DE69826521T2

DE69826521T2 - Verfahren zum quenchen von pathogen-inaktivatoren in biologischen materialien

Info

Publication number: DE69826521T2
Application number: DE69826521T
Authority: DE
Inventors: David Cook; Adonis Stassinopoulos
Original assignee: Cerus Corp
Current assignee: Cerus Corp
Priority date: 1998-01-06
Filing date: 1998-07-06
Publication date: 2005-09-29
Anticipated expiration: 2018-07-07
Also published as: US6709810B2; JP2002500204A; DE69826521D1; HK1034682A1; EP1045704B1; AU8289198A; US20040180321A1; US6270952B1; CN1284886A; CN1203900C; EP1045704A1; US7293985B2; CA2317603A1; JP4643004B2; US20020028432A1; ES2224415T3; WO1999034839A1; AU745209B2; ATE276771T1; JP2010248245A

Description

Diese Anmeldung betrifft Verfahren der Behandlung von Blutprodukten in vitro oder ex vivo mit einer nukleophilen Verbindung, um reaktive elektrophile Verbindungen in dem Material zu quenchen.
STAND DER TECHNIK
Die Übertragung einer Krankheit durch Blutprodukte und andere biologische Materialien ist nach wie vor ein ernstes Gesundheitsproblem. Während signifikante Fortschritte beim Überprüfen von Blutspendern und Testen von Blut gemacht wurden, können Viren wie z.B. Hepatitis B (HBV), Hepatitis C (HCV) und das Humanimmundefizienzvirus (HIV) dem Nachweis in Blutprodukten während des Testens aufgrund niedriger Spiegel des Virus oder der viralen Antikörper entgehen. Zusätzlich zu dem Virenrisiko gibt es derzeit keine genehmigten Tests, um das Vorliegen von Bakterien oder Protozoen in Blut zu überprüfen, das zur Verwendung bei Transfusionen gedacht ist. Es besteht ebenfalls das Risiko, dass sich ein bisher unbekanntes Pathogen in dem Blutvorrat ausbreiten kann und eine Gefahr der Übertragung einer Krankheit darstellen kann, wie es in der Tat geschah, bevor das Risiko einer HIV-Übertragung durch Bluttransfusionen erkannt wurde.
Das Aussetzen von Laborpersonal an Blut oder andere Körperflüssigkeiten stellt ebenfalls ein Gesundheitsrisiko dar. Erst in 1989 schätzten die Centers for Disease Control, dass zwölftausend in der Gesundheitsvorsorge arbeitende Personen, deren Arbeit ein Aussetzen an Blut beinhaltet, jedes Jahr mit dem Hepatitis B-Virus infiziert werden. „Guidelines for Prevention of Transmission of Human Immunodeficiency Virus and Hepatitis B Virus to Health-Care and Public-Safety Workers", Morbidity and Mortality Weekly Report, Bd. 38, Nr. S-6, Juni 1989. Diese Statistik veranschaulicht die Notwendigkeit von Verfahren, um Pathogene in biologischem Material zu inaktivieren.
Chemische Mittel sind in Blut und Blutplasma eingeführt worden, um Pathogene vor der klinischen Verwendung des Blutprodukts zu inaktivieren. Verfahren und Zusammensetzungen zur photochemischen Inaktivierung von Pathogenen wurden beschrieben. Die U.S.-Patente Nr. 5,587,490 und 5,418,130 beschreiben substituierte Psoralene, die verwendet werden, um virale oder bakterielle Verunreinigungen in Körperflüssigkeiten photochemisch zu inaktivieren. Von Phenothiazinen wie z.B. Methylenblau wurde gezeigt, dass diese Pathogene in Blutprodukten bei Beleuchtung inaktivieren. Wagner et al., Transfusion, 33: 30–36 (1993). Das U.S.-Patent Nr. 5,637,451 beschreibt ein Verfahren zum Inaktivieren von Viren in einem Erythrozyten enthaltenden Material durch Zugeben einer Phthalocyaninverbindung und Bestrahlen des Materials.
Der Nachteil von photochemischen Verfahren zur Pathogeninaktivierung ist, dass die reaktiven freien Radikale und Sauerstoffspezies, die erzeugt werden, ebenfalls eine Schädigung der Blutprodukte verursachen können und deren Eignung für die beabsichtigte Verwendung beeinträchtigen können. Quencher für freie Radikale wurden in den photochemischen Verfahren zur Pathogeninaktivierung verwendet, um die Schädigung durch freie Radikale, die während der photochemischen Reaktion auftritt, zu verringern und zu minimieren, wie in den U.S.-Patenten Nr. 4,727,027, 5,587,490, 5,418,130, 5,232,844, 5,658,722 und 5,637,451 und der Internationalen Patentanmeldung WO 97/16966 beschrieben wird.
Es sind Verbindungen zur Pathogeninaktivierung verwendet worden, die keine Photoaktivierung erfordern. Diese Verbindungen sind typischerweise Elektrophile, die mit Pathogenen reagieren. Beispielsweise beschreibt das U.S.-Patent Nr. 5,055,485 die Inaktivierung von Viren in zell- und proteinhaltigen Zusammensetzungen, indem Aryldiolepoxide verwendet werden. Andere Verbindungen erzeugen Elektrophile in situ. LoGrippo et al. werteten die Verwendung von Stickstoffmustard, CH₃-N(CH₂CH₂Cl)₂, zur Inaktivierung von Viren aus. LoGrippo et al., Proceedings of the Sixth Congress of the International Society of Blood Transfusion, Bibliotheca Haematologica (Hollander, Herausg.), 1958, Seiten 225–230. Was noch wichtiger ist, so beschreiben die U.S.-Patente Nr. 5,691,132 und 5,559,250 die Verwendung von N1,N1-Bis(2-chlorethyl)-N4-(6-chlor-2-methoxy-9-acridinyl)-1,4-pentandiamin ("Chinacrinmustard") und 5-[N,N-Bis(2-chlorethyl)amino]methyl-8-methoxypsoralen zur Pathogeninaktivierung in Blut, Blutprodukten und einer Vielzahl von Proben biologischen Ursprungs. Pathogeninaktivierende Verbindungen, welche Aziridin kovalent befestigt an einem Polyaminanteil einschließen, wurden ebenfalls verwendet, wie in Budowsky et al., Vaccine Research 5: 29–39 (1996), beschrieben wird.
Idealerweise würde die Zugabe der pathogeninaktivierenden Verbindungen, die durch elektrophile Reaktionen oder Zwischenprodukte inaktivieren, zu dem Blutprodukt oder der anderen biologischen Probe die Pathogene inaktiveren, ohne irgendwelche unerwünschten Modifikationen der Probe zu verursachen. Die pathogeninaktivierenden Verbindungen rea gieren mit den Pathogenen durch einen elektrophilen Prozess und erfordern keine Photoaktivierung. Daher werden keine reaktiven Sauerstoff- oder freie Radikalspezies erzeugt, und eine oxidative Schädigung ist kein Problem. Andere unerwünschte Nebenreaktionen können jedoch auftreten. Beispielsweise können elektrophile Reaktionen mit anderen biologischen Materialien, einschließlich Proteinen, auftreten. Diese Nebenreaktionen können eventuell die Verwendung der biologischen Probe zu ihrem beabsichtigen Zweck beeinträchtigen.
Somit besteht ein Bedarf für Verfahren, um unerwünschte elektrophile Nebenreaktionen von pathogeninaktivierenden Verbindungen, die mit Pathogenen in elektrophiler Weise wechselwirken, zu verhindern, während die Fähigkeit der pathogeninaktivierenden Verbindung, schädliche Pathogene zu inaktivieren, erhalten wird. Es besteht ein Bedarf für Verfahren zum Inaktivieren von Pathogenen in biologischen Materialien, während unerwünschte Nebenreaktionen verringert werden.
OFFENBARUNG DER ERFINDUNG
Gemäß der Erfindung wird das Verfahren von Anspruch 1 bereitgestellt, um Nebenreaktionen von pathogeninaktivierenden Verbindungen, die zur Inaktivierung von Pathogenen in Blutprodukten in vitro oder ex vivo verwendet werden, zu quenchen. Das Verfahren wird bereitgestellt, um unerwünschte Nebenreaktionen einer pathogeninaktivierenden Verbindung, die eine funktionelle Gruppe einschließt, welche eine elektrophile Gruppe ist oder in der Lage ist, eine solche zu bilden, zu quenchen. In dieser Ausführungsform wird ein biologisches Material in Form eines Blutprodukts in vitro oder ex vivo mit der pathogeninaktivierenden Verbindung und einem Quencher, welcher eine nukleophile funktionelle Gruppe umfasst, die in der Lage ist, mit der elektrophilen Gruppe kovalent zu reagieren, behandelt. Die elektrophile Gruppe an der pathogeninaktivierenden Verbindung ist in einer bevorzugten Ausführungsform eine kationische Gruppe. Verbindungen, die gequencht werden können, umfassen Verbindungen, die eine funktionelle Gruppe umfassen, welche eine reaktive Gruppe wie z.B. eine elektrophile Gruppe ist oder welche in der Lage ist, eine solche in situ zu bilden und diese gebildet hat. Beispielsweise kann die funktionelle Gruppe eine Mustardgruppe sein, die in der Lage ist, in situ eine reaktive Gruppe wie z.B. ein elektrophiles Aziridin-, Aziridinium-, Thiiran- oder Thiiraniumion zu bilden. In einer anderen Ausführungsform kann die funktionelle Gruppe ein Epoxid sein. Die biologischen Materialien werden in vitro oder ex vivo mit der pathogeninaktivierenden Verbindung und dem Quencher behandelt. Gemäß der Erfindung werden die pathogeninaktivierende Verbindung und der Quencher zu einem Material in einer für die pathogeninaktivierende Verbindung wirksamen Menge verabreicht, um Pathogene in dem Material zu inaktiveren, während dem Quencher ebenfalls erlaubt wird, unerwünschte Nebenreaktionen der pathogeninaktivierenden Verbindung zu quenchen.
In einer Ausführungsform kann ein Quencher in ein Mehrphasensystem wie z.B. ein Zweiphasensystem eingeführt werden. Beispielsweise kann der Quencher einem Zweiphasensystem verabreicht werden, bei welchem eine Membran die erste und zweite Phase trennt. In einer Ausführungsform wird eine Phase durch die Membran begrenzt. Beispielsweise kann die Membran die Außenmembran eines pathogenen Organismus definieren, wobei die erste Phase die Phase sein kann, in welcher der pathogene Organismus enthalten ist, und die zweite Phase das Innere des pathogenen Organismus sein kann. Die Membran kann beispielsweise die Lipidhülle eines Virus sein, wobei die erste Phase eine Flüssigkeit wie z.B. Blut sein kann, in welcher das Virus enthalten ist, und die zweite Phase das Innere des Virus sein kann, welches virale Nukleinsäuren enthält. In einer anderen Ausführungsform kann die Membran eine Zellmembran sein, und die membranbegrenzte Phase kann das Innere eines pathogenen einzelligen Organismus wie z.B. eines Bakteriums sein. In dieser Ausführungsform wird eine pathogeninaktivierende Verbindung in das Zweiphasensystem eingeführt, die vorzugsweise kinetisch oder thermodynamisch in der Lage ist, die Membran zu überqueren, während der Quencher in Bezug auf die pathogeninaktivierende Verbindung im wesentlichen nicht kinetisch oder thermodynamisch in der Lage ist, die Membran zu überqueren.
In einer Ausführungsform wird ein Verfahren bereitgestellt, um unerwünschte Nebenreaktionen einer pathogeninaktivierenden Verbindung in einem zweiphasigen biologischen Material zu quenchen, welches eine erste flüssige Phase, die darin ein Pathogen, das eine Membran umfasst, aufweist, und eine zweite Phase, die durch die Membran des Pathogens begrenzt wird, umfasst. Die zweite Phase ist somit der Inhalt, der innerhalb der Membran des Pathogens enthalten ist. Das biologische Material wird mit einer pathogeninaktivierenden Verbindung behandelt, welche eine funktionelle Gruppe umfasst, die in der Lage ist, eine elektrophile Gruppe zu bilden. Vor, gleichzeitig mit oder nach der Behandlung mit der pathogeninaktivierenden Verbindung wird das biologische Material mit einem Quencher behandelt, welcher eine nukleophile Gruppe umfasst, die in der Lage ist, mit der elektrophilen Gruppe kovalent zu reagieren. Vorzugsweise wird der Quencher vor oder gleichzeitig mit der pathogeninaktivierenden Verbindung zugegeben. Vorzugsweise ist die pathogeninaktivierende Verbindung vor der Bildung der elektrophilen Gruppe kinetisch oder thermodynamisch in der Lage, die Membran zu überqueren. Vorzugsweise wird die Geschwindigkeit der Durchdringung der Membran durch die pathogeninaktivierende Verbindung nach der Bildung der elektrophilen Gruppe in Bezug auf die pathogeninaktivierende Verbindung vor der Bildung der elektrophilen Gruppe wesentlich verringert. Vorzugsweise ist die pathogeninaktivierende Verbindung nach der Bildung der elektrophilen Gruppe in Bezug auf die pathogeninaktivierende Verbindung vor der Bildung der elektrophilen Gruppe im wesentlichen kinetisch oder thermodynamisch nicht in der Lage, die Membran zu überqueren. Der Quencher ist vorzugsweise in Bezug auf die pathogeninaktivierende Verbindung vor der Bildung der elektrophilen Gruppe im wesentlichen kinetisch oder thermodynamisch nicht in der Lage, die Membran zu überqueren. Der Quencher wird mit der elektrophilen Gruppe der pathogeninaktivierenden Verbindung reagieren gelassen, und die Reaktion des Quenchers mit der elektrophilen Gruppe der pathogeninaktivierenden Verbindung findet vorzugsweise im wesentlichen in der ersten Phase statt. Die pathogeninaktivierende Verbindung, welche die elektrophile Gruppe umfasst, reagiert mit einer Nukleinsäure des Pathogens in der zweiten membranbegrenzten Phase, wodurch das Pathogen inaktiviert wird. Die Verfahren erlauben die Pathogeninaktivierung durch Reaktion der pathogeninaktivierenden Verbindung mit Nukleinsäuren des Pathogens innerhalb der Membran des Pathogens, während sie das Quenchen von reaktiven pathogeninaktivierenden Verbindungen wie auch von daraus gebildeten reaktiven Spezies in der Phase, in welcher das Pathogen enthalten ist, erlauben.
Die hierin offenbarten Verfahren sind vorteilhaft, da bei dem Zweiphasensystem der Quencher in die erste Phase verabreicht wird und im wesentlichen nicht in der Lage ist, die Außenmembran des Pathogens zu überqueren und somit im wesentlichen in der zweiten Phase, d.h. im Inneren des Pathogens, nicht vorliegt. Die pathogeninaktivierende Verbindung wird beispielsweise in die erste Phase verabreicht und ist vor der Bildung der elektrophilen Gruppe in der Lage, die Membran des Pathogens zu überqueren. Bei der Bildung der elektrophilen Gruppe in situ ist die pathogeninaktivierende Verbindung im wesentlichen nicht länger in der Lage, die Membran zu überqueren. Somit tritt das Quenchen selektiv in der ersten Phase auf, während in der zweiten Phase, d.h. im Inneren des Pathogens, die pathogeninaktivierende Verbindung ohne Quenchen mit Nukleinsäuren des Pathogens reagiert. Somit tritt in einem Blutprodukt das Quenchen von reaktiven Gruppen an der pathogeninaktivierenden Verbindung und Abbauprodukten von dieser selektiv in der ersten Phase auf, in welcher das Pathogen suspendiert ist. Das Quenchen in der ersten Phase vermindert somit unerwünschte Nebenreaktionen der reaktiven Gruppe der pathogeninaktivierenden Verbindung wie z.B. eine kovalente Modifikation von Proteinen oder Zelloberflächen im Blut. In dem Verfahren werden die pathogeninaktivierende Verbindung und der Quencher in einer wirksamen Menge verabreicht, um Pathogene in dem Material zu inaktivieren, während unerwünschte Nebenreaktionen der pathogeninaktivierenden Verbindung gequencht werden.
Somit hat der Quencher eine Schutzwirkung durch die Verringerung unerwünschter Nebenreaktionen im Blut, während er erlaubt, dass eine Pathogeninaktivierung stattfindet.
Das Verfahren wird verwendet, um Blutprodukte in vitro oder ex vivo zu behandeln, welche Pathogene wie z.B. prokaryotische und eukaryotische Organismen und lipidumhüllte Viren umfassen. Insbesondere können die Verfahren verwendet werden, um Pathogene, welche Membranen umfassen, wie z.B. lipidumhüllte Viren und Bakterien, die eine Membran in Form einer Zellmembran enthalten, zu behandeln. Beispielhafte Quencher zur Behandlung von biologischen Materialien wie z.B. Blutprodukten, welche darin ein Pathogen aufweisen, das eine Membran umfasst, umfassen Glutathion, N-Acetylcystein, Cystein, Mercaptoethansulfonatsalze oder Dimercaprol.
