DE69827172T2

DE69827172T2 - Lipase und Verwendung davon zur Verbesserung von Teigen und Backwaren

Info

Publication number: DE69827172T2
Application number: DE69827172T
Authority: DE
Inventors: Charlotte Horsmans Poulsen; Jorn Borch Soe; Preben Rasmussen; Susan Mampusta Madrid; Masoud R. Zargahi
Original assignee: Danisco AS
Current assignee: DuPont Nutrition Biosciences ApS
Priority date: 1997-04-09
Filing date: 1998-04-03
Publication date: 2006-02-23
Anticipated expiration: 2018-04-04
Also published as: ATE331793T1; ES2168236T3; EP1466980A1; US20030108641A1; ES2350891T3; DE1193314T1; DE69841719D1; US6406723B1; US7371423B2; AU6820798A; WO1998045453A1; EP0977869A1; EP0973399B1; DK0973399T3; DE69825263T3; EP1721527A2; EP1193314B1; EP1466980B1; WO1998044804A1; ATE470356T1

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft das Gebiet der Nahrungsmittelherstellung, insbesondere die Herstellung von verbesserten Backwaren. Speziell liefert die Erfindung neue Polypeptide mit Lipaseaktivität, welche in der Lage ist, Nahrungsmittelprodukten, einschließlich Backwaren, verbesserte Eigenschaften zu verleihen.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG UND STAND DER TECHNIK
Lipasen (EC 3.1.1.3), die als Carboxylesterasen definiert werden können, welche die Hydrolyse von Acylglycerolen katalysieren, sind physiologisch sehr wichtige Enzyme als eines der drei Hauptverdauungsenzyme zusammen mit Amylasen und Proteasen. Sie hydrolysieren Lipide zu Glycerol und Fettsäuren, aber sie können auch in Esterifizierungs- oder Transesterifizierungsreaktionen wirken.
Mehrere Studien berichten über die Reinigung und Charakterisierung von Lipasen aus Aspergillus niger. So reinigten Tombs und Blake (Biochim. Biophys., 1982, 700:81-89) eine Lipase aus einem kommerziellen, rohen Aspergillus-Medienkonzentrat. Die reine Lipase war ein glycosyliertes Dimer, das zwei Ketten enthielt, von denen jede ein Molekulargewicht von 25 kDa hatte.
Iwai und Tsujisaka (in Lipasen, Borgström und Brockman (Hrsg.), Elsevier, Amsterdam, 1984, S. 443-468) reinigten ebenfalls eine extrazellulär abgesonderte Lipase aus Aspergillus niger und erhielten Kristalle der Lipase. Sie bestimmten das Molekulargewicht der Lipase mit 38 kDa und fanden, daß das Enzym als Monomer vorlag. Der pI-Wert wurde mit 4,3 bestimmt. Der optimale pH-Wert an Olivenöl war 5,6, und die optimale Temperatur an dem gleichen Substrat betrug 25°C. Die Lipase war stabil in einem pH-Wert-Bereich von 2,2 bis 6,8 (30°C, 24 Stunden) und bis zu einer Temperatur von 50°C (pH 5,6, 15 min). Die Lipase zeigte eine hohe Aktivität gegenüber Triglyceriden mit Fettsäuren mittlerer Kettenlänge.
Höfelmann et al. (J. Food Sci., 1985, 50:1721-1731) verwendeten ein kommerzielles Aspergillus niger Lipaseprodukt (Lipase 2212, Röhm) als Ausgangsmaterial für die Reinigung von Lipase. Es wurden zwei Lipasen mit einem Molekulargewicht von 19 kDa und 31 kDa und einem pI-Wert von 3,5 bzw. 4,0 erhalten. Beide Enzyme waren glycosyliert.
Torossian und Bell (Biotechnol. Appl. Biochem., 1991, 13:205-211) verwendeten eine rohe kommerzielle Lipasepräparation aus Aspergillus niger von Amano (Japan). Sie bestimmten das Molekulargewicht mit 37 kDa, und der pI-Wert war 4,0. Es wurde bestimmt, daß der N-Terminus XVSTSTLDELQFALQ war. Sugihara et al. (Agric. Biol. Chem., 1988, 52:1591-1592) fanden, daß der N-Terminus SVT und das Molekulargewicht 35 kDa für eine Lipase, die aus einer Amano (Japan) Aspergillus niger Lipasepräparation gereinigt war, waren.
Trotz der Diskrepanzen bezüglich des Molekulargewichts für die erwähnten Lipasen wurde von allen berichtet, daß sie 1,3-spezifisch in Bezug auf die Hydrolyse von Triglyceriden waren.
In der Backindustrie ist es gut bekannt, Enzyme, wie Amylasen, Xylanasen, Oxidasen und Proteasen, für die Verbesserung des Teiges, die Teighandhabungseigenschaften und/oder die Backware zu verwenden, um erhöhtes Volumen, verzögertes Altwerden und größere Weichheit zu erhalten. Die Verwendung von Lipasen als Backzusatz ist ebenfalls bekannt.
Daher offenbart die US 3,368,903 gereinigte Lipasepräparationen, die aus Pflanzensamen isoliert wurden, welche, wenn sie zu einem Brotteiggemisch hinzugefügt werden, einen signifikanten verzögernden Effekt auf das Altwerden von Brot haben.
Die JP-62-285749-A beschreibt ein Verfahren zur Brotherstellung, bei dem Lipase zu dem Teig im Gemisch mit lebenswichtigem Gluten und Lecithin hinzugefügt wird. Es ist angegeben, daß diese Lipase Qualitätseigenschaften, wie das Brotvolumen und die Elastizität der Krume, verschlechtert.
Mohsen et al. (Egypt. J. Food Sci., 1986, 14:175-182) beschreiben, daß ein Lipaseprodukt von Rhizopus delemar die Weichheit von Brot verbessert.
Ein Brotverbesserer, der Glucoseoxidase in Kombination mit Oxidasen, die nicht Glucoseoxidase oder Hydrolasen sind, wie z.B. Lipase, enthält, ist in der EP 468 731 A1 offenbart. Man erhält ein Brot mit einem ausreichenden Volumen, das in der Qualität der inneren und äußeren Eigenschaften zufriedenstellend ist. Jedoch hat die Verwendung von Lipase alleine einen Brotvolumeneffekt.
Die WO-94/04035 offenbart ein Verfahren zur Verbesserung der Eigenschaften eines Teiges (mit und ohne zugesetztem Fett) und/oder einer Backware, die aus dem Teig hergestellt ist, durch Zusatz einer Lipase von mikrobiellem Ursprung zu dem Teig. Die Verwendung der mikrobiellen Lipase führte zu einem erhöhten Volumen und einer verbesserten Weichheit des gebackenen Produkts. Darüber hinaus fand man einen verbesserten Anti-Alterungseffekt.
Die EP 585 988 A1 offenbart eine Brotverbessererzusammensetzung mit wenigstens einer Lipase, wenigstens einer Hemizellulase und wenigstens einer Amylase. Backexperimente zeigten, daß die Verwendung von Lipase alleine in einem Teig ohne zugesetztes Fett zu einem verminderten Volumen des gebackenen Produkts führte, wogegen kein Volumeneffekt beobachtet wurde, wenn Lipase in einem Teig verwendet wurde, der zugesetztes Fett enthielt.
Aus dem Stand der Technik kann somit abgeleitet werden, daß die Wirkungen von bekannten Lipasen, wenn sie als Teigzusätze verwendet werden, in Bezug auf das Altwerden oder die Verzögerung der Krumenfestigkeit und das Brotvolumen hochgradig variabel sind.
Die vorliegende Erfindung liefert die Verwendung eines Polypeptids mit Lipaseaktivität zur Herstellung eines Teiges und/oder eines gebackenen Produkts, wobei das Polypeptid ein Triacylglycerol hydrolysierendes Enzym ist und wobei das Polypeptid in der Lage ist, Fettsäuren mit kurzer, mittlerer und langer Kettenlänge zu spalten, dadurch gekennzeichnet, daß das Polypeptid in der Lage ist, Galaktolipide, die normalerweise in dem Mehl vorhanden sind, zu den entsprechenden Galaktosylmonoglyceriden zu hydrolysieren, und wobei das Polypeptid in der Lage ist, wenigstens 10% der Galaktosyldiglyceride, die normalerweise in dem Mehlteig vorhanden sind, zu Galaktosylmonoglyceriden zu hydrolysieren, und wobei das Enzym dem gebackenen Produkt eine oder mehrere der folgenden Eigenschaften, nämlich verbesserte Homogenität und verminderten Porendurchmesser, verleiht.
Neue Polypeptide mit Lipaseaktivität, von denen gefunden wurde, daß sie Teigen und Backwaren sehr erwünschte Eigenschaften verleihen, die im Stand der Technik nicht offenbart sind, können erfindungsgemäß verwendet werden. So zeigten diese Polypeptide in Backexperimenten überraschende und zuvor nicht beschriebene oder nahegelegte Eigenschaften, wenn sie in Mehlteigen verwendet wurden, einschließlich verbesserter Krumenporenhomogenität und vermindertem Porendurchmesser ohne gleichzeitige negative Wirkungen auf das Brotvolumen und die Krumenporosität. Somit liefert die Verwendung der Polypeptide gemäß der Erfindung Backwaren, die weniger zu mechanischer Verformung neigen.
Ein geringer durchschnittlicher Porendurchmesser, erhöhte Porenhomogenität und unveränderte Porosität implizieren, daß die Erfindung das Mittel zum Erhalt von Backwaren mit verstärkter Krumenstruktur liefert. Die verbesserte Porenhomogenität der Backware schließt weiterhin den Vorteil ein, daß man ein Produkt erhält, das aufgrund der verstärkten Krumenstruktur besser schneidbar und beständig gegenüber physischer Handhabung ist.
Es ist gut bekannt, daß es schwierig ist, dünne Schichten aus Butter oder Margarine auf Brotscheiben mit einer sehr inhomogenen Porenstruktur auszubreiten. Es ist daher ein Vorteil, daß Brot, wie es gemäß der vorliegenden Erfindung erhältlich ist, eine feine und homogene Porenstruktur besitzt.
Es ist gut bekannt, daß ein geschnittener Laib weniger beständig ist gegenüber physischer Handhabung als ein ungeschnittener Laib. Daher ist die verstärkte Krumenstruktur, die man durch Zusatz des Polypeptids der vorliegenden Erfindung zu dem Teig erhält, besonders vorteilhaft in Backwaren, wie Toastbrot, welche typischerweise unmittelbar nach dem Backen von dem Hersteller geschnitten und in geschnittenem Zustand an Fast-Food-Geschäfte und Supermärkte verteilt werden.
Man hat weiterhin gefunden, daß die Verwendung gemäß der vorliegenden Erfindung die Stabilität des Glutennetzwerks in Mehlteigen verbessert, was den Vorteil mit sich bringt, daß die Toleranz gegenüber Variationen in der Fermentationszeit verbessert wird.
Es ist daher eine wichtige Aufgabe der vorliegenden Erfindung, solche nützlichen lipaseaktiven Polypeptide bereitzustellen. Es wurde gefunden, daß solche Polypeptide aus filamentösen Pilzen, wie z.B. Aspergillus tubigensis, erhältlich sind. Jedoch wird das Polypeptid nur in geringen Mengen in Pilzstämmen vom Wildtyp produziert. Eine weitere wichtige Aufgabe besteht daher darin, ein Verfahren zur Herstellung der neuen Polypeptide in einer kostengünstigen Art und Weise unter Verwendung von rekombinanter DNA-Technologie bereitzustellen.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Dementsprechend betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung eines Polypeptids mit Lipaseaktivität zur Herstellung eines Teiges und/oder eines gebackenen Produkts, wobei das Polypeptid ein Triacylglycerol hydrolysierendes Enzym ist und wobei das Polypeptid in der Lage ist, Fettsäuren mit kurzer, mittlerer und langer Kettenlänge zu spalten, dadurch gekennzeichnet, daß das Polypeptid in der Lage ist, Galaktolipide, die normalerweise in dem Mehl vorhanden sind, zu den entsprechenden Galaktosylmonoglyceriden zu hydrolysieren, und wobei das Polypeptid in der Lage ist, wenigstens 10% der Galaktosyldiglyceride, die normalerweise in dem Mehlteig vorhanden sind, zu Galaktosylmonoglyceriden zu hydrolysieren, wobei das Polypeptid wenigstens 80% Aktivität nach vier Tagen bei 20°C und bei einem pH-Wert im Bereich von 3,5 bis 8 behält und wobei das Enzym dem gebackenen Produkt eine oder mehrere der folgenden Eigenschaften, nämlich verbesserte Homogenität und verminderten Porendurchmesser, verleiht.
Ein Polypeptid für die erfindungsgemäße Verwendung besitzt Lipaseaktivität und ist von Aspergillus tubigensis ableitbar, wobei das Polypeptid die folgenden Eigenschaften hat: (i) Es behält wenigstens 80% Aktivität nach 4 Tagen bei 20°C bei einem pH-Wert im Bereich von 3,5-8, (ii) es behält wenigstens 60% seiner Aktivität nach 1 Stunde bei 60°C in 100 mM Natriumacetat-Puffer bei einem pH-Wert von 5,0, und (iii) es besitzt einen isoelektrischen Punkt, bestimmt durch isoelektrische Fokussierung, im Bereich von 3,5-4,5. Speziell ist das Polypeptid ein solches, das wenigstens eine Aminosäuresequenz aufweist, die aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2 und SEQ ID NO:3, wobei Xaa in den Sequenzen eine Aminosäure ist, die aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr und Val.
Ein rekombinantes DNA-Molekül, das eine Nukleotidsequenz aufweist, die ein lipaseaktives Polypeptid codiert, wird hierin ebenfalls gelehrt.
Auf eine Zelle, die ein rekombinantes DNA-Molekül umfaßt, das in der Lage ist, das Polypeptid mit Lipaseaktivität zu exprimieren, wird hierin ebenfalls durch Bezugnahme angegeben.
Es wird auch ein Verfahren zur Herstellung des Polypeptids für die Verwendung gemäß der Erfindung gelehrt, wobei das Verfahren umfaßt, daß man eine Wirtszelle mit einem rekombinanten DNA-Molekül, das eine Sequenz umfaßt, die das Polypeptid codiert, transformiert, wobei die Wirtszelle in der Lage ist, die Nukleotidsequenz, die das Polypeptid codiert, zu exprimieren, die transformierte Wirtszelle unter Bedingungen kultiviert, bei denen die Nukleotidsequenz exprimiert wird, und das Polypeptid erntet.
Ein Verfahren zur Herstellung eines gebackenen Produkts mit verbesserter Porenhomogenität und reduziertem Porendurchmesser, wobei das Verfahren umfaßt, daß man das Polypeptid gemäß der Verwendung der Erfindung zu dem Teig hinzufügt.
Somit betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung des Polypeptids mit Lipaseaktivität in einem Teig für ein gebackenes Produkt zur Verbesserung der Stabilität des Glutennetzwerks in dem Teig oder zur Verleihung verbesserter Porenhomogenität oder von vermindertem Porendurchmesser in dem gebackenen Produkt, und eine teigverbessernde Zusammensetzung, die das Polypeptid und wenigstens eine weitere herkömmliche Teigzusatzkomponente umfaßt.
AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Wie es oben erwähnt ist, betrifft die Erfindung die Verwendung eines Polypeptids mit Lipaseaktivität. Wie er hierin verwendet wird, wird der Begriff "Lipase" dazu gebraucht, irgendein Triacylglycerol hydrolysierendes Enzym zu bezeichnen, einschließlich solcher Enzyme, die in der Lage sind, Fettsäuren mit kurzer, mittlerer und langer Kettenlänge abzuspalten. Gemäß der Erfindung ist das lipaseaktive Polypeptid ein solches, welches wenigstens 80% Aktivität nach 4 Tagen bei 20°C und bei einem pH-Wert im Bereich von 3,5-8, einschließlich einem pH-Wert im Bereich von 5-7, behält.
Damit es praktisch nützlich ist, ist es auch vorteilhaft, daß das Polypeptid für die Verwendung gemäß der vorliegenden Erfindung eine gute Thermotoleranz und eine optimale Temperatur für die Aktivität besitzt, wenigstens in einem Ausmaß, bei dem es in einem Teig voll aktiv ist und wenigstens bis der Teig in einem Ofen erhitzt wird. Vorzugsweise besitzt die Lipase eine Thermostabilität, die das Enzym während wenigstens eines Teils des Backvorgangs aktiv macht. Speziell ist die Thermostabilität des Polypeptids auf einem Niveau, bei dem es wenigstens 60% seiner Aktivität nach 1 Stunde bei 60°C in 100 mM Natriumacetat-Puffer bei einem pH-Wert von 5,0 behält, einschließlich eines Polypeptids, das wenigstens 80% seiner Aktivität nach 1 Stunde bei 50°C unter den gleichen Bedingungen behält.
In einer speziellen Ausführungsform umfaßt das Polypeptid für die Verwendung gemäß der Erfindung wenigstens eine Aminosäuresequenz, die hierin als SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2 und SEQ ID NO:3 gezeigt ist.
In vorteilhaften Ausführungsformen zeigt das Polypeptid für die Verwendung gemäß der Erfindung enzymatische Aktivität bei einem pH-Wert in einem Bereich von 3,5-8,0, einschließlich dem Bereich von 5-7.
Das Polypeptid für die Verwendung gemäß der vorliegenden Erfindung hat einen isoelektrischen Punkt, bestimmt durch isoelektrische Fokussierung, im Bereich von 3,5-4,5, wie dem Bereich von 3,8-4,2, einschließlich einem isoelektrischen Punkt von 4,0 ± 0,1.
Eine sehr vorteilhafte Eigenschaft des Polypeptids für die Verwendung gemäß der Erfindung ist dessen Fähigkeit, Galactolipide, wie Galactosyldiglyceride, einschließlich Digalactosyldiglycerid und Monogalactosyldiglycerid, die normalerweise in einem Teig vorhanden sind, zu den entsprechenden Galactosylmonoglyceriden zu hydrolysieren. So wurde gefunden, daß die vorliegenden Polypeptide in der Lage sind, wenigstens 10% der Galactosyldiglyceride, die normalerweise in einem Mehlteig vorhanden sind, zu Monoglyceriden zu hydrolysieren. Vorzugsweise werden wenigstens 15% dieser Diglyceride, wie wenigstens 25%, hydrolysiert.
Das Polypeptid für die Verwendung gemäß der Erfindung kann in einer glycosylierten Form vorliegen. Es wurde jedoch gefunden, daß die enzymatische Aktivität solch einer glycosylierten Lipase durch Deglycosylierung erhöht werden kann. Dementsprechend kann es bevorzugt sein, das Polypeptid in einer nicht-glycosylierten Form bereitzustellen. Daher kann, wenn das Polypeptid aus seiner natürlichen Quelle oder aus einer rekombinanten Wirtszelle in einer glycosylierten Form erhalten wird, dessen Aktivität durch N-Deglycosylierung durch wenigstens teilweises Entfernen von Kohlenwasserstoffresten durch Verdau mit einem deglycosylierenden Enzym, wie endo-β-N-Acetylglucosamidase H, erhöht werden.
Alternativ wird ein nicht-glycosyliertes Polypeptid für die Verwendung gemäß der Erfindung bereitgestellt, indem man eine DNA-Sequenz, die solch ein Polypeptid codiert, so modifiziert, daß sie eine codierende Sequenz bereitstellt, die keine Aminosäuren oder eine Untersequenz des Polypeptids codiert, die Glycosylierungsstellen bereitstellt. Wie es nachfolgend erläutert wird, können solche mutierten Sequenzen, die mutante Polypeptide mit Lipaseaktivität codieren, bereitgestellt werden, welche relativ zu dem Polypeptid vom Wildtyp eine erhöhte enzymatische Aktivität haben.
