods and
Applications", Hrsg.
Innis et al, Academic Press, New York (1990).
-
Sequenzieren:
-
Alle
Konstrukte sind unter Verwendung eines Taq DyedeoxyTM Terminator
Cycle Sequencing Kits sequenziert worden. Das Sequenzieren wurde
auf einem ABI Prism 373 DNA-Sequenzierer durchgeführt.
-
Agaroseelektorphorese:
-
Agaroselektrophorese
von DNA wurde mit 2 % Agarosegelen durchgeführt, die aus 1 % NuSieve® GTG® Low
Melting AGAROSE (FMC Bioproducts, Rockland, ME, USA) und 1% AMRESCO®-Agarose (AMRESCO,
SOLON, OH, USA) mit 0,25 μg/ml
Ethidiumbromid in Tris-Acetatpuffer (TAE-Puffer 0,04 M Tris-Actetat, 0,001 M
EDTA) zusammengesetzt waren. Proben für die Elektrophorese wurden
mit einem sterilen filtrierten Ladungspuffer gemischt, der aus 25
% Ficol und Bromphenolblau zusammengesetzt war, und in die Vertiefungen
in dem 2 % Agarosegel geladen. Die Elektrophorese lief bei 90 V
für 45
min., soweit nichts anderes angegeben ist in Tris-Acetatpuffer mit
0,25 μg/ml
Ethidiumbromid. Bänder
von geeigneter Größe wurden
unter Verwendung des Qiaquick Gel Extraction Kits (Oiagen GmbH,
Hilden, Deutschland) gelgereinigt. Als Molekulargewichtsstandard
wurde DNA-Molekulargewichtsmarker 1 (Boehringer Mannheim GmbH, Deutschland) verwendet.
Die DNA-Konzentration der gelextrahierten Produkte wurde unter Verwendung
eines Spektrophotometers abgeschätzt
(s. 5).
-
Bakterienstämme:
-
Der
Escherichia coli-Stamm E. coli BMH71-18 (supE thi Δ(lac-proAB)
F' [proAB+ laclq Δ(lacZ)M15]), wurde
als bakterieller Wirt für
Transformationen verwendet. Chemisch kompetente Zellen dieses Stamms
wurden grundsätzlich
so wie von Hanahan, D. 1983, Studies on transformation of Escherichia
coli with plasmids, J. Mol. Biol. 166: 557-580, beschrieben erzeugt.
Elektrokompetente Zellen dieses Bakterienstamms wurden erzeugt (Dower,
W.J., J.F. Miller, und C.W. Ragsdale. 1988: High efficiency transformation
of E.coli by high voltage electroporation. Nucleic Acids Res. 16:6127.
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Plasmide:
-
Das
Tetracyclin-Resistenzgen von pBR322 ist 1191 bp (Basenpaare) lang.
Eine Variante des Plasmids pBR322 mit zerstörtem Tetracyclin-Resistenzgen
wurde durch Spalten des Plasmids mit den Restriktionsenzymen SaII
und BamHI konstruiert. Dies resultiert in eine Entfernung eines
276 bp-Fragments
innerhalb des Tetracyclin-Gens. Eine Spaltungsreaktion mit HindIII
und Eagl und dem zerstörten
Plasmid würde
theoretisch zu einem 634 bp-Spaltungsprodukt führen, während ein pBR322 vom Wildtyp
gespalten mit diesen Enzymen ein 910 bp-Produkt erzeugt. Die nach
der Spaltung resultierenden vorstehenden Einzelstrangüberhänge des zerstörten Plasmids
wurden mit Klenow- Enzym
behandelt, um Doppelstrangenden an beiden Enden des Plasmids zu
erzeugen. Diese Enden wurden dann gemäß Molecular Cloning; A LABORATORY
MANUAL (2. Auflage, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989) mit
stumpfen Enden ligatiert. Das resultierende Plasmid wurde in chemisch
kompetentes E.coli BMH 71-18 transformiert und dann auf Ampicillin-enthaltende
Platten (100 μg/ml)
aufgebracht. Wenn sie erneut auf Tetracyclin-enthaltende Agarplatten
(10 μg/ml)
aufgebracht wurden, waren die Kolonien Tetracyclin-sensitiv.
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Externe Primer:
-
Zwei
externe Primer, die das Tetracyclin-Gen von pBR322 umgeben, wurden
mit den folgenden Sequenzen konstruiert, die bezeichnete einmalige
Restriktionsplätze
umfassen:
pB R322-HindIII-Vorwärtsprimer:
5'-CAGCTTATCATCGATAAGCTTTAATGCGGTAGTTTAT-3' (SEQ ID #1)
und
umgekehrter pBR322-Eagl-Primer:
5'-CGTAGCCCAGCGCGTCGGCCGCCATGCCGGCGATAATG-3' (SEQ ID #2)
-
Um
zu zeigen, dass die zwei externen Primer die funktionalen Teile
des Tetracyclin-Gens abdecken, wurde eine PCR-Reaktion mit dem oben
erwähnten
Profil für
eine 30 Zyklen-PCR mit pBR322 (259 ng) als Matrize und dem oben
beschriebenen externen Primern angewendet. Dies ergab nach nachfolgender
Spaltung mit HindIII und Eagl ein PCR-Produkt von 910 bp. Wenn dieses
Restriktionsprodukt in ein in gleicher Weise restriktionsaufgeschlossenes
pBR322-Plasmid geklont wurde, codierte das Plasmid einen Tetracyclin-resistenten
Phenotyp. Dies wurde nach Transformation einer Ligatur des Plasmids
und des 910 bp PCR-Produkts in einen E.coli-Wirt BMH 7118 aufgebracht
auf Tetracyclin-enthaltende Agarplatten (10 μg/ml) detektiert.