Die pathogeninaktivierende Verbindung kann einen Nukleinsäure-Bindungsliganden und eine funktionelle Gruppe, welche eine elektrophile Gruppe ist oder in der Lage ist, eine solche zu bilden, umfassen, wobei die elektrophile Gruppe in der Lage ist, mit einer Nukleinsäure unter Bildung einer kovalenten Bindung mit einer Nukleinsäure zu reagieren. Die pathogeninaktivierende Verbindung kann ebenfalls einen zerbrechlichen Linker umfassen, der den Nukleinsäure-Bindungsliganden und die funktionelle Gruppe verknüpft. Beispielsweise kann die funktionelle Gruppe eine Mustardgruppe sein, welche in der Lage ist, in situ zu reagieren, um eine elektrophile Gruppe wie z.B. ein Aziridiniumion zu bilden. Beispielhafte pathogeninaktivierende Verbindungen umfassen Chinacrinmustard, N-(2-Chlorethyl)-N-ethyl-N'-(6-chlor-2-methoxy-9-acridinyl)-1,3-propandiamindihydrochlorid und 5-[N,N-Bis(2-chlorethyl)amino]methyl-8-methoxypsoralen. Andere pathogeninaktivierende Verbindungen umfassen Verbindungen, welche ein Aziridin kovalent verknüpft mit einem Polyaminanteil umfassen, wie in Budowsky et al., Vaccine Research, 5: 29–39 (1996) beschrieben wird.
Quencher, die verwendet werden können, können nukleophile funktionelle Gruppen wie z.B. Thiole, Thiosäuren, Dithiosäuren, Phosphate, Thiophosphate und Amine umfassen. Beispielhafte Quencher umfassen Glutathion, N-Acetylcystein, Cystein, Thiosulfat, Mercaptoethansulfonatsalze und Dimercaprol. In einer bevorzugten Ausführungsform ist der Quencher Glutathion.
In Verfahren, in welchem ein Blutprodukt mit einem Quencher und einer pathogeninaktivierenden Verbindung behandelt wird, kann der Quencher vor, gleichzeitig mit oder nach der Zugabe der pathogeninaktivierenden Verbindung zu dem Material zugegeben werden. Vorzugsweise wird der Quencher vor oder gleichzeitig mit der pathogeninaktivierenden Verbin dung zugegeben. In einer anderen bevorzugten Ausführungsform wird der Quencher innerhalb von ca. 30 Minuten, z.B. innerhalb von ca. 15–20 Minuten oder innerhalb von ca. 10 Minuten vor bzw. nach der Zugabe der pathogeninaktivierenden Verbindung zugegeben. Biologische Materialien, welche in vitro oder ex vivo behandelt werden können, sind Blutprodukte wie z.B. Vollblut, Erythrozyten, Blutplasma oder Fraktionen von diesen und Blutplättchen. Die Verfahren können verwendet werden, um behandelte Blutprodukte zu erzeugen, die zur Einführung in ein Individuum geeignet sind. Beispielsweise ist das behandelte Material dazu geeignet, in ein Individuum, das dessen bedarf, transfundiert zu werden. Gegebenenfalls kann die Konzentration der pathogeninaktivierenden Verbindung und/oder des Quenchers in dem Material nach der Behandlung und vor der Transfusion z.B. durch Filtration oder Adsorption verringert werden. Eine große Vielzahl an biologischen Materialien, wie z.B. Blutprodukte, die ein Pathogen enthalten oder in dem Verdacht stehen, ein solches zu enthalten, kann behandelt werden.
In einer besonderen Ausführungsform wird ein Verfahren bereitgestellt, um unerwünschte Nebenreaktionen einer pathogeninaktivierenden Verbindung in einem Material, das Erythrozyten umfasst, zu quenchen, wobei das Verfahren das Behandeln eines Materials, das Erythrozyten umfasst, mit einer pathogeninaktivierenden Verbindung, welche eine funktionelle Gruppe umfasst, die eine elektrophile Gruppe ist oder in der Lage ist, eine solche zu bilden, und das Behandeln des Materials mit einem Quencher, welcher eine nukleophile Gruppe umfasst, die in der Lage ist, mit der elektrophilen Gruppe kovalent zu reagieren, beinhaltet. Die pathogeninaktivierende Verbindung in einer Ausführungsform umfasst einen Nukleinsäure-Bindungsliganden und eine Mustardgruppe, die in der Lage ist, in situ unter Bildung einer elektrophilen Gruppe wie z.B. einem Aziridiniumion zu reagieren. Das Material kann gepackte Erythrozyten umfassen. Das Material kann beispielsweise ein Blutprodukt mit einem Hämatokrit von ca. 30–85% umfassen. Beispielsweise kann ein Material, das Erythrozyten umfasst, mit einer pathogeninaktivierenden Verbindung und einem Quencher behandelt werden, und dann ist das behandelte Material dazu geeignet, in ein Individuum, das dessen bedarf, transfundiert zu werden.
Die Konzentration der pathogeninaktivierenden Verbindung kann beispielsweise ca. 0,1 μM bis 5 mM betragen. Eine Konzentration der pathogeninaktivierenden Verbindung kann bereitgestellt werden, welche ausreicht, um beispielsweise wenigstens ca. 3 bis 6 log eines Pathogens in dem Material, das behandelt wird, zu inaktivieren. Die nukleophile Gruppe ist vorzugsweise eine Thiolgruppe. Der Quencher in einer bevorzugten Ausführungsform ist Glutathion. Die Konzentration von Glutathion kann beispielsweise in der Größenordnung von ca. 0,5 bis 30 mM liegen. Das Material kann mit der pathogeninaktivierenden Verbindung und dem Quencher für beispielsweise wenigstens ca. 1 bis 48 Stunden inkubiert werden.
Vorzugsweise verringert der Quencher die Inaktivierung eines Pathogens durch die pathogeninaktivierende Verbindung um nicht mehr als ca. 3 log im Vergleich zu einer Kontrollpathogeninaktivierung, die in Abwesenheit des Quenchers durchgeführt wird. In einer anderen bevorzugten Ausführungsform verringert der Quencher in dem Verfahren die Inaktivierung eines Viruspathogens durch die pathogeninaktivierende Verbindung um nicht mehr als ca. 1 log im Vergleich zu einer Kontrollpathogeninaktivierung, die in Abwesenheit des Quenchers durchgeführt wird. Vorzugsweise ist in der Ausführungsform, in welcher ein Material, das Erythrozyten umfasst, behandelt wird, die Funktion der Erythrozyten nach der Behandlung nicht wesentlich verändert.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird ein Verfahren bereitgestellt, wobei das Verfahren das Behandeln eines Erythrozyten enthaltenden Materials mit einer wirksamen Menge der pathogeninaktivierenden Verbindung und des Quenchers, um wenigstens 2 log eines Pathogens zu inaktivieren, umfasst und wobei die Funktion der Erythrozyten durch die Behandlung nicht wesentlich verändert wird. In einer anderen bevorzugten Ausführungsform wird ein Verfahren bereitgestellt, wobei das Verfahren das Behandeln des Materials mit einer wirksamen Menge der pathogeninaktivierenden Verbindung und des Quenchers umfasst, um wenigstens 2 log eines Pathogens zu inaktivieren, und wobei die Hämolyse der Erythrozyten nach 28 Tagen Lagerung weniger als 3% beträgt.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1 ist eine graphische Darstellung, weiche das Überleben muriner Erythrozyten nach der Behandlung mit Glutathion und einer pathogeninaktivierenden Verbindung zeigt.
BESTE ART ZUR DURCHFÜHRUNG DER ERFINDUNG
Es wird ein Verfahren zum Quenchen pathogeninaktivierender Verbindungen in Blutprodukten in vitro oder ex vivo bereitgestellt. Das Verfahren gemäß der Erfindung wird in Anspruch 1 definiert. Die pathogeninaktivierende Verbindung und der Quencher werden in einer wirksamen Menge verabreicht, um Pathogene in dem Material zu inaktivieren, während unerwünschte Nebenreaktionen der pathogeninaktivierenden Verbindung gequencht werden. Der Quencher hat somit eine Schutzwirkung durch die Verringerung unerwünschter Nebenreakti onen in Materialien wie beispielsweise einem Blutprodukt, während er erlaubt, dass eine Pathogeninaktivierung stattfindet.
Definitionen
„Pathogen" ist definiert als irgendein nukleinsäurehaltiges Agens, das in der Lage ist, bei einem Menschen, anderen Säugetieren oder Wirbeltieren eine Krankheit zu verursachen. Das pathogene Agens kann einzellig oder mehrzellig sein. Beispiele für Pathogene sind Bakterien, Viren, Protozoen, Pilze, Hefen, Schimmelpilze und Mykoplasmen, welche bei Menschen, anderen Säugetieren oder Wirbeltieren eine Krankheit verursachen. Das genetische Material des Pathogens kann DNA oder RNA sein, und das genetische Material kann als einzelsträngige oder doppelsträngige Nukleinsäure vorliegen. Tabelle I listet Beispiele von Viren auf und ist nicht gedacht, um die Erfindung in irgendeiner Weise zu beschränken.
Tabelle I
„In vivo"-Verwendung eines Materials oder einer Verbindung ist definiert als die Einführung des Materials oder der Verbindung in einen lebenden Menschen, ein Säugetier oder Wirbeltier.
„In vitro"-Verwendung eines Materials oder einer Verbindung ist definiert als eine Verwendung des Materials oder der Verbindung außerhalb eines lebenden Menschen, Säugetiers oder Wirbeltiers, wobei das Material oder die Verbindung nicht zur Rückführung in einen lebenden Menschen, ein Säugetier oder Wirbeltier bestimmt ist. Ein Beispiel für eine in vitro-Verwendung wäre die Analyse von Bestandteilen einer Blutprobe unter Verwendung einer Laborausrüstung.
„Ex vivo"-Verwendung einer Verbindung ist definiert als die Verwendung einer Verbindung zur Behandlung eines biologischen Materials außerhalb eines lebenden Menschen, Säugetiers oder Wirbeltiers, wobei dieses behandelte biologische Material zur Verwendung innerhalb eines lebenden Menschen, Säugertiers oder Wirbeltiers bestimmt ist. Beispielsweise wird die Entnahme von Blut aus einem Menschen und die Einführung einer Verbindung in dieses Blut, um Pathogene zu inaktivieren, als eine ex vivo-Verwendung dieser Verbindung definiert, wenn das Blut zur Rückführung in diesen Menschen oder einen anderen Menschen bestimmt ist. Die Rückführung des menschlichen Bluts in diesen Menschen oder einen anderen Menschen wäre eine in vivo Verwendung des Blutes, im Gegensatz zu der ex vivo-Verwendung der Verbindung. Wenn die Verbindung immer noch im Blut vorliegt, wenn dieses in den Menschen rückgeführt wird, dann wird die Verbindung zusätzlich zu ihrer ex vivo-Verwendung ebenfalls in vivo eingeführt.
„Materialien, welche behandelt werden können" umfassen jegliche Materialien, einschließlich biologischer Materialien. Derartige Materialien umfassen Chemikalien, Lösungen, einschließlich Salz- oder gepufferten Lösungen, und Lösungsmittel. Jegliche Materialien, die mit einem lebenden Menschen, Säugetier oder Wirbeltier in Kontakt kommen werden oder in diese eingeführt werden, wobei ein solcher Kontakt ein Risiko mit sich bringt, eine Krankheit oder Pathogene zu übertragen, können wie hierin offenbart behandelt werden.
„Biologisches Material" ist definiert als ein Material, welches aus einem biologischen Organismus eines beliebigen Typs stammt. Beispiele für biologische Materialien umfassen Blut, Blutprodukte wie z.B. Plasma, fraktioniertes Plasma, Blutplättchenpräparate, Erythrozyten und gepackte Erythrozyten, Cerebrospinalflüssigkeit, Speichel, Urin, Schweiß, Fäzes, Sperma, Milch, Gewebeproben, homogenisierte Gewebeproben und jegliche andere Substanz, die ihren Ursprung in einem biologischen Organismus hat, sind aber nicht darauf beschränkt. Biologische Materialien umfassen ebenfalls synthetisches Material, das eine Substanz, die ihren Ursprung in einem biologischen Organismus hat, enthält, wie z.B. ein Impfstoffpräparat, das ein Pathogen oder einen Teil davon einschließt (wobei das Pathogen in diesem Fall die Substanz ist, die ihren Ursprung in einem biologischen Organismus hat) oder ein rekombinantes Protein, eine zur Analyse vorbereitete Probe, welche eine Mischung aus Blut und analytischen Reagenzien ist, Zellkulturmedium, Zellkulturen, Virenkulturen und andere Kulturen, die von einem lebenden Organismus abgeleitet sind. Gemäß der Erfindung werden nur biologische Materialien in Form von Blutprodukten in vitro oder ex vivo behandelt.
„Inaktivierung von Pathogenen" ist definiert als das Unfähigmachen zur Reproduktion von Pathogenen in einem Material. Die Inaktivierung wird ausgedrückt als der negative Logarithmus des Anteils von verbleibenden Pathogenen, die in der Lage sind, sich zu reproduzieren. Wenn somit eine Verbindung in einer bestimmten Konzentration 90% der Pathogene in einem Material reproduktionsunfähig macht, bleiben 10% oder ein Zehntel (0,1) der Pathogene in der Lage, sich zu reproduzieren. Der negative Logarithmus von 0,1 ist 1, und von dieser Konzentration dieser Verbindung wird gesagt, dass sie die vorliegenden Pathogene um 1 log inaktiviert hat. Alternativ sagt man von der Verbindung, dass diese bei dieser Konzentration 1 log Abtötung aufweist. Wenn somit eine Verbindung bei einer bestimmten Konzentration alle bis auf 10% oder ein Zehntel (0,1) der Pathogene reproduktionsunfähig macht, wird von dieser gesagt, dass sie die Pathogene um 1 log inaktiviert. Die Inaktivierung von allen bis auf 1% oder 0,1% der Pathogene würde einer Verringerung des Pathogens bei dieser Konzentration der Verbindung um 2 log bzw. 3 log entsprechen.
Verbindungen, die gequencht werden sollen
Eine Vielzahl von Verbindungen kann in Materialien wie z.B. biologischen Materialien unter Verwendung der hierin offenbarten Verfahren gequencht werden. Verbindungen, die gequencht werden können, umfassen Verbindungen, die eine funktionelle Gruppe umfassen, welche eine reaktive Gruppe wie z.B. eine elektrophile Gruppe ist oder welche in der Lage ist, eine solche z.B. in situ zu bilden und diese gebildet hat. Beispielsweise kann die funktionelle Gruppe eine Mustardgruppe sein, die in der Lage ist, in situ eine reaktive Gruppe wie z.B. ein elektrophiles Aziridin-, Aziridinium-, Thiiran- oder Thiiraniumion zu bilden. In einer anderen Ausführungsform kann die funktionelle Gruppe ein Epoxid sein. Der Quencher umfasst eine nukleophile Gruppe und wirkt, indem elektrophile reaktive Gruppen auf der Verbindung durch kovalente Reaktion der nukleophilen Gruppe auf dem Quencher mit der reaktiven elektrophilen Gruppe eingefangen werden. Der Quencher kann verwendet werden, um reaktive Spezies einschließlich der Verbindung, die eine elektrophile Gruppe umfasst, wie auch reaktive Spezies, die daraus gebildet wurden, einzufangen.
In einer Ausführungsform werden Verfahren zum Quenchen von Verbindungen bereitgestellt, die verwendet werden, um Pathogene in Materialien zu inaktivieren. In Blutprodukten umfassen Pathogene, die erwünschtermaßen inaktiviert werden sollten, Mikroorganismen wie z.B. prokaryotische, eukaryotische und virale Mikroorganismen, die Nukleinsäuren wie auch Nukleinsäuregenome oder Fragmente von diesen aus solchen Mikroorganismen enthalten. Beispiele für Viren, die inaktiviert werden können, umfassen lipidumhüllte Viren wie z.B. das vesikuläre Stomatitisvirus (VSV), Moloney-Sarcomavirus, Sindbisvirus, Humanimmundefizienzviren (HIV-1, HIV-2), humanes T-Zell-Leukämie-Virus-I (HTLV-I), Hepatitis B-Virus, Hepatitis C-Virus und Viren der Herpesgruppe, wie auch nicht umhüllte Viren einschließlich Parvovirus.
Verbindungen wurden entwickelt, welche verwendet werden, um Pathogene in biologischen Materialien zu inaktivieren, wobei die Verbindungen reaktive elektrophile Gruppen umfassen oder in situ reagieren, um diese zu bilden, ohne eine Photoaktivierung zu benötigen. Die reaktiven elektrophilen Gruppen reagieren mit den Nukleinsäuren von Pathogenen wie z.B. Viren und Bakterien, um diese zu inaktivieren. Diese reaktiven Verbindungen können jedoch ebenfalls an unerwünschten Nebenreaktionen teilnehmen. Hierin bereitgestellt werden Verfahren des Zugebens von quenchenden Verbindungen, um unerwünschte Nebenreaktionen dieser Verbindungen zu verringern, welche Pathogene durch Reaktion von elektrophilen Gruppen auf der Verbindung mit dem Pathogen inaktivieren.