Das Ausmaß an Glycosylierung des erhaltenen Polypeptids spiegelt sich in dem Molekulargewicht wider. Als ein Beispiel, wenn das Polypeptid für die Verwendung gemäß der Erfindung von Aspergillus tubigensis in einer glycosylierten Form erhalten wird, hat es typischerweise ein Molekulargewicht, bestimmt durch Gelfiltration unter Verwendung von Superose 12, von 32 ± 1 kDa. Gemäß matrixunterstützter Laserdesorptionsionisationsmassenspektrometrie (MALDI-MS) hat das Polypeptid gemäß der Erfindung ein Molekulargewicht von 31 ± 1,5 kDa. Es wurde gefunden, daß in diesem anfänglich glycosylierten Polypeptid N-verknüpfte Oligosaccharide etwa 10% des Polypeptids ausmachen.
In einer speziellen Ausführungsform umfaßt das Polypeptid für die Verwendung gemäß der Erfindung die Aminosäuresequenz, die hierin als SEQ ID NO:9 gezeigt ist, oder eine Variante, ein Homologes oder ein Fragment davon.
Im vorliegenden Zusammenhang umfassen die Begriffe "Variante" oder "Fragment" in Bezug auf das Polypeptid für die Verwendung gemäß der vorliegenden Erfindung jede Substitution, Variation, Modifikation, Ersetzung, Deletion oder Hinzufügung einer oder mehrerer Aminosäuren aus oder zu der Sequenz SEQ ID NO:9, vorausgesetzt, daß die resultierende Aminosäuresequenz Lipaseaktivität besitzt, vorzugsweise wenigstens die gleiche Aktivität wie das als SEQ ID NO:9 gezeigte Polypeptid.
Insbesondere wird der Begriff "Homologes" hierin so verwendet, daß er Polypeptide mit Lipaseaktivität umfaßt, welche im Verhältnis zu der als SEQ ID NO:9 gezeigten Sequenz eine ähnliche Aminosäurezusammensetzung oder -sequenz haben, die geringere Variationen zulassen, die keine nachteilige Wirkung auf die enzymatischen Eigenschaften und/oder die biologische Funktion haben oder die interessante und nützliche neue Eigenschaften oder biologische Funktionen verleihen können. Das homologe Polypeptid kann von irgendeinem Organismus abgeleitet sein oder es kann auch durch die Verwendung von rekombinanten DNA-Techniken erhalten werden, bei denen ein natürlich vorkommendes Polypeptid hinsichtlich seiner Sequenz modifiziert wird. Vorzugsweise ist ein homologes Polypeptid ein solches, bei dem wenigstens 75%, vorzugsweise wenigstens 85% und besonders bevorzugt wenigstens 95% Homologie zu der als SEQ ID NO:9 gezeigten Sequenz besteht.
In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung ist das Polypeptid Teil eines Fusionsproteins, das weitere enzymatisch aktive Sequenzen umfaßt. Obwohl es möglich ist, solche chimären Polypeptide durch posttranslationale Modifikationen herzustellen, ist es im allgemeinen bevorzugt, solche Fusionsproteine durch rekombinante DNA-Mittel bereitzustellen, bei denen eine Wirtszelle mit einer DNA-Sequenz, die das Fusionsprotein codiert, transformiert und dieses Produkt als ein chimäres Protein exprimiert wird. Beispiele für solch eine zusätzliche enzymatische Aktivität umfassen proteolytische, amylolytische und hemizellulolytische Aktivitäten.
Wenn ein Polypeptid von einer Zelle erhalten wird, die das Gen exprimiert, welches das Polypeptid codiert, liegt es im allgemeinen in der Form einer mehr oder weniger rohen Präparation vor, die andere (kontaminierende) enzymatische Aktivitäten enthält. Gemäß der Erfindung ist es auch möglich, das Polypeptid in einer im wesentlichen reinen Form bereitzustellen. Solch ein gereinigtes Polypeptid kann erhalten werden, indem man eine rohe Enzympräparation irgendeinem herkömmlichen Verfahren zur Reinigung von Polypeptiden und Proteinen unterzieht.
Gemäß der Erfindung ist das Polypeptid aus Aspergillus tubigensis erhältlich, wie es in den folgenden Beispielen beschrieben ist. Es kann jedoch auch von jedem anderen Organismus erhalten werden, der solch ein Polypeptid herstellt, einschließlich Pilzen, Hefespezies, Gramnegativen und Gram-positiven Bakterien, Pflanzenzellen oder Tierzellen, einschließlich menschlichen Zellen.
Wie es oben erwähnt ist, sind interessierende Eigenschaften des Polypeptids für die Verwendung gemäß der Erfindung dessen Fähigkeit, den Krumenporendurchmesser zu reduzieren und die Porenhomogenität der Krume von Brot zu verbessern. In einer speziellen Ausführungsform ist das Polypeptid ein solches, welches, wenn es zu einem Brotteig in einer Menge von 5000 Lipaseeinheiten (LUS) pro kg Mehl hinzugefügt wird, den durchschnittlichen Porendurchmesser der Krume des Brots, das aus dem Teig hergestellt wird, um wenigstens 10%, relativ zu einem Brot, welches aus einem Brotteig ohne Hinzufügung der Lipase hergestellt ist, führt. In einer weiteren Ausführungsform ist das Polypeptid ein Polypeptid, welches, wenn es zu einem Brotteig in einer Menge von 5000 LUS pro kg Mehl hinzugefügt wird, die Porenhomogenität der Krume des Brotes, das aus dem Teig hergestellt ist, um wenigstens 5%, relativ zu einem Brot, welches aus einem Brotteig ohne Hinzufügung der Lipase hergestellt ist, führt.
Zur Bezugnahme wird hierin ein rekombinantes DNA-Molekül beschrieben, das eine Nukleotidsequenz umfaßt, die das Polypeptid mit Lipaseaktivität codiert, wie es oben beschrieben ist.
Solch eine Nukleotidsequenz kann aus einer natürlichen Quelle isoliert werden oder sie kann konstruiert werden, wie es ausführlich in den untenstehenden Beispielen beschrieben ist, wo solch eine codierende Sequenz, die aus Aspergillus tubigensis isoliert und als lipA bezeichnet wird, ausführlich beschrieben ist. Die Nukleotidsequenz kann auch auf der Grundlage von Aminosäuresequenzen von natürlich vorkommendem Polypeptid, das Lipaseaktivität aufweist, synthetisiert werden.
In nützlichen Ausführungsformen umfaßt das rekombinante DNA-Molekül eine Nukleotidsequenz, die ein Lipaseaktivität aufweisendes Polypeptid codiert, welches wenigstens eine der Aminosäuresequenzen umfaßt, die hierin als SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2 und SEQ ID NO:3 gezeigt sind, oder eine Nukleotidsequenz, die ein Lipaseaktivität aufweisendes Polypeptid codiert, welches die Aminosäuresequenz umfaßt, die als SEQ ID NO:9 gezeigt ist.
In weiteren speziellen Ausführungsformen umfaßt das rekombinante DNA-Molekül wenigstens eine unter SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6 und SEQ ID NO:7 oder wenigstens die codierende Sequenz der Nukleotidsequenz, die als SEQ ID NO:8 gezeigt ist, oder eine Variante, ein Homologes oder ein Fragment davon oder eine dazu komplementäre Sequenz.
Im vorliegenden Zusammenhang umfassen die Begriffe "Variante" oder "Fragment" in Bezug auf die Nukleotidsequenz, die das Polypeptid der vorliegenden Erfindung codiert, jede Substitution, Variation, Modifikation, Ersetzung, Deletion oder Hinzufügung von einer oder mehreren Nukleinsäuren von oder zu der Sequenz, vorausgesetzt, daß die resultierende Nukleotidsequenz ein Polypeptid codiert, das Lipaseaktivität besitzt und vorzugsweise wenigstens die gleiche Aktivität wie das als SEQ ID NO:9 gezeigte Polypeptid hat.
Der Begriff "Homologes" umfaßt Homologie in Bezug auf die Sequenz und/oder Struktur und/oder Funktion, vorausgesetzt, daß die resultierende Nukleotidsequenz ein Polypeptid codiert, das Lipaseaktivität aufweist. In Bezug auf Sequenzhomologie (d.h. Ähnlichkeit) besteht vorzugsweise wenigstens 75%, besonders bevorzugt wenigstens 85%, ganz besonders bevorzugt wenigstens 95% Homologie zu der als SEQ ID NO:8 gezeigten Sequenz.
Das rekombinante DNA-Molekül kann mit Vorteil eine Sequenz umfassen, die ein Polypeptid gemäß der Erfindung codiert, das keine Aminosäure(n) enthält, die eine Glycosylierungsstelle oder Glycosylierungsstellen bereitstellt bzw. bereitstellen. Solche geeigneten rekombinanten DNA-Moleküle können unter den Plasmiden ausgewählt sein, die unter den Hinterlegungsnummern NCIMB 40931, NCIMB 40932, NCIMB 40933, NCIMB 40934 und NCIMB 40935 hinterlegt sind.
Eine Zelle, die ein rekombinantes DNA-Molekül enthält, wie es oben beschrieben ist, und die in der Lage ist, das Polypeptid für die Verwendung gemäß der Erfindung zu exprimieren, wird hierin ebenfalls gelehrt. Solch eine Zelle kann unter Pilzen, Hefespezies, Bakterien, Pflanzenzellen und Tierzellen, einschließlich menschlichen Zellen, ausgewählt sein. Geeignete Zellen werden unter filamentösen Pilzen, wie Aspergillus sp., Penicillium sp., Rhizomucor sp., Mucor sp., Trichoderma sp., einschließlich T. reesei, T. viridae und T. longibrachiatum, Neurospora sp. und Humicola sp., ausgewählt. Geeignete Aspergillus-Spezies umfassen A. niger, A. tubigensis, A. oryzae und A. awamori.
Geeignete Bakterienwirtszellen umfassen Gram-negative Spezies, wie z.B. E. coli, einschließlich dem E. coli-Stamm, der das Plasmid pLIP4 enthält, wie er unter der Hinterlegungsnummer NCIMB 40863 hinterlegt ist, und Gram-negative Spezies, wie z.B. Bacillus-Spezies und Milchsäurebakterienspezies, wie Lactococcus lactis.
Ein Verfahren zur Herstellung des Polypeptids für die Verwendung gemäß der Erfindung durch Expression einer Nukleotidsequenz, die in der Lage ist, das Polypeptid in einer geeigneten transformierten Wirtszelle zu exprimieren, wird hierin gelehrt. Das Verfahren umfaßt in einer ersten Stufe, daß eine geeignete transformierbare Zelle mit dem oben genannten rekombinanten DNA-Molekül transformiert wird, um eine transformierte Wirtszelle zu erhalten, die das Polypeptid exprimiert. Verfahren zur Transformation von prokaryontischen Wirtszellen sind auf dem Gebiet gut dokumentiert, siehe z.B. Sambrook et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Aufl., 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press).
Der Begriff "transformierte Wirtszelle" wird hierin so verwendet, daß er jeden transformierbaren Organismus umfaßt, in den die Nukleotidsequenz, die das Enzym gemäß der vorliegenden Erfindung codiert, eingebracht wurde. Das Einbringen der codierenden Sequenz kann in der Form des Einbringens eines episomalen Replikons, wie eines Plasmids, eines Bakteriophagen oder eines Cosmids, in die Zelle erfolgen. Solche Replikons können mit Vorteil in mehreren Kopien eingebracht werden, um eine erhöhte Expression des Polypeptids zu erhalten. Es kann in bestimmten Fällen vorteilhaft sein, daß die Nukleotidsequenz in das Genom des Wirtszellorganismus aufgenommen wird, z.B. mittels eines transponierbaren Elements oder durch ein Rekombinationsereignis.
Ein derzeit bevorzugter Wirtsorganismus für die Expression der Nukleotidsequenz der vorliegenden Erfindung und/oder für die Herstellung des Polypeptids der vorliegenden Erfindung ist ein Organismus der Gattung Aspergillus, wie Aspergillus niger oder Aspergillus tubigensis.
Ein transformierter Aspergillus-Stamm gemäß der vorliegenden Erfindung kann z.B. nach den Verfahren hergestellt werden, die von Rambosek und Leach (CRC Crit. Rev. Biotechnol., 1987, 6:357-393), Davis (in: Progress in Industrial Microbiology, Martinelli und Kinghorn (Hrsg.), Elsevier Amsterdam, 1994, 29:525-560), Balance (in: Molecular Industrial Mycology, Systems and Applications for Filamentous Fungi, Leong und Berka (Hrsg.), Marcel Dekker Inc., New York 1991, S. 1-29) und Turner (in: Progress in Industrial Microbiology, Martinelli und Kinghorn (Hrsg.), Elsevier Amsterdam, 1994, 29:641-666) beschrieben sind.
In einer weiteren Ausführungsform nutzt das Verfahren der Erfindung eine Hefewirtszelle, wie Saccharomyces cerevisiae oder Pichia pastoris. Die Expression von heterologen Genen in Saccharomyces cerevisiae wurde von Goody et al. (in: Yeast Biotechnology, Berry et al. (Hrsg.), Allen und Unwin, London, 1987, S. 401-429) und King et al. (in: Molecular and Cell Biology of Yeasts, Walton und Yarronton (Hrsg.), Blackie, Glasgow, 1989, S. 107-133) besprochen.
Darüber hinaus betrifft die vorliegende Erfindung in einem speziellen Aspekt die Verwendung des Polypeptids gemäß der Erfindung zur Verbesserung der Stabilität des Glutennetzwerks in einem Mehlteig und um dem gebackenen Produkt, das aus dem Teig hergestellt ist, verbesserte Porenhomogenität und reduzierten Porendurchmesser zu verleihen. Es wurde gefunden, daß das Polypeptid diese verbessernden Wirkungen in einem fettfreien Teig besitzt.
Im vorliegenden Zusammenhang wird der Begriff "fettfreier Teig" verwendet, um anzugeben, daß dem Mehlteig kein Lipid oder Fett zugesetzt ist. Ein bevorzugtes Mehl ist Weizenmehl oder ein zusammengesetztes Mehl, bei dem ein Teil des Weizenmehls durch Stärke ersetzt ist, optional ergänzt durch Pflanzenprotein und Zusätze, wie Emulgiermittel. Andere Typen von Mehl, erhalten aus Reis, Mais, Gerste und Roggen, werden ebenfalls in Erwägung gezogen.
Somit umfassen die Hauptbestandteile des Teiges Mehl, vorzugsweise Weizenmehl, Wasser und eine "gaserzeugende Substanz", wie Hefe oder ein chemisches Triebmittel. Zusätzlich zu den oben genannten Hauptbestandteilen kann der Teig geringfügige Bestandteile enthalten, wie Salz, Zucker, Mineralien, Vitamine, Aromastoffe und wenigstens einen weiteren Teigzusatz, wie z.B. ein Emulgiermittel, ein Hydrokolloid, ein Stärke abbauendes Enzym oder ein Zellulose oder Hemizellulose abbauendes Enzym.
Während des Mischens und Formens der Teigbestandteile zur Bereitstellung eines homogenen Teiges ist die Wechselwirkung zwischen Weizengluten, Stärke und Wasser wesentlich, um einen Teig mit guten Teighandhabungseigenschaften und ein zufriedenstellendes gebackenes Produkt, das aus dem Teig hergestellt ist, zu erhalten.
Es wird allgemein angenommen, daß Stärke und Gluten ein strukturelles Netzwerk ausbilden, das die Glycolipide in der Form von flüssigkristallinen Phasen mit lamellarer Struktur als Lagen zwischen Glutenprotein und Stärke umfaßt.
Die Krumenstruktur eines gebackenen Produkts kann durch visuelle Betrachtung des Brotquerschnitts beurteilt werden. Ein zuverlässigeres Verfahren, das ein quantitatives Maß für die Krumenstruktur liefert, ist jedoch die Bildanalyse unter Verwendung eines Bildanalysators, der auf dem gesamten Querschnitt von Brot die einzelnen Poren eine nach der anderen trennt und analysiert und den mittleren Porengrößendurchmesser berechnet. Der Brotquerschnitt in seiner Gesamtheit ist gekennzeichnet durch die Verteilung der einzelnen Poren, z.B. in der Form eines Histogramms. Unter Homogenität versteht man die Gleichförmigkeit der Porengröße, und im vorliegenden Zusammenhang ist der Begriff "Homogenität" als der Prozentsatz an Poren definiert, die größer sind als das 0,5-fache des Durchschnitts des Porendurchmessers und kleiner als das 2-fache des durchschnittlichen Porendurchmessers. Der Bildanalysator berechnet auch die Porosität, welche das Verhältnis des gesamten Brotquerschnitts, der aus Poren besteht, ist.
Unter Anwendung von Bildanalyse wurde gefunden, daß gebackene Produkte, die aus einem Teig hergestellt sind, wie er oben definiert ist, einschließlich einem fettfreien Teig, der durch Zusatz des Polypeptids der vorliegenden Erfindung ergänzt worden war, eine verbesserte Porenhomogenität und eine reduzierte Porengröße erzielt/erhalten haben, wobei die Porosität unverändert ist.
Somit erhält man durch Verwendung des Polypeptids gemäß der Erfindung in einem fettfreien Teig gebackene Produkte mit einer verstärkten Krumenstruktur. Es wurde auch gefunden, daß die verbesserte Porenhomogenität und die Abnahme der Porengröße nicht mit einer Verminderung anderer Broteigenschaften, wie dem Brotvolumen und Alterungseigenschaften, einhergehen.
Wie bereits erwähnt wurde, ist eine besonders interessante Eigenschaft des Polypeptids gemäß der vorliegenden Erfindung dessen Fähigkeit, durch Hydrolyse die Glycolipide, Monogalactosyldiglycerid (MGDG) und Digalactosyldiglycerid (DGDG) zu den polareren Bestandteilen Monogalactosylmonoglycerid (MGMG) und Digalactosylmonoglycerid (DGMG) zu modifizieren, welche stärker oberflächenaktive Komponenten sind als MGDG und DGDG.
Ohne Bindung an eine Theorie wird angenommen, daß die verbesserte Porenhomogenität der Brotkrume, welche durch Verwendung des Polypeptids der Erfindung in einem Teig erreicht wird, durch die Bildung der stärker oberflächenaktiven Glyceride MGMG und DGMG, welche in Kombination mit den freigesetzten Fettsäuren in ionisierter Form zu der Ausbildung von mesomorphen Phasen mit lamellarer Struktur beitragen, verursacht wird.
Erfindungsgemäß entspricht die Menge an Polypeptid, die zu dem Teig hinzugefügt wird, einer Lipaseaktivität im Bereich von 100-30.000 Lipaseeinheiten (LUS) pro kg Mehl, wie beispielsweise im Bereich von 500-10.000 Lipaseeinheiten (LUS) pro kg Mehl, einschließlich dem Bereich von 1.000-8.000 Lipaseeinheiten (LUS) pro kg Mehl.
In einer interessanten Ausführungsform umfaßt das Verfahren der Erfindung die gemeinsame Verwendung des Polypeptids der Erfindung und eines Emulgiermittels, wie Mono- und Diglyceride, Sorbitanester, Polysorbate, Sucroseester, Zitronensäureester von Mono- und Diglyceriden, Polyglycerolester von Fettsäuren, Propylenglycolmonostearat, Milchsäureester, Lecithine, Mono- und Diglyceride von genießbaren Fettsäuren und Diacetylweinsäureester von Mono- und Diglyceriden von genießbaren Fettsäuren.