-
STOPP-enthaltende Primer:
-
Zwei
mutationserzeugende pBR322-Vorwärtsprimer
und zwei umgekehrte pBR322-Primer, die einmalige Restriktionsplätze und
jeweils einen STOPP-Kodon an verschiedenen Stellen enthielten, wurden
konstruiert. Diese waren:
pBR322-Nhel-Vorwärts-STOPP:
5'-CACTATGGCGTGCTGCTAGCGCTATATGCGTTGATGCAATTTCTATGAGCACCCGTTCT-3'. (SEQ ID #3)
pBR322-Sall-Umgekehrt-STOPP:
5'-TCTCAAGGGCATCGGTCGACGCTCTCCCTTATGCGACTCCTGCATTAGGAATCAGCCCAGTAGTA
-3' (SEQ ID #4)
-
Erzeugung von STOPP-Kodon-enthaltenden
Varianten von pBR322-Plasmiden.
-
Vier
verschiedene Varianten des Tetracyclin-Gens wurden konstruiert.
Eine Kombination eines mutierten Vorwärts- oder umgekehrten Primers
mit dem entsprechenden externen Vorwärts- oder umgekehrten Primer
wurde in PCR-Reaktionen verwendet, um mutierte Einsetzungen zu erzeugen.
Das Plasmid pBR322 wurde als Matrize (250 ng) bei 40 PCR-Zyklen
verwendet. Die resultierenden restriktionsaufgeschlossenen Fragmente
wurden dann in Tetracyclin-zerstörtes
pBR322 geklont, und die resultierenden Klone wurden als FIND1 und
FIND3 bezeichnet.
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Die
folgenden Primerkombinationen wurden verwendet:
FIND 1, pBR322-Nhel-Vorwärts-STOPP-Primer
mit umgekehrtem pBR322-Eagl-Primer. Diese Kombination ergab nach
Restriktionsaufschluss die Einsetzung, wie sie in 6A gezeigt
ist; und
FIND 3, pBR322-HindIII-Vorwärtsprimer mit umgekehrtem pBR322-Sall-STOPP-Primer.
Diese Kombination ergab nach Restriktionsaufschluss die Einsetzung,
wie sie in 6B gezeigt ist,.
-
Die
verstärkten
PCR-Produkte wurden auf einem 2 % Agarosegel analysiert. Die Elektrophorese
lief bei 90 V für
40 min. wie oben beschrieben wurde. Bänder von verglichen mit dem
Molekulargewichtsstandard geeigneter Größe (1000 bP) wurden ausgeschnitten
und unter Verwendung des Qiaquick Gel Extraction Kits gelgereinigt.
Die vier unterschiedlichen STOPPenthaltenden Einsetzungen wurden
dann mit den bei den obigen Primern bezeichneten Restriktionsenzymen
gespalten. Für
Jede Einsetzung wurde ein Pool von Plasmid pBR322 mit denselben
Enzymen gespalten, und diese vier Kombinationen wurden dann gemäß dem modifizierten
Protokoll von Detlef (Modified Hanahan, revidiert M. Scott, F. Hochstenbach
und D. Güssow
1989) in chemisch kompetentes E.coli BMH 71-18 ligatiert und transformiert.
Die Transformanten wurden dann auf Ampicillin-enthaltende Agarplatten
(50 μg/ml)
aufgetragen. Wenn sie erneut auf Tetracyclinenthaltende Agarplatten
(10 μg/ml)
aufgetragen wurden, überlebten
keine Kolonien, was den funktionalen Effekt des in das Tetracyclin-Gen
eingeführten
STOPP-Kodons bestätigt.
Plasmide der vier unterschiedlichen FIND-Klone wurden mit dem Qiagen
Plasmid Midi Kit (Qiagen Inc., Chatsworth, CA, USA) zubereitet.
Die Plasmide der vier Klone wurden unter Verwendung eines Taq DyedeoxyTM Terminator Cycle Sequencing Kits sequenziert.
Das Sequenzieren wurde auf einem ABI Prism 373 DNA-Sequenzers durchgeführt. Die
STOPP-Kodons und die Einsetzungen wurden als korrekt bestätigt.
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FIND-EXPERIMENT I:
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Erzeugung von FIND-Fragmenten
für BAL31-Nukleaseaufschluss.
-
PCR-Fragmente
von FIND1 und FIND3 wurden durch Laufenlassen von PCR-Reaktionen
mit FIND 1- und
FIND 3-Plasmiden als Matrize (500 ng) und mit den beiden externen
Primern, pBR322-HindIII-Vorwärtsprimer
und umgekehrtem pBR322-Eagl-Primer, erzeugt. Die PCR-Zyklen waren
für 30
Zyklen so wie oben beschrieben. Die verstärkten PCR-Produkte wurden mit
20 μl Ladepuffer
(25 Ficoll und Bromphenolblau ) vermischt und auf einem 2 % Agarosegel
analysiert. Die Elektrophorese lief bei 90 V für 35 min, wie zuvor beschrieben
wurde. Bänder
von geeigneter Größe wurde
ausgeschnitten und unter Verwendung des Qiaquick Gel Extraction
Kits gelgereinigt. Die DNA-Konzentration
wurde für
das FIND-1-PCR-Fragment auf 112,25 μg/ml und für das FIND-3-PCR-Fragment auf 110 μg/ml abgeschätzt.