Beispiele für pathogeninaktivierende Verbindungen, welche reaktive elektrophile Gruppen bilden und verwendet werden können, um Pathogene zu inaktivieren, werden in der PCT WO 96/14737, der PCT WO 96/39818 und in den U.S. Provisional Anmeldungen Aktenzeichen Nr. 60/043,696, angemeldet am 15. April 1997, und der entsprechenden PCT, veröffentlicht als WO 98/30545, beschrieben. Zusätzlich kann Stickstoffmustard, CH₃-N(CH₂CH₂Cl)₂, bestimmte Pathogene inaktivieren. LoGrippo et al., Proceedings of the Sixth Congress of the International Society of Blood Transfusion, Bibliotheca Haematologica (Hollander, Herausg.), 1958, Seiten 225–230.
Bevorzugt sind pathogeninaktivierende Verbindungen, welche einen Anker umfassen, der kovalent an einen Effektor gebunden ist. Der Ausdruck „Anker" bezieht sich auf einen Anteil, der in der Lage ist, nicht-kovalent an ein Nukleinsäurebiopolymer wie z.B. DNA oder RNA zu binden. Der „Anker" wird ebenfalls als ein „Nukleinsäure-Bindungsligand" bezeichnet. Der Ausdruck „Effektor" bezieht sich auf einen Anteil, der in der Lage ist, mit einer Nukleinsäure zu reagieren, um eine kovalente Bindung mit der Nukleinsäure zu bilden. Vorzugsweise ist der Effektor eine funktionelle Gruppe, welche eine elektrophile Gruppe ist oder in der Lage ist, eine solche zu bilden, wobei die elektrophile Gruppe in der Lage ist, eine kovalente Bindung mit einer Nukleinsäure zu bilden. Beispielsweise beschreiben die PCT WO 96/14737, die PCT WO 96/39818 und das U.S.-Patent Nr. 5,559,250 pathogeninaktivierende Verbindungen, welche einen Effektor, der eine Mustardgruppe ist, und einen Nukleinsäure-Bindungsliganden umfassen. Pathogeninaktivierende Verbindungen, welche ein Aziridin umfassen, das kovalent an einem Polyaminanker befestigt ist, können ebenfalls verwendet werden, wie in Budowsky et al., Vaccine Research 5: 29–39 (1996) und der PCT WO 97/07674 beschrieben wird.
Eine beispielhafte Verbindung ist Chinacrinmustard, dessen Struktur nachfolgend gezeigt wird.
Chinacrinmustard
Die pathogeninaktivierenden Verbindungen können ebenfalls in einer Form bereitgestellt werden, in welcher der Anker kovalent an einen zerbrechlichen Linker gebunden ist, welcher kovalent an den Effektor gebunden ist. Der Ausdruck „zerbrechlicher Linker" bezieht sich auf einen Anteil, welcher den Anker und den Effektor kovalent verknüpft und welcher in der Lage ist, sich unter gewissen Bedingungen zu zersetzen, so dass der Anker und der Effektor nicht länger kovalent verknüpft sind. Die Anordnung Anker-zerbrechlicher Linker-Effektor ermöglicht den Verbindungen, aufgrund des Bindungsvermögens des Ankers, spezifisch an Nukleinsäure zu binden. Dieses bringt den Effektor in die Nähe zur Reaktion mit der Nukleinsäure. Pathogeninaktivierende Verbindungen, die eine Anordnung Anker-zerbrechlicher Linker-Effektor umfassen, sind in der U.S.-Provisional Anmeldung Aktenzeichen Nr. 60/043,696, angemeldet am 15. April 1997, und in der entsprechenden PCT, veröffentlicht als WO98/30545, und in der U.S.-Patentanmeldung Aktenzeichen Nr. 09/003,115, angemeldet am 6. Januar 1998, offenbart. Der Effektor kann beispielsweise eine Mustardgruppe, ein Äquivalent einer Mustardgruppe oder ein Epoxid sein.
Beispielhafte pathogeninaktivierende Verbindungen (PIC) umfassen PIC-1 und PIC-2, deren Strukturen nachstehend gezeigt werden. PIC-1 umfasst einen zerbrechlichen Linker mit einer Esterfunktion, während PIC-2 einen zerbrechlichen Linker mit einer Amidfunktion umfasst.
Eine große Vielzahl von Gruppen ist zur Verwendung für Anker, Linker und Effektoren möglich. Beispiele für Ankergruppen umfassen interkalierende Mittel, an die Nebenfurche bindende Mittel, an die Hauptfurche bindende Mittel, Moleküle, die über elektrostatische Wechselwirkungen binden, einschließlich Polyaminen, und Moleküle, welche durch sequenzspezifische Wechselwirkungen binden, sind aber nicht auf diese beschränkt. Das Folgende ist eine nicht beschränkende Liste möglicher Ankergruppen:
Acridine (und Acridinderivate, z.B. Proflavin, Acriflavin, Diacridine, Acridone, Benzacridine, Chinacrine), Actinomycine, Anthracyclinone, Rhodomycine, Daunomycin, Thioxanthenone (und Thioxanthenonderivate, z.B. Miracil D), Anthramycin, Mitomycine, Echinomycin (Chinomycin A), Triostine, Ellipticin (und Dimere, Trimere und Analoge von diesen), Norphilin A, Fluorene (und Derivate, z.B. Flourenone, Fluorenodiamine), Phenazine, Phenanthridine, Phenothiazine (z.B. Chlorpromazin), Phenoxazine, Benzothiazole, Xanthene und Thioxanthene, Anthrachinone, Anthrapyrazole, Benzothiopyranoindole, 3,4-Benzopyren, 1-Pyrenyloxiran, Benzanthracene, Benzodipyrone, Chinoline (z.B. Chloroquin, Chinin, Phenylchinolincarboxamide), Furocoumarine (z.B. Psoralene und Isopsoralene), Ethidium, Propidium, Coralyn, und polycyclische aromatische Kohlenwasserstoffe und deren Oxiranderivate;
Distamycin, Netropsin, andere Lexitropsine, Hoechst 33258 und andere Hoechst-Farbstoffe, DAPI (4',6-Diamidino-2-phenylindol), Berenil und Triarylmethan-Farbstoffe;
Aflatoxine;
Spermin, Spermidin und andere Polyamine; und
Nukleinsäuren oder Analoge, welche über sequenzspezifische Wechselwirkungen wie z.B. Tripelhelixbildung, Bildung einer D-Schleife und direkte Basenpaarung an einzelsträngige Targets binden. Derivate dieser Verbindungen sind ebenfalls nicht beschränkende Beispiele für Ankergruppen, wobei ein Derivat einer Verbindung eine Verbindung, welche einen oder mehrere Substituenten irgendeines Typs an irgendeiner Stelle trägt, Oxidations- oder Reduktionsprodukte der Verbindung usw. umfasst, aber nicht auf diese beschränkt ist.
Beispiele für zerbrechliche Linker umfassen, sind aber nicht beschränkt auf Anteile, die funktionelle Gruppen umfassen, wie z.B. Ester (wobei der Carbonylkohlenstoff des Esters zwischen dem Anker und dem sp³-Sauerstoff des Esters liegt; diese Anordnung wird ebenfalls „Vorwärts-Ester" genannt), „Rückwärts-Ester" (wobei der sp³-Sauerstoff des Esters zwischen dem Anker und dem Carbonylkohlenstoff des Esters liegt), Thioester (wobei der Carbonylkohlenstoff des Thioesters zwischen dem Anker und Schwefel des Thioesters liegt, ebenfalls „Vorwärts-Thioester" genannt), Rückwärts-Thioester (wobei der Schwefel des Thioesters zwischen dem Anker und dem Carbonylkohlenstoff des Thioesters liegt, ebenfalls „Rückwärts-Thioester" genannt), Vorwärts- und Rückwärts-Thionoester, Vorwärts- und Rückwärts-Dithionsäure, Sulfat, Vorwärts- und Rückwärts-Sulfonate, Phosphat, und Vorwärts- und Rückwärts-Phosphonatgruppen. „Thioester" bezeichnet die -C(=O)-S- Gruppe; „Thionoester" bezeichnet die -C(=S)-O- Gruppe; und „Dithionsäure" bezeichnet die -C(=S)-S- Gruppe. Der zerbrechliche Linker kann ebenfalls ein Amid umfassen, wobei der Carbonylkohlenstoff des Amids zwischen dem Anker und dem Stickstoff des Amids liegt (ebenfalls ein „Vorwärts-Amid" genannt) oder wobei der Stickstoff des Amids zwischen dem Anker und dem Carbonylkohlenstoff des Amids liegt (ebenfalls ein „Rückwärts-Amid" genannt). Für Gruppen, die als „vorwärts" und „rückwärts" bezeichnet werden können, ist die Vorwärtsorientierung die Orientierung der funktionellen Gruppen, in welcher nach der Hydrolyse der funktionellen Gruppe die resultierende Säurefunktion kovalent mit dem Ankeranteil verknüpft ist und die resultierende Alkohol-, Thiol- oder Aminfunktion kovalent mit dem Effektoranteil verknüpft ist. Die Rückwärtsorientierung ist die Orientierung der funktionellen Gruppen, in welcher nach der Hydrolyse der funktionellen Gruppe die resultierende Säurefunktion kovalent mit dem Effektoranteil verknüpft ist und die resultierende Alkohol- oder Thiolfunktion kovalent mit dem Ankeranteil verknüpft ist.
Der zerbrechliche Linker, wie z.B. ein Amidanteil, kann ebenfalls in der Lage sein, unter den Bedingungen eines enzymatischen Abbaus durch endogene Enzyme in dem biologischen Material, das behandelt wird, oder durch Enzyme, die zu dem Material zugegeben werden, abgebaut zu werden.
Beispiele für Effektoren umfassen Mustardgruppen, Mustardgruppenäquivalente, Epoxide, Aldehyde, Formaldehydsynthons und andere alkylierende und vernetzende Mittel, sind aber nicht auf diese beschränkt. Mustardgruppen sind definiert als Mono- oder Bishaloethylamingruppen und Monohaloethylsulfidgruppen einschließend. Mustardgruppenäquivalente sind definiert durch Gruppen, die über einen Mechnismus reagieren, der ähnlich ist wie bei den Mustards, wie z.B. Mono- oder Bismesylethylamingruppen, Monomesylethylsulfidgruppen, Mono- oder Bistosylethylamingruppen und Monotosylethylsulfidgruppen. Formaldehydsynthons sind definiert als jede Verbindung, die in wässriger Lösung zu Formaldehyd zerfällt, einschließlich Hydroxymethylaminen wie z.B. Hydroxymethylglycin. Beispiele für Formaldehydsynthons werden in dem U.S.-Patent Nr. 4,337,269 und in der Internationalen Patentanmeldung WO 97/02028 angegeben.
Die Konzentration der pathogeninaktivierenden Verbindung kann auf der Grundlage von Faktoren wie z.B. den Typen der Pathogene, der Art des behandelten biologischen Materials und der verwendeten inaktivierenden Verbindung ausgewählt werden.
Quenchende Verbindungen
Es werden Verfahren bereitgestellt zur Behandlung von biologischen Materialien mit quenchenden Verbindungen, welche hierin ebenfalls als „Quencher" bezeichnet werden, um unerwünschte Nebenreaktionen von reaktiven elektrophilen Spezies in dem Material zu verringern. Insbesondere werden Verfahren bereitgestellt, um unerwünschte Nebenreaktionen von pathogeninaktivierenden Verbindungen, die Pathogene in biologischen Materialien inaktivieren, zu quenchen, wobei die pathogeninaktivierenden Verbindungen entweder elektrophile Gruppen enthalten oder in der Lage sind, diese zu bilden, welche die Nukleinsäure der Pathogene schädigen. Der Quencher verringert unerwünschte Reaktionen der pathogeninaktivierenden Verbindung und der Reaktionsprodukte, die durch die pathogeninaktivierende Verbindung erzeugt werden. Bevorzugt sind Quencher, die nukleophile Gruppen umfassen, die in der Lage sind, mit den elektrophilen Gruppen auf der pathogeninaktivierenden Verbindung zu reagieren. Der Quencher, der eine nukleophile Gruppe umfasst, wirkt, indem er reaktive elektrophile Gruppen auf der Verbindung durch kovalente Reaktion der nukleophilen Gruppe auf dem Quencher mit der reaktiven elektrophilen Gruppe einfängt. Reaktive Spezies, die von dem Quencher eingefangen werden können, umfassen die Verbindung, welche eine elektrophile Gruppe umfasst, wie auch Spezies, die eine reaktive elektrophile Gruppe umfassen, die daraus gebildet wurden.
Ein Vorteil der hierin offenbarten Verfahren ist, dass eine wirksame Menge des Quenchers derart verwendet werden kann, dass unerwünschte Nebenreaktionen der pathogeninaktivierenden Verbindung verringert werden, eine Inaktivierung des Pathogens durch die pathogeninaktivierende Verbindung aber immer noch auftreten kann. Der Quencher weist somit einer Schutzwirkung durch die Verringerung unerwünschter Nebenreaktionen in Materialien wie z.B. Blut auf, während er ermöglicht, dass eine Pathogeninaktivierung stattfinden kann. Eine Vielzahl von Nebenreaktionen kann verringert werden. Beispielsweise kann in Verfahren, wo Materialien, die Blutprodukte enthalten, behandelt werden, die Modifikation von Erythrozyten verringert werden. Beispielsweise kann die Bindung von Proteinen wie z.B. IgG und/oder die Bindung der pathogeninaktivierenden Verbindung an Erythrozyten verringert werden.
In einer Ausführungsform wird ein Blutprodukt mit einer pathogeninaktivierenden Verbindung, welche eine funktionelle Gruppe umfasst, die eine elektrophile Gruppe ist oder in der Lage ist, eine solche zu bilden, und dem Quencher behandelt. In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst die pathogeninaktivierende Verbindung einen Nukleinsäure-Bindungsliganden und einen Effektor, der eine funktionelle Gruppe ist, welche eine reaktive elektrophile Gruppe ist oder in der Lage ist, eine solche zu bilden. Die elektrophile Gruppe kann beispielsweise ein Oxiran, Thiiran, Thiiranium- oder Aziridiniumion oder Aziridin sein. Der Effektor kann eine Mustardgruppe sein, die in der Lage ist, die elektrophile Gruppe zu bilden. Die Mustardgruppe kann beispielsweise in der Lage sein, in situ ein elektrophiles Aziridin oder ein elektrophiles Aziridinium- oder Thiiraniumion zu bilden.
In dem Verfahren wird das biologische Material mit einem Quencher behandelt, welcher eine nukleophile funktionelle Gruppe umfasst, die in der Lage ist, kovalent mit der elektrophilen Gruppe auf der pathogeninaktivierenden Verbindung zu reagieren. Der Quencher wird vor, gleichzeitig mit oder nach der Zugabe der pathogeninaktivierenden Verbindung zu dem Material zugegeben. In einer bevorzugten Ausführungsform wird der Quencher vor oder gleichzeitig mit der Zugabe der pathogeninaktivierenden Verbindung zugegeben. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform wird der Quencher gleichzeitig mit der pathogeninaktivierenden Verbindung zugegeben. In einer anderen bevorzugten Ausführungsform wird der Quencher innerhalb von ca. 30 Minuten, z.B. innerhalb von ca. 15–20 Minuten, oder gegebenenfalls innerhalb von 10 Minuten vor oder nach der Zugabe der pathogeninaktivierenden Verbindung zugegeben. Das Material wird in vitro oder ex vivo behandelt. Bevorzugt sind Quencher, welche unerwünschte Nebenwirkungen der pathogeninaktivierenden Verbin dungen verringern, ohne die Fähigkeit der pathogeninaktivierenden Verbindung, Pathogene zu inaktivieren, zu stören und ohne die Eigenschaften des biologischen Materials wesentlich zu verändern.
Beispiele für Quencher sind Verbindungen, die nukleophile Gruppen oder andere Gruppen, die mit elektrophilen Gruppen reagieren, einschließen. Mischungen von quenchenden Verbindungen können ebenfalls verwendet werden. Beispielhafte nukleophile Gruppen umfassen Thiol-, Thiosäure-, Dithionsäure-, Thiocarbamat-, Dithiocarbamat-, Amin-, Phosphat- und Thiophosphatgruppen. Der Quencher kann ein Stickstoffheterocyclus wie z.B. Pyridin sein oder einen solchen enthalten. Der Quencher kann eine phosphathaltige Verbindung wie z.B. Glucose-6-phosphat sein. Der Quencher kann ebenfalls eine thiolhaltige Verbindung sein, einschließlich, aber nicht beschränkt auf Glutathion, Cystein, N-Acetylcystein, Mercaptoethanol, Dimercaprol, Mercaptan, Mercaptoethansulfonsäure und Salzen davon, z.B. MESNA, Homocystein, Aminoethanthiol, Dimethylaminoethanthiol, Dithiothreitol und anderer thiolhaltiger Verbindungen. Die Quencher können ebenfalls in Form eines Salzes, wie beispielsweise als Natrium- oder Hydrochloridsalz, vorliegen.