Diacetylweinsäureester von Mono- und Diglyceriden von genießbaren Fettsäuren sind in der nahrungsmittelverarbeitenden Technologie gut bekannt und werden in breitem Maße in der Backindustrie als Teigzusätze zur Verleihung von Teigstabilität und erhöhtem Volumen der gebackenen Produkte verwendet. Typischerweise werden Diacetylweinsäureester von Mono- und Diglyceriden in einer Menge von bis zu 1 Gew.-% des Mehls verwendet.
Es wurde gefunden, daß unter Verwendung des Polypeptids der Erfindung in Kombination mit Diacetylweinsäureestern von Mono- und Diglyceriden von Fettsäuren eine verbesserte Porenhomogenität nach wie vor erhalten wird, und weiterhin, daß eine viel niedrigere Konzentration an Diacetylweinsäureestern von Mono- und Diglyceriden von Fettsäuren erforderlich ist, um das gleiche Brotvolumen zu erreichen. Erfindungsgemäß liegt eine sinnvolle Menge an Diacetylweinsäureestern von Mono- und Diglyceriden von Fettsäuren im Bereich von 0,1-1,0 Gew.-% des Mehls, vorzugsweise im Bereich von 0,1-0,5 Gew.-% des Mehls und besonders bevorzugt im Bereich von 0,1-0,4 Gew.-% des Mehls.
Die Diacetylweinsäureester von Mono- und Diglyceriden, welche erfindungsgemäß verwendet werden können, sind dadurch gekennzeichnet, daß sie eine Verseifungszahl im Bereich von 300-600, vorzugsweise eine Verseifungszahl im Bereich von 300-400, und eine Säurezahl im Bereich von 40-120, vorzugsweise eine Säurezahl im Bereich von 50-100, haben.
Gemäß der oben genannten Beschreibung der Verwendung des Polypeptids in einem Mehlteig, einschließlich einem fettfreien Teig, betrifft die vorliegende Erfindung in einem weiteren Aspekt ein Verfahren zur Herstellung eines gebackenen Produkts mit verbesserter Porenhomogenität und reduziertem Porendurchmesser aus einem Teig, einschließlich einem fettfreien Teig, wie er oben definiert ist, welches das Hinzufügen des Polypeptids der Erfindung zu dem Teig umfaßt.
In einer Ausführungsform betrifft die erfindungsgemäße Verwendung ein Polypeptid mit Lipaseaktivität, welches die Fähigkeit besitzt, die Menge an Ethylestern von Fettsäuren in einem Mehlteig um wenigstens 10%, wie beispielsweise um wenigstens 50% einschließlich um wenigstens 100% zu erhöhen.
Gemäß der Verwendung nach der Erfindung besitzt das Polypeptid mit Lipaseaktivität die Fähigkeit, den Glutenindex in einem Mehlteig zu erhöhen. Dementsprechend umfaßt in einer geeigneten Ausführungsform die Verwendung gemäß der Erfindung zur Herstellung eines gebackenen Produkts die Zugabe des Polypeptids zu dem Teig in einer Menge, die zu einer Erhöhung des Glutenindexes führt, wobei der Glutenindex mittels einer Glutomatic 2200-Vorrichtung bestimmt wird, in dem Teig um wenigstens 5% relativ zu einem Teig, welcher ohne die Hinzufügung des Polypeptids hergestellt ist.
Vorzugsweise wird der Glutenindex um wenigstens 10%, wie beispielsweise um wenigstens 15% und besonderes bevorzugt um wenigstens 20% erhöht.
In einer weiteren geeigneten Ausführungsform ist die erfindungsgemäße Verwendung eine solche, bei der wenigstens ein weiteres Enzym zu dem Teig hinzugefügt wird. Beispiele für solche weiteren Enzyme umfassen Hemizellulasen, Proteasen, Amylasen, Oxidoreduktasen, wie z.B. Hexoseoxidase, und Zellulasen.
Das Polypeptid kann bequem zu dem Teig oder zu irgendeinem der Teigbestandteile oder zu irgendeinem Gemisch der Teigbestandteile in der Form einer trockenen Zusammensetzung oder als eine flüssige Präparation, die das Polypeptid der vorliegenden Erfindung enthält, hinzugefügt werden.
Wie oben ausgeführt ist, liegt die Menge an Polypeptidaktivität im Bereich von 100-30.000 Lipaseeinheiten (LUS) pro kg Mehl, einschließlich dem Bereich von 500-10.000 Lipaseeinheiten (LUS) pro kg Mehl, wie beispielsweise im Bereich von 1.000-8.000 (LUS) pro kg Mehl.
In einer geeigneten Ausführungsform der erfindungsgemäßen Verwendung wird das Polypeptid zu dem Teig im Gemisch mit einem Diacetylweinsäureester von Mono- und Diglyceriden von genießbaren Fettsäuren hinzugefügt.
In einer weiteren geeigneten Ausführungsform der erfindungsgemäßen Verwendung ist das gebackene Produkt Toastbrot.
KURZE BESCHREIBUNG DER FIGUREN
Die vorliegende Erfindung wird unter Bezugnahme auf die anhängenden Figuren weiter erläutert.
1 zeigt die Restriktionskarte des genomischen Klons des lipA-Gens,
2 zeigt die Struktur des lipA-Gens, das die Lipase 3 codiert,
3 zeigt ein Chromatogramm von HIC-fraktioniertem Kulturüberstand einer Aspergillus tubigensis-Transformande mit 62-facher Erhöhung an Lipase 3, und
4 zeigt ein Chromatogramm von HIC-fraktioniertem Kulturüberstand des untransformierten Aspergillus tubigensis-Stamms.
BEISPIELE
Analytische Verfahren zur Bestimmung von Lipaseaktivität und Protein
(i) Bestimmung von Lipaseaktivität
1. Plattenassay auf Tributyrin enthaltendem Medium
Der Assay ist modifiziert nach Kouker und Jaeger (Appl. Environ. Microbiol., 1987, 53:211-213).
Ein typisches Protokoll für diesen Assay ist folgendes: 100 ml 2% Agar in 50 mM Natriumphosphatpuffer (pH 6,3) werden zum Sieden erhitzt, und nach Abkühlen auf etwa 70°C unter Rühren werden 5 ml 0,2% Rhodamin B unter Rühren und 40 ml Tributyrin hinzugefügt. Das Rühren wird für 2 Minuten fortgesetzt. Das Gemisch wird dann für 1 Minute sonifiziert. Nach weiteren 2 Minuten Rühren werden 20 ml des Agar-Gemischs in einzelne Petrischalen gegossen. Bei Abwesenheit von Lipaseaktivität werden die Agar-Platten, die Tributyrin und Rhodamin B enthalten, opak erscheinen und rosa gefärbt werden.
Zur Quantifizierung von Lipaseaktivität werden in dem oben genannten Agar Löcher mit einem Durchmesser von 3 mm ausgestochen und mit 10 μl Lipasezubereitung gefüllt. Die Platten werden für variierende Zeiträume bei 37°C inkubiert. Wenn Lipaseaktivität in den zu untersuchenden aufgebrachten Zubereitungen vorhanden ist, bildet sich um die Löcher herum eine scharfe pink/rötliche Zone. Wenn die Platten mit UV-Licht bei 350 nm bestrahlt werden, wird die Lipaseaktivität als Lichthof von orange gefärbter Fluoreszenz beobachtet.
2. Modifizierter Lebensmittelchemie-Codex-Assay auf Lipaseaktivität
Lipaseaktivität auf der Grundlage von Hydrolyse von Tributyrin wird gemäß dem Lebensmittelchemie-Codex, 4. Aufl. National Academy Press, 1996, S. 803 gemessen mit der Modifikation, daß der pH-Wert 5,5 anstelle von 7 beträgt. Eine LUT (Lipaseeinheit Tributyrin) ist definiert als die Menge an Enzym, welche 2 μmol Buttersäure pro Minute unter den oben genannten Testbedingungen freisetzen kann.
3. p-Nitrophenylacetat-Assay
Lipaseaktivität kann auch kolorimetrisch unter Verwendung von p-Nitrophenylacetat als ein Substrat z.B. unter Verwendung des folgenden Protokolls bestimmt werden: In einer Mikrotiterplatte werden 10 μl Probe oder Blindprobe zugegeben, gefolgt von der Zugabe von 250 μl Substrat (0,5 mg p-Nitrophenylacetat pro ml 50 mM Phosphatpuffer, pH 6,0). Die Mikrotiterplatte wird für 5 Minuten bei 30°C inkubiert, und die Absorption bei 405 nm wird unter Verwendung eines Mikroplattenlesers gelesen. Eine Einheit ist definiert als 1 μmol freigesetztes p-Nitrophenol pro 5 Minuten.
4. p-Nitrophenylhexanoat-Assay
Lipaseaktivität kann unter Verwendung von p-Nitrophenylhexanoat als ein Substrat bestimmt werden. Dieser Assay wird durchgeführt, indem man 10 μl Probenzubereitung oder Blindprobe zu einer Mikrotiterplatte hinzufügt, gefolgt von der Zugabe von 250 μl Substrat (0,5 mg p-Nitrophenylhexanoat pro ml 20 mM Phosphatpuffer, pH 6). Bei dieser Konzentration an Substrat erscheint das Reaktionsgemisch als eine milchige Lösung. Die Mikrotiterplatte wird für 5 Minuten bei 30°C inkubiert, und die Absorption bei 405 nm wird in einem Mikroplattenleser gelesen.
5. Titrimetrischer Assay auf Lipaseaktivität
Alternativ wird die Lipaseaktivität gemäß dem Lebensmittelchemie-Codex (3. Aufl., 1981, S. 492-493), modifiziert auf Sonnenblumenöl und einen pH-Wert von 5,5 anstelle von Olivenöl und einem pH-Wert von 6,5, bestimmt. Die Lipaseaktivität wird als LUS (Lipaseeinheiten Sonnenblume) gemessen, wobei 1 LUS als die Menge an Enzym definiert ist, welche 1 μmol Fettsäuren pro Minute aus Sonnenblumenöl unter den oben genannten Assaybedingungen freisetzen kann.
6. Proteinmessung
Im Verlauf der Reinigung von Lipase, wie sie im folgenden beschrieben wird, wurde das von den Säulen eluierte Protein durch Bestimmung der Absorption bei 280 nm gemessen. Das Protein in den vereinigten Proben wurde in Mikrotiterplatten mit einem empfindlichen Bradford-Verfahren nach Bio-Rad (Bio-Rad Bulletin 1177 EG, 1984) bestimmt. Rinderserumalbumin wurde als Standard verwendet.
BEISPIEL 1
Herstellung, Reinigung und Charakterisierung von Lipase 3
1.1. Herstellung
Ein mutanter Stamm von Aspergillus tubigensis wurde ausgewählt und für die Herstellung von Lipase vom Wildtyp verwendet. Diese Lipase wird hierin als Lipase 3 bezeichnet. Der Stamm wurde einer Fermentierung unterzogen in einem 750 l Fermenter, der 410,0 kg Leitungswasser, 10,8 kg Sojamehl, 11,1 kg Ammoniummonohydrogenphosphat, 4,0 kg Phosphorsäure (75%), 2,7 kg Magnesiumsulfat, 10,8 kg Sonnenblumenöl und 1,7 kg Entschäumer 1510 enthielt. Das Substrat wurde bei 121°C für 45 Minuten hitzebehandelt. Das Kulturmedium wurde direkt mit 7,5 × 10⁹ Sporen des mutanten Stamms angeimpft. Der Stamm wurde für 3 Tage bei 38°C mit pH-Wertkontrolle bei 6,5, Belüftung mit 290 l/min und Rühren bei 180 U.p.M. für die ersten zwei Tage und bei 360 U.p.M. am letzten Tag kultiviert. Das Ferment wurde unter Verwendung eines Trommelfilters abgetrennt, und das Kulturfiltrat wurde durch Ultrafiltration 3,8-fach konzentriert. Das konzentrierte Filtrat wurde mit Kaliumsorbat (0,1%) und Natriumbenzoat (0,2%) konserviert und als Ausgangsmaterial für die Reinigung von Lipase verwendet.
1.2. Reinigung von Lipase
Eine 60 ml Probe Ferment (siehe 1.1), die 557 LUS/ml enthielt und einen pH-Wert von 5,5 hatte, wurde zuerst durch einen GF/B-Filter und anschließend durch einen 0,45 μm Filter filtriert. Die filtrierte Probe wurde unter Verwendung einer Superdex G25 SP-Säule (430 ml, 22 × 5 cm), äquilibriert in 20 mM Triethanolamin, pH 7,3, entsalzt. Die Strömungsrate betrug 5 ml pro Minute. Das Gesamtvolumen nach dem Entsalzen betrug 150 ml.
Die entsalzte Probe wurde auf eine Source Q30-Anionenaustauschersäule (100 ml, 5 × 5 cm), äquilibriert in 20 mM Triethanolamin, pH 7,3, aufgebracht. Die Säule wurde mit Äquilibrierungspuffer gewaschen, bis eine stabile Grundlinie erhalten wurde. Lipaseaktivität wurde mit 420 ml eines linearen Gradienten von 0-0,35 M Natriumchlorid in Äquilibrierungspuffer und einer Strömungsrate von 5 ml/min eluiert. Fraktionen von 10 ml wurden gesammelt. Natriumacetat (100 μl einer 2 M Lösung) wurde zu jeder Fraktion hinzugefügt, um den pH-Wert auf 5,5 einzustellen. Die Fraktionen 26-32 (70 ml) wurden vereinigt.
Zu dem Pool aus der Anionenaustauscherstufe wurde Ammoniumsulfat zu 1 M hinzugefügt, und die Probe wurde auf eine Source Phenyl HIC-Säule (20 ml, 10 × 2 cm), äquilibriert in 20 mM Natriumacetat (pH 5,5), 1 M Ammoniumsulfat, aufgetragen. Die Säule wurde mit dem Äquilibrierungspuffer gewaschen. Lipase wurde mit 320 ml eines linearen Gradienten von 1 M bis 0 M Ammoniumsulfat in 20 mM Natriumacetat (pH 5,5) und einem Durchfluß von 1,5 ml/min eluiert. Fraktionen von 7,5 ml wurden gesammelt.
Die Fraktionen 33-41 wurden mittels SDS-PAGE unter Verwendung eines NOVEX-Systems mit vorgegossenen Gelen analysiert. Sowohl Elektroforese als auch Silberfärbung der Gele wurden gemäß der Anleitung des Herstellers (Novex, San Diego, USA) durchgeführt. (Das gleiche System wurde verwendet für native Elektroforese und isoelektrische Fokussierung.) Es wurde gefunden, daß die Fraktionen 40 und 41 Lipase als das einzige Protein enthielten.
1.3. Charakterisierung der gereinigten Lipase
(i) Bestimmung des Molekulargewichts
Das scheinbare Molekulargewicht der nativen Lipase betrug 37,7 kDa, gemessen nach dem oben genannten SDS-PAGE-Verfahren. Die gereinigte Lipase eluierte bei einem Molekulargewicht von 32,2 kDa von einer Superose 12-Gelfiltrationssäule (50 mM Natriumphosphat, 0,2 M Natriumchlorid, pH 6,85, Durchfluß 0,65 ml/min) und ist daher ein Monomer.
Das Molekulargewicht der Lipase wurde auch durch matrixunterstützte Laserdesorptionsionisation (MALDI) mittels eines Flugzeit- (TOF-) Massenspektrometers (Voyager Bio-Spectrometry Workstation, Perspective Biosystems) bestimmt. Proben wurden hergestellt, indem 0,7 μl entsalzte Lipaselösung und 0,7 μl einer Matrixlösung, die Sinapinsäure (3,5-Dimethoxy-4-hydroxyzimtsäure) in 70% Acetonitril (0,1% TFA, 10 mg/ml) enthielt, gemischt wurden. 0,7 μl des Probengemischs wurden auf der Oberseite einer Edelstahlsondenspitze plaziert und vor dem Einbringen in das Massenspektrometer an der Luft trocknen gelassen. Spektren wurden von wenigstens 100 Laserpulsen erhalten und der Mittelwert gebildet, um ein gutes Signal-zu-Hintergrund-Verhältnis zu erhalten. Durch zwei unabhängige Analysen wurde gefunden, daß die molekulare Masse der Lipase 30384 Da und 30310 Da war.
Ein Verdau der Lipase mit Endo-β-N-acetylglucosamidase H (10 μl) aus Streptomyces (Sigma) wurde durch Zugabe von 200 μl Lipase und Inkubieren bei 37°C für 2 Stunden durchgeführt. Das Verdaugemisch wurde unter Verwendung eines VSWP-Filter entsalzt und direkt durch MALDI-Massenspektrometrie analysiert. Ein Hauptbestandteil der deglycosylierten Lipase lieferte eine Masse von 29339 Da und 29333 Da in zwei unabhängigen Analysen. Ein geringerer Bestandteil mit einer Masse von 29508 Da wurde ebenfalls beobachtet. Diese Werte entsprechen gut dem später berechneten theoretischen Wert von 28939 Da auf der Grundlage der vollständigen Aminosäuresequenz der reifen Lipase.
(ii) Bestimmung des isoelektrischen Punkts
Der isoelektrische Punkt (pI) der Lipase wurde durch isoelektrische Fokussierung bestimmt, und es wurde gefunden, daß er 4,1 betrug.
Eine Berechnung des pI auf der Grundlage der Aminosäuresequenz, wie sie im folgenden bestimmt wurde und als SEQ ID NO:9 gezeigt ist, lieferte einen geschätzten pI von 4,07.
(iii) Bestimmung der Temperaturstabilität
Eppendorf-Röhrchen mit 25 μl gereinigter Lipase 3 plus 50 μl 100 mM Natriumacetatpuffer (pH 5,0) wurden für 1 Stunde in einem Wasserbad bei jeweils 30, 40, 50 bzw. 60°C inkubiert. Eine Kontrolle wurde auf die gleiche Weise behandelt, aber bei Raumtemperatur belassen. Nach 1 Stunde wurde die Lipase 3-Aktivität mit dem p-Nitrophenylacetat-Assay, wie er oben beschrieben ist, bestimmt.
Die gereinigte Lipase hatte eine gute Thermostabilität. Es wurde gefunden, daß die Lipase 60% ihrer Aktivität nach 1 Stunde bei 60°C behielt. 80% bzw. 85% Aktivität wurden nach 1 Stunde bei 50°C bzw. 40°C behalten.
(iv) Bestimmung der pH-Wert-Stabilität
Gereinigte Lipase 3 (200 μl) wurde zu 5 ml 50 mM Pufferlösungen hinzugefügt: (Natriumphosphat, pH 8,0, 7,0 und 6,0, und Natriumacetat, pH 5,0, 4,0 und 3,5). Die Kontrolle wurde in 5 ml 4 mM Natriumacetat, pH 5,5, verdünnt. Nach 4 Tagen bei 20°C wurde die Restaktivität mit dem modifizierten Lebensmittelchemie-Codex-Assay hinsichtlich Lipaseaktivität, wie es oben beschrieben ist, gemessen. Die Lipase war sehr stabil in dem pH-Wert-Bereich von 4,0-7,0, wo sie etwa 100% Aktivität relativ zu der Kontrolle behielt (Tabelle 1.1). Bei einem pH-Wert von 3,5 behielt die Lipase 92% Aktivität, und bei einem pH-Wert von 8,0 wurden 95% Restaktivität gegenüber der Kontrolle behalten.
Tabelle 1.1. pH-Wert-Stabilität von Lipase 3
BEISPIEL 2
Aminosäuresequenzierung von Lipase 3
Gereinigtes Lipaseenzym wurde gefriergetrocknet, und 100 μg des gefriergetrockneten Materials wurden in 50 μl eines Gemischs aus 8 M Harnstoff und 0,4 M Ammoniumhydrogencarbonat, pH 8,4, gelöst. Das gelöste Protein wurde denaturiert und für 15 Minuten bei 50°C nach Überschichten mit Stickstoff und Zugabe von 5 μl 45 mM Dithiothreitol reduziert. Nach Kühlen auf Raumtemperatur wurden 5 μl 100 mM Iodacetamid hinzugefügt, um die Cysteinreste für 15 Minuten bei Raumtemperatur in der Dunkelheit unter Stickstoff zu derivatisieren.
135 μl Wasser und 5 μg Endoproteinase Lys-C in 5 μl wurden zu dem oben genannten Reaktionsgemisch hinzugefügt, und der Verdau wurde bei 37°C unter Stickstoff für 24 Stunden durchgeführt. Die resultierenden Peptide wurden durch Umkehrphasen-HPLC auf einer VYDAC C18-Säule (0,46 × 15 cm; 10 μm; The Separation Group, Kalifornien, USA) unter Verwendung von Lösungsmittel A: 0,1% TFA in Wasser und Lösungsmittel B: 0,1% TFA in Acetonitril getrennt. Ausgewählte Peptide wurden erneut Chromatographie auf einer Develosil C18-Säule (0,46 × 10 cm, Novo Nordisk, Bagsværd, Dänemark) unter Verwendung des gleichen Lösungsmittelsystems vor einer N-terminalen Sequenzierung unterzogen. Die Sequenzierung wurde unter Verwendung eines Applied Biosystems 476A-Sequenzierers unter Anwendung von Pulsed-Liquid Schnellzyklen gemäß den Anleitungen des Herstellers (Applied Biosystems, Kalifornien, USA) durchgeführt.
Für eine direkte N-terminale Sequenzierung wurde das gereinigte Protein durch eine Brownlee C2 Aquapore-Säule (0,46 × 3 cm, 7 μm, Applied Biosystems, Kalifornien, USA) unter Verwendung des gleichen Lösungsmittelsystems wie oben geleitet. Die N-terminate Sequenzierung wurde dann durchgeführt, wie es oben beschrieben ist. Da das Protein vor der Sequenzierung nicht derivatisiert war, konnten Cysteinreste nicht bestimmt werden.