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BAL31-Nukleasebehandlung
-
Jeweils
5 μg FIND
1- und FIND 3-PCR-Fragmente (7A und
B) wurden in äquimolaren
Mengen zusammen mit 100 μl
2 × BAL31-Puffer
und 10 μl
sterilem Wasser auf ein Endvolumen von 200 μl vermischt. Ein kleineres Volumen
von 22,5 μl
wurde zubereitet, um als enzymatisch unbehandelte Nullprobe zu verbleiben.
Diese bestand aus 4,5 μl
FIND 1-Fragment und 4,5 μl
FIND 3, 11,25 μl
2 × BAL31-Nukleasepuffer
und 2,25 μl
sterilem Wasser. 1,5 ml sterile Eppendorfröhrchen mit DNA und 2 × BAL31-Nukleasepuffer
und Wasser wie beschrieben, wurden in einem 30 °C Wasserbad in einem Kaltraum
von 4 °C
für 10
min. vorinkubiert. In der Zwischenzeit wurden 5 sterile Eppendorfröhrchen mit
jeweils 4 μl
einer 200 mM EGTA-Lösung
vorbereitet. Diese wurden mit 1 bis 9 Minuten markiert. Auf dieselbe
Weise wurde ein Röhrchen
mit 2,5 μl
200 mM EGTA für
die unbehandelte Nullproben-DNA-Lösung vorbereitet.
Die Arbeitskonzentration von EGTA beträgt 20 mM. Nach den 10 min.
Vorinkubation wurde BAL31-Nuklease zu dem Röhrchen mit dem größeren Volumen
auf eine Endkonzentration von 1 Unit/μg DNA (10 μl einer 1 U/μl Lösung) zugegeben. Nach t = 1,
3, 5, 7 und 9 min. wurde das Röhrchen
gemischt, und Proben von 36 μl
wurden entfernt und in die Röhrchen
mit 4 μl
EGTA eingegeben und auf Eis gelegt. Zur selben Zeit wurde das Nullprobenvolumen
von 22,5 μl
entfernt und zu den vorbereiteten 2,5 μl EGTA zugegeben sowie ebenfalls
auf Eis gelegt. Die Röhrchen
wurden dann für
die Hitzeinaktivierung des Enzyms in ein 65 °C Wasserbad gegeben und dann
wieder auf Eis gelegt.
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Reinigung von Aufschluss-erzeugten
Fragmenten:
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Die
Volumen in den Röhrchen
wurden auf jeweils 100 μl
korrigiert, und eine Phenol/Chloroform/Isoamylalkohl-Extraktion
wurde durchgeführt.
50 μl gepuffertes
Phenol wurden zu jedem Röhrchen
zusammen mit 50 μl
einer Mischung von Chloroform und Isoamylalkohol (24:1) zugegeben.
Die Röhrchen
wurden für
30 sec. geschüttelt
und dann für
1 min. in einer Mikrofuge bei 14.000 Umdrehungen pro Minute zentrifugiert.
Dann wurde die obere Phase gesammelt und mit 2,5 Volumen 99,5 %
Ethanol gemischt (1/10 war 3M Natriumacetat, pH 5,2). Die DNA wurde
für eine
Stunde bei –80 °C präzipitiert.
Die DNA wurde dann durch Zentrifugation für 30 min. in einer Mikrofuge
bei 14.000 Umdrehungen pro Minute pelletiert. Die Pellets wurden
einmal mit 70 % Ethanol gewaschen und dann in 10 μl sterilem
Wasser wieder aufgelöst.
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Anlalyse von Aufschluss-erzeugten
gereinigten Fragmenten auf Agarosegel:
-
5 μl des aufgelösten Pellets
von jedem Zeitpunkt und von der Nullprobe wurden mit 2,5 μl Ladepuffer (25
% Ficoll und Bromphenolblau) gemischt und in Vertiefungen in einem
2 % Agarosegel geladen. Die Elektrophorese und die nachfolgende
Gelextraktion der unterschiedlichen Zeitpunkte wurde dann wie oben
durchgeführt.
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Wiederzusammenbau-PCR
mit BAL31-Nuklease-erzeugten Fragmenten:
-
Die
verbleibenden 5 μl
des aufgelösten
Pellets von jedem Zeitpunkt wurden nach Phenol-Extraktion und Präzipitation
in einem PCR-Wiederzusammenbau ohne Primer gemischt. Ein Anteil
von 5 μl
der unbehandelten Nullprobe wurde als Matrize zugegeben, um es möglich zu
machen, Fragmente voller Länge
zu erzeugen. 40 PCR-Zyklen liefen mit dem PCR-Profil und der Reaktionsmischung
wie oben beschrieben, aber ohne jeglichen Primer.