Andere thiolhaltige Verbindungen umfassen Methylthioglycolat, Thiomilchsäure, Thiophenol, 2-Mercaptopyridin, 3-Mercapto-2-butanol, 2-Mercaptobenzothiazol, Thiosalicylsäure und Thioctsäure. Beispielhafte aromatische Thiolverbindungen umfassen 2-Mercaptobenzimidazolsulfonsäure, 2-Mercaptonicotinsäure, Napthalinthiol, Chinolinthiol, 4-Nitrothiophenol und Thiophenol. Andere Quencher umfassen Nitrobenzylpyridin und anorganische Nukleophile wie z.B. Selenidsalze oder Organoselenide wie z.B. Selenocystein, Thiosulfat, Sulfit, Sulfid, Thiophosphat, Pyrophosphat, Hydrosulfid und Dithionit. Der Quencher kann ebenfalls eine Peptidverbindung sein, die eine nukleophile Gruppe enthält. Beispielsweise kann der Quencher eine cysteinhaltige Verbindung, z.B. ein Dipeptid wie z.B. GlyCys oder ein Tripeptid wie z.B. Glutathion, sein.
Ebenfalls innerhalb des Umfangs der Erfindung sind makromolekulare Komplexe, welche die nukleophile Gruppe oder eine Verbindung, welche die nukleophile Gruppe enthält, umfassen. In einer anderen Ausführungsform wird die nukleophile Gruppe wie z.B. eine Thiolgruppe oder die Verbindung, welche die nukleophile Gruppe enthält, auf einem festen Träger wie z.B. einem Chromatographiematerial immobilisiert, um einen immobilisierten Quencher zu bilden. Der feste Träger kann beispielsweise ein Agarose-, Polystyrol- oder ein anderes chromatographisches Material sein. Beispielsweise können Glutathion oder andere Verbindungen, welche eine nukleophile Gruppe wie z.B. eine Schwefelgruppe enthalten, an epoxy aktivierter Agarose befestigt werden. Beispielsweise ist Glutathion-Agarose im Handel bei Sigma (St. Louis, MO) erhältlich, wobei Glutathion über die Aminogruppe an epoxyaktivierter 4% vernetzter kugelförmiger Agarose über einen Abstandhalter mit 10 Kohlenstoffatomen befestigt ist. Zusätzlich ist Cystein-Agarose bei Sigma erhältlich, welche über die Aminogruppe an Cyanbromid-aktivierter 4% vernetzter kugelförmiger Agarose befestigt ist. Jedes aus einer Reihe von aktivierten Chromatographieharzen oder anderen Materialien kann so derivatisiert werden, dass es eine, zwei oder mehrere nukleophile Gruppen einschließt. Derartige aktivierte Matrices, die derivatisiert werden können, umfassen Cyanbromid-, Epoxy-, Nitrophenyl- und N-Hydroxysuccinimidylchlorformiat-, Thiopyridyl-, Polyacrylhydrazido- und Oxiranacryl-aktivierte Matrices. Andere beispielhafte Chromatographiematerialien, die immobilisierte nukleophile Gruppen wie z.B. Thiole umfassen, die im Handel erhältlich sind, umfassen Duolite GT-73 Polystyrol-thiolhaltiges Harz und Duolite C-467, welches die Aminophosphonsäuregruppe umfasst (Supelco, Bellefonte, PA).
In einer anderen Ausführungsform kann die Reaktion des Quenchers durch die Reaktion eines Enzyms wie z.B. Glutathiontransferase katalysiert werden. Das Vorliegen von Glutathiontransferase kann ebenfalls die Reaktivität des Quenchers mit der pathogeninaktivierenden Verbindung, die eine elektrophile Gruppe umfasst, beeinflussen. Beispielsweise kann Glutathiontransferase in einem Membransystem in Kompartimente verteilt sein, was ermöglicht, dass das Quenchen in dem Bereich auftritt und verstärkt wird, wo die Glutathiontransferase vorliegt.
Der Quencher kann ebenfalls in situ, beispielsweise durch die Reaktion eines Enzyms oder durch eine chemische Umordnung aus einem Vorläufermolekül, erzeugt werden. Ein Beispiel einer Verbindung, welche einen Quencher in situ durch enzymatische Katalyse erzeugt, ist Amifosten (Ethyol^®, U.S. Bloscience, West Conshohocken, PA).
Bevorzugte Eigenschaften von Quenchern zur Behandlung von Blutprodukten
In einer Ausführungsform werden Verfahren zum Quenchen unerwünschter Nebenreaktionen einer pathogeninaktivierenden Verbindung in einem biologischen Material, das Erythrozyten umfasst, bereitgestellt. Beispielsweise kann das Material ein Blutprodukt mit einem Hämatokrit von ca. 30–85% sein. Die pathogeninaktivierende Verbindung umfasst vorzugsweise eine funktionelle Gruppe, welche eine elektrophile Gruppe ist oder in der Lage ist, eine solche zu bilden.
Der Quencher wird vor, gleichzeitig mit oder nach der Zugabe der pathogeninaktivierenden Verbindung zu dem Blutprodukt zugegeben. Vorzugsweise wird der Quencher bei der Behandlung eines Blutprodukts vor oder gleichzeitig mit der pathogeninaktivierenden Verbindung zugegeben. In einer anderen bevorzugten Ausführungsform wird der Quencher innerhalb von ca. 30 Minuten oder innerhalb von ca. 15–20 Minuten oder gegebenenfalls innerhalb von 10 Minuten vor bzw. nach der Zugabe der pathogeninaktivierenden Verbindung zugegeben. Beispiele für Blutprodukte, welche ex vivo oder in vitro behandelt werden können, umfassen Vollblut, Blutplättchen, Erythrozyten und Plasma. Bevorzugte Quencher sind Verbindungen, welche die unerwünschten Nebenreaktionen der reaktiven Verbindungen verringern, ohne die Pathogeninaktivierung oder das Blutprodukt signifikant zu beeinträchtigen. Beispielsweise können Quencher zu einem Blutprodukt zugegeben werden, das mit einer pathogeninaktivierenden Verbindung behandelt wurde, wobei die pathogeninaktivierende Verbindung umfasst: i) einen Nukleinsäure-Bindungsliganden, der in der Lage ist, nichtkovalent an eine Nukleinsäure zu binden; und ii) eine Gruppe, welche eine elektrophile Gruppe wie beispielsweise eine kationische elektrophile Gruppe ist oder in der Lage ist, eine solche zu bilden. Bevorzugt sind Quencher, welche unerwünschte Nebenreaktionen der Verbindungen verringern können, ohne die Pathogeninaktivierung oder die Eigenschaften des bestimmten Blutprodukts, das behandelt wird, signifikant zu beeinträchtigen. Ein bevorzugter Quencher ist Glutathion.
Die pathogeninaktivierende Verbindung in einer bevorzugten Ausführungsform umfasst einen Nukleinsäure-Bindungsliganden und eine Mustardgruppe, die in der Lage ist, in situ unter Bildung der elektrophilen Gruppe zu reagieren, wobei die elektrophile Gruppe ein Aziridiniumion ist. Verbindungen einschließlich eines nichtkovalenten Nukleinsäure-Bindungsliganden und einer Mustardgruppe werden z.B. in dem U.S.-Patent Nr. 5,559,250 beschrieben. Beispielhafte Verbindungen umfassen Chinacrinmustard. Von diesen Verbindungen wird angenommen, dass diese Pathogene inaktivieren, indem sie an deren Nukleinsäurematerial binden und dieses alkylieren. In der Inaktivierungsreaktion bildet die Mustardgruppe an der Verbindung ein reaktives Aziridiniumion. Es wird angenommen, dass die Nukleinsäuren der Pathogene mit den Verbindungen durch nukleophilen Angriff der Nukleinsäure auf das elektrophile Aziridiniumzwischenprodukt, das von der Verbindung gebildet wird, reagieren. Während man nicht an irgendeine Theorie gebunden sein möchte, wird angenommen, dass Quencher wie z.B. Glutathion mit diesen pathogeninaktivierenden Verbindungen in einer ähnlichen Weise durch nukleophilen Angriff des Quenchers auf das elektrophile Aziridiniumzwischenprodukt reagieren, um ein Reaktionsprodukt oder -produkte zu erzeugen, die nicht länger in der Lage sind, mit Nukleinsäuren zu reagieren.
Während man auf keine Theorie beschränkt ist, wird ein vorgeschlagener Mechanismus der Reaktion von Nukleophilen (Nu₁ und Nu₂) mit einer Mustardgruppe auf einer pathogeninaktivierenden Verbindung in Schema I unten gezeigt.
SCHEMA I
Die Mustardgruppe kann entweder in der protonierten Form B oder in der deprotonierten Form A vorliegen, wie in Schema I gezeigt wird. Typischerweise ist bei physiologischem pH die intramolekulare Bildung der Aziridiniumzwischenprodukte C und E leicht. Quencher, die nukleophile Gruppen einschließen, werden verwendet, die in der Lage sind, mit den Aziridi niumzwischenprodukten C und E zu reagieren, um das Endprodukt F zu bilden, wobei die nukleophilen Gruppen die Chloratome der Mustardgruppe ersetzt haben.
Auch wenn die Reaktivität des Aziridiniumions hoch ist, sind die Reaktionsgeschwindigkeiten immer noch abhängig von den Eigenschaften des reagierenden Nukleophils. Weiterhin können die Quenchernukleophile mit anderen vorliegenden endogenen Nukleophilen konkurrieren, beispielsweise wenn sie in einer höheren Konzentration vorliegen als die anderen endogenen Nukleophile oder wenn sie reaktiver sind. Unter physiologischen Bedingungen ist die bevorzugte nukleophile Gruppe eine Thiolgruppe. Andere nukleophile Gruppen umfassen Phosphat- und Aminogruppen.
Der Quencher erhält vorzugsweise die Funktion des Blutprodukts und minimiert Nebenwirkungen der pathogeninaktivierenden Verbindung. Ein bevorzugter Quencher für die Behandlung von Blutprodukten, insbesondere Blutprodukten, die Erythrozyten enthalten, ist Glutathion. Glutathion ist besonders nützlich zur Verwendung bei der Behandlung von Erythrozyten enthaltenden Materialien in Kombination mit Pathogeninaktivierungsmitteln, welche Aziridiniumzwischenprodukte bilden, wie z.B. pathogeninaktivierenden Verbindungen, die Mustardgruppen enthalten. Die Thiolgruppe von Glutathion reagiert schneller mit dem Aziridiniumzwischenprodukt als mit der Ausgangsmustardverbindung.
Der Quencher durchdringt vorzugsweise im wesentlichen nicht äußere Pathogenmembranen wie z.B. Zellmenbranen und virale Lipidhüllen. Der Quencher durchdringt vorzugsweise die Lipidmembranen von Viren, Bakterien und anderen Zielpathogenen nicht in einem solchen Ausmaß, dass dieser die Schädigung, die durch die pathogeninaktivierende Verbindung an der Nukleinsäure des Pathogens verursacht wird, wesentlich verringert. Zusätzlich reagiert der Quencher vorzugsweise mit der elektrophilen Gruppe, die von der pathogeninaktivierenden Verbindung gebildet wurde, bevor er mit der Verbindung selbst reagiert. Während man auf keine Theorie beschränkt ist, wird angenommen, dass die pathogeninaktivierende Verbindung die Pathogenmembranen wie z.B. virale Lipidhüllen und Bakterienmembranen frei überqueren kann, dass aber die Verbindung, nachdem die kationische elektrophile Gruppe wie z.B. ein Aziridiniumion gebildet ist, die Pathogenmembranen nicht mehr in einem signifikanten Ausmaß überqueren kann. Somit können die elektrophilen Kationen, welche sich außerhalb des Zielpathogens bilden, die Nukleinsäure im wesentlichen nicht vernetzen; der Quencher kann jedoch mit diesen reagieren. Wenn sich umgekehrt in einer Ausführungsform das elektrophile Kation innerhalb des Pathogens bildet, ist der Quencher unfähig, die Patho genmembran zu überqueren, und die Vernetzung der Nukleinsäure schreitet ohne wesentliche signifikante Störung durch den zugegebenen Quencher fort.
Es ist bevorzugt, dass der Quencher mit der pathogeninaktivierenden Verbindung reagiert, um unerwünschte Nebenreaktionen zu quenchen, ohne die Pathogeninaktivierung durch die pathogeninaktivierende Verbindung zu stören. Dieses kann beispielsweise stattfinden durch die Verwendung eines Quenchers, der die Pathogenmembranen im wesentlichen nicht überquert und daher Nebenreaktionen außerhalb der Pathogenmembranen quencht. In einer anderen Ausführungsform kann der Quencher kinetisch so langsam mit der pathogeninaktivierenden Verbindung oder daraus gebildeten reaktiven Zwischenprodukten reagieren, dass er die Pathogeninaktivierung im wesentlichen nicht stört.
In einer Ausführungsform können Quencher zu Mehrphasensystemen wie z.B. Zweiphasensystemen zugegeben werden, welche eine Membran umfassen, die die erste und zweite Phase trennt. In einer Ausführungsform ist bei dem Zweiphasensystem eine Phase durch eine Membran begrenzt. Die Membran kann eine natürliche oder künstliche semipermeable Barriere sein, die aus natürlichen oder synthetischen Molekülen oder Mischungen von diesen zusammengesetzt ist. Beispielsweise kann die membranbegrenzte Phase das Innere eines pathogenen Organismus sein, und die andere Phase kann die Phase sein, in welcher der pathogene Organismus enthalten ist. Beispielsweise kann das Pathogen in einer fluiden Phase wie z.B. einer flüssigen Phase einschließlich Blut suspendiert sein. Die membranbegrenzte Phase kann z.B. das Innere einer viralen Lipidhülle sein, welche virale Nukleinsäuren umfasst. In einer anderen Ausführungsform kann die Membran eine Zellmembran sein, und die membranbegrenzte Phase kann das Innere eines pathogenen einzelligen Organismus wie z.B. eines Bakteriums sein. Wenigstens ein Teil der pathogeninaktivierenden Verbindung ist vorzugsweise kinetisch oder thermodynamisch in der Lage, die Membran zu überqueren, während der Quencher in Bezug auf die pathogeninaktivierende Verbindung im wesentlichen kinetisch oder thermodynamisch nicht in der Lage ist, die Membran zu überqueren.
Andere Membranen umfassen Liposomen, wie z.B. in Lasic, D., Liposomes in Gene Delivery, CRC Press, Boca Raton, FL, 1997, Kapitel 6, beschrieben wird. Die Liposomen können als vesikuläre Partikel unter Verwendung von sich selbst zusammensetzenden amphiphilen Molekülen wie z.B. Lecithinen, Sphingomyelinen und Phoshpatidylethanolaminen gebildet werden. Liposomen können ebenfalls gebildet werden, indem negativ geladene Lipide wie z.B. Phosphatidylserine, Phosphatidylglycerole und Phosphatidylinositole verwendet werden. Kationische Liposomen können ebenfalls hergestellt werden, indem kationische Detergenzien verwendet werden, die im Handel erhältlich sind, oder indem polykationische Gruppen, die mit Cholesterin verknüpft sind, verwendet werden, wie in Gao und Huang, Biochem. Biophys. Res. Commun., 179: 280–285 (1991); Nucleic Acids Res., 21: 2867–2872 (1993); und Biochemistry, 35: 1027–1036 (1996) beschrieben wird. Membranen umfassen ebenfalls künstliche Virushüllen, wie in dem U.S.-Patent Nr. 5,753,258 beschrieben wird. Die Membranen umfassen weiterhin die Membranen von nicht pathogenen Zellen wie z.B. Leukozyten.
In einer Ausführungsform wird ein Verfahren bereitgestellt, um unerwünschte Nebenreaktionen einer pathogeninaktivierenden Verbindung in einem zweiphasigen biologischen Material zu quenchen, welches eine erste Phase, die eine Flüssigkeit mit einem eine Membran umfassenden Pathogen darin umfasst, und eine zweite Phase, die von der Membran des Pathogens begrenzt wird, umfasst. Das biologische Material wird mit einer pathogeninaktivierenden Verbindung behandelt, welche eine funktionelle Gruppe umfasst, die in der Lage ist, eine elektrophile Gruppe zu bilden. Vor, gleichzeitig mit oder nach der Behandlung mit der pathogeninaktivierenden Verbindung wird das biologische Material mit einem Quencher behandelt, welcher eine nukleophile Gruppe umfasst, die in der Lage ist, kovalent mit der elektrophilen Gruppe zu reagieren. Vorzugsweise wird der Quencher vor oder gleichzeitig mit der pathogeninaktivierenden Verbindung zugegeben. In einer anderen bevorzugten Ausführungsfarm wird der Quencher innerhalb von ca. 30 Minuten oder innerhalb von ca. 15–20 Minuten oder gegebenenfalls innerhalb von ca. 10 Minuten vor oder nach der Zugabe der pathogeninaktivierenden Verbindung zugegeben.