Die folgenden Peptidsequenzen wurden gefunden:

N-terminal:	Ser-Val-Ser-Thr-Ser-Thr-Leu-Asp-Glu-Leu-Gln-Leu-Phe-Ala-Gln-Trp-Ser-Ala-Ala-Ala-Tyr-X-Ser-Asn-Asn (SEQ ID NO:1)
Internes Peptid 1:	Val-His-Thr-Gly-Phe-Trp-Lys (SED ID NO:2)
Internes Peptid 2:	Ala-Trp-Glu-Ser-Ala-Ala-Asp-Glu-Leu-Thr-Ser-Lys-Ile-Lys (SEQ ID NO:3)

Aus der HPLC-Fraktionierung konnten keine weiteren Peptide gereinigt werden, vermutlich weil sie sehr hydrophob und daher stark an die Umkehrphasensäule gebunden waren.
Eine Recherche in der SWISS-PROT-Datenbank Ausgabe 31 wurde hinsichtlich Aminosäuresequenzen mit Homologie zu den oben genannten Peptiden durchgeführt, und es wurden nur drei Sequenzen gefunden.
Alle der oben genannten Peptide zeigten eine geringe Homologie zu den oben genannten bekannten Sequenzen. Insbesondere besaß das interne Peptid 2 eine sehr geringe Homologie zu den drei Lipasen, LIP-RHIDL, LIP-RHIMI und MDLA-PENCA aus Rhizopus delamar (Haas und Berka, Gene, 1991, 109: 107-113), Rhizomucor miehei (Boel et al., Lipids, 1988, 23:701-706) bzw. Penicillium camembertii (Yamaguchi et al., Gene, 1991, 103:61-67; Isobe und Nokihara, Febs. Lett., 1993, 320:101 106). Obwohl die Homologie nicht sehr hoch war, war es möglich, die Lipase 3-Peptide an diesen Sequenzen zu positionieren, wie es in der nachfolgenden Tabelle 2.1. gezeigt ist.
Tabelle 2.1. Ausrichtung von Lipase 3-Peptiden an bekannten Lipasesequenzen
BEISPIEL 3
Isolierung und Reinigung von genomischer Aspergillus tubigensis-DNA
Der Aspergillus tubigensis-Mutantenstamm wurde in PDB (Difco) für 72 Stunden gezüchtet, und das Mycel wurde geerntet. 0,5-1 g Mycel wurden in flüssigem Stickstoff eingefroren und in einem Mörser gemahlen. Nach Verdampfen des Stickstoffs wurde das gemahlene Mycel mit 15 ml eines Extraktionspuffers (100 mM Tris·HCl, pH 8,0, 50 mM EDTA, 50 mM NaCI, 100 mM β-Mercaptoethanol) und 1 ml 20% Natriumdodecylsulfat gemischt. Das Gemisch wurde kräftig gemischt und bei 65°C für 10 Minuten inkubiert. 5 ml 3 M Kaliumacetat (pH 5,1, eingestellt mit Eisessig) wurden hinzugefügt und das Gemisch weiter auf Eis für 20 Minuten inkubiert. Die Zelltrümmer wurden durch Zentrifugation für 20 Minuten bei 20.000 × g entfernt, und 10 ml Isopropanol wurden zu dem Überstand hinzugefügt, um die extrahierte DNA zu präzipitieren (30 min bei -20°C). Nach weiterer Zentrifugation für 15 Minuten bei 20.000 × g wurde das DNA-Pellet in 1 ml TE (10 mM Tris·HCl, pH 8,0, 1 mM EDTA) gelöst und erneut durch Zugabe von 0,1 ml 3 M NaAc, pH 4,8, und 2,5 ml Ethanol präzipitiert. Nach Zentrifugation für 15 Minuten bei 20.000 × g wurde das DNA-Pellet mit 1 ml 70% Ethanol gewaschen und unter Vakuum getrocknet. Schließlich wurde die DNA in 200 μl TE gelöst und bei -20°C gelagert.
BEISPIEL 4
Die Erzeugung eines Fragments des mutmaßlichen Gens, das Lipase 3 codiert, unter Verwendung von PCR
Zum Erhalt eines Fragments des mutmaßlichen Gens (nachfolgend bezeichnet als das lipA-Gen) als eine Markierung zur Isolierung des vollständigen Gens wurde ein PCR-Vervielfältigungsverfahren auf der Grundlage der Information in der isolierten Peptidsequenz durchgeführt.
Es wurden degenerierte Primer für die PCR-Vervielfältigung eines Fragments des Lipasegens auf der Grundlage der Aminosäuresequenzen des isolierten Peptids entworfen. Die folgenden PCR-Primer wurden synthetisiert:
CO35 : TTC CAR AAN CCN GTR TGN AC (SEQ ID NO:4)
20mer 256-Gemisch, basierend auf der Peptid 1-Sequenz VHTGFWK (revers).
CO36: CAR YTN TTY GCN CAR TGG (SEQ ID NO:5)
20mer 256-Gemisch, basierend auf der N-terminalen Sequenz QLFAQW.
CO37: GCV GCH SWY TCC CAV GC (SEQ ID NO:6)
17mer 216-Gemisch, basierend auf der Sequenz des internen Peptids 2 AWESAA (revers).
Die Oligonukleotide wurden auf einem Applied Biosystems Modell 392 DNA/RNA-Synthetisierer synthetisiert. Zur Reduzierung des Ausmaßes der Degeneration wurden das seltene Ala-Codon GCA und das Ser-Codon TCA bei der Ausgestaltung des Primers C037 ausgeschlossen.
Mit diesen Primern wurden die gewünschten Fragmente mittels PCR vervielfältigt. Bei Verwendung dieser Primer wurde erwartet, daß ein Fragment von etwa 300 bp vervielfältigt werden sollte, vorausgesetzt, daß es keine Introns in dem Fragment gibt.
Die folgenden PCR-Reaktionen wurden in 0,5 ml PCR-Röhrchen zur Vervielfältigung eines mutmaßlichen lipA-Fragments angesetzt:

1. 0,5 μg genomische Gesamt-DNA, 100 pmol Primer C036, 100 pmol Primer C037, 10 μl PCR-Puffer II (Perkin Elmer), 6 μl 25 mM MgCl₂, 2 μl dNTP-Mix (10 mM dATP, 10 mM dCTP, 10 mM dGTP, 10 mM dTTP), 2 Einheiten Amplitaq-Polymerase (Perkin Elmer) und Wasser zu einem Gesamtvolumen zu 100 μl.
2. 0,5 μg genomische Gesamt-DNA, 100 pmol Primer C035, 100 pmol Primer C036, 10 μl PCR-Pufer II (Perkin Elmer), 6 μl 25 mM MgCl₂, 2 μl dNTP-Mix (10 mM dATP, 10 mM dCTP, 10 mM dGTP, 10 mM dTTP), 2 Einheiten Amplitaq-Polymerase (Perkin Elmer) und Wasser zu einem Gesamtvolumen von 100 μl.