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PCR mit externen Primern,
um die Menge an wieder zusammengebauten PCR-Produkten zu erhöhen:
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50 μl des wieder
zusammengebauten PCR-Produkt wurden mit PCR-Reagenzien einschl.
der zwei externen Primer, wie sie oben beschrieben sind, gemischt,
um eine 50 μl
PCR-Reaktion zu erzeugen. Diese PCR lief für 25 Zyklen mit dem oben beschriebenen
Profil. Das verstärkte
PCR-Produkt wurde dann auf einem Agarosegel analysiert. Ein Band
von ungefähr
1000 bP war auf dem Gel nach der zweiten PCR mit den zwei externen
Primern sichtbar. Die verbliebenen 50 μl von der ersten Wiederzusammenbau-PCR
zeigten nur einen Schmierfilm von Bändern, der das gesamte Intervall
des Molekulargewichstmarkers überspannte.
Das 1000 bp-Fragment wurde nach der zweiten PCR ausgeschnitten und
wie zuvor beschrieben gelgereinigt.
-
Restriktionsaufschluss
von wieder zusammengebautem FIND-Fragment und Tetracyclinsensitivem
pBR322 mit HindIII und Eagl:
-
10 μg Tetracyclin-zerstörtes pBR322
(10 μl)
wurden mit 10 μl
von jedem der Enzyme HindIII (10 U/μl) und Eagl (10 U/μl) (4 U Enzym/μg Vektor)
in einer Mischung mit 10 μl
10 × Puffer
B (zugeführt
mit den Enzymen) und Wasser auf 100 μl gespalten. Die Gesamtheit
des agarosegereinigten wieder zusammengebauten FIND-Fragments wurde
mit denselben Enzymen in einer ähnlichen
100 μl Reaktionsmischung
gespalten. Die Röhrchen
wurden in einem 37 °C
Wasserbad für
14 Stunden inkubiert.
-
Gelreinigung von restriktionsaufgeschlossenem
Vektor und restriktionsaufgeschlossenem wieder zusammengebautem
FIND-Fragment:
-
Die
Produkte der Spaltungsreaktionen wurden auf einem 2 % Agarosegel
analysiert. Das restriktionsaufgeschlossene Tetracyclin-zerstörte pBR322
zeigte ein Spaltungsprodukt von ungefähr 600 bp. Dies entspricht
gut der erwarteten Größe von 635
bp. Das Band des gespaltenen Plasmids wurde ausgeschnitten und wie
zuvor beschrieben wurde gelextrahiert. Das wieder zusammengebaute
gespaltene FIND-Produkt war ungefähr 1000 bp lang und wurde in
derselben Weise wie das Plasmid gelextrahiert.
-
Spektrophotometerabschätzungen
des restriktionsaufgeschlossenen Plasmids und des FIND-Fragments ergaben
die folgenden Angaben der DNA-Konzentrationen: Plasmid 13,5 μg/ml; wieder
zusammengebautes gespaltenes FIND-Fragments 77,3 μg/ml.
-
Ligatur von wieder zusammengebautem
restriktionsaufgeschlossenem FIND-Fragment mit Tetracyclin-zerstörtem restriktionsaufgeschlossenem
pBR322:
-
9,6 μg des gereinigten
gespaltenen pBR322 mit zerstörtem
Tetracyclin-Resistenzgen wurde an 2,76 μg gereinigtes wieder zusammengebautes
restriktionsaufgeschlossenes FIND-Fragment bei 12 °C Wasserbad für 16 Stunden
ligatiert. 50 μl
des Vektors wurden mit 60 μl
der Einsetzung und 15 μl
10 × Puffer
(zugeführt
mit dem Enzym), 7,5 μl
Ligase (5 U/μl)
und sterilem Wasser auf ein Endvolumen von 150 μl gemischt. Eine Ligatur von
2 μg restriktionsaufgeschlossenem
pBR322 mit zerstörtem
Tetracyclin-Resistenzgen ohne jede Einsetzung wurde ebenfalls in
derselben Weise durchgeführt.
-
Transformation von chemisch
kompetentem E. coli BMH 71-18 mit der ligatierten wieder zusammengebauten FIND-Einsetzung
und pBR322:
-
Die
Ligaturreaktionen wurden durch Phenol/Chloroform-Extraktion wie
oben beschrieben gereinigt. Die obere Phase von der Extraktion wurde
gesammelt und mit 2,5 Volumen 99,5 % Ethanol gemischt (1/10 war 3
M Natriumacetat, pH 5,2). Die DNA wurde für eine Stunde bei –80 °C präzipitiert.
Die DNA wurde dann durch Zentrifugation für 30 min. in einer Mikrofuge
bei 14.000 Umdrehungen pro Minute pelletiert. Das Pellet wurde einmal
mit 70 % Ethanol gewaschen und dann in 10 μl sterilem Wasser wieder aufgelöst. 50 μl von jeder
Ligatur wurden separat mit 95 μl
chemisch kompetentem E. coli BMH 71-80 gemischt, auf Eis für eine Stunde
inkubiert und dann gemäß dem modifizierten
Protokoll von Detlef transformiert (Modified Hanahan, revidiert
von M. Scott, F. Hochstenbach und D. Güssow 1989). Nach einer Stunde
Wachstum wurden die Bakterien von den zwei Transformationen auf
Ampicillin-enthaltende Agarplatten (100 μg/ml) ausgebreitet. Die Platten
wurden für 14
Stunden kopfüber
in einem 37 °C
Inkubator bewachsen.