Vorzugsweise überquert die pathogeninaktivierende Verbindung die Membran in Bezug auf den Quencher vor der Bildung der elektrophilen Gruppe im wesentlichen kinetisch. Ebenso überquert die pathogeninaktivierende Verbindung die Membran nach der Bildung der elektrophilen Gruppe in Bezug auf die pathogeninaktivierende Verbindung vor der Bildung der elektrophilen Gruppe vorzugsweise im wesentlichen kinetisch nicht. Der Quencher wird mit der elektrophilen Gruppe der pathogeninaktivierenden Verbindung reagieren gelassen, und die Reaktion des Quenchers mit der elektrophilen Gruppe der pathogeninaktivierenden Verbindung tritt im wesentlichen in der ersten Phase auf. Die pathogeninaktivierende Verbindung, welche die elektrophile Gruppe umfasst, reagiert mit einer Nukleinsäure des Pathogens in der zweiten Phase, innerhalb der Pathogenmembran, um dadurch das Pathogen zu inaktivieren. Die Membran kann z.B. ein Lipid umfassen. Das Pathogen kann beispielsweise ein Virus sein, welches eine Lipidhülle umfasst, welche die Membran definiert, wobei die zweite Phase durch das Innere der Lipidhülle definiert wird. Das Pathogen kann ebenfalls ein Bakterium sein, welches eine Zellmembran umfasst, die ein Lipid umfasst, welche die Membran des Zweiphasensystems definiert, wobei die zweite Phase durch das Innere der Zellmembran definiert ist.
Vorteilhafterweise wird der Quencher in dem Zweiphasensystem zu der ersten Phase zugegeben und ist im wesentlichen nicht in der Lage, die Membran des Pathogens zu überqueren. Die pathogeninaktivierende Verbindung wird beispielsweise zu der ersten Phase zugegeben. Die pathogeninaktivierende Verbindung ist vor der Bildung der elektrophilen Gruppe in der Lage, die Membran zu der zweiten Phase zu überqueren. Bei der Bildung der elektrophilen Gruppe in situ ist die pathogeninaktivierende Verbindung im wesentlichen nicht länger in der Lage, die Membran zu überqueren. Das Quenchen tritt somit selektiv in der ersten Phase auf, während in der zweiten Phase, d.h. dem Inneren des Pathogens, die pathogeninaktivierende Verbindung mit Nukleinsäuren des Pathogens ohne Quenchen reagiert. Somit tritt in einem biologischen Material wie z.B. einem Blutprodukt das Quenchen von reaktiven Gruppen auf der pathogeninaktivierenden Verbindung und Abbauprodukten von dieser selektiv in der ersten Phase auf, in welcher das Pathogen suspendiert ist. Das Quenchen in der ersten Phase verringert so unerwünschte Nebenreaktionen der reaktiven Gruppe auf der pathogeninaktivierenden Verbindung in der ersten Phase, wie beispielsweise eine kovalente Modifikation von Proteinen im Blut. In dem Verfahren werden die pathogeninaktivierende Verbindung und der Quencher in einer wirksamen Menge zugegeben, um Pathogene in dem Material zu inaktivieren, während unerwünschte Nebenreaktionen der pathogeninaktivierenden Verbindung gequencht werden. Der Quencher hat somit eine Schutzwirkung durch die Verringerung unerwünschter Nebenreaktionen in Materialien wie z.B. einem Blutprodukt, während er erlaubt, dass eine Pathogeninaktivierung stattfindet.
Glutathion hat viele Eigenschaften, die es als einen Quencher besonders nützlich macht. Es ist normalerweise in allen Zelltypen vorhanden. Es wird nicht angenommen, dass es im wesentlichen in der Lage ist, die Membranen wie z.B. Zellmembranen oder Lipidhüllen von Bakterien und lipidumhüllten Viren passiv zu überqueren. Bei pH 7 ist Glutathion geladen, und in Abwesenheit eines aktiven Transports durchdringt es Lipiddoppelschichten nicht in einem signifikanten Ausmaß. Dieses ist konsistent damit, dass die Virusinaktivierung von VSV und anderen umhüllten Viren im wesentlichen von Glutathion nicht beeinträchtigt wird. Die Inaktivierung von lipidumhüllten Viren wie z.B. HIV und VSV wird durch das Vorliegen von Glutathion oder N-Acetylcystein, zwei Thiol-Quenchern, nicht bewirkt. Glutathion hat eine geringe Auswirkung auf die Virusinaktivierung, und während es eine gewisse Auswirkung auf die Inaktivierung von Staphylococcus epidermis und Yersinia enterocolitica hat, kann dieses [Problem] bewältigt werden, indem die Dosis des zugegebenen Quenchers minimiert wird.
Beispielsweise verringert das Vorliegen von ca. 2–4 mM Glutathion die Inaktivierung von Yersinia enterocolitica durch 0,3 mM PIC-1 um ca. 1 bis 2 log Abtötung. Glutathion ist ebenfalls mit einer in vitro-Lagerung von Erythrozyten kompatibel.
Bevorzugt sind Quencher, welche die Funktion der Erythrozyten im wesentlichen nicht schädigen oder Erythrozyten nach der Behandlung modifizieren und ebenfalls die Pathogeninaktivierung durch die pathogeninaktivierende Verbindung nicht wesentlich verringern. Das Fehlen einer wesentlichen schädigenden Auswirkung auf die Funktion der Erythrozyten kann durch im Stand der Technik bekannte Verfahren zum Testen der Funktion von Erythrozyten gemessen werden. Beispielsweise können die Spiegel von Indikatoren wie z.B. intrazellulärem ATP (Adenosin-5'-triphosphat), intrazellulärem 2,3-DPG (2,3-Diphosphoglycerol) oder extrazellulärem Kalium gemessen werden und mit einer unbehandelten Kontrolle verglichen werden. Zusätzlich können Hämolyse, pH, Hämatokrit, Hämoglobin, osmotische Zerbrechlichkeit, Glucoseverbrauch und Lactatproduktion gemessen werden.
Verfahren zur Bestimmung von ATP, 2,3-DPG, Glucose, Hämoglobin, Hämolyse und Kalium sind im Stand der Technik verfügbar. Sie z.B. Davey et al., Transfusion, 32: 525–528 (1992), auf dessen Offenbarung hierin vollinhaltlich Bezug genommen wird. Verfahren zur Bestimmung der Funktion von Erythrozyten werden ebenfalls in Greenwal et al., Vox Sang, 58: 94–99 (1990); Hogman et al., Vox Sang, 65: 271–278 (1993); und Beutler et al., Blood, Bd. 59 (1982) beschrieben, auf deren Offenbarung hierin vollinhaltlich Bezug genommen wird. Extrazelluläre Kaliumspiegel können gemessen werden, indem ein Ciba Corning Model 614 K⁺/Na⁺ Analyzer (Ciba Corning Diagnostics Corp., Medford, MA) verwendet wird. Der pH kann unter Verwendung eines Ciba Corning Model 238 Blood Gas Analyzer (Ciba Corning Diagnostics Corp., Medford, MA) gemessen werden.
In dem Verfahren der Behandlung von Erythrozyten mit einer pathogeninaktivierenden Verbindung, die einen Nukleinsäure-Bindungsliganden und eine Mustardgruppe umfasst, in Gegenwart des Quenchers wie z.B. Glutathion, ist vorzugsweise in einer Ausführungsform der Spiegel von extrazellulärem Kalium nicht größer als 3mal, noch bevorzugter nicht mehr als 2mal die Menge, welche die unbehandelte Kontrolle nach 1 Tag zeigt.
Ebenso sind in einer Ausführungsform Quencher bevorzugt, die eine unerwünschte Modifikation von Erythrozyten während der Pathogeninaktivierung, wie z.B. eine Lyse oder eine andere Schädigung, inhibieren. Vorzugsweise beträgt die Hämolyse der behandelten Erythrozyten nach 28 Tagen Lagerung weniger als 3%, noch bevorzugter nach 42 Tagen Lagerung weniger als 2%, und am meisten bevorzugt nach 42 Tagen Lagerung bei 4°C weniger als oder gleich ca. 1%.
Bevorzugt sind Quencher, welche die Proteinbindung, wie z.B. die Bindung von IgG, an Erythrozyten verringern können und die unter Bedingungen verwendet werden können, welche die Pathogeninaktivierung im Vergleich zu einer Kontrolle, die in Abwesenheit des Quenchers durchgeführt wird, nicht wesentlich inhibieren. Ebenfalls bevorzugt sind Quencher, welche die Bindung von pathogeninaktivierenden Verbindungen an die Oberflächen von Erythrozyten inhibieren. Ein beispielhafter Quencher ist Glutathion. Glutathion verringert vorteilhaft eine mögliche Modifikation von Erythrozyten durch pathogeninaktivierende Verbindungen.
Die Bindung von Spezies wie z.B. IgG, Albumin und IgM an Erythrozyten kann ebenfalls gemessen werden, indem im Stand der Technik verfügbare Methoden verwendet werden. In einer Ausführungsform kann in einem Verfahren der Behandlung von Erythrozyten mit einer pathogeninaktivierenden Verbindung, die einen Nukleinsäure-Bindungsliganden und einen Effektor wie z.B. eine Mustardgruppe umfasst, in Gegenwart eines Quenchers die IgG-Bindung an Erythrozyten im Vergleich zu der IgG-Bindung in Abwesenheit eines Quenchers verringert werden. Die IgG-Bindung an Erythrozyten in Gegenwart eines Quenchers wie z.B. Glutathion und der pathogeninaktivierenden Verbindung beträgt vorzugsweise weniger als ca. 75% oder vorzugsweise weniger als ca. 50% der IgG-Bindung in Abwesenheit des Quenchers.
Das Binden von Molekülen an Erythrozyten kann unter Verwendung von Antikörpern, beispielsweise gegen Acridin und IgG, nachgewiesen werden. Antikörper zur Verwendung in Assays können im Handel erhalten werden oder können erzeugt werden, indem Verfahren verwendet werden, die im Stand der Technik verfügbar sind, z.B. wie in Harlow und Lane, „Antibodies, a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory," 1998 beschrieben wird, auf dessen Offenbarung hierin vollinhaltlich Bezug genommen wird. Beispielsweise ist anti-IgG im Handel bei Caltag, Burlingame, CA; Sigma Chemial Co., St. Louis, MO und Lampire Biological Laboratory, Pipersvelle, PA erhältlich.
Bevorzugt sind Quencher, welche die Bindung der pathogeninaktivierenden Verbindung oder von Fragmenten von dieser an Erythrozyten verringern. In der Ausführungsform, in welcher ein biologisches Material, das Erythrozyten enthält, mit einer pathogeninaktivierenden Verbindung, welche einen Effektor wie z.B. eine Mustardgruppe und eine Nukleinsäurebin dungsgruppe wie z.B. eine Acridingruppe umfasst, behandelt wird, kann die Bindung der pathogeninaktivierenden Verbindung oder von Fragmenten von dieser an Erythrozyten verringert werden. Beispielsweise kann die Bindung von Acridin, das von einer pathogeninaktivierenden Verbindung abgeleitet ist, in welcher der Nukleinsäure-Bindungsligand Acridin ist, an Erythrozyten in Gegenwart eines Quenchers wie z.B. Glutathion verringert werden. In einer bevorzugten Ausführungsform beträgt die Acridinbindung an Erythrozyten, die mit einer pathogeninaktivierenden Verbindung einschließlich einer Acridingruppe in Gegenwart eines Quenchers behandelt wurden, weniger als ca. 75% oder vorzugsweise weniger als ca. 50% oder in einer anderen bevorzugten Ausführungsform weniger als ca. 5% der Acridinbindung in Abwesenheit des Quenchers.
In einer Ausführungsform werden Quencher bereitgestellt, welche die Konzentration von reaktiven elektrophilen alkylierenden Spezies nach der Pathogeninaktivierung um beispielsweise wenigstens ca. 5% oder ca. 20% oder gegebenenfalls ca. 50% oder mehr innerhalb von 1 bis 48 Stunden, beispielsweise ca. 24 Stunden, verringern. Das Vorliegen der reaktiven elektrophilen Spezies kann festgestellt werden, indem im Stand der Technik verfügbare Methoden wie z.B. chromatographische Methoden einschließlich LC-MS (Flüssigchromatographie-Massenspektroskopie) verwendet werden.
Ebenfalls bevorzugt in einer Ausführungsform sind Quencher, welche die Inaktivierung eines Pathogens durch die pathogeninaktivierende Verbindung um nicht mehr als ca. 1 log oder nicht mehr als ca. 2 log oder gegebenenfalls nicht mehr als ca. 3 log, oder in einer anderen Ausführungsform nicht mehr als 4 log im Vergleich zu einer Kontrollpathogeninaktivierung, die in Abwesenheit des Quenchers durchgeführt wird, verringern. Vorzugsweise verringert der Quencher die Inaktivierung eines viralen Pathogens durch die pathogeninaktivierende Verbindung um nicht mehr als ca. 1 log oder nicht mehr als ca. 2 log oder gegebenenfalls nicht mehr als ca. 3 log, im Vergleich zu einer Kontrollpathogeninaktivierung, die in Abwesenheit des Quenchers durchgeführt wird. Die Konzentrationen der pathogeninaktivierenden Verbindung und des Quenchers können eingestellt werden, um die gewünschte log Abtötung zu erhalten und die Verringerung der Inaktivierung zu minimieren, die aufgrund des Vorliegens des Quenchers auftreten kann.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird ein Verfahren bereitgestellt, wobei das Verfahren das Behandeln eines Erythrozyten enthaltenden Materials mit einer wirksamen Menge der pathogeninaktivierenden Verbindung und des Quenchers umfasst, um wenigstens 2 log eines Pathogens zu inaktivieren, und wobei die Funktion der Erythrozyten durch die Behandlung nicht wesentlich verändert wird. In einer anderen bevorzugten Ausführungsform wird ein Verfahren bereitgestellt, wobei das Verfahren das Behandeln des Materials mit einer wirksamen Menge der pathogeninaktivierenden Verbindung und des Quenchers umfasst, um wenigsten 2 log eines Pathogens zu inaktivieren, und wobei die Hämolyse der Erythrozyten nach 28 Tagen Lagerung nach der Behandlung weniger als 3% beträgt.
Erythrozyten, die mit Glutathion behandelt wurden, zeigen in der Funktion der Erythrozyten im Vergleich zu unbehandelten Kontrollen keinen signifikanten Unterschied. Glutathion selbst trägt nicht in irgendeinem signifikanten Ausmaß zur Lyse von Erythrozyten oder einer anderen Schädigung bei, wie durch funktionelle Tests in vivo oder in vitro gemessen wurde. Glutathion kann die Lyse von Erythrozyten in Gegenwart von pathogeninaktivierenden Verbindungen verringern. Erythrozyten können in vitro oder ex vivo mit Glutathion behandelt werden. Einige Verbindungen wie z.B. Thiosulfat, MESNA und N-Acetylcystein sind entweder weniger aktiv oder können Erythrozyten bei Konzentrationen, die zum Quenchen wirksam sind, modifizieren.
Bedingungen für die Pathogeninaktivierung und das Quenchen
Die Bedingungen zur Behandlung biologischer Materialien mit einer pathogeninaktivierenden Verbindung und einem Quencher, um unerwünschte Nebenreaktionen zu verringern, können auf der Grundlage des ausgewählten Materials, des Quenchers und der inaktivierenden Verbindung ausgewählt werden. Die Bedingungen werden so ausgewählt, dass sie eine Pathogeninaktivierung erzeugen, während sie das biologische Material nicht wesentlich verändern.
Gemäß der Erfindung werden Blutprodukte in vitro oder ex vivo mit einer pathogeninaktivierenden Verbindung, welche einen Nukleinsäure-Bindungsüganden und einen Effektor wie z.B. eine Mustardgruppe einschließt, wobei die Mustardgruppe in der Lage ist, in situ eine reaktive elektrophile Gruppe zu bilden, inaktiviert. Das Blutprodukt wird mit einem Quencher behandelt, um unerwünschte Nebenreaktionen der pathogeninaktivierenden Verbindung zu verhindern, ohne die Eigenschaften des Blutprodukts wesentlich zu beeinträchtigen. Der Quencher kann vor, nach oder gleichzeitig mit der pathogeninaktivierenden Verbindung zu dem Blutprodukt zugegeben werden. Vorzugsweise wird der Quencher vor oder gleichzeitig mit der pathogeninaktivierenden Verbindung zugegeben. In einer anderen bevorzugten Ausführungsform wird der Quencher innerhalb von ca. 30 Minuten oder innerhalb von ca. 15 bis 20 Minuten oder gegebenenfalls innerhalb von ca. 10 Minuten vor oder nach der Zugabe der pathogeninaktivierenden Verbindung zugegeben. Erythrozyten enthaltende Materialien können in vitro oder ex vivo behandelt werden.
Die Konzentrationen der pathogeninaktivierenden Verbindung und des Quenchers in dem Blutprodukt, das behandelt wird, können nach Bedarf eingestellt werden, um die gewünschte Verringerung von unerwünschten Nebenreaktionen zu erzeugen, während die Eigenschaft des Materials wie z.B. die Funktion der Erythrozyten immer noch geschützt wird und ebenfalls die gewünschte log Abtötung der Pathogene erreicht wird.
Die Konzentration des Quenchers kann in einem nicht beschränkenden Beispiel ca. 0,1 mM bis ca. 30 mM oder ca. 0,5 mM bis 30 mM betragen. Ein nicht beschränkendes Beispiel für Bedingungen, die zur Behandlung von Erythrozyten geeignet sind, beträgt ca. 0,1 mM bis ca. 30 mM Glutathion, z.B. ca. 0,5 mM bis 20 mM oder ca. 2 mM bis 4 mM Glutathion, oder in einer Ausführungsform ca. 1 mM bis 3 mM.