Die Reaktionen wurden unter Anwendung des folgenden Programms durchgeführt:

94°C	2 min
94°C	1 min Diese Stufe wurde für 30 Zyklen wiederholt.
40°C	1 min Diese Stufe wurde für 30 Zyklen wiederholt.
72°C	1 min Diese Stufe wurde für 30 Zyklen wiederholt.
72°C	5 min
5°C	SOAK

Die PCR-Vervielfältigungen wurden in einem MJ Research Inc. PTC-100 Thermozykler durchgeführt.
In der Reaktion 1 konnten drei unterschiedliche Banden von etwa 300, 360 bzw. 400 bp festgestellt werden. Diese Banden wurden isoliert und unter Verwendung des pT7-Blue-T-Vektor-Kits (Novagene) kloniert. Die Größen dieser Fragmente stimmen mit den erwarteten Größen überein, vorausgesetzt, daß das Fragment 0, 1 bzw. 2 Introns enthält.
Die drei Fragmente wurden unter Verwendung eines "Thermo Sekvenase fluorescent labelled primer cycle sequencing Kit" (Amersham) sequenziert und auf einem ALF-Sequenzierer (Pharmacia) gemäß den Anleitungen des Herstellers analysiert. Das Fragment mit etwa 360 bp enthielt eine Sequenz, die als eine Lipase identifiziert wurde, und, da sie den Teil des N-Terminus enthielt, der distal zu der für die Primergestaltung verwendeten Sequenz lag, wurde geschlußfolgert, daß das gewünschte lipA-Genfragment erhalten wurde.
Die Sequenz des etwa 360 bp großen PCR-Fragments (SEQ ID NO:7) ist in der folgenden Tabelle 4.1. gezeigt. Die für die Primergestaltung verwendete Peptidsequenz ist unterstrichen. Der restliche Teil der N-terminalen Sequenz ist doppelt unterstrichen.
Tabelle 4.1. Mittels PCR erzeugte mutmaßliche lipA-Suequenz
Das Auffinden dieser Sequenz erlaubte eine vollständige Identifikation des PCR-Fragments als einen Teil des lipA-Gens. Das Stop-Codon, das in dem Leseraster gefunden wurde, kann entweder durch einen PCR- oder einen Lesefehler verursacht worden sein, oder es kann ein Intron vorhanden sein, das in dem Fragment codiert wird als ein Konsensus-Intronstart- und -endsignal (dargestellt in Fettschrift). Wenn das mutmaßliche Intron entfernt wird, findet eine Verschiebung im Leseraster statt. Jedoch legte eine Ausnchtung der abgeleiteten Aminosäuresequenz und der in Tabelle 2.1 gezeigten Pilzlipasen nahe, daß das Fragment ein Teil des gewünschten Gens war.
BEISPIEL 5
Klonierung und Charakterisierung des lipA-Gens
(i) Konstruktion einer genomischen Bibliothek von Aspergillus tubigensis
Genomische DNA von Aspergillus tubigensis wurde mit Tsp 5091 (New England Biolabs Inc.) teilweise verdaut. 10 μg DNA wurden in 100 μl Reaktionsgemisch, welches 2 Einheiten Tsp 5091 enthielt, verdaut. Nach 5, 10, 15 und 20 Minuten wurden 25 μl von dem Reaktionsgemisch abgenommen und der Verdau durch Zugabe von 1 μl 0,5 M EDTA, pH 8,0, gestoppt. Nachdem alle vier Reaktionen gestoppt worden waren, wurden die Proben auf einem 1%-igen Agarosegel in TAE-Puffer (10 × TAE-Stammlösung, enthaltend pro Liter: 48,4 g Trizma-Base, 11,5 ml Eisessig, 20 ml 0,5 M EDTA, pH 8,0) laufen gelassen. Mit HindIII verdaute DNA des Phagen Lambda wurde als Molekulargewichtsmarker verwendet (DNA-Molekulargewichtsmarker II, Boehringer Mannheim). Fragmente mit einer Größe zwischen etwa 5 und 10 kb wurden aus dem Gel ausgeschnitten, und die DNA-Fragmente wurden unter Verwendung des Gene Clean I-Kits (Bio-101 Inc.) gereinigt. Die gereinigten Fragmente wurden vereinigt, und 100 ng der vereinigten Fragmente wurden in 1 μg mit EcoRI verdauten und dephosphorylierten ZAP II-Vektor (Stratagene) in einem Gesamtvolumen von 5 μl ligiert. 2 μl dieses Volumens wurden mit Gigapack II-Verpackungsextrakt (Stratagene) verpackt, was eine primäre Bibliothek von 650.000 pfu lieferte.
Der E. coli-Stamm XL1-Blue-MRF (Stratagene) wurde mit 5 × 50.000 pfu der primären Bibliothek infiziert. Die infizierten Bakterien wurden mit Top-Agarose gemischt (wie NZY-Platten, aber mit 6 g Agarose pro Liter anstelle des Agars) und auf 5 NZY-Platten (13 cm) ausplattiert. Nach Inkubation bei 37°C für 7 Stunden wurden 10 ml SM-Puffer (pro Liter: 5,8 g NaCI, 2,0 g MgCl₂·7 H₂O, 50 ml 1 M Tris·HCl, pH 7,5, 5,0 ml 2% (w/v) Gelatine) zugegeben und über Nacht bei Raumtemperatur unter mildem Schütteln inkubiert. Der Puffer, der ausgewaschene Phagen enthielt, wurde gesammelt und vereinigt. 5% Chloroform wurden zugegeben, und nach kräftigem Mischen wurde das Gemisch für 1 Stunde bei Raumtemperatur inkubiert. Nach Zentrifugation für 2 Minuten bei 10.000 × g wurde die obere Phase, welche die vervielfältigte Bibliothek enthielt, gesammelt und Dimethylsulfoxid auf 7% hinzugefügt. Aliquote Teile der Bibliothek wurden in kleinen Röhrchen herausgenommen und bei -80°C eingefroren. Die eingefrorene Bibliothek enthielt 2,7 × 10⁹ pfu/ml mit etwa 6% ohne Inserts.
(ii) Durchmusterung der Aspergillus tubigensis-Blbliothek
2 × 50.000 pfu wurden auf große (22 × 22 cm) NZY-Platten ausplattiert, die ein Medium enthielten, das pro Liter folgendes enthielt: 5 g NaCI, 2 g MgSO₄·7 H₂O, 4 g Hefeextrakt, 10 g Kaseinhydrolysat, 15 g Agar, pH-Wert eingestellt auf 7,5 mit NaOH. Das Medium wurde autoklaviert und auf etwa 60°C abgekühlt und in die Platten gegossen. Pro Platte wurden 240 ml Medium verwendet.
Die angeimpften NZY-Platten wurden über Nacht bei 37° inkubiert, und es wurden Plaque-Abdrücke von den Platten genommen. Zwei Abdrücke wurden für jede Platte an Hybond N-Filter (Amersham) hergestellt. Die DNA wurde unter Verwendung von UV-Strahlung für 3 Minuten fixiert, und die Filter wurden hybridisiert, wie es im folgenden beschrieben wird, unter Verwendung des oben genannten PCR-Fragments von etwa 360 bp als die Sonde, welches mit ³²P-dCTP unter Verwendung des Ready-to-Go-Markierungskits (Pharmacia) markiert war.
Die Filter wurden vorhybridisiert für 1 Stunde bei 65°C in 25 ml Vorhybridisierungspuffer, der 6,25 ml 20 × SSC (0,3 M Na₃-Citrat, 3 M NaCI), 1,25 ml 100 × Denhard'sche Lösung, 1,25 ml 10% SDS und 16,25 ml Wasser enthielt. 150 μl 10 mg/ml denaturierte Lachssperma-DNA wurden unmittelbar vor der Verwendung zu dem Vorhybridisierungspuffer hinzugefügt. Nach der Vorhybridisierung wurde der Vorhybridisierungspuffer verworfen und die Filter über Nacht bei 65°C in 25 ml Vorhybridisierungspuffer mit dem radioaktiv markierten PCR-Fragment hybridisiert.
Am nächsten Tag wurden die Filter nach dem folgenden Verfahren gewaschen: 2 × 15 Minuten mit 2 × SSC + 0,1% SDS, 15 Minuten mit 1 × SSC + 0,1% SDS und 10 Minuten mit 0,1 × SSC + 0,1% SDS.
Alle Waschschritte wurden bei 65°C durchgeführt. Die Bögen wurden für 16 Stunden Autoradiographie unterzogen, und positive Klone wurden isoliert. Ein Klon wurde nur dann als positiv eingestuft, wenn es auf beiden Plaque-Abdrücken der betreffenden Platte ein Hybridisierungssignal gab.
Sieben mutmaßliche Klone wurden isoliert und vier wurden gereinigt durch Ausplattieren auf kleinen Petrischalen und Durchführen von Plattenabdrücken im wesentlichen wie es oben beschrieben ist.
Die gereinigten Klone wurden unter Verwendung eines ExAssist-Kits (Stratagene) in Plasmide umgewandelt.
Zwei Sequenzierungsprimer wurden auf der Grundlage des etwa bp 360 großen PCR Fragments entworfen. Die Sequenzierungsprimer wurden dazu verwendet, die Klone zu sequenzieren, und es wurde ein positiver Klon mit dem lipA-Gen, welches Lipase 3 codiert, gefunden. Der isolierte positive Klon wurde als pLIP4 bezeichnet.
(iii) Charakterisierung des pLIP4-Klons
Eine Restriktionskarte des Klons wurde hergestellt. Das oben genannte 360 bp große PCR-Fragment enthielt eine SacII-Stelle, und diese Stelle konnte auch in dem genomischen Klon gefunden werden und diese Stelle erleichterte die Konstruktion der Karte. Die Restriktionskarte, welche die Struktur von pLIP4 zeigt, ist in 1 gezeigt. Die Restriktionskarte zeigt, daß das vollständige Gen in dem Klon vorhanden ist. Da Promotor- und Terminatorsequenzen vorhanden sind, wurde darüber hinaus angenommen, daß alle wichtigen Bereiche in dem Klon vorhanden sind.
Eine Probe eines Escherichia coli-Stamms DH5α, der pLIP4 enthielt, wurde gemäß dem Budapester Vertrag bei The National Collections of Industrial and Marine Bacteria Ltd. (NCIMB), 23 St. Machar Drive, Aberdeen, Schottland, Vereinigtes Königreich, AB2 1RY am 24. Februar 1997 unter der Hinterlegungsnummer NCIMB 40863 hinterlegt.
Das Gen wurde unter Verwendung von Zyklussequenzierung und herkömmlicher Sequenzierungstechnologie sequenziert. Die vollständige Sequenz (SEQ ID NO:8) ist unten in Tabelle 5.1. gezeigt. Die Sequenz wurde für beide Stränge des vollständigen codierenden Bereichs und etwa 100 bp aufstromig und abstromig des codierenden Bereichs bestimmt. Die Sequenz abstromig zu dem codierenden Bereich wurde nur an einem Strang bestimmt und enthält ein paar Unsicherheiten. In Tabelle 5.1. unten sind die Intronsequenzen in Kleinbuchstaben angegeben, und der N-Terminus und die zwei internen Peptide (Peptid 1 und Peptid 2) sind unterstrichen: Tabelle 5.1. Die DNA-Sequenz des lipA-Gens und flankierende Sequenzen
(iv) Analyse der Sequenz des vollständigen Gens
Die erhaltenen Peptidsequenzen konnten alle in der abgeleiteten Aminosäuresequenz gefunden werden (siehe Tabelle 5.1), was wiederum bestätigt, daß die gefundene Sequenz die Sequenz des Lipase 3-Gens ist. Das Gen wurde mit lipA bezeichnet.
Die Aminosäuresequenz wurde an den drei Pilzlipasen ausgerichtet, die dazu verwendet wurden, die Peptidsequenzen auszurichten. Die Ausrichtung ist in Tabelle 5.2 gezeigt.
Tabelle 5.2 Ausrichtung der Lipase 3-Sequenz an bekannten Pilzlipasen
Die oben gezeigte Ausnchtung zeigt, daß Lipase 3 zu den bekannten Lipasesequenzen homolog ist, aber daß die Homologie nicht sehr hoch ist. Deletionen oder Insertionen in der Lipase 3-Sequenz wurden nicht beobachtet, wenn die Sequenz mit diesen drei Lipasen verglichen wurde. Dies erhärtet die Wahrscheinlichkeit, daß die mutmaßlichen Introns korrekt identifiziert wurden.
Eine Recherche in der SWISS-PROT-Datenbank Ausgabe 31 wurde durchgeführt und führte nicht zu weiteren Sequenzen mit höherer Homologie als derjenigen zu den oben genannten bekannten Lipasen (Tabelle 5.3).
Die Sequenz mit der höchsten Homologie ist eine Monodiacyllipase aus Penicillium camembertii, bei der 42% Identität gefunden wurden. Jedoch entspricht der C-Terminus von Lipase 3 den zwei Lipasen aus Zygomyceten (Rhizopus und Rhizomucor) und nicht dem P. camembertii-Enzym.
Tabelle 5.3. Ausrichtung der codierenden Sequenzen des lipA-Gens und Gens, das Monodiacyllipase aus Penicillium camembertii codiert
Bezüglich des N-Terminus der reifen Lipase wurde durch N-terminale Sequenzierung bestimmt, daß er der Serinrest Nr. 28 des Lipase 3-Vorläufers (SEQ ID NO:9), wie er in Tabelle 5.4 unten gezeigt ist, ist. Jedoch sind die Aminosäuren Nr. 1 bis Nr. 27 die Signalsequenz. Tabelle 5.4. Aminosäuresequenz des Vorläufers von Lipase 3
Anzahl der Reste: 297
Die Reste 167-176 werden als ein gemeinsames Motiv der Serinlipasen (PROSITE) erkannt. Die Kristallstruktur der Rhizomucor miehei-Serinlipase wurde untersucht und die Reste in der aktiven Stelle identifiziert (Brady et al., Nature, 1990, 343:767-770; Derewanda et al., J. Mol. Biol., 1992, 227:818-839). Die Reste der aktiven Stelle von R. miehei-Lipase waren alle in sämtlichen der Lipasen konserviert und entsprechen den folgenden Resten in Lipase 3: Serin 173, Asparaginsäure 228 und Histidin 285.
Lipase 3 enthält sieben Cysteinreste. Vier davon sind in der P. camembertii-Lipase konserviert, wo sie Disulfidbindungen ausbilden (Isobe und Nokuhara, Gene, 1991, 103:61-67). Dies entspricht Disulfidbindungen zwischen den Resten 62-67 und 131-134. Darüber hinaus sind zwei Cysteinreste homolog zu zwei C-Resten, die eine zusätzliche Disulfidbindung in Rhizopus- und Rhizomucor-Lipasen, entsprechend den Resten 49-295, ausbilden.
Zwei mutmaßliche N-Glycosylierungsstellen wurden in Lipase 3 an den Positionen 59 und 269 gefunden. Keine von diesen ist in den anderen Pilzlipasen konserviert.
BEISPIEL 6
Transformation von Aspergillus tubigensis und Überexpression von Lipase 3 in A tubigensis
Das Protokoll für die Transformation basierte auf den Lehren von Buxton et al. (Gene, 1985, 37:207-214), Daboussi et al. (Curr. Genet., 1989, 15:453-456) und Punt und van den Hondel (Meth. Enzym., 1992, 216:447-457).
Ein lipA-Stamm mit mehreren Kopien wurde durch Transformieren des pLIP4-Plasmids in den in den Aspergillus tubigensis-Stamm 6 M 179 unter Anwendung von Cotransformation mit einem Hygromycin-Resistenzmarker-Plasmid hergestellt.
Ein Durchmusterungsverfahren, das zur Visualisierung von Pilzlipase nach Ultradünnschichtisoelektrischer Fokussierung verwendet wurde, wurde zur Durchmusterung von Aspergillus tubigensis-Transformanden, die auf Agar-Platten gezüchtet wurden, angepaßt. Durchmusterung von Lipaseherstellem auf Agar-Platten wurde unter Verwendung von 2% Olivenöl als Substrat für das Enzym (Lipase) sowie als Induzierer für den Lipasepromotor durchgeführt. Darüber hinaus enthielten die Platten einen Fluoreszenzfarbstoff, Rhodamin B. In der Gegenwart von Olivenöl werden die Transformanden dazu angeregt, Lipase abzusondern. Die in die Agar-Platte abgesonderte Lipase hydrolysiert das Olivenöl, was die Bildung von orange fluoreszierenden Kolonien verursacht, was bei UV-Bestrahlung (350 nm) sichtbar ist. Das Erscheinen von fluoreszenten Kolonien wurde im allgemeinen nach 24 Stunden Wachstum aufgezeichnet. Nach mehreren Tagen des Wachstums konnten die Lipase produzierenden Stämme als orange fluoreszierende Stämme identifiziert werden, die mit dem Auge sichtbar sind. Bei dieser Plattendurchmusterungsbedingung lieferte der nicht-transformierte Stamm keine Hintergrundfluoreszenz und erschien als opak rosa Kolonien.
Sechzehn Transformanden, die orange fluoreszierende Höfe zeigten, wurden für 8 Tage in Schüttelkolben kultiviert, die 100 ml Minimalmedium, versetzt mit 1% Olivenöl, 0,5% Hefeextrakt und 0,2% Casaminosäuren, enthielten. Die Menge an abgesonderter Lipase wurde quantifiziert, indem 10 ml zellfreier Kulturüberstand in Löcher, die in Olivenöl-Rhodamin B-Agar-Platten ausgestochen waren, gegeben und die Platten über Nacht bei 37°C inkubiert wurden. Fünf Transformanden mit höherer Lipaseproduktion wurden gefunden.
Die zellfreien Kulturüberstände von den fünf Transformanden wurden unter Verwendung von NAP 5-Säulen (Pharmacia) entsalzt und mit 1 M Ammoniumsulfat (50 mM Natriumacetat, pH 5,5) äquilibriert. Die entsalzten Kulturüberstände wurden mittels hydrophober Wechselwirkungschromatographie (HIC) an einer Biogel Phenyl-5 PW-Säule (Biorad) fraktioniert. Die Elution wurde mit einem abnehmenden Salzgradienten von 1 M bis 0 M Ammoniumsulfat (20 mM Natriumacetat, pH 5,5) durchgeführt. Nach der Fraktionierung wurde ein einzelner diskreter Proteinpeak beobachtet. Die Fläche des Proteinpeaks wurde unter den verschiedenen Transformanden berechnet und mit dem nicht-transformierten Stamm verglichen. Die beste Transformande zeigte eine 62-fache Zunahme der Menge an Lipase nach HIC-Fraktionierung.
Ein Chromatogramm des HIC-fraktionierten Kulturüberstands dieser Transformande ist in 3 gezeigt, und ein ähnliches Chromatogramm für den nicht-transformierten Stamm ist in 4 gezeigt.
Die Fraktion, welche die transformierte Lipase enthielt, wurde gefriergetrocknet. Die transformierte Lipase wurde carboxymethyliert und N-terminaler Aminosäuresequenzierung der ersten 15 Aminosäuren unterzogen, und es wurde gefunden, daß die Sequenz der rekombinanten Lipase exakt die gleiche war wie diejenige der nativen Lipase, was eine korrekte Signalsequenzspaltung zeigt.
Die nach HIC gesammelten verschiedenen Lipasefraktionen wurden auf einem 12% Tris-Glycin-SDS-Gel getrennt, und Silberfärbung offenbarte eine Proteinbande, was die Homogenität der Fraktionen bestätigte. Darüber hinaus zeigte der Rohextrakt eine Hauptlipasebande als die einzige Bande, die sich in dem Kulturüberstand in sehr hohen Mengen ansammelte, wenn der Pilz in dem Olivenöl enthaltenden Medium kultiviert wurde.
Die rekombinante Lipase wurde durch matrixunterstützte Laserdesorptionsionisation (MALDI) mittels eines Flugzeit- (TOF-) Massenspektrometers, wie es hierin oben beschrieben ist, analysiert. Das Molekulargewicht der rekombinanten Lipase betrug 32.237 Da.