-
Testen von Ampicillin-resistenten
Transformanten auf Tetracyclin-resistente Rekombinanten:
-
Die
Transformation mit wieder zusammengebauten FIND-Fragment und Tetracyclin-zerstörtem pBR322
ergab 122 Ampicillin-resistente Transformanten. Das erneut ligatierte
gespaltene leere Tetracyclin-zerstörte pBR322 ergab 100 Transformanten.
Die Transformanten von beiden Kategorien wurden mit sterilen Nadeln
einzeln auf Tetracyclin (10 μg/ml)-enthaltende
Agarplatten und zur selben Zeit und an entsprechenden Orten auf
Ampicillin-enthalte Platten übertragen.
Diese Platten wurden für
14 Stunden in einem 37 °C
Inkubator inkubiert.
-
Zählen der Tetracyclin-resistenden
Rekombinanten:
-
Die
Kolonien sowohl auf den Tetracyclinplatten als auch den Ampicillinplatten
wurden am nächsten Tag
in Bezug auf beide Transformanten ausgezählt.
-
FIND-EXPERIMENT II:
-
Die
oben beschriebenen Verfahren wurden für eine zweite BAL31-Nukleasebehandlung
mit einer Mischung aus 2 μg
FIND 1 und 5 μg
FIND 3 wie oben beschrieben und in der Übersicht in 1 enthalten
angewendet. Diesmal wurden neue PCR-Fragmente mit den abgeschätzten Konzentrationen
von 192,25 μg/ml für FIND 1
und 231,5 μg/ml
für FIND
3 erzeugt. Die folgende Reaktionsmischung wurde verwendet: 26 μl FIND 1,
21,6 μl
FIND 3, 100 μl
2 × BAL31-Exonukleasepuffer,
9,9 μl BAL31-Nuklease
und Wasser auf 200 μl.
Eine Nullprobe wurde ebenfalls zubereitet mit 13 μl FIND 1
und 10,8 μl
FIND 3, 36 μl
2 × BAL31-Exonukleasepuffer, 0 μl BAL31-Nuklease und Wasser
auf 72 μl.
-
Der
BAL31-Aufschluss wurde wie in dem vorherigen Experiment beschrieben
durchgeführt,
und Proben wurden zu denselben Zeitpunkten auf Röhrchen mit 200 mM EGTA gezogen,
um eine Endkonzentration von 20 mM EGTA zu erhalten. Die Exonuklease
in den resultierenden Proben wurde wie oben beschrieben Hitze-inaktiviert,
und die Fragmente wurden extrahiert, präzipitiert und 50 % wurden auf
ein Agarosegel geladen. Nachdem sich dasselbe Erscheinungsbild wie
zuvor bei dem Gel ausgebildet hatte, wurden die Proben gereinigt
und zwei sequenzielle PCR-Reaktionen wurden wie zuvor laufen gelassen.
Das letztendliche PCR-Fragment wurde unter denselben Bedingungen
wie oben in Tetracyclin-zerstörtes
pBR322 geklont. Die Ligatur wurde dann wie beschrieben in elektrokompetente
Zellen elektroporiert (Dower, W. J., J. F. Miller und C. W. Ragsdale.
1988:: High efficiency transformation of E. coli by high voltage
electroporation, Nucleic Acids Res. 16:6127) und wie zuvor auf Amipicillin-Agarplatten
aufgetragen. Einige tausend Transformanten wurden erzielt. 397 von
diesen wurden wie oben beschrieben auf Tetracyclin-Agarplatten und
zur selben Zeit auf Ampicillin-Agarplatten übertragen. Die Menge der Tetracyclin-Revertanten
wurde am nächsten
Tag nach Inkubation für
14 Stunden in einem 37 °C
Inkubator gezählt.
-
Die
Tetracyclin-Rekombinanten wurden dann in separaten Kolonien auf
neue Tetracyclin-Platten aufgetragen. Separate Kolonien wurden dann
in flüssige
Kultur mit 1 × TB-Medium
(Terrific Broth; Molecular cloning; A LABORATRY MANUAL, 2. Auflage,
Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989) mit 1 % Glukose und sowohl
Ampicillin als auch Tetracyclin in den obigen Konzentrationen eingeimpft
und für
Plasmidpräparationen mit
dem Qiagen Plasmid Midi Kit (Qiagen Inc., Chatsworth, CA, USA) gezogen.
Glycerolstammlösungen
dieser Übernachtkulturen
wurden durch Mischen von 500 μl
Bakterienkultur mit 215 μl
50 % Glycerol und Lagern dieser Mischungen bei –80 °C präpariert.
-
Ein
bakterielles PCR-Screening mit den zwei oben erwähnten externen Primern der
Tetracyclinsensitiven Kolonien wurde durchgeführt, um die Häufigkeit
des leeren wieder ligatierten Vektors unter diesen Transformanten
abzuschätzen.
Dies wurde getan, wobei die zuvor erwähnte PCR-Mischung auf 50 μl Reaktionen herunterskaliert
wurde. Diese wurden mit jeweils einer sensitiven bakteriellen Kolonie
beimpft, und das PCR-Profil war wie oben dasselbe für 30 Zyklen.
Die resultierenden PCR-Fragmente
wurden wie oben auf Gel analysiert.