Das Molverhältnis von Quencher : pathogeninaktivierender Verbindung kann in einer nicht beschränkenden Ausführungsform von ca. 100:1 bis 1:1 reichen, beispielsweise ca. 50:1 oder z.B. ca. 10:1. Ein nicht beschränkendes beispielhaftes Verhältnis von Glutathion pathogeninaktivierender Verbindung, das zur Behandlung von Erythrozyten verwendet werden kann, kann von ca. 100:1 bis 1:1, beispielsweise ca. 50:1 bis 1:1, oder in einer anderen Ausführungsform ca. 10:1 bis ca. 2:1 betragen. In einer bevorzugten Ausführungsform beträgt das Molverhältnis von Glutathion : pathogeninaktivierender Verbindung ca. 10:1. Beispielsweise beträgt bei der Behandlung einer Zusammensetzung, die Erythrozyten umfasst, die molare Konzentration von Glutathion vorzugsweise ca. 5 bis 20mal, z.B. ca. 10mal soviel wie die molare Konzentration der pathogeninaktivierenden Verbindung. Das Verhältnis von Quencher zu pathogeninaktivierender Verbindung wird abhängig von der pathogeninäktivierenden Verbindung und dem Quencher, die ausgewählt wurden, variieren.
Typische Konzentrationen der pathogeninaktivierenden Verbindung, die einen Nukleinsäure-Bindungsliganden und einen Effektor wie z.B. eine Mustardgruppe umfasst, liegen in der Größenordnung von ca. 0,1 μM bis 5 mM, z.B. ca. 50 bis 500 μM. Beispielsweise kann eine Konzentration der pathogeninaktivierenden Verbindung verwendet werden, die ausreicht, um wenigstens ca. 1 log, z.B. wenigstens ca. 3 bis 6 log, oder gegebenenfalls wenigstens ca. 5 oder 6 log des Pathogens in der Probe zu inaktivieren. In einer Ausführungsform sind bevorzugte pathogeninaktivierende Verbindungen jene, die wenigstens 1 log Abtötung bei einer Konzentration von nicht mehr als ca. 500 μM, noch bevorzugter wenigstens 3 log Abtötung bei einer Konzentration von nicht mehr als 500 μM erzeugen. In einem anderen nicht beschränkenden Beispiel kann die pathogeninaktivierende Verbindung wenigstens 1 log Abtötung und vorzugsweise wenigstens 6 log Abtötung, bei einer Konzentration von ca. 0,1 μM bis ca. 3 mM, aufweisen. Beispielsweise können eine Konzentration von ca. 0,15 mM Chinacrinmustard und ca. 3 mM Glutathion verwendet werden, um mehr als 2 log VSV und HIV in einer Erythrozyten enthaltenden Zusammensetzung zu inaktivieren, während die Funktion der Erythrozyten erhalten wird.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird ein Verfahren bereitgestellt, wobei das Verfahren das Behandeln eines Erythrozyten enthaltenden Materials mit einer wirksamen Menge der pathogeninaktivierenden Verbindung und des Quenchers umfasst, um wenigstens 2 log eines Pathogens zu inaktivieren, und wobei die Erythrozytenfunktion durch die Behandlung nicht wesentlich verändert wird. In einer anderen bevorzugten Ausführungsform wird ein Verfahren bereitgestellt, wobei das Verfahren das Behandeln des Materials mit einer wirksamen Menge der pathogeninaktivierenden Verbindung und des Quenchers umfasst, um wenigstens 2 log eines Pathogens zu inaktivieren, und wobei die Hämolyse der Erythrozyten nach 28 Tagen Lagerung weniger als 3% beträgt.
Die Inkubation von Blutprodukten mit der pathogeninaktivierenden Verbindung und dem Quencher kann beispielsweise für wenigstens ca. 0,5 bis 48 Stunden oder mehr, beispielsweise wenigstens ca. 1 bis 48 Stunden oder wenigstens ca. 1 bis 24 Stunden, beispielsweise wenigstens ca. 8 bis 20 Stunden, durchgeführt werden. In einer anderen Ausführungsform wird die Inkubation fortgesetzt, bis das Material weiterverarbeitet oder benutzt wird.
Der Quencher kann vor, gleichzeitig mit oder nach der pathogeninaktivierenden Verbindung zu dem Material, wie z.B. einem Blutprodukt, zugegeben werden. Vorzugsweise wird der Quencher vor oder gleichzeitig mit der pathogeninaktivierenden Verbindung zugegeben. In einer anderen bevorzugten Ausführungsform wird der Quencher innerhalb von ca. 30 Minuten oder innerhalb von ca. 15 bis 20 Minuten vor oder nach der Zugabe der pathogeninaktivierenden Verbindung zugegeben.
Einige Quencher wie z.B. Glutathion können über die Zeit hinweg oxidieren oder anderweitig abgebaut werden oder reagieren. Wenn beispielsweise der Quencher eine thiolhaltige Verbindung ist, kann der Quencher unter Bildung von Disulfiddimeren oxidieren. Es ist bevorzugt, den Quencher zu dem Material zu einer Zeit und in einer Konzentration zuzugeben, dass der Quencher die pathogeninaktivierende Verbindung quenchen kann, bevor diese wesentlich abgebaut wurde oder anderweitig in situ reagiert hat. Wenn beispielsweise der Quencher Glutathion ist, wird das Glutathion in der Ausführungsform, wo das Glutathion vor der pathogeninaktivierenden Verbindung zugegeben wird, vorzugsweise weniger als ca. 12 Stunden vor der Zugabe der pathogeninaktivierenden Verbindung zugegeben. In einer bevorzugten Ausführungsform wird das Glutathion gleichzeitig mit der pathogeninaktivierenden Verbindung zugegeben. In einer anderen Ausführungsform wird das Glutathion innerhalb von 30 Minuten oder ca. 15 bis 20 Minuten oder gegebenenfalls ca. 10 Minuten nach Zugabe der pathogeninaktivierenden Verbindung zugegeben. Die Zugabe von Glutathion nahe an der Zeit der Zugabe der pathogeninaktivierenden Verbindung ist vorteilhaft, um eine mögliche Verringerung der Glutathionkonzentration, z.B. durch Oxidation oder Peptidolyse, welche z.B. in einigen biologischen Materialien wie beispielsweise Plasma auftreten kann, zu minimieren.
Für Erythrozyten wird die Inkubation typischerweise bei einer Temperatur von ca. 2°C bis 37°C, vorzugsweise ca. 18°C bis 25°C durchgeführt. Wenn beispielsweise der Quencher Glutathion ist, können Erythrozyten mit der pathogeninaktivierenden Verbindung und Glutathion für ca. 12 Stunden bei einer Temperatur von ca. 22°C inkubiert werden. Für Blutplättchen beträgt die Temperatur vorzugsweise ca. 20 bis 24°C. Für Plasma kann die Temperatur ca. 0 bis 60°C, typischerweise ca. 0–24°C betragen.
Biologische Materialien
Eine Vielzahl biologischer Materialien kann mit einer pathogeninaktivierenden Verbindung und einer quenchenden Verbindung behandelt werden. Biologische Materialien, welche in vitro oder ex vivo mit den quenchenden Verbindungen gemäß der Erfindung behandelt werden, sind Blutprodukte wie z.B. Vollblut, gepackte Erythrozyten, Blutplättchen und frisches oder eingefrorenes Plasma. Blutprodukte umfassen weiterhin den Plasmaproteinanteil, antihämophilen Faktor (Faktor VIII), Faktor IX und Faktor IX-Komplex, Fibrinogene, Faktor XIII, Prothrombin und Thrombin, Immunglobuline (wie z.B. IgG, IgA, IgD, IgE und IgM und Fragmente von diesen), Albumin, Interferon und Lymphokine. Ebenfalls umfasst sind synthetische Blutprodukte, einschließlich synthetischem Blut oder Blutproduktspeichermedien.
Verringern der Konzentration von Verbindungen in Materialien nach der Behandlung
Die Konzentration der pathogeninaktivierenden Verbindung und/oder des Quenchers in einem biologischen Material wie z.B. einem Blutprodukt kann nach der Behandlung bei spielsweise durch Adsorption in einem diskontinuierlichen oder kontinuierlichen Entfernungsprozess verringert werden. Verfahren und Vorrichtungen, die verwendet werden können, sind beschrieben in PCT US96/09846; U.S. Patentanm. Aktenzeichen Nr. 08/779,830, angemeldet am 6. Januar 1997 und in den entsprechenden PCT-Anmeldungen, die als WO98/30327 und WO98/30545 veröffentlicht wurden; und in der parallel angemeldeten Anmeldung, U.S. Patentanm. Aktenzeichen Nr. 09/003,113, angemeldet am 6. Januar 1998, und entsprechenden PCT-Anmeldungen, die veröffentlicht wurden unter WO99/34914 und WO99/34915, auf deren jeweilige Offenbarungen hierin vollinhaltlich Bezug genommen wird.
Die Erfindung wird durch Bezug auf die folgenden nicht beschränkenden Beispiele noch besser verstanden werden.
Materialien
Die folgenden Materialien wurden in den folgenden Beispielen verwendet.
Während es im Handel bei der Baxter Healthcare Corp., Deerfield, IL, erhältlich ist, wurde Adsol, das in diesem und den folgenden Experimenten verwendet wurde, durch steriles Filtrieren der folgenden Mischung erzeugt: 22 g Glucose, 9 g NaCl, 7,5 g Mannitol und 0,27 g Adenin in 1 Liter destilliertem Wasser.
Erythrosol wurde von der Baxter Healthcare Corp., Deerfield, IL, erhalten oder wurde erzeugt, indem Natriumcitratdihydrat (7,82 g); Natriumhydrogenphosphatdihydrat (0,73 g); Natriumphosphatdihydrat (3,03 g); Adenin (0,22 g); Mannitol (7,74 g); und Glucose (9 g) in 1 Liter destilliertem Wasser vereinigt wurden.
Chinacrinmustard wurde von der Aldrich Chemical Co., St. Louis, MO, erhalten. Glutathion und Cystein wurden von Sigma, St. Louis, MO, erhalten. PIC-1 (β-Alanin, N-(Acridin-9-yl), 2-[bis(2-chlorethyl)amino]ethylester) wurde wie in der U.S. Provisional Anmeldung Aktenzeichen Nr. 60/043,696, angemeldet am 15. April 1997, auf deren Offenbarung hierin vollinhaltlich Bezug genommen wird, beschrieben synthetisiert. PIC-2 (β-Alanin, N-(Acridin-9-yl), 2-[bis(2-chlorethyl)amino]ethylamid) wurde wie in der U.S. Patentanm. Aktenzeichen Nr. 09/003,115, angemeldet am 6. Januar 1998, auf deren Offenbarung hierin vollinhaltlich Bezug genommen wird, beschrieben synthetisiert.
Vesikuläres Stomatitisvirus (VSV) wurde von der ATCC American Type Cell Culture, Rockville, MD erhalten (Titer 8,8 log Einheiten).
Vollblut wurde von dem Sacramento Blood Center (Sacramento CA) erhalten.
Gepackte Erythrozyten (PRBCs) wurden von dem Sacramento Blood Center erhalten, mit einem Hämatokrit (HCT) von ca. 55–65%, oder wurden wie folgt hergestellt, indem Adsol oder Erythrosol als Additivlösung verwendet wurden: innerhalb von 20 Stunden nach Erhalt wurden Einheiten von Vollblut, die von der Sacramento Blood Bank erhalten wurden, für 5 Minuten bei 3800 UpM zentrifugiert, und das Plasma wurde in einen anderen Behälter abgeleitet (expressed); der % Hämatokrit wurde gemessen, indem ein Kapillarrohr mit der Blutprobe gefüllt wurde und für 5 Minuten abzentrifugiert wurde; das Volumen, das von den Erythrozyten eingenommen wurde, wurde mit einer Eichkurve verglichen; 94 ml Adsol oder Erythrosol wurden zugegeben; der endgültige Hämatokrit reichte von 50 bis 60 Prozent, abhängig von der Behandlung.
BEISPIELE
Beispiel 1: Reaktion des Phosphations mit pathogeninaktivierenden Verbindungen.
Die Reaktivität des Phosphations mit pathogeninaktivierenden Verbindungen wurde gezeigt. Es wurde gefunden, dass die Reaktivität für höhere pH-Werte, bei höheren Temperaturen und für höhere Phosphationenkonzentrationen steigt.
Bei der Inkubation von 100 μM PIC-1 mit 25 mM Phosphatpuffer mit steigenden pH-Werten bei Raumtemperatur (RT) wurde eine große Zunahme der Zersetzungsgeschwindigkeit beobachtet. Bei pH 2,2 wurde ein t_1/ ₂ von 450 Minuten im Vergleich zu einem t_1/ ₂ von 25 Minuten bei pH≈6 beobachtet. Die Reaktion von PIC-1 mit Phosphationen erzeugt wenigstens zwei wahrnehmbare Phosphatzwischenprodukte, wie durch HPLC festgestellt wurde. Der Disphosphatester von PIC-1 hydrolysiert weiterhin an dem zerbrechlichen Ester. Eine LC/MS-Analyse der Reaktionsmischung zwischen dem PIC-1 und Phosphationen wurde durchgeführt. Die Spezies, die unter den Reaktionsbedingungen (pH=7, Phosphatpuffer) beobachtet wurden, waren der Diphosphatester, der Monophosphatester des Diols und der Phosphatester der Chlorhydroxyverbindung.
Chinacrinmustard, welchem eine zerbrechliche Linkergruppe fehlt, reagierte ebenfalls mit Phosphationen. Die Reaktion von 100 μM Chinacrinmustard mit 50 mM Phosphat bei Raumtemperatur ist langsamer als dieselbe Reaktion bei 37°C mit 130 mM Phosphat (t_1/ ₂ = 10 Minuten bzw. 3,5 Minuten). Dieses wird sowohl durch die langsamere Produktion des Endprodukts Bisphosphoester als auch durch die längere Lebensdauer der Zwischenproduktspezies gezeigt.
Die Reaktion von Chinacrinmustard mit Glucose-6-phosphat war bei pH=7,8 ebenfalls leicht. Neue Produktspezies wurden durch HPLC beobachtet, was damit konsistent ist, dass wenigstens ein Addukt mit Glucose-6-phosphat gebildet wird.
Beispiel 2: Reaktion von Thiol und anderen Nukleophilen mit pathogeninaktivierenden Verbindungen.
Die Reaktivität der thiolhaltigen Verbindung Glutathion mit pathogeninaktivierenden Verbindungen wurde untersucht. Es wurde gefunden, dass die Reaktivität bei höheren pH-Werten, bei höheren Temperaturen und für höhere Konzentrationen an Thiol steigt. 1 mM Chinacrinmustard wurde in 25 mM HEPES (N-[2-Hydroxyethylpiperazin-N'-[2-ethansulfonsäure], Sigma, St. Louis, MO) bei pH 7 mit 4 mM Glutathion (GSH) inkubiert. Zusätzlich wurden 100 μM PIC-1 in 25 mM HEPES bei pH 7 mit 4 mM GSH bei Raumtemperatur inkubiert. Die Reaktionen von Chinacrinmustard und PIC-1 mit Glutathion fanden mit einem t_1/2 von 50 Minuten bzw. 32 Minuten statt. Das PIC-1/GSH-Bisaddukt wurde durch Massenspektroskopie identifiziert. Eine LC/MS-Analyse der Reaktionsmischung mit Glutathion zu frühen Zeitpunkten identifizierte das Glutathionmonoaddukt/Aziridiniumzwischenprodukt.
Die Reaktion der Thiole mit den pathogeninaktivierenden Verbindungen wurde ebenfalls verfolgt, indem das Verschwinden der Thiolgruppen überwacht wurde, wobei über die Ellman-Reaktion gemessen wurde, welche wie in Aldrichimica Acta, 4: 33 (1971) beschrieben, auf dessen Offenbarung hierin vollinhaltlich Bezug genommen wird, durchgeführt wurde. Die Ellman-Reaktion zeigte die Reaktion einer Verbindung, die zwei 2-Chlorethylgruppen enthielt (Chinacrinmustard), mit Thiolen in einer Stöchiometrie von 1:1,9 und einem Zeitverlauf, der mit der Zersetzung eines Chinacrinmustard konsistent ist. Diese Ergebnisse zeigen die quantitative Reaktivität von Glutathion im Zentrum des Mustard, um kovalente Thioetherbindungen zu bilden.
Es wurde gefunden, dass andere Thiole mit PIC-1 reagieren, einschließlich N-Acetylcystein, Cystein, Homocystein, dem Dipeptid GlyCys, Aminoethanthiol, Dimethylaminoethanthiol, Dithiothreitol, 2-Mercaptonicotinsäure, 2-Mercaptobenzimidazolsulfonsäure und Chinolinthiol. Die Thiole sind im Handel bei der Aldrich Chemical Company (St. Louis, MO) oder Sigma (St. Louis, MO) erhältlich. In allen Fällen wurde die Bildung der Zwischenproduktspezies durch HPLC-Analyse der Reaktionsmischungen beobachtet, und der Verbrauch der Sulfhydrylgruppe wurde über die Ellman-Reaktion beobachtet. Es wurde gefunden, dass Chinacrinmustard ebenfalls mit den Nukleophilen Thiosulfat, Hydrosulfid (HS") und Dithiocarbamat reagiert.