Eine Detektion von N-verknüpften Oligosacchariden wurde durch Verdau der Lipase mit Endo-β-N-acetylglucosamidase H aus Sfreptomyces (Sigma) erreicht. Verdau von rekombinanter Lipase, die in das Wachstumsmedium abgesondert wurde, veränderte die Beweglichkeit der Bande, die man in der SDS-PAGE sieht, wobei eine einzelne Bande mit einem Molekulargewicht von etwa 30 kDa bewegt wurde.
Deglycosylierte rekombinante Lipase, die durch Verdau mit Endoglycosidase erzeugt und mittels MALDI-Massenspektrometrie unmittelbar analysiert wurde, lieferte ein Molekulargewicht des Polypeptid-Rückgrats von 29.325 Da.
BEISPIEL 7
Konstruktion von Lipase 3-Glycosylierungsmutanten
Überexpression von Lipase 3 in dem A. tubigensis-Stamm 6M 179 (Beispiel 6) führte zu einer Überglycosylierung des Proteins und anschließender Reduzierung der Enzymaktivität.
Um das Problem der Überglycosylierung und des Verlusts an Aktivität zu umgehen, wurden mehrere mutierte lipA-Gene konstruiert. Ein Molekülmodell der dreidimensionalen Struktur von Lipase 3 basierte auf einem Datenbankvergleich mit bekannten Lipasen und ihre aufgelösten Kristallstrukturen offenbarten die Oberflächentopologie der zwei mutmaßlichen N-Glycosylierungsstellen in Lipase. Die zwei möglichen Stellen, die für die Glycosylierung verantwortlich sind, sind die Asparaginreste bei N59 und N269. Die Zwei Asparaginreste wurden durch Mutation entweder gegen einen Threoninrest (T) oder einen Glutamin (Q) ausgetauscht. Mutation zu Threonin (N > T) eliminiert die Amidgruppe, durch welche Asparagin glycosyliert wird, ohne die Größe der Seitenkette zu verändern und unter Beibehaltung des polaren Sauerstoffs. Mutation zu Glutamin (N > Q) führt zu einem zusätzlichen Kohlenstoff an der Seitenkette und einer Beibehaltung der Amidgruppe. Drei Einzelmutanten, N59T, N269T, N269Q, und zwei Doppelmutanten, N59TN269T und N59TN269Q, wurden konstruiert, wie es im folgenden beschrieben wird.
Mutagene Primer, die zur Einführung von spezifischen Sequenzmutationen ausgestaltet waren, wurden unter Verwendung von T4-Polynukleotidkinase phosphoryliert, wie es in dem Handbuch des Bio-Rad M13 in vitro Mutagenese-Kit beschrieben ist. Ein Annealen an die einzelstrangige DNA-Matrize fand in 20 mM Tris, 50 mM NaCI, 2 mM MgCl₂, bei einem molaren Verhältnis von Primer zu Matrize von 30:1 und Inkubation bei 30°C für etwa 1,5 Stunden statt. Die Synthese des zweiten Strangs wurde mittels T7-DNA-Polymerase (0,5 Einheiten) in einem Reaktionsgemisch, das 0,4 mM von jedem dNTP, 0,75 mM ATP, 17,5 mM Tris-Cl (pH 7,4), 3,75 mM MgCl₂, 21,5 mM DDT und 4T-DNA-Ligase (5 Einheiten) für die Ligation des neu synthetisierten Strangs an das 5'-Ende des Primers enthielt, durchgeführt. Die Reaktion wurde für 5 Minuten auf Eis inkubiert, anschließend bei 25°C für 5 Minuten und schließlich bei 37°C für 30 Minuten und wurde durch die Zugabe von Stop-Puffer (10 mM Tris, pH 8, 10 mM EDTA) und Einfrieren gestoppt. Die Reaktionen wurden auf einem 1%-igen Agarosegel in TAE-Puffer vor der Transformation in SURE E. coli-Zellen analysiert. Die Transformanden wurden durch DNA-Sequenzierung analysiert.
Die SURE E. coli-Transformanden, welche die mutierten lipA-Gene enthielten, wurden nach dem Budapester Vertrag bei The National Collections of Industrial and Marine Bacteria Ltd. (NCIMB), 23 St. Machar Drive, Aberdeen, Schottland, Vereinigtes Königreich, AB2 1 RY am 24. März 1998 unter den folgenden Hinterlegungsnummern hinterlegt. Die drei Einzelmutanten, N59T: NCIMB 40931, N269T: NCIMB 40932, N269Q: NCIMB 40933, und die zwei Doppelmutanten, N59TN269T: NCIMB 40934, N59TN269Q: NCIMB 40935.
BEISPIEL 8
Transformation des Aspergillus tubigensis-Stamms 3M pyrA mit lipA-Mutanten, welche Lipase 3-Glycosylierungsmutanten codieren, und Expression der mutierten Gene
(i) Transformationsverfahren
Sporen des A. tubigensis-Stamms 3M pyr A wurden über Nacht bei 34°C in einem Schüttelkolben inkubiert, der Minimalmedium, versetzt mit 2% Glucose und 10 mM Uridin, enthielt. Das Mycel wurde geerntet und in Lysepuffer mit lysierendem Enzym resuspendiert. Die hergestellten Protoplasten wurden mit Plasmiden, welche die verschiedenen Lipaseglycosylierungsmutanten codierten, nach dem Cotransformationsverfahren gemischt.
(ii) Expression von lipA-Genen, die mutante Lipasen codieren
Die Transformanden wurden hinsichtlich der Herstellung von mutanten Lipasen durchmustert. Reine Kulturen von Transformanden wurden in Flüssigmedien nach der folgenden Art und Weise fortgeführt: Sporen wurden mit einer Dichte von 10⁶/ml zugegeben und bei 34°C für 5 Tage unter Schütteln bei 200 U.p.M. gezüchtet. Das Medium für die Kultivierung von Transformanden enthielt 100 ml Minimalmedium, versetzt mit 2% Sonnenblumenöl (Induzierer), 1,5% Pepton, 0,2% Casaminosäuren und 50 μg/ml Ampicillin. Das Kulturfiltrat wurde jeden Tag gesammelt und auf Olivenöl-Rhodamin-Platten hinsichtlich Lipaseaktivität getestet. Die Öl-Rhodamin-Platten wurden nach einer Inkubation über Nacht bei 37°C hinsichtlich fluoreszenter Höfe (Lipaseaktivität) untersucht. Darüber hinaus wurde ein chromogener Test unter Verwendung von 1,2-O-Dilauryl-rac-glycero-3-glutarsäure-resorufinester (chromogenes Lipasesubstrat, Boehringer Mannheim Biochemica, Katalog Nr. 1179934) dazu verwendet, eine Doppelprüfung des an den Tagen 2, 3, 4 und 5 gesammelten Filtrats durchzuführen. Die nachfolgende Tabelle 8.1 zeigt die Lipaseaktivität von ausgewählten Transformanden, welche verschiedene modifizierte lipA-Gene, die mutante Lipase 3 codieren, exprimierten. Lipaseaktivität wurde am Tag 5 unter Verwendung des oben genannten chromogenen Tests gemessen.
Tabelle 8.1. Lipaseaktivität von Lipase 3-Enzymen, codiert von Glycosylierungsmutanten des lipA-Gens
Darüber hinaus zeigte die Lipaseaktivität in den Kulturfiltraten der Transformanden S3-4, S4-3 und des Stamms 6M 179 (welcher überglycosylierte Lipase 3 exprimierte) zunehmende lipolytische Aktivitäten (Tabelle 8.2) während der Fermentation von Tag 2 bis Tag 5.
Tabelle 8.2. Lipaseaktivität in Kulturfiltraten während der Fermentation (chromogener Test, gemessen bei 572 nm)
BEISPIEL 9
Fermentation und Reinigung von Wildtyp- und modifizierter Lipase 3
(i) Fermentation
Sporen (10⁶/ml) von Aspergillus tubigensis-Stämmen, welche verschiedene Lipase 3-Glycosylierungsmutanten exprimierten, wurden dazu verwendet, Schüttelkolben anzuimpfen, die 200 ml Minimalmedium, versetzt mit 2% Sonnenblumenöl (Induzierer), 1,5% Pepton, 0,2% Casaminosäuren und 50 μg/ml Ampicillin, enthielten. Die Kulturen wurden unter Schütteln bei 200 U.p.M. für 4 Tage bei 34°C gezüchtet. Das Kulturfiltrat wurde von dem Mycel durch Filtration durch ein Nylonfilter abgetrennt.
(ii) Reinigung von Lipase
Proben von Kulturüberstand von S2-6-, S3-4-, S4-1- bzw. S4-3-Fermentationen wurden alle auf die gleiche Art und Weise behandelt. Eine 15 ml Probe wurde zuerst an einer PD-10-Säule, die in 20 mM Triethanolamin, pH 7,3, äquilibriert war, entsalzt. Die entsalzte Probe wurde auf einen Source Q15 (HR5/5) -Anionenaustauscher, der in 20 mM Triethanolamin, pH 7,3, äquilibriert war, aufgetragen. Der Durchfluß war 1,5 ml/min. Die Säule wurde mit Äquilibrierungspuffer gewaschen, bis man eine stabile Grundlinie erhielt. Lipaseaktivität wurde dann mit 30 ml eines linearen Gradienten von 0-0,53 M NaCI in Äquilibrierungspuffer eluiert. Fraktionen von 1,5 ml wurden gesammelt. Die Fraktionen wurden unter Verwendung des Plattenassays auf Tributyrin, wie es oben beschrieben ist, hinsichtlich Aktivität durchmustert.
Zu dem Pool an Lipaseaktivität von Source Q15 wurde Ammoniumsulfat auf 1 M hinzugefügt, und die Probe wurde auf eine Source Phenyl HIC (HR5/5) -Säule, die in 20 mM Natriumacetat (pH 5,5), 1 M Ammoniumsulfat, äquilibriert war, aufgetragen. Die Säule wurde mit Äquilibnerungspuffer gewaschen. Lipase wurde mit einem linearen Gradienten von 1-0 M Ammoniumsulfat in 20 mM Natriumacetat (pH 5,5) bei einem Durchfluß von 1,5 ml/min eluiert. Fraktionen von 0,75 ml wurden gesammelt. Die Fraktionen des Lipasepeaks waren vollständig homogen (eine Bande), was durch SDS-PAGE, gefolgt von Silberfärbung, wie es oben beschrieben ist, untersucht wurde.
Die vier verschiedenen Lipaseglycosylierungsmutanten verhielten sich während der Reinigung in der gleichen Weise.
(iii) Bestimmung der spezifischen Aktivität
Die spezifische Aktivität wurde für die vier gereinigten Lipasemutanten bestimmt. Sowohl in Bezug auf die Aktivität auf Tributyrin (LUT), wie es oben beschrieben ist, als auch in Bezug auf Sonnenblumenöl (LUS), wie es ebenfalls zuvor beschrieben ist. Protein wurde bestimmt, wie es oben beschrieben ist. Die Ergebnisse sind in Tabelle 9.1 zusammengefaßt.
Tabelle 9.1. Spezifische Aktivität von mutanten Lipasen im Vergleich zu Wildtyp-Lipase 3 und überglycosylierter Lipase 3
Man sieht, daß die spezifische Aktivität der mutanten Lipasen, die in S2-6, S4-1 und S4-3 exprimiert werden, zweimal so hoch ist wie die spezifische Aktivität der überglycosylierten Lipase 3, wenn man auf Sonnenblumenöl (LUS) mißt, welches langkettige Fettsäuren enthält, welche Lipiden ähnlich sind, die normalerweise in Mehl und Teig vorhanden sind. Wenn man an Tributyrin (LUT) mißt, sind die Unterschiede in der spezifischen Aktivität weniger ausgeprägt. Dies könnte durch die Tatsache erklärt werden, daß eine mögliche "Abdeckung" der aktiven Stelle durch Überglycosylierung weniger schwerwiegend ist, wenn das Substrat klein ist, wie Tributyrin, im Gegensatz zu den langen Fettsäureketten in Sonnenblumenöl. Die spezifische Aktivität der S3-4-Lipase 3 ist niedriger als diejenige der überglycosylierten Lipase 3 (gemessen an Sonnenblumenöl).
Wenn man sie in dem LUS-Assay untersucht, besitzt keine der Mutanten eine so gute spezifische Aktivität wie die Wildtyp-Lipase 3, aber, wie es in einem folgenden Beispiel gezeigt wird, ist die enzymatische Aktivität für die Glycosylierungsmutanten höher als für die Wildtyp-Lipase 3 in einem Teigsystem.
(iv) Bestimmung des Molekulargewichts
Das scheinbare Molekulargewicht der gereinigten mutanten Lipasen wurde bestimmt, indem die Lipasen auf einem SDS-PAGE-Gel laufengelassen wurden. Die Ergebnisse sind in Tabelle 92 gezeigt.
Tabelle 9.2. Molekulargewicht von Wildtyp-, überglycosylierten und mutanten Lipasen
Man sieht, daß die überglycosylierte Lipase ein Lipase 3-Molekül liefert, welches ein größeres Molekulargewicht hat als die native Lipase 3 vom Wildtyp. Durch Entfernen von einer der zwei potentiellen N-Glycosylierungsstellen, wie es in S2-6 (N269Q) und in S3-4 (N269T) der Fall ist, wurde ein niedrigeres Molekulargewicht erhalten, aber es ist nach wie vor geringfügig höher als das der Wildtyp-Lipase 3, was auf eine Überglycosylierung an der zweiten Glycosylierungsstelle hindeutet. Durch Entfernen beider potentieller N-Glycosylierungsstellen, wie in S4-1 und S4-3 (sowohl N59T als N269Q) erhält man ein deutlich niedrigeres Molekulargewicht als dasjenige der Wildtyp-Lipase 3, was in Übereinstimmung mit einem vollständigen Fehlen von N-Glycosylierung in dieser Mutante ist.
(v) Bestimmung des isoelektrischen Punkts von Lipasemutanten
Die isoelektrischen Punkte der vier verschiedenen Lipaseglycosylierungsmutanten wurden durch Chromatofokussierung an einer Mono P (HR5/5) mit pH 4,1 für alle der mutanten Enzyme bestimmt. Die Säule wurde in 25 mM bib-Tris, pH 6,10, äquilibriert. Ein pH-Wert-Gradient wurde erzeugt, indem 100% eines 10%-igen Polypuffer 74 in Wasser (pH 3,8 mit HCl) plus 2,5% Betain laufengelassen wurde, wobei dieses die Lipase(n) eluierte. Der Durchfluß war 0,70 ml/min. Fraktionen von 0,4 ml wurden gesammelt.
(vi) Bestimmung der Temperaturstabilität der mutanten Lipase
Eine Probe von gereinigter Lipase S4-1 (296 LUT/ml) wurde 1:1 mit 200 mM NaAc, pH 5,0, verdünnt. Eppendorf-Röhrchen mit 1 ml dieser verdünnten Probe wurden für 1 Stunde in einem Wasserbad bei 30, 40, 50 bzw. 60°C inkubiert. Eine Kontrolle wurde auf die gleiche Art und Weise behandelt, aber bei Raumtemperatur belassen. Die verbleibende Lipaseaktivität wurde mit dem p-Nitrophenylacetat-Assay, wie er zuvor beschrieben wurde, bestimmt. Die Ergebnisse sind nachfolgend in Tabelle 9.3 gezeigt.
Tabelle 9.3. Temperaturstabilität von mutanter Lipase (S4-1) im Vergleich zu Wildtyp-Lipase 3
(vii) Bestimmung der pH-Wert-Stabilität von mutanter Lipase S3-4
Proben von 200 μl gereinigter mutanter Lipase S3-4 wurden zu 5 ml 50 mM Puffer (pH 3,5, 4,0, 5,0 NaAc und pH 6,0, 7,0, 8,0 Phosphatpuffer) hinzugefügt. Die Kontrolle wurde in 5,0 ml 4 mM NaAc, pH 5,5, verdünnt. Nach 4 Tagen bei 20°C wurden die Proben hinsichtlich verbleibender Aktivität nach dem modifizierten Lebensmittelchemie-Codex-Test auf Lipaseaktivität, wie er oben beschrieben ist, gemessen. Die mutante Lipase S3-4 war sehr stabil in dem pH-Wert-Bereich von 4,0-8,0, wo sie etwa 100% Aktivität relativ zu der Kontrolle behielt. Bei dem pH-Wert von 3,5 behielt die Lipase 88% Aktivität im Vergleich zu der Kontrolle. Die Ergebnisse sind in Tabelle 9.4 gezeigt.
Tabelle 9.4. pH-Wert-Stabilität der mutanten Lipase S3-4
BEISPIEL 10
Backexperimente unter Verwendung von Lipase 3
10.1. Backverfahren und analytische Methoden
(i) Backverfahren für dänisches Toastbrot
2000 g Mehl (dänisches Reformmehl), 30 g Trockenhefe, 30 g Salz und Wasser, entsprechend 400 Brabender-Einheiten + 3%, wurden in einem Hobart-Mischer mit einem Haken für 2 Minuten bei niedriger Geschwindigkeit und für 10 Minuten bei hoher Geschwindigkeit geknetet. Die Teigtemperatur nach dem Kneten betrug 25°C. Die Ruhezeit betrug 10 Minuten bei 30°C. Der Teig wurde in 750 g pro Teig aufgeteilt und erneut für 5 Minuten bei 33°C und 85% relativer Feuchte ruhen gelassen. Nach Formen auf einem Glimik-Former wurde der Teig für 50 Minuten bei 33°C in Formen gehen gelassen und in einem Wachtelofen für 40 Minuten bei 220°C mit Dampfinjektion für 16 Sekunden gebacken. Nach dem Abkühlen wurde das Brot aufgeteilt, und das Volumen des Brots wurde nach dem Rapssamenverdrängungsverfahren gemessen. Das spezifische Volumen wird durch Teilen des Brotvolumens (ml) durch das Gewicht (g) des Brots berechnet.
Die Krume wurde bewertet, wobei eine Skala von 1-5 verwendet wurde, worin 1 = grob inhomogen und 5 = schön homogen bedeuten.
Drei in Dosen mit Deckel gebackene Brote wurden bei 20°C gelagert und für Festigkeitsmessungen und Porenmessungen mittels eines Bildanalysierers verwendet.
(ii) Backverfahren für dänische Brötchen
1500 g Mehl (dänisches Reformmehl), 90 g komprimierte Hefe, 24 g Zucker, 24 g Salz und Wasser, entsprechend 400 Brabender-Einheiten -2%, wurden in einem Hobart-Mischer mit einem Haken für 2 Minuten bei niedriger Geschwindigkeit und für 9 Minuten bei hoher Geschwindigkeit geknetet. Nach dem Kneten betrug die Teigtemperatur 26°C. Der Teig wurde auf 1350 g aufgeteilt. Nach Ruhen für 10 Minuten bei 30°C wurde der Teig auf einem Fortuna-Former geformt, woraufhin der Teig für 45 Minuten bei 34°C belassen und in einem Bago-Ofen für 18 Minuten bei 220°C mit Dampfinjektion für 12 Sekunden gebacken wurde. Nach dem Abkühlen wurden die Brötchen gewogen und das Volumen der Brötchen nach dem Rapssamenverdrängungsverfahren gemessen. Das spezifische Volumen wird berechnet, wie es oben beschrieben ist.
(iii) Bestimmung der Porenhomogenität
Die Porenhomogenität des Brotes wurde mittels eines Bildanalysierers gemessen, der aus einer Standard-CCD-Videokamera, einem Videodigitalisierer und einem Personal Computer mit WinGrain-Software bestand. Für jedes Brot wurden die Ergebnisse des Porendurchmessers in mm und die Porenhomogenität als ein Durchschnitt der Messungen von 10 Brotscheiben berechnet. Die Porenhomogenität wurde in % Poren ausgedrückt, die größer als das 0,5-fache des durchschnittlichen Porendurchmessers und kleiner als das 2-fache des durchschnittlichen Porendurchmessers waren.
(iv) Bestimmung der Festigkeit
Die Festigkeit von Brot, ausgedrückt in N/dm² wurde mittels eines Instron UTM Modell 4301, verbunden mit einem Personal Computer, gemessen. Die Bedingungen der Messung der Brotfestigkeit waren folgende:

Belastung der Zelle max. 100 N

Kolbendurchmesser 50 mm

Kreuzkopfgeschwindigkeit 200 mm/min

Kompression 25%

Dicke der Brotscheibe 11 mm
Das Ergebnis war ein Durchschnitt von Messungen an 10 Brotscheiben für jedes Brot.
(v) Bestimmung des Glutenindexes
Der Glutenindex wurde mittels eines Glutomatic 2200 von Perten Instruments (Schweden) gemessen. Unmittelbar nach dem Ruhenlassen wurden 15 g Teig abgewogen und in den Glutomatic gegeben und mit 500 ml 2% NaCl-Lösung für 10 Minuten gewaschen. Der gewaschene Teig wurde in eine Glutenindex-Zentrifuge 2015 überführt, und die zwei Glutenfraktionen wurden aufgeteilt und der Glutenindex nach der folgenden Formel berechnet: Glutenindex = (Gewicht an Gluten, das auf dem Sieb verbleibt × 100)/Gesamtgewicht an Gluten
(vi) Extraktion von Lipiden aus Teig
30 g eines vollständig aufgegangenen Teiges wurden unmittelbar eingefroren und gefriergetrocknet. Der gefriergetrocknete Teig wurde in einer Kaffeemühle gemahlen und durch ein 235 μm Sieb geleitet. 4 g gefriergetrockneter Teig wurden in einem 50 ml Zentrifugenröhrchen mit Schraubdeckel eingewogen, und 20 ml mit Wasser gesättigter n-Butanol (WSB) wurden hinzugefügt. Das Zentrifugenröhrchen wurde in ein Wasserbad bei einer Temperatur von 100°C für 10 Minuten gestellt, woraufhin die Röhrchen in einen Rotamix gestellt und bei 45 U.p.M. für 20 Minuten bei Umgebungstemperatur gedreht wurden. Die Röhrchen wurden wieder für 10 Minuten in das Wasserbad gestellt und auf dem Rotamix für weitere 30 Minuten bei Umgebungstemperatur gedreht.
Die Röhrchen wurden bei 10.000 × g für 5 Minuten zentrifugiert. 10 ml des Überstands wurden in ein Gefäß pipettiert und unter Stickstoff zur Trockene eingedampft. Diese Probe wurde für eine HPLC-Analyse verwendet.
Eine ähnliche Probe wurde an einer Bond Elut Si (Varian 1211-3036) fraktioniert. Die unpolare Fraktion wurde mit 10 ml Cyclohexan : Isopropanol : Essigsäure (55 : 45 : 1) eluiert und zur Trockene eingedampft. Diese Probe wurde für die GLC-Analyse verwendet.
(vii) HPLC-Analyse
Säule: LiChrospher 100 DIOL 5 μm (Merck Art. 16152) 250 × 4 mm mit einem Wassermantel mit einer Temperatur von 50°C.
Mobile Phasen:

A: Heptan : Isopropanol : n-Butanol : Tetrahydrofuran : Isooktan : Wasser (64,5 :17,5 : 7 : 5 : 5 1)
B: Isopropanol : n-Butanol : Tetrahydrofuran : Isooktan Wasser (73 :7 : 5 : 5 : 10)

Die mobilen Phasen enthielten 1 mmol Trifluoressigsäure pro 1 mobile Phase und wurden mit Ammoniak auf einen pH-Wert von 6,6 eingestellt.
Pumpe: Waters 510, ausgestattet mit einem Gradientenregler.
Gradient:
Detektor: CUNOW DDL21 (verdampfende Lichtstreuung); Temperatur: 100°C; Spannung: 600 V; Luftströmung: 6,0 l/min.
Injektor: Hewlett Packard 1050; Injektionsvolumen: 50 μl.
Die Proben für die Analyse wurden in 5 ml Chloroform : Methanol (75 : 25) gelöst, für 10 Minuten sonifiziert und durch einen 0,45 μm Filter filtriert.
(viii) GLC-Analyse
Perkin Elmer 8420 Kapillargaschromatograph, ausgestattet mit einer WCOT Fused-silica-Säule, 12,5 m × 0,25 mm, beschichtet mit 0,1 μm stationärer Phase aus 5% Phenylmethylsilikon (CP Sil 8 CB von Crompack).
Träger: Helium
Injektion: 1,5 μl mit Aufteilung
Detektor: FID 385°C
Probenvorbereitung: 50 mg unpolare Fraktion von Weizenlipiden wurden in 12 ml Heptan Pyridin (2 : 1) mit 2 mg/ml Heptadecan als internen Standard gelöst. 500 μl der Lösung wurden in ein Bördelgefäß überführt, und 100 μl N-Methyl-N-trimethylsilyltrifluoracetamid wurden hinzugefügt. Das Gemisch wurde für 15 Minuten bei 90°C reagieren gelassen.
Berechnung: Reaktionsfaktoren für Mono-, Di- und Triglyceride und freie Fettsäuren wurden anhand von Referenzgemischen dieser Bestandteile bestimmt. Basierend auf diesen Reaktionsfaktoren wurden die Glyceride und die freien Fettsäuren in Weizenlipiden berechnet.
10.2. Backexperimente mit Lipase 3 in dänischem Toastbrot
Es wurde die Wirkung der Zugabe von Lipase 3 zu einem Teig für die Herstellung von dänischem Toastbrot ermittelt. Das Enzym wurde als eine gefriergetrocknete Präparation auf Maltodextrin zusammen mit den anderen Bestandteilen zugegeben. Die Ergebnisse der Backtests sind in den Tabellen 10.1 bis 10.4 gezeigt.
Tabelle 10.1
Tabelle 10.2
Tabelle 10.3
Tabelle 10.4
Bei Zugabe von bis zu etwa 5.000 LUS/kg Mehl der Lipase wurde keine Veränderung des Brotvolumens beobachtet, aber bei einer höheren Dosierung an Lipase 3 bestand eine Tendenz zu einer geringen, aber nicht statistisch signifikanten Volumenabnahme (Tabelle 10.1).
Aus den Ergebnissen in Tabelle 10.2 scheint es, daß Lipase 3 die Brotkrumenhomogenität verbesserte und daß der durchschnittliche Durchmesser der Krumenporen signifikant reduziert wurde.
Der Glutenindex korrelierte ebenfalls klar mit der Zugabe von Lipase 3 als ein Anzeichen für ein festeres Gluten, verursacht durch die Modifikation der Weizenlipidbestandteile, was eine bessere Teigstabilität und eine homogenere Brotporenstruktur bewirkte. Diese Modifikationen schienen jedoch bei der Zugabe von 5.000 LUS/kg Mehl an Lipase 3 optimal zu sein, wogegen eine höhere Dosierung zu einer zu starken Modifikation des Weizenglutens führte.
Die Ergebnisse der GLC- und HPLC-Analysen (Tabelle 10.3) zeigten klar, daß, die Triglyceride in dem Teig hydrolysiert waren. Aber noch interessanter war, daß auch eine Modifikation der Glycolipide, Monogalactosyldiglycerid und Digalactosyldiglycerid, beobachtet wurde. Diese Bestandteile wurden in die polareren Bestandteile Monogalactosylmonoglycerid und Digalactosylmonoglycerid umgewandelt. Da Digalactosylmonoglycerid ein stärker oberflächenaktiver Bestandteil ist als Digalactosyldiglycerid, wird angenommen, daß dieser Bestandteil zu der beobachteten verbesserten Krumenzellstruktur und Homogenität beitrug. Es schien auch, daß Phospholipide, wie Phosphatidylcholin, nur in einem sehr geringen Ausmaß modifiziert wurden.
10.3. Backexperimente mit Lipase 3 in dänischen Brötchen
Die Wirkung der Zugabe von Lipase 3 zu einem Teig für die Herstellung von dänischen Brötchen wurde ermittelt. Das Enzym wurde als eine gefriergetrocknete Präparation auf Maltodextrin zusammen mit den anderen Bestandteilen zugegeben. Die Ergebnisse der Backtests sind in den Tabellen 10.5 bis 10.7 gezeigt.
Tabelle 10.5
Tabelle 10.6
Tabelle 10.7
Aus den in Tabelle 10.5 gezeigten Ergebnissen wird deutlich, daß die Zugabe von Lipase 3 das Volumen der Brötchen nicht signifikant erhöht. Darüber hinaus wurde gefunden, daß Lipase 3 die Homogenität der Krume verbessert.
Die GLC- und HPLC-Analysen der Weizenlipide, wie sie in den Tabellen 10.6 und 10.7 gezeigt sind, demonstrierten die Modifikation dieser Lipide.
BEISPIEL 11
Vergleichende Backexperimente unter Verwendung von Lipase 3 und kommerziellen Lipaseprodukten
Lipase 3 wurde in dänischen Brötchen in einem Vergleichstest mit zwei kommerziell erhältlichen Lipaseprodukten getestet: NOVOZYM 677 BG (Nr. 1885) von Novo Nordisk (Dänemark) und Lipase A "Amano 6" (Nr. 1757) von Amano (Japan). Die Ergebnisse sind in Tabelle 11.1 zusammengefaßt.
Tabelle 11.1
Aus den Ergebnissen in Tabelle 11.1 wird deutlich, daß Lipase 3 keine Wirkung auf das Volumen von Brötchen hat, wogegen eine signifikante Volumenwirkung der kommerziellen Enzymprodukte Nr. 1885 und Nr. 1757 beobachtet wurde.
BEISPIEL 12
Vergleichsexgerimente, welche die relative Hydrolyse von Triglyceriden im Vergleich zur Hydrolyse von DGDG zeigen
Lipase 3, Lipase Nr. 1885 und Lipase Nr. 1757 wurden in dänischen Brötchen zu dem Zweck getestet, die relative Hydrolyse von Triglyceriden im Vergleich zu der Hydrolyse von Digalactosyldiglycerid (DGDG) zu untersuchen. Vollständig aufgegangener Teig wurde gefriergetrocknet und mit mit Wasser gesättigtem n-Butanol extrahiert. Die extrahierten Lipide wurden mittels GLC und HPLC analysiert, wie es oben beschrieben ist. Aus den Analyseergebnissen wurde das Ausmaß der Hydrolyse von Triglyceriden im Vergleich zu dem Ausmaß der Hydrolyse von Digalactosyldiglycerid (DGDG) bei verschiedenen Mengen an Lipasen berechnet. Die verwendeten Mengen an Lipase waren für Nr. 1885: 0, 400 und 800 LUS/kg Mehl, für Nr. 1757: 0, 1.770 und 2.360 LUS/kg Mehl und für Lipase 3: 0, 10.000 und 20.000 LUS/kg Mehl. Die Ergebnisse sind in Tabelle 12.1 gezeigt.
Tabelle 12.1
Aus den Ergebnissen in Tabelle 12.1 wird deutlich, daß Lipase 3 eine signifikante Wirkung auf die Hydrolyse von Digalactosyldiglycerid hat, wogegen die Wirkung der zwei kommerziell erhältlichen Lipasen Nr. 1757 und Nr. 1885 vernachlässigbar ist.
BEISPIEL 13
Backexperimente unter Verwendung von Lipase 3 in Kombination mit einem Diacetylweinsäureester von Mono- und Diglyceriden von Fettsäuren
Lipase 3 wurde in Kombination mit einem Diacetylweinsäureester von Mono- und Diglyceriden von genießbaren Fettsäuren mit einer Verseifungszahl von 355 und einer Säurezahl von 60 getestet (PANODAN A2020 DATEM). Die Brötchen wurden nach vier verschiedenen Fermentationszeiten, 45, 65, 85 und 105 Minuten, gebacken. Lipase 3 wurde zu den Teigbestandteilen als ein gefriergetrocknetes Pulver zugegeben. Die Porenhomogenität wurde subjektiv auf einer Skala von 1-5 eingestuft wobei 1 = grob inhomogen und 5 = schön homogen war. Die Ergebnisse der Experimente sind in Tabelle 13.1 gezeigt.
Tabelle 13.1
Es scheint gemäß Tabelle 13.1, daß Lipase 3 in Kombination mit DATEM die Porenhomogenität verbesserte, und es wurde gefunden, daß es eine kombinierte Wirkung gab, was bedeutet, daß es möglich ist, DATEM in einer viel niedrigeren Konzentration in Kombination mit Lipase 3 zu verwenden und nach wie vor das gleiche Volumen und eine bessere Krume zu erhalten.
BEISPIEL 14
Backexperiment mit Lipase 3 bei der Herstellung von dänischen Brötchen mit und ohne die Zugabe von Sojaöl
Die Wirkung von gereinigter Wildtyp-Lipase 3 wurde bei der Herstellung von dänischen Brötchen mit und ohne die Zugabe von Sojaöl zu dem Teig getestet. Die gebackenen Brötchen wurden hinsichtlich des spezifischen Volumens, der Krumenporenhomogenität und der Brotkrustenqualität bewertet. Das spezifische Volumen wurde gemessen, wie es zuvor beschrieben ist. Die Porenhomogenität wurde subjektiv auf einer Skala von 1-10 bewertet, wobei 1 = grob inhomogen und 10 = schön homogen bedeutet. Die Brotkrustenqualität wurde auf einer Skala von 1-10 bewertet, worin 1 = niedrige Qualität und 10 = hohe Qualität bedeutet.
Vollständig aufgegangene Teige aus diesen Backtests wurden eingefroren und gefriergetrocknet. Die gefriergetrockneten Teige wurden mit mit Wasser gesättigtem Butanol extrahiert, und der Gehalt an freien Fettsäuren wurde durch GLC-Analyse, wie sie auch in Beispiel 10 beschrieben ist, bestimmt. Die Ergebnisse der Backtests und der Analyse von freien Fettsäuren sind in Tabelle 14.1 zusammengefaßt.
Tabelle 14.1. Bewertung der Brötchenqualität und Gehalt an freier Fettsäure in aufgegangenem Teig
Aus dem Backexperiment wird deutlich, daß Lipase 3 sowohl die Porenhomogenität als auch die Krustenqualität sowohl in Brot mit als auch ohne zugesetztem Öl verbessert. Bei Zugabe einer hohen Menge an Lipase 3 (13.500 LUT/kg Mehl) wurde eine Verminderung des Brotvolumens beobachtet.
Die Ergebnisse der Analyse hinsichtlich freier Fettsäuren in Teig aus diesen Backexperimenten sind ebenfalls in Tabelle 14.1 gezeigt. Aus diesen Ergebnissen wird deutlich, daß Lipase 3 im Teig aktiv ist, unabhängig davon, ob Öl zugegeben wird oder nicht. Darüber hinaus war die Menge an freien Fettsäuren in dem Teig auf dem gleichen Niveau in Teigen mit und ohne Öl.
BEISPIEL 15
Bildung von Ethylester in Teig durch Zugabe von Lipase 3
Wie es in Beispiel 14 gezeigt ist, werden freie Fettsäuren produziert, wenn Lipase 3 zu einem Teig hinzugefügt wird. Während der Fermentation eines Brotteigs produziert die Hefe Kohlendioxid und Ethanol, und die Menge an Ethanol in einem Teig ist am Ende des Gehens normalerweise größer als 1 %. Wenn Lipase 3 in dem Teig vorhanden ist, katalysiert dieses Enzym nicht nur die Hydrolyse von Triglyceriden, sondern es wurde überraschend gefunden, daß auch Ethylester von Fettsäuren gebildet werden.
Ethylester von Fettsäuren sind ein gut bekannter Aromabestandteil, der unter anderem zur Maskierung von schlechten Aromen in auf Fett basierenden Nahrungsmitteln verwendet werden.
Backexperimente, die hierin nicht beschrieben sind, haben gezeigt, daß Lipase, die zu einem Teig hinzugefügt wird, in der Lage ist, den "alten" Geschmack eines Brotes zu maskieren, welcher auftritt, wenn Brot aus Mehl, das bei 35°C für drei Monate gelagert wurde, hergestellt wird. Dies könnte durch die Bildung von Ethylestern in dem Teig erklärt werden.
Die Menge an Ethylester von Fettsäuren wurde durch Extrahieren des gefriergetrockneten Teiges mit mit Wasser gesättigtem Butanol bestimmt. Die isolierte Fettphase wurde mittels GLC-MS analysiert, um sowohl die Identität als auch die Menge an Ethylestern von Fettsäuren zu bestimmen. Die Ergebnisse aus diesen Analysen sind in Tabelle 15.1 gezeigt.
Tabelle 15.1. Gehalt an Ethylester von Fettsäuren in Teig mit zugesetzter Lipase
Die Ergebnisse zeigen klar eine zunehmende Menge an Ethylester von Fettsäuren mit zunehmender Dosis an Lipase in dem Teig.
BEISPIEL 16
Die Wirkung von Lipase 3 in Biskuitkuchen
Die Wirkung von Lipase 3 wurde in einem Biskuitkuchen, der nach dem folgenden Rezept und Verfahren hergestellt war, getestet.