-
-
-
Zwei
von 40 bakteriellen PCR-gescreenten sensitiven Klonen waren leerer
wieder ligatierter Vektor. Dies würde dann 5 % der Gesamtanzahl
der Transformanten ausmachen. Deshalb sind 20 von 397 leere Vektoren.
Dies erhöhte
die Anzahl von Rekombinanten auf 5,8 %.
-
FIND-EXPERIMENT III:
-
sDie
FIND-Prozedur ist nicht auf die Verwendung in Bezug auf Tetracyclin-Gene
beschränkt,
sondern kann auf jeden Typ von Genen angewandt werden, die ein Protein
oder Proteinmotiv codieren. Dies wird beispielhaft belegt durch
Erzeugen eines neuen Repertoires an Antikörperfragmenten mit Mutationen,
die nach der FIND-Behandlung gleichmäßig über die gesamten variablen
Antikörpergene
verteilt sind.
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Mutationen
einzelner Basenpaare wurden in die VL- und VH-Regionen des anti-FITC-scFv-Antikörperfragments
B11 (Kobayashi et al., Biotechniques 1997 Sep 23 (3): 500-503) unter Verwendung
von fehlerbehafteter PCR gemäß Kuipers
et al., (Nucleic Acids Res 1991 Aug 25; 19 (16): 4558), außer einem
Anstieg bei der MgCl2-Konzentration von
2 mM auf 5 mM eingeführt.
Dieses anti-FITC-scFv-Antikörperfragment
wurde unter Verwendung der überlappenden
Ausweitungs-PCR konstruiert, und die überlappende Ausweitungsprozedur ist
zuvor für
die zufällige
Kombination von DNA-Variation verwendet worden (Söderlind
et al. Gene 1995 Jul 28; 160 (2): 269-272).
-
Die
mutierten Produkte wurden dann einem kontrollierten Abbau mit BAL31-Exonuklease
unterworfen, die verwendet werden kann, um Nukleotide von dem Termini
der Doppelstrang-DNA in kontrollierter Weise zu entfernen. Sie ist
vorwiegend eine 3'-Exonuklease
(Sambrook et al., Sambrook, J., Fritsch E. F. und Mantiatis T. Molecular
Cloning-a laboratory manual Cold Spring Harbor laboratory Press,
2. Auflage, 1989) und entfernt einzelne Nukleotide von beiden 3'-Termini der zwei
Stränge
von linearer DNA. Zusätzlich
wirkt sie auch als eine Endonuklease, die die Einzelstrang-DNA abbaut,
die von der Exonukleaseaktivität
erzeugt wird. Der Abbau ist vollständig abhängig von der Anwesenheit von
Kalzium, und die Reaktion kann in unterschiedlichen Stufen durch
Zugeben des Kalzium-chelierenden Mittels EGTA gestoppt werden. BAL31
wirkt auf einen Pool von DNA-Molekülen asynchron, was eine Population
von DNA unterschiedlicher Größe erzeugt,
deren Termini in unterschiedlichem Umfang aufgeschlossen worden
sind und deren Einzelstrang-DNA-Schwänze in der Länge variieren.
DNA von Interesse wird mit BAL31 aufgeschlossen, und Proben werden
zu verschiedenen Zeitpunkten gezogen und in eine Lösung mit
EGTA gegeben, die nicht mit der Aktivität von Taq-Polymerase wechselwirkt.
So ist der PCR-basierte Wiederzusammenbau direkt nach der Aufschlussprozedur
möglich.
Die mittlere Länge
der Einzelstrangschwänze,
die durch Aufschluss von linearer Doppelstrang-DNA erzeugt werden,
hängt sowohl
von der Dauer der BAL31-Behandlung als auch der Enzymkonzentration
ab. Hohe Enzymkonzentrationen von 2 bis 5 U/ml ergeben ein Mittel
von 5 Nukleotiden an Einzelstrang-DNA pro Terminus, während 0,1 bis
0,2 U/ml längere
Einzelstrang-DNA ergeben können.
-
Nach
der Behandlung von BAL31 wurde der Pool der erzeugten DNA-Fragmente
von variabler Länge, wie
zuvor beschrieben wieder zu scFv-Genen voller Länge zusammengebaut. Die resultierenden
Gene wurden in den Phagemid-Vektor pEXmid V geklont, und die resultierende
Bankgröße nach
der Transformation war 5,7 × 104 cfu/μg
DNA.
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Einzelne
Klone aus der Bank wurden sequenziert, um die genetische Variabilität in der
Bank abzuschätzen.
Die Häufigkeiten
der gefundenen Mutationen verteilt über die 782 bp lange VL-VH-Region des scFv-Antikörpers reichten
von 1 bis 56 (Tabelle 1). Dies ist eine Mutationsrate, die von 0,13
% bis 7,16 % reicht, während
die Mutationsrate für
fehlerbehaftete PCR mit 0,7 % berichtet worden ist (Kuipers et al.,
Nucleic Acids Res 1991 Aug. 25; 19 (16): 4558). Dieses Resultat
demonstriert den Effekt des Rekombinierens von Mutationen bei einem
Satz von Genen, das in eine variierte Genpopulation resultiert,
die bei Selektionen/dem Screening von Proteinen mit neuen und geänderten
Funktionen verwendet werden kann.