Beispiel 3: Untersuchung der Durchdringung der Erythrozytenmembran durch Glutathion
Die Fähigkeit von Glutathion, die Membranen von Erythrozyten zu durchdringen, wurde als ein Modellmembransystem für die Hüllen von Viren untersucht, da beiden jegliche aktiven Transportsysteme für dieses Peptid fehlen. Die Verteilung des GSH innerhalb und außerhalb von Erythrozyten (Sacramento Blood Center, gepackte Erythrozyten, HCT 55–65%) wurde durch Bestimmung der Mengen an Thiolgruppen in der Innerseite und der Außenseite der Zellen nach Zugabe von exogenem Glutathion ausgewertet. Tabelle 2 zeigt die Gesamtmenge an Glutathion (intrazellulär und Überstand) und die intrazelluläre Menge an Glutathion von Erythrozyten als eine Funktion der Zeit mit und ohne Zugabe von 3 mM GSH. Die Konzentration von GSH wurde auf der Grundlage der Extinktion bei 412 nm berechnet, wobei ein Beckman DU-20 (Beckman, Irvine, CA) Einzelwellenlängen-Spektrometer verwendet wurde. Die Ergebnisse zeigen, dass die Menge an Sulfhydrylgruppen in beiden Kompartimenten konstant bleibt.
TABELLE 2
Beispiel 4: Inaktivierung des Vesikulären Stomatitisvirus mit Chinacrinmustard.
Die Wirkung von verschiedenen Quenchern, die 15 Minuten nach der Zugabe eines Pathogeninaktivators zugegeben wurden, wurde untersucht. Vesikuläres Stomatitisvirus (VSV) (ATCC American Type Cell Culture, Rockville, MD, Titer 8,8 log Einheiten/mL) wurde in gepackten Erythrozyten (PRBCs), die von dem Sacramento Blood Center (Sacramento, CA) erhalten wurden, HCT 55–65%, verdünnt und mit 150 μM Chinacrinmustard (QM) behandelt. Fünfzehn Minuten nach der Zugabe von QM wurden verschiedene Quencher mit Dosen zwischen 1 bis 10 mM zugegeben. Die Quencher waren Aminoethanthiol (AET), Thiosulfat, Glutathion und N-Acetylcystein (NAC), welche von der Aldrich Chemical Co. (St. Louis, MO) erhalten wurden. Nach Inaktivierung für 4 Stunden bei Raumtemperatur wurde in einem Virenplaquetest auf das lebende Virus getestet (Markus et al., Virology, 57: 321–338 (1974)).
Tabelle 3 zeigt die Ergebnisse der Inaktivierung von VSV durch 150 μM QM in Gegenwart der verschiedenen Quencher, die nach 15 Minuten Inkubation zugegeben wurden. In Abwesenheit eines Quenchers inaktivierte QM 3,5 log an VSV. AET und Thiosulfat verminderten die Inaktivierung in einer dosisabhängigen Weise. Weder Glutathion noch NAC schienen die VSV-Inaktivierung zu vermindern.
Tabelle 3
Beispiel 5: Inaktivierung des Vesikulären Stomatitisvirus mit Chinacrinmustard, welcher gleichzeitig mit verschiedenen Quenchern zugegeben wurde.
Die Wirkungen verschiedener Quencher, die gleichzeitig mit einer pathogeninaktivierenden Verbindung zugegeben wurden, wurden untersucht. Vesikuläres Stomatitisvirus (VSV) wurde in gepackten Erythrozyten (PRBC) verdünnt. Die PRBCs wurden dann gleichzeitig mit 150 μM Chinacrinmustard (QM) und verschieden Quenchern behandelt, die mit Dosen zwischen 3 und 30 mM zugegeben wurden. Die Quencher waren Aminoethanthiol (AET), Thiosulfat, Glutathion, N-Acetylcystein (NAC), Cystein und Mercaptoethansulfonsäure-Natriumsalz (MESNA), welche von der Aldrich Chemical Co. (St. Louis, MO) erhalten wurden. Nach 4 Stunden Inaktivierung bei Raumtemperatur wurde das lebende Virus in einem CPE-Test (Baxt et al., Virology, 72: 383–392 (1976)) getestet, indem die zytopathische Wirkung (CPE) des Virus auf Babyhamsternieren (BHK)-Zellen ausgewertet wurde.
Tabelle 4 stellt die Ergebnisse von Experimenten dar, wo die Inaktivierung von VSV durch 150 μM QM bei der gleichzeitigen Zugabe von AET, Thiosulfat, Glutathion oder NAC durchgeführt wurde. In diesem Experiment wurde VSV bis unter die Nachweisgrenze abgetötet, > 4,0 log wurden inaktiviert. Somit können gewisse Quencher eine Wirkung bei der Virusinaktivierung gehabt haben, welche durch diese Grenze maskiert wurde. AET und Thiosulfat zeigten wieder eine signifikante Inhibition bei der Virusinaktivierung, wobei AET der potentere Inhibitor war. Glutathion und NAC zeigten kein Anzeichen, dass sie bei Konzentrationen bis zu 10 mM ein Abtöten des Virus bewirkten, wobei gewisse Anzeichen einer Inhibition bei 30 mM vorlagen.
Tabelle 4
Tabelle 5 stellt die Ergebnisse von einem weiteren Satz von Experimenten dar, wo die Inaktivierung von VSV durch 150 μM QM bei gleichzeitiger Zugabe von Glutathion, Cystein oder MESNA durchgeführt wurde. Die Inaktivierung durch QM allein betrug 3,0 log, und dieses Niveau wurde durch Glutathion selbst bei 30 mM nicht beeinflusst. Cystein zeigte eine dosisabhängige Verminderung bei der Virusinaktivierung, und MESNA ergab gemischte Ergebnisse mit 2,3 log Abtötung bei 30 mM Quencher.
Tabelle 5
Beispiel 6: Inaktivierung von HIV unter Verwendung eines Pathogeninaktivators und eines Quenchers.
Die Wirkungen von Glutathion auf die Inaktivierung von HIV durch einen Pathogeninaktivator wurden in PRBCs untersucht. PRBCs wurden bei einem Hämatokrit von ungefähr 60% in Adsol-Additivlösung hergestellt. Eine Stammlösung von zellfreiem HIV-III_B (Popovic et al., Science, 224: 497 (1984), ungefähr 8 log/mL) wurde bis zu einem Titer von ungefähr 7 log pro mL zugegeben.
Zu Aliquots von HIV-kontaminiertem Blut wurde Glutathion bis zu unterschiedlichen Endkonzentrationen zugegeben, worauf die zugabe von 50 μM PIC-1 folgte. Die Proben wurden für 12 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert. Die Erythrozyten wurden dann pelletiert, und das restliche Virus in der Überstandsfraktion wurde nachgewiesen, indem ein Mikroplaque-Test (Hanson et al., J. Chin. Microbio., 28: 2030 (1990)) verwendet wurde. Kontrollproben wurden nur mit Glutathion inkubiert, um dessen Auswirkung auf die Lebensfähigkeit des HIV zu bestimmen.
Die Ergebnisse der Inaktivierung von HIV durch PIC-1 und Glutathion sind in Tabelle 6 gezeigt. Die Daten in Tabelle 6 zeigen, dass die Inaktivierung von zellfreiem HIV durch Glutathion nicht inhibiert wurde. Es gab einen gewissen Verlust bei der HIV-Infektiosität, ungefähr 0,2 log, aufgrund der Inkubation bei Raumtemperatur für 12 Stunden (Probe 1 gegenüber Probe 3). 30 mM Glutathion allein schienen die Infektiosität um weitere 0,3 bis 0,6 log zu verringern (Proben 2 und 4 im Vergleich zu Proben 1 und 3). Mit 50 μM PIC-1 allein betrug die Inaktivierung ca. 1,8 log; 50 μM PIC-1 plus 30 mM Glutathion inaktivierten ca. 2,4 log. Die scheinbare Zunahme bei der Inaktivierung kann vollständig durch die Wirkung von Glutathion selbst erklärt werden. Über den Bereich von 0,1 mM bis 30 mM Glutathion hinweg gab es eine kleine Zunahme bei der HIV-Inaktivierung, welche mit den Wirkungen von Glutathion allein auf HIV konsistent war.
Tabelle 6
Beispiel 7: Behandlung von bakteriell kontaminierten RBCs mit einem inaktivator und einem Quencher.
Die Auswirkungen der Quencher Glutathion und Cystein auf die Inaktivierung von Yersinia enterocolitica wurde in einer Erythrozytenprobe untersucht. PRBCs wurden in Adsol hergestellt und mit Yersinia (California Department of Health Service, Microbial Disease Laboratory, Berkeley, CA), einer häufigen gramnegativen bakteriellen Kontamination von Blut, gespikt. Proben wurden mit 150 μM PIC-1 und Quencher hergestellt, wie in Tabelle 7 gezeigt ist. PIC-1 wurde ungefähr 5 Minuten nach den Quenchern zugegeben. Nach einer 4stündigen Inkubation bei Raumtemperatur wurde der Titer der Bakterien bestimmt, indem Verdünnungen auf Nähragar plattiert wurden und über Nacht bei 37°C kultiviert wurden.
Tabelle 7 zeigt die Wirkungen von GSH und Cystein auf die Inaktivierung von Yersinia mit 150 μM PIC-1. Weder Glutathion noch Cystein allein bei einer Konzentration von 16 mM wiesen irgendeine Wirkung auf den Titer von Yersinia auf (Proben 3 und 10). Es gab jedoch eine dosisabhängige Abnahme bei der Inaktivierung mit den Quenchern. Die Inaktivierung wurde um 4 bis 4,5 log mit 16 mM Quencher inhibiert (Proben 9 und 16), aber die Inhibition betrug weniger als 1 log mit 2 mM Quencher (Proben 6 und 13).
Tabelle 7
Beispiel 8: Verwendung von Glutathion als einem Quencher bei der Inaktivierung von Staphylococcus epidermidis
Die Auswirkungen von Glutathion auf die Inaktivierung von Staphylococcus epidermidis (California Department of Health Services, Microbial Disease Laboratory, Berkeley, CA) wurde in einer Erythrozytenprobe untersucht. PRBCs wurden in Adsol hergestellt und mit S. epidermidis gespikt. Proben wurden mit 75 μM PIC-1 und dem Quencher, Glutathion, wie in Tabelle 8 gezeigt hergestellt. PIC-1 wurde ungefähr 5 Minuten nach dem Quencher zugegeben. Nach einer 4stündigen Inkubation bei Raumtemperatur wurde der Titer der Bakterien bestimmt, indem Verdünnungen auf Nähragar plattiert wurden und über Nacht bei 37°C kultiviert wurden.
Tabelle 8 veranschaulicht die Inaktivierung von Staphylococcus epidermidis mit 75 μM PIC-1 und unterschiedlichen Mengen an GSH. Die Ergebnisse, welche in Tabelle 8 dargestellt werden, sind konsistent mit der Beobachtung, dass Glutathion die Inaktivierung von Bakterien in einem gewissen Ausmaß inhibiert. S. epidermidis war offensichtlich weniger empfindlich gegenüber dem Quenchen mit Glutathion als Yersinia.
Tabelle 8
Bei einer Konzentration von 1 bis 4 mM verringern die Quencher die Abtötung der Bakterien nur mäßig, und 3 log oder mehr Bakterien können inaktiviert werden.
Beispiel 9: Untersuchung der Auswirkungen von Quenchern auf die Verringerung unterwünschter Nebenreaktionen pathogeninaktivierender Verbindungen in Materialien, die Erythrozyten umfassen.
Die Auswirkungen von Glutathion und Cystein auf die Bindung von IgG, Albumin und der pathogeninaktivierenden Verbindung an Erythrozyten wurde untersucht. Die Behandlung von Erythrozyten mit einigen pathogeninaktivierenden Verbindungen, die einen Nukleinsäure-Bindungsliganden und eine reaktive Gruppe wie z.B. einer Mustardgruppe, wie z.B. PIC-1, einschließen, kann zu einer kovalenten Bindung auf niedrigem Niveau von IgG an die Oberfläche von Erythrozyten führen. Die Menge an IgG liegt im Allgemeinen unterhalb der Niveaus, die benötigt werden, um ein positives Ergebnis in dem Direkten Antiglobulin-Test (DAT) zu erzeugen (Walker, R. H., Herausg., Technical Manual, 10. Ausg., American Associ ation of Blood Banks, Arlington, VA, 1990). Jedoch kann die Aufnahme eines Quenchers die Proteinbindung verringern oder eliminieren. Weiterhin wird unter Verwendung einer polyklonalen Antikörpermischung, welche den Acridinanteil von PIC-1 erkennt, die Bindung der pathogeninaktivierenden Verbindung an die Erythrozytenoberfläche verringert, wenn ein Quencher aufgenommen wird.
PRBCs wurden mit einem Hämatokrit von 60% in Adsol hergestellt. Vor der Behandlung mit PIC-1 wurden entweder Glutathion oder Cystein bis zu Konzentrationen zwischen 0,5 und 16 mM zugegeben, und die Proben wurden gemischt. PIC-1 wurde bis zu 1 mM zugegeben, und die Proben wurden für 20 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert. Nach der Inkubation wurden zwanzig Mikroliter jeder Probe dreimal mit 1 mL Blutbank-Salzlösung gewaschen und in einem Endvolumen von 0,4 mL resuspendiert.
Anti-Acridin-Antikörper wurden hergestellt, wie bei Harlow und Lane, "Antibodies, a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory," 1988, beschrieben wird, worauf hierin vollinhaltlich Bezug genommen wird. Ziegen-anti-Maus-IgG und anti-Humanalbumin-Antikörper wurden von Caltag, Burlingame, CA erhalten.
Zur Analyse wurden 50 μl-Aliquots von verdünnten, gewaschenen Erythrozyten in vier Röhrchen aliquotiert und mit anti-Human-IgG-, anti-Humanalbumin- oder anti-Acridin-Antikörpern für 30 min bei 37°C inkubiert. Nach der Inkubation wurden die Proben einmal mit 1,0 mL Blutbank-Salzlösung gewaschen. Die anti-human-Antikörper wurden kovalent mit Fluorescein markiert, und Proben wurden direkt analysiert, indem ein Flusszytometer verwendet wurde. Um den anti-Acridin-Antikörper nachzuweisen, wurden die Proben ein zweites Mal gewaschen und dann mit einem fluoresceinmarkierten Ziegen-anti-Maus-IgG für 30 min bei 37°C inkubiert. Die Proben wurden vor der Analyse wie vorher gewaschen.
Zur Analyse wurden die Proben 1:1 in Haemaline 2-Lösung (Biochem Immunosystems, Allentown, PA) verdünnt und in einem FACScan (Becton-Dickinson, San Jose, CA) analysiert, wobei die Einstellungen der Streuung für eine Unterscheidung von Erythrozyten optimiert wurden. Zwanzigtausend Fluoreszenzereignisse wurden pro Probe gesammelt.
Tabelle 9 stellt die Ergebnisse dar, welche die Auswirkung von Glutathion und Cystein auf die Bindung von IgG, Albumin und Acridin an Erythrozyten zeigen. Die Behandlung mit PIC-1 allein verursachte eine klare Zunahme der IgG-, Albumin- und Acridinsignale (Proben 1 und 2). Die Inkubation mit entweder 16 mM Glutathion oder Cystein veränderte die Fluoreszenz im Vergleich zu der unbehandelten Probe nicht (Proben 3 bzw. 10). Die Behandlung mit PIC-1 in Gegenwart von jedem der Quencher verursachte eine dosisabhängige Abnahme in dem Niveau der IgG-, Albumin- und Acridinbindung. Sowohl die Bindung von IgG als auch von Albumin schienen in Gegenwart von ≥ 2 mM Quencher auf den Niveaus des Hintergrunds zu liegen (Proben 6 und 13). Die Acridinbindung war im Gegensatz dazu über den gesamten getesteten Bereich hinweg abhängig von der Konzentration des Quenchers. Selbst 16 mM Glutathion oder Cystein hoben das Acridinsignal nicht völlig auf. Mit 4 mM Glutathion sank das Acridinsignal 53fach (Probe 2 gegenüber Probe 7); mit 4 mM Cystein sank das Acridinsignal 83fach (Probe 2 gegenüber Probe 14). In einer parallelen Untersuchung unter Verwendung von 0,3 mM PIC-1 wurden unter Verwendung von Glutathion ähnliche Tendenzen beobachtet, auch wenn das anfängliche Niveau der Bindung von Proteinen und Acridin aufgrund der niedrigeren Konzentration von PIC-1 erniedrigt war.
Tabelle 9
Beispiel 10: Untersuchung der Auswirkungen von Glutathion auf die Eigenschaften von mit PIC-1 behandelten, gelagerten PRBCs.