Zucker 208 g

Mehl 188 g

Maisstärke 60 g

Backpulver 14 g

Ei 200 g

GATODAN 504, Biskuitkuchen-Gel 18 g

Wasser 150 g

Lipase 3 siehe unten
Alle Bestandteile wurden für 6 Minuten unter Verwendung eines Hobart N 50-Mischers gemischt. Das Kuchengemisch wurde zu 3 × 175 g in Biskuitkuchenformen eingewogen und für 35 Minuten bei 180°C gebacken.
Das spezifische Volumen des Kuchens wurde nach der Rapssamenverdrängungsmethode gemessen, und die Weichheit des Kuchens wurde nach Lagerung bei 20°C für 7 Tage unter Verwendung eines Instron-Nahrungsmitteltestgeräts gemessen.
Die Ergebnisse des Backtests sind in Tabelle 16.1 zusammengefaßt.
Tabelle 16.1. Spezifisches Kuchenvolumen und Weichheit nach 7 Tagen der Lagerung (hPa)
Aus den Ergebnissen wird deutlich, daß Lipase 3 die Kuchenweichheit verbessert, ohne das Volumen des Kuchens zu verändern.
BEISPIEL 17
Backexperiment unter Verwendung von Lipase 3 und optional Hemizellulase für die Herstellung von Roggen/Weizen-Brot
Roggen/Veizen-Brot wurde aus einem Teig hergestellt, der die folgenden Bestandteile enthielt: Weizenmehl, 667 g; gesiebtes Roggenmehl, 1333 g; "Backaroma sauer", 40 g; komprimierte Hefe, 60 g; Salz, 44 g; Wasser, 1160 g; Lipase 3, siehe unten; GRINDAMYL^TM N 121 (kommerzielles Hemizellulaseprodukt von Grindsted Products, Braband, Dänemark).
Der Teig wurde unter Verwendung eines Kemper-Mischers für 2 Minuten bei niedriger Geschwindigkeit und für 11 Minuten bei hoher Geschwindigkeit gemischt. Teigtemperatur: 27°C, Ruhezeit: 30 Minuten bei 32°C, Einwiegen von 800 g Gehenlassen Minuten bei 32°C und 85% relativer Feuchte, Backen für 30 Minuten bei 230°C und 10 Sekunden Dampf.
Die Klebrigkeit des Teiges wurde unter Anwendung einer Skala von 1 bis 5 eingestuft, wobei 1 = sehr klebrig und 5 = normal, nicht klebrig bedeutet. Das spezifische Brotvolumen wurde ebenfalls beurteilt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 17.1 gezeigt.
Tabelle 17.1. Die Wirkung von Lipase 3 auf die Klebrigkeit und das Brotvolumen mit und ohne Zugabe von GRINDAMYL^TM H 121
Die Zugabe von Lipase 3 in Kombination mit Hemizellulase zu Roggen/Weizen-Brot verbesserte klar die Handhabungseigenschaften des Teiges dahingehend, daß der Teig weniger klebrig war.
BEISPIEL 18
Bewertung der Wirkung von Lipase 3, hergestellt von A. tubigensis-Transformanden, in einem Modellteigsystem
Lipasen, hergestellt von fünf A. tubigensis-Transformanden: 161, S2-6, S3-4, S4-1 und 720-4 3M (siehe Tabelle 8.1) wurden in einem Modellteigsystem in verschiedenen Konzentrationen getestet, und die Bildung von freier Fettsäure wurde nach dem folgenden Verfahren analysiert:
Ein Teig wurde unter Verwendung der folgenden Bestandteile hergestellt: Mehl, 50 g; Trockenhefe, 0,375 g; NaCI, 0,75 g; Wasser, 28 g; Lipase, siehe unten. Mehl, Trockenhefe und Salz wurden für 1 Minute in einer Brabender-Mischschüssel gemischt (50 g). Lipase und Wasser wurden zu dem Teig hinzugefügt, gefolgt von Mischen für 6 Minuten bei 62 U.p.M. Der Teig wurde in einen Becher überführt, der mit einem Deckel versehen war, und der Teig wurde für 60 Minuten bei 32°C fermentiert. Der Teig wurde gefriergetrocknet. Der gefriergetrocknete Teig wurde gemahlen und gesiebt und mit mit Wasser gesättigtem Butanol (WSB) extrahiert. WSB wurde unter einem Strom von N₂ verdampft, und der Gehalt an freien Fettsäuren wurde durch Spektrophotometrie nach Kwon, D.Y. und J.S. Rhee, 1986, JAOCS 63:89, bestimmt.
In einem ersten Experiment wurde die gereinigte Wildtyp-Lipase 3 mit dem mutanten Enzym, hergestellt von der Transformande S3-4, in verschiedenen Konzentrationen verglichen, wie es in Tabelle 18.1 gezeigt ist. Die Ergebnisse zeigten klar eine erhöhte Menge an Fettsäure mit zunehmender Menge an Enzymdosierung. Es war jedoch auch deutlich, daß sich Wildtyp-Lipase 3 bei etwa 3‰ Fettsäure bei hoher Lipasedosierung ausschleicht, wogegen die Lipase, die von der Transformande S3-4 hergestellt wurde, fortgesetzt mehr Fettsäuren bei erhöhter Enzymdosierung von bis zu etwa 5‰ Fettsäure produzierte.
Tabelle 18.1. Freisetzung von freien Fettsäuren in einem Teigmodellsystem
Lipasen, die von den Transformanden 161, S2-6, S4-1 und 720-4 3M hergestellt wurden, wurden ebenfalls nach dem gleichen Verfahren getestet mit Ergebnissen, wie sie in Tabelle 18.2 gezeigt sind.
Tabelle 18.2. Freisetzung von freien Fettsäuren in einem Teigmodellsystem
Die Ergebnisse zeigten klar, daß die fünf verschiedenen Transformandenlipasen in einem Teig aktiver waren im Vergleich zu Wildtyp-Lipase 3, wenn sie bei der gleichen Enzymdosierung (LUT/kg) verglichen wurden.
BEISPIEL 19
Backexperiment unter Verwendung von Lipasen, die von S3-4 und S4-1 hergestellt worden waren, bei der Herstellung von dänischen Brötchen Es wurden Backexperimente durchgeführt, bei denen dänische Brötchen mit verschiedenen Dosierungen an Lipase, hergestellt von Transformande S3-4 bzw. S4-1, hergestellt wurden. Nach dem Backen wurde das spezifische Volumen des Brotes bestimmt, und die Krumenhomogenität wurde subjektiv beurteilt, wie es oben beschrieben ist. Die Ergebnisse aus den Backtests sind in Tabelle 19.1 gezeigt.
Tabelle 19.1. Die Wirkung von Lipasen, hergestellt von den Transformanden S3-4 bzw. S4-1. auf die Brotqualität
Eine erhöhte Dosierung beider der oben genannten Lipasen verbesserte die Krumenstruktur und produzierte ein Brot mit besserer Erscheinung und Krumenstruktur. Bei hoher Dosierung des von S3-4 hergestellten Enzyms trat eine Abnahme des Brotvolumens auf, und die gleiche Tendenz wurde für die von S4-1 hergestellte Lipase bei einer niedrigeren Dosierung beobachtet.
Es wird daraus geschlossen, daß auch diese getesteten mutanten Lipasen den Teig und die Brotstabilität und die Krumenstruktur verbesserten, wie es für Wildtyp-Lipase 3 der Fall ist.
INDICATIONS RELATING TO A DEPOSITED MICROORGANISM (PTC Rule 13bis)
ANGABEN BEZÜGLICH DER HINTERLEGTEN MIKROORGANISMEN (PCT Regel 12bis)
Zusatzblatt
Zusätzlich zu dem Mikroorganismus, der auf S. 80 der Beschreibung angegeben ist, wurden die folgenden Mikroorganismen bei
The National Collections of Industrial and Marine Bacteria Limited (NCIMB) 23 St. Machar Drive, Aberdeen, Schottland Vereinigtes Königreich AB2 1 RY
an den Daten und unter den Hinterlegungsnummern, wie sie unten angegeben sind, hinterlegt:
Für alle der oben genannten hinterlegten Mikroorganismen treffen die folgenden zusätzlichen Angaben zu:
In Bezug auf die jeweiligen Patentämter der jeweiligen benannten Staaten beantragen die Anmelder, daß eine Probe der hinterlegten Mikroorganismen, die oben angegeben sind, nur einem von dem Antragsteller benannten Experten zur Verfügung gestellt wird bis zu dem Datum, an dem das Patent erteilt wird, oder dem Datum, an dem die Anmeldung zurückgewiesen oder zurückgezogen wird oder als zurückgezogen gilt. SEQUENZPROTOKOL

Claims

Verwendung eines Polypeptids mit Lipaseaktivität zur Herstellung eines Teiges und/oder eines gebackenen Produkts, wobei das Polypeptid ein Triacylglycerol hydrolysierendes Enzym ist und wobei das Polypeptid in der Lage ist, Fettsäuren mit kurzer, mittlerer und langer Kettenlänge zu spalten, dadurch gekennzeichnet, daß das Polypeptid in der Lage ist, Galaktolipide, die normalerweise in dem Mehl vorhanden sind, zu den entsprechenden Galaktosylmonoglyceriden zu hydrolysieren, wobei das Polypeptid wenigstens 80% Aktivität nach vier Tagen bei 20°C und bei einem pH-Wert im Bereich von 3,5 bis 8 behält und wobei das Polypeptid in der Lage ist, wenigstens 10% der Galaktosyldiglyceride, die normalerweise in dem Mehlteig vorhanden sind, zu Galaktosylmonoglyceriden zu hydrolysieren, und wobei das Enzym dem gebackenen Produkt eine oder mehrere der folgenden Eigenschaften, nämlich verbesserte Homogenität und verminderten Porendurchmesser, verleiht.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei der pH-Wert im Bereich von 5 bis 7 liegt.
Verwendung nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, wobei das Polypeptid wenigstens 60% von seiner Aktivität nach einer Stunde bei 60°C in 100 mM Natriumacetatpuffer bei einem pH-Wert von 5,0 behält, einschließlich einem Polypeptid, welches wenigstens 80% seiner Aktivität nach einer Stunde bei 50°C unter den gleichen Bedingungen behält.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei, wenn das Polypeptid einem Brotteig in einer Menge von 5000 Lipaseeinheiten pro kg Mehl hinzugefügt wird, der durchschnittliche Porendurchmesser der Krume des Brots, das aus dem Teig hergestellt wird, um wenigstens 10% gegenüber einem Brot, welches aus einem Brotteig ohne Zugabe der Lipase hergestellt ist, vermindert ist.
Verwendung nach einem der vorangegangenen Ansprüche, wobei, wenn das Polypeptid einem Brotteig in einer Menge von 5000 Lipaseeinheiten pro kg Mehl hinzugefügt wird, die Porenhomogenität der Krume des Brots, das aus dem Teig hergestellt ist, um wenigstens 5% gegenüber einem Brot, welches aus einem Brotteig ohne Zugabe der Lipase hergestellt ist, erhöht wird.
Verwendung nach einem der vorangegangenen Ansprüche, wobei der Teig ein fettfreier Teig ist.
Verwendung nach einem der vorangegengenen Ansprüche, wobei der Teig und/oder das gebackene Produkt weiterhin ein Emulgiermittel umfaßt.
Verwendung nach einem der vorangegangenen Ansprüche, wobei das Polypeptid in der Lage ist, wenigstens 25% der Galaktosyldiglyceride, die normalerweise in dem Mehlteig vorhanden sind, zu Galaktosylmonoglyceriden zu hydrolysieren.