-
Reagenzien:
-
AmpIiTaq® Polymerase
wurde von Perkin-Elmer Corp., dNTP von Boehringer Mannheim Biochemica (Mannheim,
Deutschland) und BAL31-Nuklease von New England Biolabs Inc. (Beverly,
USA) erworben. Alle Restriktionsenzyme wurden von Boehringer Mannheim
Biochemica (Mannheim, Deutschland) erworben. Ethidiumbromid wurde
von Bio-Rad Laboratories (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA)
erworben. T4-DNA-Ligase wurde von Boehringer Mannheim Biochemica
(Mannheim, Deutschland) erworben.
-
Primer:
-
Alle
Primer wurden in der Abteilung konstruiert und mit einem Applied
Biosystems 391 DNA-Synthetisierer
synthetisiert. Die Restriktionsplätze, die in jeden Primer eingeführt wurden,
sind unterstrichen.
-
Wiederverstärkungsprimer:
-
Für die fehlerbehaftete
PCR und Wiederverstärkungs-PCR
nach BAL31-Behandlung:
3'-Primer
DL: FITC-b11-VL3'-FLAG-SAL1:
5'-CAA CTT TCT TGT
CGA CTT TAT CAT CAT CAT CTT TAT AAT CAC CTA GGA CCG TCA GCT TGGT
-3' (SEQ ID #10)
5'-Primer DL: FITC
B11-VH-5'-Ncol:
5'-ACT CGC GGC CCA
ACC GGC CAT GGC CGA GGT GCA GCT GTT GGA G-3' (SEQ ID #11)
-
Sequenzierprimer.
-
Sequenzieren
des umgekehrten pEXmids 4: 5'-GGA
GAG CCA CCG CCA CCC TAA C-3' (SEQ
ID #12)
Umgekehrter pUC/M 13-Primer: 5'-TCA CAC AGG AAA CAG CTA TGA C-3' (SEQ ID +13)
-
Plasmide
-
pEXmid
V: 4055 by Ncol- und Sall-Plätze
sind in 8 mit Unterstreichungen markiert.
-
Fehlerbehaftete PCR:
-
Die
fehlerbehafteten PCR-Reaktionen wurden durchgeführt in einem 10 × Puffer,
der 50 mM NaCl, 100 mM Tris-HCl, pH 8,8, 5mM MgCl2,
100 μg Gelatine
enthielt (gemäß Kuipers
et al, Nucleic Acids Res. 1991, Aug 25; 19 (16): 4558, außer einer
Erhöhung
bei der MgCl2-Konzentration von 2 mM auf
5 mM).
-
Für jede 100
l Reaktion wurden die folgenden Substanzen gemischt:
dATP 5
mM 5 μl
dGTP
5 mM 5 μl
dTTP
10 mM 10 μl
dCTP
10 mM 10 μl
20 μM 3'-Primer 1,5 μl
20
uM 5'-Primer 1,5 μl
10 × Kuipers-Puffer
10 μl
Steriles
mp H2O 46,3 μl
-
Die
Matrize scFv-FITC-B11 in pEXmid V-Vektor (24,5 ng/μl) wurde
in einer Menge von 42 ng zugesetzt. 10 μl 10 mM MnCL2 wurden
zugegeben, und das Röhrchen
wurde daraufhin überprüft, dass
kein Ausfall von MnO2 auftrat. Mindestens
5 Einheiten (Units) Taq-Enzym wurden zugegeben. Die fehlerbehaftete
PCR wurde bei den folgenden Temperaturen für 25 Zyklen ohne einen heißen Start
laufengelassen: 94 °C
1', 45 °C 1', 72 °C 1', unter Verwendung
einer Rampenzeit von 1 Sekunde, gefolgt von einem schnellen Abkühlen auf
4 °C. Das
resultierende Produkt war eine fehlerbehaftete Einsetzung über den
scFv-FITC von 782 bp. Diese Einsetzung wurde vor der BAL31-Nukleasebehandlung
mit dem Qiaquick-PCR Reinigungskit gereinigt.
-
BAL31-Behandlung:
-
Gereinigte
fehlerbehaftete Einsetzungen des FITC-B11 wurden mit 0,5 U BAL31-Enzym/μg Einsetzungs-DNA
aufgeschlossen. Sterile 1,5 ml Eppendorfröhrchen mit DNA, 2 × BAL31-Nukleasepuffer und
Wasser wurden bei 30 °C
für 10
min. vorinkubiert. Nach dieser Vorinkubation wurde außer bei
einem Kontrollröhrchen
BAL31-Nuklease auf eine Endkonzentration von 0,5 Einheiten/μg DNA zugegeben.
Das Kontrollröhrchen enthielt
somit nur DNA-Puffer und Wasser. Nach t = 2', 4',
6', 8' und letztlich 10
Minuten wurde das Röhrchen gemischt
und Proben wurden entfernt und in die Röhrchen mit EGTA gegeben und
auf Eis gelegt. Die Arbeitskonzentration von EGTA betrug 20 mM.
Zur selben Zeit wurde das Kontrollvolumen aus dem Wasserbad entfernt,
und diese Probe wurde ebenfalls mit EGTA vermischt und auf Eis gelegt.
Die Röhrchen
wurden dann zur Hitzeinaktivierung des Enzyms in ein 65 °C Wasserbad
gegeben und dann wieder auf Eis gelegt.