Um jegliche Auswirkungen von Glutathion auf die Eigenschaften von Erythrozyten zu bestimmen, wurde das folgende Experiment zweifach durchgeführt. vier Einheiten ABO-abgeglichenes Vollblut wurden vereinigt, gemischt und dann erneut in vier Blutbeutel verteilt, um identische 500 mL-Einheiten zu erzeugen. PRBCs wurden hergestellt, indem Adsol als die Additivlösung verwendet wurde. Innerhalb von 20 Stunden nach Erhalt werden die Einheiten an Vollblut, das von der Sacramento Blood Bank erhalten wurde, für 5 Minuten bei 3800 UpM zentrifugiert, und das Plasma wird in einen anderen Behälter abgeleitet. Der % Hämatokrit wird gemessen, indem ein Kapillarrohr mit der Blutprobe gefüllt und für 5 Minuten abzentrifugiert wird. Das Volumen, das von den Erythrozyten eingenommen wird, wird mit einer Kalibrierungskurve verglichen. 94 mL Adsol werden zugegeben. Der endgültige Hämatokrit reichte, abhängig von der Behandlung, von 50 bis 53 Prozent.
In jedem Experiment wurden vier Bedingungen untersucht: (1) Kontrolle, kein PIC-1 und kein Glutathion; (2) nur 3 mM Glutathion; (3) nur 0,3 mM PIC-1; und (4) 0,3 mM PIC-1 plus 3 mM Glutathion. Alle Einheiten einschließlich der Kontrolle wurden für 14 Stunden bei 20°C inkubiert. Die PRBCs wurden dann bis zum Ende in ein Lager mit 4°C überführt. Die Proben wurden unmittelbar nach der Behandlung und danach auf ca. wöchentlicher Basis zur Analyse entnommen. Die Ergebnisse für 2,3-DPG, ATP und die Hämolyse sind in den Tabellen 10 und 11 zusammengefasst. Diese Daten zeigen keinen signifikanten Unterschied zwischen irgendeiner der Behandlungen im Vergleich zu der Kontrolle. Die Messungen von extrazellulärem Kalium, intrazellulärem Glutathion, osmotischer Zerbrechlichkeit, Glucoseverbrauch und Lactatproduktion bestätigten ebenfalls, dass Glutathion, entweder allein oder mit PIC-1, die in vitro-Eigenschaften von Erythrozyten nicht signifikant verändert.
Extrazelluläre Kaliumspiegel wurden gemessen, indem ein Ciba Corning Modell 614 K⁺/Na⁺-Analysegerät (Ciba Corning Diagnostics Corp., Medford, MA) verwendet wurde. Die Hämolyse wurde gemessen, wie in Hogman et al., Transfusion 31: 26–29 (1991) beschrieben wird. Das intrazelluläre Glutathion wurde gemessen, wie in Beutler, "Red Cell Metabolism", Grune und Stratton, 3. Ausg., 1984 beschrieben wird. 2,3-DG und ATP wurden gemessen, indem die Verfahren von Sigma Nr. 665 bzw. 366 verwendet wurden (Sigma, St. Louis, MO). Der Glucoseverbrauch und die Lactatproduktion wurden gemessen, indem die Verfahren von Sigma Nr. 115 bzw. 735 verwendet wurden (Sigma, St. Louis, MO). Die osmotische Zerbrechlichkeit wurde gemessen, wie in Beutler et al., Blood, Bd. 59 (1982) beschrieben wird.
Tabelle 10
Tabelle 11
Beispiel 11: Untersuchung der Wiederherstellung und des Überlebens von Mäuse-RBCs, die mit GSH behandelt wurden.
Die Wirkung von 0,6 mM PIC-2 mit und ohne 6,0 mM GSH auf die Wiederherstellung und das Überleben von biotinmarkierten murinen Erythrozyten (RBCs) in vivo wurde untersucht. Mäuse-RBCs wurden markiert und dann mit PIC-2, PIC-2 + Glutathion oder nur Glutathion behandelt. Behandelte, markierte Zellen wurden in Empfänger infundiert. Die Zirkulation dieser Zellen wurde über 36 Tage hinweg durch Flusszytometrie verfolgt. Es wurde kein Unterschied beobachtet bei der Wiederherstellung oder der Lebensspanne von irgendeiner der behandelten RBCs im Vergleich zu Kontrollen mit nur der Markierung. Die Daten zeigen, dass Glutathion in der Behandlung kompatibel ist mit der RBC-Funktion in vivo und dass die PIC-2-Behandlung selbst Erythrozyten nicht schädigt.
Spendermäusen (BALB/c-Männchen) wurden an den Tagen 1 und 2 0,1 mg NHS (N-Hydroxysuccinimid)-Biotin (Pierce, Rockford, IL) injiziert. Eine Stunde nach der zweiten Injektion wurde die Markierungseffizienz überprüft, indem ein kleines Volumen biotinmarkiertes Vollblut aus jeder Maus mit einem Streptavidin-R-Phycoerythrin-Konjugat (Molecular Probes, Eugene, OR) umgesetzt wurde und dann der Prozentsatz der fluoreszierenden Zellen auf einem FACScan (Betton-Dickinson, San Jose, CA) bestimmt wurde. Alle Mäuse mit ≥ 90% markierten RBCs wurden als Spendermäuse verwendet.
Blut wurde aus den Spendermäusen durch Herzpunktion entnommen und einmal bei 1281 × g für sechs Minuten abzentrifugiert. Das Plasma wurde entfernt, und die PRBCs wurden für 14 Stunden bei Raumtemperatur (RT) ± 0,6 mM PIC-2 ± 6,0 mM GSH inkubiert. Am folgenden Morgen wurden die RBCs gewaschen und in HBSS (Hank's Gepufferter Salzlösung, Sigma, St. Louis, MO) resuspendiert. Die prozentuale Biotinmarkierung der gewaschenen RBCs wurde wie oben bestimmt. Die Gesamtzahl an RBCs wurde bestimmt, indem eine CBC (Vollständige Blutzellenzählung) auf einem Zellenzählgerät (Complete Blood Count Cell Counter, Biochem Immunosystems, Allentown, PA) durchgeführt wurde.
Die gewaschenen RBCs wurden dann den Empfängermäusen (BALB/c-Weibchen) transfundiert. Jede Maus erhielt ≌ 800 × 10⁶ biotinmarkierte RBCs. Jede Maus wurde zur Zeit der Transfusion gewogen, und der wahre Prozentsatz von markierten RBC/Maus wurde auf der Basis des Gewichts der Maus, ihrer RBC-Zahl, wie sie durch eine CBC bestimmt wurde, und dem Prozentsatz der markierten transfundierten RBCs, der wie oben bestimmt wurde, berechnet.
Das prozentuale Überleben der markierten RBC wurde nach 1 Std. und an den Tagen 1–40 bestimmt. Die Ergebnisse wurden normiert, indem das prozentuale Überleben nach einer Stunde = 100% verwendet wurde. Die wahre prozentuale Wiederherstellung von markierten RBCs nach einer Stunde betrug für alle Mäuse 105,8 = 17,5%. Die Ergebnisse wurde normiert auf % Überleben nach einer Stunde = 100%, um Unterschiede in der Effizienz der i.v.-Injektion von markierten RBC zu erlauben.
Das Überleben der mit PIC-2 behandelten RBC war über das Experiment hinweg im Wesentlichen dasselbe wie bei der Kontrolle. Die durchschnittlichen mittleren Überlebenswerte werden in 1 angegeben. Die Daten legen nahe, dass die Behandlung mit PIC-2, entweder mit oder ohne Glutathion, keine signifikante Auswirkung auf das Überleben der RBC aufwies. Somit ist Glutathion mit der Zirkulation von Erythrozyten in vivo nach der Behandlung kompatibel.

Claims

Ein Verfahren zum Quenchen unerwünschter Nebenreaktionen einer pathogeninaktivierenden Verbindung in einem Blutprodukt in vitro oder ex vivo, wobei das Verfahren umfasst: Behandeln eines Blutprodukts in vitro oder ex vivo mit einer wirksamen Menge einer pathogeninaktivierenden Verbindung, welche einen Nukleinsäure-Bindungsliganden und eine funktionelle Gruppe umfasst, welche eine elektrophile Gruppe ist oder in der Lage ist, eine solche zu bilden, wobei die pathogeninaktivierende Verbindung keine Photoaktivierung benötigt, um ein Pathogen zu inaktivieren; und Behandeln des Blutprodukts in vitro oder ex vivo mit einem Quencher, welcher eine nukleophile Gruppe umfasst, die in der Lage ist, kovalent mit der elektrophilen Gruppe zu reagieren; wobei die pathogeninaktivierende Verbindung und der Quencher in einer Menge verabreicht werden, die wirksam ist, um Pathogene in dem Material zu inaktivieren, während unerwünschte Nebenreaktionen der pathogeninaktivierenden Verbindung gequencht werden.
Ein Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei das Blutprodukt Vollblut, Erythrozyten, Plasma, Blutplättchen, gepackte Erythrozyten oder ein Blutprodukt mit einem Hämatokrit von ca. 30–85% umfasst.
Ein Verfahren gemäß Anspruch 1 oder 2, wobei die elektrophile Gruppe kationisch, gegebenenfalls ein Aziridiniumion ist.
Ein Verfahren gemäß irgendeinem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die elektrophile Gruppe mit einer Nukleinsäure unter Bildung einer kovalenten Bindung mit der Nukleinsäure reagiert.
Ein Verfahren gemäß irgendeinem vorhergehenden Anspruch, wobei die funktionelle Gruppe eine Mustardgruppe ist, welche in der Lage ist, in situ unter Bildung der elektrophilen Gruppe zu reagieren.
Ein Verfahren gemäß irgendeinem vorhergehenden Anspruch, wobei die pathogeninaktivierende Verbindung weiterhin einen zerbrechlichen Linker umfasst, welcher die funktionelle Gruppe und den Nukleinsäure-Bindungsliganden verknüpft.
Ein Verfahren gemäß irgendeinem vorhergehenden Anspruch, wobei die pathogeninaktivierende Verbindung einen Nukleinsäure-Bindungsliganden umfasst, welcher ausgewählt wird aus Furocumarinen, Furocumarinderivaten, Acridinen und Acridinderivaten; und wobei die funktionelle Gruppe eine Mustardgruppe ist.
Ein Verfahren gemäß irgendeinem der Ansprüche 1 bis 3, wobei die pathogeninaktivierende Verbindung β-Alanin, N-(Acridin-9-yl), 2-[Bis(2-chlorethyl)amino]ethylester oder Chinacrinmustard ist.
Ein Verfahren gemäß irgendeinem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die nukleophile Gruppe ein Thiol, eine Thiosäure, Dithiosäure, ein Phosphat, Thiophosphat, Thiosulfat oder ein Amin ist.
Ein Verfahren gemäß irgendeinem der vorhergehenden Ansprüche, wobei der Quencher ausgewählt wird aus Glutathion, N-Acetylcystein, Cystein, Mercaptoethansulfonatsalzen und Dimercaprol.
Ein Verfahren gemäß Anspruch 10, wobei der Quencher Glutathion in einer Konzentration von ca. 0,5 bis 30 mM ist.
Ein Verfahren gemäß irgendeinem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die pathogeninaktivierende Verbindung und der Quencher mit dem Material für wenigstens ca. 1 bis 48 Stunden inkubiert werden.
Ein Verfahren gemäß irgendeinem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Konzentration der pathogeninaktivierenden Verbindung ca. 0,1 μM bis 5 mM beträgt; und/oder ausreicht, um wenigstens ca. 3 bis 6 logs eines Pathogens in dem Material zu inaktivieren.
Ein Verfahren gemäß irgendeinem der vorhergehenden Ansprüche, wobei der Quencher die Inaktivierung eines Pathogens durch die pathogeninaktivierende Verbindung um nicht mehr als ca. 3 logs im Vergleich zu einer Kontrollpathogeninaktivierung, welche in Abwesenheit des Quenchers durchgeführt wird, verringert.
Ein Verfahren gemäß irgendeinem der vorhergehenden Ansprüche, wobei der Quencher die Inaktivierung eines Viruspathogens durch die pathogeninaktivierende Verbindung um nicht mehr als ca. 1 log im Vergleich zu einer Kontrollpathogeninaktivierung, welche in Abwesenheit des Quenchers durchgeführt wird, verringert.
Ein Verfahren gemäß irgendeinem der vorhergehenden Ansprüche, wobei der Quencher ein festes Trägermaterial umfasst, welches die nukleophile Gruppe umfasst.
Ein Verfahren gemäß irgendeinem der vorhergehenden Ansprüche, wobei der Quencher zu dem Blutprodukt nach der Zugabe der pathogeninaktivierenden Verbindung zugegeben wird.
Ein Verfahren gemäß irgendeinem der Ansprüche 1 bis 16, wobei der Quencher zu dem Blutprodukt vor oder gleichzeitig mit der Zugabe der pathogeninaktivierenden Verbindung zugegeben wird.
Ein Verfahren gemäß irgendeinem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Blutprodukt Erythrozyten umfasst und wobei die Funktion der Erythrozyten nach der Behandlung nicht wesentlich verändert ist.
Ein Verfahren gemäß irgendeinem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Blutprodukt Erythrozyten umfasst und wobei das Verfahren das Behandeln des Materials mit einer wirksamen Menge der pathogeninaktivierenden Verbindung und des Quenchers umfasst, um wenigstens 2 logs eines Pathogens zu inaktivieren, und wobei die Funktion der Erythrozyten durch die Behandlung nicht wesentlich verändert wird.
Ein Verfahren gemäß irgendeinem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Blutprodukt Erythrozyten umfasst und wobei die Hämolyse der Erythrozyten nach 28 Tagen Lagerung nach der Behandlung weniger als 3% beträgt.
Ein Verfahren gemäß irgendeinem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Verfahren das Behandeln des Materials mit einer wirksamen Menge der pathogeninaktivie renden Verbindung und des Quenchers umfasst, um wenigstens 2 logs eines Pathogens zu inaktivieren.
Ein Verfahren gemäß irgendeinem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Blutprodukt nach der Behandlung zur Einführung in ein Individuum geeignet ist.
Ein Verfahren gemäß irgendeinem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Verfahren das Behandeln eines Blutprodukts, welches ein Pathogen umfasst, das gegebenenfalls ein prokatryotischer oder eukaryotischer Organismus oder ein lipidumhülltes Virus ist, umfasst.
Ein Verfahren gemäß irgendeinem vorhergehenden Anspruch, wobei das Blutprodukt ein zweiphasiges biologisches Material umfasst, welches eine erste Phase, die eine Flüssigkeit umfasst, welche darin ein Pathogen aufweist, das eine Membran umfasst, und eine zweite Phase, welche durch die Membran des Pathogens begrenzt wird, umfasst, und wobei die pathogeninaktivierende Verbindung vor der Bildung der elektrophilen Gruppe, in Bezug auf den Quencher, kinetisch in der Lage ist, die Membran zu überqueren; und wobei die pathogeninaktivierende Verbindung nach der Bildung der elektrophilen Gruppe, bezogen auf die pathogeninaktivierende Verbindung vor der Bildung der elektrophilen Gruppe, im Wesentlichen kinetisch nicht in der Lage ist, die Membran zu überqueren.
Ein Verfahren gemäß Anspruch 25, welches umfasst: Reagieren lassen des Quenchers mit der pathogeninaktivierenden Verbindung, und wobei der Quencher im Wesentlichen in der ersten Phase mit der elektrophilen Gruppe der pathogeninaktivierenden Verbindung reagiert.
Ein Verfahren gemäß Anspruch 25 oder 26, welches umfasst: Reagieren lassen der pathogeninaktivierenden Verbindung, welche die elektrophile Gruppe umfasst, mit einer Nukleinsäure des Pathogens in der zweiten Phase, um dadurch das Pathogen zu inaktivieren.
Ein Verfahren gemäß irgendeinem der Ansprüche 25 bis 27, wobei die Membran ein Lipid umfasst.
Ein Verfahren gemäß irgendeinem der Ansprüche 25 bis 28, wobei das Pathogen ist: i) ein Virus, welches eine Lipidhülle umfasst, welche die Membran definiert, und wobei die zweite Phase durch das Innere der Lipidhülle definiert wird; oder ii) ein Bakterium, welches eine Zellmembran umfasst, welche ein Lipid umfasst, welche die Membran des Zweiphasensystems definiert, und wobei die zweite Phase durch das Innere der Zellmembran definiert wird.
Ein Verfahren gemäß irgendeinem der Ansprüche 25 bis 29, wobei der Quencher im Vergleich zu der pathogeninaktivierenden Verbindung vor der Bildung der elektrophilen Gruppe im Wesentlichen kinetisch nicht in der Lage ist, die Membran zu überqueren.
Ein Verfahren gemäß irgendeinem der Ansprüche 25 bis 30, wobei die pathogeninaktivierende Verbindung eine funktionelle Gruppe umfasst, welche in der Lage ist, eine elektrophile Gruppe zu bilden, welche ein Aziridiniumion ist.
Ein Verfahren gemäß irgendeinem der vorhergehenden Ansprüche, welches das Verringern der Konzentration von wenigstens einem von der pathogeninaktivierenden Verbindung und dem Quencher in dem Blutprodukt nach der Behandlung des Blutprodukts umfasst, um ein Produkt zu erhalten, welches zur Einführung in ein Individuum geeignet ist.