-
Wiederzusammenbauen der
BAL31-erzeugten Fragmente:
-
Der
Wiederzusammenbau des erzeugten Fragmentpools wurde wie zuvor beschrieben
in zwei aufeinander folgenden PCR-Reaktionen durchgeführt. Die
erste PCR-Reaktion wurde ohne die Zugabe irgendeines externen Primers
durch Mischen gleicher Mengen der Poole von unterschiedlichen Zeitpunkten
in einer Standard-PCR-Reaktion durchgeführt. Die PCR-Reaktion lief
mit 40 Zyklen, die aus dem folgenden Profil bestanden: Denaturierung
(94 °C für 1 min.),
Primeranlassen (55 °C
für 1 min.)
und Ausweitung (72 °C
für eine
Minute) unter Verwendung einer Rampenzeit von 1 Sekunde. Die PCR-Reaktionen
enthielten, soweit nichts anderes angegeben ist, 5 μl jedes Primers
(20 μM),
16 μl einer
dNTP-Mischung (1,2 mM jeweils von dTTP, dATP, dCTP und dGTP), 20 μl 10 × Reaktionspuffer,
der mit dem Enzym zugeführt
wurde, 0,5 μl
thermostabile DNA-Polymeras
AmpIiTaq® (5
U/μl) (Perkin-Elmer
Corp.) und Wasser bis auf ein Endvolumen von 100 μl.
-
Die
wieder zusammengebauten Produkte wurden dann erneut mittels einer
PCR verstärkt,
die die externen 3'-
und 5'-Primer enthielt,
um eine Einsetzung der korrekten Größe zu erzeugen und um dabei
auch die Restriktionsplätze
Ncol und Sal I für
das Klonen in den pEXmid V-Vektor einzuführen. Die PCR-Reaktion wurde 25
Zyklen laufen gelassen, die aus dem folgenden Profil bestanden:
Denaturierung (94 °C
für 1 min.), Primeranlassen
(55 °C für 1 min.)
und Ausweitung (72 °C
für 1 min.),
unter Anwendung einer Rampenzeit von 1 Sekunde. Die PCR-Reaktionen
enthielten 5 μl
jedes Primers (20 μM),
16 μl einer
dNTP-Mischung (1,25 mM jeweils von dTTP, dATP, dCTP und dGTP), 10 μl 10 × Reaktionspuffer,
der mit dem Enzym zugeführt
wurde, 0,5 μl
thermostabile DNA-Polymerase ApmIiTaq® (5
U/ul) (Perkin-Elmer Corp.) und Wasser auf ein Endvolumen von 100 μl. Die nachfolgende
Einsetzung wurde auf einem 2 % Agarosegel unter Verwendung des Qiaquick
Gelextraktionskits (Kobayashi et al., biotechniques 1997 Sep; 23
(3): 500-503) gereinigt.
-
Klonen in den PEXMID V
Phagmidvektor:
-
Die
Einsetzung und der Vektor wurden mit den Ncol- und Sall-Enzymen
von Boehringer Mannheim aufgeschlossen. Die Einsetzung wurde mit
10 U Enzym/μg
DNA gespalten und der Vektor mit 4U/μg DNA. Die Einsetzung wurde
dann wie zuvor beschrieben gelgereinigt, und der Vektor wurde unter
Verwendung des Microcon 100 Micro Konzentrators (Amicon, Inc., Beverly,
MA 01915, USA) gereinigt. Der Vektor wurde dann mit einem dritten
Enzym, dem Pstl-Enzym gespalten, dessen Restriktionsplatz zwischen
den beiden ersten Enzymen angeordnet ist. Der Vektor wurde mit dem
Qiaquickgelextraktionskit (Qiagen GmbH, Hilden, Deutschland) gereinigt.
Die Einsetzung und der gereinigte Vektor wurden mit 25 U T 4-DNA-Ligase/μg DNA (Boehringer Mannheim)
bei einem Vektor--zu-Einsetzung-Verhältnis von
590 ng Vektor zu 240 ng Einsetzung (12:1 Molverhältnis) für 14 Stunden bei 12 °C ligatiert.
Die Ligaturreaktionen wurden mit Phenolchloroformextraktion und Ethanolpräzipitation
gereinigt und anschließend
in elektrokompetente Top 10-F'-Bakterienzellen
transformiert. Die Bankgröße wurde
zu 5,7 × 104 cfu/μg
DNA bestimmt. Glycerolstammlösungen
wurden nach Transformation gemäß J. Engberg
et al (Molecular Biotechnology Band 6, 1996 Seiten 287-310) erzeugt
und bei –20 °C gelagert.
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Sequenzieren:
-
Separate
Kolonien von der Glycerolstammlösungsbank
wurden gezogen, und Plasmidpräparationen wurden
mit dem Promega Wizzard Plus Minipreps DNA-Reinigungssystem (Promega,
Madison, WI, USA) durchgeführt.
Die VL- und VH-Einsetzungen dieser Plasmide wurden mit einer PCR-verstärkt, die
die externen 3'-
und 5'-Primer enthielt,
um eine Einsetzung der korrekten Größe zu erzeugen. Diese Einsetzungen
wurden dann mit einem Big Dye DyedeosyTM Terminator
Cycle Sequencing Kit sequenziert. Das Sequenzieren wurde auf einen
ABI Prism 377-DNA-Sequenzierer durchgeführt.
-
Tabelle
1 Anzahl
an Mutationen bei den 782 by langen scFv-Sequenzen nach FIND-Behandlung
